JP2009039132A - 改良された化学物質の検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】蛍光法のような高価な測定装置を用いることなく、環境試料中の化学物質の存在または存在量を検定できる簡便かつ安価なアッセイ方法の提供。
【解決手段】化学物質に応答してプロモーター活性が変化するモニタリング用プロモーター遺伝子の下流に酸化還元酵素をコードするポリヌクレオチドを作動可能に連結することによって形質転換した組換え細胞を用いる。
【選択図】なし

Description

本発明は酸素電極を用いる化学物質の生物学的検出方法に関する。本発明はまた該検出方法に用いる形質転換細胞および装置にも関する。

環境庁により昭和４９年から平成１０年度までの２４年間にわたり毎年行われている化学物質環境追跡調査結果によれば、今まで調査した７７５種類の化学物質のうち、約４０％の物質が環境中に放出されている。一方、わが国において現在、工業的に生産されている化学物質は約５万種類とされ、その生産量、種類は年々増加している。また、塩素による水処理、焼却処理等により非意図的に生成された化学物質が環境を汚染することが知られている。これらの事実から、環境中に蓄積されている化学物質は多数あると予測されるが、これら全てを個々に調査することはきわめて困難である。

従来のバイオアッセイ（生物材料を用いてその応答性から有害性を評価する手法）は主として魚類やミジンコ、貝等の個体、細胞の生育阻害や特定の生体反応を指標としており、環境中の化学物質による毒性の評価はできるが、その毒性の性質やどのような化学物質に起因するかを判断することはできない。亜硝酸生成細菌または硝酸生成細菌の活性により評価する方法（特開平06-123705号公報、特開2000-206087号号公報）、鉄バクテリアの活性により評価する方法（特開平11-37969号公報）が提案されており、水質安全モニタ（富士電機）のような製品が販売されている。また、国外では、発光微生物の発光強度により評価する製品（MICROTOX、azur社、アメリカ；LUMIS、drlange社、ドイツ）が市販されている。しかし、これらはいずれも従来型のバイオアッセイ法の延長であり、毒性化学物質に関する詳細な情報は得られない。

わが国の化学物質のリスク管理は、新たな汚染が見出されるたびに化学物質の見直しが行われ、さらに規制と自主規制を組み合わせる体制の整備がすすめられている。しかし、トリハロメタンやダイオキシンに代表されるような有害化学物質の非意図的生成および環境放出など、複雑化、多様化する現状に即座に対応する体制は整っていない。また、「化学物質の審査及び製造等の規制に関する法律」における毒性評価法である動物実験はコストや時間がかかり国際的に受け入れ難くなっている。このように、管理体制についての問題は常に議論されるが、それを解決する具体的な手段が無いことから課題の解決には至っていない。
よって、化学物質について人体や生態系に与える影響を評価する要請がある。

化学物質が人体や生態系に与える影響を評価する方法として、レポーター・ジーン・アッセイ方法が知られている。レポーター・ジーン・アッセイ方法とは、転写活性を中心とした遺伝子の機能を調べるための、目印となる特定の遺伝子活性を測定する手法であり、プロモーターアッセイ方法などが包含される。プロモーターアッセイ法は、ある遺伝子のプロモーターの塩基配列にマーカータンパク質をコードするポリヌクレオチドを作動可能に連結し、遺伝子の発現を間接的に計測する方法である（非特許文献１）。

通常のバイオアッセイ法では、化学物質の存在は、微生物の化学物質に対する細胞応答、例えば細胞の生死、増殖能、呼吸量、特定の遺伝子の発現の変化を指標として評価される。プロモーターアッセイ方法では細胞応答としてプロモーター活性の変化、すなわちプロモーターに連結されたマーカータンパク質を指標として評価される。
マーカータンパク質の例としてはGFP（Green Fluorescence Protein）（Heim, R., Cubitt, A. B. and Tsien, R. Y.（1995） Nature 373, 663-664；Heim, R., Prasher DC. and Tsien, R. Y.（1994） Proc. Natl. Acad. Sci., 91, 12501-12504；Warg, S. and Hazerigg, T.（1994）Nature 639, 400-403；Youvan, D.C. and Michel-Beyerle, M.E.（1996）Nature Biotechnology 14 1219-1220；Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W. and Prasher, D.C.（1994）Science 263, 802-805）、β-ガラクトシダーゼ（Canestro C, Albalat R, Escriva H, Gonzalez-Duarte R. Endogenous beta-galactosidase activity in amphioxus: a useful histochemical marker for the digestive system.Dev Genes Evol 2001 Mar 211(3):154-6）、ルシフェラーゼ（Arch Toxicol 2002 Jun;76(5-6):257-61、Estrogenic activity of UV filters determined by an in vitro reporter gene assay and an in vivo transgenic zebrafish assay.Schreurs R, Lanser P, Seinen W, Van Der Burg B.)、及びアセチルトランスフェラーゼ（J Recept Signal Transduct Res 2001 Feb;21(1):71-84, A simplified method for large scale quantification of ranscriptional activity and its use in studies of steroids and steroid receptors. Zhang S, Lu J, Iyama K, Lo SC, Danielsen M.)を挙げることができる。
プロモーター活性の変化は、例えば、ＧＦＰなどの蛍光タンパク質の場合、蛍光測定によりモニターされ、ルシフェラーゼの場合、酵素−基質反応による発光によりモニターされる。

