ES2407857T3 - Nuevo gen de resistencia a los herbicidas - Google Patents

Abstract

Método para controlar al menos una mala hierba en una zona, en el que dicha zona comprende al menos unaplanta transgénica, comprendiendo dicha planta transgénica un polinucleótido aislado que codifica una proteína quedegrada enzimáticamente un herbicida seleccionado de entre el grupo constituido por un herbicida fenoxi auxina yun herbicida ariloxifenoxipropionato, en el que dicho polinucleótido se hibrida en condiciones restrictivas con elcomplemento completo de una molécula de ácido nucleico que codifica la SEC ID nº 9, en el que dicha plantaexpresa dicho nucleótido y produce dicha proteína, en el que dicho método comprende la aplicación de dichoherbicida en dicha zona.

Description

Nuevo gen de resistencia a los herbicidas.

5 Antecedentes de la invención Las malas hierbas pueden agotar rapidamente los nutrientes valiosos para el suelo necesarios para los cultivos y otras plantas deseadas. Existen muchos tipos diferentes de herbicidas utilizados actualmente para el control de las malas hierbas. Un herbicida muy popular es el gliofosfato. 0iversos cultivos como el maiz, soja, canola, algodon, remolacha azucarera, trigo, arroz y cesped, han sido desarrollados para convertirlos en resistentes al glifosato. Asi, por ejemplo, es posible sembrar los campos con maiz resistente al glifosato para mantener a raya las malas hierbas sin causar daros importantes a las plantas de maiz.

15 A mediados de los aros 90, debido a las tecnicas de ingenieria genetica surgieron los cultivos tolerantes al glifosato (GTC): con ellos los cultivadores tuvieron a su disposicion una herramienta sencilla, comoda, flexible y asequible para controlar una amplia gama de malas hierbas latifolias y gramineas, nunca vista en agricultura. Los productores adoptaron rapidamente los GTC y, en muchos casos, abandonaron muchas de las mejores practicas agronomicas como la rotacion de cultivos, la rotacion en el mecanismo de accion del herbicida, el uso de mezclas en tanque y la incorporacion del control mecanico al control de las malas hierbas por medios quimicos y culturales. En la actualidad, en Estados Unidos y en otros paises del hemisferio occidental se pueden adquirir variedades comerciales tolerantes al glifosato de soja, algodon, maiz y canola, y otros cultivos GTC (trigo, arroz, remolacha azucarera, cesped, etc.) permanecen sin comercializar a la espera de ganar aceptacion en el mercado mundial. Muchas otras especies resistentes al glifosato se encuentran en fase de experimentacion o desarrollo (entre otras,

25 alfalfa, cara de azucar, girasol, remolachas, guisantes, zanahoria, pepino, lechuga, cebolla, fresa, tomate y tabaco; especies forestales como el chopo y el arbol del ambar; y especies de horticultura ornamental como tagetes, petunias y begonias. Vease el sitio web isb.vt.edu/cfdocs/fieldtests1.cfm, 2005). Por si todo esto no bastara, el coste del glifosato ha disminuido drasticamente en los ultimos aros, hasta el punto de que son muy pocos los programas convencionales para el control de las malas hierbas que pueden competir en precio y rendimiento con los sistemas de GTC basados en el glifosato. El glifosato es utilizado con exito desde hace mas de 15 aros en el desherbado quimico de los campos y en otras aplicaciones no agricolas como medio de control total de la vegetacion. En muchos casos, como sucede con los GTC, ha sido utilizado 1-3 veces al aro durante 3, 5, 10 y hasta 15 aros seguidos. Tal proceder ha propiciado una

35 excesiva dependencia del glifosato y de la tecnologia de GTC que ha generado una gran presion selectiva en la flora arvense autoctona en favor de las plantas que de forma natural son mas tolerantes a el o que han logrado desarrollar un mecanismo de resistencia a su accion herbicida. El uso generalizado de los programas de control de malas hierbas basados exclusivamente en el glifosato esta provocando la seleccion de variedades resistentes al mismo y facilitando la propagacion de las malezas que son mas tolerantes que la mayoria de las especies diana; en otras palabras, esta generando cambios en la flora arvense. (Ng et al., 2003; Simarmata et al., 2003; Lorraine-Colwill et al., 2003; Sfiligoj, 2004; Miller et al., 2003; Heap, 2005; Murphy et al., 2002; Martin et al., 2002). Con todo, a pesar del amplio uso del glifosato en todo el mundo durante mas de 15 aros, hasta el momento son contadas las malas hierbas en las que se ha detectado resistencia (Heap,

45 2005); la mayoria de casos se han descubierto durante los ultimos 3-5 aros. Entre las malas hierbas resistentes se encuentran tanto gramineas como latifolias: Lolium rigidum, Lolium multiflorum, Eleusine indica, Ambrosia artemisiifolia, Conyza canadensis, Conyza bonariensis y Plantago lanceolata. Asimismo, malezas que no habian supuesto problema alguno hasta el uso generalizado de los GTC estan adquiriendo cada vez mas prevalencia y resultan mas dificiles de controlar en el contexto de los GTC, que abarca mas del 80% de la superficie cultivada de algodon y soja en Estados Unidos y mas del 20% de la superficie dedicada al maiz en ese mismo pais (Gianessi, 2005). Tales cambios en la flora arvense ataren predominantemente, aunque no en exclusiva, a especies latifolias de dificil control como por ejemplo Ipomoea, Amaranthus, Chenopodium, Taraxacum y Commelina. En aquellas zonas donde los cultivadores se enfrentan a malas hierbas resistentes al glifosato o a un cambio en la

55 flora arvense favorable a las especies de mas dificil control, es posible compensar la perdida de eficacia del glifosato mezclandolo en el tanque o alternandolo con otros herbicidas capaces de controlar las malas hierbas "descarriadas". Un compatible en tanque eficaz y muy utilizado para el control de las latifolias recalcitrantes es el acido 2,4diclorofenoxiacetico (2,4-0). El 2,4-0 se emplea desde hace mas de 60 aros en agricultura y en otras disciplinas como herbicida de amplio espectro contra las malas hierbas latifolias y, a pesar de que se han descrito casos esporadicos de tolerancia, sigue siendo uno de los herbicidas mas utilizados en el mundo. No obstante, una desventaja que limita su uso es su escasa selectividad en cultivos de dicotiledoneas como la soja o el algodon, motivo por el cual no suele aplicarse a cultivos de dicotiledoneas sensibles, ni siquiera en las proximidades de los mismos. Por otra parte, su empleo en los cultivos de cereales se ve limitado por la naturaleza de los daros que puede ocasionar. La combinacion de 2,4-0 y glifosato ha sido utilizada como un potente tratamiento de desherbado

65 quimico antes de la siembra sin laboreo de la soja y el algodon, aunque debido a la sensibilidad de ambas

dicotiledoneas al 2,4-0, este tipo de tratamientos debe ser aplicado al menos entre 14 y 30 dias antes de la plantacion (Agriliance, 2003).

El 2,4-0 pertenece a los herbicidas derivados del acido fenoxi, como MCPA, mecoprop y diclorprop. Ha sido utilizado en muchos cultivos de monocotiledoneas (maiz, trigo y arroz, entre otros) para el control selectivo de las malas hierbas de hoja ancha sin darar gravemente a las plantas del cultivo. El 2,4-0 es un derivado auxinico sintetico que actua desregulando la homeostasis normal entre la celula y las hormonas e impide un crecimiento equilibrado y controlado; su mecanismo de accion no se conoce con exactitud.

El 2,4-0 presenta diferentes grados de selectividad en ciertas plantas, de tal modo que las dicotiledoneas son mas sensibles a el que las gramineas. Las diferencias en el metabolismo del 2,4-0 entre plantas distintas explican en parte los grados de selectividad. En general, las plantas lo metabolizan lentamente, de modo que las diferencias observadas en la respuesta de las plantas al mismo probablemente puedan explicarse por la actividad sobre el o los sitios diana ((SSA, 2002). La metabolizacion del 2,4-0 en la planta suele acaecer en dos fases: hidroxilacion seguida de la conjugacion con aminoacidos o glucosa ((SSA, 2002).

Con el paso del tiempo, los microbios del suelo han desarrollado una via alternativa y eficaz para degradar el 2,4-0, lo que desemboca en la completa mineralizacion de este xenobiotico. Las reiteradas aplicaciones del herbicida seleccionan a los microbios que son capaces de emplearlo como fuente de carbono para crecer, atributo que les confiere una ventaja competitiva en el suelo. Por esta razon, actualmente el 2,4-0 se formula para tener una vida media relativamente breve en el suelo, sin que se hayan detectado efectos residuales destacables en los cultivos ulteriores. Ello supone una ventaja aradida a su accion herbicida.

Un microorganismo ampliamente estudiado por su capacidad para degradar el 2,4-0 es Ralstonia eutropha (Streber et al., 1987). El gen que codifica a la responsable de la primera reaccion enzimatica en la via de mineralizacion del 2,4-0 es el tfdA. Vease la patente US n° 6.153.401 y el N.° de entrada M16730 del Genbank. El tfdA cataliza la transformacion del acido 2,4-0 en diclorofenol (0CP) a traves de una reaccion mediada por una dioxigenasa dependiente de a-cetoglutarato (Smejkal et al., 2001). El 0CP posee una escasa actividad herbicida en comparacion con el 2,4-0. El gen tfdA se ha insertado en dicotiledoneas sensibles (por ejemplo, algodon y tabaco) para crear plantas transgenicas resistentes al 2,4-0 (Streber et al. (1989), Lyon et al. (1989), Lyon (1993) y patente US n° 5.608.147).

En el medio ambiente se ha identificado un gran numero de genes de tipo tfdA que codifican proteinas capaces de degradar el 2,4-0 y que figuran depositados en la base de datos Genbank. Muchos homologos son similares al tfdA (identidad de aminoacidos >85%) y poseen propiedades enzimaticas semejantes a las de dicho gen. Con todo, existen ciertos homologos que guardan una identidad notablemente menor con el tfdA (del 25-50%), pero que a pesar de ello poseen los residuos caracteristicos vinculados a las a-cetoglutarato dioxigenasas y las Fe+2 dioxigenasas. Por tanto, no es evidente cuales son las especificidades de sustrato de estas dioxigenasas divergentes.

Un ejemplo unico de escasa homologia con el tfdA (identidad de aminoacidos del 28%) es el gen rdpA de Sphingobium herbicidovorans (Kohler et al., 1999, (estendorf et al., 2002). Esta enzima cataliza la primera reaccion del proceso de mineralizacion del (R)-diclorprop (y de otros acidos (R)-fenoxipropionicos) asi como del 2,4-0 (un acido fenoxiacetico) ((estendorf et al., 2003). Las secuencias del gen rdpA bacteriano ha sido publicado con los n° de acceso de Genebank AJ628859, AF516751 Y AF516752. 0esde hace tiempo se conocen microorganismos que degradan el acido fenoxipropionico, pero hasta hace poco no se habia progresado en la caracterizacion de esta ruta (Horvath et al., 1990). Otra complicacion que aradir a la degradacion del diclorprop es la estereospecificidad (R frente a S) que afecta tanto a su captacion (Kohler, 1999) como a su oxidacion inicial ((estendorf et al., 2003). La expresion heterologa del rdpA en otros microbios o su transformacion en plantas permanecen ineditas hasta el momento. La bibliografia se ha centrado sobre todo en los homologos cercanos al tfdA que degradan fundamentalmente los acidos fenoxiaceticos aquirales como el 2,4-0.

El desarrollo de nuevas tecnicas de cultivos tolerantes a herbicidas (HTC) ha cosechado un escaso exito sobre todo debido a la eficacia, el bajo coste y la comodidad de los GTC, cualidades que les han granjeado una enorme aceptacion entre los productores y que ofrecen pocos incentivos para el desarrollo de las nuevas tecnicas de HTC.

Las subestructuras quimicas de ariloxialcanoato son habituales en muchos herbicidas comerciales, incluidos los auxinicos fenoxi (como el 2,4-0 y el diclorprop), los auxinicos piridiloxi (como fluoroxipir y triclopir), ariloxifenoxipropionatos (AOPP), inhibidores de la acetil-coenzima A carboxilasa (ACCasa) (como haloxifop, quizalofop y diclofop) e inhibidores fenoxiacetato 5-sustituidos de la protoporfirinogeno IX oxidasa (como piraflufen y flumiclorac). No obstante, estos tipos de herbicidas son bastante distintos y la bibliografia actual no aporta indicios de que compartan una via de degradacion comun. El documento 98/02562 divulga genes quimericos que son utilizados para la generacion de resistencia de plantas a varios herbicidas que comprenden los inhibidores HPP0 y EPSPS. El descubrimiento de una enzima degradadora de herbicidas multifuncional que abarcase multiples modos de accion constituiria un caracter unico y valioso para el uso en HTC.

Breve sumario de la invención

Son proporcionadas nuevas plantas que no solo son resistentes al 2,4-0, sino tambien a los herbicidas AOPP. Hasta el momento no habia ninguna expectativa o indicio de que pudiera crearse una planta dotada de estas dos propiedades ventajosas por medio de la introduccion de un unico gen. Se incluyen asimismo unas plantas que producen una o varias enzimas de la presente invencion "apiladas" junto con uno o varios genes de resistencia a herbicidas, incluidos, entre otros, genes de resistencia al glifosato, a las imidazolinonas y al glufosinato, de tal forma que proporciona plantas tolerantes a herbicidas que son compatibles con un control de las malas hierbas mas amplio y mas potente y que ofrecen opciones para el manejo de la resistencia a los herbicidas. La presente invencion incluye ademas metodos y composiciones que utilizan homologos de los genes y de las proteinas ejemplificados en la presente memoria.

Estan previstas unas plantas monocotiledoneas y dicotiledoneas tolerantes al 2,4-0, al AOPP y a uno o mas herbicidas comerciales (como por ejemplo, glifosato, imidazolinonas, glufosinato, sulfonilureas, dicamba, bromoxinilo y otros). Tambien se revelan vectores que comprenden secuencias de acidos nucleicos responsables de dicha tolerancia a herbicidas, asi como metodos para utilizar tales plantas tolerantes y combinaciones de herbicidas para controlar las malas hierbas y prevenir los cambios en la flora arvense. La presente invencion posibilita el uso de nuevas combinaciones de herbicidas de modos igualmente novedosos. Ademas, proporciona nuevos metodos para evitar el desarrollo y controlar estirpes de malas hierbas resistentes a uno o varios herbicidas, como el glifosato. La presente invencion permite nuevos usos de nuevas combinaciones de herbicidas y cultivos, como la aplicacion en presiembra, inmediatamente antes de la siembra de las semillas, con plantas que de otro modo serian sensibles al herbicida en cuestion (como el 2,4-0).

Tambien se describe la identificacion de una enzima que no solo es capaz de degradar el 2,4-0, sino que sorprendentemente tambien posee propiedades novedosas que distinguen a dicha enzima de la presente invencion de otras proteinas tfdA conocidas hasta ahora, por ejemplo. Mas especificamente, la presente invencion se refiere al uso de una enzima que es capaz de degradar tanto el 2,4-0 como los herbicidas AOPP, de una manera enantioespecifica. Hasta el momento no se ha descrito ninguna enzima dioxigenasa dependiente de a-cetoglutarato que pueda degradar herbicidas pertenecientes a clases quimicas diferentes y que esten dotados de mecanismos de accion distintos. En la presente memoria, la enzima y el gen preferidos para el uso con arreglo a la presente invencion se denominan AA0-1 (ariloxialcanoato dioxigenasa). Este descubrimiento sumamente novedoso ofrece oportunidades para servir de base a un cultivo tolerante a herbicidas (HTC) y como un caracter de marcador seleccionable.

No existia motivacion alguna para producir plantas portadoras de un gen AAD-1 (preferiblemente un polinucleotido AAD-1 dotado de una secuencia optimizada para la expresion en uno o mas tipos de plantas, como se ejemplifica en la presente memoria) y no habia expectativas de que tales plantas pudieran producir de manera efectiva una enzima AAD-1 que las convirtiera en resistentes tanto a herbicidas derivados del acido fenoxi (como el 2,4-0) como a herbicidas AOPP (como quizalofop, haloxifop, etc.). Por tanto, la presente invencion aporta numerosas ventajas que hasta el momento no se creian posibles en la disciplina.

Asimismo, se describe la identificacion y el uso de genes que codifican enzimas ariloxialcanoato dioxigenasa capaces de degradar herbicidas auxinicos fenoxi y herbicidas ariloxifenoxipropionato. Se revelan metodos para buscar sistematicamente proteinas dotadas de esas actividades, incluida la degradacion del acido 2,4diclorofenoxiacetico, de otros herbicidas auxinicos de fenoxialcanoato y de herbicidas de ariloxifenoxipropionato mediante una enzima AAD-1 recombinante. Estan previstos asimismo unos metodos para el control de las malas hierbas que comprenden la aplicacion de uno o varios herbicidas AOPP, auxinicos fenoxi, u otros herbicidas de ariloxialcanoato a plantas portadoras de un gen AAD-1. Tambien proporciona metodos para utilizar un gen AAD-1 como un marcador seleccionable para identificar celulas vegetales y plantas enteras transformadas con AAD-1, que opcionalmente pueden incluir uno, dos o mas genes foraneos insertados simultaneamente en celulas vegetales diana. Los metodos de la presente invencion incluyen la seleccion de celulas transformadas que son resistentes a niveles apropiados de un herbicida. Ademas, se describen metodos para la preparacion de un polipeptido dotado de la actividad biologica de la ariloxialcanoato dioxigenasa mediante el cultivo de plantas y/o celulas de la presente invencion.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra un esquema general de la degradacion que sufren los herbicidas auxinicos fenoxi y AOPP por la accion de la dioxigenasa.

La figura 2 muestra la perdida de actividad herbicida de una solucion de 2,4-0 tratada con AAD-1.

La figura 3 muestra la perdida de actividad herbicida de una solucion de haloxifop tratada con AAD-1.

La figura 4 representa los fenoles previstos producidos a partir de los herbicidas representantivos catalizados mediante AA0-1..

La figura 5 muestra la produccion de 2,4-diclorofenol por la accion del AAD-1 recombinante.

Las figuras 6A y 68 muestran la produccion de fenoles por la accion del AAD-1 recombinante a partir de varios sustratos herbicidas.

La figura 7 muestra la velocidad de la reaccion catalizada por la AAD-1 en funcion de la concentracion de sustrato con cuatro sustratos herbicidas distintos.

Las figuras 8A y 88 muestran que el AAD-1 (v3) se expreso por igual en hojas de Arabidopsis de distintas edades pero siguio acumulandose durante los 25 dias del experimento. Las plantas que no fueron pulverizadas con el herbicida 2,4-0 (panel A) expresaron un poco mas de AAD-1 (v3) que las que habian sido pulverizadas (panel 8). Las barras representan la media ± EEM de 5 hojas de 5 plantas distintas, con el porcentaje de expresion de la AAD-1 (v3) normalizado para la proteina total soluble. Las barras claras representan la tercera hoja joven (N-3) recogida de la parte superior de la planta, las barras oscuras representan la quinta hoja mas vieja de la parte inferior.

Las figuras 9A, 98 y 9C muestran las lesiones sufridas por plantas de Arabidopsis tras el tratamiento con 2,4-0. Cuatro lineas distintas fueron tratadas con cuatro dosis distintas de 2,4-0 y los daros causados se evaluaron 4 (panel A) y 14 (panel 8) dias despues del tratamiento. Tambien se determino la expresion de la AAD-1 (v3) en las hojas con ensayos ELISA (panel C). Los resultados corresponden a la media ± EEM de cinco hojas extraidas de cinco plantas distintas que recibieron el mismo tratamiento.

La figura 10 ilustra que las plantas de Arabidopsis transformadas con p0A83230 (AAD-1 + EPSPS) muestran un nivel de tolerancia al glifosato >14 veces mayor a los 7 0AT que las lineas naturales y transformadas de Arabidopsis utilizadas como control.

La figura 11 muestra la dosis-respuesta al R-haloxifop en suspensiones de callos de maiz.

La figura 12 muestra que con una concentracion de fenoles derivados del cihalofop de 1 !M el crecimiento sigue siendo del 76%, tan alto como el control no expuesto a dichos fenoles.

La figura 13 ofrece los datos de dosis-respuesta de un evento transgenico, el 3404-006, expuesto a haloxifop.

La figura 14 muestra las respuestas de varios clones de eventos transformados y sin transformar con AAD-1 (v3) frente a dosis letales de dos herbicidas AOPP (haloxifop y quizalofop) aplicadas 1 semana antes en postemergencia.

La figura 15 muestra tres linajes T2 distintos hallados entre 3404 transformaciones que fueron preseleccionadas con Libertyl para eliminar los nulos. Los linajes fueron escogidos para comparar su tolerancia al quizalofop teniendo en cuenta su expresion de AAD-1. La expresion se midio a los 14 0AT (datos no mostrados) y a los 30 0AT.

La figura 16 muestra un maiz transformado con AAD-1 (v3) tolerante a 8X la dosis de campo de quizalofop (Assure II) en condiciones de campo.

La figura 17 ilustra los datos de embriones inmaduros de maiz cultivados en medios que contenian cihalofop.

La Figura 18 muestra el analisis por transferencia (estern de callos de soja transformados con el gen AAD-1 (V3) que indica que las celulas del callo estan expresando la proteina AAD-1 (v3).

La figura 19 compara las curvas ajustadas correspondientes a las velocidades de degradacion del 2,4-0 con AAD-2 (v1) y AAD-1 (v1).

La figura 20 muestra la respuesta de plantas de Arabidopsis T1 transformadas con el gen AAD-1 v3 (optimizado para vegetales) o AAD-1 (v2) (natural), AAD-2 (v1) (natural) o AAD-2 (v2) (optimizado para vegetales) frente a una gama de dosis de 2,4-0 aplicadas en postemergencia. Cada maceta representa un evento de transformacion individual dentro de cada familia de genes T1.

La figura 21 muestra los resultados de transferencias (estern de plantas T1 de Arabidopsis transformadas con el gen AAD-2 (v1) natural. 0emuestran que las plantas que expresan la proteina AAD-2 (v1) estan sufriendo graves daros a causa de los tratamientos con 2,4-0 a 200 g e.a.(equivalente acido)/ha, que normalmente apenas causan daro alguno a las plantas de Arabidopsis transformadas con el AAD-1 (v2) natural o con el AAD-1 (v3)

optimizado para vegetales. La proteina AAD-2 aparece identificada en el gel. En las muestras transformadas con AAD-2 y con Pat/Cry1F se detectaron varias bandas de fondo.

La figura 22 muestra que la actividad relativa de la AAD-2 (v1) sobre los sustratos fue: 5 2,4-0 = diclorprop > (R,S)-haloxifop >> (R)-haloxifop.

Breve descripción de las secuencias

La SEC I0 n° 1 es la secuencia de un cebador directo utilizado para amplificar el gen rdpA/AAD-1 (v1). 10 La SEC I0 n° 2 es la secuencia de un cebador inverso utilizado para amplificar el gen rdpA/AAD-1 (v1).

La SEC I0 n° 3 es la secuencia de nucleotidos del AAD-1 (v1) de Sphingobium herbicidovorans.

15 La SEC I0 n° 4 es la secuencia de acidos nucleicos del gen AAD-1 natural con la diana de restriccion interna para NotI eliminada. Este gen se designa AAD-1 (v2). La secuenciacion del A0N confirmo que se habia generado el producto de PCR correcto, aunque se habia producido un cambio inadvertido en el aminoacido n.° 212, que paso de arginina a cisteina.

20 La SEC I0 n° 5 es una secuencia de A0N del gen AAD-1 (v3) "optimizada para vegetales". Este "gen" codifica la SEC I0 n° 11, que es la misma que la SEC I0 n° 9 salvo por la adicion de un residuo de alanina en la segunda posicion. El codon adicional de alanina (GCT) se incorporo para codificar una diana para Nco I (CCATGG) que abarcaba desde el codon de inicio ATG, con el fin de posibilitar posteriores operaciones de clonaje.

25 La SEC I0 n° 6 ("rdpA(ncoI)") y la SEC I0 n° 7 ("3' saci") se usaron para amplificar un fragmento de A0N mediante el sistema Fail Safe PCR System (Epicenter).

La SEC I0 n° 8 es otro cebador de PCR ("8stEII/0el NotI") que se uso con el cebador "3' SacI".

30 La SEC I0 n° 9 es la secuencia de aminoacidos natural codificada por el gen AAD-1 (v1) de Sphingobium herbicidovorans.

La SEC I0 n° 10 es la secuencia de aminoacidos codificada por la secuencia de A0N del AAD-1 (v2) de la SEC I0 n° 4.

35 La SEC I0 n° 11 es la secuencia de aminoacidos codificada por la secuencia de A0N AAD-1 (v3) optimizada para vegetales de la SEC I0 n° 5.

La SEC I0 n° 12 es la secuencia de A0N del gen AAD-2 (v1) natural. 40 La SEC I0 n° 13 es la secuencia de aminoacidos de la proteina AAD-2 (v1).

La SEC I0 n° 14 es un cebador directo utilizado para amplificar el A0N de AAD-2 (v1) para clonacion.

45 La SEC I0 n° 15 es un cebador inverso utilizado para amplificar el A0N de AAD-2 (v1) para clonacion.

La SEC I0 n° 16 es el cebador directo de M13.

La SEC I0 n° 17 es el cebador inverso de M13. 50 La SEC I0 n° 18 es un cebador directo utilizado para amplificar el A0N del AAD-2 (v1) para clonacion.

La SEC I0 n° 19 es un cebador inverso utilizado para amplificar el A0N del AAD-2 (v1) para clonacion.

55 La SEC I0 n° 20 es la proteina EPSPS natural de la soja.

La SEC I0 n° 21 es una secuencia de la proteina EPSPS de la soja portadora de dos mutaciones: una mutacion en el residuo 183 (sustitucion de la treonina de la proteina natural por una isoleucina) y otra en el residuo 187 (sustitucion de la prolina de la proteina natural por una serina).

60 La SEC I0 n° 22 es la secuencia de A0N adaptada a la soja que codifica la proteina EPSPS de la SEC I0 n° 21.

La SEC I0 n° 23 es el cebador Pat 5-3.

65 La SEC I0 n° 24 es el cebador Pat 3-3.

La SEC I0 n° 25 es el cebador directo de la PTU de AA0-1.

La SEC I0 n° 26 es el cebador inverso de la PTU de AA0-1.

La SEC I0 n° 27 es el cebador directo para la PCR de la region codificante de AA0-1.

La SEC I0 n° 28 es el cebador inverso para la PCR de la region codificante de AA0-1.

La SEC I0 n° 29 es las secuencias de nucleotidos del AAD-2 (v2) (optimizado para vegetales).

La SEC I0 n° 30 es la secuencia de la proteina AAD-2 (v2) traducida.

La SEC I0 n° 31 es el cebador directo de AAD-1 para la PCR del fragmento de Southern.

La SEC I0 n° 32 es el cebador inverso de AAD-1 para la PCR del fragmento de Southern.

Descripción detallada de la invención

El desarrollo de un gen de resistencia al 2,4-0 y el subsecuente desarrollo de cultivos resistentes proporcionan excelentes opciones para el control de las malas hierbas latifolias y resistentes al glifosato (o muy tolerantes y modificadas) durante el cultivo. El 2,4-0 es un potente herbicida contra latifolias, de amplio espectro y relativamente asequible que seria de gran utilidad para los agricultores si a los cultivos, tanto de dicotiledoneas como de monocotiledoneas, se les pudiera conferir una mayor tolerancia al mismo. Los cultivos de dicotiledoneas transgenicas tolerantes al 2,4-0 tambien ofrecerian una mayor flexibilidad en cuanto al momento y la dosis de aplicacion. Otra virtud de un caracter de tolerancia a herbicidas, en este caso al 2,4-0, seria su utilidad para prevenir daros en cultivos que normalmente son sensibles a la deriva, volatilizacion o inversion del 2,4-0 (o cualquier otro fenomeno de desplazamiento fuera de lugar), aplicacion erronea, vandalismo y similares. Otro beneficio del gen AAD-1 es que, a diferencia de todos los homologos del tfdA caracterizados hasta el momento, la AAD-1 es capaz de degradar los R-enantiomeros (isomeros con actividad herbicida) de los herbicidas auxinicos fenoxi quirales (por ejemplo, diclorprop y mecoprop) ademas de los auxinicos fenoxi aquirales (como por ejemplo el 2,4-0, MCPA y acido 4-clorofenoxiacetico). Vease la Tabla 1. En todo el mundo se utilizan numerosas mezclas de diferentes combinaciones de herbicidas auxinicos fenoxi para combatir espectros especificos de malas hierbas en las diferentes condiciones ambientales imperantes. El uso del gen AAD-1 en vegetales conferiria proteccion frente a una gama mucho mas amplia de herbicidas auxinicos fenoxi, lo cual mejora la flexibilidad y el espectro de malas hierbas que pueden ser controladas y protege a los cultivos de la deriva y de otros daros causados por el desplazamiento fuera de lugar de los herbicidas fenoxi en toda la gama de fenoxi auxinas comerciales.

Tabla 1. Herbicidas auxinicos fenoxi comerciales. Los herbicidas auxinicos fenoxi suelen nombrarse con el acido activo, pero algunos se comercializan como formulaciones del ester correspondiente y estas tambien se consideran sustratos de la enzima AAD-1 en la planta puesto que las esterasas vegetales en general convierten dichos esteres en los acidos activos en la planta. Tambien se puede hacer alusion a la sal organica o inorganica del acido correspondiente. Cuando se aluda a herbicidas quirales, ya sea en forma de ester, sal o acido propionico, los enantiomeros racemicos (R,S) u opticamente puros (R o S) se consideraran el mismo herbicida a efectos de nombrar estos herbicidas, aunque los compuestos opticamente puros reciban numeros CAS distintos. Los rangos de dosificacion utilizables pueden corresponder a tratamientos individuales o en combinacion con otros herbicidas, tanto en aplicaciones agricolas como de otro tipo.

Tabla 1. Fenoxi auxinas disponibles comercialmente

Nombre químico

N°CAS Rangos de dosificación utilizables (g e.a./ha) Rangos de dosificación preferidos (g e.a./ha) Estructura

2,4-0

94-75-7 25 - 4000 280- 1120

7 8

Tabla 1. Fenoxi auxinas disponibles comercialmente

Nombre químico

N°CAS Rangos de dosificación utilizables (g e.a./ha) Rangos de dosificación preferidos (g e.a./ha) Estructura

2,4,5-T

93-76-5 25 - 4000 25 - 4000

4-CPA

122-88-3 25 - 4000 25-4000

3,4-0A

588-22-7 25 - 4000 25 - 4000

MCPA

94-74-6 25 - 4000 125 - 1550

0iclorprop

120-36-5 25 -12000 100-2240

Mecoprop

7085-19-0 25-4000 250 - 3360

Cloprop

101-10-0 25-4000 25 - 4000

4-CPP

3307-39-9 25 - 4000 25 - 4000

Tabla 1. Fenoxi auxinas disponibles comercialmente

Nombre químico

N°CAS Rangos de dosificación utilizables (g e.a./ha) Rangos de dosificación preferidos (g e.a./ha) Estructura

Fenoprop

93-72-1 25-4000 25 - 4000

3,4-0P

3307-41-3 25-4000 25-4000

Otro beneficio mas del gen AAD-1 es su capacidad sin precedentes para degradar simultaneamente una multitud de graminicidas comerciales y no comerciales pertenecientes a la clase general de los ariloxifenoxipropionatos (AOPP). Vease la Tabla 2. Esta caracteristica hace posible la utilizacion de una serie de compuestos AOPP en cultivos

5 transgenicos portadores del AAD-1, cultivos cuya tolerancia no era posible garantizar hasta ahora. Entre estos se hallan sobre todo cereales como el maiz, arroz, trigo, cebada, centeno, avena, sorgo, especies de cesped para clima templado y frio, hierbas de pasto y muchas otras, pero tambien podria incluir cultivos de dicotiledoneas en que la tolerancia al AOPP (presente de forma natural en la mayoria de las dicotiledoneas) no alcanza niveles comercialmente aceptables para permitir su uso.

10 Tabla 2. Graminicidas AOPP ordenados por su nombre comun aceptado. Los herbicidas AOPP se denominan en general por su acido activo, pero la mayoria estan formulados comercialmente en diversas formulaciones de ester y estos tambien se consideran sustratos de la enzima AAD-1 en la planta, puesto que las esterasas vegetales en general convierten estos esteres en los acidos activos en la planta. Tambien se puede hacer alusion a la sal

15 organica o inorganica del acido correspondiente. Cuando se aluda a herbicidas quirales, ya sea en forma de ester, sal o acido propionico, los enantiomeros racemicos (R,S) u opticamente puros (R o S) se consideraran el mismo herbicida a efectos de nombrar estos herbicidas, aunque los compuestos opticamente puros reciban numeros CAS distintos. Los rangos de dosificacion utilizables pueden corresponder a tratamientos individuales o en combinacion, tanto en aplicaciones agricolas como de otro tipo.

Tabla 2. Graminicidas AOPP ordenados por su nombre comun aceptado.

Nombre químico

N°CAS Rangos de dosificación utilizables (g e.a./ha) Rangos de dosificación preferidos (g e.a./ha) Estructura

Clorazifop

72492-94-7 10-2000 10-2000

Clodinafop

105512-06-9 10-2000 20-200

Clofop

59621-49-7 10-2000 10-2000

Cyhalofop

122008-85-9 10-2000 105-560

Tabla 2. Graminicidas AOPP ordenados por su nombre comun aceptado.

Nombre químico

N°CAS Rangos de dosificación utilizables (g e.a./ha) Rangos de dosificación preferidos (g e.a./ha) Estructura

0iclofop

71283-65-3 10-2000 280-2000

Fenoxaprop

66441-23-4 10-2000 20-200

Fentiaprop

95721-12-3 10-2000 10-2000

Fluazifop

69335-91-7 10-2000 25-420

Haloxifop

69806-40-2 10-2000 20-600

Isoxapirifop

87757-18-4 10-2000 30-240

Metamifop

256412-89-2 10-2000 35-280

Propaquizafop

111479-05-1 10-2000 30-240

Quizalofop

76578-14-8 10-2000 20-240

Trifop

58597-74-4 10-2000 10-2000

Se ha logrado identificar un gen unico (AAD-1) que, introducido mediante tecnicas de ingenieria genetica para expression en vegetales, permite utilizar herbicidas auxinicos fenoxi en plantas que o bien no poseen una tolerancia intrinseca o bien resulta insuficiente para permitir su uso. Asimismo, el AAD-1 puede proteger a la planta contra los 5 herbicidas AOPP en aquellos casos en que la tolerancia natural tampoco es suficiente para garantizar la selectividad. Las plantas que sean portadoras unicamente del AAD-1 podran ser tratadas de manera secuencial o simultanea con uno, dos o una combinacion de varios herbicidas auxinicos fenoxi. La dosis de cada herbicida

auxinico fenoxi puede oscilar entre 25 y 4000 g e.a./ha, y mas habitualmente entre 100 y 2000 g e.a./ha para el control de un amplio espectro de malas hierbas dicotiledoneas. 0e modo similar, se pueden aplicar uno, dos o una mezcla de varios graminicidas AOPP a plantas que expresan el AA0-1 con un menor riesgo de daros provocados por tales herbicidas. La dosis de cada AOPP puede oscilar entre 10 y 2000 g e.a./ha, y mas habitualmente entre 20500 g e.a./ha para el control de un amplio espectro de malas hierbas monocotiledoneas. Las combinaciones de tales clases quimicas y herbicidas con distintos mecanismos de accion y espectros en el mismo campo (secuencial o simultaneamente en la mezcla de tanque) permitiria controlar la mayoria de malas hierbas que se pretenden controlar con herbicidas.

El glifosato es un herbicida muy utilizado porque controla un espectro amplisimo de malas hierbas latifolias y gramineas. No obstante, su uso reiterado en cultivos GTC y en otras aplicaciones no agricolas ha provocado, y continuara provocando, la seleccion de malas hierbas que son tolerantes naturales o biotipos resistentes al mismo. La mayoria de las estrategias para la prevencion de la resistencia a herbicidas propugnan como metodo para retrasar la aparicion de malezas resistentes la adicion a la mezcla de tanque de otros herbicidas dotados de mecanismos de accion distintos, en dosis que permitan controlar la especie en cuestion. El apilamiento del AAD-1 con un caracter de tolerancia al glifosato (y/o con otros caracteres de tolerancia a herbicidas) podria proporcionar un mecanismo para controlar las malas hierbas resistentes al glifosato (ya sean gramineas por medio de uno o varios herbicidas AOPP, o dicotiledoneas con uno o varios auxinicos fenoxi) en GTC al permitir el uso del glifosato y de uno

o varios herbicidas auxinicos fenoxi (por ejemplo, el 2,4-0) y AOPP (por ejemplo, quizalofop) de manera selectiva en el mismo cultivo. Las aplicaciones de estos herbicidas podrian ser simultaneas, con una mezcla de tanque que contenga dos o mas herbicidas con diferentes mecanismos de accion; aplicaciones individuales de una sola composicion herbicida en aplicaciones secuenciales en presiembra, preemergencia o postemergencia y fraccionamiento de las aplicaciones entre 2 horas y 3 meses; o, alternativamente, se puede aplicar cualquier combinacion de cualquier numero de herbicidas representativos de cada clase quimica en cualquier momento en el plazo de 7 meses desde la siembra del cultivo hasta la cosecha (o el intervalo de seguridad antes de la cosecha del herbicida, el que sea mas corto).

El control de un amplio espectro de malas hierbas gramineas y latifolias requiere disponer de flexibilidad en terminos del calendario de aplicacion, dosis de herbicidas y capacidad para controlar malezas dificiles o resistentes. Las aplicaciones de glifosato en un cultivo portador de un apilamiento de gen de resistencia al glifosato/AAD-1 podrian oscilar entre 250-2500 g e.a./ha; la del o los herbicidas auxinicos fenoxi entre 25-4000 g e.a./ha; y la del o los herbicidas AOPP entre 10-2000 g e.a./ha. Las combinaciones y el calendario de aplicacion mas adecuados dependen de cada situacion, de las especies implicadas y del entorno, decisiones que corresponden a un experto en control de malas hierbas que conozca los pormenores de esta invencion.

Las formulaciones herbicidas (por ejemplo, formulacion de ester, acido o sal; o concentrado soluble o emulsificable,

o liquido soluble) y los aditivos para la mezcla en tanque (por ejemplo, adyuvantes o agentes de compatibilidad) pueden modificar sustancialmente la capacidad del herbicida o de una combinacion de ellos para controlar las malas hierbas. Cualquier combinacion de los anteriores con cualquiera de las clases quimicas de herbicida citadas queda incluida en el alcance de esta invencion.

Un experto en la materia tambien sabra apreciar que el beneficio ofrecido por la combinacion de dos o mas mecanismos de accion para aumentar el espectro de malas hierbas controladas y/o controlar especies que de forma natural son mas tolerantes o resistentes tambien puede hacerse extensible a aquellas clases quimicas de herbicidas a las que los cultivos son tolerantes merced a la accion humana (por metodos transgenicos y de otro tipo) y que trascienden los GTC. Asi pues, los caracteres que codifican la resistencia al glifosato (por ejemplo los genes de resistencia vegetales o bacterianos EPSPS, GOX y GAT), resistencia al glufosinato (por ejemplo Pat, bar), resistencia a herbicidas inhibidores de la acetolactato sintasa (ALS) (por ejemplo imidazolinona, sulfonilurea, triazolopirimidina sulfonanilida, pirmidiniltiobenzoatos y otras clases quimicas = AHAS, Csr1, SurA, etc.), resistencia a bromoxinilo (por ejemplo Bxn), resistencia a inhibidores de la enzima HPP0 (4-hidroxifenil-piruvato-dioxigenasa), resistencia a inhibidores de la fitoeno desaturasa (P0S), resistencia a herbicidas inhibidores del fotosistema II (por ejemplo psbA), resistencia a herbicidas inhibidores del fotosistema I, resistencia a herbicidas inhibidores de la protoporfirinogeno IX oxidasa (PPO) (por ejemplo PPO-1), resistencia a herbicidas fenilureicos (por ejemplo CYP76B1), enzimas degradadores de dicamba (vease, por ejemplo US 20030135879) y otros se podrian apilar solos o en multiples combinaciones a fin de conferir la capacidad para controlar o evitar los cambios en la flora arvense y/o la resistencia a cualquier herbicida de las clases citadas.

Por lo que respecta a otros herbicidas, algunos inhibidores de ALS preferidos son las triazolopirimidina sulfonanilidas (como cloransulam-metil, diclosulam, florasulam, flumetsulam, metosulam y penoxsulam), pirimidiniltiobenzoatos (como bispiribac y pirithiobac) y flucarbazona. Algunos inhibidores de HPP0 preferidos son mesotriona, isoxaflutola y sulcotriona. Algunos inhibidores de PPO preferidos son flumiclorac, flumioxazin, flufenpir, piraflufen, fluthiacet, butafenacilo, carfentrazona, sulfentrazona y los difenileteres (como acifluorfen, fomesafen, lactofen y oxifluorfen).

Ademas, el AAD-1 solo o apilado con uno o varios caracteristicas de HTC , se puede combinar con otros caracteres agronomicos (resistencia a insectos o a hongos, tolerancia al estres, etc.) o de calidad (mayor rendimiento, mejor

perfil de aceites, mejor calidad de la fibra, etc.). Por tanto, la presente invencion puede formar parte de un paquete agronomico completo destinado a mejorar la calidad del cultivo, con la ventaja de aportar un control flexible y rentable de cualquier numero de plagas agronomicas.

Se describe la identificacion de una enzima que no solo es capaz de degradar el 2,4-0, sino que sorprendentemente tambien posee propiedades novedosas que la diferencian de las proteinas tfdA conocidas hasta el momento, por ejemplo. Aunque esta enzima presenta una homologia muy baja con el tfdA, los genes utilizados se pueden clasificar en general en la misma familia general de las dioxigenasas dependientes de a-cetoglutarato. Esta familia de proteinas se caracteriza por tres residuos de histidina conservados en un motivo "HX(0/E)X23-26(T/S)X114-183HX1013R" que comprende el centro activo. Las histidinas coordinan el ion Fe+2 en el centro activo que resulta esencial para la actividad catalitica (Hogan et al., 2000). En la presente memoria se comentan experimentos preliminares de expresion in vitro que fueron modificados a proposito para ayudar a seleccionar los atributos novedosos.

Mas especificamente, la presente invencion se refiere en parte al uso de una enzima que no solo es capaz de degradar el 2,4-0, sino tambien herbicidas AOPP. Hasta el momento no se habia descrito ninguna enzima dioxigenasa dependiente de a-cetoglutarato capaz de degradar herbicidas de diferentes clases quimicas y con distintos mecanismos de accion. Las enzimas y genes preferidos para el uso con arreglo a la presente invencion se denominan en la presente memoria genes y proteinas AAD-1 (ariloxialcanoato dioxigenasa).

Asimismo, se describe la identificacion y el uso de genes que codifican enzimas ariloxialcanoato dioxigenasa capaces de degradar herbicidas auxinicos fenoxi y ariloxifenoxipropionato, acido 2,4-diclorofenoxiacetico, otros herbicidas auxinicos fenoxialcanoicos y herbicidas ariloxifenoxialcanoato por la accion de una enzima AAD-1 expresada con tecnicas de A0N recombinante.

Las proteinas fueron sometidas a ensayos analiticos y biologicos para comprobar que, efectivamente, catalizaban la conversion del 2,4-0 en 2,4-diclorofenol ("0CP"; sin actividad herbicida). Las proteinas parcialmente purificadas de la presente invencion pueden convertir rapidamente el 2,4-0 en 0CP (la conversion oscila entre el 50-100%) en condiciones in vitro. Otra ventaja de las plantas transformadas con AAD-1 es que los compuestos herbicidas originales son metabolizados y transformados en formas inactivas, reduciendo las posibilidades de hallar residuos en el grano o el forraje.

La presente invencion incluye metodos para el control de malas hierbas que comprenden la aplicacion de un herbicida AOPP y/o un herbicida auxinico fenoxi a plantas que comprenden un gen AAD-1.

A partir de estos descubrimientos, ahora se facilitan nuevas plantas que comprenden un polinucleotido que codifica este tipo de enzima. Hasta el momento no habia motivacion alguna para producir tales plantas y no habia expectativas de que tales plantas pudieran producir efectivamente esta enzima para convertirlas en resistentes no solo a herbicidas fenoxi (como el 2,4-0) sino tambien a herbicidas AOPP. Por tanto, la presente invencion proporciona muchas ventajas que hasta el momento no se habian creido posibles en la disciplina.

Es posible adquirir y analizar cepas accesibles publicamente (depositadas en colecciones de cultivos como ATCC o 0SMZ) por medio de las tecnicas reveladas en la presente memoria para buscar nuevos genes. Las secuencias mostradas en la presente memoria pueden ser utilizadas para amplificar y clonar los genes homologos en un sistema de expresion recombinante con objeto de realizar mas busquedas sistematicas y ensayos con arreglo a la presente invencion.

Tal y como se ha comentado en el apartado de antecedentes, un microorganismo muy estudiado por su capacidad para degradar el 2,4-0 es Ralstonia eutropha (Streber et al., 1987). El gen que codifica la primera enzima de la via de degradacion es el tfdA. Vease la patente US n° 6.153.401 y la entrada N.° M16730 del Genbank. El tfdA cataliza la conversion del acido 2,4-0 en el 0CP, carente de accion herbicida, a traves de una dioxigenasa dependiente de acetoglutarato (Smejkal et al., 2001). Este gen ha sido utilizado en plantas transgenicas para conferir resistencia frente al 2,4-0 en plantas dicotiledoneas (por ejemplo algodon y tabaco) que normalmente son sensibles al mismo (Streber et al., 1989; Lyon et al., 1989; Lyon et al., 1993). En el medio ambiente se ha identificado un gran numero de genes de tipo tfdA que codifican proteinas capaces de degradar el 2,4-0 y que figuran depositados en la base de datos Genbank. Muchos homologos son bastante similares al tfdA (identidad de aminoacidos >85%) y poseen propiedades enzimaticas semejantes a las de dicho gen. Con todo, se conoce un pequero conjunto de homologos de la a-cetoglutarato dioxigenasa que guardan un bajo nivel de homologia con el tfdA.

El gen RdpA, procedente de Sphingobium herbicidovorans ((estendorf et al., 2002), es un ejemplo singular de baja homologia (identidad de aminoacidos 28%). Se ha demostrado que esta enzima cataliza la primera etapa del proceso de mineralizacion del (R)-diclorprop (y de otros acidos (R)-fenoxipropionicos) asi como del 2,4-0 (un acido fenoxiacetico) ((estendorf et al., 2003). 0esde hace tiempo se conocen microorganismos que degradan el acido fenoxipropionico, pero hasta hace poco no se habia progresado en la caracterizacion de esta ruta (Horvath et al., 1990). Otra complicacion que aradir a la degradacion del diclorprop es la estereospecificidad (R frente a S) que afecta tanto a su captacion (Kohler, 1999) como a su oxidacion inicial ((estendorf et al., 2003). La expresion

heterologa del rdpA en otros microbios, o la transformacion de este gen en plantas, permanecen ineditas hasta el momento. La bibliografia se ha centrado sobre todo en los homologos cercanos al tfdA que degradan fundamentalmente los acidos fenoxiaceticos aquirales. No se esperaba previamente que los genes RdpA o AAD-1 pudieran ser expresados satisfactoriamente en plantas para proporcionar las plantas resistentes al 2,4-0 (sin mencionar la resistencia a AOPP completamente sorprendente).

Como se describe con mas detalle en los ejemplos de las paginas siguientes, el rdpA de Sphingobium herbicidovorans se clono y se analizo con varias clases quimicas de herbicidas para determinar su promiscuidad de sustrato. Ya se habia demostrado que esta enzima dioxigenasa dependiente de a-cetoglutarato purificada en su forma natural degrada el 2,4-0 y el diclorprop ((estendorf et al., 2002 y 2003), pero no se habia descrito que una enzima de su tipo tuviera la capacidad de degradar herbicidas de diferentes clases quimicas y distintos mecanismos de accion. El rdpA nunca se habia expresado en plantas, ni existia motivacion para hacerlo porque el desarrollo de nuevas tecnicas de cultivos HTC se ha visto limitado en gran medida por la eficacia, el bajo costo y demas ventajas ofrecidas por los cultivos GTC (0evine, 2005).

A partir de esta actividad novedosa, las proteinas y los genes de la presente invencion se denominan en la presente memoria proteinas y genes AAD-1. En poco tiempo se confirmo que la AAD-1 degradaba in vitro diversos herbicidas auxinicos fenoxiaceticos y fenoxipropionicos. Pero, tal y como se describe por primera vez en la presente memoria, sorprendentemente tambien se descubrio que era capaz de degradar otros sustratos pertenecientes a la clase de las moleculas de ariloxialcanoato. Los graminicidas de ariloxifenoxipropionato (AOPP) son sustratos de notable importancia agronomica. Este descubrimiento sumamente novedoso ofrece oportunidades para servir de base a un cultivo tolerante a herbicidas (HTC) y como un caracter marcador seleccionable.

En la presente memoria se describe que los graminicidas AOPP de amplio espectro son excelentes sustratos de la AAD-1, al igual que el 2,4-0, el diclorprop y otros herbicidas auxinicos fenoxi. Esta enzima es unica por su capacidad para degradar una amplia gama tanto de latifolicidas de amplio espectro (herbicidas auxinicos fenoxi) como de graminicidas de amplio espectro muy activos (AOPP).

Por tanto, la presente invencion se refiere en parte a la degradacion del acido 2,4-diclorofenoxiacetico, otros herbicidas auxinicos fenoxialcanoicos y herbicidas de ariloxifenoxialcanoato mediante la expresion por tecnicas recombinantes de una enzima ariloxialcanoato dioxigenasa (AAD-1). Tambien se revela la identificacion y los usos de genes que codifican una enzima ariloxialcanoato dioxigenasa degradadora (AAD-1), capaz de degradar herbicidas auxinicos fenoxi y ariloxifenoxipropionato.

La expresion transgenica de la enzima confiere tolerancia a combinaciones de herbicidas que podrian controlar la practica totalidad de malas hierbas latifolias y gramineas. El AAD-1 puede actuar como una excelente caracteristica para cultivos tolerantes a herbicidas (HTC) que es posible apilar con otras caracteristicas de HTC (resistencia a glifosato, resistencia a glufosinato, a imidazolinona, a bromoxinilo, etc.) y caracteres de resistencia a insectos (Cry1F, Cry1Ab, Cry 34/45, etc.) por ejemplo. Asimismo, el AAD-1 puede servir como un marcador seleccionable util para la seleccion de transformantes primarios de plantas geneticamente modificadas con un segundo gen o grupo de genes.

Ademas, el gen microbiano ha sido rediserado de modo que la proteina esta codificada por codones que son utilizados preferentemente por plantas, tanto monocotiledoneas como dicotiledoneas (hemicot). Plantas de Arabidopsis, maiz, tabaco, algodon, soja, canola y arroz han sido transformadas con constructos que contenian el AAD-1 y han demostrado altos niveles de resistencia tanto a herbicidas auxinicos fenoxi como AOPP. Como se muestra a continuacion en el Ejemplo 6, el gen reconstruido a modo de ejemplo resulto mas eficaz que el gen bacteriano a la hora de conferir a la planta la resistencia contra herbicidas.

Los grupos oxialcanoato son utiles para introducir en los herbicidas una funcionalidad de acido estable. El grupo acido puede facilitar el desplazamiento por el floema gracias al "atrapamiento acido", un atributo deseable para la accion herbicida y que podria incorporarse a nuevos herbicidas para mejorar su movilidad. Ciertos aspectos de la presente invencion tambien proporcionan un mecanismo para crear HTC. Existen muchos herbicidas comerciales y experimentales que podrian servir como sustratos de la AAD-1. Por ello, el uso de los genes de interes tambien podria conferir tolerancia a esos otros herbicidas.

Los caracteres HTC de la presente invencion pueden ser utilizadas en combinaciones novedosas con otros caracteristicas HTC (como, por ejemplo, la tolerancia al glifosato). Tales combinaciones de caracteres dan lugar a metodos novedosos para controlar las malas hierbas (y especies similares), gracias a la nueva resistencia adquirida

o a la tolerancia intrinseca a los herbicidas (por ejemplo al glifosato). Por consiguiente, ademas de los caracteres HTC, dentro del alcance de la invencion quedan incluidos nuevos metodos para el control de las malas hierbas con herbicidas, en que la tolerancia a estos se crea mediante la citada enzima en cultivos transgenicos.

Por su parte, los cultivos tolerantes al glifosato predominan en todo el mundo. Cultivados muchas veces en rotacion con otros cultivos tolerantes al glifosato, el control de los ricios resistentes al glifosato puede resultar dificil en los

cultivos rotativos. Por ello, el uso de los caracteres transgenicos de la presente invencion, apilados o insertados individualmente en los cultivos, proporciona una herramienta para controlar otros cultivos HTC que aparecen como ricios.

Esta invencion se puede aplicar en el contexto de la comercializacion de un caracter de resistencia al 2,4-0 apilado con caracteres ya disponibles de resistencia al glifosato en plantas de soja, por ejemplo. Por ello, la presente invencion proporciona una herramienta para combatir los cambios en las arvenses latifolias y/o la seleccion de latifolias resistentes a herbicidas, consecuencias del intensisimo uso del glifosato contra las malas hierbas en diversos cultivos.

La expresion transgenica de los genes AAD-1 de interes se ha logrado, entre otros ejemplos, en Arabidopsis, maiz, tabaco, algodon, arroz, soja y canola, lo que no obsta para que la presente invencion pueda aplicarse en cualquier otro tipo de plantas deseado. La soja es un cultivo preferido para la transformacion con arreglo a la presente invencion. No obstante, esta invencion puede ser aplicada a otros muchos cultivos de gramineas y latifolias. 0e igual forma, el 2,4-0 puede ser utilizado mejor en cultivos de gramineas cuya tolerancia al mismo es moderada y en los que la mejora de dicha tolerancia por medio de este caracter proporcionaria a los cultivadores la oportunidad de utilizar el 2,4-0 en dosis mas eficaces y durante mas tiempo sin riesgo de darar el cultivo.

