CN111139254A - 大豆GmEPSPS1和GmEPSPS2定向突变修饰基因及其克隆方法和应用 - Google Patents
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Abstract
大豆GmEPSPS1和GmEPSPS2定向突变修饰基因及其克隆方法和应用，属于分子生物学和生物领域。本发明中，大豆GmEPSPS1基因在植物EPSPS酶保守区发生定向单氨基酸和双氨基酸置换后的基因序列分别为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3；大豆GmEPSPS2基因在植物EPSPS酶保守区发生定向单氨基酸和双氨基酸置换后的基因序列分别为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6。上述获得的基因均衍生于大豆内源GmEPSPS1和GmEPSPS2基因，具有更强的草甘膦抗性能力，在生物安全性及利用基因工程技术手段创制抗草甘膦大豆新品系应用上具有广泛的社会和经济效益。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学和生物技术领域，具体涉及一种大豆GmEPSPS1和GmEPSPS2定向突变修饰基因及其克隆方法和应用。
背景技术
大豆是我国重要的粮食和油料作物，在我国粮食产业中占据着非常重要的地位。目前，我国大豆生产的增长速度远不能满足我国人民的生活需求，需要依靠进口国际市场的转基因大豆。
田间杂草生长过盛是导致大豆作物减产的主要原因之一。除草剂草甘膦凭借其低毒、高效、广谱的除草优势占据着除草剂市场的主导地位。其作用机制主要是抑制莽草酸途径中的EPSPS酶，草甘膦与PEP竞争性结合EPSPS酶活性位点，使芳香族氨基酸合成受阻，进而使植物生长所需的生长激素、木质素等营养物质的合成也会受阻，进而导致植物死亡。EPSPS酶一般被分为两种类型，类型I主要来源于植物，大肠杆菌等部分微生物，对除草剂草甘膦的耐受性较低。类型II来源于覆盆子土壤杆菌、无色杆菌、假单胞菌等一些可以耐受极端环境影响的菌株，一般对草甘膦具有较高的耐受性。目前，国际上推广的抗草甘膦转基因大豆主要是利用基因工程手段过表达微生物来源的II型EPSPS基因的转基因大豆，其食品安全性备受争议。挖掘大豆内源的抗草甘膦基因，对利用基因工程手段培育安全性较高的抗除草剂大豆新种质，具有重要意义。
根据氨基酸序列同源比对分析结果表明，不同植物物种中，EPSPS酶具有保守的氨基酸序列区域“LGNAGTAMRPLTAA”，据报道，这个保守的区域可能是草甘膦与PEP竞争性结合EPSPS酶的活性位点。然而，大豆中EPSPS酶保守区“LGNAGTAMRPLTAA”发生突变修饰后对草甘膦抗性能力的影响并没有被公开报道过。
发明内容
本发明的目的是提供一种大豆GmEPSPS1和GmEPSPS2定向突变修饰基因及其克隆方法和应用。
本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：
本发明的大豆GmEPSPS1和GmEPSPS2定向突变修饰基因，它是大豆GmEPSPS1基因和GmEPSPS2基因在植物EPSPS酶保守区发生定向单氨基酸置换和双氨基酸置换后获得的基因；所述大豆GmEPSPS1基因在植物EPSPS酶保守区发生定向单氨基酸置换后的基因为mGmEPSPS1(PS)基因，其序列如SEQ ID NO.2所示，所述大豆GmEPSPS1基因在植物EPSPS酶保守区发生定向双氨基酸置换后的基因为mGmEPSPS1(TIPS)基因，其序列如SEQ ID NO.3所示；所述大豆GmEPSPS2基因在植物EPSPS酶保守区发生定向单氨基酸置换后的基因为mGmEPSPS2(PS)基因，其序列如SEQ ID NO.5所示，所述大豆GmEPSPS2基因在植物EPSPS酶保守区发生定向双氨基酸置换后的基因为mGmEPSPS2(TIPS)基因，其序列如SEQ ID NO.6所示。
作为优选的实施方式，所述大豆GmEPSPS1基因和大豆GmEPSPS2基因为大豆吉育72中两个编码5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的基因。
作为优选的实施方式，所述大豆GmEPSPS1基因序列如SEQ ID NO.1所示，所述大豆GmEPSPS2基因序列如SEQ ID NO.4所示。
作为优选的实施方式，所述大豆GmEPSPS1基因与Glyma.01G139600同源性为100％，所述大豆GmEPSPS2基因与Glyma.03G027400同源性为99％，与Glyma.03G027400存在10个核苷酸差异。
本发明的大豆GmEPSPS1和GmEPSPS2定向突变修饰基因的克隆方法，包括以下步骤：
步骤一、利用PCR技术从大豆吉育72幼苗的叶片中扩增并克隆GmEPSPS1基因和GmEPSPS2基因；
步骤二、利用Overlap-PCR技术，采用Overlap-PCR定向突变引物，通过三次PCR，分别扩增并克隆GmEPSPS1基因和GmEPSPS2基因编码蛋白单氨基酸置换和双氨基酸置换后的mGmEPSPS1(PS)基因、mGmEPSPS1(TIPS)基因、mGmEPSPS2(PS)基因、mGmEPSPS2(TIPS)基因。
作为优选的实施方式，步骤一中，所述基因克隆引物见下表。
