JP2001514501A

JP2001514501A - 生体異物化学品の作用部位の同定のための方法

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Publication number: JP2001514501A
Application number: JP53781298A
Authority: JP
Inventors: エルスモア，デイビツド・アレン; ラロツサ，ロバート・アラン; スマルスキ，ダナ・ロビン; バン・デイク，テイナ・カンガス
Original assignee: イー・アイ・デユポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー
Priority date: 1997-02-28
Filing date: 1998-02-26
Publication date: 2001-09-11
Also published as: CA2279576A1; EP0972074A1; AU6339098A; IL131336A0; WO1998038336A1

Abstract

(57)【要約】生体異物化合物の作用部位の発見のための方法を開示する。該方法は発光性リポーター遺伝子複合体に操作可能的に結合した遺伝子毒性−感受性プロモーターを含む検出細胞を供することを含む。遺伝子毒性である化合物に検出バクテリアを暴露すると発光の増加を生ずる。そのような化合物をグループ分けし、製薬学的活性に関して分析することができる。遺伝子毒性でない活性生体異物に検出バクテリアを暴露すると生物発光もしくは安定な発光の阻害を生ずる。栄養復帰又は遺伝子滴定などのスリクーニングに検出バクテリアを供すると化合物の作用部位が明らかになる。

Description

【発明の詳細な説明】生体異物化学品の作用部位の同定のための方法発明の分野本発明は分子生物学の分野ならびに生物学的活性に関して化合物をスクリーニングするための方法に関する。さらに特定的に、種々の生体異物化合物（ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）、特に生体異物農業化学品及び抗微生物剤の作用部位を迅速に同定するための方法が開発されている。発明の背景化学の技術分野内における技術的進歩は農業化学、製薬及び環境産業にとって興味深い多数の化学化合物の合成を可能にしてきた。これらの合成法はその有用性を同定するために合理的にスクリーニングできるよりずっと多くの化合物を作ることができる。これらの化合物の有用性は種々の構造−機能関連性に基づいてモデル化され、多くの場合はこれらの化合物を所望の既知の活性と関連付けるスクリーニング法を介して確認される。ある化合物又は化合物の種類がスクリーニングに供され、推定的活性が決定されると、化合物の作用部位、すなわち標的としても既知の機構を決定するためにさらなる分析が必要である。化学的又は環境的因子の作用の正確な部位を理解する試みは、環境的安全性に対する関心及びこの理解に伴う価値を農業化学及び製薬産業における利用のために捕らえる望みにより助長される。従って迅速であり、正確であり且つ作られている多数の化合物に適応することができる合成生体異物化合物の作用部位を決定する方法が必要である。微生物に基づく系における栄養復帰（ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌｒｅｖｅｒｓａｌ）及び遺伝子滴定（ｇｅｎｅｔｉｃｔｉｔｒａｔｉｏｎ）の相補的方法を用いる種々の化合物の作用部位の決定のための方法が開発された。ＬａＲｏｓｓａｅｔａｌ．，［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９（１４），（１９８４）８７５３−８７５７］は、オキサノグラフイ［Ｄａｖｉｓ，Ｒ．Ｗ．，Ｄ．ＢｏｔｓｔｅｉｎａｎｄＪ．Ｒ．Ｒｏｔｈ：ＡＭａｎｕａｌＦｏｒＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：ＡｄｖａｎｃｅｄＢａｃｔｅｒｉａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ．Ｘ＋２５４ｐ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ：ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８０］と呼ばれる栄養要求性突然変異により影響される経路の分類に以前に用いられた栄養復帰に関するプール戦略を記載している。この方法はサルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＬＴ２におけるスルホニルウレア除草剤作用の部位を正確に限定する。該方法は固体培地上で生育し、有効濃度の除草剤に暴露されたバクテリア細胞の菌叢を用いる。スルホニルウレア除草剤は、分枝鎖アミノ酸生合成経路の阻害によりサルモネラ生育を阻害する。栄養素の補給は除草剤作用により強いられる特定のアミノ酸欠乏を克服する。結果は約４８時間内にわかる。ＬａＲｏｓｓａｅｔａｌ．の方法は特定の活性生体異物化合物に関する作用部位の決定に有用であるが、すべての植物アッセイと同様に時間がかかり、大量のスクリーニングされるべき試験化合物を必要とする。微生物集団における遺伝子滴定は栄養復帰のための代替法となる。遺伝子滴定は過去４０年間用いられてきた。代謝拮抗物質を用いる挑戦に応答して経路酵素の力価を向上させる調節突然変異の選択はＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）及びＳ．チフィムリウムの文献において周知である。哺乳類細胞系において（薬剤及び遷移状態類似物を用いて）及び代謝拮抗物質を用いてバクテリアの両方において遺伝子重複が選択された。これらの選択は、阻害剤の悪影響を滴定して排除する（ｔｉｔｅｒｉｎｇｏｕｔ）細胞の酵素含有率の向上に基づいている。マルチコピー組み換えＤＮＡに基づく酵母染色体ライブラリと組み合わされた酵母における代謝拮抗物質を用いるそのような滴定に関する系統的選択がＦａｌｃｏ［Ｆａｌｃｏｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１０９：２１−３５（１９８５）］及びＲｉｎｅ［Ｒｉｎｅｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ８０：６７５０−４（１９８３）］により開拓された。もっと最近、Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ及びＣｈａｔｔａｊｅｅＰＮＡＳ９２：８９５０−８９５４（１９９５）］はこの組み換えＤＮＡに基づく戦略をＥ．コリで用いた。この文献は、作物保護化学品及び数種の医薬品の種々の巨大分子標的を同定するための酵母における遺伝子滴定の方法の使用を記載している。それは、組み換えＤＮＡ媒介遺伝子滴定がバクテリア標的を同定することができるとも記載している。遺伝子滴定は一般に、最初に、ゲノムの各部分が高度に増幅されるマルチコピークローニングベクターにおいてバクテリアゲノムのＤＮＡライブラリを調製することにより行われる。バクテリア宿主をライブラリを用いて形質転換し、有効阻害濃度の調べられるべき生体異物化合物を含有するプレート上での生育に関してスクリーニングする。コロニーを採取し、プラスミドを単離し、配列決定する。配列を既知の配列と比較して化合物に関する作用部位をコードし得た遺伝子を同定する。これらの栄養復帰及び遺伝子滴定の方法は両方ともバクテリア又は酵母の細胞を寒天プレート上に置き、続いて化合物の存在に応答する細胞生育に関して記録するか又は監視する必要により制限される。この制限は該方法を遅くてやっかいなものとしている。さらにこれらの方法のいずれも、スクリーニングされている化合物の相対的な生理学的又は環境的毒性を決定する方法を与えない。現在のスクリーニング法の有意な欠点の１つは、後で毒性学的スクリーニングにおける悪い結果のために捨てなければならない多くの活性化合物が初期のスクリーニングで同定され得ることである。作用部位スクリーニング中への毒性学的予備−スクリーニングの導入は、この経費のかかる時間及び資源の投資を最小にするであろう。生物発光性リポーターは当該技術分野において毒性学的検出物質として既知である。最も普通のものの１つはホタルルシフェラーゼをコードする遺伝子である。他は、生物発光性バクテリア、ビブリオ・フィシェリ（Ｖｉｂｒｉｏｆｉｓｃｈｅｒｉ）から単離された５つの遺伝子の組、ｌｕｘＣＤＡＢＥである。真核及び原核遺伝子の両方が検出物質として働くために組み換え系において用いられてきた。ホタルルシフェラーゼをコードするｃＤＮＡがＥ．コリにおいてｌａｃｚプロモーターの制御下で発現され［Ｔａｔｓｕｍｉｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．ＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ．，１１３１，（２），ｐｐ１６１−１６５，（１９９２）］、ｌｕｘＡＢ融合遺伝子が強力なＰｘｙｎプロモーターの制御下にそれを置くことにより、Ｅ．コリにおいて達成可能な量に匹敵する量でバシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）において発現された（Ｊａｃｏｂｓｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２３０（１ −２），ｐｐ２５１−２５６，（１９９１）］。バクテリア遺伝子も単離され、発現された。Ｒｙｃｈｅｒｔｅｔａｌ．，［Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｔｏｘｉｃ．ＷａｔｅｒＱｕａｌ．，６（４），ｐｐ４１５−４２２（１９９１）］は、プロモーターのないビブリオ・フィシェリのｌｕｘ遺伝子複合体を含有するプラスミド、ｐＪＥ２０２を保有する組み換えＥ．コリがＺｎ²⁺、エチジウムブロミド、ナトリウムペンタコロフィエート（ｓｏｄｉｕｍｐｅｎｔａｃｈｏｒｏｐｈｅａｔｅ）、Ｃｕ²⁺及び２，４−ジクロロフェノキシ酢酸に感受性であることを示した。このアッセイにおける応答は、形質転換されたＥ．コリにより発せられるベースライン光の減少により記録された。種々の毒物に特異的なアッセイにおいて用いるために、プロモーターのないバクテリア遺伝子複合体の使用の他に、異種プロモーターをバクテリア生物発光性構造遺伝子に融合させた。例えばｌｕｘ遺伝子複合体を化学的に応答性のバクテリアプロモーターに融合させ、次いでそのようなキメラを適した宿主中に置くことによって組み換えバクテリアを開発した。これらの組み換えバクテリアは特定の刺激に応答して光るセンサー生物である。この型の遺伝子融合の例はＢｕｒｌａｇｅｅｔａ１．，［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２（９）ｐｐ４７４９ −４７５７（１９９０）］により記載されており、そこではナフタレン分解経路のためのプロモーターを含有するプラスミドＮＡＨ７からのＤＮＡフラグメントをビブリオ・フィシェリのｌｕｘ遺伝子に融合させ、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）のある株の形質転換に用いている。得られる形質転換株はナフタレンの存在下で発光の増加を示す。生物発光の誘導は形質転換生物によるナフタレン分解と同時に起こることが示された。水銀（Ｈｇ）に特異的に応答性の他の試験系がＨ．Ｍｏｌｄｅｒｓ（ＥＰ４５６６６７）により記載されている。この場合、生物発光を担うバクテリアルシフェラーゼ（ｌｕｘＡＢ）遺伝子複合体に融合したＨｇイオンにより特異的に誘導可能なｍｅｒプロモーターを含有する指示バクテリア株が与えられる（ベクター媒介遺伝子転移により）。Ｍｏｌｄｅｒｓの試験系は水銀の存在によるｍｅｒプロモーターの誘導及び続く組み換えバクテリアからの発光の増加に頼っている。出願人等は以前に、共同所有されているＵＳＳＮ０８／２４４，３７６及びＵＳＳＮ０８／３４４，４２８において、遺伝子毒性ストレスに感受性のものを含む種々のストレスプロモーターの使用を開示している。ＵＳＳＮ０８／２４４，３７６は、タンパク質損傷（熱ショック）、ＤＮＡ損傷（遺伝子毒性）、酸化的損傷、細胞膜損傷、アミノ酸欠乏、炭素欠乏及び窒素欠乏に感受性のものを含むストレスプロモーター−生物発光性遺伝子融合体を含有する検出生物の、種々の環境的ストレスの検出のための使用を記載している。ＵＳＳＮ０８／３４４，４２８は、類似して形質転換された検出細胞の、凍結乾燥された試薬としての使用を示している。最後に、共同所有されているＵＳＳＮ０８／７３５，５４５において、出願人等はゲノムＤＮＡの制限から単離されるバクテリアプロモーターに融合した生物発光性リポーターの、新規な化合物感受性プロモーターの同定のための使用を記載している。従って克服されるべき問題は、人間を含む動物又は環境に無毒である農業化学的又は製薬学的に活性な生体異物化合物の作用部位の同定のための迅速で容易な方法を開発することである。発明の概略本発明は：（ｉ）発光性リポーター遺伝子複合体に操作可能的に結合して生物発光に関して陽性の表現型を検出バクテリアに与える遺伝子融合体を形成している遺伝子毒性−感受性プロモーターを含んでなる検出バクテリアとストレッサー（ｓｔｒｅｓｓｏｒ）とを接触させ、ここで遺伝子毒性−感受性プロモーターの遺伝子毒性化合物への暴露は発光性リポーター遺伝子複合体の高められた発現を推進し、生物発光シグナルを増加させ；（ｉｉ）検出バクテリアの生育及び光の放射量（ｌｉｇｈｔｏｕｔｐｕｔ）を監視することにより段階（ｉ）の検出バクテリアの生育を阻害することができる遺伝子毒性もしくは非−遺伝子毒性ストレッサーに関して選択し；（ｉｉｉ）段階（ｉｉ）で選択される生育−阻害性遺伝子毒性もしくは非−遺伝子毒性ストレッサーを作用部位スクリーニングに供し；（ｉｖ）検出バクテリアにおいて作用部位を同定し；（ｖｉ）標的生物において作用部位を確認することを含んでなるストレッサーの作用部位の同定のための方法を提供する。本発明はさらにｒｅｃＡ−ＬｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子融合体を含んでなる検出バクテリア株ならびに多数の細胞及び膜突然変異を有する非−生物発光性親株を提供する。本発明はさらに：（ｉ）ＳＯＳバクテリア調節回路により調節されるプロモーター及びｌｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子複合体を含んでなり、ここでｌｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子複合体はバクテリア染色体においてＳＯＳプロモーターの下流に位置し、ＳＯＳプロモーターが発現されると１ｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子複合体も発現される検出細胞を培養し；（ｉｉ）培養物を調べられるべき物質と接触させ；（ｉｉｉ）培養物における発光の放射量を測定することにより、物質が遺伝子毒性であるかどうかを決定する段階を含んでなる、化合物が遺伝子毒性であるかどうかを決定するための方法を提供する。本発明はさらに：（ｉ）発光性リポーター遺伝子複合体に操作可能的に結合して生物発光に関して陽性の表現型を検出バクテリアに与える遺伝子融合体を形成している遺伝子毒性−感受性プロモーターを含んでなる検出バクテリアとストレッサーとを接触させ、ここで遺伝子毒性−感受性プロモーターの遺伝子毒性化合物への暴露は発光性リポーター遺伝子複合体の高められた発現を推進し、生物発光シグナルを増加させ；（ｉｉ）検出バクテリアの生育及び光の放射量を監視することにより段階（ｉ）の検出バクテリアの生育を阻害することができる遺伝子毒性もしくは非−遺伝子毒性ストレッサーに関して選択し；（ｉｉｉ）生育−阻害性遺伝子毒性もしくは非−遺伝子毒性ストレッサーを、ストレッサー標的が同定される作用部位スクリーニングに供し；（ｉｖ）ストレッサー標的をコードする構造遺伝子を単離することを含んでなるストレッサー標的をコードする構造遺伝子を同定する方法を提供する。他の態様において、本発明はグリホセート−様活性、チエニルアラニン−様活性及びＡＬＳ−阻害活性を有する化合物の同定のための方法を提供する。図、生物寄託及び配列表の簡単な記載図１（フローチャート−株１ａ及び１ｂ）は、本発明で用いる検出細胞の系統を示す図である。実線の矢印は非−生物発光性株の構築を示す。破線の（ｂｒｏｋｅｎ）矢印は生物発光性誘導体の構築を示す。バクテリアの単離に用いられる選択及びスクリーニングを大文字及びイタリック活字体で示す。関連する遺伝子型をイタリックにする。ｉｇｍは最少培地上における向上した生育を示す。図２（方法チャート）は、本検出細胞を用いて遺伝子毒性に関して化合物をスクリーニングし、非−遺伝子毒性化合物の作用部位を遺伝子滴定の栄養復帰により決定する本発明の方法を示すフロー図である。図３は特定の標的の生体内阻害剤同定のための方法の図であり、既知の活性に関する化合物のスクリーニングを示している。図４ａはｉｌｖＢ、ｉｌｖＩ、ｉｌｖＨ、ｉｌｖＧｒｅｌＡ及びｓｐｏＴ突然変異ならびにｒｅｃＡ−ＬｕｘＣＤＡＢＥを含み、ｔｏｌＣ＋であり、ＤＮＡ損傷薬剤マイトマイシンＣに暴露された株ＤＰＤ１７１５のＲＬＵ対時間のプロットである。図４ｂはｒｅｃＡ−ＬｕｘＣＤＡＢＥ及びｔｏｌＣ＋を含み、ＤＮＡ損傷薬剤マイトマイシンＣに暴露された株ＤＰＤ１７３０のＲＬＵ対時間のプロットである。図５はｔｏｌＣ−及びｔｏｌＣ＋株のマイトマイシンへの感受性を比較するＲＬＵ対マイトマイシン濃度の動力学的プロットである。図６はＲｅｃＡ−ＬｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子融合体を含有し、変化する濃度の２，４−ジクロロフェノキシ酢酸に暴露された株ＤＰＤ１７１８に関するＲＬＵ対時間のプロットである。図７はＲｅｃＡ−ＬｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子融合体を含有し、変化する濃度のスルホメツロンメチルに暴露された株ＤＰＤ１７１８に関するＲＬＵ対時間のプロットである。図８（ａ）及び（ｂ）はｉｌｖＢ、ｉｌｖＩ、ｉｌｖＨ、ｉｌｖＧｒｅｌＡ及びｓｐｏＴ突然変異ならびにｒｅｃＡ−ＬｕｘＣＤＡＢＥを含み、ｔｏｌＣ＋であり、変化する濃度のグリホセートに暴露された株ＤＰＤ１７１５に関するＲＬＵ対時間のプロットを示す。図９はｒｅｃＡ−ＬｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子融合体ならびにｉｌｖＢｉｌｖＧｉｌｖＩＨｒｅｌＡｓｐｏＴｔｏｌＣ＋及びｓｐｏＴ突然変異を含み、変化する濃度のメチルビオロゲンに暴露された株ＤＰＤ１７３０に関するＲＬＵ対時間のプロットである。図１０（ａ）はｉｌｖＢ、ｉｌｖＩ、ｉｌｖＨ、ｉｌｖＧｒｅｌＡ及びｓｐｏＴ突然変異ならびにｒｅｃＡ−ＬｕｘＣＤＡＢＥを含み、ｔｏｌＣ＋であり、変化する濃度のスルホメツロンメチルに暴露された株ＤＰＤ１７１５に関するＲＬＵ対時間のプロットである。図１０（ｂ）はｉｇｍｒｅｌＡ及びｓｐｏＴ突然変異ならびにｒｅｃＡ−ＬｕｘＣＤＡＢＥを含み、ｔｏｌＣ−であり、変化する濃度のスルホメツロンメチルに暴露された株ＤＰＤ１７２８に関するＲＬＵ対時間のプロットである。図１０（ｃ）は株ＤＰＤ１７１５及びＤＰＤ１７２８の応答を比較する８０分における生物発光測定値対スルホメツロンメチルの濃度の動力学的プロットである。図１１（ａ）はｒｅｃＡ−ＬｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子融合体を含み、最少培地中の変化する濃度の３−（２−チエニル）−Ｌ−アラニンに暴露された株ＤＰＤ１７１８に関するＲＬＵ対時間のプロットである。図１１（ｂ）はｒｅｃＡ−ＬｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子融合体を含み、濃厚（ｒｉｃｈ）ＬＢ培地中の変化する濃度の３−（２−チエニル）−Ｌ−アラニンに暴露された株ＤＰＤ１７１８に関するＲＬＵ対時間のプロットである。図１２（ａ）はｒｅｃＡ−ＬｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子融合体を含み、最少培地中の変化する濃度のオキシムカルバメート化合物ＯＣに暴露された株ＤＰＤ１７１８に関するＲＬＵ対時間のプロットである。図１２（ｂ）はｒｅｃＡ−ＬｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子融合体を含み、濃厚ＬＢ培地中の変化する濃度のオキシムカルバメート化合物ＯＣに暴露された株ＤＰＤ１７１８に関するＲＬＵ対時間のプロットである。図１３（ａ）はｒｅｃＡ−ＬｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子融合体を含み、最少培地中の変化する濃度のグリホセートに暴露された株ＤＰＤ１７１８に関するＲＬＵ対時間のプロットでぁる。図１３（ｂ）はｒｅｃＡ−ＬｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子融合体を含み、濃厚ＬＢ培地中の変化する濃度のグリホセートに暴露された株ＤＰＤ１７１８に関するＲＬＵ対時間のプロットである。図１４はｒｅｃＡ−ＬｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子融合体ならびにｒｅｌＡ及び△ｉｌｖＢ突然変異を含む株ＤＰＤ１７１８に関するＲＬＵ対時間のプロットであり、生物発光の３−（２−チエニル）−Ｌ−アラニン誘導阻害からのシステインによる復帰を示している。図１５（ａ）は株ＤＰＤ１７１８に関するＲＬＵ対時間のプロットであり、スルホメツロンメチルによる光阻害を示している。図１５（ｂ）は株ＤＰＤ１７１８に関するＲＬＵ対時間のプロットであり、３つの分枝鎖状アミノ酸、リシン及びヒスチジンを含むプールによる栄養復帰の結果としての、スルホメツロンメチルによる阻害の後の光の放射量の回復を示している。図１６は生物発光応答率対０２４５ｙｇａＨ、ｐｈｅｎＡ及びａｒｏＨ遺伝子を用いて形質転換された株と接触したチエニルアラニンの濃度のプロットである。形質転換されたＥ．コリ株ＤＰＤ１７０７、ＤＰ１６７５及びＤＰＤ１７１８は、１９９７年２月１３日、ブタペスト条約の条件下に、１２３０１ＰａｒｋｌａｗｎＤｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ２０８５２Ｕ．Ｓ．Ａ．にある国際寄託機関、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）に寄託された。該株はそれぞれＡＴＣＣ９８３２８、ＡＴＣＣ９８３２９及びＡＴＣＣ９８３３０と指定された。この指定は寄託された材料の受け入れ番号を指す。出願人等はＲｕｌｅｓｆｏｒｔｈｅＳｔａｎｄａｒｄＲｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎｏｆＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅａｎｄＡｍｉｎｏＡｃｉｄＳｅｐｕｅｎｃｅｓｉｎＰａｔｅｎｔＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（ＡｎｎｅｘｅｓＩａｎｄＩＩｔｏｔｈｅＤｅｃｉｔｉｏｎｏｆｔｈｅＰｒｅｓｉｄｅｎｔｏｆｔｈｅＥＰＯ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄｉｎＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔＮｏ．２ｔｏＯＪＥＰＯ，１２／１９９２）ならびに３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１−１．８２５及びＡｐｐｅｎｄｉｃｅｓＡａｎｄＢ（ＲｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓｆｏｒＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎＤｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓＣｏｎｔａｉｎｉｎｇＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓａｎｄ／ｏｒＡｍｉｎｏＡｃｉｄＳｅｐｕｅｎｃｅｓ）に従って配列表を提供した。配列番号１〜１０はプライマーの配列である。発明の詳細な記述出願人等は、ストレスプロモーター−Ｌｕｘ遺伝子融合体が化合物作用部位に関するスクリーニングの従来の方法を強化するのに有用であることを認識した最初の者であり、生物が第１段階で遺伝子毒性化合物を示すことができ、第２のアッセイで作用部位を同定することができるというアッセイにおける二重機能の可能な検出生物を開発した最初の者である。出願人等は、アミノ酸欠乏に対する感受性を与える突然変異を有し、バクテリア生物発光性リポーター遺伝子複合体に操作可能的に結合した遺伝子毒性−感受性プロモーターを含む遺伝子融合体を含有するバクテリア検出細胞を用いることにより、特定の生体異物化合物の作用部位を見いだすための方法を開発した。典型的生体内異物には除草剤、抗ガン剤、抗微生物剤及び作物保護化学品として活性な化学品が含まれる。該方法は農業化学及び製薬産業において、化合物の作用部位の同定のためならびに類似の構造及び／又は機能の新規な化合物の設計のために高い有用性を有する。該方法においては、遺伝子毒性である生体異物化合物は遺伝子毒性−感受性プロモーター（生物発光性リポーター遺伝子複合体の転写を推進する）と相互作用し、光を増加させる。非−遺伝子毒性生体異物化合物のより高い濃度は代謝活性の妨害及び発光の減少を生じ得る。本方法は独特に構築される検出細胞を含む２部型スクリーニングを介し、特定の化合物の作用部位を迅速に決定する。検出細胞はｒｅｌＡ突然変異（アミノ酸欠乏に対する宿主細胞の応答を減少させることを担う）ならびにバクテリアｌｕｘ遺伝子複合体に操作可能的に融合した遺伝子毒性−感受性プロモーターを含むｌｕｘ遺伝子融合体を有していることができる。第１段階で検出細胞を特定の濃度のスクリーニングされるべき生体異物化合物に暴露し、培養物を生育阻害あるいは生物発光の増加に関して分析する。生物発光を増加させる化合物は遺伝子毒性として捨てる。模擬−処理（ｍｏｃｋ−ｔｒｅａｔｅｄ）された標準に対して生物発光の放射量を減少させ、調べたいずれの濃度においても細胞生物発光を増加させない化合物を第２段階に供する。第２段階は標準的栄養復帰及び遺伝子滴定スクリーニングにおいて検出生物を用い、その補足が生体異物化合物と関連する代謝妨害を妨げる栄養素又は遺伝子を同定するために生物発光性遺伝子融合体を利用する。本方法は、化学的ストレッサー作用のオキサノグラフ的復帰を検出細胞株の発光の回復により合図できることならびに限定された栄養素プールによる復帰のパターンがストレッサー化学品により阻害される経路を限定できることを初めて示した。該方法の利点には、単位時間当たりの化合物スクリーニングの数の増加、生物学的応答の速度の増加ならびにデータ収集及び処理の自動化の容易さが含まれ、一方、分析に必要な化合物の量が約３００分の１に減少する。以下の定義を本明細書で用い、それは請求の範囲の解釈のために参照されるべきである。「作物保護化学品」及び「ＣＰＣ」という用語は昆虫、植物病原体又は作物植物に損害を与えることが既知の作物−競合植物種への毒性又は忌避性（ｒｅｐｅｌｌｅｎｔ）効果を有する化合物を指す。