Es mas, la presente invencion utiliza un unico gen que puede proporcionar resistencia a herbicidas que controlan malas hierbas de hoja ancha (auxinicos) y gramineas (AOPP). Este gen podria ser utilizado en multiples cultivos, lo que permetiria el uso de una combinacion de herbicidas de amplio espectro. La presente invencion tambien puede controlar las malas hierbas resistentes a los herbicidas disponibles y ayudar a controlar los cambios en la flora arvense causados por las practicas agronomicas actuales. La AAD-1 de interes tambien puede ser utilizada para neutralizar con eficacia otros sustratos herbicidas transformandolos en compuestos sin actividad herbicida. Por todo ello, la presente invencion facilita el desarrollo de otros caracteres para HTC y/o de tecnicas de marcadores seleccionables.

Con independencia del uso de los genes de interes para producir HTC, o como un aradido al mismo, los genes de interes tambien se pueden utilizar como marcadores seleccionables para seleccionar los transformantes en cultivos celulares, en invernadero o en el campo. Los genes de interes poseen un gran valor intrinseco simplemente como marcadores seleccionables para proyectos de biotecnologia. La promiscuidad de la AAD-1 frente a otros herbicidas auxinicos fenoxialcanoicos brinda muchas oportunidades para utilizar este gen en aplicaciones de HTC y/o como marcador seleccionable.

Un gen, denominado en la presente memoria AAD-1 (ariloxialcanoato dioxigenasa), se clono de Sphingobium herbicidovorans (ATCC 700291) mediante una PCR en pET 280-S/S (designado p0A8 3203) y se expreso en E.coli 8L-21 Star. Cuando este gen se sobreexpresa (induccion con IPTG 1 mM y lisado de cultivo combinado con la siguiente mezcla de reaccion: 2,4-0 112,5 !g/ml, acido ascorbico 1 mM, a-cetoglutarato 1 mM, Fe(NH4)2(SO4)2 50 !M), la enzima recombinante resultante degrada el 2,4-0 transformandolo en 0CP, compuesto que carece de actividad herbicida (determinado por HPLC, espectrometria de masas, colorimetria y bioanalisis en placa con Arabidopsis). Ademas, se ha demostrado que la AAD-1 convierte los siguientes herbicidas en su correspondiente fenol inactivo: diclorprop, mecoprop, haloxifop, diclofop y otros (veanse las Tablas 3 y 4).

Tabla 3: Efecto de la AAD-1 (v1) purificada sobre varias auxinas y analogos auxinicos herbicidas. Los sustratos se analizaron a una concentracion de 1 mM en MOPS 25 mM y pH6,8, Fe2+ 200 !M, ascorbato sodico 200 !M, a-cetoglutarato 1 mM utilizando 1 !g o 10 !g (10X) de AA0-1 (v1) purificada por ensayo de 0,16 ml.

Tabla 3. Efecto de la AA0-1 (v1) purificada sobre varios compuestos auxinicos y analogos auxinicos dotados de accion herbicidaTabla 4: Efecto de la AA0-1 (v1) purificada sobre varios graminicidas AOPP y analogos y sobre cloquintocet. Los sustratos se analizaron a una concentracion de 1 mM en MOPS25 mM y pH 6,8, Fe2+ 200 !M, ascorbato sodico 200 !M, a-cetoglutarato 1 mM utilizando 1 !g o 10 !g (10X) de AA0-1 (v1) purificada por ensayo de 0,16 ml.

ESTRUCTURA ID de registro Compuesto AAD1 AAD1 (10x) ESTRUCTURA ID de registro Compuesto AAD1 AAD1 (10x)

117613 (R,S)-diclorprop 0,566 2,594 398166 sesona 0,02 0,177

188874 (R,S)-mecoprop 0,341 2,085 190252 0,008 0,211

83293 (R,S)-2-cloro, 4-fluorofenoxi-proprionato 0,304 2,358 124988 0,007 0,058

11113675 (R,S)-3-aminodiclorpop 0,228 2,676 11263526 0,004 0,069

188476 0,077 0,687 178577 0,003 0,021

192132 0,064 0,204 178587 0,003 0,02

195517 2,4-0 0,034 0,383 188527 0,003 0,036

Tabla 4. Efecto de la AA0-1 (v1) purificada sobre varios graminicidas AOPP y analogos y sobre cloquintocet.

ESTRUCTURA ID de registro Compuesto AAD1 AAD1 (10x) ESTRUCTURA ID de registro Compuesto AAD1 AAD1 (10x)

1870667131 (R)-quizalofop (R.S)-fluazifop 0,430,427 2,1 2,17 460511 25646 (R,S)-diclofop 0,1550,144 1,663 1,69

11044492 (R)-fenoxaprop 0,408 0,597 70222199608 (R,S)-clorazlfop cihalofop 0,1280,114 1,584 1,26

34697 (R,S)-clodinofop 0,295 1,98

14603 (R)-cihalofop 0,222 1,989 43865 haloxifop-oxiacetato 0,004 0,053

14623 (R,S)-cyhalofop 0,215 1,815 7466 (S)-cihalofop 0,003 0,017

6294266905 (R,S)-fenthiaprop haloxifop 0,199 0,172 1,055 1,63 204558 Cloquintocet 0 0,001

Proteinas (y aislamientos fuente).

La presente invencion utiliza proteinas funcionales. Por "actividad funcional" (o "activo/a") se entiende en la presente memoria que las proteinas/enzimas destinadas al uso con arreglo a la presente invencion poseen la capacidad para degradar o disminuir la actividad de un herbicida (solas o en combinacion con otras proteinas). Las plantas que producen proteinas de la presente invencion preferiblemente produciran "una cantidad efectiva" de la proteina, de modo que cuando la planta sea tratada con un herbicida, el nivel de expresion de la proteina sera suficiente para convertir a la planta en parcial o totalmente resistente o tolerante al herbicida (a una dosis habitual, si no se indica otra cosa; las dosis de aplicacion habituales se pueden encontrar en el conocido Herbicide Handbook (Weed Science Society of America, 8a edicion, 2002), por ejemplo). El herbicida se puede aplicar en dosis que normalmente matarian a la planta diana, en concentraciones y dosis normales en el campo. (Gracias a la invencion de interes, el nivel y/o la concentracion podrian ser mayores que las utilizadas hasta ahora). Preferiblemente, las celulas vegetales y las plantas de la presente invencion quedan protegidas contra la inhibicion del crecimiento o los daros causados por el tratamiento herbicida. Las plantas y las celulas vegetales transformadas de la presente invencion preferiblemente se convierten en resistentes o tolerantes a un herbicida, como se comenta en la presente memoria, lo cual significa que la planta y las celulas vegetales transformadas pueden crecer en presencia de cantidades eficaces de uno o varios herbicidas como se comenta en la presente memoria. Las proteinas preferidas poseen actividad catalitica para metabolizar uno o mas compuestos de ariloxialcanoato.

La transferencia de la actividad funcional a los sistemas vegetales o bacterianos puede implicar una secuencia de acidos nucleicos, la codificacion de la secuencia de aminoacidos de una proteina integrada en un vector de expresion proteica adecuado para el hospedador en el que reside el vector. Una forma de obtener una secuencia de acidos nucleicos que codifique una proteina con actividad funcional consiste en aislar el material genetico natural de la especie bacteriana que sintetiza la proteina de interes, utilizando informacion deducida de la secuencia de aminoacidos de la proteina, como se revela en la presente memoria. Las secuencias naturales pueden ser optimizadas para la expresion en plantas, por ejemplo, tal y como se comenta mas detalladamente en las paginas siguientes. Tambien se puede diserar un polinucleotido optimizado a partir de la secuencia de la proteina.

La presente invencion utiliza clases de proteinas dotadas de actividades novedosas como las indicadas en la presente memoria. Una forma de caracterizar dichas clases de proteinas y los polinucleotidos que las codifican consiste en definir un polinucleotido por su capacidad para hibridarse, bajo un rango de condiciones concretas, con una secuencia de nucleotidos ejemplificada (la complementaria de la misma y/o una sonda o sondas derivadas de una de las hebras) y/o por su capacidad para ser amplificada mediante PCR con cebadores derivados de las secuencias ejemplificadas.

Existen varios metodos para obtener las proteinas destinadas al uso con arreglo a la presente invencion. Por ejemplo, se pueden emplear anticuerpos dirigidos contra las proteinas reveladas en la presente memoria con el fin de identificar y aislar otras proteinas en una mezcla. En concreto, se pueden generar anticuerpos contra las porciones de las proteinas que estan mas conservadas o que son mas distintas de otras proteinas relacionadas. Esos anticuerpos se pueden utilizar entonces para identificar especificamente proteinas equivalentes dotadas de la actividad caracteristica mediante inmunoprecipitacion, enzimoinmunoadsorcion (ELISA) o inmunotransferencia. Los anticuerpos contra las proteinas mostradas en la presente memoria, o contra proteinas equivalentes, o fragmentos de dichas proteinas, se pueden preparar facilmente con procedimientos ordinarios. Los anticuerpos incluyen anticuerpos monoclonales y policlonales, preferiblemente producidos en respuesta a una proteina ejemplificada o sugerida.

Un experto en la materia reconocera facilmente que las proteinas (y los genes) de la presente invencion se pueden obtener de diversas fuentes. 0ado que ciertos elementos transponibles como los plasmidos codifican operones de degradacion de herbicidas enteros, y que estos tambien pueden estar integrados en el genoma, es posible obtener proteinas de la presente invencion de una amplia variedad de microorganismos, entre ellos bacterias recombinantes y/o naturales. Otros miembros de los ordenes Firmicutes y Proteobacteria, asi como generos portadores del rdpA, como Sphingobium, Delftia, Rodoferax y Comamonas, entre otros, pueden ser utilizados como fuentes.

Tambien es posible fabricar mutantes de aislamientos bacterianos mediante procedimientos bien conocidos por los expertos en la disciplina. Por ejemplo, se pueden obtener mutantes asporogenos de un aislamiento mediante mutagenesis con etilmetanosulfonato (EMS). Tambien se pueden conseguir mutantes con luz ultravioleta y nitrosoguanidina por medio de procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia.

Una proteina "procedente de" u "obtenible de" cualquiera de los aislamientos de interes referidos o sugeridos en la presente memoria significa que la proteina (o una proteina similar) se puede obtener del aislamiento o de alguna otra fuente, como otra cepa bacteriana o una planta. "0erivado de" tambien tiene esta connotacion e incluye proteinas obtenibles de un tipo determinado de bacteria que ha sido modificada para la expresion en una planta, por ejemplo. Un experto en la materia reconocera facilmente que, dado que se trata de un gen y de una proteina de origen bacteriano, es posible modificar una planta con tecnicas de ingenieria genetica para que produzca la proteina. Se pueden disponer preparaciones de anticuerpos, sondas de acidos nucleicos (A0N, ARN o APN, por ejemplo) y

similares utilizando el polinucleotido y/o las secuencias de aminoacidos revelados en la presente memoria, con el fin de detectar y recuperar otros genes relacionados en otras fuentes (naturales).

Es posible utilizar tecnicas ordinarias de biologia molecular para clonar y secuenciar las proteinas y los genes descritos en la presente memoria. Se puede encontrar mas informacion en Sambrook et al., 1989.

Polinucleotidos y sondas.

Ademas se proporcionan secuencias de nucleotidos que codifican proteinas para ser utilizadas con arreglo a la presente invencion. La presente invencion proporciona asimismo metodos para identificar y caracterizar genes que codifican proteinas dotadas de la actividad herbicida deseada. En una forma de realizacion, la presente invencion proporciona secuencias de nucleotidos unicas que son utiles como sondas de hibridacion y/o cebadores para tecnicas PCR. Los cebadores producen fragmentos genicos caracteristicos que pueden ser utilizados para la identificacion, caracterizacion y/o aislamiento de genes de interes concretos. Las secuencias de nucleotidos de la presente invencion codifican proteinas que son distintas de las proteinas descritas hasta la fecha.

Los polinucleotidos pueden ser utilizados para formar "genes" enteros que codifiquen proteinas o peptidos en una celula hospedadora deseada. Por ejemplo, como un experto en la materia puede reconocer facilmente, los polinucleotidos de interes se pueden colocar adecuadamente bajo el control de un promotor en un hospedador de interes, como es conocido en la tecnica. El nivel de expresion del gen y su expresion especifica en un tejido concreto

o en un momento dado pueden tener una gran repercusion en la utilidad de la invencion. En general, cuanto mayor sea el nivel de expresion proteica de un gen degradador mas rapida y mas completa sera la degradacion del sustrato (en este caso un herbicida). En general, se pretende que los promotores expresen el gen diana en niveles elevados a menos que la expresion elevada cause un impacto negativo en la salud de la planta. Normalmente, se pretende que el gen AAD-1 se exprese de manera constitutiva en todos los tejidos para conferir una proteccion completa a la planta en todas las etapas de crecimiento. No obstante, como alternativa se puede utilizar un gen de resistencia que se exprese vegetativamente; de este modo se podria utilizar el herbicida de interes en los cultivos para controlar las malezas y, posteriormente, para controlar la reproduccion sexual del cultivo de interes mediante su aplicacion durante la etapa de floracion.

Como apreciara el experto en la materia, el A0N forma normalmente una doble cadena. En esta disposicion, una hebra es complementaria de la otra y viceversa. A medida que el A0N se replica en una planta (por ejemplo), se producen hebras complementarias del mismo. El termino "hebra codificante" es utilizado a menudo en la tecnica para referirse a la hebra que se une con la hebra antisentido. El ARNm se transcribe a partir de esta hebra antisentido del A0N. La hebra codificante contiene una serie de codones (un codon son tres nucleotidos que pueden ser leidos como una unidad de tres residuos que designan un aminoacido concreto) que pueden ser leidos como un marco abierto de lectura (ORF) para formar una proteina o un peptido de interes. Para producir una proteina in vivo, normalmente una hebra de A0N se transcribe en una hebra complementaria de ARNm que servira como molde de la proteina. Por tanto, la presente invencion incluye el uso de los polinucleotidos ejemplificados mostrados en la lista de secuencias adjunta y/o de equivalentes que incluyen las hebras complementarias. La presente invencion incluye los ARN y los APN (acidos peptidos nucleicos) que son equivalentes funcionales de las moleculas de A0N ejemplificadas.

Los aislamientos bacterianos se pueden cultivar en condiciones favorables para conseguir una elevada multiplicacion del microbio. 0espues de tratar el microbio para obtener su acido nucleico genomico monocatenario, el A0N se puede poner en contacto con los cebadores de la invencion y ser sometido a una amplificacion por PCR. Con dicho procedimiento, los fragmentos caracteristicos de los genes de interes quedan amplificados, revelando asi la presencia del gen o genes de interes.

Otros aspectos incluyen genes y aislamientos identificados con los metodos y las secuencias de nucleotidos descritos en la presente memoria. Los genes identificados de esta manera pueden codificar proteinas de resistencia a herbicidas de la presente invencion.

Las proteinas y los genes para uso con arreglo a la presente invencion pueden ser identificados y obtenidos mediante sondas de oligonucleotidos, por ejemplo. 0ichas sondas son secuencias de nucleotidos que pueden ser detectadas en virtud de un marcador adecuado o que pueden ser de por si fluorescentes, tal y como se describe en la Solicitud internacional N.° (O 93/16094. Las sondas (y los polinucleotidos de la presente invencion) pueden ser de A0N, ARN o APN. Ademas de adenina (A), citosina (C), guanina (G), timina (T) y uracilo (U; en las moleculas de ARN), las sondas (y polinucleotidos) sinteticas de la presente invencion tambien pueden contener inosina (una base neutra capaz de aparearse con las cuatro bases que a veces se utiliza como sustituto de la mezcla de cuatro bases en las sondas sinteticas) y/u otras bases sinteticas (no naturales). Por tanto, siempre que en la presente memoria se aluda a un oligonucleotido sintetico y degenerado "N" o "n" se utilizaran genericamente, pudiendo ser G, A, T, C o inosina. Los codigos de ambiguedad se utilizan en la presente memoria de acuerdo con las normas de nomenclatura de la IUPAC vigentes en el momento de la presentacion de esta solicitud (por ejemplo, R significa A o G, Y significa C o T, etc.).

Como es bien sabido por los expertos en la materia, si una sonda molecular se hibrida con una muestra de acido nucleico, es razonable suponer que la sonda y la muestra guardan entre si una homologia/similitud/identidad sustancial. Preferiblemente, primero se realiza la hibridacion del polinucleotido y despues se efectuan lavados en 5 condiciones de baja, moderada o alta restrictividad mediante tecnicas bien conocidas, como se describe por ejemplo en Keller, G. H., M. M. Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, New York, N.Y., pags. 169-170. Por ejemplo, como se indica en dicha obra, se pueden conseguir condiciones de baja restrictividad con un primer lavado con (solucion salina con citrato) SSC 2x/S0S 0,1% (dodecilsulfato sodico) durante 15 minutos a temperatura ambiente; normalmente se hacen dos lavados. Se puede conseguir mas restrictividad disminuyendo la concentracion de sal y/o 10 elevando la temperatura. Por ejemplo, despues del lavado descrito se pueden hacer dos lavados con SSC 0,1x/S0S 0,1% a temperatura ambiente durante 15 minutos cada uno, seguidos por lavados con SSC 0,1x/S0S 0,1% a 55'C durante 30 minutos cada uno. Estas temperaturas se pueden utilizar con otros protocolos de hibridacion y de lavado citados en la presente memoria y como deberia saber un experto en la materia (por ejemplo, como sal se puede usar SSPE en lugar de SSC). La solucion de SSC 2x/S0S 0,1% se puede elaborar aradiendo 50 ml de SSC 20x y 5

15 ml de S0S 10% a 445 ml de agua. El SSC 20x se puede preparar combinando NaCl (175,3 g/0,150 M), citrato sodico (88,2 g/0,015 M) y agua, ajustando el pH a 7,0 con NaOH 10 N, y despues enrasando el volumen hasta 1 litro. El S0S 10% se puede preparar disolviendo 10 g de S0S en 50 ml de agua autoclavada, diluyendo despues hasta un volumen final de 100 ml.

20 La deteccion de la sonda proporciona unos medios para determinar de una manera conocida si la hibridacion se ha mantenido. Este analisis con sonda proporciona un metodo rapido para identificar genes de la presente invencion. Los segmentos de nucleotidos que se utilizan como sondas con arreglo a la invencion se pueden sintetizar con un sintetizador de A0N y procedimientos ordinarios. Estas secuencias de nucleotidos tambien se pueden utilizar como cebadores de PCR para amplificar genes de la presente invencion.

25 Las caracteristicas de hibridacion de una molecula pueden ser utilizadas para definir los polinucleotidos utilizados en la presente invencion. Por lo tanto, la presente invencion comprende polinucleotidos (y/o sus complementos, preferiblemente sus complementos completos) que hibridan con un polinucleotido ejemplificado en la presente memoria. Es decir, una forma de definir un gen (y la proteina que este codifica) consiste, por ejemplo, en determinar

30 su capacidad para hibridar con un gen conocido o ejemplificado especificamente (bajo cualquiera de las condiciones reveladas especificamente en la presente memoria).

En la presente memoria, condiciones "restrictivas" de hibridacion se refiere a las condiciones que consiguen el mismo, o aproximadamente el mismo, grado de especificidad de la hibridacion que las condiciones empleadas por 35 los solicitantes actuales. En concreto, se puede llevar a cabo una hibridacion de A0N inmovilizado sobre filtros de transferencia Southern con sondas genicas marcadas con 32P mediante metodos ordinarios (vease por ejemplo, Maniatis et al. 1982). En general, la hibridacion y los lavados posteriores se pueden llevar a cabo en condiciones que permiten la deteccion de las secuencias diana. En el caso de las sondas genicas de A0N bicatenario, la hibridacion se puede prolongar hasta el dia siguiente a 20-25'C por debajo de la temperatura de fusion (Tm) del hibrido de A0N

40 en SSPE 6x, solucion de 0enhardt 5x, S0S 0,1% y A0N desnaturalizado 0,1 mg/ml. La temperatura de fusion se describe mediante la formula siguiente (8eltz et al. 1983):

Tm= 81,5'C + 16,6 Log [Na+] + 0,41(% G+C)-0,61(% fo rmamida)-600/longitud del A0N bicatenario en pares de bases. 45 Los lavados se llevan a cabo normalmente del modo siguiente:

(1) 0os veces a temperatura ambiente durante 15 minutos en SSPE 1x, S0S 0,1% (lavado de restrictividad

baja). 50

(2) Una vez a Tm-20'C durante 15 minutos en SSPE 0,2x, S0S 0,1% (lavado de restrictividad moderada).

Con las sondas de oligonucleotidos, la hibridacion se puede prolongar hasta el dia siguiente a 10-20'C por debajo de la temperatura de fusion (Tm) del hibrido en SSPE 6x, solucion de 0enhardt 5x, S0S 0,1% y A0N 55 desnaturalizado 0,1 mg/ml. La Tm de las sondas de oligonucleotidos se describe mediante la formula siguiente:

Tm ('C)= 2 (numero de pares de bases T/A) + 4 (numer o de pares de bases G/C)

(Suggs et al., 1981). 60 Los lavados se llevan a cabo normalmente del modo siguiente:

(1) 0os veces a temperatura ambiente durante 15 minutos en SSPE 1x, S0S 0,1% (lavado de restrictividad

baja). 65

(2) Una vez a la temperatura de hibridacion durante 15 minutos en SSPE 1x, S0S 0,1% (lavado de restrictividad moderada).

En general, la sal y/o la temperatura se pueden alterar para modificar la restrictividad. Con un fragmento de A0N marcado de >70 bases de longitud aproximadamente, se pueden utilizar las siguientes condiciones:

8aja: SSPE 1x

2x, temperatura ambiente 8aja: SSPE 1x

2x, 42'C Moderada: SSPE 0,2x

1x, 65'C Alta: SSPE 0,1x, 65'C

La formacion de la molecula bicatenaria y su estabilidad dependen de la existencia de una complementariedad sustancial entre las dos hebras del hibrido y, como se ha indicado anteriormente, resulta tolerable un cierto grado de desapareamiento. Por tanto, las secuencias de las sondas incluyen mutaciones (unicas y multiples), deleciones, inserciones de las secuencias descritas y de combinaciones de las mismas, en las que dichas mutaciones, inserciones y deleciones permiten la formacion de hibridos estables con el polinucleotido diana de interes. Las mutaciones, inserciones y deleciones se pueden producir en un polinucleotido dado de muchas maneras, y tales metodos son conocidos por una persona versada en la materia. En el futuro, podrian aparecer nuevos metodos.

Tecnica de PCR.

La reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) es una sintesis enzimatica, repetitiva y conservadora de una secuencia de acidos nucleicos. Este procedimiento es bien conocido y utilizado habitualmente por los expertos en la materia (vease Mullis, Patentes U.S. N.° 4.683.195, 4.683.202 y 4.800.159; Saiki et al., 1985). La PCR se basa en la amplificacion enzimatica de un fragmento de A0N de interes que esta flanqueado por dos cebadores oligonucleotidos que hibridan con las hebras opuestas de la secuencia diana. Los cebadores se orientan preferiblemente con sus extremos 3' encarados. Los repetidos ciclos de desnaturalizacion termica del molde, la reasociacion de los cebadores con sus secuencias complementarias y la extension de los cebadores reasociados por medio de una A0N polimerasa dan como resultado la amplificacion del segmento definido por los extremos 5' de los cebadores de PCR. El producto de la extension de cada cebador puede servir como molde para el otro cebador, de modo que con cada ciclo se duplica la cantidad del fragmento de A0N producida en el ciclo anterior. Esto provoca la acumulacion exponencial del fragmento diana especifico, hasta alcanzar varios millones de copias en pocas horas. Por medio de una A0N polimerasa termoestable como la polimerasa Taq, aislada de la bacteria termofila Thermus aquaticus, el proceso de amplificacion puede automatizarse completamente. Los expertos en la materia conocen otras enzimas adecuadas.

Las secuencias de A0N ejemplificadas, o segmentos de las mismas, pueden ser utilizadas como cebadores para la amplificacion por PCR. 0urante este proceso de amplificacion, resulta tolerable un cierto grado de desapareamiento entre las bases del cebador y del molde, como mutaciones, deleciones e inserciones (especialmente adiciones de nucleotidos en el extremo 5') en los cebadores ejemplificados. Cualquier experto en la materia conoce metodos para producir mutaciones, inserciones y deleciones en un cebador.

Modificacion de genes y proteinas.

Los genes y las proteinas de interes pueden fusionarse con otros genes y proteinas para producir proteinas quimericas o de fusion. Los genes y proteinas utiles con arreglo a la presente invencion no solo incluyen las secuencias enteras ejemplificadas especificamente, sino tambien porciones, segmentos y/o fragmentos (incluidos fragmentos contiguos y deleciones internas y/o terminales respecto a las moleculas enteras) de tales secuencias, variantes, mutantes, quimeras y fusiones de los mismos. Las proteinas pueden tener aminoacidos sustituidos siempre que conserven la actividad funcional deseada. Los genes "variantes" tienen secuencias de nucleotidos que codifican las mismas proteinas o proteinas equivalentes dotadas de una actividad equivalente o similar a una proteina ejemplificada. Los terminos "proteinas variantes" y "proteinas equivalentes" se refieren a proteinas dotadas de la misma o basicamente la misma actividad biologica/funcional contra las plagas diana y las secuencias equivalentes como las proteinas expuestas a modo de ejemplo. En la presente memoria, la alusion a una secuencia "equivalente" concierne a secuencias portadoras de sustituciones, deleciones, adiciones o inserciones de aminoacidos que mejoran o que no afectan negativamente a la actividad en un grado significativo. Los fragmentos que conservan la actividad tambien quedan incluidos en esta definicion. Los fragmentos y otros equivalentes que conserven una funcion o actividad igual o similar a la de un fragmento correspondiente de una proteina ejemplificada estan comprendidos en el alcance de la presente invencion. Se pueden hacer cambios, como sustituciones o

adiciones de aminoacidos, con diversos fines, tales como aumentar (o disminuir) la estabilidad frente a proteasas de la proteina (sin disminuir material o sustancialmente la actividad funcional de la misma), eliminar o aradir una diana de restriccion, y similares. Se pueden construir facilmente variaciones de genes utilizando, por ejemplo, tecnicas ordinarias que provocan mutaciones puntuales.

Ademas, la patente US n° 5.605.793, por ejemplo, describe metodos para generar una diversidad molecular adicional utilizando el reensamblaje de A0N tras una fragmentacion al azar o dirigida. Esta se puede denominar transposicion de genes ("shuffling"), proceso que normalmente implica la mezcla de fragmentos (de un tamaro idoneo) de dos o mas moleculas de A0N distintas, seguida por repetidas rondas de renaturalizacion. Esto puede mejorar la actividad de una proteina codificada por un gen inicial. El resultado es una proteina quimerica dotada de una actividad mejor, de una especificidad por el sustrato alterada, mayor estabilidad enzimatica, estereoespecificidad alterada, u otras caracteristicas.

La transposicion se puede diserar y dirigir despues de obtener y examinar las coordenadas atomicas 30 (tridimensionales) y la estructura cristalina de la proteina de interes. Por tanto, la "transposicion dirigida" se puede dirigir a ciertos segmentos de una proteina idoneos para ser modificados, como los segmentos expuestos en la superficie, y preferiblemente no a segmentos internos implicados en el plegamiento de la proteina y que resulten esenciales para mantener la integridad de su estructura 30.

Se pueden utilizar genes variantes para producir proteinas variantes; de modo similar se pueden utilizar hospedadores recombinantes para producir las proteinas variantes. Utilizando las citadas tecnicas de "transposicion de genes" se pueden construir genes y proteinas equivalentes que comprenden 5, 10 o 20 residuos contiguos (aminoacidos o nucleotidos) de cualquier secuencia ejemplificada en la presente memoria. Como un experto en la materia sabe, las tecnicas de transposicion de genes, por ejemplo, se pueden ajustar para obtener equivalentes portadores de, por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296 o 297 residuos contiguos (aminoacidos o nucleotidos), correspondientes a un segmento (del mismo tamaro) de cualquiera de las secuencias ejemplificadas o sugeridas (o las complementarias (completas) de las mismas). Segmentos de tamaro similar, especialmente los pertenecientes a regiones conservadas, tambien pueden ser utilizados como sondas y/o cebadores.

Tambien se pueden obtener fragmentos de genes enteros por medio de exonucleasas o endonucleasas comerciales siguiendo procedimientos ordinarios. Por ejemplo, se pueden utilizar enzimas tales como la Bal31 o tecnicas de mutagenesis dirigida para cortar sistematicamente nucleotidos de los extremos de tales genes. Asimismo, se pueden obtener genes que codifiquen fragmentos activos mediante diversas enzimas de restriccion. Tambien se pueden usar proteasas para obtener directamente fragmentos activos de tales proteinas.

En la presente memoria se describen proteinas que pueden ser truncadas sin perder por ello la actividad funcional. Por "proteina truncada" se entiende una porcion de proteina que puede ser escindida sin que la proteina truncada restante pierda la actividad deseada despues de la escision. La escision se puede efectuar con diversas proteasas. Asimismo, se pueden producir proteinas escindidas con tecnicas de biologia molecular eliminando bases de A0N que codifiquen dicha proteina, bien mediante la digestion con endonucleasas de restriccion bien con otras tecnicas disponibles para los expertos en la tecnica. 0espues del truncamiento, dichas proteinas se pueden expresar en sistemas heterologos como E. coli, baculovirus, sistemas de virus vegetales, levaduras y similares y a continuacion someterse a bioanalisis en insectos del modo descrito en la presente memoria para determinar su actividad. Los expertos en la materia saben bien que es posible producir con exito proteinas truncadas que conserven su actividad funcional pese a haber perdido parte de su secuencia completa. Por ejemplo, se pueden utilizar proteinas de Bacillus thuringiensis en una forma truncada (proteina central) (veanse por ejemplo, Hofte et al. (1989) y Adang et al. (1985)). Seralar que en la presente memoria, el termino "proteina" puede incluir truncamientos funcionalmente activos.

En ciertos casos, sobre todo para la expresion en vegetales, puede ser ventajoso utilizar genes truncados que expresen proteinas truncadas. Los genes truncados preferidos codificaran normalmente un 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o un 99% de la proteina entera.

Ciertas proteinas se ejemplifican especificamente en la presente memoria. 0ado que tales proteinas se muestran meramente a titulo de ejemplo, debe quedar claro de inmediato que proteinas variantes o equivalentes (y secuencias de nucleotidos que codifican las equivalentes de las mismas) estan dotadas de una actividad igual o similar a la de las proteinas ejemplificadas. Las proteinas equivalentes deben guardar una similitud en sus aminoacidos (y/u homologia) con una proteina ejemplificada. La identidad de aminoacidos sera normalmente de al menos el 60%, preferiblemente al menos del 75%, mas preferiblemente de al menos el 80%, incluso mas preferiblemente de al menos el 90% y puede ser de al menos del 95%. Las proteinas preferidas tambien se pueden definir en terminos de intervalos de identidad y/o similitud mas concretos. Por ejemplo, la identidad y/o similitud puede ser del 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% en comparacion con una secuencia ejemplificada o sugerida en la presente memoria. Se puede utilizar cualquiera de los numeros indicados arriba para definir los limites superior e inferior.

A menos que se indique otra cosa, en la presente memoria la identidad y/o similitud porcentuales entre las secuencias de dos acidos nucleicos se han calculado utilizando el algoritmo de Karlin y Altschul, 1990, modificado segun Karlin y Altschul, 1993. Este algoritmo esta incorporado en los programas N8LAST y X8LAST de Altschul et al., 1990. Las busquedas de nucleotidos con 8LAST se llevan a cabo con el programa N8LAST, puntuacion = 100, longitud de palabra = 12. Se puede utilizar el Gapped 8LAST del modo descrito en Altschul et al., 1997. Cuando se utilizan los programas 8LAST y Gapped 8LAST, se emplean los parametros por defecto de cada programa (N8LAST y X8LAST). Vease el sitio web de NC8I/NIH. Para obtener alineaciones con huecos a efectos comparativos, se utilizo la funcion AlignX de Vector NTI Suite 8 (InforMax, Inc., North 8ethesda, Md., EE.UU.) empleando los parametros por defecto. Estos fueron: una penalizacion por apertura de hueco de 15, una penalizacion por extension de hueco de 6,66, y un intervalo de penalizacion por separacion de hueco de 8.

Tambien se pueden modificar diversas propiedades y caracteristicas tridimensionales de la proteina sin afectar negativamente a la actividad/funcionalidad de la misma. Las sustituciones conservadoras de aminoacidos se pueden tolerar o hacer sin afectar negativamente a la actividad y/o la configuracion tridimensional de la molecula. Los aminoacidos se pueden clasificar en las siguientes clases: no polares, polares sin carga, basicos y acidos. Las sustituciones conservadoras en las que un aminoacido de una clase es sustituido por otro aminoacido del mismo tipo estan comprendidas en el alcance de la presente invencion siempre que la sustitucion no afecte negativamente a la actividad biologica del compuesto. La Tabla 5 contiene un listado de ejemplos de aminoacidos pertenecientes a cada clase.

Tabla 5

Clase de aminoácido

Ejemplos de aminoácidos

No polar

Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp

Polar sin carga

Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln

Acido

Asp, Glu

8asico

Lys, Arg, His

En ciertos casos tambien se pueden hacer sustituciones no conservadoras, pero se prefieren las sustituciones que no deterioren significativamente la actividad funcional/biologica de la proteina.

En la presente memoria, la alusion a polinucleotidos "aislados" y/o proteinas "purificadas" se refiere a dichas moleculas cuando no estan asociadas con otras moleculas de su tipo con las que se encuentran en la naturaleza. Por tanto, la referencia a "aislado/a" y/o "purificado/a" implica la intervencion humana tal y como se describe en la presente memoria. Por ejemplo, un "gen" bacteriano de la presente invencion introducido en una planta para ser expresado es un "polinucleotido aislado". 0e forma similar, una proteina derivada de una proteina bacteriana y producida por una planta es una "proteina aislada".

0ebido a la degeneracion/redundancia del codigo genetico, varias secuencias de A0N pueden codificar las secuencias de aminoacidos reveladas en la presente memoria. Un experto en la materia sabra crear secuencias de A0N alternativas que codifican las mismas o basicamente las mismas proteinas. Estas se comentan con mas detalle a continuacion en la seccion titulada "Optimizacion de la secuencia para la expresion en vegetales".

Optimizacion de la secuencia para la expresion en vegetales.

Para obtener una elevada expresion de genes heterologos en plantas se prefiere en general rediserar con tecnicas de ingenieria genetica los genes, de modo que se expresen con mas eficiencia en el citoplasma de las celulas vegetales. El maiz es una de tales plantas en las que puede ser preferible rediserar el gen o genes heterologos antes de la transformacion para aumentar su nivel de expresion en dicha planta. Por consiguiente, una etapa adicional en el disero de genes que codifican una proteina bacteriana consiste en la modificacion de un gen

heterologo para lograr una expresion optima, utilizando una preferencia codonica mas estrechamente alineada con la secuencia de la planta diana, ya sea dicotiledonea o monocotiledonea. Las secuencias tambien se pueden optimizar para la expresion en cualquiera de los tipos concretos de plantas comentados a lo largo de la presente memoria.

Hospedadores transgenicos.

Los genes que codifican las proteinas de la presente invencion se pueden introducir en una amplia variedad de hospedadores microbianos o vegetales. La presente invencion incluye celulas vegetales transgenicas y plantas transgenicas. Las plantas (y celulas vegetales) preferidas son maiz, Arabidopsis, tabaco, soja, algodon, canola, arroz, trigo, cesped y hierbas de pasto, y similares. Tambien se pueden crear otros tipos de plantas transgenicas con arreglo a la presente invencion, tales como frutas, hortalizas y arboles. Mas en general, en varios aspectos de la presente invencion se pueden utilizar dicotiledoneas y/o monocotiledoneas.

En formas de realizacion preferidas, la expresion del gen propicia, directa o indirectamente, la produccion intracelular (y el mantenimiento) de la proteina o proteinas de interes. 0e esta manera, las plantas se pueden convertir en resistentes a herbicidas. Tales hospedadoras se pueden calificar como hospedadoras y/o celulas transgenicas, recombinantes, transformadas y/o transfectadas. En ciertos aspectos de la presente invencion (por ejemplo, en lo que concierne a la clonacion y la preparacion del gen de interes), se pueden producir y utilizar celulas microbianas (preferiblemente bacterianas) siguiendo tecnicas estandar, con el beneficio de la presente descripcion.

Las celulas vegetales transfectadas con un polinucleotido se pueden regenerar en plantas enteras. La utilizacion de cultivos celulares comprende cultivos de tejidos celulares, cultivos liquidos y cultivos en placa. Las semillas producidas y/o utilizadas para engendrar plantas tambien son asimismo divulgadas y otros tejidos y partes de las plantas estan asimismo incluidos en la exposicion y .etodos para producir plantas o celulas que comprenden un polinucleotido. Un metodo preferido para producir tales plantas consiste en sembrar una semilla de la presente invencion.

Insercion de los genes para crear los hospedadores transgenicos.

Un aspecto de la presente invencion consiste en la transformacion/transfeccion de plantas, celulas vegetales y otras celulas hospedadoras con polinucleotidos que expresan proteinas de la presente invencion. Las plantas transformadas de esta manera se pueden convertir en resistentes a diversos herbicidas dotados de diferentes mecanismos de accion.

Esta disponible una gran diversidad de metodos para introducir un gen que codifica una proteina deseada en el hospedador diana, en condiciones que permiten su mantenimiento y expresion estables. Tales metodos son bien conocidos por los expertos en la materia y aparecen descritos, por ejemplo, en la patente US n° 5.135.867.

Por ejemplo, se dispone de un gran numero de vectores de clonacion que comprenden un sistema de replicacion en

E. coli y un marcador para seleccionar las celulas transformadas que permiten hacer los preparativos para la insercion de genes foraneos en plantas superiores. Los vectores comprenden, por ejemplo, p8R322, series pUC, series M13mp, pACYC184, etc. Asi pues, la secuencia que codifica la proteina puede ser insertada en el vector a traves de una diana de restriccion adecuada. El plasmido resultante se utiliza para la transformacion de E. coli. Las celulas de E. coli se cultivan en un medio nutritivo adecuado y despues se recogen y se lisan. El plasmido se recupera con un proceso de purificacion que lo separa del A0N genomico. Como metodos de analisis se emplean en general analisis de la secuencia, analisis de restriccion, electroforesis y otros metodos de biologia molecular y bioquimicos. 0espues de cada manipulacion, la secuencia de A0N utilizada se puede digerir con enzimas de restriccion y unirse a la secuencia de A0N contigua. Cada secuencia plasmidica se puede clonar en el mismo o en otros plasmidos.

0ependiendo del metodo escogido para insertar los genes deseados en la planta, pueden ser necesarias otras secuencias de A0N. Si, por ejemplo, se escoge el plasmido Ti o Ri para la transformacion de la celula vegetal, entonces como minimo el borde derecho del T-A0N del plasmido, y a menudo tanto este como el borde izquierdo, debe estar unido como region flanqueadora a los genes que se desean insertar. El uso del T-A0N para la transformacion de celulas vegetales ha sido ampliamente investigado y descrito en EP 120 516; Hoekema (1985); Fraley et al. (1986); y An et al. (1985).

Son numerosas las tecnicas disponibles para insertar A0N en una celula hospedadora vegetal. Entre ellas se cuentan la transformacion con T-A0N por medio de Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes como agente de transformacion, fusion, inyeccion, biobalistica (bombardeo con microparticulas), triquitas de carburo de silicio, chorro de aerosol, PEG o electroporacion, aparte de otros metodos factibles. Si para la transformacion se opta por las agrobacterias, el A0N a insertar debe estar clonado en plasmidos especiales, ya sea en un vector intermediario o en un vector binario. Los vectores intermediarios se pueden integrar en el plasmido Ti o Ri mediante recombinacion homologa gracias a secuencias que son homologas con las secuencias del T-A0N. El plasmido Ti o

Ri tambien comprende una region vir necesaria para la transferencia del T-A0N. Los vectores intermediarios no se pueden autorreplicar en las agrobacterias y para su transferencia a Agrobacterium tumefaciens se precisa un plasmido auxiliar (conjugacion). En cambio, los vectores binarios se pueden autorreplicar tanto en E. coli como en las agrobacterias. Estos comprenden un gen marcador de seleccion y un conector o policonector que estan enmarcados por los bordes derecho e izquierdo del T-A0N. Este tipo de vectores se pueden transformar directamente en las agrobacterias (Holsters, 1978). El Agrobacterium utilizado como celula hospedadora debe contener un plasmido dotado de una region vir. La region vir es necesaria para la transferencia del T-A0N a la celula vegetal. Puede contener T-A0N adicional. La bacteria transformada de ese modo se utiliza para la transformacion de las celulas vegetales. Se pueden cultivar ventajosamente explantes vegetales con Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes para transferir el A0N a la celula vegetal y, a continuacion, regenerar plantas enteras a partir del material vegetal infectado (por ejemplo pedazos de hojas, segmentos de pedunculo, raices y protoplastos o celulas cultivadas en suspension) en un medio adecuado, que puede contener antibioticos o biocidas como agentes de seleccion. Las plantas obtenidas se pueden analizar para detectar la presencia del A0N insertado. En el caso de la inyeccion y la electroporacion no es necesario recurrir a plasmidos especiales y se pueden emplear tipos convencionales como los derivados de pUC, entre otros.

Las celulas transformadas crecen en el interior de las plantas de la manera habitual. Pueden formar celulas germinales y transmitir el caracter o caracteres transformados a la progenie. Estas plantas a su vez se pueden cultivar de manera normal y cruzarse con plantas portadoras de los mismos factores hereditarios transformados u otros factores hereditarios. Los hibridos resultantes poseen las propiedades fenotipicas correspondientes.

En algunas formas de realizacion preferidas de la invencion, los genes que codifican la proteina bacteriana se expresan a traves de unidades transcripcionales insertadas en el genoma de la planta. Preferiblemente, dichas unidades transcripcionales son vectores recombinantes capaces de lograr una integracion estable en el genoma vegetal y permitir la seleccion de las lineas vegetales transformadas que expresan el ARNm que codifica las proteinas.

Una vez el A0N insertado ha quedado integrado en el genoma, permanece relativamente estable en el (y no vuelve a salir). Suele contener un marcador de seleccion que confiere a las celulas de la planta transformada resistencia frente a un biocida o un antibiotico como kanamicina, G418, bleomicina, higromicina o cloramfenicol, entre otros. Algunos marcadores vegetales seleccionables tambien suelen proporcionar resistencia a varios herbicidas como glufosinato (PAT), glifosato (EPSPS), imazetapir (AHAS) y muchos otros. El marcador utilizado debe permitir la seleccion de las celulas transformadas en lugar de las celulas que no contienen el A0N insertado. El gen o genes de interes se expresan preferiblemente por medio de promotores constitutivos o inducibles en la celula vegetal. Una vez expresado, el ARNm se traduce en proteinas, incorporando aminoacidos de interes en ellas. Los genes que codifican una proteina expresada en las celulas vegetales pueden estar sometidos al control de un promotor constitutivo, un promotor especifico de tejido o un promotor inducible.

Existen varias tecnicas para introducir vectores recombinantes foraneos en celulas vegetales y para obtener plantas que mantengan y expresen de manera estable el gen introducido. Entre dichas tecnicas se incluyen la introduccion directa en las celulas de microparticulas recubiertas con material genetico (Patentes U.S. N.° 4.945.050 concedida a Cornell y 5.141.131 concedida a 0owElanco, ahora 0ow AgroSciences, LLC). Asimismo, se pueden transformar plantas utilizando tecnicas con Agrobacterium, veanse las Patentes U.S. N.° 5.177.010 concedida a la University of Toledo y 5.104.310 a Texas A&M, la solicitud de patente europea 013162481; las solicitudes de patente europea 120516, 15941881 y 176.112 concedidas a Schilperoot; las Patentes U.S. N.° 5.149.645, 5.469.976, 5.464.763 y

4.940.838 y 4.693.976 concedidas a Schilperoot; las solicitudes de patente europea 116718, 290799, 320500, todas concedidas a Max Planck; las solicitudes de patente europea 604662 y 627752 y la patente US n° 5.591.616, concedidas a Japan Tobacco; las solicitudes de patente europea 0267159 y 0292435 y la patente US n° 5.231.019, todas concedidas a Ciba Geigy, ahora Syngenta; las patentes U.S. N.° 5.463.174 y 4.762.785, ambas concedidas a Calgene; y las patentes U.S. N.° 5.004.863 y 5.159.135, ambas concedidas a Agracetus. Otros metodos de transformacion incluyen las tecnicas con triquitas. Veanse las patentes U.S. N.° 5.302.523 y 5.464.765, ambas concedidas a Zeneca, ahora Syngenta. Las tecnicas de electroporacion tambien han sido utilizadas para transformar plantas. Vease la (O 87/06614 concedida a 8oyce Thompson Institute; las Patentes U.S. N.° 5.472.869 y 5.384.253, ambas concedidas a 0ekalb; y (O 92/09696 y (O 93/21335, ambas otorgadas a Plant Genetic Systems. Asimismo, tambien se pueden usar vectores virales para producir plantas transgenicas que expresen la proteina de interes. Por ejemplo, se pueden transformar plantas monocotiledoneas con un vector viral utilizando los metodos descritos en la patente U.S. N.° 5.569.597 concedida a Mycogen Plant Science y Ciba-Geigy (ahora Syngenta), asi como en las patentes U.S. N.° 5.589.367 y 5.316.931, ambas concedidas a 8iosource, ahora Large Scale 8iology.

Como se ha mencionado con anterioridad, la manera de introducir el constructo de A0N en la planta hospedadora no es critica para esta invencion. Se puede emplear cualquier metodo que proporcione una transformacion eficiente. Por ejemplo, en la presente memoria se describen varios metodos para la transformacion de celulas vegetales que incluyen el uso de plasmidos Ti o Ri y similares para llevar a cabo la transformacion mediada por Agrobacterium. En muchos casos, sera deseable que el constructo utilizado para la transformacion disponga en uno o ambos lados de

los bordes del T-A0N, mas concretamente el borde derecho. Estos resulta particularmente util cuando el constructo utiliza Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes como vehiculo de la transformacion, aunque los bordes del T-A0N tambien pueden ser utiles con otros vehiculos de transformacion. Cuando se utiliza Agrobacterium para la transformacion de celulas vegetales, se puede utilizar un vector que puede ser introducido en el hospedador para la recombinacion homologa con el T-A0N o con el plasmido Ti o Ri presente en el anfitrion. El vector se puede introducir a traves de electroporacion, cruzamiento triparental y otras tecnicas de transformacion de bacterias gramnegativas conocidas por los expertos en la disciplina. El modo en que se lleva a cabo la transformacion con el vector en el Agrobacterium hospedador no es critico para esta invencion. El plasmido Ti o Ri que contiene el T-A0N para la recombinacion no tiene por que ser capaz de provocar la formacion de agallas y no resulta critico para dicha invencion siempre que dicho hospedador disponga de genes vir.

En ciertos casos de transformacion con Agrobacterium, el constructo de expresion situado entre los bordes del T-A0N se insertara en un vector de amplio espectro como pRK2 o derivados del mismo, tal y como se describe en 0itta et al. (1980) y EPO 0 120 515. El constructo de expresion y el T-A0N deben contener uno o mas marcadores como los descritos en la presente memoria que permitan la seleccion del Agrobacterium transformado y de las celulas vegetales transformadas. El marcador concreto no es esencial para esta invencion y dependera del hospedador y de la construccion utilizada.

Para la transformacion de las celulas vegetales con Agrobacterium se pueden combinar e incubar explantes con el Agrobacterium transformado durante el tiempo suficiente para posibilitar la transformacion de los mismos. 0espues de la transformacion, las agrobacterias son eliminadas por seleccion con el antibiotico adecuado y las celulas vegetales se cultivan en el medio selectivo apropiado. Una vez formados los callos, se puede estimular la formacion de brotes empleando las hormonas vegetales adecuadas de acuerdo con metodos bien conocidos en la tecnica de cultivo de tejidos vegetales y regeneracion de plantas. No obstante, no siempre es necesario un estadio intermedio de callo. 0espues de la formacion del brote, dichas celulas vegetales pueden ser transferidas a un medio que estimula la formacion de raices y completar asi la regeneracion de la planta. Las plantas pueden entonces cultivarse para obtener semillas, y estas se pueden utilizar para engendrar las generaciones futuras. Con independencia de la tecnica de transformacion utilizada, es preferible que el gen codificador de una proteina bacteriana se incorpore a un vector de transferencia genica adaptado para expresar dicho gen en una celula vegetal, incluyendo en el vector un elemento regulador promotor vegetal, asi como regiones de terminacion de la transcripcion no traducidas 3' como Nos y similares.

Ademas de las numerosas tecnicas disponibles para transformar plantas, tambien puede variar el tipo de tejido que entra en contacto con los genes foraneos. 0icho tejido incluiria, entre otros tipos: tejido embriogenico, tejido de callo de los tipos I, II y III, hipocotilo, meristemo, tejido radicular, tejidos para la expresion en floema, y similares. Casi todos los tejidos vegetales pueden ser transformados durante la desdiferenciacion mediante tecnicas adecuadas descritas en la presente memoria.

Como se ha mencionado anteriormente, si se desea es posible utilizar diferentes marcadores seleccionables. La preferencia por un marcador concreto queda a discrecion del experto, pero se puede utilizar cualquiera de los siguientes marcadores seleccionables con cualquier otro gen no enumerado en la presente memoria que pueda funcionar con un marcado seleccionable. Tales marcadores seleccionables incluyen, entre otros, el gen de la aminoglucosido fosfotransferasa del transposon Tn5 (Aph II) que codifica la resistencia a los antibioticos kanamicina, neomicina y G418, asi como aquellos genes que codifican resistencia o tolerancia al glifosato, higromicina, metotrexato, fosfinotricina (bialafos o glufosinato), imidazolinonas, sulfonilureas y herbicidas triazolopirimidinicos, como clorsulfuron, bromoxinilo, dalapon y similares.

Ademas de un marcador seleccionable, puede ser deseable utilizar un gen marcador (reporter). En ciertos casos se puede utilizar un gen marcador con o sin un marcador seleccionable. Los genes marcadores son genes que normalmente no estan presentes en el organismo o tejido receptor y que codifican proteinas que ocasionan un cambio fenotipico o tienen una propiedad enzimatica. Ejemplos de tales genes se pueden consultar en (eising et al., 1988. Los genes marcadores preferidos incluyen la beta-glucuronidasa (GUS) del locus uidA de E. coli, el gen de la cloramfenicol acetiltransferasa del Tn9 de E. coli, la proteina fluorescente verde de la medusa bioluminescente Aequorea victoria y los genes de luciferasa de la luciernaga Photinus piralis. A continuacion se puede efectuar un ensayo para detectar la expresion del gen marcador en el momento adecuado una vez introducido en las celulas receptoras. Un ensayo tal preferido consiste en el uso del gen que codifica la beta-glucuronidasa (GUS) del locus uidA de E. coli del modo descrito por Jefferson et al., (1987) para identificar celulas transformadas.

Ademas de los elementos reguladores promotores de origen vegetal, en celulas vegetales se pueden utilizar elementos de esa naturaleza procedentes de otras fuentes para expresar genes foraneos. Por ejemplo, se pueden utilizar promotores reguladores de origen bacteriano, como el promotor de la octopina sintasa, el promotor de la nopalina sintasa, el promotor de la mannopina sintasa; promotores de origen viral, como el virus del mosaico de la coliflor (35S y 19S), 35T (un promotor 35S modificado geneticamente, vease la patente US n° 6.166.302, sobre todo el Ejemplo 7E) y similares. Los promotores reguladores vegetales incluyen, entre otros, la subunidad pequera (ssu) de la ribulosa-1,6-bifosfato (RU8P) carboxilasa, el promotor de la beta-conglicinina, el promotor de la beta-faseolina,

promotor de A0H, promotores de shock termico y promotores especificos de tejido. Otros elementos como regiones de anclaje a matriz, regiones de anclaje a andamio, intrones, intensificadores, secuencias de poliadenilacion y similares pueden estar presentes y mejorar la eficiencia de la transcripcion o de la integracion del A0N. Tales elementos pueden ser necesarios, pero no necesariamente, para la funcion del A0N, aunque pueden facilitar una mejor expresion o funcionamiento del A0N modificando la transcripcion, la estabilidad del ARNm, y similares. Tales elementos pueden incluirse en el A0N a voluntad para obtener un rendimiento optimo del A0N transformado en la planta. Los elementos habituales incluyen, entre otros, Adh-intron 1, Adh-intron 6, la secuencia lider de la proteina de la capside del virus del mosaico de la alfalfa, secuencias UTR de la osmotina, la secuencia lider de la proteina de la capside del virus del rayado del maiz, asi como otras disponibles para el experto. Tambien se pueden utilizar elementos reguladores consistentes en promotores constitutivos que provocan la expresion continua del gen en todos los tipos celulares y en todo momento (por ejemplo actina, ubiquitina, CaMV 35S, y similares). Por otra parte, algunos elementos reguladores consistentes en promotores especificos de tejido son los responsables de la expresion genica en ciertos tipos de celulas y tejidos, como las hojas o las semillas (por ejemplo zeina, oleosina, napina, ACP, globulina y similares) y estos tambien pueden ser utilizados.

Los elementos reguladores promotores tambien pueden permanecer activos (o inactivos) durante una cierta etapa del desarrollo de la planta, asi como activos en ciertos tejidos y organos vegetales. Ejemplos de tales promotores incluyen, entre otros, elementos reguladores promotores especificos del polen, especificos del embrion, especificos de los estigmas del maiz, especificos de la fibra del algodon, especificos de las raices, especificos del endospermo de las semillas o especificos de la fase vegetativa, y similares. En ciertas circunstancias podria ser deseable utilizar un elemento regulador consistente en un promotor inducible, que sea responsable de la expresion de genes como respuesta a una seral especifica, por ejemplo: un estimulo fisico (genes de shock termico), luz (RU8P carboxilasa), hormona (Em), metabolitos, sustancias quimicas (respuesta a tetraciclina) y estres. Tambien se pueden utilizar otros elementos de transcripcion y traduccion que funcionen en plantas. Son conocidos en la tecnica numerosos vectores de transformacion genica especificos para vegetales.