作为优选的实施方式，步骤二中，所述Overlap-PCR定向突变引物见下表。
本发明的大豆GmEPSPS1和GmEPSPS2定向突变修饰基因在提高大豆草甘膦抗性能力中的应用，包括以下步骤：
步骤一、将GmEPSPS1基因、mGmEPSPS1(PS)基因、mGmEPSPS1(TIPS)基因、GmEPSPS2基因、mGmEPSPS2(PS)基因、mGmEPSPS2(TIPS)基因分别构建到原核表达载体pET22b中，转化大肠杆菌细胞BL21(DE3)，并利用IPTG诱导蛋白的表达；通过SDS-PAGE和Western-Blot技术鉴定蛋白的表达；
步骤二、将表达的蛋白分离纯化后，采用偶联法测定无机磷酸盐的连续释放量，测定EPSPS酶突变的活性；并在培养体系中添加不同浓度的草甘膦进行胁迫，测定IC50，分析蛋白表达后对大肠杆菌草甘膦抗性能力的影响；
步骤三、将GmEPSPS1基因、mGmEPSPS1(PS)基因、mGmEPSPS1(TIPS)基因、GmEPSPS2基因、mGmEPSPS2(PS)基因、mGmEPSPS2(TIPS)基因分别置换植物表达载体pCAMBIA3301中的GUS基因构建植物表达载体，并转化到K599发根农杆菌感受态细胞中；
步骤四、在K599发根农杆菌介导下，诱导大豆发状根，在添加不同浓度草甘膦的Hoagland培养液中对诱导的大豆发状根进行胁迫处理，分析GmEPSPS1和GmEPSPS2中PS和TIPS氨基酸取代对大豆发状根草甘膦抗性能力的影响。
作为优选的实施方式，步骤四中，所述草甘膦的浓度分别为0.5mg/L、1mg/L、1.5mg/L。
本发明的有益效果是：本发明的目的是提供大豆内源及衍生的具有草甘膦抗性能力的系列基因序列，即采用大豆“吉育72”中两个编码5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的GmEPSPS1基因和GmEPSPS2基因，分别进行定向单氨基酸置换(PS)后获得的mGmEPSPS1(PS)和mGmEPSPS2(PS)基因和分别进行双氨基酸置换(TIPS)后获得的mGmEPSPS1(TIPS)和mGmEPSPS2(TIPS)基因。将上述基因构建到原核表达载体pET22b中，并导入大肠杆菌受体细胞，诱导蛋白表达，均可提高大肠杆菌草甘膦抗性能力，且双氨基酸置换(TIPS)和单氨基酸置换(PS)后的基因赋予了大肠杆菌更强的草甘膦抗性能力。此外，将上述基因构建到pCAMBIA3301植物表达载体中，在K599农感菌作用下诱导大豆发状根，结果显示，超表达双氨基酸置换(TIPS)和单氨基酸置换(PS)基因后的大豆发状根表现出了更强的草甘膦抗性能力。经过比较，双氨基酸置换(TIPS)突变后的mGmEPSPS1(TIPS)和mGmEPSPS2(TIPS)基因草甘膦抗性能力优于单氨基酸置换(PS)突变后的mGmEPSPS1(PS)和mGmEPSPS2(PS)基因；单氨基酸置换(PS)突变后的mGmEPSPS1(PS)和mGmEPSPS2(PS)基因草甘膦抗性能力又优于大豆内源的mGmEPSPS1(PS)和mGmEPSPS2(PS)基因。因此，应用单氨基酸置换(PS)和双氨基酸置换(TIPS)均可提高GmEPSPS1基因和GmEPSPS2基因的草甘膦抗性能力。
本发明所获得的mGmEPSPS1(PS)、mGmEPSPS2(PS)、mGmEPSPS1(TIPS)和mGmEPSPS2(TIPS)基因均衍生于大豆内源GmEPSPS1和GmEPSPS2基因，且具有更强的草甘膦抗性能力，在生物安全性及利用CRISPR/Cas9等基因工程技术手段创制抗草甘膦大豆新品系应用上具有广泛的社会效益和经济效益。
附图说明
图1为GmEPSPS1及定向突变基因的原核蛋白表达的SDS-PAGE电泳检测和WesternBlot检测。图1a为GmEPSPS1及定向突变基因的原核蛋白表达的SDS-PAGE电泳检测结果，图1b为GmEPSPS1及定向突变基因的原核蛋白表达的Western Blot检测结果。
图2为GmEPSPS2及定向突变基因的原核蛋白表达的SDS-PAGE电泳检测和WesternBlot检测。图2a为GmEPSPS2及定向突变基因的原核蛋白表达的SDS-PAGE电泳检测结果，图2b为GmEPSPS2及定向突变基因的原核蛋白表达的Western Blot检测结果。
图3为超表达GmEPSPS1、mGmEPSPS1(PS)和mGmEPSPS1(TIPS)基因大豆发状根在不同浓度梯度草甘膦胁迫下的表型。
图4为超表达GmEPSPS2、mGmEPSPS2(PS)和mGmEPSPS2(TIPS)基因大豆发状根在不同浓度梯度草甘膦胁迫下的表型。
具体实施方式
本发明的大豆GmEPSPS1和GmEPSPS2定向突变修饰基因，它是大豆GmEPSPS1基因和GmEPSPS2基因在植物EPSPS酶保守区(LGNAGTAMRPLTAA)发生定向单氨基酸置换(PS)和双氨基酸置换(TIPS)后获得的基因。
大豆GmEPSPS1基因和大豆GmEPSPS2基因为大豆“吉育72”中两个编码5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的基因，是从大豆“吉育72”中分离出来的cDNA。
大豆GmEPSPS1基因序列如SEQ ID NO.1所示，所述大豆GmEPSPS2基因序列如SEQID NO.4所示。
