CN102333868A

CN102333868A - 靶向整合入Zp15 基因座

Info

Publication number: CN102333868A
Application number: CN2009801569267A
Authority: CN
Inventors: H.J.巴特勒; D.R.科宾; Y.多扬; Z.高; V.K.舒克拉; F.厄诺夫; S.E.沃登
Original assignee: Dow AgroSciences LLC; Sangamo Biosciences Inc
Current assignee: Sangamo Therapeutics Inc; Corteva Agriscience LLC
Priority date: 2008-12-17
Filing date: 2009-12-17
Publication date: 2012-01-25
Anticipated expiration: 2029-12-17
Also published as: JP2012511926A; PT2370575T; EP2370575A4; US8329986B2; SI2370575T1; JP6127297B2; DK2370575T3; CA2747124A1; ZA201104014B; AU2009333863B2; ES2654923T3; AR074783A1; AU2009333863A1; EP2370575B1; IL213557A0; EP2370575A1; HUE037911T2; KR101683928B1; US20100199389A1; WO2010077319A1

Abstract

本文中公开了用于将外源序列靶向整合入植物Zp15基因座的方法和组合物，例如，以供表达瞩目的多肽。

Description

靶向整合入Zp15 基因座

对在联邦资助研究下取得的发明的声明

不适用。

技术领域

本公开属于植物基因组工程领域，特别是将转基因靶向整合入植物Zp15基因的领域。

背景技术

生物技术已呈现为迎接全球对食物生产日益增长的挑战的基本工具。用于改善农业生产率的常规方法，例如增强的产量或工程改造的病虫害抗性，依赖于突变育种或通过转化将新颖基因导入作物物种的基因组。两种工艺均本质上不具特异性，并相对而言效率低下。举例而言，常规植物转化方法对外源DNA的递送使其在随机位置整合入基因组。因此，为了鉴定出并分离具有所需属性的转基因品系，必需生成数以千计的独特随机整合事件，然后就所需的个体进行筛选。其结果，常规植物性状工程是费力费时且无法预测的工作。此外，这些整合的随机特性使得不易预测是否发生了由于非意欲的基因组破坏所致的多效作用。其结果，具有工程改造的基因或性状的植物品系的生成、分离和表征是成功可能性低下的非常耗费劳力和成本的工艺。

靶向基因修饰克服了植物系统中的常规实践对后勤方面的挑战(logisticalchallenge)，并因此为基础植物生物学研究和农业生物技术中长久以来被渴望但未能实现的目标。然而，除了在稻中通过正负药物选择的“基因靶向”或预先工程改造的限制性位点的使用的例外，在所有植物物种包括模式植物和作物植物中的靶向基因组修饰直至最近证明是非常困难的。Terada等(2002)Nat Biotechnol 20(10)：1030；Terada等(2007)Plant Physiol 144(2)：846；D′Halluin等(2008)Plant Biotechnology J.6(1)：93。

近来，已描述了用于靶向剪切基因组DNA的方法和组合物。此类靶向剪切事件可用于例如诱导靶向诱变，诱导细胞DNA序列的靶向缺失，以及促进在预决的染色体位点的靶向重组。参见，例如美国专利公开20030232410；20050208489；20050026157；20050064474；和20060188987，以及国际专利公开WO 2007/014275，所述公开就所有的目的通过全文提述并入本文。美国专利公开号20080182332描述了使用经典的锌指核酸酶(ZFN)以供靶向修饰植物基因组，而美国专利申请号12/284,888描述了ZFN介导的靶向整合入植物EPSPS基因座。

然而，仍需要用于稳定的靶向整合入植物基因组内其他基因座以供在所述植物及其后代中确立稳定的、可遗传的遗传修饰的组合物和方法。

发明内容

本公开提供了用于在植物细胞中表达一种或多种已整合入Zp15基因的外源核酸序列的产物(即，蛋白质或RNA分子)的方法和组合物。如本文中所示，在Zp15基因座或其附近一种或多种外源序列的整合并不呈现对宿主植物再生、开花或产生种子的能力的损害，并任选地，允许外源序列跨世代的可遗传传递。所述外源核酸序列可包括，例如一种或多种基因或cDNA分子，或任何类型的编码或非编码序列，以及一种或多种调控元件(例如，启动子)。举例而言，可将可遗传的耐受基因整合入该基因座以产生具有所需除草剂抗性的作物植物。在Zp15基因座或其附近含有外源核酸的细胞还可参与(contribute to)配子体(种系)，并因此传递予后续世代中的后代。

外源核酸序列整合入Zp15基因由在所选Zp15基因座中基因组的靶向双链剪切所促进。通过使用包含DNA结合域如大范围核酸酶DNA结合域、亮氨酸拉链DNA结合域、锌指蛋白(ZFP)或经工程改造结合所选Zp15基因座之内的序列的前述的嵌合组合，并包含剪切域或剪切半域的融合蛋白，使剪切靶向Zp15基因。此种剪切刺激外源多核苷酸序列在剪切位点或其附近的整合。外源序列的整合可通过同源性依赖性和同源性非依赖性两种机理来进行。

在一个方面，本文中公开了结合于Zp15基因中的靶位点的经工程改造的DNA结合域(例如ZFP，大范围核酸酶或亮氨酸拉链)。所述DNA结合域可包括，例如任何包含表1中所示识别螺旋的经工程改造的锌指DNA结合域。本文中所述的任何DNA结合域可进一步包含功能域，例如剪切域或剪切半域。在一些实施方案中，所述剪切半域可来自IIS型限制性内切核酸酶如FokI或StsI。在其他实施方案中，所述剪切域可包含归巢内切核酸酶(homingendonuclease)，例如具有修饰的DNA结合域的归巢内切核酸酶。

在另一个方面，本文中公开了包含整合入Zp15基因座的外源序列的植物或种子。在某些实施方案中，所述外源序列整合入植物的配子体。

在另一个方面，本文中公开了用于在细胞中表达外源核酸序列产物的方法，所述方法包括：(a)在细胞中表达第一融合蛋白，所述第一融合蛋白包含第一DNA结合域(例如ZFP)和第一剪切半域，其中所述DNA结合域经工程改造结合于细胞基因组的Zp15基因中的第一靶位点；(b)在细胞中表达第二融合蛋白，所述第二融合蛋白包含第二DNA域和第二剪切半域，其中所述第二DNA域结合于细胞基因组的Zp15基因中的第二靶位点，其中所述第二靶位点不同于所述第一靶位点；和(c)将所述细胞与包含外源核酸序列和与Zp15基因中的第一序列同源的第一核苷酸序列的多核苷酸相接触；其中所述第一融合蛋白对第一靶位点的结合，以及所述第二融合蛋白对第二靶位点的结合，使得所述剪切半域处于使得细胞基因组在Zp15基因中受剪切的位置，由此导致外源序列在所述Zp15基因中整合入细胞基因组，并表达所述外源序列的产物。

所述外源核酸序列可包含编码一个或多个功能多肽的序列(例如cDNA)，其可具有或不具有一个或多个启动子和/或可产生一个或多个RNA序列(例如，通过一个或多个shRNA表达盒)，其赋予植物所需的性状。所述性状包括但不限于除草剂抗性或耐受性；昆虫抗性或耐受性；(病毒、细菌、真菌、线虫)疾病抗性或耐受性；应激耐受性和/或抗性，例如对干旱、热、冷、冰冻、过分潮湿、盐应激的抗性或耐受性；氧化应激；增加的产量；食物内含物和构造；物理外观；雄性不育；枯倒(drydown)；直立性(standability)；生产力(proficacy)；淀粉的量与质量(quantity and quality)；油的量与质量；蛋白质的量与质量；氨基酸组成；等等。毋容置疑，可视需要采用任何两种或更多种任何所述的外源核酸，如赋予除草剂、昆虫、(病毒、细菌、真菌、线虫)疾病或干旱抗性，雄性不育、枯倒、直立性、生产力、淀粉性质、油的量与质量的那些，或增加产量或营养品质的那些。在某些实施方案中，所述核酸序列包含编码除草剂抗性蛋白的序列(例如AAD-1(芳氧基链烷酸二氧合酶(aryloxyalkanoate dioxygenase))基因、AAD-12基因或草胺膦乙酰转移酶(PAT)基因)和/或其功能性片段。整合序列的表达可由可操作地连接于所述整合序列的启动子所驱动。或者，所述整合序列可不含启动子，而转录由内源Zp15启动子驱动。

在某些实施方案中，所述多核苷酸进一步包含与Zp15基因中的第二序列同源的第二核苷酸序列。所述第二核苷酸序列可与Zp15基因中的第二序列相同。此外，在包含第一和第二核苷酸序列的实施方案中，所述第一核苷酸序列可与所述Zp15基因中的第一序列相同，而所述第二核苷酸序列可与所述Zp15基因中的第二序列同源但不相同。在任何本文中所述的方法中，所述第一和第二核苷酸序列位于所述外源序列两侧(flank the exogenous sequence)。在某些实施方案中，所述多核苷酸是质粒。在其他实施方案中，所述多核苷酸是线性DNA分子。

在另一个方面，本文中提供了用于将外源序列整合入细胞基因组中Zp15基因中的方法，所述方法包括：(a)在细胞中表达第一融合蛋白，所述第一融合蛋白包含第一DNA结合域(例如ZFP)和第一剪切半域，其中所述第一DNA结合域经工程改造结合于细胞基因组的Zp15基因座中的第一靶位点；(b)在细胞中表达第二融合蛋白，所述第二融合蛋白包含第二DNA结合域(例如ZFP)和第二剪切半域，其中所述第二DNA域结合于细胞基因组的Zp15基因中的第二靶位点，其中所述第二靶位点不同于所述第一靶位点；和(c)将所述细胞与包含外源核酸序列的多核苷酸相接触；其中所述第一融合蛋白对第一靶位点的结合，以及所述第二融合蛋白对第二靶位点的结合，使得所述剪切半域处于使得细胞基因组在Zp15基因座中受剪切的位置，由此导致外源序列同源性依赖性整合入细胞基因组的所述Zp15基因座内。在某些实施方案中，编码功能多肽的外源序列插入所述Zp15基因。

在任何本文中所述方法中，所述第一和第二剪切半域可来自IIS型限制性内切核酸酶，例如FokI或StsI。此外，在任何本文中所述方法中，至少一个融合蛋白可在所述剪切半域的二聚化界面的氨基酸序列中包含改变，例如使得形成所述剪切半域的专性杂二聚体。

在任何本文中所述方法中，所述植物细胞可包括单子叶植物或双子叶植物细胞。在某些实施方案中，所述植物细胞来自作物植物，例如玉米。

附图简述

图1描绘了来自进行了ZFN对#25(结合位点用下划线标示)瞬时表达的细胞来源的玉米HiII gDNA的Zp15扩增产物的示例性序列分析结果，并揭示了在预期的剪切位点的6bp NHEJ插入(粗体标示)。

图2描绘了来自进行了ZFN对#24(结合位点用下划线标示)瞬时表达的细胞来源的玉米HiII gDNA的Zp15扩增产物的示例性序列分析结果，并揭示了在预期的剪切位点的3bp缺失。

图3是描绘命名为pDAB7489的构建体的概略图。

图4是描绘编码AAD基因的示例性除草剂耐受基因表达盒的概略图。

图5是描绘命名为pDAB7490的构建体的概略图。

图6描绘了靶向整合(TI)事件的比对，其中比对了玉米野生型(WT)，Zp15供体片段以及邻接整合的供体序列的5’和3’边界区。

图7是描绘命名为pDAB104101的构建体的概略图。

图8是描绘PAT表达盒的概略图。

图9是描绘命名为pDAB104107的构建体的概略图。

图10是描绘命名为pDAB104104的构建体的概略图。

图11是描绘命名为pDAB104105的构建体的概略图。

图12是描绘命名为pDAB104106的构建体的概略图。

图13是描绘命名为pDAB104100的构建体的概略图。

图14是描绘命名为pDAB104103的构建体的概略图。

图15是描绘命名为pDAB104102的构建体的概略图。

具体实施方式

本公开涉及用于靶向整合(TI)入植物Zp15基因的方法和组合物，所述基因位于玉米中的染色体6。使用包含DNA结合域(例如ZFP、大范围核酸酶或亮氨酸拉链)和核酸酶域的融合蛋白，可将插入(供体)序列可操作地连接于外源启动子，或其可不含启动子。如果其不含启动子，则整合的开读框的转录可在启动子特异性组织中由内源Zp15基因启动子进行。不含启动子的供体的使用降低了供体随机整合和/或供体上携带的启动子不经意(spurious)激活内源基因的可能性。

可用于靶向剪切和重组入Zp15基因的组合物包括包含剪切域(或剪切半域)和DNA结合域(例如ZFP)的融合蛋白，编码这些蛋白的多核苷酸，以及多肽和编码多肽的多核苷酸的组合。锌指结合域可包含一个或多个锌指(例如2、3、4、5、6、7、8、9或更多个锌指)，且可经工程改造以结合于任何Zp15基因内的序列。这样的一种(或多种)融合蛋白在细胞中的存在会导致所述融合蛋白结合于其结合位点，并在内源Zp15基因内剪切。

概述

除非另行指明，否则本文中公开的方法的实践，以及组合物的制备和使用采用本领域技术范围内的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、计算化学、细胞培养、重组DNA及相关领域的常规技术。这些技术在文献中得到完善说明。参见，例如Sambrook等MOLECULAR CLONING：ALABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989 and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley & Sons，New York，1987 and periodicupdates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，AcademicPress，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999。

定义

术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用，并指线性或环状构象、单链或者双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物。就本公开而言，这些术语不应视为对于聚合物长度的限制。这些术语可涵盖天然核苷酸的已知类似物，以及在碱基、糖和/或磷酸部分受修饰的核苷酸(例如硫代磷酸酯骨架)。一般而言，具体核苷酸的类似物具有相同的碱基配对特异性，即A的类似物会与T碱基配对。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用以意指氨基酸残基的聚合物。该术语亦适用于其中一个或多个氨基酸为相应的天然存在的氨基酸的化学类似物或修饰衍生物的氨基酸聚合物。

“结合”指大分子之间(例如蛋白质和核酸之间)的序列特异性非共价相互作用。并非所有结合相互作用的组分均须具有序列特异性(例如，与DNA骨架中磷酸残基的接触)，只要作为整体的相互作用具有序列特异性即可。此类相互作用一般由10^-6M^-1或更低的解离常数(K_d)所表征。“亲和力”指结合的强度：增加的结合亲和力与更低的K_d相关联。

“结合蛋白”为能够非共价结合于另一个分子的蛋白质。结合蛋白可结合于例如DNA分子(DNA结合蛋白)、RNA分子(RNA结合蛋白)和/或蛋白质分子(蛋白质结合蛋白)。在蛋白质结合蛋白的情况下，其可结合于自身(以形成同二聚体、同三聚体等)和/或其可结合于不同的一种或多种蛋白质的一个或多个分子。结合蛋白可具有多于一种类型的结合活性。举例而言，锌指蛋白具有DNA结合、RNA结合和蛋白质结合活性。

“锌指DNA结合蛋白”(或结合域)为以序列特异性方式通过一个或多个锌指结合DNA的蛋白质，或更大蛋白内的域，锌指为结合域内其结构通过对锌离子的配位而得以稳定的氨基酸序列区。术语锌指DNA结合蛋白常常简称为锌指蛋白或ZFP。

