CN103183730B - 一种与耐草甘膦相关蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与耐草甘膦相关蛋白及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与耐草甘膦相关的由序列2衍生的蛋白质。本发明的实验证明，本发明发现了一个新的蛋白，将其编码基因转入大肠杆菌中表达，可提高转基因菌株的耐草甘膦能力，得到耐草甘膦产品。因此，本发明的基因可用于培育高耐草甘膦转基因作物品种，具有很高的应用价值。

Description

一种与耐草甘膦相关蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种与耐草甘膦相关蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

杂草的存在给农业生产和粮食产量带来损失，除草剂的开发与应用给人类带来了福音。草甘膦是目前全球应用最为广泛的除草剂之一，其主要作用机理是竞争性抑制真菌、细菌、藻类、高等植物、顶复门寄生虫体内莽草酸合成途径中的芳香族氨基酸(包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)生物合成过程中的关键酶5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，EPSPS，EC 2.5.1.19)的活性，扰乱莽草酸合成途径，干扰蛋白质合成，阻止次生产物的形成，最终使植株死亡。

草甘膦的唯一靶标酶为EPSP合成酶。自1969年Ahmed等在真菌体中芳香族氨基酸的生物合成过程中首次发现EPSP合成酶之后，研究人员对EPSP合成酶的研究范围逐渐扩大，不仅集中在对其酶活性及动力学方面的研究，对EPSP合成酶相对应的EPSPS基因的研究也逐渐深入。大量研究表明，作物和杂草对草甘膦的抗性多由EPSPS基因及其突变引起，因此各国科学家投入了大量精力研究各物种中的EPSPS基因。

不同作物品种或同种作物不同品系之间对除草剂的抗性水平存在较大差异，利用除草剂抗性表型鉴定，筛选出天然抗性的品种，对其除草剂靶标酶基因进行克隆和功能检测，进而获得抗除草剂候选基因，是近年来抗除草剂候选基因及其应用的主要手段之一。随着抗草甘膦候选基因EPSPS的不断发现和分离，通过转化抗性候选基因培育抗草甘膦作物的发展突飞猛进。至今，通过转化EPSPS基因，创制出了抗草甘膦的大豆、玉米、油菜、甜菜、苜蓿、棉花等多种作物的抗性品系。

发明内容

本发明的目的是提供一种与耐草甘膦相关蛋白及其编码基因与应用。

本发明提供的蛋白，命名为PVEPSPS，是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与耐草甘膦相关的由序列2衍生的蛋白质。

上述蛋白中，一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述的序列2由525个氨基酸组成。

编码上述蛋白的基因也是本发明保护的范围。

上述编码基因如下(1)-(4)中任意一种的DNA分子：

(1)序列表中序列1所示的DNA分子；

(2)序列表中序列1的自5’末端的第207至1784位的核苷酸所示的DNA分子；

(3)在严格条件下与(1)或(2)限定的DNA序列杂交且编码与耐草甘膦相关蛋白的DNA分子；

(4)与(1)或(2)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码与耐草甘膦相关蛋白的DNA分子。

