CN104619847A - 高通量dna片段组装 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于转基因植物的载体组装的方法和系统。使用统一的模块化过程以减少周期时间(cycle time)，并且本文提供的方法和系统能够使用多孔板，例如96-孔板，增加克隆通量。在一些实施方案中，本文提供的方法和系统可避免或者减少对测序验证的需要，因为在载体组装过程中不涉及PCR。

Description

高通量DNA片段组装
发明领域
本发明一般地涉及分子生物学领域，更具体地，涉及DNA片段组装用以构建用于转基因植物的载体的领域。
发明背景
已开发了多种方法用于将转基因引入到植物体内来研究基因功能。一般地，这些用于产生转基因植物的系统具有一些共同的特征：(1)基因递送系统，(2)选择系统，用以区分被转化的细胞或植物与未被转化的细胞或植物，和(3)再生程序，用以产生整株植物(往往也是能育的)。在所有已使用的系统中，土壤杆菌介导的基因转移和粒子轰击(在组织培养中)近年来已被普遍用于产生转基因植物。
传统上，使用限制酶和连接酶来克隆用于转基因植物的载体不仅耗时而且费力，这部分地是由于不同的植物需要特定的顺式和/或反式元件，不同的植物部分/组织往往也是如此。聚合酶链式反应(PCR)被广泛用于克隆。然而，由于PCR易于出错的性质，使用PCR产生的载体需要测序验证。最近，开发了位点特异性重组酶和转座酶用于常规克隆。然而，它们在用于转基因植物的载体组装方面的应用差强人意。
因此，仍然需要提供一种用于转基因植物的高通量的载体组装方法。
发明概要
本发明涉及用于组装DNA片段以构建供转基因植物用的载体的方法和系统。使用一种统一、模块化、定向且精确的载体组装过程以减少周期时间，本文提供的方法和系统能够使用多孔板，例如96-孔板，增加克隆通量。在一些实施方案中，因为在载体组装过程中不涉及PCR，所以本文提供的方法和系统避免或者减少了对测序验证的需要。
在一个方面中，提供了一种定向DNA片段组装(directional DNA fragmentassembly)方法。该方法包括：(a)PCR扩增、合成或用至少一种II型限制酶消化质粒以获得第一DNA分子，其中该第一DNA分子包含Kozak序列；
(b)PCR扩增、合成或用至少一种II型限制酶消化质粒以获得第二DNA分子，其中该第二DNA分子在一端包含Kozak序列，在另一端包含六框(sixframe)终止序列；
(c)PCR扩增、合成或用至少一种II型限制酶消化质粒以获得第三DNA分子，其中该第三DNA分子包含六框终止序列；
(d)PCR扩增、合成或用至少一种II型限制酶消化质粒以获得第四DNA分子，其中该第四DNA分子包含载体序列；和
(e)在至少一种重组酶的存在下，用步骤(a)、(b)、(c)和(d)的消化产物组装产物载体。
在另一个方面中，提供了一种用于精确且定向的DNA片段组装的方法。该方法包括：
(a)PCR扩增、合成或用至少一种II型限制酶消化质粒以产生DNA片段1，其中该DNA片段1的侧翼是5'载体同源序列和Kozak序列；
(b)PCR扩增、合成或用至少一种II型限制酶消化质粒以产生DNA片段2，其中该DNA片段2的侧翼是Kozak序列和六框终止序列；
(c)PCR扩增、合成或用至少一种II型限制酶消化质粒以产生DNA片段3，其中该DNA片段3的侧翼是六框终止序列和3'载体同源序列；
(d)PCR扩增、合成或用至少一种II型限制酶消化质粒以产生DNA片段4，其中该DNA片段4的侧翼是3'载体同源序列和5'载体同源序列；和
(e)在至少一种重组酶的存在下，使用DNA片段1、2、3和4组装产物载体。
在所提供的方法的一个实施方案中，该方法进一步包括用具有3'-5'外切核酸酶活性的酶处理步骤(a)、(b)、(c)和(d)的消化产物。在另一个实施方案中，不使用DNA扩增技术。在进一步的实施方案中，不使用聚合酶链式反应。
在另一个实施方案中，所述II型限制酶选自下组：AcuI、BciVI、BmrI、BseRI、BsrDI、BtsI、MlyI，及其组合。在另一个实施方案中，第四DNA分子包含致死基因。在进一步的实施方案中，致死基因是ccdB。在另一个实施方案中，Kozak序列与SEQ ID NOS 1-43、64-74或其互补物具有至少80％,85％,90％,95％,或100％同一性。在进一步的实施方案中，Kozak序列选自下组：SEQ ID NOS 1-43、64-74、及其互补物。在另一个实施方案中，Kozak序列的5'端包含三框终止序列。在进一步的实施方案中，三框终止序列选自下组：SEQ ID NOS 44-62及其互补物。在另一个实施方案中，六框终止序列与SEQ ID NOS 75-80或其互补物具有至少80％,85％,90％,95％,或100％同一性。在进一步的实施方案中，六框终止序列选自下组：SEQ ID NOS 75-80及其互补物。
在另一个实施方案中，重组酶选自下组：Int,Cre,Flp,IHF,Xis,γδ,Tn3解离酶(resolvase),Hin,Gin,Cin,Fis,TndX,XerC,XerD,和Res。在另一个实施方案中，重组酶不是位点特异性重组酶。在另一个实施方案中，重组酶不包含由噬菌体编码的蛋白质。在一个进一步的实施方案中，噬菌体选自下组：λ,phi80,P22,P2,186,P4,和P1。在另一个实施方案中，第四DNA分子的消化产物包含可选择标记。在进一步的实施方案中，可选择标记包括抗生素抗性基因。在进一步或备选的实施方案中，可选择标记选自卡那霉素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因。在另一个实施方案中，步骤(a)-(e)在体外实施。在另一个实施方案中，所组装的产物载体适用于转基因植物。在进一步的或备选的实施方案中，所组装的产物载体适用于土壤杆菌介导的转化的二元载体。在另一个实施方案中，所组装的产物载体不包含选自下组的重组位点：lox位点,psi位点,dif位点,cer位点,frt位点,att位点，及其组合。
在另一个方面中，提供了一种用于组装DNA片段以构建载体的系统。该系统包括：