ＷＯ０３／０１８７９２には、蛍光法を用いて環境中に存在する化学物質を簡単に同定する方法が開示されている。この同定方法によれば、毒性物質によって特異的に活性化される酵母遺伝子プロモーターを含む塩基配列に、ＧＦＰのごとき蛍光性のマーカータンパク質をコードする塩基配列を作動可能に連結したポリヌクレオチドを含むベクターによって酵母を形質転換し、この形質転換酵母を試料に接触後、蛍光性タンパク質の発現量を蛍光測定によって検出し、発現量の増大が認められれば、毒性物質が存在すると判定することができる。

ＷＯ０３／０１８７９２ 特開２００１−２５２０６６号公報 特開２００１−２５８５９２号公報 Barelle CJ, Manson CL, MacCallum DM, Odds FC, Gow Na, Brown AJ.: GFP as a quantitative reporter of gene regulation in Candida albicans. Yeast 2004 Mar; 21(4):333-40

しかしながら、蛍光法を用いる測定では、高価な蛍光測定装置を導入する必要があり、化学物質検出システムのコストが増大してしまう。また、測定する場所も研究所等の特定の場所に限られ、あまり簡便であるとはいえなかった。
したがって、蛍光法を用いずに、より簡便に環境中の化学物質の存在または存在量を検出できるシステムが求められている。

本発明者らは、マーカータンパク質の一例であるルシフェラーゼが基質であるルシフェリンと酵素−基質反応を起こす際に、酸素を消費することに着目し、発光強度ではなく、酵素−基質反応における酸素消費量を測定することによって、マーカータンパク質の発現量を検出できることを見出した。
例えば、ホタルルシフェラーゼとＤ−ホタルルシフェリンによる酵素−基質反応は下式で示される。

このように、酵素反応において酸素を電子受容体として消費して、基質を酸化する酵素（本発明において、「酸化還元酵素」という。）として、ルシフェラーゼ以外には、例えば、チトクロムＣオキシダーゼ、リン酸ピリドキサアミンオキシダーゼ、グルタチオンオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、プロリンオキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、シュウ酸オキシダーゼ、ザルコシンオキシダーゼ等のオキシダーゼおよび、キヌレニン３−モノオキシゲナーゼ、スクアレンオキシゲナーゼ、モノオキシゲナーゼ、トリプトファン２,３−ジオキシゲナーゼ等のオキシゲナーゼが挙げられる。
例えば、グルコースオキシダーゼとグルコースによる酵素−基質反応は下式で示される。

そこで、本発明者らは、特定の化学物質が、酵母遺伝子のプロモーターを活性化し、そのような化学物質応答性プロモーターを含む塩基配列、並びにこれら遺伝子に相同性の他種由来の遺伝子のプロモーターを含む塩基配列よりなる群から選択される塩基配列の下流に、マーカータンパク質として酸化還元酵素をコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結された組換え細胞または、マーカータンパク質として酸化還元酵素をコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結されているポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換された組換え細胞を作製し、化学物質を含む試料に、この組換え細胞および酸化還元酵素の基質を添加し、試料中の溶存酸素の消費量を測定することによって、発現された酸化還元酵素の量を定量すれば、試料中の化学物質の存在または存在量を検定できることに想到した。

従来から、酸素電極を用いて溶存酸素量を検出する方法はよく知られている。
例えば、特開２００１−２５２０６６号公報には、細菌数測定対象食品を溶液中に分散させてサンプル溶液を調製し、サンプル溶液の溶存酸素を検出することによって、サンプル溶液中の細菌数を測定する方法が開示されている。
また、特開２００１−２５８５９２号公報には、酸素電極を用いて溶液の溶存酸素量を検出することによって、短時間で正確に測定対象微生物の薬剤感受性を測定する方法が開示されている。この方法によれば、測定対象微生物および薬剤を含む第１の溶液および薬剤を含まない第２の溶液について、酸素電極からの測定電流値を各々時系列的に保持し、それぞれ時系列的に保持されている測定電流値から移動平均値を算出し、それぞれ算出された移動平均値の対から最小二乗近似で時間微分値を算出するので、非常に簡便かつ正確に測定対象微生物と薬剤との反応を検出することができる。

