KR20150032306A

KR20150032306A - 고 처리량 dna 단편 조립

Info

Publication number: KR20150032306A
Application number: KR1020157001623A
Authority: KR
Inventors: 산딥 쿠마르; 스티븐 엘 에반스; 만주 굽타
Original assignee: 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨; 스티븐 엘 에반스; 만주 굽타; 산딥 쿠마르
Priority date: 2012-07-26
Filing date: 2013-07-23
Publication date: 2015-03-25
Also published as: US9752154B2; JP2015525567A; CN104619847A; IN2014DN11250A; US20150176015A1; RU2015106549A; CA2882143A1; ZA201409509B; AU2013293123A1; AU2013293123B2; EP2877581A1; EP2877581B1; BR112015001316A2; WO2014018512A1; IL236814A0

Abstract

본 발명은 트랜스제닉 식물용 벡터 조립 방법 및 시스템에 관한 것이다. 균일한 모듈식 공정을 사용하여 사이클 시간을 단축시키고, 본원에 제공된 방법 및 시스템은 다중-웰 플레이트, 예를 들어 96-웰 플레이트를 이용하여 클로닝 처리량을 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법 및 시스템은 PCR이 벡터 조립 공정에 관여되지 않기 때문에 서열분석 확인에 대한 필요성을 없애주거나 줄여 준다.

Description

고 처리량 DNA 단편 조립 {HIGH-THROUGHPUT DNA FRAGMENT ASSEMBLY}

본 발명은 일반적으로 분자 생물학 분야에 관한 것이고, 보다 구체적으로는 트랜스제닉(transgenic) 식물용 벡터를 구축하기 위한 DNA 단편 조립 분야에 관한 것이다.

트랜스진(transgene)을 식물 내로 도입하여 유전자 기능을 연구하기 위한 몇 가지 방법론이 개발되어 왔다. 일반적으로, 트랜스제닉 식물을 생성시키기 위한 이들 시스템은 일부 공통적인 특색을 지니고 있다: (1) 유전자 전달 시스템, (2) 형질전환된 세포 또는 식물을 형질전환되지 않은 것과 구별하기 위한 선별 시스템, 및 (3) 온전한 식물 (종종 생식력이 있기도 함)을 생성하기 위한 재생 과정. 사용된 모든 시스템 중에서, 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개된 유전자 전이 및 입자 충격 (조직 배양 중)이 트랜스제닉 식물을 생성하는 데 있어서 최근 수년간 대중적으로 인기가 있었다.

전통적으로, 제한 효소 및 리가제를 이용하여 트랜스제닉 식물용 벡터를 클로닝하는 것은, 부분적으로는 상이한 식물, 및 종종 상이한 식물 부분/조직에 대해 특이적 시스- 및/또는 트랜스-요소가 요구되기 때문에 시간 소모적이고 노동 집약적이었다. 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)이 클로닝에 광범위하게 사용되어 왔었다. 그러나, PCR을 이용하여 생성된 벡터는 PCR의 오류가 발생하기 쉬운 특성으로 인해 서열분석을 확인할 필요가 있다. 최근에는, 일반적인 클로닝을 위한 부위 특이적 레콤비나제(recombinase) 및 트랜스포사제(transposase)가 개발되었다. 그러나, 이들 효소를 트랜스제닉 식물용 벡터 조립에 적용하는 것은 제한된 성공만을 가져다 주었다.

따라서, 트랜스제닉 식물에 대한 고 처리량 벡터 조립 방법을 제공할 필요성은 여전히 존재한다.

발명의 개요

본 발명은 트랜스제닉 식물용 벡터를 구축하기 위한 DNA 단편 조립 방법 및 시스템에 관한 것이다. 벡터 조립에 대한 균일하고 모듈식의 지향성이면서도 정확한 공정을 사용하여 사이클 시간을 단축시키고, 본원에 제공된 방법 및 시스템은 다중-웰 플레이트, 예를 들어 96-웰 플레이트를 이용하여 클로닝 처리량을 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법 및 시스템은 PCR이 벡터 조립 공정에 관여되지 않기 때문에 서열분석 확인에 대한 필요성을 없애주거나 줄여 준다.

한 측면에서, 지향성 DNA 단편 조립 방법이 제공된다. 이러한 방법은

(a) 플라스미드를, 하나 이상의 유형 II 제한 효소를 이용하여 PCR 증폭시키거나, 합성하거나 또는 분해하여 제1 DNA 분자를 수득하는 단계 (이러한 제1 DNA 분자는 코작(Kozak) 서열을 포함함);

(b) 플라스미드를, 하나 이상의 유형 II 제한 효소를 이용하여 PCR 증폭시키거나, 합성하거나 또는 분해하여 제2 DNA 분자를 수득하는 단계 (이러한 제2 DNA 분자는 한쪽 말단에 코작 서열을 포함하고 다른쪽 말단에 6-프레임 정지 서열을 포함함);

(c) 플라스미드를, 하나 이상의 유형 II 제한 효소를 이용하여 PCR 증폭시키거나, 합성하거나 또는 분해하여 제3 DNA 분자를 수득하는 단계 (이러한 제3 DNA 분자는 6-프레임 정지 서열을 포함함);

(d) 플라스미드를, 하나 이상의 유형 II 제한 효소를 이용하여 PCR 증폭시키거나, 합성하거나 또는 분해하여 제4 DNA 분자를 수득하는 단계 (이러한 제4 DNA 분자는 벡터 서열을 포함함); 및

(e) 하나 이상의 레콤비나제의 존재 하에 단계 (a), (b), (c) 및 (d)의 분해 생성물을 이용하여 생성물 벡터를 조립하는 단계를 포함한다.

또 다른 측면에서, 정확하고 지향성의 DNA 단편 조립 방법이 제공된다. 이러한 방법은

(a) 플라스미드를, 하나 이상의 유형 II 제한 효소를 이용하여 PCR 증폭시키거나, 합성하거나 또는 분해하여 DNA 단편 1을 생성시키는 단계 (이러한 DNA 단편 1은 5' 벡터 상동성 서열과 코작 서열이 양옆에 위치하고 있음);

(b) 플라스미드를, 하나 이상의 유형 II 제한 효소를 이용하여 PCR 증폭시키거나, 합성하거나 또는 분해하여 DNA 단편 2를 생성시키는 단계 (이러한 DNA 단편 2는 코작 서열과 6-프레임 정지 서열이 양옆에 위치하고 있음);

(c) 플라스미드를, 하나 이상의 유형 II 제한 효소를 이용하여 PCR 증폭시키거나, 합성하거나 또는 분해하여 DNA 단편 3을 생성시키는 단계 (이러한 DNA 단편 3은 6-프레임 정지 서열과 3' 벡터 상동성 서열이 양옆에 위치하고 있음);

(d) 플라스미드를, 하나 이상의 유형 II 제한 효소를 이용하여 PCR 증폭시키거나, 합성하거나 또는 분해하여 DNA 단편 4를 생성시키는 단계 (이러한 DNA 단편 4는 3' 벡터 상동성 서열과 5' 벡터 상동성 서열이 양옆에 위치하고 있는 벡터 서열을 포함함); 및

(e) 하나 이상의 레콤비나제의 존재 하에 DNA 단편 1, 2, 3 및 4를 이용하여 생성물 벡터를 조립하는 단계를 포함한다.

제공된 방법의 한 실시양태에서, 이러한 방법은 상기 단계 (a), (b), (c) 및 (d)의 분해 생성물을, 3' → 5' 엑소뉴클레아제 활성을 지닌 효소로 처리하는 단계를 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, DNA 증폭 기술은 사용되지 않는다. 추가 실시양태에서, 폴리머라제 연쇄 반응은 사용되지 않는다.