上述编码基因中，所述严格条件可为如下：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

上述的序列1由2028个脱氧核苷酸组成，自5’端的第207至1784位核苷酸为PVEPSPS的开放阅读框(Open Reading Frame，0RF)，组成。

含有所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围。

上述重组载体具体为将所述蛋白的编码基因插入pGEX4T-1载体的Sma I和Not I酶切位点间，得到表达上述蛋白的重组载体。

上述重组菌为将上述的重组载体转入宿主菌中得到的重组菌，在本发明的实施例中，上述宿主菌具体为BL21(DE3)。

扩增上述基因全长或其任意片段的引物对也是本发明保护的范围；

在本发明的实施例中，上述引物对的一条引物的核苷酸序列具体为序列表中的序列3，上述引物对中的另一条引物的核苷酸序列具体为序列表中的序列4。

本发明的另一个目的是提供一种耐草甘膦产品。

本发明提供的产品，其活性成分为上述蛋白、上述的编码基因、上述的重组载体、上述的表达盒、上述的转基因细胞系或上述的重组菌。

上述蛋白、上述的编码基因、上述的重组载体、上述的表达盒、上述的转基因细胞系或上述的重组菌在制备耐草甘膦产品中的应用也是本发明保护的范围；

或上述蛋白、上述的编码基因、上述的重组载体、上述的表达盒、上述的转基因细胞系或上述的重组菌在耐草甘膦中的应用也是本发明保护的范围；

或上述蛋白、上述的编码基因、上述的重组载体、上述的表达盒、上述的转基因细胞系或上述的重组菌在培育耐草甘膦植物中的应用也是本发明保护的范围。

本发明的第三个目的是提供一种培育耐草甘膦重组菌的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：将上述的重组载体转入宿主菌中得到的重组菌，所述重组菌的耐草甘膦性高于所述宿主菌，所述宿主菌具体为BL21(DE3)。

本发明的实验证明，本发明发现了一个新的蛋白，将其编码基因转入大肠杆菌中表达，可提高转基因菌株的耐草甘膦能力，得到耐草甘膦产品。因此，本发明的基因可用于培育高耐草甘膦转基因作物品种，具有很高的应用价值。

附图说明

图1为敏感和抗性菜豆莽草酸含量比较。

图2为IPTG诱导表达产物SDS-PAGE图谱。

图3为表达PVEPSPS基因的大肠杆菌转基因菌株(转pGEX4T-PVEPSPS大肠杆菌)的草甘膦抗性鉴定。

图4为大肠杆菌pGEX4T-PVEPSPS在不同浓度草甘膦处理下生长曲线。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1、耐草甘膦蛋白及其编码基因的发现

1、耐草甘膦材料莽草酸含量测定

草甘膦作用于植物时，植物体内的EPSP合成酶受抑制，作为EPSP合成酶代谢上游的莽草酸不能转换成EPSP。莽草酸途径的堵塞导致了高量的莽草酸积累。由于莽草酸积累是EPSP合成酶抑制的直接结果，因此莽草酸积累可作为揭示草甘膦作用的生物指标。通过植物体内莽草酸积累量的多少可以初步判断出植物对草甘膦的耐性程度。

将不同品种菜豆材料播种，在菜豆长至第二复叶期时用喷雾器以2.096a.i.kg·ha^-1草甘膦喷洒处理，以筛选到具有天然抗性的菜豆(Phaseolus vulgaris)为抗性材料，以其他经草甘膦处理后死亡的菜豆为敏感材料。

草甘膦处理后1d、3d、5d、7d、10d、14d取样一次，剪取菜豆叶片洗净晾干，-80℃保存。待菜豆材料表型鉴定后将抗性单株(命名为89-09)和敏感单株，各取样品0.5g，剪碎于研钵中液氮研磨，加入1.0mL 0.25mol/L HCl，转移至离心管中，4℃，12000rpm离心15min，收集上清液，4℃保存待测。

(1)莽草酸标准曲线制作

将莽草酸标准样品10mg溶于0.25mol/L HCl 1.0mL中，分别取0、1、5、10、50、100μL上述样品已0.25mol/L HCl定容至1.0mL。取200μL上清液，加入2.0mL1.0％的过碘酸溶液，3h后加入2.0mL 1.0mol/L的NaOH并混匀，然后加入1.2mL的0.1mol/L甘氨酸混匀，静置5min，于380nm比色，记录OD值。

(2)菜豆莽草酸含量测定

采取与莽草酸标准曲线制作的相同步骤测定吸光度OD值。根据莽草酸标准曲线计算出莽草酸含量。

莽草酸积累量的测定可以初步判断材料对草甘膦的敏感性。2.096a.i.kg·ha^-1草甘膦处理后抗性(89-09)与敏感菜豆叶片中莽草酸含量的测定，表明在草甘膦作用下抗性与敏感菜豆莽草酸含量呈现先升高后降低的趋势，在2.096a.i.kg·ha^-1草甘膦处理后9d时抗性与敏感菜豆莽草酸含量达到最大值(图1)，抗性材料莽草酸含量为敏感材料的50％，说明莽草酸在敏感材料中累积量高于抗性材料。2.096a.i.kg·ha^-1草甘膦处理9d后敏感品种莽草酸一直持续较高的累积量，在调查的时间范围(14d)内敏感菜豆莽草酸累积量高于抗性品种。由此推断由于莽草酸途径中EPSP合酶的作用引起菜豆材料对草甘膦抗性。