大豆GmEPSPS1基因与Glyma.01G139600同源性为100％，所述大豆GmEPSPS2基因与Glyma.03G027400同源性为99％，与Glyma.03G027400存在10个核苷酸差异。
大豆GmEPSPS1基因在植物EPSPS酶保守区(LGNAGTAMRPLTAA)发生定向单氨基酸置换后的基因为mGmEPSPS1(PS)基因(第187位氨基酸由P变为S突变后的编码基因序列)，其序列如SEQ ID NO.2所示。
大豆GmEPSPS1基因在植物EPSPS酶保守区(LGNAGTAMRPLTAA)发生定向双氨基酸置换后的基因为mGmEPSPS1(TIPS)基因(第183位氨基酸由T变为I，同时第187位氨基酸由P变为S突变后的编码基因序列)，其序列如SEQ ID NO.3所示。
大豆GmEPSPS2基因在植物EPSPS酶保守区(LGNAGTAMRPLTAA)发生定向单氨基酸置换后的基因为mGmEPSPS2(PS)基因(第188位氨基酸由P变为S突变后的编码基因序列)，其序列如SEQ ID NO.5所示。
大豆GmEPSPS2基因在植物EPSPS酶保守区(LGNAGTAMRPLTAA)发生定向双氨基酸置换后的基因为mGmEPSPS2(TIPS)基因(第184位氨基酸由T变为I，同时第188位氨基酸由P变为S突变后的编码基因序列)，其序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明的大豆GmEPSPS1和GmEPSPS2定向突变修饰基因的克隆方法，具体包括以下步骤：
步骤一、利用PCR技术从大豆吉育72幼苗的叶片中扩增并克隆GmEPSPS1基因和GmEPSPS2基因；
步骤二、利用Overlap-PCR技术，采用Overlap-PCR定向突变引物，通过三次PCR，分别扩增并克隆GmEPSPS1基因和GmEPSPS2基因编码蛋白单氨基酸置换(PS)和双氨基酸置换(TIPS)后的mGmEPSPS1(PS)基因、mGmEPSPS1(TIPS)基因、mGmEPSPS2(PS)基因、mGmEPSPS2(TIPS)基因。
本发明的大豆GmEPSPS1和GmEPSPS2定向突变修饰基因应用在提高大豆草甘膦抗性能力中，具体包括以下步骤：
步骤一、将GmEPSPS1基因、mGmEPSPS1(PS)基因、mGmEPSPS1(TIPS)基因、GmEPSPS2基因、mGmEPSPS2(PS)基因、mGmEPSPS2(TIPS)基因分别构建到原核表达载体pET22b中，转化大肠杆菌细胞BL21(DE3)，并利用IPTG诱导蛋白的表达；通过SDS-PAGE和Western-Blot技术鉴定蛋白的表达。
步骤二、将表达的蛋白分离纯化后，采用偶联法测定无机磷酸盐的连续释放量，测定EPSPS酶突变的活性；并在培养体系中添加不同浓度的草甘膦进行胁迫，测定IC50，分析蛋白表达后对大肠杆菌草甘膦抗性能力的影响。
结果显示，将mGmEPSPS1(PS)基因、mGmEPSPS1(TIPS)基因、mGmEPSPS2(PS)基因、mGmEPSPS2(TIPS)基因在大肠杆菌细胞BL21(DE3)中进行表达，相对于GmEPSPS1基因和GmEPSPS2基因的表达，可赋予大肠杆菌更强的草甘膦抗性能力。
步骤三、将GmEPSPS1基因、mGmEPSPS1(PS)基因、mGmEPSPS1(TIPS)基因、GmEPSPS2基因、mGmEPSPS2(PS)基因、mGmEPSPS2(TIPS)基因分别置换植物表达载体pCAMBIA3301中的GUS基因构建植物表达载体，并转化到K599发根农杆菌感受态细胞中。
步骤四、在K599发根农杆菌介导下，诱导大豆发状根，在添加不同浓度(0.5mg/L、1mg/L、1.5mg/L)草甘膦的Hoagland培养液中对诱导的大豆发状根进行胁迫处理，分析GmEPSPS1和GmEPSPS2中PS和TIPS氨基酸取代对大豆发状根草甘膦抗性能力的影响。
结果显示，将mGmEPSPS1(PS)基因、mGmEPSPS1(TIPS)基因、mGmEPSPS2(PS)基因、mGmEPSPS2(TIPS)基因在大豆发状根中进行表达，相对于mGmEPSPS1基因和GmEPSPS2基因的表达，可使大豆发状根具有更强的草甘膦抗性能力。
综上，应用单氨基酸置换(PS)和双氨基酸置换(TIPS)，可提高GmEPSPS1基因和GmEPSPS2基因的草甘膦抗性能力。
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1大豆GmEPSPS1和GmEPSPS2基因的扩增和克隆
(1)大豆样本的采集及总RNA的提取：在田间采取大豆“吉育72”幼苗的叶片放于锡纸袋，液氮冷冻后暂存于-80℃冰箱。样本总RNA的提取操作依照RNA iso plus(TaKaRa)试剂盒说明进行。
(2)cDNA的合成：采用PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)试剂进行反转录。
(3)基因克隆引物见表1。
表1
(4)GmEPSPS1和GmEPSPS2全长基因的PCR扩增
扩增体系为Ex Taq 0.2μL，10×Ex Taq Buffer 2.5μL，dNTPs 2μL，模板cDNA 1μL，F1/F2 1μL，R2/R2 1μL，H2O 17.3μL；反应条件为预变性94℃5min，变性94℃30S、退火55℃45S、延伸72℃105S(30个循环)，后延伸72℃8min。