Los sistemas basados en virus de ARN vegetales tambien se pueden usar para expresar proteinas bacterianas. 0e ese modo, el gen codificante de una proteina se puede insertar en una region promotora de la capside de un virus vegetal adecuado para infectar a la planta hospedadora de interes. La proteina puede entonces expresarse y conferir proteccion a la planta frente al daro causado por el herbicida. Sistemas basados en virus de ARN vegetales aparecen descritos en la patente U.S. N.° 5.500.360 concedida a Mycogen Plant Sciences, Inc. y en las patentes

U.S. N.° 5.316.931 y 5.589.367 concedidas a 8iosource, ahora Large Scale 8iology.

A continuacion se describen ejemplos de procedimientos para poner en practica la invencion. Tales ejemplos no se deben considerar como excluyentes. Todos los porcentajes se indican en peso y todas las proporciones de mezcla de solventes se expresan en volumen a menos que se indique otra cosa.

Ejemplo 1 - Método para la identificación de genes que confieren resistencia al 2,4-D en la planta

Para identificar genes capaces de degradar herbicidas en la planta se puede comenzar consultando las bases de datos publicas como NC8I (National Center for Biotechnology Information). Como punto de partida, es preciso disponer de una secuencia genica funcional identificada que codifique una proteina con las caracteristicas deseadas (en este caso la actividad a-cetoglutarato dioxigenasa). Esta secuencia proteinica se utiliza como dato de entrada para el algoritmo 8LAST (Basic Local Alignment Search Tool) (Altschul et al., 1997) que la comparara con las secuencias proteinicas disponibles en la NC8I. Utilizando los ajustes por defecto, la busqueda da como resultado mas de 100 secuencias proteinicas con diversos grados de homologia. Este abanico ofrece desde una identidad de aminoacidos elevada (85-98%) hasta una identidad baja (23-32%). Normalmente, se supone que solo las secuencias con una homologia elevada ostentan propiedades similares a la secuencia introducida. En este caso solo se escogieron las secuencias con una homologia : 50%. A continuacion vamos a mostrar a modo de ejemplo que la clonacion y la expresion recombinante de homologos con apenas un 27% de aminoacidos conservados es factible como medio para conferir niveles comerciales de resistencia no solo frente al herbicida previsto, sino tambien frente a sustratos que nunca se habian puesto a prueba con tales enzimas.

PCR y clonacion del gen en pET.

En la base de datos de NC8I se identifico un gen (rdpA) (vease el sitio web ncbi.nlm.nih.gov; entrada n.° AF516752) homologo del tfdA de Ralstonia eutropha que solo guardaba con este una identidad de aminoacidos del 28%. La identidad porcentual se determino traduciendo primero a proteina las secuencias de A0N de rdpA y tfdA que figuraban en la base de datos, y realizando despues el alineamiento multiple de las secuencias con el programa Clustal(, del paquete de software Vector NTI.

La cepa de Sphingobium herbicidovorans portadora del gen rdpA se obtuvo de la ATCC (American Type Culture Collection, cepa n.° 700291). La cepa liofilizada se revivio siguiendo el protocolo de la ATCC y se conservo a -80'C en glicerol al 20% para uso interno como cepa 0ow 8acterial 08 536. A partir de esta solucion madre congelada, para aislar las celulas se sembro una placa de agar de triptona y soja con el contenido de un asa de Henle y se

incubo a 28'C durante 3 dias.

Se utilizo una sola colonia para sembrar en 100 ml de caldo de triptona y soja en un matraz de 500 ml con tres placas deflectoras, que se dejo incubar hasta el dia siguiente a 28'C en un agitador de plataforma a 1 50 rpm. 0e este cultivo se aislo todo el A0N con el protocolo para gramnegativos del kit 0Neasy de Qiagen (n.° catalogo de Qiagen 69504). Para amplificar el gen diana a partir del A0N genomico se diseraron los siguientes cebadores: 0irecto, 5' TCT AGA AGG AGA TAT ACC ATG CAT GCT GCA CTG TCC CCC CTC TCC CAG CG 3' [(SEC I0 n° 1) (se aradio una diana de restriccion para Xba I y un sitio de union a ribosoma (R8S))], e Inverso, 5' CTC GAG TTA CTA GCG CGC CGG GCG CAC GCC ACC GAC CG 3' [(SEC I0 n° 2) (se le aradio un codon extra de parada y una diana para Xho I)].

Se prepararon reacciones de veinte microlitros del modo siguiente: MasterMix 8 !l, cada cebador 1 !l (50 pmol/!l), A0Ng 2,5 !l, H2O 7,5 !l. A continuacion se efectuo la PCR en las condiciones siguientes: 94'C durante 45 s, 52'C durante 1,5 minutos, 72'C durante 1,5 minutos, dura nte 30 ciclos, seguidos por un ciclo final a 72'C d urante 5 minutos, utilizando un kit Master Taq de Eppendorf (Eppendorf, n.° catalogo 0032 002.250). El producto resultante de la PCR -1 kb se clono en pCR 2.1 (Invitrogen, n.° catalogo K4550-40) siguiendo el protocolo incluido y utilizando como cepa hospedadora E. coli TOP10F' quimicamente competente para verificar la secuencia de nucleotidos.

0iez de las colonias blancas resultantes se introdujeron en 4 ml de caldo Luria + 50 !g/ml de kanamicina (abreviado, L8 K) y se dejaron crecer hasta el dia siguiente a 37'C con agitacion. Los plasmidos de cada cultivo se purificaron con el kit (izard Plus SV de Promega (Promega, n.° catalogo A1460) siguiendo el protocolo incluido. La secuenciacion se llevo a cabo con el kit CEQ Quick Start de 8eckman (8eckman Coulter, n.° catalogo 608120) utilizando un cebador directo de M13 (5' GTA AAA CGA CGG CCA GT 3') (SEC I0 n° 16) y un cebador inverso de M13 (5' CAG GAA ACA GCT ATG AC 3') (SEC I0 n° 17), segun las instrucciones del fabricante. Esta secuencia genica (SEC I0 n° 3) y su proteina correspondiente (SEC I0 n° 9) recibieron la nueva designacion general de AAD-1 (v1) (ariloxialcanoato dioxigenasa) para mantener la coherencia interna.

Utilizando las enzimas de restriccion correspondientes a las dianas aradidas con los conectores del cebador (Xba 1, Xho 1) se escindio el gen AAD-1 (v1) del vector pCR2.1 y se ligo a un vector pET 280 con resistencia a estreptomicina/espectinomicina. Los productos ligados se transformaron a continuacion en E. coli TOP10F' y se cultivaron en placas de agar con caldo Luria + 50 !g/ml de estreptomicina y espectinomicina (abreviado, L8 S/S). Para distinguir entre las ligaciones AAD-1 (v1):pET 280 y pCR2.1:pET 280, se resembraron unas 20 colonias aisladas en 6 ml de L8 S/S y se cultivaron a 37'C dur ante 4 horas con agitacion.

A continuacion cada cultivo se sembro en placas con L8 K, que se incubaron a 37'C hasta el dia siguiente. Las colonias que crecieron en el medio L8 K se supusieron portadoras del vector pCR2.1 ligado y fueron descartadas. Los plasmidos de los cultivos restantes se aislaron del modo antes indicado. Este constructo de expresion recibio la designacion de p0A8 3203.

Ejemplo 2 - Expresión y análisis

2.1-Analisis por HPLC

El plasmido p0A8 3203 se mantuvo congelado a -80'C en celulas TOP10F' (Invitrogen) como cepa 0ow Recombinant 0R 1878. Para la expresion, el A0N plasmidico del cultivo de TOP10F' se purifico con el kit (izard de Promega (Fisher, n.° catalogo PR-A1460) se transformo en celulas 8L-21 Star (0E3) (Invitrogen, n.° catalogo C6010-03) siguiendo el protocolo del fabricante. 0espues de la transformacion, 50 !l de las celulas se sembraron en placas de agar L8 S/S y se incubaron hasta el dia siguiente a 37'C.

La marana siguiente, todas las colonias de la placa se recogieron y se introdujeron en 100 ml de L8 en un matraz de 500 ml con tres placas deflectoras y se incubaron a 37'C/200 rpm durante 1 h. A continuacion, se ind ujo la expresion del gen con IPTG 1 mM y se dejaron incubar otras 4 h a 30'C/200 rpm. Los 100 ml del cultivo s e centrifugaron a 4000 rpm durante 20 min, se descartaron los sobrenadantes y los sedimentos se resuspendieron en 10 ml de MOPS 50 mM. 0espues se sometieron a tres rondas de sonicacion de 45 s para lisar las celulas. Los lisados se centrifugaron a 15.000 rpm para eliminar los restos celulares. El sobrenadante se pipeteo y almaceno a 4'C. Para comprobar la expresion recombinante se hiz o correr una alicuota de 20 !l en gel Tris Glicina al 4-20% (Invitrogen, n.° catalogo EC60255).

Una vez confirmada la expresion, la actividad enzimatica se analizo del modo siguiente. En primer lugar, se desalinizo una alicuota del extracto celular con un cartucho P0-10 (Amersham, n.° catalogo 17-0435-01), que seguidamente se utilizo para las reacciones enzimaticas con herbicida.

En cada reaccion se emplearon los siguientes elementos: 2,4-0 (125 !g/ml), [ascorbato (1 mM), ion ferroso (50 !M), a-cetoglutarato (1 mM), en MOPS 100 mM], extracto celular (100 !l). La reaccion se dejo incubar a temperatura ambiente durante 30 min., tras lo cual se detuvo con la adicion de HCl 0,1 N hasta que el pH se situo entre 2 y 3. La

mitad del volumen de reaccion (-500 !l) se reservo para el bioanalisis, y el volumen restante se sometio a una extraccion en fase organica con tubos de extraccion de fase solida (Fisher, n.° catalogo 11-131-6) y 400 !l de acetonitrilo + TFA 0,05% como eluyente.

Los extractos se analizaron con HPLC para detectar la perdida del pico de 2,4-0 o la presencia de cualquier otro pico producto de la degradacion o modificacion del 2,4-0. Las condiciones de la HPLC fueron: Luna 10 ! C18(2) 250 x 4,6 mm (Phenomenex, n.° catalogo 00G-4253-E0), elucion con ACN 50% + TFA 0,05%: H2O 50% + TFA 0,05% a ACN 100% + TFA 0,05% durante 5 min.

2.2-8ioanalisis en placa para determinar la degradacion del herbicida.

Los bioanalisis con plantas permitieron averiguar si la transformacion enzimatica in vitro del herbicida comportaba la perdida de su actividad herbicida. 0ada la naturaleza selectiva de los herbicidas estudiados (monocotiledoneas controladas con herbicidas AOPP y dicotiledoneas controladas con herbicidas auxinicos), en el ensayo se emplearon Agrostis palustris natural var. Pencross como planta monocotiledonea y Arabidopsis thaliana var. Columbia como dicotiledonea. Ambas especies pueden hacerse germinar y crecer en placas de Petri pequeras.

Las semillas de Arabidopsis se sometieron a esterilizacion superficial durante 10 min. en una solucion al 50% de lejia comercial/agua desionizada (v/v) con 1 !l de Tween-20 aradido como humectante con agitacion vigorosa (agitador a 250 rpm). La solucion de lejia se decanto en el interior de una campana esteril y se lavo tres veces con agua esteril. La superficie de las semillas de agrostide se esterilizo durante 20 minutos de forma similar.

Entre veinte y treinta semillas esterilizadas de cada especie se depositaron en medio de ensayo en placa de agar solidificado esteril (PTM, Plate Test Medium) [KNO3 2,5 mM, KH2PO4 2,5 mM, FeSO4 50 mM, NaE0TA 10 mM (pH 8,0), MgSO4 2 mM, Ca(NO3)2 2 mM, H38O3 70 !M, MnCl2 14 !M, CuSO4 0,5 !M, ZnSO4 1 !M, NaMoO4.2H2O 0,2 !M, NaCl 10 !M, CoCl2.H2O 10 nM, sacarosa 0,8% (p/v), agarosa 0,4% (p/v)] en placas de Petri de 60x15 mm (Falcon 1007). El PTM se modifico aradiendo hasta seis dosis de patrones de los herbicidas a analizar o diluciones de solucion de herbicida-enzima a analizar, de modo tal que los incrementos de concentracion de 4x abarcaran un rango de dosificacion de tres ordenes de magnitud, con el GR50 (reduccion del crecimiento del 50%) situado aproximadamente en el centro del rango.

En las soluciones problema de herbicida-enzima, la concentracion maxima se determino a partir de la concentracion nominal antes de que se produjera la degradacion enzimatica. Las semillas se esparcieron uniformemente aradiendo 3 ml de PTM fundido de la misma composicion, agitandolo con movimientos circulares y dejandolo solidificar. Las placas se cerraron y se mantuvieron en condiciones esteriles en una camara de crecimiento con poca luz (24 h dia-1, 100 !E/m2s1, 23'C) durante 7 dias. La longitud de las raices y de las raices+brotes se midieron en cinco plantas escogidas al azar de Arabidopsis y de agrostide, respectivamente, y se calculo la longitud media promedio (porcentaje del control no tratado) respecto a la concentracion nominal del herbicida y el GR50.

Este bioanalisis permitio confirmar la perdida de la actividad herbicida fruto de la degradacion por la AAD-1 (v1) de la cadena lateral de oxialcanoato en varios herbicidas de uso habitual en agronomia. En varios casos, el producto fenolico previsto se habia eluido junto con el acido original en la HPLC y el bioanalisis sirvio como principal prueba de la degradacion del herbicida. Las Tablas 6 y 7 ofrecen los sustratos herbicidas analizados.

Tabla 6. 8ioanalisis en placa con Arabidopsis de sustratos auxinicos comerciales de tipo fenoxi y piridiniloxialcanoato.

GR50 (nM)

Producto quimico analizado

Prod. quimico solo Prod. quimico + Vector blanco* Prod. quimico + AAD-1 v1 Cociente GR50** Estructura

2,4-0

22 17 267 16

0CP

>1000 nd nd nd

0iclorprop

nd 30 1000 33

Tabla 6. 8ioanalisis en placa con Arabidopsis de sustratos auxinicos comerciales de tipo fenoxi y piridiniloxialcanoato.

GR50 (nM)

Producto quimico analizado

Prod. quimico solo Prod. quimico + Vector blanco* Prod. quimico + AAD-1 v1 Cociente GR50** Estructura

Triclopir

255 1000 1000 1

Fluroxipir

2200 2250 1825 <1

*El vector blanco representa el tratamiento con lisado celular en que el vector pET de E. coli no tenia insertado ningun gen.

**El cociente GR50 es una medida de la perdida de la actividad herbicida en el tratamiento con lisado que expresa la enzima respecto a los tratamientos con el vector blanco. El umbral para detectar la perdida de actividad herbicida con este ensayo se situa en � 2.

Tabla 7. 8ioanalisis en placa con agrostide de sustratos ariloxifenoxialcanoato inhibidores de la ACCasa.

GR50 (nM)

Producto quimico analizado

Prod. quimico solo Prod. quimico + Vector blanco* Prod. quimico + AAD-1 v1 Cociente GR50** Estructura

Haloxifop-RS

28 21 520 25

0iclofop-RS

nd 20 130 7

10 *El vector blanco representa el tratamiento con lisado celular en que el vector pET de E. coli no tenia insertado ningun gen.

**El cociente GR50 es una medida de la perdida de la actividad herbicida en el tratamiento con lisado que expresa la enzima respecto a los tratamientos con el vector blanco. El umbral para detectar la perdida de actividad herbicida 15 con este ensayo se situa en � 2.

2.3-Resultados de la HPLC

La bibliografia revela que las enzimas dioxigenasa de esta clase requieren a-cetoglutarato como cosubstrato (vease

20 un esquema general en la Figura 1) y el ion ferroso para unirse al centro activo. Otros experimentos presentes en la bibliografia han demostrado que la adicion de ascorbato aumenta la actividad enzimatica al mantener el hierro en estado reducido, lo que evita la degradacion de la enzima. A tenor de este trabajo previo, se prepararon ensayos iniciales suponiendo que la enzima de interes actuaria del mismo modo que otros miembros de esta clase general de enzimas.

25 Sorprendentemente, los resultados iniciales de la HPLC revelaron la presencia de un nuevo pico en el minuto 6,1, ademas de un pico reducido de 2,4-0 a los 5,5 min. Este nuevo pico no estaba presente en el analisis control. Para identificar inicialmente el pico de los 6,1 minutos, se analizo un control de 0CP en las mismas condiciones y, como cabia esperar, este tambien eluyo a los 6,1 minutos. La formacion de este producto quedo confirmada por un

30 analisis colorimetrico que detecto fenoles (vease el ejemplo 3.1), asi como por una espectrometria de masas. Como se esperaba, la AAD-1 (v1) cataliza una reaccion similar a la de otros miembros de esta clase de enzimas. En los bioanalisis estas mismas muestras tambien evidenciaron una perdida casi completa de la actividad herbicida del 2,40 en el ensayo en placa con Arabidopsis (Figura 2). Independientemente de las condiciones especificas del ensayo (tiempo de incubacion mas largo, mas enzima), la HPLC revelo que solo el 50-75% del 2,4-0 pudo ser degradado a

35 0CP. 0e hecho, la prolongacion de la induccion de las celulas de E. coli 8L-21 con IPTG solo se tradujo en una reduccion de la actividad de la enzima, a pesar de que se expreso una mayor cantidad de proteina recombinante.

Una vez demostrada la degradacion del 2,4-0, se analizaron otros sustratos con grupos ciclicos similares (oxiacetatos y oxipropionatos). Los primeros compuestos analizados fueron los analogos piridinicos fluoroxipir y triclopir, que son piridiniloxiacetatos: no se detecto actividad enzimatica en ninguno de ellos. Otros ensayos con varios analogos de estos dos piridiniloxiacetatos desprovistos de fluor o de los grupos amino tampoco revelaron degradacion alguna. Resulta destacable, empero, que la adicion de fluor en la posicion 5 del 2,4-0 provocara una perdida casi total de la degradacion enzimatica (veanse mas resultados en el apartado siguiente).

A continuacion se analizaron los inhibidores de ACCasa haloxifop y diclofop en las mismas condiciones que el 2,4-0. (Los metabolitos fenolicos correspondientes coeluyeron con el compuesto original en las condiciones de HPLC empleadas). Los resultados de los bioanalisis de estas muestras revelaron una perdida de la actividad herbicida tanto en el caso del haloxifop (Figura 3) como del diclofop. Tales resultados quedaron confirmados por el analisis colorimetrico, que tambien se utilizo para analizar una muestra mas amplia de estos compuestos.

2.4-8ioanalisis en placa para estudiar la degradacion del herbicida.

Los resultados de los bioanalisis corroboraron los resultados iniciales de la HPLC que indicaban una perdida del 2,40 original tras la incubacion de soluciones del mismo con extractos sin purificar de AA0-1 recombinante (v1) (Figura 2). Asimismo, la actividad herbicida del acido fenoxipropionico diclorprop, tambien se vio degradada de manera efectiva. El cociente GR50 nominal correspondiente a la solucion de herbicida+enzima y a la solucion de herbicida sola sirvio como medida de la perdida de actividad del herbicida original causada por la actividad enzimatica. Un valor de 2-3 estuvo correlacionado normalmente con una perdida del 50-75% de la actividad del herbicida original (Tabla 6). Con frecuencia no se pudo determinar el GR50 tras el tratamiento enzimatico porque, de hecho, no quedaba actividad herbicida detectable.

Por su parte, los herbicidas AOPP tambien resultaron ser un sustrato excelente para la AA0-1 (v1), como demuestra la casi completa degradacion de la actividad graminicida en el bioanalisis en placa con agrostide (Figura 3 y Tabla 7). Este hecho resulta significativo porque supone la primera descripcion de un miembro de esta clase de enzimas que es activo contra herbicidas que no son auxinicos fenoxi. 0e ello se deduce que esta enzima es lo bastante promiscua para catabolizar sustancias quimicas dotadas de subestructuras fenoxialcanoato similares, aunque posean mecanismos de accion herbicida completamente dispares.

Ejemplo 3 - Valoración in vitro de la actividad de la AAD-1 (v1) mediante la detección colorimétrica de compuestos fenólicos

3.1- Valoracion de la AAD-1 (v1).

La actividad de la enzima AAD-1 (v1) se valoro con la deteccion colorimetrica de los productos fenolicos mediante un version modificada del protocolo de Fukumori y Hausinger (1993) (J. Biol. Chem. 268: 24311-24317) que permitia el analisis de microplacas de 96 pocillos. El analisis colorimetrico para valorar la actividad de las dioxigenasas que hidrolizan el 2,4-0 y el diclorprop hasta convertirlo en 2,4-diclorofenol ya ha sido descrito. No obstante, se podrian producir otros fenoles distintos a partir de otros herbicidas ariloxialcanoato como haloxifop y cihalofop (vease la Figura 4). El color desarrollado por varios fenoles se comparo con el del 2,4-diclorofenol con el metodo de deteccion descrito para averiguar que productos fenolicos podrian detectarse facilmente. Los fenoles y los analogos fenolicos se analizaron a un concentracion final de 100 !M en 0,15 ml de MOPS 20 mM y pH 6,75 que contenia NH4(FeSO4)2 200 !M y ascorbato sodico 200 !M. Los fenoles derivados del haloxifop y del cihalofop presentaron colores equivalentes a los del 2,4-diclorofenol y, por tanto, se detectaron facilmente. Los piridinoles derivados del fluoroxipir y el triclopir no generaron ningun color significativo. El color desarrollado por el 2,4-diclorofenol y el fenol de haloxifop resulto lineal y proporcional a la concentracion de fenol en la valoracion hasta -500 !M. Una curva de calibracion realizada en las condiciones de valoracion estandar (160 !l de volumen final analizado) indico que con 172 !M de fenol se obtenia una absorbancia a 510 nm de 0,1.

Los analisis de la enzima se efectuaron con un volumen total de 0,15 ml de MOPS 20 mM y pH 6,75 que contenian NH4FeSO4 200 !M, ascorbato sodico 200 !M, a-cetoglutarato 1 mM, el sustrato adecuado (obtenido de una solucion madre 100 mM y disuelto en 0MSO) y enzima. Las valoraciones se iniciaron aradiendo el sustrato de ariloxialcanoato, enzima o a-cetoglutarato en el momento cero. Al cabo de 15 minutos de incubacion a 25'C, la reaccion se detuvo aradiendo 10 !l de E0TA sodico 100 mM. El color se desarrollo aradiendo 15 !l de tampon a pH 10 (3,09 g de acido borico + 3,73 g de KCl + 44 ml de KOH 1 N), 1,5 !l de 4-aminoantipirina al 2% y 1,5 !l de ferricianuro potasico al 8%. Transcurridos de 10 a 20 min, se midio la absorbancia a 510 nm en un espectrofotometro de microplacas. Los blancos contenian todos los reactivos excepto la enzima para tener en cuenta la pequera contaminacion que a veces afecta a algunos sustratos por pequeras cantidades de fenoles. Las valoraciones posteriores se refinaron modificando los reactivos aradidos, tal y como se indica a continuacion: la reaccion se detuvo aradiendo 30 !l de una mezcla 1:1:1 de E0TA sodico 50 mM, tampon a pH 10 y 4aminoantipirina al 0,2%, y despues 10 !l de ferricianuro potasico al 0,8%.

3.2-Extraccion

Actividad de la AA0-1 recombinante (v1) expresada en Escherichia coli.

Se resuspendieron sedimentos celulares de E. coli con Tris 0,1 M, pH 7,4 + lisozima 1 mg/ml (5 ml/celulas para un cultivo de 250 ml; 20 ml/celulas para 1 litro) a temperatura ambiente. Transcurridos unos 15 minutos con agitacion ocasional, la suspension se congelo en nitrogeno liquido y despues se descongelo. Se aradio A0Nasa a una concentracion final de 0,02 mg/ml y MgCl2 a 1 mM. Una vez el extracto perdio la viscosidad, se centrifugo durante 15 min y el sobrenadante se transfirio a una columna 8ioRad 100G preequilibrada con MOPS 20 mM pH 6,75 y el eluato se fracciono en alicuotas y congelo a -70'C. Los analisis se realizaron con estos extractos desalados sin purificar o con las enzimas purificadas.

Con los protocolos descritos anteriormente se extrajo y se valoro el sedimento celular de un cultivo de 250 ml de celulas E. coli inducidas que expresaban el p0A83203 portador del gen AAD-1 (v1). La actividad degradadora del 2,4-0 en el extracto de AAD-1 (v1) se comparo con la de celulas E. coli que expresaban un vector sin AAD-1 (v1) utilizando 2,4-0 1 mM; los resultados se muestran en la Figura 5. La cantidad de 2,4-diclorofenol formada es claramente proporcional a la cantidad de extracto aradido para la valoracion, mientras que el extracto control no muestra ninguna actividad degradadora del 2,4-0.

La actividad de este extracto se analizo con otros cuatro herbicidas, a saber, (R,S)-diclorprop, (R,S)-mecoprop, (R,S)-haloxifop y (R,S)-diclofop y se comparo con la del 2,4-0 (todos a una concentracion final de 0,5 mM) con 4 !l de extracto de E. coli por analisis con un periodo de analisis de 15 min. La Figura 6A muestra que la AAD-1 (v1) degrado todos los cinco herbicidas transformandolos en fenol. La actividad relativa sobre los sustratos analizados fue la siguiente: diclorprop = mecoprop > diclofop > haloxifop > 2,4-0. Asi pues, la AAD-1 (v1) despliega actividad tanto contra los graminicidas de ariloxifenoxipropionato como contra los herbicidas auxinicos fenoxi.

Seguidamente, el extracto de AAD-1 (v1) se analizo con el racemato (R,S)-haloxifop, el R-enantiomero del haloxifop y el S-enantiomero del cihalofop (todos a 0,5 mM) como sustratos potenciales para dilucidar la posible especificidad enantiomerica de la AAD-1 (v1). Los resultados se presentan en la Figura 68. La actividad de la enzima sobre el (R)haloxifop resulto equivalente a la manifestada con (R,S)-haloxifop, mientras que no se aprecio actividad alguna con el S-enantiomero del cihalofop, lo que indica que la AAD-1 (v1) presenta una especificidad R en los AOPP.

Ejemplo 4 - Especificidad de sustrato de la AAD-1 (v1)

4.1- Otros sustratos de la AAD-1 (v1).

La especificidad de sustrato de la AAD-1 (v1) hacia diversos herbicidas comerciales y experimentales se analizo empleando AAD-1 (v1) purificada en una concentracion de 1 FALTA ALGO 10 !g por analisis de 160 !l; cada sustrato se analizo a 1 mM, con un tiempo para la valoracion de 15 minutos. La Tabla 3 muestra la A510 detectada despues de la accion de la AAD-1 (v1) sobre diversos herbicidas auxinicos y analogos auxinicos de ariloxialcanoato. El mejor sustrato analizado fue el diclorprop, aunque el mecoprop tambien se degrado notablemente. Otros dos fenoxipropionatos, los analogos 4-fluoro y 3-amino del diclorprop, tambien fueron degradados con eficacia por la AAD-1 (v1). La AAD-1 (v1) produjo pequeras cantidades de fenol a partir de diversos fenoxiacetatos, incluido el 2,4

0. Las tasas relativas sobre estos sustratos se aprecian mejor en los analisis realizados con la cantidad mas grande (10 !g) de AAD-1 (v1). 0e estos datos se deduce que el 2,4-0 es degradado por la AAD-1 (v1), al igual que dos fenoxialquilsulfonatos, X188476 y X398166 (sesona).

La Tabla 4 contiene los datos de diversos graminicidas AOPP en calidad de sustratos de la AAD-1, asi como del fitoprotector cloquintocet. Todos los herbicidas AOPP comerciales analizados fueron degradados de manera efectiva por la AAD-1 (v1). Se trata de un descubrimiento inesperado que aumenta enormemente la utilidad potencial de esta enzima para conferir resistencia a una amplia gama de herbicidas graminicidas en aplicaciones transgenicas, ademas de frente a herbicidas auxinicos. La AAD-1 (v1) presento su mayor actividad contra el quizalofop (76% de la tasa del diclorprop) y la menor contra el cihalofop (27% de la tasa del quizalofop, 21% de la tasa del diclorprop). El analogo ariloxiacetato del haloxifop (X043865) fue degradado muy lentamente, con solo un pequero aumento de la A510 tras la exposicion a la cantidad mas elevada de enzima (10 !g). Este hecho concuerda con la mayor actividad de la AAD-1 (v1) manifestada contra los fenoxipropionatos respecto a los fenoxiacetatos auxinicos. La actividad minima se detecto con (S)-cihalofop, lo cual indica que la AAD-1 (v1) presenta una preferencia significativa por los R-enantiomeros de los sustratos ariloxipropionato. 0e forma similar, no se aprecio actividad contra el cloquintocet, un fitoprotector quinolinoxiacetato, lo que coincide con la observacion de que la AAD-1 (v1) prefiere los sustratos ariloxipropionato a los herbicidas auxinicos fenoxi.

Los sustratos X11115427, X124987 y MCPA se analizaron a 1 mM empleando 27 !g de AAD-1 (v1) recombinante sin purificar por valoracion. Los tres compuestos fueron degradados por la AAD-1 (v1) pero con diferente efectividad relativa (Tabla 8). El X11115427 actuo como un sustrato ligeramente mejor que el 2,4-0 (125% de la tasa del 2,4-0) a diferencia del analogo cercano 3-amino-diclorprop, que es -7 veces mejor que el 2,4-0 como sustrato (Tabla 3). La

sustitucion 5-F parece disminuir la efectividad del X11115427 como sustrato de la AAD-1 (v1). Las tasas de formacion de producto correspondientes al 5-F-fenoxiacetato y al MCPA supusieron el 32% y 55% de las del 2,4-0, respectivamente.

Tabla 8: Efecto de la AAD-1 (v1) sobre tres substratos respecto al 2,4-0. Los sustratos fueron valorados como se indica en la Tabla 6 a 1 mM utilizando un extracto sin purificar de AAD-1 (v1) recombinante obtenido en E. coli.

Tabla 8. Efecto de la AAD-1 (v1) sobre tres substratos respecto al 2,4-0.

ID de registro

Estructura molecular Compuesto A510 % 2,4-D

195517

2,4-0 0,177 100

11115427

(R,S)-3-amino, 5-Fdiclorprop 0,221 125

124987

5-F, 2,4-0 0,056 32

192711

MCPA 0,097 55

4.2-Analisis cinetico.

10 Los valores Km y kcat de la AAD-1 (v1) purificada (vease el Ejemplo 10) se calcularon con cuatro sustratos herbicidas, a saber: (R)-diclorprop, (R)-haloxifop, (R)-quizalofop y 2,4-0, en condiciones de analisis estandar (MOPS 25 mM a pH 6,8; ascorbato sodico 200 !M; Fe2+ 200 !M; a-cetoglutarato 1 mM; 25'C). Las curvas dosis-respue sta se ajustaron con Grafit (Erithacus Software, Reino Unido) y las graficas y las constantes obtenidas se muestran en la

15 Figura 7 y la Tabla 9. Los valores Km de los cuatro sustratos resultaron bastante similares (75-125 !M), pero los valores kcat variaron sustancialmente. El (R)-diclorprop presento el valor kcat mas alto y el 2,4-0 el mas bajo (10% del valor del (R)-diclorprop). Estos valores kcat concordaron con el rango de valores observado en los ensayos de especificidad para el sustrato que aparecen en las Tablas 3 y 4, ya que estos se realizaron con elevadas (saturantes) concentraciones de sustrato (1 mM).

20 Tabla 9: Constantes cineticas de los sustratos de la AAD-1 (v1). Las constantes cineticas se calcularon con los datos de la Figura 7 aplicando un ajuste con Grafit a la ecuacion de Michaelis-Menten.

Tabla 9. Constantes cineticas de los sustratos de la AA0-1 (v1).

Sustrato

Km(µM) ±SE Vmax (µmol min-1 mg -1 AAD1) ± SE kcat (min-1) kcat/Km (min-1 mM-1)

R-diclorprop

75 ± 10 0,79 ±0.03 26,1 348

R-quizalofop

125 ±20 0,57 ± 0.03 18,9 151

R-haloxifop

120 ±54 0,34 ± 0.04 11,2 94

2,4-0

96 ±8 0,57 ±0.00 2,7 28

25 Los valores relativos de Km y kcat correspondientes al diclorprop y al 2,4-0 difirieron significativamente de los publicados para la dioxigenasa R-especifica de Delftia acidovorans por (estendorf et al. (2003) (Acta Biotechnol.

23: 3-17). El valor kcat/Km publicado del 2,4-0 supone el 0,6% del valor del diclorprop, mientras que en nuestros estudios, el valor kcat/Km del 2,4-0 supone el 8% del de diclorprop. Por tanto, en el presente estudio, la AAD-1 (v1) resulto inesperadamente eficaz a la hora de catalizar la degradacion del 2,4-0. Esto aumenta su utilidad potencial

30 para conferir diversos caracteres de tolerancia a herbicidas en aplicaciones transgenicas.

4.3-Otros sustratos de la AA0-1 (v1).

Tres sustratos mas se analizaron a 1 mM utilizando 27 !g de AA0-1 recombinante (v1) bruta por valoracion:

X11115427, X124987 y MCPA. Los resultados se muestran en la Tabla 8. Los tres compuestos fueron degradados por la AA0-1 (v1), pero con diferente efectividad relativa. El X11115427 solo fue ligeramente mejor (125%) como sustrato que el 2,4-0. Esto contrasta con el 3-aminodiclorprop, que es >7 veces mejor que el 2,4-0 como sustrato (Tabla 3). Por tanto, la sustitucion 5-F redujo significativamente la efectividad del X11115427 como sustrato para la AA0-1 (v1). Una tendencia similar se observo en el caso del 5-F-2,4-0, que solo alcanzo una efectividad del 32% como sustrato respecto al 2,4-0. En este analisis, el MCPA tambien resulto menos efectivo como sustrato de la AA0-1 (v1) (55% respecto al 2,4-0).

Ejemplo 5 -Optimización de la secuencia para la expresión en vegetales

5.1- Antecedentes.

A fin de obtener una elevada de expresion de genes heterologos en vegetales, puede ser preferible modificar con tecnicas de ingenieria genetica dichos genes para que se expresen con mas eficiencia en (el citoplasma de) las celulas vegetales. El maiz es una de las especies vegetales en las que puede ser preferible rediserar el gen o genes heterologos antes de la transformacion para aumentar su nivel de expresion en la planta. Por consiguiente, un paso adicional en el disero de genes que codifican una proteina bacteriana consiste en modificar el gen heterologo para lograr una expresion optima.

Uno de los motivos para modificar con tecnicas de ingenieria genetica una proteina bacteriana que pretenda expresarse en el maiz radica en el contenido inadecuado de G+C del gen original. Por ejemplo, el contenido sumamente bajo de G+C de muchos genes bacterianos (y por tanto, la tendencia a un elevado contenido de A+T) da lugar a secuencias que imitan o duplican las secuencias de control genico de los vegetales que son muy ricas en A+T. La presencia de ciertas secuencias ricas en A+T en el A0N del gen o genes introducidos en las plantas puede ocasionar una transcripcion aberrante (por ejemplo, las regiones TATA box que suelen hallarse en los promotores genicos). Por otro lado, la presencia de otras secuencias reguladoras en el ARNm transcrito (por ejemplo, secuencias de seral de poliadenilacion (AAUAAA), o secuencias complementarias a los ARN nucleares pequeros implicados en el empalme del pre-ARNm) puede provocar inestabilidad en el ARN. Asi pues, un objetivo en el disero de genes que codifican una proteina bacteriana que se pretende expresar en maiz, preferiblemente denominados genes optimizados para vegetales, consiste en crear una secuencia de A0N con un contenido mas elevado de G+C que, preferiblemente, resulte similar a la de los genes del maiz que codifican las enzimas metabolicas. Otro objetivo en el disero de los genes optimizados para vegetales que codifican una proteina bacteriana consiste en generar una secuencia de A0N cuyas modificaciones no obstaculicen su traduccion.

La Tabla 10 ilustra el elevado contenido de G+C del genoma del maiz. Las regiones codificantes de los genes se extrajeron de las entradas del Gen8ank (Release 71) y las composiciones de bases se calcularon con el programa MacVector� (Accelerys, San 0iego, California, EE.UU.). Las secuencias intronicas no se tuvieron en cuenta en los calculos.

Tabla 10: Compilacion de contenidos G+C en las regiones codificantes de proteinas de genes del maiz

Clase de proteina a

Rango % G + C Media % G + C b

Enzimas metabolicos (76)

44,4-75,3 59,0 (+-8,0)

Proteinas estructurales (18)

48,6-70,5 63,6 (+-6,7)

Proteinas reguladoras (5)

57,2-68,8 62,0 (+-4,9)

Proteinas sin caracterizar (9)

41,5-70,3 64,3 (+-7,2)

Todas las proteinas (108)

44,4-75,3 60,8 (+-5,2)

a El numero de genes de la clase se indica entre parentesis. b Valores de la desviacion estandar indicados entre parentesis. c La media de los grupos combinados no se tuvo en cuenta en el calculo de la media.

0ebido a la flexibilidad proporcionada por la redundancia/degeneracion del codigo genetico (algunos aminoacidos son codificados por mas de un codon), la evolucion de los genomas en distintos organismos o clases de organismos se ha decantado hacia un uso diferencial de codones redundantes. Esta "preferencia codonica" queda reflejada en la composicion media de bases de las regiones codificantes de proteinas. Por ejemplo, los organismos con un contenido relativamente bajo de G+C utilizan codones portadores de A o T en la tercera posicion de los codones redundantes, mientras que aquellos con contenidos de G+C mas altos utilizan codones cuya tercera posicion acoge G o C. Se cree que la presencia de codones "menores" dentro del ARNm podria reducir su tasa absoluta de traduccion, especialmente cuando la abundancia relativa del ARNt cargado correspondiente al codon menor es baja. Una consecuencia de esto es que la disminucion de la tasa de traduccion por codones menores individuales seria como minimo aditiva para los codones menores multiples. Y, por consiguiente, los ARNm cuyo contenido de codones menores sea relativamente alto tendran bajas tasas de traduccion. Y esto, a su vez, daria como resultado niveles bajos de la proteina codificada.

En genes modificados geneticamente que codifican una proteina bacteriana para ser expresada en maiz (u otra planta, como el algodon o la soja) se ha determinado la preferencia codonica de la planta. La preferencia codonica del maiz es la distribucion estadistica de los codones que la planta utiliza para codificar sus proteinas; los codones utilizados con mas preferencia se muestran en la Tabla 11. Una vez determinada la preferencia, se determina la frecuencia porcentual de los codones en el gen o genes de interes. 0eben averiguarse que codones son preferidos en primer lugar por la planta, asi como las segundas, terceras y cuartas opciones de codones, en el caso de que existan. Entonces se puede diserar una nueva secuencia de A0N que codifique la secuencia de aminoacidos de la proteina bacteriana, pero esta nueva secuencia de A0N diferira de la secuencia bacteriana original (que codifica la proteina) por la sustitucion con codones vegetales (primera, segunda, tercera o cuarta opcion preferidas) para especificar el aminoacido en cada posicion de la secuencia proteica. A continuacion, la nueva secuencia se analiza para detectar dianas de restriccion que se hayan podido crear accidentalmente a raiz de la modificacion. Las dianas identificadas son modificadas reemplazandolas por codones de primera, segunda, tercera o cuarta opcion. Otros lugares de la secuencia que pueden alterar la transcripcion o la traduccion del gen de interes son las uniones exon:intron (5' o 3'), serales de adicion de poli A, o serales de terminacion para la ARN polimerasa. La secuencia se vuelve a analizar y a modificar para reducir la frecuencia de dobletes TA o GC. Ademas de los dobletes, los segmentos de secuencia G o C que contienen mas de cuatro residuos iguales aproximadamente pueden afectar a la transcripcion de la secuencia y, por consiguiente, estos bloques tambien se modifican sustituyendo los codones de primera o segunda eleccion, etc. con la siguiente opcion preferida.

Tabla 11. Codones de aminoacidos preferidos para las proteinas expresadas en el maiz

Aminoacido

Codon*

Alanina

GCC/GCG

Cisteina

TGC/TGT

Acido aspartico

GAC/GAT

Acido glutamico

GAG/GAA

Fenilalanina

TTC/TTT

Glicina

GGC/GGG

Histidina

CAC/CAT

Isoleucina

ATC/ATT

Lisina

AAG/AAA

Leucina

CTG/CTC

Metionina

ATG

Asparragina

AAC/AAT

Prolina

CCG/CCA

Glutamina

CAG/CAA

Arginina

AGG/CGC

Serina

AGC/TCC

Treonina

ACC/ACG

Valina

GTG/GTC

Triptofano

TGG

Tirosina

TAC/TAT

Parada

TGA/TAG

Se prefiere que los genes optimizados para vegetales que codifican una proteina bacteriana contengan alrededor del 63% de codones de primera eleccion, entre aproximadamente el 22% y aproximadamente el 37% de codones de segunda eleccion y entre alrededor del 15% y alrededor del 0% de codones de tercera o cuarta eleccion, hasta sumar el porcentaje total del 100%. Los genes optimizados para vegetales preferidos principalmente contienen alrededor de un 63% de codones de primera eleccion, al menos aproximadamente un 22% de codones de segunda eleccion, aproximadamente un 7,5% de codones de tercera eleccion y aproximadamente un 7,5% de codones de cuarta eleccion, hasta sumar el porcentaje total del 100%. El metodo descrito permite a un experto en la materia modificar un gen o genes que son foraneos para una planta dada, de modo que se expresen optimamente en plantas. El metodo se muestra con mas detalle en la solicitud PCT (O 97/13402.

Asi pues, el disero de genes optimizados para vegetales que codifiquen una proteina bacteriana pasa por diserar una secuencia de A0N que codifique la secuencia de aminoacidos de dicha proteina utilizando un codigo genetico redundante confeccionado a partir de una tabla de preferencia codonica compilada a partir de las secuencias genicas de esa planta en particular. La secuencia de A0N resultante posee un mayor grado de diversidad codonica, una composicion de bases conveniente, puede contener dianas para enzimas de restriccion ubicadas estrategicamente y carece de secuencias que puedan interferir con la transcripcion del gen o con la traduccion del ARNm resultante. 0e ese modo, los genes sinteticos que sean funcionalmente equivalentes a las proteinas/genes de la presente invencion se podran utilizar para transformar hospedadores, incluidas plantas. Se pueden encontrar

mas directrices sobre la produccion de genes sinteticos en, por ejemplo, la patente US n° 5.380.831.

5.2 - Analisis de la reconstruccion.

5 El analisis exhaustivo de las 888 pares de bases (pb) de la secuencia de A0N de la region codificante original del AAD-1 (v1) (SEC I0 n° 3) revelo la presencia de varios motivos de secuencia que se cree que afectan negativamente a la expresion optima en vegetales, asi como una composicion codonica que no resulta optima. Para mejorar la produccion de la proteina recombinante tanto en monocotiledoneas como en dicotiledoneas, se desarrollo una secuencia de A0N "optimizada para vegetales" (SEC I0 n° 5) que codifica la SEC I0 n° 11, que es la misma que

10 la SEC I0 n° 9 original excepto por la adicion de un residuo de alanina en la segunda posicion. El codon adicional de alanina (GCT; subrayado en la SEC I0 n° 5) se incluyo para codificar una diana para Nco I (CCATGG) que abarcaba el codon de inicio ATG, para permitir posteriores operaciones de clonacion. Las proteinas codificadas por las regiones codificantes original (v1) y optimizadas para vegetales (v3) son identicas en un 99,3%, difiriendo unicamente en el aminoacido numero 2. En cambio, las secuencias de A0N original (v1) y optimizadas para

15 vegetales (v3) de las regiones codificantes unicamente son identicas en un 77,7%. Se efectuo una alineacion de la secuencia del A0N original y del A0N optimizado para vegetales y en la Tabla 12 se muestran las diferencias en la composicion codonica de la secuencia original y de la secuencia optimizada para plantas.

Tabla 12. Comparacion de la composicion codonica de la region codificante del AAD-1 (v1) original y de su version optimizada para vegetales.

Aminoacido

Codon N.° gen original % gen origi-nal N.° gen opt. plantas % gen opt. plantas Aminoacido Codon N.° gen original N.° gen opt. plantas % gen opt. plantas

ALA (A)

GCA 2 9,1 5 22 LEU (L) CTA 0 0,0 0 0

GCC

10 45,5 8 35 CTC 5 22,7 7 32

22

GCG 9 40,9 0 0 CTG 16 72,7 0 0

GCT

1 4,5 10 43 22 CTT 0 0,0 8 36

ARG (R)

AGA 0 0,0 7 30 TTA 0 0,0 0 0

AGG

0 0,0 7 30 TIG 1 4,5 7 32

CGA

0 0,0 0 0 LYS (K) AAA 1 14,3 2 29

23

CGC 16 69,6 5 22 7 AAG 6 85,7 5 71

CGG

4 17,4 0 0 MET (M) ATG 8 100 8 100

CGT

3 13,0 4 17 PHE(F) TTC 10 76,9 9 69

ASN (N)

AAC 8 100,0 4 50 13 TTT 3 23,1 4 31

8

AAT 0 0,0 4 50 PRO (P) CCA 1 5,9 8 47

ASP(0)

GAC 15 78,9 10 53 CCC 9 52,9 1 6

19

GAT 4. 21,1 9 47 17 CCG 7 41,2 o- 0

CYS (C)

TGC 3 100,0 2 67 CCT 0 0,0 8 47

3

TGT 0 0,0 1 33 SER (S) AGC 11 73,3 4 27

EN0

TAA 0 0,0 0 0 AGT 0 0,0 0 0

1

TAG 1� 100,0 0 0 15 TCA 0 0,0 4 27

TGA

0 0,0 1 100 TCC 2 13,3 3 20

GLN (Q)

CAA 0 0,0 7 54 TCG 2 13,3 0 0

13

CAG 13 100,0 6 46 TCT 0 0,0 4 27

GLU (E)

GAA 8 50,0 5 31 THR (T) ACA 1 4,3 6 26

16

GAG 8 50,0 11 69 ACC 16 69,6 9 39

GLY (G)

GGA 0 0,0 6 29 23 ACG 5 21,7 0 0

GGC

15 71,4 7 33 ACT 1 4,3 8 35

21

GGG 3 14,3 2 10 TRP(() TGG 5 100 5 100

GGT

3 14,3 6 29 TYR (Y) TAC 7 70,0 6 60

HIS(H)

CAC 6 60,0 5 50 10 TAT 3 30,0 4 40

10

CAT 4 40,0 5 50 VAL(V) GTA 2 7,1 0 0

ILE(I)

ATA 0 0,0 3 25 GTC 11 39,3 8 29

12

ATC 12 100,0 5 42 28 GTG 15 53,6 10 36

ATT

0 0,0 4 33 GTT 0 0,0 10 36

Totales

148 149 Totales 148 148

20 5.3 - Construccion de los vectores binarios 5.3.1-AAD-1 reconstruido (v3). El gen optimizado para vegetales AAD-1 (v3) fue suministrado por Picoscript (acabado el disero de reconstruccion

25 del gen (vease arriba), la sintesis se encargo a Picoscript) y la secuencia (SEC I0 n° 5) se verifico internamente para

confirmar que no contenia alteraciones respecto a la secuencia esperada. Las reacciones de secuenciacion se llevaron a cabo con cebadores directos de M13 (SEC I0 n° 16) e inversos de M13 (SEC I0 n° 17) utilizando reactivos del "0ye Terminator Cycle Sequencing with Quick Start Kit" de 8eckman Coulter como se ha indicado antes. Los datos de la secuencia se analizaron y los resultados indicaron que la secuencia de A0N del AAD-1 (v3) optimizado para plantas no contenia anomalias. El gen AAD-1 (v3) se clono en p0A8726 como un fragmento Nco I-Sac I. El constructo resultante se disero como un p0A8720, que contenia: [promotor AtUbi10: Nt OSM 5'UTR: AAD1 (v3): Nt OSM3'UTR: ORF1 poliA 3'UTR] (verificado con digestiones con la enzima de restriccion Not I). Un fragmento Not I-Not I que contenia la casete descrita se clono a continuacion en el sitio Not I del vector binario p0A83038. El vector binario resultante, p0A8721, que contenia la siguiente casete [promotor AtUbi10: Nt OSM5'UTR: AAD-1 (v3): Nt OSM 3'UTR: ORF1 poliA 3'UTR: promotor CsVMV: PAT: ORF25/26 3'UTR] se digirio con enzimas de restriccion (8am HI, EcoR I, EcoR V, Hin0 III, Pac I y Xmn I) para verificar que la orientacion era correcta. El constructo acabado y verificado (p0A8721) se empleo para la transformacion en Agrobacterium (vease el apartado 6.2).

5.3.2-AAD1 natural (v1) y AAD-1 modificado (v2).

El gen AAD-1 (v1) (SEC I0 n° 3) se amplifico con PCR a partir del p0A83203. 0urante la reaccion de PCR, se modificaron los cebadores para introducir dianas de restriccion para NcoI y SacI en el cebador 5' y en el cebador 3', respectivamente. Para amplificar el fragmento de A0N se emplearon los cebadores "rdpA(ncoI)" [CCC ATG GCT GCT GCA CTG TCC CCC CTC TCC] (SEC I0 n° 6) y "3' saci" [GAG CTC ACT AGC GCG CCG GGC GCA CGC CAC CGA] (SEC I0 n° 7) con el sistema Fail Safe PCR System (Epicenter).

El amplicon de PCR se ligo a un vector de clonacion pCR 2.1 TOPO TA (Invitrogen) y la secuencia se verifico con cebadores directos de M13 (SEC I0 n° 16) e inversos de M13 (SEC I0 n° 17) utilizando los reactivos de secuenciacion del "0ye Terminator Cycle Sequencing with Quick Start Kit" de 8eckman Coulter.

Los datos de secuenciacion identificaron a un clon con la secuencia correcta. 0urante el analisis se descubrio una diana de restriccion para NotI que era superflua, situada hacia el extremo 3' del AAD-1 (v1). Esta diana se elimino para facilitar la clonacion en p0A83038; para eliminarla se llevo a cabo una reaccion de PCR con un cebador 5' interno. La diana de NotI se altero incorporando un nuevo codon para un aminoacido con el fin de eliminar la diana falsa de NotI. Este cambio alteraria la arginina de la posicion 212 convirtiendola en una cisteina. Se usaron los cebadores de PCR "8stEII/0el NotI" [TGG TGG TGA CCC ATC CGG GCA GCG GCT GCA AGG GCC] (SEC I0 n° 8) y "3' saci" (SEC I0 n° 7).

Se realizo una reaccion PCR con el sistema Fail Safe PCR System (Epicenter) y el fragmento resultante se clono en el kit de clonacion pCR 2.1 TOPO TA (Invitrogen). La confirmacion del producto de PCR correcto se llevo a cabo secuenciando el A0N y el gen "fijado" recibio la designacion de AAD-1 (v2) (SEC I0 n° 4).

La reaccion de secuenciacion con el cebador inverso de M13 (SEC I0 n° 17) y los reactivos de secuenciacion "0ye Terminator Cycle Sequencing with Quick Start Kit" de 8eckman Coulter indico que se habia aislado el fragmento de PCR correcto. Este constructo se digirio con las enzimas 8stEII y SacI. El fragmento resultante se clono en el constructo pCR2.1 AAD-1 (v2) (pCR2.1 0elta NotI) y se confirmo mediante una digestion con enzima de restriccion.

Acto seguido, el gen AAD-1 (v2) modificado se clono en el p0A8726 en forma de un fragmento de A0N NcoI/SacI. El constructo resultante (p0A8708) se verifico con digestiones por enzimas de restriccion y despues se clono en el vector binario p0A83038 como un fragmento NotI-NotI. El constructo final resultante recibio la designacion p0A8766, que contenia el [promotor AtUbi10: Nt OSM5'UTR: AAD-1 (v2): Nt OSM 3'UTR: ORF1 poliA 3'UTR: promotor CsVMV: PAT: ORF25/26 3'UTR] y fue digerido con enzimas de restriccion para verificar que la orientacion era correcta. El constructo acabado se uso entonces para la transformacion en Agrobacterium.

5.3.3 -0isero de una secuencia de A0N con codones adaptados a la soja que codifica una EPSPS de soja portadora de mutaciones que confieren tolerancia al glifosato.

Este ejemplo ilustra el disero de una nueva secuencia de A0N que codifica una 5-enolpiruvoilshikimato 3-fosfato sintasa (EPSPS) mutante de soja, optimizada para la expresion en celulas de soja. La secuencia de aminoacidos de una EPSPS de soja con tres mutaciones se muestra como la SEC I0 n° 5 del documento (O 2004/009761. Los aminoacidos mutados en dicha secuencia son el residuo 183 (treonina de la proteina original sustituida por una isoleucina), residuo 186 (arginina de la proteina original sustituida por una lisina) y residuo 187 (prolina de la proteina original sustituida por una serina). Asi pues, es posible deducir la secuencia de aminoacidos de la proteina EPSPS de soja original reemplazando los aminoacidos sustituidos de la SEC I0 n° 5 del documento (O 2004/009761 con los aminoacidos originales en las posiciones adecuadas. Esta secuencia original de la proteina se presenta en la presente memoria como la SEC I0 n° 20. En la presente memoria tambien se expone una secuencia de proteina EPSPS de soja portadora de dos mutaciones, a saber, una mutacion en el residuo 183 (treonina de la proteina original sustituida por una isoleucina) y en el residuo 187 (prolina de la proteina original sustituida por una serina), presentada en la presente memoria como la SEC I0 n° 21.