本発明の化学物質の検出方法は、（ａ）酵母遺伝子のプロモーターのうち化学物質に応答するプロモーターを含む塩基配列、並びにこれら遺伝子に相同性の他種由来の遺伝子のプロモーターを含む塩基配列よりなる群から選択される塩基配列の下流に、マーカータンパク質として酸化還元酵素をコードするポリヌクレオチドまたは酵素反応において酸素を電子受容体として基質を酸化する酵素をコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結されているポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換された組換え酵母を用いること、および（ｂ）少なくとも、被検試料と、組換え酵母と、マーカータンパク質である酸化還元酵素に対する基質と、を含む溶液について、酸素電極からの測定電流値を時系列的に保持し、保持した測定電流値の変化から溶存酸素の消費量を算出することによって、環境中の化学物質の存在または存在量を検出することを特徴とする。

すなわち、本発明の方法は、本発明による形質転換細胞から産生されるルシフェラーゼ、オキシダーゼまたはオキシゲナーゼ等の酸化還元酵素とそれらの酵素に対する基質との間の酵素−基質反応において消費される酸素量を測定することによって、産生された酸化還元酵素の存在または存在量を検出できることに基づく。
産生された酸化還元酵素の存在量の増大は、化学物質応答性の遺伝子プロモーターが化学物質の存在により活性化されたことに起因するため、酸素消費量の増大が、化学物質の存在または存在量を示すこととなる。

本発明においては、化学物質の存在または存在量の検出に形質転換細胞を用いるため、測定において形質転換細胞の呼吸など基礎代謝による酸素消費量も考慮する必要がある。
本発明において、基礎代謝による酸素消費量よりも、酵素−基質反応による酸素消費量が圧倒的に多い場合、予め、基礎代謝による酸素消費量を算出し、これを測定値から差し引くことによって、酵素−基質反応による酸素消費量を検出することができる。
また、本発明において、基礎代謝による酸素消費の影響を排除するため、形質転換細胞を破砕し、酵素−基質反応のみを観察することができる。
さらに、破砕による細胞の内容物からの影響を回避するために、マーカータンパク質として、細胞膜を透過する酸化還元酵素を選択し、形質転換細胞を破砕することなく、溶液中から形質転換細胞を回収することによって、酵素−基質反応による酸素消費量を検出することができる。

本発明の形質転換に用いる宿主細胞としてはヒト細胞が好ましいのは当然であるが、マウスその他哺乳類の細胞でも良い。また、環境中の毒性評価という面から、これまでバイオアッセイに用いられている魚類、線虫等の細胞でも可能である。また、培養が容易であることから微生物の細胞を用いることも好ましい。
本法は酵母細胞の遺伝子を基にしていること、また酵母の生育は塩濃度その他の環境試料において変動する条件に左右されないことから、好ましい細胞は酵母細胞である。
細胞を形質転換する方法はよく知られている（例えば、Kaiser C, Michaelis S, Mitchell A: Lithium acetate yeast transformation, Methods in Yeast Genetics, A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual 1994 edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press) pp.133-134,1994を参照）。
また、ベクターを用いなくとも当該酵母遺伝子のコード領域をマーカータンパク質をコードするポリヌクレオチド配列で置換することによっても目的は達せられる。上記ポリヌクレオチド構築物を細胞に直接導入することも可能であり、その方法も周知である。

そこで、本発明において、先ず、以下の群から選択される酵母遺伝子のプロモーターを含む塩基配列、並びにこれら遺伝子に相同性の他種由来の遺伝子のプロモーターを含む塩基配列よりなる群から選択される塩基配列の下流に、マーカータンパク質をコードするポリヌクレオチドを作動可能に連結した塩基配列を導入することによって、組換え酵母を作製する。

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これら酵母遺伝子の塩基配列、アミノ酸配列は公共のデータベース（例えば、ドイツのＭＩＰＳ：Munich Information Center for Protein Sequence、米国のＳＧＤ：Saccharomyces Genome Database）に開示されており、インターネットを介して知ることができる。また、プロモーター配列についても公共のデータベース（SCPD：The Promoter Database of Saccharomyces cerevisiae）に開示されている。

上記酵母遺伝子のプロモーターばかりでなく、上記酵母遺伝子に相同性を有する他種由来の遺伝子のプロモーターも使用できる。ここに「酵母遺伝子に相同性を有する遺伝子」とは、酵母遺伝子の塩基配列に５０％以上、好ましくは８０％以上の相同性を有する塩基配列を含む遺伝子であって、該酵母遺伝子がコードするタンパク質と同じ機能を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む遺伝子を言う。