锌指结合域可经“工程改造”以结合于预决的核苷酸序列。用于工程改造锌指蛋白的方法的非限定性实例为设计和选择。设计的锌指蛋白是其设计/组成主要根据理性标准所得的非天然存在的蛋白质。对于设计，理性标准包括应用取代规则和计算机化的算法以供加工储存现存ZFP设计和结合数据的信息的数据库中的信息。参见，例如美国专利6，140,081；6,453,242；和6,534,261；亦参见WO 98/53058；WO 98/53059；WO 98/53060；WO 02/016536和WO 03/016496。

“选择的”锌指蛋白是其产生主要来自经验性方法如噬菌体展示、相互作用陷阱或杂交选择所得的非天然发现的蛋白质。参见，例如US 5,789,538；US 5,925,523；US 6,007,988；US 6,013,453；US 6,200,759；WO 95/19431；WO 96/06166；WO 98/53057；WO 98/54311；WO 00/27878；WO 01/60970 WO01/88197和WO 02/099084。

术语“序列”指任何长度的核苷酸序列，其可为DNA或RNA；可为直链、环状或支化的，且可为单链或双链的。术语“供体序列”指插入基因组的核苷酸序列。供体序列可为任何长度，例如长度为2至10000个核苷酸(或任何其上或其间的整数值)，优选长度为约100至1000个核苷酸(或任何期间的整数值)，更优选长度为200至500个核苷酸。

“同源的非相同序列”指第一序列和第二序列具有一定程度的序列同一性，但其序列并不与第二序列的序列相同。举例而言，包含突变基因的野生型序列的多核苷酸与该突变基因的序列同源而不相同。在某些实施方案中，两个序列之间的同源性程度足以允许其间利用通常的细胞机理进行同源重组。两个同源的非相同序列可为任何长度，且其非同源程度可为小至单个核苷酸(例如，用于通过靶向的同源重组校正基因组点突变)或大至10或更多千碱基(10 or more kilobases)(例如，用于在染色体中的预决的异位位点插入基因)。包含所述同源的非相同序列的两个多核苷酸无需为相同长度。举例而言，可使用20至10000核苷酸或核苷酸对的外源多核苷酸(即供体多核苷酸)。

用于确定核酸和氨基酸序列同一性的技术在本领域是已知的。通常，此类技术包括对于基因确定其mRNA的核苷酸序列和/或确定由其编码的氨基酸序列，并将这些序列与第二核苷酸或氨基酸序列相比较。基因组序列亦可以该方式确定和比较。一般而言，同一性指两个多核苷酸或多肽序列各自准确的核苷酸-核苷酸或氨基酸-氨基酸对应。两个或更多个序列(多核苷酸或氨基酸)可通过确定其百分比同一性来进行比较。两个序列(无论是核酸或氨基酸序列)的百分比同一性，是两个比对序列之间准确的匹配数除以较短序列的长度并乘以100。核酸序列的大致比对由Smith和Waterman，Advances in AppliedMathematics 2：482-489(1981)的局部同源性算法提供。该算法可通过使用由Davhoff，Atlas of Protein Sequences and Structure.M.O.Dayhoff ed.，5 suppl.3：353-358，National Biomedical Research Foundation，Washington，D.C，USA开发并由Gribskov，Nucl.Acids Res.14(6)：6745-6763(1986)标准化的评分矩阵而应用于氨基酸序列。该算法用于确定序列的百分比同一性的示例性实施由Genetics Computer Group(Madison，WI)在BestFit应用程序(utility application)中提供。适用于计算序列间百分比同一性或相似性的程序在本领域一般是已知的，例如，另一种比对程序是BLAST，其以缺省参数使用。举例而言，BLASTN和BLASTP可以以下述缺省参数使用：genetic code＝standard (遗传编码＝标准)；filter＝none(过滤器＝无)；strand＝both(链＝两条)；cutoff＝60(截止值＝60)；expect＝10(期望值＝10)；Matrix＝BLOSUM62(矩阵＝BLOSUM62)；Descriptions＝50sequences(描述＝50序列)；sort by＝HIGH SCORE(分类方法＝高分)；Databases＝non-redundant，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+Swiss protein+Spupdate+PIR(数据库＝非冗余GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+Swiss蛋白+Spupdate+PIR)。这些程序的细节可见于互联网。关于本文中所述的序列，所需的序列同一性程度为大约80％至100％和任何其间的整数值。通常序列间的百分比同一性为至少70-75％，优选80-82％，更优选85-90％，甚至更优选92％，仍更优选95％，且最优选98％序列同一性。

或者，多核苷酸之间的序列相似性程度可通过在允许同源区之间形成稳定的双链体的条件下进行多核苷酸杂交，然后用单链特异性核酸酶进行消化，并确定消化片段的大小来确定。两个核酸，或两个多肽序列当其序列使用上述方法确定为在给定的分子长度上呈现至少约70％-75％，优选80％-82％，更优选85％-90％，甚至更优选92％，仍更优选95％，且最优选98％序列同一性时，为实质上彼此同源。如用于本文，实质上同源还指对特定的DNA或多肽序列显示完全同一性的序列。实质上同源的DNA序列可在例如对该具体系统定义的严格条件下在Southern杂交实验中鉴定。限定适当的杂交条件属于本领域技术。参见，例如Sambrook等，见上；Nucleic Acid Hybridization：APractical Approach，editors B.D.Hames and SJ.Higgins，(1985)Oxford；Washington，DC；IRL Press)。

两个核酸片段的选择性杂交可如下确定。两个核酸分子之间的序列同一性程度影响这些分子之间的杂交事件的效率和强度。部分相同的核酸序列会至少部分抑制完全相同的序列对靶分子的杂交。对完全相同的序列的杂交的抑制可使用本领域公知的杂交测定(例如Southern(DNA)印迹，Northern(RNA)印迹，溶液杂交等，参见Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition，(1989)Cold Spring Harbor，N.Y.)来评估。此类测定可使用多种选择性程度来进行，例如，使用从低至高变化的严格条件。如果采用低严格度的条件，非特异性结合的不存在可使用缺乏甚至部分序列同一性程度的第二探针(例如，与靶分子具有少于约30％序列同一性的探针)来评估，从而使得在不存在非特异性结合事件时，所述第二探针不会与靶杂交。

当利用基于杂交的检测系统时，选择与参照核酸序列互补的核酸探针，然后通过选择适当条件，所述探针和所述参照序列选择性彼此杂交或结合以形成双链分子。在中严格杂交条件下能够选择性杂交于参照序列的核酸分子通常在允许检测长度至少约10-14个核苷酸并与选定的核酸探针序列具有至少大约70％序列同一性的靶核酸序列的条件下杂交。严格杂交条件通常允许检测长度至少约10-14个核苷酸并与选定的核酸探针序列具有大于约90-95％序列同一性的靶核酸序列。在探针和参照序列具有特定的序列同一性程度时可用于探针/参照序列杂交的杂交条件，可如本领域已知方式确定(参见，例如Nucleic Acid Hybridization：A Practical Approach，editors B.D.Hames and SJ.Higgins，(1985)Oxford；Washington，DC；IRL Press)。

用于杂交的条件对于本领域技术人员是公知的。杂交严格度指杂交条件不利于含有错配核苷酸的杂合体形成的程度，其中较高的严格度对应于对错配杂合体较低的容忍度。影响杂交严格度的因素对于本领域技术人员是公知的，且包括但不限于温度、pH、离子强度和有机溶剂如例如甲酰胺和二甲亚砜的浓度。如本领域技术人员所知，杂交严格度随温度升高、离子强度下降和溶剂浓度下降而增加。

关于用于杂交的严格条件，本领域公知可采用多种等同条件以确立特定的严格度，即变化例如下述因素：序列的长度和特性，多种序列的碱基组成，盐和其他杂交溶液组分的浓度，杂交溶液中阻断剂(例如硫酸葡聚糖和聚乙二醇)的存在与否，杂交反应温度和时间参数，以及变化洗涤条件。一组特定的杂交条件的选择可遵循本领域的标准方法进行选择(参见，例如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual.Second Edition，(1989)Cold SpringHarbor，N.Y.)。

“重组”指两个多核苷酸之间遗传信息交换(exchange)的过程。就本公开而言，“同源重组”指特定形式的此种交换，其发生于例如细胞中双链断裂的修复过程中。该过程需要核苷酸序列同源性，使用“供体”分子作为模板修复“靶”分子(即遭受双链断裂的分子)，并不同地称作“非交换基因转变(non-crossover gene crossover)”或“短轨基因转变(short track gene crossover)”，因为其导致遗传信息从供体转移至靶。不拘于任何具体理论，此种转移可涉及断裂的靶和供体之间形成的杂双链DNA错配的校正，和/或“合成依赖性链退火(synthesis-dependent strand annealing)”，其中所述供体用于重新合成遗传信息(该信息会成为靶的一部分)，和/或其相关过程。此种特定化的HR常常导致靶分子序列的改变，从而使得供体多核苷酸的部分或全部序列掺入靶多核苷酸中。

“剪切”指DNA分子的共价骨架的断裂。剪切可通过多种包括但不限于酶法或化学水解磷酸二酯键的方法来起始。单链剪切和双链剪切二者均是可能的，且双链剪切可作为两个不同的单链剪切事件的结果而发生。DNA剪切可导致平端或粘性端(staggered end)的产生。在某些实施方案中，融合多肽用于靶向的双链DNA剪切。

“剪切域”包括一种或多种具有对于DNA剪切的催化活性的多肽序列。剪切域可包含于单一多肽链中，或剪切活性可来自两个(或更多个)多肽的结合。

“剪切半域”是与第二多肽(相同或不同的)一同形成具有剪切活性(优选双链剪切活性)的复合物的多肽序列。

“染色质”是包含细胞基因组的核蛋白结构。细胞染色质包含核酸，主要是DNA，和蛋白质，包括组蛋白和非组蛋白染色体蛋白。大多数真核细胞染色质以核小体的形式存在，其中核小体核心包含与包含组蛋白H2A、H2B、H3和H4各两个的八聚体相结合的大约150个碱基对的DNA；而接头DNA(取决于生物，具有不同长度)延伸于核小体核心之间。组蛋白H1的分子一般与接头DNA相结合。就本公开而言，认为术语“染色质”涵盖所有类型的细胞核蛋白，包括原核和真核二者。细胞染色质包括染色体和附加体染色质二者。

“染色体”为包含细胞基因组全部或部分的染色质复合物。细胞基因组通常由其核型所表征，其为构成细胞基因组的所有染色体的集合。细胞基因组可包含一个或多个染色体。

“附加体”为并非细胞染色体核型一部分的复制的核酸、核蛋白复合物或包含核酸的其他结构。附加体的实例包括质粒和某些病毒基因组。

“可接近区(accessible region)”为细胞染色质中的位点，其中核酸中存在的靶位点可由识别该靶位点的外源分子所结合。不拘于任何具体理论，认为可接近区为不包装入核小体结构的区。可接近区的不同结构常常可通过其对化学和酶探针例如核酸酶的敏感性来检测。

“靶位点”或“靶序列”为限定若充分的结合条件存在则结合分子会结合的核酸部分的核酸序列。举例而言，序列5’-GAATTC-3’是EcoRI限制性内切核酸酶的靶序列。

“外源”分子是通常并不存在于细胞，但可通过一种或多种遗传、生物化学或其他方法导入细胞的分子。“通常存在于细胞”是相对于细胞的特定发育阶段和环境条件而确定的。因此，例如，仅在肌肉胚胎发育过程中存在的分子对于成体肌肉细胞而言是外源分子。类似地，由热应激诱导的分子相对于未经热激的细胞而言是外源分子。外源分子可包含，例如任何多肽或其片段的编码序列，功能障碍的内源分子的功能性型式或正常功能的内源分子的功能障碍型式。此外，外源分子可包含来自另一个物种的编码序列，其为宿主细胞中的内源基因的直系同源物(ortholog)。

外源分子除其他之外，可为小分子，如通过组合化学方法生成的，或大分子如蛋白质、核酸、糖、脂质、糖蛋白、脂蛋白、多糖、任何上述分子的修饰衍生物或任何包含一种或多种上述分子的复合物。核酸包括DNA和RNA，可为单链或双链的；可为直链、支化或环状的，且可为任何长度。核酸包括能够形成双链体的那些，以及形成三链体的核酸。参见例如美国专利5,176,996和5,422,251号。蛋白质包括但不限于DNA结合蛋白、转录因子、染色质重塑因子(chromatin remodeling factor)、甲基化DNA结合蛋白、聚合酶、甲基酶、脱甲基酶、乙酰化酶、脱乙酰基酶、激酶、磷酸酶、整合酶、重组酶、连接酶、拓扑异构酶、促旋酶和解旋酶。

外源分子可为与内源分子相同类型的分子，例如外源蛋白质或核酸。举例而言，外源核酸可包含感染性病毒基因组，导入细胞的质粒或附加体，或并不通常存在于细胞的染色体。将外源分子导入细胞的方法对于本领域技术人员是已知的，并包括但不限于脂质介导的转移(即脂质体，包括中心和阳离子性脂质)、电穿孔、直接注入、细胞融合、颗粒轰击、磷酸钙共沉淀、纳米颗粒转化、DEAE-右旋糖酐介导的转移和病毒载体介导的转移。

与之相对，“内源”分子为通常在特定环境条件下在特定发育阶段存在于特定细胞的分子。举例而言，内源核酸可包括染色体，线粒体、叶绿体或其他细胞器的基因组，或者天然存在的附加体核酸。其他内源分子可包括蛋白质，例如转录因子和酶。

如用于本文，术语“外源核酸产物”包括多核苷酸和多肽产物，例如转录产物(多核苷酸如RNA)和翻译产物(多肽)。

“融合”分子为两个或更多个亚基例如共价连接的分子。亚基分子可为相同化学类型的分子，或可为不同化学类型的分子。第一种类型的融合分子的实例包括但不限于融合蛋白(例如，ZFP DNA结合域和剪切域之间的融合物)和融合核酸(例如，编码如上所述融合蛋白的核酸)。第二种类型的融合分子的实例包括但不限于形成三链体的核酸和多肽之间的融合物，以及小沟结合物(minor groove binder)和核酸之间的融合物。

融合蛋白在细胞中的表达可通过将所述融合蛋白递送至细胞或通过将编码所述融合蛋白的多核苷酸递送至细胞，并在其中将该多核苷酸转录，并翻译转录物以生成所述融合蛋白来获得。在细胞中表达蛋白质亦可涉及反式剪接、多肽剪切和多肽连接。将多核苷酸和多肽递送至细胞的方法在本公开其他部分进行介绍。

“基因”，就本公开而言，包括编码基因产物(见下)的DNA区，以及所有调节(regulate)基因产物产生的DNA区，无论此类调节序列是否邻近编码和/或转录的序列。相应地，基因包括但不必需限于启动子序列、终止子、翻译调节序列如核糖体结合位点和内部核糖体进入位点、增强子、沉默子(silencer)、隔绝子(insulator)、边界元件、复制起点、基质附着部位和基因座调控区。

“基因表达”指将包含于基因中的信息转化为基因产物。基因产物可为基因的直接转录产物(例如mRNA、tRNA、rRNA、反义RNA、干扰RNA、核糖体、结构RNA或其他类型的RNA)或通过mRNA的翻译产生的蛋白质。基因产物还包括通过过程如加帽(capping)、多腺苷酸化、甲基化和编辑(editing)经修饰的RNA，以及通过例如甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、ADP核糖基化、豆蔻基化(myristilation)和糖基化经修饰的蛋白质。

