KR20050044850A - 복합스트레스 내성 식물체 제조용 재조합 발현벡터 및이를 이용한 복합스트레스 내성 식물체의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 산화스트레스 유도성 프로모터(oxidative stress inducible promoter)에 복합스트레스 내성 유전자가 결합된 복합스트레스 내성 식물체 제조용 재조합 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 복합스트레스 내성 식물체 및 상기 식물체의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로는 고구마 유래의 산화스트레스 유도성 퍼옥시다제 프로모터(SWPA2 프로모터)에 복합스트레스 내성유전자(SOD(superoxide dismutase) 유전자 및 APX(ascobate peroxidase) 유전자)가 결합된 상기 유전자를 엽록체에 발현시키는 복합스트레스 내성 식물체 제조용 재조합 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 복합스트레스 내성 식물체 및 상기 식물체의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 복합스트레스 내성 식물체 제조용 재조합 발현벡터를 이용하여 생물체를 형질전환시키는 경우, 제초제, 냉해, 염해 또는 활성 산소의 발생을 유발하는 다양한 환경오염에 의한 스트레스에 대해 강한 내성을 나타내는 형질전환 식물체를 제조할 수 있으므로, 농작물의 생산성 증대 또는 유용성분의 대량 생산 등에 크게 기여할 수 있다.

Description

복합스트레스 내성 식물체 제조용 재조합 발현벡터 및 이를 이용한 복합스트레스 내성 식물체의 제조방법{RECOMBINANT EXPRESSION VECTOR FOR PRODUCTION OF PLANTS HAVING MULTIPLE STRESS TOLERANCES, AND METHOD FOR PREPARING MULTIPLE STRESS-TOLERANT PLANTS USING THE SAME}

본 발명은 고구마 유래의 산화스트레스 유도성 프로모터(oxidative stress inducible promoter)에 복합스트레스 내성 유전자가 결합되어 상기 유전자를 엽록체에 발현시키는 복합스트레스 내성 식물체 제조용 재조합 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 복합스트레스 내성 식물체 및 상기 식물체의 제조방법에 관한 것이다.

식물을 비롯한 대부분의 생물은 병균, 해충, 바이러스 등의 생물학적 스트레스 뿐만 아니라 지구 환경 악화에 따라 발생하는 고온, 염해, 건조, 공해, 병원균, 상처, 냉해, 과다한 광조건, 오존, 과다한 UV 노출 및 삼투압 충격(osmotic shock)과 같은 다양한 환경 스트레스를 받게 된다. 특히, 식물은 상기와 같은 다양한 환경 스트레스를 받게 되면, 생명 유지에 필요한 필수 원소이지만 반응성이 높은 산소가 수퍼옥사이드 음이온 라디칼(superoxide anion radical, O₂ ^-), 과산화수소(hydrogen peroxide, H₂O₂), 수산화 라디칼(hydroxyl radical) 등의 활성 산소로 변하여 생체내에서 심각한 생리적인 장해 등을 유발하게 된다. 즉, 세포내의 활성 산소의 양이 미량으로 존재하는 경우에는 이들 활성 산소는 세포내의 신호전달 물질로서 작용하여 식물 생체방어에 필요한 유전자(항산화효소, 열충격 단백질 등)의 발현을 유도하지만, 활성 산소의 양이 증가하는 경우에는 반응성이 높은 활성 산소가 농도 의존적인 방식(dose-dependent manner)으로 생리적인 장해를 유발하여 세포를 죽음에 이르게 한다.

최근, 많은 연구자들은 식물에서 이들 활성 산소에 의해 매개되는 신호전달 경로에 대해 많은 관심을 갖고 있는데, 이는 이들 경로를 조절하게 되면 세포내의 항산화효소 및 생체방어 단백질의 발현을 증가시킬 수가 있고, 궁극적으로는 각종 환경 스트레스에 대한 내성을 갖는 식물체를 개발할 수 있기 때문이다(Kovtun, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(6): 2940-2945, 2000). 최근의 보고에 의하면, 식물에서 활성 산소에 의해 매개되는 신호전달 경로에는 MAP 카이네즈 케스케이드(MAPK cascade)가 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Kovtun, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(6): 2940-2945, 2000).

슈퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase, SOD)는 수퍼옥사이드 음이온 라디칼(O₂ ^-)을 과산화수소(H₂O₂)로 전환시키는 효소로서, 효소 내에 포함된 보족 금속원소에 따라 CuZnSOD, MnSOD 및 FeSOD로 구분된다. 이들은 종류에 따라 세포내에서 위치가 달라지며, 예를 들어 CuZnSOD는 세포질과 엽록체에 존재하고, MnSOD는 미토콘드리아에 존재하며, FeSOD는 엽록체에 존재한다. SOD는 환경스트레스에 의해 생성되는 생체 내 활성 산소를 제거하는 환경 내성 인자로서 중요하며, 의약품, 식품, 화장품 등에 이용될 수 있는 것으로 제시되고 있다. 아울러, 환경스트레스에 강한 SOD의 유전자를 포함하는 형질전환된 식물체를 얻음으로써, 주로 오존, 저온, 제초제 등의 환경 스트레스에 강한 환경 내성 식물을 개발할 수 있다(Plant Physiology, 10: 1049-1054, 1995; 미국특허 제 5,538,878 호).

한편, 아스코베이트 퍼옥시다제(ascobate peroxidase, APX)는 아스코베이트를 전자 공여체로 사용하여 H₂O₂를 물로 전환시키는 효소로서 식물체와 곤충에서 발견되며, 식물체에서는 세포질, 엽록체의 스트로마 및 틸라코이드 막에 존재하는 것으로 밝혀져 있다(Free Rad. Biol. Med. 23: 473-479, 1997).

식물체의 엽록체에서는 비교적 높은 농도의 산소가 상존하며, 빛 에너지를 이용하여 물을 분해하는 과정에서 발생되는 전자 에너지를 활용하기 위한 전자전달계가 존재하고 있어, 다양한 산화스트레스에 민감하게 반응한다. 따라서 엽록체의 항산화 능력을 높일 수 있는 경우에 환경스트레스하에서도 식물의 생산성을 유지할 수 있을 것으로 기대된다.

한편, 현재까지 스트레스 내성 식물체 개발에는 특정 조건에 관계없이 항상 발현되는 CaMV 35S 프로모터에 특정 스트레스에 강한 유전자를 결합한 발현벡터를 사용한 것이 대부분이어서, 특정한 스트레스에 대해서만 내성을 나타내는 식물체가 제조되었다. 따라서, 다양한 스트레스 조건에서 발현이 가능한 프로모터 및 내성유전자를 포함하는 발현벡터, 및 상기 발현벡터로 형질전환된 식물체의 제조에 대한 필요성이 제기되어 왔다.

이에, 본 발명자들은 환경 재해 내성 형질전환 농작물의 개발을 위하여, 다양한 스트레스에 의해 발현이 유도되는 고구마 유래의 산화스트레스 유도성 퍼옥시다제 프로모터인 SWPA2 프로모터에 복합스트레스 내성유전자인 SOD(superoxide dismutase) 유전자 및 APX(ascorbate peroxidase) 유전자가 결합되어 상기 유전자를 엽록체에 발현시키는 신규한 형질전환용 발현벡터를 제조하고, 상기 발현벡터로 형질전환된 감자 및 고구마 식물체를 조직배양함으로써 재분화시킨 결과, 상기 식물체가 복합스트레스에 대한 내성이 크게 향상된다는 것을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 고구마 유래의 산화스트레스 유도성 프로모터에 복합스트레스 내성 유전자가 결합되어 상기 유전자를 엽록체에 발현시키는 복합스트레스 내성 식물체 제조용 재조합 발현벡터를 제공한다.

본 발명의 다른 목적은 상기 발현벡터로 형질전환된 복합스트레스 내성 식물체 및 상기 식물체의 제조방법을 제공한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 산화스트레스 유도성 퍼옥시다제 프로모터, 산화스트레스 유도성 퍼옥시다제 프로모터의 하류에 위치하는 담배 식각 바이러스(tobacco etch virus, TEV) 선도서열, 복합스트레스 내성 유전자, CaMV 35S 전사 종결서열(transcription terminator), 항생제 내성 유전자 및 T-DNA 보더 서열(T-DNA boarder sequence)을 포함하는 복합스트레스 내성 식물체 제조용 재조합 발현벡터 pSSA-K 및 pSSA-H를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 pSSA-K 또는 pSSA-H 발현벡터로 형질전환된 식물체를 제공한다.