ＣＰＣ’ｓには有害生物防除剤（パラクアト（メチルビオロゲン）、硫酸銅、メチダチオン）、抗−病原性化合物、例えば殺菌・殺カビ剤（クロロタロニル、２−チエニルアラニン）及びプロファンギサイド（ｐｒｏｆｕｎｇｉｃｉｄｅｓ）（オキシムカルバメート）又は昆虫の挙動の変調を担う化合物（フェロモン、アロモン及びカイロモン）が含まれ、除草剤は植物種に対して特異的又は全般的毒性を有する化合物を指す。典型的除草剤にはスルホニルウレア除草剤及びスルホンアニリド除草剤（クロルスルフロン、トリアスルフロン、メツルフロン−メチル）、オーキシン除草剤（例えばジカンバ、２−メチル−４−クロロフェノキシ酢酸、ピクロラム、クインクロラク、クインメラク）、発芽前除草剤（メツリブジン）ならびに発芽後除草剤（クレトジム、ペンジメタリン、オリザリン、ジチオピル、オキサジアゾン、プロジアミン及び２，４−ジクロロフェノキシ酢酸）の種類が含まれるがこれらに限られるわけではない。「スルホニルウレア除草剤」はスルホメツロンメチルのような酵素アセトラクテートシンターゼを阻害するＮ−（複素環式アミノカルボニル）−アリールスルホンアミド−含有除草性化合物として定義する。「スルホメツロンメチル」という用語は２−［［［［（４，６−ジメチル−２ −ピリミジニル）アミノ］カルボニル］アミノ］スルホニル］安息香酸、メチルエステル（ＣＡＳ登録番号７４２２２−９７−２）を指し、「ＳＭ」と省略する。「アセトラクテートシンターゼ」又は「ＡＬＳ」は分枝鎖状アミノ酸生合成を担う重要酵素である。「グリホセート」は「ＧＰ」と省略され、ＣＡＳ登録番号１０７１−８３−６を有し、その作用部位が植物アミノ酸合成における重要変換であるシキメートからアントラニレートへの転換を触媒する５−エノールピルビルシキメート−３− ホスフェートシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）である除草剤である。「チエニルアラニン−様活性」という用語はクロロタロニル、２−チエニルアラニンの殺菌・殺カビ活性を有する天然もしくは合成のいずれの物質も意味する。「グリホセート−様活性」という用語は５−エノールピルビルシキメート−３ −ホスフェートシンターゼ活性を妨害する天然もしくは合成のいずれの物質も意味する。「ＡＬＳ−阻害活性」という用語はアセトラクテートシンターゼの活性又はアセトラクテートシンターゼをコードする遺伝子の発現を阻害する天然もしくは合成のいずれの物質も意味する。「発光性リポーター遺伝子複合体」はその産物が発光を生ずるいずれのリポーター遺伝子も意味する。例にはバクテリアｌｕｘ遺伝子；例えばホタル（フォチヌス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓｐｙｒａｌｉｓ））又はこめつき虫（ピロフォルス・プラギオフタラムス（Ｐｙｒｏｐｈｏｒｕｓｐｌａｇｉｏｐｈｔｈａｌａｍｕｓ））からのルシフェラーゼ遺伝子（ｌｕｃ）；あるいはシーパンジー（ｓｅａｐａｎｓｙ）（レニラ・レニフォルミス（Ｒｅｎｉｌｌａｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ））からのルシフェラーゼをコードする遺伝子が含まれるがこれらに限られるわけではない。「作用部位」は特定のストレッサー又は生体異物化合物の巨大分子状標的を指す。典型的作用部位は特定の生合成経路における特異的酵素である。「プラスミド」、「ベクター」及び「カセット」という用語は、多くの場合、細胞の中心代謝の一部でない遺伝子を保有している余分の染色体要素を指し、通常、環状２本鎖ＤＮＡ分子の形態である。そのような要素は自律複製配列、ゲノム組込み配列、ファージもしくはヌクレオチド配列であることができ、線状もしくは環状であることができ、１本鎖もしくは２本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡのものであることができ、いずれの供給源から誘導されていることもでき、そこにおいては複数のヌレクオチド配列が独特の構築物に結合もしくは組み換えられており、それは選ばれた遺伝子産物のためのプロモーターフラグメント及びＤＮＡ配列を適した３’非翻訳配列と一緒に細胞中に導入することができる。「組込み体（ｉｎｔｅｇｒａｎｔ）」はその染色体中に異種遺伝子フラグメントが挿入されているバクテリア株を指す。「多重コピー」又は「マルチコピー」という用語は、それが生物における発現可能な遺伝子の存在に関する場合、細胞における遺伝子の正常な全量を越えるその遺伝子の複数のコピーを意味する。「形質転換」及び「トランスフェクション」という用語は核酸の導入の結果として細胞において新しい遺伝子を獲得することを指す。獲得する遺伝子は染色体ＤＮＡ中に組込むか又は染色体外複製配列として導入することができる。「形質転換株」は形質転換の産物を指す。「プロモーター」及び「プロモーター領域」という用語は、通常構造遺伝子のタンパク質コード配列の上流（５’）のＤＮＡの配列を指し、正しい部位で転写を開始させるのに必要なＲＮＡポリメラーゼ及び／又は他の因子の認識を与えることにより、コード領域の発現を制御する。プロモーター配列は遺伝子の発現を推進するために必要であるが、必ずしも十分ではない。「遺伝子毒性感受性プロモーター」はＤＮＡ損傷により活性化されるプロモーターを指す。これらのプロモーターの例にはｒｅｃＡ、ｕｖｒＡ、ｌｅｘＡ、ｕｍｕＤＶ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｓｕｌＡ、ｒｅｃＮ、ＵＶｒＤ、ｒｕｖ、ａｌｋＡ、ａｄａ、ｄｉｎＡ、ｄｉｎＢ、ｄｉｎＤ及びｄｉｎＦならびにＲｕｐｐによりＥ．ｃｏｌｉａｎｄＳａｌｍｏｎｅｌｌａ：ＣｅｌｌｕｌａｒａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ［Ｎｅｉｄｈａｒｄｔｅｔａｌ．，Ｅｄｓ．，ｐｐ１１９０−１２２０，ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９６））］において開示されたもののような適応応答レギュロン群のメンバーならびにＷａｌｋｅｒによりＥ．ｃｏｌｉａｎｄＳａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ：ＣｅｌｌｕｌａｒａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ［Ｎｅｉｄｈａｒｄｔｅｔａｌ．，Ｅｄｓ．，ｐｐ１４００ −１４１６，ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９６））］において開示されたＳＯＳレギュロン群のメンバーである他のプロモーターが含まれるがこれらに限られるわけではない。「フラグメント」は特定の領域のＤＮＡ配列の一部を構成する。「調節」及び「調節する」は、必ずではないが主に遺伝子の転写開始の上流（５’）に位置するＤＮＡ配列要素により制御される遺伝子発現のモジュレーションを指す。調節は刺激に対する「すべてかなしか（ａｌｌｏｒｎｏｎｅ）」の応答を生ずることができるかあるいはれそは遺伝子発現の程度における変動を生ずることができる。「操作可能的に結合した」という用語は、機能性ＲＮＡに転写されるための正しい配向及び読み枠におけるＤＮＡの２つのフラグメントの融合を指す。「発現」という用語は、遺伝子産物の配列をコードする遺伝子からの遺伝子産物への転写及び翻訳を指す。遺伝子の発現においては、遺伝子産物の配列をコードするＤＮＡ鎖が最初に相補的ＲＮＡに転写され、それは多くの場合にメッセンジャーＲＮＡであり、次いで遺伝子産物がタンパク質である場合、かくして転写されたメッセンジャーＲＮＡが上記の遺伝子産物に翻訳される。「高められた発現」は、模擬−処理された培養物において見られる発現より大きい遺伝子発現を指す。ｌｕｘ遺伝子融合体の場合、高められた発現は背景レベルを越える生物発光の増加により示され、それは転写及び続く翻訳の増加を許す一時的遅延を特徴とする。「ストレッサー」又は「攻撃物（ｉｎｓｕｌｔ）」という用語は、生物の最適以下の生育を生ずる化学的因子もしくは物理的処理を指す。ストレッサーは化学品（例えば除草剤、作物保護化学品、環境汚染物、重金属）、物理的処理、例えば温度の変化、ｐＨの変化、酸化的損傷もしくはＤＮＡ損傷（ＵＶ露出からなど）を与える因子、嫌気的生活、バクテリア培養物中への他の生命体（ウィルス、バクテリアなど）の導入などの生物学的攻撃あるいは栄養素利用性の変化を含み得るがこれらに限られるわけではない。さらにストレッサーは天然に存在する化合物、例えばＬ−バリン、ガラクトース−ホスフェート、２−ケトブチレートを含み得る。「ストレッサー標的」は特異的ストレッサーにより阻害される特異的巨大分子状標的を意味する。「生体異物化合物」及び「生体異物化学品」という用語は、自然には典型的に存在しないいずれのストレッサー化学品も指す。本発明において問題の典型的生体内異物には除草剤、有害生物防除剤、殺菌・殺カビ剤として有用なもの又は特定の代謝的作用部位を妨害することができる他の生体内異物が含まれる。「生物発光」という用語は生物からの発光の現象を指す。「生物発光に関して陽性の表現型」はｌｕｘ遺伝子融合体を含有する検出細胞による発光の増加を示す表現型を指す。「ベースライン発光」という用語は、ストレスなしの代謝状態における生物発光に関して陽性の表現型を有する細胞により発せられる光の放射量を意味する。「ｌｕｘ遺伝子複合体」という用語はｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ及びｌｕｘＥを含み、バクテリア生物発光の現象を担うｌｕｘ構造遺伝子を指す。ｌｕｘ遺伝子複合体は共同して作用するそれぞれのｌｕｘ遺伝子のすべてを含み得るかあるいは、ｌｕｘＡ及びｌｕｘＢが複合体の一部であれば、ｌｕｘ構造遺伝子のいずれかの小組を含むことができる。「遺伝子融合体」は、特定のポリペプチドをコードする少なくとも１つの構造遺伝子配列に融合した転写に必須の調節シグナル（プロモーターと呼ばれる）を含む混成ＤＮＡフラグメントである。「ｌｕｘ遺伝子融合体」という用語はｌｕｘ遺伝子複合体と適したストレッサー−感受性プロモーターの融合体を意味する。「ｒｅｃＡ−ＬｕｘＣＤＡＢＥ」はバクテリアＬｕｘ遺伝子複合体に融合した遺伝子毒性感受性プロモーターｒｅｃＡの特定の融合体を指す。「ｉｌｖＢＮ」という用語は、ヘテロ四量体（ｈｅｔｅｒｏｔｅｔｒａｍｅｒｉｃ）ＡＬＳＩ−ＥＣ４．１．３．１８のそれぞれ大及び小サブユニットをコードする構造遺伝子を指す。「ｉｌｖＧＭ」という用語は、ヘテロ四量体ＡＬＳＩＩ−ＥＣ４．１．３．１８のそれぞれ大及び小サブユニットをコードする構造遺伝子を指す。ｉｌｖＧＭはｉｌｖＢ遺伝子の一部が欠失する突然変異であるＥ．コリＫ−１２△ｉｌｖＢにおいて潜在性である。「ｉｌｖＩＨ」という用語は、ヘテロ四量体ＡＬＳＩＩＩ−ＥＣ４．１．３．１８のそれぞれ大及び小サブユニットをコードする構造遺伝子を指す。ｉｌｖＩＨはサルモネラ・チフィムリウムの実験室株において潜在性である。「ｐｈｅＡ」という用語はコリスメートムターゼ（ＥＣ５．４．９９．５）及びプレフェネートデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．５１）活性を示す２機能性（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）ポリペプチドをコードする構造遺伝子を指す。「ｒｅｌＡ」という用語はＡＴＰ：ＧＴＰ３’−ピロホスホトランスフェラーゼＩ−ＥＣ２．７．６．５をコードする構造遺伝子を指す。「ｓｐｏＴ」という用語はＡＴＰ：ＧＴＰ３’−ピロホスホトランスフェラーゼＩＩ−ＥＣ２．７．６．５をコードする構造遺伝子を指す。「ａｒｏＡ−」という用語はエノールピルビルシキメートホスフェートシンターゼ−ＥＣ２．５．１．１９をコードする構造遺伝子を指す。「ａｒｏＨ−」という用語はＤＨＡＰ（トリプトファン抑制性及びフィードバック阻害性）シンターゼ−ＥＣ４．１．２．１５をコードする構造遺伝子を指す。「ｔｏｌＣ＋」という用語は、多様な膜トランスロカーゼによりポンプ輸送で出される多くの生体内異物の流出に必要な外膜ポーリンをコードする構造遺伝子を指す。「ｇｌｋ−」という用語はグルコキナーゼ−ＥＣ２．７．１．２をコードする構造遺伝子を指す。「検出生物」、「検出バクテリア」及び「検出細胞」という用語は、発光性リポーター遺伝子もしくは遺伝子複合体に融合した遺伝子毒性−感受性プロモーターを含む遺伝子融合体を含有する生物を指す。検出細胞の「非−生物発光性親」という用語は、発光性遺伝子カセットが導入されていないバクテリア株である。「遺伝子滴定」は巨大分子状標的がストレッサーの作用を克服する点までその量が高められるような微生物の遺伝子構成の改変を指す。本発明の範囲内で、遺伝子滴定は化合物の生物化学的標的に関するスクリーニングの方法を含み、その方法では宿主生物を適したゲノムライブラリを用いてトランスフェクションし、形質転換株を化合物の存在下における生育に関してスクリーニングし、化合物に対する耐性を保有しているライブラリの部分を単離し、同定する。「栄養復帰」はストレッサーと接触した培養物に栄養素を添加し、培養物の生物学的生産量が未挑戦のレベルまで回復することを指す。「栄養素」は生物化学的経路の最終的産物又は経路の最終的産物に容易に転換される化合物を指す。典型的栄養素はアミノ酸、ビタミン、塩基もしくは糖である。ビタミンは容易に経路の最終的産物である補因子に転換され；同様に塩基はヌクレオチド三リン酸に生体内で容易に変換される。「オキサノグラフィ」という用語は、Ｄａｖｉｓ，Ｒ．Ｗ．，Ｄ．ＢｏｔｓｔｅｉｎＡｎｄＪ．Ｒ．Ｒｏｔｈ．ＡＭａｎｕａｌＦｏｒＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：ＡｄｖａｎｃｅｄＢａｃｔｅｒｉａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ．Ｘ＋２５４ｐ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ：ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８０に記載されているように、微生物において遮断されている経路の決定のための栄養素プールの診断的及び系統的投与を意味する。「相対的光単位」という用語は「ＲＬＵ」と省略され、ルミノメーターにより測定され、用いられているルミノメーターに独特の内部標準に対してキャリブレーションされる発光の測定値を指す。検出細胞及び非生物発光性株本発明において適した宿主細胞にはｌｕｘ遺伝子融合体を発現することができるいずれの細胞も含まれ、ここで原核細胞が好ましく、腸内の種類のバクテリアのメンバーが最も好ましい。腸内バクテリアは腸内細菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）科のメンバーであり、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ及びシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）などのメンバーが含まれる。それらはグラム−陰性桿菌であり、０．３〜１．０Ｘ１．０〜６．０ｍｍであり、周毛性鞭毛（ｐｅｒｉｔｒｉｃｈｏｕｓｆｌａｇｅｌｌａ）により運動性であるか（タツメラ（Ｔａｔｕｍｅｌｌａ）を除く）あるいは非運動性である。それらは酸素の存在下又は不在下で生育し、ペプトン、肉汁及び（通常）ＭａｃＣｏｎｋｅｙの培地上で良く生育する。いくつかは唯一の炭素源としてのＤ−グルコース上で生育するが、いくつかはビタミン及び／又はミネラルを必要とする。それらは呼吸及び発酵代謝を有して化学合成有機力源性であるが好塩性ではない。Ｄ−グルコース、他の炭水化物及びポリヒドロキシアルコールの発酵の間に酸及び多くの場合に可視の気体が生ずる。それらはオキシダーゼに関して陰性であり、シゲラ・ジセンテリアエ０群１（ｓｈｉｇｅｌｌａｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ０ｇｒｏｕｐｌ）及びキセノラブズス・ネマトフイルス（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ）を除き、カタラーゼに関して陽性である。硝酸塩は亜硝酸塩に還元される（エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）及びエルシナ（Ｙｅｒｓｉｎａ）のいくつかの株による場合を除く）。ＤＮＡのＧ＋Ｃ含有率は３８〜６０モル％である（Ｔ_m、Ｂｄ）。ほとんどの属内の種からのＤＮＡは少なくとも２０％互いにそしてその科の基準種であるエシェリキア・コリに関連している。顕著な例外はエルシナ、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、プロピデニカ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｉｃａ）、ハフニア（Ｈａｆｎｉａ）及びエドワルドシエラ（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ）の種であり、そのＤＮＡは他の属からの種のＤＮＡに１０〜２０％関連している。エルウィニア・クリサンテミ（Ｅｒｗｉｎｉａｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）を除き、調べられたすべての種は腸内バクテリアの共通の抗原を含有する（Ｂｅｒｇｙ’ｓＭａｎｕａｌｏｆＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｄ．Ｈ．Ｂｅｒｇｙｅｔａｌ．，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ：ＷｉｌｌｉａｍｓａｎｄＷｉｌｋｉｎｓ，１９８４）。本発明において特に有用なのはＥ．コリならびにサルモネラ属及びｒｅｃＡ遺伝子及びその上流のプロモーター領域が同定されている腸内細菌（ｅｎｔｅｒｉｃｓ）の膜である。膜突然変異本発明の宿主細胞は場合によりスクリーニング法を容易にするであろう突然変異を含んでいることができる。化学品の影響を調べるために用いるのに適したバクテリア株は、その生育がその化学品により影響されるバクテリアである。したがって問題の化学品は細胞に入り、細胞中に保持され、細胞機械（ｃｅｌｌｕｌａｒｍａｃｈｉｎｅｒｙ）の標的分子と相互作用できなければならない。細胞内への透過及びその内における堆積に影響するためのＥ．コリの種々の突然変異が既知である。ｒｆａ（Ａｍｅｓ，Ｂ．Ｎ．，Ｆ．Ｄ．Ｌｅｅ，ａｎｄＷ．Ｅ．Ｄｕｒｓｔｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７０（３）：ｐ．７８２−７８６（１９７３））、ｅｎｖＡ（Ｙｏｕｎｇ，Ｋ．ａｎｄＬ．Ｌ．Ｓｉｌｖｅｒ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７３：ｐ．３６０９−３６１４（１９９１））、ｉｍｐ（Ｓａｍｐｓｏｎ，Ｂ．Ａ．，Ｒ．Ｍｉｓｒａ，ａｎｄＳ．Ｂｅｎｓｏｎ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２２：ｐ．４９１−５０１（１９８９））、ｌｐｐ，（Ｇｉａｍ，Ｃ．Ｚ．，Ｓ．Ｈａｙａｓｈｉ，ａｎｄＨ．Ｃ．Ｗｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，（２５９）：ｐ．５６０１−５６０５，（１９８４））又はｓｕｒＡ（Ｔｏｒｍｏ，Ａ．，Ｍ．Ａｌｍｉｒｏｎ，ａｎｄＲ．Ｋｏｌｔｅｒ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，（１７２）：ｐ．４３３９−４３４７，（１９９０））の突然変異対立遺伝子を保有する株は多様な化学品に対する感受性が向上している。ｅｍｒ（Ｍａ，Ｄ．，ｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１６：ｐ．４５−５５，（１９９５））又はａｃｒＡＢ（Ｐａｕｌｓｅｎ，Ｉ．Ｔ．，ｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏ．，１９：ｐ．１１６７−１１７５，（１９９６））などの突然変異を用いる流出ポンプの破壊あるいはｔｏｌＣ（Ｓｃｈｎａｉｔｍａｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２（９），ｐｐ５５１１−５５１３，（１９９０））などの突然変異を用いるそれが用いるチャンネルの破壊も化学品感受性を向上させる。さらに、ゲノミックス（ｇｅｎｏｍｉｃｓ）と結合した遺伝子滴定はそのような増感突然変異の同定法の開発を可能にし、次いでそれを適した検出細胞バックグラウンドに組込むことができることも意図されている。いくつかの場合、化学品の標的巨大分子はその化学品の作用に対して本質的に耐性であり得る。例えばＥ．コリは酵素アセトラクテートシンターゼの２つのイソ酵素を有し、その１つはスルホニルウレア除草剤に対する結合親和性が低い。耐性イソ酵素をコードするｉｌｖＢＮの機能を破壊する突然変異は、アセトラクテートシンターゼを標的とするスルホニルウレアによる生育阻害に対する受け易さが非常に向上した株を生ずる（ＬａＲｏｓｓａ，Ｒ．Ａ．ａｎｄＤ．Ｒ．Ｓｍｕｌｓｋｉ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６０：ｐ．３９１−３９４，（１９８４））。Ｅ．コリ又は他のバクテリアの適した宿主株を既知の突然変異又は突然変異の組み合わせを保有するように構築することができる。さらに、トランスポゾン挿入あるいは化学的又は物理的処理による突然変異誘発に続く生育阻害に関するスクリーニングにより、適切に感受性の株を見いだすこともできる。ストレス感受性を与える突然変異本発明の検出細胞は場合により、それに関してスクリーニングされるべき特定のストレスに対する感受性を運ぶであろう突然変異を含んでいることができる。例えばｒｅｌＡ突然変異は細胞がアミノ酸欠乏に応答するのを妨げる。ストレス感受性において有用な他の突然変異には、例えば種々の抗ガン剤及び酸化的ストレスを引き起こす化合物に対する感受性を生ずる突然変異が含まれる。多くの抗ガン剤はＤＮＡ複製を妨害し、酸化的ストレスを引き起こす化合物は作物の菌・カビ性病原体及び人間もしくは動物のバクテリア性病原体の抑制において有用であり得ることが既知である。ｃｙａ、ｃｒｐ、ｓｐＯＴ、ａｒｃＡＢ、ｅｎｖＺ、ｏｍｐＲ、ｍａｒＲ、ｅａｒＡＢ、ｆｕｒ、ｏｘｒＧ、ｆｒｕＲ、ｒｐｏＳ、ｒｐｏＥ、ｃｒｅＢ、ｃｒｅＣ、ｇｌｎＧ、ｇｌｎＬ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＦ、ｐｈｏＢ、ｐｈｏＰ、ｐｈｏＱ、ｐｈｏＲ、ｐｈｏＵ、ｒｐｏＨ、ｌｅｘＡ、ｒｅｃＡ、ｌｒｐ、ｓｏｘＲＳ、ｏｘｙＲ、ｆｎｒ、ａｔｂＲ、ａｄａ及びｒｅｌＡから成る群より選ばれる突然変異遺伝子を含むがこれらに限られないストレスに対する感受性を運んでいる遺伝子における突然変異が好ましく、ここでｒｅｌＡ突然変異が最も好ましい。さらに遺伝子滴定は調節遺伝子に関する予期せぬ役割を示すことができる。そのような発見は、調節遺伝子座の不活性化と組み合わされてセンサー株を最適化することができる。本発明の範囲内で、株は一般にスルホニルウレア除草剤に感受性の１つのＡＬＳ（Ｉ又はＩＩＩ）のみが発現されるような突然変異を含んだ。そのような感受性の宿主は標準的トランスポゾン、化学品（例えばＨＮＯ₂及びＮＨ₂ＯＨ）、ＵＶ、挿入色素（例えばアクリジン色素）又は他の突然変異誘発案が適した過感受性突然変異を発せしめた後に野生型からスクリーニングすることができるかあるいは一緒になって所望の感受性を与える突然変異を組み合わせることにより構築することができる。突然変異誘発の方法の概覧に関し、例えばＴｈｏｍａｓＤ．ＢｒｏｃｋｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ＡＴｅｘｔｂｏｏｋｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ（１９８９）ＳｉｎａｕｅｒＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ．ＳｔｒｅｓｓＳｅｎｓｉｔｉｖｅＲｅｐｏｒｔｅｒ：ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉａｎｄＳａｌｍｏｎｅｌｌａ；ＣｅｌｌｕｌａｒａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（Ｎｉｅｄｈａｒｄｔｅｔａｌ．Ｅｄｓ．，ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９６））］を参照されたい。本発明の検出細胞は場合により、スクリーニングされるべきストレッサー化合物の特に望ましい又は望ましくない特性の検出のためのストレス−感受性リポーターを含んでいることもできる。典型的に、ストレス−感受性リポーターは適したリポーター要素に操作可能的に結合されたストレス−感受性プロモーターを含む。所望の特定の検出細胞内で発現が可能なようにプロモーターを選ばなければならない。典型的にバクテリア検出細胞の場合、プロモーターはストレス−誘導可能なバクテリアプロモーターから選ばれるであろう。本発明において適したストレス− 誘導可能なプロモーターの例は、化学品、環境汚染物、重金属、生体内異物、温度の変化、ｐＨの変化ならびに酸化的損傷、ＤＮＡ損傷、嫌気的生活、硝酸塩利用性の変化又は発病を生ぜしめる作用物質に応答性のものである。適したバクテリアストレス−プロモーターの特定の例には熱ショック遺伝子のようなタンパク質損傷に感受性のもの（ｇｒｐＥ、ｄｎａＫ、ｌｏｎ、ｒｐｏＤ、ｇｒｏＥＳＬ、ｌｙｓＵ、ｈｔｐＥ、ｈｔｐＧ、ｈｔｐＩ、ｈｔｐＫ、ｃｌｐＰ、ｃｌｐＢ、ｈｔｐＮ、ｈｔｐＯ及びｈｔｐＸ）、ＳＯＳ調節回路により制御されるもののようなＤＮＡ損傷に感受性のもの（ｒｅｃＡ、ｕｖｒＡ、ｌｅｘＡ、ｕｍｕＤＣ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｓｕｌＡ、ｒｅｃＮ、ｕｖｒＤ、ｒｕｖ、ｄｉｎＡ、ｄｉｎＢ、ｄｉｎＤ及びｄｉｎＦ）、酸化的損傷に感受性のもの（ｋａｔＧ、ａｈｐ、ｍｉｃＦ、ｓｏｄＡ、ｎｆｏ、ｚｗｆ及びｓｏｉ）、膜損傷に感受性のもの（ｆａｂＡ）、アミノ酸欠乏及びｒｅｌＡもしくはｓｐｏＴ調節遺伝子の制御下に感受性のもの（ｈｉｓ、ｉｌｖＢＮ、ｉｌｖＧＭＥＤ及びｔｈｒＡＢＣ）、炭素欠乏及びｃｙａ及びｃｒｐ調節遺伝子の制御下に感受性のもの（ｌａｃ、ｍａｌ及びｇａｌ）、ｐｈｏＢ、ｐｈｏＭ、ｐｈｏＲ及びｐｈｏＵ調節遺伝子の制御下でホスフェート欠乏に感受性のもの（ｐｈｏＡ、ｐｈｏＢＲ、ｐｈｏＥ、ｐｈｏＳ、ａｐｈＡ、ｈｉｍＡ、ｐｅｐＮ、ｕｇｐＡＢ、ｐｓｉＤ、ｐｓｉＥ、ｐｓｉＦ、ｐｓｉＫ、ｐｓｉＧ、ｐｓｉＩ、ｐｓｉＪ、ｐｓｉＮ、ｐｓｉＲ、ｐｓｉＨ、ｐｈｉＬ、ｐｈｉＯａｒａ、ｔｎａ、ｄｓｄ及びｈｕｔ）ならびにｇｌｎＢ、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＧ及びｇｌｎＬ調節遺伝子の制御下で窒素欠乏に感受性のもの（ｇｌｎＡ及びｈｕｔ）が含まれるがこれらに限られるわけではない。本発明の範囲内で好ましいのはＳＯＳ調節回路の制御下における遺伝子毒性又はＤＮＡ損傷に感受性のストレス−誘導可能なプロモーターであり、ｒｅｃＡ遺伝子が最も好ましい。