(5)GmEPSPS1基因和GmEPSPS2基因的克隆
将上述PCR产物电泳切胶回收后与克隆载体pEASY-T1 Simple Cloning Vector(TransGen)连接，并转入大肠杆菌感受态细胞Trans-T1中。挑取单菌落，使用M13通用引物进行菌液PCR检测，将电泳目的条带大小正确的克隆送苏州金维智生物公司进行测序及同源比对。
结果显示获得了全长为1578bp的GmEPSPS1(与Glyma.01G139600同源性100％)和1581bp的GmEPSPS2(与Glyma.03G027400同源性99％，存在10个差异核苷酸)基因cDNA序列。GmEPSPS1基因cDNA序列如SEQ ID NO.1所示，GmEPSPS2基因cDNA序列如SEQ ID NO.4所示。
实施例2 GmEPSPS1基因和GmEPSPS2基因的PS和TIPS定向突变克隆
(1)为了将克隆的目的基因构建到原核表达载体pET22b中，在设计的GmEPSPS1和GmEPSPS2基因全长序列引物引入了SacⅠ和XhoⅠ酶切位点。此外，针对EPSPS编码蛋白单氨基酸定向突变PS(P变为S)和双氨基酸定向突变TIPS(T变为I和P变为S)，分别设计了具有15bp重叠结构的Overlap-PCR定向突变引物，见表2。
表2
(2)GmEPSPS1基因和GmEPSPS2基因的PS和TIPS定向突变PCR扩增
利用Overlap-PCR技术，通过三次PCR，分别扩增GmEPSPS1基因和GmEPSPS2基因编码蛋白单氨基酸置换(PS)和双氨基酸(TIPS)置换后的mGmEPSPS1(PS)基因、mGmEPSPS1(TIPS)基因、mGmEPSPS2(PS)基因、mGmEPSPS2(TIPS)基因。
第一次PCR扩增使用Pfu DNA聚合酶(TransGen)扩增从GmEPSPS1/GmEPSPS2基因起始密码子到单氨基酸PS或双氨基酸TIPS置换位点的上游基因序列。具体的PCR体系为：EasyPfu DNA Polymerase 1μL，10×EasyPfu Buffer5μL，2.5mM dNTPs 5μL，GmEPSPS1基因和GmEPSPS2基因的克隆菌液作为模板1μL，mF1/mF2 1μL，m(PS)-R1/m(TIPS)-R1/m(PS)-R2/m(TIPS)-R2 1μL，ddH2O 31μL；反应条件为：预变性94℃5min，变性94℃30S、退火57℃30S、延伸72℃1min(30个循环)，后延伸72℃8min。
第二次PCR扩增使用Pfu DNA聚合酶(TransGen)扩增从GmEPSPS1/GmEPSPS2基因单氨基酸PS或双氨基酸TIPS置换位点到终止位点的下游基因序列。具体的PCR体系为：EasyPfu DNA Polymerase 1μL，10×EasyPfu Buffer5μL，2.5mM dNTPs 5μL，GmEPSPS1基因和GmEPSPS2基因的克隆菌液作为模板1μL，m(PS)-F1/m(TIPS)-F1/m(PS)-F2/m(TIPS)-F2 1μL，mR1/mR2 1μL，ddH2O 31μL；反应条件为：预变性94℃5min，变性94℃30S、退火57℃30S、延伸72℃2min(30个循环)，后延伸72℃8min。
第三次PCR扩增以混合后的前两次PCR的清洁产物为模板，使用Taq DNA聚合酶(TaKaRa)扩增GmEPSPS1/GmEPSPS2基因及PS/TIPS突变后的全长序列(含酶切位点和保护碱基)。具体的PCR体系为：Ex Taq 0.2μL，10×Ex Taq Buffer 2.5μL，dNTPs 2μL，模板为混合后的第一次PCR清洁产物(50ng)和第二次PCR清洁产物(100ng)，mF1/mF2 1μL，mR2/mR2 1μL，H2O 17.3μL；反应条件为预变性94℃5min，变性94℃30S、退火55℃45S、延伸72℃105S(30个循环)，后延伸72℃8min。
(3)GmEPSPS1、GmEPSPS2及定向突变修饰基因的克隆
将以上PCR扩增产物电泳检测条带大小正确的切胶回收，并连接pEASY-T1 SimpleCloning Vector(TransGen)克隆载体，转化Trans-T1(TransGen)大肠杆菌感受态细胞。挑取单菌落，使用M13通用引物进行菌液PCR检测，将电泳目的条带大小正确的克隆送生工生物公司进行测序，测序结果显示GmEPSPS1基因和GmEPSPS2基因及单氨基酸置换(PS)和双氨基酸(TIPS)置换后的基因序列都成功地得到了克隆。mGmEPSPS1(PS)基因序列如SEQ IDNO.2所示(重叠PCR定点(P187S)突变后的基因)，mGmEPSPS1(TIPS)基因序列如SEQ ID NO.3所示(重叠PCR定点(T183I与P187S)突变后的基因)，mGmEPSPS2(PS)基因序列如SEQ IDNO.5所示(重叠PCR定点(P188S)突变后的基因)，mGmEPSPS2(TIPS)基因序列如SEQ ID NO.6所示(重叠PCR定点(T184I与P188S)突变后的基因)。
实施例3 GmEPSPS1、GmEPSPS2及PS和TIPS定向突变修饰基因的原核表达
(1)原核表达载体的构建