A partir de la pagina web "kazusa.or.jp/codon" se obtuvo una tabla de uso de codones correspondiente a las secuencias codificantes de proteinas de la soja (Glycine max), calculada a partir de 362.096 codones (aproximadamente 870 secuencias codificantes). Estos datos se reformatearon tal y como se muestra en la Tabla

5 13. Las columnas 0 y H de la Tabla 13 presentan las distribuciones (en % de uso de todos los codones para ese aminoacido) de los codones sinonimos de cada aminoacido, tal y como se hallan en las regiones codificantes de proteinas de los genes de soja. Es evidente que algunos codones sinonimos de algunos aminoacidos (un aminoacido puede estar codificado por 1, 2, 3, 4, 6 codones) raramente estan presentes en las regiones codificantes de proteinas de la soja (por ejemplo, comparese el uso de los codones GCG y GCT que codifican la alanina). A 10 partir de los datos de la Tabla 13 se elaboro una tabla con los codones preferidos por la soja. Los codones hallados en los genes de soja con una frecuencia inferior aproximadamente al 10% del total de apariciones de un aminoacido en particular se descartaron. Para equilibrar la distribucion de las restantes opciones de codon para un aminoacido, se calculo un promedio ponderado de cada codon con la formula:

15 % ponderado de C1 =1/(%C1 + %C2 + %C3 + etc.) x %C1 x 100

donde C1 es el codon en cuestion, C2, C3, etc. representan los codones sinonimos restantes y los valores % para los codones relevantes se toman de las columas 0 y H de la Tabla 13 (descartando los valores de los codones muy poco frecuentes, seralados en negrita). El valor % ponderado de cada codon se ofrece en las columnas C y G de la

20 Tabla 13. TGA se escogio arbitrariamente como codon terminador de la traduccion. Las frecuencias de los codones preferidos se introdujeron en una tabla de codigo genetico especializada para el uso con el programa de disero de genes OptGene� (Ocimum 8iosolutions LLC, Indianapolis, Indiana).

Tabla 13. Representacion de los codones sinonimos presentes en las secuencias codificantes de proteina de la soja y calculo de un conjunto de representacion de los codones preferidos para el disero de un gen sintetico optimizado para la soja.

A

B C D E F G H

Aminoácido

Codón Ponderado % Soja % Aminoácido Codón Ponderado % Soja %

ALA (A)

GCA 33,1 30,3 LEU (L) CTA DNU 9,1

GCC

24,5 22,5 CTC 22,4 18,1

GCG

DNU* 8,5 CTG 16,3 13,2

GCT

42,3 38,7 CTT 31,5 25,5

ARG (R)

AGA 36,0 30,9 TTA DNU 9,8

AGG

32,2 27,6 TTG 29,9 24,2

CGA

DNU 8,2 LYS (K) AAA 42,5 42,5

CGC

14,8 12,7 AAG 57,5 57,5

CGG

DNU 6,0 MET (M) ATG 100,0 100

CGT

16,9 14,5 PHE (F) TTC 49,2 49,2

ASN (N)

AAC 50,0 50,0 TTT 50,8 50,8

AAT

50,0 50,0 PRO (P) CCA 39,8 36,5

ASP (D)

GAC 38,1 38,1 CCC 20,9 19,2

GAT

61,9 61,9 CCG DNU 8,3

CYS (C)

TGC 50,0 50,0 CCT 39,3 36,0

TGT

50,0 50,0 SER (S) AGC 16,0 15,1

END

TAA DNU 40,7 AGT 18,2 17,1

TAG

DNU 22,7 TCA 21,9 20,6

TGA

100,0 36,6 TCC 18,0 16,9

GLN (Q)

CAA 55,5 55,5 TCG DNU 6,1

CAG

44,5 44,5 TCT 25,8 24,2

GLU (E)

GAA 50,5 50,5 THR (T) ACA 32,4 29,7

GAG

49,5 49,5 ACC 30,2 27,7

GLY (G)

GGA 31,9 31,9 ACG DNU 8,3

GGC

19,3 19,3 ACT 37,4 34,3

GGG

18,4 18,4 TRP (W) TGG 100,0 100

GGT

30,4 30,4 TYR (Y) TAC 48,2 48,2

HIS (H)

CAC 44,8 44,8 TAT 51,8 51,8

CAT

55,2 55,2 VAL (V) GTA 11,5 11,5

ILE (I)

ATA 23,4 23,4 GTC 17,8 17,8

ATC

29,9 29,9 GTG 32,0 32,0

ATT

46,7 46,7 GTT 38,7 38,7

25 *0NU = no usar

Para obtener una secuencia de A0N optimizada para soja que codificase la proteina EPSPS portadora de dos mutaciones, se tradujo en sentido inverso la secuencia proteinica de la SEC I0 n° 21 con el programa OptGene� utilizando el codigo genetico adaptado a la soja indicado arriba. La secuencia inicial de A0N obtenida de esa forma se modifico compensando los cambios de codon (conservando la representacion media ponderada total de los codones) para reducir el numero de dobletes CG y TA entre codones adyacentes, aumentar el numero de dobletes CT y TG entre codones adyacentes, eliminar estructuras secundarias intracatenarias muy estables, eliminar o aradir dianas de restriccion y eliminar otras secuencias que pudieran afectar negativamente a la expresion o las operaciones de clonacion del gen modificado. Otros refinamientos de la secuencia consistieron en eliminar posibles sitios de escision de intrones vegetales, largos tramos de residuos de A/T o C/G y otros motivos que podrian interferir con la estabilidad del ARN, su transcripcion o la traduccion de la region codificante en las celulas vegetales. Se hicieron otros cambios para eliminar grandes marcos de lectura abiertos internos (marcos distintos de +1). Estos cambios se aplicaron de forma limitada para conservar la composicion de codones adaptados a la soja descrita arriba y preservar la secuencia de aminoacidos revelada en la SEC I0 n° 21.

La secuencia de A0N adaptada a la soja que codifica la proteina EPSPS de la SEC I0 n° 21 se ofrece como las bases 1-1575 de la SEC I0 n° 22. La sintesis del fragmento de A0N que comprende la SEC I0 n° 22 corrio a cargo de un proveedor comercial (PicoScript, Houston TX).

5.3.4 -Clonacion de otros constructos binarios.

Para acabar los p0A83295 y p0A83757 se utilizo la tecnica de clonacion Gate(ay (Invitrogen, n.° catalogo 11791043 y n.° catalogo 12535-019). Esta tecnica utiliza una recombinacion especifica de sitio basada en el fago lambda para insertar una casete genica en un vector. Para mas informacion vease Gateway Technology: A universal technology to clone DNA sequence for functional analysis and expression in multiple systems, � 1999-2003, Invitrogen Corp., 1600 Faraday Ave., Carlsbad, California 92008, EE.UU. (publicado - 2003). Los demas constructos creados para la transformacion en especies vegetales adecuadas se construyeron por medio de procedimientos similares al de arriba y otros metodos moleculares de clonacion habituales (Maniatis et al., 1982). La Tabla 14 enumera todos los constructos de transformacion utilizados con los promotores apropiados y las caracteristicas definidas, asi como el cultivo objeto de la transformacion.

El gen sacB se inserto en el vector binario p0A83289 como un marcador de seleccion bacteriano negativo para reducir la persistencia de Agrobacterium asociada con el tejido vegetal transformado. Sac8 es una enzima levanosacarasa sintetizada por Bacillus spp. que resulta toxica para la mayoria de bacterias gramnegativas cuando crecen en presencia de sacarosa (Gay et al., 1983). El gen sacB se recupero en un fragmento Hind III del plasmido pRE112 (Edwards, et al., 1998) y se clono en la diana unica para Hind III del p0A83289.

Tabla 14. Constructos binarios utilizados para la transformacion de diversas especies vegetales. Gen de

Gen de Gen de Gen de Metodo

N' N' Especies * Promo- Caracte- Caracte- Pro-

interes

GOI 2

seleccion selec.

selec.

Promotor transfor-

p0A8 p0AS transformadas tor ristica 1 ristica 2 motor

(GOI) bacteriano bact. 2 vegetal macion

8inario

-

721 A, T, Ct, S, Ca AA01 v3 AtUbi10 NtOsm -

-

-

Eritromicina pat CsVMV

con Agro. Espectinomi-

8inario

3230 A EPSPS AtUbi10 NtOsm R87 Mar v2 -AA01 v3 CsVMV

cina

con Agro. Espectinomi-

8inario

3289 S AA01 v3 CsVMV NtOsm R87 Mar v2

EPSPS

AtUbilO sac8 Hptll AtUbi3

cina

con Agro. Espectinomi-

8inario

-

3291 S AA01 v3 CsVMV NtOsm R87 Mar v2

EPSPS

AtUbilO Hptll AtUbi3

cina

con Agro. Espectinomi-

Chorro

-

3295 S AA01 v3 CsVMV NtOsm R87 Mar v2

-

-

pat AtUbilO

cina

aerosol Espectinomi-

8inario

3297 1270 A, T AA01 v3 CsVMV NtOsm R87 Mar v2 -pat AtUbilO

cina con Agro.

Traquitas/

-

-

-

3403 Cn, R AA01 v3 ZmUbi1 R87 Mar v2 -Ampicilina Como GOI

Pistola 3404

-

Cn AA01 v3 ZmUbi1 -R87 Mar v2 Ampicilina pat OsActl

Traquitas 3415

--

1283 Cn AA01 v3 ZmUbi1 -R87 Mar v2

-

Ampicilina AHAS v3 OsActl

Traquitas Espectinomi-

Superbinario

-

-

-

3602 1421 Cn AA01 v3 ZmUbi1 R87 Mar v2 -AHAS v3 OsActl

cina

con Agro Espectinomi-

8inario

-

3757 Ca AA01 v3 CsVMV NtOsm R87 Mar v2

EPSPS

AtUbi10 pat AtUbil 1

cina

con Agro. 8inario

--

3705 A AA02v2 AtUbi10 NtOsm R87 Mar v2

-

Eritromicina pat CsVMV con Agro.

*A = Arabidopsis CsVMV = promotor del virus del mosaico de las nervaduras de mandioca ZmUbi1 = promotor de la ubiquitina 1 de Zea mays

T = Tabaco AtUbi10 = promotor de ubiquitina 10 de Arabidopsisthaliana HptII = higromicina fosfotransferasa

S = Soja R87 Mar v2 = region asociada a matriz (MAR) de Nicotiana tabacum

Ct = Algodon NtOsm = region sin traducir 5' de la osmotina de Nicotiana tabacum y region sin traducir 3' de la osmotina de Nicotiana tabacum

R = Arroz

Cn = Maiz (721 y 793) Atu ORF1 3' UTR = region sin traducir 3' del marco de lectura abierto 1 de Agrobacterium tumefaciens

Ca = Canola (3295 y 3757) Atu ORF24 3' UTR = region sin traducir 3' del marco de lectura abierto 24 de Agrobacterium tumefaciens

Ejemplo 6 - Transformación en Arabidopsis y selección

6.1 -Condiciones de crecimiento de Arabidopsis thaliana.

Semillas de Arabidopsis silvestres se suspendieron en una solucion de agarosa al 0,1% (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Las semillas suspendidas se almacenaron a 4'C durante 2 dias para cumplir los requerimient os de dormicion y asegurar la germinacion simultanea de las semillas (estratificacion).

Sustrato de semillero Sunshine LP5 Mix (Sun Gro Horticulture, 8ellevue, (A) se cubrio con vermiculita fina y se rego con goteo subterraneo con solucion de Hoagland hasta dejarlo empapado. La mezcla de suelo se dejo drenar durante 24 horas. Las semillas estratificadas se sembraron en la vermiculita y se taparon con cubiertas para retener la humedad (KOR0 Products, 8ramalea, Ontario, Canada) durante 7 dias.

Las semillas germinaron y las plantas se cultivaron en una camara Conviron (modelos CMP4030 y CMP3244, Controlled Environments Limited, (innipeg, Manitoba, Canada) en condiciones de dia largo (16 horas de luz/8 horas de oscuridad) con una intensidad luminica de 120-150 !mol/m2s con temperatura (22'C) y humedad (40-50%) constantes. Las plantas se regaron inicialmente con solucion de Hoagland y despues con agua desionizada para mantener el suelo humedo pero no mojado.

6.2 -Transformacion de Agrobacterium

0e una placa de L8 + agar con eritromicina (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo, EE.UU.) (200 mg/l) o espectinomicina (100 mg/l) que contenia colonias 0H5a sembradas en estria se escogio una colonia para inocular cultivos mini prep de 4 ml (L8 liquido + eritromicina). Los cultivos se incubaron hasta el dia siguiente a 37'C en agitacion constante. Para purificar el A0N plasmidico se usaron Spin Mini Preps de Qiagen (Valencia, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Se prepararon celulas electrocompetentes de Agrobacterium tumefaciens (cepas Z707, EHA101 y L8A4404) con un protocolo de (eigel y Glazebrook (2002). Las celulas competentes de Agrobacterium se transformaron con un metodo de electroporacion adaptado de (eigel y Glazebrook (2002). 50 !l de celulas competentes de Agrobacterium se descongelaron en hielo y se les aradieron 10-25 ng del plasmido deseado. El A0N y la mezcla de celulas se vertieron en cubetas de electroporacion preenfriadas (2 mm). La transformacion se llevo a cabo con un Electroporator 2510 de Eppendorf con los siguientes ajustes: Voltaje: 2,4 kV, duracion del impulso: 5 ms.

Tras la electroporacion, se aradio 1 ml de caldo YEP (composicion por litro: 10 g de extracto de levadura, 10 g de 8acto-peptona, 5 g de NaCl) a la cubeta y la suspension de celulas-YEP se transfirio a un tubo de cultivo de 15 ml. Las celulas se incubaron a 28'C en un baro maria co n agitacion constante durante 4 horas. Finalizada la incubacion, el cultivo se sembro en placas de YEP + agar con eritromicina (200 mg/l) o espectinomicina (100 mg/l) y estreptomicina (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) (250 mg/l). Las placas se incubaron durante 2-4 dias a 28'C.

Las colonias se seleccionaron y sembraron en estria en placas de YEP + agar fresco con eritromicina (200 mg/l) o espectinomicina (100 mg/l) y estreptomicina (250 mg/l) que se incubaron a 28'C durante 1-3 dias. Las c olonias se seleccionaron para el analisis PCR para verificar la presencia del gen insertado utilizando cebadores especificos del vector. Con Spin Mini Preps de Qiagen, y siguiendo las instrucciones del fabricante, se purifico el A0N plasmidico de las colonias seleccionadas de Agrobacterium con la excepcion siguiente: para la purificacion del A0N se usaron alicuotas de 4 ml de un cultivo mini prep de 15 ml cultivado de un dia para otro (YEP liquido + eritromicina (200 mg/l)

o espectinomicina (100 mg/l)) y estreptomicina (250 mg/l)). Una alternativa al uso del Spin Mini Prep A0N consistio en lisar las celulas transformadas de Agrobacterium, suspendidas en 10 !l de agua, sometiendolas a 100'C durante 5 minutos. El A0N plasmidico del vector binario utilizado para la transformacion de Agrobacterium se incluyo como control. La reaccion de PCR se completo con A0N-polimerasa Taq de Takara Minis 8io Inc. (Madison, (isconsin) siguiendo las instrucciones del fabricante a concentraciones 0,5x. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo con un termociclador MJ Research Peltier programado con los siguientes ajustes: 1) 94'C durante 3 minutos, 2) 94'C durante 45 segundos, 3) 55'C durante 30 segundos, 4 ) 72'C durante 1 minuto, durante 29 ciclos y despue s 1 ciclo de 72'C durante 10 minutos. La reaccion se mantuvo a 4'C despues de la ciclacion. La amplificacion se analizo con electroforesis en gel de agarosa al 1% y se visualizo con tincion de bromuro de etidio. Se selecciono una colonia cuyo producto de PCR era identico al plasmido control.

6.3 -Transformacion de Arabidopsis.

Las plantas de Arabidopsis se transformaron utilizando el metodo de inmersion floral. La colonia seleccionada se inoculo en uno o varios precultivos de 15-30 ml de caldo YEP con eritromicina (200 mg/l) o espectinomicina (100 mg/l) y estreptomicina (250 mg/l). El o los cultivos se incubaron hasta el dia siguiente a 28'C con agi tacion constante a 220 rpm. Cada precultivo se uso para inocular dos cultivos de 500 ml de caldo YEP con eritromicina (200 mg/l) o espectinomicina (100 mg/l) y estreptomicina (250 mg/l) y los cultivos se incubaron hasta el dia siguiente a 28'C con agitacion constante. Las celulas se precipitaron centrifugandolas a aprox. 8700xg durante 10 minutos a temperatura

ambiente, descartando el sobrenadante. El sedimento celular se resuspendio suavemente en 500 ml de medio de infiltracion que contenia: �x de sales de Murashige y Skoog/vitaminas 85 de Gamborg, sacarosa 10% (p/v), bencilaminopurina 0,044 !M (10 !l/litro de solucion madre 1 mg/ml en 0MSO) y Silwet L-77 300 !l/litro. Plantas de aproximadamente un mes de edad se sumergieron en el medio durante 15 segundos, asegurandose de que las inflorescencias mas recientes quedaran sumergidas. A continuacion las plantas se dejaron tumbadas y se cubrieron (con cubierta transparente u opaca) durante 24 horas, despues se lavaron con agua y se colocaron en pie. Las plantas se dejaron crecer a 22'C, con un fotoperiod o de 16 horas de luz/8 horas de oscuridad. Unas 4 semanas despues de la inmersion, se recogieron las semillas.

6.4 - Seleccion de las plantas transformadas.

Las semillas T1 recien recogidas (transformadas con el gen original [AAD-1 (v2)] o el gen optimizado para plantas [AAD-1 (v3)]) se dejaron secar durante 7 dias a temperatura ambiente. Las semillas T1 se sembraron en bandejas de germinacion de 26,5 x 51 cm (T.O. Plastics Inc., Clearwater, MN), a razon de una alicuota de 200 mg de semillas T1 estratificadas (-10.000 semillas) por bandeja. Las semillas habian permanecido suspendidas en 40 ml de una solucion de agarosa al 0,1% y almacenadas a 4'C dur ante 2 dias para cumplir los requisitos de dormicion y asegurar una germinacion simultanea.

Sustrato de semillero Sunshine LP5 Mix (Sun Gro Horticulture, 8ellevue, (A) se cubrio con vermiculita fina y se rego con goteo subterraneo con solucion de Hoagland hasta dejarlo empapado, y despues se dejo drenar por gravedad. Cada alicuota de 40 ml de semillas estratificadas se sembro uniformemente en la vermiculita con una pipeta y se tapo con cubiertas para retener la humedad (KOR0 Products, 8ramalea, Ontario, Canada) durante 4-5 dias. Las cubiertas se retiraron 1 dia antes de la seleccion inicial de las transformantes por medio de la pulverizacion con glufosinato en postemergencia (seleccion para el gen PAT cotransformado).

Entre cinco y seis dias despues de la siembra (0AP) y de nuevo 10 0AP, las plantas T1 (cotiledon y estadio de 2-4 hojas, respectivamente) se pulverizaron con una solucion al 0,2% de herbicida Liberty (200 g m.a./l de glufosinato, 8ayer Crop Sciences, Kansas City, MO) con un volumen de pulverizacion de 10 ml/bandeja (703 l/ha) con una boquilla de aire comprimido 0eVilbiss ajustada para suministrar una dosis efectiva de 280 g m.a./ha de glufosinato por aplicacion. Las supervivientes (plantas con crecimiento activo) se identificaron 5-7 dias despues de la ultima pulverizacion y se trasplantaron individualmente a macetas de 3 pulgadas rellenas de medio para macetas (Metro Mix 360). Las plantas trasplantadas se taparon con cubiertas para retener la humedad durante 3-4 dias y se depositaron en una camara de crecimiento a 22'C com o se ha indicado antes. Las cubiertas se retiraron y las plantas se trasladaron al invernadero (22 ± 5'C, 50 ± 30% HR, 14 h de luz:10 h de oscuridad, minimo 500 !E/m2s1 de luz natural + suplementaria) al menos 1 dia antes del analisis para valorar la capacidad del AAD-1 (v3) (gen optimizado para vegetales) o del AAD-1 (v2) (gen microbiano natural) para conferir resistencia frente a herbicidas auxinicos fenoxi.

En las plantas T1 seleccionadas al azar para determinar la resistencia al glufosinato indicadas arriba se confirmo la expresion de la proteina PAT con un kit ELISA para PAT (N.° articulo 7000045, Strategic 0iagnostics, Inc., Newark, 0E) con el fin de confirmar la fidelidad del proceso de seleccion sin destruir las plantas (protocolo del fabricante). A continuacion, las plantas se separaron en grupos al azar para recibir varias dosis de herbicidas fenoxi (diclorprop 2,4-0). Las dosis de fenoxi aplicadas inicialmente fueron de 12,5 g e.a./ha de 2,4-0 y 50 200 g e.a./ha de diclorprop. El GR99 de Arabidopsis ronda aproximadamente los 50 g e.a./ha con 2,4-0 y los 200 g e.a./ha con diclorprop. En los ensayos posteriores se aplicaron dosis elevadas (50, 200, 800, 3200 g e.a./ha).

Todas las aplicaciones de herbicidas auxinicos se realizaron con un pulverizador 0eVilbiss del modo descrito para aplicar un volumen de 703 l/ha (0,4 ml de solucion/maceta de 3 pulgadas) o fueron aplicadas con un pulverizador de carril con un volumen de pulverizacion de 187 l/ha. El 2,4-0 utilizado era de calidad tecnica (Sigma, St. Louis, MO) disuelto en 0MSO y diluido en agua (concentracion final de 0MSO <1%) o bien la formulacion comercial de sal dimetilamina (456 g e.a./l, NuFarm, St Joseph, MO). El diclorprop utilizado era de calidad tecnica (Sigma, St. Louis, Mo., EE.UU.) disuelto en 0MSO y diluido en agua (concentracion final de 0MSO <1%). Como las dosis de herbicida sobrepasaron los 800 g e.a./ha, el pH de la solucion pulverizada resulto demasiado acido y quemo las hojas de las plantas jovenes y tiernas de Arabidopsis, complicando la evaluacion de los efectos primarios de los herbicidas. En lo sucesivo se decidio aplicar siempre estas dosis elevadas de herbicidas fenoxi diluyendolas en tampon Tris 200 mM (pH 9,0) hasta conseguir un pH final de -7-8.

Algunos individuos T1 fueron expuestos a otros herbicidas comerciales en lugar de a herbicidas auxinicos fenoxi. Una cuestion de interes consistio en determinar si el haloxifop podia ser degradado efectivamente en la planta.

Aunque Arabidopsis, por ser una dicotiledonea, no es un sistema optimo para analizar los graminicidas AOPP que inhiben la ACCasa, plantas T1 transformadas con AAD-1 (v3) fueron sometidas a dosis elevadas (400-1600 g e.a./ha) de acido RS-haloxifop (sintetizado internamente) con el pulverizador 0eVilbiss utilizado del modo descrito arriba; tales dosis provocaron anomalias en el crecimiento y muerte de plantas Arabidopsis naturales. Los daros se evaluaron 7 y 14 dias despues del tratamiento. Asimismo, otros individuos T1 fueron tratados con fluoroxipir, un

herbicida auxinico piridiloxiacetato.

6.5 - Resultados de la seleccion de las plantas transformadas.

5 Las primeras transformaciones de Arabidopsis se efectuaron con el AAD-1 (v3) (gen optimizado para vegetales). Las transformantes T1 se seleccionaron primero entre la fraccion mayoritaria de semillas no transformadas por medio de un esquema de seleccion con glufosinato. Entre las aproximadamente 400.000 semillas T1 cribadas se hallaron 493 plantas resistentes al glufosinato (gen PAT), lo que equivale a una frecuencia de transformacion/seleccion del 0,12%. 0ependiendo del lote de semillas analizadas, esta oscilo entre 0,05-0,23% (vease la Tabla 15). Un lote

10 pequero de semillas transformadas con el AAD-1 (v2) (natural) tambien se seleccionaron utilizando el glufosinato como agente de seleccion. Se identificaron 278 individuos T1 resistentes al glufosinato entre 84.000 semillas cribadas (frecuencia de transformacion/seleccion del 0,33%).

Tabla 15: Seleccion de plantas T1 transformadas con AAD-1 (v3) (optimizado para vegetales), o AAD-1 (v2) (natural), AAD-2 (v1) (natural), o AAD2 (v2) por medio de glufosinato y 2,4-0.

Agente de seleccion

Gen Preferenciacodonica Semillas totalessembradas y cribadas Numero de T1 resistentes Tasa de seleccion Rango de la tasa de seleccion % de plantas seleccionadas que expresaban PAT3

Glufosinate1

AAD-1 (v2) n 84.000 278 0,33% 0,33% nd 4

Glufosinate1

AAD-1 (v3) p 400.500 v 493 0,12% 0,05 - 0,23% 97%

2,4-02

AAD-1 ( v3) p 70.000 53 0,08% 0,07 - 0,08% 96%

Glufosinate1

AAD-2 (vl) n 1.301.500 228 0,018% 0,007 -0,021% 100%

Glufosinate1

AAD-2(v2) p 200.000 224 0,11% 0,11% nd 4

1 Esquema de seleccion con glufosinato: 280 g m.a./ha de glufosinato aplicados a los 5-6 + 10 0AP2 Esquema de seleccion con 2,4-0: 50 g m.a./ha de 2,4-0 aplicados a los 5-7 + 10-14 0AP3 Expresion de la proteina PAT determinada con tiras de ELISA PAT 4 nd, no determinado5 Preferencia codonica, n = gen microbiano natural, p = optimizado para vegetales

Las plantas T1 seleccionadas arriba se trasplantaron despues a macetas individuales y fueron pulverizadas con diversas dosis de herbicidas ariloxialcanoato comerciales. La Tabla 16 compara la respuesta del gen AAD-1 (v2) natural y del gen AAD-1 (v3) optimizado para vegetales a la hora de conferir resistencia contra el 2,4-0 a las 5 transformantes T1 de Arabidopsis. Ambos genes confirieron resistencia a plantas T1 de Arabidopsis individuales. Los niveles de respuesta de las plantas sometidas a un mismo tratamiento manifestaron una gran variabilidad, lo que puede atribuirse al hecho de que cada planta representa un evento de transformacion distinto. Cabe subrayar que a cualquiera de las dosis de 2,4-0 probadas, hubo individuos que no se vieron afectados en absoluto, mientras que otros lo fueron gravemente. En la Tabla 16 se presenta el promedio de daros en la poblacion total por cada dosis a 10 fin de demostrar la diferencia significativa entre las plantas transformadas con AAD-1 (v2) o con AAD-1 (v3) respecto a los controles naturales o transformados con PAT/Cry1F. Asimismo, resulta evidente que la tolerancia parece ser significativamente mayor (frecuencia y nivel total de la respuesta individual) con la secuencia de AAD-1 (v3) optimizada para vegetales frente a la secuencia natural del AAD-1 (v2) (vease la Tabla 16). Se han aplicado dosis mas altas de 2,4-0 (hasta 3.200 g e.a./ha) a otros individuos T1 que expresaban el AAD-1 (v3). Con tales dosis (6x la

15 dosis de campo), el nivel de daro tiende a ser mayor y la frecuencia de plantas muy resistentes menor. Tambien a estas elevadas dosis, la solucion pulverizada resulta demasiado acida si no se amortigua. Las plantas de Arabidopsis que crecen sobre todo en la camara de crecimiento presentan una cuticula muy fina y las graves quemaduras pueden complicar las pruebas con estas dosis elevadas. A pesar de ello, algunos individuos soportaron 3200 g e.a./ha de 2,4-0 sufriendo pocos o ningun daro.

20 Tabla 16. Respuesta de plantas de Arabidopsis T1 transformadas con AAD-1 v3 (optimizado para vegetales), o AAD1 v2 (natural), o AAD-2 (natural) a un rango de dosis de 2,4-0 aplicadas en postemergencia. La respuesta se presenta en terminos de % de daro visual a las 2 semanas del tratamiento. Los datos se presentan en forma de histograma de los individuos que manifestaron daro limitado o nulo (<20%), daro moderado (20-40%) o daro grave

25 (>40%). 0ado que cada T1 es un evento de transformacion independiente, cabe esperar una variacion significativa de las respuestas T1 individuales dentro de una dosis dada. Se muestra la media aritmetica y la desviacion estandar de cada tratamiento. El rango de la respuesta individual tambien aparece indicado en la ultima columna para cada dosis y transformacion. Las plantas de Arabidopsis transformadas con PAT/Cry1F sirvieron como control transformado sensible a los herbicidas auxinicos. La Arabidopsis natural no esta transformada.

30 Tabla 16. Respuesta de plantas de Arabidopsis T1 transformadas con AAD-1 v3 (utilizada para vegetales), o AAD-1 v2 (natural), o AAD-2 (natural) a un rango de dosis de 2,4-0 aplicadas en postemergencia.

Gen AAD-1 (v2) natural Promedios

<20% % 0aro 20-40% >40% % 0aro Med Std 0ev

Tampon control no tratado 50 g e.a./ha 2,4-0 200 g e.a./ha 2,4-0 800 g e.a./ha 2,4-0 Gen AAD-2 natural Promedios

20 55 45 11 <20% 6 16 11 32 % 0aro 20-40% 7 9 24 37 >40% 25,3 14,8 34,1 52,5 % 0aro Med 34,7 22,7 39,3 34,2 Std 0ev

Tampon control no tratado 50 g e.a./ha 2,4-0 200 g e.a./ha 2,4-0 800 g e.a./ha 2,4-0 Gen AAD-1 (v3) reconstruido Promedios

4 1 0 0 <20% 1 2 3 0 % 0aro 20-40% 1 11 11 14 >40% 25,0 68,2 82,7 99,8 % 0aro Med 21,7 30,2 28,8 0,8 Std 0ev

Tampon control no tratado 50 g e.a./ha 2,4-0 200 g e.a./ha 2,4-0 800 g e.a./ha 2,4-0 Natural Promedios

9 10 11 11 <20% 0 1 4 4 % 0aro 20-40% 0 5 1 1 >40% 0,0 24,3 14,0 14,7 % 0aro Med 0,0 35,9 25,9 26,1 Std 0ev

Tampon control no tratado 50 g e.a./ha 2,4-0 200 g e.a./ha 2,4-0 800 g e.a./ha 2,4-0 PAT/CrylF (control transformado) Promedios

11 0 0 0 <20% 0 0 0 0 % 0aro 20-40% 0 15 15 15 >40% 0,0 90,0 95,1 100,0 % 0aro Med 0,0 0,0 0,5 0,0 Std 0ev

Tampon control no tratado 50 g e.a./ha 2,4-0

11 0 0 0 0 15 0,0 90,7 0,0 4,2

200 g e.a./ha 2,4-0 0 0 15

97,2 1,7

800 g e.a./ha 2,4-0 0 0 15

100,0 0,0

La Tabla 17 muestra una respuesta a la dosis similar de plantas de Arabidopsis T1 al acido fenoxipropionico, diclorprop. Tambien se observaron tendencias similares con el 2,4-0, lo cual indica que la cadena lateral quiral de acido propionico sirve como un sustrato aceptable. A continuacion, se determino que era posible conferir cierto 5 grado de tolerancia al haloxifop a plantas de Arabidopsis transformadas expuestas a dosis elevadas de 400-1.600 g e.a./ha (Tabla 18). La dosis de haloxifop (graminicida) utilizada normalmente en el campo es de unos 50-70 g e.a./ha. Las dicotiledoneas se consideran por lo general tolerantes naturales a los herbicidas AOPP, pero en cambio, con tales dosis elevadas se produjeron efectos fisiologicos en Arabidopsis. Algunos individuos transformados con AAD-1 (v3) manifestaron una mayor tolerancia al haloxifop. Esto proporciona los primeros datos en plantas de que el

10 AAD-1 (v3) proporciona resistencia frente a AOPP. No se observo resistencia alguna a fluoroxipir (un herbicida auxinico piridiloxiacetato) en las Arabidopsis transformadas, dato que concuerda con los estudios in vitro en los que se utilizaron una enzima expresada heterologamente.

Tabla 17. Respuesta de plantas de Arabidopsis T1 a un rango de dosis de diclorprop aplicadas en postemergencia.

15 La respuesta se presenta en terminos de % de daro visual a las 2 semanas del tratamiento. Los datos se presentan en forma de histograma de los individuos que manifestaron poco o ningun daro (<20%), daro moderado (20-40%) o daro grave (>40%). 0ado que cada T1 es un evento de transformacion independiente, cabe esperar una variacion significativa de las respuestas T1 individuales dentro de una dosis dada. Se muestra la media aritmetica y la desviacion estandar de cada tratamiento. El rango de la respuesta individual tambien aparece indicado en la ultima

20 columna para cada dosis y transformacion. Las plantas de Arabidopsis transformadas con PAT/Cry1F sirvieron como control transformado sensible a los herbicidas auxinicos. La Arabidopsis natural no esta transformada.

Tabla 17. Respuesta de Arabidopsis T1 a un rango de dosis de diclorprop aplicadas en postemergencia.

AAD-1 v3 Promedios

<20% % 0aro 20-40% >40% % 0aro Med Std 0ev Rango

Control no tratado 12,5 g e.a./ha RS-diclorprop 50 g e.a./ha RS-diclorprop 200 g e.a./ha RS-diclorprop 800 g e.a./ha RS-diclorprop PAT/Cry1F Promedios

3 7 7 4 0 <20% 0 1 1 1 5 % 0aro 20-40% 0 0 0 3 3 >40% 0,0 5,0 3,1 40,0 51,9 % 0aro Med 0,0 7,6 8,8 50,1 40,0 Std 0ev 0 0-20 0-25 0-100 20-100 Rango

Control no tratado 12,5 g e.a./ha RS-diclorprop 50 g e.a./ha RS-diclorprop 200 g e.a./ha RS-diclorprop 800 g e.a./ha RS-diclorprop Natural Promedios

3 0 0 0 0 <20% 0 6 0 0 0 % 0aro 20-40% 0 2 8 8 8 >40% 0,0 38,1 80,0 98,3 100,0 % 0aro Med 0,0 25,3 25,3 2,2 0,0 Std 0ev 0 20-95 50-100 95-100 100 Rango

Control no tratado

3 0 0 0,0 0,0 0

12,5 g e.a./ha RS-diclorprop

3 0 0 13,3 2,9 10-15

50 g e.a./ha RS-diclorprop

0 0 3 53,3 5,8 50-60

200 g e.a./ha RS-diclorprop

0 0 3 95,0 5,0 90-100

800 g e.a./ha RS-diclorprop

0 0 3 100,0 0,6 100

25 Tabla 18. Respuesta de plantas de Arabidopsis T1 a un rango de dosis de haloxifop aplicadas en postemergencia y artificialmente altas para demostrar la tolerancia de esta dicotiledonea al graminicida. La respuesta se presenta en terminos de % daro visual a las 2 semanas del tratamiento. Los datos presentados en forma de histograma corresponden a los individuos que sufrieron un daro escaso o nulo (<20%), daro moderado (20-40%), o daro grave

30 (>40%). 0ado que cada T1 es un evento de transformacion independiente, cabe esperar una variacion significativa de las respuestas T1 individuales dentro de una dosis dada. Se muestra la media aritmetica y la desviacion estandar de cada tratamiento. El rango de la respuesta individual tambien aparece indicado en la ultima columna para cada dosis y transformacion. Las plantas de Arabidopsis transformadas con PAT/Cry1F sirvieron como control transformado sensible a los herbicidas auxinicos. La Arabidopsis natural no esta transformada.

Tabla 18. Respuesta de plantas de Arabidopsis T1 a un rango de dosis de haloxifop aplicadas en postemergencia y artificialmente altas con objeto de demostrar la tolerancia de esta dicotiledonea al graminicida.

AAD-1 v3 % 0aro Promedios <20% 20-40% >40%

% 0aro Med Std 0ev Rango

Control no tratado 3 0 0 100 g e.a./ha haloxifop 4 0 0 200 g e.a./ha haloxifop 4 0 0 400 g e.a./ha haloxifop 3 1 0 800 g e.a./ha haloxifop 1 1 2 1600 g e.a./ha haloxifop 1 0 3 PAT/CrylF % 0aro Promedios <20% 20-40% >40%

0,0 0.0 0 0,0 0,0 0 0,0 0,0 0 6,3 9,5 0-20 46,3 42,7 0-85 65,0 47,3 0-100 % 0aro Med Std 0ev Rango

Control no tratado 3 0 0 100 g e.a./ha haloxifop 4 0 0 200 g e.a./ha haloxifop 4 0 0 400 g e.a./ha haloxifop 0 4 0 800 g e.a./ha haloxifop 0 0 4 1600 g e.a./ha haloxifop 0 0 4 Natural % 0aro Promedios <20% 20-40%> >40%

0,0 0,0 0 0,0 0,0 0 10,0 0,0 10 27,5 5,0 20-30 78,8 6,3 70-85 47,5 43,5 80-100 % 0aro Med Std 0ev Rango

Untreated control 3 0 0

0,0 0,0 0

100 g e.a./ha haloxifop 3 0 0

0,0 0,0 0

200 g e.a./ha haloxifop 3 0 0

0,0 0,0 0

400 g e.a./ha haloxifop 0 3 0

20,0 0,0 20

800 g e.a./ha haloxifop 0 0 3

73,3 10,4 70-85

1600 g e.a./ha haloxifop 0 0 3

93,3 11,5 80-100

6.6 -AAD-1 (v3) como un marcador seleccionable

La capacidad para usar el AAD-1 (v3) como un marcador seleccionable utilizando el 2,4-0 como agente de seleccion se analizo inicialmente con Arabidopsis transformadas del modo descrito anteriormente. Semillas T1 transformadas con PAT y AAD-1 (v3) (p0A8 721) se sembraron en bandejas, germinaron como se ha descrito antes y fueron comparadas con semillas similares tratadas con el esquema de seleccion normal con glufosinato (5 y 10 0AP). El 2,4-0 (50 g e.a./ha) se aplico a las plantulas de Arabidopsis del mismo modo que el glufosinato. Se estudiaron variaciones en el numero y en el calendario de aplicaciones. Cada bandeja de plantas recibio una o dos aplicaciones de 2,4-0 de acuerdo con uno de los siguientes esquemas de tratamiento: 5+10 0AP, 5+14 0AP, 10 0AP, 10+14 0AP, 14 0AP. Las plantas se calificaron como resistentes o sensibles a los 19 0AP y se llevo a cabo una prueba con tiras ELISA para determinar la frecuencia de contransformacion efectiva de un gen PAT activo.

Cincuenta y tres de las 70.000 semillas plantadas fueron identificadas como resistentes al 2,4-0. Con el ELISA se analizo un subgrupo de 44 individuos de esta poblacion para detectar la expresion de la proteina PAT. El 96% de los individuos resultaron positivos, lo que indica la presencia del gen cotransformado, PAT. El escaso numero de resultados negativos hallados en el ELISA (4%) concuerda con la tasa de error del 3% hallada en poblaciones de plantas resistentes al glufosinato (Tabla 15). La eficiencia de la seleccion con 2,4-0 (0,08%) aparenta ser algo menor que la del glufosinato (0,12%), pero el rango de las tasas de seleccion en todos los experimentos parece indicar que ambos agentes de seleccion son igualmente buenos para la seleccion de las plantas de Arabidopsis transformadas con los genes AAD-1 (v3) o PAT, respectivamente. 0os aplicaciones sucesivas permiten identificar con mas precision a los individuos resistentes con los dos herbicidas analizados.

6.7 - Heredabilidad

0iversos eventos T1 se autopolinizaron para producir las semillas T2. Estas semillas constituyeron la progenie analizada mediante la aplicacion de 2,4-0 (200 g e.a./ha) a 100 hermanas T2 escogidas al azar. Cada planta T2 se trasplanto a macetas cuadradas de 7,5 cm antes de recibir la pulverizacion (pulverizador de carril a una dosis de aplicacion de 187 l/ha). Mas del 60% de las familias T1 (plantas T2) segregaron en la proporcion prevista de 3 resistentes:1 sensible correspondiente a un solo locus heredado de forma dominante siguiendo un patron mendeliano, segun determino el analisis de la ji al cuadrado (P>0,05).

Se recogieron semillas de entre 12 y 20 individuos T2 (semillas T3). Veinticinco hermanas T3 de cada una de las ocho familias T2 escogidas al azar constituyeron la progenie analizada del modo antes descrito. En todas las lineas analizadas se identificaron aproximadamente el tercio de las familias T2 que debian ser homocigotas (poblaciones no segregantes): la frecuencia oscilo entre una y cuatro de las ocho familias estudiadas. Estos datos demuestran que el AAD1 (v3) permanece integrado de forma estable y que se hereda siguiendo un patron mendeliano durante al

menos tres generaciones.

6.8 - Resistencia contra otros herbicidas atribuible a la AA0-1 en Arabidopsis

La capacidad del gen AAD-1 (v3) para proporcionar resistencia frente a otros herbicidas ariloxifenoxialcanoato en plantas de Arabidopsis transgenicas se determino utilizando un ensayo en placa in vitro modificado. Semillas de Arabidopsis thaliana naturales y portadoras del gen optimizado para vegetales AAD-1 (v3) (plantas homocigotas T4 id=PAA01.315.064) fueron esterilizadas por agitacion durante 10 min en una solucion de lejia al 50%. 0espues se lavaron cuatro veces con agua esteril para eliminar la lejia.

Los analisis de dosis-respuesta se efectuaron con un medio nutritivo (vease mas adelante) al que se le aradieron diversas dosis de compuestos problema. 0ichos compuestos se aradieron al medio calentado (55'C) en for ma de soluciones concentradas en 0MSO. Los pocillos de control contenian la cantidad apropiada de 0MSO sin ningun compuesto adicional. La concentracion final de 0MSO nunca supero el 1% (v/v). Una vez mezclada cuidadosamente, se aradio una alicuota de 6 ml del medio calentado con la concentracion adecuada del compuesto a pocillos de una bandeja para cultivo de tejidos de poliestireno de 6 pocillos y fondo plano (Falcon 353046, 8ecton 0ickson and Company, Franklin Lakes, N.J., EE.UU.). Una vez solidificado el medio, se depositaron encima aproximadamente entre 20 y 30 semillas de Arabidopsis, vertiendo los restantes 2 ml sobre las semillas. Las placas se agitaron suavemente para esparcir las semillas, se cubrieron y se dejaron enfriar hasta que el medio se solidifico completamente. A continuacion, las placas se incubaron durante 7 dias a 25'C bajo iluminacion fluoresce nte continua (75 !E m-2 s-1). La composicion del medio nutritivo es la descrita en el Ejemplo 2.2 y en Somerville y Orgen (1982).

Evaluacion de la reduccion del crecimiento.

La porcion apical de las plantas de Arabidopsis cultivadas en los medios tratados se evaluo visualmente comparandola con la porcion apical de las plantas que crecian en los medios que solo contenian 0MSO. Los valores se registraron como % de reduccion del crecimiento. Las evaluaciones de la inhibicion del crecimiento radicular en las plantas de Arabidopsis que crecian en los medios tratados se llevaron a cabo extrayendo con cuidado las plantas del medio y midiendo la longitud de la raiz. La longitud radicular se comparo entonces con la de las plantas control para calcular el porcentaje de reduccion del crecimiento. Se evaluaron como minimo cinco plantas de cada tratamiento. Los valores registrados corresponden a la media de todas las plantas evaluadas. Se calculo la concentracion necesaria para lograr un efecto inhibitorio del 50% (I50) en las raices y en los brotes de las plantas de Arabidopsis naturales y transformadas con AAD-1. En la Tabla 19 se muestran los cocientes de los biotipos resistentes respecto a los sensibles aparecen. Un cociente >2 tanto en las mediciones de las raices como de los brotes implica una resistencia significativa. Y a mayor cociente, mayor nivel de resistencia. Se observaron niveles significativos de resistencia frente a todos los herbicidas fenoxi comerciales, incluidos los acidos oxiaceticos (2,4-0 y MCPA) y los acidos oxipropionicos (diclorprop y mecoprop). 0e hecho, la evaluacion a largo plazo de las raices demuestra que la resistencia propiciada por el AAD-1 (v3) contra el acido oxipropionico es superior a la evidenciada frente a los acidos oxiaceticos, hecho que concuerda con las caracteristicas enzimaticas de la AAD-1 (v1). La evaluacion de otros herbicidas auxinicos dotados de anillos piridinicos demostro que el AAD-1 (v3) no protege de forma efectiva a Arabidopsis contra triclopir y fluoroxipir, ambos herbicidas piridiloxiacetato, ni contra el herbicida de acido picolinico picloram. La amplia resistencia contra herbicidas auxinicos fenoxi es la primera descrita en plantas in vivo. Los herbicidas auxinicos frente a los cuales la AAD-1 resulta ineficaz podrian ser herramientas viables de control y contencion de los cultivos comerciales o las especies vegetales experimentales transformadas con AAD-1.

Tabla 19. Evaluacion con el ensayo en placa in vitro de la resistencia cruzada frente a sustratos herbicidas proporcionada por el AAD-1 (v3) en Arabidopsis T4 homocigotas (AR8TH).

Compuesto

Estructura wt AR8TH shoot 150 PAA01.315 .064 T3 AR8TH shoot I50 wt AR8T H root I50 PAA0 1.315.064 AR8TH root I50 Cociente brotes Cociente raices

ppm

Auxinas fenoxi

2,4-0

0,2 10 <0,01 0,04 50 >4

diclorprop

2 5 0,01 1,5 2,5 150

Tabla 19. Evaluacion con el ensayo en placa in vitro de la resistencia cruzada frente a sustratos herbicidas proporcionada por el AAD-1 (v3) en Arabidopsis T4 homocigotas (AR8TH).

Compuesto

Estructura wt AR8TH shoot 150 PAA01.315 .064 T3 AR8TH shoot I50 wt AR8T H root I50 PAA0 1.315.064 AR8TH root I50 Cociente brotes Cociente raices

ppm

Mecoprop

2 25 0,01 1,5 12,5 150

MCPA

0,2 1 0,01 0,03 5 3

2,4,5-T

1,5 10 <0,01 <0,01 6,67 NA

Auxinas piridinicas

Fluroxipir

2 1 0,2 0,2 0,5 1

Triclopir

0,2 0,04 0,02 0,02 0,2 1

Picloram

1 0,5 0,3 0,15 0,5 0,5

6.9 - Resistencia a herbicidas aplicados por via foliar en Arabidopsis portadora del AAD-1

La capacidad del AAD-1 (v3) para conferir resistencia frente a otros herbicidas auxinicos ariloxifenoxialcanoato en 5 Arabidopsis transgenicas se determino mediante la aplicacion foliar de diversos sustratos descritos en el Ejemplo

6.8. La generacion de semillas T4 de Arabidopsis, que eran homocigotas para el AAD-1 (v3) (linea AA01.01.315.076) se estratifico y se sembro en bandejas de seleccion de forma muy similar a las plantas Arabidopsis del Ejemplo 6.4. Una linea de control transformada portadora del gen PAT y del gen de resistencia a insectos Cry1F se planto de manera similar. Las plantulas se trasplantaron a macetas individuales de 3 pulgadas en el invernadero. Todas las 10 plantas se pulverizaron con un pulverizador de carril a 187 l/ha. Fueron expuestas a una gama de herbicidas auxinicos fenoxi: 12,5-1600 g e.a./ha de la sal dimetilamina del 2,4-0 (0MA) (Riverside Chemicals), 12,5-1600 g e.a./ha de mecoprop (AH Marks), 50-3200 g e.a./ha de R-diclorprop (AH Marks), 8,75-1120 g e.a./ha de 2,4,5-T (calidad tecnica); herbicidas piridiloxiacetatos 50-3200 g e.a./ha de triclopir (0ow AgroSciences) y 50-3200 g e.a./ha de fluoroxipir (0ow AgroSciences); y, por ultimo, el metabolito del 2,4-0 resultado de la actividad de AA0-1, el 2,4

15 diclorofenol (0CP, Sigma) (a 50-3200 g e.a./ha, calidad tecnica). Todas las aplicaciones se formularon en tampon Hepes 200 mM (pH 7,5). Cada tratamiento se repitio 3-4 veces. Las plantas se evaluaron a los 3 y 14 dias despues del tratamiento y se promediaron dos experimentos.

Estos resultados (vease la Tabla 20) confirman que el AAD-1 (v3) en Arabidopsis proporciona una fuerte resistencia

20 contra los herbicidas auxinicos fenoxiaceticos, auxinicos fenoxipropionicos, pero no confiere una resistencia cruzada significativa contra los auxinicos piridiloxiaceticos analizados, resultado que corrobora los datos de los ensayos enzimaticos in vitro y de la especificidad de sustrato en placa entera. Ademas, en las plantas de Arabidopsis naturales y transgenicas no se aprecia efecto alguno del metabolito, el 2,4-diclorofenol (0CP).

Tabla 20. Comparacion de las respuestas de plantas Arabidopsis T4 naturales y homocigotas para AAD-1 (v3) frente a varios herbicidas auxinicos aplicados por via foliar.

Auxinas fenoxipropionicas

Tratamiento herbicida

Media % de daño en la 14DAT

AAD1.01.315.076.T4 Plantas homocigotas AAD1 PatCrylf-Control

50 g e.a./ha R-diclorprop 3 31

Tabla 20. Comparacion de las respuestas de plantas Arabidopsis T4 naturales y homocigotas para AAD-1 (v3) frente a varios herbicidas auxinicos aplicados por via foliar. 200 g e.a./ha R-diclorprop 3 73 800 g e.a./ha R-diclorprop 3 89 3200 g e.a./ha R-diclorprop 3 95 12.5 g e.a./ha Mecoprop 3 0 25 g e.a./ha Mecoprop 0 2 50 g e.a./ha Mecoprop 0 17 100 g e.a./ha Mecoprop 0 33 200 g e.a./ha Mecoprop 3 62 400 g e.a./ha Mecoprop 0 78 800 g e.a./ha Mecoprop 0 93 1600 g e.a./ha Mecoprop 0 100

Auxinas fenoxiaceticas

Tratamiento herbicida

Media % de daño a 14DAT

AAD1.01.315.076.T4 Plantas homocigotas AAD1

Pat/Crylf-Control

12.5 g e.a./ha 2,4-0 0MA 0 67 25 g e.a./ha 2,4-0 0MA 0 78 50 g e.a./ha 2,4-0 0MA 0 93 100 g e.a./ha 2,4-0 0MA 0 100 200 g e.a./ha 2,4-0 0MA 0 100 400 g e.a./ha 2,4-0 0MA 0 100 800 g e.a./ha 2,4-0 0MA 0 100 1600 g e.a./ha 2,4-0 0MA 0 100 8.75 g e.a./ha 2,4,5-T 0 0 17.5 g e.a./ha 2,4,5-T 3 20 35 g e.a./ha 2,4,5-T 0 43 70 g ae/ha 2,4,5-T 3 85 140 g e.a./ha 2,4,5-T 0 95 280 g e.a./ha 2,4,5-T 0 98 560 g e.a./ha 2,4,5-T 17 100 1120 g e.a./ha 2,4,5-T 3 100

Auxinas piridiloxiaceticas

Tratamiento herbicida

Media % de daño a 14DAT

AAD1.01.315.076.T4 Plantas homocigotas AAD1

Pat/Cry If-Control

50 g e.a./ha Triclopyr 31 36 200 g e.a./ha Triclopyr 58 65 800 g e.a./ha Triclopyr 74 84 3200 g e.a./ha Triclopyr 97 95 50 g e.a./ha Fluroxypyr 48 76 200 g e.a./ha Fluroxypyr 75 85 800 g e.a./ha Fluroxypyr 88 85 3200 g e.a./ha Fluroxypyr 95 95 Metabolito 0CP inactivo 50 g e.a./ha 2,4-0CP 0 0 200 g e.a./ha 2,4-0CP 0 0 800 g e.a./ha 2,4-0CP 0 0 3200 g e.a./ha 2,4-0CP 0 0

6.10 - Relacion del crecimiento de la planta con la expresion de la AA0-1 (v3) en Arabidopsis

Se disero un experimento para examinar si el nivel de expresion de la AAD-1 (v3) en Arabidopsis varia dependiendo 5 de la etapa de crecimiento. Con tal fin, se cultivo en invernadero una linea T4 homocigota para AAD-1 (v3) y de alta tolerancia (id=PAA01.01.345.163). La mitad de las plantas fue tratada con 800 g e.a./ha de 2,4-0 (del modo antes descrito) y la otra mitad no recibio tratamiento alguno. 0os hojas, la tercera desde el extremo superior y la quinta desde el extremo inferior, se arrancaron de 5 plantas, tanto tratadas como sin tratar, y se analizaron con ELISA y transferencia (estern (del modo descrito en el Ejemplo 11) a los 4, 10, 14, 20 y 25 0AT. Las Figuras 8A y 88 10 demuestran que no hubo una diferencia estadisticamente significativa en la expresion de la AAD-1 (v3) en las hojas jovenes y viejas. Asimismo, el herbicida 2,4-0 tuvo escaso impacto en el nivel de expresion de la proteina AAD-1 (v3). La proteina se habia acumulado mas en las plantas mas viejas y se observo cierta degradacion sustancial de la misma en los intervalos de tiempo mas largos.

15 En otro experimento distinto, cuatro lineas T4 homocigotas distintas de Arabidopsis que presentaban diferentes

niveles de tolerancia al herbicida 2,4-0 fueron pulverizadas con diversas dosis (0, 200, 800 y 3200 g/ha) de 2,4-0 tras lo cual se examinaron los daros causados por el herbicida y la expresion de AAD-1 (v3). Cuatro dias despues del tratamiento herbicida, apenas se observaron daros en tres de las cuatro lineas, incluso con la dosis mas elevada (Figura 9A). 0ichas plantas tambien expresaron niveles elevados de AAD-1 (v3), de entre el 0,1% y el 0,25% (Figura 98). En cambio, la linea con escasa tolerancia expreso menos del 0,1% de AAD-1 (v3) en la TSP y sufrio daros apreciables. Pero lo que resulta mas destacable es que estas plantas se habian recuperado de los daros a los 14 0AT (Figura 9A), lo que indica que un bajo nivel de expresion de la AAD-1 (v3) consiguio protegerlas de los daros graves causados por el herbicida. Todas las plantas control sufrieron daros graves y habian muerto a los 14 0AT tras recibir dosis de al menos 800 g e.a./ha de 2,4-0 y mayores.

6.11 - Analisis molecular de las Arabidopsis portadoras del AAD-1 (v3)

Con objeto de determinar la integracion estable de la unidad de transformacion vegetal compuesta por los genes PAT y AAD-1 (v3) a varias lineas homocigotas de AAD-1 (v3) se les practico un ensayo Invader (metodos de Third (ave Agbio Kit Procedures) para determinar el numero de copias del gen PAT y/o una transferencia Southern con el A0N total obtenido con el kit 0Neasy de Qiagen. El analisis supuso que existia un ligamiento fisico directo entre ambos genes, ya que estaban contenidos en el mismo plasmido.