아울러, 본 발명은

ⅰ) SWPA2 프로모터, SOD 유전자 및 APX 유전자를 포함하는 식물 형질전환용 발현벡터를 제조하는 단계;

ⅱ) 상기 발현벡터를 식물체 또는 배양세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계;

iii) 상기 형질전환체를 배양하는 단계; 및

iⅴ) 상기 형질전환체를 조직배양으로 재분화시켜 형질전환된 식물체를 제조하는 단계를 포함하는 복합스트레스 내성의 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 산화스트레스 유도성 퍼옥시다제 프로모터, 산화스트레스 유도성 퍼옥시다제 프로모터의 하류에 위치하는 담배 식각 바이러스(tobacco etch virus, TEV) 선도서열, 복합스트레스 내성 유전자, CaMV 35S 전사 종결서열(transcription terminator), 항생제 내성 유전자 및 T-DNA 보더 서열(T-DNA boarder sequence)을 포함하는 복합스트레스 내성 식물체 제조용 재조합 발현벡터 pSSA-K 및 pSSA-H를 제공한다.

본 발명의 한 실시태양에서, 고구마 유래의 상기 산화스트레스 유도성 퍼옥시다제 프로모터는 서열번호 11로 기재되는 SWPA2(sweetpotato peroxidase anionic 2) 프로모터의 염기서열인 것이 바람직하고, 상기 복합스트레스 내성유전자는 서열번호 12로 기재되는 SOD 유전자, 및 서열번호 13으로 기재되는 APX 유전자의 염기서열인 것이 바람직하다.

본 발명자들은 상기의 방법으로 제조된 복합스트레스 내성 식물체 제조용 재조합 발현벡터 pSSA-K 및 pSSA-H를 한국생명공학연구원 부설 유전자은행(Korean Collection for Type Cultures)에 2003년 11월 7일자로 기탁하였다. pSSA-K 발현벡터의 수탁번호는 KCTC10536BP이고, pSSA-H 발현벡터의 수탁번호는 KCTC10537BP이다.

SWPA2 프로모터는 본 발명자들이 고구마(Ipomoea batatas)에서 분리된 산화스트레스 유도성 프로모터(oxidative stress inducible promoter)로서, 재해내성 식물 및 기타 유용물질 생산 식물 세포주 개발에 활용이 기대되는 유전자이다(대한민국 특허 공개공보 제2001-51095호; 국제 공개공보 제 WO 01/31018 호(2000년 10월 28일자 출원); Kim, et al., Plant Mol. Biol., 51: 831-838, 2003). 구체적으로, SWPA2 프로모터는 배양세포 고발현 퍼옥시다제 프로모터로서 산화스트레스에 의해서 발현이 유도되는 유전자이며, 특히 고구마 현탁 배양세포 및 형질전환 담배 현탁 배양세포에서 대수 증식기 후반에 강하게 발현된다(국제 공개공보 제 WO 01/31018 호). 상기 프로모터는 담배 원형질체를 이용한 GUS 단백질의 일시적 분석(transient assay)에서 CaMV 35S 프로모터 보다 약 30배 높은 활성을 나타낸다. 또한, 정상적인 상태의 식물체 잎에서는 전혀 발현되지 않지만 상처, 저온, 오존 등 산화적 스트레스를 받았을 때, 발현이 유도되는 특성, 즉 산화적 스트레스에 의하여 발현이 유도되는 프로모터이다(Kim, et al., Plant Mol. Biol., 51: 831-838, 2003). 따라서, 본 발명의 SWPA2 프로모터는 환경 스트레스 내성 식물체의 개발과 형질전환 식물세포를 이용한 유용물질 생산에 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명의 SWPA2 프로모터는 스트레스에 의해 유전자의 발현을 효과적으로 유도할 수 있다. 본 발명의 SWPA2 프로모터는 ABA, 메틸 자스모네이트(methyl jasmonate), 상처, 저산소증, 활성 산소, 열 또는 질소에 의한 외부 환경으로부터의 스트레스를 인식하는 인자들을 포함한다. SWPA2 프로모터는 이러한 특성을 이용하여 프로모터 활성을 나타내는 DNA 서열 및 상기 프로모터 서열과 작동가능하도록 연결된 구조 유전자로 이루어진 융합 유전자 구조물의 제조에 이용될 수 있다. 상기 융합 유전자 구조물은 유용물질의 생산과 관련된 구조 유전자를 SWPA2 프로모터 유전자에 연결하여 다양한 환경 스트레스하에 SWPA2 프로모터의 조절을 받아 유용물질을 발현할 수 있으므로, 유용물질을 생산하기 위한 형질전환체의 제조에 유용하게 이용될 수 있다. 또한, 상기 융합 유전자 구조물에 다양한 환경 스트레스에 대해 내성을 나타내는 유전자를 구조 유전자로 사용하면 외부적인 스트레스에 대해 내성을 갖는 형질전환체의 제조에도 이용될 수 있다.

또한, 본 발명에서 사용된 SOD 유전자는 일반적으로 30종 이상의 다수의 식물로부터 분리되지만, 본 발명에서는 SOD 고생산 세포주로 선발된 카사바(Manihot esculenta) 배양세포에서 최초로 분리된 CuZnSOD 유전자(mSOD1)가 사용될 수 있고(Mol. Gen. Genet. 262: 807-814, 1999), APX 유전자로는 완두에서 분리된 유전자가 사용될 수 있다(Free Rad. Biol. Med. 23: 473-479, 1997).

바람직한 실시태양에서, 본 발명자들은 상기 서열번호 11로 기재되는 SWPA2 프로모터를 pRW20 벡터에 연결하여 pSA 벡터를 제조하고, 상기 pSA 벡터에 서열번호 12로 기재되는 mSOD1 유전자를 도입하여 pSS 벡터를 제조한다(도 1a 참조). 이어, 상기 pSS 벡터에서 SPWA2pro-TEV-TP-35S 전사종결서열 구조를 하이그로마이신 내성 유전자 및 카나마이신 내성 유전자를 갖고 있는 식물 형질전환용 발현벡터에 도입한 후, pSA 벡터에서 분리된 SWPA2pro-TEV-TP-APX-35S 전사종결서열 구조를 삽입하여 최종적인 복합스트레스 내성 식물체 제조용 재조합 발현벡터 pSSA-K 및 pSSA-H를 제조한다(도 1b 참조). 상기 pSSA-K 및 pSSA-H 발현벡터는 SWPA2 프로모터 및 mSOD1 및 APX 유전자 이외에 담배 식각 바이러스(tobacco etch virus, TEV) 선도서열, CaMV 35S 전사 종결서열(transcription terminator)을 포함하고, 하이그로마이신 및 카나마이신 내성 유전자를 각각 포함하므로, 상기 벡터로 형질전환된 복합스트레스 내성 식물체의 선발이 용이하다.

또한, 본 발명은 상기 pSSA-K 또는 pSSA-H 발현벡터로 형질전환된 복합스트레스 내성 식물체를 제공한다. 이때, 형질전환된 식물체로는 모든 식물체가 이용가능하지만, 콩, 보리, 옥수수, 톨페스큐, 감자 또는 고구마가 바람직하며, 감자 또는 고구마가 가장 바람직하다.

본 발명은 SWPA2 프로모터, SOD 유전자 및 APX 유전자가 포함된 복합스트레스내성 식물체 제조용 재조합 발현벡터를 식물체에 형질전환시켜 식물체 내에서 SOD 유전자 및 APX 유전자를 대량으로 발현하는 복합스트레스 내성을 나타내는 형질전환 식물체를 제공한다.