从上述测序完全正确的基因克隆菌液中分别提取质粒，分别进行SacⅠ、XhoⅠ双酶切(TaKaRa)，电泳后分别切胶回收目的条带。同时，提取pET-22b原核表达载体质粒，SacⅠ、XhoⅠ双酶切(TaKaRa)后切胶回收。然后在恒温金属浴16℃条件下，用T4连接酶(Promega)分别将目的基因与线性化的pET-22b质粒进行过夜连接，将连接产物转化至Trans-T1大肠杆菌感受态细胞中，挑取单菌落，进行菌液PCR及质粒酶切验证。
(2)原核表达载体的转化
提取构建好的pET-22b-GmEPSPS1、pET-22b-mGmEPSPS1(PS)、pET-22b-mGmEPSPS1(TIPS)、pET-22b-GmEPSPS2、pET-22b-mGmEPSPS2(PS)、pET-22b-mGmEPSPS2(TIPS)质粒，分别转化到BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞(TransGen)中，挑取单菌落，进行PCR鉴定。
(3)原核表达蛋白的诱导
在6ml LB液体培养基(含氨苄)中分别接种上述BL21(DE3)菌液，37℃，200rpm摇床中过夜培养。转移上述菌液至50mL LB液体培养基中，37℃，培养2-3h，测量OD值直至菌液OD值在0.6-1之间，添加IPTG，终总浓度为0.1mM，28℃诱导3-4个小时。
(4)SDS-PAGE凝胶电泳
a.制样：分别取1mL诱导前和诱导后的菌液，离心收集菌体并加入80μL ddH2O重悬，再加20μL 5×SDS-PAGE loading buffer，煮沸10min后，放-20℃暂存。
b.制胶：配制12％的SDS-PAGE分离胶和浓缩胶。
c.上样：将样品7000rpm离心5min后，取15μL上清点样。
d.电泳：先使用80V电泳；当样品达到分离胶界面时，改用120V电泳。
e.染色：考马斯亮蓝染色10min后，分2-3次共脱色30min。
f.成像：将凝胶放入成像仪进行检测，结果如图1a和图2a所示。空载体pET-22b及未经诱导的菌液中没有或有很少目的蛋白的表达。
(5)Western Blot检测
a.SDS-PAGE凝胶电泳；
b.转膜：在转膜板上依次叠放海绵，滤纸，胶，PVDF膜，滤纸和海绵并夹紧。放入转膜液中，转膜槽置于冰上，90V 1h。
c.封闭：蛋白膜放到封闭液中，室温封闭2h。
d.一抗孵育：蛋白膜放入His标签的Anti-His Mouse mAb一抗中，一抗按照1：1000稀释，室温在侧摆摇床上孵育两小时；回收一抗，加入Western洗涤液PBST，在侧摆摇床上洗涤10分钟，重复洗3次。
e.二抗孵育：按1:1000稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的Goat Anti Mouse二抗。室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育两小时；回收二抗，加入Western洗涤液，在侧摆摇床上洗涤10分钟，重复洗3次。
f.蛋白检测：利用DAB显色液避光显色，结果如图1b和图2b所示。IPTG诱导后的菌液中，目的蛋白显示出较高的表达水平，大小约为60kDa。
实施例4 GmEPSPS1和GmEPSPS2及PS和TIPS定向突变基因在大肠杆菌细胞中的活性分析
在含GmEPSPS1和GmEPSPS2及PS和TIPS定向突变基因的大肠杆菌培养体系中，添加不同浓度的草甘膦进行胁迫，莽草酸3-磷酸恒定在0.1mM的水平下，测定His标记的重组EPSPS蛋白活性和引起50％体外抑制的除草剂剂量(IC50)。
结果如表3所示，基于草甘膦IC50比率，大肠杆菌表达mGmEPSPS1(PS)对草甘膦的抗性适中，是大肠杆菌表达GmEPSPS1的2.3倍，而mGmEPSPS1(TIPS)抗性最高，是大肠杆菌表达GmEPSPS1的466倍；大肠杆菌表达mGmEPSPS2(PS)对草甘膦的抗性适中，是大肠杆菌表达GmEPSPS2的1.75倍，而mGmEPSPS2(TIPS)抗性最高，是大肠杆菌表达GmEPSPS2的282倍。mGmEPSPS1(PS)基因和mGmEPSPS1(TIPS)基因相比GmEPSPS1基因，mGmEPSPS2(PS)基因和mGmEPSPS2(TIPS)基因相比GmEPSPS2基因具有更强的抗草甘膦能力，从而增强了大肠杆菌宿主细胞的耐草甘膦能力。因此，GmEPSPS1和GmEPSPS2中PS和TIPS氨基酸取代对草甘膦的敏感性降低，是产生高水平草甘膦抗性的重要因素。
表3
实施例5 GmEPSPS1和GmEPSPS2及PS和TIPS定向突变基因植物表达载体的构建
(1)为了将克隆的目的基因构建到pCAMBIA3301表达载体中，设计的GmEPSPS1和GmEPSPS2基因全长序列引物引入了Bgl II和Pml I酶切位点。基因克隆引物列表见表4。
表4
(2)GmEPSPS1和GmEPSPS2基因及PS和TIPS定向突变基因的PCR扩增及克隆