ストレス誘導可能なプロモーターへの融合に適したリポーター遺伝子はそのようなプロモーターの制御下にあり、検出可能なシグナルを発することができる構造遺伝子である。ｌａｃＺ、ｇａｌＫ、ｘｙｌＥ、ｌｕｃ、ｌｕｘＡＢ、ｌｕｘＣＤＡＢＥ、ｐｈｏＡ、ｕｉｄＡ（ＧＵＳ）、ｃａｔ、ｎｐｔ−ＩＩ、ＳＵＣ２及びユビキチンなどの多くのバクテリアリポーターが当該技術分野において既知である（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．，ＡＳｈｏｒｔＣｏｕｒｓｅｉｎＢａｃｔｅｒｉａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ｐｐ．６３−６７）。本発明において特に有用なのは、バクテリアｌｕｘ遺伝子；例えばホタル、フォチヌス・ピラリス又はこめつき虫、ピロフォルス・プラギオフタラムスからのルシフェラーゼ遺伝子（ｌｕｃ）；あるいはシーパンジー、レニラ・レニフォルミスからのルシフェラーゼをコードする遺伝子を含むがこれらに限られない生物発光性リポーター遺伝子である。ｌｕｘ遺伝子複合体を含むｐＣＧＬＳ１プラスミドから得られるプロモーターなしのフォトラブズス・ルミネセンスｌｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子複合体は、その遺伝子産物が広範囲の温度下でＥ．コリにおいて良く機能するので、最も好ましい。この複合体はＲｏｓｓｏｎ，Ｒ．Ａ．，によりＰＣＴ国際出願ＷＯ９３／０３１７９（１９９３）において十分に記載されている。ｌｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子複合体により生ずるバクテリア生物発光は、５つの構造遺伝子（ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ及びｌｕｘＥ）の産物が共同して働いて光を発する現象である。ｌｕｘＤ産物は前駆体から１４炭素脂肪酸を生成する。１４炭素脂肪酸はＡＴＰ依存性反応においてｌｕｘＥ産物の作用を介してアシルー酵素共役体に活性化され、それがバクテリア生物発光を細胞エネルギー状態に結び付ける。アシルー酵素（ｌｕｘＥ産物）は転移因子（ｔｒａｎｓｆｅｒａｇｅｎｔ）として働き、アシル基をｌｕｘＣ産物に与える。アシル−ＬｕｘＣ２成分複合体は次いでＮＡＤＰＨがアシル共役体をＣ¹⁴アルデヒドに還元する電子対及びプロトン供与体として働く反応において還元される。この反応は細胞の還元力をバクテリア発光に結び付ける。ルシフェラーゼ（ｌｕｘＡ及びｌｕｘＢの産物）により触媒される発光反応が光を生む。発光のエネルギーはアルデヒドから脂肪酸への転換ならびに発光と細胞エネルギー状態の間の別の連鎖を与えるＦＭＮＨ₂酸化により与えられる。ｌｕｘＣＤＡＢＥの有効性はこれらの遺伝子のタンパク質産物の本質的熱不安定性により制限される。このリポーター系の温度条件は、限定された培地でバクテリアを急速に生育する必要性との一致を制限してきた。出願人等は所望の温度範囲（２８〜４２℃）で機能することができるタンパク質産物をコードするｌｕｘＣＤＡＢＥを用いることにより、この問題を解決した。所望の特定の作用部位スクリーニングに有用な特定の遺伝子型をそれぞれ有する多数の株を操作した。株の構築を図１に概説し、遺伝子型を一般的方法の中の表１にまとめる。ｒｅｃＡ−Ｌｕｘ−ＣＤＡＢＥ遺伝子融合体を含有するように操作されたすべての株が検出細胞として機能した。検出細胞は遺伝子融合体のみを含有していることができるかあるいは場合により膜透過性又はストレッサー感受性に影響する他の突然変異を有することができる。有用な株はｉｌｖＢ、ｒｅｌＡ、ｔｏｌＣ、ｉｇｍ、ｓｐｏＴ及びｉｌｖＧ遺伝子の発現又は抑制が有用な検出細胞を与えるために用いられた場合を含んで多様な遺伝子型を有する。株の構築の方法は当該技術分野において周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ．ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（１９８９）；ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉａｎｄＳａｌｍｏｎｅｌｌａ；ＣｅｌｌｕｌａｒａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（Ｎｉｅｄｈａｒｄｔｅｔａｌ．Ｅｄｓ．，ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９６））］において十分に議論された分子生物学及び微生物学の基本的要素を用いている。培養条件：典型的に細胞は適した培地中で３７℃において生育させる。本発明において好ましい生育培地はＶｏｇｅｌ−Ｂｏｎｎｅｒ培地（Ｄａｖｉｓｅｔａｌ．，ＡｄｖａｎｃｅｄＢａｃｔｅｒｉａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ，（１９８０），ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ：ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）などの通常の規定培地である。他の規定又は合成生育培地を用いることもでき、特定の微生物の生育に適した培地は微生物学又は発酵科学の技術分野における熟練者にわかるであろう。いくつかの場合にはＮＢ（栄養ブイヨン）などの濃厚又は完全培地を用いる。バクテリア生育に適したｐＨ範囲はｐＨ５．０〜ｐＨ９．０であり、ｐＨ６．０〜ｐＨ８．０が初期条件として好ましい。液体培地中におけるバクテリア細胞の生育は、初期対数期、中期対数期、後期対数期又は定常期などの種々の生育期において均一な細胞集団にストレスを与えることを可能にする。ストレスは細胞攻撃物又はストレッサーへの暴露の結果として細胞に生ずる状態である。この細胞ストレスは、バクテリア細胞又は細胞集団における正常な細胞代謝の改変を生ずるいずれの物質又は細胞環境の変化によっても引き起こすことができる。除草剤、作物保護化学品、環境汚染物又は重金属などの化学品の生育培地への添加はそのようなストレスを引き起こすことができる。さらに温度の変化、ｐＨの変化、酸化的損傷又はＤＮＡ損傷（例えばＵＶ暴露から）を生む因子、嫌気的生活あるいは硝酸塩利用性の変化は同様にストレスを引き起こし得る攻撃物である。ストレッサー生体内異物及び作物保護化学品本方法は多様な生体異物化学品そして特に作物保護化学品として有用な化合物に関する作用部位を同定するために有用である。本方法はスルホニルウレア除草剤、例えばスルホメツロンメチル、グリホセート、原殺菌・殺カビ剤、例えばオキシムカルバメート、オキシダント、例えばメチルビオロゲン（パラクアト）、ホルモン性除草剤、例えば２，４−ジクロロフェノキシ酢酸ならびに殺菌・殺カビ剤、例えば２−チエニルアラニンから選ばれるがこれらに限られない化合物の作用部位の決定のために有用である。バクテリア代謝に負の影響を与えるいずれの化学品もこの方法で分析することができる。かくして抗バクテリア剤のみでなく、抗ウィルス剤、抗ガン剤、防腐剤、殺菌剤及び作物保護化学品も本発明を用いて分析することができ、それは多くのそのような化合物の作用部位が多くの場合にバクテリア及び標的生物が共有する酵素又は補因子だからである。さらにその堆積が不利益である正常な代謝の産物をこれらの方法を用いて分析することができる。作用部位スクリーニング本方法による種々のストレッサー及び生体異物化合物の作用部位の決定は栄養復帰及び遺伝子滴定の相補的スクリーニングを用いて行われる。栄養復帰上記で限定した培地は野生型Ｅ．コリの生育に必要且つ十分な栄養素（無機化合物及び炭素源）を与える。Ｅ．コリ検出細胞（ｒｅｃＡ−Ｌｕｘ遺伝子融合体を含む）はこれらの培地中で生育し、栄養素を細胞生育及び代謝に必要な有機化学品に転換する。ストレッサー化学品が生合成過程の１つを妨害すると、細胞の代謝及び培養物の生物発光が減少するか又は排除されるであろう。栄養復帰の本方法は、最初にｒｅｃＡ−ＬＵＸ遺伝子融合体を含有する検出生物の生物発光を抑制する能力に関して化合物をスクリーニングすることを含む。次に培養物のパネルを、どの栄養素が生物発光抑制からの復帰により示される通り生育阻害から復帰させるかにつき調べることを始める。この基準を満たすストレッサー化学品を栄養的に復帰されたと定義する。ストレッサー化学品により影響される特定の経路を次いでオキサノグラフィ試験により決定する。同定された経路からの生合成中間体を補足してどの中間体が生物発光の抑制を取り除くかを決定することを用い、経路内の標的を限定することができる。非−経路栄養素（ｎｏｎ−ｐａｔｈｗａｙｎｕｔｒｉｅｎｔｓ）による調節（両方ともＢｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆＢｒａｎｃｈｅｄＣｈａｉｎＡｍｉｎｏＡｃｉｄｓ，Ｂａｒａｋｅｔａｌ．，ｅｄｓ．ＢａｌａｂａｎＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，ＦＲＧ，１９９０におけるＶａｎＤｙｋａｎｄＬａＲｏｓｓａ，ｐｐ．１２３−１３０及びＬａＲｏｓｓａｅｔａｌ．，ｐｐ１０９−１２１）もストレッサー化学品の巨大分子状標的の限定を助けることができる。遺伝子滴定遺伝子滴定案は、巨大分子状標的の細胞内濃度を正常に見られる濃度より高く増加させることにより、化学的ストレッサーの作用を克服できるということに基づいている。この方法で阻害剤の作用は滴定して排除され、通常は野生型の生育を阻害する条件下で細胞が生育する。巨大分子状標的の増加の方法は遺伝子重複の選択を介する（例えばＡｎｄｅｒｓｏｎａｎｄＲｏｔｈ，ＡｎｎＲｅｖＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３１：４７３−５０５（１９７７）；Ｗａｈｌｅｔａｌ．，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，２５４：８６７９−８９（１９７９），Ａｌｔｅｔａｌ．，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，２５３：１３５７−７０）又は高レベル構成的調節突然変異株の選択を介する（Ｒｏｔｈｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２：３０５−３２３（１９６６）；Ｈａｒｔｍａｎ，Ａｍｅｓ，ＡｎｔｏｎＹａｎｏｆｓｋｙＣａｌｖｏｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．９７：１２７２−１２８２（１９６９），Ｃａｌｖｏｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，６１：７７７−７８７（１９６９））ものであることができる。しかしながらこれらの方法は、過剰発現された遺伝子産物の限定のために幾分か骨の折れる分析に導く。好ましい態様は酵母においてＦａｌｃｏ［ＦａｌｃｏａｎｄＤｕｍａｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１０９：２１−３５（１９８５）］及びＲｉｎｅ［Ｒｉｎｅｅｔａｌ．，ＰＮＡＳＵＳＡ８０：６７５０−６７５４（１９８３）］により開発されたものであり、その方法では（ａ）高コピー数自立複製性プラスミドにおけるゲノムライブラリの構築及び（ｂ）そのようなプラスミドライブラリを適した宿主株中に導入してメロ−マルチポイド（ｍｅｒｏ−ｍｕｌｔｉｐｏｉｄｓ）のカタログを作る［ＬａＲｏｓｓａ，（１９９６），ｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉａｎｄＳａｌｍｏｎｅｌｌａ；ＣｅｌｌｕｌａｒａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（Ｎｉｅｄｈａｒｄｔｅｔａｌ．Ｅｄｓ．，ｐｐ１４００−１４１６，ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９６））］ことにより遺伝子増幅を生ぜしめる。次の段階で（ｃ）化合物のＭＩＣ（最小阻止濃度）以上で生育するコロニーに関する選択により化学的ストレッサーに対する耐性を与えるメロマルチプロイド(meromultiploids)を同定する。そのような方法は最近Ｅ．コリに拡張された（ＣｈａｔｔｅｒｊｅｅａｎｄＳｔｅｒｎｂｅｒｇ，ＰＮＡＳＵＳＡ９２：８９５０−８９５４（１９９５））。部分的ゲノム増幅による阻害剤作用の妨害栄養復帰及び遺伝子滴定の方法の他に、本検出細胞を阻害剤作用の妨害に基づく化合物の同定に用い得ることが意図されている。例えば本出願は、アンピシリン耐性に関して選択する形質転換により生物発光性又は他のテスター株中にチエニルアラニンに対する生育耐性を与えると思われるか又はそれが知られているいくつかのゲノムフラグメントを導入することを例示している。得られる生物発光性株を、挿入片のないマルチコピープラスミドベクターを形質転換に用いた負の標準と一緒に種々の濃度のチエニルアラニンに暴露し、生物発光対時間の動力学的プロットを得る（実施例９）。実施例９に示す通り、クローンｏ２４５ｙｇａＨは最高度のチエニルアラニンからの保護を与えるが他のクローンは中程度の耐性を与える。この実施例から（ａ）試験において単にチエニルアラニンを他の化合物で置き換えることにより交差耐性を見いだすことができること（事実、ディスク拡散アッセイ（ｄｉｓｋｄｉｆｆｕｓｉｏｎａｓｓａｙｓ）は表１２に同定されるものを含むいくつかの他のアミノ酸類似体に対する、ｏ２４５、ｙｇａＨにより与えられた交差耐性を明らかにした）ならびに；（ｂ）多重コピーにおいて特定の標的特定遺伝子が阻害剤耐性を与えるかどうかを調べることにより、特定の標的を攻撃する他の化学品を同定できることが明らかである。この方法でアセトラクテートシンターゼの新しい阻害剤が明らかにされた）。膜改変他の態様において、本検出細胞を変更して分裂した膜タンパク質を導入することができ、それを今度は特定の生物学的活性を有する化合物の同定に利用できることが意図されている。例えばＳＭを用いる遺伝子滴定はｔｏｌＣを耐性決定因子として同定した。同様にＧＰを用いる滴定はｙｈｈＴＳを、チエニルアラニンはｏ２４５ｙｇａＨを、アシビシンはｙｅｄＡをそしてマイトマイシンＣはｍｄｆＡを耐性決定因子として認識した（実施例７〜９）。これらの遺伝子のそれぞれは推定膜タンパク質をコードする。これらのクローニングされた遺伝子の分裂及び分裂物のＥ．コリ染色体中への導入を不当な（ｕｎｄｏ）実験なしで標準的方法により成し得ることは自明のことである。そのような分裂物の有効性は光の放射量を２分の１に減少させる用量を決定する生物発光アッセイにより容易に評価することができる。これらの分裂した遺伝子は多数の感受性バイオアッセイ（ａｐｌｅｔｈｏｒａｏｆｓｅｎｓｉｔｉｖｅｂｉｏａｓｓａｙｓ）に有用であろう。好ましい態様の議論本方法の好ましい態様を図２に示す。ｒｅｃＡ−ｌｕｘＣＤＡＢＥ融合体及びｒｅｌＡ突然変異（アミノ酸欠乏への細胞の応答を阻害する）を有する検出生物（１）を作物保護活性に関してスクリーニングされるべき１組の化合物（ストレッサー）（２）に暴露する。検出細胞からの光を増加させる化合物を遺伝子毒性として捨てる。細胞生育を遅くするが光を増加させない化合物を栄養復帰スクリーニング又は遺伝子滴定スクリーニングに供し、化合物の作用部位を決定する。栄養復帰を用いる場合、検出細胞を多数の異なる栄養素プールが補充された最少培地中で生育させ、各プールは異なる栄養素の混合物（３）から成る。代謝阻害からの復帰に必要なアミノ酸を供給するプールを生物発光性遺伝子融合体による発光の回復により検出する（４）。熟練者はゲノミックスにおける進歩が複数の関連態様を可能にすることがわかるであろう。例えば前節で記載した検出生物中に、順に並べられた（ｏｒｄｅｒｅｄ）重複高コピー数プラスミドの組を、それぞれがＥ．コリ染色体の異なるセグメントを含有するように置く。得られる株のこの組を化学的ストレッサーの遺伝子滴定スクリーニングで用い、増幅すると生物発光の放射量を阻害されないレベルに回復させる染色体領域を同定することができる。かくして遺伝子滴定を別の選択及びスクリーニング様式において行うことができる。他の態様の場合、標準的方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、同上）に従ってキメラを用いて適した宿主を形質転換することによりｒｅｃＡ−ＬＵＸ遺伝子融合体を含有する検出細胞を構築した。形質転換株はｉｌｖＢ、ｒｅｌＡ及びｔｏｌＣを含む多様な突然変異を有した。これらの突然変異の１つ又はそれより多くを含有するように検出細胞を構築した。これらの検出細胞は種々の生体内異物への暴露により変更されるベースライン発光を発した。細胞をマイトマイシンＣに暴露することにより、遺伝子毒性因子への検出細胞の感受性を調べた。中程度の量（ｔｏｌＣ⁺株の場合０．３〜２０ｕｇ／ｍＬ、ｔｏｌＣ誘導体の場合０．３〜１．２５ｕｇ／ｍＬ）のマイトマイシンＣはベースライン発光の増加を生じた。多量（ｔｏｌＣ株における＞２．５ｕｇ／ｍＬ）のマイトマイシンＣは発光の減少を生じた（図４及び５）。多様な突然変異を含有する検出細胞を４種類の除草剤（ＳＭ、ＭＶ、ＧＰ及び２，４−Ｄ）で処理し、検出細胞の生物発光の放射量への化合物の影響を決定した。それぞれの場合に動力学的プロットは除草剤に対応して発光における用量− 依存性減少を示す。影響を示すデータは図６〜９にある）。ｔｏｌＣ突然変異を含有する検出細胞を変化する濃度のＳＭ及びマイトマイシンＣに暴露し、アッセイの感度への突然変異の影響を決定した。表２及び３ならびに図４及び１０及び４に記されている通り、ｔｏｌＣ突然変異は親油性のＳＮに対する検出細胞の応答性を強化したのみでなく、マイトマイシンＣに対しても強化した。これらの試験は検出細胞の成分としてのｔｏｌＣ突然変異の有益性を示した。２つのＣＰＣ’ｓの作用部位をｒｅｃＡ−ＬｕｘＣＤＡＢＥ融合体を含む検出細胞を用いて分析した。生物発光性検出細胞を用い、それぞれの化合物に栄養復帰を適用してどの栄養素が化合物の生育阻害効果から復帰させるかを決定した。表２及び３に示す通り、オキシムカルバメート化合物で処理された細胞の場合に影響される可能性のある部位としてシステイン代謝が同定され、チエニルアラニンで処理された細胞の場合にフェニルアラニン代謝が作用部位として同定された。最後にｉｌｖＢ、ｒｅｌＡ及びｔｏｌＣ対立遺伝子を保有している検出細胞を遺伝子滴定アッセイにおいて用い、ＳＭ、２−チエニルアラニン及びＧＰの作用部位を決定した。検出細胞をＥ．コリｃＤＮＡライブラリを用いて形質転換し、形質転換株の生物発光における変化により示されるＳＭに対する耐性に関して形質転換株をスクリーニングした。耐性コロニーを採取し、プラスミドを単離し、配列決定し、標的の可能性のあるものをコードしている遺伝子に関して分析した。このやり方でｉｌｖＢＮ及びｉｌｖＩＨ遺伝子をＳＭの標的であるＡＬＳをコードする遺伝子として同定し、確認した。類似のやり方で、ＧＰに関する既知の標的であるＥＰＳＰＳをコードするａｒｏＡを選択した。２−チエニルアラニン耐性クローンに関する選択においてａｒｏＨ遺伝子が得られた。特定の標的の生体内阻害剤同定を記載する他の代わりの態様の場合、本検出細胞を作用部位が既知の化合物に関してスクリーニングするための方法においても利用することができる。そのような実施態様を図３に示す。ストレスプロモーター−ｌｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子融合体のみでなく、スクリーニングされるべき化合物の遺伝子標的を発現するプラスミドも含むように検出生物を構築することができることが意図されている。例えばＧＰに関する遺伝子標的はａｒｏＡ遺伝子によりコードされる５−エノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）であることが既知であり、ＥＰＳＰＳ遺伝子産物を発現するようにプラスミドが構築された。スクリーニングされるべき化合物を標準的検出細胞（１）及び発現可能な遺伝子標的（３）を適した濃度で含有する改変検出細胞（２）に暴露する。化合物（４）を加えないと両方の検出細胞においてベースライン発光が与えられるであろう。生育を阻害する化合物（５）の添加は両方の検出細胞において発光の減少を生ずるであろう。しかしながらグリホセート−様分子（６）への標準的検出細胞（１）の暴露が発光の減少を生ずるであろう場合、同じ化合物の改変検出細胞（２）への暴露は発光の減少がもっと小さいか又はないであろう。化合物は改変検出細胞（２）における遺伝子標的の発現により遺伝子的に滴定された。Ｅ．コリａｒｏＡ遺伝子を植物もしくは他のバクテリアのａｒｏＡ類似体で置き換え得ることは当該技術分野における熟練者にわかるであろう。さらにこの方法でいずれの問題の標的に関する化学品も同定できることが意図されている。ここで例示した特定の標的の生体内阻害剤同定の方法を用い、新しい作物保護化学品、抗バクテリア性化学品、殺菌・殺カビ性化学品、抗ガン性化学品、抗−ウィルス性化学品、バイオフィルム（ｂｉｏｆｉｌｍ）形成を妨げる化学品及び防腐剤を含むがこれらに限られない多くの有用な化合物を同定することができた。特定の標的の生体内阻害剤同定の方法を例えばＡＬＳＩＩＩの阻害剤の検出に用いることもできる。例えばアンピシリンもしくはテトラサイクリン耐性に関して選択するｐＢＲ３２２を用いてＤＰＤ１７１８を形質転換し、株ｐＢＲ３２２／ＤＰＤ１７１８を得ることができた。同様にＤＰＤ１７１８をアンピシリン耐性に関して選択するｉｌｖＩＨ含有プラスミドを用いて形質転換し、ＡＬＳＩＩＩ表現型を有する株ｐＩｌｖＩＨ／ＤＰＤ１７１８を得ることができる。これらの２つの形質転換された株を次いでＡＬＳＩＩＩの特異的阻害剤に関してスクリーニングするために用いることができ、それはＡＬＳＩＩＩの力価がｐＢＲ３２２／ＤＰＤ１７１８におけるより株ｐｌｌｖＩＨ／ＤＰＤ１７１８においてずっと高いであろうからである。予想される結果は以下である：さらに、他の生育関連表現型又は生育自身を評価してＥＰＳＰ、ＡＬＳ又は他の所望の細胞機能を妨害する新規な化合物を同定するできることが意図されている。上記の態様は実施例７〜９にさらに十分に例示され、その実施例はマイトマイシンＣ、アシビシン及びチエニルアラニンに対する耐性を運ぶ遺伝子のｒｅｃＡ −ＬＵＸ検出細胞中への導入をいかに用いてそれぞれマイトマイシンＣ、アシビシン及びチエニルアラニン活性を有する化合物に関してスクリーニングできるかを示している。別の態様において、ｒｅｃＡ−ＬＵＸ検出細胞を突然変異誘発性に関して化合物をスクリーニングするための手段として用いる。標準化エイムス試験と比較した時の、化合物突然変異誘発性の指示物質としての本ＳＯＳ調節生物発光性遺伝子融合体の効力は、融合体含有検出細胞の比較においてわかる（実施例１０）。標準的エイムス試験において陽性であった無作為に選ばれた化合物は、生物発光性検出細胞において「点火（ｌｉｇｈｔｓ−ｏｎ）」応答を与えることにより突然変異誘発性であることが確証された。本発明をさらに以下の実施例において限定する。これらの実施例は本発明の好ましい実施態様を示しているが、例示としてのみ示すものと理解されるべきである。上記の議論及びこれらの実施例から、当該技術分野における熟練者は本発明の必須の特性を突き止め、その精神及び範囲から逸脱することなく、本発明を種々の用途及び条件に適応させるために本発明の種々の変更及び修正を成し得る。実施例一般的方法リン酸化、連結及び形質転換の方法は当該技術分野において周知である。以下の実施例で用いるのに適した方法はＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭｕａｎｕａｌ，ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（１９８９）に見いだすることができる。バクテリア培養物の保持及び生育に適した材料及び方法は当該技術分野において周知である。以下の実施例で用いるのに適した方法はＭａｎｕａｌｏｆＭｅｔｈｏｄｓｆｏｒＧｅｎｅｒａｌＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（ＰｈｉｌｌｉｐｐＧｅｒｈａｒｄｔ，Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ，ＲａｌｐｈＮ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ，ＥｕｇｅｎｅＷ．Ｎｅｓｔｅｒ，ＷｉｌｌｉｓＡ．Ｗｏｏｄ，ＮｏｅｌＲ．ＫｒｉｅｇａｎｄＧ．ＢｒｉｇｇｓＰｈｉｌｌｉｐｓ，ｅｄｓ），ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｆｏｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．（１９９４）又はＴｈｏｍａｓＤ．ＢｒｏｃｋｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ＡＴｅｘｔｂｏｏｋｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ＳｅｃｏｎＥｄｉｔｉｏｎ（１９８９）ＳｉｎａｕｅｒＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡに見いだすことができる。標準的バクテリア遺伝子の案はＭｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．，ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９７２）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．，（１９９２）ＡＳｈｏｒｔＣｏｕｒｓｅｉｎＢａｃｔｅｒｉａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ；Ｓｉｌｈａｖｅｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｌ．，ａｎｄＥｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．，ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｗｉｔｈＧｅｎＦｕｓｉｏｎｓ（１９８４），ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ及びＤａｖｉｓ，Ｒ．Ｗ．，Ｂｏｔｓｔｅｉｎ，Ｄ．ａｎｄＲｏｔｈ，Ｊ．Ｒ．（１９８０），ＡＭａｎｕａｌｆｏｒＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ−ＡｄｖａｎｃｅｄＢａｃｔｅｒｉａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙに見いだすことができる。バクテリア細胞の生育及び保持に用いるすべての試薬及び材料は、他の様に特定されなければＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、ＤＩＦＣＯＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）又はＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。略字の意味は以下の通りである：「ｈ」は時間を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｄ」は日を意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味する。