基因表达的“调制(modulation)”指基因活性的变化。表达的调制可包括但不限于基因激活和基因阻遏。

“植物”细胞包括但不限于单子叶植物(monocot)或双子叶植物(dicot)细胞。单子叶植物的非限制性实例包括谷类植物如玉米、稻、大麦、燕麦、小麦、高粱、黑麦、甘蔗、菠萝、洋葱、香蕉和椰子。双子叶植物的非限制性实例包括烟草、西红柿、向日葵、棉花、甜菜、马铃薯、莴苣、甜瓜、大豆、双低菜(菜籽)和苜蓿。植物细胞可来自植物任何部分和/或植物发育的任何阶段。

“瞩目区(region of interest)”是希望其结合外源分子的任何细胞染色质区，如例如基因或基因之内或邻近的非编码序列。结合可为了靶向DNA剪切和/或靶向重组的目的。瞩目区可存在于例如染色体、附加体、细胞器基因组(例如线粒体、叶绿体)或感染的病毒基因组中。瞩目区可在基因编码区之内，在转录的非编码区如例如先导序列、尾随序列(trailer sequence)或内含子之内，或在无论是编码区上游或下游的非转录区之内。瞩目区的长度可小至单个核苷酸对或长至2000个核苷酸对，或任何核苷酸对的整数值。

术语“可操作的连接”或“可操作地连接”(或“可操作连接”)可互换使用，指两个或更多个组分(如序列元件)的并列，其中组分排列为使得所有组分均正常起作用，且允许至少组分之一可介导施加于至少一个其他组分的作用的可能性。对此加以说明：转录调节序列如启动子为可操作地连接于编码序列，如果该转录调节序列响应一种或多种转录调节因子的存在与否调控编码序列的转录水平。转录调节序列一般与编码序列顺式可操作地连接，但无需与其直接毗邻。举例而言，增强子是可操作地连接于编码序列的转录调节序列，即使两者并非邻接。

对于融合多肽，术语“可操作地连接”可指下述事实，即每个组分与其他组分连接时发挥有如并非如此连接时的作用。举例而言，对于其中ZFPDNA结合域融合于剪切域的融合多肽，ZFP DNA结合域和剪切域为可操作地连接，如果在该融合多肽中，所述ZFP DNA结合域部分能够结合其靶位点和/或其结合位点，而所述剪切域能够在靶位点的附近剪切DNA。

蛋白质、多肽或核酸的“功能性片段”是其序列与全长蛋白质、多肽或核酸不相同，然而保留与全长蛋白质、多肽或核酸相同功能的蛋白质、多肽或核酸。功能性片段可与对应的天然分子相比具有更多、更少或相同数量的残基，和/或可含有一个或多个氨基酸或核苷酸取代。用于确定核酸功能(例如，编码功能，杂交于另一个核酸的能力)的方法在本领域是公知的。类似地，用于确定蛋白质功能的方法也是公知的。例如，通过例如滤膜结合、电泳迁移率变动或免疫沉淀测定来测定多肽的DNA结合功能。DNA剪切可通过凝胶电泳来测定。参见Ausubel等，见上。一种蛋白质与另一种蛋白质相互作用的能力可通过例如共免疫沉淀、双杂交测定或(遗传和生化)互补作用来确定。参见，例如Fields等(1989)Nature 340：245-246；美国专利5,585,245号和PCTWO 98/44350。

靶位点

公开的方法和组合物包括包含剪切域(或剪切半域)和DNA结合域(例如，ZFP，大范围核酸酶或亮氨酸拉链)的融合蛋白，其中所述DNA结合域(例如，锌指蛋白、大范围核酸酶或亮氨酸拉链)通过结合于植物Zp15基因座中的序列将所述剪切域(或剪切半域)的活性导向序列附近并因此诱导Zp15中剪切(例如双链短链)。如本公开其他部分所示，可将锌指域工程改造以结合于几乎任何所需的序列。相应地，可将一个或多个DNA结合域(例如ZFP)进行工程改造以结合于植物Zp15基因中的一个或多个序列。在细胞中，包含DNA结合域(例如ZFP)和剪切域的融合蛋白的表达(或每个均包含DNA结合域和剪切半域的两个融合蛋白的表达)实现Zp15基因中的剪切。

在Zp15中就通过锌指域的结合对序列(例如，靶位点)的选择可通过例如，根据共同拥有的美国专利6,453,242号(2002年9月17日)中公开的方法来实施，该专利亦公开了设计ZFP结合于选定序列的方法。对于本领域技术人员显然对核苷酸序列的简单目视检查亦可用于靶位点的选择。相应地，任何用于靶位点选择的手段均可用于本文中所述的方法。

对于ZFP DNA结合域，靶位点一般由多个邻接的靶亚位点组成。靶亚位点指由单个锌指结合的序列(通常为核苷酸三联体，或可与邻接的四联体重叠一个核苷酸的核苷酸四联体)。参见，例如WO 02/077227。如果将与锌指蛋白发生最多接触的链命名为靶链“主要识别链”或“主要接触链”，则一些锌指蛋白结合于靶链上的三碱基三联体和非靶链上的第四碱基。靶位点一般具有至少9个核苷酸的长度，相应地，由包含至少三个锌指的锌指结合域所结合。然而，例如4-指结合域对12核苷酸靶位点，5-指结合域对15核苷酸靶位点或6-指结合域对18核苷酸靶位点的结合亦有可能。显而易见，更大的结合域(例如7-、8-、9-或更多指)对更长的靶位点的结合亦有可能。

靶位点无需为三的倍数个核苷酸。举例而言，在跨链相互作用发生的情况下(参见，例如美国专利6,453,242和WO 02/077227)，多指结合域的一个或多个个体锌指可结合于重叠的四联体亚位点。其结果，三指蛋白可结合10-核苷酸序列，其中第十个核苷酸是由端指结合的四联体的一部分，四指蛋白可结合13-核苷酸序列，其中第十三个核苷酸是由端指结合的四联体的一部分，依此类推。

在多指结合域中单个锌指之间的氨基酸接头序列的长度和特性亦影响对靶序列的结合。举例而言，在多指结合域中相邻锌指之间所谓“非正统接头(non-canonical linker)”、“长接头”或“结构化接头”的存在可允许这些指结合并不直接邻接的亚位点。此类接头的非限制性实例描述于，例如美国专利6,479,626号和WO 01/53480。相应地，在对于锌指结合域的靶位点中的一个或多个亚位点，可彼此间隔1、2、3、4、5或更多个核苷酸。仅举一例，四指结合域可结合于按顺序包含两个邻接3-核苷酸亚位点、间插核苷酸和两个邻接三联体亚位点的13-核苷酸靶位点。

序列(例如靶位点)之间的距离指间插于两个序列之间从最接近彼此的序列边缘起算的核苷酸或核苷酸对的数量。

在某些其中剪切取决于两个锌指域/剪切半域融合分子对分隔的靶位点的结合的实施方案中，两个靶位点可在相反的DNA链上。在其他实施方案中，两个靶位点均在同一DNA链上。

DNA结合域

任何DNA结合域可用于本文中公开的方法中。在某些实施方案中，所述DNA结合域包含锌指蛋白。锌指蛋白结合域包含一个或多个锌指。Miller等(1985)EMBO J.4：1609-1614；Rhodes(1993)Scientific American Feb.：56-65；美国专利6,453,242号。本文中所述的锌指结合域一般包括2、3、4、5、6或甚至更多个锌指。

通常，单个锌指结合域长约30个氨基酸。结构研究表明每个锌指域(基序)含有两个β-折叠(由含有两个不变半胱氨酸残基的β-转角维持)和α-螺旋(含有两个不变组氨酸残基)，其通过由所述两个半胱氨酸和两个组氨酸对锌原子的配位维持特定的构象。

锌指包括正统的C₂H₂锌指(即，其中锌原子由两个半胱氨酸和两个组氨酸残基配位的那些)和非正统的锌指如例如C₃H锌指(其中锌离子由三个半胱氨酸残基和一个组氨酸残基配位的那些)和C₄锌指(其中锌离子由四个半胱氨酸残基配位的那些)。关于在植物中使用的非正统ZFP，亦参见WO 02/057293和美国专利公开No.20080182332号。

经工程改造的锌指结合域可与天然存在的锌指蛋白相比，具有新颖的结合特异性。工程改造方法包括但不限于理性设计和多种类型的选择。理性设计包括，例如使用包含三联体(或四联体)核苷酸序列和单个锌指氨基酸序列的数据库，其中每个三联体或四联体核苷酸序列与一种或多种结合特定三联体或四联体序列的锌指氨基酸序列相关。

示例性选择方法，包括噬菌体展示和双杂交系统，公开于美国专利5,789,538；5,925,523；6,007,988；6,013,453；6,410,248；6，140,466；6,200,759；和6,242,568；以及WO 98/37186；WO 98/53057；WO 00/27878；WO 01/88197和GB 2,338,237。

对于锌指结合域的结合特异性的增强描述于，例如共同拥有的WO02/077227。

因为个体锌指结合于三核苷酸(即三联体)序列(或可与邻近锌指的四核苷酸结合位点重叠一个核苷酸的四核苷酸序列)，锌指结合域经工程改造结合的序列(例如，靶序列)的长度会决定在经工程改造的锌指结合域中锌指的数量。举例而言，对于其中指基序并不结合于重叠的亚位点的ZFP，六核苷酸靶序列由二指结合域结合；九核苷酸靶序列由三指结合域结合，依此类推。如本文中所示，对于靶位点中的单个锌指(即亚位点)的结合域无需为邻接的，但可间隔一个或几个核苷酸，取决于多指结合域中锌指之间的氨基酸序列(即指间接头)的长度和特性。

在多指锌指结合域中，邻近的锌指可间隔大约5个氨基酸的氨基酸接头序列(所谓“正统的”指间接头)，或者，间隔一个或多个非正统的接头。参见，例如共同拥有的美国专利6,453,242和6,534,261号。对于包含多于三个指的经工程改造的锌指结合域，在某些锌指之间更长的(“非正统的”)指间接头的插入在某些情况下可为需要的，因为其可增加结合域结合的亲和力和/或特异性。参见，例如美国专利6,479,626号和WO 01/53480。相应地，多指锌指结合域还可相对于非正统指间接头的存在和位置进行表征。举例而言，包含三个指(由两个正统指间接头联结)、长接头和另外三个指(由两个正统指间接头联结)的六指锌指结合域表示为2x3构型。类似地，包含两个指(由一个正统指间接头联结)、长接头和另外两个指(由一个正统接头联结)的结合域表示为2x2构型。包含三个二指单元(在每一个中两个指由正统接头相联结)，且其中每个二指单元通过长接头联结于邻近的二指单元的蛋白质称作3x2构型。

在多指结合域中两个邻近的锌指之间长的或非正统的指间接头的存在通常允许两个指结合于并不在靶序列中直接邻接的亚位点。相应地，在靶位点的亚位点之间可具有一个或多个核苷酸的缺口；即靶位点可含有锌指不接触的一个或多个核苷酸。举例而言，2x2锌指结合域可结合于由一个核苷酸间隔的两个六核苷酸序列，即其结合于13-核苷酸靶位点。亦参见Moore等(2001a)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：1432-1436；Moore等(2001b)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：1437-144和WO 01/53480。

如前所提及，靶位点是由单个锌指结合的三或四核苷酸序列。对于某些目的，二指单元表示为“结合模块”。结合模块可通过例如在结合特定六核苷酸靶序列的多指蛋白(一般为三指)的上下文中选取两个邻近的指来获得。或者，模块可通过装配单个锌指来构建。亦参见WO 98/53057和WO 01/53480。

或者，所述DNA结合域可来源于核酸酶。举例而言，归巢内切核酸酶和大范围核酸酶如I-Scel、I-CeuI、Pl-PspI、Pl-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-Crel、I-TevI、I-TevII和I-TevIII的识别序列是已知的。亦参见美国专利5,420,032号；美国专利6,833,252号；Belfort等(1997)Nucleic Acids Res.25：3379-3388；Dujon等(1989)Gene 82：115-118；Perler等(1994)Nucleic Acids Res.22，1125-1127；Jasin(1996)Trends Genet.12：224-228；Gimble等(1996)J.MoI.Biol.263：163-180；Argast等(1998)J.MoI.Biol.280：345-353和New England Biolabs目录。此外，归巢内切核酸酶和大范围核酸酶的DNA结合特异性可经工程改造以结合非天然靶位点。参见，例如Chevalier等(2002)Molec.Cell 10：895-905；Epinat等(2003)Nucleic Acids Res.31：2952-2962；Ashworth等(2006)Nature 441：656-659；Paques等(2007)CurrentGene Therapy 7：49-66；美国专利公开20070117128号。

作为另一个替代手段，DNA结合域可来源于亮氨酸拉链蛋白。亮氨酸拉链是在许多真核调节蛋白中涉及蛋白质-蛋白质相互作用的一类蛋白质，所述调节蛋白是与基因表达相关的重要转录因子。亮氨酸拉链指这些转录因子在几个生物界包括动物、植物、酵母等之间共享的通用结构基序。亮氨酸拉链由两个多肽(同二聚体或杂二聚体)形成，所述两个多肽以其中亮氨酸残基在α螺旋上等间隔出现从而使得两个多肽的亮氨酸残基最终位于螺旋的同一面的方式结合于特异性DNA序列。亮氨酸拉链的DNA结合特异性可利用于本文中公开的DNA结合域。

在一些实施方案中，DNA结合域为来自植物病原体黄单胞菌(Xanthomonas)来源的TAL效应物的经工程改造的域(参见Boch等(2009)Science 29 Oct 2009(10.1126/science.l 17881)以及Moscou和Bogdanove，(2009)Science 29 Oct 2009(10.1126/science.l 178817))。

剪切域

如上所示，所述DNA结合域可与剪切(核酸酶)域相联系。举例而言，归巢内切核酸酶可在其DNA结合特异性中经修饰而保留核酸酶功能。此外，锌指蛋白亦可融合于剪切域以形成锌指核酸酶(ZFN)。本文中公开的融合蛋白的剪切域部分可从任何内切核酸酶或外切核酸酶获得。剪切域可源自的示例性内切核酸酶包括但不限于，限制性内切核酸酶与归巢内切核酸酶。参见，例如，2002-2003 Catalogue，New England Biolabs，Beverly，MA；和Belfort等(1997)Nucleic Acids Res.25：3379-3388。其他剪切DNA的酶为已知的(例如，S1核酸酶；绿豆核酸酶；胰DNase I；微球菌核酸酶；酵母HO内切核酸酶；亦参见Linn等(eds.)Nucleases，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1993)。归巢内切核酸酶和大范围核酸酶的非限制性实例包括已知的I-Scel、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-Crel、I-TevI、I-TevII和I-TevIII。亦参见美国专利5,420,032号；美国专利6,833,252号；Belfort等(1997)Nucleic Acids Res.25：3379-3388；Dujon等(1989)Gene82：115-118；Perler等(1994)Nucleic Acids Res.22，1125-1127；Jasin(1996)Trends Genet.12：224-228；Gimble等(1996)J.MoI.Biol.263：163-180；Argast等(1998)J.MoI.Biol.280：345-353和New England Biolabs目录。这些酶(或其功能性片段)中的一种或多种可用作剪切域与剪切半域的来源。

限制性内切核酸酶(限制性酶)存在于许多物种中，并能够序列特异性结合于DNA(在识别位点处)，并在或结合位点或其附近剪切DNA。某些限制性酶(例如，IIS型)在远离识别位点的位点剪切DNA，且具有可分离的结合与剪切域。举例而言，IIS型酶FokI在距离其一个链上的识别位点9个核苷酸，另一个链上识别位点13个核苷酸处催化DNA的双链剪切。参见，例如，美国专利5,356,802；5,436,150和5,487,994，以及Li等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：4275-4279；Li等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2764-2768；Kim等(1994a)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：883-887；Kim等(1994b)J.Biol.Chem.269：31，978-31，982。因此，在一个实施方案中，融合蛋白包含来自至少一个IIS型限制性酶的剪切域(或剪切半域)和一个或多个锌指结合域，其可能为经或未经工程改造的。