(a)从第一DNA分子用至少一种II型限制酶消化产生的DNA片段1，其中该DNA片段1包含Kozak序列；
(b)从第二DNA分子用至少一种II型限制酶消化产生的DNA片段2，其中该DNA片段2在一端包含Kozak序列，在另一端包含六框终止序列；
(c)从第三DNA分子用至少一种II型限制酶消化产生的DNA片段3，其中该DNA片段3包含六框终止序列；
(d)从第四DNA分子用至少一种II型限制酶消化产生的DNA片段4，其中该DNA片段4包含载体序列；和
(e)至少一种重组酶，用以利用DNA片段1、2、3和4组装产物载体。
在另一个方面中，提供了一种用于载体组装的系统。该系统包括：
(a)从第一DNA分子用至少一种II型限制酶消化产生的DNA片段1，其中该DNA片段1的侧翼是5'载体同源序列和Kozak序列；
(b)从第二DNA分子用至少一种II型限制酶消化产生的DNA片段2，其中该DNA片段2的侧翼是Kozak序列和六框终止序列；
(c)从第三DNA分子用至少一种II型限制酶消化产生的DNA片段3，其中该DNA片段3的侧翼是六框终止序列和3'载体同源序列；
(d)从第四DNA分子用至少一种II型限制酶消化产生的DNA片段4，其中该DNA片段4的侧翼是3'载体同源序列和5'载体同源序列；和
(e)至少一种重组酶，用以使用DNA片段1、2、3和4组装产物载体。
在所提供的系统的一个实施方案中，该系统还包括具有3'-5'核酸外切酶活性的酶。在另一个实施方案中，不使用DNA扩增技术。在进一步的实施方案中，不使用聚合酶链式反应。
在一个实施方案中，II型限制酶选自下组：Acul,BciVI,Bmrl,BseRI,BsrDI,Btsl,Mlyl，及其组合。在另一个实施方案中，Kozak序列与CCACCATG、CCACCATGG、或其互补物具有至少80％,85％,90％,95％,或100％同一性。在进一步的实施方案中，Kozak序列选自下组：CCACCATG、CCACCATGG、或其互补物。在另一个实施方案中，六框终止序列与CTAACTAATNAG,CTAGACTAGTCTAG或其互补物具有至少80％,85％,90％,95％,或100％同一性。在进一步的实施方案中，六框终止序列选自下组：CTAACTAATNAG,CTAGACTAGTCTAG,及其互补物。
在一个实施方案中，重组酶选自下组：Int,Cre,Flp,IHF,Xis,γδ,Tn3解离酶,Hin,Gin,Cin,Fis,TndX,XerC,XerD,和Res。在另一个实施方案中，重组酶不是位点特异性重组酶。在另一个实施方案中，重组酶不包含由噬菌体编码的蛋白质。在进一步的实施方案中，噬菌体选自下组：λ,phi80,P22,P2,186,P4,和P1。在另一个实施方案中，DNA片段4包括可选择标记。在进一步的实施方案中，可选择标记包括抗生素抗性基因。在进一步或备选的实施方案中，可选择标记选自下组：卡那霉素和氨苄青霉素抗性基因。在另一个实施方案中，所组装的产物载体用于转基因植物。在进一步的或备选的实施方案中，所组装的产物载体是用于土壤杆菌介导的转化的二元载体。在另一个实施方案中，所组装的产物载体不包含选自下组的重组位点：lox位点,psi位点,dif位点,cer位点,frt位点,att位点，及其组合。
附图简述
图1显示了使用多克隆位点(MCS；通路1)的传统克隆和本文提供的高通量载体组装(通路2)之间的比较。
图2A显示了本文提供的方法和系统的示例性实施方案。Kozak序列在第一个和第二个片段中均存在，六框终止序列在第二个和第三个片段中均存在。片段可以用各种方法获得，包括PCR产生的片段。
图2B显示了本文提供的方法和系统的另一个示例性实施方案，其中片段用II型限制酶从不同质粒产生。Kozak序列在第一个和第二个片段中均存在，六框终止序列在第二个和第三个片段中均存在。片段不是用PCR产生的。
图3显示了示例性Kozak序列的列表(SEQ ID NOS:1-43)。
图4显示了示例性三框终止序列的列表(SEQ ID NOS 44-62)，其能够与Kozak序列连接。SEQ ID NO:63显示了一个示例性Kozak+三框终止序列。
图5A显示了示例性双子叶植物Kozak序列的列表。图5B显示了示例性六框终止序列的列表(SEQ ID NO:75-80)。
图6显示了从第一DNA分子(启动子载体)消化得到的示例性片段1(启动子片段)。片段1在其3'端包含Kozak序列。
图7显示了从第二DNA分子(CDS载体)消化得到的示例性片段2(编码序列片段)。片段2在其5'端包含Kozak序列，在其3'端包含六框终止序列。
图8显示了从第三DNA分子(3'UTR载体)消化得到的示例性片段3(3'UTR片段)。片段3在其5'端包含六框终止序列。
图9显示了从第四DNA分子(骨架载体)消化得到的示例性片段4(3'UTR片段)。
图10A和10B显示了使用本文提供的方法和/或系统的另一个示例性载体组装。启动子和CDS片段包含在其5'端含有三框终止序列的Kozak序列。该四个片段在一步中被组装成表达载体。
图11显示了使用本文提供的方法和/或系统的示例性载体组装。该四个片段在一步中被组装成表达载体。
发明详细说明
转基因植物的产生对许多植物物种而言已经成为常规操作，但是现有的方法学是劳动密集的。因此，本公开文本的方法和系统的目的是提供一种以一致的和/或精简的方式适合于进行高通量应用的载体组装方法。
在常规的基因克隆中，先要根据靶基因的序列鉴定合适的限制酶后方能将其插入到载体质粒中。通常用相同的限制酶切割载体DNA和基因插入物，然后用DNA连接酶将它们连接在一起。这个过程需要对DNA片段进行人工操作，这会插入非期望的多克隆位点序列，更具体地说，在启动子和编码序列之间插入非期望的多克隆位点序列，可能会影响基因表达。此外，有时编码序列或遗传元件所含的内部限制位点也会被选定的酶所识别，需要在克隆之前对它们进行修饰。因此，需要更加高效且有效的载体组装过程，以适合高通量克隆/应用。