Para el analisis Southern, se sometio un total de 1 !g de A0N a una digestion hasta el dia siguiente con Nsi I del p0A8721 a fin de obtener los datos de integracion. Las muestras se procesaron en un gel grande de agarosa al 0,85% hasta el dia siguiente a 40 voltios. A continuacion, el gen se desnaturalizo con NaOH 0,2 M, NaCl 0,6 M durante 30 minutos y despues se neutralizo con Tris HCl 0,5 M, NaCl 1,5 M y pH de 7,5 durante 30 minutos. Seguidamente se preparo un aparato de gel con SSC 20x para transferir por gravedad el gel a una membrana de nilon (Millipore INYC00010), dejandolo hasta el dia siguiente. Acabada la transferencia, la membrana se expuso a luz UV en presencia de un entrelazador (stratagene UV stratalinker 1800) a 1200x100 microjulios. 0espues la membrana se lavo con S0S 0,1%, SSC 0,1 durante 45 minutos. Finalizado el lavado de 45 minutos, la membrana fue horneada durante 3 horas a 80'C y se conservo a 4'C hasta la hibridacion. El molde de hibridacion c onsistio en los cebadores preparados (Pat 5-3 AGATACCCTTGGTTGGTTGC) (SEC I0 n° 23) y (Pat 3-3 CAGATGGATCGTTTGGAAGG) (SEC I0 n° 24) diserados para obtener la region codificante del gen PAT. El producto se inyecto en un gel de agarosa al 1%, se recorto y despues se extrajo el gel con el procedimiento de extraccion de Qiagen (28706). La membrana se sometio entonces a una etapa de prehibridacion a 60'C dur ante 1 hora en tampon Perfect Hyb (Sigma H7033). Con el procedimiento Prime it RmT dCTP-labeling rxn (Stratagene 300392) se procedio al revelado con una sonda de 32P (Perkin Elmer). La sonda sobrante se lavo con columnas ProbeQuant G50 (Amersham 27-5335-01). Se usaron 2 millones de CPM por ml de tampon Perfect Hyb para hibridar las membranas de transferencia hasta el dia siguiente. Finalizada la hibridacion las membranas se sometieron a dos lavados de 20 minutos a 65'C con S0 S 0,1%, SSC 0,1. Finalmente, las membranas se expusieron a pelicula fotografica dejandolas hasta el dia siguiente, incubadas a -80'C.

Los resultados demuestran que todas las plantas resistentes al 2,4-0 analizadas contenian el gen PAT (y, por tanto, se deduce que el AAD-1 (v3) tambien). El analisis del numero de copias revelo que el numero total de insertos oscilaba entre 1 y >10 copias. Este resultado concuerda con los datos de expresion de la proteina AAD-1 (v3), lo cual indica que la presencia de la enzima se traduce en niveles significativamente altos de resistencia (>>200 veces) a todos los acidos fenoxiaceticos y fenoxipropionicos comerciales.

6.12 - Arabidopsis transformada con el apilamiento molecular del gen AAD-1 (v3) y el gen de resistencia al glifosato

0el modo descrito anteriormente se produjeron semillas T1 de Arabidopsis portadoras del plasmido p0A83230 (AAD-1 (v3) + EPSPS) que codificaba un supuesto caracter de resistencia al glifosato. Las transformantes T1 se seleccionaron utilizando el AAD-1 (v3) como marcador seleccionable del modo descrito en el Ejemplo 6.6, con la salvedad de que la dosis de 2,4-0 utilizada fue de 75 g e.a./ha. En el primer intento de seleccion se obtuvieron 24 eventos transformados T1 que se trasplantaron a macetas de tres pulgadas en el invernadero como se ha descrito antes. Tambien se analizaron tres lineas de control de Arabidopsis distintas: natural Columbia-0, lineas T5 homocigotas AAD-1 (v3) + PAT (transformadas con p0A8721), y una linea homocigota PAT + Cry1F (control transformado). Solo las plantas portadoras del p0A83230 fueron preseleccionadas en el estadio de plantula por su tolerancia al 2,4-0. Cuatro dias despues del trasplante, las plantas se dividieron en partes iguales para recibir el tratamiento foliar con un pulverizador de carril del modo antes descrito con 0, 26,25, 105, 420 o 1680 g e.a./ha de glifosato (Glyphomax Plus, 0ow AgroSciences) en tampon Hepes 200 mM (pH 7,5). Todos los tratamientos se repitieron 4 -5 veces. Las plantas se evaluaron 7 y 14 dias despues del tratamiento. El calculo de los valores I50 revelo un nivel de tolerancia >14 veces mayor conferido por el apilamiento del EPSPS con el AAD-1 (v3) (vease la Figura 10). El AAD-1 (v3) no confirio resistencia al glifosato (re: respuesta p0A8721). Estas plantas T1 se cultivaron para obtener semillas, siendo autopolinizadas para engendrar las semillas T2. Las plantas T1 portadoras del p0A83230 han demostrado tolerancia a dosis letales de 2,4-0 y de glifosato. Las plantas T2 seguiran siendo analizadas para demostrar que estas plantas cotransformadas pueden resistir los tratamientos de mezcla en tanque a base de glifosato+2,4-0 como se describe en el Ejemplo 21 y se ha demostrado en maiz transformado con AAD-1 (v3) en el Ejemplo 8.

Ejemplo 7. Transformación con triquitas del maíz, y uso del AAD-1 (v3) como marcador seleccionable

7.1 - Clonacion del AAD-1 (v3)

El fragmento de AAD-1 (v3) se recibio integrado en un fragmento NcoI/SacI. El constructo p0A84005 se digirio con NcoI y SacI y se aislo el fragmento central de 5175 pb. Los dos fragmentos se unieron con A0N-ligasa de T4 y se transformaron en celulas 0H5a. Se realizaron minipreps de las colonias resultantes con el kit mini prep QIA Spin de Qiagen, y despues se digirieron para comprobar la orientacion. El plasmido intermedio correcto se denomino p0A83403. El p0A83403 y el p0A88505 (OsAct1/PAT/ZmLip) se digirieron con NotI. La banda de 3442 pb derivada del p0A83403 y la banda de 11017 pb del p0A88505 se aislaron y se purificaron. Ambos fragmentos se unieron juntos, se insertaron en celulas 0H5a y los plasmidos resultantes se analizaron para comprobar la orientacion. El constructo final se designo p0A83404, que contiene ZmUbi1/po-aad1/ZmPer5::OsAct1/PAT/ZmLip.

7.2 - Iniciacion del callo/suspension

Con objeto de obtener embriones inmaduros para iniciar el cultivo de callos, se practicaron cruces F1 entre progenitores Hi-II A y 8 cultivados en invernadero (Armstrong et al. 1991). Cuando los embriones tenian 1,0-1,2 mm de tamaro (unos 9-10 dias despues de la polinizacion) se recogieron las espigas y su superficie se esterilizo lavandolas con jabon Liqui-Noxl, sumergiendolas en etanol al 70% durante 2-3 minutos y, despues, en lejia comercial al 20% (hipoclorito sodico 0,1%) durante 30 minutos.

Las espigas se lavaron con agua destilada esteril, los embriones cigoticos inmaduros se extrajeron en condiciones asepticas y se cultivaron en medio 15Ag10 (medio N6 (Chu et al., 1975), 2,4-0 1,0 mg/l, sacarosa 20 g/l, hidrolizado de caseina 100 mg/l (digestion enzimatica), L-prolina 25 mM, AgNO3 10 mg/l, Gelrite 2,5 g/l, pH 5,8) durante 2-3 semanas con el escutelo apartado del medio. El tejido que presentaba la morfologia adecuada ((elter et al., 1995) se transfirio selectivamente a intervalos quincenales a medio 15Ag10 fresco durante aproximadamente 6 semanas, y despues se transfirio a medio 4 (medio N6, 2,4-0 1,0 mg/l, sacarosa 20 g/l, hidrolizado de caseina 100 mg/l (digestion enzimatica), L-prolina 6 mM, Gelrite 2,5 g/l, pH 5,8) a intervalos quincenales durante aproximadamente 2 meses.

Para iniciar los cultivos embriogenicos en suspension, se aradieron aproximadamente 3 ml de volumen celular compactado (PCV) del callo generado a partir de un unico embrion a aproximadamente 30 ml de H9CP + medio liquido (mezcla basal de sales MS (Murashige y Skoog, 1962), vitaminas MS modificadas con un contenido 10 veces menor de acido nicotinico y 5 veces mas de tiamina-HCl, 2,4-0 2,0 mg/l, acido a-naftalenacetico (NAA) 2,0 mg/l, sacarosa 30 g/l, hidrolizado de caseina 200 mg/l (digestion con acido), mioinositol 100 mg/l, L-prolina 6 mM, agua de coco 5% v/v (aradida justo antes del subcultivo), pH 6,0). Los cultivos en suspension se mantuvieron a oscuras en matraces Erlenmeyer de 125 ml en un agitador de temperatura controlada a 125 rpm y 28'C. Las lineas cel ulares quedaron establecidas por lo general en el plazo de dos a tres meses desde la iniciacion. 0urante el establecimiento, las suspensiones se subcultivaron cada 3,5 dias aradiendo 3 ml de PCV de celulas y 7 ml de medio acondicionado a 20 ml de H9CP + medio liquido fresco con una micropipeta de punta ancha. Cuando el tejido comenzo a doblar su tamaro, las suspensiones se ampliaron y se introdujeron en matraces de 500 ml en los cuales 12 ml de PCV de celulas y 28 ml de medio acondicionado se transfirieron a 80 ml de H9CP + medio. Una vez las suspensiones quedaron completamente establecidas, se criopreservaron para uso futuro.

7.3 - Criopreservacion y descongelacion de la suspensiones

0os dias despues del subcultivo, se aradieron 8 ml de crioprotector (disuelto en medio H9CP+ sin agua de coco, glicerol 1 M, 0MSO 1 M, sacarosa 2 M, esterilizado con filtro) a 4 ml de PCV de celulas en suspension y 4 ml de medio acondicionado, y a continuacion se agito a 125 rpm y 4'C durante 1 hora en un matraz de 125 ml. Al cabo de 1 hora se aradieron 4,5 ml a un criovial Corning de 5,0 ml preenfriado. Una vez llenos los viales, estos se mantuvieron durante 15 minutos a 4'C en un congelad or de velocidad controlada, y despues se dejaron congelar a una velocidad de -0,5'C/minuto hasta alcanzar una t emperatura final de -40'C. Alcanzada dicha temperat ura, los viales se transfirieron a cajas con gradillas contenidas en una unidad de almacenamiento Cryoplus 4 (Forma Scientific) llena con vapores de nitrogeno liquido.

Para la descongelacion los viales se extrajeron de la unidad de almacenamiento, se depositaron en un contenedor cerrado con hielo seco y despues se sumergieron en un baro maria a 40-45'C hasta que la "ebullicion" d esaparecio. Una vez descongelados, los contenidos se vertieron sobre una pila de -8 papeles de filtro esteriles (hatman de 70 mm (N.° 4) en placas de Petri de 100x25 mm tapadas. Tras dejar durante unos minutos que los filtros absorbieran el liquido, el filtro superior con las celulas se transfirio a medio GN6 (medio N6, 2,4-0 2,0 mg/l, sacarosa 30 g/l, Gelrite 2,5 g/l, pH 5,8) durante 1 semana. Al cabo de la semana, solo el tejido con una morfologia conveniente se transfirio del papel de filtro directamente a medio GN6 fresco. Este tejido se subcultivo cada 7-14 dias hasta disponer de 1 a 3 gramos para iniciar el cultivo en suspension en aproximadamente 30 ml de medio H9CP+ en matraces Erlenmeyer de 125 ml. Tres mililitros de PCV se subcultivaron en medio H9CP+ fresco cada 3,5 dias hasta obtener un total de 12 ml de PCV, momento en que se inicio el subcultivo del modo descrito.

7.4 - 0osis-respuesta de tejido no transformado al acido haloxifop

Se agruparon varias lineas celulares Hi-II donantes sin transformar, se trataron con triquitas sin A0N, se filtraron en medio GN6 a razon de 6 ml por filtro, y se dejo que formaran un callo durante 2-3 semanas a 28'C. Por c ada tratamiento, se transfirieron aproximadamente 200 mg del tejido de callo en suspension a los medios de seleccion en placas de 60x20 mm que contenian acido R-haloxifop 30, 100, 300 nM. Se hicieron tres duplicados de cada concentracion. Tambien se preparo un medio control con bialafos 1 mg/l (formulacion comercial Herbiace, Meiji Seika, Japon) y GN6 (1H) para comparar. El callo se extrajo a las 2 semanas, se peso y se transfirio a medio fresco con la misma concentracion durante otras 2 semanas. Transcurridas un total de 4 semanas, se extrajo el tejido, se peso por ultima vez y se desecho. Los resultados se presentan en la Figura 11.

Tambien se llevaron a cabo dos estudios independientes de dosis respuesta del callo a los productos de degradacion fenolicos del haloxifop y cihalofop para confirmar que estos productos finales no serian perjudiciales para el crecimiento del mismo. Los datos de dosis-respuesta a los fenoles derivados del cihalofop (vease la Figura 12) demuestran que con una concentracion de fenoles del cihalofop de 1 !M, el crecimiento sigue suponiendo el 76% del observado en el control exento de fenoles del cihalofop. Los datos correspondientes a la dosis-respuesta de los fenoles del haloxifop demuestran que incluso con una concentracion de fenoles del haloxifop de 300 nM, el crecimiento fue igual o superior al del control no expuesto a tales fenoles (datos no representados).

7.5 - Transformacion con triquitas con seleccion por bialafos

Alrededor de 24 horas antes de la transformacion, 12 ml de PCV de celulas de maiz embriogenicas criopreservadas en suspension mas 28 ml de medio acondicionado se subcultivaron en 80 ml de medio liquido GN6 (medio GN6 sin Gelrite) en un matraz Erlenmeyer de 500 ml, colocandose en un agitador a 125 rpm y 28'C. Este paso se re pitio dos veces con la misma linea celular, de modo que en total se repartieron 36 ml de PCV en 3 matraces. Veinticuatro horas despues se extrajo el medio liquido GN6 y se sustituyo por 72 ml de medio osmotico GN6 S/M (medio N6, 2,40 2,0 mg/l, sacarosa 30 g/l, sorbitol 45,5 g/l, manitol 45,5 g/l, mioinositol 100 mg/l, pH 6,0) por matraz con el fin de lisar las celulas. Los matraces se colocaron en un agitador a oscuras durante 30-35 minutos, y durante ese tiempo se preparo una suspension de triquitas de carburo de silicio de 50 mg/ml aradiendo el volumen adecuado de medio liquido GN6 S/M a -405 mg de triquitas de carburo de silicio autoclavadas (Advanced Composite Materials, Inc.).

Tras la incubacion en GN6 S/M, se vertieron los contenidos de los matraces en un unico frasco de centrifuga de 250 ml. Una vez sedimentadas las celulas, se extrajo todo el liquido GN6 S/M menos -14 ml y se reservo en un matraz esteril de 1 litro para su uso posterior. La suspension prehumedecida de triquitas se vorteo durante 60 segundos a maxima velocidad y se aradieron 8,1 ml al frasco, al cual se aradieron despues 170 !g de A0N como ultimo paso. El frasco se coloco inmediatamente en un mezclador comercial de pintura Red 0evil 5400 modificado y se agito durante 10 segundos. Acabada la agitacion, la mezcla de celulas, medios, triquitas y A0N se aradio al contenido del matraz de 1 litro junto con 125 ml de medio liquido GN6 fresco para reducir la osmolaridad. Las celulas se dejaron recuperar en un agitador durante 2 horas antes de filtrarlas en un papel de filtro (hatman n.° 4 (5,5 cm) utilizando una unidad recolectora de celulas de vidrio que estaba conectada a un tubo de vacio.

Sobre la superficie del filtro sometido a vacio se pipetearon 3 -6 ml de suspension dispersada. Los filtros se depositaron en placas de 60 x 20 mm con medio GN6, y las placas se cultivaron durante 1 semana a 28'C en una caja oscura cubierta con una lamina de plastico (<2 milimetros de espesor), pero no hermeticamente, a fin de reducir la evaporacion de las placas.

Al cabo de 1 semana, los papeles de filtro se transfirieron a placas de 60x20 mm con medio GN6 (1H) (medio N6, 2,4-0 2,0 mg/l, sacarosa 30 g/l, mioinositol 100 mg/l, bialafos 1,0 mg/l, Gelrite 2,5 g/l, pH 5,8) o medio GN60 (1H) (igual que el GN6 (1H) excepto por la presencia de dicamba 8,0 mg/l y 2,4-0 0,8 mg/l).

Las placas se depositaron en cajas y se cultivaron como antes durante otra semana. 0os semanas despues de la transformacion, el tejido se incluyo sembrando la mitad de las celulas de la placa o bien la totalidad en 3,0 ml de medio de agarosa GN6 fundido (medio N6, 2,4-0 2,0 mg/l, sacarosa 30 g/l, mioinositol 100 mg/l, agarosa Sea Plaque 7 g/l, pH 5,8, autoclavada durante solamente 10 minutos a 121'C) que contenia bialafos 1 mg/l. E l tejido se disgrego y 3 ml de agarosa y tejido se vertieron uniformemente sobre la superficie de una placa de 100 x 15 mm con medio GN6 (1H) o GN60 (1H). Este paso se repitio con las demas placas. Finalizada la inclusion, las placas se sellaron individualmente con Nescofilml o Parafilm Ml, y despues se cultivaron durante 1 semana a 28'C en cajas oscuras.

Los aislamientos presumiblemente transformados solian hacerse visibles entre 5 y 8 semanas despues de la transformacion. Los aislamientos potenciales se extrajeron de la placa incluida y se transfirieron a medio de seleccion fresco de la misma concentracion utilizada en las placas de 60 x 20 mm. Si al cabo de 2 semanas aproximadamente se apreciaba un crecimiento sostenido, el evento se consideraba resistente y era sometido al analisis molecular.

La regeneracion se inicio transfiriendo el tejido de callo a un medio inductor con citocininas, 28 (1H), que contenia

bialafos 1 mg/l, sales y vitaminas MS, sacarosa 30,0 g/l, 8AP 5 mg/l, 2,4-0 0,25 mg/l, Gelrite 2,5 g/l; pH 5,7. Las

-

celulas se dejaron crecer con poca luz (13 !Em-2s-1) durante una semana y despues con luz mas intensa (40 !Em-2s 1) otra semana mas antes de transferirlas al medio de regeneracion, 36 (1H), identico al 28 (1H) salvo porque carecia de reguladores del crecimiento vegetal. Las plantulas pequeras (3-5 cm) se sacaron y se depositaron en tubos de cultivo de 150 x 25 mm que contenian medio SHGA sin agente de seleccion (sales basales y vitaminas de Schenk y Hildebrandt, 1972; mioinositol 1 g/l, sacarosa 10 g/l, Gelrite 2,0 g/l, pH 5,8). Una vez las plantulas desarrollaron un sistema radicular y aereo suficiente, se trasplantaron a suelo en un invernadero.

7.6 - Transformacion con triquitas con seleccion por haloxifop

Los parametros de insercion del A0N utilizados para la seleccion directa con herbicidas "fop" fueron identicos a los del procedimiento de seleccion con bialafos, excepto en que se cotransformaron juntos 85 !g de p0A83403 y 85 !g de un constructo que contenia un gen marcador de GFP (proteina verde fluorescente), y que solo se filtraron 3 ml de suspension en medio GN6 despues de la recuperacion de 2 horas.

Al cabo de 0-7 dias en medio GN6 sin agentes de seleccion, los papeles de filtro se transfirieron a placas de 60x20 mm con medio GN6 que contenia 2,4-0 2 mg/l mas acido R-haloxifop 50, 100, 200 nM. Las placas se colocaron en cajas y se cultivaron durante otra semana mas. Al cabo de esa semana, el tejido se incluyo sembrando todas las celulas de la placa en 3,0 ml de medio de agarosa GN6 fundido que contenia la misma concentracion de agente de seleccion que en la transferencia previa. Todas las etapas posteriores fueron identicas al protocolo de seleccion con PAT/regeneracion salvo porque el medio de regeneracion contenia acido R-haloxifop 100 nM en lugar de bialafos 1 mg/l.

7.7 - Resultados.

Se iniciaron varios experimentos de analisis con diversos niveles de haloxifop y cihalofop, y se recuperaron 47 aislamientos por seleccion directa. Un subgrupo de eventos en callo fue analizado con PCR y transferencia (estern. Tras obtener los datos de expresion, 21 eventos destacados fueron sometidos a un analisis con transferencia Southern. Los resultados obtenidos con NcoI, enzima de restriccion de corte unico, para obtener los datos de integracion despues del analisis con sonda del AAD-1 (v3), demuestran sin lugar a dudas la integracion estable del AAD-1 (v3) tras la transformacion con triquitas combinada con la seleccion con herbicidas "fop" (ariloxifenoxipropionato).

7.8 - 0emostracion cuantitativa de la tolerancia in vitro de eventos en callo que expresan la AAD-1 (v3) sometidos a seleccion con bialafos

Noventa y siete aislamientos de callo recuperados de la seleccion con bialafos fueron sometidos a un analisis Invader para conocer el numero de copias de PAT asi como a un analisis de PTU del AAD-1 (v3) con PCR (vease el Ejemplo 7.10). El analisis de la expresion de la proteina AAD-1 (v3) con transferencia (estern/ELISA en sandwich (Ejemplo 11) se llevo a cabo con un subgrupo de los eventos. En la Tabla 21 se describe un resumen. 0e cada uno de estos eventos se regeneraron al menos 15 plantas T0 con las que se efectuaron pruebas de pulverizacion y de las que se obtuvieron semillas.

Tabla 21.

Evento N.°

N.º de copias de PAT PCR de la PTU del AA0-1 (v3) Western del callo

3404-001

2 + +

3404-006

2 + +

3404-013

3 + +

3404-017

1 + +

3404-020

3 + nd

3404-022

2 + +

3404-025

2 + +

3404-027

3 + +

3404-031

1 + +

3404-033

2 + nd

3404-036

3 + +

3404-044

3 + +

3404-050

3 + +

3404-053

3 + +

3404-074

2 + +

3404-082

2 + +

Un subgrupo mas pequero de estos eventos se evaluo en estudios de dosis-respuesta comparandolo con un control no transformado. Se analizo un rango de concentraciones de haloxifop de hasta 400 nM (formulacion Gallant Super).

Los datos de dosis-respuesta de un evento, el 3404-006, se generaron utilizando los metodos generales del Ejemplo 7.4, y se muestran en la Figura 13. Estos demuestran que el evento 3404-006 no manifesto una reduccion significativa del crecimiento del callo a concentraciones de haloxifop de hasta 400 nM, mientras que el crecimiento del callo de maiz no transgenico si se vio inhibido a dicha dosis. Estos datos no han sido normalizados para tener

5 cuenta las diferencias inherentes de crecimiento que no estan vinculadas con la expresion del transgen.

7.9 - Transformacion con traquitas con seleccion por imazetapir

La casete ZmUbi1/AAD-1 (v3)/ZmPer5 se extrajo del p0A83404 con AscI/SwaI y se inserto en p0A82212 para crear

10 el vector para transformacion de AAD-1 (v3) y AHAS con triquitas p0A83415, tambien denominado p0AS1283). Una vez acabado, este constructo se transformo en maiz por medio de triquitas de carburo de silicio como se ha descrito en el Ejemplo 7.4, excepto porque se filtraron 2 ml de celulas, proceso al que siguieron una recuperacion de 7 dias en medio GN6 y la seleccion con un medio que contenia imazetapir 3 !M procedente del herbicida Pursuitl 0G. El analisis Invader permitio identificar 36 eventos que contenian los genes AAD-1 (v3) y AHAS.

15 Cincuenta y tres eventos de callos de maiz derivados de estas transformaciones se analizaron con ELISA y con transferencia (estern para determinar la expresion de AAD-1 (v3) -un subgrupo de los datos se muestra a continuacion. En los eventos citados en la Tabla 22, los niveles de expresion de los eventos detectados como positivos oscilaron entre 90 y mas de 1000 ppm en la proteina soluble total.

Tabla 22.

Número de ID del evento AAD-1

Nivel de expresión (ppm) Transferencia Western

1283[1]-001

2 -

1283[l]-002

206 +++

1283[l]-003

1 -

1283[l]-004

90 +++

1283[l]-005

1 -

1283[l]-006

105 +++

1283[l]-007

212 ++

1283[l]-008

114 ±

1283[l]-009

305 +

1283[1]-010

2 -

1283[1]-011

4 -

1283[1]-012

200 +++

1283[1]-013

134 +++

1283[1]-014

4 -

1283[1]-015

194 +++

1283[1]-016

4 -

1283[1]-017

196 +++

1283[1]-018

3 -

1283[1]-019

178 +

1283[l]-020

260 ++

1283[1]-021

144 +++

1283[l]-022

140 +++

1283[l]-023

191 +++

1283[l]-024

392 ++

1283[l]-025

368 ++

1283[l]-026

14 -

1283[l]-027

1006 ++

Control Neg

3 -

Control Neg

3 -

Patron (0,5 �g/mL)

++

Patron (5 �g/mL)

++++

7.10 - Analisis molecular: materiales y metodos aplicados a maiz

7.10.1 - Obtencion del tejido, aislamiento y cuantificacion del A0N.

25 Tejido fresco repartido en varios tubos se liofilizo a 4'C durante 2 dias. Una vez completamente seco, se introdujo una perla de tungsteno (Valenite) en cada tubo y las muestras de tejido se sometieron durante 1 minuto a molturacion en seco con un molino de perlas Kelco. 0espues se realizo el procedimiento de aislamiento de A0N 0Neasy del modo acostumbrado (Qiagen, 0Neasy 69109). A continuacion, una alicuota del A0N extraido se tiro

30 con Pico Green (Molecular Probes P7589) y se leyo en el fluorimetro (8ioTek) con patrones conocidos para obtener

la concentracion en ng/!l.

7.10.2 - Analisis con ensayo Invader.

Las muestras de A0N se diluyeron hasta 20 ng/!l y se desnaturalizaron incubandolas en un termociclador a 95'C durante 10 minutos. A continuacion se preparo la mezcla Signal Probe con la mezcla de oligonucleotidos facilitada y MgCl2 (Third (ave Technologies). Alicuotas de 7,5 !l se colocaron en cada pocillo de la placa del ensayo Invader seguidas por alicuotas de 7,5 !l de los controles, patrones y muestras desconocidas diluidas a 20 ng/!l. A todos los pocillos se les aradio 15 !l de aceite mineral (Sigma) para cubrirlos. Las placas se incubaron entonces a 63'C durante 1 hora y se leyeron en el fluorimetro (8iotek). El % de seral respecto al fondo de la sonda diana se dividio por el % de seral respecto al fondo de la sonda de control interna para calcular el cociente. El cociente de los patrones (cuyo numero de copias es conocido) desarrollados y validados con transferencia Southern, se uso para estimar el numero de copias de los eventos desconocidos.

7.10.3 - Reaccion en cadena de la polimerasa.

Como molde se emplearon 100 ng de A0N total. Se usaron 20 mM de cada cebador con el kit Takara Ex Taq PCR Polymerase (Mirus TAKRR001A). Los cebadores utilizados para la PTU del AAD-1 (v3) fueron: (0irecto-ATAATGCCAGC CTGTTAAACGCC) (SEC I0 n° 25) e (Inverso-CTCAAGCATATGAATGACCT CGA) (SEC I0 n° 26). La reaccion de PCR se realizo en un termociclador 9700 Geneamp (Applied 8iosystems), sometiendo las muestras a 94'C durante 3 minutos y 35 ciclos de 94 'C durante 30 segundos, 63'C durante 30 segundos, y 72'C durante 1 minuto y 45 segundos seguidos por 72'C du rante 10 minutos. Los cebadores utilizados para la PCR de la region codificante del AAD-1 (v3) fueron: (0irecto-ATGGCTCATGCTGCCCTCAGCC) (SEC I0 n° 27) e (Inverso-CGGGC AGGCCTAACTCCACCAA) (SEC I0 n° 28). La reaccion de PCR se llevo a cabo con un termociclador 9700 Geneamp (Applied 8iosystems), sometiendo las muestras a 94'C durante 3 minutos y 35 ciclos de 94'C duran te 30 segundos, 65'C durante 30 segundos, y 72'C durante 1 minuto y 45 segundos seguidos por 72'C durante 10 minutos. Los productos de la PCR se analizaron con una electroforesis en gel de agarosa al 1% y tincion con Et8r.

7.10.4 - Analisis con transferencia Southern.

El analisis con transferencia Southern se llevo a cabo con el A0N total obtenido con el kit 0Neasy de Qiagen. Un total de 2 !g de A0N fueron sometidos a una digestion hasta el dia siguiente con Afl II y tambien con EcoRV en el caso del p0A83404, con NcoI en el del p0A83403, y con SpeI en el del p0A81421 a fin de obtener los datos de integracion. Acabada la digestion se inyecto una alicuota de -100 ng en un gel al 1% para confirmar que la digestion habia sido completa. 0espues de esta comprobacion, las muestras se procesaron en un gel de agarosa grande al 0,85% hasta el dia siguiente a 40 voltios. A continuacion, el gel se desnaturalizo con NaOH 0,2 M, NaCl 0,6 M durante 30 minutos y se neutralizo con Tris HCl 0,5 M, NaCl 1,5 M y pH de 7,5 durante 30 minutos. Seguidamente se preparo un aparato de gel con SSC 20x para transferir por gravedad el gel a una membrana de nilon (Millipore INYC00010), dejandolo hasta el dia siguiente. Acabada la transferencia, la membrana se expuso a luz UV en presencia de un entrelazador (stratagene UV stratalinker 1800) a 1200x100 microjulios. 0espues la membrana se lavo con S0S 0,1%, SSC 0,1 durante 45 minutos. Finalizado el lavado de 45 minutos, la membrana fue horneada durante 3 horas a 80'C y despues se conservo a 4'C hasta la hibridacion. El molde de hibridacion se preparo con la PCR de la region codificante antes seralada utilizando el plasmido p0A83404. El producto se inyecto en un gel de agarosa al 1%, se recorto y despues se extrajo el gel con el procedimiento de extraccion de Qiagen (28706). La membrana se sometio entonces a una etapa de prehibridacion a 60'C durante 1 hora en tampon Perfect Hyb (Sigma H7033). Con el procedimiento Prime it RmT dCTP-labeling rxn (Stratagene 300392) se procedio al revelado con una sonda de 32P (Perkin Elmer). La sonda sobrante se lavo con columnas ProbeQuant G50 (Amersham 27-5335-01). Se usaron 2 millones de CPM para hibridar las membranas de transferencia hasta el dia siguiente. Finalizada la hibridacion, las membranas se sometieron a dos lavados de 20 minutos a 65'C con S0S 0,1%, SSC 0,1. Finalmente, las membranas se expusieron a pelicula fotografica dejandolas hasta el dia siguiente, incubadas a -80'C.

Ejemplo 8 - Datos de tolerancia in vivo y de tolerancia en el campo generados por eventos portadores del AAD-1 (v3) seleccionados con PAT (pDAB3404)

8.1 - Tolerancia de plantas de maiz T0 a herbicidas AOPP

Cuando se pudieron regenerar mas de 15 plantas clonales por evento, se transfirieron plantas adicionales al invernadero para someterlas a una seleccion preliminar por tolerancia aplicando en postemergencia herbicidas AOPP a plantas de maiz T0. Las plantas aclimatadas en el invernadero se dejaron crecer hasta que brotaron 2-4 hojas nuevas de aspecto normal del verticilio (es decir, plantas que habian superado con exito la transicion del cultivo in vitro a las condiciones del invernadero). Las plantas se cultivaron en el invernadero a 27'C con 16 horas d e luz:8 horas de oscuridad. A continuacion, las plantas se trataron con formulaciones comerciales de uno de los tres herbicidas AOPP siguientes: Assurel II (0uPont), Clincher* (0ow AgroSciences) o Gallant Super* (0ow AgroSciences) correspondientes respectivamente a quizalofop, cihalofop y haloxifop. Las aplicaciones de herbicida se efectuaron con un pulverizador de carril con un volumen de pulverizacion de 187 l/ha, altura de pulverizacion 50 cm, y todas las pulverizaciones incorporaron el aceite vegetal concentrado Agridex al 1% v/v. El numero de clones de cada evento vario de una semana a otra debido al ritmo de regeneracion y aclimatacion de cada evento. En conjunto, se intento tratar a clones representativos de cada evento con un rango de dosificacion del herbicida comprendido entre 1x dosis letal (-�x dosis de campo) hasta 8x dosis de campo (64x dosis letal). La dosis letal se

5 define como la dosis que causa daros >95% a la linea endogamica Hi-II. La Hi-II constituye la base genetica de las transformantes de la presente invencion.

Los AOPP son en general herbicidas muy potentes que matan el maiz. El maiz Hi-II nacido de semillas de tres o cuatro hojas es erradicado (daros >95%) con 8,8, 62,5, y 4,4 g e.a./ha de haloxifop, cihalofop y quizalofop, 10 respectivamente. Todas las lineas transformadas con AAD-1 (v3) estudiadas sobrevivieron a una dosis minimamente letal de todos los herbicidas AOPP analizados. 0e hecho, la mayoria de las lineas analizadas sobrevivieron sin daros visibles (14 0AT) aun despues de recibir una 8x dosis de campo de quizalofop (64x dosis letal). Varios clones individuales de los eventos "017" y "038," empero, sufrieron daros significativos a dosis elevadas. Ello podria ser resultado de una menor expresion del gen debido al lugar o al modo de insercion del

15 mismo.

En la mayoria de los eventos quedo demostrado un alto nivel de tolerancia a AOPP, incluso cuando las aplicaciones tuvieron lugar en plantas recien salidas del cultivo in vitro (estadio T0). Resulta destacable que esta tolerancia se consumara frente a los tres herbicidas AOPP y que probablemente pueda hacerse extensiva a todos los herbicidas

20 de esa clase, como se ha demostrado previamente con la AA0-1 in vitro.

La Figura 14 ofrece las respuestas de varios clones del evento transformados con AAD-1 (v3) y sin transformar a dosis letales de dos herbicidas AOPP (haloxifop y quizalofop) aplicados 1 semana antes.

25 La Tabla 23 contiene los datos de las respuestas de eventos seleccionados de maiz T0 transformados con AAD-1 (v3) a tres herbicidas AOPP aplicados en postemergencia.

Tabla 23. Respuesta de eventos seleccionados de maiz T0 transformados con AAD-1 (v3) a tres herbicidas AOPP aplicados en postemergencia.

Constructo

Evento Clon Haloxifop* g e.a./ha Cyhalofop** g e.a./ha Quizalofop*** e.a./ha % daño a 14 DAT

3404

001 016 8.8 0

3404

001 018 62.5 0

3404

001 017 8.8 0

3404

001 019 8.8 30

3404

001 020 35 0

3404

017 018 35 0

3404

017 019 35 0

3404

017 020 70 0

3404

017 021 70 0

3404

017 022 140. 0

3404

017 023 140 30

3404

017 024 � 280 30

3404

017 025 280 20

3404

022 019 8.8 0

3404

022 020 17.5 0

3404

022 016 17.5 0

3404

022 024 62.5 0

3404

022 018 125 0

3404

022 021 8.8 0

3404

022 017 17.5 0

3404

022 022 35 0

3404

022 023 70 0

3404

033 012 35 0

3404

033 013 70 0

3404

033 014 70 0

3404

033 015 140 0

3404

033 016 280 0

3404

038 016 8.8 0

3404

038 018 62.5 0

3404

038 017 8.8 0

3404

038 019 35 70

3404

038 020 35 80

Tabla 23. Respuesta de eventos seleccionados de maiz T0 transformados con AAD-1 (v3) a tres herbicidas AOPP aplicados en postemergencia.

Constructo

Evento Clon Haloxifop* g e.a./ha Cyhalofop** g e.a./ha Quizalofop*** e.a./ha % daño a 14 DAT

3404

038 021 70 80

3404

038 022 70 80 .

(dosis letal = (dosis letal = (dosis letal = 8.8 e e.a./ha)

62.5 g e.a./ha) 4.4 g e.a./ha) *Gallant super� + COC 1% (v/v) **Clincher� + COC 1% (v/v) ***Assure II + COC 1% (v/v)

�Marca registrada de 0ow AgroSciences, LLC

8.2 -Tolerancia en campo de plantas de maiz T1 portadoras del p0A83404 a los herbicidas quizalofop, 2,4-0 y glufosinato

Se llevaron a cabo dos ensayos de campo en estaciones agricolas de Hawai e Indiana. Semillas de maiz de plantas T1 endogamicas fueron utilizadas para evaluar la tolerancia de 16 lineas de evento AA0-1 frente a quizalofop y 2,4

0. Tres hibridos no transformados se incluyeron a efectos comparativos. El hibrido Hi-II x 5XH571 comparte el mismo linaje que las lineas del evento AAD-1 (v3). El hibrido Croplan 585SR es una linea resistente a setoxidim.

El disero experimental consistio en un sistema de parcelas subdivididas con cuatro replicas. La parcela principal fue el tratamiento herbicida y la subparcela el evento AAD-1 (v3) o el hibrido de comparacion. Las parcelas consistian en una hilera de 3,7 metros con aproximadamente 25 semillas plantadas en cada hilera. Por lo que respecta a los eventos AA0-1, en cada replicado se sembraron semillas de un linaje diferente de cada evento.

Las parcelas de AAD-1 (v3) recibieron en el estadio V2 la aplicacion de glufosinato a 560 g m.a./ha para eliminar las plantas no transformadas. Los tratamientos del experimento incluyeron formulaciones comerciales de quizalofop aplicadas a 70 y 140 g e.a./ha, 2,4-0 (sal dimetilamina) a 560 y 1120 g e.a./ha, y un control no tratado. Los tratamientos se aplicaron con una mochila pulverizadora con lanza difusora que proporcionaba un volumen de pulverizacion de 187 l/ha a una presion de 130-200 kPa. Los tratamientos con quizalofop se aplicaron en el estadio V3-V4 y los tratamientos con 2,4-0 en el estadio V5-V6.

Las parcelas tratadas con quizalofop se evaluaron visualmente para detectar los daros al cultivo al cabo de una y tres semanas de la aplicacion ((AA) utilizando una escala de 0-100%, en la cual 0 significa sin daros y 100 muerte completa. Las parcelas tratadas con 2,4-0 se evaluaron visualmente para detectar el encamado de las plantas 2 dias despues de la aplicacion (0AA) utilizando una escala de 0-100% en la que 0 equivale a ninguna planta encamada y 100 equivale a todas las plantas encamadas. Asimismo, las parcelas tratadas con 2,4-0 fueron analizadas visualmente 3-4 (AA para evaluar la deformacion de las raices fulcreas con una escala de 0-10.

8.2.1 -Resultados

La respuesta del evento AAD-1 (v3) a las dosis mas altas analizadas de quizalofop y 2,4-0 se muestran en la Tabla

24. 0ichas dosis representan aproximadamente el doble de las dosis comerciales normales. Los hibridos no transformados resultaron gravemente darados (80-100%) por el quizalofop a 70 g e.a./ha, incluida la linea resistente a setoxidim, aunque esta manifesto una tolerancia ligeramente mejor que los otros dos hibridos. Todos los eventos AAD-1 (v3) excepto un linaje del evento 3404.001 manifestaron una tolerancia excelente al quizalofop a 70 g e.a./ha. No se observaron sintomas visibles en los eventos AAD-1 (v3) excepto en los casos seralados anteriormente.

Tabla 24.

Tratamiento (dosis) =

Quizalofop (140 g e.a./ha) 2,4-D amina (1120 g e.a./ha) 2,4-D amina (1120 g e.a./ha) Resultados del análisis Cocientes de segregación de resistencia tras pulverización con Liberty

Evaluación Evento o Híbrido 3404.001 3404.006

% de daño 3 WAA (escala 0100) % de encamado (escala 0-100) Deformación raíces fúlcreas 3-4 WAA (escala 0-10) Número copias de AAD-1 en hoja (análisis southern) Transf. Western de AAD1 en hojas T0 ELISA de AAD1 en hojas T0 Media de población T1 Media de población T2

IN HI

IN HI

IN HI

IN HI HI

25 25 0 0

0 5 0 0 1 2 0 0 3 +++ +++ 1 ++ +++ 40% 47% X 33% 26% X

Tabla 24.

Tratamiento (dosis) =

Quizalofop (140 g e.a./ha) 2,4-D amina (1120 g e.a./ha) 2,4-D amina (1120 g e.a./ha) Resultados del análisis Cocientes de segregación de resistencia tras pulverización con Liberty

Evaluación Evento o Híbrido 3404.013

% de daño 3 WAA (escala 0100) % de encamado (escala 0-100) Deformación raíces fúlcreas 3-4 WAA (escala 0-10) Número copias de AAD-1 en hoja (análisis southern) Transf. Western de AAD1 en hojas T0 ELISA de AAD1 en hojas T0 Media de población T1 Media de población T2

IN

HI IN HI IN HI IN HI HI

0 0

0 0

0 0

1 + +++ 63% 58% X

3404.017

0 0 1 0 0 0 2 +/- ++ 48% 47% X

3404.020

0 0 0 0 0 0 2 ++ +++ 50% 51% X

3404.022

0 0 1 0 0 0 1 + ++ .51% 57% 76%*

3404.025

0 0 0 0 0 0 2 +++ ++++ 55% 59% X

3404.027

0 0 3 0 0 0 5 + ++ 51% 50% X

3404.031

0 0 1 0 0 0 1 ++ ++++ 47% 43% 61%*

3404.033

0 0 0 0 0 0 2 o 3 + ++ 52% 49% X

3404.036

0 0 0 0 0 0 4 ++ +++ 52% 48% X

3404.044

0 0 1 0 0 1 1 + +/- 50% 48% X

3404.050

0 0 0 1 0 1 2 nd nd 38% 28% X

3404.053

0 0 1 0 0 0 2 +++ +++ 48% 56% X

3404.074

0 0 0 0 0 0 1 ++ +++ 53% 52% 73%*

3404.082

0 0 0 0 0 1 3 nd nd 38% 36% X

0K493 Hl-ll X

100 100 20 23 8 9

5XH571 CROPLAN

100 100 13 34 7 9

585SR

80 96 11 33 9 9

*Concuerda con la segregacion de un caracter regido por un solo locus dominante segun el analisis de la ji al cuadrado (P > 0,05)

El 2,4-0 aplicado a la dosis de 1120 g e.a./ha provoco niveles significativos (11-33%) de epinastia en los hibridos no transformados, una respuesta normal cuando se aplican a partir del estadio de crecimiento V4. En todos los eventos de AAD-1 (v3) se observo una escasa o nula epinastia, excepto en un linaje de 3404.001 (estudiado solo en Indiana)

5 donde se produjeron niveles moderados (5-13%).

Las raices fulcreas de los hibridos no transformados quedaron gravemente deformadas (evaluadas con 9 en una escala de 0-10) por el 2,4-0 a 1120 g e.a./ha. 0e nuevo, esta es una respuesta normal al 2,4-0 cuando se aplica a partir del estadio de crecimiento V4. Al igual que con la respuesta de epinastia, se observaron pocos o nulos daros

10 en las raices fulcreas en los eventos AAD-1 (v3), excepto en un linaje de 3404.001.

Tendencias similares se observaron con las dosis mas bajas de quizalofop y 2,4-0, aunque en los hibridos no transformados se observaron niveles de respuesta reducidos pero todavia significativos (datos no representados).

15 Estos resultados indican que la mayoria de lineas de eventos transformados con AAD-1 (v3) manifestaron un alto nivel de resistencia al quizalofop y al 2,4-0 a dosis que eran letales o que causaban graves malformaciones epinasticas a los hibridos de maiz no transformados. Vease tambien la Figura 16.

8.2.2 -Proporciones de segregacion mendeliana previstas en tres eventos T2.

20 Plantas de linajes individuales de cada evento fueron autopolinizadas al azar en el campo. Las semillas T2 se recolectaran a mano cuando alcanzaron la madurez fisiologica. Partiendo del numero de copias del gen unico (vease la Tabla 24 anterior) y del rendimiento global de la generacion T1 (segregacion, tolerancia a herbicidas y vigor), se escogieron tres eventos (022, 031 y 074) para proseguir la evaluacion en el campo. Las hileras de cada evento se

25 plantaron con una sembradora de cono de precision, a razon de 2500-3000 semillas por hilera. En el estadio de crecimiento V2, todas las lineas AAD-1 (v3) fueron pulverizadas con 140 g e.a./ha de quizalofop (Assurel II) utilizando una mochila pulverizadora como se ha descrito previamente. Esta dosis mato rapidamente todos los segregantes "nulos" (no transformados). Todos los eventos presentaron una proporcion de segregacion concordante con la herencia mendeliana de un locus unico de herencia dominante (3 resistentes:1 sensible, o supervivencia del

30 75%) (vease la Tabla 24). Los homocigotos y los hemicigotos del evento 74 fueron identificados analizando la cigosidad (vease la descripcion del ensayo Invader de AAD-1 (v3) en maiz). Las plantas hemicigotas se eliminaron y las plantas homocigotas AAD-1 (v3) se cruzaron con maiz 8E1146 endogamico por introgresion y homocigoto para el caracter de resistencia al glifosato NK603, dando lugar a una semilla hibrida F1 homogenea que es hemicigota para la resistencia al glifosato, el AAD-1 (v3) y la resistencia al glufosinato.

8.3 - Apilamiento del AAD-1 (v3) y de PAT con los genes de resistencia al glifosato en maiz

Plantas de maiz T2 homocigotas para AAD-1 (v3)/PAT se cruzaron con plantas de maiz resistentes al glifosato para producir semillas F1 portadoras de los genes AAD-1 (v3), PAT y de resistencia al glifosato como se describe en el

10 ejemplo anterior.

Las semillas F1 se sembraron individualmente en macetas de 3 pulgadas rellenas con medio de crecimiento Metro-Mixl 360 (Sun Gro Horticulture). Las macetas se regaron inicialmente con solucion de Hoagland por goteo subterraneo hasta empapar el sustrato, que despues se dejo drenar por gravedad, cultivandose a 27'C en

15 condiciones de 16 horas de luz:8 horas de oscuridad en el invernadero. 0urante el resto del estudio las plantas se regaron con goteo subterraneo con agua desionizada.

Las plantas se dejaron crecer hasta que brotaron 2-4 hojas del verticilio. En este momento las aplicaciones de herbicida se efectuaron con un pulverizador de carril con un volumen de pulverizacion de 187 l/ha, a una altura de 50

20 cm. Las plantas se pulverizaron con dosis de 2,4-0 0MA, glifosato, glufosinato, y con diversas combinaciones de los tres. Todas las aplicaciones se formularon en tampon Hepes de 200 mM (pH 7,5). En las pulverizaciones que incluian glufosinato el tratamiento se formulo aradiendo sulfato amonico al 2% p/v.

A los 3 y 14 dias del tratamiento (0AT) se evaluaron las plantas. Se les asigno una puntuacion de daros observando

25 si presentaban enanismo, clorosis y necrosis. Las plantas calificadas con una puntuacion de daros del 90% o superior se consideraron muertas. Los resultados del estudio a los 14 0AT son proporcionados en la Tabla 25.

Tabla 25.

Dosis de campo

% daños en el 14 DAT

Hi II X 5XH751

RR/PAT/AAD1

Med

Med

Control no tratado

- 0 0

840 g e.a./ha glifosato

1X 98 0

1680 g e.a./ha glifosato

2X 100 0

3360 g e.a./ha glifosato

4X 100 0

560 g e.a./ha 2,4-0 0MA

1X 10 0

1120 g e.a./ha 2,4-0 0MA

2X 14 0

2240 g e.a./ha 2,4-0 0MA

4X 29 0

470 g e.a./ha glufosinato

1X 80 0

940 g e.a./ha glufosinato

2X 90 3

1880 g e.a./ha glufosinato

4X 96 15

840 g e.a./ha glifosato + 560 g e.a./ha 2,4-0 0MA

1X + 1X 96 1

1680 g e.a./ha glifosato +1120 g e.a./ha 2,4-0 0MA

2X + 2X 100 2

3360 g e.a./ha glifosato + 2240 g e.a./ha 2,4-0 0MA

4X + 4X 100 1

470 g e.a./ha glufosinato + 560 g e.a./ha 2,4-0 0MA

1X + 1X 89 5

940 g e.a./ha glufosinato + 1120 g e.a./ha 2,4-0 0MA

2X + 2X 91 10

1880 g e.a./ha glufosinato + 2240 g e.a./ha 2,4-0 0MA

4X + 4X 97 13

840 g e.a./ha glifosato + 470 g e.a./ha glufosinato

1X + 1X 90 5

1680 g e.a./ha glifosato + 940 g e.a./ha glufosinato

2X + 2X 98 15

3360 g e.a./ha glifosato + 1880 g e.a./ha glufosinato

4X + 4X 100 15

Este estudio demostro que el gen AAD-1 (v3) en maiz se puede apilar con un gen de resistencia al glifosato y otro

30 gen de resistencia al glufosinato para proporcionar una fuerte tolerancia en el campo al 2,4-0, el glifosato y el glufosinato, solos o en combinaciones de tanque.

8.3.1 -Resistencia del maiz portador del AAD-1 (v3) a las combinaciones de 2,4-0 0MA y quizalofop.

35 Semillas T28C1 del evento hemicigoto numero 3404-025.001R/R001 8ulked.001.S058 se sembraron individualmente en macetas de 3 pulgadas preparadas con medio de crecimiento Metro-Mixl 360. Las macetas se regaron inicialmente con solucion de Hoagland por goteo subterraneo hasta empapar el sustrato, y despues se dejo drenar por gravedad, cultivandose a 27'C en condiciones de 16 horas de luz:8 horas de oscuridad en el invernadero. 0urante el resto del estudio las plantas se regaron con goteo subterraneo con agua desionizada.

40 Las plantas se dejaron crecer hasta el estadio V1 en el invernadero. En ese momento las plantas se seleccionaron

con 560 g e.a./ha de Assurel II al que se habia aradido aceite vegetal concentrado Agridex al 1% en tampon Hepes 200 mM con un pulverizador de carril de laboratorio ajustado a 187 l/ha. Se dejaron pasar 4 dias para que las plantas manifestaran los sintomas de la seleccion. Ninguna de las plantas sufrio daros. Las aplicaciones de herbicida se realizaron con un pulverizador de carril a un volumen de pulverizacion de 187 l/ha, a una altura de 18 pulgadas. Todas las aplicaciones se formularon con tampon Hepes 200 mM (pH 7,5) con la adicion de Agridex al 1% v/v.

A los 3 y 14 dias del tratamiento (0AT) se evaluaron las plantas asignandolas una puntuacion de daros si presentaban enanismo, clorosis o necrosis. Las plantas calificadas con una puntuacion de daros del 90% o superior se consideraron muertas. Las plantas de este linaje presentaron un 0% de daros a los 14 0AT con todas las combinaciones de mezcla en tanque, mientras que las plantas naturales sufrieron daros del 100%. Estos resultados indican que el AAD-1 (v3) no solo proporciona una solida resistencia en el campo frente al 2,4-0 y el quizalofop, sino tambien frente a dosis exageradas de multiples combinaciones de las dos familias quimicas. Resulta logico pensar que se pueden implementar nuevas medidas de control de malas hierbas basadas en combinaciones de herbicidas auxinicos fenoxi y graminicidas de AOPP en el maiz (o en otros cultivos transformados con AA0-1) que hasta ahora no eran posibles con un solo gen HTC.

8.3.2 -Tolerancia de plantas de maiz T0 (p0A83403) al herbicida quizalofop.

Un conjunto de aproximadamente ocho clones T0 de 17 eventos distintos se regenero y se transfirio al invernadero para someterlos a una seleccion preliminar por tolerancia con una dosis discriminadora de quizalofop aplicada en postemergencia. El tratamiento se aplico con un pulverizador de carril a 35 g e.a./ha (1x dosis de campo, 4x dosis letal) a las plantas de maiz T0 con 3 hojas adaptadas al invernadero, con las condiciones del pulverizador de carril antes descritas. Las plantas se calificaron como resistentes o sensibles 7 dias despues del tratamiento. En cada aplicacion del herbicida se incluyo un maiz control no transgenico. 0os eventos, los eventos 014 y 047, presentaron dos o mas clones T0 sensibles a 35 g e.a./ha de quizalofop, lo cual indica un nivel inesperado de sensibilidad en tales eventos. Los 15 eventos restantes manifestaron una integracion estable, asi como una expresion estable de la proteina y la capacidad para tolerar una concentracion 4x dosis letal de quizalofop en toda la planta.

8.3.3 Expresion del AAD-1 (v3) en terminos de tolerancia al quizalofop

Tres linajes T2 distintos extraidos de 3404 transformaciones que habian sido preseleccionadas con Libertyl (como previamente se ha descrito) para eliminar los nodulos se escogieron para comparar su tolerancia al quizalofop merced a la expresion del AA0-1 (v3). La expresion se midio a los 14 0AT (datos no mostrados) y a los 30 0AT (vease la Figura 15). La linea con mayor tolerancia, el evento 3404-074, siempre expreso una cantidad mas elevada de AAD-1 (v3) que los otros dos eventos a dosis de campo 1x y superiores. 0e estos datos se concluye que el maiz que expresa el AAD-1 (v3) puede quedar protegido de los daros causados por quizalofop en la dosis mas elevada analizada (2240 g/ha), que es 16 veces la 1x dosis de campo de 35 g/ha. Asimismo, el nivel de expresion resulto uniforme a lo largo de todo el experimento.

Ejemplo 9 - Transformación de maíz con el AAD-1 (v3) mediante Agrobacterium

9.1 - Material vegetal

Semillas de un cruce F1 de "High II" (esto es, Progenitor A y 8) (Armstrong et al., 1991) se plantaron directamente en macetas de 5 galones que contenian una mezcla de Metro-Mixl 360:suelo mineral 95:5. Las plantas se cultivaron en invernadero con un fotoperiodo de 16 horas complementado con una combinacion de lamparas de haluro metalico y sodio de alta presion.