또 다른 실시양태에서, 유형 II 제한 효소는 AcuI, BciVI, BmrI, BseRI, BsrDI, BtsI, MlyI 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 제4 DNA 분자는 치사 유전자를 포함한다. 추가 실시양태에서, 이러한 치사 유전자는 ccdB이다. 또 다른 실시양태에서, 코작 서열은 서열 1-43, 64-74 또는 이들의 보체와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%의 동일성을 갖는다. 추가 실시양태에서, 코작 서열은 서열 1-43, 64-74 및 이들의 보체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 코작 서열은 그의 5' 말단에 3-프레임 정지 서열을 포함한다. 추가 실시양태에서, 이러한 3-프레임 정지 서열은 서열 44-62 및 이들의 보체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 6-프레임 정지 서열은 서열 75-80 또는 이들의 보체와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%의 동일성을 갖는다. 추가 실시양태에서, 6-프레임 정지 서열은 서열 75-80 및 이들의 보체로 이루어진 군으로부터 선택된다.

또 다른 실시양태에서, 레콤비나제는 Int, Cre, Flp, IHF, Xis, γδ, Tn3 레솔바제(resolvase), Hin, Gin, Cin, Fis, TndX, XerC, XerD 및 Res로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 레콤비나제는 부위 특이적 레콤비나제가 아니다. 또 다른 실시양태에서, 레콤비나제는 박테리오파지(bacteriophage)에 의해 코딩된 단백질을 포함하지 않는다. 추가 실시양태에서, 박테리오파지는 람다, phi80, P22, P2, 186, P4 및 P1로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 제4 DNA 분자의 분해 생성물은 선별 마커를 포함한다. 추가 실시양태에서, 선별 마커는 항생제 내성 유전자를 포함한다. 추가 또는 대체 실시양태에서, 선별 마커는 카나마이신 및 암피실린 내성 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 단계 (a) 내지 (e)는 시험관내에서 수행된다. 또 다른 실시양태에서, 조립된 생성물 벡터는 트랜스제닉 식물에 사용하기 위한 것이다. 추가 또는 대체 실시양태에서, 조립된 생성물 벡터는 아그로박테리움-매개된 형질전환을 위한 이원성 벡터이다. 또 다른 실시양태에서, 조립된 생성물 벡터는 lox 부위, psi 부위, dif 부위, cer 부위, frt 부위, att 부위 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 재조합 부위를 포함하지 않는다.

또 다른 측면에서, 벡터를 구축하기 위한 DNA 단편 조립 시스템이 제공된다. 이러한 시스템은

(a) 하나 이상의 유형 II 제한 효소를 이용하여 제1 DNA 분자로부터 분해된 DNA 단편 1 (이러한 DNA 단편 1은 코작 서열을 포함함);

(b) 하나 이상의 유형 II 제한 효소를 이용하여 제2 DNA 분자로부터 분해된 DNA 단편 2 (이러한 DNA 단편 2는 한쪽 말단에 코작 서열을 포함하고 다른쪽 말단에 6-프레임 정지 서열을 포함함);

(c) 하나 이상의 유형 II 제한 효소를 이용하여 제3 DNA 분자로부터 분해된 DNA 단편 3 (이러한 DNA 단편 3은 6-프레임 정지 서열을 포함함);

(d) 하나 이상의 유형 II 제한 효소를 이용하여 제4 DNA 분자로부터 분해된 DNA 단편 4 (이러한 DNA 단편 4는 벡터 서열을 포함함); 및

(e) DNA 단편 1, 2, 3 및 4를 이용하여 생성물 벡터를 조립하기 위한 하나 이상의 레콤비나제를 포함한다.

또 다른 측면에서, 벡터 조립을 위한 시스템이 제공된다. 이러한 시스템은

(a) 하나 이상의 유형 II 제한 효소를 이용하여 제1 DNA 분자로부터 분해된 DNA 단편 1 (이러한 DNA 단편 1은 5' 벡터 상동성 서열과 코작 서열이 양옆에 위치하고 있음);

(b) 하나 이상의 유형 II 제한 효소를 이용하여 제2 DNA 분자로부터 분해된 DNA 단편 2 (이러한 DNA 단편 2는 코작 서열과 6-프레임 정지 서열이 양옆에 위치하고 있음);

(c) 하나 이상의 유형 II 제한 효소를 이용하여 제3 DNA 분자로부터 분해된 DNA 단편 3 (이러한 DNA 단편 3은 6-프레임 정지 서열과 3' 벡터 상동성 서열이 양옆에 위치하고 있음);

(d) 하나 이상의 유형 II 제한 효소를 이용하여 제4 DNA 분자로부터 분해된 DNA 단편 4 (이러한 DNA 단편 4는 3' 벡터 상동성 서열과 5' 벡터 상동성 서열이 양옆에 위치하고 있는 벡터 서열을 포함함); 및

제공된 시스템의 한 실시양태에서, 이러한 시스템은 3' → 5' 엑소뉴클레아제 활성을 지닌 효소를 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, DNA 증폭 기술은 사용되지 않는다. 추가 실시양태에서, 폴리머라제 연쇄 반응은 사용되지 않는다.

한 실시양태에서, 유형 II 제한 효소는 AcuI, BciVI, BmrI, BseRI, BsrDI, BtsI, MlyI 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 코작 서열은 CCACCATG, CCACCATGG 또는 이들의 보체와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%의 동일성을 갖는다. 추가 실시양태에서, 코작 서열은 CCACCATG, CCACCATGG 및 이들의 보체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 6-프레임 정지 서열은 CTAACTAATNAG, CTAGACTAGTCTAG 또는 이들의 보체와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%의 동일성을 갖는다. 추가 실시양태에서, 6-프레임 정지 서열은 CTAACTAATNAG, CTAGACTAGTCTAG 및 이들의 보체로 이루어진 군으로부터 선택된다.

한 실시양태에서, 레콤비나제는 Int, Cre, Flp, IHF, Xis, γδ, Tn3 레솔바제, Hin, Gin, Cin, Fis, TndX, XerC, XerD 및 Res로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 레콤비나제는 부위 특이적 레콤비나제가 아니다. 또 다른 실시양태에서, 레콤비나제는 박테리오파지에 의해 코딩된 단백질을 포함하지 않는다. 추가 실시양태에서, 박테리오파지는 람다, phi80, P22, P2, 186, P4 및 P1로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, DNA 단편 4는 선별 마커를 포함한다. 추가 실시양태에서, 선별 마커는 항생제 내성 유전자를 포함한다. 추가 또는 대체 실시양태에서, 선별 마커는 카나마이신 및 암피실린 내성 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 조립된 생성물 벡터는 트랜스제닉 식물에 사용하기 위한 것이다. 추가 또는 대체 실시양태에서, 조립된 생성물 벡터는 아그로박테리움-매개된 형질전환을 위한 이원성 벡터이다. 또 다른 실시양태에서, 조립된 생성물 벡터는 lox 부위, psi 부위, dif 부위, cer 부위, frt 부위, att 부위 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 재조합 부위를 포함하지 않는다.