上記遺伝子のプロモーターの塩基配列の下流に、マーカータンパク質をコードするポリヌクレオチドを作動可能に連結してポリヌクレオチド構築物を得る。プロモーターにタンパク質をコードするポリヌクレオチドを作動可能に連結する方法は当業者によく知られている（例えばR.W.オールド、S.B.プリムローズ 遺伝子操作の原理 原書第５版, 培風館, pp138-165, pp.234-263, 2000を参照）。

マーカータンパク質の例としては、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、クリックビートルルシフェラーゼ等のルシフェラーゼ；チトクロムＣオキシダーゼ、リン酸ピリドキサアミンオキシダーゼ、グルタチオンオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、プロリンオキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、シュウ酸オキシダーゼ、ザルコシンオキシダーゼ等のオキシダーゼ；キヌレニン３−モノオキシゲナーゼ、スクアレンオキシゲナーゼ、モノオキシゲナーゼ、トリプトファン２,３−ジオキシゲナーゼ等のオキシゲナーゼを挙げることができる。

ルシフェラーゼをコードする塩基配列の例として、pGL3-Basic Vector (Promega)のルシフェラーゼの配列を配列番号１に示す。

ゲノム配列のよく知られた酵母の遺伝子のうち、オキシダーゼ関連遺伝子として、Q0045、Q0250、Q0275、YBL064c、YBR035c、YBR244w、YDL067c、YDR044w、YDR079w、YDR231c、YDR453c、YDR506c、YEL045c、YER014w、YER021w、YER058w、YER141w、YER145c、YER153c、YER154w、YFL041w、YGL187c、YGL191w、YGL205w、YGR029w、YGR060w、YGR062c、YGR112w、YGR234w、YHR051w、YHR116w、YIL111w、YIR037w、YJL003w、YJR034w、YKL026c、YKR066c、YLL009c、YLL018c-a、YLR038c、YLR142w、YLR205c、YLR395c、YML086c、YML129c、YMR020w、YMR058w、YMR256c、YNL052w、YOR350c、YPL132w、YPR037cが挙げられる。
また、ゲノム配列のよく知られた酵母の遺伝子のうち、オキシゲナーゼ関連遺伝子として、YBL098w、YDR402c、YGL055w、YGR175c、YGR255c、YHR007c、YHR176w、YJR025c、YJR069c、YJR078w、YJR149w、YLL057c、YLR205c、YMR015cが挙げられる。
これらの酵母遺伝子の塩基配列は、公共のデータベース（例えば、ドイツのＭＩＰＳ：Munich Information Center for Protein Sequence、米国のＳＧＤ：Saccharomyces Genome Database）に開示されており、インターネットを介して知ることができる。また、プロモーター配列についても公共のデータベース（SCPD：The Promoter Database of Saccharomyces cerevisiae）に開示されている。
本発明において、上記オキシダーゼ関連遺伝子またはオキシゲナーゼ関連遺伝子に相同性を有する他種由来の遺伝子を用いることもできる。

本発明の方法により検出できる毒性物質は特に限定がないが例えば、Ｎａ_２Ａｓ、ＣｄＣｌ_２、ＨｇＣｌ_２、ＰｂＣｌ_２、４−ニトロキノリン−Ｎ−オキサイド、２,４,５−トリクロロフェノール、γ−ヘキサクロロシクロへキサン、エチレンビスジチオカルバミドサンマンガン、２,４,５,６−テトラクロロ−１,３−ベンゼンジカルボニトリル、テトラメチルチウラムジスルフィド、エチレンビス（ジチオカルバメート）亜鉛、８−メチル−Ｎ−バニリル−６−ノネンアミド、ジンジャオール、アクロレイン、ジメチルスルホオキシド、ラウンドアップ（登録商標、除草剤）（Ｎ−（ホスホメチル）グリシナートアンモニウム４１．０％、界面活性剤５９．０％）、ドデシルベンゾスルホン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、２,４−ジクロロフェノキシ酢酸、シアン化カリウム、べンゾ（ａ）ピレン、ホルムアルデヒド、ビスフェノールＡ、２,５−ジクロロフェノール、塩化メチル水銀、ｐ−ノニルフェノール、ペンタクロロフェノール、塩化ニッケル（ＩＩ）、重クロム酸カリウム、トリフェニルスズクロライド、フェノール、Ｓ−４−クロロベンジル−Ｎ,Ｎ−ジエチルカルバマート、ヘキサクロロフェン、トリクロサン、硫酸銅等を含む。