본 발명의 실시태양에서는 상기에서 제조된 pSSA-K 또는 pSSA-H 발현벡터를 모든 식물체, 바람직하게는 콩, 보리, 옥수수, 톨페스큐, 감자 또는 고구마, 가장 바람직하게는 감자 또는 고구마에 도입하여 SOD 유전자 및 APX 유전자를 발현시킨다. 구체적으로, 본 발명자들은 상기 발현벡터를 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) EHA105를 이용하거나 입자 충격(particle bombardment) 방법을 사용하여 상기 감자 또는 고구마의 어린잎 또는 엽병 절편체에 도입시켜 형질전환체를 제조한 뒤, 상기 형질전환체를 조직배양함으로써 식물체의 각 기관으로 재분화시킨다(도 2a 및 도 3a 참조). 또한, 상기 재분화된 형질전환 감자 또는 고구마 식물체로부터 게놈 DNA를 추출하고, 이것을 PCR에 의해 상기 SWPA2 프로모터 또는 APX 유전자를 증폭시킴으로써 상기 식물체의 게놈내에 상기 SWPA2 프로모터 또는 APX 유전자가 도입되었음을 확인한다(도 2b 및 도 3b 참조). 아울러, 상기 PCR에 의해 형질전환되었음이 확인된 각 식물체로부터 게놈 DNA를 추출하고, 이것을 멤브레인(membrane)에 전달(transfer)한 후, SWPA2 프로모터 또는 APX 유전자를 이용한 서던블럿(Southern blot)의 혼성화 반응에 의해 상기 식물체의 게놈 내에 SWPA2 프로모터 또는 APX 유전자가 도입되었음을 다시 한번 확인한다(도 2c 및 도 3c 참조).

또한, 본 발명은

ⅰ) SWPA2 프로모터, SOD 유전자 및 APX 유전자를 포함하는 식물 형질전환용 발현벡터를 제조하는 단계;

ⅱ) 상기 발현벡터를 식물체 또는 배양세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계;

iii) 상기 형질전환체를 배양하는 단계; 및

iⅴ) 상기 형질전환체를 조직배양으로 재분화시켜 형질전환된 식물체를 제조하는 단계를 포함하는 복합스트레스 내성의 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.

이때, 상기 발현벡터는 pSSA-K 또는 pSSA-H 발현벡터인 것이 바람직하고, 상기 식물체 또는 배양세포는 모든 식물체, 바람직하게는 콩, 보리, 옥수수, 톨페스큐, 감자 또는 고구마, 가장 바람직하게는 감자 또는 고구마이다.

또한, 상기 형질전환체는 일반적인 식물 형질전환 방법에 의해 제조될 수 있지만(Horsch, et al., Cold Spring Harb Symp Quant Biol., 50: 433-7, 1985; Rogerset, et. al., 1986), 바람직하게는 입자 충격(particle bombard) 방법으로 형질전환체를 제조할 수 있다.

본 발명자들은 바람직한 실시태양에서 발현벡터로 pSSA-K 또는 pSSA-H 벡터를 사용하고, 상기 발현벡터는 SWPA2 프로모터, SOD 유전자 및 APX 유전자 이외에 담배 식각 바이러스(tobacco etch virus, TEV) 선도서열, CaMV 35S 전사 종결서열(transcription terminator)을 포함하며, 하이그로마이신 및 카나마이신 내성 유전자를 각각 포함하고 있어, 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체의 선발이 용이하다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 복합스트레스 내성 유전자의 발현벡터인 pSSA-K 및 pSSA-H의 제조

본 발명자들에 의해 제조된 서열번호 11로 기재되는 산화스트레스 유도성 SWPA2 프로모터(대한민국 특허 공개공보 제2001-51095호; 국제 공개공보 제 WO 01/31018 호)에 서열번호 12로 기재되는 카사바의 CuZnSOD(CuZn superoxide dismutase, mSOD1)를 코딩하는 cDNA(GenBank accession number AF170297, Lee, et al., Mol. Gen. Genet., 262: 807-814, 1999) 및 서열번호 13으로 기재되는 완두의 APX(ascorbate peroxidase; Randy, et al., Free Rad. Biol. Med., 23: 473-479, 1997)를 코딩하는 cDNA가 연결(ligation)된 벡터를 제조하였다.

구체적으로, 먼저 서열번호 1 및 서열번호 2로 기재되는 프라이머를 이용하여 94℃에서 1분, 51℃에서 1분, 72℃에서 1분 30초의 1사이클의 PCR을 30회 수행하여 SWPA2 프로모터 서열을 증폭한 후, 공급자가 제공하는 프로토콜(protocol)에 따라 증폭된 SWPA2 프로모터 서열을 pGEM-T Easy 플라스미드 벡터(Promega, USA)에 클로닝하였다. 염기서열 분석에 의해 상기 목적하는 SWPA2 프로모터 서열이 정확하게 증폭되었음을 확인하였다. 상기 프라이머 염기서열에는 Hind Ⅲ 및 Xho I 절단부위(restriction site)가 존재하므로, Hind Ⅲ 및 Xho I을 처리하여 SWPA2 프로모터 서열이 클로닝된 pGEM-T Easy 플라스미드 벡터로부터 SWPA2 프로모터 서열을 분리하였다. 이어, 완두의 APX(ascorbate peroxidase)가 엽록체로 이동되도록 제조된 pRW20 벡터(Allen, et al., Free Rad. Biol. Med., 23: 473-479, 1997)를 동일한 제한효소로 절단하여 증가된 35S 프로모터(enhanced 35S promoter)를 제거한 후, 이전에 분리된 SWPA2 프로모터 서열를 상기 벡터에 연결(ligation)하여 pSA 벡터를 구축하였다(도 1a).

pSA 벡터의 APX 유전자를 mSOD1 유전자로 교체하기 위하여, 서열번호 3 및 서열번호 4로 기재되는 프라이머를 이용하여 94℃에서 1분, 57℃에서 1분, 72℃에서 1분의 1사이클의 PCR을 30회 수행하여 mSOD1 유전자를 증폭하고, 공급자가 제공하는 프로토콜에 따라 증폭된 mSOD1 유전자를 pGEM-T Easy 플라스미드 벡터(Promega, USA)에 클로닝하였다. 이어, 염기서열 분석에 의해 상기 목적하는 mSOD1 유전자가 정확하게 증폭되었음을 확인하였다. 상기 프라이머 염기서열에는 Sal I 및 Sac I 절단부위가 존재하므로, Sal I 및 Sac I을 처리하여 mSOD1 유전자가 클로닝된 pGEM-T Easy 플라스미드 벡터로부터 mSOD1 유전자를 분리하고, 동일한 제한효소에 의해 절단된 상기 pSA 벡터에 mSOD1 유전자를 도입하였다. 상기 방법으로 구축된 벡터를 pSS 벡터라 명명하였다(도 1a).

최종적으로, 하이그로마이신(hygromycin) 내성 유전자를 포함하는 pCAMBIA1300 플라스미드(Center for Application of Molecular Biology to International Agriculture, Australia) 및 카나마이신(kanamycin) 내성 유전자를 포함하는 pCAMBIA2300 플라스미드(Center for Application of Molecular Biology to International Agriculture, Australia)를 이용하여 SOD 및 APX를 동시에 형질전환하기 위한 식물 형질전환용 벡터인 pSSA-K 및 pSSA-H 벡터를 제조하였다. 구체적으로, 상기 pSS 벡터를 Hind Ⅲ로 절단하여 얻은 약 2.0kb 크기의 DNA 절편을 동일한 제한효소로 절단된 pCAMBIA1300 플라스미드 및 pCAMBIA2300 플라스미드에 도입하였다. 여기에 pSA를 Pst I으로 절단하여 얻은 2.3kb 크기의 DNA 절편을 도입하여 SOD 및 APX 유전자가 동시에 도입된 발현벡터인 pSSA-K 벡터(pCAMBIA2300에 도입된 경우) 및 pSSA-H 벡터(pCAMBIA1300에 도입된 경우)를 각각 구축하였다(도 1b). 본 발명자들은 상기 제조된 pSSA-K 및 pSSA-H 발현벡터를 한국생명공학연구원 부설 유전자은행(KCTC)에 2003년 11월 7일자로 기탁하였으며, 상기 pSSA-K 벡터의 수탁번호는 KCTC10536BP이고, pSSA-H 벡터의 수탁번호는 KCTC10537BP이다. 상기 도 1a 및 도 1b에서 SWPA2 pro: 산화스트레스 유도성 프로모터, E35S pro: 증가된(enhanced) CaMV 35S 프로모터, TEV: 담배 식각 바이러스(tobacco etch virus, TEV) 선도서열, TP: 완두 CuZnSOD(구리ㆍ아연 슈퍼옥사이드 디스뮤타제, superoxide dismutase)의 신호서열, 35S 3': CaMV 35S 전사 종결서열(transcription terminator), Amp: 항생제(ampicillin) 내성 유전자, H: Hind Ⅲ, P: Pst I, Xh: Xho I, R: EcoR I, N: Nco I, S: Sal I, B: BamH I, X: Xba I, 및 Sa: Sac I이다.