本文提供了用于载体组装的方法和系统，它们使用特定的序列接合点，这些接合点在用于给定生物体的所有载体之间是统一的。与先前已知的克隆方法不同，这里提供的方法和系统的设计方案有可能进行高通量克隆/应用。例如，编码序列5'和3'端的Kozak/共有序列(Kozak M.,1991)和终止密码子(在一个或多个读框中)、以及位于它们的相邻DNA片段两端的相同序列，能够用于转基因植物的载体设计。这些序列不仅为稳定的基因表达提供关键的生物学功能，还充当使用DNA重组技术进行线性DNA片段组装所需的关键序列同源物。
提供了一种将DNA片段组装成为功能转录单元且没有任何不期望的间插序列的快速的、高通量(HTP)的过程。该处理采用编码区5'和3'接合点上的独特生物体特异性小序列。利用这些独特的接合点微同源性沿着所需方向组装启动子、编码序列和3'UTR。可以将独特的Kozak/共有序列插入到5'接合点，而将六框终止密码子添加在编码序列的3'。启动子3'上插入的Kozak/共有序列和3'UTR 5'上添加的六框终止密码子，为使用DNA重组技术制造HTP载体提供了所需的接合点同源性。
在一些实施方案中，提供了使用II型限制酶从本文提供的用于载体组装的质粒提取DNA片段。该发明使用可以产生平末端或短的3'突出端(overhang)的II型限制酶(见表1)。无缝克隆或类似酶的3'-5'核酸外切酶活性使片段在克隆处理中变平。本发明还描述了在用于骨架提取的载体中使用致死基因，例如ccdB。此外，在与用于提取片段供无缝组装的载体不同的骨架上使用可选择标记。骨架载体上的阴性选择标记可以避免背景克隆受可能的未被切割的骨架载体的影响，同时片段载体上的不同选择标记可以防止未被切割的片段载体污染的背景。
使用II型限制酶直接从质粒提取克隆相容性DNA片段省略了PCR扩增的需要。DNA片段可以组装成期望的产物载体，其两端的侧翼是II型限制酶位点，使得质粒限制酶切后释放出小的3'突出端或平末端片段。提供了用于提取和构建相容性片段文库的平台，使得该技术模块化、高通量并且自动化。在一些实施方案中，提供了阴性选择标记在供体载体/质粒中的应用，而产物载体的载体骨架可以包括阳性选择标记。这些实施方案防止了可能的未被切割的载体影响背景，使所提供的方法和系统在某些条件下更加高效。
如本文所使用的，短语“载体”是指一段DNA，通常是双链的，其中可插入一段外来DNA。载体可以是例如质粒或病毒来源的，其通常编码可选择的或可筛选的标记或转基因。载体用于将外来或异源DNA转运到合适的宿主细胞中。一旦在宿主细胞内，载体便可以独立复制或者与宿主染色体DNA同时复制。或者，载体能够导向外来或异源DNA插入到宿主染色体中。
如本文所使用的，短语“转基因载体”是指含有DNA插入区段，即在宿主细胞内被转录成mRNA或作为RNA复制的“转基因”，的载体。短语“转基因”不仅指所插入DNA的被转换成RNA的部分，还指载体中为RNA转录和复制所必需的部分。转基因通常包括感兴趣的基因，但不必一定包含含有能够产生蛋白质的开放阅读框的多核苷酸序列。
如本文所使用的，短语“转化的”或“转化”是指将DNA引入到细胞内。短语“转化体”或“转基因的”是指被转化的或经历了转化程序的植物细胞、植物等。所引入的DNA的形式通常是含有所插入DNA片段的载体。
如本文所使用的，短语“可选择标记”或“可选择标记基因”是指这样的基因，其在植物转化中任选地使用，用来例如保护植物细胞免于选择试剂的伤害或提供对选择试剂的抗性/耐受性。只有接受了功能性可选择标记的细胞或植物才能够在具有选择试剂的条件下分裂或生长。选择试剂的实例可包括，例如，抗生素，包括大观霉素、新霉素、卡那霉素、巴龙霉素、庆大霉素，和潮霉素。这些可选择标记包括新霉素磷酸转移酶基因(npt II)，其表达一种赋予对抗生素卡那霉素抗性的酶，和相关抗生素新霉素、巴龙霉素、庆大霉素和G418的基因，或潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)，其表达一种赋予对潮霉素抗性的酶。其他的可选择标记基因可包括编码除草剂抗性的基因，包括Bar(抗(草铵膦)或膦丝菌素(PPT))，乙酰乳酸合成酶(ALS，抗抑制剂如磺酰脲(SUs)、咪唑啉酮(IMIs)、三唑并嘧啶(triazolopyrimidines(TPs))、嘧啶氧代苯甲酸(pyrimidinyl oxybenzoates(POBs))、和磺酰氨基羰基三唑啉酮，其阻止支链氨基酸合成的第一步)，草甘膦，2,4-D，和金属抗性或敏感性。短语“标记阳性”是指已经过转化从而包含可选择标记基因的植物。
在所选表达载体中可以组入各种可选择或可检测标记，以允许鉴定和选择被转化的植物或转化体。许多方法可供用于验证选择标记在被转化植物内的表达，包括例如DNA测序和PCR(聚合酶链式反应)、Southern印迹、RNA印迹、用于检测从载体表达的蛋白的免疫学方法，例如介导草铵膦抗性的沉淀的蛋白或者其他蛋白，例如报告基因β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、DsRed、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、碱性磷酸酶等(见Sambrook等Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ThirdEdition,Cold Spring Harbor Press,N.Y.,2001，本文引用其全部内容作为参考)。
使用可选择标记选择被转化的细胞或组织。可选择标记基因包括编码抗生素抗性的基因，例如编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的基因，以及赋予对除草剂化合物抗性的基因。除草剂抗性基因一般编码对除草剂不敏感的被修饰的靶蛋白，或者编码可以在除草剂在植物体内发挥作用之前将其降解或脱毒的酶。见DeBlock et al.(1987)EMBO J.,6:2513-2518；DeBlock et al.(1989)Plant Physiol.,91:691-704；Fromm et al.(1990)8:833-839；Gordon-Kamm et al.(1990)2:603-618)。例如，已经使用编码突变体靶酶，5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)和乙酰乳酸合酶(ALS)，获得了对草甘膦或磺酰脲除草剂的抗性。对草铵膦、溴苯腈和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的抗性可以通过使用编码膦丝菌素乙酰转移酶、腈水解酶或2,4-二氯苯氧乙酸单氧化酶(它们分别对这些除草剂脱毒)的细菌基因来获得。2,4-D抗性的酶/基因先前已经在US 2009/0093366和WO 2007/053482中被公开，本文引用其全部内容作为参考。