生物発光はルミノメーター、モデルＭＬ３０００（ＤｙｎａｔｅｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）において製造者の指示に従って測定した。以下の実施例で用いる作物保護化学品はスルホメツロンメチル［ＤｕＰｏｎｔＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＰｒｏｄｕｃｔｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥから入手］、グリホセート［Ｓｉｇｍａから入手］、メチルビオロゲン［Ｓｉｇｍａから入手］、２−チエニルアラニン［Ａｌｄｒｉｃｈから入手］であり、化合物ＯＣ、原殺菌・殺カビ活性を有するオキシムカルバメートの種類のメンバーである化合物ＯＣはＤｕＰｏｎｔＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＰｒｏｄｕｃｔｓにより製造された。マイトマイシンＣ及びアシビシンはＳｉｇｍａから入手した。原液は以下の通りに調製した：２−チエニルアラニン−水中で（１０ｍｇ／ｍＬ）スルホメツロンメチル−０．０１ＮのＮａＯＨ中で（３．６ｍｇ／ｍＬ）グリホセート−水中で（５ｍｇ／ｍＬ）化合物ＯＣ−ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）中で（１０ｍｇ／ｍＬ）メチルビオロゲン−水中で（２ｍｇ／ｍＬ）マイトマイシンＣ−水中で（１ｍｇ／ｍＬ）アシビシン水中で１０ｍｇ／ｍｌ。株形質転換したＥ．コリ株ＤＰＤ１７０７、ＤＰ１６７５及びＤＰＤ１７１８を１９９７年２月１３日、国際寄託所であるＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）に寄託した。株はそれぞれＡＴＣＣ９８３２８、ＡＴＣＣ９８３２９及びＡＴＣＣ９８３３０と命名された。ＣＰＣ作用部位の決定において有用な追加の検出細胞の株を下記の表１に示す。ライブラリの構築Ｅ．コリＷ３１１０［Ｂ．Ｂａｃｈｍａｎｎ，ｉｎＥ．ｃｏｌｉａｎｄＳａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ：ＣｅｌｌｕｌａｒａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（Ｎｉｅｄｈａｒｄｔｅｔａｌ．，Ｅｄｓ．，ｐｐ１１９０−１２２０，ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９８７））］から単離した染色体ＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３Ａ１で部分的に消化し、アガロースゲル上でサイズ分別した。２つのサイズ範囲（約２．５及び４．０Ｋｂｐという平均サイズ）の画分を、あらかじめ制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、コウシ腸アルカリ性ホスファターゼで処理したｐＢＲ３２２（０．１１ピコモル）又はｐＵＣ１８（０．１１ピコモル）に連結した。それぞれの連結反応における染色体ＤＮＡ対ベクターのモル比は約０．２：１であった。連結産物を用いて超受容性Ｅ．コリＸＬ２Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）をＡｍｐＲに形質転換した。プールした形質転換株（各形質転換に関して＞１０⁵）をプラスミドＤＮＡの単離に用いた。実施例１検出細胞株の構築株ＤＰＤ１６７５の構築ｔｏｌＣ及びｉｌｖＢを含有する株ＤＰＤ１６７５の構築は、ｉｌｖＢ突然変異を有し、遺伝子型［ｉｌｖＢ２１０１ａｒａｔｈｉ △ｐｒｏｌａｃ］を有するＨ．Ｅ．Ｕｍｂａｒｇｅｒ，ＰｕｒｄｕｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙからのＥ．コリ株であるＣＵ８４７の操作により行った。Ｐ１_virファージ原料を株ＤＥ１１２［ｔｏｌＣ：：ｍｉｎｉＴｎ１０；ＶａｎＤｙｋｅｔａｌ．，ＡｐｐｌｉｅｄａｎｄＥｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６０：１４１４−１４２０（１９９４）に十分に記載されている、Ｂ．ＢａｃｈｍａｎｎｉｎＥ．ｃｏｌｉａｎｄＳａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ：ＣｅｌｌｕｌａｒａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（Ｎｉｅｄｈａｒｄｔｅｔａｌ．，Ｅｄｓ．，ｐｐ１１９０−１２２０，ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９８７））に記載されているＲＭ４４３と同質遺伝子］上でＪ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ，ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ，（１９７２）ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ｐｐ２０１−２０５に記載されている標準的方法により生育させた。ファージ原料をＭｉｌｌｅｒ（同上）により記載されている通り、株ＣＵ８４７と混合し、テトラサイクリン耐性組み換え体を選択し、ＭａＣｏｎｋｅｙ寒天（Ｍｉｌｌｅｒ，同上）上で生育できず、従って胆汁酸塩感受性表現型を示す組み換え体をＤＰＤ１６７５と命名した。ＤＰＤ１７０７の構築ｒｅｃＡ−ＬｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子融合体を含有するＤＰＤ１７０７を以下の通りに構築した。Ｂ．ＢａｃｈｍａｎｎｉｎＥ．ｃｏｌｉａｎｄＳａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ：ＣｅｌｌｕｌａｒａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（Ｎｉｅｄｈａｒｄｔｅｔａｌ．，Ｅｄｓ．，ｐｐ１１９０−１２２０，ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９８７））］に記載されているＲＭ４４３と同質遺伝子である株ＤＰＤ２７９４（Ｕ．Ｓ．５６８３８６８に十分に記載されている）からプラスミドｐｒｅｃＡＬｕｘ３を単離した。プロモーター領域（ｒｅｃＡ）をプライマー１、２（それぞれ配列番号１及び２）を用いるＰＣＲにより増幅した。プライマー１：プライマー２：得られる産物をＢａｍＨＩ及びＳａＩＩで消化し、（Ｒｏｓｓｏｎ，Ｒ．Ａ．，ＰＣＴ国際出願ＷＯ９３／０３１７９（１９９３））により十分に記載されているフォトラブズス・ルミネセンスｌｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子複合体を含有する同様に消化されたｐＪＴ２０５プラスミド（正式にはｐＣＧＬＳ２０５と呼ばれる）と混合した。連結の後、混合物を株ＤＨ５（ＡＴＣＣ）中に形質転換し、アンピシリン耐性コロニーを選択した。コロニーを生物発光に関してスクリーニングした。１つのそのような生物発光性形質転換株をＤＰＤ１６５７と命名した。株ＤＰＤ１６５７から単離したプラスミドｐＲｅｃＡＬｘｘ１をＰｓｔ１及びＥｃｏｒ１で消化した。この消化されたプラスミドを同様に消化されたｐＢｒｉｎｔ．ＣＭ．プラスミド［Ｆ．Ｖａｌｌｅ，ＩｎｓｉｔｕｔｏｄｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉａ，ＵＮＡＭ，Ｃｕｅｒｎａｖａｃａ，Ｍｅｘｉｃｏから；Ｂａｌａｂａｓｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅ１７２：６５−６９（１９９６）］と混合した。連結の後、クロラムフェナコール耐性形質転換株を株ＤＨ５において回収した。耐性コロニーを生物発光性表現型に関してスクリーニングした。１つのそのような形質転換株をＤＰＤ１６９６と命名した。この株中のプラスミドをｐＤＥＷ１４と呼んだ。プラスミドｐＤＥＷ１４はフォトラブズス・ルミネセンスｌｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子複合体へのｒｅｃＡプロモーターの融合体を含んだ。この融合体はｌａｃＺコード配列内に位置した。プラスミドｐＤＥＷ１４をＤＰＤ１６９６から単離し、ＤＮＡを株ＪＣ７６２３［Ｂ．Ｂａｃｈｍａｎｎ，ｉｎＥ．ｃｏｌｉａｎｄＳａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ：ＣｅｌｌｕｌａｒａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（Ｎｉｅｄｈａｒｄｔｅｔａｌ．，Ｅｄｓ．，ｐｐ２４６６，ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９８７））］中に形質転換により導入し、クロラムフェナコール耐性コロニーを選択した。アンピシリン感受性且つｌａｃＺ陰性（すなわちＸ−ｇａｌを切断できない）のコロニーをＤＰＤ１７０７と命名した。それはＥ．コリ染色体のｌａｃＺ遺伝子座中に組込まれたｒｅｃＡＬｕｘ融合体を有し、生物発光性であった。Ｐ１_virのファージ原料を株ＤＰＤ１７０７上で調製した（Ｐ１_vir及び方法はＪ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ，ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｉｎＭｏｌｕｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ，（１９７２）ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ｐｐ２０１−２０５に十分に記載されている）。ＤＰＤ１７１８（ｌａｃＺ：：ｒｅｃＡ’φ’ｌｕｘＣＤＡＢＥ）の構築を株ＤＰＤ１６９２から行った。株ＤＰＤ１７０７上で生育させたＰ１_virファージ原料をＭｉｌｌｅｒ（同上）により記載されている通り、株ＤＰＤ１６９２と混合し；クロラムフェニコール耐性組み換え体を選択した。生物発光も示す１つのそのような組み換え体をＤＰＤ１７１８と命名した。同じ形質導入法を用い、表１に報告した株ＤＰＤ１７１５、ＤＰＤ１７３０、ＤＰＤ１７２８、ＤＰＤ１７２９、ＤＰＤ１７１６、ＤＰＤ１７０８、ＤＰＤ１７１９、ＤＰＤ１７０９及びＤＰＤ１７１４を作った。実施例２ＤＮＡ損傷因子マイトマイシンＣの存在下で強化される生物発光遺伝子毒性物質に関する感受性に関して検出細胞を調べるために、株ＤＰＤ１７１５及びＤＰＤ１７３０をＬＢ培地において中期対数期まで生育させた。株ＤＰＤ１７１５及びＤＰＤ１７３０は、ＤＰＤ１７３０がｔｏｌＣであるがＤＰＤ１７１５はｔｏｌＣ＋である点のみで異なる。培地に０〜２０ｕｇ／ｍＬの範囲で変化する濃度のマイトマイシンＣを加えた。遺伝子毒の導入後の発光の動力学を、温度を３７℃に制御する以外は以前に記載された通りに（ＶａｎＤｙｋｅｅｔａｌ．，ＡｐｐｌｉｅｄａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ６０，１４１４，（１９９４））、ミクロタイタープレートフォーマットルミノメーターを用いて監視した。動力学を図４（ａ）及び（ｂ）に示し、用量−応答曲線を図５に示す。ＤＰＤ１７３０［ｔｏｌＣ−］（図４（ｂ））の場合、高濃度のマイトマイシンＣ（本明細書では約２．５ｕｇ／ｍＬより高い）は生育に帰し得る発光の増加を阻害又は妨害するであろう。低濃度（２．５ｕｇ／ｍＬ未満）では、細胞は化学品の存在を認識しない。中濃度（０．６３及び０．３１ｕｇ／ｍＬ）で細胞は、模擬処理された標準を越える生物発光の大きな増加により簡単に監視される通り、ＳＯＳ応答の誘導による損傷に応答し、それは時間の関数として現れる。対照的にｔｏｌＣ＋株であるＤＰＤ１７１５（図４（ａ））はマイトマイシンＣに対してずっと感受性が低い（図５を参照されたい）。誘導はマイトマイシンＣ濃度の全範囲を通して観察された。阻害効果は観察されなかった。予想通り、誘導はｌｅｘＡ−依存性であることが、ＤＮＡ損傷へのＳＯＳ応答を制御するｌｅｘＡ遺伝子において異なっている同質遺伝子対の株中に形質導入により導入された融合体の動力学及び用量−応答曲線により示された。ＳＯＳ応答が活性化されるべき場合はｌｅｘＡによりコードされるＬｅｘＡリプレッサーが切断されねばならない［Ｗａｌｋｅｒ，１９９６，ｉｎＥ．ｃｏｌｉａｎｄＳａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ：ＣｅｌｌｕｌａｒａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（Ｎｉｅｄｈａｒｄｔｅｔａｌ．，Ｅｄｓ．，ｐｐ１４００−１４１６，ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９８７））］。株ＤＰＤ１７０７上で生育させたファージ原料を用い、ｌａｃＺ：：ｒｅｃＡ’φ’ｌｕｘＣＤＡＢＥ融合体を株ＤＭ８００（ｌｅｘＡ⁺）及びＤＭ８０３（非−開裂性リプレッサー遺伝子産物の故に非誘導性ｌｅｘＡ［Ｍｏｕｎｔｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔ．，１１２：８８６（１９７２）］中に形質導入により導入した。生物発光性であるそれぞれの交雑（ｃｒｏｓｓ）からの１つのクロラムフェニコール形質導入株を保存し、ＤＰＤ１７１４（ｌａｃＺ：：ｒｅｃＡ’φ’ｌｕｘＣＤＡＢＥｌｅｘＡ⁺）及びＤＰＤ１７０９（ｌａｃＺ：：ｒｅｃＡ’φ’ｌｕｘＣＤＡＢＥｌｅｘＡ）と命名した。マイトマイシンＣ処理は株ＤＰＤ１７１４からの発光を強化させたが、株ＤＰＤ１７０９からの発光は強化させず、ＬｅｘＡリプレッサーを切断できないことが生物発光の増加を妨害しているので、該処理が真のＳＯＳ応答を引き出すことを示している。実施例３４つの作物保護化学品を用いる処理の後に減少する生物発光実施例３は、検出細胞の光の放射量への４種の作物保護化学品の影響を示す。検出株を上記の通りに中期対数期まで生育させ、以下の条件に従ってスルホメツロンメチル、メチルビオロゲン、グリホセート及び２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）で処理し、この場合すべての培養物を３７℃に保持し、０〜９０分間をかけて試験を行った。株ＤＰＤ１７１８を７８〜５０００ｕｇ／ｍＬの濃度範囲に及ぶ２，４−Ｄに暴露した。生物発光における調節（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）を図６に示す。株ＤＰＤ１７１５を２．５〜２５００ｕｇ／ｍＬの濃度範囲に及ぶグリホセートに暴露した。生物発光における調節を図８（ａ）及び（ｂ）に示す。株ＤＰＤ１７１８を２４〜１８００ｕｇ／ｍＬの濃度範囲に及ぶスルホメツロンメチルに暴露した。生物発光における調節を図７に示す。株ＤＰＤ１７３０を０．７５〜４８ｕｇ／ｍＬの濃度範囲に及ぶメチルビオロゲンに暴露した。生物発光における調節を図９に示す。動力学的データを示す図から明らかな通り、すべての作物保護化学品は検出株からの発光における用量−依存性減少を与えた。実施例４ｔｏｌＣはスルホメツロンメチル及びマイトマイシンＣへの応答を強化する実施例４はスルホメツロンメチル及びマイトマイシンＣに対する検出細胞の応答へのｔｏｌＣ突然変異の影響を示す。上記の通りに検出細胞を中期対数期まで生育させた。検出細胞をある範囲の作物保護化学品に暴露し、暴露から８０分後に生物発光を測定した。株ＤＰＤ１７１５（ｔｏｌＣ＋）及び株ＤＰＤ１７２８（ｔｏｌＣ）を０．００６〜０．４ｕｇ／ｍＬの濃度範囲に及ぶスルホメツロンメチルに暴露し、応答を図１０（ａ〜ｃ）で比較した。同様にｔｏｌＣ＋及びｔｏｌＣ株を０〜２０ｕｇ／ｍＬの濃度のマイトマイシンＣに暴露し、応答を図５で比較した。データから、ｔｏｌＣ突然変異がＣＰＣに対する検出株の感受性を強化する効果を有することが明らかである。ｔｏｌＣ−株の効力を示す生物発光アッセイをディスク拡散アッセイを用いて確証した［Ｓｔｅｐｈｅｎｓｅｔａｌ．，ＰＮＡＳ７２，４３８９，（１９７５）；ＬａＲｏｓｓａＲ．Ａ．ａｎｄＪ．Ｖ．Ｓｃｈｌｏｓｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９，８７５３（１９８４）］（データは示さない）。実施例５栄養復帰によるオキシムカルバメートＯＣ、グリホセート及びチエニルアラニンの作用部位の示唆実施例５はオキシムカルバメートＯＣ、グリホセート及びチエニルアラニンの作用部位の同定のための検出細胞の使用を示す。株ＤＰＤ１７１８を最少培地又はＬＢ培地において３７℃で生育させ、多様な濃度に及ぶ３−（２−チエニル）−Ｌ−アラニン又はオキシムカルバメートプロファンギサイド化合物ＯＣのいずれかに暴露した。３−（２−チエニル）−Ｌ− アラニンの濃度は最少及びＬＢ培地の両方における生育の場合に０〜１００ｕｇ／ｍＬの範囲であった。化合物ＯＣの濃度は最少培地において生育した細胞の場合に０〜１００ｕｇ／ｍＬの範囲であり、ＬＢ培地において生育した細胞の場合に０〜１０００ｕｇ／ｍＬの範囲であった。最少及びＬＢ濃厚培地の両方において生育した細胞の場合のグリホセートの濃度は０〜５０００ｕｇ／ｍＬの範囲であった。図１１（ａ）、（ｂ）、１２（ａ）、（ｂ）及び１３（ａ）、（ｂ）におけるデータによりわかる通り、これらの化合物を用いる検出細胞の処理は、最少培地において発光を減少させたが、濃厚ＬＢ培地において発光は減少しなかった。オキサノグラフィを用いてこれらの実験の作物保護化学品の光−阻害効果の除去を担う栄養素を決定した。オキサノグラフィ案：株ＤＰＤ１７１８を最少培地において中期対数期まで生育させた。種々の塩基、ビタミン及びアミノ酸を示す合計１１個の個別のプールを作る（表２、５）。それぞれのプールは１つの成分を他のプールと共有する。それぞれのプールを単独で二重にミクロタイターウェル中に加えた。プールの組成はＤａｖｉｓ，Ｒ．Ｗ．，Ｄ．ＢｏｔｓｔｅｉｎＡｎｄＪ．Ｒ．Ｒｏｇｈ，ＡＭａｎｕａｌＦｏｒＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：ＡｄｖａｎｃｅｄＢａｃｔｅｒｉａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ．Ｘ＋２５４ｐ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ：ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８０，ｐｐ２０６〜２０８に記載されている通り、代謝的センス（ｍｅｔａｂｏｒｉｃｓｅｎｓｅ）を作っている。サルモネラ・チフィムリウムとＥ．コリの間の代謝の相違に適応させるために、記載した１１個のプールにＤａｖｉｓｅｔａｌ．のプールからの小さい変更を加えた。プールの成分は以下の通りであり；プールにおけるその濃度はＤａｖｉｓｅｔａｌ．，同上により記載された通りである：プールー成分１−アデノシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グルタミン、チミン２−グアノシン、ロイシン、チロシン、アスパラギン、セリン３−システイン、イソロイシン、トリプトファン、ウラシル、グルタメート４−メチオニン、リシン、トレオニン、アスパルテート、ＤＡＰ５−イソロイシン、バリン、プロリン、アルギニン、グリシン６−アデノシン、グアノシン、システイン、メチオニン、イソロイシン７−ヒスチジン、ロイシン、イソロイシン、リシン、バリン８−フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、トレオニン、プロリン、ＰＡＢＡ、ＤＨＢＡ９−グルタミン、アスパラギン、ウラシル、アスパルテート、アルギニン１０−チミン、セリン、グルタメート、ＤＡＰ、グリシン１１−ピリドキシン、ニコチネート、ビオチン、パントテネート、アラニン。ウェル当たりに加えられる容積は１０μＬのそれぞれのプール及びあらかじめ決められた阻害濃度のある化合物が補足されている４０μＬの新しい最少培地であった。最少培地中で生育した５０マイクロリットルの中期対数期細胞をミクロタイターウェルに加えた。次いでミクロタイタープレートをＭＬ２０００ルミノメーター中に入れ、試料の生物発光を時間を経て監視した。データを化合物の挑戦を受けない細胞の試料と比較した。生物発光の回復によって決定される通り、細胞が化合物の阻害効果を克服することを可能にするプールを、化合物の損傷効果から復帰させる成分を含むプールであると決定した。最後にプールのそれぞれの成分を調べて生物発光の回復を担う特定の成分を決定した。化合物ＯＣ作用の栄養復帰表２は化合物ＯＣとＤＰＤ１７１８の相互作用からのデータを記録している。消灯（ｌｉｇｈｔｓ−ｏｆｆ）応答（光の放射量における約１０００分の１への減少）は最少培地上で観察されるが濃厚培地上では観察されない。オキサノグラフィ（表３）はシステインを含有するプール６の存在が消灯応答を妨害できることを示した。＊培地：Ｅ＋Ｂ１＋グルコース＋グリシン＋プロリン＋ウラシル３７℃／ＤＰＤ１７１８／２５ｕｇ／ｍＬにおける化合物ＯＣプール３を用い、いくつかの時点に消灯応答の弱い妨害が見られた（データは示さない）。かくしてプール３及び６の個々の成分を消灯応答を妨害するその能力に関して調べた：逆転因子が２つのプールの間の共通成分であるシステインであることは明らかである。システインは化学品−誘導栄養要求性突然変異から復帰させることによるかあるいはオキシムカルバメート又はその加水分解産物と付加物を形成することによりその効果を発揮し得た。これらの２つのモデルを区別しようと、システインの立体異性体を復帰因子として調べた：Ｄ−システインも化合物ＯＣの効果から復帰できることが明らかである。次いで出願人等はＤ−システインが２つのｃｙｓＤ株、ｃｙｓＡ突然変異株、ｃｙｓＨ株及びｃｙｓＢ突然変異株の栄養要求性突然変異を満たすことを調べ、見いだした。データはＤ−システインが光学的に純粋でないか又はＥ．コリが２つの立体異性体を相互転換させる能力を有するかのいずれかであることを示唆している。追加の実験は２−メルカプトエタノールを含む多様な化合物上に存在する遊離のスルフヒドリル基が生物発光の原殺菌・殺カビ剤阻害のクエンチングを担うことを示した（データは示さない）。その発見は遊離のＳＨ基を有する化合物が化合物ＯＣの作用を除去することを示しており、Ｌ−システイン生合成が化合物ＯＣの作用により危うくならないことを示唆している。かくして栄養復帰実験は阻害作用を除去することができる因子を示唆することができる。そのような実験はさらなる研究で支持されねばならない。２−チエニルアラニン作用からの栄養復帰チエニルアラニン阻害の栄養復帰を化合物ＯＣの場合と類似のやり方で行った。上記の通りにプールを作った。図１４に示される通り、プール１及び８によるチエニルアラニン阻害からの復帰が観察された。復帰をフェニルアラニンに帰因させることができ、プールの他の成分に帰因させることはできない。グリホセート作用からの栄養復帰グリホセート阻害からの栄養復帰を化合物ＯＣ及びチエニルアラニンの場合と類似のやり方で行った。図１３（ａ〜ｂ）及び表５に示される通り、プール８のみによるグリホセート阻害からの復帰が観察された。＊培地：Ｅ＋Ｂ１＋グルコース＋グリシン＋プロリン＋ウラシル３７℃／ＤＰＤ１７１８／６００ｕｇ／ｍＬにおけるグリホセートプール８のみによる復帰は、共通の（ｃｏｍｍｏｎ）芳香族アミノ酸経路における遮断を示している（Ｄａｖｉｓｅｔａｌ．，同上、ｐ．２０８）。かくしてグリホセートの標的経路がこの方法により正確に同定される。スルホメツロンメチル（ＳＭ）作用からの栄養復帰チアミン、グルコース及びウラシルが補足された最少Ｅ培地中で生育している株ＤＰＤ１７１８の生物発光を用量−依存的方法でスルホメツロンメチルにより阻害した（調べた濃度が１８００、９００、４５０、２２５、１１３、６１、３１及び０ｕｇ／ｍＬであった図１５（ａ）を参照されたい）。２５０ｕｇ／ｍＬの除草剤の投与により引き起こされたＳＭ阻害からの栄養復帰を図１５ｂの下部パネルに描く。阻害からの復帰において最も有効なプールは３つの分枝鎖状アミノ酸、リシン及びヒスチジンから成るプール７であった。このプールによる復帰は既知のＳＭ作用の部位と一致する。プール１（アデノシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グルタミン、チミン）、９（グルタミン、アスパラギン、ウラシル、アスパルテート、アルギニン）及び１１（ピリドキシン、ニコチネート、ビオチン、パントテネート、アラニン）の場合に、もっと低い程度までのそして非常に遅れた動力学を以ての不完全な復帰が見られた。実施例６遺伝子滴定によるスルホメツロンメチル及びグリホセートの作用部位の同定選ばれた突然変異株とのＧＰ及びＳＭの相互作用の分析によるＧＰ及びＳＭ感受性の特性化グリホセートはＥ．コリＫ１２に対して阻害性であると予測される。対照的にスルホメツロンメチルはｉｌｖＢＮによりコードされる屈折力のあるＡＬＳＩイソ酵素の存在の故にＥ．コリに対して阻害性でない。両方の化合物はＥコリのｉｌｖＢ突然変異株を阻害する。阻害のゾーンのアッセイは、アミノ酸欠乏への緊縮応答のマウンティング（ｍｏｕｎｔｉｎｇ）を妨害するｒｅｌＡ無効対立遺伝子のｉｌｖＢ突然変異株中への導入がＧＰへの過感受性を生ずるがスルホメツロンメチルに対する応答を変更しないことを示す。ＳＭ耐性メロマルチプロイド株ＤＰＤ１６７５は、生来ＳＭに対して耐性の野生型ＡＬＳＩの生産を妨害するｉｌｖＢ突然変異の存在の故に、ｉｌｖＩＨによりコードされる単一のＳＭ −感受性ＡＬＳであるＡＬＳＩＩＩを発現する。それは流出ポンプ媒介による細胞質からのＳＭの排除を妨害するｔｏｌＣ突然変異も含んでいる。これらの２つの突然変異は一緒になってＳＭに非常に感受性の株を生じている。出願人等は最少培地含有プレートにおいて株ＤＰＤ１６７５のＭＩＣが３ｕｇ／ｍＬであることを決定した。除草剤スルホメツロンメチルの遺伝子滴定を株ＤＰＤ１６７５（表１）において行った。この株はｉｌｖＢ対立遺伝子及びｔｏｌＣにおいて突然変異を保有しており、それは細胞を該除草剤に対して感受性とし、疎水性化合物に対してより透過性としている。この株における該除草剤のＭＩＣは、最少プレート上における１日の生育の後、３ｕｇ／ｍＬであることが決定された。ＤＰＤ１６７５の凍結された受容性細胞（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１８：１６９（１９９０）の方法により調製）を、ｐＢＲ３２２に基づくもの及びｐＵＣ１８に基づくものの２種類のＥ．コリライブラリからの０．５μＬのプラスミドＤＮＡを用いて形質転換した。形質転換混合物を１回洗浄し、１ＸＥ［Ｄａｖｉｓｅｔａｌ．，同上、ｐｐ．２０２−２０３］中に再懸濁させてから、Ｄａｖｉｓｅｔａｌ．，同上、ｐｐ．２０１−２１０及びＭｉｌｌｅｒ，１９７２，同上、ｐ．４３２において見いだすことができる標準的濃度でチアミン、プロリン、グリシン及びグルコースが補足された最少Ｅプレートにプレート化した。所望のクローンに関する選択は、やはり培地中に含まれたアンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）及びスルホメツロンメチル（９μｇ／ｍＬ）であった。