PT2308977E

PT2308977E - Novo gene de resistência a herbicida

Info

Publication number: PT2308977E
Application number: PT100122027T
Authority: PT
Inventors: Donald J Merlo; Terry R Wright; Justin M Lira; Nicole Arnold
Original assignee: Dow Agrosciences Llc
Priority date: 2004-04-30
Filing date: 2005-05-02
Publication date: 2013-05-13
Also published as: EP2298901B1; CA2897475C; ES2435247T5; CA2563206A1; US20210147867A1; DK2298901T4; US11149283B2; DK2298901T3; WO2005107437A3; PL2298901T5; EP2298901A2; EP1740039B1; ES2389843T3; EP2308977A2; PT1740039E; WO2005107437A2; US10450549B2; EP1740039A2; BRPI0509460A; ES2406809T3

Description

ΕΡ 2 308 977/ΡΤ DESCRIÇÃO "Novo gene de resistência a herbicida"

Antecedentes do invento

As ervas daninhas podem esgotar rapidamente os nutrientes valiosos do solo necessários para as culturas e outras plantas desejáveis. Existem muitos tipos diferentes de herbicidas utilizados actualmente para o controlo de ervas daninhas. Um herbicida extremamente popular é o glifosato.

Foram desenvolvidas culturas, tais como milho, soja, colza, algodão, beterraba açucareira, trigo, relva e arroz, que são resistentes a glifosato. Assim, pode pulverizar-se glifosato em campos com culturas activas de milho resistente a glifosato, por exemplo, para controlar as ervas daninhas sem danificar significativamente as plantas de milho.

Com a introdução de culturas tolerantes a glifosato (GTC) modificadas por engenharia genética na década de 90, os agricultores ficaram com uma ferramenta simples, conveniente, flexível e barata para controlar uma vasta gama de ervas daninhas de folha larga e gramíneas, sem paralelo na agricultura. Consequentemente, os produtores adoptaram rapidamente as GTC e em muitos casos abandonaram muitas das melhores práticas agronómicas aceites, tais como rotação de culturas, rotação do modo de acção do herbicida, mistura em tanque, incorporação de controlo mecânico de ervas daninhas com controlo químico e de cultura. Actualmente encontram-se disponíveis comercialmente soja, algodão, milho e colza tolerantes a glifosato nos Estados Unidos e noutros locais do hemisfério ocidental. Mais GTC (e.g., trigo, arroz, beterraba açucareira, relva, etc.) estão preparadas para introdução desde que sejam aceites pelo mercado global. Muitas outras espécies resistentes a glifosato estão em estágios experimentais ou de desenvolvimento (e.g., alfafa, cana de açúcar, girassol, beterrabas, ervilhas, cenoura, pepino, alface, cebola, morangos, tomate e tabaco; espécies de 2 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ silvicultura tais como choupo e liquidâmbar; e espécies de horticultura tais como margarida, petúnia e begónias; consultar a página de internet "isb.vt.edu/cfdocs/fieldtestsl.cfm, 2005"). Adicionalmente, o custo do glifosato desceu drasticamente nos últimos anos a ponto de poucos programas de controlo de ervas daninhas convencionais poderem competir eficazmente em preço e em desempenho com os sistemas GTC glifosato. 0 glifosato tem sido utilizado com sucesso em queimadas e outras áreas sem cultura para controlo da vegetação total durante mais de 15 anos. Em muitos casos, tal como com GTC, utilizou-se glifosato 1-3 vezes por ano durante 3, 5, 10 até 15 anos seguidos. Estas circunstâncias levaram a um excesso de confiança na tecnologia do glifosato e das GTC e colocaram uma elevada pressão de selecção sobre as espécies de ervas daninhas nativas para plantas que são naturalmente mais tolerantes a glifosato ou que desenvolveram um mecanismo de resistência à actividade herbicida do glifosato. A utilização extensiva de programas de controlo de ervas daninhas exclusivamente com glifosato está a resultar na selecção de ervas daninhas resistentes a glifosato e a seleccionar a propagação de espécies de ervas daninhas que são inerentemente mais tolerantes a glifosato do que a maioria das espécies alvo (i.e., variações nas ervas daninhas). (Ng et ai., 2003; Simarmata et al., 2003; Lorraine-Colwill et al., 2003; Sfiligoj, 2004; Miller et al., 2003; Heap, 2005; Murphy et al., 2002; Martin et al., 2002.) Embora o glifosato tenha sido vastamente utilizado globalmente durante mais de 15 anos, apenas foram relatados alguns casos de ervas daninhas que desenvolveram resistência a glifosato (Heap, 2005); no entanto, a maioria destes casos foi identificada nos últimos 3-5 anos. As ervas daninhas resistentes incluem tanto espécies de gramineas, como de folha larga - Lolium rigidum, Lolium multiflorum, Eleuslne Indica, Ambrósia artemisiifolia, Conyza canadensis, Conyza bonariensis e Plantago lanceolata. Adicionalmente, ervas daninhas que antes da vasta utilização de GTC não eram um problema agronómico estão agora a tornar-se 3 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ mais prevalecentes e difíceis de controlar no contexto das GTC, que compreende >80% da área de algodão e soja dos EUA e >20% da área de milho dos EUA (Gianessi, 2005) . Estas variações das ervas daninhas estão a ocorrer predominantemente (mas não exclusivamente) com ervas daninhas de folha larga, difíceis de controlar. Alguns exemplos incluem as espécies Ipomoea, Amaranthus, Chenopodium, Taraxacum e Commelina.

Em áreas em que os agricultores se deparam com ervas daninhas resistentes a glifosato ou com uma variação para espécies de ervas daninhas mais difíceis de controlar, os agricultores podem compensar as debilidades do glifosato por mistura em tanque ou por alternância com outros herbicidas que controlarão as ervas daninhas que falharam. Um parceiro popular e eficaz para mistura em tanque para controlar ervas de folha larga que escapam tem sido em muitos casos o ácido 2,4-Diclorofenoxiacético (2,4-D): o 2,4-D tem sido utilizado em agronomia e em situações sem cultura para controlo de ervas daninhas de folha larga de largo espectro há mais de 60 anos. Têm sido relatados casos individuais de espécies mais tolerantes, mas o 2,4-D permanece um dos herbicidas mais utilizados globalmente. Uma limitação a uma maior utilização de 2,4-D é a sua selectividade muito baixa em culturas de dicotiledóneas, tais como soja ou algodão, e portanto 2,4-D não é tipicamente utilizado em culturas sensíveis de dicotiledóneas (e geralmente nem nas proximidades). Adicionalmente, a utilização de 2,4-D em culturas de gramíneas é algo limitada pela natureza das lesões à cultura que podem ocorrer. O 2,4-D em combinação com glifosato tem sido utilizado para proporcionar um tratamento mais robusto das queimadas antes do plantio soja e algodão por plantação directa; no entanto, devido à sensibilidade destas espécies de dicotiledóneas a 2,4-D, estes tratamentos de queimadas devem ocorrer pelo menos 14-30 dias antes de plantar (Agriliance, 2003). O 2,4-D fenoxiácidos, 2,

4-D tem encontra-se na tal como o MCPA, sido utilizado classe de herbicidas dos o mecoprop e o dicloroprop. O em muitas culturas de em culturas 4 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ monocotiledóneas (tais como milho, trigo e arroz) para o controlo selectivo de ervas daninhas de folha larga sem danificar gravemente as plantas da cultura pretendida. O 2,4-D é um derivado sintético da auxina que actua desregulando a homeostase hormonal celular normal e impede um crescimento equilibrado e controlado; no entanto, o modo de acção exacto é ainda desconhecido. 0 2,4-D apresenta diferentes níveis de selectividade em determinadas plantas (e.g., as dicotiledóneas são mais sensíveis do que as gramíneas). 0 metabolismo diferencial do 2.4- D por diferentes plantas é uma das explicações para os níveis de selectividade variáveis. Em geral, as plantas metabolizam 2,4-D lentamente, pelo que a resposta variável das plantas ao 2,4-D pode ser explicada mais provavelmente pela diferente actividade no(s) local(is) alvo (WSSA, 2002). O metabolismo das plantas do 2,4-D ocorre tipicamente através de um mecanismo em duas fases, tipicamente hidroxilação seguida por conjugação com aminoácidos ou glucose (WSSA, 2002).

Ao longo do tempo, as populações microbianas desenvolveram uma via alternativa e eficaz para a degradação deste xenobiótico em particular, que resulta na mineralização completa de 2,4-D. As aplicações sucessivas do herbicida seleccionam os micróbios que podem utilizar o herbicida como fonte de carbono para crescimento, o que lhes dá uma vantagem competitiva no solo. Por este motivo, o 2,4-D é actualmente formulado de modo a ter um tempo de semivida no solo relativamente curto e não se verificam quaisquer efeitos de arrastamento significativos para as culturas subsequentes. Tal constitui mais uma vantagem para a utilidade do herbicida 2.4- D.

Um dos organismos que tem sido investigado extensivamente devido à sua capacidade de degradar 2,4-D é Ralstonia eutropha (Streber et al., 1987). O gene que codifica a primeira etapa enzimática na via de mineralização é tfdA. Consultar patente U.S. 6 153 401 e N.° de acesso GENBANK M16730. TfdA catalisa a conversão do ácido 2,4-D em diclorofenol (DCP) através de uma 5 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ reacção pela dioxigenase dependente de a-cetoglutarato (Smejkal et al., 2001). O DCP apresenta baixa actividade herbicida comparativamente com 2,4-D. O TfdA tem sido utilizado em plantas transgénicas para conferir resistência a 2,4-D em plantas dicotiledóneas (e.g., algodão e tabaco) que são normalmente sensíveis a 2,4-D (Streber et al. (1989), Lyon et al. (1989), Lyon (1993) e patente U.S. 5 608 147).

Foi identificado um elevado número de genes do tipo tfdA que codificam proteínas capazes de degradar 2,4-D a partir do ambiente e foram depositados na base de dados Genbank. Muitos dos homólogos são semelhantes a tfdA (>85% de identidade de aminoácidos) e apresentam propriedades enzimáticas semelhantes a tfdA. Contudo, existem alguns homólogos que têm uma identidade com tfdA significativamente inferior (25-50%), mas apresentam os resíduos característicos associados a dioxigenases de Fe2+ de α-cetoglutarato dioxigenase. Assim, não são óbvias quais são as especificidades de substrato destas dioxigenases divergentes.

Um exemplo único de baixa homologia com tfdA (28% de identidade de aminoácidos) é rdpA de Sphingobium herbicidovorans (Kohler et al., 1999, Westendorf et al., 2002). Demonstrou-se que esta enzima catalisa a primeira etapa na mineralização de (R)-diclorprop (e outros ácidos (R)-fenoxipropiónicos) bem como de 2,4-D (um ácido fenoxiacético) (Westendorf et al., 2003). Sequências do gene rdpA foram publicadas com os números de acesso na Genebank AJ628859, AF516751 e AF516752. Embora os organismos que degradam ácido fenoxipropiónico tenham sido descritos já há algum tempo, até recentemente tinham sido feitos poucos progressos na caracterização desta via (Horvath et al., 1990). Uma complicação adicional na degradação de diclorprop é a estereoespecificidade (R vs. S) envolvida tanto na absorção (Kohler, 1999), como na oxidação inicial de diclorprop (Westendorf et al., 2003). A expressão heteróloga de rdpA noutros micróbios ou a transformação deste gene em plantas não foi até hoje relatada. A literatura tem-se focado principalmente nos homólogos mais próximos de tfdA que 6 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ degradam principalmente os ácidos fenoxiacéticos aquirais (e.g., 2,4-D) . 0 desenvolvimento de novas tecnologias de culturas tolerantes a herbicidas (HTC) tem tido sucesso limitado devido principalmente à eficácia, baixo custo e conveniência das GTC. Consequentemente tem-se registado uma elevada taxa de adopção de GTC entre os produtores. Tal criou um baixo incentivo para desenvolver novas tecnologias HTC.

As subestruturas químicas ariloxialcanoato são a entidade comum a muitos herbicidas comercializados incluindo as fenoxiauxinas (tais como 2,4-D e diclorprop) , piridiloxiauxinas (tais como fluroxipir e triclopir), inibidores de acetil-coenzima A-carboxilase (ACCase) de ariloxifenoxipropionatos (AOPP) (tais como haloxifop, quizalofop e diclofop) e inibidores de protoporfirinogénio oxidase IX de fenoxiacetato substituído em 5 (tais como piraflufeno e flumiclorac). No entanto, estas classes de herbicidas são todas bastante diferentes e não existe qualquer evidência na literatura actual de vias de degradação comuns entre estas classes químicas. WO 98/02562 divulga genes quiméricos que são utilizados para a geração de resistência em plantas a vários herbicidas incluindo inibidores de HPPD e EPSPS. A identificação de uma enzima multifuncional para a degradação de herbicidas que abranja modos múltiplos seria não só única como também valiosa como uma característica de HTC.

Sumário sucinto do invento São proporcionadas novas plantas que não só são resistentes a 2,4-D, mas também a herbicidas AOPP. Até agora não existia qualquer expectativa ou sugestão de que poderia ser produzida uma planta com ambas estas propriedades vantajosas através da introdução de um único gene. Estão também incluídas plantas que produzem uma ou mais enzimas do presente invento juntas, conjuntamente com um ou mais genes de resistência a herbicida, incluindo entre outros os genes de resistência a glifosato, imidazolinona e glufosinato, de modo 7 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ a proporcionar plantas tolerantes a herbicida compatíveis com um controlo de ervas daninhas mais alargado e robusto e opções de gestão de resistência a herbicida. 0 presente invento inclui adicionalmente métodos e composições que utilizam homólogos dos genes e proteínas aqui exemplificados. São proporcionadas plantas monocotiledóneas e dicotiledóneas tolerantes a 2,4-D, AOPP e a um ou mais herbicidas disponíveis comercialmente (e.g., glifosato, imidazolinonas, glufosinato, sulfonilureias, dicamba, bromoxinil e outros). Também se divulgam vectores compreendendo sequências de ácido nucleico responsáveis por tal tolerância a herbicida, bem como métodos de utilização de tais plantas tolerantes e combinações de herbicidas para controlo de ervas daninhas e prevenção de variações nas populações de ervas daninhas. O presente invento permite a utilização de novas combinações de herbicidas de novas formas. Além disso, o presente invento proporciona novos métodos para prevenir o desenvolvimento e controlar estirpes de ervas daninhas que são resistentes a um ou mais herbicidas, tal como glifosato. 0 presente invento permite novas utilizações de novas combinações de herbicidas e culturas, incluindo aplicação pré-plantio numa área que será utilizada para plantio imediatamente antes do plantio com sementes para plantas que de outra forma seriam sensíveis a esse herbicida (tal como 2,4-D).

Também se descreve a identificação de uma enzima que não só é capaz de degradar 2,4-D, mas que surpreendentemente também apresenta novas propriedades, que distinguem a enzima do presente invento das proteínas tfdA previamente conhecidas, por exemplo. Mais especificamente, o presente invento refere-se à utilização de uma enzima que é capaz de degradar tanto 2,4-D, como herbicidas AOPP, de uma forma enantioespecífica. Não se tinha reportado anteriormente qualquer enzima dioxigenase dependente de α-cetoglutarato com a capacidade de degradar herbicidas de diferentes classes químicas e modos de acção. A enzima e o gene preferidos para utilização de acordo com o presente invento denominam-se aqui AAD-1 8 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ (AriloxiAlcanoato-Dioxigenase). Esta constatação altamente inovadora é a base de oportunidades de significativas caracteristicas de HTC e marcadores seleccionáveis. Não existia qualquer motivação anterior para produzir plantas compreendendo um gene AAD-1 (de preferência um polinucleótido AAD-1 que tem uma sequência optimizada para expressão num ou mais tipos de plantas, tal aqui como exemplificado) e não existia qualquer expectativa de que tais plantas pudessem produzir eficazmente uma enzima AAD-1 para tornar as plantas resistentes não só a herbicidas fenoxiácidos (tal como 2,4-D), mas também a herbicidas AOPP (tais como quizalofop, haloxifop, et al.). Assim, o presente invento proporciona muitas vantagens que até agora não se pensava serem possíveis na especialidade.

Descreve-se também a identificação e utilização de genes que codificam enzimas ariloxialcanoato-dioxigenase que são capazes de degradar herbicidas fenoxiauxinicos e ariloxifenoxipropionatos. Também se divulgam métodos para rastrear proteínas quanto a estas actividades, incluindo a degradação de ácido 2,4-Diclorofenoxiacético, outros herbicidas auxínicos de fenoxialcanoato e herbicidas de ariloxifenoxipropionato, através de uma enzima AAD-1 expressa recombinantemente. O presente invento também inclui métodos para controlar ervas daninhas em que os referidos métodos compreendem aplicar um ou mais herbicidas AOPP, fenoxiauxina ou outros ariloxialcanoatos a plantas compreendendo um gene AAD-1. Também se proporcionam métodos para utilizar um gene AAD-1 como um marcador seleccionável para identificar células vegetais e plantas completas transformadas com AAD-1, opcionalmente incluindo um, dois ou mais genes exógenos inseridos simultaneamente nas células vegetais alvo. Os métodos do presente invento incluem seleccionar células transformadas que são resistentes a níveis adequados de um herbicida. Descrevem-se adicionalmente métodos para preparar um polipéptido com a actividade biológica de ariloxialcanoato-dioxigenase, por cultura de plantas e/ou células do presente invento. 9 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

Descrição sucinta das figuras A figura 1 apresenta um esquema geral para clivagem por dioxigenase de herbicidas fenoxiauxinicos ou AOPP. A figura 2 apresenta perda de actividade herbicida de uma solução de 2,4-D tratada com AAD-1. A figura 3 apresenta a perda de actividade herbicida de uma solução de haloxifop tratada com AAD-1. A figura 4 apresenta os fenóis que se antecipam produzir a partir de herbicidas representativos catalisados por AAD-1. A figura 5 apresenta a produção de 2,4-Diclorofenol por AAD-1 recombinante.

As figuras 6A e 6B apresentam a produção de fenol por AAD-1 recombinante a partir de vários substratos herbicidas. A figura 7 apresenta a velocidade da reacção de AAD-1 em função da concentração de substrato para quatro substratos herbicidas.

As figuras 8A e 8B demonstram que AAD-1 (v3) foi expresso igualmente em folhas de Arabidopsis de diferentes idades mas continuou a acumular-se ao longo dos 25 dias da experiência. As plantas que não foram pulverizadas com o herbicida 2,4-D (painel A) expressaram um pouco mais de AAD-1 (v3) do que as que foram pulverizadas (painel B) . As barras representam a média ± EPM de 5 folhas de 5 plantas diferentes, com a percentagem de expressão de AAD-1 (v3) normalizada para a proteina solúvel total. As barras claras representam as terceiras folhas jovens (N-3) recolhidas do topo, as barras escuras representam as 5.aS folhas mais velhas da parte inferior. 10 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

As figuras 9Α, 9Β e 9C apresentam as lesões nas plantas Arabidopsis após tratamento com 2,4-D. Trataram-se cada uma das quatro linhas diferentes com quatro doses diferentes de 2,4-D e classificaram-se as lesões 4 (painel A) e 14 (painel B) dias após tratamento. Determinou-se também a sua expressão de AAD-1 (v3) em folhas utilizando ELISA (painel C). Os resultados são a média ± EPM de cinco folhas de cinco plantas diferentes que receberam o mesmo tratamento. A figura 10 ilustra que Arabidopsis transformada com pDAB3230 (AAD-1 + EPSPS) apresenta um nível de tolerância a glifosato a 7 DAT >14 vezes ao tipo selvagem e linhas de Arabidopsis transformadas com controlo. A figura 11 apresenta a dose-resposta de suspensões de calos de milho a R-haloxifop. A figura 12 demonstra que para ci-halofop fenol 1 μΜ, o crescimento é ainda 76% relativamente ao controlo sem ci-halofop fenol. A figura 13 ilustra os dados de dose-resposta num evento transgénico, 3404-006, a haloxifop. A figura 14 apresenta as respostas de vários eventos de clones transformados com AAD-1 (v3) e não transformados a doses letais de dois herbicidas AOPP (haloxifop e quizalofop) aplicados como uma pulverização pós-emergência 1 semana antes. A figura 15 apresenta três diferentes linhagens T2 de transformações 3404 que foram pré-rastreadas com Liberty® para remover os nulos, que foram seleccionadas para comparar a sua tolerância a quizalofop relativamente à sua expressão de AAD-1. A expressão foi medida em 14 DAT (dados não apresentados) e em 30 DAT. A figura 16 apresenta milho transformado com AAD-1 (v3) tolerante a 8X a taxa de campo de quizalofop (Assure II) em condições de campo. 11 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ A figura 17 ilustra os dados de embriões de milho imaturos cultivados em meio contendo ci-halofop. A figura 18 apresenta uma análise de transferência "Western" de calos de soja transformados com o gene AAD-1 (V3) indicando que as células de calos expressam a proteína AAD-1 (v3). A figura 19 apresenta as curvas ajustadas às taxas de degradação de 2,4-D por AAD-2 (vl) relativamente a AAD-1 (vl). A figura 20 apresenta a resposta de Arabidopsis Ti transformada com AAD-1 v3 (optimizado para plantas) ou AAD-1 (v2) (nativo), AAD-2 {vl) (nativo) ou AAD-2 (v2) (optimizado para plantas) a uma gama de taxas de 2,4-D aplicadas pós-emergência. Cada vaso representa um evento de transformação individual no interior de cada família de genes Ti. A figura 21 apresenta análise de transferência "western" de plantas de Arabidopsis IÇ individuais transformadas com AAD-2 (vl) nativo. Tal demonstra que as plantas que expressam a proteína AAD-2 (vl) sofrem lesões graves com tratamentos com 2,4-D de 200 g ae (equivalentes ácidos)/ha, que normalmente causam poucas lesões a Arabidopsis transformada com AAD-1 (v2) nativo ou AAD-1 (v3) optimizado para plantas. Identifica-se a proteína AAD-2 no gel. Detectaram-se várias bandas de fundo em amostras transformadas com AAD-2 e transformadas com Pat/CrylF. A figura 22 mostra que a actividade relativa de AAD-2 (vl) nos substratos foi 2,4-D = diclorprop > (R,S)-haloxifop >> (R)-haloxifop.

Descrição sucinta das sequências SEQ ID NO:l é a sequência de um iniciador directo utilizado para amplificar o gene rdpA/AAD-1 (vl). 12 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ SEQ ID ΝΟ:2 é a sequência de um iniciador inverso utilizado para amplificar o gene rdpA/AAD-1 (vl). SEQ ID NO:3 é a sequência de nucleótidos de AAD-1 (vl) de Sphingobium herbicidovorans. SEQ ID NO:4 é a sequência de ácido nucleico do gene AAD-1 nativo com um local de restrição Notl interno removido. Este gene é denominado AAD-1 (v2). A sequenciação de ADN confirmou que foi gerado o produto de PCR correcto, mas efectuou-se uma alteração inadvertida no aminoácido n.° 212 de arginina para cisteina. SEQ ID NO:5 é uma sequência de ADN de AAD-1 (v3) "optimizado para plantas". Este "gene" codifica SEQ ID NO:11, que é igual à SEQ ID NO:9 excepto pela adição de um resíduo de alanina na segunda posição. O codão de alanina (GCT) adicional foi incluído para codificar um local Nco I (CCATGG) abrangendo o codão de iniciação ATG, para permitir as subsequentes operações de clonagem. SEQ ID NO: 6 ("rdpA (ncol) ") e SEQ ID NO: 7 ("3'saci") foram utilizadas para amplificar um fragmento de ADN utilizando o sistema de PCR Fail Safe (Epicenter). SEQ ID NO:8 é outro iniciador de PCR ("BstEII/Del Notl") que foi utilizado com o iniciador "3' Saci". SEQ ID NO:9 é a sequência de aminoácidos nativa codificada pelo gene AAD-1 (vl) de Sphingobium herbicidovorans. SEQ ID NO:10 é a sequência de aminoácidos codificada pela sequência de ADN AAD-1 (v2) de SEQ ID NO:4. SEQ ID NO:11 é a sequência de aminoácidos codificada pela sequência de ADN de AAD-1 (v3) optimizado para plantas de SEQ ID NO:5. 13 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ SEQ ID ΝΟ:12 é a sequência ADN do gene AAD-2 (vl) nativo. SEQ ID NO:13 é a sequência de aminoácidos da proteína AAD-2 (vl). SEQ ID NO:14 é um iniciador directo utilizado para amplificar ADN de AAD-2 (vl) para clonagem. SEQ ID NO:15 é um iniciador inverso utilizado para amplificar ADN de AAD-2 (vl) para clonagem. SEQ ID NO:16 é o iniciador directo Ml3. SEQ ID NO:17 é o iniciador inverso M13. SEQ ID NO:18 é um iniciador directo utilizado para amplificar ADN de AAD-2 (vl) para clonagem. SEQ ID NO:19 é um iniciador inverso utilizado para amplificar ADN de AAD-2 (vl) para clonagem. SEQ ID NO:20 é a proteína de soja EPSPS nativa. SEQ ID NO:21 é uma sequência de proteína de soja EPSPS duplamente mutada, contendo uma mutação no resíduo 183 (a treonina da proteína nativa é substituída por isoleucina) e no resíduo 187 (a prolina da proteína nativa é substituída por serina). SEQ ID NO:22 é a sequência de ADN desviada para soja que codifica a proteína EPSPS de SEQ ID NO:21. SEQ ID NO:23 é o iniciador Pat 5-3. SEQ ID NO:24 é o iniciador Pat 3-3. SEQ ID NO:25 é o iniciador directo AAD-1 PTU. SEQ ID NO:26 é o iniciador inverso AAD-1 PTU. 14

ΕΡ 2 308 977/PT SEQ ID NO:27 é o iniciador directo para PCR da região de codificação de AAD-1. SEQ ID NO:28 é o iniciador inverso para PCR da região de codificação de AAD-1. SEQ ID NO:29 é o nucleótido AAD-2 (v2) (optimizado para plantas). SEQ ID NO:30 é a sequência traduzida da proteína AAD-2 (v2). SEQ ID NO:31 é o fragmento "Southern" do iniciador directo de PCR AAD-1. SEQ ID NO:32 é o fragmento "Southern" do iniciador inverso de PCR AAD-1.

Descrição detalhada do invento O presente desenvolvimento de um gene de resistência a 2,4-D e subsequentes culturas resistentes proporciona excelentes opções para controlar espécies de ervas daninhas de folha larga, resistentes a glifosato (ou altamente tolerantes e com variação) para aplicações em cultura. O 2,4-D é um herbicida para folha larga de largo espectro, relativamente barato e robusto, que proporcionaria uma utilidade excelente para os produtores caso fosse possível proporcionar maior tolerância a culturas tanto de dicotiledóneas, como de outras monocotiledóneas. As culturas de dicotiledóneas transgénicas tolerantes a 2,4-D também teriam uma maior flexibilidade em termos de tempo e taxa de aplicação. Uma utilidade adicional de uma característica de tolerância a herbicida para 2,4-D seria a sua utilidade na prevenção de danos em culturas normalmente sensíveis devidos a arrastamento de 2,4-D, volatilização, inversão (ou outros fenómenos de movimentos externos), má aplicação, vandalismo e semelhantes. Um benefício adicional do gene AAD-1 é que, contrariamente a 15 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ todos os homólogos de tfdA caracterizados até à data, o AAD-1 é capaz de degradar os enantiómeros R (isómeros activos como herbicida) das fenoxiauxinas quirais (e.g., diclorprop e mecoprop) além das fenoxiauxinas aquirais (e.g., 2,4-D, MCPA, ácido 4-clorofenoxiacético). Consultar a tabela 1. Foram utilizadas várias misturas de diferentes combinações de fenoxiauxina globalmente para atacar espectros específicos de ervas daninhas e condições ambientais em várias regiões. A utilização do gene AAD-1 em plantas proporcionaria protecção contra um maior espectro de herbicidas fenoxiauxínicos, aumentando assim a flexibilidade e o espectro de ervas daninhas que pode ser controlado, protegendo de arrastamentos ou outras lesões externas dos herbicidas fenoxi para toda a gama de fenoxiauxinas disponíveis comercialmente.

Tabela 1. Fenoxiauxinas disponíveis comercialmente. A referência a herbicidas fenoxiauxínicos é feita em geral ao ácido activo, mas algumas são formuladas comercialmente como uma variedade de formulações dos ésteres correspondentes e estes são igualmente considerados como substratos para a enzima AAD-1 na planta, dado que em geral as esterases vegetais convertem estes ésteres nos ácidos activos na planta. Igualmente, também se pode referir o sal orgânico ou inorgânico correspondente do ácido correspondente. Quando se indicam herbicidas de ácido propiónico, sal ou éster quirais, as misturas racémicas (R,S) ou enantiómeros purificados opticamente (R ou S) são considerados os mesmos herbicidas para o objectivo de denominação destes herbicidas, embora possam corresponder números CAS diferentes aos compostos opticamente puros. As gamas de taxas de utilização possíveis podem ser como tratamentos sozinhos ou em combinação com outros herbicidas, tanto em utilizações em cultura como em não cultura. 16 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

Tabela 1. Fenoxiauxinas disponíveis comercialmente. Nome químico n. 2 CAS Gamas de taxa de utilização possíveis (g ae/ha) Gamas de taxa de utilização preferidas (g ae/ha) Estrutura 2, 4-D 94-75-7 25 - 4000 280 - 1120 C1Y^N V/X / o—ch2—c Cl OH 2,4,5-T 93-76-5 25 - 4000 25 - 4000 L-l —ch2—é Cl \>H 4-CPA 122-88-3 25 - 4000 25 - 4000 ΎΊ ch2—c \lH 3,4-DA 588-22-7 25 - 4000 25 - 4000 “XX , Cl 0—ch2—c \ OH MCPA 94-74-6 25 - 4000 125 - 1550 "y CHi o—ch2—c OH Diclorprop 120-36-5 25 - 12000 100 - 2240 Xjl th· /° —CH—d Cl OH Mecoprop 7085-19-0 25 - 4000 250 - 3360 ch3 L r / u—CH—C noh 17 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

Tabela 1. Fenoxiauxinas disponíveis comercialmente. Nome químico n.fi CAS Gamas de taxa de utilização possíveis (g ae/ha) Gamas de taxa de utilização preferidas (g ae/ha) Estrutura Cloprop 101-10-0 25 - 4000 25 - 4000 ,Aj:y 4-CPP 3307-39-9 25 - 4000 25 - 4000 C'Y\ f· 0 Fenoprop 93-72-1 25 - 4000 25 - 4000 Cl aj, T I |H* ,0 \ Λ 1 / y Ό—CH—c r!i OH 3,4-DP 3307-41-3 25 - 4000 25 - 4000 XX r· p Cl 0—CH—C \ OH

Um benefício adicional do gene AAD-1 é a sua capacidade sem precedentes de degradar concomitantemente uma gama de compostos graminicidas comerciais e não comerciais da classe geral dos ariloxifenoxipropionatos (AOPP). Consultar a tabela 2. Este atributo pode permitir a utilização de qualquer de vários compostos AOPP em culturas transgénicas contendo AAD-1, em que a tolerância dessas culturas não permitia anteriormente a utilização nessas culturas. Estas incluirão mais usualmente culturas de gramíneas tais como milho, arroz, trigo, cevada, centeio, aveia, sorgo, espécies de turfa de estação quente e de estação fria, espécies de pasto graminóide e muitas outras, mas também poderia incluir culturas de dicotiledóneas em que a tolerância a AOPP (presente naturalmente na maioria das dicotiledóneas) não atinge valores 18 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ comercialmente aceitáveis para permitir a utilização de AOPP nas referidas culturas de dicotiledóneas.

Tabela 2. Compostos graminicidas AOPP listados pelos nomes usualmente aceites. A referência a herbicidas AOPP é feita geralmente ao ácido activo, mas a maioria é formulada comercialmente como qualquer de várias formulações de ésteres e estes são igualmente considerados substratos para a enzima AAD-1 na plantas, dado que as esterases vegetais geralmente convertem estes ésteres nos ácidos activos na planta. Igualmente, a referência pode ser ao sal orgânico ou inorgânico correspondente do ácido correspondente. Quando se indicam herbicidas de ácido propiónico, sal ou éster quirais, as misturas racémicas (R,S) ou enantiómeros purificados opticamente (R ou S) são considerados os mesmos herbicidas para o objectivo de denominar estes herbicidas, embora possam corresponder números CAS diferentes aos compostos opticamente puros. As gamas de taxas de utilização possíveis podem ser como tratamentos sozinhos ou em combinação com outros herbicidas, tanto em utilizações em cultura como em não cultura.

Tabela 2. Compostos graminicidas AOPP listados pelos nomes usualmente aceites. Nome químico n.2 CAS Gamas de taxa de utilização possíveis (g ae/ha) Gamas de taxa de utilização preferidas (g ae/ha) Estrutura Clorazifop 72492-94-7 10-2000 10-2000 OH Clodinafop 105512-06-9 10-2000 20-200 _ l \1H Clofop 59621-49-7 10-2000 10-2000 OH Ci-halofop 122008-85-9 10-2000 105-560 19 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

Tabela 2. Compostos graminicidas AOPP listados pelos nomes usualmente aceites. Nome químico n.a CAS Gamas de taxa de utilização possíveis (g ae/ha) Gamas de taxa de utilização preferidas (g ae/ha) Estrutura Diclofop 71283-65-3 10-2000 280-2000 ^"XX r f ^ N0—CH—C VCH Fenoxaprop 66441-23-4 10-2000 20-200 ^0—c—c H Fentiaprop 95721-12-3 10-2000 10-2000 ”O>XX r, ^0—CH—C Fluazifop 69335-91-7 10-2000 25-420 i 'oH Haloxifop 69806-40-2 10-2000 20-600 i \>H Isoxapirifop 87757-18-4 10-2000 30-240 "RXl r, ^0—CH—C "D Metamifop 256412-89-2 10-2000 35-280 ^ Xx nq—c—c i \l—CH, x Propaquizafop 111479-05-1 10-2000 30-240 J WCHj—CHj—0N j—tu, Quizalofop 76578-14-8 10-2000 20-240 XXjv 1 \ i OH Trifop 58597-74-4 10-2000 10-2000 ’~^TX r, ^O—CH—C OH 20 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

Identificou-se agora um único gene (AAD-1) que, quando modificado por engenharia genética para expressão em plantas, tem as propriedades que permitem a utilização de herbicidas fenoxiauxinicos em plantas em que nunca existiu tolerância inerente ou em que esta não era suficientemente elevada para permitir a utilização destes herbicidas. Adicionalmente, o AAD-1 pode proporcionar protecção na planta contra herbicidas AOPP quando a tolerância natural também não era suficiente para permitir selectividade. As plantas contendo apenas AAD-1 podem ser agora tratadas sequencialmente ou misturadas em tanque com um, dois ou uma combinação de vários herbicidas fenoxiauxinicos. A taxa para cada herbicida fenoxiauxínico pode estar na gama de 25 a 4000 g ae/ha e mais tipicamente de 100 a 2000 g ae/ha para o controlo de um vasto espectro de ervas daninhas dicotiledóneas. Igualmente podem ser aplicados um, dois ou uma mistura de vários compostos graminicidas AOPP às plantas que expressam AAD-1 com risco reduzido de lesões pelos referidos herbicidas. A taxa para cada AOPP pode estar na gama de 10 a 2000 g ae/ha e mais tipicamente 20-500 g ae/ha para o controlo de um vasto espectro de ervas daninhas monocotiledóneas. As combinações destas diferentes classes químicas e de herbicidas com modos e espectros de acção diferentes no mesmo campo (quer sequencialmente, quer em combinação por mistura em tanque) deve proporcionar controlo da maioria das ervas daninhas potenciais para as quais se pretende controlo com herbicida. O glifosato é utilizado extensivamente porque controla um muito vasto espectro de ervas daninhas de folha larga e gramíneas. No entanto, a utilização repetida de glifosato em GTC e em aplicações fora de cultura tem seleccionado, e continuará a seleccionar, variações de ervas daninhas para espécies naturalmente mais tolerantes ou biotipos resistentes a glifosato. A mistura de parceiros herbicidas em tanque utilizados em taxas eficazes que proporcionam controlo da mesma espécie mas que têm diferentes modos de acção é prescrito pela maioria das estratégias de gestão de resistência a herbicida como um método para atrasar o aparecimento de ervas daninhas resistentes. A junção de AAD-1 21 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ com uma característica de tolerância a glifosato (e/ou com outras características de tolerância a herbicidas) pode proporcionar um mecanismo para permitir o controlo de espécies de ervas daninhas resistentes a glifosato (quer espécies de gramíneas com um ou mais herbicidas AOPP, quer espécies de ervas daninhas de folha larga com uma ou mais fenoxiauxinas) em GTC, permitindo a utilização de herbicida(s) glifosato, fenoxiauxina(s) (e.g., 2,4-D) e AOPP (e.g., quizalofop) selectivamente na mesma cultura. As aplicações destes herbicidas poderiam ser simultâneas numa mistura em tanque compreendendo dois ou mais herbicidas de diferentes modos de acção; aplicações individuais de composição de um único herbicida em aplicações sequenciais como pré-plantio, pré-emergência ou pós-emergência e desdobramento dos intervalos de aplicações desde 2 horas a 3 meses; ou alternativamente pode aplicar-se qualquer combinação de qualquer número de herbicidas representativos de cada classe química em qualquer altura no intervalo de 7 meses do plantio da cultura até à colheita da cultura (ou o intervalo pré-colheita para o herbicida individual, dependendo do que for mais curto). É importante ter flexibilidade no controlo de um vasto espectro de ervas daninhas gramíneas e de folha larga em termos de altura de aplicação, taxa de herbicidas individuais e capacidade para controlar ervas daninhas difíceis ou resistentes. As aplicações de glifosato numa cultura com uma junção do gene de resistência a glifosato/AAD-1 pode estar na gama de 250-2500 g ae/ha; o(s) herbicida(s) fenoxiauxinico (s) (um ou mais) poderiam ser aplicados a 25-4000 g ae/ha; e o(s) herbicida(s) AOPP (um ou mais) poderiam ser aplicados a 10-2000 g ae/ha. A(s) combinação(ões) óptima(s) e altura desta(s) aplicação(ões) dependerão da situação específica, espécie e ambiente e serão determinadas da melhor forma por um perito na especialidade do controlo de ervas daninhas e com o benefício da presente divulgação.

As formulações de herbicida (e.g., formulação em éster, ácido ou sal; ou concentrado solúvel, concentrado emulsionável ou líquido solúvel) e os aditivos da mistura em tanque (e.g., 22 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ adjuvantes ou agentes de compatibilidade) podem afectar significativamente o controlo de ervas daninhas de um determinado herbicida ou combinação de um ou mais herbicidas. Qualquer combinação destes com qualquer um dos produtos químicos herbicidas mencionados anteriormente encontra-se no âmbito deste invento.

Um perito na especialidade também perceberia o benefício de combinar dois ou mais modos de acção para aumentar o espectro de ervas daninhas controladas e/ou para o controlo de espécies naturalmente mais tolerantes ou espécies de ervas daninhas resistentes poder-se-ia também alargar a grupos químicos para os quais a tolerância a herbicida foi permitida em culturas por envolvimento humano (quer transgénica, quer não transgenicamente) além das GTC. De facto, podem juntar-se características que codificam resistência a glifosato (e.g., EPSPS, GOX, GAT de plantas ou bactérias resistentes), resistência a glufosinato (e.g., Pat, bar), resistência a herbicida que inibe acetolactato-sintetase (ALS) (e.g., imidazolinona, sulfonilureia, triazolopirimidina sulfonanilida, pirmidiniltiobenzoatos e outros grupos químicos = AHAS, Csrl, SurA, et al.), resistência a bromoxinil (e.g., Bxn), resistência a inibidores de enzima HPPD (4-hidroxifenil-piruvato-dioxigenase), resistência a inibidores de fitoeno-dessaturase (PDS), resistência a herbicidas que inibem o fotossistema II (e.g., psbA), resistência a herbicidas que inibem o fotossistema I, resistência a herbicidas que inibem protoporfirinogénio-oxidase IX (PPO) (e.g., PPO-1), resistência a herbicidas de fenilureia (e.g., CYP76B1), enzimas de degradação de dicamba (consultar, e.g., US 20030135879) e outros, sozinhos ou em combinações múltiplas, para proporcionar a capacidade de controlar ou evitar eficazmente as variações das ervas daninhas e/ou resistência a qualquer herbicida das classes supramencionadas.

Relativamente a herbicidas adicionais, alguns inibidores de ALS adicionais preferidos incluem as triazolopirimidinassulfonanilidas (tais como cloransulam-metilo, diclosulam, florasulam, flumetsulam, metosulam e 23 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ penoxsulam), pirimidiniltiobenzoatos (tais como bispiribac e piritiobac) e flucarbazona. Alguns dos inibidores de HPPD preferidos incluem mesotriona, isoxaflutola e sulcotriona. Alguns inibidores de PPO preferidos incluem flumiclorac, flumioxazina, flufenpir, piraflufen, flutiacet, butafenacil, carfentrazona, sulfentrazona e os difeniléteres (tais como acifluorfen, fomesafen, lactofen e oxifluorfen).

Adicionalmente, o AAD-1 sozinho ou junto com uma ou mais caracteristicas de HTC adicionais podem ser juntos com uma ou mais caracteristicas iniciais (e.g., resistência a insectos, resistência a fungos ou tolerância a stress, et al.) ou finais (e.g., rendimento aumentado, melhor perfil de óleos, melhor qualidade de fibra, et al.) adicionais. Assim, o presente invento pode ser utilizado para proporcionar um pacote agronómico completo de qualidade de cultura melhorada com a capacidade de controlar flexivelmente e com um custo eficaz quaisquer pestes agronómicas.

Descreve-se a identificação de uma enzima que não só é capaz de degradar 2,4-D, mas surpreendentemente também possui novas propriedades, que distinguem a enzima das proteínas tfdA previamente conhecidas, por exemplo. Embora esta enzima tenha muito baixa homologia com tfdA, os genes utilizados ainda podem ser na generalidade classificados na mesma família global de dioxigenases dependentes de α-cetoglutarato. Esta família de proteínas é caracterizada por três resíduos de histidina conservados num motivo "HX (D/E) X23-26 (T/S) X114-183HX10-13R" que compreende o local activo. As histidinas coordenam o ião Fe+2 no local activo que é essencial para a actividade catalítica (Hogan et al., 2000). As experiências preliminares de expressão in vitro aqui discutidas foram concebidas para auxiliar a seleccionar novos atributos.

Mais especificamente, o presente invento refere-se em parte à utilização de uma enzima que não só é capaz de degradar 2,4-D, mas também herbicidas AOPP. Não foi reportada anteriormente qualquer enzima dioxigenase dependente de α-cetoglutarato que tenha a capacidade de degradar herbicidas 24 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ de classes químicas e modos de acção diferentes. As enzimas e genes preferidos para utilização de acordo com o presente invento são aqui denominados genes e proteínas AAD-1 (AriloxiAlcanoato-Dioxigenase) .

Também se descreve a identificação e utilização de genes que codificam enzimas ariloxialcanoato-dioxigenase que são capazes de degradar herbicidas fenoxiauxínicos e ariloxifenoxipropionato, ácido 2, 4-Diclorofenoxiacético, outros herbicidas auxínicos fenoxialcanóicos e herbicidas ariloxifenoxialcanoatos por uma enzima AAD-1 expressa recombinantemente.

As proteínas têm ensaio positivo para conversão de 2,4-D em 2, 4-Diclorofenol ("DCP"; inactivo como herbicida) em ensaios analíticos e biológicos. As proteínas parcialmente purificadas do presente invento podem converter rapidamente 2,4-D em DCP (na gama de 50-100% de conversão) in vitro. Uma vantagem adicional que as plantas transformadas com AAD-1 proporcionam é que o(s) herbicida(s) parental(is) é(são) metabolizado(s) em formas inactivas, reduzindo assim o potencial para colheita de resíduos de herbicida no grão ou restolho. O presente invento inclui métodos para controlar ervas daninhas em que os referidos métodos compreendem a aplicação de um herbicida AOPP e/ou um herbicida fenoxiauxínico em plantas compreendendo um gene AAD-1.

Em vista destas constatações, proporcionam-se agora novas plantas que compreendem um polinucleótido que codifica este tipo de enzima. Até ao momento, não existia qualquer motivação para produzir tais plantas e não existia qualquer expectativa de que tais plantas pudessem produzir eficazmente esta enzima para tornar as plantas resistentes não só a herbicidas de ácidos fenoxi (tais como 2,4-D) mas também herbicidas AOPP. Assim, o presente invento proporciona muitas vantagens que até agora não se pensava serem possíveis na especialidade. 25 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

Podem adquirir-se e rastrear-se estirpes disponíveis ao público (depositadas em colecções de culturas tais como ATCC ou DSMZ), utilizando técnicas aqui divulgadas, quanto a novos genes. As sequências aqui divulgadas podem ser utilizadas para amplificar e clonar genes homólogos num sistema de expressão recombinante para rastreio e ensaios adicionais, de acordo com o presente invento.

Tal como discutido anteriormente na secção de antecedentes, um organismo que foi extensivamente estudado relativamente à sua capacidade de degradar 2,4-D é Ralstonia eutropha (Streber et al., 1987). O gene que codifica a primeira enzima na via de degradação é tfdA. Consultar patente U.S. 6 153 401 e N.° de acesso GENBANK M16730. O tfdA catalisa a conversão de ácido 2,4-D em DCP inactivo como herbicida através de uma reacção pela dioxigenase dependente de α-cetoglutarato (Smejkal et ai., 2001). O tfdA tem sido utilizado em plantas transgénicas para conferir resistência a 2,4-D em plantas dicotiledóneas (e.g., algodão e tabaco) normalmente sensíveis a 2,4-D (Streber et al., 1989; Lyon et al., 1989; Lyon et al., 1993). Foi identificado do ambiente um elevado número de genes do tipo tfdA que codificam proteínas capazes de degradar 2,4-D e foram depositadas no banco de dados Genbank. Muitos homólogos são bastante semelhantes a tfdA (>85% de identidade de aminoácidos) e têm propriedades enzimáticas semelhantes a tfdA. No entanto, foi presentemente identificada uma pequena colecção de homólogos de dioxigenase dependente de α-cetoglutarato que têm um baixo nível de homologia com tfdA.

RdpA de Sphingobium herbicidovorans (Westendorf et al., 2002) é um exemplo único com baixa homologia (28% de identidade de aminoácidos). Demonstrou-se que esta enzima catalisa a primeira etapa da mineralização de (R)-diclorprop (e outros ácidos (R)-fenoxipropiónicos), bem como de 2,4-D (um ácido fenoxiacético) (Westendorf et al., 2003). Embora o organismo responsável pela degradação de ácido fenoxipropiónico seja conhecido há algum tempo, têm sido feitos poucos progressos na caracterização desta via até 26 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ recentemente (Horvath et al., 1990). Uma complicação adicional na degradação de diclorprop é a estereoespecificidade (R vs. S) envolvida tanto na absorção (Kohler, 1999), como na oxidação inicial de diclorprop (Westendorf et al., 2003). Ainda não foi relatada a expressão heteróloga de rdpA noutros micróbios ou a transformação deste gene em plantas. A literatura tem-se focado principalmente em torno de homólogos próximos de tfdA que degradam principalmente ácidos fenoxiacéticos aquirais. Não existia qualquer expectativa anterior de que os genes rdpA ou AAD-1 pudessem ser expressos com sucesso em plantas, de modo a tornar as plantas resistentes a 2,4-D (sem mencionar a completamente surpreendente resistência a AOPP).

Tal como descrito mais detalhadamente nos exemplos seguintes, o rdpA foi clonado de Sphingobium herbicidovorans e ensaiado quanto a promiscuidade de substrato entre várias classes químicas de herbicidas. Tinha-se demonstrado anteriormente que esta enzima dioxigenase dependente de a-cetoglutarato purificada na sua forma nativa degrada 2,4-D e diclorprop (Westendorf et al., 2002 e 2003). No entanto, não se tinha relatado anteriormente que qualquer enzima dioxigenase dependente de α-cetoglutarato tivesse a capacidade de degradar herbicidas de diferentes classes químicas e modos de acção. O rdpA nunca tinha sido expresso em plantas, nem existia qualquer motivação para o fazer porque o desenvolvimento de novas tecnologias de HTC tem sido limitado largamente devido à eficácia, baixo custo e conveniência das GTC (Devine, 2005).

Tendo em consideração a nova actividade, as proteínas e genes do presente invento denominam-se aqui proteínas e genes AAD-1. Presentemente confirmou-se que AAD-1 degrada uma variedade de herbicidas auxínicos fenoxiacéticos e fenoxipropiónicos In vltro. No entanto, tal como relatado pela primeira vez aqui, verificou-se surpreendentemente que esta enzima também é capaz de degradar substratos adicionais da classe das moléculas de ariloxialcanoato. Os substratos com importância agronómica significativa são os herbicidas de 27 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ gramíneas ariloxifenoxipropionatos (ΑΟΡΡ). Esta divulgação altamente inovadora é a base das oportunidades de caracteristicas de culturas tolerantes a herbicidas (HTC) e marcadores seleccionáveis.

Relata-se aqui o vasto espectro de herbicidas AOPP para gramíneas que são substratos excelentes para AAD-1, bem como 2,4-D, diclorprop e outras fenoxiauxinas. Esta enzima é única na sua capacidade de apresentar actividade de degradação de herbicidas contra uma gama de herbicidas de largo espectro para folha larga (fenoxiauxinas) e uma gama de herbicidas de largo espectro para gramíneas altamente activos (AOPP).

Assim, o presente invento refere-se em parte à degradação do ácido 2,4-Diclorofenoxiacético, outros herbicidas auxínicos fenoxialcanóicos e herbicidas ariloxifenoxialcanoatos através de uma enzima ariloxialcanoato-dioxigenase (AAD-1) expressa recombinantemente. Também se divulga a identificação e utilizações de genes que codificam uma enzima de degradação ariloxialcanoato-dioxigenase (AAD-1) capaz de degradar herbicidas fenoxiauxínicos e ariloxifenoxipropionatos. A enzima permite expressão transgénica resultante em tolerância a combinações de herbicidas que controlariam praticamente todas as ervas daninhas de folha larga e gramíneas. AAD-1 pode servir como uma excelente característica de cultura tolerante a herbicida (HTC) para juntar a outras caracteristicas de HTC (e.g., resistência a glifosato, resistência a glufosinato, resistência a imidazolinona, resistência a bromoxinil, et al.) e caracteristicas de resistência a insectos (CrylF, CrylAb, Cry 34/45, et al.) por exemplo. Adicionalmente, o AAD-1 pode servir como um marcador seleccionável para auxílio na selecção de produtos de transformação primários de plantas modificadas por engenharia genética com um segundo gene ou grupo de genes.

Além disso, o gene microbiano foi re-manipulado de modo que a proteína é codificada por codões com uma desvio para utilização em plantas monocotiledóneas e dicotiledóneas 28 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ (hemicotiledóneas). Transformaram-se Arabidopsis, milho, tabaco, algodão, soja, colza e arroz com construções contendo AAD-1 e demonstraram-se elevados níveis de resistência tanto a fenoxiauxina, como a herbicidas AOPP. Tal como apresentado seguidamente no exemplo 6, o gene reconstruído exemplificado foi mais eficaz a conferir resistência a herbicida à planta, comparativamente com o gene bacteriano.

Os grupos oxialcanoato são úteis para introduzir uma funcionalidade ácida estável em herbicidas. O grupo ácido pode conferir mobilidade de floema por "captura ácida", que é um atributo desejável para acção herbicida e portanto poderia ser incorporado em novos herbicidas com objectivos de mobilidade. Aspectos do presente invento também proporcionam um mecanismo para criar HTC. Existem muitos herbicidas comerciais e experimentais potenciais que podem servir como substratos para AAD-1. Assim, a utilização dos presentes genes pode também resultar em tolerância a herbicida igualmente a estes outros herbicidas.

As características de HTC do presente invento podem ser utilizadas em novas combinações com outras características de HTC (incluindo entre outras tolerância a glifosato). Estas combinações de características dão origem a novos métodos para controlar espécies de ervas daninhas (e semelhantes), devido à resistência assim adquirida ou à tolerância inerente a herbicidas (e.g., glifosato). Assim, além das características de HTC, os novos métodos para controlar ervas daninhas utilizando herbicidas, para os quais se criou tolerância a herbicida através da referida enzima em culturas transgénicas, encontram-se no âmbito do invento.

Adicionalmente, as culturas tolerantes a glifosato cultivadas em todo o mundo são prevalecentes. Muitas vezes em rotação com outras culturas tolerantes a glifosato, o controlo de voluntários resistentes a glifosato pode ser dificil em culturas em rotação. Assim, a utilização das presentes características transgénicas, transformadas em conjunto ou 29 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ individualmente em culturas, proporciona uma ferramenta para controlar outras culturas HTC voluntárias.

Este invento pode ser aplicado no contexto da comercialização de uma caracteristica de resistência a 2,4-D em conjunto com as caracteristicas actuais de resistência a glifosato em soja, por exemplo. Assim, este invento proporciona uma ferramenta para combater variações de espécies de ervas daninhas de folha larga e/ou selecção de ervas daninhas de folha larga resistentes a herbicida, que culmina da extremamente elevada confiança dos produtores no glifosato para controlo de ervas daninhas em várias culturas.

Exemplifica-se a expressão transgénica dos presentes genes AAD-1 em, por exemplo, Arabidopsis, milho, tabaco, algodão, arroz, soja e colza. No entanto, o presente invento pode ser aplicado a quaisquer outros tipos desejáveis de plantas. A soja é uma cultura preferida para transformação de acordo com o presente invento. No entanto, este invento pode ser aplicado a múltiplas outras culturas de gramineas e outras culturas de folha larga. De igual modo, o 2,4-D pode ser utilizado mais positivamente em culturas de gramineas em que a tolerância a 2,4-D é moderada e uma tolerância aumentada através desta caracteristica proporcionaria aos produtores a oportunidade de utilizar 2,4-D em taxas mais eficazes e ao longo de um período de aplicação mais alargado, sem o risco de lesões na cultura.

Ainda adicionalmente, o presente invento utiliza um único gene que pode proporcionar resistência a herbicidas que controlam ervas daninhas de folha larga (auxinas) e gramineas (AOPP). Este gene pode ser utilizado em múltiplas culturas para permitir a utilização de um vasto espectro de combinações de herbicidas. 0 presente invento pode também controlar ervas daninhas resistentes a produtos químicos actuais e auxiliar no controlo de variações do espectro de ervas daninhas resultantes das práticas agronómicas actuais. 0 presente AAD-1 pode também ser utilizado em esforços para desintoxicar eficazmente substratos herbicidas adicionais em formas não herbicidas. Assim, o presente invento proporciona o 30 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ desenvolvimento de características de HTC adicionais e/ou tecnologia de marcadores seleccionáveis.

Independentemente ou em adição à utilização dos presentes genes para produzir HTC, os presentes genes podem também ser utilizados como marcadores seleccionáveis para seleccionar com sucesso produtos de transformação em culturas celulares, estufas e no campo. Há um elevado valor inerente para os presentes genes simplesmente como marcadores seleccionáveis para projectos de biotecnologia. A promiscuidade de AAD-1 para outros herbicidas auxinicos fenoxialcanóicos proporciona muitas oportunidades para utilizar este gene para objectivos de HTC e/ou de marcador seleccionável.