其剪切域可与结合域分离的示例性IIS型限制性酶为FokI。该特定酶作为二聚体具有活性。Bitinaite等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：10，570-10，575。相应地，就本公开而言，用于公开的融合蛋白中的FokI酶部分被视为剪切半域。因此，对于使用锌指-FokI融合物的靶向双链剪切和/或靶向细胞序列取代，可将每个均包含FokI剪切半域的两个融合蛋白用于重建具有催化活性的剪切域。或者，亦可使用含有锌指结合域和两个FokI剪切半域的单一多肽。针对使用锌指-FokI融合物的靶向剪切与靶向序列变化的参数在本公开其他部分提供。

剪切域或剪切半域可为蛋白质任何保留剪切活性，或保留多聚化(例如，二聚化)以形成功能性剪切域的能力的部分。

示例性IIS型限制性酶描述于共同拥有的国际公开WO 2007/014275中，其通过全文提述并入本文。

为了增强剪切特异性，亦可修饰剪切域。在某些实施方案中，采用剪切半域的变体，这些变体最小化或防止剪切半域的同二聚化。此类经修饰的剪切半域的非限制性实例详述于WO 2007/014275，其通过全文提述并入本文。亦参见实施例。在某些实施方案中，所述剪切域包含经工程改造而最小化或防止同二聚化的剪切半域(亦称作二聚化域突变体)，其对于本领域技术人员是已知的，并描述于例如美国专利公开20050064474和20060188987号，其通过全文提述并入本文。在FokI位置446、447、479、483、484、486、487、490、491、496、498、499、500、531、534、537和538的氨基酸残基均为影响FokI剪切半域二聚化的靶。参见，例如美国专利公开20050064474和20060188987号；国际专利公开WO 07/139898；Miller等(2007)Nat.Biotechnol.25(7)：778-785。

其他经工程改造而形成专性杂二聚体的FokI的剪切半域亦可用于本文中所述的ZFN。在一个实施方案中，第一剪切半域在FokI的位置490和538的氨基酸残基包含突变，而第二剪切半域在氨基酸残基486和499包含突变。

在某些实施方案中，所述剪切域包含两个剪切半域，两者均为包含结合域、第一剪切半域和第二剪切半域的单个多肽的一部分。剪切半域可具有相同的氨基酸序列或不同的氨基酸序列，只要其起剪切DNA的作用。

一般而言，如果融合蛋白包含剪切半域，则需要两个融合蛋白用于剪切。或者，可使用包含两个剪切半域的单个蛋白质。所述两个剪切半域可来源于相同的内切核酸酶(或其功能性片段)，或每个剪切半域可来源于不同的内切核酸酶(或其功能性片段)。此外，对于两个融合蛋白的靶位点优选彼此的位置使得两个融合蛋白对其相应的靶位点的结合使所述剪切半域彼此处于允许所述剪切半域形成功能性剪切域(例如，通过二聚化)的空间取向。因此，在某些实施方案中，靶位点的近缘间隔5-8个核苷酸或15-18个核苷酸。然而任何整数个核苷酸或核苷酸对可间插于两个靶位点之间(例如，2至50或更多个核苷酸)。一般而言，剪切点位于靶位点之间。

融合蛋白

用于设计和构建融合蛋白(及其编码多核苷酸)的方法对本领域技术人员为已知的。举例而言，用于设计和构建包含DNA结合域(例如，锌指结构域)与调节或剪切域(或剪切半域)的融合蛋白，以及编码此类融合蛋白的多核苷酸的方法，描述于共同拥有的美国专利6,453,242和6,534,261以及美国专利申请公开2007/0134796和2005/0064474；通过全文提述并入本文。在某些实施方案中，构建了编码所述融合蛋白的多核苷酸。这些多核苷酸可插入载体中，而该载体可导入细胞中(其他关于将多核苷酸导入细胞的载体和方法的公开见下)。

在本文中所述方法的某些实施方案中，锌指核酸酶包括包含锌指结合域和来自FokI限制性酶的剪切半域的融合蛋白，并在细胞中表达两个此类融合蛋白。在细胞中两个融合蛋白的表达可为将两个蛋白质递送至所述细胞；将一个蛋白质与编码一个蛋白质的核酸递送至所述细胞；将每个均编码一个蛋白质的两个核酸递送至所述细胞；或通过将编码两个蛋白质的单个核酸递送至所述细胞所得的结果。在其他实施方案中，融合蛋白包含含有两个剪切半域与锌指结合域的单一多肽链。在此情况下，单个融合蛋白表达于细胞中，且虽不愿拘于理论，但认为作为所述剪切半域的分子内二聚体形成的结果，该融合蛋白剪切DNA。

在某些实施方案中，所述融合蛋白(例如，ZFP-FokI融合物)的组分经排列，使得所述锌指域最接近所述融合蛋白的氨基端，而所述剪切半域最接近其羧基端。这反映了天然存在的二聚体剪切域如那些源自FokI酶中的剪切域的相对取向，其中DNA结合域最接近氨基端而剪切半域最接近羧基端。在这些实施方案中，所述剪切半域的二聚化形成功能性核酸酶是通过将所述融合蛋白结合至相反DNA链上的位点来实现的，其中所述结合位点的5’端彼此接近。

在其他实施方案中，所述融合蛋白(例如，ZFP-FokI融合物)的组分经排列，使得所述剪切半域最接近所述融合蛋白的氨基端，而所述锌指域最接近其羧基端。在这些实施方案中，所述剪切半域的二聚化形成功能性的核酸酶是通过将所述融合蛋白结合至相反DNA链上的位点来实现的，其中所述结合位点的3’端彼此接近。

还在其他实施方案中，第一融合蛋白在最接近所述融合蛋白氨基端处含有所述剪切半域，而在最接近其羧基端处含有所述锌指域，而第二融合蛋白如下述排列，使得所述锌指域在最接近融合蛋白的氨基端处，而所述剪切半域在最接近其羧基端处。在这些实施方案中，两个融合蛋白均结合于同一个DNA链，其中所含锌指域最靠近羧基端的第一融合蛋白的结合位点位于所含锌指域最接近氨基端的第二融合蛋白的结合位点的5’侧。

在所公开的融合蛋白的某些实施方案中，其在锌指域和剪切域(或剪切半域)间的氨基酸序列称为“ZC接头”。所述ZC接头须与上面讨论的指间接头区别开来。对于获取优化剪切的ZC接头的细节，参见，例如美国专利公开20050064474A1和20030232410，以及国际专利公开WO05/084190。

在一个实施方案中，本公开提供了包含具有示于表1的一个或多个识别螺旋氨基酸序列的锌指蛋白的ZFN。在另一个实施方案中，本文提供了包含具有示于表1的一个或多个识别螺旋的编码ZFP的核苷酸序列的ZFP表达载体。

靶向整合

所公开的方法和组合物可用于在植物细胞染色质的Zp15基因中剪切DNA，这促进外源序列稳定和靶向地整合入所述基因座。如本文中所述，植物细胞能良好地耐受内源Zp15基因的功能缺失，且整合在该基因之内的序列广泛地转录，并生成具有种系修饰的植物以供将整合序列可遗传的进行传递。相应地，Zp15是用于靶向整合外源序列的理想位点。

对于靶向整合入Zp15，将一个或多个DNA结合域(例如ZFP)工程改造以结合位于预决的剪切位点或其附近的靶位点，并将包含经工程改造的DNA结合域和剪切域的融合蛋白在细胞中表达。当所述融合蛋白的DNA结合(例如锌指)部分结合于靶位点时，剪切域在DNA靠近靶位点处剪切，优选通过双链断裂进行。

在Zp15基因座中双链断裂的存在促进外源序列通过同源重组进行整合。因此，包含待插入所述Zp15基因的外源序列的多核苷酸会包含与Zp15基因同源的一个或多个区以促进同源重组。

如本文中所述，可将任何瞩目的序列(外源序列)导入Zp15基因座。示例性外源序列包括但不限于任何多肽编码序列(例如cDNA)、启动子、增强子和其他调节序列(例如干扰RNA序列，shRNA表达盒，表位标记，标记基因，剪切酶识别位点和多种类型的表达构建体。此类序列可使用标准分子生物学技术(克隆，合成等)方便地获得，并且/或者为商业上可获得的。

除了本文中所述的融合分子之外，对选定的基因组序列的靶向替代亦涉及替代(或供体)序列的导入。所述供体序列可在所述融合蛋白的表达之前、同时或之后导入细胞。所述供体多核苷酸包含与Zp15充足的同源性以支持其与所述与其具有同源性的Zp15基因组序列之间的同源重组(或同源导向的修复)。供体和基因组序列间大约25，50，100，200，500，750，1000，1500，2000或更多个核苷酸的序列同源性(或任何在10到2000之间整数值个核苷酸，或更多)将支持其间的同源重组。在某些实施方案中，所述同源臂长度少于1000个碱基对。在其他实施方案中，所述同源臂长度少于750个碱基对。亦参见美国临时专利申请61/124,047号，其通过提述并入本文。

供体序列的长度可为10至5000个核苷酸(或任何其间整数值个核苷酸)或更长的范围。显而易见所述供体序列通常与其取代的基因组序列不完全相同。举例而言，所述供体多核苷酸的序列可与所述基因组序列相比含有一个或多个单碱基变化，插入，缺失，倒位或重排，只要存在与染色体序列充足的同源性即可。或者，供体序列可含有两侧为两个同源区的非同源序列。此外，供体序列可包含含有与细胞染色质中的瞩目区不同源的序列的载体分子。一般而言，供体序列的同源区会具有与期望其与之进行重组的基因组序列至少50％的序列同一性。在某些实施方案中，存在60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或99.9％的序列同一性。可存在任何1％和100％之间值的序列同一性，取决于所述供体多核苷酸的长度。

供体分子可含有几个与细胞染色质同源的非毗连区。举例而言，为了靶向插入通常不存在于瞩目区的序列，所述序列可存在于供体核酸分子中，且其两侧为与瞩目区的基因序列具有同源性的区。

亦可将供体分子插入Zp15基因座以充当供将来使用的储备。举例而言，可将同源于内源基因但含有瞩目的突变的供体分子插入Zp15基因座。接着，可导入对所述内源基因有特异性的ZFN，其会剪切所述内源基因座和含有瞩目的突变的Zp15基因座中的供体分子。然后，所得的基因组中的DSB可成为用于从Zp15基因座释放的供体分子的整合位点。以此方式，可极大地增加在任何瞩目区靶向整合供体序列的效率，因为该方法并不依赖于编码ZFN的核酸和那些供体序列二者的同时摄入。

亦可将供体分子插入Zp15基因座以充当供后续插入的靶位点。举例而言，可将包含含有供其他ZFN设计的识别位点的DNA序列的供体分子插入所述Zp15基因座。接着，可生成其他ZFN设计，并将其表达于细胞从而使得通过修复或同源重组剪切和修饰起始供体分子。以此方式，可在Zp15基因座进行反复的供体分子整合。

为了使确定成功插入所述供体序列的测定(例如，杂交，PCR，限制性酶消化)简单化，相对于Zp15基因组序列的某些序列差异可存在于供体序列中。优选地，若其位于编码区，则此类核苷酸序列差异不会改变氨基酸序列，或会造成沉默氨基酸变化(即，不影响所述蛋白质结构或功能的变化)。所述供体多核苷酸可任选地含有对应于在瞩目区中DNA结合域结合位点的序列中的改变，以阻止剪切已通过同源重组导入细胞染色质的供体序列。

所述供体多核苷酸可为单链或双链的DNA或RNA，且可以线性或环状形式导入细胞。若以线性形式导入，所述供体序列的两端可通过本领域技术人员已知的方法保护(例如，免受外切核酸性降解)。举例而言，可将一个或多个双脱氧核苷酸残基添加至线性分子的3’端，和/或将自身互补的寡核苷酸连接到一个或两个末端。参见，例如，Chang等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：4959-4963；Nehls等.(1996)Science 272：886-889。其他保护外源多核苷酸免受降解的方法包括但不限于，添加末端氨基基团和使用修饰的核苷酸间连接，例如，硫代磷酸酯，氨基磷酸酯，以及O-甲基核糖或脱氧核糖残基。

可将多核苷酸作为具有其他序列的载体分子一部分导入细胞，所述其他序列如例如复制起点、启动子和编码抗生素抗性的基因。而且，供体多核苷酸可作为裸核酸，作为与试剂如纳米颗粒、脂质体或聚羟体(poloxamer)复合的核酸导入，或这可通过细菌或病毒(例如，土壤杆菌(Agrobacterium)，根瘤菌属菌种(Rhizobium sp.)NGR234，苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizoboium meliloti)，百脉根中生根瘤菌(Mesorhizobium loti)，烟草花叶病病毒，马铃薯病毒X，花椰菜花叶病病毒和木薯叶脉花叶病病毒)递送。参见，例如，Chung等(2006)Trends Plant Sci.11(1)：1-4。

看来在细胞序列中双链断裂的存在，加上与邻近或围绕所述断裂的区具有同源性的外源DNA分子的存在，激活通过将序列信息从所述供体分子转移至细胞(例如，基因组或染色体)序列中来修复所述断裂的细胞机理；即，通过同源导向修复过程，亦称为“基因转变”。申请人的方法有利地将经工程改造的ZFP的强力靶向能力与剪切域(或剪切半域)组合以特异地靶向共生同源基因如Zp15基因，从而使得靶序列的剪切在需要插入外源序列的基因组区中产生双链断裂。

对于改变染色体序列，无需将供体的全序列拷贝入所述染色体，只要拷贝足够多的供体序列以实现所期望的序列改变即可。

通过同源重组插入供体序列的效率与细胞DNA中双链断裂与需要重组发生的位点间的距离负相关。换言之，当双链断裂越靠近需要重组发生的位点时，观察到越高的同源重组效率。在准确的重组位点未预决的情况下(例如，所需的重组事件可在一段基因组序列范围上发生时)，选择所述供体核酸的长度与序列，以及剪切位点，以获得所需的重组事件。在所需事件设计为在基因组序列中改变单个核苷酸对的序列的情况下，细胞染色质在该核苷酸对任一侧10000个核苷酸以内受剪切。在某些实施方案中，剪切发生在距需改变其序列的核苷酸对任一侧1,000、500、200、100、90、80、70、60、50、40、30、20、10、5或2个核苷酸以内，或为任何在2到1000之间整数值的核苷酸之内。

如上所详述，每个均包括锌指结合域与剪切半域的两个融合蛋白的结合位点，自每个结合位点靠另一个结合位点最近的边缘测量，可间隔5-8或15-18个核苷酸，且剪切发生在所述结合位点之间。剪切是发生在所述结合位点间的单一位点处还是多个位点处并不重要，因为受剪切的基因组序列由供体序列所取代。因此，对于有效地通过靶向重组改变单个核苷酸对的序列，结合位点间区域的中点为距该核苷酸对10000核苷酸以内，优选1000核苷酸以内，或500个核苷酸以内，或200个核苷酸以内，或100个核苷酸以内，或50个核苷酸以内，或20个核苷酸以内，或10个核苷酸以内，或5个核苷酸以内，或2个核苷酸以内，或1个核苷酸以内，或就在瞩目的核苷酸对处。