ｐＢＲ３２２又はｐＵＣ１８のいずれかに連結されたＥ．コリ染色体の無作為なフラグメントを含有する２つのライブラリを用いて株ＤＰＤ１６７５を形質転換した。１９個の単離物からのプラスミドは、株ＤＰＤ１６７５中に再導入されるとＳＭに対する耐性を与えた（表６）。これらの形質転換株の胆汁酸への応答を評価した；胆汁酸感受性はｔｏｌＣ^- 表現型を示し、胆汁酸耐性はｔｏｌＣ⁺表現型を示す。６個のプラスミドのＤＰＤ１６７５中への導入は胆汁酸塩耐性の単離物を生じ、これらの株がｔｏｌＣ⁺ ／ｔｏｌＣ異型接合体であり、ｔｏｌＣ⁺が優性であることを示唆した。各挿入片の両鎖を配列決定することにより、この仮定を確証した。ｐＢＲ３２２中への挿入片の配列決定に用いたプライマーは：であり、ｐＵＣ１８中への挿入片の配列決定に用いたものは：であった。得られた配列をＥ．コリゲノム（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号Ｕ０００９６）上に置くためにＩｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ法（Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓｍｅｔｈｏｄｓ）を用いた。これらのデータ（表６）はＳＭ及び胆汁酸塩耐性の両方を与えるそれぞれのプラスミドがｔｏｌＣ⁺を保有しているという結論に出願人等を導いた。他の１３個のプラスミドを含有する株ＤＰＤ１６７５は、プラスミドを含まない宿主の胆汁酸塩感受性表現型を保持していた。１９個のプラスミドを用いて株ＭＦ２０００も形質転換した。ＭＦ２０００は突然変異ｉｌｖＢＮ及びｉｌｖＩＨ対立遺伝子を保有しており、従ってＡＬＳ活性がない。そのままで該株はイソロイシン−バリン栄養要求性突然変異体である。ｔｏｌＣ⁺含有プラスミドの導入は株ＭＦ２０００の観察される栄養要求性を変更しない。対照的に、他の１９個のプラスミドを含有する株ＭＦ２０００の形質転換株はイソロイシン−バリン原栄養体であった。これは、それらがＡＬＳＩ又はＡＬＳＩＩＩのいずれかを発現していること及びプラスミドがｉｌｖＢＮ又はｉｌｖＩＨを保有しているらしいことを示した。これらの挿入片の末端も配列決定し、Ｅ．コリゲノム（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号Ｕ０００９６；表６を参照されたい）の完全な一次配列との比較により、挿入片上に保有されている遺伝子の同定に導いた。示されたデータから、我々はＳＭ−耐性メロマルチプロイドの最初の収集物の中に９個のｉｌｖＢＮ⁺／ｉｌｖＢＮ異型接合体（表６を参照されたい）及び２個のｉｌｖＩＨ⁺／ｉｌｖＩＨ⁺同型接合体があったことを結論した。グリホセート耐性メロマルチプロイドの選択及び特性化株ＤＰＤ１６９２を用いてグリホセート耐性メルマルチプロイドを選択した。出願人等は、最少培地プレートにおいて株ＤＰＤ１６９２のＭＩＣが３．０ｍＭ（０．５６ｍｇ／ｍＬ）のグリホセートであることを決定した。０．５ｕＬのライブラリ１（ｐＢＲ２２に基づく；０．０３７５ｕｇＤＮＡ）又はライブラリ３（ｐＵＣ１８に基づく、０．１５ｕｇ、ＤＮＡ）を用いて形質転換された受容性ＤＰＤ１６９２細胞は、濃厚培地プラスアンピシリン上でプレート化すると１０⁴個の形質転換株を与え、かくしてそれぞれマイクログラムＤＮＡ当たりに約３ｘ１０⁵及び０．７ｘ１０⁵ 形質転換株という頻度を有した。グルコース、グリシン、プロリン、ウラシル及びチアミンならびに選択因子アンピシリン（１００ｕｇ／ｍＬ）及びグリホセート（３．３ｍＭ＝０．５６ｍｇ／ｍＬ）で修正された最少Ｅ培地から成る選択プレート当たりに約２ｘ１０³個の細胞をプレート化した。グリホセート耐性メルマルチプロイドは３７℃における９６時間のインキュベーションを通じて現れた。グリホセート選択はｐＢＲ＃２２ライブラリからの７個の形質転換株及びｐｕＣ１８ライブラリからの１８個の形質転換株の単離を生じた（表６）。最初の宿主株ＤＰＤ１６９２を２５個のプラスミドで再形質転換すると、グリホセート耐性が得られ、プラスミドが耐性表現型を与えたことを確証した。グリホセート耐性を与えるプラスミドを用いて栄養要求性ａｒｏＡ突然変異Ｅ．コリ株ＡＢ２８２９を形質転換することにより、グリホセートの既知の標的をコードする遺伝子であるａｒｏＡの存在をスクリーニングした。原栄養性の形質転換株は、ａｒｏＡ遺伝子がグリホセート−耐性を与えるブラスミド上に滞留していることを示した。２５個の単離されたプラスミドの中の２つは最少培地上におけるＡＢ２８２９の生育を回復させた。これらの２つのプラスミド上のａｒｏＡの存在を上記のプライマーを用いる配列分析（表６を参照されたい）により確証した。株ＤＰＤ１６９２において２５個のグリホセート耐性プラスミドを比較した場合に、これらの２つのプラスミドはグリホセートに対する最も強い耐性を与えた（データは示さない）。非−ａｒｏＡ含有プラスミドである残る２３個の中で、新規なグリホセート耐性を与える３種の別の挿入片を配列分析により同定した（表６を参照されたい）。Ａ群は１７個のメンバーを有し、Ｂ群は４個のメンバーを有し、Ｃ群は２個のメンバーを有した。Ｅ．コリゲノム地図に対する挿入片の位置決定を、データベースのＦＡＳＴＡ及びＢＬＡＳＴ（ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＰａｃｋａｇｅＶｅｒｓｉｏｎ９．０，ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃ．）走査により行った。Ｅ．コリ染色体上で７７．８分にマッピングされるＡ群の挿入片は２つの以前に配列決定されたＯＲＦ’ｓ、ｙｈｈＳ．及びｙｈｈＴ．を含有する。これらのＯＲＦ ’ｓの両方に関する推定タンパク質構造は膜に及ぶと推定されるドメインを含んでおり、かくしてそれらはパーミアーゼであると思われる。１４．２分領域にマッピングされる第２のＢ群の４つのメンバーはＥ．コリ染色体の特性化されていない領域を含有している。第３の群の２つの挿入片はＥ．コリ染色体の５２．３分の領域にマッピングされる。配列分析は、炭水化物代謝に関連する遺伝子がこの挿入片に含まれることを明らかにした。今日までに同定されたＯＲＦ’ｓは以前に記載されていない成分ＩＩＣ及びＩＩＢＰＴＳ酵素を含む。これらの２つの遺伝子によりコードされる推定アミノ酸配列は、フルクトース−様ＰＴＳオペロンによりコードされる成分ＩＩＣ及びＩＩＢ酵素との相同性を共有している（Ｒｅｉｚｅｒ，Ｊ．Ａ．ｅｔａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４１，９６１，（１９９５））。新しいＰＴＳ酵素ＩＩ相同染色体の他に、この挿入片は単一のＥ．コリグルコキナーゼ遺伝子、ｇｌｋを含有している。実施例７マイトマイシンＣ−耐性遺伝子の同定実施例７は、ｒｅｃＡ−ＬＵＸ融合体を含有する検出細胞の構築に用いることができるマイトマイシンＣに対する耐性を有する遺伝子の同定及び単離を例示する。マイトマイシンＣ作用の遺伝子滴定マイトマイシンＣ（ＤＮＡ損傷因子）はＥ．コリのｌｅｘＡ^ind突然変異株、ＤＭ８０３のコロニー形成を３ｕｇ／ｍｌのＭＩＣで阻害する。このＭＩＣはｌｅｘＡ⁺株ＤＭ８００のＭＩＣより５倍低い。受容性ＤＭ８０３細胞をｐＢＲ３２２ライブラリ及びｐＵＣ１８ライブラリを用いて形質転換した。１５μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣ（３ＸＭＩＣ）の存在下に、３７℃においてＬＢＡｍｐ１５０プレート上でプレート化することによりコロニーを選択した。２日後、ｐＵＣ１８に基づくＥ．コリライブラリを用いて細胞を形質転換したプレート上で４つのコロニーが現れた。これらの４つのコロニーを採取した；すべてのプレートをさらに５日間インキュベーションしたが、さらに別のコロニーは現れなかった。プラスミドを４つのコロニーから精製し、ｐｌｅｘＡ３．１、３．２、３．３及び３．４と命名した。株ＤＭ８０３の再形質転換によるそれぞれのプラスミドの再導入はアンピシリン耐性とマイトマイシンＣ耐性の間の連鎖を示し、それぞれの場合、マイトマイシンＣ耐性はプラスミドがコードする特徴であることを示した。ＤＭ８０３宿主からのプラスミドの精製は困難であり一低い収率及び保存した時の試料の分解が観察された。かくして配列決定のためのプラスミド鋳型の慣例的精製のためにプラスミドをＲＦＭ４４３に転移させた。得られた配列：（１）ＬｅｘＡ３．１挿入片の２つの末端を配列決定した。ＬｅｘＡ３．１前進−プライム（ｆｏｒｗａｒｄ−ｐｒｉｍｅｄ）配列はＢｌａｔｔｎｅｒＥ．コリ配列決定プロジェクトにより限定される４００の中からの領域２９１（１８分）−推定フィンブリンチャペロン遺伝子及びｙｈｃＡを有するｇｌｔ領域にマッピングされ、逆−プライム（ｒｅｖｅｒｓｅ−ｐｒｉｍｅｄ）配列は４００からの領域７６にマッピングされ−この領域はｄａｃＣ（ペニシリン結合タンパク質）及びｄｅｏＲ（デオキシリボースオペロンリプレッサー）ならびに未知の機能のタンパク質をコードするいくつかの読み取り枠を含有する。これらは染色体の非−連続領域なので、選択されたプラスミドはおそらくライブラリ構築の間に融合した２つの非隣接フラグメントのキメラである。（２）ＬｅｘＡ３．２の前進−及び逆−開始配列はＥ．コリデータベースにおける４００からの領域７６にマッピングされる。この領域は挿入片中に存在する８．６ｋｂの中にｄａｃＣ（ペニシリン結合タンパク質）及びｄｅｏＲ（デオキシリボースオペロンリプレッサー）を含有する。ＬｅｘＡ３．３の逆−開始配列は：ＬｅｘＡ３．２と同じ領域にマッピングされ；前進−開始配列は今の時点では入手できない。（３）同様にＬｅｘＡ３．４逆−開始配列もＬｅｘＡ３．２と同じ領域にマッピングされ、Ｌｅｘ３．３と同じ結合を含有すると思われる；この場合も前進− 開始配列は入手できない。かくしてＥ．コリの染色体の領域７６内の単数もしくは複数の遺伝子がマイトマイシンＣに対するマルチコピー耐性を与えると思われる。セグメントの分割及び再試験がマイトマイシンＣ耐性を担う新規な単数もしくは複数の遺伝子を限定するであろうことは明らかである。ｐＬｅｘＡ３．２上に含まれるこれらの遺伝子及び読み取り枠は：ｏ１２７，ｏ３７１，ｆ２１０，ｄａｃＣ＝ペニシリン−結合タンパク質６前駆体，ｄｅｏＲ＝デオキシリボースオペロンリプレッサー，ｆ１９８，ｏ４１０＝ｍｄｆＡ，ｆ９４，ｆ２６２，ｆ４０２及びｏ１７８である。非−誘導性対立遺伝子が耐性機構の可能性のあるサブセットを含み得るので、ＳＯＳ応答に熟達している（ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｔｉｎ）株を用いてさらなる実験を行った。株ＲＦＭ４４３はｌｅｘＡ⁺であり、かくしてマイトマイシンＣを用いる遺伝子滴定に用いた。この株の場合のマイトマイシンＣに関するＭＩＣは濃厚固化ＬＢ培地上で１〜３ｕｇ／ｍｌであることが決定された。かくして寒天を用いて固化し、６ｕｇ／ｍｌのマイトマイシンＣ及び１５０ｕｇ／ｍｌのアンピシリンを補足したＬＢを用い、ｐＢＲ３２２又はｐＵＣ１８のいずれかにおいて構築したＥ．コリ遺伝子ライブラリを用いて株ＲＦＭ４４３を形質転換した後にマイトマイシン耐性クローンを選択した。そのような耐性分離物から精製されるプラスミドＤＮＡをＲＦＭ４４３中に再導入し、耐性がプラスミドがコードする特徴であるかどうかを示した。ベクター−挿入片結合物のＤＮＡ配列決定は、マイトマイシンＣに対する耐性を与える配列を限定することに役立った。そのような耐性は挿入片の配列決定により限定される３つの部位にマッピングされた（下記を参照されたい）。７回単離された部位ＡはｐＬｅｘＡ３プラスミド（上記）に存在する１８分における部位と一致する。しかしながらこのプラスミドの組は（下記の表７を参照されたい）、最近記載されたマルチドラッグトランスポーターである１８分領域における１つの特定の遺伝子、ｏ４１０（ｍｄｆＡ）が多重コピー中に存在する時にマイトマイシンＣに対する耐性を与えることができることを示している。他のＤＮＡ損傷因子、Ｃ０３６０の阻害作用は部位Ａクローンにより影響されない。ＮＤ−決定せず；＋は生育を示す；−は生育しないことを示す。部位Ｂ媒介の耐性は、４３分領域の高用量の故に１６個の個別の挿入片により限定される（下記の表８を参照されたい）。部位Ｂからのこれらの挿入片が共有する唯一の完全な遺伝子はｓｄｉＡであり、これはその産物が細胞分裂に必須であるｆｔｓＱＡＺオペロンの正のアクチベータをコードする。ｓｄｉＡ及びｒｐｏＳ遺伝子産物の両方がｆｔｓＱＡＺの別のプロモーターに作用する。ＤＮＡ損傷因子Ｃ０３６０の阻害作用はいくつかの部位Ｂクローンの存在により低下する。＊これらの挿入片の１つの末端のみを配列決定した；ＮＤ−決定せず；＋は生育を示す；−は生育しないことを示す。１０個の部位Ｃ挿入片を配列決定により同定した（下記の表９を参照されたい）。これらは４４分領域から生じ、唯一の共通の完全な遺伝子、ｓｂｍＣを有する。この遺伝子の発現は、二本鎖ＤＮＡの破壊を引き起こす他のＤＮＡ損傷因子である小さいペプチド抗生物質であるマイクロシンＢ１７により誘導され、定常期に入る。限られたサンプリングは部位ＣクローンがＤＮＡ損傷因子Ｃ０３６０への交差耐性を与えないことを示している。ＮＤ−決定せず；＋は生育を示す；−は生育しないことを示す。実施例８アシビシン耐性遺伝子の同定実施例８は、ｒｅｃＡ−ＬＵＸ融合体を含有する検出細胞の構築において用いることができるアシビシンに対する耐性を有する遺伝子の同定及び単離を例示する。アシビシン作用の遺伝子滴定アシビシンは最少培地上におけるＥ．コリ株ＤＰＤ１６７５のコロニー形成をｌｕｇ／ｍｌのＭＩＣで阻害する。受容性ＤＰＤ１６７５細胞をそれぞれＥ．コリ染色体の無作為なフラグメントを含有するｐＢＲ３２２ライブラリ及びｐＵＣ１８ライブラリを用いて形質転換した。グルコース、チアミン、プロリン、１００ｕｇ／ｍｌのアンピシリン及び３μｇ／ｍｌのアシビシン（ＭＩＣの３倍）が補足されたＥプレート上で３７℃においてプレート化することによりコロニーを選択した。長時間のインキュベーションの後、コロニーがプレート上に現れた。コロニーからプラスミドを精製し、命名した。株ＤＰＤ１６７５の再形質転換による各プラスミドの再導入はアンピシリン耐性とアシビシン耐性の連鎖を示し、それぞれの場合にアシビシン耐性はプラスミドがコードする特徴であることを示した。耐性クローンからのプラスミドの精製は配列決定のためのプラスミド鋳型を与えた。得られた配列組１のクローンは約４３分における領域２８７に由来する。数は９であり、その挿入片は約２８００〜５８００ｂｐで変化するが、すべてが完全なｙｅｄＡを含有する。表１０の吟味は、耐性を与えるすべての組５のクローンにおいて、この領域に他の完全な遺伝子がないことを示している。組２のクローンは１つのみであり、それは約６９分における領域３７４にマッピングされる。それは１８３１ｂｐの挿入片を含有し、それは完全なｉｃｉＡ及びｆ７６遺伝子を含有している。関連するクローンを表１０において同定する：実施例９チエニルアラニン様化合物の生体内阻害剤同定実施例９はｒｅｃＡ−ＬＵＸ融合体を含有する検出細胞の構築において用いることができるチエニルアラニンに対する耐性を有する遺伝子の同定及び単離を例示する。方法はチエニルアラニン耐性遺伝子の単離及び適した検出細胞の形質転換により行われる。チエニルアラニン作用の遺伝子滴定チエニルアラニンは最少培地上におけるＥ．コリ株ＤＰＤ１６７５のコロニー形成を７５ｕｇ／ｍｌのＭＩＣで阻害する。受容性ＤＰＤ１６７５細胞をそれぞれＥ．コリ染色体の無作為なフラグメントを含有するｐＢＲ３２２ライブラリ及びｐＵＣ１８ライブラリを用いて形質転換した。グルコース、チアミン、プロリン、１００ｕｇ／ｍｌのアンピシリン及び１５０μｇ／ｍｌのチエニルアラニン（ＭＩＣの２倍）が補足されたＥプレート上で３７℃においてプレート化することによりコロニーを選択した。長時間のインキュベーションの後、コロニーがプレート上に現れた。コロニーからプラスミドを精製し、命名した。株ＤＰＤ１６７５の再形質転換による各プラスミドの再導入はアンピシリン耐性とチエニルアラニン耐性の連鎖を示し、それぞれの場合にチエニルアラニン耐性はプラスミドがコードする特徴であることを示した。耐性クローンからのプラスミドの精製は配列決定のためのプラスミド鋳型を与えた。表１１に示す以下のプラスミド挿入片構造を与える配列が得られた：プラスミドｐＡＨＨ１（Ｒ．Ｂａｕｒｅｌｅ，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＶｉｒｇｉｎｉａから得られるａｒｏＨを含有するが隣接遺伝子を含有していないマルチコピープラスミド）を株ＤＰＤ１６７５に導入するとチエニルアラニン耐性表現型を生じ、ａｒｏＨがマルチコピー媒介の耐性を担う遺伝子であることを示す。チエニルアラニン耐性により単離されるクローンは２つの組のものであった。１２個の独立して単離されるクローンの重複領域により限定される１つの耐性の組は遺伝子ｏ２４５ｙａｇａＨを含有し、それはＥ．コリ染色体の５９．７９分に位置する。５つの独立して単離されるクローンの重複領域により限定される他の耐性の組はＥ．コリ染色体上の３８．２２分に位置する領域を含有し、ｙｄｉＧ（Ａ）ａｒｏＨｙｄｉＥｆ４７８を含んだ。ＤＰＤ１７５０からのそれぞれのＯＲＦｓ（ｏ２４５ｙａｇａＨ）のサブクローニング株ＤＰＤ１７５０はｐｒｏＸｏ８８ｏ３０５０２４５ｙｇａＨを含有する最大の挿入片（ｐＤＥＷ４５）を含有する。ＤＰＤ１７５０から単離されるプラスミドＤＮＡ（ｐＤＥＷ４５）を鋳型として用いるＰＣＲ増幅を用い、独立してｏ２４５又はｙｇａＨＯＲＦのいずれかをサブクローニングした。ＯＲＦにフランキングする限定された制限部位を有するプライマーを設計し、それぞれ別のＯＲＦをＰＣＲ増幅し、次いでｐＢＲ３２２中に方向的に（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌｌｙ）クローニングできるようにした。前進方向のプライマーは、そのヌクレオチド配列中に導入されたＢａｍＨＩ制限部位（５’ＧＧＡＴＣＣ３’ ）をそれが含有するように構築した。逆プライマーはそのヌクレオチド配列中に導入されたＥｃｏＲＩ制限部位（５’ＧＡＡＴＣＣ３’）を有する。ｏ２４５遺伝子の単離のためのＰＣＲ反応に特異的なプライマーはそれぞれ「ｏ２４５ｆ」及び「ｏ２４５ｒ」であった。ｙｇａＨ遺伝子の単離のためのＰＣＲ反応に特異的なプライマーはそれぞれ「ｙｇａＨｆ及び「ｙｇａＨｒ」であった。それらの特定的ヌクレオチド配列を下記に記載する。ＰＣＲ反応は９４℃、１分；５０℃、１分；７２℃、１分の４０サイクルを行い、プライマー条件はそれぞれ１００ピコモルであった。ＰＣＲ産物の濃度及びサイズを２．０％アガロースゲル上の電気泳動により確認した。ｏ２４５ＰＣＲ反応は推定１２３６ｂｐの産物を与えた。同様にｙｇａＨＰＣＲ反応は推定サイズ６６１ｂｐの産物を増幅した。ＰＣＲ産物をカラム濾過（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ）により精製し、次いで酵素消化した。ｏ２４５及びｙｇａＨＰＣＲ産物ならびに連結の際に宿主ベクターとして働くｐＢＲ３２２ベクターにつき、連続的ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ制限消化を行った。試料の一部を０．７％アガロースゲル上で移動させ、そのＤＮＡ濃度を決定した。挿入ＤＮＡとしてｙｇａＨ又は０２４５消化ＰＣＲ産物を用い、宿主ベクターｐＢＲ３２２中への連結反応を４℃において終夜行った。連結されたｐＤＮＡのアリコートを、１５０μｇ／ｍｌにおいてアンピシリン耐性に関して選択し、２０μｇ／ｍｌにおいてテトラサイクリン感受性に関してスクリーニングするＤＨ５α宿主中に形質転換した。アンピシリン耐性テトラサイクリン感受性単離物からプラスミドＤＮＡを単離した。逆遺伝子滴定のためのＤＰＤ１７１８中への形質転換ｏ２４５連結プラスミド（ｐＤＥＷ４０）又はｙｇａＨ連結ブラスミド（ｐＤＥＷ３９）をアンピシリン１５０μｇ／ｍｌ耐性を選択し、生物発光、クロラムフェニコール（２０μｇ／ｍｌ）及びカナマイシン耐性（２５μｇ／ｍｌ）に関してスクリーニングするＤＰＤ１７１８中に形質転換した。宿主株ＤＰＤ１７１８は染色体に組込まれたｒｅｃＡ：：ｌｕｘ_P.l.を含有しており、生物発光の基底量をＲＬＵ’ｓ（相対的光単位）の点で非常に高くしている。正及び負の標準として用いるために他のプラスミド、すなわちｐｈｅＡ栄養要求性突然変異体を補うｐＢＲ３２２クローンに関して選択することにより単離されるｐＢＲ３２２、ＡＨ１（ａｒｏＨ）（ＣＢ１８から単離）及びｐｐｈｅＡをＤＰＤ１７１８中に形質転換した。実験案０．４％チアミン及び０．４％グルコースが補足された最少Ｅ培地中で、３７ ℃において震盪させながら株を生育させた。翌朝、培養物を新しい最少培地中に希釈し、初期対数期まで生育させた。チエニルアラニン原液（ｄＨ₂Ｏ中に溶解された１０ｍｇ／ｍｌ）の連続２倍希釈を、１００μｇ／ｍｌを最高濃度としてミクロタイタープレートにおける最少培地中で行った。生物発光を１時間監視し、動力学的データを集めた。プロットされたデータを図１６に比率として示す（発光の点で未挑戦細胞に標準化）。すべての濃度において、最後の時点のみを示す（通常は約６０分における）。以下の案に従い、細胞に関してゾーンアッセイも行った。株を１５０ｕｇ／ｍｌのアンピシリンが補足されたＬＢ培地中で３７℃において終夜生育させた。遠心により培養物を集めてから等容積のＥ培地中に再懸濁させた。０．１ｍｌの部分を０．７％の寒天で修正された２．５ｍｌのＥ培地においてプレート化し、グルコース、プロリン、ウラシル及び１００ｕｇ／ｍｌのアンピシリンが補足されたＥ寒天プレート上の均一な細胞叢を得た。示す量の化合物を含有する濾紙を叢の上に置いた。プレートを３７℃で終夜インキュベーションしてからクリアリングのゾーンを測定した。ゾーンアッセイは表１２に示すように、チエニルアラニンに対する感受性の傾向を確証した。ｎｚ＝ゾーンなし用いた株の関連する遺伝子型を表１３に示す。実施例１０突然変異誘発化合物の同定対標準的エイムス復帰突然変異体アッセイ実施例１０は標準的な復帰突然変異体に基づくエイムス試験に対し、ｒｅｃＡ −ＬＵＸ含有検出細胞を用いる突然変異誘発化合物に関するスクリーニングの感受性及び精度を比較する。本実施例は、サルモネラ・チフィムリウム株ＴＡ１００、ＴＡ１５３５、ＴＡ９７ａ及びＴＡ９８ならびにエシェリキア・コリ株ＷＰ２ｕｖｒＡ（ｐＫＭ１０１）に供した試験物質の突然変異誘発性の可能性を評価した。サルモネラ株はヒスチジン生合成酵素をコードする遺伝子における突然変異の故に必須アミノ酸であるヒスチジンを合成することができない。欠失遺伝子における追加の突然変異はヒスチジンを合成する能力を再取得したそれぞれのサルモネラバクテリアを生じ得る［（Ｍａｒｏｎ，Ｄ．Ｍ．ａｎｄＢ．Ｎ．Ａｍｅｓ，ＭｕｔａｔｉｏｎＲｅｓｅａｒｃｈ１１３，１７３−２１５，（１９８３）］。Ｅ．コリＷＰ２ｕｖｒＡ（ｐＫＭ１０１）はトリプトファン生合成に必要な遺伝子におけるオーカー突然変異の故にトリプトファンを合成することができない。Ｅ．コリ復帰突然変異体は、オーカー部位におけるさらなる変化又はｔＲＮＡ遺伝子中のある遺伝子座におけるサプレッサー突然変異から生じ得る［Ｂｒｕｓｉｃｋｅｔａｌ．，ＭｕｔａｔｉｏｎＲｅｓｅａｒｃｈ７６，１６９−１９０（１９８０）］。トップ寒天（ｔｏｐａｇａｒ）における微量のヒスチジン又はトリプトファンは栄養要求性細胞分裂のいくつかの世代が原−突然変異誘発性障害を定着させることを許す。これはバクテリアの微視的な「叢」の形成を生ずる。しかしながら原栄養要求性状態に復帰するバクテリアのみは分裂し続けることができ、巨視的なコロニーを形成することができる。これらの復帰突然変異体に、ヒスチジン（Ｓ．チフィムリウム株）又はトリプトファン（Ｅ．コリ）が欠乏した寒天プレート上で生育する能力により記しをつけることができる。化学的に誘導される復帰突然変異体の数を自然の復帰突然変異体の数と比較することにより、試験物質の突然変異誘発性を評価することができる。試験物質及び負の標準ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）は調べたすべての化合物の場合に用いられた溶媒であり、かくして試験物質溶媒として及び負の標準として選ばれた。試験物質の希釈は室温においてＤＭＳＯ中で行った。負の標準はこの研究の間、安定であると仮定され、不安定性の証拠は観察されなかった。不純物が研究を妨害したとは思われなかった。正の指示物質正の指示物質は以下を含んだ：２−アミノアントラセン（２ＡＡ）、２−ニトロフルオレン（２ＮＦ）、アジ化ナトリウム（ＮＡＡＺ）、ＩＣＲ１９１アクリジン（ＩＣＲ１９１）及びメチンスルホン酸メチル（ＭＭＳ）。脱イオン水はＮＡＡＺ、ＩＣＲ１９１及びＭＭＳのための溶媒であった。他の正の指示物質のための溶媒はＤＭＳＯであった。正の指示物質はこの研究の間、安定であると仮定され、不安定性の証拠は観察されなかった。不純物が研究を妨害したとは思われなかった。サルモネラテスター株の特性化Ｓ．チフィムラウムテスター株はＤｒ．ＢｒｕｃｅＡｍｅｓ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡから入手した。Ｓ．チフィムリウム株の表現型の特性及び突然変異感受性を下記の通りに表１４にまとめる：ｕｖｒＢ（ＤＮＡ切除修復をコードする遺伝子）における欠失は突然変異原に対するバクテリアの感受性を向上させる。［ＡｍｅｓＢ．Ｎ.，Ｆ．Ｄ．Ｌｅｅ，ａｎｄＷ．Ｅ．Ｄｕｒｓｔｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７０，７８２−７８６，（１９７３）］。紫外光に対するバクテリアの感受性の向上を示すことによりｕｖｒＢの特徴が確証される。この欠失はビオチン生合成に必要な遺伝子を介して広がりもするので、バクテリアは生育のために外生のビオチンを必要とする。ｒｆａ突然変異はリポ多糖（ＬＰＳ）細胞壁の一体性における部分的損失を引き起こし、大分子の透過性が増す（Ａｍｅｓｅｔａｌ.，１９７３）。Ｒ−因子プラスミド（マーカー遺伝子としてアンピシリン耐性を保有しているプラスミドｐＫＭ１０１）の存在は、これらのバクテリアに内在性である誤りがちなＤＮＡ修復システムの強化を生ずる。［ＭｃＣａｎｎｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７２，９７９−９８３，（１９７５）］引用した試験ガイドラインはＳ．チフィムリウム株ＴＡ１５３７を必要としているが、もっと最近に開発されたＴＡ９７ａ株を用いた。ＴＡ９７はＴＡ１５３７のために推薦される代替株であり、フレームシフト突然変異原に対してより感受性であることが示された。（１，５）しかしながら再構築された株Ｔａ９７ａが現在ＴＡ９７の代わりに慣例的に用いられており、それは向上したその生育性の故である（ＢｒｕｃｅＡｍｅｓ及び共同研究者との個人的な連絡）。Ｅ．コリＷＰ２ｕｖｒＡ（ｐＫＭ１０１）はＮａｔｉｏｎａｌＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＢａｃｔｅｒｉａ，ＴｏｒｒｅｙＲｅｓｅａｒｃｈＳｔａｔｉｏｎ，Ｓｃｏｔｌａｎｄから入手した。トリプトファン生合成がオーカーナンセンス突然変異により遮断されているので、塩基対置換の結果として復帰突然変異体が生ずる。第２の種類の突然変異体がｔＲＮＡｓをコードする遺伝子におけるナンセンスサプレッサー突然変異の結果として生じ得る。フレームシフト突然変異原は一般にこの株により検出されると思われない。（Ｂｒｕｓｉｃｋ，ｅｔａｌ．同上）サルモネラテスター株の保存及び培養すべてのバクテリア株を約−７０℃においてＯｘｏｉｄ栄養ブイヨン中の８％ＤＭＳＯ中で凍結して保存した。