PCR体系为Ex Taq 0.2μL，10×Ex Taq Buffer 2.5μL，dNTPs 2μL，分别以GmEPSPS1基因、mGmEPSPS1(PS)基因、mGmEPSPS1(TIPS)基因及GmEPSPS2基因、mGmEPSPS2(PS)基因和mGmEPSPS2(TIPS)基因的T克隆菌液为模板，CF1/CF2 1μL，CR2/CR2 1μL，H2O17.3μL；反应条件为预变性94℃5min，变性94℃30S、退火55℃45S、延伸72℃105S(30个循环)，后延伸72℃8min。将以上PCR扩增产物电泳检测条带大小正确的切胶回收，并连接pEASY-T1 Simple Cloning Vector(TransGen)克隆载体，并转化Trans-T1(TransGen)大肠杆菌感受态细胞。挑取单菌落，使用M13通用引物进行菌液PCR检测，将电泳目的条带大小正确的克隆送生工生物公司进行测序。
(3)植物表达载体的构建
从上述获得的各目的基因的T克隆菌液中提取质粒DNA，Bgl II和Pml I酶切后电泳回收目的基因片段；同时提取pCAMBIA3301质粒DNA，Bgl II和Pml I酶切后回收载体大片段，然后在恒温金属浴16℃条件下，用T4连接酶(Promega)分别将目的基因与pCAMBIA3301质粒大片段过夜连接，将连接产物转化至Trans-T1大肠杆菌感受态细胞中，挑取单菌落，进行菌液PCR及质粒酶切验证。
实施例6 GmEPSPS1和GmEPSPS2及PS和TIPS定向突变基因在大豆发状根中的表达及草甘膦抗性分析
(1)K599发根农杆菌感受态细胞的制备及转化
制备K599发根农杆菌感受态细胞，并分别提取构建好的GmEPSPS1基因、mGmEPSPS1(PS)基因、mGmEPSPS1(TIPS)基因及GmEPSPS2基因、mGmEPSPS2(PS)基因、mGmEPSPS2(TIPS)基因的pCAMBIA3301载体质粒，将提取的质粒转化到K599发根农杆菌感受态细胞中，并进行菌液PCR鉴定。
(2)大豆发状根的诱导
在K599发根农杆菌介导下，诱导大豆发状根，待大豆发状根被诱导生长至10cm左右，剪去大豆主根并对其进行掐尖，保留一对真叶和2对复叶。然后将剪去主根的大豆在蛭石中缓苗5天左右，缓解剪主根对大豆苗产生的伤害。
(3)大豆发状根的草甘膦胁迫处理及表型分析
在未添加除草剂和添加不同浓度草甘膦(0.5mg/L、1mg/L、1.5mg/L)的四分之一Hoagland培养液中对诱导的发状根进行胁迫处理，结果如图3和图4所示，mGmEPSPS1(PS)基因和mGmEPSPS1(TIPS)基因相比GmEPSPS1基因、野生型和空载体对照，以及mGmEPSPS2(PS)基因和mGmEPSPS2(TIPS)基因相比GmEPSPS2基因、野生型和空载体生长状态良好。因此，GmEPSPS1和GmEPSPS2中PS和TIPS氨基酸取代可提高大豆发状根的草甘膦抗性能力。
本发明公开了一种大豆GmEPSPS1和GmEPSPS2定向突变修饰基因及其克隆方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
序列表
<110> 吉林农业大学
<120> 大豆GmEPSPS1和GmEPSPS2定向突变修饰基因及其克隆方法和应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1578
<212> DNA
<213> 人工(基因)
<400> 1
atggcccaag tgagcagagt gcacaatctt gctcaaagca ctcaaatttt tggccattct 60
tccaactcca acaaactcaa atcggtgaat tcggtttcat tgaggccacg cctttggggg 120
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cgaggcattg atgtcaatat gaacaagatg ccagatgttg ccatgacact tgctgttgtt 1260
gcactatttg ctaatggtcc cactgctata agagatgtgg caagttggag agttaaagag 1320
actgagagga tgatagcaat ctgcacagaa ctcagaaagc taggagcaac agttgaagaa 1380
ggtcctgatt actgtgtgat tactccacct gagaaattga atgtcacagc tatagacaca 1440
tatgatgacc acagaatggc catggcattc tctcttgctg cttgtgggga tgttccagta 1500
accatcaagg atcctggttg caccaggaag acatttcctg actactttga agtccttgag 1560
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<211> 1592
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<213> 人工(基因)
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ttaatgtggg gaagggaaat tccggcgtgt ttaaggtttc tgcatcggtc gccgccgcag 240
agaagccgtc aacgtcgccg gagatcgtgt tggaacccat caaagacttc tcgggtacca 300