其他除草剂能够抑制生长点或分生组织，包括咪唑啉酮或磺酰脲。这个类别中的示例基因编码突变的ALS和AHAS酶，如分别由例如Lee等，EMBOJ.7:1241(1988)和Miki等,Theor.Appl.Genet.80:449(1990)所描述的。
草甘膦抗性基因包括：突变体5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因(通过导入重组核酸和/或天然EPSP基因的各种体内诱变的形式)、aroA基因和草甘膦乙酰转移酶(GAT)基因。对其他膦酰基化合物的抗性基因包括草胺膦(来自链霉菌属物种(Streptomyces species),包括吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)和绿色产色链霉菌(Streptomycesviridichromogenes)的草胺膦乙酰基转移酶(PAT)基因)、和吡啶氧或苯氧基丙酸和环己酮(ACC酶抑制剂编码基因)，见例如授予Shah等的美国专利4,940,835和授予Barry等的美国专利6,248,876，它们公开了可以对植物赋予草甘膦抗性的EPSP形式的核苷酸序列。编码突变体aroA基因的DNA分子可以以ATCC保藏号39256获得，并且该突变体基因的核苷酸序列在授予Comai的美国专利No.4,769,061中公开。授予Kumada等的欧洲专利申请No.0333033和授予Goodman等的美国专利No.4,975,374公开了对除草剂诸如L-膦丝菌素赋予抗性的谷氨酰胺合成酶基因的核苷酸序列。PAT基因的核苷酸序列可以参见授予Leemans等的欧洲申请No.0242246。另外，DeGreef等，Bio/Technology 7:61(1989)描述了生成表达编码PAT活性的嵌合bar基因的转基因植物。赋予对苯氧基丙酸和环己酮，包括稀禾定(sethoxydim)和吡氟氯禾灵(haloxyfop)的抗性的基因的例子包括Marshall et al,Theon.Appl.Genet.83:435(1992)描述的Accl-S1、Acc1-S2和Acc1-S3基因。能够赋予草甘膦抗性的GAT基因记载于授予Castle等的WO 2005012515。赋予对2,4-D、苯氧基丙酸和吡啶基氧基生长素除草剂的抗性的基因在WO2005107437和美国专利申请系列No.11/587,893中有描述。
其他除草剂能够抑制光合作用，包括三嗪(psbA和ls+基因)或苯基氰(腈水解酶基因)。Przibila等，Plant Cell 3:169(1991)描述了用编码突变体psbA基因的质粒转化衣滴虫(Chlamydomonas)。腈水解酶基因的核苷酸序列在授予Stalker的美国专利No.4,810,648中被公开，含有这些基因的DNA分子可以以ATCC保藏号53435、67441、和67442获得。Hayes等，Biochem.J.285:173(1992)描述了编码谷胱甘肽S-转移酶的DNA的克隆和表达。
为本发明的目的，可选择标记基因包括，但不仅限于，编码如下的基因：新霉素磷酸转移酶II(Fraley et al.(1986)CRC Critical Reviews in PlantScience,4:1-25)；氰胺水合酶(cyanamide hydratase)(Maier-Greiner et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:4250-4264)；天冬氨酸激酶；二氢吡啶二羧酸合酶(Perl et al.(1993)Bio/Technology,11:715-718)；色氨酸脱羧酶(Goddijn etal.(1993)Plant Mol.Bio.,22:907-912)；二氢吡啶二羧酸合酶和脱敏的天冬氨酸激酶(Perl et al.(1993)Bio/Technology,11:715-718)；bar基因(Toki et al.(1992)Plant Physiol.,100:1503-1507和Meagher et al.(1996)and Crop Sci.,36:1367)；色氨酸脱羧酶(Goddijn et al.(1993)Plant Mol.Biol.,22:907-912)；新霉素磷酸转移酶(NEO)(Southern et al.(1982)J.Mol.Appl.Gen.,1:327；潮霉素磷酸转移酶(HPT或HYG)(Shimizu et al.(1986)Mol.Cell Biol.,6:1074)；二氢叶酸还原酶(DHFR)(Kwok et al.(1986)PNAS USA 4552)；膦丝菌素乙酰转移酶(DeBlock et al.(1987)EMBO J.,6:2513)；2,2-二氯丙酸脱卤素酶(Buchanan-Wollatron et al.(1989)J.Cell.Biochem.13D:330)；乙酰羟酸合酶(Anderson et al,美国专利4,761,373；Haughn et al.(1988)Mol.Gen.Genet.221:266)；5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-磷酸合酶(aroA)(Comai et al.(1985)Nature317:741)；卤代芳基腈水解酶(haloarylnitrilase)(Stalker et al,已公开的PCT申请WO87/04181)；乙酰辅酶A羧化酶(Parker et al.(1990)Plant Physiol.92:1220)；二氢蝶酸合酶(sul I)(Guerineau et al.(1990)Plant Mol.Biol.15:127)；和32kD光系统II多肽(psbA)(Hirschberg et al.(1983)Science,222:1346)。