Um gene, aqui denominado AAD-1 (ariloxialcanoato-dioxigenase), foi clonado a partir de Sphingobium herbicidovorans (ATCC 700291) por PCR em pET 280-S/S (denominado pDAB 3203) e expresso em E. coli BL-21 Star. Quando este gene é sobre-expresso (por indução com IPTG 1 mM) e o lisado da cultura é combinado com a seguinte mistura reaccional: 2,4-D a 112,5 pg/ml, ácido ascórbico 1 mM, a-cetoglutarato 1 mM, Fe (NH4) 2 (SO4) 2 50 μΜ, a enzima produzida recombinantemente degrada 2,4-D em DCP inactivo como herbicida (tal como determinado por HPLC, espectrometria de massa, ensaio colorimétrico e ensaio de placas de Arabidopsis) . Adicionalmente, demonstrou-se que AAD-1 converte os seguintes herbicidas no seu fenol correspondente inactivo: diclorprop, mecoprop, haloxifop, diclofop e outros (consultar as tabelas 3 e 4) . 31 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

Tabela 3: Efeito de AAD-1 (vl) purificado em vários herbicidas auxinicos e análogos de auxina. Os substratos foram ensaiados a 1 mM em MOPS 25 mM pH 6,8, Fe2+ 200 μΜ, ascorbato de Na 200 μΜ, α-cetoglutarato 1 mM, utilizando 1 μg ou 10 μg (10X) de AAD-1 (vl) purificado por 0,16 ml de ensaio.

Tabela 3: Efeito de AAD-1 (vl) purificado em vários herbicidas auxinicos e análogos de auxina. ESTRUTURA ID de registo Composto AAD1 AAD1 (10x) ESTRUTURA ID de registo Composto AAD1 AADl (lOx) ytçr Cl 117613 (R, S) -diclorprop 0,566 2,594 398166 sesona 0,02 0,177 y^r H.C 188874 (R, S) -mecoprop 0,341 2, 085 ^yrÇra Cl 190252 0,008 0,211 HO ° jr Cl 83293 (R, S)-2-cloro, 4-fluorofenoxi-propionato 0,304 2,358 V JCYf HO Y** Cl 124988 0,007 0,058 11113675 (R, S)—3— aminodiclorprop 0,228 2,676 o 11263526 0,004 0,069 Mr 188476 0, 077 0,687 y^vçr 178577 0,003 0,021 yQçr Cl 192132 0, 064 0,204 a 178587 0,003 0,02 Cl 195517 2, 4-D 0, 034 0,383 M» a 188527 0,003 0,036 32 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

Tabela 4: Efeito de AAD-1 (vl) purificado em vários graminicidas AOPP e análogos e em cloquintocet. Os substratos foram ensaiados a 1 mM em MOPS 25 mM, pH 6,8, Fe2+ 200 μΜ, ascorbato de Na 200 μΜ, α-cetoglutarato 1 mM utilizando 1 μg ou 10 μg (10X) de AAD-1 (vl) purificado por 0,16 ml de ensaio.

Tabela 4. Efeito de AAD-1 (vl) purificado em vários graminicidas AOPP e análogos e em cloquintocet._ ESTRUTURA ID de registo Composto AADl AADl (lOx) ESTRUTURA ID de regist o Composto AADl AADl (10x) "°V 18706 (R)- quizalofop 0,43 2, 1 iWv » OH 460511 (R, S) -diclofop 0,155 1,663 Rojo 67131 <R,S)-fluazifop 0,427 2,17 Véu? Cl 25646 0,144 1,69 - 11044492 (R)- fenoxaprop 0, 408 0,597 •VoR 70222 (R, S) -clorazifop 0,128 1,584 x&f 34697 (R,S)-clodinofop 0,295 1, 98 p 199608 ci—halofop 0,114 1,26 14603 (R)-ci-halofop 0,222 1,989 •RoA a 43865 haloxifop-oxiacetato 0,004 0,053 VA 14623 (R,S)-ci-halofop 0,215 1,815 7466 (S)-ci-halofop 0,003 0,017 •Veuí 62942 (R, S) -fentiaprop 0, 199 1,055 có 1 204558 Cloquintocet 0 0,001 66905 haloxifop 0, 172 1,63

Proteínas (e isolados de fonte). O presente invento utiliza proteínas funcionais. "Actividade funcional" (ou "activa") significa aqui que as proteínas/enzimas para utilização de acordo com o presente invento têm a capacidade de degradar ou diminuir a actividade de um herbicida (sozinhas ou em combinação com outras proteínas). As plantas que produzem proteínas do presente invento de preferência produzirão "uma quantidade eficaz" da proteína de modo a que, quando a planta é tratada com um herbicida, o nível de expressão da proteína é suficiente para tornar a planta completa ou parcialmente resistente ou tolerante ao herbicida 33 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ (a uma taxa típica, salvo indicação em contrário; as taxas de aplicação típicas podem ser encontradas no bem conhecido Herbicide Handbook (Weed Science Society of America, Oitava edição, 2002), por exemplo). 0 herbicida pode ser aplicado em taxas que normalmente matariam a planta alvo, em taxas e concentrações de campo normais. (Devido ao presente invento, o nivel e/ou concentração podem ser opcionalmente superiores aos que foram previamente utilizados.) De preferência, as células vegetais e plantas do presente invento estão protegidas contra inibição de crescimento ou lesões causadas por tratamento com herbicida. As plantas e células vegetais transformadas do presente invento tornam-se de preferência resistentes ou tolerantes a um herbicida, tal como aqui discutido, o que significa que a planta ou células vegetais transformadas podem crescer na presença de quantidades eficazes de um ou mais herbicidas, tal como aqui discutido. As proteínas preferidas do presente invento têm actividade catalítica para metabolizar um ou mais compostos ariloxialcanoato. A transferência da actividade funcional para plantas ou sistemas bacterianos pode envolver uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos para uma proteína integrada num vector de expressão da proteína adequado ao hospedeiro onde se irá encontrar o vector. Uma forma de obter uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína com actividade funcional é isolar o material genético nativo das espécies bacterianas que produzem a proteína de interesse, utilizando a informação deduzida da sequência de aminoácidos da proteína, tal como aqui divulgada. As sequências nativas podem ser optimizadas para expressão em plantas, por exemplo, tal como discutido seguidamente em maior detalhe. Também se pode conceber um polinucleótido optimizado com base na sequência da proteína. O presente invento utiliza classes de proteínas com novas actividades, tal como aqui identificadas. Um modo de caracterizar estas classes de proteínas e os polinucleótidos que as codificam é definindo um polinucleótido pela sua capacidade de hibridar, numa gama de condições especificadas, 34 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ com uma sequência de nucleótidos exemplificada (o seu complementar e/ou uma sonda ou sondas derivadas de qualquer das cadeias) e/ou a sua capacidade de ser amplificado por PCR utilizando iniciadores derivados das sequências exemplificadas.

Existem muitos métodos para obter proteínas para utilização de acordo com o presente invento. Por exemplo, podem utilizar-se anticorpos para as proteínas aqui divulgadas para identificar e isolar outras proteínas de uma mistura de proteínas. Especificamente podem desenvolver-se anticorpos para partes das proteínas que são mais conservadas ou mais distintas comparativamente com outras proteínas relacionadas. Estes anticorpos podem então ser utilizados para identificar especificamente proteínas equivalentes com a actividade característica por imunoprecipitação, ensaio de imuno-absorção enzimática (ELISA) ou imunotransferência. Podem preparar-se facilmente anticorpos para as proteínas aqui divulgadas ou para proteínas equivalentes ou para fragmentos destas proteínas, utilizando procedimentos padrão. Os anticorpos incluem anticorpos monoclonais e policlonais, de preferência produzidos em resposta a uma proteína exemplificada ou sugerida.

Um perito na especialidade reconhecerá facilmente que as proteínas (e genes) do presente invento podem ser obtidas de uma variedade de fontes. Dado que se sabe que os operões de degradação completa de herbicidas são codificados em elementos transponíveis tais como plasmídeos, bem como integrados genomicamente, podem obter-se proteínas do presente invento a partir de uma vasta variedade de microrganismos, por exemplo, incluindo bactérias recombinantes e/ou de tipo selvagem. Podem ser utilizados como isolados fonte outros membros das ordens Firmicutes e Proteobacteria e géneros específicos com rdpA conhecidos, tais como Sphingobium, Delftia, Rodoferax e Comamonas, por exemplo.

Podem preparar-se mutantes de isolados bacterianos por procedimentos que são bem conhecidos na especialidade. Por 35 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ exemplo, podem obter-se mutantes não esporogénicos através de mutagénese de um isolado com etilmetanossulfonato (EMS). Os mutantes podem ser preparados utilizando luz ultravioleta e nitrosoguanidina por procedimentos bem conhecidos na especialidade.

Uma proteina "de" ou "obtenível de" qualquer dos presentes isolados aqui nomeada ou sugerida significa que a proteina (ou uma proteina semelhante) pode ser obtida do isolado ou de alguma outra fonte, tal como outra estirpe bacteriana ou uma planta. "Derivada de" também tem esta conotação e inclui proteínas obteníveis de um determinado tipo de bactéria que são modificadas para expressão numa planta, por exemplo. Um perito na especialidade reconhecerá facilmente que, dada a divulgação de um gene e proteina bacterianos, pode conceber-se racionalmente uma planta para produzir a proteína. Podem preparar-se preparações de anticorpo, sondas de ácido nucleico (ADN, ARN ou PNA, por exemplo) e semelhantes, utilizando o polinucleótido e/ou as sequências de aminoácidos aqui divulgadas e utilizadas para rastrear e recuperar outros genes relacionados de outras fontes (naturais).

Podem utilizar-se técnicas padrão de biologia molecular para clonar e sequenciar as proteínas e genes aqui descritos. Pode encontrar-se informação adicional em Sambrook et al., 1989 .

Polinucleótidos e sondas. Proporcionam-se adicionalmente sequências de nucleótidos que codificam proteínas para utilização de acordo com o presente invento. O presente invento proporciona adicionalmente métodos para identificar e caracterizar genes que codificam proteínas com a actividade herbicida pretendida. Numa concretização, o presente invento proporciona sequências de nucleótidos únicas que são úteis como sondas e/ou iniciadores de hibridação para técnicas de PCR. Os iniciadores produzem fragmentos de genes característicos que podem ser utilizados na identificação, caracterização e/ou isolamento de genes de interesse específicos. As sequências de nucleótidos do presente invento 36 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ codificam proteínas que sao distintas das proteínas anteriormente descritas.

Os polinucleótidos podem ser utilizados para formar "genes" completos para codificar proteínas ou péptidos numa célula hospedeira pretendida. Por exemplo, tal como o perito na especialidade reconhecerá facilmente, os presentes polinucleótidos podem ser colocados adequadamente sob controlo de um promotor num hospedeiro de interesse, tal como é bem conhecido na especialidade. O nível de expressão génica e expressão específica do momento/do tecido pode ter um grande impacto na utilidade do invento. Em geral, os maiores níveis de expressão de um gene de degradação resultam numa degradação mais rápida e mais completa de um substrato (neste caso de um herbicida alvo). Será desejável que os promotores expressem o gene alvo em níveis elevados, salvo se a expressão elevada tiver um consequente impacto negativo na saúde da planta. Tipicamente seria desejável que o gene AAD-1 fosse expresso constitutivamente em todos os tecidos para protecção completa da planta, em todos os estádios do crescimento. No entanto, poder-se-ia alternativamente utilizar um gene de resistência expresso vegetativamente; tal permitiria a utilização do herbicida alvo na cultura para controlo de ervas daninhas e controlaria subsequentemente a reprodução sexuada da cultura alvo por aplicação durante o estágio de floração.

Tal como é sabido pelos peritos na especialidade, o ADN existe tipicamente numa forma em cadeia dupla. Neste arranjo, uma cadeia é complementar à outra e vice-versa. À medida que o ADN é replicado numa planta (por exemplo), são produzidas cadeias complementares de ADN adicionais. A "cadeia codificante" é frequentemente utilizada na especialidade para referir a cadeia que se liga à cadeia anti-sentido. O ARNm é transcrito a partir da cadeia "anti-sentido" do ADN. A cadeia de "sentido directo" ou "codificante" tem uma série de codões (um codão é um conjunto de três nucleótidos que pode ser lido como uma unidade de três resíduos para especificar um determinado aminoácido) que pode ser lido como um quadro de leitura aberto (ORF) para formar uma proteína ou péptido de 37 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ interesse. De modo a produzir uma proteína in vivo, tipicamente uma cadeia de ADN é transcrita numa cadeia complementar de ARNm, que é utilizado como molde para a proteína. Assim, o presente invento inclui a utilização dos polinucleótidos exemplificados apresentados na listagem de sequências em anexo e/ou equivalentes, incluindo as cadeias complementares. Incluem-se no presente invento ARN e PNA (ácido nucleico peptídico) que são funcionalmente equivalentes às moléculas de ADN exemplificadas.

Podem cultivar-se isolados bacterianos em condições que resultam em elevada multiplicação do micróbio. Após tratamento do micróbio para obter ácido nucleico genómico em cadeia simples, pode pôr-se o ADN em contacto com os iniciadores do invento e sujeitar-se a amplificação por PCR. Os fragmentos característicos dos genes de interesse serão amplificados pelo procedimento, identificando assim a presença do(s) gene(s) de interesse.

Aspectos adicionais incluem genes e isolados identificados utilizando os métodos e as sequências de nucleótidos aqui divulgadas. Os genes assim identificados podem codificar proteínas de resistência a herbicidas do presente invento.

As proteínas e genes para utilização de acordo com o presente invento podem ser identificados e obtidos por utilização de sondas oligonucleotídicas, por exemplo. Estas sondas são sequências de nucleótidos detectáveis que podem ser detectadas devido a um marcador adequado ou podem tornar-se inerentemente fluorescentes, tal como descrito no pedido internacional WO 93/16094. As sondas (e os polinucleótidos do presente invento) podem ser ADN, ARN ou PNA. Além de adenina (A), citosina (C) , guanina (G) , timina (T) e uracilo (U; para moléculas de ARN), as sondas sintéticas (e polinucleótidos) do presente invento podem também ter inosina (uma base neutra capaz de emparelhar com todas as quatro bases; por vezes utilizada em vez de uma mistura de todas as quatro bases em sondas sintéticas) e/ou outras bases sintéticas (não naturais). Assim, quando aqui se refere um 38 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ oligonucleótido sintético degenerado e é utilizado genericamente "N" ou "η", "N" ou "n" pode ser G, A, T, C ou inosina. Os códigos de ambiguidade tal como aqui utilizados estão de acordo com as convenções de nomenclatura padrão da IUPAC da altura da apresentação do presente pedido (por exemplo, R significa A ou G, Y significa C ou T, etc.).

Tal como é bem conhecido na especialidade, caso uma molécula sonda hibride com uma amostra de ácido nucleico, pode assumir-se razoavelmente que a sonda e a amostra têm homologia/similaridade/identidade substancial. De preferência, é primeiro efectuada a hibridação do polinucleótido, seguida por lavagens em condições de rigor baixo, moderado ou alto, por técnicas bem conhecidas na especialidade, tal como descrito em, por exemplo, Keller, G.H., M.M. Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, New York, NY, p. 169-170. Por exemplo, tal como aí referido, podem conseguir-se condições pouco rigorosas lavando primeiro com SSC 2x (solução salina de citrato padrão)/SDS (dodecilsulfato de sódio) a 0,1% durante 15 minutos, à temperatura ambiente. Efectuam-se tipicamente duas lavagens. Um maior rigor pode conseguir-se baixando a concentração de sal e/ou aumentando a temperatura. Por exemplo, a lavagem descrita anteriormente pode ser seguida por duas lavagens com SSC 0,lx/SDS a 0,1% durante 15 minutos cada, à temperatura ambiente, seguida por lavagens subsequentes com SSC 0,lx/SDS a 0,1% durante 30 minutos cada, a 55°C. Estas temperaturas podem ser utilizadas com outros protocolos de hibridação e lavagem apresentados aqui e tal como é conhecido dos peritos na especialidade (pode utilizar-se SSPE como sal em vez de SSC, por exemplo) . Pode preparar-se SSC 2x/SDS a 0,1% por adição de 50 ml de SSC 20x e 5 ml de SDS a 10% a 445 ml de água. Pode preparar-se SSC 20x por combinação de NaCl (175,3 g/0,150 M) , citrato de sódio (88,2 g/0,015 M) e água, ajuste do pH a 7,0 com NaOH 10 N e seguidamente ajuste do volume a 1 litro. Pode preparar-se SDS a 10% por dissolução de 10 g de SDS em 50 ml de água autoclavada e seguidamente diluindo para 100 ml. 39 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ A detecção da sonda proporciona um meio para determinar de uma forma conhecida se a hibridação foi mantida. Tal análise da sonda proporciona um método rápido para identificar genes do presente invento. Os segmentos de nucleótidos utilizados como sondas de acordo com o invento podem ser sintetizados utilizando um sintetizador de ADN e procedimentos padrão. Estas sequências de nucleótidos podem também ser utilizadas como iniciadores de PCR para amplificar genes do presente invento.

As caracteristicas de hibridação de uma molécula podem ser usadas para definir polinucleótidos utilizados no presente invento. Assim, o presente invento inclui polinucleótidos (e/ou os seus complementares, de preferência os seus complementares completos) que hibridam com um polinucleótido aqui exemplificado. Ou seja, um modo de definir um gene (e a proteína que codifica), por exemplo, é pela sua capacidade de hibridar (em quaisquer das condições aqui especificamente divulgadas) com um gene conhecido ou especificamente exemplificado.

Tal como aqui utilizado, condições "rigorosas" para hibridação referem-se a condições que atingem o mesmo, ou cerca do mesmo, grau de especificidade de hibridação do que as condições utilizadas pelos presentes requerentes. Especificamente, a hibridação de ADN imobilizado em transferências de "Southern" com sondas especificas dos genes marcadas com 32P pode efectuar-se por métodos padrão (consultar, e.g., Maniatis et al. 1982) . Em geral, a hibridação e subsequentes lavagens podem ser efectuadas em condições que permitem a detecção de sequências alvo. Para sondas de genes de ADN em cadeia dupla, a hibridação pode ser feita durante a noite a 20-25°C abaixo da temperatura de fusão (Tm) do híbrido de ADN em SSPE 6x, solução de Denhardt 5x, SDS a 0,1%, ADN desnaturado a 0,1 mg/ml. A temperatura de fusão é descrita pela seguinte fórmula (Beltz et al. 1983):

Tm = 81,5sc + 16,6 Log[Na+] + 0,41(%G+C) - 0,61(% de formamida) - 600/comprimento da cadeia dupla em pares de bases 40 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

As lavagens podem ser tipicamente efectuadas da seguinte forma: (1) Duas vezes à temperatura ambiente durante 15 minutos em SSPE lx, SDS a 0,1% (lavagem de baixo rigor). (2) Uma vez a Tm-20°C durante 15 minutos em SSPE 0,2x, SDS a 0,1% (lavagem de rigor moderado).

Para sondas oligonucleotidicas, a hibridação pode ser efectuada durante a noite a 10-20°C abaixo da temperatura de fusão (Tm) do híbrido em SSPE 6x, solução de Denhardt 5x, SDS a 0,1%, ADN desnaturado a 0,1 mg/ml. A Tm para as sondas oligonucleotidicas pode ser determinada pela seguinte fórmula:

Tm(ôC) = 2 (numero de pares de bases T/A) + 4 (número de pares de bases G/C) (Suggs et al., 1981).

As lavagens podem ser tipicamente da seguinte forma: (1) Duas vezes à temperatura ambiente durante 15 minutos em SSPE lx, SDS a 0,1% (lavagem de baixo rigor). (2) Uma vez à temperatura de hibridação durante 15 minutos em SSPE lx, SDS a 0,1% (lavagem de rigor moderado).

Em geral, pode alterar-se o sal e/ou a temperatura para mudar o rigor. Com um fragmento de ADN marcado >70 bases ou próximo, de comprimento, podem utilizar-se as seguintes condições:

Baixo: SSPE lx ou 2x, temperatura ambiente

Baixo: SSPE lx ou 2x, 42°C

Moderado: SSPE 0,2x ou lx, 65°C

Elevado: SSPE 0,lx, 65°C. 41 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ A formação de cadeias duplas e a estabilidade dependem da complementaridade substancial entre as duas cadeias do híbrido e, tal como referido anteriormente, pode ser tolerado um certo grau de não emparelhamento. Assim, as sequências das sondas incluem mutações (tanto simples, como múltiplas) , deleções, inserções das sequências descritas e suas combinações, em que as referidas mutações, inserções e deleções permitem a formação de híbridos estáveis com o polinucleótido alvo de interesse. Podem produzir-se mutações, inserções e deleções numa determinada sequência polinucleotídica de várias formas e estes métodos são conhecidos dos peritos da especialidade. No futuro, pode passar-se a conhecer outros métodos.

Tecnologia de PCR. A reacção em cadeia pela polimerase (PCR) é uma síntese repetitiva, enzimática e utilizando iniciadores, de uma sequência de ácido nucleico. Este procedimento é bem conhecido e utilizado usualmente pelos peritos na especialidade (consultar Mullis, patentes U.S. 4 683 195, 4 683 202 e 4 800 159; Saiki et al., 1985). A PCR baseia-se na amplificação enzimática de um fragmento de ADN de interesse que é flanqueado por dois iniciadores oligonucleotídicos que hibridam com cadeias opostas da sequência alvo. Os iniciadores são de preferência orientados com as extremidades 3' apontando uma para a outra. Os ciclos repetidos de desnaturação por calor do molde, hibridação dos iniciadores com as suas sequências complementares e extensão dos iniciadores hibridados com uma ADN-polimerase resultam na amplificação do segmento definido pelas extremidades 5' dos iniciadores de PCR. O produto de extensão de cada iniciador pode servir como um molde para o outro iniciador, de modo que cada ciclo essencialmente duplica a quantidade de fragmento de ADN produzida no ciclo anterior. Tal resulta na acumulação exponencial do fragmento alvo específico, até vários milhões de vezes em algumas horas. Utilizando uma ADN-polimerase termoestável, tal como a polimerase Taq isolada da bactéria termofilica Thermus aquaticus, o processo de amplificação pode ser completamente automatizado. São conhecidas dos peritos na especialidade outras enzimas que podem ser utilizadas. 42 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

Podem utilizar-se sequências de ADN exemplificadas, ou seus segmentos, como iniciadores para amplificação por PCR. Na realização da amplificação por PCR, pode tolerar-se um certo grau de não emparelhamento entre o iniciador e o molde, tais como mutações, deleções e inserções (especialmente adições de nucleótidos na extremidade 5') dos iniciadores exemplificados. As mutações, inserções e deleções podem ser produzidas num determinado iniciador por métodos conhecidos pelos peritos na especialidade.

Modificação de genes e proteínas. Os presentes genes e proteínas podem ser fundidos com outros genes e proteínas para produzir proteínas quiméricas ou de fusão. Os genes e proteínas úteis de acordo com o presente invento incluem não só as sequências completas especificamente exemplificadas, mas também partes, segmentos e/ou fragmentos (incluindo fragmentos contíguos e internos e/ou deleções terminais comparativamente com as moléculas completas) destas sequências, suas variantes, mutantes, quimeras e fusões. As proteínas podem ter aminoácidos substituídos desde que retenham a actividade funcional pretendida. Os genes "variantes" têm sequências de nucleótidos que codificam as mesmas proteínas ou proteínas equivalentes com actividade equivalente ou semelhante a uma proteína exemplificada. As expressões "proteínas variantes" e "proteínas equivalentes" referem-se a proteínas com a mesma ou essencialmente a mesma actividade biológica/funcional contra as pestes alvo e sequências equivalentes tal como as proteínas exemplificadas. Tal como aqui utilizado, a referência a uma sequência "equivalente" refere-se a sequências com substituições, deleções, adições ou inserções de aminoácidos que melhoram ou que não afectam adversamente a actividade numa extensão significativa. Também se incluem nesta definição fragmentos que retêm actividade. Os fragmentos e outros equivalentes que retêm a mesma função ou actividade ou semelhante a um fragmento correspondente de uma proteína exemplificada encontram-se no âmbito do presente invento. Podem efectuar-se alterações, tais como substituições ou adições de aminoácidos, para vários objectivos, tais como aumentar (ou diminuir) a estabilidade da proteína às proteases 43 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ (sem diminuir materialmente/substancialmente a actividade funcional da proteína), remoção ou adição de um local de restrição e semelhantes. Podem ser facilmente construídas variações de genes utilizando técnicas padrão para fazer mutações pontuais, por exemplo.

Além disso, a patente U.S. 5 605 793, por exemplo, descreve métodos para gerar diversidade molecular adicional por utilização de re-montagem de ADN após fragmentação aleatória ou focada. Tal pode ser denominado "rearranjo" ("shuffling") de genes gue tipicamente envolve mistura de fragmentos (de um tamanho pretendido) de duas ou mais moléculas de ADN diferentes, seguido por ciclos repetidos de renaturação. Tal pode melhorar a actividade de uma proteína codificada por um gene de partida. O resultado é uma proteína quimérica com actividade melhorada, especificidade de substrato alterada, estabilidade da enzima aumentada, estereoespecificidade alterada ou outras características.

Pode desenhar-se e dirigir-se a um alvo o "rearranjo" após obtenção e exame das coordenadas atómicas 3D (tridimensionais) e da estrutura cristalina de uma proteína de interesse. Assim, pode dirigir-se um "rearranjo focado" a determinados segmentos de uma proteína que são ideais para modificação, tais como segmentos expostos à superfície e de preferência segmentos não internos que estão envolvidos no enrolamento da proteína e integridade estrutural 3D essencial.

Podem utilizar-se genes variantes para produzir proteínas variantes; podem utilizar-se hospedeiros recombinantes para produzir as proteínas variantes. Utilizando estas técnicas de "rearranjo de genes" ("gene shuffling") podem construir-se genes e proteínas equivalentes que compreendem quaisquer 5, 10 ou 20 resíduos (aminoácidos ou nucleótidos) contíguos de qualquer sequência aqui exemplificada. Tal como os peritos na especialidade sabem, as técnicas de rearranjo de genes, por exemplo, podem ser ajustadas para obter equivalentes com, por exemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 44 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ 44 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ 33, 34, 35 , 36, 37, 38, 39, 40, CO 49, 50 , 51, 52, 53, 54, 55, 63, 6 4, 65 , 66, 67, 68, 69, 70, CO > 79, 80 , 81, 82, 83, LO OD 00 93, 94, 95, , 96, 97, 98, 9 9, 100, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 287, 288, 289, 290 , 29] L, 292, , 41, 42, 43, 44, 45 , 46, 47, , 56, 57, 58, 59, 60 , 61, 62, , 71, 72, 73, 74, 75 , 76, 77, , 86, 87, 88, 89, 90 , 91, 92, 101, 102, 103 , 104, 105, 106, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 161, 162, 163, 164, 165, 16 6, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 2 96 ou 29 7 contíguos, em qualquer (ou os seus Podem também especialmente sondas e/ou 293, 294, 295, resíduos (aminoácidos ou nucleótidos) correspondentes a um segmento (do mesmo tamanho) das sequências exemplificadas ou sugeridas complementares (complementares totais)). utilizar-se segmentos com iguais tamanhos, aqueles para regiões conservadas, como iniciadores.

Podem preparar-se fragmentos exonucleases ou endonucleases acordo com procedimentos padrão se enzimas tais como Bal 31 ou para cortar sistematicamente destes genes. Adicionalmente codificam fragmentos activos enzimas de restrição. Podem ut: directamente fragmentos activos í de genes completos utilizando disponíveis comercialmente de . Por exemplo, podem utilizar-mutagénese dirigida ao local nucleótidos das extremidades podem obter-se genes que utilizando uma variedade de Llizar-se proteases para obter destas proteínas. 45 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

Divulgam-se aqui proteínas que podem ser truncadas e mesmo assim mantêm actividade funcional. "Proteína truncada" significa que uma parte de uma proteína pode ser cortada e a proteína truncada remanescente mantém e apresenta a actividade pretendida após clivagem. A clivagem pode ser conseguida por várias proteases. Além disso, podem produzir-se proteínas clivadas eficazmente utilizando técnicas de biologia molecular em que se removem bases do ADN que codificam a referida proteína, quer através de digestão com endonucleases de restrição, quer através de outras técnicas disponíveis ao perito na especialidade. Após truncagem, as referidas proteínas podem ser expressas em sistemas heterólogos, tais como E. coli, baculovírus, sistemas víricos baseados em plantas, levedura e semelhantes e seguidamente colocados em ensaios de insectos, tal como aqui divulgado, para determinar a actividade. É bem conhecido na especialidade que as proteínas truncadas podem ser produzidas com sucesso de modo a manterem actividade funcional, embora tenham menos do que a sequência completa inteira. Por exemplo, podem utilizar-se proteínas de B.t. numa forma truncada (proteína do núcleo) (consultar, e.g., Hõfte et al. (1989) e Adang et al. (1985)). Tal como aqui utilizada, a expressão "proteína" pode incluir truncagens activas funcionalmente.

Em alguns casos, especialmente para a expressão em plantas, pode ser vantajoso utilizar genes truncados que expressam proteínas truncadas. Os genes truncados preferidos codificarão tipicamente 40, \—1 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63 64, 65, 6 6, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 9 8 ou 99 % da proteína completa «

Determinadas proteínas foram aqui especificamente exemplificadas. Dado que estas proteínas são meramente exemplos de proteínas, deverá ser óbvio que as proteínas variantes ou equivalentes (e as sequências de nucleótidos que codificam os seus equivalentes) têm a mesma actividade ou actividade semelhante às proteínas exemplificadas. As 46 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ proteínas equivalentes terão similaridade de aminoácidos (e/ou homologia) com uma proteína exemplificada. A identidade de aminoácidos será tipicamente pelo menos 60%, de preferência pelo menos 75%, com maior preferência pelo menos 80%, ainda com maior preferência pelo menos 90% e pode ser pelo menos 95%. As proteínas preferidas podem também ser definidas em termos de gamas mais especificas de identidade e/ou similaridade. Por exemplo, a identidade e/ou similaridade pode ser de 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% comparativamente com uma sequência aqui exemplificada ou sugerida. Pode utilizar-se qualquer número listado anteriormente para definir os limites superior e inferior.

Salvo indicação em contrário, tal como aqui utilizada, a percentagem de identidade e/ou similaridade de sequência de dois ácidos nucleicos é determinada utilizando o algoritmo de Karlin e Altschul, 1990, modificado como em Karlin e Altschul 1993. Este algoritmo está incorporado nos programas NBLAST e XBLAST de Altschul et ai., 1990. As buscas de nucleótidos BLAST são efectuadas com o programa NBLAST, pontuação = 100, comprimento de palavra = 12. Pode utilizar-se Gapped BLAST tal como descrito em Altschul et al., 1997. Quando se utilizam os programas BLAST e Gapped BLAST, utilizam-se os parâmetros pré-estabelecidos dos programas respectivos (NBLAST e XBLAST). Consultar a página da internet de NCBI/NIH. Para obter alinhamentos com hiatos para objectivos de comparação, utilizou-se a função AlignX do Vector NTI Suite 8 (InforMax, Inc., North Bethesda, MD, E.U.A.), utilizando os parâmetros pré-estabelecidos. Estes são: uma penalização por abertura de hiato de 15, uma penalização por extensão de hiato de 6,66 e uma gama de penalização de separação de hiato de 8.

Também se podem alterar várias propriedades e características tridimensionais da proteína sem afectar adversamente a actividade/funcionalidade da proteína. Podem ser toleradas/efectuadas substituições de aminoácidos 47 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ conservativas para não afectar adversamente a actividade e/ou a configuração tridimensional da molécula. Os aminoácidos podem ser divididos nas seguintes classes: não polares, polares neutros, básicos e ácidos. As substituições conservativas em que um aminoácido de uma classe é substituído por outro aminoácido do mesmo tipo estão no âmbito do presente invento, desde que a substituição não seja negativa para a actividade biológica do composto. A tabela 5 apresenta uma listagem de exemplos de aminoácidos pertencentes a cada classe.

Tabela 5 Classe de aminoácido Exemplos de aminoácidos Não polar Polar neutro Ácido Básico Ala, Vai, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gin Asp, Glu Lys, Arg, His Em alguns casos, também se podem fazer substituições não conservativas. No entanto, as substituições preferidas não prejudicam significativamente a actividade funcional/biológica da proteína.

Tal como aqui utilizado, uma referência a polinucleótidos "isolados" e/ou proteínas "purificadas" referem-se a estas moléculas quando não estão associadas com outras moléculas com as quais se encontrariam na natureza. Assim, a referência a "isolado" e/ou "purificado" significa o envolvimento da "mão humana" tal como aqui descrito. Por exemplo, um "gene" bacteriano do presente invento colocado numa planta para expressão é um "polinucleótido isolado". De igual modo, uma proteína derivada de uma proteína bacteriana e produzida por uma planta é uma "proteína isolada".

Devido à degenerescência/redundância do código genético, várias sequências de ADN diferentes podem codificar as sequências de aminoácidos aqui divulgadas. Faz parte do conhecimento dos peritos na especialidade como criar sequências de ADN alternativas que codificam as mesmas, ou 48 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ essencialmente as mesmas, proteínas. Tal é também discutido mais detalhadamente em seguida na secção intitulada "Optimização da sequência para expressão em plantas."

Optimização da sequência para expressão em plantas. Para obter elevada expressão de genes heterólogos em plantas é geralmente preferido manipular novamente os genes de modo a que sejam expressos mais eficientemente nas células vegetais (no citoplasma) . O milho é uma destas planta em que pode ser preferível redesenhar o(s) gene(s) heterólogo(s) antes da transformação para aumentar o seu nível de expressão na referida planta. Assim, uma etapa adicional na concepção de genes que codificam uma proteína bacteriana é a re-manipulação de um gene heterólogo para expressão óptima, utilizando desvio de codões mais proximamente alinhado com a sequência da planta alvo, quer seja uma espécie dicotiledónea, quer seja monocotiledónea. As sequências também podem ser optimizadas para expressão em qualquer um dos tipos de plantas mais específicos aqui discutidos noutra secção.

Hospedeiros transgénicos. Os genes que codificam proteínas do presente invento podem ser introduzidos numa vasta variedade de hospedeiros microbianos ou vegetais. 0 presente invento inclui células vegetais transgénicas e plantas transgénicas. As plantas preferidas (e células vegetais) são milho, Arabidopsis, tabaco, soja, algodão, colza, arroz, trigo, relva e gramíneas de pastos e semelhantes. Também se podem preparar outros tipos de plantas transgénicas de acordo com o presente invento, tais como frutas, vegetais e árvores. Mais geralmente, podem utilizar-se dicotiledóneas e/ou monocotiledóneas em vários aspectos do presente invento.

Em concretizações preferidas, a expressão do gene resulta, directa ou indirectamente, na produção (e manutenção) intracelular da(s) proteína(s) de interesse. Podem tornar-se as plantas resistentes a herbicida desta forma. Tais hospedeiros podem ser referidos como hospedeiros e/ou células transgénicos, recombinantes, transformados e/ou transfectados. Em alguns aspectos deste invento (na clonagem e preparação do 49 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ gene de interesse, por exemplo), podem produzir-se células microbianas (de preferência bacterianas) e podem utilizar-se de acordo com técnicas padrão, com o beneficio da presente divulgação.

As células vegetais transfectadas com um polinucleótido podem ser regeneradas em plantas inteiras. Utilizando culturas celulares incluindo culturas de células de tecidos, culturas liquidas e culturas em placa. As sementes produzidas e ou utilizadas para gerar plantas são também divulgadas. Também se incluem outros tecidos e partes de plantas na divulgação e de igual modo métodos de produção de plantas ou células compreendendo um polinucleótido. Um método preferido para produzir tais plantas é por plantação de uma semente do presente invento.

Inserção de genes para formar hospedeiros transgénicos. Um aspecto do presente invento é a transformação/transfecção de plantas, células vegetais e outras células hospedeiras com polinucleótidos que expressam proteínas do presente invento. As plantas transformadas desta forma podem tornar-se resistentes a vários herbicidas com diferentes modos de acção.

Está disponível uma vasta gama de métodos para introduzir um gene que codifica uma proteína pretendida no hospedeiro alvo em condições que permitem a manutenção e expressão estáveis do gene. Estes métodos são bem conhecidos dos peritos na especialidade e são descritos, por exemplo, na patente U.S. 5 135 867.

Por exemplo, está disponível um elevado número de vectores de clonagem compreendendo um sistema de replicação em E. coli e um marcador que permite a selecção das células transformadas, para preparação para a inserção de genes estanhos em plantas superiores. Os vectores compreendem, por exemplo, pBR322, a série pUC, a série M13mp, pACYC184, etc. Assim, a sequência que codifica a proteína pode ser inserida no vector num local de restrição adequado. O plasmídeo resultante é utilizado para transformação em E. coli. 50 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

Cultivam-se as células de E. coli num meio nutriente adequado, seguidamente recolhem-se e lisam-se. O plasmídeo é recuperado por purificação separando-o do ADN genómico. Geralmente efectua-se análise de sequência, análise de restrição, electroforese e outros métodos bioquímicos-biologia molecular como métodos de análise. Após cada manipulação, a sequência de ADN utilizada pode ser digerida por restrição e ligada à sequência de ADN seguinte. Cada sequência plasmídica pode ser clonada no mesmo ou noutros plasmídeos. Dependendo do método de inserção dos genes pretendidos na planta, podem ser necessárias outras sequências de ADN. Caso de utilize, por exemplo, o plasmídeo Ti ou Ri para a transformação da célula vegetal, então pelo menos a fronteira direita, mas frequentemente a fronteira direita e a esquerda do T-ADN do plasmídeo Ti ou Ri, têm que ser ligadas como regiões flanqueantes dos genes a inserir. A utilização de T-ADN para a transformação de células vegetais tem sido investigada intensamente e está descrita em EP 120 516; Hoekema (1985); Fraley et al. (1986); e An et al. (1985).

Está disponível um elevado número de técnicas para inserir ADN numa célula hospedeira vegetal. Essas técnicas incluem transformação com T-ADN utilizando Agrobacterium tumefadens ou Agrobacterium rhizogenes como agente de transformação, fusão, injecção, biolística (bombardeamento de micropartícula), fios ("whiskers") de carbeto de silício, feixe de aerossol, PEG ou electroporação, bem como outros métodos possíveis. Caso se utilizem agrobactérias para a transformação, o ADN a ser inserido tem de ser clonado em plasmídeos especiais, nomeadamente num vector intermediário ou num vector binário. Os vectores intermediários podem ser integrados no plasmídeo Ti ou Ri por recombinação homóloga das sequências que são homólogas a sequências no T-ADN. O plasmídeo Ti ou Ri também compreende a região vir necessária para a transferência do T-ADN. Os vectores intermediários não podem replicar-se em agrobactérias. 0 vector intermediário pode ser transferido para Agrobacterium tumefaciens através de uma plasmídeo auxiliador (conjugação). Os vectores binários podem replicar-se tanto em E. coli, como em agrobactérias. 51 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

Estes compreendem um gene marcador de selecção e um ligante ou poliligante que se encontra enquadrado pelas regiões de fronteira direita e esquerda do T-ADN. Eles podem ser transformados directamente em agrobactérias (Holsters, 1978). A Agrobacterium utilizada como célula hospedeira compreende um plasmideo que transporta a região vir. A região vir é necessária para a transferência do T-ADN para a célula vegetal. Pode também conter T-ADN adicional. A bactéria assim transformada é utilizada para a transformação de células vegetais. Podem cultivar-se vantajosamente explantes de plantas com Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes para a transferência do ADN para a célula vegetal. Podem então regenerar-se plantas completas a partir do material da planta infectado (por exemplo, pedaços de folhas, segmentos de caule, raízes, mas também protoplastos ou células cultivadas em suspensão) num meio adequado que pode conter antibióticos ou biocidas para selecção. As plantas assim obtidas podem então ser ensaiadas quanto à presença de ADN inserido. Não existem requisitos especiais para os plasmídeos no caso de injecção e electroporação. É possível utilizar plasmídeos comuns, tais como, por exemplo, derivados de pUC.

As células transformadas crescem dentro das plantas da forma habitual. Podem formar células germinais e transmitir a(s) característica(s) transformada(s) às plantas da descendência. Estas plantas podem ser cultivadas da forma usual e cruzadas com plantas que têm os mesmos factores hereditários transformados ou outros factores hereditários. Os híbridos resultantes individuais têm as propriedades fenotípicas correspondentes.

Em algumas concretizações preferidas do invento, os genes que codificam a proteína bacteriana são expressos a partir de unidades de transcrição inseridas no genoma da planta. De preferência, as referidas unidades de transcrição são vectores recombinantes capazes de integração estável no genoma da planta e permitem a selecção das linhas de plantas transformadas que expressam o ARNm que codifica as proteínas. 52 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

Uma vez que o ADN inserido seja integrado no genoma, é ai relativamente estável (e não volta a sair). Normalmente contém um marcador seleccionável que confere às células vegetais transformadas resistência a um biocida ou a um antibiótico, tais como canamicina, G418, bleomicina, higromicina ou cloranfenicol, entre outros. Os marcadores seleccionáveis para plantas também proporcionam tipicamente resistência a vários herbicidas tais como glufosinato (PAT) , glifosato (EPSPS) , imazetiapir (AHAS) e muitos outros. 0 marcador utilizado individualmente deve assim permitir a selecção das células transformadas e não das células que não contêm o ADN inserido. Os(s) gene(s) de interesse são de preferência expressos por promotores constitutivos ou indutíveis na célula vegetal. Uma vez expresso, o ARNm é traduzido um proteínas, incorporando assim aminoácidos de interesse na proteína. Os genes que codificam uma proteína expressa nas células vegetais podem estar sob o controlo de um promotor constitutivo, um promotor específico de tecido ou um promotor indutíveis.

Existem várias técnicas para introduzir vectores recombinantes estranhos em células vegetais e para obter plantas que mantêm e expressam estavelmente o gene introduzido. Estas técnicas incluem a introdução de material genético que reveste micropartícuias directamente em células (patentes U.S. 4 945 050 de Cornell e 5 141 131 de DowElanco, actualmente Dow AgroSciences, LLC) . Além disso, as plantas podem ser transformadas utilizando tecnologia de Agrobacterium, consultar patente U.S. 5 177 010 de

Universidade de Toledo; 5 104 310 de Texas A&M; pedido de patente europeia 0131624B1; pedidos de patente europeia 120516, 159418B1 e 176 112 de Schilperoot; patentes U.S. 5 149 645, 5 469 976, 5 464 763 e 4 940 838 e 4 693 976 de

Schilperoot; pedidos de patente europeia 116718, 290799, 320500, todas de Max Planck; pedidos de patente europeia 604662 e 627752 e patente U.S. 5 591 616, de Japan Tobacco; pedidos de patente europeia 0267159 e 0292435 e patente U.S. 5 231 019, todas de Ciba Geigy, actualmente Syngenta; patentes U.S. 5 463 174 e 4 762 785, ambas de Calgene; e patentes U.S. 5 004 863 e 5 159 135, ambas de Agracetus. 53 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

Outras tecnologias de transformação incluem tecnologia de fios ("whiskers") . Consultar patentes U.S. 5 302 523 e 5 464 765, ambas de Zeneca, actualmente Syngenta. A tecnologia de electroporação também tem sido utilizada para transformar plantas. Consultar WO 87/06614 de Boyce Thompson Institute; patentes U.S. 5 472 869 e 5 384 253, ambas de Dekalb; e WO 92/09696 e WO 93/21335, ambas de Plant Genetic Systems. Além disso, também podem ser utilizados vectores viricos para produzir plantas transgénicas que expressam a proteína de interesse. Por exemplo, podem transformar-se plantas monocotiledóneas com um vector virai utilizando os métodos descritos em patente U.S. 5 569 597 de Mycogen Plant Science e Ciba-Geigy (actualmente Syngenta), bem como patentes U.S. 5 589 367 e 5 316 931, ambas de Biosource, actualmente Large Scale Biology.

Tal como mencionado anteriormente, a forma como a construção de ADN é introduzida na planta hospedeira não é crítica para este invento. Pode utilizar-se qualquer método que proporcione uma transformação eficiente. Por exemplo, descrevem-se aqui vários métodos para transformação de células vegetais e incluem a utilização de plasmídeos Ti ou Ri e semelhantes para efectuar transformação mediada por Agrobacterium. Em muitos casos, será desejável ter a construção utilizada para transformação limitada num ou em ambos os lados por fronteiras de T-ADN, mais especificamente a fronteira direita. Tal é particularmente útil quando a construção utiliza Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes como um modo de transformação, embora as fronteiras de T-ADN possam ser úteis com outros modos de transformação. Quando se utiliza Agrobacterium para transformação de células vegetais, pode utilizar-se um vector que pode ser introduzido no hospedeiro para recombinação homóloga com T-ADN ou os plasmídeos Ti ou Ri presentes no hospedeiro. A introdução do vector pode ser efectuada através de electroporação, cruzamento triparental e outras técnicas para transformar bactérias Gram-negativas que são conhecidas dos peritos na especialidade. A forma de transformação com vector no hospedeiro de Agrobacterium não é crítica para este invento. O 54 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ plasmídeo Ti ou Ri contendo o T-ADN para recombinação pode ser capaz ou incapaz de causar formação de galhas e não é critico para o referido invento desde que os genes vir estejam presentes no referido hospedeiro.

Em alguns casos, quando se utiliza Agrobacterium para transformação, a construção de expressão no interior das fronteiras de T-ADN será inserida num vector de amplo espectro tal como pRK2 ou seus derivados, tal como descrito em Ditta et al. (1980) e EP 0 120 515. Incluído na construção de expressão e no T-ADN estarão um ou mais marcadores, tal como aqui descrito, que permitem a selecção de Agrobacterium transformada e células vegetais transformadas. O marcador especifico utilizado não é essencial para este invento, sendo o marcador preferido dependente do hospedeiro e da construção utilizados.

Para a transformação de células vegetais utilizando Agrobacterium, podem combinar-se explantes e incubar-se com Agrobacterium transformada durante um tempo suficiente para permitir a sua transformação. Após transformação, matam-se as agrobactérias por selecção com o antibiótico adequado e cultivam-se as células vegetais com o meio selectivo adequado. Uma vez formados calos, pode incentivar-se a formação de rebentos por utilização de hormonas de plantas adequadas de acordo com métodos bem conhecidos na especialidade da cultura de tecidos de plantas e regeneração de plantas. No entanto, nem sempre é necessário uma etapa intermediária de calos. Após formação de rebentos, as referidas células vegetais podem ser transferidas para um meio que incentiva a formação de raízes completando assim a regeneração da planta. As plantas podem então ser cultivadas para formação de sementes e as referidas sementes podem ser utilizadas para estabelecer gerações futuras. Independentemente da técnica de transformação, o gene que codifica uma proteína bacteriana é de preferência incorporado num vector de transferência de genes adaptado para expressar o referido gene numa célula vegetal, incluindo no vector um elemento de regulação promotor de plantas, assim 55 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ como regiões de terminação de transcrição não traduzidas a 3', tais como Nos e semelhantes.

Além das numerosas tecnologias para transformar plantas, o tipo de tecido que se põe em contacto com os genes heterólogos pode também variar. Tal tecido incluiria, mas não se lhes limitam, tecido embriogénico, tecido de calos de tipo I, II e III, hipocótilo, meristema, tecido de raiz, tecidos para expressão em floema e semelhantes. Praticamente todos os tecidos de planta podem ser transformados durante desdiferenciação utilizando técnicas adequadas aqui descritas.

Tal como mencionado anteriormente, podem ser utilizados vários marcadores seleccionáveis, caso desejado. A preferência por um determinado marcador é deixada à discrição do perito, mas pode ser utilizado qualquer dos seguintes marcadores seleccionáveis conjuntamente com qualquer outro gene não listado aqui que possa funcionar como um marcador seleccionável. Estes marcadores seleccionáveis incluem, mas não se lhes limitam, o gene de aminoglicósido-fosfotransferase de transposão Tn5 (Aph II) que codifica resistência aos antibióticos canamicina, neomicina e G418, bem como os genes que codificam resistência ou tolerância a glifosato; higromicina; metotrexato; fosfinotricina (bialafos ou glufosinato); herbicidas imidazolinonas, sulfonilureias e triazolopirimidinas, tais como clorsulfurão; bromoxinil, dalapão e semelhantes.

Além de um marcador seleccionável, pode ser desejável utilizar um gene repórter. Em alguns casos pode utilizar-se um gene repórter com ou sem um marcador seleccionável. Os genes repórter são genes que não estão tipicamente presentes no organismo ou tecido recebedor e tipicamente codificam proteínas que resultam numa alteração fenotípica ou numa propriedade enzimática. Proporcionam-se exemplos de tais genes em Weising et ai., 1988. Os genes repórter preferidos incluem beta-glucuronidase (GUS) do locus uidA de E. coli, o gene de cloranfenicol-acetiltransferase de Tn9 de E. coli, a proteína verde fluorescente da medusa bioluminescente Aequorea victoria 56 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ e os genes de luciferase do pirilampo Photinus pyralis. Pode então efectuar-se um ensaio para detectar expressão do gene repórter num momento adequado após introdução do referido gene nas células recebedoras. Um destes ensaios preferido implica a utilização do gene que codifica beta-glucuronidase (GUS) do locus uidA de E. coli tal como descrito por Jefferson et al., (1987) para identificar células transformadas.

Além dos elementos de regulação promotores de plantas, podem utilizar-se eficazmente elementos de regulação promotores de várias fontes em células vegetais para expressar genes estranhos. Por exemplo, podem ser utilizados elementos de regulação promotores de origem bacteriana, tais como o promotor de octopina-sintetase, o promotor de nopalina-sintetase, o promotor de manopina-sintetase; promotores de origem virai, tais como o vírus do mosaico da couve-flor (35S e 19S), 35T (que é um promotor 35S re-manipulado, consultar a patente U.S. 6 166 302, especialmente o exemplo 7E) e semelhantes. Os elementos de regulação promotores de plantas incluem, mas não se lhes limitam, a subunidade pequena (ssu) de ribulose-1,6-bisfosfato (RUBP)-carboxilase, o promotor de beta-conglicinina, o promotor de beta-faseolina, o promotor ADH, promotores de choque térmico e promotores específicos de tecidos. Também podem estar presentes outros elementos, tais como regiões de ligação à matriz, regiões de ligação à estrutura, intrões, facilitadores, sequências de poliadenilação e semelhantes e assim podem melhorar a eficácia de transcrição ou integração do ADN. Tais elementos podem ou não ser necessários para a função do ADN, embora possam proporcionar melhor expressão ou funcionamento do ADN afectando a transcrição, a estabilidade do ARNm e semelhantes. Tais elementos podem ser incluídos no ADN tal como pretendido para obter um desempenho óptimo do ADN transformado na planta. Os elementos típicos incluem, mas não se lhes limitam, Adh-intrão 1, Adh-intrão 6, a sequência de comando da proteína do revestimento do vírus do mosaico de alfafa, sequências UTR de osmotina, a sequência de comando da proteína do revestimento do vírus do raiado fino do milho, bem como outros disponíveis para os peritos na especialidade. Podem também utilizar-se 57 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ elementos de regulação promotores constitutivos que dirigem assim a expressão génica continua em todos os tipos celulares e durante todo o tempo (e.g., actina, ubiquitina, CaMV 35S e semelhantes). Os elementos de regulação promotores específicos de tecidos são responsáveis pela expressão génica em tipos de células ou de tecidos específicos, tais como as folhas ou as sementes (e.g., zeína, oleosina, napina, ACP, globulina e semelhantes) e estes também podem ser utilizados.

Os elementos de regulação promotores podem também ser activos (ou inactivos) durante um determinado estágio do desenvolvimento da planta, bem como activos em tecidos e órgãos da planta. Exemplos destes incluem, mas não se lhes limitam, elementos de regulação promotores específicos do pólen, específicos do embrião, específicos da barba de milho, específicos da fibra de algodão, específicos da raiz, específicos do endosperma da semente ou específicos da fase vegetativa e semelhantes. Em determinadas circunstâncias pode ser desejável utilizar um elemento de regulação promotor indutiveis, que é responsável pela expressão de genes em resposta a um sinal específico, tais como: estímulo físico (genes de choque térmico), luz (RUBP-carboxilase), hormona (Em), metabolitos, produtos químicos (sensíveis a tetraciclina) e stress. Podem utilizar-se outros elementos de transcrição e de tradução desejáveis. São conhecidos na especialidade numerosos vectores de transferência de genes específicos de plantas.

Podem também ser utilizados sistemas baseados em ARN de vírus de plantas para expressar proteína bacteriana. Dessa forma, o gene que codifica a proteína pode ser inserido numa região promotora do revestimento de um vírus de planta adequado que infectará a planta hospedeira de interesse. A proteína pode ser então expressa proporcionando assim protecção da planta contra danos por herbicida. Descrevem-se sistemas baseados em ARN de vírus de plantas na patente U.S. 5 500 360 de Mycogen Plant Sciences, Inc. e nas patentes U.S. 5 316 931 e 5 589 367 de Biosource, actualmente Large Scale Biology. 58 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

Todas as patentes, pedidos de patente, pedidos provisórios e publicações aqui referidos ou citados são incorporados por referência na sua totalidade na medida em que não sejam inconsistentes com os ensinamentos explícitos do presente fascículo.

Os seguintes exemplos ilustram procedimentos para pôr o invento em prática. Estes exemplos não devem ser interpretados como limitativos. Todas as percentagens são em peso e todas as proporções de misturas de solventes são em volume, salvo indicação em contrário.

Exemplo 1 - Método para identificar genes que conferem resistência a 2,4-D na planta

Como meio para identificar genes que possuem actividades de degradação de herbicidas na planta, é possível explorar bases de dados públicas actuais, tais como NCBI (National Center for Biotechnology Information). Para iniciar o processo, é necessário ter uma sequência de um gene funcional já identificada que codifica uma proteína com as características pretendidas (i.e., actividade de a-cetoglutarato-dioxigenase). Esta sequência de proteína é então utilizada como entrada para o algoritmo BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (Altschul et al., 1997) para comparar com as sequências disponíveis depositadas em NCBI. Utilizando configurações pré-estabelecidas, esta busca resulta em mais de 100 sequências de proteínas homólogas a vários níveis. Estas variam entre altamente idênticas (85-98%) e identidade muito baixa (23-32%) ao nível dos aminoácidos. Tradicionalmente, apenas é de esperar que as sequências com elevada homologia mantenham propriedades semelhantes à sequência de entrada. Neste caso seleccionamos apenas as sequências com < 50% de homologia. Vamos exemplificar que a clonagem e expressão recombinante de homólogos com apenas 27% de conservação de aminoácidos pode ser utilizada para conferir níveis comerciais de resistências não só ao herbicida pretendido, mas também a substratos nunca antes ensaiados com estas enzimas. 59 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ PCR e clonagem do gene em pET. Identificou-se um único gene (rdpA) na base de dados NCBI (consultar a página da internet ncbi.nlm.nih.gov; n.° de acesso AF516752) como um homólogo com apenas 28% de identidade de aminoácidos com tfdA de Ralstonia eutropha. Determinou-se a percentagem de identidade traduzindo primeiro ambas as sequências de ADN, de rdpA e tfdA, depositadas na base de dados para proteínas, e seguidamente utilizando ClustalW no utilitário VectorNTI para fazer o alinhamento de sequências múltiplas.

Obteve-se a estirpe de Sphingobium herbicidovorans contendo o gene rdpA de ATCC (American Type Culture Collection estirpe n.° 700291). Reavivou-se a estirpe liofilizada de acordo com o protocolo de ATCC e armazenou-se a -80°C em glicerol a 20% para uso interno como estirpe bacteriana Dow DB 536. A partir desta solução-mãe congelada riscou-se uma placa em ágar-ágar de soja triptica com uma ansa de células para isolamento e incubaram-se a 28°C durante 3 dias.

Utilizou-se uma única colónia para inocular 100 ml de meio de soja triptica num matraz de três aletas de 500 ml, que foi incubado durante a noite a 28°C num agitador de modelo chão a 150 rpm. A partir de tal, isolou-se o ADN total com o protocolo para Gram-negativas do kit DNeasy da Qiagen (n.° cat. Qiagen 69504). Conceberam-se os seguintes iniciadores para amplificar o gene alvo a partir do ADN genómico, Directo: 5' TCT AGA AGG AGA TAT ACC ATG CAT GCT GCA CTG TCC CCC CTC TCC CAG CG 3' [(SEQ ID NO:l) (adiciona um local de restrição Xba I e um local de ligação ao ribossoma (RBS))] e Inverso: 5' CTC GAG TTA CTA GCG CGC CGG GCG CAC GCC ACC GAC CG 3' [(SEQ ID NO: 2) (adiciona um codão de paragem adicional e um local Xhol)].