2、耐草甘膦蛋白的发现

以抗性菜豆单株89-09叶片为材料，提取RNA。

(1)3’RACE

采用TaKaRa公司3’-Full RACE Core Set Ver.2.0试剂盒中自带的反转录体系。将菜豆RNA 1μg和3’RACEAdaptor(5μM)1.0μL的混合物70℃变性10min，冰上2min，然后再加入5×M-MLV Buffer 2.0μL，dNTPs(10mM)1.0μL，RNase Inhibitor10U，Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)50U，加入Nuclease-Free Water到终体系10μL。42℃60min，72℃15min。产物用于后续试验。

3’RACE所用引物：

3’RACE Adaptor：含有由TaKaRa独特设计的dT区域及Adaptor Primer部分

3’RACE Outer Primer：5’-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3’

PV-3’gspoutF：5’-ATGCCTGATGTAGCCATGACC-3’

PCR反应体系为：反转录cDNA反应液，2.0μL；1×cDNA Dilution Buffer II，8.0μL；PV-3’gspoutF(10μM)，2.0μL；3’RACE Outer Primer(10μM)，2.0μL；10×ExTaqPCR buffer(含25μmol/mLMg²⁺)，5.0μL；ExTaq DNA酶，2.5U；加入ddH₂O到终体系50μL。

PCR反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。PCR扩增产物用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测。用GelDoc凝胶成像系统仪在紫外灯下观察并照相。

目的片段的回收：具体操作步骤采用Axygen公司凝胶回收试剂盒提供的方法。在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽表面液体。计算凝胶重量，该重量作为一个凝胶体积(如100mg＝100μL体积)。加入3个凝胶体积的BufferDE-A，混合均匀后于75℃加热，间断混合(每2～3min)，直至凝胶块完全熔化(约6～8min)。加入0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混合均匀。吸取上一步中的混合液，转移到DNA制备管中(置于2mL离心管)，12000rpm离心1min，弃滤液。将制备管置回2mL离心管，加500μL Buffer W1，12000rpm离心30s，弃滤液。将制备管置回2mL离心管，加700μL Buffer W2，12000rpm离心30s，弃滤液。用同样的方法再用700μL Buffer W2洗涤一次，12000rpm离心1min。将制备管置回离心管中，12000rpm离心1min。将制备管置于洁净的1.5mL离心管中，在制备膜中央加25～30μL Eluent或去离子水，室温静止1min，12000rpm离心1min洗脱DNA。

目的片段与载体连接：纯化PCR产物与pMD18-T载体连接，连接体系为：pMD18-TVector，1.0μL；PCR Product，2.0μL(约40ng)；Solution I，5.0μL；加入ddH₂O到终体系10μL。混合均匀，16℃反应过夜。

目的片段的转化及克隆鉴定：克隆载体pMD18-T质粒转化大肠杆菌，具体操作步骤按照天根生化科技有限公司提供的方法进行。准备LB/Amp(50μg/mL)，IPTG，X-gal固体平板，每板涂IPTG 40μL、X-gal 16μL，室温放置1～2h。取出大肠杆菌TOP10感受态细胞放置于冰上。短暂离心连接管，加入10μL连接液于100μL的感受态细胞中，轻弹管底，缓慢单向混匀，于冰上放置30min。42℃热击90s，然后立即冰浴2～3min。加入900μL LB液体培养基(不含抗生素)，37℃200rpm振荡培养1h。4000rpm离心4min，弃掉部分离心液后沉淀回溶。取适量涂于平板上，37℃倒置培养12～16h。挑取白色克隆于1.0mL LB/Amp的液体培养基中于37℃，200rpm，培养6～10h。

以培养过夜的阳性克隆子菌液为模板，用M13引物进行PCR扩增以鉴定插入片段。

M13F：5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’

M13R：5’-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’