도 1은 다중 클로닝 부위 (MCS)를 이용한 전통적인 클로닝 (경로 1)과 본원에 제공된 고 처리량 벡터 조립 (경로 2) 간의 비교를 도시한 것이다.
도 2a는 본원에 제공된 방법 및 시스템의 예시적 실시양태를 도시한 것이다. 코작 서열은 제1 단편과 제2 단편 둘 다에 존재하고, 6-프레임 정지 서열은 제2 단편과 제3 단편 둘 다에 존재한다. 이들 단편은 PCR 생성된 단편을 포함한 각종 접근법을 사용하여 수득할 수 있다.
도 2b는 본원에 제공된 방법 및 시스템의 또 다른 예시적 실시양태를 도시한 것인데, 여기서는 상이한 플라스미드로부터 유형 II 제한 효소를 이용하여 단편을 생성시킨다. 코작 서열은 제1 단편과 제2 단편 둘 다에 존재하고, 6-프레임 정지 서열은 제2 단편과 제3 단편 둘 다에 존재한다. 이들 단편은 PCR을 이용하여 생성되지 않는다.
도 3은 예시적 코작 서열 (서열 1-43)의 목록을 나타낸 것이다.
도 4는 코작 서열에 연결될 수 있는 예시적 3-프레임 정지 서열 (서열 44-62)의 목록을 나타낸 것이다. 서열 63은 예시적 코작 + 3-프레임 정지 서열을 나타낸다.
도 5a는 예시적 쌍자엽식물 코작 서열의 목록을 나타낸 것이다. 도 5b는 예시적 6-프레임 정지 서열 (서열 75-80)의 목록을 나타낸 것이다.
도 6은 제1 DNA 분자 (프로모터 벡터)로부터 분해된 예시적 단편 1 (프로모터 단편)을 도시한 것이다. 단편 1은 그의 3' 말단에 코작 서열을 포함한다.
도 7은 제2 DNA 분자 (CDS 벡터)로부터 분해된 예시적 단편 2 (코딩 서열 단편)를 도시한 것이다. 단편 2는 그의 5' 말단에 코작 서열을 포함하고 그의 3' 말단에 6-프레임 정지 서열을 포함한다.
도 8은 제3 DNA 분자 (3'UTR 벡터)로부터 분해된 예시적 단편 3 (3'UTR 단편)을 도시한 것이다. 단편 3은 그의 5' 말단에 6-프레임 정지 서열을 포함한다.
도 9는 제4 DNA 분자 (골격 벡터)로부터 분해된 예시적 단편 4 (3'UTR 단편)를 도시한 것이다.
도 10a 및 10b는 본원에 제공된 방법 및/또는 시스템을 이용하는 또 다른 예시적 벡터 조립을 도시한 것이다. 프로모터 및 CDS 단편은 그의 5' 말단에 3-프레임 정지 서열을 포함하는 코작 서열을 함유한다. 이러한 4개 단편을 발현 벡터 내로 한 단계로 조립한다.
도 11은 본원에 제공된 방법 및/또는 시스템을 이용하는 예시적 벡터 조립을 도시한 것이다. 4개 단편을 발현 벡터 내로 한 단계로 조립한다.

발명의 상세한 설명

트랜스제닉 식물을 생성하는 것이 많은 식물 종에 대해 통상적인 것으로 되어왔지만, 현 방법론은 노동 집약적이다. 따라서, 본원에 개시된 방법 및 시스템의 목적은 일관되고/되거나 간결한 방식으로 고 처리량 적용하는 데 적합한 벡터 조립 방법을 제공하는 것이다.

통상적인 유전자 클로닝에서는, 표적 유전자를 벡터 플라스미드 내로 삽입하기 전에 이러한 표적 유전자의 서열을 기초로 하여 적합한 제한 효소를 확인한다. 벡터 DNA와 유전자 삽입물 둘 다는 전형적으로, 동일한 제한 효소(들)로 절단한 다음, DNA 리가제와 함께 라이게이션시킨다. 이러한 공정을 위해서는 DNA 단편을 수동으로 조작해야 하는데, 이와 같이 조작하기 위해서는 바람직하지 못한 다중 클로닝 부위 서열을, 보다 구체적으로는 유전자 발현에 영향을 미칠 수도 있는 코딩 서열과 프로모터 사이에 삽입시켜야 한다. 또한, 이러한 코딩 서열 또는 유전 요소는 종종, 상기와 같이 선택된 효소에 의해 인식되기도 하는 내부 제한 부위를 함유할 수도 있으므로, 클로닝 이전에 변형시킬 필요가 있다. 따라서, 고 처리량 클로닝/적용에 적응가능한 보다 효율적이면서도 유효한 벡터 조립 공정이 필요하다.

소정의 유기체에 대해 모든 벡터들 간에 균일한 특이적 서열 연접부를 이용하는 벡터 조립 방법 및 시스템이 제공된다. 이와 같이 제공된 방법 및 시스템을 설계하여, 기존에 공지된 클로닝 방법과 상반되게 고 처리량 클로닝/적용을 가능하게 한다. 예를 들어, 코작/컨센서스 서열 (문헌 [Kozak M., 1991] 참조), 및 코딩 서열의 5' 및 3' 말단에 정지 코돈 (2-프레임 이상에서) 및 그의 인접한 DNA 단편의 말단에 동일한 서열을 트랜스제닉 식물용으로 설계된 벡터에 사용할 수 있다. 이들 서열은 안정적인 유전자 발현에 있어 결정적인 생물학적 기능을 제공하면서도 DNA 재조합 기술을 이용하여 선형 DNA 단편 조립에 필요한 극히 중요한 서열 상동성으로서 제공되기도 한다.

DNA 단편을 조립하여, 바람직하지 못한 어떠한 간섭 서열도 수반하지 않는 기능적 전사 단위로 만드는 고속 달성의 고 처리량 (HTP) 공정이 제공된다. 이러한 공정은 코딩 영역의 5' 및 3' 연접부 상에 독특한 유기체-특이적 소형 서열을 활용하였다. 이들 독특한 연접부 마이크로-상동성은 프로모터, 코딩 서열 및 3'UTR을 목적하는 배향으로 조립하기 위해 사용된다. 독특한 코작/컨센서스 서열을 5' 연접부 상에 삽입할 수 있고, 이러는 동안에 6-프레임 정지 코돈을 코딩 서열의 3' 상에 가할 수 있다. 코작/컨센서스 서열을 프로모터의 3' 상에 삽입하고 6-프레임 정지 코돈을 3'UTR의 5' 상에 부가하면, DNA 재조합 기술을 이용하여 HTP 벡터를 제조하는 데 필요한 연접부 상동성이 제공된다.

일부 실시양태에서, 본원에 제공된 벡터 조립을 위해 플라스미드로부터 DNA 단편을 추출하기 위한 유형 II 제한 효소의 용도가 제공된다. 평활하거나 짧은 3' 오버행(overhang)을 제공하는 유형 II 제한 효소 (표 1 참조)가 본 발명에 사용된다. 원활한 클로닝 또는 유사한 효소의 3' → 5' 엑소뉴클레아제 활성으로 인해, 단편들은 클로닝 공정 동안 평활해진다. 본 발명은 또한, 골격 추출에 사용되는 벡터에 치사 유전자, 예를 들어 ccdB를 사용하는 것을 기재하고 있다. 또한, 선별 마커는 원활한 조립을 위해 단편을 추출하는 데 사용되는 벡터와는 상이한 골격 상에 사용한다. 골격 벡터 상의 음성 선별 마커는 절단되지 않은 잠재적 골격 벡터에 대한 배경 클론을 피할 것이며, 이러는 동안 단편 벡터 상의 상이한 선별 마커는 배경이 절단되지 않은 단편 벡터로 오염되지 못하게 할 것이다.

클로닝 상용성 DNA 단편을 플라스미드로부터 직접적으로 추출하기 위해 유형 II 제한 효소를 사용하면, PCR 증폭할 필요가 없어진다. DNA 단편을 조립하여, 양 말단에 유형 II 제한 효소 부위가 위치하고 있는 목적 생성물 벡터로 만들 수 있으므로, 소형 3' 오버행 또는 평활 말단 단편이 플라스미드 제한 후에 방출된다. 모듈식의 고 처리량 자동화 기술을 만들기 위해 상용성 단편의 라이브러리를 추출 및 구축하기 위한 플랫폼(platform)이 제공된다. 일부 실시양태에서, 공여 벡터/플라스미드에 음성 선별 마커를 사용하는 것이 제공되는데, 여기서 생성물 벡터의 벡터 골격은 양성 선별 마커를 포함할 수 있다. 이들 실시양태는 배경이 절단되지 않은 잠재적 벡터로 오염되지 못하게 하고, 본원에 제공된 방법 및 시스템이 특정 상황 하에서 보다 효율적일 수 있도록 해준다.