Estabeleceram-se reacções de vinte microlitros da seguinte forma: 8 μΐ de MasterMix, 1 μΐ de cada iniciador (50 pmol/μΐ), 2.5 μΐ de gDNA, 7,5 μΐ de H20. Efectuou-se então a PCR nas

seguintes condições: 94°C 45 s, 52°C 1,5 minutos, 72°C 1.5 minutos, durante 30 ciclos, seguido por um ciclo final de 60 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ 72°C 5 minutos, utilizando o kit Master Taq de Eppendorf (n.° cat. Eppendorf 0032 002.250). O produto de PCR resultante de ~1 kb foi clonado em pCR 2.1 (n.° cat. Invitrogen K4550-40) seguindo o protocolo incluso, com a estirpe hospedeira E. coli TOP10F' quimicamente competente, para verificação da sequência de nucleótidos.

Repicaram-se dez das colónias brancas resultantes para 4 ml de meio Luria + canamicina (LB K) a 50 pg/ml e cultivaram-se durante a noite a 37°C com agitação. Purificaram-se os plasmideos de cada cultura utilizando o kit Promega Wizard Plus SV (n.° cat. Promega A1460) e seguindo o protocolo incluso. Efectuou-se sequenciação com o kit Quick Start de Beckman CEQ (n.° cat. Beckman Coulter 608120) utilizando iniciadores M13 directo (5' GTA AAA CGA CGG CCA GT 3') (SEQ ID NO: 16) e inverso (5' CAG GAA ACA GCT ATG AC 3') (SEQ ID NO:17), segundo as instruções dos fabricantes. A esta sequência génica (SEQ ID NO:3) e à sua proteína correspondente (SEQ ID NO:9) foi atribuída uma nova denominação geral para coerência interna AAD-1 (vl) (AriloxiAlcanoato-Dioxigenase).

Utilizando as enzimas de restrição correspondentes aos locais adicionados com os ligantes de iniciador (Xba 1, Xho 1) cortou-se o AAD-1 (vl) do vector pCR2.1 e ligou-se ao vector pET 280 resistente a estreptomicina/espectinomicina. Transformaram-se então os produtos ligados em E. coli TOP10F' e plaquearam-se em placas de ágar-ágar de meio Luria + estreptomicina e espectinomicina a 50 pg/ml (LB S/S). Para diferenciar entre ligações AAD-1 (vl):pET 280 e pCR2.1:pET 280 repicaram-se aproximadamente 20 colónias isoladas para 6 ml de LB S/S e cultivaram-se a 37°C durante 4 horas com agitação.

Cada cultura foi então plaqueada em placas LB K, que foram incubadas a 37°C durante a noite. Assumiu-se que as colónias que crescem em LB K têm o vector pCR2.1 ligado e foram rejeitadas. Isolaram-se plasmideos das restantes culturas, tal como anteriormente. Esta construção de expressão foi denominada pDAB 3203. 61 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

Exemplo 2 - Expressão e ensaio 2.1 - Análise de HPLC. O plasmídeo pDAB 3203 foi mantido congelado a -80°C em células TOPIOF' (Invitrogen) como a estirpe Dow Recombinante DR 1878. Para a expressão, transformou-se ADN plasmídico purificado da cultura TOPIOF' utilizando o kit Wizard da Promega (n.° cat. Fisher PR-A1460) em células BL-21 Star (DE3) (n.° cat. Invitrogen C6010-03) seguindo o protocolo do fabricante. Após transformação, plaquearam-se 50 μΐ das células em placas de ágar-ágar LB S/S e incubaram-se durante a noite a 37°C.

Na manhã seguinte, rasparam-se todas as colónias de toda a placa para 100 ml de LB num matraz de três aletas de 500 ml e incubaram-se a 37°C/200 rpm durante 1 h. Induziu-se então expressão génica com IPTG 1 mM e incubou-se durante 4 h a 30°C/200 rpm. Centrifugaram-se todos os 100 ml da cultura a 4000 rpm durante 20 min. Rejeitaram-se então os sobrenadantes e ressuspenderam-se os sedimentos em 10 ml de MOPS 50 mM. Estes foram então sujeitos a três ciclos de ultra-sons de 45 s para lisar as células. Seguidamente centrifugaram-se os lisados a 15 000 rpm para remover os resíduos celulares. Pipetou-se o sobrenadante e armazenou-se a 4°C. Para verificar a expressão recombinante, correu-se uma alíquota de 20 μΐ num gel de Tris glicina a 4-20% (n.° de cat. Invitrogen EC60255).

Após confirmação da expressão ensaiou-se a actividade enzimática da seguinte forma. Primeiro dessalinizou-se uma alíquota do extracto celular com um cartucho PD-10 (n.° de cat. Amersham 17-0435-01). Tal foi então utilizado para as reacções enzimáticas com herbicida subsequentes.

Para cada reacção, combinaram-se os seguintes: 2,4-D (125 pg/ml) , [ascorbato (1 mM) , ião ferroso (50 μΜ) , α-cetoglutarato (1 mM) em MOPS 100 mM] , extracto celular (100 μΐ). Esta reacção foi então incubada à temperatura ambiente durante 30 min, após os quais se parou a reacção com a adição de HC1 0,1 N até pH entre 2 e 3. Metade do volume 62 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ reaccional (-500 μΐ) foi posto de lado para o bioensaio, o volume restante foi extraido organicamente utilizando tubos de extracção de fase sólida (n.° de cat. Fisher 11-131-6), eluindo com 400 μΐ de acetonitrilo + TFA a 0,05%.

Os extractos foram então ensaiados em HPLC quanto à perda do pico de 2,4-D ou à presença de quaisquer picos adicionais resultantes da degradação ou modificação do 2,4-D. As condições para a HPLC foram: Luna 10 μ C18 (2) 250 x 4, 6 mm (n.° de cat. Phenomenex 00G-4253-E0) , corrido a ACN a 50% + TFA a 0,05%: H20 a 50% + TFA a 0,05% até ACN a 100% + TFA a 0,05% ao longo de 5 min. 2.2 - Bioensaios de ensaio de placas para degradação de herbicida.

Utilizaram-se bioensaios de plantas para determinar se a transformação enzimática do herbicida in vitro resultava numa perda concomitante da actividade herbicida. Dada a natureza selectiva dos herbicidas ensaiados (i.e., plantas monocotiledóneas controladas por herbicidas AOPP e plantas dicotiledóneas controladas por herbicidas auxinicos), utilizaram-se Agrostis palustris var. Pencross e Arabidopsis thaliana var. Columbia de tipo selvagem como espécies de ensaio de monocotiledóneas e dicotiledóneas, respectivamente. Cada uma das espécies é passível de germinação e cultura em pequenas placas de Petri.

Esterilizou-se a superfície de sementes de Arabidopsis durante 10 min. em lixívia comercial/água desionizada a 50% (v/v) com adição de 1 pL de Tween-20 como agente de molhagem, com agitação vigorosa (agitador de bancada a 250 rpm). Decantou-se a solução de lixívia dentro de uma hote estéril e enxaguou-se três vezes com água estéril. Esterilizou-se a superfície de sementes de Agrostis durante 20 minutos de uma forma semelhante.

Adicionaram-se vinte a trinta sementes esterilizadas, para cada espécie de ensaio utilizada, a meio de ensaio de placas 63 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ de ágar-ágar sólido estéril (PTM) [KNCh 2,5 mM, KH2PO4 2,5 mM, FeS04 50 mM, NaEDTA 10 mM (pH 8,0), MgS04 2 mM, Ca(N03) 2 2 mM, H3BO3 70 μΜ, MnCl2 14 μΜ, CuS04 0,5 μΜ, ZnS04 1 μΜ, NaMo04-2H20 0,2 μΜ, NaCl 10 μΜ, CoC12-H20 10 nM, sacarose a 0,8% (p/v) , agarose a 0,4% (p/v)] para o bioensaio em placas de Petri 60x15 mm (Falcon 1007). Modificou-se adicionalmente o PTM por adição de até seis taxas de padrões de herbicida de ensaio ou de diluições de solução de ensaio de herbicida-enzima de modo que os aumentos de concentração de quatro vezes abrangessem uma gama de taxas de três ordens de grandeza com a taxa GR5o (50% de redução de crescimento) aproximadamente no centro da gama.

Para as soluções de ensaio de herbicida-enzima, determinou-se a concentração máxima com base na concentração nominal antes de ocorrência de qualquer degradação enzimática subsequente. Espalharam-se homogeneamente as sementes por adição de 3 ml de PTM fundido com a mesma composição, agitou-se por rotação e deixou-se solidificar. Selaram-se as placas e mantiveram-se em condições estéreis numa câmara de cultura de baixa iluminação (24 h dia-1, 100 pE/m2s1, 23°C) durante 7 dias. Mediu-se o comprimento da raiz e da raiz + rebento em cinco plantas Arabidopsis e Agrostis, respectivamente, escolhidas aleatoriamente, comprimento médio (percentagem de controlo não tratado) relativamente a concentração nominal de herbicida e determinou-se GR50.

Este bioensaio foi utilizado para confirmar a perda de actividade herbicida em resultado de degradação por AAD-1 (vl) da cadeia lateral de oxialcanoatos de vários herbicidas agronomicamente relevantes. Em vários casos, o produto fenólico antecipado co-eluiu com o ácido parental em HPLC e o bioensaio serviu como um rastreio primário da degradação do herbicida. As tabelas 6 e 7 representam os substratos herbicidas ensaiados. 64 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

Tabela 6. Bioensaio de ensaio de placas de Arabídopsis para substratos fenoxi e piridiniloxialcanoato auxina comerciais._ _GR50 (nM)_

Produto Produto Produto Produto químico químico químico + químico + Razão ensaiado sozinho vector branco* AAD-1 vl GR5q1_Estrutura_

2,4-D 22 17 DCP >1000 nd

Diclorprop nd 30

Triclopir 255 1000

Fluroxipir 2200 2250 1825 <1

NH, * O vector branco representa um tratamento de lisado celular em que o vector de E. coli pET não tinha inserção de gene. ** A razão GR50 é uma medida da perda de actividade herbicida do tratamento de lisado que expressa enzima relativamente a tratamentos com vector branco. Considera-se que um número 1 2 é o limiar para detectar perda de actividade herbicida com este ensaio. substratos que

Estrutura

Tabela 7. Bioensaio de ensaio de placas de Agrostis para inibem ariloxifenoxialcanoatos ACCase comerciais. GR5q (nM)

Produto Produto Produto Produto químico químico químico + químico + Razão ensaiado sozinho vector branco* AAD-1 vl GR5q1

OH

Haloxifop-RS 28 21 520 25

F CH,

Cl

Diclofop-RS nd 20 130 7 cr

o OH * O vector branco representa um tratamento de lisado celular em que o vector de E. coli pET não tinha inserção de gene. 1 A razão GR50 é uma medida da perda de actividade herbicida do tratamento de lisado que expressa enzima relativamente a tratamentos com vector branco. Considera-se que um número > 2 é o limiar para detectar perda de actividade herbicida com este ensaio. 65 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ 2.3 - Resultados de HPLC.

Sabia-se da literatura que as enzimas dioxigenase nesta classe requerem α-cetoglutarato como co-substrato (para um esquema geral, consultar a figura 1) e ião ferroso para se ligar ao local activo. Outras experiências na literatura demonstraram que a adição de ascorbato aumentou a actividade enzimática mantendo o ferro no estado reduzido, evitando assim que a enzima seja degradada. Com base neste trabalho anterior, estabeleceram-se ensaios iniciais assumindo que a presente enzima funcionaria da mesma forma que os outros membros desta classe geral de enzimas.

Surpreendentemente, os resultados iniciais de HPLC demonstraram a presença de um novo pico a 6,1 minutos, além de um pico de 2,4-D reduzido a 5,5 min. Este novo pico não se encontrava presente no ensaio de controlo. Para uma identificação inicial do pico a 6,1 minutos, correu-se um controlo de DCP nas nossas condições de ensaio e previsivelmente este também eluiu a 6,1 minutos. A formação deste produto foi confirmada utilizando um ensaio colorimétrico para detectar fenóis (consultar exemplo 3.1), bem como espectrometria de massa. Tal como esperado, AAD-1 (vl) efectua uma reacção semelhante à dos outros membros desta classe de enzimas. No bioensaio, verificou-se que estas mesmas amostras têm uma perda praticamente completa de actividade herbicida de 2,4-D no ensaio de placas de Arabidopsis (figura 2). Independentemente das condições especificas do ensaio (i.e., incubações mais longas, mais enzima), apenas 50-75% do 2,4-D pôde ser degradado em DCP, tal como medido por HPLC. De facto, a indução mais prolongada das células de E. coli BL-21 com IPTG resultou apenas em menos enzima activa, embora se tenha expresso mais proteína recombinante total.

Após demonstrar a degradação de 2,4-D, ensaiaram-se substratos adicionais com substituições semelhantes no anel (i.e., oxiacetatos e oxipropionatos). Os primeiros compostos ensaiados foram os análogos de piridina, fluroxipir e 66 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ triclopir, que são piridiniloxiacetatos. Não se detectou qualquer actividade enzimática em qualquer destes substratos. Ensaios adicionais em vários análogos destes dois piridiniloxiacetatos com os grupos flúor ou amino removidos também não foram degradados. Curiosamente, no entanto, a adição de um flúor na posição 5 de 2,4-D resultou numa perda quase total de degradação enzimática (consultar a próxima secção para resultados adicionais).

Ensaiaram-se então os inibidores de ACCase, haloxifop e diclofop, utilizando as mesmas condições que com o 2,4-D. (Os correspondentes metabolitos fenólicos co-eluiram com o composto parental nas condições de HPLC utilizadas.) Os resultados do bioensaio para estas amostras mostraram perda de actividade herbicida tanto contra haloxifop (figura 3) , como diclofop. Estes resultados foram também confirmados pelo ensaio colorimétrico, que foi também utilizado para ensaiar uma amostra mais ampla destes compostos. 2.4 - Bioensaios de teste de placas para degradação de herbicida.

Os resultados dos testes de bioensaio corroboraram os resultados de HPLC iniciais que indicaram perda de 2,4-D parental após incubação de soluções de 2,4-D com extractos de AAD-1 (vl) recombinante não purificada (figura 2). Adicionalmente, a actividade herbicida do ácido fenoxipropiónico, diclorprop, foi também degradada eficazmente. A razão entre GR50 nominal para a solução herbicida + enzima e a solução apenas de herbicida foi utilizada como uma medida da perda de actividade do herbicida parental resultante da actividade enzimática. Uma razão de 2-3 correlaciona-se tipicamente com 50-75% de perda de actividade herbicida parental (tabela 6). Frequentemente não foi possível determinar GR5o após tratamento com enzima; de facto, não permaneceu qualquer actividade herbicida detectável.

Igualmente, a classe de herbicidas AOPP serviu como excelente substrato para AAD-1 (vl) tal como demonstrado pela 67 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ degradação praticamente completa da actividade graminicida utilizando o bioensaio de placas de Agrostis (figura 3 e tabela 7). Estes dados são significativos porque é a primeira observação relatada para qualquer membro desta classe de enzimas que é activa em herbicidas que não são fenoxiauxinas. As implicações são que esta enzima é suficientemente promíscua para utilizar produtos químicos com subestruturas semelhantes a fenoxialcanoatos, embora tenham modos de acção como herbicidas completamente diferentes.

Exemplo 3 - Ensaio in vitro da actividade de AAD-1 (vl) através de detecção colorimétrica de fenol 3.1 Ensaio de AAD-1 (vl).

Mediu-se a actividade da enzima AAD-1 (vl) por detecção colorimétrica do produto fenólico utilizando um protocolo de Fukumori e Hausinger (1993) (J. Biol. Chem. 268: 24311-24317) modificado para permitir desenvolvimento num formato de microplaca de 96 poços. O ensaio colorimétrico foi descrito para utilização na medição da actividade de dioxigenases que clivam 2,4-D e diclorprop para libertar o produto 2.4- diclorofenol. No entanto, potencialmente, podem ser libertados outros fenóis de herbicidas ariloxialcanoatos diferentes, tais como haloxifop e ci-halofop (consultar figura 4). Comparou-se o rendimento de cor de vários fenóis relativamente ao de 2,4-diclorofenol utilizando o método de detecção previamente descrito para avaliar quais dos produtos fenólicos podiam ser facilmente detectados. Ensaiaram-se os fenóis e os análogos de fenol a uma concentração final de 100 μΜ em 0,15 ml de MOPS 20 mM pH 6,75 contendo NH4(FeS04)2 200 μΜ, ascorbato de sódio 200 μΜ. Os fenóis derivados de haloxifop e ci-halofop tinham rendimentos de cor equivalentes ao de 2,4-Diclorofenol e portanto foram facilmente detectados. Os piridinóis derivados de fluroxipir e triclopir não produziram cor significativa. O rendimento de cor de 2.4- diclorofenol e do fenol de haloxifop foi linear e proporcional à concentração de fenol no ensaio até -500 μΜ.

Uma curva de calibração efectuada em condições padrão de 68 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ ensaio (160 μΐ de volume final de ensaio) indicou que se obtinha uma absorvância a 510 nm de 1,0 a partir de fenol 172 μΜ.

Efectuaram—se ensaios enzimáticos num volume total de 0,15 ml de MOPS 20 mM pH 6,75 contendo NH4FeS04 200 μΜ,

ascorbato de sódio 200 μΜ, α-cetoglutarato 1 mM, o substrato adequado (adicionado a partir de uma solução mãe 100 mM preparada em DMSO) e enzima. Os ensaios foram iniciados por adição do substrato ariloxialcanoato, enzima ou a- cetoglutarato no tempo zero. Após 15 minutos de incubação a 25°C, terminou-se a reacção por adição de 10 μΐ de EDTA de sódio 100 mM. Desenvolveu-se a cor por adição de 15 μΐ de tampão de pH 10 (3,09 g de ácido bórico + 3,73 g de KC1 + 44 ml de KOH 1 N) , 1,5 μΐ de 4-aminoantipirina a 2% e 1,5 μΐ de ferricianeto de potássio a 8%. Após 10 a 20 min, registou-se a absorvância a 510 nm num leitor de microplacas espectrofotométrico. Os brancos continham todos os reagentes excepto a enzima para contabilizar as pequenas contaminações ocasionais de alguns dos substratos com pequenas quantidades de fenóis. Posteriormente, os ensaios foram efectuados mais convenientemente consolidando as adições da seguinte forma: a reacção foi parada por adição de 30 μΐ de uma mistura 1:1:1 de EDTA Na 50 mM; tampão pH 10 e 4-aminoantipirina a 0,2%, seguidamente adicionando 10 μΐ de ferricianeto de potássio a 0, 8%. 3.2 - Extracção.

Actividade de AAD-1 (vl) recombinante expressa em Escherichia coli. Ressuspenderam-se sedimentos de células de E. coli em Tris 0,1 M, pH 7,4 + lisozima a 1 mg/ml (5 ml/células de 250 ml de cultura; 20 ml/células de 1 litro) à temperatura ambiente. Após cerca de 15 minutos com agitação ocasional, congelou-se a suspensão em azoto liquido e seguidamente descongelou-se. Adicionou-se ADNase numa concentração final de 0,02 mg/ml e MgCl2 1 mM. Após o extracto já não estar viscoso, centrifugou-se o extracto durante 15 min. Passou-se o sobrenadante numa coluna BioRad 10DG pré- 69 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ equilibrada com MOPS 20 mM pH 6,75 e armazenou-se o eluato em aliquotas a -70°C. Os ensaios foram efectuados com estes extractos dessalinizados, não purificados, ou com as enzimas purificadas.

Extraiu-se um sedimento celular de uma cultura de 250 ml de células de E. coli induzidas que expressam pDAB3203 contendo o gene que codifica AAD-1 (vl) e ensaiou-se usando os protocolos descritos anteriormente. A actividade de clivagem de 2,4-D no extracto de AAD-1 (vl) foi comparada com a de células de E. coli que expressam um vector sem AAD-1 (vl) utilizando 2,4-D 1 mM e apresenta-se na figura 5. A quantidade de 2,4-diclorofenol formado é claramente proporcional à quantidade de extracto adicionado ao ensaio, enquanto o extracto de controlo não contém qualquer actividade de clivagem de 2,4-D. A actividade deste extracto foi ensaiada em quatro herbicidas adicionais, (R,S)-diclorprop, (R,S)-mecoprop, (R,S)-haloxifop e (R,S)-diclofop em comparação com 2,4-D (todos a uma concentração final de 0,5 mM) utilizando 4 μΐ do extracto de E. coli por ensaio com um período de ensaio de 15 min. A figura 6A mostra que AAD-1 (vl) clivou todos os cinco herbicidas para obter um fenol, sendo a actividade relativa nos substratos diclorprop = mecoprop > diclofop > haloxifop > 2,4-D. Assim, AAD-1 (vl) tem actividade em herbicidas graminicidas ariloxifenoxipropionatos, bem como em fenoxiauxinas. O extracto de AAD-1 (vl) foi então ensaiado usando (R,S)-haloxifop racémico, sendo o enantiómero R de haloxifop e o enantiómero S de ci-halofop (ambos a 0,5 mM) substratos potenciais para avaliar a possível especificidade enantiomérica de AAD-1 (vl). Os resultados apresentam-se na figura 6B. A actividade da enzima em (R)-haloxifop foi equivalente à em (R,S)-haloxifop, enquanto não se verificou qualquer actividade no enantiómero S de ci-halofop indicando que AAD-1 (vl) tem especificidade R nos AOPP. 70 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

Exemplo 4 - Especificidade de substrato de AAD-1 (vl) 4.1 - Substratos adicionais de AAD-1 (vi).

Ensaiou-se a especificidade de substrato de AAD-1 (vl) para vários herbicidas comerciais e experimentais. Utilizou-se AAD-1 (vl) purificada a 1 ou 10 pg por 160 μΐ de ensaio e cada substrato foi ensaiado a 1 mM com um tempo de ensaio de 15 minutos. A tabela 3 apresenta A5i0 detectada após a acção de AAD-1 (vl) em vários herbicidas auxinicos ariloxialcanoatos e análogos de auxina. O melhor substrato ensaiado foi diclorprop, sendo mecoprop também clivado eficazmente. Dois outros fenoxipropionatos, os análogos 4-fluoro e 3-amino de diclorprop, também sofreram uma acção eficaz de AAD-1 (vl). AAD-1 (vl) produziu pequenas quantidades de fenol a partir de vários fenoxiacetatos incluindo 2,4-D. As taxas relativas nestes substratos são mais bem estimadas a partir dos ensaios que utilizam a quantidades maiores (10 pg) de AAD-1 (vl). A partir destes dados, 2,4-D é clivado por AAD-1 (vl), tal como dois fenoxialquilsulfonatos, X188476 e X398166 (sesona). A tabela 4 apresenta os dados para vários herbicidas graminicidas AOPP como substratos para AAD1 e também o protector cloquintocet. Todos os herbicidas AOPP comerciais ensaiados foram clivados eficazmente por AAD-1 (vl). Tal é uma constatação inesperada e aumenta grandemente a potencial utilidade desta enzima para conferir resistência a uma vasta variedade de herbicidas graminicidas em utilizações transgénicas, para além das auxinas. A AAD-1 (vl) apresenta a maior actividade em quizalofop (76% da taxa de diclorprop) e a actividade mais baixa em ci-halofop (27% da taxa de quizalofop, 21% da taxa de diclorprop). O análogo ariloxiacetato de haloxifop (X043865) foi clivado muito lentamente com apenas um pequeno aumento em A5io utilizando a quantidade maior (10 pg) de enzima. Tal é consistente com a maior actividade de AAD-1 (vl) verificada em fenoxipropionatos relativamente a auxinas fenoxiacetatos. A actividade mínima foi detectada em (S)-ci-halofop indicando que AAD-1 (vl) tem uma preferência significativa por enantiómeros R de substratos ariloxipropionato. De igual modo, não se verificou qualquer 71 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ actividade contra ο protector de quinolinoxiacetato, cloquintocet, o que é consistente com a observação de que AAD-1 (vl) prefere substratos ariloxipropionato relativamente a fenoxiauxinas.

Ensaiaram-se os substratos X11115427, X124987 e MCPA a 1 mM utilizando 27 pg de AAD-1 (vl) recombinante impura por ensaio. Todos os três compostos foram substratos para AAD-1 (vl) mas com eficácias relativas diferentes (tabela 8). X11115427 foi ligeiramente melhor como substrato do que 2,4-D (125% da taxa de 2,4-D) contrariamente ao análogo próximo 3-aminodiclorprop, que é ~7 vezes melhor do que 2,4-D como substrato (tabela 3) . A substituição 5-F parece diminuir a eficácia de X11115427 como substrato para AAD-1 (vl). As taxas de formação de produto a partir de 5-F-fenoxiacetato e de MCPA foram 32% e 55% da de 2,4-D, respectivamente.

Tabela 8: Efeito de AAD-1 (vl) em três substratos relativamente a 2,4-D. Ensaiaram-se os substratos tal como na tabela 6 a 1 mM utilizando um extracto de AAD-1 (vl) recombinante impuro de E. coli.

Tabela 8. Efeito de AAD-1 (vl) em três substratos relativamente a 2,4-D. ID de registo Estrutura molecular Composto A510 % 2,4-D 195517 s^° o •i? Ω 2, 4-D 0, 177 100 11115427 0 (R,S)-3-amino, 5-F-diclorprop 0,221 125 124987 yvÒ'”. cr 5-F, 2,4-D 0,056 32 192711 H,C MCPA 0,097 55 72 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ 4.2-Caracterizaçao cinética.

Determinaram-se os valores de Km e kcat de AAD-1 (vl) purificada (consultar exemplo 10) para quatro substratos herbicidas, (R)-diclorprop, (R)-haloxifop, (R)-quizalofop e 2,4-D em condições padrão de ensaio (MOPS 25 mM, pH 6,8; ascorbato Na 200 μΜ; Fe2+ 200 μΜ; α-cetoglutarato 1 mM; 25°C) . Ajustaram-se as curvas de dose-resposta utilizando o Grafit (Erithacus Software, RU) e apresentam-se os gráficos e as constantes derivadas na figura 7 e tabela 9, respectivamente. Os valores de Km para os quatro substratos foram praticamente semelhantes (75 - 125 μΜ) , mas os valores de kcat variaram significativamente. O (R)-diclorprop apresentou o valor de kcat mais elevado e o 2,4-D o mais baixo (10% do de (R) -diclorprop). Estes valores de kcat foram consistentes com a gama de valores verificados nos ensaios de especificidade de substrato apresentados na tabela 3 e tabela 4 dado que estes foram efectuados a concentrações de substrato (1 mM) elevadas (saturantes) .

Tabela 9: Constantes cinéticas para substratos de AAD-1 (vl). As constantes cinéticas foram derivadas dos dados na figura 7 utilizando ajuste com Grafit à equação de Michaelis-Menten.

Tabela 9. Constantes cinéticas para substratos AAD-1 (vl). Substrato κ« (μΜ) ± EP Vmax (μπιοί min-1 mg 1 AAD1) ± EP kcat (min"1) kcat/Km (min-1 mM-1) R-diclorprop 75 ± 10 0,79 ± 0,03 26,1 348 R-quizalofop 125 ± 20 0,57 ± 0,03 18,9 151 R-haloxifop 120 ± 54 0,34 ± 0,04 11,2 94 2, 4-D 96 ± 8 0,57 ± 0,00 2,7 28

Os valores relativos de Km e kcat para diclorprop e 2,4-D diferem significativamente dos publicados para a dioxigenase específica de R de Delftia acidovorans por Westendorf et al. (2003) (Acta Biotechnol. 23: 3-17). O valor publicado de kcat/Km para 2,4-D é 0,6% do de diclorprop, enquanto nos nossos estudos o valor de kcat/Km para 2,4-D é 8% do de diclorprop. Assim, neste estudo, AAD-1 (vl) é inesperadamente eficaz na catálise da clivagem de 2,4-D. Tal aumenta a sua potencial 73 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ utilidade para conferir tolerância diversificada a caracteristicas de herbicidas em aplicações transgénicas. 4.3 - Substratos adicionais para AAD-1 (vl).

Ensaiaram-se três substratos adicionais a 1 mM utilizando 27 pg de AAD-1 (vl) recombinante impura por ensaio; X11115427, X124987 e MCPA. Os resultados apresentam-se na tabela 8. Todos os três compostos foram substratos para AAD-1 (vl) mas com eficácias relativas diferentes. X11115427 foi apenas ligeiramente melhor (125%) como substrato do que 2,4-D. Contrariamente, o 3-aminodiclorprop foi >7 vezes melhor do que o 2,4-D como substrato (tabela 3). Assim, a substituição 5-F diminuiu significativamente a eficácia de X11115427 como substrato para AAD-1 (vl). Verificou-se um padrão semelhante com 5-F-2,4-D que é apenas 32% tão eficaz como substrato relativamente a 2,4-D. Neste ensaio, MCPA também foi menos eficaz como substrato de AAD-1 (vl) (55% relativamente a 2,4-D).

Exemplo 5 - Optimização de sequência para expressão em plantas 5.1 - Antecedentes.

Para obter expressão elevada de genes heterólogos em plantas, pode ser preferível re-manipular os referidos genes de modo a que sejam mais eficazmente expressos em células vegetais (no citoplasma). 0 milho é uma destas plantas em que pode ser preferível re-manipular o(s) gene(s) heterológo(s) antes da transformação para aumentar o seu nivel de expressão na referida planta. Assim, uma etapa adicional na concepção de genes que codificam uma proteína bacteriana é a re-manipulação de um gene heterólogo para expressão óptima.

Uma razão para re-manipular uma proteína bacteriana para expressão em milho é devida ao teor não óptimo de G+C do gene nativo. Por exemplo, o teor muito baixo de G+C de muitos genes bacterianos nativos (e consequente desvio para teores elevados de A+T) resulta na geração de sequências que mimetizam ou duplicam as sequências de controlo da planta que se sabe serem altamente ricas em A+T. A presença de algumas das sequências 74 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ ricas em Α+Τ no ADN do(s) gene(s) introduzido (s) na planta (e.g., regiões da caixa TATA normalmente encontradas em promotores génicos) pode resultar em transcrição aberrante do(s) gene(s). Por outro lado, a presença de outras sequências de regulação residentes no ARNm transcrito (e.g., sequências de sinal de poliadenilação (AAUAAA) ou sequências complementares a ARN nucleares pequenos envolvidos em splicing de pré-ARNm) pode levar a instabilidade de ARN. Assim, um objectivo da concepção de genes que codificam uma proteína bacteriana para expressão em milho, com maior preferência denominados como gene(s) optimizado(s) para plantas, é gerar uma sequência de ADN com um elevado teor de G+C; e de preferência uma próxima da dos genes de milho que codificam enzimas metabólicas. Outro objectivo da concepção de gene(s) optimizado(s) para plantas que codificam uma proteína bacteriana é gerar uma sequência de ADN na qual as modificações na sequência não prejudicam a tradução. A tabela 10 ilustra quão elevado é o teor de G+C no milho. Para os dados na tabela 10 extraíram-se as regiões de codificação dos genes de entradas de GenBank (edição 71) e as composições de bases foram calculadas utilizando o programa MacVectorTM (Accelerys, San Diego, Califórnia). Ignoraram-se as sequências de intrões nos cálculos.

Tabela 10: Compilação dos proteina em genes de milho teores cíg G + C dG regiões codificantes de Classe de proteínas .sup.a Gama de % G + C Média de % G + C.sup.b Enzimas metabólicas (76) 44,4-75,3 59, 0 ( .+- .8,0) Proteínas Estruturais (18) 48,6-70,5 63,6 ( .+- .6,7) Proteínas de regulação (5) 57,2-68,8 62, 0 ( .+- .4,9) Proteínas não caracterizadas (9) 41,5-70,3 64,3 (.+- .7,2) Todas as proteínas (108) 44,4-75,3 60, 8 (.+- .5,2) .sup.a Número de genes na classe apresentado entre parêntesis, .sup.b Desvio padrão apresentado entre parêntesis. .sup.c Média dos grupos combinados foi ignorada no cálculo da média

Devido à plasticidade proporcionada pela redundância/degenerescência do código genético (i.e., alguns aminoácidos são especificados por mais do que um codão) , a evolução dos genomas em diferentes organismos ou classes de 75 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ organismos resultou na utilização diferenciada de codões redundantes. Este "desvio de codões" ("codon bias") reflecte-se na composição média de bases das regiões de codificação da proteina. Por exemplo, os organismos com teores relativamente baixos de G+C utilizam codões com A ou T na terceira posição de codões redundantes, enquanto os que têm teores mais elevados de G+C utilizam codões com G ou C na terceira posição. Pensa-se que a presença de codões "minoritários" no interior de um ARNm pode reduzir a taxa de tradução absoluta desse ARNm, especialmente quando a abundância relativa do ARNt carregado correspondente ao codão minoritário é baixa. Uma extensão disto é que a diminuição da taxa de tradução por codões minoritários individuais seria pelo menos aditiva para codões minoritários múltiplos. Assim, os ARNm com teores relativamente elevados de codões minoritários teriam taxas de tradução correspondentemente baixas. Esta taxa seria reflectida por subsequentes baixos niveis da proteina codificada.

Em genes concebidos por engenharia genética que codificam uma proteina bacteriana para expressão em milho (ou outra planta, tal como algodão ou soja), determinou-se o desvio de codões da planta. 0 desvio de codões para o milho é a distribuição de codões estatística que a planta usa para codificar as suas proteínas e a utilização preferida de codões apresenta-se na tabela 11. Após determinar o desvio, determina-se a percentagem de frequência de codões do(s) gene(s) de interesse. Devem determinar-se os codões de primeira escolha preferidos pela planta, bem como a segunda, terceira e quarta escolha de codões preferidos, quando existem selecções múltiplas. Pode então conceber-se uma nova sequência de ADN que codifica a sequência amino da proteína bacteriana, mas a nova sequência de ADN difere da sequência de ADN bacteriana nativa (que codifica a proteína) pela substituição por codões da planta (primeira escolha, segunda escolha, terceira escolha ou quarta escolha) para especificar o aminoácido em cada posição na sequência de aminoácidos da proteína. A nova sequência é então analisada quanto a locais para enzimas de restrição que possam ter sido criados pela 76 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ modificação. Os locais identificados são modificados adicionalmente por substituição dos codões pelos codões preferidos de primeira, segunda, terceira ou quarta escolha. Outros locais na sequência que poderiam afectar a transcrição ou a tradução do gene de interesse são as junções exão:intrão (5' ou 3'), sinais de adição poli A ou sinais de terminação de ARN-polimerase. A sequência é analisada adicionalmente e modificada para reduzir a frequência de dupletos TA ou GC. Além dos dupletos, as sequências de blocos de G ou C que têm mais do que cerca de quatro resíduos iguais podem afectar a transcrição da sequência. Assim, estes blocos são também modificados por substituição dos codões de primeira ou segunda escolha, etc. pelo codão preferido da escolha seguinte.

Tabela 11. Codões de aminoácidos expressas em milho preferidos para proteínas Aminoácido Codão* Alanina GCC/GCG Cisteína TGC/TGT Ácido aspártico GAC/GAT Ácido glutâmico GAG/GAA Fenilalanina TTC/TTT Glicina GGC/GGG Histidina CAC/CAT Isoleucina ATC/ATT Lisina AAG/AAA Leucina CTG/CTC Metionina ATG Asparagina AAC/AAT Prolina CCG/CCA Glutamina CAG/CAA Arginina AGG/CGC Serina AGC/TCC Treonina ACC/ACG Valina GTG/GTC Triptofano TGG Tirosina TAC/TAT Paragem TGA/TAG 77 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ É preferível que o(s) gene(s) optimizado(s) para plantas que codificam uma proteína bacteriana contenham cerca de 63% de codões de primeira escolha, entre cerca de 22% a cerca de 37% de codões de segunda escolha e entre cerca de 15% a cerca de 0% de codões de terceira ou de quarta escolha, em que a percentagem total é de 100%. O mais preferível é que o(s) gene(s) optimizado(s) para plantas contenham cerca de 63% de codões de primeira escolha, pelo menos cerca de 22% de codões de segunda escolha, cerca de 7,5% de codões de terceira escolha e cerca de 7,5% de codões de quarta escolha, em que a percentagem total é de 100%. O método descrito anteriormente permite que um perito na especialidade modifique o(s) gene(s) que são estranho (s) a uma determinada planta de modo que os genes sejam expressos optimamente em plantas. O método é ilustrado adicionalmente no pedido PCT WO 97/13402.

Assim, de forma a conceber genes optimizados para plantas que codificam uma proteína bacteriana, concebe-se uma sequência de ADN para codificar a sequência de aminoácidos da referida proteína utilizando um código genético redundante estabelecido a partir da tabela de desvios de codões compilada para as sequências de genes de uma determinada planta. A sequência de ADN resultante tem um grau de diversidade de codões mais elevado, uma composição de bases pretendida, pode conter locais de reconhecimento de enzimas de restrição colocados estrategicamente e não tem sequências que possam interferir com a transcrição do gene ou com a tradução do produto de ARNm. Assim, podem utilizar-se genes sintéticos que são funcionalmente equivalentes às proteínas/genes do presente invento para transformar hospedeiros, incluindo plantas. Podem encontrar-se orientações adicionais relativas à produção de genes sintéticos, por exemplo, na patente U.S. 5 380 831. 5.2 - Análise de reconstrução.

Uma análise exaustiva dos 888 pares de bases (pb) da sequência de ADN da região de codificação de AAD-1 (vl) nativa (SEQ ID NO:3) revelou a presença de vários motivos de sequência que se pensa serem prejudiciais à expressão óptima 78 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ em plantas, bem como uma composição de codões não óptima. Para melhorar a produção da proteína recombinante em monocotiledóneas, bem como em dicotiledóneas, desenvolveu-se uma sequência de ADN "optimizada para plantas" (SEQ ID NO: 5) que codifica SEQ ID NO: 11, que é idêntica à SEQ ID NO: 9 nativa excepto pela adição de um resíduo de alanina na segunda posição. 0 codão de alanina adicional (GCT; sublinhado em SEQ ID NO: 5) foi incluído para codificar um local Nco I (CCATGG) que abrange o codão de início ATG, para permitir as operações de clonagem subsequentes. As proteínas codificadas pelas regiões de codificação nativa (vl) e optimizada para plantas (v3) são 99,3% idênticas e diferem apenas no aminoácido número 2. Contrariamente, as sequências de ADN nativa (vl) e optimizada para plantas (v3) das regiões de codificação são apenas 77,7% idênticas. Efectuou-se um alinhamento de sequências dos ADN nativo e optimizado para plantas e a tabela 12 apresenta as diferenças nas composições de codões das sequências nativa e optimizada para plantas. 79 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ (vl) e versão optimizada para plantas

Amino— ácido Codão N. 2 gene nativo % de gene nativo N. s gene opt. plantas % de gene opt. plantas Amino— ácido Codão N. 2 gene nativo N. 2 gene opt. plantas % de gene opt. plantas ALA (A) 22 GCA 2 9, 1 5 22 LEU (L) 22 CTA 0 0, 0 0 0 GCC 10 45, 5 8 35 CTC 5 22, 7 7 32 GCG 9 40, 9 0 0 CTG 16 72, 7 0 0 GCT 1 4, 5 10 43 CTT 0 0, 0 8 36 ARG (R) 23 AGA 0 0, 0 7 30 TTA 0 0, 0 0 0 AGG 0 0, 0 7 30 TTG 1 4, 5 7 32 CGA 0 0, 0 0 0 LYS (K) 7 AAA 1 14,3 2 29 CGC 16 69,6 5 22 AAG 6 85, 7 5 71 CGG 4 17,4 0 0 MET (M) ATG 8 100 8 100 CGT 3 13, 0 4 17 PHE (F) TTC 10 76,9 9 69 ASN (N) AAC 8 100,0 4 50 13 TTT 3 23,1 4 31 8 AAT 0 0, 0 4 50 PRO (P) CCA 1 5, 9 8 47 ASP (D) GAC 15 78, 9 10 53 CCC 9 52,9 1 6 19 GAT 4 21, 1 9 47 17 CCG 7 41,2 0 0 CYS (C) TGC 3 100,0 2 67 CCT 0 0, 0 8 47 3 TGT 0 0, 0 1 33 SER (S) AGC 11 73,3 4 27 END TAA 0 0, 0 0 0 AGT 0 0, 0 0 0 1 TAG 1 100,0 0 0 15 TCA 0 0, 0 4 27 TGA 0 0, 0 1 100 TCC 2 13,3 3 20 GLN (Q) CAA 0 0, 0 7 54 TCG 2 13,3 0 0 13 CAG 13 100,0 6 46 TCT 0 0, 0 4 27 GLU (E) GAA 8 50, 0 5 31 THR (T) ACA 1 4,3 6 26 16 GAG 8 50, 0 11 69 ACC 16 69,6 9 39 GLY (G) GGA 0 0, 0 6 29 23 ACG 5 21, 7 0 0 GGC 15 71, 4 7 33 ACT 1 4,3 8 35 21 GGG 3 14, 3 2 10 TRP(W) TGG 5 100 5 i íoo GGT 3 14, 3 6 29 TYR (Y) TAC 7 70,0 6 60 HIS (H) CAC 6 60, 0 5 50 10 TAT 3 30,0 4 40 10 CAT 4 40, 0 5 50 VAL (V) GTA 2 7,1 0 0 ILE (I) ATA 0 0, 0 3 25 GTC 11 39,3 8 29 12 ATC 12 100,0 5 42 28 GTG 15 53,6 10 36 ATT 0 0, 0 4 33 GTT 0 0, 0 10 36 Totais 148 149 Totais 148 148

Tabela 12. Comparação de composição de codões da região de codificação nativa de AAD-1 5.3 - Realização de vectores binários. 5.3.1 - Reconstrução de AAD-1 (v3) . 0 gene AAD-1 (v3) optimizado para plantas foi obtido de Picoscript (completou-se a concepção da reconstrução do gene (consultar acima) e encomendou-se a Picoscript a construção) e verificou-se a 80 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ sequência (SEQ ID NO:5) internamente, para confirmar que não se encontravam presentes quaisquer alterações da sequência esperada. As reacções de sequenciação foram efectuadas com o iniciador directo M13 (SEQ ID NO: 16) e iniciador inverso M13 (SEQ ID NO: 17) utilizando os reagentes "Dye Terminator Cycle Sequencing with Quick Start Kit" de Beckman Coulter, tal como anteriormente. Analisaram-se os dados da sequência e os resultados indicaram que não estavam presentes quaisquer anomalias na sequência de ADN de AAD-1 (v3) optimizada para plantas. O gene AAD-1 (v3) foi clonado em pDAB726 na forma de um fragmento Nco I - Sac I. A construção resultante foi denominada pDAB720, contendo: [promotor AtUbilO: Nt OSM 5'UTR: AAD-1 (v3): Nt OSM3'UTR: ORF1 polyA 3'UTR] (verificado com digestões de restrição com Not I) : Clonou-se então um fragmento Not Ι-Not I contendo a cassete descrita para o local Not I do vector binário pDAB3038. O vector binário resultante, pDAB721, contendo a cassete seguinte [promotor AtUbilO: Nt OSM5'UTR: AAD-1 (v3): Nt OSM 3'UTR: ORF1 polyA 3'UTR: promotor CsVMV: DAT: ORF25/26 3'UTR] foi digerido por restrição (com Bam Hl, EcoR I, EcoR V, HinD III, Pac I e Xmn I) para verificação da orientação correcta. A construção completa verificada (pDAB721) foi utilizada para transformação em Agrobacterium (consultar secção 6.2). 5.3.2 - AADl (vl) nativo e AAD-1 (v2) modificado. O gene AAD-1 (vl) (SEQ ID NO: 3) foi amplificado por PCR a partir de pDAB3203. Durante a reacção de PCR, efectuaram-se alterações no interior dos iniciadores para introduzir os locais de restrição Ncol e Saci no iniciador 5' e iniciador 3', respectivamente. Utilizaram-se os iniciadores "rdpA(ncoI)" [CCC ATG GCT GCT GCA CTG TCC CCC CTC TCC] (SEQ ID NO: 6) e "3'saci" [GAG CTC ACT AGC GCG CCG GGC GCA CGC CAC CGA] (SEQ ID NO:7) para amplificar um fragmento de ADN utilizando o sistema de PCR Fail Safe (Epicenter).

Ligou-se o amplicão de PCR no vector de clonagem pCR 2.1 TOPO TA (Invitrogen) e verificou-se a sequência com os iniciadores directo M13 (SEQ ID NO: 16) e inverso M13 (SEQ ID 81 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ ΝΟ:17) utilizando os reagentes de "Dye Terminator Cycle Sequencing with Quick Start Kit" de Beckman Coulter.

Os dados da sequência identificaram um clone com a sequência correcta. Durante a análise identificou-se um local de restrição Notl supérfluo perto da extremidade 3' de AAD-1 (vl). Este local foi removido para facilitar clonagem em pDAB3038. Para remover o local adicional efectuou-se uma reacção PCR com um iniciador 5' interno. O local Notl foi alterado por incorporação de um novo codão para um aminoácido para remover o local Notl ilegítimo. Esta alteração alteraria a arginina na posição 212 para uma cisteína. Foram utilizados os iniciadores de PCR "BstEII/Del Notl" [TGG TGG TGA CCC ATC CGG GCA GCG GCT GCA AGG GCC] (SEQ ID NO:8) e "3' saci" (SEQ ID NO:7).

Completou-se uma reacção de PCR utilizando o sistema PCR Fail Safe (Epicenter) e clonou-se o fragmento resultante no kit de clonagem pCR 2.1 TOPO TA (Invitrogen) . Completou-se a confirmação do produto de PCR correcto por sequenciação de ADN e o gene "corrigido" foi denominado AAD-1 (v2) (SEQ ID NO:4).

Uma reacção de sequenciação utilizando o iniciador inverso M13 (SEQ ID NO: 17) e os reagentes de "Dye Terminator Cycle Sequencing with Quick Start Kit" de Beckman Coulter indicou que tinha sido isolado o fragmento de PCR correcto. Esta construção foi digerida com as enzimas BstEII e Saci. O fragmento resultante foi clonado na construção pCR2.1 AAD-1 (v2) (pCR2.1 Delta Notl) e confirmado através de digestão com enzimas de restrição. O gene AAD-1 (v2) modificado foi então clonado em pDAB726 na forma de um fragmento de ADN Ncol/Sacl. Verificou-se a construção resultante (pDAB708) com digestões de restrição. Esta construção foi então clonada em pDAB3038 binário na forma de um fragmento Notl - Notl. A construção final resultante foi denominada pDAB766, contendo [promotor AtUbilO: Nt OSM5'UTR: AAD-1 (v2): Nt OSM 3'UTR: ORF1 polyA 3'UTR: promotor CsVMV: PAT: ORF25/26 3'UTR] e foi digerida por restrição para 82 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ verificação da orientação correcta. A construção completa foi então utilizada para transformação em Agrobacterium. 5.3.3 - Concepção de uma sequência de ADN com desvio de codões para soja que codifica uma EPSPS de soja com mutações que conferem tolerância a glifosato. Este exemplo apresenta a concepção de uma nova sequência de ADN que codifica uma 5-enolpiruvoílchiquimato-3-fosfato-sintetase (EPSPS) de soja mutada, mas que está optimizada para expressão em células de soja. A sequência de aminoácidos de uma EPSPS de soja triplamente mutada é divulgada como SEQ ID NO: 5 de WO 2004/009761. Os aminoácidos mutados na sequência assim divulgada estão no resíduo 183 (treonina da proteína nativa substituída por isoleucina), no resíduo 186 (arginina da proteína nativa substituída por lisina) e no resíduo 187 (prolina da proteína nativa substituída por serina). Assim, pode deduzir-se a sequência de aminoácidos da proteína EPSPS de soja nativa por substituição dos aminoácidos substituídos de SEQ ID NO:5 de WO 2004/009761 pelos aminoácidos nativos nas posições adequadas. Esta sequência da proteína nativa apresenta-se aqui como SEQ ID NO:20. Uma sequência de proteína EPSPS de soja duplamente mutada, contendo uma mutação no resíduo 183 (treonina da proteína nativa substituída por isoleucina) e no resíduo 187 (prolina da proteína nativa substituída por serina) apresenta-se aqui como SEQ ID NO:21.

Obteve-se uma tabela de utilização de codões para sequências de codificação de proteínas de soja (Glycine max), calculada a partir de 362 096 codões (aproximadamente 870 sequências de codificação), da página da internet "kazusa.ou.jp/codon". Estes dados foram reformatados tal como apresentados na tabela 13. As colunas D e H da tabela 13 apresentam as distribuições (em % de utilização de todos os codões para esse aminoácido) de codões sinónimos para cada aminoácido, tal como verificado nas regiões de codificação da proteína de genes de soja. É óbvio que alguns codões sinónimos para alguns aminoácidos (um aminoácido pode ser especificado por 1, 2, 3, 4 ou 6 codões) estão presentes bastante raramente nas regiões de codificação de proteína de soja (por exemplo, 83 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ comparar a utilização dos codões GCG e GCT para especificar alanina). Calculou-se uma tabela de utilização de codões desviada para soja a partir dos dados da tabela 13. Os codões apresentados em genes de soja em menos do que cerca de 10% das ocorrências totais para o aminoácido particular foram ignorados. Para equilibrar a distribuição das restantes escolhas de codão para um aminoácido, calculou-se uma representação média ponderada para cada codão, utilizando a fórmula: % ponderada de Cl =1/(%C1 + %C2 + %C3 + etc.) x %C1 x 100 em que Cl é o codão em causa, C2, C3, etc. representam os restantes codões sinónimos e os valores de % para os codões relevantes são obtidos das colunas D e H da tabela 13 (ignorando os valores de codões raros em negrito) . O valor da % ponderada para cada codão apresenta-se nas colunas C e G da tabela 13. Seleccionou-se arbitrariamente TGA como o terminador de tradução. Introduziram-se então as frequências de utilização do codão desviadas numa tabela de código genético especializada para utilização pelo programa de concepção de genes OptGene™ (Ocimum Biosolutions LLC, Indianapolis, Indiana). 84 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

Tabela 13. Representação de codões sinónimos em sequências de codificação de proteínas de soja e cálculo de um conjunto de representação de codões desviados para concepção de genes sintéticos optimizados para soja_ A B c D E F G H Amino- ácido Codão % ponderada % de soja Amino- ácido Codão % ponderada % de soja ALA (A) GCA 33,1 30,3 LEU (L) CTA NU 9,1 GCC 24, 5 22,5 CTC 22,4 18,1 GCG NU* 8,5 CTG 16,3 13,2 GCT 42,3 38,7 CTT 31,5 25,5 ARG (R) AGA 36,0 30,9 TTA NU 9,8 AGG 32,2 27,6 TTG 29,9 24,2 CGA NU 8,2 LYS (K) AAA 42,5 42,5 CGC 14, 8 12, 7 AAG 57,5 57,5 CGG NU 6,0 MET (M) ATG 100,0 100 CGT 16,9 14,5 PHE (F) TTC 49,2 49,2 ASN (N) AAC 50,0 50,0 TTT 50,8 50,8 AAT 50,0 50,0 PRO (P) CCA 39,8 36,5 ASP (D) GAC 38,1 38,1 CCC 20,9 19,2 GAT 61,9 61,9 CCG NU 8,3 CYS (C) TGC 50,0 50,0 CCT 39,3 36,0 TGT 50,0 50,0 SER (S) AGC 16,0 15, 1 END TAA NU 40,7 AGT 18,2 17, 1 TAG NU 22, 7 TCA 21,9 20,6 TGA 100,0 36,6 TCC 18,0 16,9 GLN (Q) CAA 55,5 55,5 TCG NU 6,1 CAG 44,5 44, 5 TCT 25, 8 24, 2 GLU (E) GAA 50,5 50,5 THR (T) ACA 32,4 29, 7 GAG 49,5 49,5 ACC 30,2 27, 7 GLY (G) GGA 31,9 31,9 ACG NU 8,3 GGC 19,3 19,3 ACT 37, 4 34,3 GGG 18, 4 18,4 TRP (W) TGG 100, 0 100 GGT 30, 4 30,4 TYR (Y) TAC 48,2 48,2 HIS (H) CAC 44, 8 44, 8 TAT 51, 8 51,8 CAT 55, 2 55, 2 VAL (V) GTA 11,5 11,5 ILE (I) ATA 23,4 23,4 GTC 17, 8 17, 8 ATC 29,9 29,9 GTG 32,0 32, 0 ATT 46,7 46,7 GTT 38,7 38, 7 *NU = Não Usar

Para derivar uma sequência de ADN optimizada para soja que codifica a proteína EPSPS duplamente mutada, efectuou-se tradução inversa da proteína da sequência de SEQ ID NO:21 pelo programa OptGene™ utilizando o código genético desviado para soja derivado anteriormente. A sequência de ADN inicial assim derivada foi então modificada para compensar as alterações de codões (mantendo a representação da média ponderada global para os codões) para reduzir o número de dupletos CG e TA entre codões adjacentes, aumentar os números de dupletos CT e 85 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ TG entre codões adjacentes, remover estruturas secundárias intra-cadeia altamente estáveis, remover ou adicionar locais de reconhecimento para enzimas de restrição e para remover outras sequências que possam ser prejudiciais para a expressão ou manipulações de clonagem do gene concebido por engenharia genética. Efectuaram-se refinamentos adicionais da sequência por eliminação de potenciais locais de splicing de intrões de planta, cadeias longas de resíduos A/T ou C/G e outros motivos que possam interferir com a estabilidade do ARN, transcrição ou tradução da região de codificação em células vegetais. Foram efectuadas outras alterações para eliminar quadros de leitura abertos internos longos (quadros diferentes de +1). Todas estas alterações foram efectuadas considerando as restrições para manutenção da composição desviada para soja, tal como descrito anteriormente, e mantendo a sequência de aminoácidos divulgada como SEQ ID NO:21. A sequência de ADN desviada para soja que codifica a proteína EPSPS de SEQ ID NO:21 é apresentada como as bases 1-1575 de SEQ ID NO: 22. A síntese de um fragmento de ADN compreendendo SEQ ID NO:22 foi efectuada por um fornecedor comercial (PicoScript, Houston TX). 5.3.4 - Clonagem de construções binárias adicionais. Para completar pDAB3295 e pDAB3757 incorporou-se a utilização da tecnologia de clonagem Gateway (n.° de cat. Invitrogen 11791-043 e 12535-019) . A tecnologia GateWay utiliza recombinação baseada em fagos lambda específica do local para inserir uma cassete de um gene num vector. Para mais informação consultar Gateway Technology: A universal Technology to clone DNA sequence for functional analysis and expression in multiple Systems, © 1999-2003, Invitrogen Corp., 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA 92008 (impresso - 2003). Todas as outras construções criadas para transformação em espécies de plantas adequadas foram construídas utilizando procedimentos semelhantes aos anteriores e outros métodos padrão de clonagem molecular (Maniatis et al., 1982). A tabela 14 apresenta uma lista de todas as construções de transformação utilizadas com 86 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ promotores adequados e características definidas, bem como transformadas em culturas.

Adicionou-se o gene sacB ao vector binário pDAB3289 na forma de um marcador de selecção negativo bacteriano para reduzir a persistência de Agrobacterium associada a tecido vegetal transformado. SacB é uma enzima levana-sacarase produzida por Bacillus spp. e é tóxica para a maioria das bactérias Gram-negativas quando cultivadas na presença de sacarose (Gay et ai., 1983) . O gene sacB foi recuperado de um fragmento Hind III do plasmideo pRE112 (Edwards, et ai., 1998) e clonado no local Hind III único em pDAB3289.