안(An)의 방법(An, Meth. Enzymol., 153: 292-305, 1987)을 이용하여 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) EHA105(Hood, et al., Trans. Res., 2: 208-218, 1993)에 상기에서 제조된 식물 형질전환용 발현벡터(pSSA-K 또는 pSSA-H)를 도입하여 감자의 형질전환체를 제조하였다.

또한, 큐아젠(Qiagen, U.S.A)사의 플라스미드 맥시 키트(Plasmid Maxi kit)를 이용하여 플라스미드 DNA(pSSA-K 벡터)를 대장균으로부터 대량으로 분리한 후, 하기 실시예 3의 방법에 의한 입자 충격(particle bombardment) 방법을 사용하여 고구마를 형질전환시켰다.

<실시예 2> pSSA-K 발현벡터를 이용한 형질전환 감자의 제조

<2-1> 형질전환 감자 식물체의 제조

본 발명자들은 상기 실시예 1에서 제조한 pSSA-K 벡터를 포함하는 아그로박테리움 투메파시엔스 EHA105와 감자 식물체의 절편체를 공동배양하여 감자를 형질전환시켰다.

구체적으로, 형질전환에 사용된 감자(Solanum tuberosum L.) 식물체는 국내의 식용 품종인 수미(Superior) 및 가공용 품종인 대서(Atlantic)를 배양기 내에서 배양하였다. MS(Murashige and Skoog, Physiol. Plant., 15: 473-497, 1962) 배지에 3%의 슈크로스(sucrose)를 첨가하여 16시간 광/8시간 암 주기, 및 40μ㏖·m^-2·sec^-1의 냉백(cool-white) 형광의 조건하에 25℃ 배양실에서 상기 감자 식물체를 배양하였으며, 2주 동안 배양한 신초(shoot)의 상부로부터 2 내지 3번째의 어린잎 및 엽병(petiole)을 절취하여 형질전환 재료로 사용하였다.

카나마이신 50 ㎎/ℓ이 첨가된 LB 배지(박토펩톤(bacto peptone) 10 g/ℓ, 효모 추출액(yeast extract) 5 g/ℓ 및 NaCl 10 g/ℓ) 5 ㎖에 아그로박테리아를 접종하여 28℃ 진탕배양기(shaking incubator)에서 하루 동안 배양한 아그로박테리아 배양액 100 ㎕, 및 감자 식물체의 잎과 엽병 절편체 각각을 MS 기본 액체배지 10 ㎖가 들어있는 페트리 디쉬(petri dish)에 넣어 충분히 혼합한 후 25℃의 암 조건하에서 2일 동안 공동배양하였다. MS 기본 액체배지로 아그로박테리아를 세척한 후, 멸균된 필터 페이퍼로 공동배양한 감자 잎 및 엽병 절편체의 물기를 제거하였다. 이어, 잎과 엽병 절편체를 선발배지(제아틴(zeatin) 2 ㎎/ℓ, NAA(α-naphthaleneacetic acid) 0.01 ㎎/ℓ, GA3(지베렐린, gibberellin) 0.1 ㎎/ℓ, 클라포란(claforan) 300 ㎎/ℓ 및 카나마이신(kanamycin) 100 ㎎/ℓ를 포함하는 MS 배지)에서 배양하였다. 3주 간격으로 신선한 배지로 옮겨 계대배양하였으며, 약 3 내지 약 4주 동안 배양하였을 때 카나마이신 내성을 갖는 신초(shoot)의 발생이 캘러스(callus)와 함께 유도되었다.

잎이 1 내지 2장 정도 나왔을 때, 뿌리 유도 배지(클라포란 300 ㎎/ℓ 및 카나마이신 100 ㎎/ℓ를 포함하는 MS 기본 배지)로 옮겨 뿌리의 발생을 유도하였다. 뿌리는 대부분의 신초로부터 잘 유도되었으며, 뿌리가 발달된 소식물체를 배양 용기에서 꺼내 외기에 4 내지 5일 동안 노출시키고(배양실에서 순화시키고), 원예용 상토 화분으로 옮긴 후 배양기에서 재배하였다(도 2a). 그 결과, 기내에서 증식한 감자 식물체로부터 마이크로튜버(microtuber)가 형성되었다(도 2a). 외부 유전자의 도입에 의해 형성된 형질전환된 감자 식물체는 비-형질전환된 감자 식물체와 외형적인 차이는 발견되지 않았다. 한편, 형질전환 재료로 사용된 엽병 조직은 잎에 비해 많은 수의 신초가 유도되었지만, PCR 결과에 따르면 대부분이 형질전환되지 않은 것으로 판명되었다.

<2-2> PCR과 서던블섯을 사용한 형질전환체의 확인

실시예 <2-1>에서 제조된 형질전환 감자 식물체의 형질전환 여부를 확인하기 위하여, 카나마이신 함유 배지에서 일차적으로 선발된 재분화 식물체를 대상으로 SWPA2 프로모터의 특이 프라이머인 서열번호 5 및 서열번호 6으로 기재되는 프라이머를 이용하여 94℃에서 1분, 53℃에서 1분, 72℃에서 1분의 1사이클의 PCR을 30회 수행하여 SWPA2 프로모터를 증폭함으로써 형질전환체를 선발하였다(도 2b). 그 결과, 외래 유전자가 도입된 식물체의 경우에 0.5kb의 단편이 증폭되어 SWPA2 프로모터가 도입되었음을 확인하였다. 상기 도 2b에서 M: 분자 크기를 나타내는 마커(marker), NT: 비-형질전환(non-transformation)된 감자 식물체, 1-5: 카나마이신 내성의 감자 식물체, 및 P: 양성 대조군 DNA(positive control DNA)이다.

PCR에 의해 형질전환된 것으로 확인된 감자 식물체를 무작위로 선발하여 서던블럿(Southern blotting) 분석을 실시하였다. 구체적으로, 배양기에서 생육중인 대서 및 수미 식물체 각각의 잎으로부터 디엔이지^?? 플랜트 맥시 키트(DNeasy^?? Plant Maxi kit, QIAGEN 사)를 이용하여 게놈 DNA를 각각 추출하였다. 얻어진 게놈 DNA 30 ㎍을 제한효소 EcoR I으로 절단하여 아가로즈 겔에서 전기영동을 수행하였다. 상기 겔 상의 게놈 DNA를 제타프로브 멤브레인(Zeta Probe membrane, Bio-Rad 사)으로 전달(transfer)한 후, 상기 멤브레인에 전달된 DNA와 SWPA2 프로모터 일부분인 0.5kb를 ³²P로 표지한 유전자 단편을 탐침으로 이용하여 혼성화(hybridization) 반응을 수행하였다. 혼성화 반응이 종료된 후, 멤브레인을 세척하고, X-선 필름에 노출시켜 밴드를 확인한 결과, 형질전환된 대서 및 수미 식물체는 도입된 유전자가 3개 이상의 밴드로 존재하고, 대조군 식물체에서는 어떠한 밴드도 나타나지 않음을 확인하였으며, 이는 SWPA2 프로모터가 감자 게놈 내에 안정적으로 도입되었음을 보여주는 것이다(도 2c). 상기 도 2c에서 NT: 비-형질전환된 감자 식물체, A1-A3: 형질전환된 대서(Atlantic) 식물체, 및 S1-S3: 형질전환된 수미(Superior) 식물체이다.

<실시예 3> pSSA-K 발현벡터를 이용한 형질전환 고구마의 제조

<3-1> 형질전환 고구마 식물체의 제조

본 발명자들은 상기 실시예 1에서 제조된 pSSA-K 벡터를 이용하여 입자 충격(particle bombardment) 방법으로 고구마 배 발생 캘러스를 형질전환시켰다.

구체적으로, 국내에서 식용으로 재배되는 고구마(Ipomoea batatas Lam.; 품종명: 율미)의 배 발생 캘러스를 형질전환 재료로 사용하였다. 고구마의 배 발생 캘러스는 본 발명자들이 고구마 식물체 재분화 시스템 확립을 위해 유도한 후에 유지되고 있는 것을 사용하였다(Kwon, et al., Korean J. Plant Biotechnol., 29: 189-192, 2002).