反应体系为：菌液，1.0μL；10×PCR Buffer(含25μmol/mL Mg²⁺)，2.0μL；2mmol/LdNTPs，2.0μL；M13F(2μmol/L)，1.5μL；M13R(2μmol/L)，1.5μL；Taq DNA酶2U；加入ddH₂O到终体系20μL。

PCR反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸8min。PCR扩增产物用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测。

选取PCR检测为阳性的菌液样品，委托上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

(2)5’RACE

取10μg抗性菜豆总RNA，10×CIP Buffer 2.0μL，Calf Intestine Alkaline Phosphatase(CIP)2.0μL，加入Nuclease-free Water到终体系20μL。混合均匀，37℃1h。加入Ammonium Acetate Solution 15μL，Nuclease-free Water 115μL、acidphenol∶chloroform＝1∶1 150μL，彻底涡旋混匀，室温13400rpm离心5min，吸取上清至一新离心管中。加入氯仿150μL，涡旋，室温13400rpm离心5min，吸取上清至一新离心管中。加入150μL异丙醇，涡旋，冰上放置10min。13400rpm离心20min，用500μL70％乙醇洗涤沉淀，13400rpm离心5min，弃去乙醇，干燥沉淀。用11μLNuclease-free Water溶解沉淀，命名为CIP’d RNA，置于冰上。取5μL CIP’d RNA，加入10×TAP Buffer 1.0μL，Tobacco Acid Pyrophosphatase 2.0μL，Nuclease-free Water 2.0μL，混匀，37℃1h，处理后的RNA命名为CIP/TAP-treated RNA。取2.0μLCIP/TAP-treated RNA，加入5’RACE Adapter 1.0μL，10×RNA Ligase Buffer 1.0μL(用手快速温热溶解)、T4RNA Ligase 5U、Nuclease-free Water 4.0μL，混匀，37℃1h，处理后的RNA命名为Ligated RNA。

RT-PCR：Ligated RNA，2.0μL；dNTPs(2.5mM)，4.0μL；Random Decamers，2.0μL；10×RT Buffer，2.0μL；RNase Inhibitor，1.0μL；M-MLV Reverse Transcriptase，1.0μL；加入Nuclease-free Water到终体积20μL。混匀，42℃温育1h，-20℃保存或进行PCR。

5’RACE所用引物：

5’RACE Adaptor：

5’-GCUGAUGGCGAUGAAUGAACACUGCGUUUGCUGGCUUUGAUGAAA-3’

5’RACE Outer Primer：5’-GCTGATGGCGATGAATGAACACTG-3’

5’RACE Inner Primer：

5’-CGCGGATCCGAACACTGCGTTTGCTGGCTTTGATG-3’

PV-5’gspoutR：5’-AGGAATCTCGTGGTGGTCCAGTAAC-3’

PV-5’gspinR：5’-CAGTGACTGCTGCACCAGCTAG-3’

Outer PCR反应体系：反转录反应液，1.0μL；dNTPs(2.5mM)，4.0μL；PV-5’gspoutR(10μM)，2.0μL；5’RACE Outer Primer(10μM)，2.0μL；10×ExTaq PCR buffer(含25μmol/mL Mg²⁺)，5.0μL；TaKaRa ExTaq DNA酶，2.5U；加入ddH₂O到终体积50μL。

Outer PCR反应条件：94℃预变性3min后，94℃变性30s，68-58℃退火30s，72℃延伸1min，每循环降低1℃，进行11个循环；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，进行26个循环；72℃延伸10min，然后4℃保存。

Inner PCR反应体系：Outer PCR产物，1μL；dNTPs(2.0mM)，5.0μL；PV-5’gspinR(10μM)，2.0μL；5’RACE Inner Primer(10μM)，2.0μL；10×ExTaq PCR buffer(含25μmol/mL Mg²⁺)，5.0μL；TaKaRa ExTaq DNA酶，2.5U；加入ddH₂O至终体积50μL。

Inner PCR反应体系：94℃预变性3min后，94℃变性30s，68-58℃退火30s，72℃延伸1min，每循环降低1℃，进行11个循环；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，进行26个循环；72℃延伸10min，然后4℃保存。