Tabela 14. Construções binárias utilizadas na transformaçao de várias espécies de plantas. N.° pDAB N.° pDAS Espécies* transformadas em Gene de interesse (GOI) Promotor Região 1 Região 2 GOI 2 Promotor Gene de selecção bacteriano Selecção bacteriana no gene 2 Gene de selecçãc de planta Promotor Método de transformação 721 A, T, Ct, S, Ca AAD1 v3 AtUbilO NtOsm - - - Eritromicina - pat CsVMV Agro binário 3230 A EPSPS AtUbilO NtOsm RB7 Mar v2 - Espectinomicina - AADl v3 CsVMV Agro binário 3289 S AAD1 v3 CsVMV NtOsm RB7 Mar v2 EPSPS AtUbilO Espectinomicina sacB Hptll AtUbi3 Agro binário 3291 s AADl v3 CsVMV NtOsm RB 7 Mar v2 EPSPS AtUbilO Espectinomicina - Hptll AtUbi3 Agro binário 3295 s AAD1 v3 CsVMV NtOsm RB 7 Mar v2 - - Espectinomicina - pat AtUbilO Feixe de aerossol 3297 1270 A, T AADl v3 CsVMV NtOsm RB 7 Mar v2 - - Espectinomicina - pat AtUbilO Agro binário 3403 Cn, R AADl v3 ZmUbil - RB 7 Mar v2 - - Ampicilina - Mesmo que GOI Fios ("Whiskers") / Pistola 3404 Cn AADl v3 ZmUbil - RB7 Mar v2 - - Ampicilina - pat OsActl Fios ("Whiskers") 3415 1283 Cn AADl v3 ZmUbil - RB7 Mar v2 - - Ampicilina - AHAS v3 OsActl Fios ("Whiskers") 3602 1421 Cn AADl v3 ZmUbil - RB7 Mar v2 - - Espectinomicina - AHAS v3 OsActl Agro superbinário 3757 Ca AADl v3 CsVMV NtOsm RB7 Mar v2 EPSPS AtUbilO Espectinomicina - pat AtUbill Agro binário 3705 A AAD2 v2 AtUbilO NtOsm RB7 Mar v2 - - Eritromicina - pat CsVMV Agro binário *A = Arabidopsis T = Tabaco S = Soja Ct = Algodão R = Arroz Cn = Milho Ca = Colza

CsVMV=Promotor de vírus do mosaico das nervuras de mandioca

AtUbilO=Promotor de ubiquitina 10 de Arabidopsis thaliana RB7 Mar v2 = região associada a matriz de Nicotiana tabacum (MAR)

Nt Osm = Região não traduzida a 5' de osmotina de Nicotiana tabacum e região não traduzida a 3' de osmotina de Nicotiana tabacum (721 e 793) Atu ORF1 3' UTR = Região não traduzida a 3' do quadro de leitura aberta 1 de

Agrobacterium tumefaciens (3295 e 3757) Atu ORF24 3' UTR = Região não traduzida a 3' do quadro de leitura aberta 24 de

Agrobacterium tumefaciens

ZmUbil = promotor de ubiquitina 1 de Zea mays Hptll = higromicina-fosfotransferase 87 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

Exemplo 6 - Transformação em Arabidopsis e selecção 6.1-Condições de cultura de Arabidopsis thaliana.

Suspenderam-se sementes de Arabidopsis de tipo selvagem numa solução de agarose a 0,1% (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Armazenaram-se as sementes em suspensão a 4°C durante 2 dias para completar os requisitos de dormência e assegurar uma germinação síncrona das sementes (estratificação).

Cobriu-se a mistura Sunshine LP5 (Sun Gro Horticulture, Bellevue, WA) com vermiculite fina e sub-irrigou-se com solução de Hoagland até estar molhado. Deixou-se drenar a mistura de solo durante 24 horas. Semearam-se as sementes estratificadas na vermiculite e cobriram-se com coberturas de humidade (KORD Products, Bramalea, Ontario, Canadá) durante 7 dias.

Germinaram-se as sementes e cultivaram-se as plantas num Conviron (modelos CMP4030 e CMP3244, Controlled Environments Limited, Winnipeg, Manitoba, Canadá) em condições de dia longo (16 horas de luz/8 horas de escuro) a uma intensidade de luz de 120-150 pmol/m2seg a temperatura constante (22°C) e humidade (40-50%). As plantas foram regadas inicialmente com solução de Hoagland e subsequentemente com água desionizada para manter o solo húmido mas não molhado. 6.2 - Transformação em Agrobacterium.

Utilizou-se uma placa de LB + ágar-ágar com eritromicina (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) (200 mg/L) ou espectinomicina (100 mg/L) contendo uma colónia riscada de DH5a para obter uma colónia para inocular 4 ml de culturas mini prep (LB líquido + eritromicina). Incubaram-se as culturas durante a noite a 37°C com agitação constante. Utilizaram-se Spin Mini Preps de Qiagen (Valência, CA) , para purificar o ADN plasmídico segundo as instruções do fabricante. 88 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

Prepararam-se células de Agrobacterium tumefaciens (estirpes Z707s, EHAlOls e LBA4404s) electrocompetentes utilizando um protocolo de Weigel e Glazebrook (2002). Transformaram-se as células competentes de Agrobacterium utilizando um método de electroporação adaptado de Weigel e Glazebrook (2002). Descongelaram-se 50 μΐ de células competentes de Agrobacterium tumefaciens em gelo e adicionou-se 10-25 ng do plasmideo pretendido às células. Adicionou-se a mistura de ADN e células a cuvetes de electroporação pré-arrefecidas (2 mm). Utilizou-se um electroporador Eppendorf 2510 para a transformação nas seguintes condições, voltagem: 2,4 kV, duração do impulso: 5 ms.

Após electroporação adicionou-se 1 ml de meio YEP (por litro: 10 g de extracto de levedura, 10 g de bactopeptona, 5 g de NaCl) à cuvete e transferiu-se a suspensão celular em YEP para um tubo de cultura de 15 ml. Incubaram-se as células a 28°C num banho de água com agitação constante durante 4 horas. Após incubação, plaqueou-se a cultura YEP + ágar-ágar com eritromicina (200 mg/L) ou espectinomicina (100 mg/L) e estreptomicina (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) (250 mg/L). Incubaram-se as placas durante 2-4 dias a 28°C.

Seleccionaram-se colónias e utilizaram-se para riscar placas frescas de YEP + ágar-ágar com eritromicina (200 mg/L) ou espectinomicina (100 mg/L) e estreptomicina (250 mg/L) e incubaram-se a 28 °C durante 1-3 dias. Seleccionaram-se colónias para análise por PCR para verificar a presença da inserção de gene usando iniciadores específicos de vector. Utilizaram-se Spin Mini Preps de Qiagen, efectuadas segundo as instruções do fabricante, para purificar o ADN plasmídico de colónias seleccionadas de Agrobacterium com a seguinte excepção: utilizaram-se alíquotas de 4 ml de uma cultura miniprep durante a noite de 15 ml (YEP líquido + eritromicina (200 mg/L) ou espectinomicina (100 mg/L)) e estreptomicina (250 mg/L)) para a purificação de ADN. Uma alternativa à utilização de Qiagen Spin Mini Prep de ADN foi lisar as células de Agrobacterium transformadas, suspenderam-se em 89 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ 10 μΐ de água, a 100°C durante 5 minutos. Incluiu-se ADN plasmidico do vector binário utilizado na transformação de Agrobacterium como controlo. Completou-se a reacção de PCR utilizando Taq ADN-polimerase de Takara Mirus Bio Inc. (Madison, Wisconsin) seguindo as instruções do fabricante a concentrações 0,5x. As reacções de PCR foram efectuadas num termociclador MJ Research Peltier programado para as seguintes condiçoes; 1) 94°C durante 3 minutos, 2) hD o O durante 45 segundos, 3) 55 °C durante 30 segundos, 4 ) 72 °C durante 1 minuto, durante 29 ciclos, seguidamente 1 ciclo de 72 °C durante 10 minutos. A reacçao foi mantida a 4 °C após os ciclos. A amplificação foi analisada por electroforese em gel de agarose a 1% e visualizou-se com coloração com brometo de etidio. Seleccionou-se uma colónia cujo produto de PCR foi idêntico ao controlo de plasmídeo. 6.3 - Transformação em Arabidopsis.

Transformou-se Arabidopsis utilizando o método de imersão das inflorescências ("floral dip"). A colónia seleccionada foi utilizada para inocular uma ou mais pré-culturas de 15-30 ml de meio YEP contendo eritromicina (200 mg/L) ou espectinomicina (100 mg/L) e estreptomicina (250 mg/L). Incubaram-se as culturas durante a noite a 28°C com agitação constante a 220 rpm. Utilizou-se cada pré-cultura para inocular duas culturas de 500 ml de meio YEP contendo eritromicina (200 mg/L) ou espectinomicina (100 mg/L) e estreptomicina (250 mg/L) e incubaram-se as culturas durante a noite a 28°C com agitação constante. As células foram então sedimentadas a aproximadamente 8700x g durante 10 minutos à temperatura ambiente e rejeitou-se o sobrenadante resultante. Ressuspendeu-se suavemente o sedimento celular em 500 ml de meio de infiltração contendo: l/2x sais de Murashige e Skoog/ vitaminas B5 de Gamborg, sacarose a 10% (p/v), benzilaminopurina 0,044 μΜ (10 μΐ/litro de uma solução mãe 1 mg/ml em DMSO) e Silwet L-77 a 300 μΐ/litro. Imergiram-se plantas com aproximadamente 1 mês de idade em meio durante 15 segundos, assegurando a submersão das inflorescências mais novas. As plantas foram então deitadas de lado e cobertas 90 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ (transparentes ou opacas) durante 24 horas, seguidamente lavaram-se com água e colocaram-se na vertical. Cultivaram-se as plantas a 22°C, com um fotoperiodo de 16 horas de luz/ 8 horas de escuro. Aproximadamente 4 semanas após a imersão, colheram-se as sementes. 6.4 - Selecção de plantas transformadas.

Deixaram-se secar sementes Ti colhidas de fresco (transformadas com gene nativo [AAD-1 (v2)] ou optimizado para plantas [AAD-1 (v3)]) durante 7 dias à temperatura ambiente. Semearam-se as sementes Ti em tabuleiros de germinação de 26,5 x 51 cm (T.O. Plastics Inc., Clearwater, MN), cada recebendo uma alíquota de 200 mg de sementes Ti estratificadas (~10 000 sementes) que tinham sido previamente suspensas em 40 ml de solução de agarose a 0,1% e armazenadas a 4°C durante 2 dias para completar os requisitos de dormência e assegurar germinação síncrona das sementes.

Cobriu-se a mistura Sunshine LP5 (Sun Gro Horticulture Inc., Bellevue, WA) com vermiculite fina e subirrigou-se com solução de Hoagland até ficar molhada, seguidamente deixou-se drenar por gravidade. Semeou-se cada alíquota de 40 ml de sementes estratificadas homogeneamente na vermiculite com uma pipeta e cobriram-se com coberturas de humidade (KORD Products, Bramalea, Ontario, Canadá) durante 4-5 dias. As coberturas foram removidas 1 dia antes da selecção inicial de produtos de transformação utilizando pulverização pós-emergência de glufosinato (que selecciona o gene PAT co-transformado).

Cinco a seis dias após plantação (DAP) e novamente 10 DAP, pulverizaram-se as plantas Th (cotiledóneas e estágio de 2-4 folhas, respectivamente) com uma solução de herbicida Liberty a 0,2% (200 g ae/L de glufosinato, Bayer Crop Sciences, Kansas City, MO) a um volume de pulverização de 10 ml/tabuleiro (703 L/ha) utilizando uma ponta de pulverização de ar comprimido DeVilbiss para entrega de uma taxa efectiva de 280 g ae/ha de glufosinato por aplicação. 91 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

Identificaram-se os sobreviventes (plantas com crescimento activo) 5-7 dias após a pulverização final e transplantaram-se individualmente para vasos de 3 polegadas preparados com meio de vaso (Metro Mix 360). Cobriram-se as plantas transplantadas com coberturas de humidade durante 3-4 dias e colocaram-se numa câmara de cultura a 22°C, tal como anteriormente. As coberturas foram removidas subsequentemente e mudaram-se as plantas para uma estufa (22±5°C, 50±30% HR, 14 h luz:10 escuro, mínimo de 500 pE/m2s1 luz natural + suplementar) pelo menos 1 dia antes de ensaio para a capacidade de AAD-1 (v3) (gene optimizado para plantas) ou AAD-1 (v2) (gene microbiano nativo) proporcionarem resistência a herbicida fenoxiauxínico.

Foi confirmada a expressão da proteína PAT nas plantas Ti individuais seleccionadas anteriormente aleatoriamente para resistência a glufosinato, utilizando um kit de ELISA para PAT (n.° 7000045, Strategic Diagnostics, Inc., Newark, DE) para confirmar não destrutivamente a fidelidade do processo de selecção (protocolo do fabricante). As plantas foram então atribuídas aleatoriamente a várias taxas de herbicidas fenoxi (diclorprop ou 2,4-D). As taxas de fenoxi aplicadas inicialmente foram 2,4-D a 12,5 g ae/ha e diclorprop a 50 ou 200 g ae/ha. GR99 para Arabidopsis é cerca de 2,4-D a 50 g ae/ha e diclorprop a 200 g ae/ha. Aplicaram-se taxas elevadas em ensaios subsequentes (50, 200, 800 ou 3200 g ae/ha).

Todas as aplicações de herbicida auxinico foram efectuadas utilizando o pulverizador DeVilbiss, tal como descrito anteriormente, para aplicar 703 L/ha de volume de pulverização (0,4 ml de solução/vaso de 3 polegadas) ou aplicado por moto-pulverizador um volume de pulverização de 187 L/ha. Utilizou-se 2,4-D de grau técnico (Sigma, St. Louis, MO) dissolvido em DMSO e diluído em água (DMSO <1% de concentração final) ou a formulação comercial de sal de dimetilamina (456 g ae/L, NuFarm, St Joseph, MO). O diclorprop utilizado foi de grau técnico (Sigma, St. Louis, MO) dissolvido em DMSO e diluído em água (DMSO <1% de concentração final). Para taxas de herbicida superiores a 800 g ae/ha, o pH da solução de 92 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ pulverização torna-se demasiado ácido, queimando as folhas das plantas de Arabidopsis novas e tenras e complicando a avaliação dos efeitos principais dos herbicidas. Tornou-se prática padrão aplicar estas taxas elevadas de herbicidas fenoxi em tampão Tris 200 mM (pH 9,0) para um pH final de ~7-8.

Alguns indivíduos Ti foram sujeitos a herbicidas comerciais alternativos em vez de uma fenoxiauxina. Um ponto de interesse foi determinar se haloxifop podia ser degradado eficazmente na planta.

Embora Arabidopsis, sendo uma dicotiledónea, não seja um sistema óptimo para ensaios de inibição de ACCase por herbicidas gramineas AOPP, sujeitaram-se plantas Ti transformadas com AAD-1 (v3) em taxas elevadas (400-1600 g ae/ha) de ácido RS-haloxifop (sintetizado internamente) que causa anomalias de crescimento e morte em Arabidopsis de tipo selvagem, utilizando o pulverizador DeVilbiss, tal como descrito anteriormente. Efectuou-se classificação das lesões 7 e 14 dias após tratamento. De igual modo, trataram-se indivíduos Ti com o herbicida auxínico piridiloxiacetato, fluroxipir. 6.5 - Resultados de selecção de plantas transformadas.

As primeiras transformações de Arabidopsis foram efectuadas utilizando AAD-1 (v3) (gene optimizado para plantas). Os produtos de transformação Ti foram primeiro seleccionados das restantes sementes não transformadas utilizando um esquema de selecção de glufosinato. Rastrearam-se mais de 400 000 sementes Ti e identificaram-se 493 plantas resistentes a glufosinato (gene PAT), o que resulta numa frequência de transformação/selecção de 0,12%. Dependendo do lote de sementes ensaiado, tal estava na gama de 0,05-0,23% (consultar a tabela 15). Também se seleccionou um pequeno lote de sementes transformadas com AAD-1 (v2) (nativo) utilizando o agente de selecção glufosinato. Identificaram-se duzentos e setenta e oito indivíduos Ti resistentes a glufosinato entre 93 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ as 84 000 sementes rastreadas (frequência de transformação/ selecção de 0,33%).

Tabela 15: Selecção de plantas Tx individuais transformadas com AAD-1 (v3) (optimizado para plantas) ou AAD-1 (v2) (nativo), AAD-2 (vi) (nativo) ou AAD-2 (v2) optimizado para plantas utilizando glufosinato e 2,4-D.

Agente de selecção Gene Desvio de codões Sementes totais semeadas e rastreadas Número de Ti resistentes Taxa de selecção Gama de taxas de selecção % de plantas seleccionadas que expressam PAT3 Glufosinato1 AAD-1 (v2) N 84 000 278 0,33% 0, 33% nd4 Glufosinato1 AAD-1 (v3) P 400 500 493 0, 12% 0,05 a 0, 23% 97% 2,4-D2 AAD-1 (v3) P 70 000 53 0, 08% 0,07 a 0, 08% 96% Glufosinato1 AAD-2 (vl) N 1 301 500 228 0,018% 0,007 a 0,021% 100% Glufosinato1 AAD-2 (v2) P 200 000 224 0,11% 0, 11% nd4 1Esquema de selecção com glufosinato: 280 g ae/ha de glufosinato aplicado 5-6 + 10 DAP 2Esquema de selecção com 2,4-D: 50 g ae/ha de 2,4-D aplicado 5-7 + 10-14 DAP 3Expressão de proteína PAT determinada por tiras de ELISA de PAT 4nd, não determinado 5desvio de codões, n=gene microbiano nativo, p=optimizado para plantas

As plantas Ti seleccionadas anteriormente foram subsequentemente transplantadas para vasos individuais e pulverizadas a várias taxas de herbicidas ariloxialcanoato comerciais. A tabela 16 compara a resposta de genes AAD-1 (v2) nativo e AAD-1 (v3) optimizado para plantas para conferir resistência a 2,4-D a produtos de transformação Ti de Arabidopsis. Ambos os genes conferiram resistência a plantas Ti individuais de Arabidopsis. Dentro de um determinado tratamento, o nivel de resposta da planta variou grandemente e pode ser atribuido ao facto de cada planta representar um evento de transformação independente. É importante notar que a cada taxa de 2,4-D ensaiada, existiram indivíduos que não foram afectados, enquanto outros foram seriamente afectados. Apresenta-se na tabela 16 uma média de lesões globais da população por taxa, simplesmente para demonstrar a diferença significativa entre as plantas transformadas com AAD-1 (v2) ou AAD-1 (v3) relativamente a controlos de tipo selvagem ou transformados com PAT/CrylF. Também é evidente que a tolerância parece ser significativamente maior (frequência e nível global de resposta individual) para a sequência 94 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ AAD-1 (ν3) optimizada para plantas relativamente à sequência nativa AAD-1 (v2) (consultar tabela 16) . Aplicaram-se taxas mais elevadas de 2,4-D (até 3 200 g ae/ha) a indivíduos Ti adicionais que expressam AAD-1 (v3). Os níveis de lesões tendem a ser maiores e a frequência de plantas altamente resistentes é menor a estas taxas elevadas (6x taxas de campo). Igualmente a estas taxas elevadas, a solução de pulverização torna-se altamente ácida excepto se for tamponada. A Arabidopsis cultivada principalmente na câmara de cultura tem uma cutícula muito fina e os efeitos de queimaduras graves podem complicar o ensaio a estas taxas elevadas. No entanto, alguns indivíduos sobreviveram 3200 g ae/ha de 2,4-D com poucas ou nenhumas lesões.

Tabela 16. Resposta de Arabidopsis Ti transformada com AAD-1 v3 (optimizado para plantas) ou AAD-1 v2 (nativo) ou AAD-2 (nativo) a uma gama de taxas de 2,4-D aplicadas pós-emergência. A resposta é apresentada em termos de % de lesões visuais 2 WAT. Os dados são apresentados como um histograma de indivíduos que apresentam lesões pequenas ou nenhuma lesão (<20%), lesões moderadas (20-40%) ou lesões graves (>40%). Dado que cada Ti é um evento de transformação independente, é de esperar uma variação significativa das respostas individuais de 13 numa determinada taxa. Apresenta-se a média aritmética e o desvio padrão para cada tratamento. A gama de resposta individual também é indicada na última coluna para cada taxa e transformação. A Arabidopsis transformada com PAT/CrylF serviu como controlo transformado sensível a auxina. A Arabidopsis de tipo selvagem não é transformada. 95 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

Tabela 16. Resposta de Arabidopsis Ti transformada com AAD-1 v3 (optimizado para plantas) ou AAD-1 v2 (nativo) ou AAD-2 (nativo) a uma gama de taxas de 2,4- D aplicadas pós- emergência. o, o de lesões % de lesões Médias do gene AAD-1 nativo (v2) <20% 20-40% >40% Média Desvio padrão tampão de controlo não tratado 20 6 7 25,3 34, 7 2,4-D a 50 g ae/ha 55 16 9 14, 8 22, 7 2,4-D a 200 g ae/ha 45 11 24 34, 1 39,3 2,4-D a 800 g ae/ha 11 32 37 52,5 34,2 o, o de lesões % de lesões Médias do gene AAD-2 nativo <20% 20-40% >40% Média Desvio padrão tampão de controlo não tratado 4 1 1 25, 0 21,7 2,4-D a 50 g ae/ha 1 2 11 68,2 30,2 2,4-D a 200 g ae/ha 0 3 11 82,7 28,8 2,4-D a 800 g ae/ha 0 0 14 99,8 0, 8 0, "0 de lesões % de lesões Médias do gene AAD-1 reconstruído (v3) <20% 20-40% >40% Média Desvio padrão tampão de controlo não tratado 9 0 0 0, 0 0, 0 2,4-D a 50 g ae/ha 10 1 5 24, 3 35, 9 2,4-D a 200 g ae/ha 11 4 1 14, 0 25, 9 2,4-D a 800 g ae/ha 11 4 1 14, 7 26, 1 o. o de lesões % de lesões Médias de tipo selvagem <20% 20-40% >40% Média Desvio padrão tampão de controlo não tratado 11 0 0 0, 0 0, 0 2,4-D a 50 g ae/ha 0 0 15 90, 0 0, 0 2,4-D a 200 g ae/ha 0 0 15 95,1 0, 5 2,4-D a 800 g ae/ha 0 0 15 100, 0 0, 0 o "3 de lesões % de lesões Médias de PAT/CrylF transformado) (controlo <20% 20-40% >40% Média Desvio padrão tampão de controlo não tratado 11 0 0 0,0 0, 0 2,4-D a 50 g ae/ha 0 0 15 90,7 4,2 2,4-D a 200 g ae/ha 0 0 15 97,2 1, 7 2,4-D a 800 g ae/ha 0 0 15 100,0 0, 0 A tabela 17 apresenta uma resposta à dose semelhante de

Arabidopsis Ti ao ácido fenoxipropiónico, diclorprop. 96 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

Verificaram-se tendências semelhantes às de 2,4-D, indicando que a cadeia lateral propiónica quiral serve como um substrato aceitável. Seguidamente determinou-se se se pode conferir um grau aumentado de tolerância a haloxifop a Arabidopsis transformada a taxas elevadas de 400 - 1600 g ae/ha (tabela 18). A taxa de utilização de campo normal para haloxifop (um herbicida especifico de gramineas) é cerca de 50-70 g ae/ha. As dicotiledóneas são geralmente consideradas naturalmente tolerantes a herbicidas AOPP; no entanto, ocorrem efeitos fisiológicos graves em Arabidopsis a estas taxas elevadas. Alguns indivíduos transformados com AAD1 (v3) apresentaram tolerância aumentada a haloxifop. Tal proporciona os primeiros dados em plantas que AAD-1 (v3) proporcionará resistência a AOPP. Não se verificou qualquer resistência com fluroxipir (uma priridiloxiacetato auxina) em Arabidopsis transformada, consistente com o trabalho in vitro utilizando a enzima expressa heterologamente.

Tabela 17. Resposta de Arabidopsis Ti a uma gama de taxas de diclorprop aplicado pós-emergência. A resposta é apresentada em termos de % de lesões visuais 2 WAT. Os dados são apresentados como um histograma de indivíduos que apresentam lesões pequenas ou nenhuma lesões (<20%), lesões moderadas (20-40%) ou lesões graves (>40%) . Dado que Ti é um evento de transformação independente, é de esperar uma variação significativa das respostas individuais de Ti numa determinada taxa. Apresenta-se a média aritmética e o desvio padrão para cada tratamento. A gama de resposta individual também é indicada na última coluna para cada taxa e transformação. A Arabidopsis transformada com PAT/CrylF serviu como controlo transformado sensível a auxina. A Arabidopsis de tipo selvagem não é transformada. 97 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

Tabela 17. Resposta de Arabidopsis Ti a uma gama de taxas de diclorprop aplicadas pós-emergência. de lesões de lesões Médias do gene AAD-1 (v3) <20% 20-40% >40% Média Desvio padrão Gama Controlo não tratado 3 0 0 0,0 0,0 0 RS-diclorprop a 12,5 g ae/ha 7 1 0 5, 0 7,6 0-20 RS-diclorprop a 50 g ae/ha 7 1 0 3,1 8,8 0-25 RS-diclorprop a 200 g ae/ha 4 1 3 40,0 50,1 0-100 RS-diclorprop a 800 g ae/ha 0 5 3 51,9 40,0 20-100 % de lesões % de lesões Médias de PAT/CrylF <20% 20-40% >40% Média Desvio Gama padrão Controlo não tratado 3 0 0 0,0 0,0 0 RS-diclorprop a 12,5 g ae/ha 0 6 2 38,1 25,3 20-95 RS-diclorprop a 50 g ae/ha 0 0 8 80,0 25,3 50-100 RS-diclorprop a 200 g ae/ha 0 0 8 98,3 2,2 95-100 RS-diclorprop a 800 g ae/ha 0 0 8 100,0 0, 0 100 % de lesões % de lesões Médias de tipo selvagem <20% 20-40% >40% Média Desvio Gama padrão Controlo não tratado 3 0 0 0,0 0,0 0 RS-diclorprop a 12,5 g ae/ha 3 0 2 13,3 2,9 10-15 RS-diclorprop a 50 g ae/ha 0 0 3 53,3 5, 8 50-60 RS-diclorprop a 200 g ae/ha 0 0 3 95, 0 5, 0 90-100 RS-diclorprop a 800 g ae/ha 0 0 3 100,0 0, 0 100 Tabela 18. Resposta de Arabidopsis Tl a uma gama de taxas de haloxifop aplicado pós-emergência a taxas artificialmente tolerância da A resposta é elevadas na tentativa de demonstrar a dicotiledónea Arabidopsis ao graminicida. apresentada em termos de % de lesões visuais 2 WAT. Os dados são apresentados como um histograma de indivíduos que apresentam lesões pequenas ou nenhum lesão (<20%), lesões moderadas (20-40%) ou lesões graves (>40%). Dado que cada TI é um evento de transformação independente, é de esperar uma variação significativa das respostas individuais de Tl numa determinada taxa. Apresenta-se a média aritmética e o desvio padrão para cada tratamento. A gama de resposta individual 98 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ também é indicada na última coluna para cada taxa e transformação. A Arabidopsis transformada com PAT/CrylF serviu como controlo transformado sensível a auxina. A Arabidopsis de tipo selvagem não é transformada.

Tabela 18. Resposta de Arabidopsis T! a uma gama de taxas de haloxifop aplicadas pós-emergência a taxas artificialmente elevadas na tentativa de demonstrar a tolerância da dicotiledónea Arabidopsis ao graminicida. Médias de AAD-1 (v3) o, o <20% de lesões 20-40% >40% % de Média lesões Desvio padrão Gama Controlo não tratado 3 0 0 0, 0 0, 0 0 haloxifop a 100 g ae/ha 4 0 0 0, 0 0, 0 0 haloxifop a 200 g ae/ha 4 0 0 0, 0 0, 0 0 haloxifop a 400 g ae/ha 3 1 0 6,3 9,5 0-20 haloxifop a 800 g ae/ha 1 1 2 46,3 42,7 0-85 haloxifop a 1600 g ae/ha 1 0 3 65, 0 47, 3 0-100 0, o de lesões % de lesões Médias de PAT/CrylF <20% 20-40% >40% Média Desvio Gama padrão Controlo não tratado 3 0 0 0,0 0,0 0 haloxifop a 100 g ae/ha 4 0 0 0,0 0,0 0 haloxifop a 200 g ae/ha 4 0 0 10,0 0,0 10 haloxifop a 400 g ae/ha 0 4 0 27, 5 5, 0 20-30 haloxifop a 800 g ae/ha 0 0 4 78,8 6,3 70-85 haloxifop a 1600 g ae/ha 0 0 4 47, 5 43,5 80-100 Médias de tipo selvagem o, o <20% de 20 lesões -40% >40% % de Média lesões Desvio padrão Gama Controlo não tratado 3 0 0 0,0 0, 0 0 haloxifop a 100 g ae/ha 3 0 0 0,0 0, 0 0 haloxifop a 200 g ae/ha 3 0 0 0,0 0, 0 0 haloxifop a 400 g ae/ha 0 3 0 20,0 0, 0 20 haloxifop a 800 g ae/ha 0 0 3 73,3 10,4 70-85 haloxifop a 1600 g ae/ha 0 0 3 93,3 11,5 80-100 99 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ 6.6 - AAD-1 (ν3) como um marcador seleccionável. A capacidade de utilizar AAD-1 (v3) como um marcador seleccionável utilizando 2,4-D como o agente de selecção foi analisada inicialmente em Arabidopsis transformada tal como descrito anteriormente. Semearam-se sementes Ti transformadas com PAT e AAD1 (v3) (pDAB 721) em tabuleiros e germinaram-se tal como descrito anteriormente e compararam-se a semente semelhante tratada com o esquema de selecção normal de glufosinato (5 e 10 DAP) . Aplicou-se 2,4-D (50 g ae/ha) a plântulas de Arabidopsis tal como previamente efectuado com glufosinato. Ensaiaram-se variações no número de aplicações e altura da aplicação. Cada tabuleiro de plantas recebeu uma ou duas alturas de aplicação de 2,4-D num dos seguintes esquemas de tratamento: 5 + 10 DAP, 5 + 14 DAP, 10 DAP, 10 + 14 DAP, 14 DAP. Identificaram-se as plantas como resistentes ou sensíveis a 19 DAP e correram-se tiras de ensaio ELISA para determinar a frequência de co-transformação bem-sucedida de um gene PAT activo.

Identificaram-se cinquenta e três entre 70 000 sementes plantadas como resistentes a 2,4-D. Utilizou-se ELISA para rastrear um subconjunto de 44 indivíduos desta população para expressão de proteína PAT. Noventa e seis porcento dos indivíduos foram positivos indicando a presença do gene co-transf ormado, PAT. O baixo número de resultados de ELISA negativos (4%) está de acordo com uma taxa de erro de 3% em populações de plantas resistentes a glufosinato (tabela 15). A eficácia de selecção parece ser algo menor do que com 2,4-D (0,08%) relativamente a glufosinato (0,12%); no entanto, a gama de taxas de selecção ao longo de todas as experiências indicaria que ambos os agentes de selecção são igualmente bons para seleccionar Arabidopsis transformada com genes AAD-1 (v3) ou PAT, respectivamente. Duas aplicações sucessivas identificam mais precisamente os indivíduos resistentes a ambos os herbicidas ensaiados. 100 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ 6.7 - Herdabilidade . Vários eventos Ti foram autopolinizados para produzir sementes T2. Estas sementes foram a descendência ensaiada por aplicação de 2,4-D (200 g ae/ha) a 100 irmãos T2 aleatórios.

Cada planta T2 individual foi transplantada para vasos quadrados de 7,5 cm antes de aplicação por pulverização (moto-pulverizador a 187 L/ha de taxa de aplicação). Mais de 60% das famílias Τχ (plantas T2) segregaram-se no modelo antecipado de 3 resistentes:1 sensível para um local único herdado dominantemente com hereditariedade mendeliana, tal como determinado pelo teste do Qui quadrado (P > 0,05).

Colheram-se sementes de 12 a 20 indivíduos T2 (sementes T3) . Ensaiaram-se vinte e cinco irmãos T3 de cada uma das oitos famílias T2 seleccionadas aleatoriamente e foram ensaiadas para descendência, tal como descrito anteriormente. Foram identificadas aproximadamente um terço das famílias T2 que se antecipavam ser homozigóticas (populações não segregadas) em cada linha ensaiada: com uma frequência na gama de um a quatro entre as oito famílias ensaiadas. Estes dados demonstram que AAD1 (v3) é integrado estavelmente e herdado de uma forma mendeliana até pelo menos três gerações. 6.8 - Resistência a herbicida adicional atribuível a AAD-1 em Arabidopsis. A capacidade de AAD-1 (v3) proporcionar resistência a outros herbicidas ariloxifenoxialcanoatos em Arabidopsis transgénica foi determinada utilizando um ensaio de placa in vitro modificado. Esterilizaram-se sementes de Arabidopsis thaliana de tipo selvagem, bem como de Arabidopsis thaliana contendo o gene optimizado para plantas AAD-1 (v3) (plantas homozigóticas T4 id = PAADl.315.064) por agitação durante 10 min numa solução de lixívia a 50%. Estas sementes foram então enxaguadas quatro vezes com água estéril para remover a lixívia. 101 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

Os ensaios de dose-resposta utilizaram um meio nutritivo (consultar seguidamente) suplementado com várias taxas de compostos de ensaio. Os compostos de ensaio foram adicionados ao meio aquecido (55°C) como soluções concentradas em DMSO. Os poços de controlo tinham a quantidade adequada de DMSO sem qualquer composto adicional. A concentração final de DMSO nunca excedeu 1 % (v/v). Após mistura cuidadosa, adicionou-se um aliquota de 6 mL de meio morno contendo a concentração adequada de composto a cada poço num tabuleiro de cultura de tela de poliestireno de 6 poços de fundo plano (Falcon 353046, Becton Dickson and Company, Franklin Lakes, NJ) . Após solidificação do meio, aplicaram-se aproximadamente 20 a 30 sementes de Arabidopsis em cima do meio solidificado e colocaram-se os restantes 2 mL de meio por cima das sementes. As placas foram levemente agitadas para dispersar as sementes, taparam-se e deixaram-se arrefecer até o meio estar completamente solidificado. Incubaram-se as placas durante 7 dias a 25°C em iluminação fluorescente continua (75 μΕ m_2s_1) . A composição do meio nutritivo foi como descrita no exemplo 2.2 e em Somerville e Orgen (1982).

Avaliação da redução de crescimento. Avaliou-se visualmente a parte apical das plantas Arabidopsis cultivadas no meio tratado relativamente à parte apical das plantas cultivadas no meio contendo apenas DMSO. Registaram-se os valores como % de redução de crescimento. As avaliações da inibição de crescimento da raiz das plantas de Arabidopsis cultivadas no meio tratado foram conseguidas por extracção cuidadosa das plantas do meio e medindo o comprimento da raiz. Estes comprimentos da raiz foram então comparados com o comprimento da raiz das plantas de controlo para determinar a % de redução de crescimento. Avaliou-se um mínimo de cinco plantas para cada tratamento. Os valores registados são uma média de todas as plantas avaliadas. As concentrações calculadas para atingir um efeito de inibição de 50% (l50) foram determinadas para as raízes e para os rebentos de Arabidopsis de tipo selvagem e transformada com AAD-1. As razões entre biotipos resistentes e sensíveis estão incluídas na tabela 19. Uma razão >2 para as medições tanto de raiz, 102 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ como de rebentos significa geralmente resistência significativa. Quanto maior a razão, maior o nivel de resistência. Todas as fenoxiauxinas comerciais apresentaram niveis de resistência significativos, incluindo ácidos oxiacéticos (2,4-D e MCPA), bem como ácidos oxipropiónicos (diclorprop e mecoprop). De facto, a avaliação crónica da raiz mostra que a resistência ao ácido oxipropiónico é mais elevada com AAD-1 (v3) do que para ácidos oxiacéticos, em consistência com as caracteristicas enzimáticas de AAD-1 (vl) . A avaliação de outras auxinas contendo anéis piridina mostrou que AAD-1 (v3) não protegeu eficazmente Arabidopsis de herbicidas piridiloxiacetatos, triclopir e fluroxipir, ou do herbicida de ácido picolinico, picloram. A vasta resistência a fenoxiauxina é a primeira relatada em planta. As auxinas alternativas para as quais AAD-1 não protege seriam ferramentas viáveis para o controlo e contenção de culturas comerciais transformadas com AAD-1 ou espécies vegetais experimentais.

Tabela 19. Avaliação de ensaio de placas in vítro de resistência cruzada a substrato herbicida conferida por AAD-1 (v3) em Arabidopsis T4 homozigóticas (ARBTH). Composto Estrutura 150 para rebento ARBTH de tipo selvagem 150 para rebento PAAD1.31 5.064 T3 ARBTH 150 para rebento ARBTH de tipo selvagem 150 para rebento PAAD1.31 5.064 ARBTH Razão de rebento Razão de raiz Ppm Fenoxiauxinas 2, 4-D 0,2 10 < 0,01 0, 04 50 >4 diclorprop 2 5 0,01 1,5 2,5 150 Mecoprop 2 25 0,01 1,5 12,5 150 MCPA ΤΧλ 0,2 1 0,01 0,03 5 3 103 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

Tabela 19. Avaliação de ensaio de placas in vitro de resistência cruzada a substrato herbicida conferida por AAD-1 (v3) em Arabidopsis T4 homozigóticas (ARBTH). Composto Estrutura 150 para rebento ARBTH de tipo selvagem 150 para rebento PAAD1.31 5.064 T3 ARBTH 150 para rebento ARBTH de tipo selvagem 150 para rebento PAAD1.31 5.064 ARBTH Razão de rebento Razão de raiz Ppm Fenoxiauxinas 2,4,5-T YY o α^λ 1.5 10 <0, 01 <0, 01 6,67 NA Piridinoauxinas Fluroxipir o \_y~:= o o !h 2 1 0,2 0,2 0,5 1 Triclopir 0,2 0,04 0,02 0, 02 0,2 1 Picloram N cr*'* Ν'^Λ'^ΐΓ'° 0 1 0,5 0,3 0, 15 0,5 0,5 6.9 - Resistência a aplicações foliares de herbicida em

Arabidopsis AAD-1.

Determinou-se a capacidade de AAD-1 (v3) proporcionar resistência a outros herbicidas auxínicos ariloxifenoxialcanoatos em Arabidopsis transgénica por aplicação foliar dos vários substratos descritos no exemplo 6.8. Estratificou-se geração T4 de semente de Arabidopsis, homozigótica para AAD-1 (v3) (linha AAD1.01.315.076) e semeou-se em tabuleiros de selecção de modo muito semelhante ao de Arabidopsis (Exemplo 6.4). Plantou-se uma linha de controlo transformada contendo PAT e o gene CrylF de resistência a insectos de forma semelhante. Transferiram-se as plântulas para vasos individuais de 3 polegadas na estufa. Pulverizaram-se todas as plantas utilizando um moto-pulverizador a 187 L/ha. As plantas foram pulverizadas com uma gama de herbicidas fenoxiauxinicos: sal de dimetilamina de 104 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ 2.4- D (DMA) (Riverside Chemicals) 12,5-1600 g ae/ha, mecoprop (AH Marks) 12,5-1600 g ae/ha, R-diclorprop (AH Marks) 50-3200 g ae/ha, 2,4,5-T (grau técnico) 8,75-1120 g ae/ha; herbicidas piridiloxiacetatos triclopir (Dow AgroSciences) 50-3200 g ae/ha e fluroxipir (Dow AgroSciences) 50-3200 g ae/ha; e o metabolito de 2,4-D resultante de actividade AAD-1, 2.4- Diclorofenol (DCP, Sigma) (a 50-3200 g ae/ha, grau técnico). Todas as aplicações foram formuladas em tampão Hepes 200 mM (pH 7,5). Cada tratamento foi replicado 3-4 vezes. As plantas foram avaliadas 3 e 14 dias após tratamento e foram calculadas as médias de duas experiências.

Estes resultados (consultar tabela 20) confirmam que AAD-1 (v3) em Arabidopsis proporciona resistência robusta a auxinas fenoxiacéticas, auxinas fenoxipropiónicas, mas não mostraram resistência cruzada significativa às auxinas piridiloxiacéticas ensaiadas e corroboram os dados de especificidade de substrato da enzima in vitro e de placa completa. Adicionalmente, não há qualquer efeito do metabolito, 2,4-Diclorofenol (DCP), em Arabidopsis de tipo selvagem ou transgénica.

Tabela 20. Comparação da resposta de plantas de Arabidopsis homozigóticas e de tipo selvagem a vários herbicidas aplicação foliar. T4 AAD-1 (v3) auxinicos com Auxinas fenoxipropiónicas Tratamento com herbicida Média da % de lesões 14DAT Plantas AAD1.01.315.076.T4 homozigóticas AAD1 Controlo PatCrylf R-Diclorprop a 50 g ae/ha 3 31 R-Diclorprop a 200 g ae/ha 3 73 R-Diclorprop a 800 g ae/ha 3 89 R-Diclorprop a 3200 g ae/ha 3 95 Mecoprop a 12,5 g ae/ha 3 0 Mecoprop a 25 g ae/ha 0 2 Mecoprop 50 g ae/ha 0 17 Mecoprop a 100 g ae/ha 0 33 Mecoprop a 200 g ae/ha 3 62 Mecoprop a 400 g ae/ha 0 78 Mecoprop a 800 g ae/ha 0 93 Mecoprop a 1600 g ae/ha 0 100 105 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

Tabela 20. Comparação da resposta de plantas de Arabidopsis homozigóticas e de tipo selvagem a vários herbicidas aplicação foliar. T4 AAD-1 (v3) auxinicos com Auxinas fenoxipropiónicas Tratamento com herbicida Média da % de lesões 14DAT Plantas AAD1.01.315.076.T4 Controlo homozigóticas AAD1 PatCrylf Auxinas fenoxiacéticas Tratamento com herbicida Média da % de lesões 14 DAT Plantas AAD1.01.315.076.T4 Controlo homozigóticas AAD1 PatCrylf 2,4-D DMA a 12,5 g ae/ha 0 67 2,4-D DMA a 25 g ae/ha 0 78 2,4-D DMA a 50 g ae/ha 0 93 2,4-D DMA a 100 g ae/ha 0 100 2,4-D DMA a 200 g ae/ha 0 100 2,4-D DMA a 400 g ae/ha 0 100 2,4-D DMA a 800 g ae/ha 0 100 2,4-D DMA a 1600 g ae/ha 0 100 2,4,5-T a 8,75 g ae/ha 0 0 2,4,5-T a 17,5 g ae/ha 3 20 2,4,5-T a 35 g ae/ha 0 43 2,4,5-T a 70 g ae/ha 3 85 2,4,5-T a 140 g ae/ha 0 95 2,4,5-T a 280 g ae/ha 0 98 2,4,5-T a 560 g ae/ha 17 100 2,4,5-T a 1120 g ae/ha 3 100 Auxinas piridiloxiacéticas Tratamento com herbicida Média da % de lesões 14DAT Plantas AAD1.01.315.076.T4 Controlo homozigóticas AAD1 PatCrylf Triclopir a 50 g ae/ha 31 36 Triclopir a 200 g ae/ha 58 65 Tr iclopir a 800 g ae/ha 74 84 Triclopir a 3200 g ae/ha 97 95 Fluroxipir a 50 g ae/ha 48 76 Fluroxipir a 200 g ae/ha 75 85 Fluroxipir a 800 g ae/ha 88 85 Fluroxipir a 3200 g ae/ha 95 95 Metabolito DCP inactivo 2,4-DCP a 50 g ae/ha 0 0 106 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

Tabela 20. Comparação da resposta de plantas de Arabidopsis homozigóticas e de tipo selvagem a vários herbicidas aplicação foliar. T4 AAD-1 (v3) auxínicos com Auxinas fenoxipropiónicas Tratamento com herbicida Média da % de lesões 14 DAT Plantas AAD1.01.315.076.T4 homozigóticas AAD1 Controlo PatCrylf 2,4-DCP a 200 g ae/ha 0 0 2,4-DCP a 800 g ae/ha 0 0 2,4-DCP a 3200 g ae/ha 0 0 6.10 - Relação entre crescimento da planta e expressão de AAD-1 (v3) em Arabidopsis.

Concebeu-se uma experiência para analisar se o nivel de expressão de AAD-1 (v3) em Arabidopsis varia em diferentes estágios de crescimento. Cultivou-se em estufa uma linha AAD-1 (v3) T4 homozigótica (id=PAADl.01.345.163) de elevada tolerância. Metade das plantas foram tratadas com 2,4-D a 800 g ae/ha (tal como previamente descrito) enquanto a outra metade não foi tratada. Colheram-se duas folhas, a 3a folha a contar do topo e a 5a folha a contar da base, de 5 plantas, tanto tratadas, como não tratadas, e analisaram-se por experiências de ELISA e transferência "Western" (tal como descrito no exemplo 11) em 4, 10, 14, 20 e 25 DAT. As figuras 8A e 8B mostram que não houve qualquer diferença estatística na expressão de AAD-1 (v3) entre folhas novas e velhas. Além disso, o herbicida 2,4-D teve pouco impacto no nível de expressão da proteína AAD-1 (v3). Os níveis de proteína acumularam em plantas mais velhas com alguma degradação de proteína significativa nos pontos temporais mais tardios.

Numa experiência independente, pulverizaram-se quatro linhas diferentes de Arabidopsis T4 homozigóticas, que apresentam um nível de tolerância diferente ao herbicida 2,4-D, com vários níveis (0, 200, 800 e 3200 g/ha) de 2,4-D e analisaram-se as lesões por herbicida e a expressão de AAD-1 (v3). Quatro dias após o tratamento com herbicida, 107 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ observaram-se poucas lesões em três das quatro linhas, mesmo à dose mais elevada ensaiada (figura 9A) . Estas plantas também expressaram um nível elevado de AAD-1 (v3), de 0,1 a 0,25% (figura 9B). Pelo contrário, a linha de baixa tolerância expressou menos de 0,1% de AAD-1 (v3) em TSP e sofreu lesões observáveis. Mais importante, recuperaram das lesões em 14 DAT (figura 9A) , indicando que o baixo nivel de expressão de AAD-1 (v3) foi capaz de proteger as plantas de lesões graves por herbicida. Todas as plantas de controlo sofreram lesões graves e morreram a 14 DAT a doses de 2,4-D de 800 g ae/ha e superiores. 6.11 - Análise molecular de Arabidopsis AAD-1 (v3).

Efectuou-se o ensaio "Invader" (métodos dos procedimentos do kit "Third Wave Agbio") para o número de cópias do gene PAT e/ou análise de transferência "Southern" com ADN total obtido do kit Qiagen DNeasy em várias linhas AAD-1 (v3) homozigóticas para determinar integração estável da unidade de transformação da planta contendo PAT e AAD-1 (v3). A análise assumiu ligação física directa destes genes dado que eles estão contidos no mesmo plasmideo.

Para análise "Southern", sujeitou-se um total de 1 pg de ADN a uma digestão durante a noite com Nsi I para pDAB13721 para obter dados de integração. As amostras foram corridas num gel de agarose a 0,85 % grande durante a noite a 40 volts. O gel foi então desnaturado em NaOH 0,2 M, NaCl 0,6 M durante 30 minutos. O gel foi então neutralizado em Tris HC1 0,5 M, NaCl 1,5 M pH de 7,5 durante 30 minutos. Preparou-se então um aparelho de gel contendo SSC 20x para obter um gel de gravidade para transferência para membrana de nylon (Millipore INYC00010) durante a noite. Após a transferência durante a noite, a membrana foi então sujeita a luz UV através de um reticulador (Stratagene UV stratalinker 1800) a 1200 X100 microjoules. A membrana foi então lavada em SDS a 0,1%, SSC 0,lx durante 45 minutos. Após a lavagem de 45 minutos, a membrana foi incubada durante 3 horas a 80°C e seguidamente armazenou-se a 4°C até hibridação. O fragmento molde de 108 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ hibridaçao consistiu dos iniciadores preparados (Pat 5-3 AGATACCCTTGGTTGGTTGC) (SEQ ID NO: 23) e (Pat 3-3 CAGATGGATCGTTTGGAAGG) (SEQ ID NO:24) concebidos para obter a região de codificação de PAT. O produto foi então corrido num gel de agarose a 1% e excisado e seguidamente o gel foi extraido utilizando o procedimento de extracção de gel de Qiagen (28706). A membrana foi então sujeita a uma etapa de pré-hibridação a 60°C durante 1 hora em tampão Perfect Hyb (Sigma H7033). Utilizou-se o procedimento da reacção de marcação com dCTP Prime it RmT (Stratagene 300392) para revelar a sonda baseada em p32 (Perkin Elmer). Limpou-se a sonda utilizando colunas Probe Quant. G50 (Amersham 27-5335-01). Utilizaram-se dois milhões de contagens CPM por ml de tampão Perfect Hyb para hibridar as transferências "Southern" durante a noite. Após a hibridação durante a noite, sujeitaram-se as transferências a duas lavagens de 20 minutos a 65°C em SDS a 0,1%, SSC 0,lx. As transferências foram então expostas a película durante a noite, incubando a -80°C.

Os resultados demonstraram que todas as plantas resistentes a 2,4-D ensaiadas continham PAT (e assim consequentemente AAD-1 (v3)). A análise dos números de cópias demonstrou que o total de inserções estava na gama de 1 a >10 cópias. Tal correlaciona-se também com os dados de expressão de proteína AAD-1 (V3) indicando que a presença da enzima proporciona níveis significativamente elevados de resistência (>>200 vezes) a todos os ácidos fenoxiacéticos e fenoxipropiónicos disponíveis comercialmente. 6.12 - Arabidopsis transformada com junção molecular de AAD-1 (v3) e gene de resistência a glifosato.

Produziu-se semente de Arabidopsis Ti, tal como descrito previamente, contendo plasmídeo pDAB3230 (AAD-1 (v3) + EPSPS) que codifica uma suposta característica de resistência a glifosato. Seleccionaram-se os produtos de transformação Tx utilizando AAD-1 (v3) como o marcador seleccionável, tal como descrito no exemplo 6.6, excepto na taxa de 2,4-D utilizada que foi de 75 g ae/ha. Recuperaram-se vinte e quatro eventos 109 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ Τι transformados individualmente da primeira tentativa de selecção e transferiram-se para vasos de três polegadas na estufa, tal como descrito anteriormente. Ensaiaram-se três linhas de controlo de Arabidopsis diferentes: Columbia-0 de tipo selvagem, linha AAD-1 (v3) + PAT T5 homozigótica (transformada com pDAB721) e linha PAT + CrylF homozigótica (controlo transformado). Pré-seleccionaram-se apenas plantas pDAB3230 no estágio de plântula para tolerância a 2,4-D. Quatro dias após transplante, as plantas foram divididas igualmente por tratamento foliar por moto-pulverizador, tal como previamente descrito, com glifosato a 0, 26,25, 105, 420, ou 1680 g ae/ha (Glyphomax Plus, Dow AgroSciences) em tampão Hepes 200 mM (pH 7,5). Todos os tratamentos foram replicados 4 ou 5 vezes. As plantas foram avaliadas 7 e 14 dias após tratamento. Calcularam-se os valores de I50 e verificou-se que o nível de tolerância proporcionado por EPSPS em junção molecular com AAD-1 (v3) foi >14 vezes (consultar a figura 10). AAD-1 (v3) não proporcionou por si só resistência a glifosato (relativo a resposta a pDAB721). Estas plantas Ti serão cultivadas até se obterem sementes e autopolinizadas para obter sementes T2. As plantas Ti pDAB 3230 demonstraram tolerância a doses letais de 2,4-D e glifosato. As plantas T2 serão ensaiadas adicionalmente para demonstrar que estas plantas co-transformadas resistem a tratamentos de glifosato + 2,4-D aplicados em mistura em tanque, tal como descrito no exemplo 21 e apresentado para milho transformado com AAD-1 (v3) no exemplo 8.

Exemplo 7 - Transformação de milho mediada por fios ("WHISKERS") e utilização de AAD-1 (v3) como um marcador seleccionável 7.1- Clonagem de AAD-1 (v3). DH5a.

Efectuaram-se

Obteve-se o fragmento AAD-1 (v3) de um fragmento Ncol/Sacl. Digeriu-se a construção pDAB4005 com Ncol e Saci e isolou-se o fragmento de esqueleto de 5175 pb. Ligaram-se conjuntamente os dois fragmentos utilizando ADN-ligase de T4 e transformaram-se em células 110 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ minipreparações nas colónias resultantes utilizando o kit QIA Spin mini prep da Qiagen e digeriram-se as colónias para verificar a orientação. O plasmídeo intermediário correcto foi denominado pDAB3403. Digeriram-se pDAB3403 e pDAB8505 (OsActl/PAT/ZmLip) com NotI. Isolou-se e purificou-se a banda de 3442 pb de pDAB3403 e a banda de 11017 pb de pDAB8505. Ligaram-se conjuntamente os fragmentos, transformaram-se para DH5oí e rastrearam-se os plasmídeos resultantes para orientação. A construção final foi denominada pDAB3404, gue contém ZmUbil/po-aadl/ZmPer5::OsActl/PAT/ZmLip. 7.2 - Iniciação de calo/suspensão.

Para obter embriões imaturos para iniciação de cultura de calo, efectuaram-se cruzamentos Fi entre parentes A e B Hi-II cultivados em estufa (Armstrong et ai. 1991). Quando os embriões atingiram 1,0-1,2 mm de tamanho (aproximadamente 9-10 dias após-polinização), colheram-se as espigas e esterilizou-se a superfície esfregando com detergente Liqui-Nox®, imersão em etanol a 70% durante 2-3 minutos, seguidamente imersão em lixívia comercial a 20% (hipoclorito de sódio a 0,1%) durante 30 minutos.

Enxaguaram-se as espigas em água destilada, estéril e excisaram-se assepticamente os embriões zigóticos imaturos e cultivaram-se em meio 15Agl0 (meio N6 (Chu et ai., 1975), 2,4-D a 1,0 mg/L, sacarose a 20 g/L, hidrolisado de caseína (digestão enzimática) a 100 mg/L, L-prolina 25 mM, AgNC>3 10 mg/L, Gelrite a 2,5 g/L, pH 5,8) durante 2-3 semanas com o escutelo virado para fora do meio. Transferiu-se selectivamente o tecido que apresenta a morfologia adequada (Welter et al., 1995) em intervalos de duas semanas para meio 15Agl0 fresco durante cerca de 6 semanas, seguidamente transferiram-se para meio 4 (meio N6, 2,4-D a 1,0 mg/L, sacarose a 20 g/L, hidrolisado de caseína (digestão enzimática) a 100 mg/L, L-prolina 6 mM, Gelrite a 2,5 g/L, pH 5,8) a intervalos de duas semanas durante aproximadamente 2 meses. 111 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

Para iniciar as culturas embriogénicas em suspensão, adicionou-se aproximadamente 3 ml de volume celular empacotado (PCV) de tecido de calo originário de um único embrião a aproximadamente 30 ml de meio liquido H9CP+ (mistura salina basal MS (Murashige e Skoog, 1962), vitaminas MS modificadas contendo 10 vezes menos ácido nicotinico e 5 vezes mais tiamina-HCl, 2,4-D a 2,0 mg/L, ácido α-naftalenoacético (NAA) a 2,0 mg/L, sacarose a 30 g/L, hidrolisado de caseina (digestão ácida) a 200 mg/L, mio-inositol a 100 mg/L, L-prolina 6 mM, água de coco a 5% v/v (adicionada imediatamente antes de subcultura), pH 6,0). As culturas em suspensão foram mantidas em condições de escuro em matrazes Erlenmeyer de 125 ml num agitador com temperatura controlada a 125 rpm, a 28°C. Tipicamente estabeleceram-se linhas celulares no intervalo de 2 a 3 meses após iniciação. Durante o estabelecimento, as suspensões foram sub-cultivadas de 3,5 em 3,5 dias por adição de 3 ml de PCV de células e 7 ml de meio condicionado a 20 ml de meio liquido H9CP+ fresco utilizando uma pipeta de ponta larga. Quando o tecido começou a duplicar de tamanho, aumentou-se a escala das suspensões e mantiveram-se em matrazes de 500 ml para os quais se transferiu 12 ml de PCV de células e 28 ml de meio condicionado para 8 0 ml de meio H9CP+. Quando as suspensões estavam completamente estabelecidas, foram crio-conservadas para uso futuro. 7.3 - Crio-conservação e descongelamento de suspensões.