상기 배 발생 캘러스를 직경 1 내지 2㎜의 세포괴로 자르고, 2,4-디클로로페녹시 아세트산(2,4-dichlorophenoxy acetic acid, 2,4-D) 1 ㎎/ℓ가 첨가된 MS 고체배지 중앙에 약 2㎝의 원내에 상기 세포괴를 치상하여 하루 동안 배양한 후, 입자 충격을 수행하였다(도 3a). 구체적으로, 상기 실시예 1에서 제조된 식물 형질전환용 pSSA-K 벡터를 분리한 후, 상기 DNA를 1 ㎛ 직경의 금입자(gold particle)에 코팅하고, 이어 PDS-1000/He 입자 운송 시스템(particle delivery system, BioRad 사)을 이용하여 9㎝ 거리 및 1,100psi 기압에서 입자 충격(particle bombarding)시켰다. 입자 충격을 수행한 후 3일 동안 25℃ 암소(dark site)에서 배양한 후, 2,4-D 1 ㎎/ℓ와 카나마이신 100 ㎎/ℓ가 함유된 MS 선발배지에서 카나마이신 내성 배 발생 캘러스를 선발하였다. 선발은 5 내지 6개월 동안 3주 간격으로 계대배양하면서 진행하였다. 카나마이신 100 ㎎/ℓ가 첨가되고 2,4-D는 첨가되지 않은 MS 기본배지로 상기 카나마이신 내성 배 발생 캘러스를 옮기고, 40 μ㏖·m^-2·sec^-1의 냉백(cool-white) 형광 및 25℃의 배양실에서 체세포배로 유도시킨 후에 식물체로 재분화시켰다(도 3a).

<3-2> PCR 및 서던블럿에 의한 형질전환체의 확인

실시예 <3-1>에서 제조된 형질전환 고구마 식물체의 형질전환 여부를 확인하기 위하여, 카나마이신 함유 배지에서 일차적으로 선발된 재분화 식물체를 대상으로 SWPA2 프로모터의 특이 프라이머인 서열번호 7 및 서열번호 8로 기재되는 프라이머 또는 APX 유전자의 특이 프라이머인 서열번호 9 및 서열번호 10으로 기재되는 프라이머를 이용하여 94℃에서 1분, 56℃에서 1분, 72℃에서 1분의 1사이클의 PCR을 30회 수행하여 SWPA2 프로모터 또는 APX 유전자를 증폭한 후에 이를 전기영동함으로써 형질전환체를 선발하였다(도 3b). 그 결과, 외래 유전자가 도입된 식물체에 있어서 SWPA2 프로모터의 특이 프라이머의 경우에는 약 1kb 단편이 증폭되었고, APX 유전자의 특이 프라이머의 경우에는 약 0.5kb 단편이 증폭되어 SWPA2 유전자 또는 APX 유전자가 각각 도입되었음을 확인하였다. 상기 도 3b에서 M: 분자 크기를 나타내는 마커(marker), NT: 비-형질전환(non-transformation)된 고구마 식물체, 1-9: 카나마이신 내성의 고구마 식물체, 및 P: 양성대조군 DNA(positive control DNA)이다.

PCR에 의해 형질전환된 것으로 확인된 고구마 식물체를 무작위로 선발하여 서던블럿(Southern blotting) 분석을 실시하였다. 구체적으로, 배양기에서 생육중인 고구마 식물체 잎으로부터 디엔이지^?? 플랜트 맥시 키트(DNeasy ^??Plant Maxi kit, QIAGEN 사)를 이용하여 게놈 DNA를 각각 추출하였다. 얻어진 게놈 DNA 30 ㎍을 제한효소 EcoR I으로 절단하여 아가로즈 겔에 전기영동을 수행하였다. 상기 겔 상의 게놈 DNA를 제타프로브 멤브레인(zeta probe membrane, Bio-Rad 사)으로 전달(transfer)한 후, 상기 멤브레인에 전달된 DNA와 mSOD1의 일부분인 0.5 kb를 ³²P로 표지된 유전자 단편을 탐침으로 이용하여 혼성화(hybridization) 반응을 수행하였다. 혼성화 반응이 종료된 후, 멤브레인을 세척하고, X-선 필름에 노출시켜 밴드를 확인한 결과, 카나마이신 내성 고구마 식물체에서 2카피(copy) 이상의 mSOD1이 안정적으로 도입되었으며, 대조군 식물체에서는 어떠한 밴드도 나타나지 않음을 확인하였였다(도 3c). 상기 도 3c에서 NT: 비-형질전환된 고구마 식물체, 및 T1-T4: 형질전환 고구마(품종: 율미) 식물체이다.

<실시예 4> SSA 형질전환 식물체의 환경 내성 특성

<4-1> 산화스트레스에 대한 내성 특성

<4-1-1> 감자 식물체 잎 절편체(leaf disc)의 산화스트레스에 대한 내성 특성

SSA 형질전환 감자(품종: 대서) 식물체의 산화스트레스에 대한 내성을 조사하기 위하여 비-형질전환 식물체(NT 식물체) 및 SSA 식물체를 온실에서 생육하였다. 생육 7주 된 식물체의 잎(상부로부터 5 내지 7번째 잎)에서 지름 8 ㎜인 10개의 잎 절편체를 취하여 0, 3, 5 및 10μM의 메틸 비올로겐(methyl viologen, MV)을 각각 포함하는 0.4 M 소비톨(sorbitol) 용액 5 ㎖에 띄우고, 12시간 동안 암 상태에서 배양하여 MV를 흡수하도록 하였다. 암 처리 후에 광 상태에서 48시간 동안 배양한 후에 전기 전도도계(electrical conductivity meter, Orion, Model 162)를 이용하여 용액의 이온 전도도를 측정함으로써 잎의 손상 정도를 조사하였다(도 4). MV를 처리하지 않은 경우 NT 및 SSA 식물체 잎의 이온 전도도는 48시간까지 거의 일정하게 20%로 유지하였다. MV를 처리한 경우에는 SSA 식물체의 잎 절편체를 포함하는 용액의 전기 전도도는 NT 식물체의 전기 전도도에 비해 매우 낮게 나타났다. 3, 5, 및 10 μM MV를 처리한지 12시간 이후부터 NT 식물체의 잎 절편체는 심한 손상을 입었고, 48시간 후에는 80% 이상의 세포 손상을 입은 것으로 나타났지만, SSA 식물체의 경우에 MV를 처리한지 36시간까지는 40% 정도의 세포 손상을 입은 것으로 나타났다. 이 같은 결과로부터 SSA 식물체가 NT 식물체에 비해 2배 높은 내성을 나타냄을 알 수 있었으며, 이는 SOD 및 APX가 엽록체에 동시에 발현된 형질전환 감자 식물체는 MV에 의해 유도된 산화스트레스에 대해 내성이 증가되었음을 의미한다. 상기 도 4에서는 NT: 비-형질전환 식물체, 및 SSA: pSSA-K 벡터가 도입된 식물체이다.

<4-1-2> 감자 식물체의 산화스트레스에 대한 내성 특성

식물체 수준에서 산화스트레스에 대한 내성 특성을 확인하기 위하여, 온실에서 4주 동안 생육한 NT 식물체, EV 식물체(pCAMBIA2300 벡터가 도입된 식물체), 및 SSA 식물체에 0, 150, 200 및 250 μM MV 용액(0.1% 트윈 20을 포함함) 70 ㎖를 분무부스(spray booth, Model SB-6, DeVries Manufacturing, Hollandale, MN)를 이용하여 분사하였다. MV 분사 5일 후에 식물체 잎에 나타나는 가시적인 손상(visual damage) 정도를 조사한 결과, 150 μM MV를 분사시켰을 경우 NT 식물체, EV 식물체 및 SN 식물체 잎의 일부분이 고사되었지만, SSA 식물체는 거의 손상되지 않았다. NT 식물체 및 EV 식물체의 잎은 MV 농도가 증가할수록 손상 정도가 증가하였으며, 250 μM 농도에서는 90% 이상의 손상을 입었지만, SSA 식물체는 일부분만이 손상을 입었다(도 5). 상기 도 5에서 NT: 비-형질전환체, EV: pCAMBIA2300 벡터가 도입된 식물체, 및 SSA: pSSA-K 벡터가 도입된 감자 식물체이다.