PCR扩增产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。用GelDoc凝胶成像系统仪在紫外灯下观察并照相。目的片段的回收、目的片段与载体连接、目的片段的转化及克隆鉴定方法同3’RACE。

(3)菜豆EPSPS基因全长cDNA的分离

以3’RACE和5’RACE拼接的序列结果为基础，利用Primer Premier 5.0和Oligo 6.0软件设计菜豆EPSPS cDNA全长引物。

PVEPSPAF：5’-AAACACTTTATGTGACTCAATC-3’

PVEPSPAR：5’-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTTC-3’

cDNA第一链的合成：反转录合成体系为：1μg总RNA，加入5×PrimerScriptTMBuffer 4.0μL，Random 6mers 1.0μL、Oligo dT Primer 1.0μL、PrimerScript TM RTEnzyme Mix I 1.0μL，加入Nuclease-free Water至终体积20μL。

反转录合成条件为：37℃，15min；85℃，5s，-20℃保存。

RT-PCR反应体系为：cDNA第一链模板，0.5μL；10×PCR Buffer(含25μmol/mLMg²⁺)，2.0μL；2mmol/L dNTPs，2.0μL；PVEPSPF(2μmol/L)，2.5μL；PVEPSPR(2μmol/L)，2.5μL；ExTaq DNA酶1U；加入ddH₂O至终体积20μL。

RT-PCR反应程序：在T1/Thermocycler扩增仪上进行。94℃预变性5min后，94℃变性30s，65-54℃退火30s(每循环降低1℃)，72℃延伸2min，进行12个循环；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，进行30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

PCR扩增产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。用GelDoc凝胶成像系统仪在紫外灯下观察并照相。目的片段的回收、目的片段与载体连接、目的片段的转化及克隆鉴定方法同3’RACE。

PCR扩增得到2.0kb左右的片段，即获得的全长cDNA命名为PVEPSPS。经过测序表明，PVEPSPS长2028bp，具有序列表中序列1的核苷酸序列，自序列1的5’端的第207至1784位核苷酸为PVEPSPS的编码序列，编码一条长526个氨基酸的蛋白PVEPSPS，PVEPSPS具有序列表中序列2的氨基酸残基序列。自序列2的氨基端第1-526氨基酸为EPSPS结构域序列。

上述PVEPSPS也可以通过人工合成序列1获得。

实施例2、耐草甘膦蛋白及其编码基因的功能验证

1、耐草甘膦蛋白的获得

将PVEPSPS的ORF克隆pGEX4T-1载体，具体方法为：

根据上述PVEPSPS编码区cDNA序列设计引物，序列如下所示：PVEPSPF，5’-TTCCCGGGTATGGCCCAGGTGAGCAGAG-3’(下划线标注的是Sma I酶识别位点，序列3)；PVEPSPR，5’-GCGGCCGCTCCTAGTGCTTGGTGAACCTCTCG-3’(下划线标注的是Not I酶识别位点，序列4)。

将菜豆89-09单株(陶波，秦智伟，曲桂琴等.1993.菜豆抗草甘膦基因筛选的研究.中国农学通报.9(5)：31～33，公众可从中国农业科学院作物科学研究所；东北农业大学获得)叶片RNA，反转录成cDNA第一链，以该cDNA为模板，以PVEPSPF和PVEPSPR为引物进行PCR扩增。

也可以以人工合成的序列1作为模板，以PVEPSPF和PVEPSPR为引物进行PCR扩增，得到1578bp的片段，测序表明，该片段具有序列1的自5’末端的第207至1784位的核苷酸序列。

2、原核表达载体的构建

将上述获得的扩增产物1578bp的片段用Sma I和Not I双酶切，得到酶切片段与经过同样酶切得到的pGEX4T-1载体(购自GE Healthcare，产品目录号27-4580-01)连接，得到连接产物，将连接产物转入大肠杆菌，得到转化子，提取转化子的质粒，送去测序，结果为该质粒为将序列1的自5’末端的第207至1784位的核苷酸插入pGEX4T-1载体的Sma I和Not I酶识别位点之间，得到重组载体，将该重组载体命名为pGEX4T-PVEPSPS。