Dois dias após subcultura, adicionou-se 4 ml de PCV de células em suspensão e 4 ml de meio condicionado a 8 ml de crio-protector (dissolvido em meio H9CP+ sem água de coco, glicerol 1 M, DMSO 1 M, sacarose 2 M, esterilizado por filtração) e deixou-se a agitar a 125 rpm a 4°C durante 1 hora num matraz de 125 ml. Após 1 hora, adicionou-se 4,5 ml a um frasquinho de congelamento Corning de 5,0 ml arrefecido. Depois de encher os frasquinhos individuais, mantiveram-se durante 15 minutos a 4°C num congelador de velocidade controlada, seguidamente deixaram-se congelar a uma velocidade de -0,5°C/minuto até atingir a temperatura final de -40°C. 112 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

Após atingir a temperatura final, transferiram-se os frasquinhos para caixas dentro de prateleiras dentro de uma unidade de armazenamento Cryoplus 4 (Forma Scientific) cheia com vapor de azoto liquido.

Para descongelar, removeram-se os frasquinhos da unidade de armazenamento e colocaram-se num recipiente de gelo seco fechado, seguidamente mergulharam-se num banho de água mantido a 40-45°C até parar o borbulhamento. Depois de descongelados, despejou-se o conteúdo para uma pilha de ~8 papéis de filtro Whatman de 70 mm (N.° 4) estéreis em placas de Petri de 100x25 mm cobertas. Deixou-se absorver o liquido pelos filtros durante vários minutos, seguidamente transferiu-se o filtro do topo que continha as células para meio GN6 (meio N6, 2,4-D a 2,0 mg/L, sacarose a 30 g/L, Gelrite a 2,5 g/L, pH 5,8) durante 1 semana. Após 1 semana, transferiu-se apenas o tecido com morfologia promissora do papel de filtro directamente para meio GN6 fresco. Este tecido foi subcultivado em intervalos de 7-14 dias até se encontrarem disponíveis 1 a 3 gramas para iniciação de suspensão em aproximadamente 30 mL de meio H9CP+ em matrazes Erlenmeyer de 125 ml. Subcultivaram-se três mililitros de PCV para meio H9CP+ fresco de 3,5 em 3,5 dias até se obter um total de 12 ml de PCV, altura em que se fez subcultura tal como anteriormente descrito. 7.4 - Dose-resposta de tecido não transformado a ácido haloxifop.

Puseram-se conjuntamente linhas celulares Hi-II dadoras não transformadas, tratadas com fios ("WHISKERS") sem ADN, filtradas para meio GN6 a uma velocidade de 6 ml por filtro e deixaram-se formar calo durante 2-3 semanas a 28°C. Transferiu-se aproximadamente 200 mg de tecido em suspensão em calo por tratamento para meio de selecção em placas de 60x20 mm contendo ácido R-haloxifop 30, 100 ou 300 nM. Utilizaram-se três réplicas por concentração. Incluiu-se também um meio de controlo contendo bialafos a 1 mg/L (formulação comercial Herbiace, Meiji Seika, Japão), GN6 (1H) para comparação. Removeu-se o calo após 2 semanas, pesaram-se 113 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ e transferiram-se para meio fresco da mesma concentração durante mais 2 semanas. Após terem passado um total de 4 semanas, removeu-se o tecido, pesou-se ao tempo final e seguidamente rejeitou-se. Os resultados apresentam-se na figura 11.

Efectuaram-se também dois estudos de dose-resposta independentes de tecido de calo aos produtos de degradação de fenol de haloxifop e ci-halofop, respectivamente, para confirmar que este produto final não é prejudicial ao crescimento de calo. Os dados de dose-resposta de fenol de ci-halofop (consultar a figura 12) demonstram que para fenol de ci-halofop 1 μΜ, o crescimento é ainda 76% o do controlo sem fenol de ci-halofop. Os dados de dose-resposta de fenol de haloxifop demonstram que mesmo para fenol de haloxifop 300 nM, o crescimento foi igual ou superior ao controlo sem fenol de haloxifop (dados não apresentados). 7.5 - Transformação mediada por fios ("WHISKERS") utilizando selecção com bialafos.

Aproximadamente 24 horas antes de transformação, subcultivou-se 12 ml de PCV de células embriogénicas de milho em suspensão previamente crio-conservadas mais 28 ml de meio condicionado para 80 ml de meio liquido GN6 (meio liquido GN6 sem Gelrite) num matraz Erlenmeyer de 500 ml e colocou-se num agitador a 125 rpm, a 28°C. Repetiu-se isto 2 vezes utilizando a mesma linha celular, de modo que se distribuiu um total de 36 ml de PCV para 3 matrazes. Após 24 horas, removeu-se o meio liquido GN6 e substituiu-se por 72 ml de meio osmótico GN6 S/M (meio N6, 2,4-D a 2,0 mg/L, sacarose a 30 g/L, sorbitol a 45,5 g/L, manitol a 45,5 g/L, mio-inositol a 100 mg/L, pH 6,0) por matraz de modo a plasmolisar as células. Colocaram-se os matrazes num agitador no escuro durante 30-35 minutos e durante este tempo preparou-se uma suspensão a 50 mg/ml de fios ("whiskers") de carbeto de silício por adição do volume adequado de meio líquido GN6 S/M a -405 mg de fios ("whiskers") de carbeto de silício (Advanced Composite Materials, Inc.) pré-autoclavados. 114 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

Após incubação em GN6 S/M, recolheram-se conjuntamente os conteúdos de cada matraz para um frasco de centrífuga de 250 ml. Depois de todas as células terem sedimentado no fundo, retirou-se todo o GN6 S/M líquido excepto ~14 ml e recolheu-se para um frasco de 1 L estéril para futura utilização. Sujeitou-se a suspensão de fios ("whiskers") pré-molhada a vortex durante 60 segundos à velocidade máxima e adicionou-se 8,1 ml ao frasco, ao qual se tinha adicionado 170 pg de ADN como última etapa. Colocou-se o frasco imediatamente num misturador de tinta comercial Red Devil 5400 modificado e agitou-se durante 10 segundos. Após agitação, adicionou-se a mistura de células, meios, fios ("whiskers") e ADN ao conteúdo de um matraz de 1 L conjuntamente com 125 ml de meio líquido GN6 fresco para reduzir o agente osmótico. Deixaram-se as células recuperar num agitador durante 2 horas antes de se filtrar com papel de filtro Whatman n.° 4 (5,5 cm) utilizando uma unidade de recolha de célula de vidro ligada a uma linha de vácuo.

Pipetou-se 3 ou 6 mL de suspensão dispersa para a superfície do filtro e ligou-se o vácuo. Colocaram-se os filtros em placas de 60 x 20 mm de meio GN6. Cultivaram-se as placas durante 1 semana a 28°C numa caixa escura que foi fechada folgadamente com uma única camada de plástico (< 2 mm de espessura) para minimizar a evaporação das placas individuais.

Após 1 semana, transferiram-se os papéis de filtro para placas de 60x20 mm de meio GN6 (1H) (meio N6, 2,4-D a 2,0 mg/L, sacarose a 30 g/L, mio-inositol a 100 mg/L, bialafos a 1,0 mg/L; Gelrite a 2,5 g/L, pH 5,8) ou meio GN6D (1H) (igual a GN6 (1H) excepto com dicamba a 8,0 mg/L e 2,4-D a 0, 8 mg/L) .

Colocaram-se as placas em caixas e cultivaram-se como anteriormente durante uma semana adicional. Duas semanas após transformação, embebeu-se o tecido raspando ^ das células na placa ou todas as células na placa para 3,0 mL de meio GN6 de 115 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ agarose fundido (meio N6, 2,4-D a 2,0 mg/L, sacarose a 30 g/L, mio-inositol a 100 mg/L, agarose Sea Plaque a 7 g/L, pH 5,8, autoclavado durante apenas 10 minutos a 121°C) contendo bialafos a 1 mg/L. Quebrou-se o tecido e despejou-se homogeneamente os 3 mL de agarose e tecido na superfície de uma placa de 100 x 15 mm de meio GN6 (1H) ou GN6D (1H) . Repetiu-se isto para todas as placas restantes. Uma vez embebidas, selaram-se individualmente as placas com Nescofilm® ou Parafilm M® e seguidamente cultivaram-se durante 1 semana a 28°C em caixas escuras.

Os isolados supostamente transformados foram tipicamente visíveis 5-8 semanas após transformação. Removeram-se todos os isolados potenciais da placa embebida e transferiram-se para meio de selecção fresco da mesma concentração em placas de 60 x 20 mm. Nos casos em que foi evidente crescimento sustentável após aproximadamente 2 semanas, considerou-se o evento resistente e foi submetido para análise molecular.

Iniciou-se a regeneração por transferência de tecido de calo para um meio de indução baseado em citoquinina, 28 (1H), contendo bialafos a 1 mg/L, sais e vitaminas MS, sacarose a 30,0 g/L, BAP a 5 mg/L, 2,4-D a 0,25 mg/L, Gelrite a 2,5 g/L; pH 5,7. Deixaram-se crescer as células em luz baixa (13 pEm^s-1) durante uma semana e seguidamente com luz mais forte (40 pEirr2s_1) durante outra semana antes de se transferirem para meio de regeneração, 36 (1H), que foi idêntico a 28 (1H) excepto sem os reguladores de crescimento de plantas. Removeram-se plântulas pequenas (3-5 cm) e colocaram-se em tubos de cultura de 150 x 25 mm contendo meio SHGA sem selecção (sais e vitaminas basais de Schenk e Hildebrandt, 1972; mio-inositol a 1 g/L, sacarose a 10 g/L, Gelrite a 2,0 g/L, pH 5,8). Quando as plântulas desenvolveram um sistema de raiz e rebento suficiente, foram transplantadas para solo na estufa. 7.6 - Transformação mediada por fios ("WHISKERS") utilizando selecção com haloxifop. 116 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

Os parâmetros de entrega de ADN para selecção directa com "fop" foram idênticos ao procedimento de selecção com bialafos excepto que se co-transformaram conjuntamente 85 pg de pDAB3403 e 85 pg de construção contendo um gene repórter de GFP (proteína fluorescente verde) e apenas se filtraram 3 mL de suspensão para meio GN6 seguido de uma recuperação de 2 horas.

Após 0-7 dias em meio GN6 isento de selecção, transferiram-se os papéis de filtro para placas de 60x20 mm de meio GN6 contendo 2,4-D a 2 mg/L e ácido R-haloxifop 50, 100, ou 200 nM. Colocaram-se as placas em caixas e cultivaram-se durante uma semana adicional. Após uma semana, o tecido foi embebido raspando todas as células da placa para 3,0 mL de meio GN6 de agarose fundido contendo a mesma concentração de agente de selecção da transferência anterior. Todas as etapas seguintes foram idênticas ao protocolo de selecção/regeneração PAT excepto por se ter incluído ácido R-haloxifop 100 nM no meio de regeneração em vez de bialafos a 1 mg/L. 7.7 - Resultados.

Iniciaram-se múltiplas experiências de ensaio de vários níveis de haloxifop e ci-halofop e recuperaram-se 47 isolados da selecção directa. Submeteu-se um subconjunto dos eventos de calo a rastreio utilizando análise por PCR e "Western". Após estes dados de expressão, submeteram-se 21 eventos principais a análise "Southern". Os resultados utilizando Ncol, um cortador único, para obter dados de integração após sondagem com AAD-1 (v3), demonstram inequivocamente integração estável de AAD-1 (v3) após transformação mediada por fios ("Whiskers") acoplada a selecção com "fop". 7.8 - Demonstração quantitativa de tolerância in vitro de eventos de calo que expressam AAD-1 (v3) de selecção com bialafos

Submeteram-se noventa e sete isolados de calo recuperados de selecção com bialafos a análise do número de cópias de PAT 117 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ através de Invader e análise de PTU de AAD-1 (v3) através de PCR (consultar exemplo 7.10). Efectuou-se expressão de proteína AAD-1 (v3) utilizando transferência "Western"/ELISA em sanduíche (exemplo 11) num subconjunto dos eventos. Descreve-se um resumo na seguinte tabela 21. Regeneraram-se pelo menos 15 plantas T0 de cada um destes eventos e enviaram-se para ensaio de pulverização e produção de semente.

Tabela 21. Evento N.fl de cópias de PAT PCR para PTU de AAD-1 (v3) "Western" de calo 3404-001 2 + + 3404-006 2 + + 3404-013 3 + + 3404-017 1 + + 3404-020 3 + Nd 3404-022 2 + + 3404-025 2 + + 3404-027 3 + + 3404-031 1 + + 3404-033 2 + Nd 3404-036 3 + + 3404-044 3 + + 3404-050 3 + + 3404-053 3 + + 3404-074 2 + + 3404-082 2 + +

Avaliou-se um subconjunto menor destes eventos em estudos de dose-resposta em comparação com controlo não transformado. Ensaiou-se uma gama de concentrações de haloxifop (de formulação Gallant Super) , até 400 nM. Os dados de dose-resposta para um evento, 3404-006, foram gerados utilizando os métodos gerais do exemplo 7.4 e apresentam-se na figura 13. Tal demonstra que o evento 3404-006 não apresentava qualquer redução significativa de crescimento de calo a concentrações de haloxifop até 400 nM, enquanto o crescimento de tecido de calo de milho não transgénico foi inibido a esta taxa. Estes dados não foram normalizados para contabilizar as diferenças de crescimento inerentes que não estão relacionadas com a expressão do transgene. 118 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ 7.9 Transformação mediada por fios ("WHISKERS") utilizando selecção com imazetapir.

Removeu-se a cassete ZmUbil/AAD-1 (v3)/ZmPer5 de pDAB3404 com AscI/SwaI e inseriu-se em pDAB2212 para criar o vector de transformação com fios ("Whiskers") pDAB3415 com AAD-1 (v3) e AHAS, que também se denomina pDAS1283. Uma vez completa, transformou-se esta construção para milho através de transformação mediada por fios ("whiskers") de carbeto de silício tal como descrito no exemplo 7.4, excepto que se filtraram 2 mL de células seguida de uma recuperação de 7 dias em meio GN6, seguida de selecção em meio contendo herbicida imazetapir 3 μΜ de Pursuit® DG. Após análise Invader, identificaram-se 36 eventos que continham os genes AAD-1 (v3) e AHAS.

Ensaiaram-se cinquenta e três calos de milho destas transformações em experiências de ELISA e de transferência "Western" para a sua expressão de AAD-1 (v3) - apresenta-se um subconjunto dos dados seguidamente. Para os eventos apresentados na tabela 22, os níveis de expressão desses positivos detectados variaram na gama de 90 até mais de 1000 ppm de proteínas solúveis totais.

Tabela 22. N.fi de identificação de evento AAD-1 Nivel de expressão (ppm) Transferência "Western" 1283 [1]-001 2 - 1283 [1]-002 206 + + + 1283 [1]-003 1 - 1283 [1]-004 90 + + + 1283 [1]-005 1 - 1283 [1]-006 105 + + + 1283 [1]-007 212 + + 1283 [1]-008 114 ± 1283 [1]-009 305 + 1283 [1]-010 2 - 1283 [1]-011 4 - 1283 [1]-012 200 + + + 1283 [1]-013 134 +++ 1283 [1]-014 4 - 119 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

Tabela 22. N.s de identificação de evento Nível de expressão Transferência AAD-1 (ppm) "Western" 1283[1]-015 194 + + + 1283 [1]-016 4 - 1283 [1]-017 196 + + + 1283 [1]-018 3 - 1283 [1]-019 178 + 1283 [1]-020 260 + + 1283 [1]-021 144 + + + 1283 [1]-022 140 + + + 1283[1]-023 191 + + + 1283 [1]-024 392 + + 1283 [1]-025 368 + + 1283 [1]-026 14 - 1283 [1]-027 1006 + + Controlo negativo 3 - Controlo negativo 3 - Padrão (0,5 pg/mL) + + Padrão (5 gg/mL) + + + + 7.10- Análise molecular: Materiais e métodos de milho. 7.10.1 - Colheita de tecido, isolamento e quantificação de ADN.

Colocou-se tecido fresco em tubos e liofilizou-se a 4°C durante 2 dias. Após o tecido estar completamente seco, colocou-se uma pérola de tungsténio (Valenite) no tubo e as amostras foram sujeitas a 1 minuto de moagem a seco utilizando um moinho de bolas Kelco. Seguiu-se então o procedimento de isolamento de ADN padrão DNeasy (Qiagen, DNeasy 69109). Corou-se então uma alíquota do ADN extraído com Pico Green (Molecular Probes P7589) e leu-se no fluorómetro (BioTek) com padrões conhecidos para obter a concentração em ng/μΐ. 7.10.2 - Análise por ensaio Invader.

Diluíram-se as amostras de ADN a 20 ng/μΐ, seguidamente desnaturaram-se por incubação num termociclador a 95°C durante 10 minutos. Preparou-se então mistura de sonda de sinalização utilizando a mistura de oligonucleótidos e MgCl2 (Third Wave 120 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

Technologies) proporcionada. Colocou-se uma alíquota de 7,5 μΐ em cada poço da placa de ensaio Invader, seguido por uma aliquota de 7,5 μΐ de controlos, padrões e amostras desconhecidas diluidas a 20 ng/μΐ. Cobriu-se cada poço com 15 μΐ de óleo mineral (Sigma). As placas foram então incubadas a 63°C durante 1 hora e leram-se no fluorómetro (Biotek). Para o cálculo da razão, calculou-se a % sinal acima da linha de base para a sonda alvo dividida pela % sinal acima da linha de base da sonda de controlo interno. Utilizou-se a razão de padrões de número de cópias conhecidos, revelados e validados por análise de transferência "Southern", para identificar as cópias estimadas dos eventos desconhecidos. 7.10.3 - Reacção de polimerização em cadeia.

Utilizou-se um total de 100 ng de ADN total como molde. Utilizou-se cada iniciador a 20 mM com o kit Takara Ex Taq PCR Polymerase (Mirus TAKRR001A). Os iniciadores para o AAD-1 (v3) PTU foram (Directo - ATAATGCCAGC CTGTTAAACGCC) (SEQ ID NO:25) e (Inverso - CTCAAGCATATGAATGACCT CGA) (SEQ ID NO:26). Efectuou-se a reacção de PCR no termociclador 9700 Geneamp (Applied Biosystems), submetendo as amostras a 94°C durante 3 minutos e 35 ciclos de 94°C durante 30 segundos, 63°C durante 30 segundos e 72°C durante 1 minuto e 45 segundos seguido de 72°C durante 10 minutos. Os iniciadores para PCR de região de codificação de AAD-1 (v3) foram (Directo -ATGGCTCATGCTGCCCTCAGCC) (SEQ ID NO:27) e (Inverso - CGGGC AGGCCTAACTCCACCAA) (SEQ ID NO:28). Efectuou-se a reacção de PCR no termociclador 9700 Geneamp (Applied Biosystems), submetendo as amostras a 94°C durante 3 minutos e 35 ciclos de 94°C durante 30 segundos, 65°C durante 30 segundos e 72°C durante 1 minuto e 45 segundos seguido de 72°C durante 10 minutos. Analisaram-se os produtos de PCR por electroforese num gel de agarose a 1% corado com EtBr. 7.10.4 - Análise de transferência "Southern".

Efectuou-se análise de transferência "Southern" com ADN total obtido do kit Qiagen DNeasy. Sujeitou-se um total de 121 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ 2 pg de ADN a uma digestão durante a noite de Afl II e também EcoRV para pDAB3404, Ncol para pDAB3403 e Spel para pDAB1421 para obter dados de integração. Após a digestão durante a noite, correu-se uma alíquota de -100 ng num gel a 1% para assegurar digestão completa. Após se ter assegurado tal, correram-se as amostras num gel de agarose a 0,85% grande durante a noite a 40 volts. O gel foi então desnaturado em NaOH 0,2 M, NaCl 0,6 M durante 30 minutos. O gel foi então neutralizado em Tris HC1 0,5 M, NaCl 1,5 M pH de 7,5 durante 30 minutos. Preparou-se um aparelho de gel contendo SSC 20x para transferir um gel por gravidade para membrana de nylon (Millipore INYC00010) durante a noite. Após a transferência durante a noite, a membrana foi então sujeita a luz UV através de reticulador (Stratagene UV stratalinker 1800) a 1200 X100 microjoules. A membrana foi então lavada em SDS a 0,1%, SSC 0,lx durante 45 minutos. Após a lavagem de 45 minutos, a membrana foi incubada durante 3 horas a 80 °C e seguidamente armazenada a 4°C até hibridação. Preparou-se o fragmento de molde de hibridação utilizando a região de codificação de PCR anterior utilizando o plasmídeo pDAB3404. O produto foi então corrido num gel de agarose a 1% e excisado e seguidamente extraído do gel utilizando o procedimento de extracção de gel de Qiagen (28706) . A membrana foi então sujeita a uma etapa de pré-hibridação a 60°C durante 1 hora em tampão Perfect Hyb (Sigma H7033). Utilizou-se o procedimento de reacção de marcação com dCTP Prime it RmT (Stratagene 300392) para revelar a sonda baseada em p32 (Perkin Elmer): Limpou-se a sonda utilizando colunas Probe Quant. G50 (Amersham 27-5335-01). Utilizaram-se dois milhões de contagens CPM para hibridar as transferências "Southern" durante a noite. Após a hibridação durante a noite, sujeitaram-se então as transferências a duas lavagens de 20 minutos a 65°C em SDS a 0,1%, SSC 0,lx. Expuseram-se então as transferências a película durante a noite, incubando a - 80°C.

Exemplo 8 - Dados de tolerância in vivo e tolerância no campo gerados a partir de eventos AAD-1 (v3) seleccionados por PAT (pDAB3404) 122 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ 8.1 - Tolerância de plantas de milho Tp a herbicidas AOPP.

Caso se tenham regenerado com sucesso mais de 15 clones de plantas por evento, transferiram-se então plantas extra para a estufa para rastreio preliminar de tolerância com herbicidas AOPP aplicados pós-emergência em plantas de milho To. Deixou-se que as plantas aclimatadas a estufa crescessem até à emergência do verticilo de 2-4 folhas novas e de aparência normal (i.e., as plantas mudaram das condições de crescimento de cultura de tecidos para as condições de crescimento de estufa). Cresceram-se as plantas a 27°C em condições de 16 horas de luz: 8 horas de escuro na estufa. Trataram-se então as plantas com formulações comerciais de um de três herbicidas AOPP: Assure® II (DuPont), Clincher* (Dow AgroSciences) ou Gallant Super* (Dow AgroSciences) para quizalofop, ci-halofop ou haloxifop, respectivamente. As aplicações de herbicida foram efectuadas com um moto-pulverizador a um volume de pulverização de 187 L/ha, altura de pulverização de 50 cm e todos os líquidos para pulverização continham adjuvante concentrado de óleo de cultura Agridex a 1% v/v. 0 número de clones de cada evento variou de semana a semana devido à taxa de regeneração e aclimatação de cada evento. Globalmente fez-se uma tentativa de tratar clones representativos de cada evento com uma gama de doses de herbicida entre IX a dose letal (~l/8 X a dose de campo) até 8X a dose de campo (64 X a dose letal) . Define-se uma dose letal como a taxa que provoca uma lesão >95% ao Hi-II de linha consanguínea. Hi-II são os antecedentes genéticos dos produtos de transformação do presente invento.

Os AOPP são geralmente herbicidas muito potentes na eliminação de milho. O milho com três a quatro folhas Hi-II cultivado a partir da semente é eliminado eficazmente (>95% de lesão) com 8,8, 62,5 e 4,4 g ae/ha de haloxifop, ci-halofop e quizalofop, respectivamente. Cada uma das linhas ensaiadas e transformadas com AAD-1 (v3) sobreviveu a uma dose minimamente letal de cada herbicida AOPP ensaiado. De facto, a maioria das linhas ensaiadas sobreviveu sem lesões visíveis (14 DAT) mesmo quando tratada com uma dose de campo de 8X (64X a dose letal) 123 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ de quizalofop. No entanto, vários clones individuais dos eventos "017" e "038" sofreram lesões significativas com taxas elevadas. Tal poderia ser uma consequência de expressão génica reduzida devido à forma ou local de inserção do gene.

Demonstrou-se o elevado nível de tolerância a AOPP para a maioria dos eventos, mesmo quando se fizeram aplicações em plantas acabadas de sair da cultura de tecidos (estágio To). Significativamente, demonstrou-se esta tolerância para os três herbicidas AOPP e provavelmente poderá estender-se a todos os herbicidas AOPP tal como previamente demonstrado para AAD-1 in vitro. A figura 14 apresenta as respostas de vários clones de eventos transformados com AAD-1 (v3) ou não transformados a doses letais de dois herbicidas AOPP (haloxifop e quizalofop) aplicados uma semana antes. A tabela 23 apresenta dados para as respostas de eventos de milho T0 transformados com AAD-1 (v3) seleccionados, a três herbicidas AOPP aplicados após emergência.

Tabela 23. Resposta de eventos de milho T0 transformados com AAD-1 (v3) seleccionados a três herbicidas AOPP aplicados após emergência. Construção Evento Clone Haloxifop* g ae/ha Ci-halofop* * g ae/ha Quizalofop*** g ae/ha % lesão 14 DAT 3404 001 016 8,8 0 3404 001 018 62,5 0 3404 001 017 8,8 0 3404 001 019 8, 8 30 3404 001 020 35 0 3404 017 018 35 0 3404 017 019 35 0 3404 017 020 70 0 3404 017 021 70 0 3404 017 022 140 0 3404 017 023 140 30 3404 017 024 280 30 3404 017 025 280 20 3404 022 019 8,8 0 3404 022 020 17,5 0 3404 022 016 17,5 0 3404 022 024 62,5 0 3404 022 018 125 0 124 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

Tabela 23. Resposta de eventos de milho T0 transformados com AAD-1 (v3) seleccionados a três herbicidas AOPP aplicados após emergência. Construção Evento Clone Haloxifop* g ae/ha Ci—halofop* * g ae/ha Quizalofop*** g ae/ha % lesão 14 DAT 3404 022 021 00 00 0 3404 022 017 17, 5 0 3404 022 022 35 0 3404 022 023 70 0 3404 033 012 35 0 3404 033 013 70 0 3404 033 014 70 0 3404 033 015 140 0 3404 033 016 280 0 3404 038 016 00 00 0 3404 038 018 62,5 0 3404 038 017 00 00 0 3404 038 019 35 70 3404 038 020 35 80 3404 038 021 70 80 3404 038 022 70 80 (dose letal = (dose letal = (dose letal = 8,8 g ae/ha) 62,5 g ae/ha) 4,4 g ae/ha) *Gallant súper* + COC a 1% (v/v) **Clincher* + COC a 1% (v/v) ***Assure II + COC a 1% (v/v)

*Marca registada de Dow AgroSciences, LLC 8.2 - Tolerância no campo de plantas de milho pDAB3404 Ti aos herbicidas guizalofop, 2,4-D e qlufosinato.

Estabeleceram-se dois ensaios de campo nas estações de campo no Havai e Indiana. Utilizou-se sementes de milho de plantas Ti consanguíneas para avaliar dezasseis linhas de evento AAD1 para tolerância a quizalofop e 2,4-D. Incluíram-se três híbridos não transformados com objectivos comparativos. 0 híbrido Hi-II x 5XH571 é da mesma linhagem das linhas de evento AAD-1 (v3) . O híbrido Croplan 585SR é uma linha resistente a setoxidim. A concepção experimental foi um talhão dividido com quatro réplicas. 0 talhão principal foi tratado com herbicida e o sub-talhão foi evento AAD-1(v3) ou híbrido de comparação. Os talhões tinham uma fila por cada 3,7 metros com aproximadamente vinte e cinco sementes plantada em cada fila. 125 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

Para eventos AAD1 plantaram-se em cada replicado sementes de uma linhagem diferente dentro de cada evento.

Aplicou-se glufosinato a 560 g ae/ha nos talhões AAD-1 (v3) no estágio V2 para eliminar plantas não transformadas. Os tratamentos experimentais incluíram formulações comerciais de quizalofop aplicadas a 70 e 140 g ae/ha, 2,4-D (sal de dimetilamina) a 560 e 1120 g ae/ha e um controlo não tratado. Aplicaram-se os tratamentos utilizando equipamento pulverizador de mochila com vara com entrega de 187 L/ha de volume de transportador a uma pressão de 130-200 kpa. Aplicaram-se os tratamentos com quizalofop no estágio V3-V4 do milho e aplicaram-se os tratamentos com 2,4-D no estágio V5-V6.

Os talhões tratados com quizalofop foram avaliados visualmente para lesões nas colheitas às uma e três semanas após aplicação (WAA) usando uma escala 0-100%, em que 0 corresponde a ausência de lesão e 100 corresponde a morte completa. Os talhões tratados com 2,4-D foram avaliados visualmente para inclinação da planta aos 2 dias após aplicação (DAA) usando uma escala 0-100%, em que 0 corresponde a ausência de inclinação em todas as plantas e 100 corresponde a todas as plantas estarem inclinadas. Adicionalmente, os talhões 2,4-D foram avaliados visualmente a 3-4 WAA para deformação de raiz adventícia usando uma escala 0-10. 8.2.1- Resultados.

Apresenta-se na tabela 24 a resposta do evento AAD-1 (v3) às taxas mais elevadas ensaiadas de quizalofop e 2,4-D. Estas taxas representam aproximadamente duas vezes as taxas utilizadas normalmente comercialmente. Os híbridos não transformados foram gravemente lesionados (80-100%) por quizalofop a 70 g ae/ha incluindo a linha resistente a setoxidim, apesar de apresentar tolerância ligeiramente melhorada do que os outros dois híbridos. Todos os eventos AAD-1 (v3) com excepção de uma linhagem do evento 3404.001 apresentaram tolerância excelente a quizalofop a 70 g ae/ha. 126 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

Nao se observaram sintomas visíveis nos eventos AAD-1 (v3) com excepção dos eventos anteriormente mencionados.

Tabela 24 Trata- Quizalofop Amina de Amina de Razões de resistência à mento (140 g ae/ha 2, 4—D 2, 4- -D Resultados da análise segregação após (taxa)= ) (1120 g a (1120 g ae pulverização com e/ha) /ha) Liberty números transfe ELISA Avaliação % de lesão 3 % de Deformação de rência de Média da Média da = WAA (escala inclina— de raizes cópias "Western" AAD-1 população Ti população 0-100) ção 2DAA adventícia AAD-1 em de em T2 (escala s 3- -4 WAA folhas AAD-1 folha 0-100) (escala 0- (análise em To 10) "Southern" folha T0 Evento ou híbrido IN Hl IN Hl IN HI IN HI HI 3404.001 25 25 0 5 1 2 3 ++ + + + + 40% 47% X 3404.006 0 0 0 0 0 0 1 + + + + + 33% 26% X 3404.013 0 0 0 0 0 0 1 + + + + 63% 58% X 3404.017 0 0 1 0 0 0 2 +/- + + 48% 47% X 3404.020 0 0 0 0 0 0 2 + + + + + 50% 51% X 3404.022 0 0 1 0 0 0 1 + + + 51% 57% 76%* 3404.025 0 0 0 0 0 0 2 + + + + + + + 55% 59% X 3404.027 0 0 3 0 0 0 5 + + + 51% 50% X 3404.031 0 0 1 0 0 0 1 + + + + + + 47% 43% 61%* 3404.033 0 0 0 0 0 0 2 ou 3 + + + 52% 49% X 3404.036 0 0 0 0 0 0 4 + + + + + 52% 48% X 3404.044 0 0 1 0 0 1 1 + + /- 50% 48% X 3404.050 0 0 0 1 0 1 2 nd nd 38% 28% X 3404.053 0 0 1 0 0 0 2 + + + + + + 48% 56% X 3404.074 0 0 0 0 0 0 1 + + + + + 53% 52% 73%* 3404.082 0 0 0 0 0 1 3 nd nd 38% 36% X DK493 100 100 20 23 8 9 HI-II X 5XH571 100 100 13 34 7 9 CROPLAN 585SR 80 96 11 33 9 9 * Ajusta a segregação de característica dominante de local único tal como determinada pelo teste do Qui quadrado (P>0,05) 2,4-D a uma taxa de 1120 g ae/ha provocou níveis significativos (11-33%) de inclinação com torção do peciolo nos híbridos não transformados, uma resposta normal quando aplicado após o estágio de crescimento V4. Observou-se pouca ou nenhuma inclinação em todos os eventos AAD-1 (v3) com excepção de uma linhagem de 3404.001 (local do Indiana apenas) na qual se observaram níveis moderados de inclinação (5-13%). 127 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

As raízes adventícias de híbridos não transformados estavam gravemente deformadas (classificação de 9 numa escala de 0-10) por 2,4-D à taxa de 1120 g ae/ha. Mais uma vez esta é uma resposta normal a 2,4-D aplicado para além da fase de crescimento V4. Tal como com a resposta à inclinação, observaram-se poucas ou nenhumas lesões das raizes adventícias com todos os eventos AAD-1 (v3) com excepção de uma linhagem de 3404.001.

Ocorreram tendências semelhantes para razões ensaiadas inferiores de quizalofop e 2,4-D apesar de terem sido em níveis de resposta reduzidos mas ainda significativos nos híbridos não transformados (dados não apresentados).

Estes resultados indicam que a maioria das linhas de eventos transformadas com AAD-1 (v3) apresentaram um elevado nível de resistência a quizalofop e 2,4-D com taxas que foram letais ou provocaram malformações com torção do pecíolo grave em hibridos de milho não transformados. Consultar também a figura 16. 8.2.2 - Razões esperadas de segregação mendeliana em três eventos T2.

Autopolinizaram-se aleatoriamente no campo plantas de linhagens individuais de cada evento. Recolheram-se manualmente sementes T2 na maturidade fisiológica. Com base no número de cópias de gene único (consultar tabela 24 anteriormente) e desempenho global na geração Ti (segregação, tolerância a herbicida e vigor) escolheram-se três eventos (022, 031 e 074) para avaliação adicional no campo. Plantaram-se as filas de cultura de cada evento utilizando um semeador de cone de precisão consistindo cada um de 2500-3000 sementes. No estágio de crescimento V2 pulverizaram-se todas as linhas AAD-1 (v3) com quizalofop (Assure® II) 140 g ae/ha utilizando um pulverizador de mochila tal como anteriormente descrito. Esta taxa eliminou rapidamente todos os produtos de segregação "nulos" (não transformados). Cada 128 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ evento apresentou uma razão de segregação consistente com gene dominante com hereditariedade mendeliana de um único local (3 resistantes:1 sensível ou 75% de sobrevivência) (consultar tabela 24). Identificaram-se homozigotos e hemizigotos do evento 74 por ensaio de zigotia (referência à descrição do ensaio AAD-1 (v3) Invader para milho). Removeram-se as plantas hemizigóticas e cruzaram-se plantas homozigóticas AAD-1 (v3) com milho BE1146 consanguíneo com introgressão e homozigótico para a característica de resistência a glifosato, NK603, gerando uma semente híbrida Fi homogénea que é hemizigótica para resistência a glifosato, AAD-1 (v3) e resistência a glufosinato. 8.3 - Junção de AAD-1 (v3) e PAT com genes de resistência a glifosato em milho.

Cruzaram-se plantas de milho homozigóticas T2 AAD-1 (v3)/PAT com plantas de milho resistentes a glifosato produzindo-se uma semente Fi contendo AAD-1 (v3), PAT e genes de resistência a glifosato tal como descrito no exemplo anterior.

Plantaram-se individualmente sementes Fi em vasos de 3 polegadas preparados com meio de crescimento Metro-Mix® 360 (Sun Gro Horticulture). Os vasos foram inicialmente sub-irrigados com solução Hoagland até ficarem molhados e seguidamente permitiu-se drenagem por gravidade e crescimento a 27°C em condições de 16 horas de luz: 8 horas de escuro na estufa. Até ao final do estudo sub-irrigaram-se as plantas com água desionizada.

Deixou-se crescer as plantas até ao aparecimento de 2- 4 folhas do verticilo. Nesta altura fizeram-se aplicações de herbicida com um moto-pulverizador a um volume de pulverização de 187 L/ha, altura de pulverização de 50 cm. Pulverizaram-se as plantas com taxas de 2,4-D DMA, glifosato, glufosinato e várias combinações dos três. Formularam-se todas as aplicações em tampão Hepes 200 mM (pH 7,5). Em aplicações de pulverização 129 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ nas quais estava presente glufosinato formulou-se o tratamento com a adição de sulfato de amónio a 2% p/v.

Avaliaram-se as plantas 3 e 14 dias após o tratamento (DAT). Atribuiram-se às plantas pontuações de lesão relativamente a nanismo, clorose e necrose. As plantas com uma pontuação de lesão de 90% ou superior consideram-se mortas. Os resultados do estudo a 14 DAT podem observar-se na tabela 25.

Tabela 25. Taxa de campo % de lesão a 14 DAT Hi II X 5XH751 RR/PAT/AAD1 Média Média Controlo não tratado - 0 0 Glifosato a 840 g ae/ha IX 98 0 Glifosato a 1680 g ae/ha 2X 100 0 Glifosato a 3360 g ae/ha 4X 100 0 2,4-D DMA a 560 g ae/ha IX 10 0 2,4-D DMA a 1120 g ae/ha 2X 14 0 2,4-D DMA a 2240 g ae/ha 4X 29 0 Glufosinato a 470 g ae/ha IX 80 0 Glufosinato a 940 g ae/ha 2X 90 3 Glufosinato a 1880 g ae/ha 4X 96 15 Glifosato a 840 g ae/ha + 2,4-D DMA a 560 g ae/ha IX + IX 96 1 Glifosato a 1680 g ae/ha glifosato + 2,4-D DMA a 1120 g ae/ha 2X + 2X 100 2 Glifosato a 3360 g ae/ha glifosato + 2,4-D DMA a 2240 g ae/ha 4X + 4X 100 1 Glufosinato a 470 g ae/ha + 2,4-D DMA a 560 g ae/ha IX + IX 89 5 Glufosinato a 940 g ae/ha + 2,4-D DMA a 1120 g ae/ha 2X + 2X 91 10 Glufosinato a 1880 g ae/ha + 2,4-D DMA a 2240 g ae/ha 4X+4X 97 13 Glifosato a 840 g ae/ha + glufosinato a 470 g ae/ha IX + IX 90 5 Glifosato a 1680 g ae/ha + glufosinato a 940 g ae/há 2X+2X 98 15 Glifosato a 3360 g ae/ha + glufosinato a 1880 g ae/há 4X + 4X 100 15 130 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

Este estudo demonstrou que o gene AAD-1 (v3) em milho pode ser junto com um gene de resistência a glifosato e com um gene de resistência a glufosinato para proporcionar uma tolerância robusta ao nível do campo contra 2,4-D, glifosato e glufosinato sozinhos ou em combinações misturadas em tanque. 8.3.1 - Resistência de milho AAD-1 (v3) utilizando uma mistura em tanque de 2,4-D DMA e quizalofop.

Plantaram-se sementes T2BCi do evento hemizigótico número 3404-025.001R/R001 Bulked.001.5058 individualmente em vasos de 3 polegadas preparados com meio de crescimento Metro-Mix® 360. Inicialmente sub-irrigaram-se os vasos com solução Hoagland até ficarem molhados e seguidamente permitiu-se drenagem por gravidade e crescimento a 27 °C em condições de 16 horas de luz: 8 horas de escuro na estufa. Até ao final do estudo sub-irrigaram-se as plantas com água desionizada.

Deixou-se crescer as plantas até ao estágio VI na estufa. Nesta altura seleccionaram-se as plantas com Assure® II a 560 g ae/ha com a adição de óleo de cultura Agridex a 1% v/v em tampão Hepes 200 mM com o moto-pulverizador de investigação a 187 L/ha. Deixaram-se as plantas durante 4 dias para mostrarem sintomas da selecção. Nenhuma das plantas apresentou lesões. As aplicações de herbicida foram efectuadas com um moto-pulverizador a um volume de pulverização de 187 L/ha, altura de pulverização de 18 polegadas. Formularam-se todas as aplicações em tampão Hepes 200 mM (pH 7,5) com a adição de Agridex a 1% v/v.

Aos 3 e 14 dias após tratamento (DAT) avaliaram-se as plantas. Atribuíram-se pontuações de lesão às plantas relativamente a nanismo, clorose e necrose. As plantas com uma pontuação de lesão de 90% ou superior consideram-se mortas. As plantas desta linhagem específica apresentavam 0% de lesões a 14 DAT para todas as combinações de misturas em tanque, enquanto o tipo selvagem apresentava 100% de lesão. Estes resultados indicam que AAD-1 (v3) proporciona não apenas uma resistência robusta ao nível do campo contra 2,4-D e 131 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ quizalofop individualmente, mas também contra taxas exageradas de várias combinações desses dois produtos químicos. Esperar-se-ia logicamente implementar novas medidas de controlo de ervas daninhas com combinações de fenoxiauxinas e graminicidas AOPP em milho (ou outras culturas transformadas com AAD-1) que não eram anteriormente permitidas por HTC de um único gene. 8.3.2 - Tolerância de plantas de milho (pDAB3403) T0 a herbicida quizalofop.

Regenerou-se um alvo de aproximadamente oito clones de planta T0 de cada um de 17 eventos e transferiu-se para a estufa para rastreio preliminar de tolerância com taxa de discriminação aplicada pós-emergência de herbicida quizalofop aplicado com moto-pulverizador a 35 g ae/ha (IX taxa de campo, 4X dose letal) a plantas de milho T0 com 3 folhas e adaptadas a estufa utilizando as condições de moto-pulverizador anteriormente descritas. Classificaram-se as plantas como resistentes ou sensíveis 7 dias após tratamento. Incluiu-se milho de controlo não transgénico em cada aplicação de pulverização. Dois eventos, evento 014 e 047, tinham dois ou mais clones To sensíveis a quizalofop a 35 g ae/ha, indicando um nível inesperado de sensibilidade para este evento. Os outros 15 eventos apresentaram integração estável, expressão de proteína e capacidade de tolerar 4X a dose letal de quizalofop ao nível da planta total. 8.3.3 Expressão de AAD-1 (v3) relativamente a tolerância a quizalofop.

Escolheram-se três linhagens T2 diferentes de 3404 transformações que foram pré-rastreadas com Liberty® (tal como anteriormente descrito) para remover nulos, para comparar a sua tolerância a quizalofop relativamente à sua expressão de AAD-1 (v3). Mediu-se a expressão a 14 DAT (dados não apresentados) e a 30 DAT (ver figura 15) . A linha com maior tolerância, evento 3404-074, expressou sempre uma quantidade mais elevada de AAD-1 (v3) do que os outros dois eventos com 132 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ taxas de campo de IX e superior. Estes dados permitem concluir que o milho que expressa AAD-1 (v3) pode ser protegido de lesão por quizalofop ao nível mais elevado testado (2240 g/ha) , que é 16 vezes a dose de campo IX de 35 g/ha. Além disso, o nível de expressão foi consistente ao longo do período da experiência.

Exemplo 9 - Transformação mediada por Agrobacterium de milho com AAD-1 (v3) 9.1 - Material para plantas.

Plantam-se directamente sementes de um cruzamento Fi "High II" (i.e., parente A e B) (Armstrong et al.r 1991) em vasos de 5 galões contendo Metro-Mix® 360:solo mineral 95:5. Cultivam-se as plantas na estufa com um fotoperíodo de 16 horas suplementado por uma combinação de candeeiros de sódio a pressão elevada e de halogeneto metálico. 9.2 - Fonte de tecido.

Para obter embriões imaturos Hi-II (F2) efectuaram-se subpolinizações controladas. No dia da polinização, colocaram-se em sacos as bandeiras com libertação activa e recolheu-se o pólen fresco e aplicou-se cuidadosamente nas barbas. Isolaram-se os embriões imaturos tal como descrito no exemplo 7.2. 9.3 - Preparação de um vector superbinário.

Construiu-se uma construção de Agrobacterium, pDAB2272, contendo o gene AAD-1 (v3) em combinação com o gene de marcação seleccionável AHAS por isolamento do fragmento Notl de 3443 pares de bases de pDAB3404 contendo ZmUbil v2/ AAD-1 (v3)/ZmPer5 v2 e sua inserção no local Notl de pDAB8549. 0 plasmídeo resultante contém as cassetes ZmUbil v2/ AAD-1 (v3)/ ZmPer5 v2 e OsActl v2/AHAS v3/ZmLip vl flanqueadas por regiões MAR não idênticas na orientação directa. Este produto foi subsequentemente transformado em LBA4404/pSBl para 133 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ criar ο vector superbinário que se denominou pDAB3602 mas também se refere como pDAS1421. 9.4 - Fornecimento de bactérias.

Todas as transformações usam o vector "Super Binário" de Japan Tobacco descritas na patente U.S. 5 591 616 ("Método para transformar monocotiledóneas") . Para preparar a suspensão de Agrobacterium para tratamento, colocaram-se 1-2 ansas de bactérias recombinantes pDAS1421 de uma placa de cultura YP em 5 ml de meio LS-inf.Mod (meio basal LS (Linsmaier e Skoog, 1965), vitaminas N6, 2,4-D a 1,5 mg/L, sacarose a 68,5 g/L, glucose a 36,0 g/L, L-prolina a 6 mM, pH 5,2). Submeteu-se a mistura a vortex até se obter uma suspensão uniforme. Determinou-se a concentração bacteriana utilizando um colorimetro Klett-Summerson Photoelectric por leitura da densidade da solução. Ajustou-se a solução para uma concentração de Klett 200 (~1 x 109 ufc/ml) e adicionou-se acetossiringona 100 μΜ à solução. 9.5 - Infecção e co-cultivo.

Isolaram-se os embriões imaturos directamente para um tubo de centrífuga contendo 2 ml de meio líquido LS-inf.Mod. Submeteu-se cada tubo, contendo -100 embriões, a vortex durante 3-5 s. Removeu-se o meio e substitui-se por meio líquido fresco e repetiu-se o vortex. Removeu-se novamente o meio líquido e desta vez substituiu-se com uma solução de Agrobacterium a uma concentração de Klett 200. Submeteu-se a mistura Agrobacterium e embrião a vortex durante 30 s. Após 5 minutos de incubação à temperatura ambiente, transferiram-se os embriões para meio LS-As Mod (meio basal LS, vitaminas N6, 2,4-D a 1,5 mg/L, sacarose a 30,0 g/L, L-prolina a 6 mM, AgNC>3 a 0,85 mg/L, acetossiringona 100 μΜ, Gelrite a 3,0 g/L, pH 5,8) para uma co-cultura de 5 dias a 25°C. 9.6 - Dose-resposta utilizando embriões imaturos.

Iniciaram-se estudos dose-resposta utilizando embriões imaturos tratados com Agrobacterium estirpe LBA4404 isentos de 134 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ um plasmídeo tal como anteriormente descrito: após tratamento, co-cultivaram-se os embriões durante 5 dias a 25°C e transferiram-se então para meio de selecção contendo diferentes níveis de R-haloxifop ou R-ci-halofop. Transferiram-se também embriões para meio contendo bialafos a 1 mg/L e imazetapir 100 nM como controlos negativos. Pontuaram-se os embriões para % de formação de calo embriogénico após 2 semanas e novamente após 4 semanas. Ensaiaram-se embriões para níveis de R-haloxifop até 30 nM; contudo, observou-se redução insuficiente de formação de calo nos níveis mais elevados pelo que se utilizaram concentrações mais elevadas (50 - 100 nM) durante as experiências de transformação. Apresentam-se na figura 17 dados de embriões cultivados em meio contendo ci-halofop. 9.7 - Selecção.

Após co-cultivo, submeteram-se os embriões a um esquema de selecção em 2 etapas após o que se obtiveram isolados transformados. Para a selecção utilizou-se meio LSD Mod (meio basal LS, vitaminas N6, 2,4-D a 1,5 mg/L, MES a 0,5 g/L, sacarose a 30,0 g/L, L-prolina a 6 mM, AgNCh a 1,0 mg/L, cefotaxima a 250 mg/L, Gelrite a 2,5 g/L, pH 5,7) conjuntamente com um ou dois níveis de selecção de haloxifop, ci-halofop ou imazetafir. Ao longo da fase de selecção cultivaram-se os embriões no escuro a 28°C. Primeiro transferiram-se os embriões para um nível inicial de selecção (R-haloxifop 50-100 nM ou R-ci-halofop 300 nM) durante 14 dias e seguidamente mudaram-se para um nível de selecção superior (ácido R-haloxifop 250-500 nM ou ci-halofop 1,5 μΜ) a uma taxa de 5 embriões/placa. Submeteu-se igualmente um subconjunto de embriões a imazetafir de Pursuit® DG em aumento de 100 a 500 nM como um controlo positivo. Utiliza-se Pursuit® como agente de selecção química quando se utiliza o gene AHAS, com base na patente U.S. 5 731 180. Transferiu-se tecido a intervalos bissemanais no mesmo meio até à obtenção de colónias embriogénicas. Mantiveram-se estas colónias em pressão de selecção elevada durante o restante tempo de cultura. Juntaram-se as colónias transgénicas recuperadas por 135 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ transferência para meio de selecçao fresco a intervalos de 2 semanas para regeneração e análise adicional. 9.8. - Regeneração e produção de sementes.

Para regeneração transferem-se as culturas para 28 meios de "indução" e 36 meios de "regeneração" tal como descrito anteriormente contendo R-haloxifop 100 nM ou ci-halofop 1,5 μΜ para diferenciação de plântulas. Quando as plântulas se estabeleceram, transferiram-se para tubos SHGA para permitir crescimento e desenvolvimento adicional do rebento e raizes tal como descrito anteriormente. Efectuaram-se polinizações controladas para produção de sementes tal como descrito anteriormente. 9.9 - Recuperação de eventos e detalhes da análise; rastreios de planta completa de linhagens de milho T0 contendo AAD-1 (v3) e AHAS (pDAS 1421).

Seleccionaram-se setenta e dois eventos transformados com Agrobacterium em diferentes niveis de ácido de R-haloxifop e ácido de R-ci-halofop in vitro. Analisaram-se vinte e duas amostras de calos por análise de transferência "Southern" para integração estável de AAD-1 (v3) no genoma tal como descrito anteriormente. Escolheram-se dez eventos de cópia única, tal como indicado na tabela 26, para regeneração.

Tabela 26. Evento de milho Agente de selecção in vitro N.2 de cópia "Southern" (calo) Transferência "Western" (AAD-1) para calo T0 Avaliação de linhagens T0 resistentes a quizalofop 35 g ae/ha (nM) AAD-1 Resistente Sensível 1421 [21]-016 50 Haloxifop 1 + 8 0 1421 [22]-020 100 Haloxifop 1 + + 8 0 1421[22]-022 100 Haloxifop 1 + 8 0 1421[22]-023 100 Haloxifop 1 + + 8 0 1421[3]-036 100 Haloxifop 1 + + 8 0 1421[4]-031 300 Ci-halofop 1 + + 9 0 1421[4]-032 300 Ci-halofop 1 + + 8 0 1421[4]-033 300 Ci-halofop 1 + + 12 0 136 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

Tabela 26. Evento de milho Agente de selecção in vitro N.de cópia "Southern" (calo) Transferência "Western" (AAD-1) para calo T0 Avaliação de linhagens T0 resistentes a quizalofop 35 g ae/ha (nM) AAD-1 Resistente Sensível 1421[4]-034 300 Ci-halofop 1 + + 8 0 1421[4]-035 300 Ci-halofop 1 + + 6 0 Os eventos com mais que 1 cópia não se levaram para a estufa

Mudaram-se para solo na estufa um mínimo de seis linhagens clonais regeneradas por evento e rastrearam-se utilizando um moto-pulverizador tal como descrito anteriormente para aplicar guizalofop a 35 g ae/ha quando emergem 2-4 folhas novas e normais (consultar secção 8.3.3). A presença de proteína AAD-1 numa transferência "Western" correlacionou perfeitamente com resistência a herbicida na geração T0 independentemente de qual o herbicida AOPP que se usasse para selecção. Não há impacto negativo do segundo gene HTC (AHAS) na função de AAD-1 (v3).

Exemplo 10 - Purificação de AAD-1 (vl) para criação de anticorpo e caracterização bioquímica

Todas as operações durante a purificação foram efectuadas a 4°C. Ressuspenderam-se células de E. coli congeladas ou frescas de aproximadamente 1 L de cultura, cultivadas e induzidas tal como no exemplo 3, em 200 ml de tampão de extracção contendo Tris-HCl 20 mM, EDTA 1 mM e 2 ml de mistura de inibição de proteases (Sigma) e partiram-se por tratamento no ultra-sons em gelo utilizando um aparelho de ultra-sons Branson. Obteve-se o extracto solúvel por centrifugação num rotor GSA (Sorvall) a 12 000 rpm (24 OOOg) durante 20 minutos. Carregou-se então o sobrenadante numa coluna de permuta iónica Mono Q (Pharmacia HR 10/10) equilibrada com Tris-HCl 20 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0 e lavou-se a coluna com o mesmo tampão durante 10 CV (80 ml) . Eluiu-se a proteína com 80 ml de um gradiente linear de NaCl de 0 a 0,25 M em tampão de coluna, recolhendo-se fracções de 2 ml. Recolheram-se conjuntamente as fracções contendo AAD-1 (vl) e concentraram-se utilizando 137 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ colunas de centrifugação com membrana de MWCO 3 0 kDa (Millipore). A amostra foi então separada adicionalmente numa coluna de exclusão de tamanho Superdex 200 (Pharmacia, XK 16/60) com tampão contendo Tris-HCl 20 mM, NaCl 0,15 M e DTT 1 mM, pH 8,0 a uma caudal de 1 ml/min. Analisaram-se os resultados da purificação por SDS-PAGE e determinou-se a concentração de proteína pelo ensaio de Bradford utilizando albumina de soro bovino como padrão.

Exemplo 11 - Purificação de AAD 1 recombinante e produção de anticorpo

Manteve-se congelado a -80°C o plasmídeo pDAB3203 contendo o gene AAD-1 (vl) em células TOP10F' (Invitrogen) como estirpe recombinante Dow DR1878. Para expressão, transformou-se o ADN plasmídico purificado de cultura de células TOP10F' utilizando o kit Wizard da Promega (n.° de cat. Fisher PR-A1460) para células BL-21 Star (DE3) (n.° de cat. Invitrogen C6010-03) seguindo o protocolo do fabricante. Após transformação, plaquearam-se 50 pL das células em placas de ágar-ágar LB S/S e incubaram-se durante a noite a 37°C. Rasparam-se todas as colónias de toda a placa de ágar-ágar para 100 mL de LB num matraz de três aletas de 500 mL e incubou-se a 37°C com agitaçao a 200 rpm durante 1 h. Induziu-se então expressão génica com IPTG 1 mM e incubou-se durante 4 h a 30 °C com agitação a 200 rpm. Centrifugaram- -se todos os 100 mL de cultura a 4000 rpm durante 20 min. Deitou- se fora o sobrenadante e ressuspenderam-se os sedimentos em 200 mL de extracção contendo Tris-HCl 20 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM e 2 mL de mistura de inibidor de protease (Sigma) e partiu-se por tratamento com ultra-sons em gelo utilizando um aparelho de ultra-sons Branson. Centrifugou-se o lisado a 24 OOOx g durante 20 min para remover os resíduos celulares. Submeteu-se então o sobrenadante contendo a proteína AAD-1 ao protocolo de purificação.

Todas as purificações de AAD-1 (vl) foram efectuadas a 4°C tal como discutido no exemplo 10, salvo indicação em contrário. Carregou-se o lisado celular numa coluna de permuta 138 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ iónica Mono Q (n.° de cat. Pharmacia HR 10/10) equilibrada com Tris-HCl 20 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM, seguido de lavagem com 80 mL do mesmo tampão. Eluiram-se as proteínas com 80 ml de um gradiente linear de NaCl de 0 a 0,25 M em tampão de coluna, recolhendo-se fracções de 2 ml. Recolheram-se conjuntamente as fracções contendo AAD-1 e concentraram-se utilizando colunas de centrifugação com membrana de MWCO 30 kDa (Millipore) . A amostra foi então separada adicionalmente numa coluna de exclusão de tamanho Superdex 200 (Pharmacia, XK 16/60) com tampão contendo Tris-HCl 20 mM (pH 8,0), NaCl 0,15 M e DTT 1 mM. Determinou-se a concentração de proteína pelo ensaio de Bradford utilizando albumina de soro bovino como padrão.