9.2 - Fuente de tejido

Para obtener embriones Hi-II (F2) inmaduros, se llevaron a cabo polinizaciones controladas entre hermanas. El dia de la polinizacion se embolsaron las paniculas que desprendian polen recogiendo asi el polen fresco que despues se aplico cuidadosamente a los estigmas. Los embriones inmaduros se aislaron tal y como se describe en el Ejemplo 7.2.

9.3 - Preparacion de un vector superbinario

La construccion de un constructo de Agrobacterium, el p0A82272, portador del gen AAD-1 (v3) y del gen marcador seleccionable AHAS se efectuo aislando el fragmento NotI de 3443 pares de bases del p0A83404 portador de ZmUbi1 v2/AAD-1 (v3)/ZmPer5 v2 e insertandolo en el sitio NotI del p0A88549. El plasmido resultante contiene las casetes ZmUbi1 v2/AAD-1 (v3)/ZmPer5 v2 y OsAct1 v2/AHAS v3/ZmLip v1 flanqueadas por regiones MAR no identicas en la orientacion directa. Este plasmido se transformo posteriormente en el L8A4404/pS81 para crear un vector superbinario, que se denomino p0A83602 y que tambien se designa como p0AS1421.

9.4 - Fuente de bacterias

Todas las transformaciones se llevaron a cabo con el vector "superbinario" de Japan Tobacco descrito en la patente US n° 5.591.616 ("Method for Transforming Monocotyledons"). Para preparar la suspension de Agrobacterium del tratamiento, 1-2 contenidos de asas con bacterias recombinantes p0AS1421, sembradas en estria en una placa con medio YP, se depositaron en 5 ml de medio LS-inf. Mod (Medio basal LS (Linsmaier y Skoog, 1965), vitaminas N6, 2,4-0 1,5 mg/l, sacarosa 68,5 g/l, glucosa 36,0 g/l, L-prolina 6 mM, pH 5,2). La mezcla se vorteo hasta conseguir una suspension uniforme. La concentracion bacteriana se determino con un fotocolorimetro Klett-Summerson midiendo la densidad de la solucion. La solucion se ajusto a una concentracion de 200 unidades Klett (-1x109 ufc/ml) y se le aradio acetosiringona 100 !M.

9.5 - Infeccion y cocultivo

Los embriones inmaduros se aislan directamente en un tubo de microcentrifuga que contiene 2 ml de medio liquido LS-inf. Mod. Cada tubo, que contiene -100 embriones, se vortea durante 3-5 s. El medio se elimina y se sustituye con medio liquido fresco y se repite el vorteo. El medio liquido se descarta de nuevo y se sustituye por una solucion de Agrobacterium a la concentracion de 200 Klett. La mezcla de Agrobacterium y embriones se vortea durante 30 s. 0espues de 5 minutos de incubacion a temperatura ambiente, los embriones se transfirieron a medio LS-As Mod (medio basal LS, vitaminas N6, 2,4-0 1,5 mg/l, sacarosa 30,0 g/l, L-prolina 6 mM, AgNO3 0,85 mg/l, acetosiringona 100 !M, Gelrite 3,0 g/l, pH 5,8) durante 5 dias de cocultivo a 25'C.

9.6 - Estudios de dosis-respuesta con embriones inmaduros

Los estudios de dosis-respuesta se iniciaron con embriones inmaduros tratados con la cepa de Agrobacterium L8A4404 carente de un plasmido como se ha descrito antes. Una vez tratados, los embriones se cocultivaron durante 5 dias a 25'C y a continuacion se transfiri eron a medios de seleccion que contenian diversos niveles de Rhaloxifop o R-cihalofop. Los embriones tambien se transfirieron a medios que contenian bialafos 1 mg/l e imazetapir 100 nM como controles negativos. Los embriones se evaluaron calculando el % de formacion de callos embriogenicos al cabo de 2 semanas y, de nuevo, a las 4 semanas. Los embriones se expusieron a niveles de Rhaloxifop de hasta 30 nM, pero pese a ello se observo una reduccion insuficiente de la formacion de callos con los niveles mas elevados, por lo que en los experimentos de transformacion se opto por emplear concentraciones aun mas elevadas (50-100 nM). Los datos del crecimiento de los embriones en el medio con cihalofop se muestran en la Figura 17.

9.7 - Seleccion

0espues del cocultivo, los embriones fueron sometidos a un proceso de seleccion en dos etapas con el cual se obtuvieron los aislamientos transformados. Para la seleccion se empleo medio LS0 Mod (medio basal LS, vitaminas N6, 2,4-0 1,5 mg/l, MES 0,5 g/l, sacarosa 30,0 g/l, L-prolina 6 mM, AgNO3 1,0 mg/l, cefotaxima 250 mg/l, Gelrite 2,5 g/l, pH 5,7) que se uso junto con uno o dos niveles de seleccion de haloxifop, cihalofop o imazetapir. 0urante la fase de seleccion, los embriones se cultivaron a oscuras a 28'C. Los embriones fueron sometidos a una prime r nivel de seleccion (R-haloxifop 50-100 nM o R-cihalofop 300 nM) durante 14 dias, y despues a otro nivel superior (acido Rhaloxifop 250-500 nM o cihalofop 1,5 !M) a razon de 5 embriones/placa. Una parte de los embriones tambien se expuso en dos pasos a imazetapir (100 y despues 500 nM) mediante el preparado Pursuitl 0G como control positivo. Pursuitl se utiliza como agente de seleccion quimico cuando se emplea el gen AHAS, segun la patente US n° 5.731.180. El tejido se transfirio cada 15 dias al mismo medio hasta obtener colonias embriogenicas. Estas colonias se mantuvieron sometidas a una elevada presion selectiva durante el resto del periodo de cultivo. Las colonias transgenicas recuperadas se hicieron recrecer transfiriendolas a medio de seleccion fresco cada quince dias para su regeneracion y posterior analisis.

9.8 - Regeneracion y produccion de semillas

Para la regeneracion, los cultivos se transfirieron a medio de "induccion" 28 y medio de "regeneracion" 36 (citados previamente) que contenian R-haloxifop 100 nM o cihalofop 1,5 !M para diferenciar las plantulas. Una vez establecidas las plantulas, se trasladaron a tubos con SHGA para permitir el crecimiento y el desarrollo de los brotes y las raices tal y como se ha descrito antes. A continuacion se realizaron polinizaciones controladas para producir semillas del modo descrito anteriormente.

9.9 -Recuperacion de eventos y detalles del analisis; Seleccion de plantas enteras de los linajes de maiz T0 portadores de los genes AAD-1 (v3) y AHAS (p0AS1421).

Setenta y dos eventos transformados con Agrobacterium se seleccionaron con varios niveles de acido R-haloxifop y acido R-cihalofop in vitro. Veintidos muestras de callo se analizaron con transferencia Southern para confirmar la integracion estable del AAD-1 (v3) en el genoma del modo previamente descrito. 0iez eventos de copia unica, indicados en la Tabla 26, se escogieron para la regeneracion.

Tabla 26.

Evento en maíz

Agente de selección in vitro N.º de copias por Southern (callo) Transferencia Western (AAD-1) Callo T0 Evaluación de linajes T0 resistentes a 35 g e.a./ha de quizalofop

(nM)

AAD-1 Resistente Sensible

1421[21]-016

50 Haloxifop 1 + 8 0

1421[22]-020

100 Haloxifop 1 ++ 8 0

1421[22]-022

100 Haloxifop 1 + 8 0

1421[22]-023

100 Haloxifop 1 ++ 8 0

1421[3]-036

100 Haloxifop 1 ++ 8 0

1421 [41-031

300 Cihalofop 1 ++ 9 0

1421[4]-032

300 Cihalofop 1 ++ 8 0

1421 [4J-033

300 Cihalofop 1 ++ 12 0

1421 [4]-034

300 Cihalofop 1 ++ 8 0

1421 [41-035

300 Cihalofop 1 ++ 6 0

Los eventos con mas de 1 copia no se trasladaron al invernadero

Un minimo de seis linajes clonicos regenerados por evento se transplantaron al suelo en el invernadero y se seleccionaron con un pulverizador de carril del modo antes descrito aplicando 35 g e.a./ha de quizalofop cuando brotaron 2-4 hojas nuevas normales (vease el apartado 8.3.3). La presencia de la proteina AA0-1 en la transferencia (estern concordo perfectamente con la resistencia al herbicida en la generacion T0, independientemente del herbicida AOPP empleado en la seleccion. El segundo gen de HTC (AHAS) no tuvo ninguna repercusion negativa sobre la funcion del gen AAD-1 (v3).

Ejemplo 10 - Purificación de la AAD-1 (v1) para la creación de anticuerpos y la caracterización bioquímica

Todas las operaciones realizadas durante la purificacion se llevaron a cabo a 4'C. Celulas de E. coli congeladas o frescas procedentes de un cultivo de aproximadamente 1 litro, cultivadas y estimuladas como en el Ejemplo 3, se resuspendieron en 200 ml de tampon de extraccion que contenia Tris-HCl 20 mM, E0TA 1 mM y 2 ml de Cocktail inhibidor de proteasas (Sigma), y se disgregaron con sonicacion en hielo con un sonicador 8ranson. El extracto soluble se obtuvo por centrifugacion en una centrifuga GSA (Sorvall) a 12.000 rpm (24.000 g) durante 20 minutos. A continuacion, el sobrenadante se introdujo en una columna de intercambio ionico Mono Q (Pharmacia HR 10/10) equilibrada con Tris-HCl 20 mM, E0TA 1 mM, pH 8,0, y la columna se lavo con el mismo tampon con 10 volumenes de columna (80 ml). La proteina se eluyo con 80 ml de un gradiente lineal de NaCl de 0 a 0,25 M en el tampon de la columna, recogiendose fracciones de 2 ml. Las fracciones que contenian la AA0-1 (v1) se agruparon y se concentraron con columnas para centrifuga dotadas con una membrana M(CO de 30 k0a (Millipore). A continuacion, la muestra se separo con una columna de exclusion por tamaro Superdex 200 (Pharmacia, XK 16/60) con tampon a base de Tris-HCl 20 mM, NaCl 0,15 M y 0TT 1 mM, pH 8,0 y un caudal de 1 ml/min. Las fracciones purificadas se analizaron con S0S-PAGE y la concentracion de proteinas se determino con el ensayo de 8radford utilizando albumina de suero bovino como patron.

Ejemplo 11 - Purificación de la AAD-1 recombinante y producción de anticuerpos

El plasmido p0A83203 portador del gen AAD-1 (v1) se mantuvo congelado a -80'C en celulas TOP10F ' (Invitrogen) como cepa 0ow Recombinant 0R1878. Para la expresion, el A0N plasmidico purificado del cultivo de celulas TOP10F' con el kit (izard de Promega (Fisher, n.° catalogo PR-A1460) se transformo en celulas 8L-21 Star (0E3) (Invitrogen, n.° catalogo C6010-03) siguiendo el protocolo del fabricante. 0espues de la transformacion, 50 !l de las celulas se sembraron en placas de agar L8 S/S y se incubaron hasta el dia siguiente a 37'C. Todas las co lonias de la placa de agar se recogieron y se introdujeron en un matraz de 500 ml dotado de tres placas deflectoras con 100 ml de L8 y se incubaron a 37'C con una velocidad de agitacion de 200 rpm durante 1 h. Acto seguido, se indujo la expresion del gen con IPTG 1 mM, y se incubaron durante 4 h a 30'C con 200 rpm de agitacion. Los 100 ml de cultivo se centrifugaron a 4000 rpm durante 20 min. Tras descartar el sobrenadante, el sedimento se resuspendio en 200 ml de medio para extraccion que contenia Tris-HCl 20 mM (pH 8,0), E0TA 1 mM y 2 ml de Cocktail inhibidor de proteasas (Sigma), y se disgregaron con sonicacion en hielo con un sonicador 8ranson. El lisado se centrifugo a 24.000x g durante 20 min para eliminar los restos celulares. Por ultimo, el sobrenadante que contenia la proteina AA0-1 se sometio a un protocolo de purificacion.

Las purificaciones de la AA0-1 (v1) se llevaron a cabo a 4'C, tal y como se comenta en el Ejemplo 10, a menos que se indique lo contrario. El lisado celular se deposito en una columna de intercambio ionico Mono Q (Pharmacia, n.° catalogo HR 10/10) equilibrada con Tris-HCl 20 mM (pH 8,0), E0TA 1 mM, seguida de un lavado con 80 ml del mismo tampon. Las proteinas de eluyeron con 80 ml de un gradiente lineal de NaCl de 0 a 0,25 M en tampon de columna, recogiendose fracciones de 2 ml. Las fracciones que contenian la AA0-1 se agruparon y concentraron con columnas para centrifugacion dotadas de una membrana M(CO de 30 k0a (Millipore). A continuacion, la muestra se separo con una columna de exclusion por tamaro Superdex 200 (Pharmacia, XK 16/60) con tampon a base de Tris-HCl 20 mM (pH 8,0), NaCl 0,15 M y 0TT 1 mM. La concentracion de proteinas se determino con el ensayo de 8radford utilizando la albumina de suero bovino como patron.

Cinco miligramos de AA0-1 (v1) purificada se remitieron a Zymed Laboratories, Inc. (South San Francisco, California, EE.UU.) para iniciar la produccion de anticuerpos policlonales de conejo. El conejo recibio 5 inyecciones en el lapso de 5 semanas; cada inyeccion contenia 0,5 mg de la proteina purificada suspendidos en 1 ml de adyuvante incompleto de Freund. Los sueros se analizaron con ELISA y transferencia (estern para confirmar la especificidad y la afinidad antes de proceder a la purificacion por afinidad y la conjugacion con peroxidasa de rabano (HRP) (Zymed Lab Inc).

11.1 - Extraccion de la AAD-1 (v3) de las hojas de las plantas

Se cortaron aproximadamente entre 50 y 100 mg de tejido foliar en pequeros trozos y se depositaron en tubos de microcentrifuga que contenian 2 perlas de acero inoxidable (4,5 mm; 0aisy Co., n.° catalogo 145462-000) y 300 !l de tampon de extraccion para plantas (P8S con Triton X-100 0,1% y 0TT 10 mM). Los tubos se agitaron durante 4 min en un homogeneizador de tipo Bead beater a velocidad maxima y despues se centrifugaron durante 10 min a 5.000xg. El sobrenadante que contenia las proteinas solubles de la planta se analizo para determinar la proteina soluble total (TSP) y las concentraciones de AAD-1 (v3).

11.2 - Ensayo de 8radford

La concentracion de proteina soluble total extraida del tejido foliar se determino con el ensayo de 8radford utilizando la albumina de suero bovino (8SA) como patron. Cinco microlitros de 8SA diluida en serie en P8S o del extracto vegetal se transfirieron a una placa de microtitulacion de 96 pocillos con las muestras por triplicado. Las concentraciones de patron oscilaron entre 2000 y 15,6 !g/ml. El concentrado de proteina a analizar se diluyo en primer lugar 5x en P8S, solucion de la que se aradieron 250 !l a cada pocillo, incubandose a temperatura ambiente durante 5 min. La densidad optica (0.O.) se midio a 595 nm con un lector de microplacas. La concentracion de proteina de cada muestra se extrapolo a partir de la curva patron con el programa Softmaxl Pro (version 4.0) (Molecular 0evices).

11.3 - Enzimoinmunoanalisis de adsorcion (ELISA).

El ensayo se realizo a temperatura ambiente si no se indica lo contrario. Se tapizo una placa de microtitulacion de 96 pocillos con cien microlitros de anticuerpo anti-AA0-1 purificado (0,5 !g/ml) que permanecio en incubacion a 4'C durante 16 horas. La placa se lavo cuatro veces con tampon de lavado (solucion salina tamponada con fosfato 100 mM (P8S; pH 7,4) que contenia Tween 20 al 0,05%) utilizando un lavador de placas, y despues se bloqueo con leche descremada al 4% disuelta en P8S durante 1 hora. Finalizado el lavado, se incubaron en los pocillos 100 !l de AA0-1 patron a concentraciones conocidas o de extracto vegetal (vease el apartado anterior). La curva patron se trazo con concentraciones de AA0-1 purificada comprendidas entre 100 y 1,6 ng/ml por triplicado. Los extractos vegetales se diluyeron 5, 10, 20 y 40x en P8S y se analizaron por duplicado. Al cabo de una hora de incubacion la placa se lavo del mismo modo indicado arriba. Cien microlitros de conjugado de anticuerpo anti-AA0-1 con HRP (0,25 �g/ml) se incubaron en cada pocillo durante 1 hora antes de eliminarlos por lavado. Cien microlitros de sustrato de HRP, 1-Step� Ultra TM8-ELISA (Pierce), se incubaron en cada pocillo durante 10 minutos y despues la reaccion se detuvo aradiendo 100 !l de H2SO4 0,4 N. A continuacion se midio la 0.O. de cada pocillo con un lector de microplaca a 450 nm. Para determinar las concentraciones de AA0-1 en el extracto vegetal, se promedio el valor de la 0.O. de las muestras duplicadas y la concentracion se extrapolo a partir de la curva patron con el programa Softmaxl Pro version 4.0 (Molecular 0evices).

Para la comparacion, cada muestra se normalizo con su concentracion TSP y se calculo el porcentaje de expresion respecto a la TSP.

11.4 - Analisis por transferencia (estern

Los extractos vegetales y los patrones de AA0-1 (5 y 0,5 !g/ml) se incubaron con tampon para muestra de Laemmli a 95'C durante 10 minutos y se separaron por electr oforesis en un gel prefabricado de Tris-Glicina al 8-16%. A continuacion, las proteinas se trasladaron por electrotransferencia a una membrana de nitrocelulosa con un protocolo ordinario. Tras bloquear la membrana con leche descremada al 4% disuelta en P8S, se procedio a detectar la proteina AA0-1 con un antisuero anti-AA0-1 seguido por conjugados anti-conejo de cabra/HRP. La proteina detectada se visualizo utilizando el sustrato quimioluminiscente ECL (estern Analysis Reagent (Amersham, n.° catalogo RPN 21058).

Ejemplo 12 - Transformación de tabaco

La transformacion de plantas de tabaco con Agrobacterium tumefaciens se llevo a cabo siguiendo un metodo similar, aunque no identico, a metodos publicados (Horsch et al., 1988). El tejido para la transformacion se obtuvo con el proceso siguiente: semillas de tabaco (Nicotiana tabacum cv. Kentucky 160) con la superficie esterilizada se sembraron sobre medio TO8, un medio sin hormonas de Murashige y Skoog (Murashige y Skoog, 1962) solidificado

con agar. Las plantas se cultivaron durante 6-8 semanas en una sala de incubacion iluminada a 28-30'C y las hojas para el protocolo de transformacion se recogieron en condiciones esteriles. Se cortaron trozos de hoja de aproximadamente un centimetro cuadrado en condiciones esteriles, descartando el nervio principal. Cultivos de una cepa de Agrobacterium (EHA101S, portadora del p0A8721, AAD-1 (v3) + PAT), se hicieron crecer durante un dia en un matraz en agitacion a 250 rpm y a 28'C; despues se extrajo el sedimento por centrifugacion y se resuspendio en sales de Murashige y Skoog esteriles, ajustandose hasta obtener una densidad optica final de 0,5 a 600 nm. Los trozos de hoja se sumergieron en esta suspension bacteriana durante aproximadamente 30 segundos, despues se secaron con toallitas de papel esteriles y se depositaron cara arriba sobre medio TO8+ (medio de Murashige y Skoog con acido indolacetico 1 mg/l y benciladenina 2,5 mg/l) y se incubaron a oscuras a 28'C. 0os dias despues los trozos de hoja se trasladaron a medio TO8+ con cefotaxima 250 mg/l (Agri-8io, North Miami, Florida, EE.UU.) y glufosinato amonico 5 mg/l (materia activa de 8asta, 8ayer Crop Sciences) y se incubaron a 28-30'C con lu z. El medio TO8+ con cefotaxima y 8asta se renovo dos veces a la semana durante las dos primeras semanas y una vez a la semana a partir de entonces. Entre 4 y 6 semanas despues los trozos fueron tratados con las bacterias, y las plantas pequeras que brotaban de los focos transformados se sacaron de la preparacion y se plantaron en cajas Phytatray� II (Sigma) llenas de medio TO8 que contenia cefotaxima 250 mg/l y 8asta 10 mg/l. Estas plantulas se cultivaron en una sala de incubacion iluminada. Tres semanas despues, se cortaron pedazos de tallo que se replantaron en el mismo medio. Las plantas estuvieron listas para el traslado al invernadero al cabo de 2-3 semanas mas.

Una vez en el invernadero, el agar de las raices se elimino lavandolas y se trasplantaron en tierra en macetas cuadradas de 13,75 cm. Las macetas se colocaron en una bolsa Ziplocl (SC Johnson & Son, Inc.), por cuyo fondo circulaba agua corriente, permaneciendo bajo luz indirecta a 30'C durante una semana. Al cabo de 3-7 di as, se abrio la bolsa, las plantas se fertilizaron y se dejaron crecer en la bolsa abierta hasta que se aclimataron al invernadero, momento en el que se retiro la bolsa. Las plantas se cultivaron en condiciones calidas ordinarias (30'C, 16 horas de dia, 8 horas de oscuridad, minimo de luz natural + complementaria = 500 !E/m2s1).

Antes de la propagacion, las plantas T0 se muestrearon para analizar su A0N y determinar el numero de copias insertadas. Por conveniencia se analizo el gen PAT, que estaba ligado molecularmente al AAD-1 (v3). El tejido fresco se coloco en tubos y se liofilizo a 4'C dura nte 2 dias. Una vez completamente seco el tejido, se coloco en el tubo una perla de tungsteno (Valenite) y las muestras se sometieron durante 1 minuto a molturacion en seco con un molino de perlas Kelco. 0espues se procedio a aislar el A0N con 0Neasy (Qiagen, 0Neasy 69109). Una alicuota del A0N extraido se tiro con Pico Green (Molecular Probes P7589) y se leyo en un fluorimetro (8ioTek) con patrones conocidos para obtener la concentracion en ng/!l.

Las muestras de A0N se diluyeron a 9 ng/!l, y despues se desnaturalizaron incubandolas en un termociclador a 95'C durante 10 minutos. A continuacion se preparo l a mezcla Signal Probe utilizando la mezcla de oligonucleotidos proporcionada y MgCl2 (Third (ave Technologies). En los pocillos de una placa para ensayo Invader se depositaron alicuotas de 7,5 !l y despues alicuotas de 7,5 !l de los controles, patrones y de las muestras desconocidas diluidas a 20 ng/!l. Todos los pocillos se cubrieron con 15 !l de aceite mineral (Sigma). A continuacion, las placas se incubaron a 63'C durante 1,5 horas y se leyeron en un fluorimetro (8iotek). El % de seral respecto al fondo de la sonda diana se dividio por el % de seral respecto al fondo de la sonda de control interna para calcular el cociente. El cociente de los patrones (cuyo numero de copias es conocido) desarrollados y validados con transferencia Southern, se uso para estimar el numero de copias de los eventos desconocidos (Tabla 27).

Tabla 27. Eventos T0 en plantas de tabaco transformadas con p0A8721 (AAD-1(v3) + PAT).

Evento

N.º copias PAT (Southern) Región codificante PCR de AAD-1 ELISA frig AAD-1 /ml extracto vegetal) Tolerancia relativa de T0 a pulverización con 2,4-D*

721(1)1

1 + 0.9 Media

721(2)1

nd nd 0.6 Media

721(2)2

5 + 0.3 8aja

721(2)3

3 + 2.6 Media

721(2)5

5 + 4.1 Variable

721(2)6

3 + 0.5 Variable

721(2)8

5 + 0.3 Alta

721(2)11

3 + n/a Alta

721(2)12

3 + 4.1 Media

721(2)13

2 + 0.5 Media

721(2)14

5 + 0.2 Alta

721(2)16

4 + .3.2 Media

721(2)17

3 + nd Alta

721(2)18

5 + nd Alta

721(2)19

>10 + nd 8aja

721(2)20

5 + nd Media

Tabla 27. Eventos T0 en plantas de tabaco transformadas con p0A8721 (AAD-1(v3) + PAT).

Evento

N.º copias PAT (Southern) Región codificante PCR de AAD-1 ELISA frig AAD-1 /ml extracto vegetal) Tolerancia relativa de T0 a pulverización con 2,4-D*

721(2)21

4 + nd Alta

721(2)22

7 + nd Media

721(2)23

>10 + nd Variable

721(3)003

3 + nd Variable

721(3)008

2 + nd Alta

721(3)012

1 + nd Alta

721(3)4

2 + 0.5 Alta

721(3)5

9 + 3.3 Alta

721(3)6

4 + 7.1 Variable

721(3)9

2 + 1 8aja

721(3)10

3 + 0.6 Alta

721(3)11

7 + 6 8aja

721(3)13

4 + 0.1 Alta

721(3)014

2 + 0.1 Media

nd = no realizado Leyenda: Tolerancia relativa* 0aro a 3200 g e.a./ha de 2,4-0 (14 0AT) 8aja 0aro >50% Media 0aro 20-50% Alta 0aro <20% Variable Contradictorio

Las estimaciones del numero de copias fueron confirmadas analizando varios eventos con transferencia Southern. El analisis por transferencia Southern se efectuo con el A0N total obtenido con el kit 0Neasy de Qiagen. Un total de 2 !g de A0N se sometieron a una digestion hasta el dia siguiente con NsiI y con HindIII para el p0A8721 a fin de obtener los datos de integracion. 0espues de la digestion se proceso una alicuota de -100 ng en un gel al 1% para comprobar que la digestion era completa. 0espues de esta comprobacion, las muestras se procesaron con el mismo protocolo indicado en el Ejemplo 6, apartado 11.

Todos los eventos se analizaron asimismo con PCR para determinar la presencia del gen AAD-1 (v3) utilizando las mismas muestras de A0N extraido. Como molde se utilizo un total de 100 ng de A0N total. Se usaron 20 mM de cada cebador con el kit Takara Ex Taq PCR Polymerase kit (Mirus TAKRR001A). Los cebadores utilizados para la PCR de la region codificante del AA0-1 fueron: (RdpAcodF ATGGCTCA TGCTGCCCTCAGCC) (SEC I0 n° 27) y (RdpAcodR CGGGCAGGCCTAACTCCACC AA) (SEC I0 n° 28). La reaccion de PCR se llevo a cabo con un termociclador 9700 Geneamp (Applied 8iosystems), sometiendo las muestras a 94'C durante 3 minutos y 35 c iclos de 94'C durante 30 segundos, 64'C durante 30 segund os, y 72'C durante 1 minuto y 45 segundos seguidos por 72'C durante 10 minutos. Los productos de la PCR se analizaron con electroforesis en gel de agarosa al 1% y tincion con Et8r. Entre 4 y 12 linajes clonales de cada uno de los 30 eventos positivos en la PCR se generaron y se trasladaron al invernadero.

Las lantas representativas de 19 eventos (a razon de una planta por evento) se analizaron para determinar la expresion de la AAD-1 (v3) con los metodos ELISA descritos previamente. Todos los eventos analizados manifestaron niveles detectables de la AAD-1 (v3) (Tabla 27). La expresion de la proteina resulto variable en los diferentes eventos.

Plantas T0 de los 30 eventos fueron expuestas a un amplio rango de dosis de 2,4-0 aplicadas cuando tenian 3-4 pulgadas de altura. Las pulverizaciones se hicieron del modo antes descrito con un pulverizador de carril a un volumen de pulverizacion de 187 l/ha. A clones representativos de cada evento se les aplico la sal dimetilamina de 2,4-0 (Riverside Corp) a 0, 50, 200, 800, 3200 g e.a./ha mezclada con agua desionizada. Cada tratamiento se repitio 1-3 veces. Las evaluaciones de los daros se efectuaron a los 3 y 14 0AT. Todos los eventos analizados resultaron mas tolerantes al 2,4-0 que la linea de control sin transformar KY160. En varios eventos se produjo cierta epinastia inicial provocada por el herbicida auxinico con la dosis de 800 g e.a./ha y con dosis inferiores a esta. Algunos eventos no sufrieron daros con esta dosis (equivalente a 1,5x la dosis de campo). Todos los eventos manifestaron a los 3 0AT algun grado de daro auxinico temporal tras ser tratados con 3200 g e.a./ha. Con esta elevada dosis tambien se observaron algunas quemaduras foliares debido a la acidez de la solucion pulverizada. En los ensayos sucesivos las soluciones que contenian dosis elevadas de 2,4-0 se tamponaron. La respuesta de las plantas T0 tratadas con 3200 g e.a./ha de 2,4-0 (-6x la dosis de campo) se empleo para clasificar la tolerancia relativa de cada evento como "baja" (daro >50% a los 14 0AT), "media" (daro 20-50%), "alta" (daro <20%). Algunos eventos manifestaron una respuesta desigual en las replicas del tratamiento y se consideraron "variables" (Tabla 27).

Verificacion de la alta tolerancia al 2,4-0

0e cada uno de los eventos que sobrevivieron a las dosis elevadas de 2,4-0 se reservaron entre dos y cuatro individuos T0 que se dejaron autofecundar en el invernadero para engendrar las semillas T1. 0e la generacion T0 se escogieron dos lineas de tabaco portadoras del AAD-1 (v3) (eventos 721(2)-013.010 y 721(3)-008.005). Las semillas T1 se estratificaron y se sembraron en bandejas de seleccion muy similares a las de Arabidopsis (Ejemplo 6.4); despues se eliminaron selectivamente los nulos no transformados de esta poblacion segregante con 280 g m.a./ha de glufosinato (seleccion por PAT). Las supervivientes se trasplantaron a macetas individuales de 3 pulgadas en el invernadero. Estas lineas habian manifestado niveles medios y altos de resistencia al 2,4-0 en la generacion T0. En las plantas T1 que no proceden directamente del tejido cultivado cabe esperar una respuesta mas coherente. Estas plantas se compararon con tabaco KY 160 natural. Todas las plantas fueron tratadas con un pulverizador de carril a 187 l/ha, con el que recibieron un rango de 70-4480 g e.a./ha de 2,4-0 sal dimetilamina (0MA), R-diclorprop, y una mezcla 50/50 de ambos herbicidas. Todas las aplicaciones se formularon con tampon Hepes 200 mM (pH 7,5). Cada tratamiento se repitio 4 veces. Las plantas se evaluaron 3 y 14 dias despues del tratamiento, asignandolas una puntuacion de daros si presentaban enanismo, clorosis o necrosis. La generacion T1 esta segregando, de modo que cabe esperar una respuesta variable debido a la diferencia en cigosidad (Tabla 28). No se observaron daros con las dosis inferiores a 1x la dosis de campo (560 g e.a./ha) de 2,4-0 y de R-diclorprop en ningun evento. Los daros observados con dosis de hasta 8x la dosis de campo (4480 g de e.a./ha) resultaron infimos, en forma de enanismo, sin que hubiera daros por el herbicida auxinico. Estos resultados indican que el AAD-1 (v3) puede conferir un grado de tolerancia comercial, incluso a una dicotiledonea tan sensible a las auxinas como el tabaco. Estos resultados tambien demuestran que es posible conferir resistencia contra los herbicidas auxinicos fenoxi quirales (acido 2,4diclorofenoxipropionico) y aquirales (acido 2,4-diclorofenoxiacetico), tanto solos como combinados en mezcla de tanque.

Tabla 28. Respuesta de plantas de tabaco T1 segregantes para AA0-1 a herbicidas auxinicos fenoxi.

Herbicida

KY160 natural 721(2)013.010 (tolerancia media en la generación T0) 721(3)008.005 (tolerancia alta en la generación T0)

Daño % medio de las réplicas a los 14 DAT

560 g e.a./ha 2,4-0 0MA 75 5 0 1120 g e.a./ha 2,4-0 0MA 80 5 2 2240 g e.a./ha 2,4-0 0MA 90 5 0 4480 g e.a./ha 2,4-0 0MA 95 5 5 560 g e.a./ha R-diclorprop 70 5 0 1120 g e.a./ha R-diclorprop 75 5 0 2240 g e.a./ha R-diclorprop 88 5 0 4480 g e.a./ha R-diclorprop 95 10 5 560 g e.a./ha 2,4-0 0MA/R-diclorprop 80 5 5 1120 g e.a./ha 2,4-0 0MA/R-diclorprop 80 10 10 2240 g e.a./ha 2,4-0 0MA/R-diclorprop 95 15 15 4480 g e.a./ha 2,4-0 0MA/R-diclorprop 95 15 15

Tambien se llevo a cabo una prueba con 100 plantas de la progenie de cada una de las dos lineas AAD-1 (v3) (eventos 721(2)-013.010 y 721(3)-008.005). Las semillas se estratificaron, sembraron y trasplantaron con el mismo procedimiento indicado, con la salvedad de que las plantas nulas no fueron eliminadas por seleccion con Liberty. Todas fueron pulverizadas con 560 g e.a./ha de 2,4-0 0MA del modo antes descrito. Al cabo de 14 0AT, se contabilizaron las plantas resistentes y sensibles. Ambos eventos, �013� y �008�, segregaron como un caracter mendeliano dominante (3R:1S) segun determino el analisis de la ji al cuadrado. La AA0-1 se hereda como un gen de resistencia a fenoxi auxinas robusto en muchas especies.

La tolerancia en el campo quedo demostrada plantando semillas T1 o T2 en el invernadero, eliminando selectivamente las plantas nulas con Liberty del modo descrito, y cultivando las plantulas en bandejas de trasplante de 72 alveolos (Hummert International) con medio Metro 360 en las condiciones de cultivo indicadas arriba. Las plantas se trasplantaron en parcelas en el campo con una plantadora industrial de hortalizas. Para mantener el crecimiento vigoroso de las plantas se utilizo riego por goteo o aspersion. Una vez alcanzaron 6-12 pulgadas de altura, las plantas de tabaco se pulverizaron con una amplia gama de herbicidas auxinicos fenoxi y se evaluaron como se muestra anteriormente. Los factores de estres ambiental son mas acusados en las condiciones de campo, pero a tenor de la experiencia con el maiz transformado con AAD-1 (v3), cabe esperar una solida transferencia de la resistencia del invernadero al campo.

Ejemplo 13 - Transformación de soja

Las tecnicas de transferencia genica han sido utilizadas con exito para mejorar la soja mediante la introduccion de caracteres como la tolerancia a herbicidas (Padgette et al., 1995), la modificacion de aminoacidos (Falco et al., 1995) y la resistencia a insectos (Parrott et al., 1994). La introduccion de caracteres foraneos en especies cultivadas requiere metodos que permitan la produccion rutinaria de lineas transgenicas con secuencias marcadoras seleccionables, que contienen insertos sencillos. Los transgenes deberian heredarse en forma de un solo locus funcional para simplificar la mejora genetica. Se ha descrito la insercion de genes foraneos en soja cultivada mediante el bombardeo con microproyectiles de ejes embrionarios cigoticos (McCabe et al., 1988) o cultivos embriogenicos somaticos (Finer y McMullen, 1991), y la transformacion con Agrobacterium de explantes de cotiledon (Hinchee et al., 1988) o embriones cigoticos (Chee et al., 1989).

Las plantas transformadas con Agrobacterium suelen contener insertos sencillos con un bajo numero de copias (8irch, 1991). Los tres tejidos diana investigados para la transferencia de genes en la soja poseen ventajas y desventajas: ejes embrionarios cigoticos (Chee et al., 1989; McCabe et al., 1988), cotiledon (Hinchee et al., 1988) y cultivos embriogenicos somaticos (Finer y McMullen, 1991). Este ultimo ha sido objeto de extensas investigaciones como tejido diana para la transferencia directa de genes. Los cultivos embriogenicos suelen ser bastante prolificos y son viables durante mucho tiempo. No obstante, se ha vinculado la esterilidad y las aberraciones cromosomicas sufridas por transformantes primarias a la edad de las suspensiones embriogenicas (Singh et al., 1998) y, por tanto, la iniciacion continua de nuevos cultivos parece ser necesaria para que los sistemas de transformacion de la soja puedan emplear este tejido. Este sistema requiere un elevado nivel de 2,4-0, una concentracion de 40 mg/l, para iniciar el callo embriogenico y ello plantea un problema fundamental para el uso del gen AAD-1 (v3), ya que el locus transformado podria no desarrollarse con 2,4-0 en el medio. Asi pues, la transformacion del meristemo parece ser el metodo ideal para el desarrollo de plantas resistentes al 2,4-0 con el AAD-1 (v3).

13.1 - Metodo de transformacion 1: transformacion del nudo cotiledonar de la soja con Agrobacterium tumefaciens

Las primeras descripciones de transformacion de la soja refirieron el uso como diana de celulas meristematicas de la region del nudo cotiledonar (Hinchee et al., 1988) y la multiplicacion de brotes a partir de los meristemos apicales (McCabe et al., 1988). En el metodo del nudo cotiledonar con A. tumefaciens, la preparacion del explante y la composicion de los medios de cultivo estimulan la proliferacion de meristemos auxiliares en el nudo (Hinchee et al., 1988). Todavia no se sabe con certeza si tales tratamientos desencadenan la formacion de un callo realmente desdiferenciado, pero totipotente. La recuperacion de multiples clones de un evento de transformacion originado a partir de un solo explante y la infrecuente recuperacion de plantas quimericas (Clemente et al., 2000; Olhoft et al., 2003) apuntan a su origen en una sola celula, celula transgenica que se multiplica hasta engendrar bien un cultivo meristematico transgenico que prolifera, bien un brote uniformemente transformado que se multiplica en nuevos brotes. El metodo para la multiplicacion de brotes de soja, basado originalmente en el bombardeo con microproyectiles (McCabe et al., 1988) y, en fecha mas reciente, adaptado a la transformacion con Agrobacterium (Martinell et al., 2002), no sufre aparentemente el mismo grado o tipo de desdiferenciacion que el metodo del nudo cotiledonar, porque el sistema esta basado en la identificacion de quimeras en la linea germinal. El rango de genotipos que se estan logrando transformar con el metodo del nudo cotiledonar con Agrobacterium crece sin cesar (Olhoft y Somers, 2001). Este metodo basado en la formacion de meristemo de novo y la multiplicacion de brotes esta menos limitado a genotipos especificos. Ademas, se trata de un protocolo que no esta basado en el 2,4-0, lo que resulta ideal para un sistema de seleccion con este herbicida. Por consiguiente, el metodo del nudo cotiledonar podria ser el metodo de eleccion para el desarrollo de cultivares de soja resistentes al 2,4-0. Aunque la descripcion de este metodo se remonta a 1988 (Hinchee et al., 1988), solo en fecha muy reciente se ha podido refinar para conseguir de forma rutinaria la transformacion con alta frecuencia de varios genotipos de soja (Zhang et al., 1999; Zeng et al., 2004).

13.1.1 -Preparacion de Agrobacterium.

El plasmido, p0A8721, contiene el gen AAD-1 (v3) bajo el control del promotor Ubi10 de Arabidopsis. Este plasmido tambien contiene el gen PAT, controlado con el promotor de la actina del arroz, el cual codifica una enzima que degrada el glufosinato y que puede ser utilizado como agente de seleccion para las transformantes. Este vector puede ser utilizado en el experimento de transformacion descrito a continuacion. El constructo p0A8721 se introdujo en la cepa de Agrobacterium EHA101S mediante electroporacion.

Los cultivos de Agrobacterium portadores del p0A8721 destinados a las transformaciones se pueden cultivar en medio YEP (peptona 10 g/l, extracto de levadura 5 g/l y NaCl 5 g/l, pH 7,0). Los cultivos de Agrobacterium se precipitan a baja velocidad y se resuspenden en medio liquido SCM (ver a continuacion) hasta obtener una 0.O.660 de 0,6 antes de proceder a la inoculacion.

13.1.2 - Transformacion de la planta.

Semillas de "Thorne," "(illiams82" y "NE3001", genotipos publicos de soja, se pueden desinfectar con un lavado de 20 minutos en lejia comercial (NaClO) al 20% (v/v) a la que se araden 2 gotas de Liqui-Noxl. Las semillas deben enjuagarse cinco veces con agua esteril y sembrarse en medio sin hormonas SHGA, dejandolas germinar durante 5 dias a 24'C con un fotoperiodo de 18/6 horas de luz /oscuridad. El medio 85 contiene macro y micronutrientes y vitaminas y esta descrito por Gamborg et al. (1968) (Sigma, n.° catalogo G 5893, St. Louis). Todos los medios se solidifican con agar lavado al 0,8% (p/v) (Sigma, n.° catalogo A 8678). Como alternativa, ciertos genotipos de soja pueden ser sometidos a un procedimiento de esterilizacion superficial en seco con gas cloro (Cl2) en que las semillas maduras se depositan en placas de Petri de 100 x 25 mm formando una monocapa, a razon de unas 130 semillas por placa. Se colocan 3-4 placas en un desecador con una campana extractora de gases, de tal forma que las placas queden medio abiertas y que haya espacio suficiente para colocar un vaso de precipitados de 250 ml en medio del desecador. El vaso de precipitados se llena con 95 ml de lejia comercial, a los que se araden gota a gota 5 ml de HCl concentrado (12N) dejandolos resbalar por el costado del vaso. El desecador se cierra inmediatamente y se deja durante al menos 16 horas en la campana extractora. Acabada la esterilizacion, las placas se cierran y se depositan en una cabina de flujo laminar donde se dejan abiertas durante unos 30 minutos para eliminar el gas Cl2 sobrante. A continuacion las semillas se hacen germinar del modo descrito anteriormente. Las semillas esterilizadas en seco permanecen esteriles a temperatura ambiente durante unas 2 semanas. Los explantes para la inoculacion se preparan de un modo antes descrito (Hinchee et al., 1988).

Los explantes deben inocularse durante 30 minutos. El medio de cocultivo y de resuspension de Agrobacterium consiste en medio 85 complementado con 8AP 1 mg/l, GA3 1 mg/l, sacarosa 3% (p/v), MES (acido 2-[Nmorfolino]etanosulfonico) 20 mM, L-cisteina 400 mg/l (Olhoft y Somers, 2001) pH 5,7, ditiotreitol (0TT) 0,99 mM y acetosiringona (AS) 200 !M. Los explantes se cocultivan durante 5 dias a 25'C. Tras el cocultivo, los explantes se lavan con el medio de cocultivo que contiene timentin 100 mg/l y cefotaxima 200 mg/l, sin MES ni AS.

A continuacion, los explantes deben colocarse en un medio inductor de brotes y transferirse cada 14 dias durante un total de 28 dias antes de la seleccion con herbicida. El medio inductor de brotes consiste en medio 85 sin diluir complementado con 8AP 1,7 mg/l, timentin 100 mg/l, cefotaxima 200 mg/l pH 5,7 y sacarosa 3% (p/v). Los cotiledones deben colocarse con su lado adaxial hacia arriba y la region del nudo cotiledonar a ras con el medio, y ser expuestos a niveles crecientes de 8asta (2, 5, 6 y por ultimo 7 mg/l de glufosinato amonico) o a niveles subletales de 2,4-0 comprendidos entre 10 mg y 400 mg/l cada 2 semanas durante un total de 8 semanas.

Los explantes diferenciados se trasfieren entonces a un medio de elongacion de brotes durante 4 a 10 semanas mas, donde permanecen expuestos a la misma seleccion con glufosinato o bajo una menor presion selectiva con 2,4-0, en concentraciones de 10 mg a 100 mg/l. El medio de elongacion consiste en medio 85 (Sigma, n.° catalogo M0404) con ribosido de zeatina 1 mg/l, IAA (acido indol-3-acetico) 0,1 mg/l, GA3 0,5 mg/l, glutamina 50 mg/l, asparragina 50 mg/l, y sacarosa 3 % (p/v), pH 5,8. Los brotes elongados se hacen enraizar, sin ninguna otra seleccion, en medio MS diluido a la mitad/vitaminas 85 sin diluir, mas NAA (acido a-naftalenacetico) 0,5 mg/l o IAA 0,1 mg/l y sacarosa 2% (p/v).

Los antibioticos, timentin y cefotaxima, se mantienen presentes en los medios durante toda la seleccion. El medio de los cultivos se renueva cada 2 semanas. Las plantulas se aclimatan durante 1-2 semanas antes del traslado al invernadero.

13.1.3 - Evaluacion de la progenie.

Unas plantas T0 se dejan autofecundar en el invernadero para engendrar las semillas T1. Las plantas T1 (y en la medida en que se disponga de suficientes clones, tambien las plantas T0) son pulverizadas con diferentes dosis de herbicida para determinar el nivel de proteccion frente al mismo proporcionado por los genes AAD-1 (v3) y PAT en la soja transgenica. Las dosis de 2,4-0 aplicadas a las plantas T0 consisten normalmente en una o dos dosis selectivas del orden de 100 a 400 g e.a./ha. Por su parte, las semillas T1 reciben dosis de herbicida mas amplias, comprendidas entre 50-3200 g e.a./ha de 2,4-0. 0e igual forma, las plantas T0 y T1 se pueden seleccionar por su resistencia al glufosinato mediante un tratamiento en postemergencia con 200-800 y 50-3200 g e.a./ha de este herbicida, respectivamente. El analisis de la expresion de la proteina se efectua del modo descrito en el Ejemplo 9 para Arabidopsis y maiz. La herencia del AAD-1 (v3) se averigua analizando la segregacion en la progenie T1 y T2 de los caracteres de tolerancia a los herbicidas.

13.2 - Metodo de transformacion 2: transformacion con Agrobacterium "sin agitacion" de una suspension de celulas de soja no regenerables

Unas suspensiones de celulas de soja 0AS se cultivaron en un tercer ciclo con 10 ml de volumen de suspension sedimentada transferidos a 115 ml de medio liquido fresco. El volumen de celulas sedimentadas se determino dejando asentar la suspension celular durante 2 min en un matraz de 125 ml tras una agitacion energica y extrayendo las celulas del fondo del mismo con una micropipeta de 10 ml con punta ancha. 0espues, los matraces se colocaron en agitadores orbitales a 140 rpm.

Unas alicuotas de 4 ml de celulas en suspension a una 0.O.600 de 0,72 se transfirieron junto con acetosiringona (AS) 200 !M a una placa de Petri esteril de 100x25. 0espues, se aradieron 100 !l de una suspension de Agrobacterium EHA105 con una densidad a 0.O.650 de 1,2 y se mezclo bien. La placa con la mezcla de Agrobacterium y de celulas en suspension se agito bien con movimientos circulares y se deposito en una camara oscura de crecimiento a una temperatura constante de 25'C.

13.2.1 - Seleccion de las celulas de soja en suspension y aislamiento de las colonias transformadas.

Al cabo de 4 dias de cocultivo la placa se volvio a agitar para mezclar la suspension y se transfirio una alicuota de 1,5 ml al medio de seleccion que a continuacion se esparcio sobre medio gelificado en una placa de Petri de 100x15 ml. El medio de seleccion consistia en medio 85 sin disolver complementado con 8AP 1,7 mg/l, timentin 100 mg/l, cefotaxima 200 mg/l pH 5,7 y sacarosa al 3% (p/v), aradiendosele ademas glufosinato amonico en una concentracion de 5 mg/l. Tras permanecer 10 min en la campana extractora para el secado, las placas se incubaron durante 4 semanas a oscuras y a 28'C. Las colonias seleccionadas crecieron y once de ellas se transfirieron a medio fresco para 3 experimentos distintos y se mantuvieron durante 3-4 meses. Las 11 colonias resistentes escogidas produjeron callos que crecieron en el medio de seleccion con glufosinato 5 mg/l. Las celulas en suspension sin transformar resultaron sensibles a la siembra en medio con glufosinato amonico 0,5 mg/l. En cambio, las colonias transformadas resistieron una concentracion 5x de glufosinato amonico y se mantuvieron hasta 4 meses.

Los eventos de callo se muestrearon para los analisis cuando alcanzaron entre 2 y 3 cm de diametro. Al menos dos colonias aisladas en dos experimentos distintos fueron analizadas para determinar la expresion de la proteina AA0

1. Los analisis con ELISA y (estern de ambos aislamientos arrojaron un resultado positivo para la expresion de proteinas AA0-1. Los analisis con ELISA (Tabla 29) y con transferencia (estern (Figura 18) de los dos callos de soja independientes transformados con el gen AAD-1 (v3) indicaron que las celulas del callo estaban expresando la proteina AA0-1 (v3). El ELISA en sandwich detecto un 0,0318% y un 0,0102% de AAD-1 (v3) en la proteina soluble total extraida de dos muestras de tejido de callo. 0ebido a la sensibilidad y la reactividad cruzada del antisuero, en la transferencia (estern se observaron bandas multiples. Pese a ello, en ambas muestras de callo se observo la banda especifica de la AAD-1 (v3), a diferencia del tejido natural (negativo) donde no estaba presente. Los analisis por PCR de la region codificante demostraron la presencia de productos del tamaro esperado de las regiones codificantes de AA01 y PAT en estas colonias, lo cual indica que habian sido transformadas.

Tabla 29. 0atos de PCR y ELISA de los eventos transgenicos de soja.

Evento

PCR de la región codificante de AAD-1 PCR de la región codificante de PAT TSP (Hg/ml) AAD-1 (ng/ml) % Expressión

1-1

+ + 1995,13 633,89 0,0318%

2-1

+ + 2018,91 205,92 0,0102%

Control negativo

- - 2074,63 -1,22 -0,0001%

13.3 - Metodo de transformacion 3: Transformacion con chorro de aerosol de callo embriogenico de soja

El cultivo de callo embriogenico de soja y el proceso de exposicion al chorro de aerosol se describen en la patente US n° 6.809.232 (Held et al.).

Unos callos embriogenicos de varias variedades de elite Stine, 96E750, 96E94, 97E986, 96E144 y 96E692 incluido, entre otras se recogieron por separado en el centro de placas de 81-30 3Co5My o 81-30 3Co5My0.25PA0.5K tres dias despues de haber sido trasladadas a medio fresco. A continuacion, el tejido se pulverizo con p0A83295 utilizando A0N linealizado a una concentracion aproximada de 0,2 !g/ml. 0espues de la pulverizacion del aerosol, el callo embriogenico se transfirio a 81-30 3Co5My o 81-30 3Co5My0.25PA0.5K frescos para un pase de un mes. El tejido se transfirio seguidamente a un medio selectivo que contenia bialafos 1 mg/l. 0urante la seleccion, el bialafos se mantuvo normalmente a 1 mg/l durante los dos primeros pases de un mes y despues se aumento a 2 mg/l durante los tres a siete meses siguientes. Los eventos transgenicos se identificaron cuando el tejido de callo generado por los experimentos de transformacion comenzo a organizarse y a generar estructuras embriogenicas mientras todavia permanecia en medio selectivo con 2,4-0 mas bialafos. Una vez identificadas, las estructuras en maduracion se regeneraron en plantas siguiendo el protocolo siguiente: las estructuras embriogenicas se trasladaron de 81-30 3Co5My o 81-30 3/co5My0.25PA0.5K a medio 83. Al cabo de 3-4 semanas de crecimiento en medio 83, las estructuras individuales se transfirieron a medio fresco. Transcurridas otras 3-4 semanas, los embriones maduros se transfirieron a medio 85G y se expusieron a la luz. Los embriones que se alargaron y produjeron raices se transfirieron a tubos con medio 1/2 85G donde prosiguieron su desarrollo en plantulas; por ultimo, estas se sacaron de los tubos y se plantaron en macetas.

Se probaron algunas variantes de los medios citados en la Tabla 30, por ejemplo, 81-30 3Co5My, elaborado con agua de coco al 3% y mioinositol 5 g/l aradidos a 81-30. Otras variantes incluyeron: 81-30 3Co5My0.25 PA0.5K, que contenia medio basal 81-30 mas agua de coco al 3%, mioinositol 5 g/l, acido fitico 0,25 g/l y KH2PO4 adicional 0,5 g/l; y 1/2 85G, que contenia todos los ingredientes del medio 85G diluidos a la mitad.

Tabla 30. Medios de crecimiento para soja

Ingredientes por litro

Bl-30

B3 B5G

Sales Ms

4,43 g 4,43 g

Sales 85

3,19g

Tabla 30. Medios de crecimiento para soja

Ingredientes por litro

Bl-30

B3 B5G

NaE0TA

37,3 mg 37,3 mg 37,3 mg

2,4-0

30 mg

Carbon activado

5g

Phytagar

8 g 8 g

Gelrite

2 g

PH

5,8 5,8 5,8

Ejemplo 14 - Introducción del AAD-1 (v3) en algodón

14.1 - Protocolo de transformacion del algodon

Las semillas de algodon (genotipo Co310) se sumergen en etanol al 95% durante 1 minuto para esterilizar su superficie, se lavan, se esterilizan con lejia comercial al 50% durante veinte minutos, y despues se lavan 3 veces con agua destilada esteril antes de dejarlas germinar en medio G (vease Tabla 31) en cajas Magenta GA-7 expuestas a una alta intensidad luminica, 40-60 !E/m2, con un fotoperiodo de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad a 28'C.

Los segmentos cuadrados de cotiledon (-5 mm) se extrajeron de plantulas de 7-10 dias de edad y se depositaron en placas de Petri con medio liquido M (vease Tabla 31) (Nunc, n.° articulo 0875728). Los segmentos cortados se trataron con una solucion de Agrobacterium durante 30 minutos y despues se transfirieron a medio M semisolido (Tabla 31), permaneciendo en cocultivo durante 2-3 dias. Al termino de este, los segmentos se transfirieron a medio MG (Tabla 31). La carbenicilina es el antibiotico utilizado para matar a Agrobacterium y el glufosinato amonico es el agente de seleccion que unicamente debe permitir el crecimiento de las celulas portadoras del gen transferido.

Preparacion de Agrobacterium.

Inocular 35 ml de medio Y (Tabla 31) (con estreptomicina (solucion madre de 100 mg/ml) y eritromicina (solucion madre 100 mg/ml)) con el contenido de un asa de bacterias dejadas crecer durante un dia a oscuras y 28'C, en agitacion a 150 rpm. El dia siguiente, la solucion de Agrobacterium se vierte en un tubo de centrifuga Oakridge esteril (Nalge-Nunc, 3139-0050), y se centrifuga con un aparato 8eckman J2-21 a 8.000 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante se descarta, el sedimento se resuspende en 25 ml de liquido M (Tabla 31) y se vortea. Una alicuota del mismo se coloca en un tubo de cultivo de vidrio (Fisher, 14-961-27) para la lectura en un fotocolorimetro (Klett-Summerson, modelo 800-3). La nueva suspension se diluye con medio liquido M para proceder a la lectura en el fotocolorimetro Klett de 108 ufc/ml con un volumen total de 40 ml.