본원에 사용된 바와 같은, 어구 "벡터"는 그것 내로 외래 DNA 조각을 삽입할 수 있는, 전형적으로 이중 가닥의 DNA 조각을 지칭한다. 벡터는, 예를 들어 전형적으로 선별 또는 스크리닝 마커 또는 트랜스진을 코딩하는, 플라스미드 또는 바이러스 기원의 것일 수 있다. 벡터는 외래 또는 이종 DNA를 적합한 숙주 세포 내로 수송하기 위해 사용된다. 일단 숙주 세포 내에 있으면, 벡터는 숙주 염색체성 DNA와 독립적으로 또는 이와 우연의 일치로 복제될 수 있다. 또 다른 한편, 벡터는 외래 또는 이종 DNA를 숙주 염색체 내로 표적 삽입시킬 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은, 어구 "트랜스진 벡터"는 DNA의 삽입된 절편, 즉 숙주 세포 내에서 RNA로서 복제되거나 또는 mRNA로 전사되는 "트랜스진"를 함유하는 벡터를 지칭한다. 어구 "트랜스진"은 RNA로 전환되는 삽입된 DNA의 그 부분뿐만 아니라 RNA의 전사 또는 복제에 필요한 벡터의 그 부분을 지칭한다. 트랜스진은 전형적으로, 관심 유전자를 포함하지만, 단백질을 생산할 수 있는 개방 판독 프레임을 함유하는 폴리뉴클레오티드 서열을 반드시 포함할 필요는 없다.

본원에 사용된 바와 같은, 어구 "형질전환된" 또는 "형질전환"은 DNA를 세포 내로 도입하는 것을 지칭한다. 어구 "형질전환체" 또는 "트랜스제닉"은 형질전환되었거나 또는 형질전환 과정을 진행 중인 식물 세포, 식물 등을 지칭한다. 이와 같이 도입된 DNA는 통상적으로, 삽입된 DNA 조각을 함유하는 벡터의 형태이다.

본원에 사용된 바와 같은, 어구 "선별 마커" 또는 "선별 마커 유전자"는, 예를 들어 식물 세포를 선별제로부터 보호하거나 또는 선별제에 대한 내성/허용성을 제공하기 위해 식물 형질전환에 임의로 사용되는 유전자를 지칭한다. 기능적 선별 마커를 수용하고 있는 세포 또는 식물만이 선별제 갖는 조건 하에 분할되거나 성장할 수 있다. 선별제의 예는, 예를 들어 항생제를 포함할 수 있는데, 이는 스펙티노마이신, 네오마이신, 카나마이신, 파로모마이신, 겐타마이신 및 히그로마이신을 포함한다. 이들 선별 마커는 항생제 카나마이신에 대한 내성을 부여해 주는 효소를 발현하는, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 (npt II)에 대한 유전자, 및 관련 항생제인 네오마이신, 파로모마이신, 겐타마이신 및 G418에 대한 유전자, 또는 히그로마이신에 대한 내성을 부여해 주는 효소를 발현하는, 히그로마이신 포스포트랜스퍼라제 (hpt)에 대한 유전자를 포함한다. 기타 선별 마커 유전자는 Bar를 포함한 제초제 내성 [BASTA^® (글루포시네이트 암모늄) 또는 포스피노트리신(PPT)에 대항한 내성], 아세토락테이트 신타제 내성 [ALS; 술포닐우레아 (SU), 이미다졸리논 (IMI), 트리아졸로피리미딘 (TP), 피리미디닐 옥시벤조에이트 (POB), 및 측쇄 아미노산의 합성에 있어서의 제1 단계를 방지하는 술포닐아미노 카르보닐 트리아졸리논과 같은 억제제에 대항한 내성], 글리포세이트, 2,4-D 및 금속 내성 또는 감수성을 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 어구 "마커-양성"은 선별 마커 유전자를 포함하도록 형질전환시킨 식물을 지칭한다.

각종 선별 또는 검출 마커를 선택된 발현 벡터 내로 혼입시켜 형질전환된 식물 또는 형질전환체를 확인 및 선별할 수 있다. 형질전환된 식물에서의 선별 마커의 발현을 확인하기 위한 많은 방법이 이용가능한데, 이는 예를 들어, DNA 서열분석 및 PCR (폴리머라제 연쇄 반응), 서던 블롯팅(Southern blotting), RNA 블롯팅, 벡터로부터 발현된 단백질, 예를 들어 포스피노트리신 내성을 매개하는 침전된 단백질, 또는 기타 단백질, 예컨대 리포터 유전자 β-글루쿠로니다제 (GUS), 루시페라제, 그린 형광성 단백질 (GFP), DsRed, β-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT), 알칼리성 포스파타제 등을 검출하기 위한 면역학적 방법을 포함한다 (문헌 [Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Press, N.Y., 2001] 참조; 그의 전문이 본원에 참조로 포함됨).

선별 마커 유전자는 형질전환된 세포 또는 조직의 선별을 위해 활용된다. 선별 마커 유전자는 항생제 내성을 코딩하는 유전자, 예컨대 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II (NEO) 및 히그로마이신 포스포트랜스퍼라제 (HPT)를 코딩하는 유전자뿐만 아니라 제초성 화합물에 대한 내성을 부여해 주는 유전자를 포함한다. 제초제 내성 유전자는 일반적으로, 그 제초제에 대해 무감각한 변형된 표적 단백질을 코딩하거나 또는 제초제가 작용할 수 있기 전에 식물 내에서 그러한 제초제를 분해하거나 그 독성을 제거하는 효소를 코딩한다 (문헌 [DeBlock et al. (1987) EMBO J., 6:2513-2518]; [DeBlock et al. (1989) Plant Physiol., 91:691-704]; [Fromm et al. (1990) 8:833-839]; [Gordon-Kamm et al. (1990) 2:603-618] 참조). 예를 들어, 글리포세이트 또는 술포닐우레아 제초제에 대한 내성은 돌연변이체 표적 효소, 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 신타제 (EPSPS) 및 아세토락테이트 신타제 (ALS)를 코딩하는 유전자를 사용함으로써 획득하였다. 글루포시네이트 암모늄, 브로목시닐(bromoxynil), 및 2,4-디클로로페녹시아세테이트 (2,4-D)에 대한 내성은 각각의 제초제를 해독시키는, 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제, 니트릴라제, 또는 2,4-디클로로페녹시아세테이트 모노옥시게나제를 코딩하는 박테리아 유전자를 사용함으로써 획득하였다. 2,4-D 내성에 대한 효소/유전자는 앞서 US 2009/0093366 및 WO 2007/053482 (그들의 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 개시되었다.

이미다졸리논 또는 술포닐우레아를 포함한 기타 제초제는 생장점 또는 분열 조직을 억제할 수 있다. 이러한 범주에 있는 예시적 유전자는, 예를 들어 다음 문헌에 각각 기재된 바와 같은 돌연변이체 ALS 및 AHAS 효소를 코딩한다 (문헌 [Lee et al., EMBO J. 7: 1241 (1988)]; 및 [Miki et al., Theon. Appl. Genet. 80:449 (1990)] 참조).

글리포세이트 내성 유전자는 돌연변이체 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 신타제 (EPSP) 유전자 (재조합 핵산의 도입을 통하고/통하거나 천연의 EPSP 유전자, aroA 유전자 및 글리포세이트 아세틸트랜스퍼라제 (GAT) 유전자 각각의 각종 형태의 생체내 돌연변이 유발을 통함)를 포함한다. 기타 포스포노 화합물에 대한 내성 유전자는 글루포시네이트 [스트렙토미세스 히그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus) 및 스트렙토미세스 비리디크로모게네스(Streptomyces viridichromogenes)를 포함한 스트렙토미세스 종으로부터의 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 (PAT) 유전자], 및 피리디녹시 또는 페녹시 프로프리온산 및 시클로헥손 (ACCase 억제제-코딩 유전자)을 포함한다 (예를 들어, 식물에 글리포세이트 내성을 부여할 수 있는 EPSP 형태의 뉴클레오티드 서열이 개시되어 있는 미국 특허 번호 4,940,835 (Shah, et al.) 및 미국 특허 번호 6,248,876 (Barry et al.) 참조). 돌연변이체 aroA 유전자를 코딩하는 DNA 분자는 ATCC 수탁 번호 39256 하에 수득할 수 있고, 이러한 돌연변이체 유전자의 뉴클레오티드 서열은 L-포스피노트리신과 같은 제초제에 대한 내성을 부여해 주는 글루타민 신테타제 유전자의 뉴클레오티드 서열이 개시되어 있는, 미국 특허 번호 4,769,061 (Comai), 유럽 특허 출원 번호 0 333 033 (Kumada et al.), 및 미국 특허 번호 4,975,374 (Goodman et al.)에 개시되어 있다. PAT 유전자의 뉴클레오티드 서열은 유럽 출원 번호 0 242 246 (Leemans et al.)에 제공되어 있다. 또한, 문헌 ([DeGreef et al., Bio/Technology 7:61 (1989)] 참조)에는 PAT 활성을 코딩하는 키메라 bar 유전자를 발현하는 트랜스제닉 식물의 생성이 기재되어 있다. 페녹시 프로프리온산 및 시클로헥손 [세톡시딤(sethoxydim) 및 할록시폽(haloxyfop)을 포함함]에 대한 내성을 부여해 주는 유전자의 예는 문헌 ([Marshall et al., Theon. Appl. Genet. 83:435 (1992)] 참조)에 기재된 Acc1-S1, Acc1-S2 및 Acc1-S3 유전자이다. 글리포세이트 내성을 부여할 수 있는 GAT 유전자가 WO 2005012515 (Castle et al.)에 기재되어 있다. 2,4-D, fop 및 피리딜옥시 옥신 제초제에 대한 내성을 부여해 주는 유전자는 WO 2005107437 및 미국 특허 출원 번호 11/587,893에 기재되어 있다.