또한, 가시적인 손상율, 잎의 건중량 및 엽록소 함량을 측정함으로써 SSA 식물체의 MV에 대한 내성 정도를 분석하였다. NT 식물체 및 EV 식물체의 잎에 150 μM MV를 각각 분사하는 경우에 각각의 식물체의 잎은 20 내지 40% 정도의 손상을 입었지만, SSA 식물체는 20% 미만의 손상을 입은 것으로 나타났다(도 6a). 또한 MV 처리 결과 NT 식물체 및 EV 식물체에서 살아남은 건전한 잎 건중량은 MV 농도가 증가할수록 감소하여 250 μM MV 처리시 무처리에 비해 50% 감소한 반면(도 6b), 형질전환체의 경우 MV 처리 후에 살아남은 잎의 건중량은 MV 농도에 관계없이 무처리군의 잎의 건중량과 비슷하였다. 또한, 엽록소 함량은 잎의 건중량과 비슷한 경향은 보였으며 무처리군의 식물체 및 MV 처리구의 형질전환 식물체의 엽록소 함량은 40 mg/cm²이었다(도 6c). 상기 도 6a 내지 도 6c에서 NT: 비-형질전환체, EV: pCAMBIA2300 벡터가 도입된 식물체, 및 SSA: pSSA-K 벡터가 도입된 감자 식물체이다.

<4-1-3> 고구마 식물체 잎 절편체의 산화스트레스에 대한 내성 특성

SSA 형질전환 고구마(품종: 율미) 식물체의 산화스트레스에 대한 내성을 조사하기 위하여 비-형질전환 식물체(NT 식물체) 및 SSA 식물체를 각각 3개씩 온실에서 생육하였다. 생육 8주 된 식물체의 잎(상부로부터 3 내지 4번째 잎)에서 지름 8 ㎜인 10개의 잎 절편체를 취하여 0, 2.5, 5 및 10 μM의 메틸 비올로겐(methyl viologen, MV)에서 실시예 <4-1-1>과 동일한 방식으로 MV를 처리한 후 각각의 농도의 MV에 대한 잎 절편체의 손상 정도를 측정하였다(도 7). SSA 식물체의 잎 절편체를 포함하는 용액의 전기 전도도는 NT 식물체의 전기 전도도에 비해 매우 낮았다. NT 식물체의 잎 절편체는 MV 처리 12시간 이후부터 50% 이상의 가시적인 손상이 나타났지만, SSA 식물체의 잎 절편체는 30% 이하의 가시적인 손상을 입었다. 특히, 5 μM MV 처리시 SSA 식물체는 NT 식물체에 비해 45% 정도의 가시적인 손상을 입은 것으로 나타났다. 상기 도 7에서 NT: 비-형질전환 식물체, 및 SSA: pSSA-K 벡터가 도입된 고구마 식물체이다.

<4-1-4> 고구마 식물체의 산화스트레스에 대한 내성 특성

고구마 식물체 수준에서 산화스트레스에 대한 내성 특성을 확인하기 위하여, 온실에서 4주 동안 생육한 NT 식물체 및 SSA 식물체에 0, 100, 150 및 200 μM MV 용액(0.1% 트윈 20을 포함함) 70 ㎖를 실시예 <4-1-2>에 개시된 방법에 따라 수행하였다. MV 분사 5일 후에 식물체 잎에 나타나는 가시적인 손상(visual damage) 정도를 조사한 결과, 100 내지 150 μM MV를 분사시켰을 경우 NT 식물체의 잎은 백화 현상이 뚜렷하게 나타나 고사하였지만, SSA 식물체의 잎은 부분적으로 손상을 입었다. 그러나 200 μM 농도로 처리되었을 경우에 NT 식물체는 거의 고사하였지만, SSA 식물체는 잎의 일부분에서만 백화 현상이 관찰되었다(도 8). 상기 도 8에서 NT: 비-형질전환체, EV: pCAMBIA2300 벡터가 도입된 고구마 식물체, 및 SSA: pSSA-K 벡터가 도입된 고구마 식물체이다.

또한, 광합성효율, 잎의 건중량 및 가시적인 잎의 손상율을 측정함으로써 SSA 식물체의 MV에 대한 내성 정도를 분석하였다. 광합성효율은 MV 처리 2일 후에 식물체의 상부로부터 3번째 잎에서 측정하였다. 100 μM MV를 분사하였을 경우에 NT 식물체 및 SSA 식물체의 광합성효율은 MV 처리 전에 비해 약간 감소하여 0.7로 나타났으며(도 9a), 150 μM 및 200 μM MV를 처리하였을 경우에 광합성효율은 0.4 이상으로 NT 식물체에 비해 2배 이상 내성이 증가하였음을 알 수 있었다. 또한, MV 처리 5일 후에 식물체의 건중량을 조사한 결과, MV 처리 전에 NT 식물체 및 SSA 식물체의 건중량은 약 400 ㎎이었지만, MV 처리 후에는 NT 식물체 잎의 건중량은 MV 농도가 증가할수록 감소하여 200 μM MV 처리군은 MV 무처리군에 비해 90% 감소하였지만, SSA 식물체는 60% 정도 감소하여 NT 식물체에 비해 3배 정도 높은 내성을 나타냈다(도 9b). 또한, MV 처리 5일 후에 식물체의 가시적인 손상을 조사한 결과, 100 μM 농도에서는 식물체의 가시적인 손상 정도가 별로 큰 차이를 나타내지 않았으며, 200 μM 농도에서는 NT 식물체의 잎은 85% 정도 손상을 입었지만, SSA 식물체는 40% 미만으로 손상을 입어 NT에 비해 SSA 식물체가 MV에 대해 2배 이상 내성이 증가하였음을 보여주었다(도 9c). 상기 도 9a 내지 도 9c에서 NT: 비-형질전환체, EV: pCAMBIA2300 벡터가 도입된 고구마 식물체, 및 SSA: pSSA-K 벡터가 도입된 고구마 식물체이다.

<4-2> 온도 스트레스에 대한 내성 특성

<4-2-1> 감자 식물체 잎 절편체의 고온 스트레스에 대한 내성 특성

SSA 형질전환 감자(품종: 대서) 식물체의 고온 스트레스에 대한 내성 특성을 조사하기 위하여 NT 식물체(비-형질전환 식물체) 및 SSA 식물체를 온실에서 생육하였다. 생육 7주 된 식물체의 잎(상부로부터 5 내지 7번째의 잎)에서 지름 8 ㎜인 10개의 잎 절편체를 취하여 0.4 M 소비톨 용액 5 ㎖에 각각 띄우고, 37℃의 연속광하에서 60시간 동안 배양하였으며, 대조군은 배양 온도가 25℃인 것을 제외하고 동일한 조건하에서 배양하였다. 용액의 이온 전도도는 MV 처리시와 동일한 방식으로 12시간 간격으로 측정하여 잎의 손상 정도를 조사하였다. 고온 스트레스를 가하지 않은 경우(25℃ 처리군) NT 식물체 및 SN 식물체의 이온 전도도는 60시간까지 거의 일정하게 유지되었지만(도 10a), 37℃의 스트레스를 가하는 경우에 SSA 식물체는 NT 식물체에 비해 뚜렷한 내성을 나타냈다(도 10b). SSA 식물체의 내성은 고온 처리 12시간 이후부터 조금씩 나타나기 시작하여 36시간 및 48시간 이후에는 각각 42% 및 52% 정도로 낮은 이온 전도도를 나타냈으며, 60시간 후에는 2배 이상의 높은 내성을 나타냈다. 상기 도 10a 및 도 10b에서 NT: 비-형질전환 식물체, 및 SSA: pSSA-K 벡터가 도입된 식물체이다.

<4-2-2> 감자 식물체의 고온 스트레스에 대한 내성 특성

형질전환 감자(품종: 대서) 식물체의 고온 스트레스에 대한 내성 특성을 확인하기 위하여 온실에서 4주 동안 생육한 감자(품종: 대서)의 NT 식물체, EV 식물체 및 SSA 식물체를 42℃에 10시간 동안 노출시킨 결과, NT 식물체 및 EV 식물체는 시들었지만, SSA 식물체는 시들지 않고 건강한 상태를 유지하였다(도 11a). 고온 처리 전과 처리 후의 광합성효율을 비교한 결과, 고온 처리 10 및 20시간 후에 NT 식물체의 광합성효율은 각각 15% 및 30% 정도로 감소하였지만, SSA 식물체는 고온 처리 20시간 후에도 6% 정도 감소하였다(도 11b). 또한, 고온 처리 후에 25℃로 3시간 동안 회복시킨 결과, NT 식물체 및 EV 식물체의 광합성효율은 약 50% 정도로 고온 처리 전의 상태로 회복되었지만, SSA 식물체는 고온 처리 전의 상태로 거의 회복되었음을 나타냈다. 상기 도 11a 및 도 11b에서 NT: 비-형질전환체, EV: pCAMBIA2300 벡터가 도입된 식물체, 및 SSA: pSSA-K 벡터가 도입된 식물체이다.