在某些实施方案中，同源染色体可充当供体多核苷酸。因此，例如，在异源杂合体中突变的校正可通过工程改造出下述融合蛋白来实现，所述蛋白结合于并剪切在一个染色体上的突变序列，但并不剪切在同源染色体上的野生型序列。在携带突变的染色体上的双链断裂激发了基于同源性的“基因转变”过程，其中来自同源染色体的野生型序列被拷贝入受剪切的染色体，从而恢复了两个拷贝的野生型序列。

亦提供了可增强靶向重组水平的方法与组合物，包括但不限于，使用其他ZFP-功能域融合物以激活涉及同源重组的基因的表达，如RAD54上位显性组(epistasis group)的植物基因(例如AtRad54，AtRadSl)，和其产物与前述基因产物相互作用的基因。参见例如Klutstein M等Genetics.2008Apr；178(4)：2389-97。

类似地，可使用ZFP-功能域融合物与本文中公开的方法与组合物组合，以阻抑涉及非同源末端连接的基因的表达(例如，Ku70/80、XRCC4、多聚(ADP核糖)聚合酶、DNA连接酶4)。参见，例如，Riha等(2002)EMBO21：2819-2826；Freisner等(2003)Plant J.34：427-440；Chen等(1994)EuropeanJournal of Biochemistry 224：135-142。公开了使用锌指结合域与功能域间融合物激活与阻遏基因表达的方法，例如公开于于共同拥有的美国专利6,534,261；6,824,978和6,933,113中。其他阻遏方法包括使用靶向待阻遏的基因序列的反义寡核苷酸和/或小干扰RNA(siRNA或RNAi)或shRNA。

作为激活涉及同源重组的基因产物表达的备选方法或附加方法，可将这些蛋白质(或其功能性片段)与靶向Zp15的锌指结合域的融合物用于将这些蛋白质(重组蛋白)募集至瞩目区，从而增加其局部浓度，并进一步激发同源重组过程。或者，如上所述涉及同源重组的多肽(或其功能性片段)可为包含锌指结合域、剪切域(或剪切半域)和所述重组蛋白(或其功能性片段)的三重融合蛋白的一部分。其他涉及基因转变与重组相关染色质重塑(remodeling)，且可用于前述方法和组合物的蛋白质，包括组蛋白乙酰转移酶(例如，Esalp，Tip60)，组蛋白甲基转移酶(例如，Dotlp)，组蛋白激酶与组蛋白磷酸酶。亦参见Bhat等(1999)Plant J.33：455-469。

在包含锌指/核酸酶融合分子和供体DNA分子的细胞中靶向重组效率的进一步增加，是通过将细胞阻断于细胞周期的G₂期来实现，在该期同源性驱动的修复过程具最大限活性。此种停滞可用多种方法实现。举例而言，细胞可经例如影响细胞周期进行从而将细胞停止在G₂期的药物、化合物和/或小分子处理。这类分子的实例包括但不限于，影响微管聚合的化合物(例如，长春花碱，诺考达唑(nocodazole)，紫杉醇)，与DNA相互作用的化合物(例如，顺-铂(II)二胺二氯化物，顺铂，多柔比星)和/或影响DNA合成的化合物(例如，胸苷，羟基脲，L-含羞草碱，依托泊苷(etoposide)，5-氟尿嘧啶)。重组效率的额外增加是通过使用组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂(例如，丁酸钠，曲古抑菌素(trichostatin)A)实现的，所述抑制剂改变染色质结构以使细胞重组机构更易接近基因组DNA。

其他停止细胞周期的方法包括过表达抑制CDK细胞周期激酶活性的蛋白质，例如，通过将编码该蛋白质的cDNA导入所述细胞或者通过将激活编码该蛋白的基因表达的经工程改造的ZFP导入所述细胞。细胞周期停止亦可通过抑制细胞周期蛋白和CDK活性的方法来实现，例如，使用RNAi方法(例如，美国专利6,506,559号)或通过将阻遏一种或多种涉及细胞周期进行的基因如例如细胞周期蛋白和/或CDK基因的表达的改造ZFP导入所述细胞。对于合成经工程改造的锌指蛋白以供调节基因表达的方法参见，例如共同拥有的美国专利6,534,261号。

或者，在某些情况下，在缺乏供体多核苷酸的情况下进行靶向剪切(优选在S或G₂期)，而重组发生在同源染色体间。

表达载体

可将如本文中所述的编码一个或多个融合蛋白(例如ZFN)的核酸克隆入载体以供转化入原核或真核细胞以供复制和/或表达。载体可为原核载体例如质粒，或穿梭载体，昆虫载体或真核载体。编码融合蛋白的核酸亦可克隆入表达载体内，以施用于植物细胞。

为了表达融合蛋白(例如ZFN)，编码融合蛋白的序列通常亚克隆入含有启动子以引导转录的表达载体中。合适的细菌与真核启动子在本领域为公知的，并描述于，例如Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(2nded.1989；3^rd ed.，2001)；Kriegler，Gene Transfer and Expression：A LaboratoryManual(1990)；和Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等，见上)中。可获得在例如大肠杆菌、芽孢杆菌属菌种和沙门氏菌属中表达所述ZFP的细菌表达系统(Palva等，Gene 22：229-235(1983))。此类表达系统的试剂盒是商业上可获得的。针对哺乳类细胞、酵母和昆虫细胞的真核表达系统对本领域技术人员是公知的，且亦为商业上可获得的。

用于引导编码融合蛋白的核酸表达的启动子取决于具体用途。举例而言，适于宿主细胞的强组成型启动子通常用于表达和纯化融合蛋白。

相反，当在体内施用融合蛋白以供调节植物基因时(参见下面的“对植物细胞的核酸递送”部分)，取决于所述融合蛋白的具体用途使用组成型或诱导型的启动子。植物启动子的非限定性实例包括源自拟南芥(A.thaliana)泛素-3(ubi-3)(Callis等，1990，J.Biol.Chem.265-12486-12493)；根癌土壤杆菌(A.tumifaciens)甘露碱合酶(Δmas)(Petolino等，美国专利6,730,824号)；和/或木薯叶脉花叶病病毒(CsVMV)(Verdaguer等，1996，Plant Molecular Biology31：1129-1139)的启动子序列。亦参见实施例。

除了启动子之外，表达载体通常包含转录单元或表达盒，其包含在宿主细胞，无论是原核还是真核细胞中表达核酸所需的所有其他元件。典型的表达盒因此含有可操作性的连接于例如编码所述融合蛋白的核酸序列的启动子，以及例如用于有效的转录物多聚腺苷化、转录终止、核糖体结合位点或翻译终止所需的信号。其它盒元件可能包括，例如增强子、异源剪接信号和/或核定位信号(NLS)。

根据所述融合蛋白的预期用途，例如，在植物、动物、细菌、真菌、原生生物等中的表达，选取用于将遗传信息转运入细胞的具体表达载体(参见下面所述的表达载体)。标准细菌与动物表达载体在本领域为已知的，且详述于，例如，美国专利公开20050064474A1以及国际专利公开WO05/084190，WO05/014791与WO03/080809中。

标准转染方法可用于产生表达大量的蛋白质的细菌、哺乳类、酵母或昆虫细胞系，然后所述蛋白质可使用标准技术纯化(参见，例如，Colley等，J.Biol.Chem.264：17619-17622(1989)；Guide to Protein Purificatton，in Methods inEnzymology，vol.182(Deutscher，ed.，1990))。真核和原核细胞的转化根据标准技术实施(参见，例如，Morrison，J.Bact.132：349-351(1977)；Clark-Curtiss &Curtiss，Methods in Enzymology 101：347-362(Wu等，eds.，1983)。

可使用任何将外源核苷酸序列导入此类宿主细胞中的公知方法。这些包括使用磷酸钙转染，polybrene，原生质体融合，电穿孔，超声波方法(例如，声致孔(sonoporation))，脂质体，显微注射，裸DNA，质粒载体，附加体性的和整合性的病毒载体，以及其它用于将克隆的基因组DNA、cDNA、人工合成DNA或其它外源基因材料导入宿主细胞中的任何公知方法(参见，例如，Sambrook et al.，见上)。仅仅需要所用的具体遗传工程方法能够成功地将至少一个基因导入能够表达所选蛋白质的宿主细胞。

将核酸递送至植物细胞

如上所示，DNA构建体可通过多种常规技术导入所需的植物宿主(例如，导入其基因组)。对于此类技术的综述，参见，例如Weissbach & WeissbachMethods for Plant Molecular Biology(1988，Academic Press，N.Y.)Section VIII，pp.421-463；以及Grierson & Corey，Plant Molecular Biology(1988，2d Ed.)，Blackie，London，Ch.7-9。

举例而言，所述DNA构建体可使用如电穿孔和对植物细胞原生质体的显微注射的方法直接导入所述植物细胞的基因组DNA，或者所述DNA构建体可使用生物弹射击(biolistic)方法，例如DNA颗粒轰击(参见，例如，Klein等(1987)Nature 327：70-73)直接导入植物组织。或者，所述DNA构建体可通过纳米颗粒转化导入植物细胞(参见，例如美国专利申请12/245,685号，其通过全文提述并入本文)。或者，所述DNA构建体可与合适的T-DNA边界/侧翼区组合，并导入常规的根癌土壤杆菌宿主载体。根癌土壤杆菌介导转化技术，包括解除武装(disarming)和使用二元载体，在科学文献中得到充分描述。参见，例如，Horsch等(1984)Science 233：496-498，和Fraley等(1983)Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 80：4803。

此外，基因转移可使用非土壤杆菌细菌或病毒，例如，根瘤菌属物种NGR234，苜蓿中华根瘤菌，百脉根中生根瘤菌，马铃薯病毒X，花椰菜花叶病病毒与木薯叶脉花叶病病毒和/或烟草花叶病病毒。参见，例如，Chung等(2006)Trends Plant Sci.11(1)：1-4。

当细胞使用二元T DNA载体(Bevan(1984)Nuc.Acid Res.2：8711-8721)或共培养过程(Horsch等(1985)Science 227：1229-1231)由细菌感染时，所述根癌土壤杆菌宿主的毒性功能将引导包含所述构建体与邻近标记的T链插入植物细胞DNA。一般而言，所述土壤杆菌转化系统用于工程改造双子叶植物(Bevan等(1982)Ann.Rev.Genet 16：357-384；Rogers et al(1986)Methods Enzymol.118：627-641)。所述土壤杆菌转化系统亦可用于转化，以及转移DNA至单子叶植物和植物细胞。参见美国专利5,591,616号；Hernalsteen等(1984)EMBOJ 3：3039-3041；Hooykass-Van Slogteren等(1984)Nature 311：763-764；Grimsley等(1987)Nature 325：1677-179；Boulton等(1989)Plant Mol.Biol.12：31-40.；以及Gould等(1991)Plant Physiol.95：426-434。

其他基因转移与转化方法包括但不限于，通过钙离子-，聚乙二醇(PEG)-或电穿孔-介导的裸DNA摄入进行的原生质体转化(参见Paszkowski等(1984)EMBO J 3：2717-2722，Potrykus等(1985)Molec.Gen.Genet.199：169-177；Fromm等(1985)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 82：5824-5828；和Shimamoto(1989)Nature 338：274-276)以及对植物组织进行电穿孔(D′Halluin et al.(1992)PlantCell 4：1495-1505)。其它植物细胞转化的方法包括显微注射，碳化硅介导DNA摄入(Kaeppler等(1990)Plant Cell Reporter 9：415-418)，以及微粒轰击(参见Klein等(1988)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 85：4305-4309；以及Gordon-Kamm等(1990)Plant Cell 2：603-618)。

本公开的方法与组合物可用于将外源序列插入植物细胞基因组中预决的位置(例如Zp15基因)。这是有用的，考虑到导入植物基因组的转基因表达严重取决于其整合位点。相应地，编码例如除草剂耐受性、昆虫抗性以、营养、抗生素或治疗分子的基因可通过靶向重组插入到植物基因组中对其表达有利的区。

通过上述任何转化技术产生的转化植物细胞可经培养再生出完整植物，其具有转化的基因型以及因此具有所需的表型。此类再生技术依赖于在组织培养生长培养基中操作某些植物激素，通常依赖于杀生物剂和/或除草剂标记，其可与所需的核苷酸序列一同导入。自培养原生质体的植物再生描述于Evans等″Protoplasts Isolation and Culture″in Handbook of Plant Cell Culture，pp.124-176，Macmillian Publishing Company，New York，1983；以及Binding，Regeneration of Plants，Plant Protoplasts，pp.21-73，CRC Press，Boca Raton，1985。再生亦可得自植物愈伤组织，外植体，器官，花粉，胚或其部分。此类再生技术一般地描述于Klee等(1987)Ann.Rev.of Plant Phys.38：467-486。

导入植物细胞的核酸可用于赋予基本上任何植物以所需的性状。使用本公开的核酸构建体和上述提及的多种转化方法，可将广泛种类的植物与植物细胞系统工程改造获取本文所述的所需生理学和农艺学特征。在优选实施方案中，需工程改造的靶植物与植物细胞包括但不限于，那些单子叶与双子叶植物，如作物，包括谷类作物(例如，小麦，玉米，稻，黍，大麦)，果实作物(例如，西红柿，苹果，梨，草莓，橙子)，草料作物(例如，苜蓿)，根菜作物(例如，胡萝卜，马铃薯，甜菜，薯蓣(yam))，叶菜作物(例如，莴苣(lettuce)，菠菜)；有花植物(例如，牵牛花，玫瑰，雏菊)，松柏类树木(conifers and pin trees)(例如，松杉，云杉)；用于植物补救(phytoremediation)的植物(例如，积聚重金属的植物)；油料作物(例如，向日葵，油菜籽)以及实验用的植物(例如，拟南芥(Arabidopsis))。因此，本公开的方法和组合物具有对广泛范围的植物的用途，所述植物包括但不限于，来自天门冬属(Asparagus)、燕麦属(Avena)、芸薹属(Brassica)、柑橘属(Citrus)、西瓜属(Citrullus)、辣椒属(Capsicum)、南瓜属(Cucurbita)、胡萝卜属(Daucus)、飞蓬属(Erigeron)、大豆属(Glycine)、棉属(Gossypium)、大麦属(Hordeum)、莴苣属(Lactuca)、黑麦草属(Lolium)、番茄属(Lycopersicon)、苹果属(Malus)、木薯属(Manihot)、烟草属(Nicotiana)、诸葛菜属(Orychophragmus)、稻属(Oryza)、鳄梨属(Persea)、菜豆属(Phaseolus)、豌豆属(Pisum)、梨属(Pyrus)、李属(Prunus)、萝卜属(Raphanus)、黑麦属(Secale)、茄科(Solanum)、高粱属(Sorghum)、小麦属(Triticum)、葡萄属(Vitis)、豇豆属(Vigna)和玉蜀黍属(Zea)的物种。

本领域技术人员会理解在外源序列稳定地掺入转基因植物并确证为可操作的之后，其可通过有性杂交导入其它植物中。任意多种标准育种技术均可使用，取决于待进行杂交的物种。

转化的植物细胞、愈伤组织、组织或植物可就存在于所述转化DNA上的标记基因编码的性状通过选择或筛选所述工程改造植物材料进行识别与分离。举例而言，可通过将工程改造的植物材料在下述培养基中生长而实施选择，即所述培养基含有抑制量的抗生素或除草剂，但所述转化基因构建体针对所述抗生素或除草剂提供抗性。进一步，转化植物与植物细胞亦可能通过筛选任何可见标记基因(例如，β-葡萄糖醛酸苷酶，萤光素酶，B或C1基因)的活性来识别，所述标记基因可能存在于重组核酸构建体上。上述选择与筛选方法对本领域技术人员是众所周知的。