4、转pGEX4T-PVEPSPS大肠杆菌的获得

用核酸构建体导入大肠杆菌感受态细胞的方法获得转pGEX4T-PVEPSPS大肠杆菌，具体方法为：制作大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，将核酸构建体pGEX4T-PVEPSPS转入大肠杆菌菌株BL21(DE3)细胞中获得重组菌株，通过氨苄抗性筛选重组菌。

以培养的大肠杆菌阳性克隆转化子为模板，以PVEPSPF和PVEPSPR为引物进行PCR扩增，扩增到1578bp的片段的为阳性重组菌，将该重组菌株命名为BL21(DE3)/pGEX4T-PVEPSPS。

采用同样的方法，将空载体pGEX4T-1转入大肠杆菌菌株BL21(DE3)细胞中，得到重组菌BL21(DE3)/pGEX4T-1，提取质粒，以PVEPSPF和PVEPSPR为引物进行PCR扩增，未得到1578bp的片段，重组菌BL21(DE3)/pGEX4T-1为转空载体重组菌。

5、转pGEX4T-PVEPSPS大肠杆菌的草甘膦抗性鉴定

挑取重组单菌落BL21(DE3)/pGEX4T-PVEPSPS接种至LB液体培养基中，37℃振摇培养至OD₆₀₀为0.6后，加入终浓度为1.0mmol·L^-1IPTG，继续培养。在IPTG诱导后0h、2h、4h、6h、8h、12h分别取2mL菌液(分装于2个2mL Eppendorf管中)，其中一管12000rpm离心30s收集菌体，另一管进行草甘膦抗性鉴定。

将菌体悬于80μL pH 7.0 0.2mmol·L^-1Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液中，同时加入20μL 5×SDS上样缓冲液，于涡旋混匀仪悬浮沉淀，沸水煮8min，以备电泳加样。采用不连续垂直SDS-PAGE电泳检测PVEPSPS基因表达蛋白，以BL21(DE3)/pGEX4T-1和BL21(DE3)为阴性对照，以BL21(DE3)/pGEX4T-CP4EPSPS为阳性对照。蛋白电泳上层浓缩胶为5％，下层分离胶为12％。

上述的BL21(DE3)/pGEX4T-CP4EPSPS的构建方法如下：

以孟山都公司第一代抗草甘膦转EPSPS基因的大豆D01(王晓波，蒋凌雪，魏利，刘林，陆伟，李文欣，王俊，陶波，常汝镇，邱丽娟.外源抗草甘膦EPSPs基因在大豆基因组中的整合与定位.作物学报.2010，36(3)：365-375，公众可从中国农业科学院作物科学研究所；东北农业大学获得)单株的cDNA为模板，用CP4 EPSPS cDNA全长引物：

CP4FLF：5’-GAATTCATGGCACAAATTAACAACATGGC-3’(含EcoR I酶切位点)

CP4FLR：5’-GTCGACTCAGGCAGCCTTCGTATCGG-3’(含Sal I酶切位点)

进行PCR扩增，得到1584bp的PCR产物，将该PCR产物经EcoR I和Sal I双酶切，得到的酶切产物与经过同样酶切得到的pGEX4T-1连接，得到重组质粒，将重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞，得到转化子，提取质粒进行EcoR I和Sal I双酶切检测验证，得到1584bp的为阳性质粒，命名为pGEX4T-CP4EPSPS，将含有该阳性质粒的转化子命名为BL21(DE3)/pGEX4T-CP4EPSPS。

结果如图2所示，其中，1-4：IPTG未诱导前；5-8：IPTG诱导后2h；9-12：IPTG诱导后4h；13-16：IPTG诱导后6h；17-20：IPTG诱导后8h；21-24IPTG诱导后12h；每4个样品顺序为BL21(DE3)、BL21(DE3)/pGEX4T-1、BL21(DE3)/pGEX4T-PVEPSPS、BL21(DE3)/pGEX4T-CP4EPSPS阳性样品，从图2中可以看出，BL21(DE3)/pGEX4T-PVEPSPS在IPTG诱导后，GST融合蛋白(约为26kDa)能够正常表达。在IPTG诱导后2h后，BL21(DE3)/pGEX4T-PVEPSPS、BL21(DE3)/pGEX4T-CP4EPSPS阳性样品蛋白(均约为55kDa+GST融合蛋白26kDa＝81kDa)开始表达，随着诱导时间的增长，蛋白表达量有所增加，当诱导达到6h～12h时，蛋白表达量处于稳定状态，蛋白诱导表达成功。