Al cabo de tres semanas, el callo formado a partir de los segmentos de cotiledon se aisla y se transfiere a medio MG fresco. El callo se transfiere a medio MG durante 3 semanas mas. A continuacion, se traslada a medio CG (Tabla 31) y se transfiere de nuevo a medio fresco de seleccion al cabo de tres semanas. 0espues de otras tres semanas, el tejido de callo se transfiere a medio 0 (Tabla 31) carente de reguladores del crecimiento vegetal para la induccion del callo embriogenico. Tras 4-8 semanas en este medio, se forma el callo embriogenico, que puede distinguirse del callo no embriogenico por su color amarillento-blancuzco y las celulas granulares. Los embriones comienzan a regenerarse poco despues y presentan un distintivo color verde.

Los embriones mas grandes y desarrollados se aislan y se transfieren a medio 0K (Tabla 31) para completar el desarrollo embrionario. Tres semanas despues (o cuando los embriones hayan crecido), los embriones germinados se transfieren a medio fresco para el desarrollo de brotes y raices. Al cabo de 4-8 semanas, todas las plantas bien desarrolladas se trasplantan al suelo y se cultivan hasta que alcanzan la madurez. Al cabo de un par de meses, la planta ya ha crecido lo suficiente para ser pulverizada y determinar su resistencia al 2,4-0.

Tabla 31. Medios para la transformacion del algodon

Ingredientes por litro

G M líquido M MG CG D DK Y

Sales LS (5X)

200 ml 200 ml 200 ml 200 ml 200 ml

Glucosa

30 g 30 g 30 g 30 g 20 g

vit 85 modificada(1000x)

1 ml 1ml 1ml 1ml 1ml 10 ml 1 ml

Cinetina (1mM)

1ml 1ml 1 ml 4,6 ml 0,5ml

2,4-0 (1mM)

1ml 1 ml 1ml

Agar

8 g 8 g 8 g 8 g 8 gs 8 g

Sales 0K( (0190)

1 saquete 1 saquete

Mioinositol (100x)

1 ml 10 ml

Sacarosa 3%

30 g 30 g 10 gramos

NAA

Tabla 31. Medios para la transformacion del algodon

Ingredientes por litro

G M líquido M MG CG D DK Y

Carbenicilina (250 mg/ml)

2 ml 0,4 ml

GLA (10mg/ml)

0,5 ml 0,3 ml

Peptona

10 g

Extracto de levadura

10 g

NaCl

5 g

14.2 - Pormenores del experimento

Para este experimento se trataron 500 segmentos de cotiledon con p0A8721. 0e los 500 segmentos tratados, 475

5 presentaron callos aislados durante la seleccion (frecuencia de transformacion del 95%). El callo se selecciono con glufosinato amonico, debido a la inclusion del gen PAT en el constructo, puesto que ya se habia elaborado un esquema de seleccion. El analisis de la linea del callo mediante PCR e Invader permitio determinar los patrones de insercion y comprobar que el gen estuviera presente en el estadio de callo; las lineas de callos que eran embriogenicas fueron sometidas a un analisis (estern.

14.3 - Resultados del analisis de los callos

El analisis tenia por proposito descartar todas las lineas que no contuvieran la PTU completa, no manifestaran expresion o tuvieran un alto numero de copias; tales lineas no se regenerarian. 0e las 475 lineas de callos 15 transformados con p0A8721, 306 se sometieron al analisis PCR y al ensayo Invader (Tabla 32). Muy pocas lineas arrojaron un resultado negativo en la PCR. Los resultados de Invader no estan listos todavia integramente porque de algunas muestras no se pudo extraer suficiente A0N, y tuvieron que volver a enviarse. No obstante, los datos disponibles hasta ahora del ensayo Invader demuestran que pocas lineas analizadas presentan un gran numero de copias (>2 copias) (Tabla 32). 0ebido al gran numero de lineas que superaron el analisis, fue preciso reducir el

20 numero de lineas de callos embriogenicos mantenidas por su excesivo volumen. Noventa lineas se enviaron para el analisis con (estern, y ocho de ellas resultaron negativas. Este analisis revelo una elevada expresion en la mayoria de las lineas (Tabla 32). A tenor de los resultados de estos analisis (y de los resultados pendientes) se estan manteniendo 82 lineas de callos embriogenicos para la regeneracion de las plantas.

Tabla 32. Analisis de los callos de algodon

Línea

N.° de copias PTU Western Línea N.° de copias PTU Western

1

2 pos *** 43 1 pos *****

2

1 pos *** 44 A0N escaso pos *****

3

1 pos *** 45 1 pos *****

4

pos *** 46 2 pos *****

5

1 pos *** 47 1 pos ***

6

1 pos neg 48 1 pos ***

7

1 pos **** 49 3 pos. dudoso neg

8

1 pos ***** 50 1 pos ****

9

pos * 51 4 pos neg

10

1 pos * 52 2 pos ****

11

1 pos ***** 53 1 pos ***

12

1 pos * 54 1 pos ****

13

1 pos * 55 1 pos neg

14

1 pos ** 56 5 pos *

15

1 pos **** 57 2 pos. dudoso neg

16

1 pos ***** 58 8 pos ****

17

1 pos * 59 2 pos ****

18

1 pos *** 60 5 pos *****

19

1 pos ** 61 1 pos **

20

1 pos ***** 62 1 pos **

21

pos ***** 63 1 pos ***

22

1 pos ***** 64 1 pos ***

23

1 pos ***** 65 3 pos ****

24

pos *neg 66 5 pos *

25

1 pos **** 67 6 pos *

26

1 pos **** 68 A0N escaso pos neg

27

A0N escaso pos ***** 69 A0N escaso pos ****

28

A0N escaso pos ** 70 A0N escaso pos **

29

A0N escaso pos ***** 71 A0N escaso pos. dudoso **

30

17 pos * 72 A0N escaso pos ****

Tabla 32. Analisis de los callos de algodon

Línea

N.° de copias PTU Western Línea N.° de copias PTU Western

31

A0N escaso pos ***** 73 A0N escaso neg ***

32

A0N escaso pos ***** 74 A0N escaso pos. dudoso ***

33

A0N escaso pos **** 75 A0N escaso pos ***

34

A0N escaso pos. dudoso ***** 76 A0N escaso pos neg

35

A0N escaso pos **** 77 A0N escaso pos. dudoso ****

36

A0N escaso pos neg 78 A0N escaso pos ****

37

A0N escaso pos **** 79 1 pos **

38

A0N escaso neg ***** 80 A0N escaso pos ***

39

1 pos **** 81 A0N escaso pos ***

40

A0N escaso pos * 82 A0N escaso pos ***

41

A0N escaso pos * 83 A0N escaso neg ****

42

A0N escaso pos ** 84 A0N escaso pos ***

Patron AA01 5�g/ml ***** Patron AA01 0,5�g/ml **

85 A0N escaso pos **

86

A0N escaso pos *

14.4 - Regeneracion de la planta

0os lineas de algodon portadoras del AAD-1 (v3) que produjeron plantas con arreglo al protocolo indicado se enviaron al invernadero. Para demostrar que el gen AAD-1 (v3) confiere al algodon resistencia frente al 2,4-0, plantas de algodon portadoras del AAD-1 (v3) y otras naturales fueron tratadas con un pulverizador de carril a 187 l/ha. Las plantas recibieron una dosis de 560 g e.a./ha de 2,4-0MA formulado en tampon Hepes 200 mM (pH 7,5) y fueron evaluadas 3, 7 y 14 dias despues del tratamiento. Se les asigno una puntuacion de daros observando si presentaban enanismo, clorosis y necrosis. Las plantas que recibieron una puntuacion de daro igual o superior al 90% se consideraron muertas. Tres dias despues del tratamiento (0AT) las plantas naturales comenzaron a mostrar epinastia y recibieron una puntuacion del 15%; en cambio, las plantas portadoras del AAD-1 (v3) manifestaron 0% de daros. A los 7 0AT, las plantas naturales seguian presentando epinastia y los brotes nuevos habian comenzado a amarronarse; recibieron una puntuacion del 50%. A los 14 0AT, las plantas con AAD-1 (v3) seguian indemnes, mientras que las naturales presentaban un acusado enanismo, con las zonas de nuevo crecimiento marrones y marchitas. Por lo tanto, el tipo natural recibio una valoracion del 90% a los 14 0AT.

Este estudio demuestra que el gen AAD-1 (v3) confiere al algodon una notable tolerancia frente al 2,4-0 aplicado en dosis de hasta 560 g e.a./ha.

Ejemplo 15 - Transformación con Agrobacterium de otros cultivos

A partir de la presente descripcion, es posible transformar otros cultivos con arreglo a la presente invencion por medio de tecnicas conocidas en la disciplina. Para la transformacion de centeno con Agrobacterium, vease por ejemplo, Popelka y Altpeter (2003). Para la transformacion de soja con Agrobacterium, vease por ejemplo, Hinchee et al., 1988. Para la transformacion de sorgo con Agrobacterium, vease por ejemplo, Zhao et al., 2000. Para la transformacion de cebada con Agrobacterium, vease por ejemplo, Tingay et al., 1997. Para la transformacion de trigo con Agrobacterium, vease por ejemplo, Cheng et al., 1997. Para la transformacion de arroz con Agrobacterium, vease por ejemplo, Hiei et al., 1997.

Los nombres cientificos de esas y otras plantas se enumeran a continuacion. 0ebe quedar claro que es posible utilizar esas y otras tecnicas de transformacion (sin Agrobacterium) para llevar a cabo la transformacion del gen AAD-1 (v3), por ejemplo, en las plantas siguientes, entre otras: maiz (Gramineae, Zea mays), trigo (Pooideae, Triticum spp.), arroz (Gramineae, Oryza spp. y Zizania spp.), cebada (Pooideae, Hordeum spp.), algodon (Abroma Dicotyledoneae, Abroma augusta, y Malvaceae, Gossypium spp.), soja (Leguminosae, Glycine max), remolacha azucarera (Chenopodiaceae, Beta vulgaris altissima), cara de azucar (Arenga pinnata), tomate (Solanaceae, Lycopersicon esculentum y otras spp., Physalis ixocarpa, Solanum incanum y otras spp., y Cyphomandra betacea), patata, batata, centeno (Pooideae, Secale spp.), pimientos (Solanaceae, Capsicum annuum, sinense y frutescens), lechuga (Compositae, Lactuca sativa, perennis y pulchella), col, apio (Umbelliferae Apium graveolens), berenjena (Solanaceae, Solanum melongena), sorgo (todas las especies de Sorghum), alfalfa (Leguminosae, Medicago sativum), zanahoria (Umbelliferae, Daucus carota sativa), judias (Leguminosae, Phaseolus spp. y otros generos), avenas (Avena sativa y strigosa), guisantes (Leguminosae, Pisum, Vigna y Tetragonolobus spp.), girasol (Compositae, Helianthus annuus), calabaza (Dicotyledoneae, Cucurbita spp.), pepino (0icotyledoneae genera), tabaco (Solanaceae, Nicotiana spp.), Arabidopsis (Cruciferae, Arabidopsis thaliana), cesped (Lolium, Agrostis y otras familias), y trebol (Leguminosae). Tales plantas, con genes AAD-1 (v3), por ejemplo, estan incluidas en la presente invencion.

Ejemplo 16 - Apilamiento del gen AAD-1 (v3) con el gen de resistencia a herbicidas AHAS

El apilamiento de AAD-1 (v3) con el gen de resistencia a herbicidas AHAS se describe en el Ejemplo 7.9.

Ejemplo 17 - Más pruebas de resultados sorprendentes: AAD-1 vs. AAD-2

17.1 - Clonacion inicial del AAD-2 (v1)

En la base de datos de NC8I se identifico otro gen homologo (vease el sitio web ncbi.nlm.nih.gov; entrada n.° AP005940) que solo mantenia una identidad de aminoacidos del 44% con el tfdA. Este gen se denomina en la presente memoria AAD-2 (v1) por coherencia. La identidad porcentual se determino traduciendo las secuencias de A0N del AAD-2 y del tfdA (SEC I0 n° 12 y entrada GEN8ANK N.° M16730, respectivamente) a sus respectivas proteinas (SEC I0 n° 13 y entrada GEN8ANK N.° M16730, respectivamente), y despues procediendo al alineamiento multiple de las secuencias por medio del programa Clustal(, incluido en el paquete de software Vector NTI.

La cepa de Bradyrhizobium japonicum portadora del gen AAD-2 (v1) se adquirio en el Northern Regional Research Laboratory (NRRL, cepa n.° 84450). La cepa liofilizada se revivio siguiendo el protocolo del NRRL y se conservo a 80'C en glicerol al 20% para uso interno como la ce pa bacteriana 0ow 8acterial 08 663. 0e esta solucion madre congelada, se sembro el contenido de celulas de un asa en una placa de agar triptona y soja para el aislamiento, incubandose a 28'C durante 3 dias. Una sola colonia se sembro en 100 ml de caldo de triptona y soja contenidos en un matraz de 500 ml con tres placas deflectoras, que se incubo hasta el dia siguiente a 28'C en un agi tador de plataforma a 150 rpm. 0e este se aislo el A0N total con el protocolo para gramnegativas del kit 0Neasy de Qiagen (Qiagen, n.° catalogo 69504). Para amplificar el gen diana a partir del A0N genomico se diseraron los siguientes cebadores: 0irecto: 5' ACT AGT AAC AAA GAA GGA GAT ATA CCA TGA CGA T 3' [(brjap 5'(speI) SEC I0 n° 14 (aradidos una diana de restriccion para Spe I y un sitio de union a ribosoma (R8S))], e Inverso: 5' TTC TCG AGC TAT CAC TCC GCC GCC TGC TGC TGC 3' [(br jap 3' (xhoI) SEC I0 n° 15 (aradido una diana para Xho I)].

Reacciones de 50 microlitros se prepararon del modo siguiente: tampon Fail Safe 8uffer 25 !l, cada cebador 1 !l (50 ng/!l), A0Ng 1 !l (200 ng/!l), H2O 21 !l, polimerasa Taq 1 !l (2,5 unidades/!l). Tres tampones Fail Safe -A, 8 y C se usaron en tres reacciones distintas. A continuacion, se llevo a cabo la PCR con las condiciones siguientes: ciclo de desnaturalizacion por calor a 95'C durante 3,0 m inutos; 95'C durante 1,0 minuto, 50'C durante 1,0 m inuto, 72'C durante 1,5 minutos, durante 30 ciclos; seguidos de un ciclo final de 72'C durante 5 minutos, utilizan do el FailSafe PCR System (Epicenter, n.° catalogo FS99100). El producto resultante de la PCR de -1 kb se clono en pCR 2.1 (Invitrogen, n.° catalogo K4550-40) siguiendo el protocolo incluido, utilizando como cepa hospedadora la E. coli TOP10F' quimicamente competente, para verificar la secuencia de nucleotidos.

0iez de las colonias blancas surgidas se sembraron en 3 !l de caldo Luria + ampicilina 1000 !g/ml (L8 Amp) y se dejaron crecer hasta el dia siguiente a 37'C con ag itacion. Los plasmidos de cada cultivo se purificaron con el kit Nucleospin Plus Plasmid Miniprep Kit (80 8iosciences, n.° catalogo K3063-2) siguiendo el protocolo incluido. El A0N aislado se sometio a una digestion con enzimas de restriccion para confirmar la presencia del producto de la PCR en el vector pCR2.1. El A0N plasmidico se digirio con la enzima de restriccion EcoRI (New England 8iolabs, n.° catalogo R0101S). La secuenciacion se llevo a cabo con el kit 8eckman CEQ Quick Start (8eckman Coulter, n.° catalogo 608120) utilizando un cebador directo de M13 [5' GTA AAA CGA CGG CCA GT 3'] (SEC I0 n° 16) y otro inverso [5' CAG GAA ACA GCT ATG AC 3'] (SEC I0 n° 17), segun las instrucciones del fabricante. Esta secuencia genica y su proteina correspondiente recibieron una nueva designacion general de AAD-2 (v1) para mantener la coherencia interna.

17.2 - Construccion del vector binario de AAD-2 (v1)

El gen AAD-2 (v1) se amplifico por PCR a partir del p0A83202. 0urante la reaccion de PCR se modificaron los cebadores para introducir dianas de restriccion para AflIII y SacI en el cebador 5' y en el cebador 3', respectivamente. Los cebadores "NcoI de 8rady" [5' TAT ACC ACA TGT CGA TCG CCA TCC GGC AGC TT 3'] (SEC I0 n° 18) y "SacI de 8rady" [5' GAG CTC CTA TCA CTC CGC CGC CTG CTG CTG CAC 3'] (SEC I0 n° 19) se usaron para amplificar un fragmento de A0N por medio del sistema Fail Safe PCR System (Epicentre). El producto de la PCR se clono en el vector de clonacion pCR 2.1 TOPO TA (Invitrogen) y la secuencia se verifico con los cebadores M13 directo e inverso utilizando los reactivos para secuenciacion del kit "0ye Terminator Cycle Sequencing with Quick Start Kit", de 8eckman Coulter. Los datos de la secuenciacion permitieron identificar un clon con la secuencia correcta (p0A8716). Seguidamente, el fragmento del gen AAD-2 (v1) AflIII/SacI se clono en el vector p0A8726 NcoI/SacI. El constructo resultante (p0A8717); promotor AtUbi10: Nt OSM 5'UTR: AAD-2 (v1): Nt OSM3'UTR: ORF1 poliA 3'UTR se verifico con digestiones con enzimas de restriccion (con NcoI/SacI). Este constructo a su vez se clono en el p0A83038 binario con un fragmento de A0N NotI-NotI. El constructo resultante (p0A8767); promotor AtUbi10: Nt OSM5'UTR: AAD-2 (v1): Nt OSM 3'UTR: ORF1 poliA 3'UTR: promotor del CsVMV: PAT: ORF25/26 3'UTR se digirio con enzimas de restriccion (NotI, EcoRI, Hin0III, NcoI, PvuII y SalI) para verificar la correcta orientacion. El constructo acabado (p0A8767) se empleo para la transformacion en Agrobacterium.

17.3 - Comparacion de las especificidades de sustrato de AAD-2 (v1) y AAD-1 (v1)

La actividad de un extracto de E. coli que expresaba la AA0-2 (v1) (p0A83202) preparado como en el Ejemplo 11 se analizo con cuatro herbicidas, a saber, 2,4-0, (R,S)-diclorprop, (R,S)-haloxifop y (R)-haloxifop (todos en una

concentracion final de 0,5 mM) utilizando 3 !l (42 !g) de extracto de E. coli por ensayo, con un periodo de ensayo de

15 min. La Figura 22 muestra que la actividad relativa de la AA0-2 (v1) sobre los sustratos fue: 2,4-0 = diclorprop >

(R,S)-haloxifop >> (R)-haloxifop. Por tanto, la AA0-2 (v1) difiere de la AA0-1 (v1) en que posee un nivel similar de

5 actividad sobre el 2,4-0 y el diclorprop (mientras que la actividad de la AA0-1 (v1) sobre el 2,4-0 es -10% de la

manifestada contra diclorprop). La AA0-2 (v1) tambien difiere de la AA0-1 (v1) en que es incapaz de actuar contra el

(R)-haloxifop. La Tabla 33 contiene los datos de otros sustratos analizados con AA0-1 (v1) y AA0-2 (v1) que

confirman que esta ultima es especifica para sustratos (S)-enantiomeros, a diferencia de la AA0-1 (v1), que lo es

para (R)-enantiomeros. En otra prueba la AA0-2 (v1) difirio de la AA0-1 (v1) en que se detectaron pequeras o nulas 10 cantidades de fenoles derivados del 2,4-0 sulfonato (en el que un grupo sulfonato sustituye al carboxilato del 2,4-0)

mientras que la AA0-1 (v1) genera niveles significativos de fenoles a partir de este compuesto (-25% del 2,4-0).

Tabla 33. Comparacion de la actividad de AA0-1 y AA0-2 sobre varios sustratos. Los sustratos se analizaron a 0,5 mM durante 15 min en MOPS 25 mM pH 6,8, Fe2+ 200 !M, ascorbato sodico 200 !M, a-cetoglutarato 1 mM con 4 !l de extracto de AA0-1 (32 !g de proteina) o 3 !l de extracto de AA0-2 (42 !g de proteina).

A510

ESTRUCTURA

ID Reg Compuesto Enantiómero AAD1 AAD2

18706

quizalofop R 0,27 0,01

8671

haloxifop R 0,12 0

66905

haloxifop R,S 0,1 0,3

14623

cihalofop R,S 0,12 0,1

14603

cihalofop R 0,14 0

7466

cihalofop S 0 0,15

11044492 fenoxaprop R 0,14 0 0,22

43865

haloxifopacetato - 0

La cinetica enzimatica de las proteinas AA0-1 (v1) y AA0-2 (v1) parcialmente purificadas se comparo utilizando el

15 2,4-0 como sustrato. Vease la Figura 19. Los valores Km correspondientes al 2,4-0 ascendieron a 97 y 423 !M para la AA0-1 (v1) y la AA0-2 (v1) respectivamente, y los valores de la Vmax. aparente fueron de 0,11 y 0,86 unidades de A510, respectivamente (Tabla 34). 0ado que en los analisis se utilizaron cantidades equivalentes de enzima (determinadas por el analisis con S0S-PAGE), se puede concluir que la kcat de la AA0-2 (v1) con el 2,4-0 es casi ocho veces mayor que la de la AA0-1 (v1), y que el kcat/Km es dos veces mayor. Por tanto, la AA0-2 (v1) es

20 significativamente mas eficiente a la hora de degradar el 2,4-0 in vitro que la AA0-1 (v1). Este hecho contrasta

sorprendentemente con los resultados hallados in vivo en las plantas y que se describen a continuacion, en los cuales las plantas que expresaban la AA0-1 (v1) resultaron significativamente mas resistentes al 2,4-0 que las portadoras de AA0-2 (v1).

Tabla 34. Comparacion de los valores Km y Vmax.correspondientes a las ariloxialcanoato dioxigenasas (AA0) de p0A83202 (AA0-2) y p0A83203 [AA0-1 (v1)] obtenidos con diferentes sustratos herbicidas:

AA0-2 2,4-0 423 (±1) 0,86 2,03

AA0-1 (v1) 2,4-0 97 (±21) 0,11 1,16

Nota: los ensayos se realizaron en MOPS pH 6,75 + a-cetoglutarato 1 mM + ascorbato sodico 0,1 mM + Fe2+ 0,1 mM y los fenoles liberados se detectaron por colorimetria con 4-aminoantipirina/ferricianuro.

17.4 - Evaluacion de las plantas de Arabidopsis transformadas

Las semillas T1 transformadas con un gen natural [AAD-1 (v2)], un gen optimizado para vegetales [AAD-1 (v3)] o un gen natural AAD-2 (v1) recien recogidas se dejaron secar por espacio de 7 dias a temperatura ambiente. 0espues se sembraron en bandejas de germinacion de 26,5 x 51 cm (T.O. Plastics Inc., Clearwater, Minnesota, EE.UU.), en cada una de las cuales se plantaron alicuotas de 200 mg de semillas T1 estratificadas (-10.000 semillas) que previamente habian sido suspendidas en 40 ml de solucion de agarosa al 0,1% y mantenidas a 4'C durante 2 dias para completar los requerimientos de la dormicion y asegurar una germinacion simultanea.

El sustrato de semillero Sunshine LP5 Mix (Sun Gro Horticulture, 8ellevue, (ashington, EE.UU.) se cubrio con vermiculita fina, se rego por goteo subterraneo con solucion de Hoagland hasta dejarlo empapado, y despues se dejo drenar por gravedad. Cada alicuota de 40 ml de semillas estratificadas se sembro uniformemente en la vermiculita con una pipeta y se tapo con una cubierta para retener la humedad (KOR0 Products, 8ramalea, Ontario, Canada) durante 4-5 dias. Las cubiertas se retiraron 1 dia antes de la seleccion inicial de transformantes mediante una pulverizacion en postemergencia con glufosinato (que selecciono a las contransformadas con el gen PAT).

Entre 5 y 6 dias despues de la siembra (0AP) y de nuevo a los 10 0AP, las plantas T1 (cotiledon y estadio de 2-4 hojas, respectivamente) se pulverizaron con una solucion de herbicida Liberty al 0,2% (200 g m.a./l de glufosinato, 8ayer Crop Sciences, Kansas City, Mo., EE.UU.) con un volumen de pulverizacion de 10 ml/bandeja (703 l/ha) utilizando una boquilla de aire comprimido 0eVilbiss para suministrar una dosis efectiva de 280 g m.a./ha de glufosinato por aplicacion. Las plantas supervivientes (las que continuaban creciendo) se identificaron 5-7 dias despues de la ultima pulverizacion y se trasplantaron de forma individual a macetas de 3 pulgadas rellenas con medio para macetas (Metro Mix 360). Las plantas trasplantadas se taparon con cubiertas para retener la humedad durante 3-4 dias y se mantuvieron en una camara de crecimiento a 22'C como antes. Posteriormente, las cubiertas se retiraron y las plantas se trasladaron al invernadero (22 ± 5'C, 50 ± 30% HR, 14 h de luz:10 h de o scuridad, minimo de luz natural + complementaria = 500 !E/m2s1) al menos 1 dia antes del ensayo destinado a analizar la capacidad de AAD-1 (v3), AAD-1 (v2) o AAD-2 (v1) para conferir resistencia contra herbicidas fenoxi auxina.

En plantas T1 seleccionadas por su resistencia frente al glufosinato y escogidas al azar se confirmo la expresion de la proteina PAT por medio de un kit de ELISA para PAT (n.° articulo 7000045, Strategic 0iagnostics, Inc., Newark, 0E); de ese modo se confirmo de forma no destructiva la fidelidad del proceso de seleccion (protocolo del fabricante). A continuacion las plantas se asignaron al azar para recibir diversas dosis de 2,4-0 (50-800 g e.a./ha).

Las aplicaciones de herbicida se realizaron con un pulverizador de carril ajustado a un volumen de pulverizacion de 187 l/ha. El 2,4-0 empleado consistio en una formulacion comercial de la sal dimetilamina (456 g e.a./l, NuFarm, St Joseph, MO) mezclada con tampon Tris 200 mM (pH 9,0).

17.5 - Resultados de la seleccion de las plantas transformadas

Las primeras transformaciones de Arabidopsis se efectuaron con el gen AAD-1 (v3). En primer lugar, las transformantes T1 se seleccionaron entre el conjunto de semillas no transformadas mediante un esquema de seleccion con glufosinato. Mas de 400.000 semillas T1 fueron sometidas a seleccion y entre ellas se hallaron 493 plantas resistentes al glufosinato (gen PAT), lo que equivale a una frecuencia de transformacion/seleccion de 0,12%. 0ependiendo del lote de semillas analizado, esta oscilo entre 0,05-0,23% (vease la Tabla 15 en el Ejemplo 6.5 precedente). Tambien con el glufosinato como agente de seleccion, se detecto un pequero lote de semillas transformadas con el gen natural AAD-1 (v2). Entre las 84.000 semillas analizadas se identificaron 278 individuos T1 resistentes al glufosinato (frecuencia de transformacion/seleccion del 0,33%). Sorprendentemente, las transformaciones de Arabidopsis con el gen natural AAD-2 (v1) arrojaron una frecuencia de transformacion muy baja al seleccionarse por la tolerancia al glufosinato (funcion de marcador seleccionable PAT). Entre las alrededor de 1,3 millones de semillas analizadas solo se recuperaron 228 plantas transformantes para el glufosinato, lo que equivale a una frecuencia de transformacion/seleccion del 0,018% (vease la Tabla 15). Asi pues, la frecuencia de transformacion del AAD-2 (v1) natural solo supuso el 6% de la del AAD-1 (v2) natural. El gen AAD-2 (v1) natural fue optimizado posteriormente de manera artificial, clonado e incorporado en un p0A83705 para transformar Arabidopsis con los metodos antes descritos (vease el Ejemplo 5). El gen AAD-2 (v2) optimizado para vegetales (SEC I0 n° 29, que codifica la SEC I0 n° 30) manifesto una frecuencia de seleccion en Arabidopsis T1 con herbicida Liberty que resulto normal, de aproximadamente 0,11% (vease la Tabla 15).

Las plantas T1 seleccionadas se trasplantaron a macetas individuales y se pulverizaron con diversas dosis de herbicidas ariloxialcanoato comerciales. La Tabla 16 (en el Ejemplo 6.5 anterior) compara la respuesta de los genes AAD-1 (v2), AAD-1 (v3), AAD-2 (v1) y AAD-1 (v2) para conferir resistencia contra el 2,4-0 a plantas Arabidopsis T1 transformadas. Todos los genes proporcionaron cierta resistencia sustancial contra el 2,4-0 respecto a las lineas control transformadas y sin transformar, aunque los diversos constructos manifestaron una amplia variabilidad en su capacidad para conferir resistencia frente al 2,4-0 a las plantas T1 de Arabidopsis. Los niveles de respuesta de las plantas sometidas a un mismo tratamiento manifestaron una gran variabilidad, lo que puede atribuirse al hecho de que cada planta representa un evento de transformacion distinto. Cabe subrayar que a cualquiera de las dosis de 2,4-0 probadas, hubo individuos que no se vieron afectados en absoluto, mientras que otros lo fueron gravemente. En la Tabla 16 se presenta el promedio de daros en la poblacion total por cada dosis con objeto de demostrar la diferencia significativa entre las plantas transformadas con AAD-1 (v2), AAD-1 (v3), AAD-2 (v1) o con AAD-1 respecto a los controles naturales o transformados con PAT/Cry1F.

Sorprendentemente, las plantas transformadas con AAD-2 (v1) resultaron mucho menos resistentes al 2,4-0 que las transformadas con los genes AAD-1 (v2) o AAD-1 (v3) (Tabla 16), tanto en terminos de frecuencia de plantas muy tolerantes como de promedio total de daros. Ninguna planta transformada con AAD-2 (v1) sobrevivio a 200 g e.a./ha de 2,4-0 relativamente indemne (daros visuales <20%), y los daros de la poblacion global oscilaron alrededor del 83%. En cambio, el 56% (45 de 80) de las plantas T1 transformadas con AAD-1 (v2) sobrevivieron a 200 g e.a./ha de 2,4-0 sin daros sustanciales (promedio de daros en la poblacion = 34%), y >73% (11 de 15) de las plantas T1 portadoras del AAD-1 (v3) resultaron indemnes (promedio de daros en la poblacion = 14%). Vease la Figura 20. La tolerancia en las portadoras del gen AAD-2 (v2) optimizado para vegetales resulto ligeramente mejor respecto al gen natural; en cambio, la comparacion de los genes AAD-1 y -2 optimizados para vegetales indica una ventaja significativa para el AAD-1 (v3) expresado en planta (vease la Tabla 16).

Estos resultados son inesperados, dado que la comparacion in vitro de las AAD-1 (v2) y AAD-2 (v1) naturales indicaba que el 2,4-0 era mas degradado por la AAD-2 (v1). La AAD-2 (v1) se expresa en las plantas T1 en diferentes grados con el tamaro previsto, pero su expresion confiere escasa proteccion contra los daros causados por el 2,4-0. Existe poca correlacion entre el nivel de expresion observado en la transferencia (estern y el nivel de daro causado por el 2,4-0 en las mismas plantas. Vease la Figura 21. No resulto patente ninguna gran diferencia en el nivel de expresion de la proteina (en planta) entre los genes AAD-2 natural y optimizado para vegetales. Estos datos corroboran los resultados previos que convierten la expresion funcional de la AAD-1 (v3) en la planta como un medio de conferir resistencia a los herbicidas 2,4-0 y AOPP en un hecho inesperado.

Ejemplo 18 - Aplicaciones de desherbado en presiembra

Este ejemplo y los siguientes son ejemplos concretos de nuevas aplicaciones herbicidas que la presente invencion de AA0-1 hace posibles.

Las aplicaciones de herbicidas en presiembra tienen por finalidad matar las malas hierbas que han brotado durante el invierno o a inicios de primavera antes de plantar los cultivos. Normalmente dichas aplicaciones se realizan en sistemas de cultivo sin laboreo o laboreo reducido donde antes de la siembra no se ha llevado a cabo la eliminacion fisica de las malas hierbas. El programa herbicida, por tanto, debe controlar un espectro muy amplio de malas hierbas dicotiledoneas y gramineas que esta presente en el momento de la siembra. Glifosato, gramoxona y glufosinato son ejemplos de herbicidas no selectivos y no residuales muy utilizados en las aplicaciones herbicidas en presiembra. Algunas malezas, sin embargo, resultan dificiles de controlar en esa epoca del aro debido a uno o varios de los factores siguientes: insensibilidad intrinseca de la especie o el biotipo al herbicida, tamaro relativamente grande de las malezas anuales de invierno, y condiciones meteorologicas frias que limitan la absorcion y actividad del herbicida. Existen varias opciones para la mezcla en tanque de los herbicidas a fin de aumentar el espectro y la actividad contra las malas hierbas cuando los herbicidas mas selectivos resultan ineficientes. Un ejemplo consistiria en aplicar una mezcla en tanque de 2,4-0 y glifosato para controlar a Conyza canadensis (calta). El glifosato se puede utilizar en dosis de 420 a 1680 g e.a./ha, mas habitualmente entre 560 y 840 g e.a./ha, para el control en presiembra de la mayoria de malezas presentes, pero tambien se pueden aplicar entre 280-1120 g e.a./ha de 2,4-0 para ayudar a controlar numerosas malas hierbas de hoja ancha (por ejemplo, la calta). El 2,4-0 es un herbicida de eleccion por su eficacia contra un amplisimo abanico de malas hierbas dicotiledoneas, incluso a bajas temperaturas, y su modico coste. No obstante, si el futuro cultivo es una dicotiledonea sensible, los residuos de 2,4-0 que permanezcan en el suelo (a pesar de su breve vida media) pueden afectarlo. La soja es un cultivo sensible que requiere un periodo minimo de tiempo de 7 (para 280 g e.a./ha de 2,4-0) a 30 dias (para aplicaciones de 2,4-0 de 1120 g e.a./ha) entre las aplicaciones de desherbado y la siembra. El uso del 2,4-0 como tratamiento en presiembra del algodon esta prohibido (veanse las etiquetas oficiales, la mayoria disponibles en el CPR, 2003 o en linea en cdms.net/manuf/manuf.asp). En el caso del algodon o la soja transformados con AAD-1 (v3), estos cultivos deben ser capaces de sobrevivir a los residuos de 2,4-0 presentes en el suelo a causa de los tratamientos de desherbado efectuados hasta justo antes o incluso despues de la siembra, pero antes de la emergencia del cultivo. La mayor flexibilidad y el menor coste de los otros integrantes de la mezcla de tanque (o de la premezcla comercial) mejoraran las opciones de control de malas hierbas y aumentaran la efectividad de las aplicaciones de desherbado en situaciones importantes de laboreo reducido o nulo. Este ejemplo es una de las muchas opciones que estaran disponibles. Los expertos en tecnicas de control de malas hierbas advertiran otras aplicaciones como, por ejemplo, gramoxona + 2,4-0 o glufosinato + 2,4-0 utilizando los productos descritos en las etiquetas oficiales de los herbicidas (CPR, 2003) y los usos descritos en la Agriliance Crop Protection Guide (2003), entre otras. Los expertos en la materia tambien reconoceran que el ejemplo anterior tambien se puede aplicar a cualquier cultivo sensible al 2,4-0 (o a otro herbicida auxinico fenoxi), que quedara protegido por el gen AAD-1 (v3) siempre que este resulte integrado de forma estable.

Ejemplo 19 - Uso en cultivo de los herbicidas auxínicos fenoxi en soja, algodón y otros cultivos de dicotiledóneas transformados únicamente con AAD-1 (v3)

El gen AAD-1 (v3) puede posibilitar el uso de los herbicidas auxinicos fenoxi (por ejemplo, 2,4-0, diclorprop, MCPA y otros) para el control de un amplio espectro de malas hierbas latifolias directamente en cultivos que normalmente son sensibles al 2,4-0. La aplicacion del 2,4-0 en dosis de 280 a 2240 g e.a./ha permitiria controlar la mayoria de arvenses latifolias presentes en los entornos agricolas; habitualmente se utilizan sobre todo 560-1120 g e.a./ha. En un sistema de control integral de las malas hierbas tambien se deben controlar las gramineas. En estos momentos hay registrada una amplia gama de graminicidas, como por ejemplo haloxifop, quizalofop, fenoxaprop, fluazifop, setoxidim y cletodim, para el uso en la mayoria de cultivos de dicotiledoneas, los cuales toleran de forma natural tales herbicidas. Una combinacion de quizalofop (20-100 g e.a./ha) y 2,4-0 (420-840 g e.a./ha) podria proporcionar dos mecanismos de accion herbicidas en un cultivo de dicotiledonea transformada con AAD-1 (v3) (esto es, soja o algodon) que controlarian la mayoria de malas hierbas agronomicas de manera similar al glifosato en cultivos tolerantes al mismo (veanse los espectros de control de malas hierbas en las caracteristicas tecnicas de la Crop Protection Guide de Agriliance).

Una ventaja de esta herramienta adicional es el coste sumamente bajo del herbicida de hoja ancha y el potencial control residual de breve vida que proporcionan las dosis mas altas de 2,4-0 y/o los herbicidas AOPP cuando se utilizan en dosis elevadas, a diferencia de un herbicida no residual como el glifosato, que no consigue controlar las malas hierbas que germinan tardiamente. Esta herramienta tambien facilita un mecanismo para rotar los modos de accion herbicidas con las ventajas de los HTC como una estrategia integrada para el manejo de la resistencia a herbicidas y los cambios en la flora arvense en una estrategia de rotacion de HTC con un cultivo tolerante a glifosato/AAD-1 (v3), tanto si se rotan las especies de cultivo como si no. Asimismo, los componentes para el control de gramineas y dicotiledoneas de este sistema son independientes el uno del otro, lo que permite a un experto en tecnicas de control de malas hierbas decidir cual es la proporcion de herbicida AOPP y auxinico mas eficaz y rentable economicamente. Por ejemplo, si en el momento de la aplicacion del herbicida predominan las latifolias, se puede aplicar un tratamiento con 560 a 1120 g e.a./ha de 2,4-0, sin ningun herbicida mas. Asi se reducirian las aplicaciones innecesarias de herbicida, proporcionando flexibilidad para reducir los costes de produccion y la carga ambiental de pesticidas, al tiempo que se reduciria la presion selectiva innecesaria que puede acabar generando resistencia a los herbicidas entre las malas hierbas.

Otros beneficios pueden incluir la tolerancia a la deriva o la volatilizacion del 2,4-0, fenomenos responsables de daros en cultivos de dicotiledoneas cercanos; no es necesario respetar un periodo entre la aplicacion y la siembra (vease el ejemplo anterior); y se reducen los problemas de daros por contaminacion en cultivos de dicotiledoneas provocados por una limpieza poco esmerada de los tanques que han contenido 2,4-0. El dicamba y otros herbicidas se pueden seguir utilizando para el control de los ricios de dicotiledoneas transformadas con AAD-1 (v3).

Los expertos en la materia tambien reconoceran que el ejemplo anterior es aplicable a cualquier cultivo sensible al 2,4-0 (o a otro herbicida auxinico fenoxi) que quedaria protegido por el gen AAD-1 (v3) si queda transformado de forma estable. Un experto en las tecnicas de control de malas hierbas reconocera que la transformacion con AAD-1 (v3) posibilita el uso de varios herbicidas auxinicos fenoxi comerciales solos o en combinacion con cualquier herbicida AOPP comercial. Las dosis especificas de otros herbicidas representativos de estas familias quimicas se pueden calcular con las etiquetas de los herbicidas compiladas en el manual CPR (Crop Protection Reference) o una compilacion similar o con cualquier referencia de proteccion de cultivos comercial o academica como la Crop Protection Guide de Agriliance (2003). Todos los herbicidas alternativos que puedan ser utilizados en HTC gracias al AAD-1 (v3), ya sea en aplicaciones de un solo herbicida, en mezcla de tanque o secuenciales, se consideran dentro del alcance de la presente invencion.

Ejemplo 20 -Uso en cultivo de los herbicidas auxínicos fenoxi y AOPP en maíz, arroz y otras especies de monocotiledóneas transformadas únicamente con AAD-1 (v3)

0e un modo analogo, la transformacion de especies de gramineas (como, entre otras, maiz, arroz, trigo, cebada o cesped y gramineas forrajeras) con AAD-1 (v3) permitiria el uso de graminicidas AOPP muy eficaces en cultivos que normalmente son sensibles a estos herbicidas. La mayoria de gramineas presentan una tolerancia natural a los herbicidas auxinicos como los herbicidas auxinicos fenoxi (2,4-0, diclorprop y otros). No obstante, el nivel relativamente bajo de selectividad para el cultivo ha mermado la utilidad en dichos cultivos debido a la mayor brevedad del intervalo de aplicacion y a malas hierbas latifolias alternativas. Los cultivos de monocotiledoneas transformados con AAD-1 (v3) permitirian el uso de una combinacion de tratamientos similar a la descrita en los cultivos de dicotiledoneas, como es la aplicacion de 2,4-0 a dosis de 280 a 2240 g e.a./ha para controlar la mayoria de malas hierbas latifolias, aunque generalmente se utilizarian 560-1120 g e.a./ha. Por su parte, se pueden utilizar diversos graminicidas AOPP de amplio espectro (haloxifop, quizalofop, fenoxaprop, fluazifop, etc.) para controlar un gran numero de malas hierbas gramineas. Los graminicidas de ciclohexanodiona como setoxidim, cletodim, etc. no podrian ser utilizados en este sistema como en los cultivos de dicotiledoneas, ya que la AA0-1 no confiere proteccion contra esta familia quimica y los cultivos de gramineas son sensibles de forma natural a los derivados de la ciclohexanodiona. No obstante, este atributo posibilitaria el uso de tales herbicidas como medio para controlar los ricios de monocotiledoneas transformadas con el AAD-1 (v3). A partir de ahora, la AA0-1 hace posible la adopcion de estrategias de control de malas hierbas similares a las de los cultivos de dicotiledoneas. Una combinacion de quizalofop (20-100 g e.a./ha) y 2,4-0 (420-840 g e.a./ha) proporcionaria dos mecanismos de accion distintos en un cultivo de monocotiledoneas transformadas con AAD-1 (v3) (por ejemplo maiz y arroz) que controlaria la mayoria de malas hierbas agronomicas de un modo similar al glifosato en los cultivos tolerantes a este (veanse los espectros de control de malas hierbas consultando las caracteristicas tecnicas en la Crop Protection Guide de Agriliance).

Una ventaja de esta herramienta adicional es el coste sumamente bajo del herbicida de hoja ancha y el potencial control residual de breve vida que proporcionan las dosis mas altas de 2,4-0 y/o los herbicidas AOPP cuando se utilizan en dosis elevadas, a diferencia de un herbicida no residual como el glifosato, que no consigue controlar las malas hierbas que germinan tardiamente. Esta herramienta tambien facilita un mecanismo para rotar los modos de accion herbicidas con las ventajas de los HTC como una estrategia integrada para el manejo de la resistencia a herbicidas y los cambios en la flora arvense en una estrategia de rotacion de HTC con un cultivo tolerante a glifosato/AAD-1 (v3), tanto si se rotan las especies de cultivo como si no. Asimismo, los componentes para el control de gramineas y dicotiledoneas de este sistema son independientes el uno del otro, lo que permite a un experto en tecnicas de control de malas hierbas decidir cual es la proporcion de herbicida AOPP y auxinico mas eficaz y rentable economicamente. Por ejemplo, si en el momento de la aplicacion del herbicida predominan las latifolias, se puede aplicar un tratamiento con 560 a 1120 g e.a./ha de 2,4-0, sin ningun herbicida mas. Asi se reducirian las aplicaciones innecesarias de herbicida, proporcionando flexibilidad para reducir los costes de produccion y la carga ambiental de pesticidas, al tiempo que se reduciria la presion selectiva innecesaria que puede acabar generando resistencia a los herbicidas entre las malas hierbas. La mayor tolerancia del maiz y de otras monocotiledoneas a los herbicidas auxinicos fenoxi fomentara el uso de tales herbicidas en cultivo sin las restricciones impuestas por el estadio de crecimiento o el riesgo de encamado, fenomenos como la inhibicion del desenrollamiento de las hojas, encamado, fragilidad de la raspa provocada por reguladores del crecimiento en el maiz, o la deformacion de las raices fulcreas.

Los expertos en la materia tambien reconoceran que el ejemplo anterior puede ser aplicable a cualquier cultivo de monocotiledonea que quedara protegido por el gen AAD-1 (v3) de los daros causados por cualquier herbicida AOPP. Un experto en las tecnicas de control de malas hierbas reconocera que la transformacion con AAD-1 (v3) posibilita el uso de varios herbicidas auxinicos fenoxi comerciales, solos o en combinacion con cualquier herbicida AOPP comercial. Las dosis especificas de otros herbicidas representativos de estas familias quimicas se pueden calcular con las etiquetas de los herbicidas compiladas en el manual CPR (Crop Protection Reference) o una compilacion similar o con cualquier referencia de proteccion de cultivos comercial o academica como la Crop Protection Guide de Agriliance (2003). Todos los herbicidas alternativos que puedan ser utilizados en HTC gracias al AAD-1 (v3), ya sea en aplicaciones de un solo herbicida, en mezcla de tanque o secuenciales, se consideran comprendidos en el alcance de la presente invencion.

Ejemplo 21 - AAD-1 (v3) apilado con un carácter de tolerancia al glifosato en cualquier cultivo

La gran mayoria de hectareas de algodon, canola y soja sembradas en Norteamerica contienen un caracter de tolerancia al glifosato (GT), y la adopcion del maiz GT crece dia a dia. Otros cultivos GT (por ejemplo trigo, arroz, remolacha azucarera y cesped) se encuentran en fase de desarrollo pero no han sido comercializados hasta la fecha. Muchas otras especies resistentes al glifosato se encuentran en fase experimental o de desarrollo (por ejemplo alfalfa, cara de azucar, girasol, remolacha, guisantes, zanahoria, pepino, lechuga, cebolla, fresa, tomate y tabaco; especies forestales como el chopo y el arbol de ambar; y especies de horticultura ornamental como tagetes, petunias y begonias; isb.vt.edu/cfdocs/fieldtests1.cfm, 2005 en el web). Los cultivos GTC son herramientas valiosas por la amplisima variedad de malas hierbas que permiten controlar y por la comodidad y rentabilidad economica que ofrecen. No obstante, el actual uso del glifosato como un tratamiento basico ordinario esta seleccionando malas hierbas resistentes a el. Es mas, las malezas en que el glifosato resulta de forma natural menos eficaz estan desplazando a las especies predominantes en los campos donde solo se aplican programas herbicidas a base de glifosato. El apilamiento del AAD-1 (v3) con un caracter GT, ya sea mediante cruzamiento convencional o conjuntamente con un evento de transformacion novedoso, mejoraria el control de las malas hierbas, la sensibilidad y la capacidad para manejar los cambios de la flora arvense y la aparicion de resistencia a herbicidas. Tal y como se ha seralado en ejemplos precedentes, la transformacion de los cultivos con AAD-1 (v3) posibilita la aplicacion selectiva de herbicidas AOPP en los cultivos de monocotiledoneas, ofrece un mayor margen de seguridad a los cultivos de monocotiledoneas frente a los herbicidas auxinicos fenoxi y, por ultimo, permite la aplicacion selectiva de los herbicidas auxinicos fenoxi en los cultivos de dicotiledoneas. Se pueden imaginar diversas opciones para mejorar el control de las malas hierbas mediante el apilamiento del AAD-1 (v3) y de un caracter GTC en una especie cultivada de monocotiledonea o dicotiledonea:

a) El glifosato se puede aplicar en postemergencia a una dosis ordinaria (420 a 2160 g e.a./ha, preferiblemente 560 a 840 g e.a./ha) para el control de la mayoria de malas hierbas gramineas y latifolias. Para el control de las malas hierbas resistentes al glifosato como Conyza canadensis o de malas hierbas que resultan de por si dificiles de controlar con el (por ejemplo, Commelina spp), se puede aplicar 2,4-0 a 280-2240 g e.a./ha (preferiblemente 560-1120 g e.a./ha) de manera secuencial, en mezcla en tanque, o en premezcla con glifosato para lograr un control eficaz.

b) El glifosato se puede aplicar en postemergencia a una dosis ordinaria (420 a 2160 g e.a./ha, preferiblemente 560 a 840 g e.a./ha) para el control de la mayoria de malas hierbas gramineas y latifolias. Para el control de las malas hierbas resistentes al glifosato como Lolium rigidum o Eleusine indica, se puede aplicar quizalofop a 10-200 g e.a./ha (preferiblemente 20-100 g e.a./ha) de manera secuencial, en mezcla en tanque o en premezcla con glifosato para lograr un control eficaz.

c) Actualmente, las dosis de glifosato usadas en los GTC oscilan en general entre 560 a 2240 g e.a./ha por aplicacion. El glifosato es mucho mas eficaz contra las especies de gramineas que contra las latifolias. El apilamiento de los caracteres AAD-1 (v3) + GT permitiria la administracion del glifosato en dosis graminicidas eficaces (105-840 g e.a./ha, y preferiblemente 210-420 g e.a./ha). El 2,4-0 (a 280-2240 g e.a./ha, y preferiblemente 560-1120 g e.a./ha) se podria aplicar entonces de manera secuencial, mezclado en tanque o como premezcla con dosis de glifosato eficaces contra las gramineas para conseguir el necesario control de las malas hierbas latifolias. Un herbicida AOPP como el quizalofop a 10-200 g e.a./ha (preferiblemente a 20100 g e.a./ha y mas preferiblemente a 20-35 g e.a./ha), podria conseguir un control mas solido de las gramineas y/o retrasar el desarrollo de gramineas resistentes al glifosato. La baja dosis de glifosato tambien seria beneficiosa para el control de las malas hierbas latifolias, aunque el control primario radicaria en el 2,4

0.

Un experto en tecnicas de control de malas hierbas reconocera que la transformacion de cultivos con AAD-1 (v3) permitira el uso de uno o varios herbicidas auxinicos fenoxi comerciales, solos o en combinacion con uno o varios herbicidas AOPP comerciales (secuencial o independientemente). Las dosis especificas de otros herbicidas representativos de estas familias quimicas se pueden calcular con las etiquetas de los herbicidas compiladas en el manual CPR (Crop Protection Reference) o una compilacion similar o con cualquier referencia de proteccion de cultivos comercial o academica como la Crop Protection Guide de Agriliance (2003). Todos los herbicidas alternativos que puedan ser utilizados en HTC gracias al AAD-1 (v3), ya sea en aplicaciones de un solo herbicida, en mezcla de tanque o secuenciales, estan comprendidos en el alcance de la presente invencion

Ejemplo 22 - AAD-1 (v3) apilado con un carácter de tolerancia al glufosinato en cualquier cultivo

La tolerancia al glufosinato (PAT o bar) ya esta presente en varias especies cultivadas en Norteamerica en forma de marcador seleccionable de un caracter agronomico como proteinas de resistencia a insectos o especificamente como un caracter de HTC. Entre tales cultivos se encuentran, entre otros, la canola, el maiz y el algodon tolerantes al glufosinato. Otros cultivos tolerantes al glufosinato (por ejemplo arroz, remolacha azucarera, soja y cesped) se encuentran en fase de desarrollo pero no han sido comercializados hasta la fecha. El glufosinato, al igual que el glifosato, es un herbicida de amplio espectro para gramineas y hoja ancha, dotado de una relativa selectividad. El mecanismo de accion del glufosinato difiere del del glifosato. Actua con rapidez, pues provoca la desecacion y la necrosis en las hojas tratadas entre 24 y 48 horas despues de la aplicacion, lo que supone una ventaja para lograr un rapido control de las malas hierbas. Sin embargo, ello tambien limita la translocacion del glufosinato a los tejidos meristematicos de la planta, lo que se traduce en un control menos eficiente, tal y como evidencia el rendimiento relativo de ambos compuestos en muchas especies (Agriliance, 2003).

El apilamiento del AAD-1 (v3) con un caracter de tolerancia al glufosinato, ya sea mediante cruzamiento convencional o conjuntamente con un evento de transformacion novedoso, mejoraria la eficacia y la flexibilidad en el control de las malas hierbas, la sensibilidad y la capacidad para manejar los cambios de la flora arvense y la aparicion de resistencia a herbicidas. Tal y como se ha seralado en ejemplos precedentes, la transformacion de los cultivos con AAD-1 (v3) posibilita la aplicacion selectiva de herbicidas AOPP en los cultivos de monocotiledoneas, ofrece un mayor margen de seguridad a los cultivos de monocotiledoneas frente a los herbicidas auxinicos fenoxi y, por ultimo, permite la aplicacion selectiva de los herbicidas auxinicos fenoxi en los cultivos de dicotiledoneas. Se pueden imaginar diversas opciones para mejorar el control de las malas hierbas mediante el apilamiento del AAD-1 (v3) y de un caracter de tolerancia al glufosinato en una especie cultivada de monocotiledonea o dicotiledonea:

a) El glufosinato se puede aplicar en postemergencia a una dosis ordinaria (200 a 1700 g e.a./ha, preferiblemente 350 a 500 g e.a./ha) para el control de la mayoria de malas hierbas gramineas y latifolias. Hasta la fecha no se ha confirmado la existencia de malas hierbas resistentes al glufosinato, pero son mas las especies de malezas que de forma natural son tolerantes a el que en el caso del glifosato.

i) Las malas hierbas gramineas que son tolerantes naturales (por ejemplo Echinochloa spp. o Sorghum spp.) se pueden controlar con su mezcla en tanque con quizalofop a 10-200 g e.a./ha (preferiblemente 20100 g e.a./ha).

ii) Las malas hierbas latifolia que son tolerantes naturales (por ejemplo, Cirsium arvensis y Apocynum cannabinum) se pueden controlar con la mezcla en tanque de 2,4-0 a 280-2240 g e.a./ha, y preferiblemente a 560-2240 g e.a./ha, para el control eficaz de estas especies perennes de dificil control y reforzar el control de las latifolias anuales.

b) Una triple combinacion de glufosinato (200-500 g e.a./ha) + 2,4-0 (280-1120 g e.a./ha) + quizalofop (10-100 g e.a./ha), por ejemplo, proporcionaria un espectro de control solapado mas solido. Ademas, el solapamiento del espectro proporciona un mecanismo adicional para el manejo o el retraso en la aparicion de malas hierbas resistentes a herbicidas.