２０ｍＬのＯｘｏｉｄ栄養ブイヨンに０．１ｍＬの解凍したバクテリア懸濁液を接種し、震盪させながら３７℃でインキュベーションすることにより終夜培養物を調製した。終夜培養物は次いで突然変異誘発アッセイに用いるまで氷上で保存した。バクテリア株の表現型を以前に保存した単離物に関して確認し、各試験と同時には確認しなかった。株の凍結された永久原料に関する結果は適した応答を示した。用量選択評価した最高濃度は、プレート当たり１００μｇの濃度における試験物質の溶液又は懸濁液であった。溶解度の情報は、必要な時に実験的に確認した。濃度は、溶媒への試験物質の添加が得られる溶液の体積を変えないと仮定して計算した。安定性及び濃度の検証試験物質の溶液は処理の直前に調製し、研究条件下で安定であると仮定した。処理及び対照用の提案溶液（ｔｒｅａｔｍｅｎｔａｎｄｃｏｎｔｒｏｌｄｏｓｉｎｇｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）は濃度、均一性又は安定性に関して分析しなかった。トップ寒天は安定性又は試験物質もしくは標準品の濃度に関して検定せず、それはこの評価が研究の目的の達成に必要と思われなかったからである。バクテリア突然変異誘発アッセイこの研究は代謝活性化を含まない１つの試験から成った。各テスター株、試験濃度及び条件に関して３重の複製をプレート化した。すべてのアッセイに正の指示物質及び負の標準を含んだ。活性化を伴う処理は０．１ｍＬの負の標準又は試験物質溶液、０．５ｍＬのＳ９混合物及び０．１ｍＬの少なくとも１ｘ１０８個のバクテリアを含有する終夜培養物を、Ｓ．チフィムリウム株の場合は０．０５ｍＭのＬ−ヒスチジン及び０．０５ｍＭのＤ−ビオチンあるいはＥ．コリ株の場合は０．０５ｍＭのＬ −トリプトファンが補足された２ｍＬのトップ寒天［０．６％寒天（ｗ／ｖ）及び０．６％ＮａＣｌ（ｗ／ｖ）］に加えることにより行った。これらの成分を混合し、デキストロースを含む２５ｍＬのＤａｖｉｓ最少寒天を含有するプレート（最少寒天プレート、ＭＯＬＴＯＸから購入）上に注いだ。それぞれに標識されたプレートを約３７℃で約４８時間インキュベーションした後に復帰突然変異コロニーを計数した。必要な場合は計数の前にプレートを冷却した。統計的分析各テスター株に関し、それぞれの濃度における復帰突然変異体の平均数及び標準偏差を計算した。分類ガイドライン（１）調べたいずれの試験物質濃度においても、いずれの株における復帰突然変異体の平均数も負の標準における復帰突然変異体の平均数より少なくとも２倍大きく；且つ（２）その同じ株において正の用量−応答関係がある場合に、試験物質を陽性であると分類した。（１）負の標準における復帰突然変異体の平均数より少なくとも２倍大きい復帰突然変異体の平均数を有する試験物質濃度がない；及び（２）正の用量−応答関係がないのいずれかの場合に試験物質を陰性であると分類した。試験物質、ＡＡ、ＢＢ、ＣＣ、ＤＤ、ＥＥ、ＦＦ及びＧＧを、外生代謝活性系（Ｓ９）なしで、サルモネラ・チフィムリウム株ＴＡ１００、ＴＡ１５３５、ＴＡ９７ａ及びＴＡ９８ならびにエシェリキア・コリ株ＷＰ２ｕｖｒＡ（ｐＫＭ１０１）における突然変異誘発性に関して評価した。６．２５、１２．５、２５．０、５０．０及び１００．０（ｇ／プレート）の濃度を負の（溶媒）標準に対する比較において評価した。これらの研究条件下で、評価された７つの試験品の中の５つにおいて突然変異誘発活性の証拠が検出された。結果を下記の表１５にまとめる：（ａ）１００ｕｌのアッセイ容積（ｂ）２８ｍｌのプレート容積ＡＡ、ＢＢ、ＣＣ、ＥＥ、ＦＦ及びＧＧは突然変異誘発活性の証拠を示した。試験−物質関連毒性として判断されたものの故に、ＤＤの突然変異誘発性の評価のために十分に受け入れられない濃度があった。６つの光誘導化合物（２欄）の中の５つは突然変異誘発性でもあるが（４欄）、光を誘導するための閾値は（２欄）突然変異を引き起こすための閾値（４欄）と等しいか又はそれより低いようである。さらに、消灯アッセイ（３欄）は生育阻害アッセイ（５欄）より優れているようである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１１年２月２５日（１９９９．２．２５）【補正内容】他は、生物発光性バクテリア、ビブリオ・フィシェリ（Ｖｉｂｒｉｏｆｉｓｃｈｅｒｉ）から単離された５つの遺伝子の組、ｌｕｘＣＤＡＢＥである。真核及び原核遺伝子の両方が検出物質として働くために組み換え系において用いられてきた。ホタルルシフェラーゼをコードするｃＤＮＡがＥ．コリにおいてｌａｃｚプロモーターの制御下で発現され［Ｔａｔｓｕｍｉｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．ＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ．，１１３１，（２），ｐｐ１６１−１６５，（１９９２）］、ｌｕｘＡＢ融合遺伝子が強力なＰｘｙｎプロモーターの制御下にそれを置くことにより、Ｅ．コリにおいて達成可能な量に匹敵する量でバシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）において発現された（Ｊａｃｏｂｓｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２３０（１−２），ｐｐ２５１−２５６，（１９９１）］。バクテリア遺伝子も単離され、発現された。Ｒｙｃｈｅｒｔｅｔａｌ．，［Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｔｏｘｉｃ．ＷａｔｅｒＱｕａｌ．，６（４），ｐｐ４１５−４２２（１９９１）］は、プロモーターのないビブリオ・フィシェリのｌｕｘ遺伝子複合体を含有するプラスミド、ｐＪＥ２０２を保有する組み換えＥ．コリがＺｎ²⁺、エチジウムブロミド、ナトリウムペンタコロフィエート（ｓｏｄｉｕｍｐｅｎｔａｃｈｏｒｏｐｈｅａｔｅ）、Ｃｕ²⁺及び２，４−ジクロロフェノキシ酢酸に感受性であることを示した。このアッセイにおける応答は、形質転換されたＥ．コリにより発せられるベースライン光の減少により記録された。種々の毒物に特異的なアッセイにおいて用いるために、プロモーターのないバクテリア遺伝子複合体の使用の他に、異種プロモーターをバクテリア生物発光性構造遺伝子に融合させた。例えばｌｕｘ遺伝子複合体を化学的に応答性のバクテリアプロモーターに融合させ、次いでそのようなキメラを適した宿主中に置くことによって組み換えバクテリアを開発した。これらの組み換えバクテリアは特定の刺激に応答して光るセンサー生物である。この型の遺伝子融合の例はＢｕｒｌａｇｅｅｔａｌ．，［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２（９）ｐｐ４７４９−４７５７（１９９０）］により記載されており、そこではナフタレン分解経路のためのプロモーターを含有するプラスミドＮＡＨ７からのＤＮＡフラグメントをビブリオ・フィシェリのｌｕｘ遺伝子に融合させ、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）のある株の形質転換に用いている。得られる形質転換株はナフタレンの存在下で発光の増加を示す。生物発光の誘導は形質転換生物によるナフタレン分解と同時に起こることが示された。水銀（Ｈｇ）に特異的に応答性の他の試験系がＨ．Ｍｏｌｄｅｒｓ（ＥＰ４５６６６７）により記載されている。この場合、生物発光を担うバクテリアルシフェラーゼ（ｌｕｘＡＢ）遺伝子複合体に融合したＨｇイオンにより特異的に誘導可能なｍｅｒプロモーターを含有する指示バクテリア株が与えられる（ベクター −媒介遺伝子転移により）。Ｍｏｌｄｅｒｓの試験系は水銀の存在によるｍｅｒプロモーターの誘導及び続く組み換えバクテリアからの発光の増加に頼っている。化学品に対して特異的に応答性の試験系と対照的に、多様な化学品に対する全体的調節応答を測定する（ｍｅａｓｕｒｅｓ）原核系がＶａｎＤｙｋｅｅｔａｌ．［Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６０（５），ｐｐ．１４１４−１４２０（１９９４）］により記載されている。この系では、ビブリオ・フィシェリのｌｕｘ遺伝子へのＥ．コリからの熱ショックプロモーターの融合体を含有するＥ．コリ株が多くの化学的ストレスに対して生物発光の増加により応答した。化学毒性の決定のための方法としての真核細胞のストレス応答の測定はＦａｒｒａｎｄＴｏｄｄ（ＷＯ９４１７２０８）により記載された。この場合、該開示は本来の真核細胞のストレスプロモーターに結合した遺伝子からの転写及び翻訳量の測定のための方法を提供した。以下のそれぞれの群からの少なくとも１つのストレスプロモーターが用いられている：レドックスストレス、ＤＮＡストレス、タンパク質ストレス及びエネルギー／イオン性ストレス。この方法は真核細胞における化学品の作用の様式についての情報を与える；しかしながらそのような情報は化学品の作用部位についての情報を直接与えはしないであろう。出願人等は以前に、共同所有されている１９９７年３月２４日申請の米国特許第５，７３１，１５３号及び’９９７年１１月４日申請の米国特許第５，６８３，８６８号（ＷＯ９４１３８３１）において、遺伝子毒性ストレスに感受性のものを含む種々の真核細胞のストレスプロモーターの使用を開示している。ＷＯ９４１３８３１は、タンパク質損傷（熱ショック）、ＤＮＡ損傷（遺伝子毒性）、酸化的損傷、細胞膜損傷、アミノ酸欠乏、炭素欠乏及び窒素欠乏に感受性のものを含むストレスプロモーター−生物発光性遺伝子融合体を含有する検出生物の、種々の環境的ストレスの検出のための使用を記載している。米国特許第５，７３１，１６３号は、類似して形質転換された検出細胞の、凍結乾燥された試薬としての使用を示している。最後に、共同所有されているＵＳＳＮ０８／７３５，５４５において、出願人等はゲノムＤＮＡの制限から単離されるバクテリアプロモーターに融合した生物発光性リポーターの、新規な化合物感受性プロモーターの同定のための使用を記載している。従って克服されるべき問題は、人間を含む動物又は環境に無毒である農業化学的又は製薬学的に活性な生体異物化合物の作用部位の同定のための迅速で容易な方法を開発することである。発明の概略本発明は：（ｉ）発光性リポーター遺伝子複合体に操作可能的に結合して生物発光に関して陽性の表現型を検出バクテリアに与える遺伝子融合体を形成している遺伝子毒性−感受性プロモーターを含んでなる検出バクテリアとストレッサー（ｓｔｒｅｓｓｏｒ）とを接触させ、ここで遺伝子毒性−感受性プロモーターの遺伝子毒性化合物への暴露は発光性リポーター遺伝子複合体の高められた発現を推進し、生物発光シグナルを増加させ（ｉｉ）検出バクテリアの生育及び光の放射量（ｌｉｇｈｔｏｕｔｐｕｔ）を監視することにより段階（ｉ）の検出バクテリアの生育を阻害することができる遺伝子毒性もしくは非−遺伝子毒性ストレッサーに関して選択し；（ｉｉｉ）段階（ｉｉ）で選択される生育−阻害性遺伝子毒性もしくは非−遺伝子毒性ストレッサーを作用部位スクリーニングに供し；（ｉｖ）検出バクテリアにおいて作用部位を同定し；（ｖｉ）標的生物において作用部位を確認することを含んでなるストレッサーの作用部位の同定のための方法を提供する。本発明はさらにｒｅｃＡ−ＬｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子融合体を含んでなる検出バクテリア株ならびに多数の細胞及び膜突然変異を有する非−生物発光性親株を提供する。本発明はさらに：（ｉ）ＳＯＳバクテリア調節回路により調節されるプロモーター及びｌｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子複合体を含んでなり、ここでｌｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子複合体はバクテリア染色体においてＳＯＳプロモーターの下流に位置し、ＳＯＳプロモーターが発現されるとｌｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子複合体も発現される検出細胞を培養し；（ｉｉ）培養物を調べられるべき物質と接触させ；（ｉｉｉ）培養物における発光の放射量を測定することにより、物質が遺伝子毒性であるかどうかを決定する段階を含んでなる、化合物が遺伝子毒性であるかどうかを決定するための方法を提供する。本発明はさらに：（ｉ）発光性リポーター遺伝子複合体に操作可能的に結合して生物発光に関して陽性の表現型を検出バクテリアに与える遺伝子融合体を形成している遺伝子毒性−感受性プロモーターを含んでなる検出バクテリアとストレッサーとを接触させ、ここで遺伝子毒性−感受性プロモーターの遺伝子毒性化合物への暴露は発光性リポーター遺伝子複合体の高められた発現を推進し、生物発光シグナルを増加させ；（ｉｉ）検出バクテリアの生育及び光の放射量を監視することにより段階（ｉ）の検出バクテリアの生育を阻害することができる遺伝子毒性もしくは非−遺伝子毒性ストレッサーに関して選択し；（ｉｉｉ）生育−阻害性遺伝子毒性もしくは非−遺伝子毒性ストレッサーを、ストレッサー標的が同定される作用部位スクリーニングに供し；（ｉｖ）ストレッサー標的をコードする構造遺伝子を単離することを含んでなるストレッサー標的をコードする構造遺伝子を同定する方法を提供する。他の態様において、本発明はグリホセート−様活性、チエニルアラニン−様活性及びＡＬＳ−阻害活性を有する化合物の同定のための方法を提供する。図、生物寄託及び配列表の簡単な記載図１（フローチャート−株１ａ及び１ｂ）は、本発明で用いる検出細胞の系統を示す図である。実線の矢印は非−生物発光性株の構築を示す。破線の（ｂｒｏｋｅｎ）矢印は生物発光性誘導体の構築を示す。バクテリアの単離に用いられる選択及びスクリーニングを大文字及びイタリック活字体で示す。関連する遺伝子型をイタリックにする。ｉｇｍは最少培地上における向上した生育を示す。図２（方法チャート）は、本検出細胞を用いて遺伝子毒性に関して化合物をスクリーニングし、非−遺伝子毒性化合物の作用部位を遺伝子滴定の栄養復帰により決定する本発明の方法を示すフロー図である。図３は特定の標的の生体内阻害剤同定のための方法の図であり、既知の活性に関する化合物のスクリーニングを示している。図４ａはｉｌｖＢ、ｉｌｖＩ、ｉｌｖＨ、ｉｌｖＧｒｅｌＡ及びＳｐｏＴ突然変異ならびにｒｅｃＡ−ＬｕｘＣＤＡＢＥを含み、ｔｏｌＣ＋であり、ＤＮＡ損傷薬剤マイトマイシンＣに暴露された株ＤＰＤ１７１５のＲＬＵ対時間のプロットである。図４ｂはｒｅｃＡ−ＬｕｘＣＤＡＢＥ及びｔｏｌＣ＋を含み、ＤＮＡ損傷薬剤マイトマイシンＣに暴露された株ＤＰＤ１７３０のＲＬＵ対時間のプロットである。株の構築の方法は当該技術分野において周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ．ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（１９８９）；ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉａｎｄＳａｌｍｏｎｅｌｌａ；ＣｅｌｌｕｌａｒａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（Ｎｉｅｄｈａｒｄｔｅｔａｌ．Ｅｄｓ．，ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９６））］において十分に議論された分子生物学及び微生物学の基本的要素を用いている。培養条件：典型的に細胞は適した培地中で３７℃において生育させる。本発明において好ましい生育培地はＶｏｇｅｌ−Ｂｏｎｎｅｒ培地（Ｄａｖｉｓｅｔａｌ．，ＡｄｖａｎｃｅｄＢａｃｔｅｒｉａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ，（１９８０），ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ：ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）などの通常の規定培地である。他の規定又は合成生育培地を用いることもでき、特定の微生物の生育に適した培地は微生物学又は発酵科学の技術分野における熟練者にわかるであろう。いくつかの場合にはＮＢ（栄養ブイヨン）などの濃厚又は完全培地を用いる。バクテリア生育に適したｐＨ範囲はｐＨ５．０〜ｐＨ９．０であり、ｐＨ６．０〜ｐＨ８．０が初期条件として好ましい。液体培地中におけるバクテリア細胞の生育は、初期対数期、中期対数期、後期対数期又は定常期などの種々の生育期において均一な細胞集団にストレスを与えることを可能にする。ストレスは細胞攻撃物又はストレッサーへの暴露の結果として細胞に生ずる状態である。この細胞ストレスは、バクテリア細胞又は細胞集団における正常な細胞代謝の改変を生ずるいずれの物質又は細胞環境の変化によっても引き起こすことができる。除草剤、作物保護化学品、環境汚染物又は重金属などの化学品の生育培地への添加はそのようなストレスを引き起こすことができる。さらに温度の変化、ｐＨの変化、酸化的損傷又はＤＮＡ損傷（例えばＵＶ暴露から）を生む因子、嫌気的生活あるいは硝酸塩利用性の変化は同様にストレスを引き起こし得る攻撃物である。ストレッサー生体内異物及び作物保護化学品本方法は多様な生体異物化学品そして特に作物保護化学品として有用な化合物に関する作用部位を同定するために有用である。本方法はスルホニルウレア除草剤、例えばスルホメツロンメチル、グリホセート、原殺菌・殺カビ剤、例えばオキシムカルバメート、オキシダント、例えばメチルビオロゲン（パラクアト）、ホルモン性除草剤、例えば２，４−ジクロロフェノキシ酢酸ならびに殺菌・殺カビ剤、例えば２−チエニルアラニンから選ばれるがこれらに限られない化合物の作用部位の決定のために有用である。バクテリア代謝に負の影響を与えるいずれの化学品もこの方法で分析することができる。かくして抗バクテリア剤のみでなく、抗ウィルス剤、抗ガン剤、防腐剤、殺菌剤及び作物保護化学品も本発明を用いて分析することができ、それは多くのそのような化合物の作用部位が多くの場合にバクテリア及び標的生物が共有する酵素又は補因子だからである。細胞をマイトマイシンＣに暴露することにより、遺伝子毒性因子への検出細胞の感受性を調べた。中程度の量（ｔｏｌＣ⁺株の場合０．３〜２０μｇ／ｍＬ、ｔｏｌＣ誘導体の場合０．３〜１．２５μｇ／ｍＬ）のマイトマイシンＣはベースライン発光の増加を生じた。多量（ｔｏｌＣ株における＞２．５μｇ／ｍＬ）のマイトマイシンＣは発光の減少を生じた（図４及び５）。多様な突然変異を含有する検出細胞を４種類の除草剤（ＳＭ、ＭＶ、ＧＰ及び２，４−Ｄ）で処理し、検出細胞の生物発光の放射量への化合物の影響を決定した。それぞれの場合に動力学的プロットは除草剤に対応して発光における用量− 依存性減少を示す。影響を示すデータは図６〜９にある）。ｔｏｌＣ突然変異を含有する検出細胞を変化する濃度のＳＭ及びマイトマイシンＣに暴露し、アッセイの感度への突然変異の影響を決定した。表２及び３ならびに図４及び１０及び４に記されている通り、ｔｏｌＣ突然変異は親油性のＳＮに対する検出細胞の応答性を強化したのみでなく、マイトマイシンＣに対しても強化した。これらの試験は検出細胞の成分としてのｔｏｌＣ突然変異の有益性を示した。２つのＣＰＣ’ｓの作用部位をｒｅｃＡ−ＬｕｘＣＤＡＢＥ融合体を含む検出細胞を用いて分析した。生物発光性検出細胞を用い、それぞれの化合物に栄養復帰を適用してどの栄養素が化合物の生育阻害効果から復帰させるかを決定した。表２及び３に示す通り、オキシムカルバメート化合物で処理された細胞の場合に影響される可能性のある部位としてシステイン代謝が同定され、チエニルアラニンで処理された細胞の場合にフェニルアラニン代謝が作用部位として同定された。最後にｉｌｖＢ、ｒｅｌＡ及びｔｏｌＣ対立遺伝子を保有している検出細胞を遺伝子滴定アッセイにおいて用い、ＳＭ、２−チエニルアラニン及びＧＰの作用部位を決定した。検出細胞をＥ．コリｃＤＮＡライブラリを用いて形質転換し、形質転換株の生物発光における変化により示されるＳＭに対する耐性に関して形質転換株をスクリーニングした。耐性コロニーを採取し、プラスミドを単離し、配列決定し、標的の可能性のあるものをコードしている遺伝子に関して分析した。このやり方でｉｌｖＢＮ及びｉｌｖＩＨ遺伝子をＳＭの標的であるＡＬＳをコードする遺伝子として同定し、確認した。類似のやり方で、ＧＰに関する既知の標的であるＥＰＳＰＳをコードするａｒｏＡを選択した。２−チエニルアラニン耐性クローンに関する選択においてａｒｏＨ遺伝子が得られた。特定の標的の生体内阻害剤同定を記載する他の代わりの実施態様の場合、本検出細胞を作用部位が既知の化合物に関してスクリーニングするための方法においても利用することができる。そのような実施態様を図３に示す。ストレスプロモーター−ｌｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子融合体のみでなく、スクリーニングされるべき化合物の遺伝子標的を発現するプラスミドも含むように検出生物を構築することができることが意図されている。例えばＧＰに関する遺伝子標的はａｒｏＡ遺伝子によりコードされる５−エノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）であることが既知であり、ＥＰＳＰＳ遺伝子産物を発現するようにプラスミドが構築された。スクリーニングされるべき化合物を標準的検出細胞（１）及び発現可能な遺伝子標的（３）を適した濃度で含有する改変検出細胞（２）に暴露する。化合物（４）を加えないと両方の検出細胞においてベースライン発光が与えられるであろう。生育を阻害する化合物（５）の添加は両方の検出細胞において発光の減少を生ずるであろう。しかしながらグリホセート−様分子（６）への標準的検出細胞（１）の暴露が発光の減少を生ずるであろう場合、同じ化合物の改変検出細胞（２）への暴露は発光の減少がもっと小さいか又はないであろう。化合物は改変検出細胞（２）における遺伝子標的の発現により遺伝子的に滴定された。Ｅ．コリａｒｏＡ遺伝子を植物もしくは他のバクテリアのａｒｏＡ類似体で置き換え得ることは当該技術分野における熟練者にわかるであろう。さらにこの方法でいずれの問題の標的に関する化学品も同定できることが意図されている。ここで例示した特定の標的の生体内阻害剤同定の方法を用い、新しい作物保護化学品、抗バクテリア性化学品、殺菌・殺カビ性化学品、抗ガン性化学品、抗−ウィルス性化学品、バイオフィルム（ｂｉｏｆｉｌｍ）形成を妨げる化学品及び防腐剤を含むがこれらに限られない多くの有用な化合物を同定することができた。特定の標的の生体内阻害剤同定の方法を例えばＡＬＳＩＩＩの阻害剤の検出に用いることもできる。例えばアンピシリンもしくはテトラサイクリン耐性に関して選択するｐＢＲ３２２を用いてＤＰＤ１７１８を形質転換し、株ｐＢＲ３２２／ＤＰＤ１７１８を得ることができた。同様にＤＰＤ１７１８をアンピシリン耐性に関して選択するｉｌｖＩＨ含有プラスミドを用いて形質転換し、ＡＬＳＩＩＩ表現型を有する株ｐＩＩｖＩＨ／ＤＰＤ１７１８を得ることができる。これらの２つの形質転換された株を次いでＡＬＳＩＩＩの特異的阻害剤に関してスクリーニングするために用いることができ、それはＡＬＳＩＩＩの力価がｐＢＲ３２２／ＤＰＤ１７１８におけるより株ｐｌｌｖＩＨ／ＤＰＤ１７１８においてずっと高いであろうからである。予想される結果は以下である：同じ形質導入法を用い、表１に報告した株ＤＰＤ１７１５、ＤＰＤ１７３０、ＤＰＤ１７２８、ＤＰＤ１７２９、ＤＰＤ１７１６、ＤＰＤ１７０８、ＤＰＤ１７１９、ＤＰＤ１７０９及びＤＰＤ１７１４を作った。実施例２ＤＮＡ損傷因子マイトマイシンＣの存在下で強化される生物発光遺伝子毒性物質に関する感受性に関して検出細胞を調べるために、株ＤＰＤ１７１５及びＤＰＤ１７３０をＬＢ培地において中期対数期まで生育させた。株ＤＰＤ１７１５及びＤＰＤ１７３０は、ＤＰＤ１７３０がｔｏｌＣであるがＤＰＤ１７１５はｔｏｌＣ＋である点のみで異なる。培地に０〜２０μｇ／ｍＬの範囲で変化する濃度のマイトマイシンＣを加えた。遺伝子毒の導入後の発光の動力学を、温度を３７℃に制御する以外は以前に記載された通りに（ＶａｎＤｙｋｅｅｔａｌ．，ＡｐｐｌｉｅｄａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ６０，１４１４，（１９９４））、ミクロタイタープレートフォーマットルミノメーターを用いて監視した。動力学を図４（ａ）及び（ｂ）に示し、用量−応答曲線を図５に示す。ＤＰＤ１７３０［ｔｏｌＣ−］（図４（ｂ））の場合、高濃度のマイトマイシンＣ（本明細書では約２．５μｇ／ｍＬより高い）は生育に帰し得る発光の増加を阻害又は妨害するであろう。低濃度（２．５μｇ／ｍＬ未満）では、細胞は化学品の存在を認識しない。中濃度（０．６３及び０．３１μｇ／ｍＬ）で細胞は、模擬処理された標準を越える生物発光の大きな増加により簡単に監視される通り、ＳＯＳ応答の誘導による損傷に応答し、それは時間の関数として現れる。対照的にｔｏｌＣ＋株であるＤＰＤ１７１５（図４（ａ））はマイトマイシンＣに対してずっと感受性が低い（図５を参照されたい）。誘導はマイトマイシンＣ濃度の全範囲を通して観察された。阻害効果は観察されなかった。予想通り、誘導はｌｅｘＡ−依存性であることが、ＤＮＡ損傷へのＳＯＳ応答を制御するｌｅｘＡ遺伝子において異なっている同質遺伝子対の株中に形質導入により導入された融合体の動力学及び用量−応答曲線により示された。ＳＯＳ応答が活性化されるべき場合はｌｅｘＡによりコードされるＬｅｘＡリプレッサーが切断されねばならない［Ｗａｌｋｅｒ，１９９６，ｉｎＥ．ｃｏｌｉａｎｄＳａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ：ＣｅｌｌｕｌａｒａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（Ｎｉｅｄｈａｒｄｔｅｔａｌ．，Ｅｄｓ．，ｐｐ１４００−１４１６，ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９８７））］。株ＤＰＤ１７０７上で生育させたファージ原料を用い、ｌａｃＺ：：ｒｅｃＡ’φ’ｌｕｘＣＤＡＢＥ融合体を株ＤＭ８００（ｌｅｘＡ⁺）及びＤＭ８０３（非−開裂性リプレッサー遺伝子産物の故に非誘導性ｌｅｘＡ［Ｍｏｕｎｔｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔ．，１１２：８８６（1９７２）］中に形質導入により導入した。生物発光性であるそれぞれの交雑（ｃｒｏｓｓ）からの１つのクロラムフェニコール形質導入株を保存し、ＤＰＤ１７１４（ｌａｃＺ：：ｒｅｃＡ’φ’ｌｕｘＣＤＡＢＥｌｅｘＡ⁺）及びＤＰＤ１７０９（ｌａｃＺ：：ｒｅｃＡ’φ’ｌｕｘＣＤＡＢＥｌｅｘＡ）と命名した。マイトマイシンＣ処理は株ＤＰＤ１７１４からの発光を強化させたが、株ＤＰＤ１７０９からの発光は強化させず、ＬｅｘＡリプレッサーを切断できないことが生物発光の増加を妨害しているので、該処理が真のＳＯＳ応答を引き出すことを示している。実施例３４つの作物保護化学品を用いる処理の後に減少する生物発光実施例３は、検出細胞の光の放射量への４種の作物保護化学品の影響を示す。検出株を上記の通りに中期対数期まで生育させ、以下の条件に従ってスルホメツロンメチル、メチルビオロゲン、グリホセート及び２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）で処理し、この場合すべての培養物を３７℃に保持し、０〜９０分間をかけて試験を行った。株ＤＰＤ１７１８を７８〜５０００μｇ／ｍＬの濃度範囲に及ぶ２，４−Ｄに暴露した。