tcacattgcc agggtccaag tctctgtcca atcgaatttt gcttcttgct gctctctctg 360
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cattaaggac ccttggactg cgtgtggaag atgacaaaac aaccaaacaa gcaattgttg 480
aaggctgtgg gggattgttt cccactagta aggaatctaa agatgaaatc aatttattcc 540
ttggaaatgc tggtattgca atgcgttcgt tgacagcagc tgtggttgct gcaggtggaa 600
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ttgctggtct taagcaactt ggtgcagatg ttgattgctt tcttggcaca aactgtccac 720
ctgttcgtgt aaatgggaag ggaggacttc ctggcggaaa ggtgaaactg tctggatcag 780
ttagcagtca atacttgact gctttgctta tggcagctcc tttagctctt ggtgatgtgg 840
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tggagcgttt tggagtttct gtggaacaca gtggtaattg ggataggttc ttggtccatg 960
gaggtcaaaa gtacaagtct cctggcaatg cttttgttga aggtgatgct tcaagtgcca 1020
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ttacatggtc agagaacagt gtcactgttt ctggaccacc acgagatttt tctggtcgaa 1200
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<212> DNA
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atgttccagt aaccatcaag gatcctggtt gcaccaggaa gacatttccc gactactttg 1560
aagtccttga gaggttcaca aggcacctcg agcgg 1595
Claims (10)
1.大豆GmEPSPS1和GmEPSPS2定向突变修饰基因，其特征在于，它是大豆GmEPSPS1基因和GmEPSPS2基因在植物EPSPS酶保守区发生定向单氨基酸置换和双氨基酸置换后获得的基因；所述大豆GmEPSPS1基因在植物EPSPS酶保守区发生定向单氨基酸置换后的基因为mGmEPSPS1(PS)基因，其序列如SEQ ID NO.2所示，所述大豆GmEPSPS1基因在植物EPSPS酶保守区发生定向双氨基酸置换后的基因为mGmEPSPS1(TIPS)基因，其序列如SEQ ID NO.3所示；所述大豆GmEPSPS2基因在植物EPSPS酶保守区发生定向单氨基酸置换后的基因为mGmEPSPS2(PS)基因，其序列如SEQ ID NO.5所示，所述大豆GmEPSPS2基因在植物EPSPS酶保守区发生定向双氨基酸置换后的基因为mGmEPSPS2(TIPS)基因，其序列如SEQ ID NO.6所示。
2.根据权利要求1所述的大豆GmEPSPS1和GmEPSPS2定向突变修饰基因，其特征在于，所述大豆GmEPSPS1基因和大豆GmEPSPS2基因为大豆吉育72中两个编码5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的基因。
3.根据权利要求1所述的大豆GmEPSPS1和GmEPSPS2定向突变修饰基因，其特征在于，所述大豆GmEPSPS1基因序列如SEQ ID NO.1所示，所述大豆GmEPSPS2基因序列如SEQ ID NO.4所示。
4.根据权利要求1所述的大豆GmEPSPS1和GmEPSPS2定向突变修饰基因，其特征在于，所述大豆GmEPSPS1基因与Glyma.01G139600同源性为100％，所述大豆GmEPSPS2基因与Glyma.03G027400同源性为99％，与Glyma.03G027400存在10个核苷酸差异。
5.如权利要求1至4中任意一项所述的大豆GmEPSPS1和GmEPSPS2定向突变修饰基因的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、设计基因克隆引物，利用PCR技术从大豆吉育72幼苗的叶片中扩增并克隆GmEPSPS1基因和GmEPSPS2基因；
步骤二、利用Overlap-PCR技术，采用Overlap-PCR定向突变引物，通过三次PCR，分别扩增并克隆GmEPSPS1基因和GmEPSPS2基因编码蛋白单氨基酸置换和双氨基酸置换后的mGmEPSPS1(PS)基因、mGmEPSPS1(TIPS)基因、mGmEPSPS2(PS)基因、mGmEPSPS2(TIPS)基因。
6.根据权利要求5所述的大豆GmEPSPS1和GmEPSPS2定向突变修饰基因的克隆方法，其特征在于，步骤一中，所述基因克隆引物见下表。