２種以上の組換え微生物、即ち異なる酵母遺伝子のプロモーターにマーカータンパク質をコードするポリヌクレオチドを作動可能に連結したポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換した２種以上の組換え微生物を用いて、それぞれについて上記方法を行なうと毒性物質を更に特定することができる。例えば以下の実施例で示すように酵母遺伝子プロモーターとしてＹＬＬ０５７Ｃのものを用いると2,4−ジクロロフェノキシ酢酸、亜ヒ酸若しくはその塩、カドミウム塩、青酸若しくはその塩が検出可能であり、酵母遺伝子としてＹＬＲ３０３Ｗを用いると2,4−ジクロロフェノキシ酢酸、亜ヒ酸若しくはその塩、カドミウム塩、青酸若しくはその塩、ベンゾ(a)ピレン、ホルムアルデヒド、エチレンビスジチオカルバミド酸マンガン、水銀塩が検出可能である。従って、例えば、酵母遺伝子としてＹＬＲ３０３Ｗを用いた場合にはマーカータンパク質の発現が誘導されるが、酵母遺伝子としてＹＬＬ０５７Ｃを用いた場合にはマーカータンパク質の発現が誘導されないなら毒性物質はベンゾ(a)ピレン、水銀塩、エチレンビスジチオカルバミド酸マンガン又はホルムアルデヒドと特定される。またいずれの酵母遺伝子を用いた場合にもマーカータンパク質の発現が誘導されるなら毒性物質は2,4−ジクロロフェノキシ酢酸、亜ヒ酸若しくはその塩、カドミウム塩、又は青酸若しくはその塩と特定される。

図１は、この発明の化学物質測定装置の一実施態様を示すブロック図である。
この測定装置は、化学物質の存在または存在量を調べようとする被検試料、形質転換細胞およびその形質転換細胞に導入されたポリヌクレオチドにコードされる酸化還元酵素に対する基質を添加してなる第１溶液を収容する第１セル１と、被検試料を添加せず、形質転換細胞を添加してなる第２溶液を収容する第２セル２と、第１セル１に装着されて第１溶液の溶存酸素量を検出し、測定電流値を出力する第１酸素センサ１ａと、第２セル２に装着されて第２溶液の溶存酸素量を検出し、測定電流値を出力する第２酸素センサ２ａと、第１酸素センサ１ａから出力される測定電流値を時系列的に保持する第１保持部３と、第２酸素センサ２ａから出力される測定電流値を時系列的に保持する第２保持部４と、第１保持部３に時系列的に保持されている測定電流値から移動平均値を算出し、時系列的に保持する第１移動平均値算出保持部５と、第２保持部４に時系列的に保持されている測定電流値から移動平均値を算出し、時系列的に保持する第２移動平均値算出保持部６と、第１移動平均値算出保持部５に時系列的に保持されている移動平均値から第１の時間微分値を算出する第１時間微分値算出部７と、第２移動平均値算出保持部６に時系列的に保持されている移動平均値から第２の時間微分値を算出する第２時間微分値算出部８と、第１の時間微分値と第２の時間微分値とに基づいて化学物質の存在または存在量を測定する化学物質測定部９とを有している。

図２は、本発明の化学物質測定装置の原理を示す概略図である。図２に示すように、作用極（作用電極）２１と参照極（参照電極２２）と対極（対電極）２３から構成され、測定機器２４に接続された酸素電極を備えたセル１中に溶液２５を収容する。
溶液中で作用極２１において、Ｏ_２＋４Ｈ^＋→２Ｈ_２Ｏの反応が生じて４ｅ⁻の電子の授受が行われ、これに対応する電流が流れる。この反応は溶存酸素濃度に依存するため、流れる電流量を溶存酸素濃度に依存する。
したがって、第１溶液および第２溶液の電流値をそれぞれ測定し、第１溶液の電流値が第２溶液の電流値よりも小さい、すなわち、溶存酸素量が少ないとき、酵素−基質反応が促進されていると判断することができる。酵素−基質反応の促進は、化学物質に応答して化学物質応答性プロモーターが活性化して、上昇した濃度の酵素が発現されたことを意味する。
かくして、溶存酸素量の測定により、被検体中の化学物質の存在または存在量を検出することができる。

本発明は、被検試料と、酵素反応において酸素を電子受容体として基質を酸化する酵素をコードするポリヌクレオチドまたは酵素反応において酸素を電子受容体として基質を酸化する酵素をコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結されているポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換されていることを特徴とする組換え細胞と、前記酵素反応において酸素を電子受容体として基質を酸化する酵素に対する基質と、を含む溶液中の溶存酸素量を、酸素電極を用いて検出し、酸素電極からの出力信号を、第１の所定時間の間、第２の時間間隔で収集し、出力信号の変化から、溶存酸素量の変化を算出することによって、被検試料中の化学物質の存在または存在量を検出することを特徴とする化学物質測定方法も提供する。
ここで、第１の所定時間とは、測定開始から、所定の電流値を下回るまで、もしくはプラトーに達するまで、もしくは所定の時間が経過するまでの時間をいう。