<4-2-3> 고구마 식물체의 저온 스트레스에 대한 내성 특성

형질전환 고구마(품종: 율미) 식물체의 저온 스트레스에 대한 내성 특성을 확인하기 위하여 온실에서 4주 동안 생육한 NT 식물체 및 SSA 식물체를 4℃에 24시간 동안 노출시킨 결과, NT 식물체는 시들었지만, SSA 식물체는 시들지 않고 건강한 상태를 유지하였다(도 12a). 또한, 저온 처리 24시간 후에 25℃로 12시간 동안 회복시킨 결과, NT 식물체는 가시적인 손상의 회복 정도가 약하여 시든 상태를 유지하였지만, SSA 식물체는 거의 회복되어 저온 처리 전과 비슷한 상태를 유지하였다(도 12b). 저온 처리 전의 NT 식물체 및 SSA 식물체의 광합성효율은 모두 0.8이었으며, 저온 처리 6시간 후에는 저온 처리전과 비슷한 값은 유지하였지만, 처리 시간이 경과함에 따라 광합성률이 감소하여 24시간 후에는 NT 식물체의 경우에 광합성효율이 30% 이상 감소하였고, SSA 식물체는 20% 미만으로 감소하였다. 24시간 동안 저온 처리한 후에 25℃에서 12시간 동안 회복시킨 후 광합성효율을 다시 조사한 결과, NT 식물체는 회복 이후에도 광합성효율이 60%로 감소된 상태를 유지하였지만, SSA 식물체는 식물체 개체간의 차이가 존재하였지만 저온 처리전과 비슷한 정도로 광합성효율이 회복되었다(도 12c). 상기 도 12a 내지 도 12c에서 NT: 비-형질전환 고구마 식물체, 및 SSA4 및 SSA7: pSSA-K 벡터가 도입된 식물체이다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 복합스트레스 내성 식물체 제조용 재조합 발현벡터로 형질전환된 식물체는 제초제, 냉해, 염해 또는 활성 산소를 유발시키는 다양한 환경오염에 의한 스트레스에 대해 강한 내성을 나타내므로, 농작물의 생산성 증대 또는 유용성분의 대량생산 등에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1a 및 도 1b는 본 발명의 SOD(superoxide dismutase)와 APX(ascorbate peroxidase) 유전자를 동시에 발현시키는 벡터의 제조과정(a) 및 상기 유전자를 포함하는 복합스트레스 내성 식물체 제조용 재조합 발현벡터(b)를 나타낸 모식도이고,

도 2a는 본 발명의 복합스트레스 내성 식물체 제조용 재조합 발현벡터(pSSA-K 벡터)를 이용하여 제조된 카나마이신 내성의 형질전환 감자(품종: 수미)를 조직배양함으로써 재분화시킨 식물체의 각 기관의 형태를 나타낸 사진이고,

도 2b는 서열번호 1 및 서열번호 2로 기재되는 프라이머를 이용한 PCR을 통해 본 발명의 발현벡터(pSSA-K 벡터)로 형질전환된 감자 식물체에서 SWPA2 프로모터의 증폭을 확인한 전기영동 사진이고,

도 2c는 본 발명의 발현벡터(pSSA-K 벡터)를 이용하여 제조된 형질전환 감자 식물체의 게놈(genome) 상에 SOD 및 APX 유전자가 존재함을 확인한 서던블럿(Southern blot) 사진이고,

도 3a는 본 발명의 발현벡터(pSSA-K 벡터)를 이용하여 제조된 카나마이신 내성의 형질전환 고구마(품종: 율미)를 조직배양함으로써 재분화시킨 식물체의 각 기관의 형태를 나타낸 사진이고,

도 3b는 서열번호 1 및 서열번호 2로 기재되는 프라이머를 이용한 PCR을 통해 본 발명의 발현벡터(pSSA-K 벡터)로 형질전환된 고구마 식물체에서 SWPA2 프로모터의 증폭을 확인한 전기영동 사진이고,

도 3c는 본 발명의 발현벡터(pSSA-K 벡터)를 이용하여 제조된 형질전환 고구마 식물체의 게놈(genome) 상에 SOD 및 APX 유전자가 존재함을 확인한 서던블럿(Southern blot) 사진이고,

도 4는 0, 3, 5 및 10 μM 농도의 메틸 비올로겐(methyl viologen, MV)용액에서 48시간 동안 처리한 후의 용액의 이온 전도도를 측정하여 NT 식물체 및 SN 식물체의 잎 절편체에서의 막 손상율을 조사한 것이고,

도 5는 0, 150, 200 및 250 μM MV 용액을 분사한지 5일 후의 감자 식물체의 MV에 대한 내성 사진을 나타낸 것이고,

도 6은 0, 150, 200 및 250 μM MV 용액을 분사한지 5일 후의 감자 식물체의 가시적인 잎 손상(A), 살아남은 잎의 상대적인 건중량(B), 및 엽록소 함량(C)을 나타낸 것이고,

도 7은 0, 2.5, 5 및 10 μM 농도의 메틸 비올로겐 용액에서 72시간 동안 처리한 후의 용액의 이온 전도도를 측정하여 NT 식물체 및 SSA 식물체의 고구마 잎 절편체에서의 막 손상율을 조사한 것이고,

도 8은 0, 100, 150 및 200 μM MV 용액을 분사한지 3일 후의 감자 식물체의 MV에 대한 내성 사진을 나타낸 것이고,

도 9는 0, 100, 150 및 200 μM MV 용액을 분사한지 3일 후의 감자 식물체의 광합성효율(A), 살아남은 잎의 상대적인 건중량(B), 및 잎의 가시적인 손상 정도(C)를 나타낸 것이고,

도 10은 감자 식물체 잎 절편체(leaf disc)의 고온 스트레스에 대한 내성 특성을 분석한 것으로, 25℃(A) 및 37℃(B)에서 60시간 동안 처리하여 막의 이온 전도도로 나타낸 것이고,

도 11a 및 도 11b는 감자 식물체의 고온 스트레스에 대한 내성 특성을 분석한 것으로, 37℃에서 10 시간 동안 처리한 후의 가시적인 식물체 손상(a), 및 42℃에서 10 시간 및 20 시간 동안 처리한 후의 광합성효율(b)을 나타낸 것이고,

도 12a 내지 도 12c는 고구마 식물체의 저온 스트레스에 대한 내성 특성을 분석한 것으로, 4℃에서 24시간 동안 처리한 후의 가시적인 식물체 손상(A), 4℃에서 24 시간 후에 25℃에서 12 시간 동안 회복시킨 식물체의 사진(B), 및 4℃에서 24시간의 저온 처리 기간 및 25℃에서 12시간의 회복 후의 광합성효율(C)을 나타낸 것이다.