生物発光における調節（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）を図６に示す。株ＤＰＤ１７１５を２．５〜２５００μｇ／ｍＬの濃度範囲に及ぶグリホセートに暴露した。生物発光における調節を図８（ａ）及び（ｂ）に示す。株ＤＰＤ１７１８を２４〜１８００μｇ／ｍＬの濃度範囲に及ぶスルホメツロンメチルに暴露した。生物発光における調節を図７に示す。株ＤＰＤ１７３０を０．７５〜４８μｇ／ｍＬの濃度範囲に及ぶメチルビオロゲンに暴露した。生物発光における調節を図９に示す。動力学的データを示す図から明らかな通り、すべての作物保護化学品は検出株からの発光における用量−依存性減少を与えた。実施例４ｔｏｌＣはスルホメツロンメチル及びマイトマイシンＣへの応答を強化する実施例４はスルホメツロンメチル及びマイトマイシンＣに対する検出細胞の応答へのｔｏｌＣ突然変異の影響を示す。上記の通りに検出細胞を中期対数期まで生育させた。検出細胞をある範囲の作物保護化学品に暴露し、暴露から８０分後に生物発光を測定した。株ＤＰＤ１７１５（ｔｏｌＣ＋）及び株ＤＰＤ１７２８（ｔｏｌＣ）を０．００６〜０．４μｇ／ｍＬの濃度範囲に及ぶスルホメツロンメチルに暴露し、応答を図１０（ａ〜ｃ）で比較した。同様にｔｏｌＣ＋及びｔｏｌＣ株を０〜２０μｇ／ｍＬの濃度のマイトマイシンＣに暴露し、応答を図５で比較した。データから、ｔｏｌＣ突然変異がＣＰＣに対する検出株の感受性を強化する効果を有することが明らかである。ｔｏｌＣ−株の効力を示す生物発光アッセイをディスク拡散アッセイを用いて確証した［Ｓｔｅｐｈｅｎｓｅｔａｌ．，ＰＮＡＳ７２，４３８９，（１９７５）；ＬａＲｏｓｓａＲ．Ａ．ａｎｄＪ．Ｖ．Ｓｃｈｌｏｓｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９，８７５３（１９８４）］（データは示さない）。実施例５栄養復帰によるオキシムカルバメートＯＣ、グリホセート及びチエニルアラニンの作用部位の示唆実施例５はオキシムカルバメートＯＣ、グリホセート及びチエニルアラニンの作用部位の同定のための検出細胞の使用を示す。株ＤＰＤ１７１８を最少培地又はＬＢ培地において３７℃で生育させ、多様な濃度に及ぶ３−（２−チエニル）−Ｌ−アラニン又はオキシムカルバメートプロファンギサイド化合物ＯＣのいずれかに暴露した。３−（２−チエニル）−Ｌ− アラニンの濃度は最少及びＬＢ培地の両方における生育の場合に０〜１００μｇ／ｍＬの範囲であった。化合物ＯＣの濃度は最少培地において生育した細胞の場合に０〜１００μｇ／ｍＬの範囲であり、ＬＢ培地において生育した細胞の場合に０〜１０００μｇ／ｍＬの範囲であった。最少及びＬＢ濃厚培地の両方において生育した細胞の場合のグリホセートの濃度は０〜５０００ｕｇ／ｍＬの範囲であった。図１１（ａ）、（ｂ）、１２（ａ）、（ｂ）及び１３（ａ）、（ｂ）におけるデータによりわかる通り、これらの化合物を用いる検出細胞の処理は、最少培地において発光を減少させたが、濃厚ＬＢ培地において発光は減少しなかった。オキサノグラフィを用いてこれらの実験の作物保護化学品の光−阻害効果の除去を担う栄養素を決定した。オキサノグラフィ案：株ＤＰＤ１７１８を最少培地において中期対数期まで生育させた。種々の塩基、ビタミン及びアミノ酸を示す合計１１個の個別のプールを作る（表２、５）。それぞれのプールは１つの成分を他のプールと共有する。それぞれのプールを単独で二重にミクロタイターウェル中に加えた。プールの組成はＤａｖｉｓ，Ｒ．Ｗ．，Ｄ．ＢｏｔｓｔｅｉｎＡｎｄＪ．Ｒ．Ｒｏｇｈ，ＡＭａｎｕａｌＦｏｒＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：ＡｄｖａｎｃｅｄＢａｃｔｅｒｉａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ．Ｘ＋２５４ｐ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ：ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８０，ｐｐ２０６〜２０８に記載されている通り、代謝的センス（ｍｅｔａｂｏｒｉｃｓｅｎｓｅ）を作っている。サルモネラ・チフィムリウムとＥ．コリの間の代謝の相違に適応させるために、記載した１１個のプールにＤａｖｉｓｅｔａｌ．のプールからの小さい変更を加えた。プールの成分は以下の通りであり；プールにおけるその濃度はＤａｖｉｓｅｔａｌ．，同上により記載された通りである：＊培地：Ｅ＋Ｂ１＋グルコース＋グリシン＋プロリン＋ウラシル３７℃／ＤＰＤ１７１８／２５μｇ／ｍＬにおける化合物ＯＣプール３を用い、いくつかの時点に消灯応答の弱い妨害が見られた（データは示さない）。かくしてプール３及び６の個々の成分を消灯応答を妨害するその能力に関して調べた：２−チエニルアラニン作用からの栄養復帰チエニルアラニン阻害の栄養復帰を化合物ＯＣの場合と類似のやり方で行った。上記の通りにプールを作った。図１４に示される通り、プール１及び８によるチエニルアラニン阻害からの復帰が観察された。復帰をフェニルアラニンに帰因させることができ、プールの他の成分に帰因させることはできない。グリホセート作用からの栄養復帰グリホセート阻害からの栄養復帰を化合物ＯＣ及びチエニルアラニンの場合と類似のやり方で行った。図１３（ａ〜ｂ）及び表５に示される通り、プール８のみによるグリホセート阻害からの復帰が観察された。＊培地：Ｅ＋Ｂ１＋グルコース＋グリシン＋プロリン＋ウラシル３７℃／ＤＰＤ１７１８／６００μｇ／ｍＬにおけるグリホセートプール８のみによる復帰は、共通の（ｃｏｍｍｏｎ）芳香族アミノ酸経路における遮断を示している（Ｄａｖｉｓｅｔａｌ．，同上、ｐ．２０８）。かくしてグリホセートの標的経路がこの方法により正確に同定される。スルホメツロンメチル（ＳＭ）作用からの栄養復帰チアミン、グルコース及びウラシルが補足された最少Ｅ培地中で生育している株ＤＰＤ１７１８の生物発光を用量−依存的方法でスルホメツロンメチルにより阻害した（調べた濃度が１８００、９００、４５０、２２５、１１３、６１、３１及び０μｇ／ｍＬであった図１５（ａ）を参照されたい）。２５０μｇ／ｍＬの除草剤の投与により引き起こされたＳＭ阻害からの栄養復帰を図１５ｂの下部パネルに描く。阻害からの復帰において最も有効なプールは３つの分枝鎖状アミノ酸、リシン及びヒスチジンから成るプール７であった。このプールによる復帰は既知のＳＭ作用の部位と一致する。プール１（アデノシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グルタミン、チミン）、９（グルタミン、アスパラギン、ウラシル、アスパルテート、アルギニン）及び１１（ピリドキシン、ニコチネート、ビオチン、パントテネート、アラニン）の場合に、もっと低い程度までのそして非常に遅れた動力学を以ての不完全な復帰が見られた。実施例６遺伝子滴定によるスルホメツロンメチル及びグリホセートの作用部位の同定選ばれた突然変異株とのＧＰ及びＳＭの相互作用の分析によるGP及びＳＭ感受性の特性化グリホセートはＥ．コリＫ１２に対して阻害性であると予測される。対照的にスルホメツロンメチルはｉｌｖＢＮによりコードされる屈折力のあるＡＬＳＩイソ酵素の存在の故にＥ．コリに対して阻害性でない。両方の化合物はＥコリのｉｌｖＢ突然変異株を阻害する。阻害のゾーンのアッセイは、アミノ酸欠乏への緊縮応答のマウンティング（ｍｏｕｎｔｉｎｇ）を妨害するｒｅｌＡ無効対立遺伝子のｉｌｖＢ突然変異株中への導入がＧＰへの過感受性を生ずるがスルホメツロンメチルに対する応答を変更しないことを示す。ＳＭ耐性メロマルチプロイド株ＤＰＤ１６７５は、生来ＳＭに対して耐性の野生型ＡＬＳＩの生産を妨害するｉｌｖＢ突然変異の存在の故に、ｉｌｖＩＨによりコードされる単一のＳＭ −感受性ＡＬＳであるＡＬＳＩＩＩを発現する。それは流出ポンプ媒介による細胞質からのＳＭの排除を妨害するｔｏｌＣ突然変異も含んでいる。これらの２つの突然変異は一緒になってＳＭに非常に感受性の株を生じている。出願人等は最少培地含有プレートにおいて株ＤＰＤ１６７５のＭＩＣが３μｇ／ｍＬであることを決定した。除草剤スルホメツロンメチルの遺伝子滴定を株ＤＰＤ１６７５（表１）において行った。この株はｉｌｖＢ対立遺伝子及びｔｏｌＣにおいて突然変異を保有しており、それは細胞を該除草剤に対して感受性とし、疎水性化合物に対してより透過性としている。この株における該除草剤のＭＩＣは、最少プレート上における１日の生育の後、３μｇ／ｍＬであることが決定された。ＤＰＤ１６７５の凍結された受容性細胞（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１８：１６９（１９９０）の方法により調製）を、ｐＢＲ３２２に基づくもの及びｐＵＣ１８に基づくものの２種類のＥ．コリライブラリからの０．５μＬのプラスミドＤＮＡを用いて形質転換した。形質転換混合物を１回洗浄し、１ＸＥ［Ｄａｖｉｓｅｔａｌ．，同上、ｐｐ．２０２−２０３］中に再懸濁させてから、Ｄａｖｉｓｅｔａｌ．，同上、ｐｐ．２０１−２１０及びＭｉｌｌｅｒ，１９７２，同上、ｐ．４３２において見いだすことができる標準的濃度でチアミン、プロリン、グリシン及びグルコースが補足された最少Ｅプレートにプレート化した。所望のクローンに関する選択は、やはり培地中に含まれたアンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）及びスルホメツロンメチル（９μｇ／ｍＬ）であった。ｐＢＲ３２２又はｐＵＣ１８のいずれかに連結されたＥ．コリ染色体の無作為なフラグメントを含有する２つのライブラリを用いて株ＤＰＤ１６７５を形質転換した。１９個の単離物からのプラスミドは、株ＤＰＤ１６７５中に再導入されるとＳＭに対する耐性を与えた（表６）。対照的に、他の１９個のプラスミドを含有する株ＭＦ２０００の形質転換株はイソロイシン−バリン原栄養体であった。これは、それらがＡＬＳＩ又はＡＬＳＩＩＩのいずれかを発現していること及びプラスミドがｉｌｖＢＮ又はｉｌｖＩＨを保有しているらしいことを示した。これらの挿入片の末端も配列決定し、Ｅ．コリゲノム（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号Ｕ０００９６；表６を参照されたい）の完全な一次配列との比較により、挿入片上に保有されている遺伝子の同定に導いた。示されたデータから、我々はＳＭ−耐性メロマルチプロイドの最初の収集物の中に９個のｉｌｖＢＮ⁺／ｉｌｖＢＮ異型接合体（表６を参照されたい）及び２個のｉｌｖＩＨ⁺／ｉｌｖＩＨ⁺同型接合体があったことを結論した。グリホセート耐性メロマルチプロイドの選択及び特性化株ＤＰＤ１６９２を用いてグリホセート耐性メルマルチプロイドを選択した。出願人等は、最少培地プレートにおいて株ＤＰＤ１６９２のＭＩＣが３．０ｍＭ（０．５６ｍｇ／ｍＬ）のグリホセートであることを決定した。０．５ｕＬのライブラリ１（ｐＢＲ２２に基づく；０．０３７５μｇＤＮＡ）又はライブラリ３（ｐＵＣ１８に基づく、０．１５μｇ、ＤＮＡ）を用いて形質転換された受容性ＤＰＤ１６９２細胞は、濃厚培地プラスアンピシリン上でプレート化すると１０⁴個の形質転換株を与え、かくしてそれぞれマイクログラムＤＮＡ当たりに約３ｘ１０⁵及び０．７ｘ１０⁵形質転換株という頻度を有した。グルコース、グリシン、プロリン、ウラシル及びチアミンならびに選択因子アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）及びグリホセート（３．３ｍＭ＝０．５６ｍｇ／ｍＬ）で修正された最少Ｅ培地から成る選択プレート当たりに約２ｘ１０³個の細胞をプレート化した。グリホセート耐性メルマルチプロイドは３７℃における９６時間のインキュベーションを通じて現れた。グリホセート選択はｐＢＲ＃２２ライブラリからの７個の形質転換株及びｐｕＣ１８ライブラリからの１８個の形質転換株の単離を生じた(表６)。最初の宿主株ＤＰＤ１６９２を２５個のプラスミドで再形質転換すると、グリホセート耐性が得られ、プラスミドが耐性表現型を与えたことを確証した。グリホセート耐性を与えるプラスミドを用いて栄養要求性ａｒｏＡ突然変異Ｅ．コリ株ＡＢ２８２９を形質転換することにより、グリホセートの既知の標的をコードする遺伝子であるａｒｏＡの存在をスクリーニングした。原栄養性の形質転換株は、ａｒｏＡ遺伝子がグリホセート−耐性を与えるブラスミド上に滞留していることを示した。２５個の単離されたプラスミドの中の２つは最少培地上におけるＡＢ２８２９の生育を回復させた。これらの２つのプラスミド上のａｒｏＡの存在を上記のプライマーを用いる配列分析（表６を参照されたい）により確証した。株ＤＰＤ１６９２において２５個のグリホセート耐性プラスミドを比較した場合に、これらの２つのプラスミドはグリホセートに対する最も強い耐性を与えた（データは示さない）。非−ａｒｏＡ含有プラスミドである残る２３個の中で、新規なグリホセート耐性を与える３種の別の挿入片を配列分析により同定した（表６を参照されたい）。Ａ群は１７個のメンバーを有し、Ｂ群は４個のメンバーを有し、Ｃ群は２個のメンバーを有した。Ｅ．コリゲノム地図に対する挿入片の位置決定を、データベースのＦＡＳＴＡ及びＢＬＡＳＴ（ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＰａｃｋａｇｅＶｅｒｓｉｏｎ９．０，ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃ．）走査により行った。Ｅ．コリ染色体上で７７．８分にマッピングされるＡ群の挿入片は２つの以前に配列決定されたＯＲＦ’ｓ、ｙｈｈＳ．及びｙｈｈＴ．を含有する。これらのＯＲＦ’ｓの両方に関する推定タンパク質構造は膜に及ぶと推定されるドメインを含んでおり、かくしてそれらはパーミアーゼであると思われる。14．２分領域にマッピングされる第２のＢ群の４つのメンバーはＥ．コリ染色体の特性化されていない領域を含有している。第３の群の２つの挿入片はＥ．コリ染色体の５２．３分の領域にマッピングされる。配列分析は、炭水化物代謝に関連する遺伝子がこの挿入片に含まれることを明らかにした。今日までに同定されたＯＲＦ’ｓは以前に記載されていない成分ＩＩＣ及びＩＩＢＰＴＳ酵素を含む。これらの２つの遺伝子によりコードされる推定アミノ酸配列は、フルクトース−様ＰＴＳオペロンによりコードされる成分ＩＩＣ及びＩＩＢ酵素との相同性を共有している（Ｒｅｉｚｅｒ，Ｊ．Ａ．ｅｔａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４１，９６１，（１９９５））。新しいＰＴＳ酵素ＩＩ相同染色体の他に、この挿入片は単一のＥ．コリグルコキナーゼ遺伝子、ｇｌｋを含有している。実施例７マイトマイシンＣ−耐性遺伝子の同定実施例７は、ｒｅｃＡ−ＬＵＸ融合体を含有する検出細胞の構築に用いることができるマイトマイシンＣに対する耐性を有する遺伝子の同定及び単離を例示する。マイトマイシンＣ作用の遺伝子滴定マイトマイシンＣ（ＤＮＡ損傷因子）はＥ．コリのｌｅｘＡ^ind突然変異株、ＤＭ８０３のコロニー形成を３μｇ／ｍｌのＭＩＣで阻害する。このＭＩＣはｌｅｘＡ⁺株ＤＭ８００のＭＩＣより５倍低い。受容性ＤＭ８０３細胞をｐＢＲ３２２ライブラリ及びｐＵＣ１８ライブラリを用いて形質転換した。１５μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣ（３ＸＭＩＣ）の存在下に、３７℃においてＬＢＡｍｐ１５０プレート上でプレート化することによりコロニーを選択した。２日後、ｐＵＣ１８に基づくＥ．コリライブラリを用いて細胞を形質転換したプレート上で４つのコロニーが現れた。これらの４つのコロニーを採取した；すべてのプレートをさらに５日間インキュベーションしたが、さらに別のコロニーは現れなかった。プラスミドを４つのコロニーから精製し、ｐｌｅｘＡ３．１、３．２、３．３及び３．４と命名した。株ＤＭ８０３の再形質転換によるそれぞれのプラスミドの再導入はアンピシリン耐性とマイトマイシンＣ耐性の間の連鎖を示し、それぞれの場合、マイトマイシンＣ耐性はプラスミドがコードする特徴であることを示した。ＤＭ８０３宿主からのプラスミドの精製は困難であり−低い収率及び保存した時の試料の分解が観察された。かくして配列決定のためのプラスミド鋳型の慣例的精製のためにプラスミドをＲＦＭ４４３に転移させた。得られた配列：（１）ＬｅｘＡ３．１挿入片の２つの末端を配列決定した。ＬｅｘＡ３．１前進−プライム（ｆｏｒｗａｒｄ−ｐｒｉｍｅｄ）配列はＢｌａｔｔｎｅｒＥ．コリ配列決定プロジェクトにより限定される４００の中からの領域２９１（１８分）−推定フィンブリンチャペロン遺伝子及びｙｈｃＡを有するｇｌｔ領域にマッピングされ、逆−プライム（ｒｅｖｅｒｓｅ−ｐｒｉｍｅｄ）配列は４００からの領域７６にマッピングされ−この領域はｄａｃＣ（ペニシリン結合タンパク質）及びｄｅｏＲ（デオキシリボースオペロンリプレッサー）ならびに未知の機能のタンパク質をコードするいくつかの読み取り枠を含有する。これらは染色体の非−連続領域なので、選択されたプラスミドはおそらくライブラリ構築の間に融合した２つの非隣接フラグメントのキメラである。（２）ＬｅｘＡ３．２の前進−及び逆−開始配列はＥ．コリデータベースにおける４００からの領域７６にマッピングされる。この領域は挿入片中に存在する８．６ｋｂの中にｄａｃＣ（ペニシリン結合タンパク質）及びｄｅｏＲ（デオキシリボースオペロンリプレッサー）を含有する。ＬｅｘＡ３．３の逆−開始配列は：ＬｅｘＡ３．２と同じ領域にマッピングされ；前進−開始配列は今の時点では入手できない。（３）同様にＬｅｘＡ３，４逆−開始配列もＬｅｘＡ３．２と同じ領域にマッピングされ、Ｌｅｘ３．３と同じ結合を含有すると思われる；この場合も前進− 開始配列は入手できない。かくしてＥ．コリの染色体の領域７６内の単数もしくは複数の遺伝子がマイトマイシンＣに対するマルチコピー耐性を与えると思われる。セグメントの分割及び再試験がマイトマイシンＣ耐性を担う新規な単数もしくは複数の遺伝子を限定するであろうことは明らかである。ｐＬｅｘＡ３．２上に含まれるこれらの遺伝子及び読み取り枠は：ｏ１２７，ｏ３７１，ｆ２１０，ｄａｃＣ＝ペニシリン−結合タンパク質６前駆体，ｄｅｏＲ＝デオキシリボースオペロンリプレッサー，ｆ１９８，ｏ４１０＝ｍｄｆＡ，ｆ９４，ｆ２６２，ｆ４０２及びｏ１７８である。非−誘導性対立遺伝子が耐性機構の可能性のあるサブセットを含み得るので、ＳＯＳ応答に熟達している（ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｔｉｎ）株を用いてさらなる実験を行った。株ＲＦＭ４４３はｌｅｘＡ⁺′であり、かくしてマイトマイシンＣを用いる遺伝子滴定に用いた。この株の場合のマイトマイシンＣに関するＭＩＣは濃厚固化ＬＢ培地上で１〜３μｇ／ｍｌであることが決定された。かくして寒天を用いて固化し、６μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣ及び１５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを補足したＬＢを用い、ｐＢＲ３２２又はｐＵＣ１８のいずれかにおいて構築したＥ．コリ遺伝子ライブラリを用いて株ＲＦＭ４４３を形質転換した後にマイトマイシン耐性クローンを選択した。そのような耐性分離物から精製されるプラスミドＤＮＡをＲＦＭ４４３中に再導入し、耐性がプラスミドがコードする特徴であるかどうかを示した。ベクター−挿入片結合物のＤＮＡ配列決定は、マイトマイシンＣに対する耐性を与える配列を限定することに役立った。そのような耐性は挿入片の配列決定により限定される３つの部位にマッピングされた（下記を参照されたい）。実施例８アシビシン耐性遺伝子の同定実施例８は、ｒｅｃＡ−ＬＵＸ融合体を含有する検出細胞の構築において用いることができるアシビシンに対する耐性を有する遺伝子の同定及び単離を例示する。アシビシン作用の遺伝子滴定アシビシンは最少培地上におけるＥ．コリ株ＤＰＤ１６７５のコロニー形成を１μｇ／ｍｌのＭＩＣで阻害する。受容性ＤＰＤ１６７５細胞をそれぞれＥ．コリ染色体の無作為なフラグメントを含有するｐＢＲ３２２ライブラリ及びｐＵＣ１８ライブラリを用いて形質転換した。グルコース、チアミン、プロリン、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び３μｇ／ｍｌのアシビシン（ＭＩＣの３倍）が補足されたＥプレート上で３７℃ においてプレート化することによりコロニーを選択した。長時間のインキュベーションの後、コロニーがプレート上に現れた。コロニーからプラスミドを精製し、命名した。株ＤＰＤ１６７５の再形質転換による各プラスミドの再導入はアンピシリン耐性とアシビシン耐性の連鎖を示し、それぞれの場合にアシビシン耐性はプラスミドがコードする特徴であることを示した。耐性クローンからのプラスミドの精製は配列決定のためのプラスミド鋳型を与えた。得られた配列組１のクローンは約４３分における領域２８７に由来する。数は９であり、その挿入片は約２８００〜５８００ｂｐで変化するが、すべてが完全なｙｅｄＡを含有する。表１０の吟味は、耐性を与えるすべての組５のクローンにおいて、この領域に他の完全な遺伝子がないことを示している。組２のクローンは１つのみであり、それは約６９分における領域３７４にマッピングされる。それは１８３１ｂｐの挿入片を含有し、それは完全なｉｃｉＡ及びｆ７６遺伝子を含有している。関連するクローンを表１０において同定する：実施例９チエニルアラニン様化合物の生体内阻害剤同定実施例９はｒｅｃＡ−ＬＵＸ融合体を含有する検出細胞の構築において用いることができるチエニルアラニンに対する耐性を有する遺伝子の同定及び単離を例示する。方法はチエニルアラニン耐性遺伝子の単離及び適した検出細胞の形質転換により行われる。チエニルアラニン作用の遺伝子滴定チエニルアラニンは最少培地上におけるＥ．コリ株ＤＰＤ１６７５のコロニー形成を７５μｇ／ｍｌのＭＩＣで阻害する。受容性ＤＰＤ１６７５細胞をそれぞれＥ．コリ染色体の無作為なフラグメントを含有するｐＢＲ３２２ライブラリ及びｐＵＣ１８ライブラリを用いて形質転換した。グルコース、チアミン、プロリン、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び１５０μｇ／ｍｌのチエニルアラニン（ＭＩＣの２倍）が補足されたＥプレート上で３７℃においてプレート化することによりコロニーを選択した。長時間のインキュベーションの後、コロニーがプレート上に現れた。コロニーからプラスミドを精製し、命名した。株ＤＰＤ１６７５の再形質転換による各プラスミドの再導入はアンピシリン耐性とチエニルアラニン耐性の連鎖を示し、それぞれの場合にチエニルアラニン耐性はプラスミドがコードする特徴であることを示した。耐性クローンからのプラスミドの精製は配列決定のためのプラスミド鋳型を与えた。表１１に示す以下のプラスミド挿入片構造を与える配列が得られた：正及び負の標準として用いるために他のプラスミド、すなわちｐｈｅＡ栄養要求性突然変異体を補うｐＢＲ３２２クローンに関して選択することにより単離されるｐＢＲ３２２、ＡＨ１（ａｒｏＨ）（ＣＢ１８から単離）及びｐｐｈｅＡをＤＰＤ１７１８中に形質転換した。実験案０．４％チアミン及び０．４％グルコースが補足された最少Ｅ培地中で、３７ ℃において震盪させながら株を生育させた。翌朝、培養物を新しい最少培地中に希釈し、初期対数期まで生育させた。チエニルアラニン原液（ｄＨ₂Ｏ中に溶解された１０ｍｇ／ｍｌ）の連続２倍希釈を、１００μｇ／ｍｌを最高濃度としてミクロタイタープレートにおける最少培地中で行った。生物発光を１時間監視し、動力学的データを集めた。プロットされたデータを図１６に比率として示す（発光の点で未挑戦細胞に標準化）。すべての濃度において、最後の時点のみを示す（通常は約６０分における）。以下の案に従い、細胞に関してゾーンアッセイも行った。株を１５０μｇ／ｍｌのアンピシリンが補足されたＬＢ培地中で３７℃において終夜生育させた。遠心により培養物を集めてから等容積のＥ培地中に再懸濁させた。０．１ｍｌの部分を０．７％の寒天で修正された２．５ｍｌのＥ培地においてプレート化し、グルコース、プロリン、ウラシル及び１００μｇ／ｍｌのアンピシリンが補足されたＥ寒天プレート上の均一な細胞叢を得た。示す量の化合物を含有する濾紙を叢の上に置いた。プレートを３７℃で終夜インキュベーションしてからクリアリングのゾーンを測定した。ゾーンアッセイは表１２に示すように、チエニルアラニンに対する感受性の傾向を確証した。（１）負の標準における復帰突然変異体の平均数より少なくとも２倍大きい復帰突然変異体の平均数を有する試験物質濃度がない；及び（２）正の用量−応答関係がないのいずれかの場合に試験物質を陰性であると分類した。試験物質、ＡＡ、ＢＢ、ＣＣ、ＤＤ、ＥＥ、ＦＦ及びＧＧを、外生代謝活性系（Ｓ９）なしで、サルモネラ・チフィムリウム株ＴＡ１００、ＴＡ１５３５、ＴＡ９７ａ及びＴＡ９８ならびにエシェリキア・コリ株ＷＰ２ｕｖｒＡ（ｐＫＭ１０１）における突然変異誘発性に関して評価した。６．２５、１２．５、２５．０、５０．０及び１００．０（ｇ／プレート）の濃度を負の（溶媒）標準に対する比較において評価した。これらの研究条件下で、評価された７つの試験品の中の５つにおいて突然変異誘発活性の証拠が検出された。結果を下記の表１５にまとめる：（ａ）１００ｕｌのアッセイ容積（ｂ）２８ｍｌのプレート容積ＡＡ、ＢＢ、ＣＣ、ＥＥ、ＦＦ及びＧＧは突然変異誘発活性の証拠を示した。試験−物質関連毒性として判断されたものの故に、ＤＤの突然変異誘発性の評価のために十分に受け入れられない濃度があった。６つの光誘導化合物（２欄）の中の５つは突然変異誘発性でもあるが（４欄）、光を誘導するための閾値は（２欄）突然変異を引き起こすための閾値（４欄）と等しいか又はそれより低いようである。さらに、消灯アッセイ（３欄）は生育阻害アッセイ（５欄）より優れているようである。請求の範囲１．（ｉ）発光性リポーター遺伝子複合体に操作可能的に結合して生物発光に関して陽性の表現型を検出バクテリアに与える遺伝子融合体を形成している遺伝子毒性−感受性プロモーターを含んでなる検出バクテリアとストレッサーとを接触させ、ここで遺伝子毒性−感受性プロモーターの遺伝子毒性化合物への暴露は発光性リポーター遺伝子複合体の高められた発現を推進し、生物発光シグナルを増加させ；（ｉｉ）検出バクテリアの生育及び光の放射量を監視することにより段階（ｉ）の検出バクテリアの生育を阻害することができる遺伝子毒性もしくは非−遺伝子毒性ストレッサーに関して選択し；（ｉｉｉ）選択される生育−阻害性遺伝子毒性もしくは非−遺伝子毒性ストレッサーを作用部位スクリーニングに供し；（ｉｖ）検出バクテリアにおいて作用部位を同定し；（ｖｉ）標的生物において作用部位を確認することを含んでなるストレッサーの作用部位の同定のための方法。２．段階（ｉｉ）のストレッサーが遺伝子毒性であり、段階（ｉｉｉ）のストレッサーが非−遺伝子毒性である請求の範囲第１項の方法。３．発光性リポーター遺伝子複合体を熱安定性ｌｕｘ、ｌｕｘＣＤＡＢＥ、熱不安定性ｌｕｘ、レネラｌｕｘ及びｌｕｃから成る群より選ぶ請求の範囲第１項の方法。４．検出バクテリアが腸内バクテリアであり、作物保護化学品を堆積させる能力を与える第１の突然変異及び活性ストレッサーに対する全体的細胞応答を妨害する第２の突然変異を含む請求の範囲第１項の方法。５．第２の突然変異がアミノ酸欠乏に対する全体的細胞応答を妨害する請求の範囲第４項の方法。６．ストレッサーが作物保護化学品、抗バクテリア性化学品、抗ウィルス性化学品、抗ガン性化学品及び防腐性化学品から成る群より選ばれる請求の範囲第１項の方法。７．ストレッサーが除草剤、有害生物防除剤及び殺菌・殺カビ剤を含む作物保護化学品の群から選ばれる請求の範囲第６項の方法。