次いで、図３のフローチャートに基づき、本発明による化学物質測定の工程を説明する。ステップＳＰ１において、第１セル１に収容された溶液に被検試料および形質転換細胞を添加するとともに、第２セル２に収容された溶液に被検試料を添加せず、形質転換細胞を添加し、ステップＳＰ２において、第１酸素センサ１ａ、第２酸素センサ２ａによる溶存酸素量の検出を開始し、ステップＳＰ３において、第１酸素センサ１ａ、第２酸素センサ２ａから出力される測定電流値をそれぞれ時系列的に保持し、ステップＳＰ４において、それぞれ時系列的に保持されている測定電流値から移動平均値を算出し、ステップＳＰ５において、それぞれ算出された移動平均値に対から最小二乗近似で時間微分値を算出し、ステップＳＰ６において、それぞれ算出された時間微分値に基づいて化学物質の存在を検出し、そのまま一連の処理を終了する。

第１溶液および第２溶液の溶存酸素量を同時に測定し、移動平均値から化学物質の存在または存在量を検出する１つの具体例について説明したが、第１溶液および第２溶液の溶存酸素量を逐次測定することもできる。また、上記移動平均値を用いる測定方法は測定精度が高いため好ましいが、セルに収容された溶液の溶存酸素が消費し尽くされるまでの時間を測定することもできる。

以下に本発明を実施例により更に説明するが本発明はこれら実施例に限定されるものではないことは勿論である。

実施例１
毒性物質の検出のためいかなる酵母遺伝子が有用であるかを調べるため以下の実験を行った。
ＹＰＤ培地（酵母エキス１％、ポリペプトン２％、ブドウ糖２％）に酵母（Saccharomyces cerevisiae S288C(α SUC2mal mel gap2 CUP1)）を２５℃で培養した。対数増殖期に以下の細胞に対して毒性を有する化学物質の１つを添加して更に２時間培養した。これと同条件で化学物質を添加せずに培養して対照区とした。化学物質の濃度は酵母の生育を阻害するが死滅には至らないような濃度を選択した。

培養終了後遠心して集菌した。これに酢酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ酢酸ナトリウム、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ）を加え、６５℃で５分間振とうし、室温に戻した後上澄みを得るという操作を２回繰り返した。これにフェノール／クロロホルム１：１溶液を１／２容量加えて遠心し上澄みを得、これに上澄みと等容量のクロロホルムを加え遠心し、上澄みを得た。この上澄みに等容量の０．３Ｍ酢酸ナトリウムを含むイソプロパノールを加え室温にて３０分放置後遠心を行ない全ＲＮＡの沈殿物を得た。この沈殿物に７０％エタノールを加え遠心し再度沈殿させ、乾燥後水に溶解させた。この全ＲＮＡから次の方法によりｍＲＮＡを単離した。ｍＲＮＡは３′末端にポリＡ鎖が付加されているため、ラテックス粒子の表面上に固定されたポリＴ構造を持ったポリヌクレオチドによりｍＲＮＡをトラップした後に、スピンカラムで洗浄、溶出を行なった（Oligotex-dT30<Super>mRNA Purification Kit, Takara）。このｍＲＮＡを蛍光標識したヌクレオチドを用い逆転写酵素（Super Script II Reverse Transcriptase; カタログ番号18064-014, GibcoBRL）を用いて逆転写し、逆転写の際にＣｙ３−ｄＵＴＰまたはＣｙ５−ｄＵＴＰを取りこませて標識ｃＤＮＡを得た。

この標識ｃＤＮＡをＴＥバッファー（10mM Tris・HCl/1mM EDTA, pH8.0）に溶解し、酵母のすべての遺伝子を有するＤＮＡチップ（ＤＮＡチップ研究所製）に滴下し、６５℃で１２時間以上ハイブリダイズさせた。このＤＮＡチップの蛍光強度をスキャナーで読み取り、化学物質を添加しない場合の蛍光強度に対する比、即ち化学物質存在下における発現ｍＲＮＡ量／化学物質不存在下における発現ｍＲＮＡ量としてリスト１〜９に示した。なおこれらの表中、最右欄の「強度」はコントロール細胞における各遺伝子のｍＲＮＡ発現量を全遺伝子の発現量の平均値で割った値である。コントロールのｍＲＮＡ発現量が小さく、化学物質を添加した場合のｍＲＮＡ発現量が大きい遺伝子が毒性物質の検出に特に有用である。

機能未知の酵母遺伝子２４００のうち約７００が重金属、農薬、界面活性剤等の毒性を有する化学物質いずれかによりｍＲＮＡの発現が誘導され（表１）、ミトコンドリア局在タンパク質遺伝子１６７(表２）、遺伝子修復系タンパク質遺伝子５２（表３）、エネルギー系タンパク質遺伝子１６１（表４）、トランスポート促進タンパク質遺伝子１４２（表５）、ストレスタンパク質遺伝子９０（表６）、代謝系たんぱく質遺伝子１４２（表７）、脱毒性蛋白質遺伝子６０（表８）、その他のカテゴリーに属する遺伝子５０７（表９）のｍＲＮＡの発現が毒性を有する化学物質のいずれかにより誘導されることが示される。ここで、化学物質存在下における発現ｍＲＮＡ量／化学物質不存在下における発現ｍＲＮＡ量が２倍以上のものを有意とした。