트리아진 (psbA 및 1s+ 유전자) 또는 벤조니트릴 (니트릴라제 유전자)을 포함한 기타 제초제는 광합성을 억제할 수 있다. 문헌 ([Przibila et al., Plant Cell 3: 169 (1991)] 참조)에는 돌연변이체 psbA 유전자를 코딩하는 플라스미드를 이용하여 클라미도모나스(Chlamydomonas)를 형질전환시키는 것이 기재되어 있다. 니트릴라제 유전자에 대한 뉴클레오티드 서열은 미국 특허 번호 4,810,648 (Stalker)에 개시되어 있고, 이들 유전자를 함유하는 DNA 분자는 ATCC 수탁 번호 53435, 67441, 및 67442 하에 입수 가능하다. 글루타치온 S-트랜스퍼라제를 코딩하는 DNA의 클로닝 및 발현은 문헌 ([Hayes et al., Biochem. J. 285: 173 (1992)] 참조)에 기재되어 있다.

본 발명의 목적상, 선별 마커 유전자는 다음을 코딩하는 유전자를 포함하지만, 그에 제한되지 않는다: 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II (문헌 [Fraley et al. (1986) CRC Critical Reviews in Plant Science, 4:1-25] 참조); 시아나미드 히드라타제 (문헌 [Maier-Greiner et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:4250-4264] 참조); 아스파르테이트 키나제; 디히드로디피콜리네이트 신타제 (문헌 [Perl et al. (1993) Bio/Technology, 11:715-718] 참조); 트립토판 데카르복실라제 (문헌 [Goddijn et al. (1993) Plant Mol. Bio., 22:907-912] 참조); 디히드로디피콜리네이트 신타제 및 탈감작화 아스파르테이트 키나제 (문헌 [Perl et al. (1993) Bio/Technology, 11:715-718] 참조); bar 유전자 [문헌 [Toki et al. (1992) Plant Physiol., 100:1503-1507] 및 [Meagher et al. (1996) and Crop Sci., 36:1367] 참조); 트립토판 데카르복실라제 (문헌 [Goddijn et al. (1993) Plant Mol. Biol., 22:907-912] 참조); 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 (NEO) (문헌 [Southern et al. (1982) J. Mol. Appl. Gen., 1:327] 참조); 히그로마이신 포스포트랜스퍼라제 (HPT 또는 HYG) (문헌 [Shimizu et al. (1986) Mol. Cell Biol., 6:1074] 참조); 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) (문헌 [Kwok et al. (1986) PNAS USA 4552] 참조); 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제 (문헌 [DeBlock et al. (1987) EMBO J., 6:2513] 참조); 2,2-디클로로프로피온산 데할로게나제 (문헌 [Buchanan-Wollatron et al. (1989) J. Cell. Biochem. 13D:330] 참조); 아세토히드록시산 신타제 (문헌 [Anderson et al, 미국 특허 번호 4,761,373]; [Haughn et al. (1988) Mol. Gen. Genet. 221:266] 참조); 5-에놀피루빌-시키메이트-포스페이트 신타제 (aroA) (문헌 [Comai et al. (1985) Nature 317:741] 참조); 할로아릴니트릴라제 (문헌 [Stalker et al., 공개된 PCT 출원 WO87/04181] 참조); 아세틸-조효소 A 카르복실라제 (문헌 [Parker et al. (1990) Plant Physiol. 92:1220] 참조); 디히드롭테로에이트 신타제 (sul I) (문헌 [Guerineau et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15:127] 참조); 및 32 kD 광시스템 II 폴리펩티드 (psbA) (문헌 [Hirschberg et al. (1983) Science, 222:1346] 참조).

또한, 클로람페니콜 (문헌 [Herrera-Estrella et al. (1983) EMBO J., 2:987-992] 참조); 메토트렉세이트 (문헌 [Herrera-Estrella et al. (1983) Nature, 303:209-213]; [Meijer et al. (1991) Plant Mol Bio., 16:807-820 (1991)] 참조); 히그로마이신 (문헌 [Waldron et al. (1985) Plant Mol. Biol., 5:103-108]; [Zhijian et al. (1995) Plant Science, 108:219-227] 및 [Meijer et al. (1991) Plant Mol. Bio. 16:807-820] 참조); 스트렙토마이신 (문헌 [Jones et al. (1987) Mol. Gen. Genet., 210:86-91] 참조); 스펙티노마이신 (문헌 [Bretagne-Sagnard et al. (1996) Transgenic Res., 5:131-137] 참조); 블레오마이신 (문헌 [Hille et al. (1986) Plant Mol. Biol., 7:171-176] 참조); 술폰아미드 (문헌 [Guerineau et al. (1990) Plant Mol. Bio., 15:127-136] 참조); 브로목시닐 (문헌 [Stalker et al. (1988) Science, 242:419-423] 참조); 2,4-D (문헌 [Streber et al. (1989) Bio/Technology, 7:811-816] 참조); 글리포세이트 (문헌 [Shaw et al. (1986) Science, 233:478-481] 참조); 및 포스피노트리신 (문헌 [DeBlock et al. (1987) EMBO J., 6:2513-2518] 참조)에 대한 내성을 코딩하는 유전자가 포함된다. 본 개시내용에 인용된 모든 참고문헌은 달리 언급되지 않는 한 그들의 전문이 본원에 참조로 포함된다.

선별 마커 및 리포터 유전자의 상기 목록은 이에 제한적인 것을 의미하지 않는다. 어떠한 리포터 또는 선별 마커 유전자도 본 발명에 의해 포괄된다. 필요한 경우, 이러한 유전자는 당해 분야에 공지된 방법에 의해 서열분석될 수 있다.

리포터 및 선별 마커 유전자는 식물에서의 최적의 발현을 위해 합성된다. 즉, 이러한 유전자의 코딩 서열은 식물에서의 발현을 증강시키도록 변형시켰다. 보다 높은 형질전환 효율을 가져다주는 보다 고 수준으로 식물에서 발현되도록 합성 마커 유전자를 설계한다. 유전자의 합성 최적화를 위한 방법은 당해 분야에서 이용가능하다. 사실상, 몇 가지 유전자는 식물에서의 유전자 생성물의 발현을 증가시키도록 최적화하였다.

마커 유전자 서열은 특별한 식물 종에서의 발현을 위해 최적화시킬 수 있거나 또 다른 한편으론, 식물 계열에서의 최적의 발현을 위해 변형시킬 수 있다. 특별한 관심 식물 종에서 가장 많은 양으로 발현된 단백질 중의 가장 높은 빈도의 코돈으로부터 상기 식물 선호 코돈을 결정할 수 있다 (예를 들어, [EPA 0359472; EPA 0385962; WO 91/16432]; 문헌 [Perlak et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:3324-3328]; 및 [Murray et al. (1989) Nucleic Acids Research, 17: 477-498]; [미국 특허 번호 5,380,831; 및 미국 특허 번호 5,436,391] 참조; 본원에 참조로 포함됨). 이러한 방식으로, 뉴클레오티드 서열을 어떠한 식물에서의 발현을 위해서도 최적화시킬 수 있다. 유전자 서열의 모든 또는 어느 부분도 최적화된 것이거나 합성일 수 있는 것으로 인식된다. 즉, 완전히 최적화되거나 부분적으로 최적화된 서열을 사용할 수도 있다.