还包括编码对下述者的抗性的基因：氯霉素(Herrera-Estrella et al.(1983)EMBO J.,2:987-992)；甲氨蝶呤(Herrera-Estrella et al.(1983)Nature,303:209-213；Meijer et al.(1991)Plant Mol Bio.,16:807-820(1991)；潮霉素(Waldron et al.(1985)Plant Mol.Biol.,5:103-108；Zhijian et al.(1995)PlantScience,108:219-227和Meijer et al.(1991)Plant Mol.Bio.16:807-820)；链霉素(Jones et al.(1987)Mol.Gen.Genet.,210:86-91)；大观霉素(Bretagne-Sagnard et al.(1996)Transgenic Res.,5:131-137)；博来霉素(Hille etal.(1986)Plant Mol.Biol.,7:171-176)；磺胺(Guerineau et al.(1990)Plant Mol.Bio.,15:127-136)；溴苯腈(Stalker et al.(1988)Science,242:419-423)；2,4-D(Streber et al.(1989)Bio/Technology,7:811-816)；草甘膦(Shaw et al.(1986)Science,233:478-481)；和膦丝菌素(DeBlock et al.(1987)EMBO J.,6:2513-2518)。除非另外指出，否则本文引用所有这些参考文献的全部内容作为参考。
上面列举的可选择标记和报告基因没有限制意义。本发明可以包含任何报告或可选择标记基因。如果有必要，这些基因可以通过本领域已知的方法进行测序。
报告基因和可选择标记基因以在植物体内表达最优的方式合成。也就是说，基因的编码序列经过修饰从而提高在植物体内的表达。设计合成的标记基因使其以更高水平在植物体内表达，导致更高的转化效率。合成最优化基因的方法可以技术上获得。实际上，已经有多个基因被最优化，从而增加基因产物在植物内的表达。
标记基因可以为了在特定植物物种中的表达最优化，或者，可以为了在植物家族中的最优表达而被修饰。植物的优选密码子可以根据特定的感兴趣植物物种中最大量表达的蛋白质的频率最高的密码子加以确定。参见，例如，EPA 0359472；EPA 0385962；WO 91/16432；Perlak et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:3324-3328；和Murray et al.(1989)Nucleic Acids Research,17:477-498；美国专利5,380,831；和美国专利No.5,436,391，本文引用其内容作为参考。通过这种方式，可以为了在任何植物体内表达而核苷酸序列进行最优化。可以认识到，全部基因序列或其任何部分均可是经优化或合成的。也就是说，可以使用完全最优化的或部分最优化的序列。
此外，已经开发出了多种使用土壤杆菌介导的转化系统的转化策略。例如，二元载体策略是基于二质粒系统，其中T-DNA位于和其余Ti质粒不同的质粒中。在共整合策略中，T-DNA的一小部分位于和外来基因相同的载体上，该载体随后与Ti质粒重组。
如本文所使用的，词语“植物”包括双子叶植物和单子叶植物。双子叶植物的实例包括烟草，拟南芥，大豆，番茄，木瓜，加拿大油菜(canola)，向日葵，棉花，苜蓿，马铃薯，葡萄，木豆(pigeon pea)，豌豆，芸苔(Brassica)，鹰嘴豆，甜菜，油菜籽，西瓜，甜瓜，辣椒，花生，南瓜(pumpkin)，萝卜，菠菜，倭瓜(squash)，西兰花，卷心菜，胡萝卜，花椰菜，芹菜，大白菜，黄瓜，茄子，和莴苣。单子叶植物的实例包括玉米、水稻、小麦、甘蔗、大麦、黑麦、高粱、兰花、竹子、香蕉、香蒲、百合、燕麦、洋葱、粟，和黑小麦。
如本文所使用的，词语“宿主”是指任何能够成为重组克隆产物受体的原核或真核生物。因此，“宿主”包括能够被遗传工程改造的原核和真核生物。这些宿主的实例见Maniatis et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1982)。
如本文所使用的，词语“插入”或“插入物”是指可以通过已知的分子生物学方法操作的期望核酸片段或核酸片段群体。因此，术语插入物的含义包括某个核酸(优选地DNA)片段或片段群体。这些插入物可以包括一个或多个基因/元件。
如本文所使用的，词语“插入物供体”是指携带该插入物的两个亲本核酸分子(例如RNA或DNA)的其中一个。插入物供体分子包括插入物及插入物两侧的特定位点。插入物供体可为线性的或环形的。在本发明的一个实施方案中，插入物供体是环形DNA分子，并且还包括克隆载体序列。当使用插入物的群体或核酸区段的群体制造插入物供体时，可以产生插入物供体的群体，其可以根据本文提供的方法和/或系统加以使用。
如本文所使用的，词语“产物”或“产物载体”是指经过本文所述的载体组装过程后产生的期望的后代分子(daughter molecule)。产物含有要克隆或要亚克隆的核酸。根据本发明，当使用插入物供体的群体时，所得的产物分子群将含有插入物供体的插入物的群体的全部或一部分，并且优选地含有插入物供体的原始分子的代表性群体。
如本文所使用的，词语“启动子”是指一般被描述为基因5'-区的DNA序列，位于起始密码子附近。近邻的DNA片段的转录在启动子区起始。可阻遏型启动子的转录速度响应阻遏剂而降低。可诱导型启动子的转录速度响应诱导剂而增加。组成型启动子的转录速度不受特殊调节，尽管它在一般遗传代谢条件的影响下会有差异。