このように毒性物質が存在すると特定の酵母遺伝子の発現が誘導されるのは、毒性物質が該遺伝子のプロモーターを活性化することによると考えられる。そこで本発明者は、酵母遺伝子のプロモーターを含むポリヌクレオチドにマーカータンパク質をコードするポリヌクレオチドを作動可能に連結したポリヌクレオチドを含むベクターを調製し、該ベクターで酵母細胞を形質転換した。
以下の実施例にはそのようなベクターの調製、該ベクターを用いる酵母細胞の形質転換、形質転換した細胞による毒性物質の検出を示す。

プロモーターアッセイ法はｍＲＮＡの細胞内の変動をマーカー遺伝子の発現レベルに置き換えて、遺伝子発現量を非破壊で測定する方法である。化学物質を検出するために選択した遺伝子は化学物質不存在下においても発現しており、従ってマーカータンパク質も化学物質不存在下においても存在する。本発明の方法は被検試料を付加した時の酵母遺伝子の挙動をマーカータンパク質の発現量の変化によって計測し、毒性化学物質の存在およびその種類を推定するものである。このため、化学物質不存在下においてはマーカータンパク質の産生が少ない方が望ましく、また化学物質存在下においてマーカータンパク質の産生が多い方が望ましい。
このため、プロモーターアッセイにおける酵母遺伝子の選択にあたっては、強度（コントロール細胞における遺伝子の発現量／全遺伝子の発現量の平均値）が、好ましくは１．５以下、より好ましくは１以下、さらに好ましくは０．５以下であり、発現倍率（化学物質存在下の発現ｍＲＮＡ／化学物質不存在下の発現ｍＲＮＡ）が好ましくは３以上、より好ましくは１０以上、さらに好ましくは２０以上であるものを選択する。

実施例２
酵母遺伝子ＹＫＬ０７１ｗのプロモーター配列を含むポリヌクレオチドをPCRにより増幅するためのプライマーを作成した。プライマーはプライマー設計用のソフトウェアであるOligo4.0-S, SequencherIマッキントッシュ版を用いて設計し、アッパープライマーの塩基配列は、
cgcaataatactggaaacatcaa （配列番号２）
であり、ロウワープライマーの塩基配列は、
atcgactttgtttgcttagaat （配列番号３）
とした。PCRはテンプレートとして酵母の染色体（Saccharomyces cerevisiae S288C, Cat.40802，Reserch Genetics, Inc.）を用い試薬は市販のキット（KOD DNA Polymerase；コードKOD-101、Toyobo）を使用する。
使用するベクターは大腸菌と酵母の両方で複製されるYEp型シャトルベクターであるｐYES2（pYES2, Cat no:V825-20, Invirtogen Corporation, USA）（R.W.オールド、S.B.プリムローズ 遺伝子操作の原理 原書第５版, 培風館, pp.234-263, 2000））を用いる。また、マーカータンパク質であるリン酸ピリドキサミンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチド（配列番号４）は、酵母の染色体ＤＮＡをテンプレートとして遺伝子YBR035cの部分をＰＣＲで増幅したものを用いる。

まず、ｐYES2の multiple cloning site の中にオキシダーゼを挿入したベクターを作成した。その後、ｐYES2のGAL1プロモーターの部分を目的とする酵母遺伝子であるＹＫＬ０７１ｗのプロモーター配列を含むポリヌクレオチド（配列番号４）で置換して、目的とするプラスミドベクターを得る。オキシダーゼおよびプロモーター配列を含むポリヌクレオチドの挿入の操作は、適当な制限酵素を選択して行う。

次にこのプラスミドベクターで酵母Saccharomyces cerevisiae W303を形質転換する。形質転換の手順を以下に示す。
１）酵母細胞Saccharomyces cerevisiae W303を200mLのSD培地でOD660が０．５になるまで振とう培養する。
２）集菌して５mLのTE-bufferにけん濁する。
３）2.5Mのリチウムアセテイト250μLを添加する。
４）300μLずつ分注し10μlの上記プラスミドベクターを添加し、３０℃３０分培養する。
５）700μLの５０％PEG4000を付加し、３０℃６０分振とう培養する。
６）ヒートショック（４２℃、５分）後、急冷する。
７）１Mソルビト−ルで２回洗浄する。
８）最小栄養培地で作成した寒天プレートに播種する。