Forneceram-se cinco miligramas de AAD-1 (vl) purificada a Zymed Laboratories, Inc. (South San Francisco, CA) para produção de anticorpo policlonal de coelho. O coelho recebeu 5 injecções no periodo de 5 semanas contendo cada injecção 0,5 mg da proteína purificada suspensa em 1 mL de adjuvante incompleto de Freund. Ensaiaram-se os soros por experiências de ELISA e de transferência "Western" para confirmar especificidade e afinidade antes de purificação por afinidade e conjugação com peroxidase de rábano (HRP) (Zymed Lab Inc). 11.1 - Extracção de AAD-1 (v3) de folhas de planta.

Cortaram-se aproximadamente 50 a 100 mg de tecidos de folhas em pequenas porções e puseram-se em tubos de microcentrífuga contendo 2 pérolas de aço inoxidável (4,5 mm; Daisy Co., n.° de cat. 145462-000) e 300 pL de tampão de extracção de planta (PBS contendo Triton X-100 a 0,1% e DTT 10 mM) . Agitaram-se os tubos durante 4 min com um batedor de pérolas a velocidade máxima seguido de centrifugação durante 10 min a 5 OOOx g. Analisou-se o sobrenadante contendo as proteínas solúveis da planta para as concentrações totais de proteína solúvel (TSP) e de AAD-1 (v3). 11.2 - Ensaio de Bradford.

Determinou-se a concentração total de proteína solúvel de tecidos de folha de planta pelo ensaio de Bradford utilizando 139 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ albumina de soro bovino (BSA) como padrão. Transferiram-se cinco microlitros de diluições em série de BSA em PBS ou extractos de planta para uma placa de microtitulação de 96 poços em triplicados. Para os padrões as concentrações foram na gama de 2000 a 15,6 pg/mL. O produto concentrado para ensaio de proteína foi primeiro diluído 5 vezes em PBS e adicionou-se 250 pL a cada poço e incubou-se à temperatura ambiente durante 5 min. Mediu-se cada densidade óptica (DO) a 595 nm utilizando um leitor de microplacas. Extrapolou-se a concentração de proteína para cada amostra a partir de uma recta padrão utilizando Softmax® Pro (ver. 4.0) (Molecular Devices). 11.3 - Ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA).

Realizou-se o ensaio à temperatura ambiente salvo indicação em contrário. Revestiram-se cem microlitros de anticorpo anti-AAD-1 purificado (0,5 pg/mL) numa placa de microtitulação de 96 poços e incubou-se a 4°C durante 16 horas. Lavou-se a placa quatro vezes com tampão de lavagem (soro fisiológico em tampão fosfato (PBS; pH 7,4) 100 mM contendo Tween 20 a 0,05%) utilizando um lavador de placas, seguido de bloqueamento com leito magro a 4% dissolvido em PBS durante 1 hora. Após lavagem, incubaram-se nos poços 100 pL de padrão AAD-1 de concentrações conhecidas ou extracto de planta (consultar secção anterior). Para a recta padrão, as concentrações de AAD-1 purificado variaram entre 100 e 1,6 ng/mL em triplicados. Diluíram-se os extractos de plantas 5, 10, 20 e 40 vezes em PBS e analisaram-se em duplicados. Após 1 hora de incubação, lavou-se a placa como anteriormente. Incubaram-se cem microlitros de anticorpo anti-AAD-1 conjugado com HRP (0,25 ug/mL) em cada poço durante 1 hora antes da lavagem. Incubaram-se cem microlitros de substrato de HRP, 1-Step™ Ultra TMB-ELISA (Pierce), em cada poço durante 10 minutos antes da reacção ser parada por adição de 100 pL de H2SC>4 0,4N. Mediu-se a DO de cada poço utilizando um leitor de microplacas a 450 nm. Para determinar as concentrações de AAD-1 em extractos de planta, fez-se a média dos valores de DO 140 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ dos duplicados e extrapolou-se a partir da recta padrão utilizando Softmax® Pro ver. 4.0 (Molecular Devices).

Para comparação, normalizou-se cada amostra com a sua concentração TSP e calculou-se a percentagem de expressão de TSP. 11.4 - Análise de hibridação "Western".

Incubaram-se extractos de planta ou padrões AAD-1 (5 e 0,5 pg/mL) com tampão de amostra Laemmli a 95°C durante 10 minutos e separam-se por electroforese num gel pré-moldado com Tris-glicina 8-16%. Transferiram-se então as proteínas por electrotransferência para membrana de nitrocelulose utilizando um protocolo padrão. Após bloqueio em leite magro a 4% em PBS, detectou-se proteína AAD-1 com anti-soro anti-AADl seguido de conjugados de cabra anti-coelho com HRP. Visualizou-se a proteína detectada com substrato de quimioluminescência ECL Western Analysis Reagent (Amersham n.° de cat. RPN 21058).

Exemplo 12 - Transformação de tabaco

Efectuou-se transformação de tabaco com Agrobacterium tumefaciens através de um método semelhante, mas não idêntico, a métodos publicados (Horsch et al., 1988). Para proporcionar uma fonte de tecido para a transformação esterilizou-se a superfície de sementes de tabaco (Nicotiana tabacum cv. Kentucky 160) e plantou-se à superfície em meio TOB, que é um meio Murashige e Skoog isento de hormona (Murashige e Skoog, 1962) solidificado com ágar-ágar. Cultivaram-se as plantas durante 6-8 semanas num quarto de incubação iluminado a 28-30°C e recolheram-se as folhas de forma estéril para utilização no protocolo de transformação. Cortaram-se destas folhas, de forma estéril, bocados de aproximadamente um centímetro quadrado, excluindo a nervura mediana. Sedimentaram-se numa centrífuga culturas de estirpes de Agrobacterium (EHA101S contendo pDAB721, AAD-1 (v3) + PAT) , cultivadas durante a noite num matraz num agitador colocado a 250 rpm a 28°C e ressuspenderam-se em sais Murashige e Skoog estéreis e ajustaram-se a uma densidade óptica de 0,5 a 600 nm. Mergulharam-se os bocados de folhas nesta suspensão 141 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ bacteriana durante aproximadamente 30 segundos, secaram-se em toalhas de papel estéreis e colocaram-se viradas para cima em meio TOB+ (meio Murashige e Skoog contendo ácido acético de índole 1 mg/L e benziladenina a 2,5 mg/L) e incubou-se no escuro a 28°C. Dois dias mais tarde mudaram-se os bocados de folhas para meio TOB+ contendo cefotaxima (Agri-Bio, North Miami, Florida) a 250 mg/L e glufosinato de amónio a 5 mg/L (ingrediente activo em Basta, Bayer Crop Sciences) e incubou-se a 28-30°C à luz. Mudaram-se os bocados de folhas para meio TOB+ fresco com cefotaxima e Basta duas vezes por semana durante as primeiras duas semanas e uma vez por semana daí em diante. Quatro a seis semanas após tratamento dos bocados de folhas com as bactérias, removeram-se desta preparação de tecidos as plantas pequenas provenientes de focos transformados e plantaram-se em meio TOB contendo cefotaxima a 250 mg/L e Basta a 10 mg/L em vasos Phytatray™ II (Sigma). Cresceram-se estas plântulas num quarto de incubação iluminado. Após 3 semanas retiraram-se cortes dos caules e transplantaram-se no mesmo meio. As plantas ficaram prontas para enviar para a estufa após 2-3 semanas adicionais.

Mudaram-se as plantas para a estufa por lavagem do ágar-ágar das raízes, transplantando para solo em vasos quadrados de 13,75 cm colocando o vaso num saco Ziploc® (SC Johnson & Son, Inc.) , colocando água da torneira na base do saco e colocando em luz indirecta numa estufa a 30°C durante uma semana.

Após 3-7 dias abriu-se o saco; fertilizaram-se as plantas e deixou-se crescer com o saco aberto até as plantas estarem aclimatadas à estufa, altura em que se removeu o saco. Cresceram-se as plantas em condições normais de estufa morna (30°C, 16 horas de dia, 8 horas de noite, mínimo de luz natural + suplementar = 500 pE/m2s1) .

Antes da propagação amostraram-se plantas T0 para análise de ADN para determinar o número de cópias inseridas. Por conveniência, ensaiou-se gene PAT que estava ligado molecularmente a AAD-1 (v3). Colocou-se tecido fresco em tubos 142 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ e liofilizou-se a 4°C durante 2 dias. Após secagem completa do tecido, colocou-se uma pérola de tungsténio (Valenite) no tubo e submeteram-se as amostras a 1 minuto de moagem a seco utilizando um moinho de bolas Kelco. Seguiu-se então o procedimento de isolamento de ADN DNeasy padrão (Qiagen, DNeasy 69109). Corou-se então uma aliquota do ADN extraido com Pico Green (Molecular Probes P7589) e leu-se no fluorómetro (BioTek) com padrões conhecidos para obter a concentração em ng/μΐ.

Diluiram-se as amostras de ADN para 9 ng/μΐ, seguidamente desnaturaram-se por incubação num termociclador a 95°C durante 10 minutos. Preparou-se então mistura Signal Probe utilizando a mistura de oligos proporcionada e MgCl2 (Third Wave Technologies). Colocou-se uma aliquota de 7,5 μΐ em cada poço da placa de ensaio Invader seguido de uma aliquota de 7,5 μΐ de controlos, padrões e 20 ng/μΐ de amostras desconhecidas diluidas. Sobrepôs-se em cada poço 15 μΐ de óleo mineral (Sigma). Incubaram-se então as placas a 63°C durante 1,5 horas e leu-se num fluorómetro (Biotek). Calcula-se a razão pela divisão da % de sinal relativamente à linha de base para a sonda alvo e a % de sinal relativamente à linha de base da sonda de controlo interno. Utilizou-se a razão de padrões de cópia conhecidos desenvolvidos e validados com análise de hibridação "Southern", para identificar a cópia estimada de eventos desconhecidos (tabela 27).

Tabela 27. Eventos T0 de tabaco transformado com pDAB721 (AAD-1(v3) + PAT) . Evento N.de cópias PAT ("Southern") PCR da região de codificação para AAD-1 ELISA (pg AAD-1 / ml de extracto de planta) Tolerância relativa T0 pulverização com 2,4-D * 721(1)1 1 + 0,9 Média 721(2)1 nd nd 0,6 Média 721(2)2 5 + 0,3 Reduzida 721(2)3 3 + 2,6 Média 721(2)5 5 + 4,1 Variável 721(2)6 3 + 0,5 Variável 721(2)8 5 + 0,3 Elevada 143 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

Tabela 27 PAT) . Eventos T0 de tabaco transformado com pDAB721 (AAD-1 (v3) + Evento N.2 de cópias PCR da região ELISA (pg Tolerância PAT de codificação AAD-1 / ml de relativa T0 ("Southern") para AAD-1 extracto de planta) pulverização com 2,4-D * 721(2)11 3 + n/a Elevada 721(2)12 3 + 4,1 Média 721(2)13 2 + 0,5 Média 721(2)14 5 + 0,2 Elevada 721(2)16 4 + ,3,2 Média 721(2)17 3 + nd Elevada 721(2)18 5 + nd Elevada 721(2)19 >10 + nd Reduzida 721(2)20 5 + nd Média 721(2)21 4 + nd Elevada 721(2)22 7 + nd Média 721(2)23 >10 + nd Variável 721 (3)003 3 + nd Variável 721 (3)008 2 + nd Elevada 721 (3)012 1 + nd Elevada 721 (3)4 2 + 0,5 Elevada 721 (3)5 9 + 3,3 Elevada 721 (3)6 4 + 7,1 Variável 721 (3)9 2 + 1 Reduzida 721 (3)10 3 + 0,6 Elevada 721 (3)11 7 + 6 Reduzida 721 (3)13 4 + 0,1 Elevada 721 (3)014 2 + 0,1 Média nd = não efectuado

Legenda: Tolerância Lesão com 2,4-D a 3200 g ae/ha (14DAT) relativa *

Reduzida Média Elevada Variável >50% de lesão 20-50% de lesão <20% de lesão inconsistente

Confirmaram-se as estimativas de número de cópias por análise "Southern" em vários eventos. Efectuaram-se as análises de transferência "Southern" com o ADN total obtido do kit Qiagen DNeasy. Submeteu-se um total de 2 yg de ADN a uma digestão durante a noite com Nsil e também HindIII para 144 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ pDAB721 para obter dados de integração. Após a digestão durante a noite correu-se uma alíquota de -100 ng num gel de 1% para assegurar digestão completa. Após esta certeza processaram-se as amostras utilizando o mesmo protocolo que no exemplo 6 secção 11.

Ensaiaram-se também todos os eventos para a presença do gene AAD-1 (v3) por PCR utilizando as mesmas amostras de ADN extraídas. Utilizou-se um total de 100 ng de ADN total como molde. Utilizou-se 20 mM de cada iniciador com o kit de Takara Ex Taq PCR Polymerase (Mirus TAKRR001A). Os iniciadores da PCR de região de codificação AAD-1 foram (RdpAcodF ATGGCTCA TGCTGCCCTCAGCC) (SEQ ID NO:27) e (RdpAcodR CGGGCAGGCCTAACTCCACCAA) (SEQ ID NO:28). Efectuou-se a reacção de PCR no termociclador 9700 Geneamp (Applied Biosystems), submetendo as amostras a 94°C durante 3 minutos e 35 ciclos de 94°C durante 30 segundos, 64°C durante 30 segundos e 72°C durante 1 minuto e 45 segundos seguido de 72 °C durante 10 minutos. Analisaram-se os produtos de PCR por electroforese num gel de agarose a 1% corado com EtBr. Regeneraram-se quatro das 12 linhagens clonais de cada um dos 30 eventos positivos em PCR e transferiram-se para a estufa.

Ensaiou-se uma planta representativa de cada um dos 19 eventos para expressão de AAD-1 (v3) por métodos de ELISA tal como anteriormente descrito. Todos os eventos ensaiados apresentaram níveis detectáveis de AAD-1 (v3) (tabela 27). A expressão de proteínas variou ao longo dos eventos.

Provocaram-se plantas T0 de cada um dos 30 eventos com uma vasta gama de pulverização de 2,4-D nas plantas que tinham uma altura de 3-4 polegadas. As aplicações de pulverização foram efectuadas tal como descrito anteriormente utilizando um moto-pulverizador com um volume de pulverização de 187 L/ha. Aplicou-se sal de dimetilamina de 2,4-D (Riverside Corp) a 0, 50, 200, 800 ou 3200 g ae/ha a clones representativos de cada evento misturados com água desionizada. Cada tratamento foi replicado 1-3 vezes. Registaram-se as pontuações de lesão a 3 e 14 DAT. Cada evento ensaiado foi mais tolerante a 2,4-D do 145 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ que a linha de controlo não transformada KY160. Em vários eventos, ocorreu alguma torção do pecíolo auxínica inicial relacionada com herbicida a doses de 800 g ae/ha ou inferiores. Alguns eventos não foram lesionados a esta taxa (equivalente a 1,5X a taxa de campo). Todos os eventos sofreram algum nível de dano auxínico temporário 3 DAT quando tratados com 3200 g ae/ha. Ocorreu também alguma queimadura de folhas a esta taxa elevada devido à acidez da solução de pulverização. As tentativas futuras a taxas elevadas de 2,4-D foram tamponadas. Utilizou-se a resposta de plantas T0 tratadas com 2,4-D a 3200 g ae/ha (~6X a taxa de campo) para diferenciar a tolerância relativa de cada evento em "baixa" (>50% de lesão a 14 DAT), "média" (20-50% de lesão), "elevada" (<20% de lesão). Alguns eventos tiveram respostas inconsistentes entre replicados e consideraram-se "variável" (tabela 27).

Verificação de tolerância elevada a 2,4-D.

Salvaram-se de cada evento dois a quatro indivíduos T0 sobreviventes a taxas elevadas de 2,4-D e deixou-se auto-fertilizar na estufa para originar sementes Ti. Escolheram-se duas linhas de tabaco AAD-1 (v3) (evento 721(2)-013.010 e 721(3)-008.005) da geração T0. Estratificou-se a semente Ti e semeou-se em tabuleiros de selecção da mesma forma que Arabidopsis (exemplo 6.4), seguido de remoção selectiva de nulos não transformados nesta população segregada com glufosinato a 280 g ae/ha (selecção PAT) . Transferiram-se os sobreviventes para vasos individuais de 3 polegadas na estufa. Estas linhas proporcionaram níveis elevados e médios de robustez a 2,4-D na geração T0. Antecipa-se uma consistência de resposta melhorada em plantas Ti que não tenham vindo directamente de cultura de tecidos. Compararam-se essas plantas contra tabaco KY 160 de tipo selvagem. Pulverizaram-se todas as plantas por utilização de um moto-pulverizador a 187 L/ha. Pulverizaram-se as plantas numa gama de 70-4480 g ae/ha de sal de dimetilamina de 2,4-D (DMA), R-diclorprop e de uma mistura 50/50 dos dois herbicidas. Formularam-se todas as aplicações em tampão Hepes 200 mM 146 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ (ρΗ 7,5). Replicou-se cada tratamento 4 vezes. Avaliaram-se as plantas aos dias 3 e 14 após tratamento. Atribuíram-se às plantas pontuações de lesão relativamente a nanismo, clorose e necrose. A geração Ti está em segregação pelo que se espera alguma resposta variável devido à diferença em zigotia (tabela 28). Não se observou lesões com taxas inferiores a IX as taxas de campo (560 g ae/ha) para 2,4-D ou R-diclorprop em qualquer dos eventos. Observou-se muito pequenas lesões mesmo até 8 vezes as taxas de campo (4480 g ae/ha) e tal expressou-se como nanismo, não como lesões de herbicida auxínico. Estes resultados indicaram que AAD-1 (v3) pode proporcionar tolerância de nível comercial mesmo em culturas de dicotiledóneas muito sensíveis a auxinas tal como tabaco. Estes resultados também mostram que a resistência pode ser proporcionada tanto contra herbicidas fenoxiauxínicos quirais (ácido 2,4-Diclorofenoxipropiónico) como aquirais (ácido 2,4-Diclorofenoxiacético) sozinhos ou em combinações de misturas em tanque.

Tabela 28. Resposta de plantas de fenoxiauxínicos. tabaco que segregam AAD-1 a herbicidas KY160 - 721 (2)013.010 721(3)008.005 Tipo (tolerância (tolerância selvagem média na geração elevada na geração Herbicida T0) T0) % média de lesão em replicados 14 DAT 2,4-D DMA a 560 g ae/ha 75 5 0 2,4-D DMA a 1120 g ae/ha 80 5 2 2,4-D DMA a 2240 g ae/ha 90 5 0 2,4-D DMA a 4480 g ae/ha 95 5 5 R-diclorprop a 560 g ae/ha 70 5 0 R-diclorprop a 1120 g ae/ha 75 5 0 R-diclorprop a 2240 g ae/ha 88 5 0 R-diclorprop a 4480 g ae/ha 95 10 5 2,4-D DMA/R-diclorprop a 560 g ae/ha 80 5 5 2,4-D DMA/R-diclorprop a 1120 g ae/ha 80 10 10 2,4-D DMA/R-diclorprop a 2240 g ae/ha 95 15 15 2,4-D DMA/R-diclorprop a 4480 g ae/ha 95 15 15 147 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

Efectuou-se igualmente um ensaio de descendência a 100 plantas em cada uma das duas linhas AAD-1 (v3) (eventos 721(2)-013.010 e 721(3)-008.005). Estratificaram-se as sementes, semearam-se e transplantaram-se seguindo o procedimento anterior com a excepção de não se removerem as plantas nulas por selecção com Liberty. Pulverizaram-se então todas as plantas com 2,4-D DMA a 560 g ae/ha tal como descrito anteriormente. Após 14 DAT contaram-se as plantas resistentes e sensiveis. Ambos os eventos '013' e '008' segregaram para caracteristica mendeliana dominante de local único (3R:1S) tal como determinado pelo teste do Qui quadrado. AAD-1 é hereditário como gene de resistência robusta a fenoxiauxina em várias espécies.

Demonstrar-se-á tolerância ao nível do campo por plantação de sementes Ti ou T2 na estufa, removendo selectivamente as plantas nulas por selecção com Liberty tal como descrito anteriormente e passando para trás as plântulas individuais em bases planas de transplante de 72 poços (Hummert International) em meio Metro 360 de acordo com as condições de crescimento anteriormente descritas. Transplantar-se-ão plantas individuais nos talhões de campo utilizando um plantador de vegetais industrial. Utilizar-se-á rega por gotejamento ou superior para manter as plantas em crescimento vigoroso. Assim que as plantas atingirem 6-12 polegadas de altura, pulverizar-se-ão as plantas de tabaco com uma vasta gama de fenoxiauxinas e classificar-se-ão como anteriormente. Os stresses ambientais são mais significativos em condições de campo; contudo, com base em experiências anteriores com milho transformado com AAD-1 (v3), espera-se que a resistência da estufa seja traduzida para o campo de forma robusta.

Exemplo 13 - Transformação de soja

Conseguiu-se o melhoramento de soja através de técnicas de transferência génica para características tais como tolerância a herbicida (Padgette et ai., 1995), modificação de aminoácidos (Falco et al., 1995) e resistência a insectos (Parrott et al., 1994). A introdução de características 148 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ exógenas em espécies de cultura necessita de métodos que permitirão produção rotineira de linhas transgénicas utilizando sequências de marcadores seleccionáveis contendo inserções simples. Os transgenes devem ser herdados como um único local funcional de modo a simplificar a reprodução. Foi relatada a entrega de genes exógenos a soja cultivada por bombardeamento com micro-projécteis de eixos de embriões zigóticos (McCabe et al., 1988) ou de culturas embriogénicas somáticas (Finer e McMullen, 1991) e transformação mediada por Agrobacterium de plântulas cotilédones (Hinchee et al., 1988) ou embriões zigóticos (Chee et al., 1989).

Os produtos de transformação derivados de transformações mediadas por Agrobacterium tendem a apresentar inserções simples com número de cópias reduzido (Birch, 1991). Há benefícios e desvantagens associados com cada um dos três tecidos alvo investigados para transferência génica em soja, eixos de embriões zigóticos (Chee et al., 1989; McCabe et al., 1988), cotilédone (Hinchee et al., 1988) e culturas embriogénicas somáticas (Finer e McMullen, 1991). Estes últimos foram investigados extensivamente como um tecido alvo para transferência génica directa. As culturas embriogénicas tendem a ser bastante prolíficas e podem manter-se ao longo de períodos prolongados. Contudo, têm-se associado esterilidade e aberrações cromossómicas dos produtos primários de transformação à idade das suspensões embriogénicas (Singh et al., 1998) e assim parece ser necessário iniciar continuamente novas culturas para sistemas de transformação de soja utilizando este tecido. Este sistema necessita de um nível elevado de 2,4-D, a uma concentração de 40 mg/L, para iniciar o calo embriogénico e tal coloca um problema fundamental na utilização do gene AAD-1 (v3) dado que o local transformado não poderá ser desenvolvido adicionalmente com 2,4-D no meio. Assim, a transformação baseada no meristema é ideal para o desenvolvimento de plantas resistentes a 2,4-D utilizando AAD-1 (v3). 149 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ 13.1 - Método de transformaçao 1: transformação do nó do cotilédone de soja mediado por Agrobacterium tumefaciens.

Os primeiros relatos de transformação de soja tiveram como alvo células do meristema na região do nó do cotilédone (Hinchee et al., 1988) e multiplicação de rebentos a partir de meristemas apicais (McCabe et al., 1988). No método de nó do cotilédone baseado em A. tumefaciens, a preparação de explantes e a composição de meios de cultura estimulam a proliferação de meristemas auxiliares no nó (Hinchee et al., 1988). Não é claro se com estes tratamentos ocorre a iniciação de uma cultura de calo realmente desdiferenciada mas totipotente. A recuperação de clones múltiplos de um evento de transformação de um único explante e a recuperação pouco frequente de plantas quiméricas (Clemente et al., 2000; Olhoft et al., 2003) indica uma origem de células única seguida de multiplicação da célula transgénica para produzir uma cultura de meristema transgénico em proliferação ou um rebento transformado uniformemente que apresenta multiplicação adicional de rebentos. O método de multiplicação de rebentos de soja, originalmente baseado em bombardeamento de micro-projécteis (McCabe et al., 1988) e mais recentemente adaptado para transformação mediada por Agrobacterium (Martinell et al., 2002), não apresenta aparentemente o mesmo nivel ou tipo de desdiferenciação do que o método de nó do cotilédone porque o sistema se baseia na identificação bem-sucedida de quimeras de linha germinal. A gama de genótipos que foram transformados através do método de nó do cotilédone baseado em Agrobacterium está em aumento sustentado (Olhoft e Somers, 2001) . Este método de meristema novo e multiplicação de rebento é menos limitado a genótipos específicos. Trata-se igualmente de um protocolo não baseado em 2,4-D que seria ideal para um sistema de selecção 2,4-D. Assim, o método de nó de cotilédone pode ser o método de eleição para desenvolver cultivares de soja resistentes a 2,4-D. Apesar de este método ter sido descrito já em 1988 (Hinchee et al., 1988), foi apenas muito recentemente que foi optimizado para transformação de elevada frequência de rotina de vários genótipos de soja (Zhang et al., 1999; Zeng et al., 2004). 150 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ 13.1.1 - Preparação de Agrobacterium. 0 plasmídeo pDAB721 contém o gene AAD-1 (v3) sob o controlo do promotor UbilO de Arabidopsis. Este plasmídeo também transporta o gene PAT sob o controlo do promotor de actina de arroz e codifica para uma enzima gue degrada glufosinato que pode ser utilizada como agente de selecção para produtos de transformação. Este vector pode ser utilizado na experiência de transformação descrita seguidamente. A construção pDAB721 foi mobilizada para Agrobacterium estirpe EHA101S por electroporação.

As culturas de Agrobacterium apresentando pDAB721 utilizadas nas transformações podem ser cultivadas em meio YEP (peptona a 10 g/L, extracto de levedura a 5 g/L e NaCl a 5 g/L, pH 7,0). Sedimentam-se as culturas de Agrobacterium a baixa velocidade e ressuspendem-se em meio líquido SCM (consultar infra) até DO660 de 0,6 para utilização nas inoculações. 13.1.2 - Transformação de plantas.

Podem desinfectar-se as sementes dos genótipos públicos de soja "Thorne", "Williams82" ou "NE3001" através de uma lavagem de 20 minutos em lixívia comercial (NaClO) a 20% (v/v) com adição de 2 gotas de Liqui-Nox®. Devem enxaguar-se as sementes cinco vezes com água estéril em meio SHGA isento de hormonas e deixar-se germinar durante 5 dias a 24°C com um regime de 18/6 horas luz/escuro. O meio B5 consiste de micronutrientes e macronutrientes e vitaminas descrito por Gamborg et al. (1968) (Sigma, n.° de cat. G 5893, St. Louis) . Todos os meios são solidificados com ágar-ágar lavado a 0,8% (p/v) (n.° de cat.

Sigma A 8678). Alternativamente, determinados genótipos de soja podem ser submetidos a um procedimento de esterilização de superfície seca utilizando cloro gasoso (Cl2) no qual se colocam as sementes maduras em placas de Petri de 100 x 25 mm em camada única utilizando cerca de 130 sementes por placa. Colocam-se aproximadamente 3-4 placas num exsicador e 151 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ coloca-se em hote de modo a que todas as placas fiquem meio abertas e que haja espaço suficiente para um copo de 250 ml no meio do exsicador. Enche-se o copo com 95 ml de lixívia comercial à qual se adiciona 5 ml de HC1 concentrado (12 N) gota-a-gota ao longo das paredes do copo. Fecha-se imediatamente o exsicador e deixa-se durante pelo menos 16 horas numa hote. Após esterilização fecham-se as placas e colocam-se numa câmara de fluxo laminar e abrem-se durante cerca de 30 minutos para remover qualquer excesso de CI2 gasoso. Germinam-se então as sementes tal como descrito anteriormente. As sementes com esterilização de superfície seca permanecerão estéreis à temperatura ambiente durante cerca de 2 semanas. Preparam-se os explantes para inoculação tal como descrito anteriormente (Hinchee et ai., 1988).

Os explantes devem ser inoculados durante 30 minutos. O meio de co-cultivo e de ressuspensão de Agrobacterium consiste de meio B5 suplementado com BAP a 1 mg/L, GA3 a 1 mg/L, sacarose a 3% (p/v), MES (ácido 2-[N-morfolino]- etanossulfónico) 20 mM, L-cisteina a 400 mg/L (Olhoft e

Somers, 2001) pH 5,7, ditiotreitol (DTT) 0,99 mM e acetossiringona (AS) 200 μΜ. Co-cultivaram-se os explantes durante 5 dias a 25°C. Após co-cultivo, lavaram-se os explantes no meio de co-cultivo contendo timentina a 100 mg/L e cefotaxima a 200 mg/L, sem MES e AS.

Devem colocar-se os explantes em meio de indução de rebentos e devem transferir-se de 14 em 14 dias durante um total de 28 dias antes de selecção com herbicida. O meio de indução de rebentos consiste de meio B5 sem diluição suplementado com BAP a 1,7 mg/L, timentina a 100 mg/L, cefotaxima a 200 mg/L, pH 5,7 e sacarose a 3% (p/v) . Devem colocar-se os cotilédones com o adaxial para cima com a região do nó do cotilédone a verter para o meio, com adição de níveis crescentes de Basta (glufosinato de amónio a 2, 5, 6 e seguidamente 7 mg/L) ou niveis sub-letais de 2,4-D na gama de 10 mg a 400 mg/L de 2 em 2 semanas durante um total de 8 semanas. 152 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

Transferem-se subsequentemente os explantes em diferenciação para meio de alongamento de rebentos durante 4 a 10 semanas adicionais sob a mesma selecção de glufosinato ou sob menor pressão de selecção com 2,4-D na gama de 10 mg a 100 mg/L. O meio de alongamento consistiu de meio B5 (n.° de cat. Sigma M0404) com adição de ribósido de zeatina a 1 mg/L, IAA (ácido indole-3-acético) a 0,1 mg/L, GA3 a 0,5 mg/L, glutamina a 50 mg/L, asparagina a 50 mg/L e sacarose a 3% (p/v), pH 5,8. Os rebentos alongados devem ser enraizados, sem selecção adicional, em meio MS/B5 diluído para metade com vitaminas sem diluição mais NAA (ácido α-naftalenacético) a 0,5 mg/L ou IAA a 0,1 mg/L e sacarose a 2% (p/v).

Mantêm-se os antibióticos, timentina e cefotaxima, no meio ao longo da selecção. Transferem-se as culturas para meio fresco de 2 em 2 semanas. Aclimatam-se as plântulas durante 1 a 2 semanas antes da transferência para a estufa. 13.1.3 - Avaliação da descendência.

Deixam-se as plantas To auto-fertilizarem na estufa para originar semente Ti. Pulverizar-se-ão plantas Ti (e na medida em que se produzam clones suficientes de planta T0) com uma gama de doses de herbicida para determinar o nível de protecção de herbicida proporcionado pelos genes AAD-1 (v3) e PAT em soja transgénica. As taxas de 2,4-D utilizadas em plantas T0 utilizarão tipicamente uma ou duas taxas selectivas na gama de 100-400 g ae/ha. A semente Ti será tratada com uma dose de herbicida mais vasta na gama 50-3200 g ae/ha de 2,4-D. De igual modo, podem rastrear-se plantas T0 e Ti para resistência a glufosinato por tratamento pós-emergência com glufosinato a 200-800 e 50-3200 g ae/ha, respectivamente. A análise de expressão de proteína ocorrerá tal como descrito no exemplo 9 para Arabidopsis e milho. A determinação da hereditariedade de AAD-1 (v3) será efectuada utilizando segregação de descendência Ti e T2 relativamente a tolerância a herbicida. 153 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ 13.2 - Método de transformação 2: Transformação mediada por Agrobacterium "sem agitação" de suspensão de células de soja não regeneráveis.

Cultivaram-se suspensões de células de soja DAS num ciclo de 3 dias com transferência de 10 ml do volume da suspensão que assentou para 115 ml de meio liquido fresco. Determinou-se o volume das células que assentaram deixando a suspensão celular assentar durante 2 min no matraz de 125 mL após aqitação circular viqorosa e sequidamente retiram-se as células do fundo do matraz com uma pipeta de 10 ml de ponta larga. Transferiram-se então os matrazes para um agitador orbital a 140 rpm.

Transferiram-se aliquotas de 4 ml da suspensão de células a DO600 a 0,72 conjuntamente com acetossiringona (AS) 200 μΜ para uma placa de Petri estéril 100x25. Adicionou-se suspensão de Agrobacterium EHA105 a uma densidade de DO650 de 1,2 num volume de 100 pL e misturou-se bem. Agitou-se bem por rotação a mistura de Agrobacterium e suspensão de células e transferiu-se a placa para a câmara de crescimento no escuro na qual se manteve a temperatura a 25°C. 13.2.1 - Selecção de células de soja em suspensão e isolamento das colónias transformadas.

Após 4 dias de co-cultivo agitou-se por rotação a placa novamente para misturar bem a suspensão e transferiu-se uma aliquota de 1,5 ml para o meio de selecção e espalhou-se no meio de gel numa placa de Petri de 100x15 ml. O meio de selecção consistiu de meio B5 sem diluição suplementado com BAP a 1,7 mg/L, timentina a 100 mg/L, cefotaxima a 200 mg/L, pH 5,7 e sacarose a 3% (p/v) e completou-se o meio com glufosinato de amónio ao nível de 5 mg/L. Após 10 min a secar na hote incubaram-se as placas durante 4 semanas no escuro a 28°C. As colónias apareceram na selecção e transferiram-se um total de 11 colónias para meio fresco de 3 experiências diferentes e mantiveram-se durante 3-4 meses. Todas as 11 colónias resistentes produziram calos que cresceram em 154 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ glufosinato a 5 mg/L contendo meio de selecção. As células em suspensão não transformadas foram sensíveis quando plaqueadas em meio de glufosinato de amónio a 0,5 mg/1. Contudo, as colónias transformadas foram resistentes a 5x a concentração de glufosinato de amónio e mantiveram-se até 4 meses.

Amostraram-se eventos de calo para análises quando estes atingiram 2 a 3 cm de diâmetro. Analisaram-se pelo menos dois dos isolados de colónias, um de cada duas experiências diferentes, para expressão de proteína AAD1. As análises de ELISA e "Western" efectuadas nestes dois isolados apresentaram expressão positiva de proteínas AAD1. Tanto a análise ELISA (tabela 29) como a transferência "Western" (figura 18) em dois calos de soja independentes transformados com gene AAD-1 (v3) indicaram que as células do calo estão a expressar a proteína AAD-1 (v3). O ensaio ELISA em sanduíche detectou 0,0318% e 0,0102% de proteína solúvel total de AAD-1 (v3) em duas amostras diferentes de tecido de calo. Devido à sensibilidade e reactividade cruzada do anti-soro observaram-se várias bandas na transferência "western". Contudo, observou-se a banda específica de AAD-1 (v3) em ambas as amostras de calo mas não no tecido de tipo selvagem (negativo). As análises de PCR de região de codificação mostraram os produtos com o tamanho esperado das regiões de codificação AAD1 e PAT nestas colónias indicando que foram transformadas.

Tabela 29. Dados de PCR e ELISA para eventos de soja transgénica. Evento PCR de região de codificação de AAD-1 PCR de região de codificação de PAT T SP (ug/mL) AAD-1 (ng/mL) % de expressão 1-1 + + 1995,13 633,89 0,0318% 2-1 + + 2018,91 205,92 0,0102% Controlo negativo - - 2074,63 -1,22 -0,0001% 155 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ 13.3 - Método de transformaçao 3: transformaçao de tecido de calo de soja embriogénico mediada por feixe de aerossol. A cultura de tecido de calo de soja embriogénico e a aplicação do feixe foram tal como descrito na patente U.S. 6 809 232 (Held et al.).

Recolheram-se separadamente os calos embriogénicos de algumas variedades de Stine elite, incluindo 96E750, 96E94, 97E986, 96E144 e 96E692 para o centro de placas de Bl-30 3Co5My ou Bl-30 3Co5MyO.25PA0.5K três dias após transferência para meio fresco. Aplicou-se então ao tecido o feixe de pDAB3295 utilizando ADN linearizado a uma concentração de aproximadamente 0,2 yg/ml. Após aplicação do feixe, transferiram-se os calos embriogénicos para Bl-30 3Co5My ou Bl-30 3Co5MyO.25PA0.5K frescos para uma passagem de um mês. Transferiu-se então o tecido para meio selectivo contendo bialafos a 1 mg/1. Com bialafos a selecção manteve-se tipicamente a 1 mg/1 para as primeiras duas passagens de um mês e seguidamente aumentou para 2 mg/1 durante os três a sete meses seguintes. Identificaram-se os eventos transgénicos quando o tecido de calo gerado pelas experiências de transformação se começou a organizar e desenvolveu para estruturas embriogénicas enquanto ainda estava em meio selectivo contendo 2,4-D mais bialafos. Uma vez identificadas, regeneraram-se as estruturas em maturação para plantas de acordo com o protocolo seguinte: transferiram-se estruturas embriogénicas de Bl-30 3Co5My ou Bl-30 3/co5MyO.25PA0.5K para meio B3. Após 3 a 4 semanas de crescimento em meio B3 transferiram-se as estruturas individuais para meio fresco. Após mais 3 a 4 semanas transferiram-se os embriões em maturação para meio B5G e colocaram-se à luz. Transferiram-se os embriões que tinham alongado e produzido raízes para tubos contendo 1/2 de meio B5G nos quais continuaram o seu desenvolvimento para plântulas; e removeram-se essas plântulas dos tubos e colocaram-se em vasos.

Ensaiaram-se variações dos meios referidos na tabela 30, e.g., Bl-30 3Co5My, que foi produzido por adição de água de 156 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ coco a 3% e mio-inositol a 5 g/1 a Bl-30. Outras variações incluíram: Bl-30 3Co5My0.25 PAO.5K que continha meio basal Bl-30 mais água de coco a 3%, mio-inositol a 5 g/1, ácido fítico a 0,25 g/1 e KH2P04 a 0,5 g/1 adicional e 1/2 de B5G que continha todos os ingredientes do meio B5G a metade da concentração.

Tabela 30. Meios de crescimento para soja Ingredientes em 1 litro Bl-30 B3 B56 Sais Ms 4,43 g 4,43 g Sais B5 3,19 g NaEDTA 37,3 mg 37,3 mg 37,3 mg 2, 4-D 30 mg Carvão activado 5 g Phytagar 8g 8g Gelrite 2g PH 5, 8 5, 8 5, 8

Exemplo 14 - Permitir incorporação de AAD-1 (v3) em algodão 14.1 - Protocolo de transformação de algodão.

Submetem-se sementes de algodão (genótipo Co310) a esterilização superficial em etanol a 95% durante 1 minuto, enxaguam-se, esterilizam-se com lixívia comercial a 50% durante vinte minutos e seguidamente enxaguaram-se 3 vezes com água destilada estéril antes da germinação em meio G (tabela 31) em vasos Magenta GA-7 e manteve-se com elevada intensidade luminosa de 40-60 yE/m2 com o fotoperiodo de 16 horas de luz e 8 horas de escuro a 28°C.

Isolam-se quadrados (~5mm) de segmentos de cotilédone de plântulas com 7-10 dias em líquido de meio líquido M (tabela 31) em placas de Petri (Nunc, n.° 0875728). Tratam-se os segmentos cortados com uma solução de Agrobacterium (durante 30 minutos) e seguidamente transfere-se para meio M semi-sólido (tabela 31) e submete-se a co-cultivo durante 2-3 dias. Após co-cultivo transferem-se os segmentos para meio MG (tabela 31) . Utiliza-se carbenicilina como o antibiótico para matar Agrobacterium e o glufosinato de amónio é o agente 157 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ de selecçao que permitirá crescimento apenas das células que contêm o gene transferido.

Preparação de Agrobacterium. Inocular 35 ml de meio Y (tabela 31) (contendo estreptomicina (solução-mãe a 100 mg/ml) e eritromicina (solução-mãe a 100 mg/ml)) com uma ansa de bactérias para crescer durante a noite no escuro a 28°C com agitação a 150 rpm. No dia seguinte deitar a solução de Agrobacterium num tubo oakridge estéril (Nalge-Nunc, 3139-0050) e centrifugar em Beckman J2-21 a 8 000 rpm durante 5 minutos. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 25 ml de M liquido (tabela 31) e submeter a vortex. Colocar uma aliquota num tubo de cultura de vidro (Fisher, 14-961-27) para leitura Klett (Klett-Summerson, modelo 800-3). Diluir a nova suspensão utilizando meio liquido M até uma leitura no medidor Klett de 108 unidades formadoras de colónias por mL com um volume total de 40 ml.

Após três semanas isola-se o calo dos segmentos cotilédones e transfere-se para meio MG fresco. Transfere-se o calo durante 3 semanas adicionais em meio MG. Transfere-se então o calo para meio CG (tabela 31) e transfere-se novamente para meio de selecção fresco após três semanas. Após outras três semanas transfere-se o tecido do calo para meio D (tabela 31) isento de reguladores de crescimento de planta para indução de calo embriogénico. Após 4-8 semanas neste meio, forma-se calo embriogénico e pode distinguir-se de calo não embriogénico pela sua cor branca amarelada e células granulares. Os embriões começam a regenerar dentro de pouco tempo e têm uma cor verde distintiva.

Isolam-se os embriões maiores e bem desenvolvidos e transferem-se para meio DK (tabela 31) para desenvolvimento de embriões. Após 3 semanas (ou quando os embriões se desenvolveram) transferem-se os embriões germinados para meio fresco para desenvolvimento de rebentos e raízes. Após 4-8 semanas transferem-se todas plantas bem desenvolvidas para o solo e crescem-se até à maturidade. Após um par de meses a 158 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ planta cresceu até poder ser pulverizada para determinar se tinha resistência a 2,4-D.

Tabela 31. Meio para transformação de algodão Ingredientes em 1 litro G M líquido M MG CG D DK Y Sais LS (5X) 200 ml 200 ml 200 ml 200 ml 200 ml Glucose 30 gramas 30 gramas 30 gramas 30 gramas 20 gramas B5 vit modificado (lOOOx) 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 10 ml 1 ml Cinetina (lmM) lml 1 ml 1 ml 4,6 ml 0,5ml 2,4-D (lmM) 1 ml 1 ml 1 ml Ágar-ágar 8 gramas 8 gramas 8 gramas 8 gramas 8 gramas 8 gramas Sais DKW (Dl90) 1 pacote 1 pacote Mio-inositol (lOOx) 1 ml 10 ml Sacarose a 3% 30 gramas 30 gramas 10 gramas NAA Carbenicilina (250 mg/ml) 2 ml 0,4 ml GLA (10 mg/ml) 0, 5 ml 0,3 ml Peptona 10 gramas Extracto de levedura 10 gramas NaCl 5 gramas 14.2 - Especificidades da experiência.

Para esta experiência trataram-se 500 segmentos de cotilédones com pDAB721. Dos 500 segmentos tratados, 475 tinham calo isolado aquando da selecção (95% de frequência de transformação). Seleccionou-se o calo em glufosinato de amónio, devido à inclusão do gene PAT na construção, dado que já tinha sido desenvolvido um esquema de selecção. Iniciou-se a análise da linha de calo na forma de PCR e Invader para determinar os padrões de inserção e assegurar que o gene estava presente na etapa de calo e seguidamente enviaram-se as linhas de calo que estavam embriogénicas para análise de "Western". 14.3 - Resultados da análise de calo. 0 objectivo da análise é eliminar quaisquer linhas que não tenham o PTU completo, que não apresentem expressão ou que tenham um número de cópias elevado, de modo a que essas linhas não sejam regeneradas. Das 475 linhas de calo transformadas com pDAB721, enviaram-se 306 para análise de PCR e ensaio 159 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

Invader (tabela 32) . Muito poucas linhas foram negativas em PCR. Os resultados de Invader não estão completos nesta altura porque algumas amostras tinham quantidades de ADN reduzidas quando foram extraídas e estas foram ressubmetidas. Contudo, ao dados correntes de Invader mostram que apenas poucas das linhas submetidas apresentaram número de cópias elevado (número de cópias >2) (tabela 32). Devido ao elevado número de linhas que passaram na análise foi necessário diminuir o número de linhas de calo embriogénico que foram mantidas devido ao volume. Enviaram-se noventa linhas para a análise "Western" e oito dessas foram negativas. A análise "Western" mostrou expressão elevada da maioria das linhas (tabela 32) . Estão a manter-se oitenta e duas linhas de calo embriogénico para regeneração de planta com base nos resultados da análise (e resultados pendentes). 160 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

Tabela 32. Análise de calos de algodão

Linha N. 2 de cópias PTU "Western" Linha N. 2 de cópias PTU "Western" 1 2 pos k k k 43 1 pos ★ ★ ★ ★ ★ 2 1 pos k k k 44 Pouco ADN pos ★ ★ ★ ★ ★ 3 1 pos k k k 45 1 pos ★ ★ ★ ★ ★ 4 2 pos k k k 46 2 pos k k k k k 5 1 pos k k k 47 1 pos k k k 6 1 pos neg 48 1 pos k k k 7 1 pos k k k k 49 3 pos fraco neg 8 1 pos k k k k k 50 1 pos ★ ★ ★ ★ 9 2 pos * 51 4 pos neg 10 1 pos * 52 2 pos ★ ★ ★ ★ 11 1 pos k k k k k 53 1 pos ★ ★ ★ 12 1 pos * 54 1 pos ★ ★ ★ ★ 13 1 pos * 55 1 pos neg 14 1 pos * * 56 5 pos * 15 1 pos ★ ★ ★ ★ 57 2 pos fraco neg 16 1 pos ★ ★ ★ ★ ★ 58 pos ★ ★ ★ ★ 17 1 pos * 59 2 pos ★ ★ ★ ★ 18 1 pos ★ ★ ★ 60 5 pos ★ ★ ★ ★ ★ 19 1 pos k k 61 1 pos k k 20 1 pos k k k k k 62 1 pos k k 21 2 pos k k k k k 63 1 pos k k k 22 1 pos k k k k k 64 1 pos k k k 23 1 pos k k k k k 65 3 pos k k k k 24 4 pos * ou neg 66 5 pos * 25 1 pos ★ ★ ★ ★ 67 6 pos * 26 1 pos ★ ★ ★ ★ 68 Pouco ADN pos neg 27 Pouco ADN pos ★ ★ ★ ★ ★ 69 Pouco ADN pos ★ ★ ★ ★ 28 Pouco ADN pos * * 70 Pouco ADN pos * * 29 Pouco ADN pos ★ ★ ★ ★ ★ 71 Pouco ADN pos fraco * * 30 17 pos * 72 Pouco ADN pos ★ ★ ★ ★ 31 Pouco ADN pos ★ ★ ★ ★ ★ 73 Pouco ADN neg ★ ★ ★ 32 Pouco ADN pos k k k k k 74 Pouco ADN pos fraco k k k 33 Pouco ADN pos k k k k 75 Pouco ADN pos k k k 34 Pouco ADN pos fraco k k k k k 76 Pouco ADN pos Neg 35 Pouco ADN pos k k k k 77 Pouco ADN pos fraco ★ ★ ★ ★ 36 Pouco ADN pos neg 78 Pouco ADN pos ★ ★ ★ ★ 37 Pouco ADN pos ★ ★ ★ ★ 79 1 pos * * 38 Pouco ADN neg ★ ★ ★ ★ ★ 80 Pouco ADN pos ★ ★ ★ 39 1 pos ★ ★ ★ ★ 81 Pouco ADN pos ★ ★ ★ 40 Pouco ADN pos * 82 Pouco ADN pos ★ ★ ★ 41 Pouco ADN pos * 83 Pouco ADN neg ★ ★ ★ ★ 42 Pouco ADN pos * * 84 Pouco ADN pos ★ ★ ★ 85 Pouco ADN pos * * padrão AAD1 5ug/ml ★ ★ ★ ★ ★ 86 Pouco ADN pos * padrão AAD1 0,5ug/ml 161 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ 14.4 - Regeneração de planta.

Duas linhas de algodão AAD-1 (v3) produziram plantas de acordo com o protocolo anterior que foram enviadas para a estufa. Para demonstrar que o gene AAD-1 (v3) confere resistência a 2,4-D em algodão, pulverizaram-se tanto a planta de algodão AAD-1 (v3) como as plantas de algodão de tipo selvagem com um moto-pulverizador a 187 L/ha. Pulverizaram-se as plantas com 2,4-DMA a 560 g ae/ha formulado em tampão Hepes 200 mM (pH 7,5). Avaliaram-se as plantas aos dias 3, 7 e 14 após tratamento. Atribuiram-se às plantas pontuações de lesão relativamente a nanismo, clorose e necrose. Considera-se que as plantas às quais se atribuiu uma pontuação de lesão de 90% ou superior estão mortas. Três dias após o tratamento (DAT) a planta de tipo selvagem começou a apresentar epinastia e recebeu uma classificação de 15%; contrariamente, a planta AAD-1 (v3) apresentou 0% de lesão. A 7 DAT a epinastia continuou no tipo selvagem e os novos rebentos começaram a ficar castanhos. Recebeu uma classificação de 50% a este ponto temporal. A 14 DAT a planta AAD-1 (v3) ainda não apresentava lesões, enquanto o tipo selvagem estava gravemente enfezada e as novas áreas de crescimento estavam castanhas e enrugadas. Assim, o tipo selvagem recebeu uma classificação de 90% a 14 DAT.

Este estudo demonstra que o gene AAD-1 (v3) em algodão proporciona tolerância substancial a 2,4-D até pelo menos 560 g ae/ha.

Exemplo 15 - Transformação com Agrobacterium de outras culturas

Considerando a presente divulgação, podem transformar-se culturas adicionais de acordo com o presente invento utilizando técnicas que são conhecidas na especialidade. Para transformação mediada por Agrobacterium de centeio, consultar, e.g., Popelka e Altpeter (2003). Para transformação mediada por Agrobacterium de soja, consultar, e.g., Hinchee et al., 1988. Para transformação mediada por Agrobacterium de sorgo, 162 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ consultar, e.g., Zhao et al., 2000. Para transformação mediada por Agrobacterium de cevada, consultar, e.g., Tingay et al., 1997. Para transformação mediada por Agrobacterium de trigo, consultar, e.g., Cheng et al., 1997. Para transformação mediada por Agrobacterium de arroz, consultar, e.g., Hiei et al., 1997.

Fornecem-se seguidamente os nomes latinos para estas e outras plantas. Deve esclarecer-se que se podem utilizar estas e outras técnicas de transformação (não de Agrobacterium) para transformar AAD-1 (v3), por exemplo, para estas e para outras plantas, incluindo entre outras, milho (Gramineae Zea mays), trigo (Pooideae Triticum spp.), arroz (Gramineae Oryza spp. e Zizania spp.), cevada (Pooideae Hordeum spp.), algodão (Abroma Dicotyledoneae, Abroma augusta e Malvaceae Gossypium spp.), soja (Soya Leguminosae Glycine max), beterraba açucareira (Chenopodiaceae Beta vulgaris altíssima), cana-de-açúcar (Arenga pinnata), tomate (Solanaceae Lycopersicon esculentum e outras spp., Physalis ixocarpa, Solanum incanum e outras spp. e Cyphomandra betacea), batata, batata-doce, centeio (Pooideae Secale spp.), pimentos (Solanaceae Capsicum annuum, sinense e frutescens), alface (Compositae Lactuca sativa, perennis e pulchella), couve, aipo (Umbelliferae Apium graveolens), beringela (Solanaceae Solanum melongena), sorgo (todas as espécies de sorgo), alfalfa (Leguminosae Medicago sativum), cenoura (Umbelliferae Daucus carota sativa), feijões (Leguminosae Phaseolus spp. e outros géneros), aveia (Avena Sativa e Strigosa), ervilhas (Leguminosae Pisum, Vigna e Tetragonolobus spp.), girassol (Compositae Helianthus annuus), abóbora (Dicotyledoneae Cucurbita spp.), pepino (Dicotyledoneae genera) , Tabaco (Solanaceae Nicotiana spp.), Arabidopsis (Cruciferae Arabidopsis thaliana), relva (Lolium, Agrostis e outra familias) e trevo (Leguminosae) . Tais plantas com genes AAD-1 (v3), por exemplo, incluem-se no presente invento. 163 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

Exemplo 16 - Junção de AAD-1 (v3) com o gene de resistência a herbicida AHAS

Descreve-se no exemplo 7.9. a junção de AAD-1 (v3) com o gene de resistência a herbicida AHAS

Exemplo_17_-_Evidência_adicional_dos_resultados surpreendentes: AAD-1 contra AAD-2 17.1 - Clonagem inicial de AAD-2 (vl).

Identificou-se outro gene da base de dados NCBI (consultar o sitio ncbi.nlm.nih.gov; n.° de acesso AP005940) como um homólogo com apenas 44% de identidade de aminoácidos com tfdA. Refere-se aqui este gene como AAD-2 (vl) por coerência. Identificou-se a percentagem de identidade, primeiro por tradução das sequências de ADN de AAD-2 e tfdA (SEQ ID NO:12 e n.° de acesso GENBANK M16730, respectivamente) para proteinas (SEQ ID NO:13 e n.° de acesso GENBANK M16730, respectivamente) e seguidamente utilizando ClustalW no pacote de utilitários VectorNTI para efectuar o alinhamento de sequência múltiplas.

Obteve-se a estirpe de Bradyrhizobium japonicum contendo o gene AAD-2 (vl) de Northern Regional Research Laboratory (NRRL, n.° de estirpe B4450). Reviveu-se a estirpe liofilizada de acordo com o protocolo NRRL e armazenou-se a -80 °C em glicerol a 20% para utilização do laboratório como estirpe bacteriana de Dow DB 663. A partir desta solução-mãe congelada riscou-se então uma placa de ágar-ágar com soja tríptica usando uma ansa de células para isolamento e incubou-se a 28°C durante 3 dias. Utilizou-se uma colónia única para inocular 100 ml de meio liquido de soja triptica num matraz de três aletas de 500 mL e incubou-se durante a noite a 28°C num agitador de modelo chão a 150 rpm. Isolou-se ADN total desta cultura com o protocolo Gram-negativo do kit DNeasy da Qiagen (n.° de cat. Qiagen 69504). Conceberam-se os seguintes iniciadores para amplificar o gene alvo do ADN genómico, Directo: 5' ACT AGT AAC AAA GAA GGA GAT ATA CCA TGA CGA T 3' [(brjap 5'(spel) SEQ ID NO:14 (adição do local de restrição Spe I e local de ligação ao ribossoma (RBS) ) ] e Inverso: 5' 164 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ TTC TCG AGC ΤΑΤ CAC TCC GCC GCC TGC TGC TGC 3' [ (br jap 3' (xhol) SEQ ID NO:15 (adição de um local Xho I)].

Estabelecem-se reacções de cinquenta microlitros como se segue: Tampão Fail Safe 25 μΐ, 1 μΐ de cada iniciador (50 ng/μΐ), gADN 1 μΐ (200 ng/μΐ), H2O 21 μΐ, Taq polimerase 1 μΐ (2,5 unidades/μΐ). Utilizaram-se três tampões Fail Safe A, B e C em três reacções independentes. Efectuou-se então PCR nas seguintes condições: 95°C 3,0 minutos ciclo de desnaturação pelo calor; 95°C 1,0 minuto, 50°C 1,0 minuto, 72°C 1,5 minutos, durante 30 ciclos; seguido por um ciclo final de 72°C 5 minutos utilizando o sistema de PCR FailSafe (n.° de cat. Epicenter FS99100). O produto de PCR resultante com ~1 kb foi clonado em pCR 2.1 (n.° de cat. Invitrogen K4550-40) seguindo o protocolo incluso, com E. coli TOP10F' como a célula hospedeira quimicamente competente, para verificação da sequência de nucleótidos.