<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY <120> RECOMBINANT EXPRESSION VECTOR FOR PRODUCTION OF PLANTS HAVING MULTIPLE STRESS TOLERANCES, AND METHOD FOR PREPARING MULTIPLE STRESS-TOLERANT PLANTS USING THE SAME <160> 13 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of SWPA2 promoter <400> 1 ttaaagcttc catgatcaga tcgata 26 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> backward primer of SWPA2 promoter <400> 2 cgggtctaga ggtcaaagga aaat 24 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of mSOD1 gene <400> 3 gtcgacgtga aggctgaa 18 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> backward primer of mSOD1 <400> 4 gagctctatc ctcgcaaacc 20 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of specific SWPA2-1 <400> 5 atttatcggc aaggaggagg ta 22 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> backward primer of specific SWPA2-1 <400> 6 cccggtgagg tgatttgaa 19 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of specific SWPA2-2 <400> 7 caccaagtac ccaaaccctc tatt 24 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> backward primer of specific SWPA2-2 <400> 8 gttggcgtga ccgtacatta ttg 23 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of specific APX <400> 9 ttcggaacaa ttaagcacca a 21 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> backward primer of specific APX <400> 10 aagagggcgg aatacagagt cagt 24 <210> 11 <211> 1325 <212> DNA <213> Ipomoea batatas <400> 11 aagcttccat gatcagatcg ataataccaa atggtaccac ctaactaggt gatatatatt 60 atgtatgtca ttattttaaa ctgtattaca aagactattt tttcattaat tggtacaaag 120 aaaaattaaa cagaaaagaa aggaaaaaat gactcaccac ctagcaccta gacacctaga 180 caccaagtac ccaaaccctc tattttcaac atctattttc agatgtaaat atgagttgga 240 cgaagaaggt gttagcaatt atttgattaa tcttgctacg ataattatga tccactcact 300 tagtcatttt tttcagacca agacaactag cttgagtttt ttattgtatg tggtcggaac 360 gttttttgta attaaaaaaa taaaagttgc atcattatat atggtagatt aagtaattga 420 tcaatcaacg tttaattttg catttatcgg caaggtggag gttccaactt ccagtcgaac 480 ttagagagtc attggagacc ttgaccagtt aactagcggt gtcgaaaacc tgcacaactt 540 gagatttaat tgcatacctt ttatatatga cgcgttttat ttttttttcc tagaaaataa 600 tttggaagaa aataagaata tgtattctgt gaaagctagg ccaaaacgaa tgtcttttcg 660 tcgttttcgt taaaggttta gatcatattt catctggtcc aacactcaaa cttgtataat 720 ggacgaatta ttagtcattt tagacctacc ggctagcgcg acttttttgt tttccataaa 780 gattcgataa ttgcatggcc agatgcaaag tttgaaattt aatgtttgcc aaatcctatc 840 atacaccaca acacatgtct cagggccaag tggcaccagc aaacattcct gtcataatta 900 atttttttaa tgagaaggag gaaactcaca gctattactc gaaggtatat aatattgagt 960 aaatcttact ttgtgattct agttgacaaa acaccgcaag ataaactata ctaagttcaa 1020 atcacctcac cgggttggct cagattggtt ttttcaatac aagagggggt gtgaactccc 1080 gtgccgacct cttttgaggg acaataatgt acggtcacgc caacctagct tgattttttc 1140 tgacaaatat attactacat atattacacg gtcaaataat taatcaaaaa ataaaaaaag 1200 accccaatta aagtccccaa ccactctcaa atattctatt taagggaaac cttagaggca 1260 attcatgcat cctcaacccc ttcttcttca ttttcttaat cttacatttt cctttgaccc 1320 tcgag 1325 <210> 12 <211> 801 <212> DNA <213> Manihot esculenta <400> 12 tctcgatctt ctctgtctaa gctctaaagg ggtgctctga gatcacgtaa aacaatggtg 60 aaggctgaag ctgttcttac cagtagtgag ggggttagcg gaacaatctt ctttacccaa 120 gaaggagatg gtcctaccac tgtaactgga aacatttccg gccttaagcc agggcttcat 180 gggttccacg tccatgccct tggagacaca acaaacggtt gcatgtcaac tgggccacac 240 tttaaccctt ctggcaaaga tcatggtgcc cctgaggatg agattcgtca tgctggtgat 300 ctgggaaatg tcactgctgg tgatgatggc actgctagtt tcacaattat tgacaagcat 360 attcctcttt ctggtcaaaa ttcaatcata ggaagggcag ttgttgttca tgcagatcct 420 gatgatcttg gcaggggagg acatgaactc agtaaaacca ccggaaatgc tggtggcaga 480 gtagcatgcg gtattattgg tttgcgagga tagagtgctt ctccagagat caataacaag 540 acaaagacag ctgaaacatg cacagccgga caacctttag aagaacgtta ggagaccatt 600 aactcatttg aataaaagaa agaataatac tgtagttttg gctggtttgg tcttgtgatc 660 tcaagatggt gtatgctttg tatggtttcg tgaagtttat tgaactttga actttttcga 720 atggtagggc ttgctctttg tctggtccaa attcaggccg tggatgtttt atactgcttt 780 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 801 <210> 13 <211> 1054 <212> DNA <213> Pisum sativum <400> 13 gaattcggct tgtgctctcc tcgtgtcact agggtttaac ttcttcgttt ttgcttctta 60 gatttcgaga atcgtttgct atgggaaaat cttacccaac tgttagtccc gattaccaga 120 aggccattga aaaggctaag aggaagctca gaggttttat cgctgagaag aaatgcgctc 180 ctctaattct ccgtttggca tggcactctg ctggtacttt tgattccaag acaaagactg 240 gtggtccttt cggaacaatt aagcaccaag ctgagcttgc tcatggtgct aacaacggtc 300 ttgatatcgc ggttaggctg ttggagccta ttaaggagca attccctatt gtgagctatg 360 ctgatttcta ccagttggct ggtgttgttg ctgttgagat taccggtgga cctgaagttc 420 ctttccaccc tggtagggag gacaagcctg agccaccacc tgagggtcgc ttgcctgatg 480 ccactaaggg ttctgaccat ttgagggatg tgtttggaaa ggctatgggg cttagtgatc 540 aggacattgt tgctctatct ggtggtcaca ccattggagc tgcacacaag gagcgttctg 600 gatttgaggg accatggact tctaatcctc tcatttttga caactcatat ttcactgagt 660 tgttgactgg tgagaaggat ggccttcttc agttgccaag tgataaggca cttttgactg 720 actctgtatt ccgccctctt gttgagaaat atgctgcgga tgaagatgtt ttctttgctg 780 attatgctga agcacatctt aagctctctg agcttggatt tgctgaagcc taagtcacag 840 ttgtttggtg tttagagagg agcactgtcc tgaatcttac ataaatttca tagacgttgc 900 ttttattttc aatgtgattc atcttagttg ggtagcattt tggatgtatt ttggaagttt 960 gattgttttc tctattgttg atccttggtt aaataacatt gttaagtggt aatgcccagc 1020 tattgcattt tcctgataaa aaaaaaaccg aatt 1054

Claims (11)

1. 산화스트레스 유도성 퍼옥시다제 프로모터, 산화스트레스 유도성 퍼옥시다제 프로모터의 하류에 위치하는 복합스트레스 내성 유전자, 항생제 내성 유전자, 담배 식각 바이러스(tobacco etch virus, TEV) 선도서열, CaMV 35S 전사 종결서열(transcription terminator) 및 T-보더 서열(boarder sequence)을 포함하는 복합스트레스 내성 식물체 제조용 재조합 발현벡터.
2. 제 1 항에 있어서,

   상기 산화스트레스 유도성 퍼옥시다제 프로모터는 서열번호 11로 기재되는 SWPA2(sweetpotato peroxidase anionic 2)의 염기서열인 것을 특징으로 하는 발현벡터.
3. 제 1 항에 있어서,

   상기 복합스트레스 내성 유전자는 서열번호 12로 기재되는 수퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase, SOD) 유전자 및 서열번호 13으로 기재되는 아스코베이트 퍼옥시다제(ascobate peroxidase, APX) 유전자인 것을 특징으로 하는 발현벡터.
4. 제 1 항에 있어서,

   pSSA-K(수탁번호: KCTC10536BP) 또는 pSSA-H(수탁번호: KCTC10537BP) 벡터인 것을 특징으로 하는 발현벡터.
5. 제 1 항의 발현벡터로 형질전환된 식물체.
6. 제 5 항에 있어서,

   상기 형질전환된 식물체는 감자 또는 고구마인 것을 특징으로 하는 식물체.
7. ⅰ) SWPA2 프로모터, SOD 유전자 및 APX 유전자를 포함하는 식물 형질전환용 발현벡터를 제조하는 단계;

   ⅱ) 상기 발현벡터를 식물체 또는 배양세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계;

   iii) 상기 형질전환체를 배양하는 단계; 및

   iⅴ) 상기 형질전환체를 조직배양으로 재분화시켜 형질전환된 식물체를 제조하는 단계를 포함하는 복합스트레스 내성의 형질전환 식물체의 제조방법.
8. 제 7 항에 있어서,

   상기 발현벡터는 제 1 항의 pSSA-K 또는 pSSA-H 발현벡터인 것을 특징으로 하는 제조방법.
9. 제 7 항에 있어서,

   상기 식물체 또는 배양세포는 감자 또는 고구마인 것을 특징으로 하는 제조방법.
10. 제 7 항에 있어서,

    상기 단계 ii)에서 상기 형질전환체는 입자 충격(particle bombardment) 방법으로 제조되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
11. 제 7 항에 있어서,

    상기 단계 ii)는

    ⅰ) 발현벡터를 아그로박테리아(Agrobacteria)에 도입하는 단계; 및

    ⅱ) 상기 아그로박테리아를 식물체 캘러스(callus) 또는 배양세포와 공동배양하는 형질전환체를 제조하는 단계인 것을 특징으로 하는 제조방법.