如本文所使用的，词语“位点特异性重组酶”是指一类重组酶，其通常具有至少如下的4种活性(或其组合)：(1)识别一个或两个特定的核酸序列；(2)剪切所述序列或多个序列；(3)参与链交换的拓扑异构酶活性；和(4)连接酶活性，以重新缝合被剪切的核酸链。见Sauer,B.,Current Opinions inBiotechnology 5:521-527(1994)。保守位点特异性重组与同源重组和转座的差异在于参与双方均是高度特异的。链交换机制涉及在没有DNA合成的情况下剪切和重新连接特定的DNA序列。见Landy,A.(1989)Ann.Rev.Biochem.58:913-949。
如本文所使用的，词语“载体”是指为插入物提供有用的生物学或生物化学性质的核酸分子(优选地DNA)。实例包括质粒、噬菌体、自主复制序列(ARS)、着丝粒和其他能够在体外或在宿主细胞内复制或被复制，或者能够将期望核酸片段运输到宿主细胞内的期望位置的序列。载体可以具有一个或多个限制性内切酶识别位点，此类位点处的序列能够被以可确定的方式(determinable)切割，而不会丧失载体的关键生物学功能，并且核酸片段可以剪接到此类位点中，以便造成其复制和克隆。载体能够进一步提供引物位点，例如用于PCR，转录和/或翻译起始和/或调节位点，重组信号，复制子，可选择标记等。克隆载体可以进一步含有一个或多个适合用于鉴定被克隆载体转化的细胞的可选择标记。
提供了方法和系统，通过它们能够为DNA片段的微同源性(micro-homologies)增加模块性，从而能够混合和匹配多个DNA片段而无需每次均再合成DNA片段。提供相似的生物学功能的序列可以用作DNA重组的同源区。在一些实施方案中，利用启动子与编码序列相邻末端之间的Kozak共有序列同源性，和编码序列与3'UTR相邻末端之间的终止密码子(在多于1个框中)同源性来组装新的植物转录单元(PTU)。类似地，利用PTU两端的限制酶识别位点的微同源性将其同时组装到质粒中。提供的方法和系统能够定向地、精确地并且高通量地组装用于载体构建的PTU，其在功能上与转基因表达兼容。
提供的方法和系统可用于创建高通量、灵活、模块化DNA组装平台，允许进行载体组装/构建，而无需在载体中添加任何非期望的额外的序列。利用所提供的方法和系统，能够混合和匹配现有的模块DNA片段，来构建具有期望的遗传元件的载体。利用所提供的方法和系统还能够定向地、精确地和高通量地组装用于载体构建的PTU，其在功能上与转基因表达兼容。
实施例
实施例1-载体组装的模块化方法
图1例证了传统克隆方法(路径1)和本文提供的模块化方法(路径2)之间的差异。所提供的模块化方法涉及的步骤大大减少，并且适用于高通量规格。
提供了一种模块化且高效的载体构建方法，用于同时、精确并且定向组装DNA片段。图2A例证了所提供的示例组装过程。DNA片段可以是PCR扩增的、合成的、或者从现有质粒切下的。Kozak序列被插入在编码序列的5'端，而氨基酸终止密码子被添加在3'端。启动子片段(片段1)在3'端含有Kozak序列，在5'端有一个与载体接合点匹配的小序列。编码片段(片段2)在5'端含有Kozak序列，在3'端含有氨基酸终止密码子(在多于一个框中)序列。类似地，3'UTR片段(片段3)在3'UTR的5'端含有氨基酸终止密码子(在多于一个框中)序列，和另一个与另一载体接合点匹配的小序列。载体片段(片段4)具有两个不同的载体接合点序列，它们与片段1和3中的相应序列相同。在合适的DNA重组系统的存在下组合这些模块化线性片段，将会精确地组装出含有这四个片段、而在转录单元内没有任何非期望的序列的最终载体。
图2B进一步显示了另一个实施方案，其中DNA片段从前体质粒通过限制酶消化产生，其中载体组装不使用包含PCR的DNA扩增。
在一些实施方案中，匹配的质粒序列是限制酶(RE)识别位点，一旦转基因被插入到感兴趣的生物体中，便能够利用该位点进行下游分析，PTU或者整合。RE位点还能够用于从质粒回收DNA片段，以及其随后用于其它载体组装。
图6-9和11显示了根据图2B的具体实施方案。通过用EcoRV/XmnI消化含有卡那霉素选择基因的骨架载体，删除ccdB基因而获得线性骨架(图9)。将13个核苷酸的最小Kozak序列插入到编码序列的5'，而在编码序列的3'上添加六框终止密码子序列。启动子含有位于3'接合点的Kozak序列和与质粒接合点匹配的13个核苷酸的最小序列(5'载体同源性)。类似地，在3'UTR的5'端插入六框终止密码子序列。3'UTR的3'端含有与质粒的另一端匹配的15个核苷酸的序列(3'载体同源性)。各片段的侧翼是II型限制位点，在片段序列内不存在位点。II型酶可以选自：AcuI、BciVI、BmrI、BseRI、BsrDI、BtsI、MlyI，及其组合。具体地，在启动子、CDS以及含有载体组装所需的短同源性的3'UTR的侧翼有II型限制酶MlyI。质粒用MlyI限制性酶切，获得具有期望大小的组装载体。可以使用本领域众所周知的方法，通过各种限制酶消化后进行凝胶电泳来验证这些组装载体。在合适的DNA重组系统的存在下组合这些模块化线性片段能够精确地组装出最终的载体，其含有按限定次序排列的4个片段，且在转录单元中不含有任何非期望的序列。组装的载体的序列还可以通过DNA测序加以验证。
尽管出于清晰阐述的目的，已经通过举例说明的方式对前述发明进行了详细的描述，但是很显然，在附加权利要求的范围内可以进行某些改变和修饰。
实施例2
图10A和10B显示了另一个实施方案，其中启动子和CDS含有Kozak序列，Kozak序列在其5'端包含三框终止序列。通过用EcoRV/XmnI消化含有卡那霉素选择基因的骨架载体删除ccdB基因而获得线性骨架(例如图9)。11个核苷酸的三框终止序列被添加到10个核苷酸的Kozak序列的5'，该Kozak序列被插入在编码序列(Cry34Abl v2)的5'，而在编码序列的3'上添加六框终止密码子序列。