Un experto en las tecnicas de control de malas hierbas reconocera que la transformacion con AAD-1 (v3) posibilita el uso de varios herbicidas auxinicos fenoxi comerciales, solos o en combinacion con cualquier herbicida AOPP comercial. Las dosis especificas de otros herbicidas representativos de estas familias quimicas se pueden calcular con las etiquetas de los herbicidas compiladas en el manual CPR (Crop Protection Reference) o una compilacion o manual similar, con las etiquetas compiladas en linea (por ejemplo cdms.net/manuf/manuf.asp) o con cualquier referencia de proteccion de cultivos comercial o academica como la Crop Protection Guide de Agriliance (2003). Todos los herbicidas alternativos que puedan ser utilizados en HTC gracias al AAD-1 (v3), ya sea en aplicaciones de un solo herbicida, en mezcla de tanque o secuenciales, estan comprendidos en el alcance de la presente invencion.

Ejemplo 23 - AAD-1 (v3) apilado con un carácter AHAS en cualquier cultivo

La tolerancia a los herbicidas de imidazolinona (AHAS y otros) ya esta presente en varias especies cultivadas en Norteamerica como, por ejemplo, maiz, arroz y trigo. Otros cultivos tolerantes a las imidazolinonas (por ejemplo algodon y remolacha azucarera) se encuentran en fase de desarrollo pero no han sido comercializados hasta la fecha. Muchos herbicidas de imidazolinona (por ejemplo imazamox, imazetapir, imazaquin e imazapic) se utilizan de forma selectiva en varios cultivos convencionales. La incorporacion de caracteres de tolerancia a las imidazolinonas como AHAS y similares ha posibilitado el uso de imazetapir, imazamox y del no selectivo imazapir. Los HTC tolerantes a las imidazolinonas disponibles hasta la fecha tienen la ventaja de no ser transgenicos. Esta familia quimica tambien ejerce una sustancial actividad residual en el suelo, lo que permite prolongar el control de las malas hierbas mas alla del momento de la aplicacion, a diferencia de los sistemas basados en el glifosato o el glufosinato. No obstante, el espectro de malas hierbas controlado por los herbicidas de imidazolinona no es tan extenso como el del glifosato (Agriliance, 2003). Asimismo, las imidazolinonas poseen un mecanismo de accion (inhibicion de la acetolactato sintasa, ALS) contra el cual muchas especies arvenses han generado resistencia (Heap, 2004). El apilamiento del AAD-1 (v3) con un caracter de tolerancia a las imidazolinonas, ya sea mediante cruzamiento convencional o conjuntamente con un evento de transformacion novedoso, mejoraria la eficacia y la flexibilidad del control de las malas hierbas, la capacidad para manejar los cambios de la flora arvense y la aparicion de resistencia a herbicidas. Tal y como se ha seralado en ejemplos precedentes, la transformacion de los cultivos con AAD-1 (v3) posibilita la aplicacion selectiva de herbicidas AOPP en los cultivos de monocotiledoneas, ofrece un mayor margen de seguridad a los cultivos de monocotiledoneas frente a los herbicidas auxinicos fenoxi y, por ultimo, permite la aplicacion selectiva de los herbicidas auxinicos fenoxi en los cultivos de dicotiledoneas. Se pueden imaginar diversas opciones para mejorar el control de las malas hierbas mediante el apilamiento del AAD-1 (v3) y de un caracter de tolerancia a las imidazolinonas en una especie cultivada de monocotiledonea o dicotiledonea:

a) Imazetapir puede aplicarse en postemergencia a una dosis estandar (35 a 280 g e.a./ha, preferiblemente 70140 g e.a./ha) para el control de numerosas malas hierbas gramineas y latifolias.

i) Las malas hierbas latifolias resistentes a los inhibidores de ALS como Amaranthus rudis, Ambrosia trifida, Chenopodium album (entre otras, Heap, 2004) pueden ser controladas mediante la mezcla en tanque de 2,4-0 a 280-2240 g e.a./ha, y preferiblemente a 560-1120 g e.a./ha.

ii) Las malas hierbas latifolias que toleran de forma natural las imidazolinonas, como Ipomoea spp., tambien pueden ser controladas mediante la mezcla en tanque de 2,4-0 a 280-2240 g e.a./ha, y preferiblemente a 560-1120 g e.a./ha.

iii) Las malas hierbas gramineas que son resistentes a los inhibidores de ALS como Sorghum halepense y Lolium spp., pueden ser controladas mediante la mezcla en tanque de quizalofop a 10-200 g e.a./ha (preferiblemente a 20-100 g e.a./ha).

iv) Las malas hierbas gramineas que son tolerantes naturales (por ejemplo Agropiron repens) tambien pueden ser controladas mediante la mezcla en tanque de quizalofop a 10-200 g e.a./ha (preferiblemente a 20-100 g e.a./ha).

b) Una triple combinacion de imazetapir (35 a 280 g e.a./ha, preferiblemente 70-140 g e.a./ha) + 2,4-0 (2801120 g e.a./ha) + quizalofop (10-100 g e.a./ha), por ejemplo, puede proporcionar un espectro de control solapado mas solido. Ademas, el solapamiento del espectro proporciona un mecanismo adicional para el manejo o el retraso en la aparicion de malas hierbas resistentes a herbicidas.

Un experto en las tecnicas de control de malas hierbas reconocera que la transformacion con AAD-1 (v3) y su apilamiento con cualquier caracter de tolerancia a imidazolinona mediante cruzamiento convencional o ingenieria genetica permiten el uso de varios herbicidas de imidazolinona, herbicidas auxinicos fenoxi o herbicidas AOPP comerciales, solos o en multiples combinaciones. Las dosis especificas de otros herbicidas representativos de estas familias quimicas se pueden calcular con las etiquetas de los herbicidas compiladas en el manual CPR (Crop Protection Reference) o una compilacion o manual similar, con las etiquetas compiladas en linea (por ejemplo cdms.net/manuf/manuf.asp) o con cualquier referencia de proteccion de cultivos comercial o academica como la Crop Protection Guide de Agriliance (2003). Todos los herbicidas alternativos que puedan ser utilizados en HTC gracias al AAD-1 (v3), ya sea en aplicaciones de un solo herbicida, en mezcla de tanque o secuenciales, estan comprendidos en el alcance de la presente invencion

Ejemplo 24 - AAD-1 (v3) en arroz

24.1 - 0escripcion de los medios

Los medios de cultivo empleados se ajustaron a un pH 5,8 con KOH 1 M y se solidificaron con Phytagel 2,5 g/l (Sigma). Los callos embriogenicos se cultivaron en placas de Petri de 100 x 20 mm que contenian 40 ml de medio semisolido. Las plantulas de arroz se cultivaron en 50 ml de medio en cajas Magenta. Las suspensiones celulares se mantuvieron en matraces de Erlenmeyer de 125 ml, con 35 ml de medio liquido agitado a 125 rpm. La induccion y el mantenimiento de los cultivos embriogenicos tuvo lugar a oscuras y a 25-26'C, y la regeneracion de las plantas y el cultivo de las plantas enteras se realizo con un fotoperiodo de 16 h (Zhang et al. 1996).

La induccion y el mantenimiento del callo embriogenico se efectuaron en medio basal N8 del modo descrito con anterioridad (Li et al. 1993), pero modificado para contener glutamina 500 mg/l. Los cultivos en suspension se iniciaron y mantuvieron en medio liquido SZ (Zhang et al. 1998) con la adicion de sacarosa 30 g/l en lugar de maltosa. El medio osmotico (N8O) consistio en medio N8 al que se aradio manitol y sorbitol, ambos en una concentracion de 0,256 M. Los callos resistentes a higromicina 8 se seleccionaron con medio N8 complementado con higromicina 8 50 mg/l durante 3-4 semanas. La prerregeneracion se efectuo en un medio (PRH50) elaborado con medio N8 sin acido 2,4-diclorofenoxiacetico (2,4-0), pero con 6-bencilaminopurina (8AP) 2 mg/l, acido anaftalenacetico (NAA) 1 mg/l, acido abscisico (A8A) 5 mg/l e higromicina 8 50 mg/l durante 1 semana. La regeneracion de las plantulas se llevo a cabo en medio de regeneracion (RNH50), consistente en medio N8 sin 2,40, complementado con 8AP 3 mg/l, NAA 0,5 mg/l e higromicina 8 50 mg/l hasta que se regeneran los brotes. Estos se transfirieron a medio de enraizamiento con sales basales de Murashige y Skoog y vitaminas 85 de Gamborg diluidas a la mitad, complementado con sacarosa 50 mg/l e higromicina 8 (1/2MSH50).

24.2 - 0esarrollo del cultivo de tejido.

Semillas maduras desecadas de Oryza sativa L. japonica cv. Taipei 309 se esterilizaron del modo descrito por Zhang et al. 1996. Los tejidos embriogenicos se indujeron cultivando semillas de arroz maduras y esteriles en medio N8 a oscuras. El callo primario de aproximadamente 1 mm de diametro se extrajo del escutelo y con el se inicio la suspension celular en medio liquido SZ. A continuacion, las suspensiones se mantuvieron del modo descrito por Zhang 1995. Los tejidos embriogenicos contenidos en la suspension se extrajeron del cultivo liquido 3-5 dias despues del subcultivo anterior y se colocaron en medios osmotico N8O hasta formar un circulo de unos 2,5 cm de diametro en una placa de Petri, cultivandose durante 4 h antes del bombardeo. Entre 16 y 20 h despues del bombardeo, los tejidos se transfirieron del medio N8O a medio de seleccion N8H50 con higromicina 8, asegurandose de que la superficie bombardeada quedara cara arriba, y se incubaron a oscuras durante 14-17 dias. Los callos recien formados se separaron de los explantes originales bombardeados y se colocaron cerca sobre el mismo medio. Al cabo de otros 8-12 dias, se seleccionaron visualmente los callos opacos y relativamente compactos y se trasladaron a medio de prerregeneracion PRH50 durante 7 dias a oscuras. El callo en crecimiento, ahora mas compacto y opaco, paso a cultivarse en el medio de regeneracion RNH50 durante 14-21 dias con un fotoperiodo de 16 h. Los brotes regenerados se transfirieron a cajas Magenta que contenian medio � MSH50. Las plantas regeneradas de un mismo explante se consideran hermanas y son tratadas como una linea vegetal independiente. Las plantas se consideraron portadoras del gen hph si producian raices gruesas y blancas y crecian con vigor en medio � MSH50. Una vez las plantulas alcanzaron la parte superior de las cajas Magenta, se trasplantaron a suelo en una maceta de 6 cm con humedad del 100% durante una semana, y despues se trasladaron a una camara de crecimiento con un periodo de luz de 14 h a 30'C y en oscuridad a 21'C durante 2-3 semanas antes de trasplantarlas en macetas de 13 cm en el invernadero. Las semillas se recogieron y se secaron a 37'C d urante una semana antes de conservarlas a 4'C.

24.3 - 8ombardeo con microproyectiles

Los bombardeos se llevaron a cabo con el sistema 8iolistic P0S-1000/He� (8io-Rad, Laboratories, Inc.). Tres miligramos de particulas de oro de 1,0 micrometro de diametro se lavaron una vez con etanol al 100%, dos veces con agua destilada esteril y se resuspendieron en 50 !l de agua en un tubo Eppendorf siliconado. A la suspension de oro se le aradieron cinco microgramos de A0N plasmidico que representaba un cociente molar 1:6 de p0O(3303 (vector portador de Hpt) a p0A83403, 20 !l de espermidina (0,1 M) y 50 !l de cloruro calcico (2,5 M). La mezcla se incubo a temperatura ambiente durante 10 min, se sedimento a 10.000 rpm durante 10 s, despues se resuspendio en 60 !l de etanol 100% frio y a continuacion se introdujeron 8-9 !l de la misma en cada pelicula circular de plastico (macrocarrier). Las muestras de tejidos se bombardearon a 1100 psi y un vacio de 27 pulgadas de Hg, como describen Zhang et al. (1996).

24.4 - Analisis de la tolerancia

Plantulas de arroz en estadio de 3-5 hojas se pulverizaron con una solucion al 0,3% (v/v) de 0uPont� Assurel II que contenia aceite vegetal concentrado Agridex al 1% (v/v) con un pulverizador de perilla 0eVilbiss (atomizador de vidrio modelo 15-R0). Esta concentracion corresponde aproximadamente a 140 g e.a./ha. Las plantas se pulverizaron bajo una campana extractora de vapores a una distancia de 8-12 pulgadas con 6 chorros dirigidos de tal modo que la planta entera quedo cubierta con una fraccion igual de herbicida. Cada chorro suministra aproximadamente 100 !l de solucion a la plantula. Una vez tratadas, las plantulas se dejaron secar durante una hora antes de sacarlas de la campana extractora. La evaluacion de la sensibilidad o la resistencia se efectuo 10-14 dias despues del tratamiento (0AT) y los resultados se muestran en la Tabla 35.

Tabla 35.

Nombre de la muestra

140 g ae/ha quizalofop

Control

Muerto

63-1A

Sin daros

63-1F

Sin daros

63-48

Sin daros

63-40

Sin daros

63-6C

Muerto

24.5 - Recoleccion del tejido, aislamiento y cuantificacion del A0N

Se deposito tejido fresco en tubos y se liofilizo a 4'C durante 2 dias. Una vez completamente seco, se coloco una perla de tungsteno (Valenite) en el tubo y las muestras de tejido fueron sometidas durante 1 minuto a molturacion en seco con un molino de perlas Kelco. A continuacion, se procedio a aislar el A0N con un procedimiento 0Neasy ordinario (Qiagen, 0Neasy 69109). 0espues, una alicuota del A0N extraido se tiro con Pico Green (Molecular Probes P7589) y se visualizo en el fluorimetro (8ioTek) con patrones conocidos para obtener la concentracion en ng/!l.

24.6 - Analisis con transferencia Southern

El analisis con transferencia Southern se efectuo con el A0N total obtenido con el kit 0Neasy de Qiagen. Un total de 2 !g de A0N se sometieron a una digestion hasta el dia siguiente con HindIII para el p0A83403 a fin de obtener los datos de integracion. 0e manera similar, un total de 2 !g de A0N fueron sometidos a una digestion hasta el dia siguiente con MfeI para obtener los datos de la PTU. Acabada la digestion, se proceso una alicuota de -100 ng en un gel al 1% para comprobar que la digestion era completa. 0espues de esta comprobacion las muestras se procesaron en un gel grande de agarosa al 0,85% hasta el dia siguiente a 40 voltios. Acto seguido, el gel se desnaturalizo con NaOH 0,2 M, NaCl 0,6 M durante 30 minutos. El gel se neutralizo seguidamente con Tris HCl 0,5 M, NaCl 1,5 M y pH 7,5 durante 30 minutos. Acto seguido, se preparo un aparato de gel con SSC 20x para transferir por gravedad el gel a una membrana de nilon (Millipore INYC00010), dejandolo hasta el dia siguiente. Acabada la transferencia, la membrana se expuso a luz UV en presencia de un entrelazador (stratagene UV stratalinker 1800) a 1200x100 microjulios. 0espues la membrana se lavo con S0S 0,1%, SSC 0,1 durante 45 minutos. Finalizado el lavado de 45 minutos, la membrana fue horneada durante 3 horas a 80'C y se conservo a 4'C hasta la hib ridacion. El molde de hibridacion se preparo con la PCR de la region codificante mediante el plasmido p0A83404. Como molde se emplearon en total 100 ng de A0N total. Se usaron 20 mM de cada cebador con el kit Takara Ex Taq PCR Polymerase (Mirus TAKRR001A). Los cebadores utilizados para el fragmento Southern fragment PCR AA0-1 fueron (0irecto-ATGGCTCATGCTGCCCTCAGCC) (SEC I0 n° 31) y (Inverso-GGGCAGGCCTAACTCCACCAA) (SEC I0 n° 32). La reaccion de PCR se llevo a cabo con un termociclador 9700 Geneamp (Applied 8iosystems), sometiendo las muestras 94'C durante 3 minutos y 35 ciclos de 94'C durante 30 segundos, 65'C durante 30 segundos, y 7 2'C durante 1 minuto y 45 segundos seguidos por 72'C du rante 10 minutos.

El producto se inyecto en un gel de agarosa al 1%, se recorto y despues se extrajo el gel con el procedimiento de extraccion de Qiagen (28706). La membrana se sometio entonces a una etapa de prehibridacion a 60'C dur ante 1 hora en tampon Perfect Hyb (Sigma H7033). Con el procedimiento Prime it RmT dCTP-labeling rxn (Stratagene 300392) se procedio al revelado con una sonda de 32P (Perkin Elmer). La sonda sobrante se lavo con columnas ProbeQuant G50 (Amersham 27-5335-01). Se usaron 2 millones de CPM por ml de tampon Perfect Hyb para hibridar las membranas de transferencia hasta el dia siguiente. Finalizada la hibridacion las membranas se sometieron a dos lavados de 20 minutos a 65'C con S0 S 0,1%, SSC 0,1. Finalmente, las membranas se expusieron a una pantalla de imagen de fosforo durante toda la noche y se procesaron en un escaner Storm (Molecular 0evices). Los resultados se resumen en la Tabla 36.

Tabla 36. Resultados de la transferencia Southern.

Evento

Datos de integración del Southern Datos de PTU del Southern

Número of bandas

Tamaño esperado 3049bp

63-1 A

8 si, 7 bandas distintas

63-1 F

5 . si, 9 bandas distintas

63-4 A

20 si, 20 bandas distintas

63-4 0

20 si, 19 bandas distintas

63-6 C

2 A0N insuficiente para ambos cortes

10 Las plantas 63-1 A y 63-1 F no pertenecen al mismo evento; las plantas 63-4 A y 63-4 0 son del mismo evento. Estos eventos tienen PTU del tamaro esperado, pero son muy complejos. Estos datos de PTU obtenidos en la transferencia Southern concuerdan con los datos de expresion y los datos de la pulverizacion. La muestra 63-6 C no contaba con suficiente A0N para realizar las transferencias Southern de integracion y de PTU.

15 24.7 - 0atos de la transferencia (estern

La preparacion de la muestra y las condiciones de analisis corresponden a las descritas previamente. Cinco lineas de arroz transgenico y una linea de control no transgenica fueron analizadas para detectar la expresion de la AA0-1 con ELISA y transferencia (estern. La AA0-1 se detecto en cuatro lineas (63-1A, 63-1F, 63-48 y 63-40) pero no asi

20 en la linea 63-1C en la planta control. Los niveles de expresion oscilaron entre 15,6 y 183 ppm de proteina soluble total. Se presenta un resumen de los resultados en la Tabla 37.

Tabla 37.

Línea

Nombre de la muestra TSP (µg/mL) [AAD1] (ng/mL) ELISA Expressión (ppm) Western

1 2 3 4 5 6 7 8

Control 6719,58 63-1A 8311,87 63-1F 11453,31 63-48 13835,09 36-40 13656,49 63-6C 5343,63 Patron de AA01 (0,5 �g/ml) Patron de AA01 (5,0 �g/ml) 0,00 351,17 2092,35 216,00 717,05 0,00 0,00 42,25 182,69 15,61 52,51 0.00 -± ++ + ++ -+++ +++++

Ejemplo 25 - Procedimientos de transformación de césped

25 La transformacion genetica con Agrobacterium tumefaciens de la agrostide estolonifera, consistente en sustituir el gen "bar" por el AAD-1 (v3), puede conseguirse mediante un callo embriogenico obtenido a partir de semillas (cv. Penn-A-4), tal y como se describe de forma general a continuacion. Vease "Efficiency of Agrobacterium tumefaciensmediated turfgrass (Agrostis stolonifera L) transformation" (Luo et. al., 2004).

30 El callo se infecta con una cepa de A. tumefaciens (L8A4404) portadora de un vector superbinario que contiene un gen bar resistente a herbicida controlado por un promotor de ubiquitina de arroz. La eficiencia total de la transformacion estable oscila entre el 18% y el 45%. Los analisis con transferencia Southern y geneticos confirmaron la integracion del transgen en el genoma de la agrostide estolonifera asi como su transmision normal y su expresion

35 estable en la generacion T1. Todos los eventos de transformaciones independientes contenian entre una y tres copias del transgen, y la mayoria (60-65%) portaban una sola copia del gen foraneo sin reordenamientos aparentes.

25.1 - Preparacion de las semillas para la induccion del callo embriogenico

40 Semillas maduras se descascarillaron con papel de lija y se esterilizaron superficialmente con lejia Clorox al 10% (v/v) (hipoclorito sodico al 6%) mas Tween 20 0,2% (v/v) (Polisorbato 20) con agitacion vigorosa durante 90 min. 0espues de cinco lavados con agua destilada esteril, las semillas se introdujeron en medio inductor de callos (sales basales y vitaminas MS, sacarosa 30 g/l, hidrolizado de caseina 500 mg/l, acido 3,6-dicloro-o-anisico (dicamba) 6,6 mg/l, 6-bencilaminopurina (8AP) 0,5 mg/l y Phytagel 2 g/l. El pH del medio se ajusto a 5,7 antes de autoclavar a

45 120'C durante 20 min).

25.2 - Induccion del callo embriogenico

Las placas de cultivo con los explantes de semillas preparados se mantuvieron a oscuras y temperatura ambiente durante 6 semanas. Los callos embriogenicos se seleccionaron visualmente y se cultivaron en medio inductor de callo fresco a oscuras y temperatura ambiente durante 1 semana antes del cocultivo.

25.3 -Infeccion y cocultivo con Agrobacterium

Un dia antes de la infeccion con Agrobacterium, el callo embriogenico se dividio en trozos de 1 a 2 mm y se coloco en medio inductor de callo que contenia acetosiringona 100 !M. A continuacion, a cada trozo de callo se le aplico una alicuota de 10 �l de suspension de Agrobacterium (L8A4404) (0.O.= 1,0 a 660 nm), seguida de 3 dias de cocultivo a oscuras y 25'C.

25.4 - Etapa de reposo y control de Agrobacterium

Para la fase de tratamiento con antibiotico, el callo se transfirio y se cultivo durante 2 semanas en un medio inductor de callo con cefotaxima 125 mg/l y carbenicilina 250 mg/l para suprimir el crecimiento bacteriano.

25.5 - Seleccion e identificacion de las colonias potencialmente transgenicas

0espues, para la seleccion, el callo se introdujo en medio inductor de callo dotado de cefotaxima 250 mg/l y fosfinotricina (PPT) 10 mg/l durante 8 semanas. Tanto el tratamiento antibiotico como el proceso de seleccion entero se realizaron a temperatura ambiente y a oscuras. El intervalo de subcultivo durante la seleccion fue normalmente de 3 semanas.

25.6 - Regeneracion de plantas transgenicas

Para la regeneracion de la planta, los eventos de callos que proliferan en presencia de PPT (resistentes) se colocan primero en medio de regeneracion (medio basal MS, sacarosa 30 g/l, mioinositol 100 mg/l, 8AP 1 mg/l y Phytagel 2 g/l) complementado con cefotaxima, PPT o higromicina. Estos callos se mantuvieron a oscuras y a temperatura ambiente durante 1 semana y despues se emplazaron bajo luz durante 2-3 semanas para el desarrollo de los brotes. No hubo plantas albinas a raiz de la seleccion con PPT (el uso de higromicina como agente de seleccion provoca la aparicion de muchas plantas albinas).

25.7 - Induccion de raices y traslado al invernadero

Los pequeros brotes se separaron y se transfirieron a medio de regeneracion sin hormonas que contenia PPT y cefotaxima para estimular el enraizamiento al tiempo que se mantenia la presion de seleccion y se erradicaba cualquier celula superviviente de Agrobacterium. Las plantulas con raices bien desarrolladas (3-5 semanas) se trasladaron a suelo y se cultivaron en invernadero o en el campo.

25.8 - Vernalizacion y polinizacion cruzada de las plantas transgenicas

Las plantas transgenicas permanecieron al aire libre en un vivero con medidas de contencion (3-6 meses) hasta el solsticio de invierno en diciembre. Las plantas vernalizadas se trasladaron entonces al invernadero y se mantuvieron a 25'C bajo un fotoperiodo de 16/8 h y rodeadas de plantas naturales no transgenicas que las aislaron fisicamente de otras fuentes de polen. Las plantas comenzaron a florecer 3-4 semanas despues de trasladarlas de nuevo al invernadero. Se fecundaron con el polen de las plantas naturales circundantes. Las semillas recogidas de cada planta transgenica se hicieron germinar en suelo a 25'C, y las plantas T1 se cultivaron en el invernad ero para ser analizadas posteriormente.

25.9 - Otras gramineas diana

Otras gramineas que pueden ser blanco de la transformacion con AA0-1 con arreglo a la presente invencion son: espiguilla (Poa annua), pasto bahia, grama de 8ermuda, cerillos, bromo, agrostide comun (Agrostis capillaries), caramazo, alpiste, zacate amargo, ciempies, caruela roja encespedante (Festuca rubra commutata), garranchuelo, agrostide estolonifera (Agrostis stolonifera), rabillo de zorra (Koeleria macrantha), gramalote, festucas, Festolium, caruela de oveja (Festuca ovina), navajita pelillo, avenilla, carota, amor de hortelano, mezclas (equinas, pastos, etc.), gramineas autoctonas, dactilo, ballico (Lolium perenne), agrostide blanca, cebadilla, ballico perenne y ballico de Italia, caruela roja semirreptante (Festuca rubra trichophylla), caruela (Poa pratensis), cintillo, caruela roja reptante (Festuca rubra rubra), pasto del Sudan, pasto varilla, caruela alta (Festuca arundinacea), fleo, aira de cesped (Deschampsia caespitosa), cespedes diversos, grama y hierba Manila.

Ejemplo 26 - AAD-1 (v3) en canola

26.1 - Transformacion de la canola

El gen AAD-1 (v3) que confiere resistencia frente al 2,4-0 se uso para transformar plantas de Brassica napus var. Nexera* 710 con Agrobacterium. El constructo portador del gen AAD-1 (v3) estaba controlado por un promotor del CsVMV y el gen Pat por el promotor AtUbi10.

La superficie de las semillas se esterilizo con lejia comercial al 10% y se lavaron tres veces con agua destilada esteril. A continuacion, se colocaron en medio basal MS diluido a la mitad (Murashige y Skoog, 1962) y se mantuvieron en un regimen de crecimiento a 25'C, co n un fotoperiodo de 16 h de luz/8 h de oscuridad.

0e las plantulas de 5-7 dias de edad se cortaron segmentos de hipocotilo (3-5 mm) y se colocaron en medio inductor de callo K101 (medio MS con cinetina 1 mg/l y 2,4-0 1 mg/l) durante 3 dias como pretratamiento. Los segmentos se transfirieron a continuacion a una placa de Petri, donde fueron tratados con las cepas de Agrobacterium Z7075 o L8A4404 portadoras del p0A8721. Agrobacterium se habia cultivado hasta el dia siguiente a 28'C en oscuridad con un agitador a 150 rpm y despues se resuspendio en el medio de cultivo.

Finalizados los 30 min de tratamiento de los segmentos de hipocotilo con Agrobacterium, se volvieron a depositar en medio inductor de callo durante 3 dias. 0espues del cocultivo, los segmentos se colocaron en K101TC (medio inductor de callo con carbenicilina 250 mg/l y Timentin 300 mg/l) durante una semana para la recuperacion. Otra alternativa consistio en colocar directamente los segmentos en medio de seleccion K101H1 (el medio anterior pero con Herbiace 1 mg/l). La carbenicilina y el Timentin fueron los antibioticos utilizados para matar a Agrobacterium. El agente de seleccion Herbiace permitio el crecimiento de las celulas transformadas.

Unas muestras de callo de 35 eventos independientes se analizaron con PCR. Las 35 muestras arrojaron un resultado positivo para la presencia de AAD-1 (v3), mientras que los controles no transformados dieron negativo (apartado del ensayo de PCR). En diez muestras de callo se confirmo la expresion de la proteina AA0-1 con un ELISA (apartado de analisis de la proteina).

Los segmentos de hipocotilo transformados en callo se depositaron a continuacion en medio de regeneracion de brotes 83Z1H1 (medio MS, bencilaminopurina 3 mg/l, zeatina 1 mg/l, MES 0,5 g/l [acido 2-(N-morfolino) etanosulfonico], nitrato de plata 5 mg/l, Herbiace 1 mg/l, carbenicilina y Timentin). Al cabo de 3 semanas, los brotes comenzaron a regenerarse. Los segmentos de hipocotilo junto con los brotes se transfirieron a medio 83Z1H3 (medio MS, bencilaminopurina 3 mg/l, zeatina 1 mg/l, MES 0,5 g/l [acido 2-(N-morfolino) etanosulfonico], nitrato de plata 5 mg/l, Herbiace 3 mg/l, carbenicilina y Timentin) durante 3 semanas mas.

Los brotes se separaron de los segmentos de hipocotilo y se transfirieron a medio de elongacion de brotes MESH10 (MS, MES 0,5 g/l, Herbiace 10 mg/l, carbenicilina, Timentin) durante 2-4 semanas. Para inducir el enraizamiento, los brotes alargados se cultivaron en MSI.1 (MS con acido indolbutirico 0,1 mg/l). Una vez las plantas mostraron un sistema radicular bien desarrollado, se plantaron en suelo. Las plantas se cultivaron en condiciones ambientales controladas en una camara Conviron durante 1-2 semanas antes del traslado al invernadero.

Las plantas T0 transformadas se autopolinizaron en el invernadero para obtener las semillas T1. Las plantas T0 y la progenie T1 fueron pulverizadas con un rango de concentraciones de herbicida para averiguar el nivel de proteccion conferida por el gen AAD-1 (v3).

26.2 - "Analisis molecular": Materiales de canola y metodos

26.2.1 - Recoleccion del tejido, aislamiento y cuantificacion del A0N.

Se coloco tejido fresco en tubos y se liofilizo a 4'C durante 2 dias. Una vez completamente seco, se introdujo una perla de tungsteno (Valenite) en el tubo y las muestras de tejido se sometieron durante 1 minuto a molturacion en seco en un molino de perlas Kelco. A continuacion se procedio a aislar el A0N con el procedimiento 0Neasy (Qiagen, 0Neasy 69109). Una alicuota del A0N extraido se tiro con Pico Green (Molecular Probes P7589) y se leyo en el fluorimetro (8ioTek) con patrones conocidos para obtener la concentracion en ng/�l.

26.2.2 - Reaccion en cadena de la polimerasa.

Un total de 100 ng de A0N total se usaron como molde. 20 mM de cada cebador se usaron con el kit Takara Ex Taq PCR Polymerase kit (Mirus TAKRR001A). Los cebadores utilizados para la PCR de la region codificante del AAD-1 (v3) fueron (0irecto-ATGGCTCATG CTGCCCTCAGCC) (SEC I0 n° 27) y (Inverso-CGGGCAGGCCTAACTCCACCAA) (SEC I0 n° 28). La reaccion de PCR se llevo a cabo con un termociclador 9700 Geneamp (Applied 8iosystems), sometiendo las muestras a 94'C durante 3 minutos y 35 ciclos de 94'C duran te 30 segundos, 65'C durante 30 segundos, y 72'C durante 2 minutos seguidos por 72'C durante 10 minutos. Los productos de PCR se analizaron con electroforesis en un gel de agarosa al 1% terido con Et8r. Treinta y cinco muestras de 35 plantas con eventos de AAD-1 (v3) dieron positivo. Tres muestras de control negativo dieron negativo.

26.3 - ELISA

5 El ELISA descrito en el apartado anterior detecto la proteina AA0-1 en 10 eventos distintos de transformacion de canola. Los niveles de expresion oscilaron entre 150 y mas de 1000 ppm de proteina soluble total (TSP). Tres muestras diferentes de callos sin transformar se analizaron en paralelo sin que se detectara una seral sustancial, lo cual indica que los anticuerpos utilizados en el ensayo presentaban una infima reactividad cruzada con la matriz

10 celular de canola. Un resumen de los resultados se presenta en la Tabla 38.

Tabla 38. Expresion de la AA0-1 en callos de canola.

n.º de muestra

Peso (mg) [TSP] (µg/mL) [AAD1] (ng/mL) Expressión (ppm TSP) PCR de AAD1

1

114 757,02 119,36 157,67 +

2

55 839,79 131,84 156,99

3

53 724,41 202,12 279,01

4

52 629,01 284,89 452,92 +

5

55 521,75 175,88 337,08 +

6

61 707,69 74,24 153,71 +

7

51 642,02 559,11 1026,73

8

65 707,69 270,73 382,56 +

9

51 642,02 197,90 308,25 +

10

51 1417,42 220,63 156,66 +

Control 1

53 2424,67 18,67 7,70 -

Control 2

61 2549,60 35,00 13,73 -

Control 3

59 2374,41 22,79 9,60 -

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Listado de secuencias

<110>Dow AgroSciences LLC

<120>NUEVOS GENES DE RESISTENCIA A HERBICIDAS

<130>502-14 T4

<140>05 771 746.4

<141>2005-05-02

<150>US 60/567,052

<151>2004-04-30

<160>32

<170>Patentln versión 3.2

<210>1

<211>50

<212>ADN

<213>Secuencia artificial

<220>

<223>Cebador directo utilizado para amplificar el gen rdpA/AAD-1 (vl)

<400>1

tctagaagga gatataccat gcatgctgca ctgtcccccc tctcccagcg <210> 2

<211> 38

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso utilizado para amplificar el gen rdpA/AAD-1 (vl)

<400> 2

ctcgagttac tagcgcgccg ggcgcacgcc accgaccg 38

<210> 3

<211> 915

<212> ADN

<213> Sphingobium herbicidovorans

<220>

<221> misc_feature D

<222> (1)..(18)

<223> Conector del cebador

<220>

<221> misc_feature

<222> (907)..(915)

<223> Conector del cebador

<400> 3

tctagaagga gatataccat gcatgctgca ctgtcccccc tctcccagcg ctttgagcgc 60 atcgcggtcc agccgctgac cggcgtcctg ggcgccgaga tcaccggcgt cgacctgcgc 120 gagccgctcg acgacagcac ctggaacgaa atcctcgacg cgttccacac ttaccaggtc 180 atctattttc ccggccaggc gatcaccaac gaacagcaca tcgccttcag ccggcgcttc 240 ggccccgtcg atcccgtgcc cctgctcaag agcatcgaag ggtatccaga ggtgcagatg 300 atccgccgcg aagccaacga aagcgggcgt gtgatcggtg aygactggca caccgacagc 360 accttcctgg acgcaccgcc ggccgccgtg gtgatgcgcg cgatcgacgt gcccgagcat 420 ggcggcgaca ccggttttct gagcatgtac accgcgtggg agacgctgtc gcccaccatg 480 caggccacca tcgaagggtt gaacgtagtg cacagcgcca cgcgtgtgtt cggctcgctc 540 taccaggccc agaaccggcg cttcagcaac accagcgtca aggtgatgga cgtcgacgcg 600 ggcgaccgtg aaaccgtgca ccccctggtg gtgacccatc cgggcagcgg ccgcaagggc 660 ctgtacgtga accaggtcta ttgccagcgc atcgagggca tgaccgatgc cgaaagcaaa 720 ccgctgctgc agttcctgta cgagcatgcg acacggttcg atttcacctg ccgcgtgcgc 780 tggaagaagg accaggtcct ggtctgggac aacctgtgca cgatgcaccg ggccgtaccc 840 gactacgcgg gcaagttccg ctacctgacg cgcaccacgg tcggtggcgt gcgcccggcg 900 cgctagtaac tcgag 915

<210> 4

<211> 897

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> AAD-1 (v2) secuencia primaria

<220>

<221> misc_feature

<222> (1) . . (2)

<223> conector del cebador

<220>

<221> misc_feature

<222> (891)..(897)

<223> conector del cebador

<400> 4

ccatggctgc tgcactgtcc cccctctccc agcgctttga gcgcatcgcg gtccagccgc 60 tgaccggcgt cctgggcgcc gagatcaccg gcgtcgacct gcgcgagccg ctcgacgaca 120 gcacctggaa cgaaatcctc gacgcgttcc acacttacca ggtcatctat tttcccggcc 180 aggcgatcac caacgaacag cacatcgcct tcagccggcg cttcggcccc gtcgatcccg 240 tgcccctgct caagagcatc gaagggtatc cagaggtgca gatgatccgc cgcgaagcca 300 acgaaagcgg gcgtgtgatc ggtgatgact ggcacaccga cagcaccttc ctggacgcac 360 cgccggccgc cgtggtgatg cgcgcgatcg acgtgcccga gcatggcggc gacaccggtt 420 ttctgagcat gtacaccgcg tgggagacgc tgtcgcccac catgcaggcc accatcgaag 480 ggttgaacgt agtgcacagc gccacgcgtg tgttcggctc gctctaccag gcccagaacc 540 ggcgcttcag caacaccagc gtcaaggtga tggacgtcga cgcgggcgac cgtgaaaccg 600 tgcaccccct ggtggtgacc catccgggca gcggctgcaa gggcctgtac gtgaaccagg 660 tctattgcca gcgcatcgag ggcatgaccg atgccgaaag caaaccgctg ctgcagttcc 720 tgtacgagca tgcgacacgg ttcgatttca cctgccgcgt gcgctggaag aaggaccagg 780 tcctggtctg ggacaacctg tgcacgatgc accgggccgt acccgactac gcgggcaagt 840 tccgctacct gacgcgcacc acggtcggtg gcgtgcgccc ggcgcgctag tgagctc 897

<210> 5

<211> 919

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> AAD-1 (v3) secuencia primaria

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(2)

<223> conector del cebador

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(8)

<223> codón de alanina adicional (GCT)

<220>

<221> misc_feature

<222> (894)..(919)

<223> conector del cebador

<400> 5

ccatggctca tgctgccctc agccctctct cccaacgctt tgagagaata gctgtccagc 60 cactcactgg tgtccttggt gctgagatca ctggagtgga cttgagggaa ccacttgatg 120 acagcacctg gaatgagata ttggatgcct tccacactta ccaagtcatc tactttcctg 180 gccaagcaat caccaatgag cagcacattg cattctcaag aaggtttgga ccagttgatc 240 cagtgcctct tctcaagagc attgaaggct atccagaggt tcagatgatc cgcagagaag 300 ccaatgagtc tggaagggtg attggtgatg actggcacac agactccact ttccttgatg 360 cacctccagc tgctgttgtg atgagggcca tagatgttcc tgagcatggc ggagacactg 420 ggttcctttc aatgtacaca gcttgggaga ccttgtctcc aaccatgcaa gccaccatcg 480 aagggctcaa cgttgtgcac tctgccacac gtgtgttcgg ttccctctac caagcacaga 540 accgtcgctt cagcaacacc tcagtcaagg tgatggatgt tgatgctggt gacagagaga 600 cagtccatcc cttggttgtg actcatcctg gctctggaag gaaaggcctt tatgtgaatc 660 aagtctactg tcagagaatt gagggcatga cagatgcaga atcaaagcca ttgcttcagt 720 tcctctatga gcatgccacc agatttgact tcacttgccg tgtgaggtgg aagaaagacc 780 aagtccttgt ctgggacaac ttgtgcacca tgcaccgtgc tgttcctgac tatgctggca 840 agttcagata cttgactcgc accacagttg gtggagttag gcctgcccgc tgagtagtta 900 gcttaatcac ctagagctc 919

<210> 6

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador 5' rdpA(ncoI)

<400> 6

cccatggctg ctgcactgtc ccccctctcc

30

<210> 7 <211> 33 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador 3'saci

<400> 7

gagctcacta gcgcgccggg cgcacgccac cga

33

<210> 8 <211> 36 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> 5' cebador BstEII/ Del NotI

<400> 8

tggtggtgac ccatccgggc agcggctgca agggcc

36

<210> 9 <211> 295 <212> PRT <213> Sphingobium herbicidovorans

<400> 9

<210> 10

<211> 295

5

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> AAD-1 v2 traducción

10

<220>

<221> MIS C_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Diferente de vl

15

<220>

<221> MIS C_FEATURE

<222> (212)..(212)

<223> Diferente de vl

20

<400> 10

5

<210> 11 <211> 296 <212> PRT <213> Secuencia artificial

10

<220> <223> AAD-1 v3 traducción

94

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(2)..(3)

<223>Diferente de VI

<400>11

<210> 12

<211> 888

<212> ADN

<213> Bradyrhizobium japonicum USDA 110

<400> 12

atgacgatcg ccatccggca gcttcagacg cattttgtcg gccaggtttc cggcctcgat 60 ttgcgaaagc cgctcacgcc gggcgaggcc cgcgaggtcg agtccgccat ggacaaatac 120 gcggtgctcg ttttccacga ccaggacatc accgacgagc agcagatggc tttcgcgctg 180 aacttcggcc agcgcgagga cgcgcgcggc ggcacggtca ccaaggagaa ggactaccgg 240 ctgcaatccg gcctgaacga cgtctccaat ctcggcaagg acggcaagcc gctggccaag 300 gacagccgca cgcacctgtt caatctcggc aactgcctct ggcactccga cagctcgttc 360 cgtcccattc ccgcaaaatt ctcgctgctg tcggcgcgcg tggtgaaccc gacgggcggc 420 aacaccgaat tcgcggacat gcgcgccgcc tatgacgcgc tcgacgacga gaccaaggcc 480 gaaatcgagg acctcgtctg cgagcactcg ctgatgtatt cgcgcggctc gctcggcttc 540 accgagtaca ccgacgaaga gaagcagatg ttcaagccgg tcctgcaacg cctcgtgcgc 600 acccatccgg tccaccgccg caagtcgctg tatctctcgt cgcatgccgg caagatcgcc 660 agcatgagcg tgccggaggg gcggctgctg ttgcgcgatc tcaacgagca cgcgacgcag 720 ccggaattcg tctacgtcca caaatggaag ctgcatgacc tcgtgatgtg ggacaaccgc 780 cagaccatgc accgcgtccg ccgctacgac cagtcccagc cccgcgacat gcgccgcgcg 840 acggtggcgg ggacggagcc gacggtgcag cagcaggcgg cggagtag 888

<210> 13

<211> 289

<212> PRT

<213> Bradyrhizobium japonicum USDA 110

<400> 13

5

<210> 14 <211> 34 <212> ADN <213> Secuencia artificial

10

<220> <223> brjap 5' (spel)

97

<400> 14

actagtaaca aagaaggaga tataccatga cgat

34

<210> 15

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> br jap 3' (xhol)

<400> 15

ttctcgagct atcactccgc cgcctgctgc tgc

33

<210> 16

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo M13

<400> 16

gtaaaacgac ggccagt

17

<210> 17

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso M13

<400> 17

caggaaacag ctatgac

17

<210> 18

<211> 32

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> NcoI de Brady

<400> 18

tataccacat gtcgatcgcc atccggcagc tt

32

<210> 19

<211> .33

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> SacI de Brady

<400> 19

gagctcctat cactccgccg cctgctgctg cac

33

<210> 20

<211> 525

<212>PRT

<213>Glycine max

<400>20

<212>PRT

<213>Secuencia artificial

<220>

10 <223> Proteína EPSPS de soja con dos mutaciones: la treonina 183 se convierte en isoleucina y la prolina 187 se convierte en serina

<400>21

<210>22

<211>1604

<212>ADN

<213>Secuencia artificial

<220>

<223>Secuencia de ADN adaptada a la soja que codifica la EPSPS con dos mutaciones mostrada en la SEQ ID Nº 21, con secuencia añadida

<220>

<221>misc_feature

<222>(1) . . (1575)

<223>Secuencia codificante de la secuencia de ADN adaptada a la soja que codifica la proteína EPSPS de la SEQ ID Nº 21

<220>

<221>misc_feature .

<222>(1576) . . (1578)

<223>Codón terminador de la traducción TGA

<220>

<221>misc_feature

<222>(1579)..(1604)

<223>Secuencia incluida para introducir codones de terminación de la traducción en los

seis marcos abiertos de lectura, y para introducir una diana para la enzima de

restricción SacI para las operaciones de clonación

<400> 22

atggctcaag tctcccgtgt tcacaatctt gctcagtcaa cccaaatctt tggacattca

60

agcaactcaa acaaactgaa gtctgtgaat tctgtctcac ttcgcccacg cctttgggga

120

gcatccaaga gtcgcatacc aatgcacaag aatgggagtt tcatgggcaa cttcaatgtt

180

gggaaaggca attctggtgt cttcaaagtt tcagcttctg ttgcagccgc agagaaaccc

240

agcacttccc ctgagattgt tcttgaaccc attaaggact tcagtggaac aatcactctg

300

cctggatcaa agagtctttc aaacagaata cttctcttgg cagctctgag tgaaggaacc

360

actgtagttg acaacctttt gtactctgaa gatattcatt acatgttggg tgctctcaga

420

actcttgggt tgagagttga agatgacaag accacaaaac aagccatagt tgaaggatgt

480

ggtgggttgt ttccaacaag caaagaatcc aaagatgaga tcaacttgtt tcttggcaat

540

gctggaattg caatgagaag cctcactgct gcagtagttg cagctggtgg gaatgcaagt

600

tatgtccttg atggtgtccc cagaatgagg gaaaggccca tcggtgacct tgtggctggc

660

ctgaaacagc ttggagcaga tgttgattgc ttcttgggca caaactgccc tccagtgaga

720

gtgaatggga agggaggttt gcctggtgga aaggtcaaac tgagtggatc agtctcttcc

780

cagtatctga ctgccttgct catggctgcc cctctggctt tgggtgatgt ggagattgaa atagtggaca agttgatttc tgttccatat gtggaaatga ccctcaaact catggagagg tttggagttt ctgttgaaca ttctggcaac tgggatcgtt tccttgtaca tggaggtcag aagtacaaaa gccctggcaa tgcctttgtt gaaggggatg caagctctgc ttcctatctc ttggctgggg ctgccatcac tggtgggacc atcacfcgtga atggctgtgg cacctcatcc cttcaaggtg atgtaaagtt tgcagaggtc ttggagaaaa tgggtgccaa ggtcacctgg tctgagaaca gtgtaactgt gtctggacct cccagagact tcagtggcag aaaggttctc cgtggaattg atgtgaacat gaacaagatg ccagatgtgg ccatgaccct cgctgttgta gccctgtttg caaatggacc aactgcaatc cgtgatgttg cttcatggag ggtgaaggag acagagagga tgattgccat ttgcacagaa ctccgcaaac ttggtgcaac agttgaagag ggaccagatt actgtgtgat aaccccacct gagaagctca atgtgacagc cattgacacc tatgatgacc acagaatggc aatggctttc tcccttgctg cctgtggtga tgtgcctgtg actatcaaag accctgggtg cacaaggaag acatttccag actactttga agttttggag aggttgacaa agcactgagt agttagctta atcacctaga gctc

840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1604

<210> 23 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador Pat 5-3

<400> 23

agataccctt ggttggttgc

20

<210> 24 <211> 20 <212> AND <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador Pat 3-3

<400> 24

cagatggatc gtttggaagg

20

<210> 25 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador directo AAD-1 PTU

<400> 25

ataatgccag cctgttaaac gcc

23

<210> 26 <211> 23 <212> AND <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador inverso AAD-1 PTU

<400> 26

ctcaagcata tgaatgacct cga

23

<210> 27 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo utilizado para la PCR de la región codificante del AAD-1 (RdpAcodF)

<400> 27

atggctcatg ctgccctcag cc 22

<210> 28

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso utilizado para la PCR de la región codificante del AAD-1 (RdpAcodR)

<400> 28

cgggcaggcc taactccacc aa 22

<210> 29

<211> 932

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> AAD-2 v2 con nucleótidos optimizados para vegetales

<400> 29

ccatggctac catagcaatc agacagctcc agacccactt tgtgggtcaa gtttctggat 60 tggacctcag aaagccactc actcctggag aagccagaga agttgaatca gctatggaca 120 agtacgcagt tcttgtcttc catgaccaag acatcacaga tgagcaacag atggcctttg 180 ccctcaactt tggtcagagg gaggatgcac gtggtggcac tgtcaccaaa gagaaggatt 240 accgtcttca gtctggcctc aatgatgttt ccaacttggg caaagatgga aagccacttg 300 ccaaggacag ccgcacccat ttgttcaacc ttggaaactg cttgtggcat tctgactcca 360 gcttcagacc aatcccagcc aagttcagcc tcctttctgc tcgtgttgtg aacccaactg 420 'gtgggaacac tgagtttgct gacatgagag ctgcctatga tgctcttgac gatgaaacca 480 aagctgagat tgaggacctt gtgtgtgagc actctctcat gtactcaagg ggctcacttg 540 gcttcactga gtacacagat gaagagaagc aaatgttcaa gcccgtcttg cagcgcttgg 600 tccgcacaca ccctgtgcac cgtcgcaaat cactctacct ctccagccat gccggaaaga 660 ttgccagcat gtccgtccct gaagggaggc tccttttgag ggatttgaat gaacatgcta 720 ctcagcctga gttcgtctat gttcacaaat ggaagttgca tgatcttgtg atgtgggaca 780 ataggcaaac catgcacaga gtgaggagat atgaccagtc ccaacccaga gacatgcgcc 840 gtgcaacagt tgctgggacc gagcccacag tgcaacagca agcagcagag tgagtagtta 900 gcttaatcac ctagagctcg gtcaccagat ct 932

<210> 30

<211> 296

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Proteína AAD-2 v2 traducida

<400> 30 <210>31

<211>22

<212>ADN

<213>Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo para la PCR del fragmento de Southern de AAD-1

<400> 31

atggctcatg ctgccctcag cc 22

<210> 32

<211> 21 10 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo para la PCR del fragmento de Southern de AAD-1

<400> 32

gggcaggcct aactccacca a 21

Claims (20)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Metodo para controlar al menos una mala hierba en una zona, en el que dicha zona comprende al menos una planta transgenica, comprendiendo dicha planta transgenica un polinucleotido aislado que codifica una proteina que degrada enzimaticamente un herbicida seleccionado de entre el grupo constituido por un herbicida fenoxi auxina y un herbicida ariloxifenoxipropionato, en el que dicho polinucleotido se hibrida en condiciones restrictivas con el complemento completo de una molecula de acido nucleico que codifica la SEC I0 n° 9, en el que dicha planta expresa dicho nucleotido y produce dicha proteina, en el que dicho metodo comprende la aplicacion de dicho herbicida en dicha zona.

2. 2.

   Metodo segun la reivindicacion 1, en el que dicho metodo incluye la aplicacion de dicho herbicida a dicha planta.

3. 3.

   Metodo segun la reivindicacion 1, en el que dicho herbicida es un herbicida fenoxi auxina, preferentemente un herbicida 2,4-0.

4. 4.

   Metodo segun la reivindicacion 1, en el que dicho herbicida comprende la estructura quimica siguiente

   o una sal de la misma.

5. 5.

   Metodo segun la reivindicacion 1, comprendiendo ademas dicha planta uno o varios otros genes de resistencia a herbicida.

6. 6.

   Metodo segun la reivindicacion 1, comprendiendo ademas dicha planta una caracteristica de tolerancia al glifosato y una caracteristica de tolerancia al glufosinato, y comprendiendo dicho metodo la aplicacion de 2,4-0, glifosato y glufosinato a dicha zona.

7. 7.

   Metodo segun la reivindicacion 1, comprendiendo ademas dicha planta un gen de tolerancia al dicamba, y comprendiendo dicho metodo la aplicacion de dicamba a dicha zona.

8. 8.

   Metodo segun la reivindicacion 1, comprendiendo ademas dicha planta un gen de tolerancia a un herbicida que es un inhibidor de la acetolactato sintasa.

9. 9.

   Metodo segun la reivindicacion 1, comprendiendo ademas dicha planta un gen de tolerancia al glufosinato.

10. 10.

    Metodo segun la reivindicacion 1, en el que dicha planta es una planta de maiz.

11. 11.

    Metodo segun la reivindicacion 1, en el que dicho herbicida se aplica en la presiembra, preemergencia y/o posemergencia de dicha planta.

12. 12.

    Metodo segun la reivindicacion 1, en el que dicho metodo comprende la plantacion de una semilla en dicha zona, y dejar que dicha semilla se convierta en dicha planta.

13. 13.

    Metodo segun la reivindicacion 12, en el que dicha aplicacion se lleva a cabo en la preemergencia de dicha planta.

14. 14.

    Metodo de la reivindicacion 1, comprendiendo dicha proteina la secuencia de aminoacidos de la SEC I0 n° 9 o una variante de la misma en el que dicha variante presenta una actividad dioxigenasa dependiente de alfacetoglutarato, al menos una delecion de aminoacido o una sustitucion conservadora, y al menos una identidad de secuencia de 95% con la SEC I0 n° 9.

15. 15.

    Metodo segun la reivindicacion 1, en el que dichas malas hierbas resistentes al glifosfato son controladas en un campo de plantas de cultivo tolerantes al glifosfato.

16. 16.

    Metodo segun la reivindicacion 1, en el que dicha zona es un campo y dicho metodo comprende la aplicacion de dicho herbicida en dicho campo y la plantacion de una semilla en dicho campo en el plazo de 14 dias desde la aplicacion de dicho herbicida, y dejar a dicha semilla convertirse en dicha planta transgenica.

17. 17.

    Metodo segun la reivindicacion 1, en el que dicho metodo comprende la aplicacion de un herbicida original a dicha zona.

18. 18.

    Metodo segun la reivindicacion 1, en el que dicho metodo comprende la aplicacion de uno o mas herbicidas a dicha zona, preferiblemente de modo secuencial y/o de una mezcla en tanque o simultaneamente.

19. 19.

    Metodo para controlar al menos una mala hierba en un campo, en el que dicho campo contiene al menos a una

    5 planta que comprende un polinucleotido aislado que codifica una proteina que degrada enzimaticamente un herbicida seleccionado de entre el grupo constituido por una fenoxi auxina y un ariloxifenoxipropionato, en el que dicha molecula de acido nucleico que codifica dicha proteina se hibrida en condiciones restrictivas con el complemento completo de una secuencia especificada por la SEC I0 n° 5 y en el que dicho polinucleotido esta ligado operativamente a un promotor que es funcional en una celula vegetal, en el que el metodo comprende la

    10 aplicacion de una combinacion de herbicidas a dichos campos.
20. 20. Metodo segun la reivindicacion 19, en el que dicha combinacion de herbicidas comprende 2,4-0.