Repicaram-se dez das colónias brancas resultantes para 3 μΐ de meio liquido Luria + ampicilina a 1000 pg/ml (LB Amp) e cultivaram-se durante a noite a 37°C com agitação. Purificaram-se plasmideos de cada cultura utilizando o kit de mini-preparação Nucleospin Plus Plasmid (n.° de cat. BD Biosciences K3063-2) e seguindo o protocolo incluso.

Completou-se a digestão de restrição dos ADN isolados para confirmar a presença do produto de PCR no vector pCR2.1. Digeriu-se o ADN plasmidico com a enzima de restrição EcoRI (n.° de cat. New England Biolabs R0101S). Efectuou-se a sequenciação com o kit Quick Start de Beckman CEQ (n.° de cat. Beckman Coulter 608120) utilizando os iniciadores de M13 Directo [5' GTA AAA CGA CGG CCA GT 3'] (SEQ ID NO: 16) e Inverso [5' CAG GAA ACA GCT ATG AC 3'] (SEQ ID NO:17), segundo as instruções do fabricante. A esta sequência de gene e sua proteína correspondente deu-se a nova designação geral AAD-2 (vl) para coerência interna. 165 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ 17.2 - Conclusão do vector binário AAD-2 (vl).

Amplificou-se por PCR o gene AAD-2 (vl) a partir de pDAB3202. Durante a reacção de PCR fizeram-se alterações nos iniciadores para introduzir os locais de restrição AflIII e Saci no iniciador 5' e no iniciador 3', respectivamente. Utilizaram-se os iniciadores "Ncol de Brady" [5' TAT ACC ACA TGT CGA TCG CCA TCC GGC AGC TT 3'] (SEQ ID NO: 18) e "Saci de Brady" [5' GAG CTC CTA TCA CTC CGC CGC CTG CTG CTG CAC 3'] (SEQ ID NO:19) para amplificar um fragmento de ADN utilizando o sistema de PCR Fail Safe (Epicentre). Clonou-se o produto de PCR no vector de clonagem pCR 2.1 TOPO TA (Invitrogen) e verificou-se a sequência com os iniciadores M13 Directo e M13 Inverso utilizando os reagentes de sequenciação "Dye

Terminator Cycle Sequencing with Quick Start Kit" de Beckman Coulter. Os dados de sequenciação identificaram um clone com a sequência correcta (pDAB716). Clonou-se então o fragmento AfÍlll/Sacl do gene AAD-2 (vl) no vector NcoI/SacI pDAB726. Verificou-se a construção resultante (pDAB717); promotor AtUbilO: Nt OSM 5'UTR: AAD-2 (vl): Nt OSM3'UTR: ORF1 poliA 3'UTR com digestões de restrição (com NcoI/SacI). Clonou-se esta construção no binário pDAB3038 na forma de um fragmento de ADN NotI - NotI. Efectuou-se a digestão de restrição da construção resultante (pDAB767); promotor AtUbilO: Nt OSM5'UTR: AAD-2 (vl): Nt OSM 3'UTR: ORF1 poliA 3'UTR: promotor CsVMV: PAT: ORF25/26 3'UTR (com Notl, EcoRI, HinDIII, Ncol,

PvuII e Sall) para verificação da orientação correcta. Utilizou-se então a construção completa (pDAB767) para transformação em Agrobacterium. 17.3 - Comparação das especificidades de substrato de AAD-2 (vl) e AAD-1 (vl)

Ensaiou-se um extracto de E. coli que expressa AAD-2 (vl) (pDAB3202) preparado como no exemplo 11 para actividade de quatro herbicidas, 2,4-D, (R,S)-diclorprop, (R,S)-haloxifop e (R)-haloxifop (todos a uma concentração final de 0,5 mM) utilizando 3 μΐ (42 pg) de extracto de E. coli por ensaio com um período de ensaio de 15 min. A figura 22 demonstra que a 166 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ actividade relativa de AAD-2 (vl) nos substratos foi 2,4-D = diclorprop > (R,S)-haloxifop >> (R)-haloxifop. Assim AAD-2 (vl) difere de AAD-1 (vl) por ter um nivel de actividade semelhante em 2,4-D e em diclorprop (enquanto a actividade de AAD-1 (vl) em 2,4-D é -10% da de diclorprop) . AAD-2 (vl) também difere de AAD-1 (vl) por ser incapaz de actuar em (R)-haloxifop. A tabela 33 apresenta dados de substratos adicionais ensaiados com AAD-1 (vl) e AAD-2 (vl) que confirmam que AAD-2 (vl) é especifico para enantiómeros (S) de substratos, contrariamente a AAD-1 (vl) que é especifico para enantiómeros (R). Em outro ensaio, verificou-se que AAD-2 (vl) era diferente de AAD-1 (vl) por libertar pouco ou nenhum fenol detectável de sulfonato de 2,4-D (no qual um grupo sulfonato substitui o carboxilato de 2,4-D) enquanto AAD-1 (vl) produz níveis significativos de fenol a partir deste composto (-25% de 2,4-D.)

Tabela 33. Comparação de actividades AAD1 e AAD2 em diferentes substratos. Ensaiaram-se os substratos a 0,5 mM durante 15 min em MOPS 25 mM pH 6,8, Fe2+ 200 μΜ, ascorbato de Na 200 μΜ, α-cetoglutarato 1 mM utilizando 4 μΐ de extracto de AAD1 (32 pg de proteina) ou 3 μΐ de extracto de AAD2 (42 pg de proteína). A510 ESTRUTURA ID de registo Composto Enantiómero AAD1 AAD2 XXX 18706 quizalofop R 0,27 0, 01 ;yTX Φ 8671 haloxifop R 0, 12 0 ^cojcfr Cl 66905 haloxifop R, S 0,1 0,3 ort N\ o^ych· Qj0r 14623 ci-halofop R, S 0,12 0,1 167 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

Tabela 33. Comparação de actividades AAD1 e AAD2 em diferentes substratos. Ensaiaram-se os substratos a 0,5 mM durante 15 min em MOPS 25 mM pH 6,8, Fe2+ 200 μΜ, ascorbato de Na 200 μΜ, α-cetoglutarato 1 mM utilizando 4 μΐ de extracto de AAD1 (32 μg de proteína) ou 3 μΐ de extracto de AAD2 (42 pg de proteína). A510 ESTRUTURA ID de registo Composto Enantiómero AAD1 AAD2 OH / °=( /=\ /ΓΛ N==— 14603 ci-halofop R 0,14 0 °^Ç 7466 ci-halofop S 0 0, 15 S Chiral fVo fy ch» 11044492 fenoxaprop R 0,14 0 Cl 43865 acetato de haloxifop - 0 0, 22

Compararam-se as cinéticas enzimáticas de AAD-1 (vl) e AAD-2 (vl) parcialmente purificadas utilizando 2,4-D como substrato. Consultar a figura 19. Os valores de Km para 2,4-D foram 97 e 423 μΜ para AAD-1 (vl) e AAD-2 (vl) respectivamente e os valores de Vmáx aparente foram 0,11 e 0,86 unidades de A5io, respectivamente (tabela 34). Devido a se terem utilizado quantidades equivalentes de enzima nos ensaios (tal como determinado por análise de SDS-PAGE), pode concluir-se que o kcat de AAD-2 (vl) para 2,4-D é cerca de 8 vezes superior ao valor para AAD-1 (vl) e kcat/Km é 2 vezes superior. Assim AAD-2 (vl) é significativamente mais eficaz na clivagem de 2,4-D in vitro do que AAD-1 (vl). Tal contrasta surpreendentemente com o que se verificou na planta e que se relata seguidamente, em que plantas que expressam AAD-1 (vl) são significativamente melhores a conferir resistência a 2,4-D relativamente a AAD-2 (vl). 168 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

Tabela 34. Comparação dos valores de Km e "Vmáx" para ariloxialcanoato-dioxigenases (AAD) de pDAB3202 (AAD-2) e pDAB3203 [AAD-1 (vl)] com diferentes herbicidas substratos:

Enzima Composto Km (μΜ) ±EP Vmáx (unidades de Km/Vmáx (unidades Ά510) arbitrárias) AAD-2 2,4-D 423 (±1) 0,86 2,03 AAD-1 (vl) 2,4-D 97 (±21) 0,11 1,16

Notas: Efectuaram-se ensaios em MOPS pH 6,75 + α-cetoglutarato 1 mM + ascorbato de Na 0,1 mM + Fe2+ 0,1 mM e os fenóis libertados foram detectados colorimetricamente utilizando 4-aminoantipirina/ferricianeto. 17.4 - Avaliação de Arabidopsis transformada.

Deixou-se secar durante 7 dias à temperatura ambiente sementes Ih recentemente colhidas e transformadas com gene [AAD-1 (v2)] nativo, [AAD-1 (v3)] optimizado para planta ou AAD-2 (vl). Semeou-se a semente Ih em tabuleiros de germinação de 26,5 x 51 cm (T.O. Plastics Inc., Clearwater, MN), recebendo cada um aliquotas de 200 mg de semente Ti estratificada (—10 000 sementes) que tinham sido previamente suspensas em 40 ml de solução de agarose a 0,1% e armazenadas a 4°C durante 2 dias para completar os requisitos de dormência vegetativa e assegurar germinação síncrona das sementes.

Cobriu-se Sunshine Mix LP5 (Sun Gro Horticulture Inc.,

Bellevue, WA) com vermiculite fina e sub-irrigou-se com solução de Hoagland até estar molhado e seguidamente deixou-se drenar por gravidade. Semearam-se em vermiculite homogeneamente aliquotas de 40 ml de semente estratificada com uma pipeta e cobriu-se com coberturas de humidade (KORD Products, Bramalea, Ontario, Canada) durante 4-5 dias.

Removeram-se as coberturas 1 dia antes da selecção dos produtos de transformação iniciais utilizando pulverização com glufosinato pós-emergência (selecção para co-transformação com gene PAT) .

Cinco a seis dias após plantar (DAP) e mais uma vez a 10 DAP, pulverizaram-se plantas Ti (cotilédone e estágio de 2-4 folhas, respectivamente) com uma solução a 0,2% de herbicida Liberty (glufosinato a 200 g ae/L, Bayer Crop Sciences, Kansas City, MO) a um volume de pulverização de 10 ml/tabuleiro 169 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ (703 L/ha) utilizando uma ponta de pulverização de ar comprimido DeVilbiss para entregar um caudal efectivo de 280 g ae/ha de glufosinato por aplicação. Identificaram-se os sobreviventes (plantas em crescimento activo) 5-7 dias após a pulverização final e transplantaram-se individualmente para vasos de 3 polegadas preparados com meio de vaso (Metro Mix 360). Cobriram-se as plantas transplantadas com coberturas de humidade durante 3-4 dias e colocaram-se numa câmara de cultura a 22 °C tal como anteriormente. Removeram-se subsequentemente as coberturas e deslocaram-se as plantas para a estufa (22±5°C, 50±30% de HR, 14 horas de luz:10 escuro, minimo 500 yE/m2s1 luz natural + suplemento) pelo menos 1 dia antes do ensaio relativamente à capacidade de AAD-1 (v3), AAD-1 (v2) ou AAD-2 (vl) proporcionarem resistência a herbicida fenoxiauxinico.

Confirmou-se expressão de proteína PAT em plantas Τχ individuais aleatórias, anteriormente seleccionadas para resistência a glufosinato, utilizando um kit de ELISA PAT (N.° 7000045, Strategic Diagnostics, Inc., Newark, DE) para confirmar de forma não destrutiva a fidelidade do processo de selecção (protocolo do fabricante). Atribuíram-se então aleatoriamente as plantas a várias taxas de 2,4-D (50-800 g ae/ha).

Aplicaram-se por moto-pulverizador aplicações de herbicida num volume de pulverização de 187 L/ha. O 2,4-D utilizado foi a formulação comercial de sal de dimetilamina (456 g ae/L, NuFarm, St Joseph, MO) misturada em tampão Tris 200 mM (pH 9,0) . 17.5 - Resultados de selecção de plantas transformadas.

Efectuaram-se as primeiras transformações de Arabidopsis utilizando AAD-1 (v3). Seleccionaram-se primeiro os produtos de transformação Τχ da linha de base de semente não transformada utilizando um esquema de selecção de glufosinato. Rastrearam-se mais de 400 000 sementes Τχ e identificaram-se 493 plantas resistentes a glufosinato (gene PAT) resultando 170 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ numa frequência transformação/selecção de 0,12%. Dependendo do lote de sementes ensaiado, tal variou na gama 0,05-0,23% (consultar tabela 15 do exemplo 6.5 anterior). Seleccionou-se igualmente um lote pequeno de sementes transformadas com AAD-1 (v2) nativo utilizando o agente de selecção glufosinato. Identificaram-se duzentos e setenta e oito indivíduos Ti resistentes a glufosinato de entre 84 000 sementes rastreadas (0,33% de frequência transformação/selecção). Surpreendentemente, as transformações Arabidopsis utilizando o gene AAD-2 (vl) nativo proporcionaram uma frequência de transformação muito baixa quando seleccionadas para tolerância a glufosinato (função de marcador seleccionável de PAT). Rastrearam-se aproximadamente 1,3 milhões de sementes e apenas se recuperaram 228 produtos de transformação de glufosinato, resultando numa frequência transformação/selecção de 0,018% (consultar tabela 15). A frequência de transformação em AAD-2 (vl) nativo foi de apenas 6% do verificado para AAD-1 (v2) nativo. O gene AAD2 (vl) nativo foi subsequentemente optimizado sinteticamente, clonado e transformado como pDAB3705 para Arabidopsis utilizando métodos descritos anteriormente (consultar exemplo 5). O gene AAD2 (v2) (SEQ ID NO:29, que codifica SEQ ID NO:30) optimizado para planta levou a uma frequência de selecção normal para Ti de Arabidopsis utilizando herbicida Liberty de aproximadamente 0,11 % (consultar tabela 15).

Subsequentemente transplantaram-se as plantas Ti seleccionadas anteriormente para vasos individuais e pulverizaram-se com várias taxas de herbicidas ariloxialcanoato comerciais. A tabela 16 (no exemplo 6.5 anteriormente) compara a resposta dos genes AAD-1 (v2), AAD-1 (v3), AAD-2 (vl) e AAD-1 (v2) para conferir resistência a 2,4-D a produtos de transformação Ti de Arabidopsis. Todos os genes proporcionaram de facto alguma resistência significativa a 2,4-D relativamente a linhas de controlo transformadas e não transformadas; contudo, as construções individuais foram muito variáveis relativamente à sua capacidade de conferir resistência a 2,4-D para plantas ^ de Arabidopsis individuais. Dentro de determinado tratamento, o nível de 171 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ resposta da planta variou grandemente e pode ser atribuído ao facto de cada planta representar um evento de transformação independente. É importante salientar que para cada taxa de 2,4-D ensaiada houve indivíduos que não foram afectados enquanto alguns foram gravemente afectados. Apresenta-se na tabela 16 uma taxa média de lesão para a população global apenas para demonstrar a diferença significativa entre as plantas transformadas com AAD-1 (v2), AAD-1 (v3), AAD-2 (vl) ou AAD-2 (v2) contra o tipo selvagem ou controlos transformados com PAT/CrylF.

Surpreendentemente, os produtos de transformação AAD-2 (vl) foram muito menos resistentes a 2,4-D do que os dos genes AAD-1 (v2) ou AAD-1 (v3) (tabela 16) tanto relativamente a frequência de plantas altamente tolerantes como a lesão média global. Nenhuma plantas transformada com AAD-2 (vl) sobreviveu a 2,4-D a 200 g ae/ha relativamente sem lesões (<20% de lesões visíveis) e a lesão para a população global foi de cerca de 83%. Contrariamente, 56% (45 de 80) de plantas Ti transformadas com AAD-1 (v2) sobreviveram a 2,4-D a 200 g ae/ha sem lesões (média de lesão da população = 34%) e >73% (11 de 15) de plantas Ti AAD-1 (v3) não mostraram lesões (média de lesão da população = 14%). Consultar a figura 20. A tolerância melhorou ligeiramente para AAD2 (v2) optimizado para planta relativamente ao gene nativo; contudo, a comparação de ambos os genes AAD-1 e AAD-2 optimizados para planta indica uma vantagem significativa para AAD-1 (v3) na planta (consultar tabela 16).

Estes resultados são inesperados já que a comparação in vitro de AAD-1 (v2) e AAD-2 (vl) nativos indicou que 2,4-D era melhor degradado por AAD-2 (vl). AAD-2 (vl) é expresso em plantas li individuais a diferentes níveis com o tamanho esperado; contudo, esta proteína expressa proporcionou pouca protecção contra lesão por 2,4-D. Existe pouca correlação entre o nível de expressão verificado na hibridação "Western" e o nível de lesão de 2,4-D nas mesmas plantas. Consultar a figura 21. Não foi evidente uma grande diferença no nível de expressão de proteína (na planta) para genes AAD-2 nativos e 172 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ genes optimizados para planta. Estes dados corroboram revelações anteriores que tornam inesperada a expressão de AAD-1 (v3) na planta para proporcionar resistência a 2,4-D e herbicidas AOPP.

Exemplo 18 - Aplicações de extermínio pré-plantio

Este exemplo e os seguintes são exemplos específicos de novas utilizações de herbicida tornadas possíveis pelo AAD-1 objecto do invento.

As aplicações de extermínio pré-plantio pretendem eliminar ervas daninhas que apareceram durante o Inverno ou no início da Primavera antes do plantio de determinada colheita. Tipicamente aplicam-se estas aplicações em sistemas de gestão sem lavoura ou com lavoura reduzida em que a remoção física de ervas daninhas não fica completa antes do plantio. O programa de herbicida deve por isso controlar uma muito vasta variedade de ervas daninhas de folha larga e gramíneas presentes na altura do plantio. O glifosato, o gramoxone e o glufosinato são exemplos de herbicidas não selectivos, não residuais vastamente utilizados para aplicações de herbicida para extermínio pré-plantio. Contudo, algumas ervas daninhas são difíceis de controlar nesta altura da estação devido a um ou mais dos seguintes: insensibilidade inerente da espécie de erva daninha ou biótipo ao herbicida, tamanho relativamente grande das ervas daninhas anuais de Inverno e condições climatéricas frias que limitam a absorção e actividade do herbicida. Estão disponíveis várias opções de herbicida para mistura em tanque com estes herbicidas para aumentar o espectro e actividade nas ervas daninhas nos casos em que os herbicidas não selectivos são fracos. Um exemplo seria aplicações em misturas em tanque de 2,4-D com glifosato para auxiliar no controlo de Conyza canadensis (avoadinha). Pode utilizar-se glifosato desde 420 a 1680 g ae/ha, mais tipicamente 560 a 840 g ae/ha, para o controlo de extermínio pré-plantio da maioria das ervas daninhas presentes; contudo, pode aplicar-se 2,4-D a 280 - 1120 g ae/ha para ajudar no controlo de muitas espécies de erva daninha de folha larga 173 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ (e.g., avoadinha). Ο 2,4-D é um herbicida de eleição porque é eficaz numa muito vasta gama de ervas daninhas de folha larga, eficaz mesmo a baixas temperaturas e extremamente económico. Contudo, se a colheita subsequente é uma cultura de dicotiledóneas sensíveis, os resíduos de 2,4-D no solo (apesar da sua curta duração) podem ter um impacto negativo na colheita. A soja é uma cultura sensível e necessita de um período de tempo mínimo de 7 dias (para uma taxa de 2,4-D a 280 g ae/ha) até pelo menos 30 dias (para aplicações de 2,4-D de 1120 g ae/ha) entre as aplicações de extermínio e o plantio. O 2,4-D está proibido como tratamento de extermínio antes da plantação de algodão (consultar os critérios federais, estando a maioria disponíveis através de CPR, 2003 ou na internet em cdms.net/manuf/manuf.asp). Com algodão ou soja transformados com AAD-1 (v3) estas culturas devem ser capazes de sobreviver a resíduos de 2,4-D no solo de aplicações de extermínio aplicadas directamente e mesmo após a plantação, antes da emergência da colheita. A flexibilidade aumentada e o custo reduzido dos parceiros de mistura em tanque (ou pré-mistura comercial) melhorarão o controlo das opções de ervas daninhas e aumentará a robustez das aplicações de extermínio em situações importantes sem lavoura e com lavoura reduzida. Este exemplo é uma de muitas opções que estarão disponíveis. Os peritos na especialidade de controlo de ervas daninhas notarão várias outras aplicações incluindo, entre outras gramoxone + 2,4-D ou glufosinato + 2,4-D por utilização de produtos descritos nos critérios federais de herbicidas (CPR, 2003) e utilizações descritas no Agriliance Crop Protection Guide (2003), como exemplos. Os peritos na especialidade reconhecerão também que o exemplo anterior pode ser aplicado a qualquer colheita sensível a 2,4-D (ou outro herbicida fenoxiauxínico) que seria protegida pelo gene AAD-1 (v3) se for transformada de forma estável.

Exemplo 19 - Utilização na colheita de herbicidas fenoxiauxínicos em soja, algodão e outras culturas de dicotiledóneas transformadas apenas com AAD-1 (v3) 174 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ Ο gene AAD-1 (ν3) pode permitir a utilização de herbicidas fenoxiauxinicos (e.g., 2,4-D, diclorprop, MCPA, et al.) para o controlo de um vasto espectro de ervas daninhas de folha larga directamente em culturas normalmente sensíveis a 2,4-D. A aplicação de 2,4-D de 280 a 2240 g ae/ha controlaria a maioria das espécies de ervas daninhas de folha larga presentes em ambientes agronómicos. Mais tipicamente utiliza-se 560 1120 g ae/ha. Para um controlo completo do sistema de ervas daninhas, devem controlar-se as ervas daninhas gramíneas. Vários herbicidas graminicidas de largo espectro, incluindo entre outros haloxifop, quizalofop, fenoxaprop, fluazifop, setoxidim e cletodim estão actualmente registados para utilização na maioria das culturas de dicotiledóneas que são naturalmente tolerantes a estes herbicidas. Uma combinação de quizalofop (20 - 100 g ae/ha) mais 2,4-D (420 - 840 g ae/ha) poderia proporcionar dois modos de acção de herbicida numa cultura de dicotiledóneas transformadas com AAD-1 (v3) (i.e., soja ou algodão) que controlaria a maioria das ervas daninhas agronómicas de modo semelhante ao glifosato em culturas tolerantes ao glifosato (consultar o espectro de controlo de ervas daninhas por referência às classificações de desempenho do Agriliance Crop Protection Guide).

Uma vantagem desta ferramenta adicional é o custo extremamente reduzido da componente de herbicida de folha larga e dos potenciais resíduos de curta duração do controlo de ervas daninhas proporcionados por taxas elevadas de 2,4-D e/ou herbicidas AOPP quando utilizados em taxas mais elevadas, enquanto herbicida não residual como glifosato não proporcionaria qualquer controlo de ervas daninhas de germinação tardia. Esta ferramenta também proporciona um mecanismo de rotação dos modos de acção dos herbicidas com a conveniência de HTC como uma estratégia integrada de resistência a herbicida e gestão de variação de erva daninha numa estratégia de colheita tolerante a glifosato/rotação de HTC com AAD-1 (v3), quer se faça ou não rotação das espécies de cultura. Adicionalmente, as componentes deste sistema de controlo de ervas daninhas gramíneas e de folha larga são independentes entre si, permitindo assim que o perito na 175 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ especialidade de controlo de ervas daninhas determine a razão de herbicida auxinico e AOPP mais eficaz do ponto de vista de preço e de eficácia. Por exemplo, caso as ervas daninhas de folha larga sejam as únicas ervas daninhas significativamente presentes quando se necessita aplicação de herbicida, poderia efectuar-se uma aplicação de herbicida 2,4-D de 560 a 1120 g ae/ha sem outro herbicida. Tal reduziria as aplicações desnecessárias de herbicida, proporcionaria flexibilidade para reduzir custos à cabeça e reduziria as cargas ambientais de pesticidas e reduziria a pressão selectiva desnecessária para o desenvolvimento de ervas daninhas resistentes a herbicida.

Os benefícios adicionais poderiam incluir tolerância a desvio ou volatilização por 2,4-D como mecanismos para lesão por 2,4-D fora do campo para culturas de dicotiledóneas; ausência de necessidade de intervalo antes da plantação após aplicação de 2,4-D (consultar exemplo anterior); e menos problemas provenientes de lesão por contaminação de culturas de dicotiledóneas resultantes de tanques de mistura que continham 2,4-D com limpeza incompleta. Podem ainda utilizar-se dicamba (e outros herbicidas) para o controlo subsequente de colheitas voluntárias de dicotiledóneas transformadas com AAD-1 (v3).

Os peritos na especialidade reconhecerão também que o exemplo anterior pode ser aplicado a qualquer cultura sensível a 2,4-D (ou outro herbicida fenoxiauxínico) que seria protegida pelo gene AAD-1 (v3) caso fosse transformada de forma estável. O perito na especialidade de controlo de ervas daninhas reconhecerá agora que a utilização de vários herbicidas fenoxiauxínicos comerciais sozinhos ou em combinação com qualquer herbicida AOPP comercial é permitida pela transformação com AAD-1 (v3). Podem determinar-se taxas específicas de outros herbicidas representativos destes grupos químicos pelas características do herbicida compiladas no livro CPR (Crop Protection Reference) ou compilação semelhante ou qualquer referência de protecção de colheitas comercial ou académica tais como o Crop Protection Guide de Agriliance (2003). Considera-se que cada herbicida alternativo com 176 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ permissão de utilização em HTC através de AAD-1 (v3) quer utilizado sozinho, em mistura de tanque ou sequencialmente, encontra-se no âmbito deste invento.

Exemplo 20 - Utilização na colheita de herbicidas fenoxiauxínicos e AOPP em milho, arroz e outras espécies de monocotiledóneas transformadas apenas com AAD-1 (v3)

De forma análoga, a transformação de espécies gramineas (tais como, entre outras, milho, arroz, trigo, cevada ou relva e pasto) com AAD-1 (v3) permitiria a utilização de graminicidas AOPP altamente eficazes em culturas normalmente sensíveis a esses herbicidas. A maioria das espécies gramineas tem uma tolerância natural a herbicidas auxínicos tais como as fenoxiauxinas (i.e., 2,4-D, diclorprop, et al.). Contudo, um nível relativamente reduzido de selectividade de cultura resultou na diminuição da utilidade dessas culturas devido ao encurtamento da janela temporal de aplicação e ervas daninhas de folha larga alternativas. As culturas de monocotiledóneas transformadas com AAD-1 (v3) permitiriam assim a utilização de uma combinação semelhante de tratamentos descritos para culturas de dicotiledóneas tais como a aplicação de 2,4-D de 280 a 2240 g ae/ha para controlar a maioria das espécies de erva daninha de folha larga. Mais tipicamente utilizar-se-ia 560 - 1120 g ae/ha. Poderia utilizar-se uma variedade de herbicidas graminicida AOPP de largo espectro (incluindo entre outros haloxifop, quizalofop, fenoxaprop e fluazifop) para controlar eficazmente uma vasta selecção de ervas daninhas gramineas. Não se poderia utilizar neste sistema herbicidas graminicidas de ciclo-hexanodiona tal como setoxidim, cletodim, et al. tal como mostrado para culturas de dicotiledóneas dado que AAD-1 não protegeria destes grupos químicos e as culturas gramineas seriam naturalmente sensíveis aos grupos químicos de ciclo-hexanodiona. Contudo, este atributo permitiria a utilização de herbicidas ciclo-hexanodiona para o controlo subsequente de colheitas voluntárias de gramineas transformadas com AAD-1 (v3) . Estratégias semelhantes para controlo de ervas daninhas são agora permitidas por AAD-1 para as espécies de culturas de 177 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ dicotiledóneas. Uma combinação de quizalofop (20 100 g ae/ha) mais 2,4-D (420 - 840 g ae/ha) poderia proporcionar dois modos de acção de herbicidas numa cultura de monocotiledóneas transformada com AAD-1 (v3) (e.g., milho e arroz) que controlaria a maioria das ervas daninhas agronómicas de modo semelhante a glifosato em culturas tolerantes a glifosato (consultar o espectro de controlo de ervas daninhas por referência às classificações de desempenho do Agriliance Crop Protection Guide).

Uma vantagem desta ferramenta adicional é o custo extremamente reduzido da componente de herbicida de folha larga e dos potenciais resíduos de curta duração do controlo de ervas daninhas proporcionados por taxas elevadas de 2,4-D e/ou herbicidas AOPP quando utilizados a taxas mais elevadas. Contrariamente, um herbicida não residual como glifosato não proporcionaria qualquer controlo de ervas daninhas de germinação tardia. Esta ferramenta também proporciona um mecanismo de fazer rotação dos modos de acção dos herbicidas com a conveniência de HTC como uma estratégia integrada de resistência a herbicida e gestão de variação de erva daninha numa estratégia de colheita tolerante a glifosato/rotação de HTC com AAD-1 (v3), quer se alterne ou não as espécies de cultura. Adicionalmente, as componentes deste sistema de controlo de ervas daninhas gramíneas e de folha larga são independentes entre si, permitindo assim que o perito na especialidade de controlo de ervas daninhas determine a razão de herbicida auxínico e AOPP mais eficaz do ponto de vista de preço e de eficácia. Por exemplo, caso as ervas daninhas de folha larga sejam as únicas ervas daninhas significativamente presentes quando se necessita aplicação de herbicida, poderia efectuar-se uma aplicação de herbicida 2,4-D de 560 a 1120 g ae/ha sem outro herbicida. Tal reduziria as aplicações desnecessárias de herbicida, proporcionaria flexibilidade para reduzir custos à cabeça e reduziria as cargas ambientais de pesticidas e reduziria a pressão selectiva desnecessária para o desenvolvimento de ervas daninhas resistentes a herbicida. A tolerância acrescida de milho e outras monocotiledóneas às fenoxiauxinas permitirá a utilização destes herbicidas na 178 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ 178 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ cultura sem restrições de estágios de crescimento ou 0 potencial para inclinação da cultura, fenómenos de desenrolamento tais como " rabos de rato", inclinação da cultura, caule quebradiço induzido por reguladores de crescimentos em milho ou raízes adventícias deformadas.

Os peritos na especialidade reconhecerão também que o exemplo anterior pode ser aplicado a qualquer cultura de monocotiledóneas que seria protegida pelo gene AAD-1 (v3) contra lesão por qualquer herbicida AOPP. O perito na especialidade de controlo de ervas daninhas reconhecerá agora que a utilização de vários herbicidas fenoxiauxinicos sozinhos ou em combinação com qualquer herbicida AOPP comercial é permitida pela transformação AAD-1 (v3). Podem determinar-se taxas especificas de outros herbicidas representativos destes grupos químicos pelas características do herbicida compiladas no livro CPR (Crop Protection Reference) ou compilação semelhante, compilações de critérios na internet (e.g., cdms.net/manuf/manuf.asp), ou qualquer referência de protecção de colheitas comercial ou académica tais como o Crop Protection Guide de Agriliance (2003). Considera-se que cada herbicida alternativo com permissão de utilização em HTC através de AAD-1 (v3) quer utilizado sozinho, em mistura em tanque ou sequencialmente, encontra-se no âmbito deste invento.

Exemplo 21 - AAD-1 (v3) juntamente com a característica de tolerância a qlifosato em qualquer cultura morango, A grande maioria das áreas plantadas com algodão, colza e soja na América do Norte apresentam uma característica de tolerância a glifosato (GT) e a adopção de milho GT está a aumentar. Têm estado em desenvolvimento culturas GT adicionais (e.g., trigo, arroz, beterraba açucareira e relva) mas até à data ainda não foram lançadas no mercado. Muitas outras espécies resistentes a glifosato estão num estágio entre experimental e de desenvolvimento (e.g., alfalfa, cana-de-açúcar, girassol, beterrabas, ervilhas, cenouras, pepinos, alface, cebola, morango, tomate e tabaco; espécies de 179 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ silvicultura tais como choupo e liquidâmbar; e espécies hortícolas tais como margaridas, petúnia e begónias; isb.vt.edu/cfdocs/fieldtestsl.cfm, 2005 na internet). Os GTC são ferramentas valiosas pela impressionante variedade de ervas daninhas controladas e conveniência e eficácia económica proporcionada por este sistema. Contudo, a utilidade do glifosato como um tratamento de base que é actualmente padrão é seleccionar para ervas daninhas resistentes a glifosato. Além disso, as ervas daninhas contras as quais o glifosato é inerentemente menos eficaz estão a variar para espécie predominante em campos nos quais se estão a praticar programas químicos apenas com glifosato. Agregando AAD-1 (v3) com uma característica GT, quer através de criação convencional ou conjuntamente como um novo evento de transformação, poderia melhorar a eficácia de controlo de ervas daninhas, flexibilidade e capacidade de gerir variações de ervas daninhas e desenvolvimento de resistência a herbicida. Tal como mencionado nos exemplos anteriores, por transformação de culturas com AAD-1 (v3), pode aplicar-se selectivamente herbicidas AOPP em culturas de monocotiledóneas, as culturas de monocotiledóneas terão uma maior margem de segurança relativamente a fenoxiauxina e podem aplicar-se selectivamente as fenoxiauxinas em culturas de dicotiledóneas. Podem prever-se vários cenários para opções de controlo melhorado de ervas daninhas em que se juntam AAD-1 (v3) e uma característica GT em quaisquer espécies de culturas de monocotiledóneas ou de dicotiledóneas: a) Pode aplicar-se glifosato a uma taxa de aplicação padrão pós-emergência (420 a 2160 g ae/ha, de preferência 560 a 840 g ae/ha) para o controlo da maioria das espécies de ervas daninhas gramíneas e de folha larga. Para o controlo de ervas daninhas de folha larga resistentes a glifosato tal como Conyza canadensis ou ervas daninhas inerentemente difíceis de controlar com glifosato (e.g., Conunelina spp), pode aplicar-se 2,4-D a 280-2240 g ae/ha (de preferência 560-1120 g ae/ha) sequencialmente, em mistura em tanque ou como uma pré-mistura com glifosato para proporcionar controlo eficaz. 180 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ b) Pode aplicar-se glifosato a uma taxa de aplicação padrão pós-emergência (420 a 2160 g ae/ha, de preferência 560 a 840 g ae/ha) para o controlo da maioria das espécies de ervas daninhas gramíneas e de folha larga. Para o controlo de espécies de gramineas resistentes a glifosato tal como Lolium rigidum ou Eleusine indica, pode aplicar-se quizalofop a 10-200 g ae/ha (de preferência 20-100 g ae/ha) sequencialmente, em mistura em tanque ou como uma pré-mistura com glifosato para proporcionar controlo eficaz. c) Presentemente, as taxas de glifosato aplicadas em GTC variam geralmente na gama entre 560 e 2240 g ae/ha por ponto temporal de aplicação. O glifosato é muito mais eficaz em espécies gramineas do que em espécies de erva daninha de folha larga. As caracteristicas AAD-1 (v3) + GT acumuladas permitiriam taxas de glifosato eficazes para gramíneas de (105-840 g ae/ha, com maior preferência 210-420 g ae/ha). Poderia então aplicar-se 2,4-D (a 280-2240 g ae/ha, com maior preferência 560-1120 g ae/ha) sequencialmente, em mistura em tanque ou como uma pré-mistura com taxas de glifosato eficazes para gramineas para proporcionar o controlo necessário de ervas daninhas de folha larga. Poderia utilizar-se um herbicida AOPP tal como quizalofop a 10-200 g ae/ha (de preferência 20-100 g ae/ha e com maior preferência 20-35 g ae/ha) para um controlo mais robusto de ervas daninhas gramineas e/ou para atrasar o desenvolvimento de gramineas resistentes a glifosato. A taxa reduzida de glifosato proporcionaria também algum beneficio ao controlo de ervas daninhas de folha larga; contudo, o controlo primário seria proporcionado por 2,4-D. O perito na especialidade de controlo de ervas daninhas reconhecerá que a utilização de um ou mais herbicidas fenoxiauxínicos comerciais sozinhos ou em combinação (sequencial ou independentemente) com um ou mais herbicidas AOPP comerciais é permitida pela transformação das culturas com AAD-1 (v3). Podem determinar-se taxas específicas de outros herbicidas representativos destes grupos químicos pelas caracteristicas do herbicida compiladas no livro CPR (Crop 181 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

Protection Reference) ou compilação semelhante, critérios compilados na internet (e.g., cdms.net/manuf/manuf.asp) ou quaisquer guias de protecção de colheitas comerciais ou académicos tais como o Crop Protection Guide de Agriliance (2003). Cada herbicida alternativo com permissão de utilização em HTC através de AAD-1 (v3) quer utilizado sozinho, em mistura de tanque ou sequencialmente, encontra-se no âmbito deste invento.

Exemplo 22 - AAD-1 (v3) juntamente com a característica de tolerância a glufosinato em qualquer cultura A tolerância ao glufosinato (PAT ou bar) está actualmente presente em várias culturas plantadas na América do Norte como marcador seleccionável para uma caracteristica de entrada tal como proteínas de resistência a insectos ou especificamente como uma caracteristica de HTC. As culturas incluem, entre outras, colza, milho e algodão tolerantes a glufosinato. Têm estado em desenvolvimento culturas tolerantes a glufosinato adicionais (e.g., arroz, beterraba açucareira, soja e relva) mas ainda não foram introduzidas no mercado até à data. O glufosinato, tal como o glifosato, é um herbicida de largo espectro para gramíneas e folhas largas relativamente não selectivo. O modo de acção do glufosinato difere do glifosato. É de actuação mais rápida resultando na secura e "queima" das folhas tratadas 24-48 horas após a aplicação do herbicida. Tal é vantajoso para o aparecimento de controlo rápido de ervas daninhas. Contudo, tal também limita a translocação de glufosinato para regiões meristemáticas de plantas alvo resultando num pior controlo de ervas daninhas tal como evidenciado pelas taxas de desempenho relativas do controlo de ervas daninhas pelos dois compostos em muitas espécies (Agriliance, 2003).

Acumulando AAD-1 (v3) com uma caracteristica de tolerância a glufosinato, quer através de criação convencional ou conjuntamente como um novo evento de transformação, poderia melhorar a eficácia de controlo de ervas daninhas, flexibilidade e capacidade de gerir variações de ervas 182 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ daninhas e desenvolvimento de resistência a herbicida. Tal como mencionado nos exemplos anteriores, por transformação de culturas com AAD-1 (v3) podem aplicar-se selectivamente herbicidas AOPP em culturas de monocotiledóneas, as culturas de monocotiledóneas terão uma maior margem de segurança relativamente a fenoxiauxina e podem aplicar-se selectivamente as fenoxiauxinas em culturas de dicotiledóneas. Podem prever-se vários cenários para opções de controlo melhorado de ervas daninhas em que se juntam AAD-1 (v3) e uma caracteristica de tolerância a glufosinato em quaisquer espécies de culturas de monocotiledóneas ou de dicotiledóneas: a) Pode aplicar-se glufosinato a uma taxa de aplicação padrão pós-emergência (200 to 1700 g ae/ha, de preferência 350 a 500 g ae/ha) para o controlo de muitas espécies de ervas daninhas gramineas e de folha larga. Até à data, não foram confirmadas quaisquer ervas daninhas resistentes a glufosinato; contudo, o número de ervas daninhas inerentemente tolerantes a glufosinato é maior do que a glifosato. i) Puderam controlar-se espécies de ervas daninhas gramineas inerentemente tolerantes (e.g., Echinochloa spp ou Sorghum spp) por mistura em tanque de quizalofop a 10-200 g ae/ha (de preferência 20-100 g ae/ha). ii) Puderam controlar-se espécies de ervas daninhas de folha larga inerentemente tolerantes (e.g., Cirsium arvensis e Apocynum cannabinum) por mistura em tanque de 2,4-D a 280-2240 g ae/ha, com maior preferência 560-2240 g ae/ha, para controlo eficaz destas espécies perenes mais difíceis de controlar e para melhorar a robustez do controlo das espécies anuais de ervas daninhas de folha larga. b) Uma combinação em três frentes de glufosinato (200-500 g ae/ha) + 2,4-D (280-1120 g ae/ha) + quizalofop (10-100 g ae/ha), por exemplo, poderia proporcionar um espectro mais robusto e sobreponivel de controlo de ervas daninhas. Adicionalmente, o espectro sobreponivel proporciona um 183 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ mecanismo adicional para a gestão ou atraso de ervas daninhas resistentes a herbicida. O perito na especialidade de controlo de ervas daninhas reconhecerá que a utilização de um ou mais herbicidas fenoxiauxinicos comerciais sozinhos ou em combinação (sequencial ou independentemente) com um ou mais herbicidas AOPP comerciais é permitida pela transformação das culturas com AAD—1 (v3). Podem determinar-se taxas especificas de outros herbicidas representativos destes grupos químicos pelos critérios do herbicida compiladas no livro CPR (Crop Protection Reference) ou compilação semelhante, critérios compilados na internet (e.g., cdms.net/manuf/manuf.asp) ou quaisquer guias de protecção de colheitas comerciais ou académicos tais como o Crop Protection Guide de Agriliance (2003). Cada herbicida alternativo com permissão de utilização em HTC através de AAD-1 (v3) quer utilizado sozinho, em mistura em tanque ou sequencialmente, encontra-se no âmbito deste invento.

Exemplo 23 - AAD-1 (v3) juntamente com a característica AHAS em qualquer cultura A tolerância a herbicida imidazolinona (AHAS, et al.) está actualmente presente em várias culturas plantadas na América do Norte incluindo, entre outras, milho, arroz e trigo. Têm estado em desenvolvimento culturas tolerantes a imidazolinona adicionais (e.g., algodão e beterraba açucareira) mas ainda não foram introduzidas no mercado até à data. Muitos herbicidas imidazolinona (e.g., imazamox, imazetapir, imazaquin e imazapic) são presentemente utilizados selectivamente em várias culturas convencionais. A utilização de imazetapir, imazamox e do imazapir não selectivo foi permitida através de características de tolerância a imidazolinona tal como AHAS et al. Até à data, as HTC tolerantes a imidazolinona têm a vantagem de não serem transgénicas. Esta classe química também tem actividade residual no solo significativa sendo assim capaz de proporcionar controlo de ervas daninhas prolongado para além 184 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ do ponto temporal da aplicação, contrariamente a sistemas baseados em glifosato ou glufosinato. Contudo, o espectro de ervas daninhas controladas pelos herbicidas imidazolinona não é tão vasto como para o glifosato (Agriliance, 2003) . Adicionalmente, os herbicidas imidazolinona têm um modo de acção (inibição de acetolactato-sintetase, ALS) contra o qual muitas ervas daninhas desenvolveram resistência (Heap, 2004) . Por junção de AAD-1 (v3) com uma característica de tolerância a imidazolinona, quer através de criação convencional ou conjuntamente como um novo evento de transformação, poderia melhorar eficácia de controlo de ervas daninhas, flexibilidade e capacidade de gerir variações de ervas daninhas e desenvolvimento de resistência a herbicida. Tal como mencionado nos exemplos anteriores, por transformação de culturas com AAD-1 (v3) podem aplicar-se selectivamente herbicidas AOPP em culturas de monocotiledóneas, as culturas de monocotiledóneas terão uma maior margem de segurança relativamente a fenoxiauxinas e podem aplicar-se selectivamente as fenoxiauxinas em culturas de dicotiledóneas. Podem prever-se vários cenários para opções de controlo melhorado de ervas daninhas em que se juntam AAD-1 (v3) e uma caracteristica de tolerância a imidazolinona em quaisquer espécies de culturas de monocotiledóneas ou de dicotiledóneas: a) Pode aplicar-se imazetapir a uma taxa de aplicação padrão pós-emergência de (35 a 280 g ae/ha, de preferência 70 a 140 g ae/ha) para o controlo de muitas espécies de gramineas e de folha larga. i) Puderam controlar-se espécies de ervas daninhas de folha larga resistentes a inibidor de ALS tais como Amaranthus rudis, Ambrósia trifida, Chenopodium album (entre outras, Heap, 2004) por mistura em tanque de 2,4-D a 280-2240 g ae/ha, com maior preferência 560-1120 g ae/ha,. ii) Puderam também controlar-se espécies de ervas daninhas de folha larga inerentemente mais tolerantes a herbicidas imidazolinona tais como Ipomoea spp. por 185 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ mistura em tanque de 2,4-D a 280-2240 g ae/ha, com maior preferência 560-1120 g ae/ha. iii) Puderam controlar-se espécies de ervas daninhas gramineas resistentes a inibidor de ALS tais como Sorghum halepense e Lolium spp. por mistura em tanque de quizalofop a 10-200 g ae/ha (de preferência 20-100 g ae/ha). iv) Puderam também controlar-se espécies de ervas daninhas gramineas inerentemente tolerantes (e.g., Agropyron repens) por mistura em tanque de quizalofop a 10-200 g ae/ha (de preferência 20-100 g ae/ha). b) Uma combinação em três frentes de imazetapir (35 — 280 g ae/ha, de preferência 760-140 g ae/ha) + 2,4-D (280 — 1120 g ae/ha) + quizalofop (10-100 g ae/ha), por exemplo, poderia proporcionar um espectro mais robusto e sobreponível de controlo de ervas daninhas. Adicionalmente, o espectro sobreponivel proporciona um mecanismo adicional para a gestão ou atraso de ervas daninhas resistentes a herbicida. O perito na especialidade de controlo de ervas daninhas reconhecerá que a utilização de quaisquer de entre vários herbicidas imidazolinona, herbicidas fenoxiauxinicos ou herbicidas AOPP comerciais sozinhos ou em combinação múltiplas, é permitida pela transformação com AAD-1 (v3) e junção com qualquer caracteristica de tolerância a imidazolinona por criação convencional ou por engenharia genética. Podem determinar-se taxas especificas de outros herbicidas representativos destes grupos químicos pelas características do herbicida compiladas no livro CPR (Crop Protection Reference) ou compilação semelhante, características compiladas na internet (e.g., cdms.net/manuf/manuf.asp) ou quaisquer guias de protecção de colheitas comerciais ou académicos tais como o Crop Protection Guide de Agriliance (2003). Cada herbicida alternativo com permissão de utilização em HTC através de AAD-1 (v3) quer utilizado sozinho, em mistura em tanque ou sequencialmente, encontra-se no âmbito deste invento. 186 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

Exemplo 24 - AAD-1 (ν3) em arroz 24.1 - Descrição dos meios.

Os meios de cultura utilizados foram ajustados a pH 5,8 com KOH 1 M e solidificados com Phytagel a 2,5 g/1 (Sigma) . Cultivaram-se calos embriogénicos em placas de Petri 100 x 20 mm contendo 40 ml de meio semi-sólido. Cresceram-se plântulas de arroz em 50 ml de meio em caixas Magenta. Mantiveram-se as suspensões de células em matrazes de 125 ml contendo 35 ml de meio liquido e agitaram-se por rotação a 125 rpm. A indução e manutenção de culturas embriogénicas ocorreu no escuro a 25-26°C e a regeneração de plantas e cultura das plantas completas ocorreu num fotoperiodo de 16 h (Zhang et al. 1996). A indução e manutenção de calos embriogénicos ocorreu em meio basal NB tal como descrito anteriormente (Li et al. 1993), mas adaptado para conter glutamina a 500 mg/1. Iniciaram-se culturas em suspensão e mantiveram-se em meio liquido SZ (Zhang et al. 1998) com a inclusão de sacarose a 30 g/1 em vez de maltose. O meio osmótico (NBO) consistiu de meio NB com a adição de manitol e sorbitol cada um 0, 256 M. Seleccionaram-se calos resistentes a higromicina B em meio NB suplementado com higromicina B a 50 mg/1 durante 3-4 semanas. A pré-regeneração ocorreu em meio (PRH50) consistindo de meio NB sem ácido 2,4-Diclorofenoxiacético (2,4-D) mas com a adição de 6-benzilaminopurina (BAP) a 2 mg/1, ácido α-naftalenacético (NAA) a 1 mg/1, ácido abscísico (ABA) a 5 mg/1 e higromicina B a 50 mg/1 durante 1 semana. A regeneração de plântulas seguiu através de cultura em meio de regeneração (RNH50) compreendendo meio NB sem 2,4-D e suplementado com BAP a 3 mg/1, NAA a 0,5 mg/1 e higromicina B a 50 mg/1 até regeneração dos rebentos. Transferiram-se os rebentos para meio de enraizamento com sais basais de Murashige e Skoog a metade da concentração e vitaminas B5 de Gamborg, suplementado com sacarose a 1% e higromicina B a 50 mg/1 (1/2MSH50). 187 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ 24.2 - Desenvolvimento de culturas de tecidos.

Esterilizaram-se sementes maduras secas de Oryza sativa L. japonica cv. Taipei 309 tal como descrito em Zhang et al. 1996. Induziram-se tecidos embriogénicos por cultura de sementes de arroz maduras estéreis em meio NB no escuro. Removeu-se o calo primário com aproximadamente 1 mm de diâmetro do escutelo e utilizou-se para iniciar suspensão celular em meio liquido SZ. Mantiveram-se então as suspensões tal como descrito em Zhang 1995. Removeram-se os tecidos embriogénicos derivados da suspensão da cultura liquida 3-5 dias após a subcultura anterior e colocaram-se em meio osmótico NB O para formar um circulo com cerca de 2,5 cm de diâmetro numa placa de Petri e cultivaram-se durante 4 h antes do bombardeamento. Dezasseis a 2 0 h após o bombardeamento transferiram-se os tecidos de meio NBO para meio de selecção NBH50 com higromicina B, assegurando que a superfície bombardeada estava virada para cima e incubou-se no escuro durante 14-17 dias. Separaram-se então os calos formados de novo dos explantes bombardeados originais e colocaram-se perto no mesmo meio. Após 8-12 dias adicionais, identificaram-se calos opacos relativamente compactos e transferiram-se para meio de pré-regeneração PRH50 durante 7 dias no escuro. O calo em crescimento, que se tornou mais compacto e opaco foi então sub-cultivado em meio de regeneração RNH50 durante um período de 14-21 dias com um fotoperíodo de 16 h. Transferiram-se os rebentos em regeneração para caixas Magenta contendo meio ½ de MSH50. Plantas múltiplas que regenerem a partir de um único explante consideraram-se irmãs e trataram-se como uma linha de planta independente. Pontuou-se uma planta como positiva para o gene hph se produzir raízes espessas e brancas e crescer vigorosamente em meio ^ de MSH50. Assim que as plântulas atingiram o topo das caixas Magenta, transferiram-se para solo num vaso de 6 cm com humidade a 100% durante uma semana e seguidamente deslocaram-se para uma câmara de crescimento com um fotoperíodo de 14 h a 30°C e no escuro a 21°C durante 2-3 semanas antes de transplantar para vasos de 13 cm na estufa. Recolheram-se as sementes e secaram-se a 37°C durante uma semana antes do armazenamento a 4°C. 188 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ 24.3 - Bombardeamento com microprojécteis.

Todos bombardeamentos foram efectuados com o sistema Biolistic PDS-1000/He™ (BioRad, Laboratories, Inc.). Lavou-se uma vez três miligramas de partículas de ouro com 1,0 micrómetro de diâmetro com etanol a 100%, duas vezes com água destilada estéril e ressuspendeu-se em 50 μΐ de água num tubo Eppendorf siliconizado. Adicionou-se à suspensão de ouro cinco microgramas de ADN plasmídico representando uma razão molar 1:6 de pDOW3303 (vector contendo Hpt) para pDAB3403, 20 μΐ de espermidina (0,1 M) e 50 μΐ de cloreto de cálcio (2,5 M) . Incubou-se a mistura à temperatura ambiente durante 10 min, sedimentou-se a 10000 rpm durante 10 s, ressuspendeu-se em 60 μΐ de etanol a 100% frio e distribuíram-se 8-9 μΐ para cada macro-transportador. Bombardearam-se amostras de tecido a 1100 psi e 27 polegadas de vácuo de Hg tal como descrito por Zhang et al. (1996) . 24.4 - Ensaios de tolerância.

Pulverizaram-se plântulas de arroz no estágio de 3-5 folhas com solução de DuPont™ Assure® II a 0,3% (v/v) contendo concentrado de óleo de culturas Agridex a 1% (v/v) utilizando um pulverizador de ampola DeVilbiss (atomizador de vidro modelo 15-RD). Esta concentração corresponde a aproximadamente 140 g ae/ha. Pulverizou-se cada planta numa hote a uma distância de 8-12 polegadas com 6 jactos completos do pulverizador dirigidos de modo a cobrir a planta na sua totalidade com uma porção equivalente de herbicida. Cada jacto entregou aproximadamente 100 μΐ de solução à plântula. Após pulverização deixaram-se as plântulas secar durante uma hora antes de serem deslocadas para fora da hote. Determinou-se pontuação para sensibilidade ou resistência aos dias 10-14 após o tratamento (DAT) e apresenta-se na tabela 35 seguidamente. 189 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

Tabela 35. Nome da amostra Quizalofope a 140 g ae/ha Controlo Morta 63-1A Sem lesão 63-1F Sem lesão 63-4B Sem lesão 63-4D Sem lesão 63-6C Morta 24.5 - Colheita de tecido, isolamento e quantificação de ADN.

Colocou-se tecido fresco em tubos e liofilizou-se a 4°C durante 2 dias. Após secagem completa do tecido colocou-se uma pérola de tungsténio (Valenite) no tubo e submeteram-se as amostras a 1 minuto de moagem a seco utilizando um moinho de bolas Kelco. Seguiu-se então o procedimento padrão de isolamento de ADN DNeasy (Qiagen, Dneasy 69109). Corou-se então uma aliquota do ADN extraído com Pico Green (Molecular Probes P7589) e digitalizou-se num fluorómetro (BioTek) com padrões conhecidos para obter a concentração em ng/μΐ. 24.6 - Análise de transferência "Southern".

Efectuou-se análise de transferência "Southern" com ADN total obtido do kit Qiagen DNeasy. Submeteu-se um total de 2 yg de ADN a uma digestão durante a noite com HindIII para pDAB3403 para obter dados de integração. De igual modo, submeteu-se um total de 2 yg de ADN a uma digestão durante a noite com Mfel para obter os dados PTU. Após a digestão durante a noite correu-se uma aliquota de -100 ng num gel a 1% para assegurar digestão completa. Após esta confirmação correram-se as amostras num gel de agarose grande a 0,85% durante a noite a 40 volt. Desnaturou-se então o gel em NaOH 0,2 M, NaCl 0,6 M durante 30 minutos. Neutralizou-se então o gel em Tris HC1 0,5 M, NaCl 1,5 M pH 7,5 durante 30 minutos. Montou-se então um aparelho de gel contendo SSC 20x para obter uma transferência do gel por gravidade para membrana de nylon (Millipore INYC00010) durante a noite. Após a transferência 190 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ durante a noite submeteu-se então a membrana a luz UV através de reticulador (Stratagene UV stratalinker 1800) a 1200 X100 microjoule. Lavou-se então a membrana em SDS a 0,1%, SSC 0,lx durante 45 minutos. Após a lavagem de 45 minutos, incubou-se a membrana durante 3 horas a 80°C e seguidamente armazenou-se a 4°C até hibridação. Preparou-se o fragmento do molde de hibridação utilizando PCR de região de codificação utilizando o plasmideo pDAB3404. Utilizou-se como molde um total de 100 ng de ADN total. Utilizou-se cada iniciador 20 mM com o kit Takara Ex Taq PCR Polymerase (Mirus TAKRR001A). Os iniciadores para o PCR de fragmento de "Southern" AAD-1 foram (Directo -ATGGCTCATGCTGCCCTCAGCC) (SEQ ID NO:31) e (Inverso GGGCAGGCCTAACTCCACCAA) (SEQ ID NO:32). Efectuou-se a reacção de PCR no termociclador 9700 Geneamp (Applied Biosystems), submetendo as amostras a 94°C durante 3 minutos e 35 ciclos de 94°C durante 30 segundos, 65°C durante 30 segundos e 72°C durante 1 minuto e 45 segundos seguidos de 72°C durante 10 minutos.