启动子(ZmUbil v8)也包含相似的Kozak序列，其含有位于3'接合点的三框终止序列和与质粒接合点匹配的13个核苷酸的最小序列(5'载体同源性)。类似地，在3'UTR的5'端插入六框终止密码子序列。3'UTR的3'端含有与质粒的另一端匹配的15个核苷酸的序列(3'载体同源性)。各片段的侧翼有II型限制位点，在片段序列内不存在位点。II型酶可以选自：AcuI、BciVI、BmrI、BseRI、BsrDI、BtsI、MlyI，及其组合。这些组装的载体能够通过各种限制酶消化，并在消化后使用凝胶电泳观察片段模式来加以验证，这是本领域众所周知的。组装好的载体的序列也可以使用本领域已知的方法通过DNA测序加以验证。

Claims (20)

1.一种用于DNA片段组装的方法，包括，
(a)提供包含Kozak序列的第一DNA分子；
(b)提供在一端包含Kozak序列且在另一端包含六框终止序列的第二DNA分子；
(c)提供包含六框终止序列的第三DNA分子；
(d)提供包含线性载体序列的第四DNA分子；和
(e)在至少一种重组酶的存在下，使用步骤(a),(b),(c),和(d)的DNA片段组装产物载体。
2.权利要求1的方法，其中DNA片段使用PCR扩增或直接DNA合成获得。
3.一种用于DNA片段组装的方法，包括，
(a)用至少一种II型限制酶消化第一DNA分子，其中该第一DNA分子的消化产物包含Kozak序列；
(b)用至少一种II型限制酶消化第二DNA分子，其中该第二DNA分子的消化产物在一端包含Kozak序列，在另一端包含六框终止序列；
(c)用至少一种II型限制酶消化第三DNA分子，其中该第三DNA分子的消化产物包含六框终止序列；
(d)用至少一种II型限制酶消化第四DNA分子，其中该第四DNA分子的消化产物包含载体序列；和
(e)在至少一种重组酶的存在下，使用步骤(a),(b),(c),和(d)的消化产物组装产物载体。
4.权利要求1的方法，还包括用具有3'-5'核酸外切酶活性的酶处理步骤(a),(b),(c),和(d)的消化产物。
5.权利要求1的方法，其中不使用DNA扩增技术。
6.权利要求1的方法，其中不使用聚合酶链式反应。
7.权利要求1的方法，其中所述II型限制酶选自下组：AcuI、BciVI、BmrI、BseRI、BsrDI、BtsI、MlyI，及其组合。
8.权利要求1的方法，其中所述第四DNA分子包含致死基因。
9.权利要求8的方法，其中所述致死基因是ccdB。
10.权利要求1的方法，其中所述Kozak序列在其5'端包含三框终止序列。
11.权利要求1的方法，其中所述Kozak序列选自下组：SEQ ID NO:1-43,64-74，及其互补物。
12.权利要求10的方法，其中所述三框终止序列选自下组：SEQ ID NO:44-62及其互补物。
13.权利要求1的方法，其中所述六框终止序列选自下组：SEQ ID NO:75-80及其互补物。
14.权利要求1的方法，其中重组酶选自下组：Int,Cre,Flp,IHF,Xis,γδ,Tn3解离酶,Hin,Gin,Cin,Fis,TndX,XerC,XerD,和Res。
15.权利要求1的方法，其中所述第四DNA分子的消化产物包含可选择标记，并且该可选择标记选自卡那霉素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因。
16.一种用于DNA片段组装的系统，包括，
(a)从第一DNA分子用至少一种II型限制酶消化产生的DNA片段1，其中该DNA片段1包含Kozak序列；
(b)从第二DNA分子用至少一种II型限制酶消化产生的DNA片段2，其中该DNA片段2在一端包含Kozak序列，在另一端包含六框终止序列；
(c)从第三DNA分子用至少一种II型限制酶消化产生的DNA片段3，其中该DNA片段3包含六框终止序列；
(d)从第四DNA分子用至少一种II型限制酶消化产生的DNA片段4，其中该DNA片段4包含载体序列；和
(e)至少一种重组酶，用以使用DNA片段1、2、3和4组装产物载体。
17.权利要求16的系统，还包括具有3'-5'核酸外切酶活性的酶。
18.权利要求16的系统，其中所述II型限制酶选自下组：AcuI、BciVI、BmrI、BseRI、BsrDI、BtsI、MlyI，及其组合。
19.权利要求16的系统，其中所述重组酶选自下组：Int,Cre,Flp,IHF,Xis,γδ,Tn3解离酶,Hin,Gin,Cin,Fis,TndX,XerC,XerD,和Res。
20.权利要求16的系统，其中该DNA片段4包含可选择标记，并且该可选择标记选自卡那霉素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106318961A (zh) * 2015-06-30 2017-01-11 未名生物农业集团有限公司 一种多dna片段载体的构建方法及其应用

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107002150B (zh) * 2015-01-09 2020-09-01 深圳华大基因研究院 一种dna合成产物的高通量检测方法

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4535060A (en) 1983-01-05 1985-08-13 Calgene, Inc. Inhibition resistant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthetase, production and use
US5380831A (en) 1986-04-04 1995-01-10 Mycogen Plant Science, Inc. Synthetic insecticidal crystal protein gene
US4761373A (en) 1984-03-06 1988-08-02 Molecular Genetics, Inc. Herbicide resistance in plants
US4940835A (en) 1985-10-29 1990-07-10 Monsanto Company Glyphosate-resistant plants