亦可使用物理与生物化学方法鉴定包含插入基因构建体的植物或植物细胞转化体。这些方法包括但不限于：1)用于检测与确定重组DNA插入的结构的Southern分析或PCR扩增；2)用于检测和检查所述基因构建体的RNA转录物的Northern印迹、S1 RNase保护、引物延伸或逆转录酶-PCR扩增；3)用于检测酶或核酶活性的酶测定，其中此类基因产物由所述基因构建体编码；4)蛋白质凝胶电泳、Western印迹技术、免疫沉淀或酶联免疫分析(ELISA)，其中所述基因构建体产物为蛋白质。其它技术，如原位杂交、酶染色以及免疫染色亦可用于在特定植物器官与组织中检测所述重组构建体的存在或表达。实施所有这些分析的方法对本领域技术人员而言为公知的。

使用本文中公开的方法进行基因操作的效果可通过例如对从瞩目的组织分离的RNA(例如mRNA)进行Northern印迹来加以观察。通常，若mRNA存在或mRNA的量增加，则可假定其相应的转基因正在表达。可使用其它测量基因和/或所编码的多肽的活性的方法。可使用不同类型的酶测定，取决于所使用的底物以及检测反应产物或副产物增加或减少的方法。此外，所表达的多肽的水平可用免疫化学方法，即ELISA、RIA、EIA和其它对本领域技术人员为公知的基于抗体的测定如电泳检测测定(可进行染色或Western印迹)，来进行测量。作为一个非限定性实例，使用ELISA测定检测AAD-1和PAT蛋白描述于美国专利申请11/587,893号，其通过全文提述并入本文。所述转基因可选择性地表达于所述植物的一些组织或一些发育阶段，或所述转基因可基本上在所有植物组织中，基本上在其整个生活史中表达。然而，任何组合式的表达模式亦可适用。

本公开亦涵盖了上述转基因植物的种子，其中所述种子具有所述转基因或基因构建体。本公开进一步涵盖了上述转基因植物的后代、克隆、细胞系或细胞，其中所述后代、克隆、细胞系或细胞具有所述转基因或基因构建体。

融合蛋白(例如ZFN)和编码融合蛋白的表达载体可直接施用于植物以供基因调节、靶向剪切和/或重组。在某些实施方案中，所述植物包含多个共生同源靶基因。已知植物可含有多个共生同源基因。因此，一个或多个不同的融合蛋白或编码融合蛋白的表达载体可施用于植物以在该植物中靶向一个或更多Zp15基因。

有效量的施用可通过通常用于使得融合蛋白与待处理的植物细胞最终接触的任何途径。ZFP以任何合适的方法施用，优选使用可接受的载体。施用此类调整剂的合适方法是可获得的，且对本领域技术人员为公知的，而且，尽管可使用多于一种途径施用特定组合物，特定途径常常可提供较之其它途径更加迅捷而更加有效的反应。

载体亦可部分地根据所施用的特定组合物，以及用于施用该组合物的特定方法来使用与确定。相应地，有广泛种类的载体的合适配方可供使用。

实施例

下述为实施本公开具体实施方案的实施例。所述实施例仅为说明的目的而提供，并不旨在以任何方式限制本公开的范围。

已努力确保所用的数值(例如，量、温度等)的准确性，然而毋庸置疑，应允许一定的实验误差和偏差。

实施例1：Zp15靶基因座的鉴定和表征

基于可公开获得的遗传图(Lawrence，C等(2004)NAR 32：393-397；玉米互联网数据库)和玉米基因组序列草图，基于其关于Zp15基因可获得的信息及其位置，将位于染色体6短臂上的Zp15基因座选为使用ZFN进行修饰的靶标。来自玉米、编码15kD β玉米醇溶蛋白(zein)的基因(Zp15)的基因组结构和序列已描述并评注于公开领域(Woo等(2001)Plant Cell 13(10)：2297-2313)。Zp15基因的序列描述于GenBank登录号AF371264，其通过提述并入本文。

将Zp15基因组序列用于使用BLAST算法查询TIGR和玉米GDB基因组数据库。鉴定出了几个具有与Zp15重叠同源性的序列，包括但不限于两个重叠群(AZM5_16782和ZmGSStucl 1-12-04.8785.1)和几个EST(M72708、M13507、M12147、AY103640和AF371264)。基于这些登录号的序列以及Zp15序列，设计了多个短的寡核苷酸以供作为使用Primer3程序(Rozen，S.和Skaletsky，HJ.(2000)Primer3 on the WWW for general users and for biologistprogrammers.In：Krawetz S，Misener S(eds.)Bioinformatics Methods andProtocols：Methods in Molecular Biology.Humana Press，Totowa，NJ，pp365-386；亦可在互联网上获得)的PCR引物。

这些引物包括但不限于下述正向寡核苷酸：

P67F 5’-CGTATGAATTCATTGACAACC-3’(SEQ ID NO：1)

P68F 5’-ATGATCTATCTGTAAATCC-3’(SEQ ID NO：2)

P69F 5’-CGTCATGCAACGCAACATTCC-3’(SEQ ID NO：3)

P73F 5’-AAGAACATCACAAGTTATGC-3’(SEQ ID NO：4)

P74F 5’-TCATGTGGATCCAAGGCATC-3’(SEQ ID NO：5)

此外，所述引物包括但不限于下述反向寡核苷酸：

P70R 5’-ATGTGTGTCGTCTTACTGC-3’(SEQ ID NO：6)

P71R 5’-CAGTAGTAGGGCGGAATG-3’(SEQ ID NO：7)

P72R 5’-GGGCAGCTGGTACTG-3’(SEQ ID NO：8)

P75R 5’-CTATAATCGATGTAGAGC-3’(SEQ ID NO：9)

P76R 5’-CTATGCTTTGTCTATAGTCG-3’(SEQ ID NO：10)

所有寡核苷酸引物由Integrated DNA Technologies(IDT，Coralville，IA)合成并自其购买。从玉米品种Hi-II扩增gDNA是在PCR热循环仪上使用30nggDNA进行的。分离了对应于来自Hi-II的Zp15基因的2215bp扩增片段，并将其克隆入pCR2.1质粒(Invitrogen，Carlsbad，CA)。该片段的序列分析揭示了来自玉米品种Hi-II的Zp15基因组结构含有两个外显子和一个31bp的小内含子(SEQ ID NO：126)。对于Zp15靶向的ZFN的设计着眼于来自玉米品种Hi-II的Zp15基因的编码区。

实施例2：设计靶向玉米Zp15基因的锌指核酸酶

为了装配用于ZFN的表达载体，设计了适用于选自文库档案或从头开始合成的编码任何给定的编码ZFN的基因对的逐步模块性克隆方案。

首先使用如Doyon等(2008)Nature Biotechnology 26(6)：702和美国专利申请12/284,887号中所述的酵母测定筛选来筛选靶向Zp15的ZFN。简言之，将整个Zp15基因座导入出芽酵母基因组中的HO基因座以直接比较靶基因之内不同结合位点处的ZFN活性；对ZFN就其在报道基因中诱导DSB的能力使用如Doyon等中所述的报道基因测定(MELl)进行筛选。

基于这些间接(proxy)系统测定法的结果，确证了测试多个ZFN对能够在Zp15之内诱导DSB。

在酵母预筛选之后，接着将所述ZFN对亚克隆入玉米特异性表达载体。如美国专利公开20080182332号所述，将包含来源于玉米op-2和FokI核酸酶域使用玉米的密码子偏好重新设计并合成的核定位信号(NLS)区段的载体用独特Xho I位点下游的单个核苷酸插入(C)修饰以构建额外的Sac I位点。修饰了类似的载体以包含来自Thosea asigna病毒的2A核糖体停顿(stuttering)序列。将编码单个锌指蛋白ORF的基因盒通过KpnI和BamHI限制性位点克隆入这些载体之任一，接着将两个载体通过BglII/XhoI限制性位点组合，得到含有包含两个两侧为(flanked by)NcoI和SacI限制性位点的ZFN编码域的中间构建体。

将来自该中间构建的NcoI/SacI盒通过限制性酶消化切出，并连接至质粒骨架pDAB3872，pDAB3872含有来自玉米泛素-1基因的启动子(Sharrock等(1992)Plant MoI Biol.18(4)：675)和来自玉米根偏好阳离子性过氧化物酶(maize root preferential cationic peroxidase)基因的终止子序列(美国专利7,179,902号)。

所得的质粒包含ZFN基因，加上用于质粒维持的相关选择性标记和两侧的attL位点以供方便使用来自Invitrogen(Carlsbad，CA)的GATEWAY^TM系统进行操作。将每个使用该克隆方案生成的ZFN构建体转化入大肠杆菌DH5α细胞，然后在适当的选择下进行维持。

表1显示了用于靶向整合入Zp15基因座的实验的示例性靶向Zp15的ZFN。ZFN的DNA靶序列示于第二栏(DNA靶位点以大写字母表示；非接触的核苷酸以小写字母表示)，而第三至第六栏显示蛋白质中每个锌指(F1至F4)识别区的氨基酸序列(相对于螺旋起点的氨基酸-1至+6)。还在表1的第一栏中提供了对于每个蛋白质的识别号。

表1

显而易见ZFN可方便地插入C2H2或C3H骨架，且多种序列可用于连接锌指蛋白和剪切域。关于此类序列，参见美国专利公开20080182332特别是表6，其通过全文提述并入本文。

实施例3：玉米细胞中Zp15的ZFN介导破坏

测试了通过ZFN对的DSB诱导。鉴定出了能够有效地在内源Zp15基因意欲的靶位点处产生DSB的ZFN对。利用了通过非同源末端连接(NHEJ)(已知其在ZFN诱导的断裂位点处生成小DNA缺失/插入)进行的DSB修复的易错特性以选择有效地结合并剪切内源Zp15基因靶位点的ZFN对。

将ZFN在培养的玉米细胞中瞬时表达，并进行了在预测的剪切位点处靶基因座的序列分析。举例而言，将编码ZFN对#25(上述所示11768/11766识别螺旋)的质粒pDAB7468如美国专利申请12/001,939号(通过全文提述并入本文)中所述通过WHISKERS^TM介导的转化递送入玉米Hi-II细胞培养物。在24或72小时的瞬时表达之后，将所得的经破坏的ZFN靶序列从分离的基因组DNA扩增并克隆入质粒载体pCR2.1。对该gDNA使用酶Bsu36I进行限制性消化，然后扩增Zp15靶序列并将PCR产物克隆入质粒载体pCR2.1。通过限制性消化质粒DNA然后进行琼脂糖凝胶电泳来分析克隆的扩增产物的单个菌落(将显示对限制性酶Bsu36I的剪切有抗性的克隆的扩增产物视为含有破坏与ZFN剪切位点相关的限制性位点的突变)。

对192个克隆的直接序列分析揭示了6bp的插入(图1)。在另一个实例中，将编码ZFN对#24(上述所示的11753/11750识别螺旋)的质粒pDAB7467直接递送入玉米细胞培养物，并在24或72小时的瞬时表达之后，扩增了ZFN靶序列并将其克隆入质粒载体pCR2.1。对192个克隆的直接序列分析揭示了在准确剪切位点处的3bp缺失(图2)。本文中所述的插入和缺失为在靶位点处诱导的DSB的NHEJ修复的结果，并表明ZFN24和25在玉米细胞中的内源Zp15基因座处具有剪切活性。

使用ZFN25或28进行了相同的方法，但其中并不通过限制性酶消化筛选菌落，而是直接对192个独立的克隆进行测序。检测出6bp的插入(图2，顶部)。

综上所述，这些数据表明瞬时暴露于ZFN足以在培养的玉米细胞中的Zp15基因座诱导靶向的DSB。

实施例4：靶向整合入Zp15基因座

为了测试在Zp15处具有剪切活性的设计的ZFN能否驱动外源序列的整合，我们构建了携带编码来自Sphingomonas herbicidovorans的示例性外源除草剂抗性基因AAD-1(ATCC 700291)的自主基因盒的供体DNA分子。AAD-1编码酶芳氧基链烷酸二氧合酶，并赋予对芳氧基苯氧基丙酸除草剂的抗性(国际专利WO2005/107437，WO2008141154A2)。本领域技术人员会知道其他外源核酸可类似地掺入供体DNA分子，包括但不限于其他除草剂耐受基因如相关的AAD-12基因。在该除草剂耐受基因供体中，启动子序列来源于稻(O.sativa)肌动蛋白(GenBank登录号S44221和X63830)，而终止子序列来源于玉米(Z.mays L.)脂肪酶(GenBank登录号L35913)。

A.供体DNA分子的构建

包含与Zp15具有同源性的区的供体构建体如下所述生成。将含有Zp15基因的同源性侧翼的质粒骨架工程改造以允许任何供体DNA序列整合入Zp15基因的相应靶位点。这里示例的质粒骨架最初来自基础质粒载体pBCSK(-)噬菌粒(3.4kbp)(Stratagene，La Jolla，CA)。该方法具有四个步骤。

第一步，通过使用SpeI和SalI(New England Biolabs，Beverly，MA)限制性内切核酸酶直链化3μg pBC SK(-)来制备所述基础质粒。将所述3.3kbp经SpeI/SalI消化的亚克隆载体pBC SK(-)从凝胶切出，并使用QIAQUICK GelExtraction Kit(QIAGEN Inc.，Valencia，CA)依照生产商的指示进行纯化。

第二步，使用下述由Integrated DNA Technologies，Inc.(Coralville，IA)合成的寡核苷酸引物从Zp15分离5’-和3’-同源性侧翼：

Zp15HRDonorNotI(205)F：5’-GCGGCCGCATGCAAGAGCTGTTGATC-3’(SEQID NO：97)

Zp15HRDonorMfeI(1025)R：5’-CAATTGCCGGCGTAGTAGGGCGCCGCCGCCAGC-3’(SEQ ID NO：98)

Zp15HRDonorMfeI(1025)F：5’-CAATTGGTGTGGGCAGCCGAGCGCCATGTTCCAG-3’(SEQ ID NO：99)

Zp15HRDonorSalI(2270)R 5’-GTCGACCGATACTGATGCGGACCGTCCACCTTGTC-3’(SEQ ID NO：100).