Correu-se o produto num gel de agarose a 1% e excisou-se e extraiu-se do gel utilizando o procedimento de extracção de gel Qiagen (28706) . Submeteu-se então a membrana a uma etapa de pré-hibridação a 60°C durante 1 hora em tampão Perfect Hyb (Sigma H7033). Utilizou-se o procedimento da reacção de marcação com dCTP Prime it RmT (Stratagene 300392) para desenvolver a sonda baseada em p32 (Perkin Elmer). Limpou-se a sonda utilizando colunas Probe Quant. G50 (Amersham 27-5335- 01) . Utilizaram-se CPM com dois milhões de contagens para hibridar as transferências "Southern" durante a noite. Após a hibridação durante a noite, submeteram-se as transferências a duas lavagens de 20 minutos a 65°C em SDS a 0,1%, SSC 0,lx. Expuseram-se então as transferências num gerador de imagens de 32P durante a noite e digitalizaram-se utilizando um digitalizador Storm (MOLECULAR DEVICES). Apresenta-se na tabela 36 um resumo dos resultados. 191 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

Tabela 36. Resultados de "Southern". Evento Dados de "Southern" integrados Dados de "Southern" PTU Número de bandas Tamanho esperado de 3049 pb 63-1 A 8 sim, 7 bandas distintas 63-1 F 5 sim, 9 bandas distintas 63-4 A 20 sim, 20 bandas distintas 63-4 D 20 sim, 19 bandas distintas 63-6 C 2 Rendimento de ADN insuficiente em ambos os cortes

As plantas 63-1 A e 63-1 F não são o mesmo evento; As plantas 63-4 A e 63-4 D são o mesmo evento. Estes eventos têm os PTU do tamanho esperado mas são muito complexos. Estes dados PTU de transferência "Southern" correlacionam-se com os dados de expressão e com os dados de pulverização. A amostra 63-6 C não tinha ADN suficiente presente para efectuar tanto integração como transferências "Southern" PTU. 24.7 - Dados de "Western" A preparação da amostra e as condições de análise foram tal como descrito anteriormente. Analisaram-se cinco linhas de arroz transgénico e um controlo não transgénico relativamente a expressão de AAD-1 utilizando ELISA e transferência "Western". Detectou-se AAD-1 em quatro linhas (63-1A, 63-1F, 63-4B e 63-4D) mas não na linha 63-1C ou na planta de controlo. Os níveis de expressão variaram entre 15,6 e 183 ppm de proteína solúvel total. Apresenta-se na tabela 37 um resumo dos resultados.

Tabela 37. Pista Nome da amostra TSP (ug/mL) ELISA [AAD1] (ng/mL) Expressão (ppm) "Western" 1 Controlo 6719,58 0, 00 0, 00 - 2 63-1A 8311,87 351,17 42,25 ± 3 63-1F 11453,31 2092,35 182,69 + + 4 63-4B 13835,09 216,00 15, 61 + 5 36-4D 13656,49 717,05 52,51 + + 6 63-6C 5343,63 0, 00 0, 00 - 7 8 Padrão AAD1 Padrão AAD1 (0,5 pg/mL) (5,0 pg/mL) + + + + + + + + 192 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

Exemplo 25 - Procedimentos de transformaçao de relva

Obteve-se transformação genética com AAD-1 (v3) em substituição do gene "bar" tal como descrito seguidamente para Agrostis palustris mediada por Agrobacterium tumefaciens através de calo embriogénico iniciado a partir das sementes (cv. Penn-A-4), tal como descrito na generalidade seguidamente. Consultar "Efficiency of Agrobacterium tumefaciens-mediated turfgrass (Agrostis stolonifera L) transformation" (Luo et. al., 2004).

Infecta-se o calo com uma estirpe de A. tumefaciens (LBA4404) apresentando um vector super-binário que contém um gene bar de resistência a herbicida e dirigido por um promotor de ubiquitina de arroz. A eficiência global de transformação estável variou na gama de 18% a 45%. A transferência "Southern" e a análise genética confirmou a integração do transgene no genoma de Agrostis palustris e transmissão normal e expressão estável do transgene na geração Ti. Todos os eventos de transformação independentes apresentaram uma a três cópias do transgene e a maioria (60-65%) continha apenas uma cópia única do gene exógeno sem rearranjos aparentes. 25.1 - Preparação de sementes para indução de calo embriogénico.

Descascaram-se as sementes maduras com lixa e esterilizou-se a superfície com lixívia Clorox a 10% (v/v) (hipoclorito de sódio a 6%) com Tween 20 (polissorbato 20) a 0,2% (v/v) com agitação vigorosa durante 90 min. Após enxaguamento cinco vezes em água destilada e estéril, colocaram-se as sementes em meio de indução de calo (sais basais MS e vitaminas, sacarose a 30 g/1, caseína hidrolisada a 500 mg/1, ácido 3,6-dicloro-o-anísico (dicamba) a 6,6 mg/1, 6-benzilaminopurina (BAP) a 0,5 mg/1 e Phytagel a 2 g/1. Ajustou-se o pH do meio a 5,7 antes de autoclavar a 120°C durante 20 min). 193 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ 25.2 - Indução de calo embriogénico.

Mantiveram-se as placas de cultura contendo explantes de semente preparadas no escuro à temperatura ambiente durante 6 semanas. Seleccionaram-se visualmente calos embriogénicos e sub-cultivaram-se em meio de indução de calo fresco no escuro à temperatura ambiente durante 1 semana antes do co-cultivo. 25.3 - Infecção com Agrobacterium e co-cultivo.

Um dia antes da agro-infecção dividiu-se o calo embriogénico em bocados de 1 a 2 mm e colocaram-se em meio de indução de calo contendo acetossiringona 100 μΜ. Aplicou-se então uma aliquota de 10 ul de uma suspensão de Agrobacterium (LBA4404) (DO=l, 0 a 660 nm) a cada bocado de calo seguido de 3 dias de co-cultivo no escuro a 25°C. 25.4 - Estágio de descanso e controlo de Agrobacterium.

Para a etapa de tratamento com antibiótico, transferiu-se então o calo e cultivou-se durante 2 semanas em meio de indução de calo mais cefotaxima a 125 mg/1 e carbenicilina a 250 mg/1 para suprimir o crescimento bacteriano. 25.5 - Selecção e identificação de potenciais colónias transgénicas.

Subsequentemente, para selecção, deslocou-se o calo para meio de indução de calo contendo cefotaxima a 250 mg/1 e fosfinotricina (PPT) a 10 mg/1 durante 8 semanas. Efectuou-se tratamento com antibiótico e efectuou-se o processo de selecção completo à temperatura ambiente no escuro. O intervalo de subcultura durante a selecção foi tipicamente de 3 semanas. 25.6 - Regeneração de plantas transgénicas.

Para regeneração de plantas, deslocam-se primeiro os eventos de calo em proliferação resistentes a PPT para meio de regeneração (meio basal MS, sacarose a 30 g/1, mio-inositol a 100 mg/1, BAP a 1 mg/1 e Phytagel a 2 g/1) suplementado com 194 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ cefotaxima, ΡΡΤ ou higromicina. Mantiveram-se estes calos no escuro à temperatura ambiente durante 1 semana e seguidamente deslocaram-se para a luz durante 2-3 semanas para desenvolvimento de rebentos. Não ocorreram plantas albinas com selecção por PPT (a utilização de higromicina como agente de selecção produz um nivel elevado de plantas albinas). 25.7 - Indução de raízes e transferência para estufa.

Separaram-se então os rebentos pequenos e transferiram-se para meio de regeneração isento de hormona contendo PPT e cefotaxima para promover crescimento de raízes enquanto se mantém pressão selectiva e supressão de quaisquer células de Agrobacterium remanescentes. Transferiram-se então as plântulas com raízes bem desenvolvidas (3-5 semanas) para solo e cultivaram-se na estufa ou no campo. 25.8 - Vernalização e exogamia de plantas transgénicas.

Mantiveram-se as plantas transgénicas no exterior numa maternidade de confinamento (3-6 meses) até ao solstício de Inverno em Dezembro. Transferiram-se então as plantas vernalizadas para a estufa e mantiveram-se a 25°C com um fotoperíodo de 16/8 h e rodearam-se com plantas de tipo selvagem não transgénicas que fisicamente as isolaram de outras fontes de pólen. As plantas iniciaram florescência 3-4 semanas após terem sido deslocadas de volta para a estufa. Foram sujeitas a exogamia com o pólen das plantas de tipo selvagem que as rodeavam. Germinaram-se as sementes recolhidas de cada planta transgénica individual em solo a 25°C e cultivaram-se plantas Ti na estufa para análise posterior. 25.9 - Outras gramíneas alvo.

Outras gramíneas que podem ser alvos para transformação AAD-1 de acordo com o presente invento incluem cabelo-de-cão-anual (Poa annua), grama forquilha, Agrostis, grama-bermuda, bluegrass, milho-zaburro, bromus, agrostide-ténue (Agrostis capillaris), Capim búfalo, alpista, grama São Carlos, grama centípede, Festuca rubra commutata, Digitaria, Agrostis 195 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ stolonifera, Κoeleria macrantha, Paspalum dilatatum, festuca, Festolium, Festuca ovina, Bouteloua gracilis, grama índia (Sorghastrum nutans), sorgo de Alepo (Sorghum halepense), Eragrostis, misturas (equina, pasto, etc.), relvas nativas, Dactila, azevém (Lolium perenne), Agrostis gigantea, cevadilha, azevém anual e perene, Festuca rubra trichophylla, poa-dos-prados {Poa pratensis), grama-santo-agostinho, Festuca rubra rubra, capim-sudão, Panicum virgatum, Festuca arundinacea, rabo-de-gato, Deschampsia caespitosa, relvas, erva de trigo e erva Zoysia.

Exemplo 26 - AAD-1 (v3) em colza 26.1 - Transformação de colza.

Utilizou-se o gene AAD-1 (v3) que confere resistência a 2,4-D para transformar Brassica napus var. Nexera* 710 com transformação mediada por Agrobacterium. A construção continha o gene AAD-1 (v3) dirigido pelo promotor CsVMV e o gene Pat dirigido pelo promotor AtUbilO.

Esterilizou-se a superfície das sementes com lixívia comercial a 10% durante 10 minutos e enxaguou-se 3 vezes com água destilada estéril. Colocaram-se então as sementes em meio basal MS (Murashige e Skoog, 1962) a metade da concentração e manteve-se em regime de crescimento estabelecido a 25°C e um fotoperíodo de 16 h de luz/8 h de escuro.

Excisaram-se segmentos de hipocótilo (3-5 mm) de plântulas com 5-7 dias e colocou-se em meio de indução de calo K1D1 (meio MS com quenetina a 1 mg/1 e 2,4-D a 1 mg/1) durante 3 dias como pré-tratamento. Transferiram-se então os segmentos para uma placa de Petri tratada com Agrobacterium Z707S ou estirpe LBA4404 contendo pDAB721. Cultivou-se Agrobacterium durante a noite a 28 °C no escuro num agitador a 150 rpm e subsequentemente ressuspendeu-se no meio de cultura.

Após 30 min de tratamento de segmentos de hipocótilo com Agrobacterium, colocaram-se estes de volta no meio de indução de calo durante 3 dias. Após co-cultivo colocaram-se os 196 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ segmentos em K1D1TC (meio de indução de calo contendo carbenicilina a 250 mg/1 e timentina a 300 mg/1) durante uma semana de recuperação. Alternativamente colocam-se os segmentos directamente em meio de selecção K1D1H1 (meio anterior com Herbiace a 1 mg/1). A carbenicilina e a timentina foram os antibióticos utilizados para matar Agrobacterium. O agente de selecção Herbiace permitiu o crescimento das células transformadas.

Ensaiaram-se por PCR amostras de calo de 35 eventos independentes. Todas as 35 amostras testaram positivo para a presença de AAD-1 (v3), enquanto os controlos não transformados foram negativos (secção sobre o ensaio de PCR) . Confirmaram-se que dez amostras de calo expressavam a proteína AAD-1 tal como determinado por ELISA (secção sobre análise de proteína).

Colocaram-se então os segmentos de hipocótilo com calo em meio de regeneração de rebentos B3Z1H1 (meio MS, benzilamino purina a 3 mg/1, Zeatin a 1 mg/1, MES [ácido 2-(N-morfolino)etanossulfónico] a 0,5 g/1, nitrato de prata a 5 mg/1, Herbiace a 1 mg/1, carbenicilina e timentina). Após 3 semanas os rebentos iniciaram a regeneração. Transferem-se os segmentos de hipocótilo conjuntamente com os rebentos para meio E>3Z1H3 (meio MS, benzilamino purina a 3 mg/1, Zeatin a 1 mg/1, MES [ácido 2-(N-morfolino)etanossulfónico] a 0,5 g/1, nitrato de prata a 5 mg/1, Herbiace a 3 mg/1, carbenicilina e timentina) durante mais 3 semanas.

Excisaram-se os rebentos dos segmentos de hipocótilo e transferiram-se para meio de alongamento de rebentos MESH10 (MS, MES a 0,5 g/1, Herbiace a 10 mg/1, carbenicilina, timentina) durante 2-4 semanas. Cultivam-se os rebentos alongados para indução de raízes em MSI.l (MS com ácido indolebutírico a 0,1 mg/1). Assim que as plantas apresentaram um sistema de raízes bem estabelecido, estas foram transplantadas para o solo. Aclimataram-se as plantas em condições ambientais controladas no Conviron durante 1- 2 semanas antes da transferência para a estufa. 197 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

Auto-polinizaram-se as plantas TO transformadas na estufa para obter semente Tl. Pulverizaram-se as plantas TO e a descendência Tl com uma gama de concentrações de herbicida para estabelecer o nivel de protecção pelo gene AAD-1 (v3). 26.2 - "Análise molecular": materiais e métodos para colza 26.2.1 - Isolamento e quantificação de ADN de recolha de tecido.

Colocou-se tecido fresco nos tubos e liofilizou-se a 4°C durante 2 dias. Após secagem completa do tecido colocou-se uma pérola de tungsténio (Valenite) no tubo e submeteram-se as amostras a 1 minuto de moagem a seco utilizando um moinho de bolas Kelco. Seguiu-se então o procedimento padrão de isolamento de ADN DNeasy (Qiagen, Dneasy 69109). Corou-se então uma alíquota do ADN extraído com Pico Green (Molecular Probes P7589) e leu-se num fluorómetro (BioTek) com padrões conhecidos para obter a concentração em ng/μΐ. 26.2.2 - Reacção de polimerização em cadeia.

Utilizou-se um total de 100 ng de ADN total como molde. Utilizou-se cada iniciador a 20mM com o kit Takara Ex Taq PCR Polymerase (Mirus TAKRR001A). Os iniciadores para PCR de região de codificação de AAD-1 (v3) foram (Directo ATGGCTCATG CTGCCCTCAGCC) (SEQ ID NO:27) e (Inverso.

CGGGCAGGCCTAACTCCACCAA) (SEQ ID NO:28). Efectuou-se a reacção de PCR no termociclador 9700 Geneamp (Applied Biosystems), submetendo as amostras a 94°C durante 3 minutos e 35 ciclos de 94°C durante 30 segundos, 65°C durante 30 segundos e 72°C durante 2 minutos seguido de 72°C durante 10 minutos. Analisaram-se os produtos de PCR por electroforese num gel de agarose a 1% corado com EtBr. 35 amostras de 35 plantas com eventos AAD-1 (v3) tiveram teste positivo. Três amostras de controlo negativo tiveram teste negativo. 198 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ 26.3 - ELISA.

Utilizando a ELISA estabelecida descrita na secção anterior, detectou-se proteína AAD-1 em 10 eventos de transformação de colza diferentes. Os níveis de expressão variaram entre 150 até mais de 1000 ppm de proteína solúvel total (TSP) . Ensaiaram-se três amostras diferentes de calos não transformados em paralelo com a detecção de sinal fraco, indicando que os anticorpos utilizados no ensaio tinham uma reactividade cruzada mínima com a matriz de células de colza. Apresenta-se na tabela 38 um resumo dos resultados.

Tabela 38. Expressão de AAD1 em calos de colza. N.2 de amostra Peso (mg) [TSP] (pg/mL) [AAD1] (ng/mL) Expressão (ppm TSP) PCR para AAD1 1 114 757,02 119,36 157,67 + 2 55 839,79 131,84 156,99 + 3 53 724,41 202,12 279,01 + 4 52 629,01 284,89 452,92 + 5 55 521,75 175,88 337,08 + 6 61 707,69 74, 24 153,71 + 7 51 642,02 559,11 1026,73 + 8 65 707,69 270,73 382,56 + 9 51 642,02 197,90 308,25 + 10 51 1417,42 220,63 156,66 + Controlo 1 53 2424,67 18,67 7, 70 - Controlo 2 61 2549,60 35, 00 13,73 - Controlo 3 59 2374,41 22,79 9,60 -

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<210> 4 <211> 897 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> sequência primária de AAD-1 (v2) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> ligante de iniciador <220> <221> misc_feature <222> (891)..(897) <223> ligante de iniciador 211 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ <400> 4 ccatggctgc tgcactgtcc cccctctccc agcgctttga gcgcatcgcg gtccagccgc 60 tgaccggcgt cctgggcgcc gagatcaccg gcgtcgacct gcgcgagccg ctcgacgaca 120 gcacctggaa cgaaatçctc gacgcgttcc acacttacca ggtcatctat tttcccggcc 180 aggcgatcac caacgaacag cacatcgcct tcagccggcg cttcggcccc gtcgatcccg 240 tgcccctgct caagagcatc gaagggtatc cagaggtgca gatgatccgc cgcgaagcca 300 acgaaagcgg gcgtgtgatc ggtgatgact ggcacaccga cagcaccttc ctggacgcac 360 cgccggccgc cgtggtgatg cgcgcgatcg acgtgcccga gcatggcggc gacaccggtt 420 ttctgagcat gtacaccgcg tgggagaogc tgtcgcccac catgcaggcc accatcgaag 480 ggttgaacgt agtgcacagc gccacgcgtg tgttcggctc gctctaccag gcccagaacc 540 ggcgcttcag caacaccagc gtcaaggtga tggacgtcga cgcgggcgac cgtgaaaccg 600 tgcaccccct ggtggtgacc catccgggca gcggctgcaa gggcctgtac gtgaaccagg 660 tctattgcca gcgcatcgag ggcatgaccg atgccgaaag caaaccgctg ctgcagttcc 720 tgtacgagca tgcgacacgg ttcgatttca cctgccgcgt gcgctggaag aaggaccagg 780 tcctggtctg ggacaacctg tgcacgatgc accgggccgt acccgactac gcgggcaagt 840 tccgctacct gacgcgcacc acggtcggtg gcgtgcgccc ggcgcgctag tgagctc 897 <210> 5 <211> 919 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> sequência primária de AAD-1 (v3) <220> <221> misc_feature <222> (1) .· (2) <223> ligante de iniciador <220> <221> misc_feature <222> (6) .. (8) <223> codão de alanina adicional (GCT) <220> <221> misc_feature <222> (894)..(919) <223> ligante de iniciador 212 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ <400> 5 ccatggctca tgctgccctc agccctctct cccaacgctt tgagagaata gctgtccagc 60 cactcactgg tgtccttggt gctgagatca ctggagtgga cttgagggaa ccacttgatg 120 acagcacctg gaatgagata ttggatgcct tccacactta ccaagtcatc tactttcctg 180 gccaagcaat caccaatgag cagcacattg cattctcaag aaggtttgga ccagttgatc 240 cagtgcctct tctcaagagc attgaaggct atccagaggt tcagatgatc cgcagagaag 300 ccaatgagtc tggaagggtg attggtgatg actggcacac agactccact ttccttgatg 360 cacctccagc tgctgttgtg atgagggcca tagatgttcc tgagcatggc ggagacactg 420 ggttcctttc aatgtacaca gcttgggaga ccttgtctcc aaccatgcaa gccaccatcg 480 aagggctcaa cgttgtgcac tctgccacac gtgtgttcgg ttccctctac caagcacaga 540 accgtcgctt cagcaacacc tcagtcaagg tgatggatgt tgatgctggt gacagagaga 600 cagtccatcc cttggttgtg actcatcctg gctctggaag gaaaggcctt tatgtgaatc 660 aagtctactg tcagagaatt gagggcatga cagatgcaga atcaaagcca ttgcttcagt 720 tcctctatga gcatgccacc agatttgact tcacttgccg tgtgaggtgg aagaaagacc 780 aagtccttgt ctgggacaac ttgtgcacca tgcaccgtgc tgttcctgac tatgctggca 840 agttcagata cttgactcgc accacagttg gtggagttag gcctgcccgc tgagtagtta 900 gcttaatcac ctagagctc 919

<210> 6 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> iniciador 5' rdpA(ncoI) <400> 6 cccatggctg ctgcactgtc ccccctctcc 30

<210> 7 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> iniciador 3' saci <400> 7 gagctcacta gcgcgccggg cgcacgccac cga 33

<210> 8 <211> 36 <212> ADN <213> Sequência Artificial 213 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ <220> <223> iniciador 5' BstEII/ Del Notl <400> 8 tggtggtgac ccatccgggc agcggctgca agggcc 36

<210> 9 <211> 295 <212> PRT <213> Sphingobium herbicidovorans <400> 9

Met His Ala Ala Leu Ser Pro Leu 1 5 Vai Gin Pro Leu Thr Gly Vai Leu 20 Leu Arg Glu Pro Leu Asp Asp Ser 35 40 Phe His Thr Tyr Gin Vai Ile Tyr 50 55 Glu Gin His Ile Ala Phe Ser Arg 65 70 Pro Leu Leu Lys Ser Ile Glu Gly 85 Arg Glu Ala Asn Glu Ser Gly Arg 100 Asp Ser Thr Phe Leu Asp Ala Pro 115 120 Ile Asp Vai Pro Glu His Gly Gly 130 135 Thr Ala Trp Glu Thr Leu Ser Pro 145 150 Leu Asn Vai Vai His Ser Ala Thr

Ser Gin Arg Phe Glu Arg Ile Ala 10 15

Gly Ala Glu Ile Thr Gly Vai Aep 25 30

Thr Trp Asn Glu Ile Leu Asp Ala 45

Phe Pro Gly Gin Ala Ile Thr Asn 60

Arg Phe Gly Pro Vai Asp Pro Vai 75 80

Tyr Pro Glu Vai Gin Met Ile Arg 90 95

Vai Ile Gly Asp Asp Trp His Thr 105 110

Pro Ala Ala Vai Vai Met Arg Ala 125

Asp Thr Gly Phe Leu Ser Met Tyr 140

Thr Met Gin Ala Thr Ile Glu Gly 155 160

Arg Vai Phe Gly Ser Leu Tyr Gin 170 175 165 214 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

Ala Gin Asn Arg Arg phe Ser Asn Thr Ser Vai Lys Vai Met Asp Vai 130 185 190

Asp Ala Gly Asp Arg Glu Thr Vai His Pro Leu Vai Vai Thr His Pro 195 200 205

Gly Ser Gly Arg Lys Gly Leu Tyr Vai Asn Gin Vai Tyr Cys Gin Arg 210 215 220

Xle Glu Gly Met Thr Asp Ala Glu Ser Lys Pro Leu Leu Gin Phe Leu 225 230 235 240

Tyr Glu His Ala Thr Arg Phe Asp Phe Thr Cys Arg Vai Arg Trp Lys 245 250 255

Lys Asp' Gin Vai Leu Vai Trp Asp Asn Leu Cys Thr Met His Arg Ala 260 265 270

Vai Pro Asp Tyr Ala Gly Lys Phe Arg Tyr Leu Thr Arg Thr Thr Vai 275 280 285

Gly Gly Vai Arg Pro Ala Arg 290 295

<210> 10 <211> 295 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Tradução de AAD-1 v2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) .. (2) <223> Diferente de vl <220> <221> MISC_FEATURE <222> (212) .. (212) <223> Diferente de vl <400> 10

Met Ala Ala Ala Leu Ser Pro Leu Ser Gin Arg Phe Glu Arg Ile Ala 15 10 15

Vai Gin Pro Leu Thr Gly Vai Leu Gly Ala Glu Xle Thr Gly Vai Asp 20 25 30

Leu Arg Glu 35

Pro

Leu Asp Asp' Ser Thr Trp Asn Glu Ile 40 45

Leu Asp Ala 215 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

Phe His Thr Tyr Gin Vai Ile Tyr Phe Pro Gly Gin Ala Ile Thr Asn 50 55 60 Glu Gin His Ile Ala 65 Phe Ser Arg Arg Phe Gly Pro Vai Asp pro Vai 70 75 80

Pro Leu Leu Lys Ser Ile Glu Gly Tyr Pro Glu Vai Gin Met Ile· Arg 65 90 95

Arg Glu Ala Asn Glu Ser Gly Arg Vai Ile Gly Asp Asp Trp His Thr 100 105 lio

Asp Ser Thr Phe Leu Asp Ala Pro Pro Ala Ala Vai Vai Met Arg Ala 115 120 125

Ile Asp Vai Pro Glu His Gly Gly Asp Thr Gly Phe Leu Ser Met Tyr 130 135 140

Thr Ala Trp Glu Thr Leu Ser Pro Thr Met Gin Ala Thr Ile Glu Gly 145 150 155 160 Leu Asn Vai Vai His 165 Ser Ala Thr Arg Vai Phê Gly Ser Leu Tyr Gin 170 175 Ala Gin Asn Arg Arg 180 Phe Ser Asn Thr Ser Vai Lys Vai Met Asp Vai 185 190 Asp Ala Gly Asp Arg 195 Glu Thr Vai His Pro Leu Vai Vai Thr His Pro 200 205 Gly Ser Gly Cys Lys 210 Gly Leu Tyr Vai Asn Gin Vai Tyr Cys Gin Arg 215 220 Ile Glu Gly Met Thr 225 Asp Ala Glu Ser Lys Pro Leu Leu Gin Phe Leu 230 235 240 Tyr Glu His Ala Thr 245 Arg Phe Asp Phe Thr Cys Arg Vai Arg Trp Lys 250 255 Lys Asp Gin Vai Leu 260 Vai Trp Asp Asn Leu Cys Thr Met His Arg Ala 265 270 Vai Pro Asp Tyr Ala 275 Gly Lys Phe Arg Tyr Leu Thr Arg Thr Thr Vai 280 285

Gly Gly Vai Arg Pro Ala Arg 290 295 216 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

<210> 11 <211> 296 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Tradução de AAD-1 ν3 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) .. (3)

<223> Diferente de VI <400> 11

Met Ala His Ala Ala Leu Ser Pro Leu Ser Gin Arg Phe Glu Arg Ile 1 5 .10 15

Ala Vai Gin Pro Leu Thr Gly Vai Leu Gly Ala Glu Ile Thr Gly Vai 20 25 30

Asp Leu Arg Glu Pro Leu Asp Asp Ser Thr Trp Asn Glu Ile Leu Asp 35 40 45

Ala Phe His Thr Tyr Gin Vai Ile Tyr Phe Pro Gly Gin Ala Ile Thr 50 55 60

Asn Glu Gin His Ile Ala Phe Ser Arg Arg Phe Gly Pro Vai Asp Pro 65 70 75 80

Vai Pro Leu Leu Lys Ser Ile Glu Gly Tyr Pro Glu Vai Gin Met Ile 85 90 95

Arg Arg Glu Ala Asn Glu Ser Gly Arg Vai Ile Gly Asp Asp Trp His 100 105 110

Thr Asp Ser Thr Phe Leu Asp Ala Pro Pro Ala Ala Vai Vai Met Arg 115 120 125

Ala Ile Asp Vai Pro Glu His Gly Gly Asp Thr Gly Phe Leu Ser Met 130 135 140

Tyr Thr Ala Trp Glu.Thr Leu Ser Pro Thr Met Gin Ala Thr Ile Glu 145 150 155 160

Gly Leu Asn Vai Vai His Ser Ala Thr Arg Vai Phe Gly Ser Leu Tyr 165 170 175

Gin Ala Gin Asn Arg Arg Phe Ser Asn Thr Ser Vai Lys Vai Met Asp 180 185 190

Vai Thr His

Vai Asp Ala Gly Asp Arg Glu Thr Vai His Pro Leu Vai 195 200 205 217 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

Pro Gly 210 Ser Gly Arg Lys Gly Leu 215 Tyr Vai Asn Gin 220 Vai Tyr Cys Gin Arg 225 Ile Glu Gly Met Thr 230 Asp Ala Glu Ser Lys 235 Pro Leu Leu Gin Phe 240 Leu Tyr Glu His Ala 245 Thr Arg Phe Asp Phe 250 Thr Cys Arg Vai Arg 255 Trp Lys Lys- Asp Gin Vai 260 Leu Vai Trp Asp Asn 265 Leu Cys Thr Met 270 Hls Arg Ala Vai Pro 275 Asp Tyr Ala Gly Lys 280 Phe Arg Tyr Leu Thr Arg 285 Thr Thr Vai Gly 290 Gly Vai Arg Pro Ala Arg 295

<210 > 12 <211> 888 <212> ADN <213> Bradyrhizobium japonicum USDA 110 <4 0 0 > 12 atgacgatcg ccatccggca gcttcagacg cattttgtcg gccaggtttc cggcctcgat 60 ttgcgaaagc cgctoacgcc gggcgaggcc cgcgaggtcg agtccgccat ggacaaatac 120 gcggtgctcg ttttccacga ccàggacatc acegacgagc agcagatggc tttcgcgctg 180 aacttcggcc agcgcgagga cgcgcgcggc ggcacggtca ccaaggagaa ggactaccgg 240 ctgcaatccg gcctgaacga cgtctccaat ctcggcaagg acggcaagcc gctggocaag 300 gacagccgca cgcacctgtt caatctcggc aactgcctct ggcactccga cagctcgttc 360 cgtcccattc ccgcaaaatt ctcgctgctg tcggcgcgcg tggtgaaccc gacgggcggc 420 aacaccgaat tcgcggacat gcgogccgcc tatgacgcgc tcgacgacga gaccaaggcc 480 gaaatcgagg acctcgtotg cgagcactcg ctgatgtatt cgcgcggctc gctcggcttc 540 accgagtaca ccgacgaaga gaagcagatg ttcaagccgg tcctgcaacg cctcgtgcgc 600 acccatccgg tccaccgccg caagtcgctg tatctctcgt cgcatgccgg 1 caagatcgcc 660 agcatgagcg tgccggaggg gcggctgctg ttgcgcgatc tcaacgagca cgcgacgcag 720 ccggaattcg tctacgtcca caaatggaag ctgcatgacc tcgtgatgtg ggacaaccgc 780 cagaccatgc accgcgtccg ccgctacgac cagtcccagc cccgcgacat gcgccgcgcg 840 acggtggcgg ggacggagcc gacggtgcag cagcaggcgg cggagtag 888

<210> 13 <211> 289 <212> PRT <213> Bradyrhizobium japonicum USDA 110 218 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ <400> 13

Met Thr 1 Ile Ala Ile Arg Gin Leu Gin Thr Hie Phe Vai Gly Gin Vai 5 10 15 Ser Gly Leu Asp Leu Arg Lys Pro Leu Thr Pro Gly Glu Ala Arg Glu 20 25 30 Vai Glu Ser Ala Met Asp Lys Tyr Ala Vai Leu Vai Phe His Asp Gin 35 40 45 Asp Ile 50 Thr Asp Glu Gin Gin Met Ala Phe Ala Leu Asn Phe Gly Gin 55 60

Arg Glu Asp Ala Arg Gly Gly Thr Vai Thr Lys Glu Lys Asp Tyr Arg 65 70 75 80

Leu Gin Ser Gly Leu Asn Asp Vai Ser Asn Leu Gly Lys Asp Gly Lys 85 90 95

Pro Leu Ala Lys Asp Ser Arg Thr His Leu Phe Asn Leu Gly Asn Cys

Leu Trp 100 105 110 His Ser Asp Ser Ser Phe Arg Pro Ile Pro Ala Lys Phe Ser 115 120 125 Leu Leu 130 Ser Ala Arg Vai Vai Asn Pro Thr Gly. Gly Asn Thr Glu Phe 135 140 Ala Asp 145 Met Arg Ala Ala Tyr Asp Ala Leu Asp Asp Glu Thr Lys Ala 150 155 160 Glu Ile Glu Asp Leu Vai Cys Glu His Ser Leu Met Tyr Ser Arg Gly 165 170 175 Ser Leu Gly Phe Thr Glu Tyr Thr Asp Glu Glu Lys Gin Met Phe Lys 180 185 190 Pro Vai Leu Gin Arg Leu Vai Arg Thr His Pro Vai His Arg Arg Lys 195 200 205 Ser Leu 210 Tyr Leu Ser Ser His Ala Gly Lys Ile Ala Ser Met Ser Vai 215 220 Pro Glu 225 Gly Arg Leu Leu Leu Arg Asp Leu Asn Glu His Ala Thr Gin 230 235 240 219 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

Pro Glu Phe Vai Tyr Vai His Lys Trp Lys ' Leu His Asp Leu Vai Met 245 250 255

Trp Asp Asn Arg Gin Thr Met His Arg Vai Arg Arg Tyr Asp Gin Ser 260 265 · 270

Gin Pro Arg Asp Met Arg Arg Ala Thr Vai Ala Gly Thr Glu Pro Thr 275 280 285 Vai <210> <211> <212> <213> 14 34 ADN Sequência Artificial <220> <223> brjap 5' (spel) <400> 14 actagtaaca aagaaggaga tataccatga cgat 34 <210> <211> <212> <213> 15 33 ADN Sequência Artificial <220> <223> br jap 3' (xhol) <400> 15 ttctcgagct atcactccgc cgcctgctgc tgc 33 <210> <211> <212> <213> 16 17 ADN Sequência Artificial <220> <223> iniciador directo M13 <400> 16 gtaaaacgac ggccagt 17 <210 > <211 > <212> <213> 17 17 ADN Sequência Artificial <220> <223> iniciador inverso M13 <400> 17 caggaaacag ctatgac 17 220 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

<210 > 18 <211> 32 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Ncol de Brady <400> 18 tataccacat gtcgatcgcc atccggcagc tt 32

<210 > 19 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Saci de Brady <400> 19 gagctcctat cactccgccg cctgctgctg cac 33 <210> 20 <211> 525

<212> PRT <213> Glycine max <400> 20

Met Ala Gin Vai Ser Arg Vai His Asn Leu Ala Gin Ser Thr Gin Ile 1 5 10 15

Phe Gly His Ser Ser Asn Ser Asn Lys Leu Lys Ser Vai Asn Ser Vai 20 25 30

Ser Leu Arg Pro Arg Leu Trp Gly Ala Ser Lys Ser Arg Ile Pro Met 35 40 45

His Lys Asn Gly Ser Phe Met Gly Asn Phe Asn Vai Gly Lys Gly Asn 50 55 60

Ser Gly Vai Phe Lys Vai Ser Ala Ser Vai Ala Ala Ala Glu Lys Pro 65 70 75 80

Ser Thr' Ser Pro Glu Ile Vai Leu Glu Pro Ile Lys Asp Phe Ser Gly 85 90 95

Thr ile Thr Leu Pro Gly Ser Lys Ser Leu Ser Asn Arg Ile Leu Leu 100 105 110 221 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

Leu Ala Ala Leu Ser Glu Gly Thr 115 120.

Thr Vai Vai Asp Asn Leu Leu Tyr 125

Ser Glu Asp Ile His Tyr Mét Leu 130 135

Gly Ala Leu Arg Thr Leu Gly Leu 140

Arg Vai Glu Asp Asp Lys Thr Thr 145 150

Lys Gin Ala Ile Vai Glu Gly Cys 155 160

Gly Gly Leu Phe Pro Thr Ser Lys 165

Glu Ser Lys Asp Glu Ile Asn Leu 170 175

Phe Leu Gly Asn Ala Gly Thr Ala 180

Met Arg Pro Leu Thr Ala Ala Vai 185 190

Vai Ala Ala Gly Gly Asn Ala Ser Tyr Vai Leu Asp Gly Vai Pro Arg 195 200 205

Met Arg Glu Arg Pro Ile Gly Asp Leu Vai Ala Gly Leu Lys Gin Leu 210 215 220

Gly Ala Asp Vai Asp Cys Phe Leu Gly Thr Asn Cys Pro Pro Vai Arg 225 230 235 240

Vai Asn Gly Lys Gly Gly Leu Pro Gly Gly Lys Vai Lys Leu Ser Gly 245 250 255

Ser Vai Ser Ser Gin Tyr Leu Thr Ala Leu Leu Met Ala Ala Pro Leu 260 265 270

Ala Leu Gly Asp Vai Glu Ile Glu lie Vai Asp Lys Leu Ile Ser Vai 275 280 285

Pro Tyr Vai Glu Met Thr Leu Lys Leu Met Glu Arg Phe Gly Vai Ser 290 295 300

Vai Glu His Ser Gly Asn Trp Asp Arg Phe Leu Vai His Gly Gly Gin 305 310 315 320

Lys Tyr Lys Ser Pro Gly Asn Ala Phe Vai Glu Gly Asp Ala Ser Ser 325 330 335

Ala Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Ala Ala Ile Thr Gly Gly Thr Ile Thr 340 345 350 222 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

Vai Asn Gly Cys Gly Thr Ser Ser Leu Gin Gly Asp Vai Lys Phe Ala 355 360 365

Glu Vai Leu Glu Lys Met Gly Ala Lys Vai Thr Trp Ser Glu Asn Ser 370 375 380

Vai Thr Vai Ser Gly Pro Pro Arg Asp Phe Ser Gly Arg Lys Vai Leu 385 390 395 400

Arg Gly Ile Asp Vai Asn Met Asn Lys Met Pro Asp Vai Ala Met Thr 405 410 415

Leu Ala Vai Vai Ala Leu Phe Ala Asn Gly Pro Thr Ala Ile Arg Asp 420 425 430

Vai Ala Ser Trp Arg Vai Lys Glu Thr Glu Arg Met Ile Ala Ile Cys 435 440 445

Thr Glu Leu Arg Lys Leu Gly Ala Thr Vai Glu Glu Gly Pro Asp Tyr 450 ' 455 460

Cys Vai Ile Thr Pro Pro Glu Lys Leu Asn Vai Thr Ala Ile Asp Thr 465 470 475 480

Tyr Asp Asp His Arg Met Ala Met Ala Phe Ser Leu Ala Ala Cys Gly 485 490 495

Asp Vai Pro Vai Thr Ile Lys Asp Pro Gly Cys Thr Arg Lys Thr Phe 500 505 510

Pro Asp Tyr Phe Glu Vai Leu Glu Arg Leu Thr Lys His 515 520 525

<210> 21 <211> 525 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Proteína EPSPS de soja com mutação dupla: treonina convertida para isoleucina; prolina 187 convertida para serina <400> 21

Met Ala Gin Vai Ser Arg Vai His Asn Leu Ala Gin Ser Thr Gin Ile 15 10 15

Phe Gly His Ser 20

Ser Asn Ser Asn Lys 25

Leu Lys Ser Vai Asn 30

Ser Vai 183 223 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

Ser Leu Arg Pro Arg Leu Trp Gly Ala Ser Lys Ser Arg Ile Pro Met 35 40 45 His Lys Asn Gly Ser Phe Met Gly Asn Phe Asn Vai 50 55 60 Gly Lys Gly Asn Ser Gly Vai Phe Lys Vai Ser Ala Ser Vai Ala Ala 65 70 75 Ala Glu Lys Pro 80 Ser Thr Ser Pro Glu Ile Vai Leu Glu Pro Ile Lys 85 90 Asp Phe Ser Gly 95

Thr Ile Thr Leu Pro Gly Ser Lys Ser Leu Ser Asn Arg Ile Leu Leu 100 105 110

Leu Ala Ala Leu Ser Glu Gly Thr Thr Vai Vai Asp 115 120 Asn Leu Leu Tyr 125 Ser Glu Asp Ile His Tyr Met Leu Gly Ala Leu Arg 130 135 140 Thr Leu Gly Leu Arg Vai Glu Asp. Asp Lys Thr Thr Lys Gin Ala Ile 145 150 155 Vai Glu Gly Cys 160 Gly Gly Leu Phe Pro Thr Ser Lys Glu Ser Lys Asp 165 170 Glu Ile Asn Leu 175 Phe Leu Gly Asn Ala Gly Ile Ala Met Arg Ser. Leu 180 185 Thr Ala Ala Vai 190 Vai Ala Ala Gly Gly Asn Ala Ser Tyr Vai Leu Asp 195 ‘ 200 Gly Vai Pro Arg 205

Met Arg Glu Arg Pro Ile Gly Asp Leu Vai Ala Gly Leu Lys Gin Leu 210 215 220 Gly Ala Asp Vai Asp Cys Phe Leu Gly Thr Asn Cys 225 230 235 Pro Pro Vai Arg 240 Vai Asn Gly Lys Gly Gly Leu Pro Gly Gly Lys Vai 245 250 Lys Leu Ser Gly 255 Ser Vai Ser Ser Gin Tyr Leu Thr Ala Leu Leu Met 260 265 Ala Ala Pro Leu 270 224 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

Ala Leu Gly Asp Vai Glu Ile Glu Ile Vai Asp Lys Leu Ile Ser Vai 275 280 285

Pro Tyr Vai Glu Met Thr Leu Lys Leu Met Glu Arg Phe Gly Vai Ser 290 295 300

Vai Glu His Ser Gly Asn Trp Asp Arg Phe Leu Vai His Gly Gly Gin 305 310 315 320

Lys Tyr Lys Ser Pro Gly Asn Ala Phe Vai Glu Gly Asp Ala Ser Ser 325 330 335

Ala Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Ala Ala Ile Thr Gly Gly Thr Ile Thr 340 345 350

Vai Asn Gly Cys Gly Thr Ser Ser Leu Gin Gly Asp Vai Lys Phe Ala 355 360 365

Glu Vai Leu Glu Lys Met Gly Ala Lys Vai Thr Trp Ser Glu Asn Ser 370 375 380

Vai Thr Vai Ser Gly Pro Pro Arg 385 390

Asp Phe Ser Gly Arg Lys Vai Leu 395 400

Arg Gly Ile Asp Vai Asn Met Asn 405

Lys Met Pro Asp Vai Ala Met Thr 410 415

Leu Ala Vai Vai Ala Leu Phe Ala 420

Asn Gly Pro Thr Ala Ile Arg Asp 425 430

Vai Ala Ser Trp Arg Vai Lys Glu 435 440

Thr Glu Arg Met Ile Ala Ile Cys 445

Thr Glu Leu Arg Lys Leu Gly Ala 450 455

Thr Vai Glu Glu Gly Pro Asp Tyr 460

Cys Vai Ile Thr Pro Pro Glu Lys Leu Asn Vai Thr Ala Ile Asp Thr 465 470 475 480

Tyr Asp Asp His Arg Met Ala Met Ala Phe Ser Leu Ala Ala Cys Gly 485 490 495

Asp Vai Pro Vai Thr Ile Lys Asp Pro Gly Cys Thr Arg Lys Thr Phe 500 505 510

Pro Asp Tyr Phe Glu Vai Leu Glu Arg Leu Thr Lys His 515 520 525

<210> 22 <211> 1604 <212> ADN <213> Sequência artificial 225 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ <220> <223> Sequência de ADN desviada para soja que codifica para EPSPS com mutação dupla divulgada em SEQ ID NO:21, com sequência adicionada <220> <221> misc_feature <222> (1) .. (1575) <223> Sequência de codificação da sequência de ADN desviada para soja que codifica para a proteína EPSPS de SEQ ID N0:21 <220> <221> misc_feature <222> (1576)..(1578) <223> Terminador de tradução tga <220> <221> misc_feature <222> (1579)..(1604) <223> Sequência incluída para introduzir codões de paragem de tradução em todos os seis quadros de leitura abertos e para introduzir um local de reconhecimento de enzima de restrição Saci com objectivos de clonagem <400> 22 atggctcaag tctcccgtgt tcacaatctt gctcagtcaa cccaaatctt tggacattca 60 agcaactcaa acaaactgaa gtctgtgaat tctgtctcac ttcgcccacg cctttgggga 120 gcatccaaga gtcgcatacc aatgcacaag aatgggagtt tcatgggcaa cttcaatgtt 180 gggaaaggca attctggtgt cttcaaagtt tcagcttctg ttgcagccgc agagaaaccc 240 agcacttccc ctgagattgt tcttgaaccc attaaggact tcagtggaac aatcactctg 300 cctggatcaa agagtctttc aaacagaata cttctcttgg cagctctgag tgaaggaacc 360 actgtagttg acaacctttt gtactctgaa gatattcatt acatgttggg tgctctcaga 420 actcttgggt tgagagttga agatgacaag accacaaaac aagccatagt tgaaggatgt 480 ggtgggttgt ttccaacaag caaagaatcc aaagatgaga tcaacttgtt tcttggcaat 540 gctggaattg caatgagaag cctcactgct gcagtagttg cagctggtgg gaatgcaagt 600 tatgtccttg atggtgtccc cagaatgagg gaaaggccca tcggtgacct tgtggctggc 660 ctgaaacagc ttggagcaga tgttgattgc ttcttgggca caaactgccc tccagtgaga 72 0 gtgaatggga agggaggttt gcctggtgga aaggtcaaac tgagtggatc agtctcttcc 780 cagtatctga ctgccttgct çatggctgcc cctctggctt tgggtgatgt ggagattgaa 840 900 226 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1604 atagtggaca agttgatttc tgttccatat gtggaaatga ccctcaaact catggagagg tttggagttt ctgttgaaca ttctggcaac tgggatcgtt tccttgtaca tggaggtcag aagtacaaaa gccctggcaa tgcctttgtt gaaggggatg caagctctgc ttcctatctc ttggctgggg ctgccatcac tggtgggacc atcactgtga atggctgtgg cacctcatcc cttcaaggtg atgtaaagtt tgcagaggtc ttggagaaaa tgggtgccaa ggtcacctgg tctgagaaca gtgtaactgt gtctggacct cccagagact tcagtggcag aaaggttctc cgtggaattg atgtgaacat gaacaagatg ccagatgtgg ccatgaccct cgctgttgta gccctgtttg caaatggacc aactgcaatc cgtgatgttg cttcatggag ggtgaaggag acagagagga tgattgccat ttgcacagaa ctccgcaaac ttggtgcaac agttgaagag ggaccagatt actgtgtgat aaccccacct gágaagctca atgtgacagc cattgacacc tatgatgacc acagaatggc aatggctttc tcccttgctg cctgtggtga tgtgcctgtg actatcaaag accctgggtg cacaaggaag acatttccag actactttga agttttggag aggttgacaa agcactgagt agttagctta atcacctaga gctc

<210> 23 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador Pat 5-3 <400> 23 agataccctt ggttggttgc 20

<210> 24 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador Pat 3-3 <400> 24 cagatggatc gtttggaagg 20

<210> 25 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador directo AAD-1 PTU <400> 25 ataatgccag cctgttaaac gcc 23 227 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

<210> 26 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador inverso AAD-1 PTU <400> 26 ctcaagcata tgaatgacct cga 23

<210> 27 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador directo para PCR de região de codificação de AAD-1 (RdpAcodF) <400> 27 atggctcatg ctgccctcag cc 22

<210> 28 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador inverso para PCR de região de codificação de AAD-1 (RdpAcodR) <400> 28 cgggcaggcc taactccacc aa 22

<210> 29 <211> 932 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Nucleótidos optimizados para planta de AAD-2 v2 <400> 29 ccatggctac catagcaatc agacagctcc agacccactt tgtgggtcaa gtttctggat 60 tggacctcag aaagccactc actcctggag aagccagaga agttgaatca gctatggaca 120 agtacgcagt tcttgtcttc catgaccaag acatcacaga tgagcaacag atggcctttg 180 ccctcaactt tggtcagagg gaggatgcac gtggtggcac tgtcaccaaa gagaaggatt 240 accgtcttca gtctggcctc aatgatgttt ccaacttggg caaagatgga aagccacttg 300 ccaaggacag ccgcacccat ttgttcaacc ttggaaactg cttgtggcat tctgactcca 360 gcttcagacc aatcccagcc aagttcagcc tcctttctgc tcgtgttgtg aacccaactg 420 228 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ gtgggaacac tgagtttgct gacatgagag ctgcctatga tgctcttgac gatgaaacca 480 aagctgagat tgaggacctt gtgtgtgagc actctctcat gtactcaagg ggctcacttg 540 gcttcactga gtacacagat gaagagaagc aaatgttcaa gcccgtcttg cagcgcttgg 600 tccgcacaca ccctgtgcac cgtcgcaaat cactctacct ctccagccat gccggaaaga 660 ttgccagcat gtccgtccct gaagggaggc tccttttgag ggatttgaat gaacatgcta 720 ctcagcctga gttcgtctat gttcacaaat ggaagttgca tgatcttgtg atgtgggaca 780 ataggcaaac catgcacaga gtgaggagat atgaccagtc ccaacccaga gacatgcgcc 840 gtgcaacagt tgctgggacc gagcccacag tgcaacagca agcagcagag tgagtagtta 900 gcttaatcac ctagagctcg gtcaccagat ct 932

<210> 30 <211> 296 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Proteína AAD-2 ν2 traduzida <400> 30

Met Ala Thr Ile Ala Ile Arg Gin Leu Gin Thr His Phe Vai Gly Gin 1 5 10 15 Vai Ser Gly Leu Asp Leu Arg Lys Pro Leu Thr Pro Gly Glu Ala Arg 2 0 25 30 Glu Vai Glu Ser Alá Met Asp Lys Tyr Ala Vai Leu Vai Phe His Asp 35 40 45 Gin Asp Ile Thr Asp Glu Gin Gin Met Ala Phe Ala Leu Asn Phe Gly 50 55 60 Gin Arg Glu Asp Ala Arg Gly Gly Thr Vai Thr Lys Glu Lys Asp Tyr 65 70 75 80 Arg Leu Gin Ser Gly Leu Asn Asp Vai Ser Asn Leu Gly Lys Asp Gly 85 90 95 Lys Pro Leu Ala Lys Asp Ser Arg Thr His Leu Phe Asn Leu Gly Asn 100 105 110 Cys Leu Trp His Ser Asp Ser Ser Phe Arg Pro Ile Pro Ala Lys Phe 115 120 125 229 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ

Ser Leu Leu Ser Ala Arg Vai Vai Asn Pro Thr Gly Gly Asn Thr Glu 130 135 140

Phe Ala Asp Met Arg Ala Ala Tyr Asp Ala Leu Asp Asp Glu Thr Lys 145 150 155 160

Ala Glu Ile Glu Asp Leu Vai Cys Glu His Ser Leu Met Tyr Ser Arg 165 170 175

Gly Ser Leu Gly Phe Thr Glu Tyr Thr Asp Glu Glu Lys Gin Met Phe 180 185 190

Lys Pro Vai Leu Gin Arg Leu Vai Arg Thr His Pro Vai His Arg Arg 195 200 205

Lys Ser Leu Tyr Leu Ser Ser His Ala Gly Lys Ile Ala Ser Met Ser 210 215 220

Vai Pro Glu Gly Arg Leu Leu Leu Arg Asp Leu Asn Glu His Ala Thr 225 230 235 240

Gin Pro Glu Phe Vai Tyr Vai His Lys Trp Lys Leu His Asp Leu Vai 245 250 255

Met Trp Asp Asn Arg Gin Thr Met His Arg Vai Arg Arg Tyr Asp Gin 260 265 270

Ser Gin Pro Arg Asp Met Arg Arg Ala Thr Vai Ala Gly Thr Glu Pro 275 280 285

Thr Vai Gin Gin Gin Ala Ala Glu 290 295

<210> 31 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador directo de PCR de fragmento de "Southern" AAD-1 <400> 31 atggctcatg ctgccctcag cc 22

<210> 32 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador inverso de PCR de fragmento de "Southern" AAD-1 230 ΕΡ 2 308 977/ΡΤ <400> 32 gggcaggcct aactccacca a 21

Lisboa, 2013-05-06

Claims

ΕΡ 2 308 977/ΡΤ 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Método de controlo de pelo menos uma erva daninha numa área, em que a referida área compreende pelo menos uma planta transgénica, a referida planta transgénica compreendendo um polinucleótido isolado que codifica uma proteína que degrada enzimaticamente um herbicida seleccionado do grupo que consiste em um herbicida fenoxiauxínico e um herbicida ariloxifenoxipropionato, em que o referido polinucleótido híbrida sob condições rigorosas com a complementar completa de uma molécula de ácido nucleico que codifica SEQ ID NO:9, em que a referida planta expressa o referido polinucleótido e produz a referida proteína, em que o referido método compreende a aplicação do referido herbicida na referida área.
2. Método da reivindicação 1 em que o referido método inclui a aplicação do referido herbicida na referida planta.
3. Método da reivindicação 1 em que o referido herbicida é um herbicida fenoxiauxínico, preferivelmente um herbicida 2,4-D.
4. Método da reivindicação 1 em que o referido herbicida compreende a seguinte estrutura química o

ou um seu sal.
5. Método da reivindicação 1, em que a referida planta compreendendo ainda um ou mais outros genes de resistência a herbicidas.
6. Método da reivindicação 1, em que a referida planta compreende ainda uma característica de tolerância a glifosato e uma característica de tolerância a glufosinato, e em que o referido método compreende a aplicação de 2,4-D, glifosato, e glufosinato na referida área.
7. Método da reivindicação 1, em que a referida planta compreende ainda um gene para tolerância a dicamba, e em que o ΕΡ 2 308 977/ΡΤ 2/3 referido método compreende a aplicaçao de dicamba na referida área.
8. Método da reivindicação 1, em que a referida planta compreende ainda um gene para tolerância a um herbicida que é um inibidor de acetolactato-sintase.
9. Método da reivindicação 1, em que a referida planta compreende ainda um gene para tolerância a glufosinato.
10. Método da reivindicação 1, em que a referida planta é uma planta de milho.
11. Método da reivindicação 1, em que o referido herbicida é aplicado num estado pré-plantio, pré-emergência, e/ou pós-emergência da referida planta.
12. Método da reivindicação 1, em que o referido método compreende plantar uma semente na referida área, e permitir que a referida semente cresça transformando-se na referida planta.
13. Método da reivindicação 12, em que a referida aplicação é conduzida pré-emergência da referida planta.
14. Método da reivindicação 1, em que a referida proteína compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:9 ou uma variante, em que a referida variante possui actividade de dioxigenase dependente de alfa-cetoglutarato, pelo menos uma deleção ou substituição conservativa de aminoácidos, e pelo menos 95% de identidade de sequência com SEQ ID NO:9.
15. Método da reivindicação 1 em que ervas daninhas resistentes a glifosfato são controladas num campo de plantas de cultura tolerantes a glifosfato.
16. Método da reivindicação 1, em que a referida área é um campo e o referido método compreende aplicar o referido herbicida no referido campo e plantar uma semente no referido campo nos 14 dias seguintes à aplicação do referido herbicida, e permitir que a referida semente cresça transformando-se na referida planta transgénica. ΕΡ 2 308 977/ΡΤ 3/3
17. Método da reivindicação 1, em que o referido método compreende a aplicação de um herbicida parental na referida área.
18. Método da reivindicação 1, em que o referido método compreende a aplicação de um ou mais herbicidas na referida área, preferivelmente de maneira sequencial e/ou a partir de uma mistura em tanque ou simultaneamente.
19. Método de controlo de pelo menos uma erva daninha num campo, em que o referido campo contém pelo menos uma planta que compreende um polinucleótido isolado que codifica uma proteina que degrada enzimaticamente um herbicida seleccionado do grupo que consiste em uma fenoxiauxina e um ariloxifenoxipropionato, em que a referida molécula de ácido nucleico que codifica a referida proteina híbrida sob condições rigorosas com a complementar completa de uma sequência especificada por SEQ ID NO: 5 e em que o referido polinucleótido está operativamente ligado a um promotor que é funcional numa célula vegetal, em que o método compreende a aplicação de uma combinação de herbicidas nos referidos campos.
20. Método da reivindicação 19, em que a referida combinação de herbicidas compreende 2,4-D. Lisboa, 2013-05-06