또한, 아그로박테리움-매개된 형질전환 시스템을 활용하는 몇 가지 형질전환 전략이 개발되었다. 예를 들어, 이원성 벡터 전략은 T-DNA가 나머지 Ti 플라스미드와 상이한 플라스미드 내에 있는 2-플라스미드 시스템에 기초한 것이다. 공동-통합 전략에서는, 소량의 T-DNA를 외래 유전자와 동일한 벡터 내에 놓아두는데, 이후에 벡터는 Ti 플라스미드와 재조합된다.

본원에 사용된 바와 같은, 어구 "식물"은 쌍자엽식물 및 단자엽식물을 포함한다. 쌍자엽식물의 예는 담배, 아라비돕시스(Arabidopsis), 대두, 토마토, 파파야, 카놀라, 해바라기, 목화, 알팔파, 감자, 포도 나무, 비둘기 완두콩, 완두콩, 브라시카(Brassica), 병아리 콩, 사탕무, 평지씨, 수박, 멜론, 고추, 땅콩, 호박, 무, 시금치, 스쿼시, 브로콜리, 양배추, 당근, 콜리플라워, 셀러리, 배추, 오이, 가지, 및 양상추를 포함한다. 단자엽식물의 예는 옥수수, 쌀, 밀, 사탕 수수, 보리, 호밀, 수수, 난초, 대나무, 바나나, 카타일스(cattails), 백합, 귀리, 양파, 기장 및 라이밀(triticale)을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은, 어구 "숙주"는 재조합 클로닝 생성물의 수용자일 수 있는 모든 원핵 또는 진핵 유기체를 지칭한다. 따라서, "숙주"는 유전자 조작될 수 있는 원핵 또는 진핵 유기체를 포함한다. 이러한 숙주의 예에 대해서는 다음 문헌을 참조할 수 있다 (문헌 [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1982)] 참조).

본원에 사용된 바와 같은, 어구 "삽입물(들)"은 공지된 분자 생물학 방법에 의해 조작될 수 있는 목적하는 핵산 절편 또는 핵산 절편 집단을 지칭한다. 따라서, 용어 삽입물(들)은 특별한 핵산 (바람직하게 DNA) 절편 또는 절편 집단을 포함하는 것을 의미한다. 이러한 삽입물(들)은 하나 이상의 유전자/요소를 포함할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은, 어구 "삽입물 공여자"는 이러한 삽입물을 수반하는 2개의 모 핵산 분자 (예를 들어, RNA 또는 DNA) 중 하나를 지칭한다. 삽입물 공여자 분자는 특이적 부위를 갖는 양쪽 측면 상에 위치한 삽입물을 포함한다. 삽입물 공여자는 선형이거나 환형일 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 삽입물 공여자는 환형 DNA 분자이고, 클로닝 벡터 서열을 추가로 포함한다. 삽입물 집단 또는 핵산 절편 집단을 사용하여 삽입물 공여자를 제조하는 경우, 삽입물 공여자 집단이 생성되는데, 이를 본원에 제공된 방법 및/또는 시스템에 따라서 사용할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은, 어구 "생성물" 또는 "생성물 벡터"는 본원에 기재된 벡터 조립 공정 후의 목적하는 딸 분자를 지칭한다. 이러한 생성물은 클로닝되거나 서브클로닝되어야 하는 핵산을 함유한다. 본 발명에 따라서, 삽입물 공여자 집단을 사용하는 경우, 이로써 생성되는 생성물 분자 집단은 삽입물 공여자 집단의 전부 또는 일부를 함유할 것이고, 바람직하게는 삽입물 공여자의 본래 분자의 대표적 집단을 함유할 것이다.

본원에 사용된 바와 같은, 어구 "프로모터"는 출발 코돈에 근접하여 위치한, 유전자의 5'-영역으로서 일반적으로 기재된 DNA 서열을 지칭한다. 인접한 DNA 절편의 전사는 프로모터 영역에서 개시된다. 전사의 억제성 프로모터의 비율은 억제성 작용제에 반응하여 감소된다. 전사의 유도성 프로모터의 비율은 유도성 작용제에 반응하여 증가된다. 전사의 구성적 프로모터의 비율은 구체적으로 조절되지 않지만, 이는 일반적 대사 조건의 영향 하에 다양할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은, 어구 "부위-특이적 레콤비나제"는 전형적으로 적어도 다음 4가지 활성 (또는 그의 조합)을 지닌 레콤비나제의 유형을 지칭한다: (1) 1개 또는 2개의 특이적 핵산 서열을 인식하는 활성; (2) 상기 서열(들)을 절단하는 활성; (3) 가닥 교환에 관여한 토포이소머라제 활성; 및 (4) 절단된 핵산 가닥을 다시 봉할 수 있는 리가제 활성 (문헌 [Sauer, B., Current Opinions in Biotechnology 5:521-527 (1994)] 참조). 보존적 부위-특이적 재조합은 양 파트너에 대한 고도의 특이성에 의해 상동성 재조합 및 전위와 구별된다. 가닥 교환 기전은 DNA 합성의 부재 하에 특이적 DNA 서열을 절단하고 재연결시키는 것을 포함한다 (문헌 [Landy, A. (1989) Ann. Rev. Biochem. 58:913-949] 참조).

본원에 사용된 바와 같은, 어구 "벡터"는 유용한 생물학적 또는 생화학적 특성을 특정 삽입물에 제공하는 핵산 분자 (바람직하게는 DNA)를 지칭한다. 그의 예는 플라스미드, 파지, 자기 복제 서열 (ARS), 중심절, 및 시험관내에서 또는 숙주 세포에서 복제할 수 있거나 복제될 수 있거나, 또는 목적하는 핵산 절편을 숙주 세포 내의 목적하는 위치로 전달할 수 있는 기타 서열을 포함한다. 벡터는 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위를 가질 수 있는데, 이 부위에서 서열들은 벡터의 필수 생물학적 기능의 손실 없이도 확정가능한 방식으로 절단될 수 있고, 이러한 부위 내로 핵산 단편이 스플라이싱되어 그의 복제 및 클로닝이 유발될 수 있다. 벡터는, 예를 들어 PCR용 프라이머 부위, 전사 및/또는 해독 개시 및/또는 조절 부위, 재조합 신호, 레플리콘, 선별 마커 등을 추가로 제공할 수 있다. 클로닝 벡터는 이러한 클로닝 벡터를 이용하여 형질전환된 세포를 확인하는 데 사용하기 적합한 하나 이상의 선별 마커를 추가로 함유할 수 있다.

DNA 단편의 마이크로-상동성에 모듈성을 부가함으로써, 매번 DNA 단편을 재합성하지 않고서도 다수의 DNA 단편을 혼합 및 매치할 수 있게 하는 방법 및 시스템이 제공된다. 유사한 생물학적 기능을 제공해 주는 서열을 DNA 조합을 위한 상동성 영역으로서 사용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로모터와 코딩 서열 인접 말단 간의 코작 컨센서스 서열 상동성과, 코딩 서열과 3'UTR 인접 말단 간의 정지 코돈 (2 프레임 이상에서) 상동성을 이용하여 새로운 식물 전사 단위 (PTU)를 조립한다. 유사하게, PTU의 양 말단에 제한 효소 인식 부위의 마이크로-상동성을 이용하여, 이를 플라스미드 내로 동시에 조립한다. 상기 제공된 방법 및 시스템은 트랜스진 발현과 기능상 상용성인 벡터 구축을 위해 PTU의 지향적이면서도 정확한 고 처리량 조립을 가능케 한다.