使用LA TAQ PCR试剂盒(TaKaRa Biotechnology Inc.Otsu，Shiga，Japan)提供的试剂实施PCR扩增反应。PCR反应混合物由5μL 10X LA PCR^TM BufferII(Mg2+)、20ng双链模板(Hi-II玉米基因组DNA)、10pmol正向寡核苷酸引物、10pmol反向寡核苷酸引物、8μL dNTP混合物(2.5mM每种dNTP)、33.5μL H₂O、0.5μL(2.5单位)TaKaRa LA TaqTM DNA聚合酶、1滴矿物油组成。将引物Zpl5HRDonorNotI(205)F和Zpl5HRDonorMfeI(1025)R用于一个反应，而将引物Zpl5HRDonorMfeI(1025)F和Zpl5HRDonorSalI(2270)R用于第二个反应。PCR反应是使用Perkin-Elmer Cetus，48-样品DNA热循环仪(Norwalk，CT)在下述循环条件下进行的：94℃4分钟/1循环；98℃20秒，65℃1分钟，68℃1分钟/30循环；72℃5分钟/1循环、4℃/维持。对十五(15)μl的每种PCR反应产物进行电泳，并用UV光显影扩增的片段，并通过与1kbp DNA梯型分子量标记(ladder)相比较来估计片段大小。通过对5’片段825bp的DNA片段的存在或对于3’-片段1,250bp片段的存在来鉴定出预期的质粒克隆。将这些片段从凝胶切出，并使用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN Inc.，Valencia，CA)依照生产商的指示进行纯化。然后将纯化的片段使用TOPO TACLONING(R)Kit克隆入pCR2.1质粒，并依照生产商的实验方案转化入ONE

TOP10化学感受态大肠杆菌细胞(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)。

通过限制性酶消化和测序数据鉴定并确证了含有所述825bp 5’-片段或1,250bp 3’-片段的单个菌落。含有所述825bp 5’-片段的菌落是通过MfeI和NotI(New England Biolabs，Beverly，MA)的限制性酶消化来确证的。含有所述1,250bp 3’-片段的菌落是通过使用SalI(New England Biolabs，Beverly，MA)的限制性酶消化鉴定并确证的。预期的质粒克隆是通过除了3.9kbp

2.1载体之外插入的825bp(5’-片段)或1,250bp(3’-片段)的存在而鉴定出的。质粒克隆的双链测序反应如生产商所述使用CEQ^TM DTCS-Quick Start Kit(Beckman-Coulter，Palo Alto，CA)进行。反应物使用Performa DTR Gel FiltrationCartridges(Edge BioSystems，Gaithersburg，MD)如生产商的实验方案所述进行纯化。在Beckman-Coulter CEQ^TM 2000XL DNA Analysis System上分析测序反应物，并使用SEQUENCHER^TM版本4.1.4(Gene Codes Corporation，AnnArbor，MI)进行核苷酸表征。来自Zp15的5’-和3’-同源性片段的序列示于SEQID NO：127和SEQ ID NO：128。

第三步，如下所述将3’同源性侧翼连接至基础质粒。用限制性酶消化含有正确3’同源性侧翼序列的克隆，并将DNA片段从凝胶切出，并使用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN Inc.，Valencia，CA)纯化。将这些片段以1∶5载体：插入比例使用500单位T4DNA连接酶(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)在20μL的反应体积中在16℃水浴中16hr温育的条件下连接至之前经SpeI/SalI消化(见上)的纯化的基础质粒。接着将五(5)μL连接反应物转化入大肠杆菌One

Top 10 Chemically Competent Cells，(Invitrogen LifeTechnologies，Carlsbad，CA)，并铺板于含有抗生素选择的培养基之上。分离推定的菌落，并将其用SpeI和SalI限制性酶(New England Biolabs，Beverly，MA)消化以鉴定含有连接的3’-片段的克隆。

第四步，将5’同源性侧翼连接入含有所述3’同源性侧翼的质粒。将在上面第三步中所述的含有3’同源性侧翼的质粒用MfeI和NotI限制性内切核酸酶(New England Biolabs，Beverly，MA)在37℃消化1小时。将经所述NotI/MfeI消化的含有3’同源性侧翼的质粒从凝胶切出，并使用QIAquick Gel ExtractionKit(QIAGEN Inc.，Valencia，CA)依照生产商的指示进行纯化。

产生了通过使用所述MfeI和NotI限制性酶的限制性酶消化生成的5’同源性侧翼的分离的片段，并将其与含有所述3’同源性侧翼的质粒在20μL连接反应物中使用1∶5的载体：插入比和500单位T4DNALigase(Invitrogen LifeTechnologies，Carlsbad，CA)加以连接。将连接反应物在16℃水浴中温育16小时。

在连接之后，将5μL连接反应物根据生产商的推荐转化入MAX

DH5α^TM Chemically Competent Cells(Invitrogen LifeTechnologies，Carlsbad，CA)。选取单个菌落，并分离质粒DNA，并将其用NotI限制性酶(New England Biolabs，Beverly，MA)消化以鉴定含有5’同源性侧翼供体的整合片段的质粒。所得的质粒命名为pDAB7489(图3)。

构建了包含含有启动子、除草剂耐受基因和多腺苷酸化(polyA)终止序列的植物转录单元(PTU)的除草剂耐受基因表达盒。所述启动子序列来源于稻肌动蛋白1(McElroy等(1990)Plant Cell 2，163-171；GenBank登录号S44221和GenBank登录号X63830)。所述除草剂耐受基因包含AAD-1(芳氧基链烷酸二氧合酶)基因，其赋予针对芳氧基苯氧基丙酸除草剂的抗性(WO2005/107437)。所用基因的型式为型式#3，其包含用于在植物中表达的密码子优化的序列。终止子序列来源于玉米L脂肪酶(GenBank登录号L35913的玉米脂肪酶cDNA克隆)。该玉米序列包含用于AAD-1基因的3’未翻译区/转录终止区)。所述除草剂耐受基因表达盒示于图4。

为了生成该盒，由Integrated DNA Technologies，Inc.(Coralville，IA)在标准脱盐和用水稀释至0.125μg/μL浓度的条件下合成下述寡核苷酸引物：

OsActAad1v.3ZmLipMfeIF 5’-CAATTGGTCATTCATATGCTTGAGAAGAG-3’(SEQ ID NO：101)

OsActAad1v.3ZmLipMfeIR 5’-CAATTGAGCACTTAAAGATCTTTAGAAG-3’(SEQ ID NO：102)

PCR扩增反应是使用LA TAQ PCR Kit(TaKaRa Biotechnology Inc.，Otsu，Shiga，，Japan)实施的。PCR反应混合物包含：5μL 10X LA PCR^TM Buffer II(Mg2²⁺)、20ng双链模板(pDAB3878质粒DNA)、10pmol正向寡核苷酸引物、10pmol反向寡核苷酸引物、8μL dNTP混合物(每种2.5mM)、33.5μL H₂O、0.5μL(2.5单位)TaKaRa LA Taq^TMDNA聚合酶、1滴矿物油组成。PCR反应物是使用Perkin-Elmer Cetus，48-样品DNA热循环仪(Norwalk，CT)在下述循环条件下进行的：94℃，4分钟/1循环；98℃20秒，55℃1分钟，68℃3分钟/30循环；72℃，5分钟/1循环；4℃/维持。将每种PCR反应物的十五(15)μl在100V在补充了0.5％溴乙锭的1.0％TAE琼脂糖凝胶中电泳1小时。用UV光显影扩增的条带，并通过与1kbp DNA梯型分子量标记比较来估计片段大小。

通过对2.7kbp的DNA片段的存在来鉴定出预期的PCR产物(AAD-1PTU)。将这些片段从凝胶切出，并使用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGENInc.，Valencia，CA)依照生产商的指示进行纯化。然后将纯化的片段使用TOPOTA

Kit (用

2.1载体)和ONE

TOP10化学感受态大肠杆菌细胞(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)依照生产商的实验方案克隆入pCR2.1质粒。

选取单个菌落，分离质粒DNA，并对其用限制性酶MfeI (New EnglandBiolabs，Beverly，MA)消化。通过除了所述3.9kbp

2.1载体之外还存在插入的2,674bp的DNA片段(AAD-1PTU)来鉴定出预期的质粒克隆。质粒克隆的双链测序反应如生产商所述使用CEQ^TM DTCS-Quick Start Kit(Beckman-Coulter，Palo Alto，CA)进行。反应物使用Performa DTR Gel FiltrationCartridges(Edge BioSystems，Gaithersburg，MD)如生产商的实验方案所述进行纯化。在Beckman-Coulter CEQ(TM)2000XL DNA Analysis System上分析测序反应物，并使用SEQUENCHER^TM版本4.1.4(Gene Codes Corporation，AnnArbor，MI)进行核苷酸表征。

将来自含有正确的2,674bp序列的克隆的限制性片段从凝胶切出，并使用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN Inc.，Valencia，CA)依照生产商的指示进行纯化。然后将该片段在连接反应中与经限制性酶MfeI消化并接着去磷酸化的纯化的pDAB7489(质粒骨架)相组合。连接是在下述条件下进行的：在16℃水浴中在16小时温育条件下，在20μL的反应体积中，1∶5载体：插入比和500单位T4DNA Ligase(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)。然后将五(5)μL的连接反应物转化入50μL大肠杆菌MAX

DH5α^TMChemically Competent Cells(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)并在生产商所述的选择条件下进行铺板。

选择单个克隆，分离质粒DNA，并对其用限制性酶MfeI(New EnglandBiolabs，Beverly，MA)消化。预期的质粒克隆含有2,674bp(AAD-1PTU)和5,413bp(pDAB7489载体)的DNA片段。所得的质粒命名为pDAB7490(图5)。

生成并维持玉米品种Hi-II的胚发生细胞培养(Armstrong等(1991)MaizeGenet Coop Newsletter 65：92-93)，并对其进行编码ZFN24和供体分子pDAB7490的质粒的同时转化。愈伤组织的转化和选择，以及之后转化体的再生描述于美国专利申请12/001,939号，其通过全文提述并入本文。对于关于转化和选择实验方案的其他指南，参见Petolino等(2000)Plant Cell Rept.19：781-786。在开花之后，将植物自花传粉或与玉米品种DAS5XH751进行异型杂交。收获并干燥所得的后代种子。愈伤组织再生为完整、可育的玉米植物描述于美国专利申请12/001,939号，特别是实施例22，其通过全文提述并入本文。

B.AAD-1基因盒靶向整合入Zp15基因座

对于含有整合的编码除草剂耐受基因盒的供体DNA分子的除草剂耐受事件，预期所述事件的一些部分为供体DNA靶向整合入ZFN诱导的双链断裂位点的结果。为了从来源于除草剂耐受基因盒随机整合的那些事件区分这些靶向整合事件，利用了使用基因组特异性和后续基因组特异性加上供体特异性PCR引物组合的基于PCR的基因型分型策略。

在所有除草剂耐受转化事件中AAD-1转基因靶向对随机整合的差示性基因型分型是使用特异于Zp15基因座和AAD-1基因的基于PCR的测定来实施的。在本文中所示的实例中，所有寡核苷酸引物是由Integrated DNATechnologies，Inc.(Coralville，IA)在标准脱盐和用水稀释至100μM浓度的条件下合成的。设计了下述组的正向和反向寡核苷酸引物以退火至特异于位于供体DNA序列边界之外的Zp15基因靶标的gDNA序列：

HB501f：5’-AAGGTCCCAAATCTGAGGCATACTGTTGCT-3’(SEQ ID NO：103)

HB502r：5’-GAGGTCCTATGCTTTGTCTATAGTCGGCAG-3’(SEQ ID NO：104)

亦设计了第二组正向和反向寡核苷酸引物以退火至特异于位于供体DNA序列边界之外但嵌于第一对之内的Zp15基因靶标的gDNA序列：

HB503f 5’-GGCATACTGTTGCTGCCCTGCTGGAA-3’(SEQ ID NO：105)

HB504r 5’-GACACCTATAATCGATGTAGAGCCGAAGAG-3’(SEQ IDNO：106)

此外设计了正向和反向寡核苷酸引物以特异性退火至对应于AAD-1除草剂耐受基因编码区的供体DNA：

HB505f 5’-AGTCCACCCCAGTGATCTCAGCACCA-3’(SEQ ID NO：107)

HB506f 5’-AGTGGCTGGACAGCTATTCTCTCAAAGCGT-3’(SEQ IDNO：108)

HB507r 5’-ACGCTTTGAGAGAATAGCTGTCCAGCCACT -3’(SEQ ID NO：109)

HB508r 5’-TGGTGCTGAGATCACTGGGGTGGACT-3’(SEQ ID NO：110)

利用结合于Zp15基因组区和所述供体分子的引物实施了两个不同的初级扩增反应，得到了跨越基因组和供体的整合边界的扩增子。第一反应着眼于基因组和供体之间的5’边界，并使用引物组HB501f和HB507r。第二反应着眼于供体和基因组之间的3’边界，并使用引物组HB505f和HB502r。从转化的玉米Hi-II事件分离基因组DNA。初级PCR扩增反应使用由LA TAQ PCRKit(TaKaRa Biotechnology Inc.，Otsu，Shiga，Japan)提供的试剂实施。该PCR反应混合物由2.5μl 10X La Taq PCR^TM Buffer、40-200ng双链基因组DNA模板、10μM正向寡核苷酸引物、10μM反向寡核苷酸引物、2μl dNTP混合物(每种2.5mM)、16.25μl H₂O、0.25μl(1.25单位)LATaq^TMDNA聚合酶组成。PCR反应是使用Bio-Rad，96-样品DNA Engine Tetrad2，Peltier Thermal Cycler(Hercules，CA)在下述循环条件下进行的：94℃2分钟/1循环；94℃30秒，62℃30秒，68℃5分钟/30循环；4℃/维持。

接着将初级PCR反应产物在H₂O中稀释1∶100，并用作模板DNA以供两个不同的次级PCR反应。所述次级反应亦使用结合Zp15基因组区和供体分子的引物，得到了跨越基因组和供体的整合边界的扩增子。具体引物的身份决定该扩增是着眼于基因组和供体之间的5’-或3’-边界。第一反应着眼于基因组和供体之间的5’边界，并使用引物组HB503f和HB508r。第二反应着眼于供体和基因组之间的3’边界，并使用引物组HB506f和HB504r。两种PCR反应均由2.5μl 10X La Taq PCR^TM Buffer、1μl模板(初级PCR反应的1∶50稀释)、10μM正向寡核苷酸引物、10μM反向寡核苷酸引物、2μl dNTP混合物(每种2.5mM)、16.25μl H₂O、0.25μl(1.25单位)LATaq^TMDNA聚合酶组成。PCR反应是使用Bio-Rad，96-样品DNA Engine Tetrad2，Peltier Thermal Cycler(Hercules，CA)在下述循环条件下进行的：94℃2分钟/1循环；94℃30秒，62℃30秒，68℃5分钟/30循环；4℃/维持。观察到预期的2，180bp(对于5’-边界)或2,980bp(对于3’-边界)的PCR扩增子片段。

将这些片段从凝胶切出，并使用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGENInc.，Valencia，CA)依照生产商的指示纯化。然后将纯化的片段使用TOPO TACLONING(R)Kit(用

2.1载体)和ONE

TOP10化学感受态大肠杆菌(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)依照生产商的实验方案克隆入pCR2.1质粒。

选取单个菌落，分离质粒DNA，并对其用限制性酶EcoRI (New EnglandBiolabs，Beverly，MA)消化。预期的质粒克隆通过除了3.9kbp

2.1载体之外还存在插入的适当大小的DNA片段来鉴定。

进行了质粒克隆的双链测序反应，而核苷酸表征和比对使用SEQUENCHER^TM；版本4.1.4(Gene Codes Corporation，Ann Arbor，MI)进行。

选定的来源于AAD-1供体基因盒插入Zp15靶基因的靶向整合事件(事件#147)的序列数据示于图6中的比对。

对着眼于基因组和供体之间的5’-或3’-边界的初级PCR产物扩增进行亦着眼于基因组和供体之间的5’-或3’-边界的次级扩增。对应于这些次级扩增产物的克隆片段与野生型Zp15基因组序列以及靶向整合事件的预期序列的比对清楚地表明发生了供体DNA在靶位点的精确整合。Zp15基因组基因座的核苷酸序列、基因组/供体边界、对应于Zp15同源侧翼的供体区的核苷酸序列和除草剂耐受盒的核苷酸序列均保存于来源于该事件的多次克隆的PCR产物。因此，该事件代表了其中发生了ZFN介导的双链断裂的同源性驱动修复和供体DNA在特定基因靶标的靶向整合的基因组。在图6中，我们显示来源于单个代表性分离的转化玉米愈伤组织的序列比对数据(事件#147)。