８．ストレッサーがスルホニルウレア除草剤、プロファンギサイド、殺菌・殺カビ剤、オキシダント及びホルモン性除草剤から成る群より選ばれる請求の範囲第７項の方法。９．ストレッサーがスルホメツロンメチル、グリホセート、オキシムカルバメート、メチルビオロゲン、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、２−チエニルアラニン、アシビシン及びマイトマイシンＣから成る群より選ばれる請求の範囲第８項の方法。１０．遺伝子毒性−感受性プロモーターがＳＯＳ調節回路により制御される遺伝子毒性−感受性プロモーターの群より選ばれる請求の範囲第１項の方法。１１．遺伝子毒性−感受性プロモーターがｒｅｃＡ、ｌｅｘＡ、ｕｍｕＤＣ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｓｕｌＡ、ｒｅｃＮ、ｕｖｒＤ、ｒｕｖ、ｄｉｎＡ、ｄｉｎＢ、ｄｉｎＤ及びｄｉｎＦから成る遺伝子毒性−感受性プロモーターの群より選ばれる請求の範囲第１０項の方法。１２．遺伝子毒性−感受性プロモーターがｒｅｃＡである請求の範囲第１１項の方法。１３．作用部位スクリーニングが遺伝子滴定スクリーニング又は栄養復帰スクリーニングである請求の範囲第１項の方法。１４．ＤＰＤ１７０７、ＤＰＤ１７０８、ＤＰＤ１７１５、ＤＰＤ１７１６、ＤＰＤ１７１８、ＤＰＤ１７１９ＤＰＤ１７２８、ＤＰＤ１７２９及びＤＰＤ１７３０から成る群より選ばれるｒｅｃＡ−ＬｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子融合体を含んでなる検出細胞株。１５．ＤＰＤ１６７８、ＤＰＤ１６７５、ＤＰＤ１６９０ＤＰＤ１０１２、ＤＰＤ１０１３、ＤＰＤ１６９２、ＤＰＤ１６８０、ＤＰＤ１６９３、ＤＰＤ１６８２ＤＰＤ１０１０及びＤＰＤ１０１１から成る群より選ばれる非−生物発光性親株。１６．（ｉ）チエニルアラニン−様活性を有すると思われる化合物を第１の検出バクテリア及び第２の検出バクテリアと接触させ、第１の検出バクテリアは：ａ）発現可能なｌｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子融合体；及びｂ）ｐｈｅＡ及びａｒｏＨから成る群より選ばれる過剰発現されない遺伝子の正常な細胞性補体を含んでなり；第２の検出細胞は：ａ）発現可能なｌｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子融合体；及びｂ）ｐｈｅＡ及びａｒｏＨから成る群より選ばれる過剰発現される発現可能な遺伝子の多重コピーを含んでなり；第１及び第２の検出細胞は同質遺伝子性であり、発現可能なｌｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子融合体はベースライン発光を生み；（ｉｉ）チエニルアラニン−様活性を有すると思われる化合物と接触した第１及び第２の検出細胞の光の放射量を監視し、そこにおいてａ）第１及び第２の検出細胞の両方におけるベースライン発光に等しい光の放射量は生物学的活性のない化合物を示し；ｂ）ベースライン発光と比較した時の第１及び第２の検出細胞の両方における光の放射量の減少は生育阻害活性を有する化合物を示し；ｃ）ベースライン発光と比較した時の第１の検出細胞における光の放射量の減少ならびに第２の検出細胞における光の放射量の増加又は維持はチエニルアラニン−様活性を有する化合物を示すことを含んでなるチエニルアラニン−様化合物の同定のための方法。１７．（ｉ）グリホセート−様活性を有すると思われる化合物を第１の検出バクテリア及び第２の検出バクテリアと接触させ、第１の検出バクテリアは：ａ）発現可能なｌｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子融合体；及びｂ）過剰発現されないａｒｏＡ遺伝子の正常な細胞性補体を含んでなり；第２の検出細胞は：ａ）発現可能なｌｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子融合体；及びｂ）過剰発現される選ばれた発現可能なａｒｏＡ遺伝子の多重コピーを含んでなり；第１及び第２の検出細胞は同質遺伝子性であり、発現可能なｌｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子融合体はベースライン発光を生み；（ｉｉ）グリホセート−様活性を有すると思われる化合物と接触した第１及び第２の検出細胞の光の放射量を監視し、そこにおいてａ）第１及び第２の検出細胞の両方におけるベースライン発光に等しい光の放射量は生物学的活性のない化合物を示し；ｂ）ベースライン発光と比較した時の第１及び第２の検出細胞の両方における光の放射量の減少は生育阻害活性を有する化合物を示し；ｃ）ベースライン発光と比較した時の第１の検出細胞における光の放射量の減少ならびに第２の検出細胞における光の放射量の増加又は維持はグリホセート−様活性を有する化合物を示すことを含んでなるグリホセート−様化合物の同定のための方法。１８．（ｉ）ＡＬＳ−阻害活性を有すると思われる化合物を第１の検出バクテリア及び第２の検出バクテリアと接触させ、第１の検出バクテリアは：ａ）発現可能なｌｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子融合体；及びｂ）ｉｌｖＢＮ及びｉｌｖＩＨから成る群より選ばれる過剰発現されない遺伝子の正常な細胞性補体を含んでなり；第２の検出細胞は：ａ）発現可能なｌｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子融合体；及びｂ）ｉｌｖＢＮ及びｉｌｖＩＨから選ばれる過剰発現される発現可能な遺伝子の多重コピーを含んでなり；第１及び第２の検出細胞は同質遺伝子性であり、発現可能なｌｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子融合体はベースライン発光を生み；（ｉｉ）ＡＬＳ−阻害活性を有すると思われる化合物と接触した第１及び第２の検出細胞の光の放射量を監視し、そこにおいてａ）第１及び第２の検出細胞の両方におけるベースライン発光に等しい光の放射量は生物学的活性のない化合物を示し；ｂ）ベースライン発光と比較した時の第１及び第２の検出細胞の両方における光の放射量の減少は生育阻害活性を有する化合物を示し；ｃ）ベースライン発光と比較した時の第１の検出細胞における光の放射量の減少ならびに第２の検出細胞における光の放射量の増加又は維持はＡＬＳ−阻害活性を有する化合物を示すことを含んでなるＡＬＳ−阻害性化合物の同定のための方法。１９．（ｉ）ＳＯＳバクテリア調節回路により調節されるプロモーター及びｌｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子複合体を含んでなり、ｌｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子複合体はバクテリア染色体中でＳＯＳプロモーターの下流に位置し、ＳＯＳプロモーターが発現されるとｌｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子複合体も発現される検出細胞を培養し；（ｉｉ）段階（ｉ）の培養物を調べられるべき物質と接触させ；（ｉｉｉ）培養物における発光の放射量を測定することにより物質が遺伝子毒性であるかどうかを決定する段階を含んでなる遺伝子毒性物質の同定のための方法。２０．ＳＯＳバクテリア調節回路により調節されるプロモーターがｒｅｃＡ、ｌｅｘＡ、ｕｍｕＤＣ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｓｕｌＡ、ｒｅｃＮ、ｕｖｒＤ、ｒｕｖ、ｄｉｎＡ、ｄｉｎＢ、ｄｉｎＤ及びｄｉｎＦから成る群より選ばれる請求の範囲第１９項の方法。２１．（ｉ）発光性リポーター遺伝子複合体に操作可能的に結合して生物発光に関して陽性の表現型を検出バクテリアに与える遺伝子融合体を形成している遺伝子毒性−感受性プロモーターを含んでなる検出バクテリアとストレッサーとを接触させ、ここで遺伝子毒性−感受性プロモーターの遺伝子毒性化合物への暴露は発光性リポーター遺伝子複合体の高められた発現を推進し、生物発光シグナルを増加させ；（ｉｉ）検出バクテリアの生育及び光の放射量を監視することにより段階（ｉ）の該検出バクテリアの生育を阻害することができる遺伝子毒性もしくは非−遺伝子毒性ストレッサーに関して選択し；（ｉｉｉ）生育−阻害性遺伝子毒性もしくは非−遺伝子毒性ストレッサーをストレッサー標的が同定される作用部位スクリーニングに供し；（ｉｖ）ストレッサー標的をコードする構造遺伝子を単離することを含んでなるストレッサー標的をコードする構造遺伝子の同定の方法。２２．（ｉ）発現可能なｌｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子融合体を含んでなる検出バクテリアとストレッサーを接触させ、ここで発現可能なｌｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子融合体は検出バクテリアにおいてベースライン発光を生み；（ｉｉ）検出バクテリアの生育及び光の放射量を監視することにより段階（ｉ）の検出バクテリアの生育を阻害することができるストレッサーに関して選択し；（ｉｉｉ）段階（ｉｉ）で選択される生育−阻害性ストレッサーを作用部位スクリーニングに供し；（ｉｖ）検出バクテリアにおいて作用部位を同定し；（ｖ）標的生物において作用部位を確認することを含んでなるストレッサーの作用部位の同定のための方法。２３．発現可能なｌｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子融合体がさらにｇｒｐＥ、ｄｎａＫ、ｌｏｎ、ｒｐｏＤ、ｇｒｏＥＳＬ、ｌｙｓＵ、ｈｔｐＥ、ｈｔｐＧ、ｈｔｐＩ、ｈｔｐＫ、ｃｌｐＰ、ｃｌｐＢ、ｈｔｐＮ、ｈｔｐＯ、ｈｔｐＸ、ｋａｔＧ、ａｈｐ、ｍｉｃＦ、ｓｏｄＡ、ｎｆｏ、ｚｗｆ、ｓｏｉ、ｆａｂＡ、ｈｉｓ、ｉｌｖＢＮ、ｉｌｖＧＭＥＤ、ｔｈｒＡＢＣ、ｌａｃ、ｍａｌ及びｇａｌ、ｐｈｏＡ、ｐｈｏＢＲ、ｐｈｏＥ、ｐｈｏＳ、ａｐｈＡ、ｈｉｍＡ、ｐｅｐＮ、ＵｇＰＡＢ、ｐｓｉＤ、ｐｓｉＥ、ｐｓｉＦ、ｐｓｉＫ、ｐｓｉＧ、ｐｓｉＩ、ｐｓｉＪ、ｐｓｉＮ、ｐｓｉＲ、ｐｓｉＨ、ｐｈｉＬ、ｐｈｉＯ、ａｒａ、ｔｎａ、ｄｓｄ、ｇｌｎＡ及びｈｕｔから成る群より選ばれるストレッサー感受性プロモーターを含む請求の範囲第２２項の方法。２４．（ｉ）発光性リポーター遺伝子複合体に操作可能的に結合して生物発光に関して陽性の表現型を検出バクテリアに与える遺伝子融合体を形成している遺伝子毒性−感受性プロモーターを含んでなる検出バクテリアとストレッサーとを接触させ；（ｉｉ）検出バクテリアの生育及び光の放射量を監視することにより段階（ｉ）における検出バクテリアの生育を阻害する少なくとも１つのストレッサーに関して選択し；（ｉｉｉ）段階（ｉｉ）で選択された生育−阻害ストレッサーを（ａ）限定された栄養素組成物が補足された最少生育培地を含んでなる複数の栄養プールを調製し、各栄養プールは他のすべてのプールと異なる栄養素組成物を含んでなり；（ｂ）（ｉｉｉ）（ａ）のプールのそれぞれにおいて段階（ｉ）の検出バクテリアを生育させて栄養素培養物を作り；（ｃ）（ｉｉｉ）（ｂ）の栄養素培養物からの光の放射量を監視し、ここで発光の増加は栄養素復帰を示している段階を含んでなる栄養復帰作用部位スクリーニングに供し、（ｉｖ）段階（ｉｉｉ）（ｃ）の栄養素により復帰されたストレッサー標的をコードする構造遺伝子を同定することを含んでなるストレッサー標的をコードする構造遺伝子の同定のための方法。２５．（ｉ）発光性リポーター遺伝子複合体に操作可能的に結合して生物発光に関して陽性の表現型を検出バクテリアに与える遺伝子融合体を形成している遺伝子毒性−感受性プロモーターを含んでなる検出バクテリアとストレッサーとを接触させ；（ｉｉ）検出バクテリアの生育及び光の放射量を監視することにより段階（ｉ）の検出バクテリアの生育を阻害する少なくとも１つのストレッサーに関して選択し；（ｉｉｉ）生育−阻害ストレッサーを（ａ）段階（ｉ）の検出生物のゲノムから高−コピー数自立複製性プラスミドにおいてゲノムライブラリを構築し；（ｂ）段階（ｉｉｉ）（ａ）のゲノムライブラリを用いて適した宿主細胞を形質転換し；（ｃ）段階（ｉｉｉ）（ｂ）の形質転換された宿主をストレッサーと接触させて試験培養物を作り；（ｄ）段階（ｉｉｉ）（ｃ）の試験培養物を発光の変化に関して監視し、ここで発光の増加がストレッサー標的をコードする構造遺伝子の存在を示す段階を含んでなる遺伝子滴定作用部位スクリーニングに供することを含んでなるストレッサー標的をコードする構造遺伝子の同定のための方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者スマルスキ，ダナ・ロビンアメリカ合衆国デラウエア州19808ウイルミントン・グリーンバンクロード603 (72)発明者バン・デイク，テイナ・カンガスアメリカ合衆国デラウエア州19803ウイルミントン・ケンブリツジドライブ119

Claims

【特許請求の範囲】１．（ｉ）発光性リポーター遺伝子複合体に操作可能的に結合して生物発光に関して陽性の表現型を検出バクテリアに与える遺伝子融合体を形成している遺伝子毒性−感受性プロモーターを含んでなる検出バクテリアとストレッサーとを接触させ、ここで遺伝子毒性−感受性プロモーターの遺伝子毒性化合物への暴露は発光性リポーター遺伝子複合体の高められた発現を推進し、生物発光シグナルを増加させ；（ｉｉ）検出バクテリアの生育及び光の放射量を監視することにより段階（ｉ）の検出バクテリアの生育を阻害することができる遺伝子毒性もしくは非−遺伝子毒性ストレッサーに関して選択し；（ｉｉｉ）選択される生育−阻害性遺伝子毒性もしくは非−遺伝子毒性ストレッサーを作用部位スクリーニングに供し；（ｉｖ）検出バクテリアにおいて作用部位を同定し；（ｖｉ）標的生物において作用部位を確認することを含んでなるストレッサーの作用部位の同定のための方法。２．段階（ｉｉ）のストレッサーが遺伝子毒性であり、段階（ｉｉｉ）のストレッサーが非−遺伝子毒性である請求の範囲第１項の方法。３．発光性リポーター遺伝子複合体を熱安定性ｌｕｘ、ｌｕｘＣＤＡＢＥ、熱不安定性ｌｕｘ、レネラｌｕｘ及びｌｕｃから成る群より選ぶ請求の範囲第１項の方法。４．検出バクテリアが腸内バクテリアであり、作物保護化学品を堆積させる能力を与える第１の突然変異及び活性ストレッサーに対する全体的細胞応答を妨害する第２の突然変異を含んでなる請求の範囲第１項の方法。５．第２の突然変異がアミノ酸欠乏に対する全体的細胞応答を妨害する請求の範囲第４項の方法。６．ストレッサーが作物保護化学品、抗バクテリア性化学品、抗ウィルス性化学品、抗ガン性化学品及び防腐性化学品から成る群より選ばれる請求の範囲第１項の方法。７．ストレッサーが除草剤、有害生物防除剤及び殺菌・殺カビ剤から成る作物保護化学品の群から選ばれる請求の範囲第６項の方法。８．ストレッサーがスルホニルウレア除草剤、プロファンギサイド、殺菌・殺カビ剤、オキシダント及びホルモン性除草剤から成る群より選ばれる請求の範囲第７項の方法。９．ストレッサーがスルホメツロンメチル、グリホセート、オキシムカルバメート、メチルビオロゲン、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、２−チエニルアラニン、アシビシン及びマイトマイシンＣから成る群より選ばれる請求の範囲第８項の方法。１０．遺伝子毒性−感受性プロモーターがＳＯＳ調節回路により制御される遺伝子毒性−感受性プロモーターの群より選ばれる請求の範囲第１項の方法。１１．遺伝子毒性−感受性プロモーターがｒｅｃＡ、ｕｖｒＡ、ｌｅｘＡ、ｕｍｕＤＣ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｓｕｌＡ、ｒｅｃＮ、ｕｖｒＤ、ｒｕｖ、ｄｉｎＡ、ｄｉｎＢ、ｄｉｎＤ及びｄｉｎＦから成る遺伝子毒性−感受性プロモーターの群より選ばれる請求の範囲第１０項の方法。１２．遺伝子毒性−感受性プロモーターがｒｅｃＡである請求の範囲第１１項の方法。１３．作用部位スクリーニングが遺伝子滴定スクリーニング又は栄養復帰スクリーニングである請求の範囲第１項の方法。１４．ＤＰＤ１７０７、ＤＰＤ１７０８、ＤＰＤ１７１５、ＤＰＤ１７１６、ＤＰＤ１７１８、ＤＰＤ１７１９ＤＰＤ１７２８、ＤＰＤ１７２９及びＤＰＤ１７３０から成る群より選ばれるｒｅｃＡ−ＬｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子融合体を含んでなる検出細胞株。１５．ＤＰＤ１６７８、ＤＰＤ１６７５、ＤＰＤ１６９０ＤＰＤ１０１２、ＤＰＤ１０１３、ＤＰＤ１６９２、ＤＰＤ１６８０、ＤＰＤ１６９３、ＤＰＤ１６８２ＤＰＤ１０１０及びＤＰＤ１０１１から成る群より選ばれる非−生物発光性親株。１６．（ｉ）チエニルアラニン−様活性を有すると思われる化合物を第１の検出バクテリア及び第２の検出バクテリアと接触させ、第１の検出バクテリアは：ａ）発現可能なｌｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子融合体；及びｂ）ｐｈｅＡ及びａｒｏＨから成る群より選ばれる過剰発現されない遺伝子の正常な細胞性補体を含んでなり；第２の検出細胞は：ａ）発現可能なｌｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子融合体；及びｂ）ｐｈｅＡ及びａｒｏＨから成る群より選ばれる過剰発現される発現可能な遺伝子の多重コピーを含んでなり；第１及び第２の検出細胞は同質遺伝子性であり、発現可能なｌｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子融合体はベースライン発光を生み；（ｉｉ）チエニルアラニン−様活性を有すると思われる化合物と接触した第１及び第２の検出細胞の光の放射量を監視し、そこにおいてａ）第１及び第２の検出細胞の両方におけるベースライン発光に等しい光の放射量は生物学的活性のない化合物を示し；ｂ）ベースライン発光と比較した時の第１及び第２の検出細胞の両方における光の放射量の減少は生育阻害活性を有する化合物を示し；ｃ）ベースライン発光と比較した時の第１の検出細胞における光の放射量の減少ならびに第２の検出細胞における光の放射量の増加又は維持はチエニルアラニン−様活性を有する化合物を示すことを含んでなるチエニルアラニン−様化合物の同定のための方法。１７．（ｉ）グリホセート−様活性を有すると思われる化合物を第１の検出バクテリア及び第２の検出バクテリアと接触させ、第１の検出バクテリアは：ａ）発現可能なｌｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子融合体；及びｂ）過剰発現されないａｒｏＡ遺伝子の正常な細胞性補体を含んでなり；第２の検出細胞は：ａ）発現可能なｌｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子融合体；及びｂ）過剰発現される選ばれた発現可能なａｒｏＡ遺伝子の多重コピーを含んでなり；第１及び第２の検出細胞は同質遺伝子性であり、発現可能なｌｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子融合体はベースライン発光を生み；（ｉｉ）グリホセート−様活性を有すると思われる化合物と接触した第１及び第２の検出細胞の光の放射量を監視し、そこにおいてａ）第１及び第２の検出細胞の両方におけるベースライン発光に等しい光の放射量は生物学的活性のない化合物を示し；ｂ）ベースライン発光と比較した時の第１及び第２の検出細胞の両方における光の放射量の減少は生育阻害活性を有する化合物を示し；ｃ）ベースライン発光と比較した時の第１の検出細胞における光の放射量の減少ならびに第２の検出細胞における光の放射量の増加又は維持はグリホセート−様活性を有する化合物を示すことを含んでなるグリホセート−様化合物の同定のための方法。１８．（ｉ）ＡＬＳ−阻害活性を有すると思われる化合物を第１の検出バクテリア及び第２の検出バクテリアと接触させ、第１の検出バクテリアは：ａ）発現可能なｌｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子融合体；及びｂ）ｉｌｖＢＮ及びｉｌｖＩＨから成る群より選ばれる過剰発現されない遺伝子の正常な細胞性補体を含んでなり；第２の検出細胞は：ａ）発現可能なｌｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子融合体；及びｂ）ｉｌｖＢＮ及びｉｌｖＩＨから選ばれる過剰発現される発現可能な遺伝子の多重コピーを含んでなり；第１及び第２の検出細胞は同質遺伝子性であり、発現可能なｌｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子融合体はベースライン発光を生み；（ｉｉ）ＡＬＳ−阻害活性を有すると思われる化合物と接触した第１及び第２の検出細胞の光の放射量を監視し、そこにおいてａ）第１及び第２の検出細胞の両方におけるベースライン発光に等しい光の放射量は生物学的活性のない化合物を示し；ｂ）ベースライン発光と比較した時の第１及び第２の検出細胞の両方における光の放射量の減少は生育阻害活性を有する化合物を示し；ｃ）ベースライン発光と比較した時の第１の検出細胞における光の放射量の減少ならびに第２の検出細胞における光の放射量の増加又は維持はＡＬＳ−阻害活性を有する化合物を示すことを含んでなるＡＬＳ−阻害性化合物の同定のための方法。１９．（ｉ）ＳＯＳバクテリア調節回路により調節されるプロモーター及びｌｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子複合体を含んでなり、ｌｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子複合体はバクテリア染色体中でＳＯＳプロモーターの下流に位置し、ＳＯＳプロモーターが発現されるとｌｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子複合体も発現される検出細胞を培養し；（ｉｉ）段階（ｉ）の培養物を調べられるべき物質と接触させ；（ｉｉｉ）培養物における発光の放射量を測定することにより物質が遺伝子毒性であるかどうかを決定する段階を含んでなる遺伝子毒性物質の同定のための方法。２０．ＳＯＳバクテリア調節回路により調節されるプロモーターがｒｅｃＡ、ｕｖｒＡ、ｌｅｘＡ、ｕｍｕＤＣ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｓｕｌＡ、ｒｅｃＮ、ｕｖｒＤ、ｒｕｖ、ｄｉｎＡ、ｄｉｎＢ、ｄｉｎＤ及びｄｉｎＦから成る群より選ばれる請求の範囲第１９項の方法。２１．（ｉ）発光性リポーター遺伝子複合体に操作可能的に結合して生物発光に関して陽性の表現型を検出バクテリアに与える遺伝子融合体を形成している遺伝子毒性−感受性プロモーターを含んでなる検出バクテリアとストレッサーとを接触させ、ここで遺伝子毒性−感受性プロモーターの遺伝子毒性化合物への暴露は発光性リポーター遺伝子複合体の高められた発現を推進し、生物発光シグナルを増加させ；（ｉｉ）検出バクテリアの生育及び光の放射量を監視することにより段階（ｉ）の該検出バクテリアの生育を阻害することができる遺伝子毒性もしくは非−遺伝子毒性ストレッサーに関して選択し；（ｉｉｉ）生育−阻害性遺伝子毒性もしくは非−遺伝子毒性ストレッサーをストレッサー標的が同定される作用部位スクリーニングに供し；（ｖｉ）ストレッサー標的をコードする構造遺伝子を単離することを含んでなるストレッサー標的をコードする構造遺伝子の同定の方法。２２．（ｉ）発現可能なｌｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子融合体を含んでなる検出バクテリアとストレッサーを接触させ、ここで発現可能なｌｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子融合体は検出バクテリアにおいてベースライン発光を生み；（ｉｉ）検出バクテリアの生育及び光の放射量を監視することにより段階（ｉ）の検出バクテリアの生育を阻害することができるストレッサーに関して選択し；（ｉｉｉ）段階（ｉｉ）で選択される生育−阻害性ストレッサーを作用部位スクリーニングに供し；（ｉｖ）検出バクテリアにおいて作用部位を同定し；（ｖｉ）標的生物において作用部位を確認することを含んでなるストレッサーの作用部位の同定のための方法。２３．発現可能なｌｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子融合体がさらにｇｒｐＥ、ｄｎａＫ、ｌｏｎ、ｒｐｏＤ、ｇｒｏＥＳＬ、ｌｙｓＵ、ｈｔｐＥ、ｈｔｐＧ、ｈｔｐＩ、ｈｔｐＫ、ｃｌｐＰ、ｃｌｐＢ、ｈｔｐＮ、ｈｔｐＯ、ｈｔｐＸ、ｋａｔＧ、ａｈｐ、ｍｉｃＦ、ｓｏｄＡ、ｎｆｏ、ｚｗｆ、ｓｏｉ、ｆａｂＡ、ｈｉｓ、ｉｌｖＢＮ、ｉｌｖＧＭＥＤ、ｔｈｒＡＢＣ、ｌａｃ、ｍａｌ及びｇａｌ、ｐｈｏＡ、ｐｈｏＢＲ、ｐｈｏＥ、ｐｈｏＳ、ａｐｈＡ、ｈｉｍＡ、ｐｅｐＮ、ｕｇｐＡＢ、ｐｓｉＤ、ｐｓｉＥ、ｐｓｉＦ、ｐｓｉＫ、ｐｓｉＧ、ｐｓｉＩ、ｐｓｉＪ、ｐｓｉＮ、ｐｓｉＲ、ｐｓｉＨ、ｐｈｉＬ、ｐｈｉＯ、ａｒａ、ｔｎａ、ｄｓｄ、ｇｌｎＡ及びｈｕｔから成る群より選ばれるストレッサー感受性プロモーターを含んでなる請求の範囲第２２項の方法。２４．（ｉ）発光性リポーター遺伝子複合体に操作可能的に結合して生物発光に関して陽性の表現型を検出バクテリアに与える遺伝子融合体を形成している遺伝子毒性−感受性プロモーターを含んでなる検出バクテリアとストレッサーとを接触させ；（ｉｉ）検出バクテリアの生育及び光の放射量を監視することにより段階（ｉ）における検出バクテリアの生育を阻害する少なくとも１つのストレッサーに関して選択し；（ｉｉｉ）段階（ｉｉ）で選択された生育−阻害ストレッサーを（ａ）限定された栄養素組成物が補足された最少生育培地を含んでなる複数の栄養プールを調製し、各栄養プールは他のすべてのプールと異なる栄養素組成物を含んでなり；（ｂ）（ｉｉｉ）（ａ）のプールのそれぞれにおいて段階（ｉ）の検出バクテリアを生育させて栄養素培養物を作り；（ｃ）（ｉｉｉ）（ｂ）の栄養素培養物からの光の放射量を監視し、ここで発光の増加は栄養素復帰を示している段階を含んでなる栄養復帰作用部位スクリーニングに供し、（ｉｖ）段階（ｉｉｉ）（ｃ）の栄養素により復帰されたストレッサー標的をコードする構造遺伝子を同定することを含んでなるストレッサー標的をコードする構造遺伝子の同定のための方法。２５．（ｉ）発光性リポーター遺伝子複合体に操作可能的に結合して生物発光に関して陽性の表現型を検出バクテリアに与える遺伝子融合体を形成している遺伝子毒性−感受性プロモーターを含んでなる検出バクテリアとストレッサーとを接触させ；（ｉｉ）検出バクテリアの生育及び光の放射量を監視することにより段階（ｉ）の検出バクテリアの生育を阻害する少なくとも１つのストレッサーに関して選択し；（ｉｉｉ）生育−阻害ストレッサーを（ａ）段階（ｉ）の検出生物のゲノムから高−コピー数自立複製性プラスミドにおいてゲノムライブラリを構築し；（ｂ）段階（ｉｉｉ）（ａ）のゲノムライブラリを用いて適した宿主細胞を形質転換し；（ｃ）段階（ｉｉｉ）（ｂ）の形質転換された宿主をストレッサーと接触させて試験培養物を作り；（ｄ）段階（ｉｉｉ）（ｃ）の試験培養物を発光の変化に関して監視し、ここで発光の増加がストレッサー標的をコードする構造遺伝子の存在を示す段階を含んでなる遺伝子滴定作用部位スクリーニングに供することを含んでなるストレッサー標的をコードする構造遺伝子の同定のための方法。