상기 제공된 방법 및 시스템은 바람직하지 못하거나 여분의 어떠한 서열도 벡터에 부가할 필요가 없이 벡터 조립/구축을 허용해 주는 고 처리량의 융통성인 모듈식 DNA 조립 플랫폼을 창출시키는 데 유용하다. 상기 제공된 방법 및 시스템은 기존의 모듈식 DNA 단편을 혼합 및 매치하여 목적하는 유전 요소를 지닌 벡터를 구축할 수 있게 해준다. 상기 제공된 방법 및 시스템은 추가로, 트랜스진 발현과 기능상 상용성인 벡터 구축을 위한 PTU의 지향적이면서도 정확한 고 처리량 조립을 가능케 한다.

실시예

실시예 1 - 벡터 조립을 위한 모듈식 접근법

도 1은 전통적 클로닝 방법 (경로 1)과 본원에 제공된 모듈식 접근법 (경로 2) 간의 차이를 예시한 것이다. 제공된 모듈식 접근법은 본질적으로, 관여하는 단계 수가 더 적고 고 처리량 포맷에 적응 가능하다.

DNA 단편을 동시에 정확하고 지향적으로 조립하기 위한, 모듈식이긴 하지만 고도로 효율적인 벡터 구축 접근법이 제공된다. 제공된 예시적 조립 공정이 도 2a에 예시되어 있다. DNA 단편은 기존의 플라스미드로부터 PCR 증폭되거나, 합성되거나, 또는 절단될 수 있다. 코작 서열을 코딩 서열의 5'에 삽입시키고, 이러한 동안에 아미노산 정지 코돈을 코딩 서열의 3' 말단에 가한다. 프로모터 단편 (단편 1)은 그의 3' 말단에 코작 서열을 함유하고, 벡터 연접부와 매치되는 그의 5' 말단에 소형 서열을 함유한다. 코딩 단편 (단편 2)은 그의 5' 연접부에 코작 서열을 함유하고, 그의 3' 말단에 아미노산 정지 코돈 (2 프레임 이상에서) 서열을 함유한다. 유사하게, 3'UTR 단편 (단편 3)은 3'UTR의 5' 말단에 아미노산 정지 코돈 (2 프레임 이상에서) 서열을 함유하고, 또 다른 벡터 연접부와 매치되는 또 다른 소형 서열을 함유한다. 벡터 단편 (단편 4)은 단편 1 및 3 중의 상응하는 서열과 동일한 2개의 상이한 벡터 연접부 서열을 갖는다. 이들 모듈식 선형 단편을 적합한 DNA 재조합 시스템의 존재 하에 합하면, 전사 단위 내에 바람직하지 못한 어떠한 서열도 수반하지 않으면서 이들 4개 단편을 함유하는 최종 벡터가 정확하게 조립될 것이다.

도 2b는 DNA 단편이 전구체 플라스미드로의 제한 효소 분해로부터 생성되고 PCR을 포함한 DNA 증폭이 벡터 조립에 이용되지 않는 또 다른 실시양태를 추가로 도시한 것이다.

일부 실시양태에서, 매치되는 플라스미드 서열은, 일단 트랜스진이 관심 유기체 내로 삽입되면, PTU 또는 통합인 하류 분석에 활용될 수 있는 제한 효소 (RE) 인식 부위이다. 이러한 RE 부위는 또한, 플라스미드로부터 DNA 단편을 회수하고 이를 다른 벡터 조립에 후속 사용하는데 이용될 수 있었다.

도 6 내지 9 및 11은 도 2b에 따르는 구체적 실시양태를 도시한 것이다. 선형 골격은 카나마이신 선별 유전자를 함유하는 골격 벡터의 EcoRV/XmnI 분해를 이용하여 ccdB 유전자를 고갈시키면서 수득한다 (도 9). 최소 13개의 뉴클레오티드 코작 서열을 코딩 서열의 5'에 삽입하면서, 이 동안에 코딩 서열의 3' 상에 6-프레임 정지 코돈을 가한다. 프로모터는 3' 연접부에 코작 서열을 함유하고, 플라스미드 연접부와 매치되는 최소 13개의 뉴클레오티드 서열 (5' 벡터 상동성)을 함유한다. 유사하게, 6-프레임 정지 코돈 서열을 3'UTR의 5' 말단에 삽입한다. 3'UTR의 3' 말단은 플라스미드의 또 다른 말단과 매치되는 15개의 뉴클레오티드 서열 (3' 벡터 상동성)을 함유한다. 이러한 단편은 유형 II 제한 부위가 양옆에 위치하고 있어 단편 서열 내에는 어떠한 부위도 존재하지 않는다. 유형 II 효소는 AcuI, BciVI, BmrI, BseRI, BsrDI, BtsI, MlyI 및 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다. 구체적으로 언급하면, 벡터 조립에 필요한 짧은 상동성을 함유하는 프로모터, CDS 및 3'UTR은 유형 II 제한 효소 MlyI가 양옆에 위치하고 있다. 이 플라스미드를 MlyI로 제한하고, 예상된 크기로 조립된 벡터를 수득한다. 이들 조립된 벡터는 각종 제한 효소로 분해한 다음, 당해 분야에 널리 공지된 방법을 이용하여 겔 전기영동함으로써 검증할 수 있다. 이들 모듈식 선형 단편을 적합한 DNA 재조합 시스템의 존재 하에 합함으로써, 전사 단위 내에 바람직하지 못한 어떠한 서열도 수반하지 않으면서 규정된 순서로 4개 단편을 함유하는 최종 벡터를 정확하게 조립할 수 있다. 이와 같이 조립된 벡터의 서열은 또한, DNA 서열분석에 의해 검증할 수 있다.

전술된 발명이 명료한 이해 목적으로 예시 및 예를 통하여 일부 상세히 기재되긴 하였지만, 첨부된 특허청구범위 내에서 특정의 변화 및 변형이 실시될 수 있다는 것은 명백할 것이다.

실시예 2

도 10a 및 10b는 프로모터 및 CDS가 그의 5' 말단에 3-프레임 정지 서열을 포함하는 코작 서열을 함유하는 또 다른 실시양태를 도시한 것이다. 선형 골격은 카나마이신 선별 유전자를 함유하는 골격 벡터의 EcoRV/XmnI 분해를 이용하여 ccdB 유전자를 고갈시키면서 수득한다 (예를 들어 도 9). 11개의 뉴클레오티드 3-프레임 정지 서열을, 코딩 서열 (Cry34Abl v2)의 5'에 삽입되는 10개 뉴클레오티드 코작 서열의 5' 말단에 가하면서, 이 동안에 6-프레임 정지 코돈 서열을 코딩 서열의 3' 상에 가한다.