JPH0795952B2 (ja) 1986-01-08 1995-10-18 カルジ−ン・インコ−ポレイテツド ハロアリ−ルニトリル分解遺伝子、その使用および該遺伝子含有細胞
US4810648A (en) 1986-01-08 1989-03-07 Rhone Poulenc Agrochimie Haloarylnitrile degrading gene, its use, and cells containing the gene
DE3765449D1 (de) 1986-03-11 1990-11-15 Plant Genetic Systems Nv Durch gentechnologie erhaltene und gegen glutaminsynthetase-inhibitoren resistente pflanzenzellen.
US4975374A (en) 1986-03-18 1990-12-04 The General Hospital Corporation Expression of wild type and mutant glutamine synthetase in foreign hosts
EP0333033A1 (en) 1988-03-09 1989-09-20 Meiji Seika Kaisha Ltd. Glutamine synthesis gene and glutamine synthetase
JPH05506578A (ja) 1990-04-18 1993-09-30 プラント・ジエネテイツク・システムズ・エヌ・ベー 変性ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ殺虫性結晶タンパク質遺伝子及びそれらの植物細胞中での発現
US5633435A (en) 1990-08-31 1997-05-27 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases
TW261517B (zh) 1991-11-29 1995-11-01 Mitsubishi Shozi Kk
US7351578B2 (en) * 1999-12-10 2008-04-01 Invitrogen Corp. Use of multiple recombination sites with unique specificity in recombinational cloning
US8877916B2 (en) * 2000-04-26 2014-11-04 Ceres, Inc. Promoter, promoter control elements, and combinations, and uses thereof
EP2105496B1 (en) * 2000-12-08 2013-02-20 Life Technologies Corporation Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiple recognition sites
EP2535414B1 (en) 2003-04-29 2017-12-13 Pioneer Hi-Bred International Inc. Novel glyphosate-n-acetyltransferase (gat) genes
EP1635772A4 (en) * 2003-05-05 2008-02-13 Dow Agrosciences Llc STERILE IMMUNOPROPHYLACTIC AND THERAPEUTIC COMPOSITIONS DERIVED FROM TRANSGENIC VEGETABLE CELLS AND METHODS OF PRODUCTION THEREOF
NZ550602A (en) 2004-04-30 2009-11-27 Dow Agrosciences Llc Plants comprising herbicide resistance gene encoding aryloxyalkanoate dioxygenase
EP1947926B1 (en) 2005-10-28 2014-11-26 Dow AgroSciences LLC Novel herbicide resistance genes

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KARIMI ET AL: "GATEWAY vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation", 《TRENDS IN PLANT SCIENCE》 *
KARMI M ET AL: "Modular cloning in plant cells", 《TRENDS IN PLANT SCIENC》 *
SASKAI YUKARI ET AL: "Evidence for high specificity and efficiecy of multiple recombination signals in mixed DNA cloning by the Multisite Gateway system", 《JOURANL OF BIOTECHNOLOGY》 *
WALHOUT ET AL: "GATEWAY RECOMBINATIONAL CLONING:APPICATION TO THE CLONING OF LARGE NUMBERS OF OPEN READING FRAMES OR ORFEOMES", 《METHODS IN ENZYMOLOGY》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106318961A (zh) * 2015-06-30 2017-01-11 未名生物农业集团有限公司 一种多dna片段载体的构建方法及其应用

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