将上述可以诱导表达81kDa的重组菌BL21(DE3)/pGEX4T-PVEPSPS进行草甘膦抗性鉴定，同时接种在含有草甘膦浓度0mM、25mM、50mM、75mM、100mM的液体LB培养基中7d后观察菌落生长情况；以BL21(DE3)/pGEX4T-1和BL21(DE3)为对照。

7d观察菌落生长，结果如图3，图3中为培养7d观察菌落生长，其中A依次为BL21(DE3)/pGEX4T-PVEPSPS在草甘膦浓度为0mM、25mM、50mM、75mM、100mM时生长情况；B依次为BL21(DE3)/pGEX4T-1在草甘膦浓度为0mM、25mM、50mM、75mM、100mM时生长情况；C依次为BL21(DE3)在草甘膦浓度为0mM、25mM、50mM、75mM、100mM时生长情况，

从图3可以看出，BL21(DE3)/pGEX4T-PVEPSPS、BL21(DE3)/pGEX4T-1和BL21(DE3)在0mM的LB培养基中溶液混浊，菌株均能生长正常，证明三个菌种都具有较强的活力；BL21(DE3)/pGEX4T-PVEPSPS在含有草甘膦25mM、50mM、75mM的LB培养基中溶液混浊，菌株能够正常生长，但是浑浊度比在含有草甘膦0mM的LB培养基中程度轻，菌株生长稍弱，可见随着草甘膦浓度的增加，草甘膦对BL21(DE3)/pGEX4T-PVEPSPS的抑制作用增强；BL21(DE3)/pGEX4T-1和大肠杆菌BL21(DE3)在含有草甘膦25mM、50mM的液体LB培养基中能够生长，在75mM的LB培养基中颜色透亮，菌株不能正常生长，因为菌种大肠杆菌BL21(DE3)本身就具有弱的抗草甘膦能力，但是在高草甘膦浓度下不能生长；大肠杆菌pGEX4T-PVEPSPS在含有草甘膦浓度75mM的液体LB培养基中可以正常生长，而大肠杆菌pGEX4T不能生长，证明转化质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中成功复制表达，其功能得到了发挥。

将10μL上述各菌株接种至含有草甘膦0mM、25mM、50mM、75mM、100mM的20mL LB培养基(蛋白胨1.0％，酵母抽提物0.5％，NaCl 1.0％，121℃高压灭菌18min)中培养7d，以分光光度计测定OD₆₀₀值。

各菌株的生长结果如图4所示，图4为BL21(DE3)/pGEX4T-PVEPSPS(pGEX4T-PVEPSPS)、BL21(DE3)/pGEX4T-1(pGEX4T-1)和大肠杆菌BL21(DE3)(BL21)在不同浓度草甘膦处理下生长曲线。

BL21(DE3)/pGEX4T-PVEPSPS(pGEX4T-PVEPSPS)在含有草甘膦0mM、25mM、50mM、75mM、100mM的LB中的OD₆₀₀为0.648、0.181、0.167、0.105、0.000；

BL21(DE3)/pGEX4T-1(pGEX4T)在含有草甘膦0mM、25mM、50mM、75mM、100mM的LB中的OD₆₀₀为0.636、0.223、0.090、0.000、0.000；

BL21(DE3)(BL21)在含有草甘膦0mM、25mM、50mM、75mM、100mM的LB中的OD₆₀₀为0.648、0.178、0.194、0.000、0.000；

从上述结果均可表明PVEPSPS基因在大肠杆菌中表达可以提高转基因大肠杆菌的耐草甘膦能力。

Claims (3)

1.一种蛋白，是由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因是如下(1)或(2)的DNA分子：

(1)序列表中序列1所示的DNA分子；

(2)序列表中序列1的自5’末端的第207至1784位的核苷酸所示的DNA分子。