프로모터 (ZmUbi1 v8)는 또한, 3' 연접부에 3-프레임 정지 서열을 포함하는 유사한 코작 서열을 함유하고, 플라스미드 연접부와 매치되는 최소 13개의 뉴클레오티드 서열 (5' 벡터 상동성)을 함유한다. 유사하게, 6-프레임 정지 코돈 서열을 3'UTR (StPinII 3'UTR)의 5' 말단에 삽입한다. 3'UTR의 3' 말단은 플라스미드의 또 다른 말단과 매치되는 15개의 뉴클레오티드 서열 (3' 벡터 상동성)을 함유한다. 이러한 단편은 유형 II 제한 부위가 양옆에 위치하고 있어 단편 서열 내에는 어떠한 부위도 존재하지 않는다. 유형 II 효소는, 예를 들어 AcuI, BciVI, BmrI, BseRI, BsrDI, BtsI, MlyI 및 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다. 이들 조립된 벡터는 각종 제한 효소로 분해함으로써 검증할 수 있고, 분해 후 단편 패턴은 당해 분야에 널리 공지된 바와 같은 겔 전기영동을 이용하여 관찰할 수 있다. 이와 같이 조립된 벡터의 서열은 또한, 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 DNA 서열분석에 의해 검증할 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Dow AgroSciences, LLC Kumar, Sandeep Evans, Steven L. Gupta, Manju L. <120> HIGH-THROUGHPUT DNA FRAGMENT ASSEMBLY <130> 72751 <160> 88 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kozak Sequence <400> 1 ccacacgaca ccatg 15 <210> 2 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kozak Sequence <400> 2 ccagaagaca ccatg 15 <210> 3 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kozak Sequence <400> 3 aaagagcccg ccatg 15 <210> 4 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kozak Sequence <400> 4 aaccgcccag ccatg 15 <210> 5 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kozak Sequence <400> 5 aacgagaccg agatg 15 <210> 6 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kozak Sequence <400> 6 aagagcccca agatg 15 <210> 7 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kozak Sequence <400> 7 acaagagcca ccatg 15 <210> 8 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kozak Sequence <400> 8 acaggaacca cgatg 15 <210> 9 <211> 15 <212> DNA 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<220> <223> Kozak Sequence <400> 36 ggccaaacca agatg 15 <210> 37 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kozak Sequence <400> 37 ggctagccca ccatg 15 <210> 38 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kozak Sequence <400> 38 gggcatccca cgatg 15 <210> 39 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kozak Sequence <400> 39 ggtgcaccag agatg 15 <210> 40 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kozak Sequence <400> 40 gtcagcgcaa agatg 15 <210> 41 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kozak Sequence <400> 41 tgcggcacaa ccatg 15 <210> 42 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kozak Sequence <400> 42 tgggacccaa cgatg 15 <210> 43 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kozak Sequence <400> 43 ccggggtcga ccatg 15 <210> 44 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3-Frame Stop <400> 44 taattaattg a 11 <210> 45 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 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Sequence <400> 64 ctgcaggtcg acatg 15 <210> 65 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kozak Sequence <400> 65 ctgcaggtcg acatg 15 <210> 66 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kozak Sequence <400> 66 aagtttgtag atctccatg 19 <210> 67 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kozak Sequence <400> 67 aaatgcgcag atccccatg 19 <210> 68 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kozak Sequence <400> 68 aaaaaatg 8 <210> 69 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kozak Sequence <400> 69 caaaaatg 8 <210> 70 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kozak Sequence <400> 70 aaaacatg 8 <210> 71 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kozak Sequence <400> 71 caaacatg 8 <210> 72 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kozak Sequence <400> 72 aacaaatg 8 <210> 73 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kozak Sequence <400> 73 aaacaatg 8 <210> 74 <211> 8 <212> 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82 ccaccatgg 9 <210> 83 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kozak sequence <400> 83 ccaccatg 8 <210> 84 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kozak sequence <400> 84 ccaccatgg 9 <210> 85 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 6-Frame stop sequence <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is a, c, g, or t <400> 85 ctaactaatn ag 12 <210> 86 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 6-Frame stop sequence <400> 86 ctagactagt ctag 14 <210> 87 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 6-Frame stop sequence <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is a, c, g, or t <400> 87 ctaactaatn ag 12 <210> 88 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 6-Frame stop sequence <400> 88 ctagactagt ctag 14

Claims

(a) 코작(Kozak) 서열을 포함하는 제1 DNA 분자를 제공하는 단계;
(b) 한쪽 말단에 코작 서열을 포함하고 다른쪽 말단에 6-프레임 정지 서열을 포함하는 제2 DNA 분자를 제공하는 단계;
(c) 6-프레임 정지 서열을 포함하는 제3 DNA 분자를 제공하는 단계;
(d) 선형 벡터 서열을 포함하는 제4 DNA 분자를 제공하는 단계; 및
(e) 하나 이상의 레콤비나제의 존재 하에 단계 (a), (b), (c) 및 (d)의 DNA 단편을 이용하여 생성물 벡터를 조립하는 단계
를 포함하는, DNA 단편 조립 방법.
제1항에 있어서, DNA 단편이 PCR 증폭 또는 직접 DNA 합성을 이용하여 수득되는 것인 방법.
(a) 제1 DNA 분자를 하나 이상의 유형 II 제한 효소로 분해시키며, 여기서 제1 DNA 분자의 분해 생성물은 코작 서열을 포함하는 것인 단계;
(b) 제2 DNA 분자를 하나 이상의 유형 II 제한 효소로 분해시키며, 여기서 제2 DNA 분자의 분해 생성물은 한쪽 말단에 코작 서열을 포함하고 다른쪽 말단에 6-프레임 정지 서열을 포함하는 것인 단계;
(c) 제3 DNA 분자를 하나 이상의 유형 II 제한 효소로 분해시키며, 여기서 제3 DNA 분자의 분해 생성물은 6-프레임 정지 서열을 포함하는 것인 단계;
(d) 제4 DNA 분자를 하나 이상의 유형 II 제한 효소로 분해시키며, 여기서 제4 DNA 분자의 분해 생성물은 벡터 서열을 포함하는 것인 단계; 및
(e) 하나 이상의 레콤비나제의 존재 하에 단계 (a), (b), (c) 및 (d)의 분해 생성물을 이용하여 생성물 벡터를 조립하는 단계
를 포함하는, DNA 단편 조립 방법.
제1항에 있어서, 단계 (a), (b), (c) 및 (d)의 분해 생성물을, 3' → 5' 엑소뉴클레아제 활성을 지닌 효소로 처리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제1항에 있어서, DNA 증폭 기술이 사용되지 않는 것인 방법.
제1항에 있어서, 폴리머라제 연쇄 반응이 사용되지 않는 것인 방법.
제1항에 있어서, 유형 II 제한 효소가 AcuI, BciVI, BmrI, BseRI, BsrDI, BtsI, MlyI 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 제4 DNA 분자가 치사 유전자를 포함하는 것인 방법.
제8항에 있어서, 치사 유전자가 ccdB인 방법.
제1항에 있어서, 코작 서열이 그의 5' 말단에 3-프레임 정지 서열을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 코작 서열이 서열 1-43, 64-74 및 이들의 보체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제10항에 있어서, 3-프레임 정지 서열이 서열 44-62 및 이들의 보체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 6-프레임 정지 서열이 서열 75-80 및 이들의 보체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 레콤비나제가 Int, Cre, Flp, IHF, Xis, γδ, Tn3 레솔바제(resolvase), Hin, Gin, Cin, Fis, TndX, XerC, XerD 및 Res로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 제4 DNA 분자의 분해 생성물이 선별 마커를 포함하고, 이러한 선별 마커가 카나마이신 및 암피실린 내성 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
(a) 하나 이상의 유형 II 제한 효소를 이용하여 제1 DNA 분자로부터 분해되며, 코작 서열을 포함하는 DNA 단편 1;
(b) 하나 이상의 유형 II 제한 효소를 이용하여 제2 DNA 분자로부터 분해되며, 한쪽 말단에 코작 서열을 포함하고 다른쪽 말단에 6-프레임 정지 서열을 포함하는 DNA 단편 2;
(c) 하나 이상의 유형 II 제한 효소를 이용하여 제3 DNA 분자로부터 분해되며, 6-프레임 정지 서열을 포함하는 DNA 단편 3;
(d) 하나 이상의 유형 II 제한 효소를 이용하여 제4 DNA 분자로부터 분해되며, 벡터 서열을 포함하는 DNA 단편 4; 및
(e) DNA 단편 1, 2, 3 및 4를 이용하여 생성물 벡터를 조립하기 위한 하나 이상의 레콤비나제
를 포함하는, DNA 단편 조립 시스템.
제16항에 있어서, 3' → 5' 엑소뉴클레아제 활성을 지닌 효소를 추가로 포함하는 시스템.
제16항에 있어서, 유형 II 제한 효소가 AcuI, BciVI, BmrI, BseRI, BsrDI, BtsI, MlyI 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 시스템.
제16항에 있어서, 레콤비나제가 Int, Cre, Flp, IHF, Xis, γδ, Tn3 레솔바제, Hin, Gin, Cin, Fis, TndX, XerC, XerD 및 Res로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 시스템.
제16항에 있어서, DNA 단편 4가 선별 마커를 포함하고, 이러한 선별 마커가 카나마이신 및 암피실린 내성 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 시스템.