形質転換の確認は選択培地（ＳＤ培地（Yeast nitrogen base without amino acids (Difco 0919-15)＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、ヒスチジン、トリプトファン、ロイシン）により行う。選択培地の寒天プレートに生育したコロニーはさらに、アミノ酸の栄養要求性を確認する。

実施例３
実施例２にて作成した組換え酵母を、SD培地（アデニン、ヒスチジン、トリプトファン、ロイシン）において、２５℃にて振とう培養することにより定常状態になるように増殖させる。
定常状態の酵母をSD培地で５００倍希釈して、２５℃にて１５時間振とう培養を行い、対数増殖期として、６００ｎｍの吸光度が０．２から０．５にあることを確認した後、異なる濃度の化学物質ＴＰＮを負荷した。最終濃度が０．００５３ｐｐｍ、０．０５３ｐｐｍ、０．５３ｐｐｍの溶液をそれぞれ溶液Ａ、Ｂ、Ｃとする。
また、対照溶液として、ＴＰＮを含まない溶液を標準溶液Ｓとする。

図２のブロック図で示される化学物質測定装置の第１セルに測定用溶液Ａ、ＢまたはＣを収容し、第２セルに対照溶液を収容して、溶存酸素量の測定を開始する。
測定用溶液Ａ、ＢまたはＣおよび標準溶液Ｓにリン酸ピリドキサミンを添加して、測定を開始する。

測定用溶液Ａ、ＢまたはＣの測定電流値の時間変化と標準溶液Ｓの測定電流値の時間変化とを比較することによって、各測定溶液中に存在する化学物質（ＴＰＮ）の刺激により産生されたリン酸ピリドキサミンオキシダーゼの量を知ることができ、これによって、化学物質の存在または存在量を検出することができる。
測定用溶液Ａ、Ｂ、Ｃおよび標準溶液Ｓの溶存酸素測定における電流値の時間変化を図４に示す。

図４は、標準溶液Ｓについては、オキシダーゼの発現がないため、電流値に変化がなく、測定用溶液Ａ、Ｂ、Ｃについては、化学物質（ＴＮＰ）の濃度が高くなるにしたがって、初期の電流値の低下速度が大きく、プラトーに到達した時の定常値も低くなることを示している。

この発明の化学物質測定装置の一実施態様を示すブロック図である。 この発明の化学物質測定装置の酸素電極の原理を示す概略図である。 この発明の化学物質測定方法の一実施態様を示すフローチャートである。 この発明による溶存酸素測定における電流値の時間変化を示すグラフである。

符号の説明

１・・・第１セル、１ａ・・・第１酸素センサ、
２・・・第２セル、２ａ・・・第２酸素センサ、
３・・・第１保持部、４・・・第２保持部、
５・・・第１移動平均値算出保持部、６・・・第２移動平均値算出保持部、
７・・・第１時間微分値算出部、８・・・第２時間微分値算出部、
９・・・化学物質測定部、
２１・・・作用電極、
２２・・・参照電極、
２３・・・対電極、
２４・・・測定機器、
２５・・・溶液。

Claims (2)

1. 化学物質の存在下において上昇したプロモーター活性を発現する遺伝子のプロモーターを含む塩基配列の下流に、酵素反応において酸素を電子受容体として基質を酸化する酵素をコードするポリヌクレオチドまたは酵素反応において酸素を電子受容体として基質を酸化する酵素をコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結されているポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換されていることを特徴とし、ここに、酵素反応において酸素を電子受容体として基質を酸化する酵素が、酵母遺伝子のQ0045、Q0250、Q0275、YBL064c、YBR035c、YBR244w、YDL067c、YDR044w、YDR079w、YDR231c、YDR453c、YDR506c、YEL045c、YER014w、YER021w、YER058w、YER141w、YER145c、YER153c、YER154w、YFL041w、YGL187c、YGL191w、YGL205w、YGR029w、YGR060w、YGR062c、YGR112w、YGR234w、YHR051w、YHR116w、YIL111w、YIR037w、YJL003w、YJR034w、YKL026c、YKR066c、YLL009c、YLL018c-a、YLR038c、YLR142w、YLR205c、YLR395c、YML086c、YML129c、YMR020w、YMR058w、YMR256c、YNL052w、YOR350c、YPL132w、YPR037c、およびこれらの遺伝子に相同性を有する他種由来の遺伝子の塩基配列よりなる群から選択される遺伝子の塩基配列、または酵母遺伝子のYBL098w、YDR402c、YGL055w、YGR175c、YGR255c、YHR007c、YHR176w、YJR025c、YJR069c、YJR078w、YJR149w、YLL057c、YLR205c、YMR015c、およびこれらの遺伝子に相同性を有する他種由来の遺伝子の塩基配列よりなる群から選択される遺伝子の塩基配列である、組換え細胞。
2. 組換え酵母であることを特徴とする請求項１に記載の組換え細胞。

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