7.根据权利要求5所述的大豆GmEPSPS1和GmEPSPS2定向突变修饰基因的克隆方法，其特征在于，步骤二中，所述Overlap-PCR定向突变引物见下表。
8.如权利要求1至4中任意一项所述的大豆GmEPSPS1和GmEPSPS2定向突变修饰基因在提高大豆草甘膦抗性能力中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、将GmEPSPS1基因、mGmEPSPS1(PS)基因、mGmEPSPS1(TIPS)基因、GmEPSPS2基因、mGmEPSPS2(PS)基因、mGmEPSPS2(TIPS)基因分别构建到原核表达载体pET22b中，转化大肠杆菌细胞BL21(DE3)，并利用IPTG诱导蛋白的表达；通过SDS-PAGE和Western-Blot技术鉴定蛋白的表达；
步骤二、将表达的蛋白分离纯化后，采用偶联法测定无机磷酸盐的连续释放量，测定EPSPS酶突变的活性；并在培养体系中添加不同浓度的草甘膦进行胁迫，测定IC50，分析蛋白表达后对大肠杆菌草甘膦抗性能力的影响；
步骤三、将GmEPSPS1基因、mGmEPSPS1(PS)基因、mGmEPSPS1(TIPS)基因、GmEPSPS2基因、mGmEPSPS2(PS)基因、mGmEPSPS2(TIPS)基因分别置换植物表达载体pCAMBIA3301中的GUS基因构建植物表达载体，并转化到K599发根农杆菌感受态细胞中；
步骤四、在K599发根农杆菌介导下，诱导大豆发状根，在添加不同浓度草甘膦的Hoagland培养液中对诱导的大豆发状根进行胁迫处理，分析GmEPSPS1和GmEPSPS2中PS和TIPS氨基酸取代对大豆发状根草甘膦抗性能力的影响。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，步骤四中，所述草甘膦的浓度分别为0.5mg/L、1mg/L、1.5mg/L。
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN114836446A (zh) * | 2022-04-26 | 2022-08-02 | 上海交通大学 | 一种抗草甘膦的植物及其制法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102094032A (zh) * | 2004-04-30 | 2011-06-15 | 美国陶氏益农公司 | 新除草剂抗性基因 |
| CN102399794A (zh) * | 2010-09-08 | 2012-04-04 | 创世纪转基因技术有限公司 | 一种棉花epsp合成酶突变体基因及其应用 |
| US20190359992A1 (en) * | 2016-06-28 | 2019-11-28 | Cellectis | Altering expression of gene products in plants through targeted insertion of nucleic acid sequences |
-
2020
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102094032A (zh) * | 2004-04-30 | 2011-06-15 | 美国陶氏益农公司 | 新除草剂抗性基因 |
| CN102399794A (zh) * | 2010-09-08 | 2012-04-04 | 创世纪转基因技术有限公司 | 一种棉花epsp合成酶突变体基因及其应用 |
| US20190359992A1 (en) * | 2016-06-28 | 2019-11-28 | Cellectis | Altering expression of gene products in plants through targeted insertion of nucleic acid sequences |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| HEPING HAN ET AL.: ""A double EPSPS gene mutation endowing glyphosate resistance shows a remarkably high resistance cost"", 《PLANT CELL ENVIRON.》 * |
| 张云彤: ""大豆GmaroA基因的克隆、表达分析及功能鉴定"", 《中国学位论文全文数据库》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114836446A (zh) * | 2022-04-26 | 2022-08-02 | 上海交通大学 | 一种抗草甘膦的植物及其制法 |
| CN114836446B (zh) * | 2022-04-26 | 2023-12-19 | 上海交通大学 | 一种抗草甘膦的植物及其制法 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20200512 |
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