已获得了其他代表发生独特的靶向整合的转化事件，说明本文中教导的方法在玉米愈伤组织中是可重复的。

实施例5：PAT靶向整合入Zp15基因座

作为用于将选定的外源多核苷酸靶向整合入本文中公开的靶向的基因座的方法的进一步例示，设计并构建了其他携带编码PAT的自主基因盒的DNA供体分子以测试外源供体序列在内源Zp15靶基因座之内的整合。配置具有对内源Zp15基因靶标特异性剪切活性的ZFN以在该基因座处构建DSB。接着，将携带编码来自绿色产色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)的PAT的自主基因盒以及同源于Zp15的侧翼序列的供体DNA分子整合入Zp15靶标的ZFN诱导的DSB。PAT编码酶草胺膦乙酰转移酶，并通过乙酰化赋予针对除草剂化合物草胺膦(PPT)的抗性(美国专利5,633,434号)。草胺膦是除草剂LIBERTY、BASTA和IGNITE的活性成分。将PAT编码序列作为植物转录单元(PTU)构建，并含有来源于稻肌动蛋白的启动子序列(GenBank登录号S44221和X63830)和来源于玉米脂肪酶的终止子序列(GenBank登录号L35913)。

A.供体DNA分子构建

含有与Zp15具有同源性的区的Zp15供体构建体如下所述合成地生成。设计了包含来自pDAB7489的核苷酸4595-5346(5’-同源性序列；SEQ IDNO：111)和核苷酸21-796(3’-同源性序列；SEQ ID NO：112)的Zp15同源性区。该同源性区包含在所述5’-和3’-同源元件之间的MfeI克隆位点和在5’和3’端的NotI限制性位点。合成了该DNA序列(SEQ ID NO：113)，并将其在SacI和KpnI克隆位点插入卡那霉素抗性ColE1型质粒pMK(Gene Art Ag，Regensburg，Germany)。所得的供体质粒命名为pDAB104101(图7)，并含有Zp15的同源性侧翼以允许任何瞩目的DNA序列整合入Zp15基因的相应靶位点。

构建了包含含有启动子、除草剂耐受基因和多腺苷酸化(polyA)终止序列的完整PTU的除草剂耐受基因表达盒。启动子序列来源于稻肌动蛋白1(McElroy等(1990)Plant Cell 2：163-171，GenBank登录号S44221和GenBank登录号X63830)。所述除草剂耐受基因是PAT。终止子序列来源于玉米脂肪酶(GenBank登录号L35913的玉米脂肪酶cDNA克隆)。该玉米序列包含PAT基因的3’非翻译区/转录终止子区。PAT除草剂耐受基因表达盒示于图8。

从质粒pDAB 102256通过PCR使用由Integrated DNA Technologies，Inc.(Coralville，IA)合成的引物扩增所述PAT基因：

DC001 5’-CCAGTGCAATTGGGTCATTCATATGCTTGAGAAG-3’(SEQ ID NO：114)

DC002 5’-CCAGTGCAATTGAATTCAGCACTTAAAGATCTTTAG-3’(SEQ ID NO：115)

PCR扩增反应是使用PHUSION^TM DNA Polymerase(New England Biolabs，Beverly，MA)在下述循环条件下进行的：98℃30秒/1循环；98℃10秒，60℃20秒，72℃45秒/9循环；98℃10秒，72℃60秒/24循环；72℃10分钟/1循环；4℃/维持。PCR反应产物通过在1.0％TAE琼脂糖凝胶中的电泳进行分析。

预期的PCR产物通过2.3kbp的DNA片段(PAT PTU)的存在来鉴定。将该片段从凝胶切出并使用QIAQUICK^TM Gel Extraction Kit(QIAGEN Inc.，Valencia，CA)依照生产商的指示进行纯化。然后将纯化的片段使用Zero BluntTOPO PCR Cloning Kit和ONE

TOP10化学感受态大肠杆菌细胞(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)克隆入pCR-Blunt II-TOPO载体。

挑取单个克隆，并分离质粒DNA并对其进行质粒DNA限制性酶消化和序列分析。对克隆的PAT插入进行测序以阐明克隆的PCR产物(SEQ IDNO：116)的身份和序列保真度。一种此种质粒克隆命名为pDAB104107(图9)，并随后用作供插入新的Zp15同源性供体载体的PAT基因盒的来源。

通过用MfeI消化接着进行凝胶电泳、切出和纯化来从pDAB104107回收2.3kbp PAT基因片段。亦将Zp15同源性供体质粒pDAB104101用MfeI消化并凝胶纯化。将PAT基因片段连接至pDAB104101，得到其中如差示性限制性酶消化确定PAT基因在MfeI位点以相对于Zp15基因序列的两种取向之任一插入的克隆。pDAB104104(图10)包含以与Zp15基因相同的转录取向插入的PAT基因。pDAB104105(图11)包含以与Zp15基因相反的转录取向插入的PAT基因。

B.其他供体DNA分子构建

生成了另一种含有与Zp15具有同源性的区的供体构建体，其中pDAB7489中的Zp153’-同源性序列通过截短而改变，而pDAB7489中Zp155’-同源性序列保持不变。截短的3’同源性区是从pDAB7489通过PCR使用由Integrated DNA Technologies，Inc.(Coralville，IA)合成的引物生成的：

DC003 5’-CTAATCGTCGACTCGTCAAGCCCCGCCTTTAAAT-3’(SEQ ID NO：117)

DC004 5’-CTAATCCAATTGGTGTGGGCAGCCGAGCG-3’(SEQ ID NO：118)

PCR扩增反应是使用PHUSION HOT START DNA Polymerase(NewEngland Biolabs，Beverly，MA)在下述循环条件下进行的：98℃30秒/1循环；98℃10秒，72℃15秒/33循环；72℃5分钟/1循环；4℃/维持。对PCR反应产物进行1.0％TAE琼脂糖凝胶中的电泳。

预期的PCR产物是通过0.8kbp的DNA片段(Zp153’-同源性)的存在鉴定的。将该片段从凝胶切出并使用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN Inc.，Valencia，CA)依照生产商的指示进行纯化。然后将纯化的片段使用Zero BluntTOPO PCR Cloning Kit和One

TOP10化学感受态大肠杆菌细胞(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)依照生产商的指示克隆入pCR-Blunt II-TOPO载体。

挑取单个菌落，并对其进行质粒DNA分离和限制性酶消化确证。对Zp153’同源性插入进行测序以阐明克隆的PCR产物(SEQ ID NO：119)的身份和序列保真度。一种此种质粒克隆命名为pDAB104106(图12)并随后用作供取代入pDAB7489以构建新的Zp15同源性供体载体的新Zp153’同源性序列的来源。

将pDAB7489用MfeI和SalI顺次消化，并将4.2kbp的载体片段凝胶纯化。将pDAB104106亦用MfeI和SalI消化，并将包含截短的Zp153’同源性序列的0.8kbp片段凝胶纯化。这些凝胶纯化的片段的连接和转化得到了其中截短的Zp153’同源性序列取代初始Zp153’同源性序列的克隆。该质粒命名为pDAB104100(图13)并用作所述PAT基因的受体。

通过用MfeI消化将所述PAT基因从104107去除。在凝胶电泳之后，将2.3kbp的PAT基因片段凝胶纯化。亦将Zp15同源性供体质粒pDAB104100用MfeI消化并凝胶纯化。将所述PAT基因连接入pDAB104100得到了其中如差示性限制性酶消化确定PAT基因在MfeI位点以相对于Zp15基因的两种取向之任一插入的克隆。pDAB104103(图14)包含以与Zp15基因相同的转录取向插入的PAT基因。pDAB104102(图15)包含以相对于Zp15基因相反的转录取向插入的PAT基因。

C.玉米的转化和靶向Zp15的PAT插入的回收

生成并维持了玉米品种Hi-II的胚发生细胞培养(Armstrong等(1991)Maize Genet Coop Newsletter 65：92-93)，并对其进行编码ZFN24和供体分子的质粒的同时转化。供体分子包括那些本文中所述的：pDAB104102、pD AB104103、pD AB 104104和pD AB 104105。愈伤组织的转化和选择以及转化体的后续再生描述于美国专利申请12/001,939号，特别是实施例19，其通过全文提述并入本文。对于关于转化和选择实验方案的其他指南，参见Petolino等(2000)Plant Cell Rept.19：781-786。在开花之后，将植物自花传粉或与玉米品种如DAS5XH751进行异型杂交(outcross)。可收获并干燥所得的后代种子，且可分析来自这些种子的植物以说明靶向整合事件的可遗传性。愈伤组织再生为完整、可育的玉米植物描述于美国专利申请12/001,939号，特别是实施例22，其通过全文提述并入本文。

D.靶向Zp15的PAT插入的鉴定

通过PCR检测转化的愈伤组织中靶向Zp15的PAT插入。从愈伤组织通过公知并常用的方法如Plant DNEASY Kit(QIAGEN Inc.，Valencia，CA)或Dellaporta的方法(Dellaporta等(1983)Plant MoI.Biol.Rep.1；19-21)提取模板基因组DNA。将PAT特异性引物与已经用于检测AAD-1靶向整合入Zp15基因座的Zp15侧翼序列引物一同使用导致在5’和3’Zp15同源性区扩增PAT靶向插入连结处的扩增。PAT特异性引物可为：

DC013 5’-CAATCGTAAGCGTTCCTAGCCTTCCAG-3’(SEQ ID NO：120)

DC014 5’-CTGGAAGGCTAGGAACGCTTACGATTG-3’(SEQ ID NO：121)

具体而言，当供体DNA具有相对于Zp15基因直接(direct)取向的PAT基因时，将供体DNA 5’Zp15同源性序列的两翼的基因组区中引物HB501f或HB503f与PAT蛋白编码区中的引物DC013(SEQ ID NO：120)一同使用以检测PAT-Zp155’插入连结处。类似地，当供体DNA具有相对于Zp15基因间接(indirect)取向的PAT基因时，将引物HB501f或HB503f与PAT蛋白编码区中的引物DC014(SEQ ID NO：121)一同使用以检测PAT-Zp155’插入连结处。对于检测PAT-Zp153’插入连结处，当供体DNA具有相对于Zp15基因间接取向的PAT基因时，将引物HB502r或HB504r与引物DC013(SEQ ID NO：120)一同使用以检测插入连结处。类似地，当供体DNA具有相对于Zp15基因直接取向的PAT基因时，将引物HB502r或HB504r与引物DC014(SEQ ID NO：121)一同使用以检测PAT-Zp155’插入连结处。

PCR扩增反应是使用PHUSION HOT START DNA Polymerase (NewEngland Biolabs，Beverly，MA)的下述循环条件下实施的：98℃30秒/1循环；98℃10秒，72℃15秒/33循环；72℃5分钟/1循环；4℃/维持。使用TAE琼脂糖凝胶电泳分辨并鉴定PCR产物。使用不同的PAT-Zp15供体DNA生成的转基因愈伤组织中来自PAT-Zp15靶向整合事件的PCR产物的预期凝胶片段大小如下所述：

HB501f/HB503f+DC013(5’)＝26kbp(pDAB104103)，2.6kbp(pDAB104104)

HB501f/HB503f+DC014(5’)＝1.6kbp(pDAB104105)，1.7kbp(pDAB104102)

HB502r/HB504r+DC013(3’)＝3.2kbp(pDAB104105)，3.2kbp(pDAB104102)

HB502r/HB504r+DC014(3’)＝1.2kbp(pDAB104103)，1.2kbp(pDAB104104)

使用本领域技术人员已知的标准方法克隆并测序了包含5’和3’PAT-Zp15靶向整合连结处的PCR产物。举例而言，将所述PCR产物从琼脂糖凝胶纯化，并使用TOPO BLUNT

Kit和ONE

TOP10化学感受态大肠杆菌细胞(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)依照生产商的指示克隆入pCR-BluntII TOPO质粒。

然后对克隆的整合连结处进行测序以阐明PAT基因通过藉由掺入供体转化载体的5’和3’Zp15同源性序列的同源重组在Zp15基因座插入玉米基因组。除了TOPO载体特异性引物M13正向和M13反向之外，使用了PAT基因盒特异性引物以获得靶向的整合克隆的完整序列。亦将特异于PAT蛋白编码序列的PCR引物SEQ ID NO：120和SEQ ID NO：121用作测序引物。此外，亦可将其他引物用于测序。这些包括但不限于特异于PAT盒的稻肌动蛋白启动子元件的那些：

DC-S1 5’-CCAACTGGACAATAGTCTCCAC-3’(SEQ ID NO：122)

DC-S2 5’-CATCGCCACTATATACATACC-3’(SEQ ID NO：123)

以及特异于PAT蛋白编码序列的那些：

DC-S3 5’-CGTCTCAATGTAATGGTTAACG-3’(SEQ ID NO：124)

DC-S4 5’-GCCCAGCGTAAGCAATACCAG-3’(SEQ ID NO：125)

实施例6：在Zp15基因座处AAD-1靶向整合的可遗传性

生成了携带靶向所述Zp15基因座的AAD-1基因盒的转基因愈伤组织事件(事件138)。再生了事件138T₀植物，并将其作为雌性与DAS5XH751雄性杂交。种植所得的T₁种子，并生长出T₁植物。

通过PCR分析T₁植物以阐明AAD-1-Zp15靶向整合的发生。PCR扩增反应是使用PHUSION HOT START DNA Polymerase(New England Biolabs，Beverly，MA)在下述条件下进行的：98℃30秒/1循环；98℃10秒，72℃15秒/33循环；72℃5分钟/1循环；4℃/维持。通过在1.0％TAE琼脂糖凝胶中的电泳分析PCR反应产物。从T₁植物提取基因组DNA，并将其在用设计供检测AAD-1Zp155’整合连结处的嵌套引物进行的PCR反应中用作模板DNA。初级和次级PCR反应使用之前在分析愈伤组织事件147的分析中使用相同引物进行。对于初级PCR，使用引物HB501f和HB507r。初级PCR产生2.2kbp预期大小的条带。将初级PCR反应产物的等分试样稀释1∶100并在使用嵌套引物HB503f和HB508r的次级PCR中用作模板。次级PCR亦于预期大小的2.2kbp产生条带。

将所述2.2kbp次级PCR产物使用ZERO BLUNT TOPO PCR Cloning Kit和ONE SHOT TOP10化学感受态大肠杆菌细胞(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)依照生产商的指示克隆入pCR-Blunt II-TOPO。将克隆的DNA使用侧翼载体特异性引物(M13正向和M13反向)进行测序。发现其序列与在Zp15基因座处AAD-1靶向整合所预期的序列相同。

本文中提及的所有专利、专利申请和公开就所有目的通过全文提述并入本文。

尽管出于理解清楚的目的，通过说明和举例的方式以一定细节提供了本公开，对于本领域技术人员显而易见可实施多种变化和修饰而不偏离本公开的精神或范围。相应地，前述描述和实例不应视为限制性的。

Claims

1.一种将一种或多种外源核酸序列整合入植物细胞基因组的方法，所述方法包括：

在植物细胞基因组中在Zp15基因座中或其附近造成双链断裂，从而导致包含所述一种或多种外源序列的多核苷酸在所述Zp15基因座或其附近整合入所述细胞的基因组。

2.权利要求1的方法，进一步包括表达所述一种或多种外源序列的产物。

3.权利要求1或2的方法，其中所述双链断裂是通过下述造成的：

(a)在细胞中表达第一融合蛋白，所述第一融合蛋白包含第一锌指结合域和第一剪切半域，其中所述第一锌指结合域经工程改造以结合于所述植物细胞基因组中Zp15基因座中或其附近的第一靶位点；和

(b)在细胞中表达第二融合蛋白，所述第二融合蛋白包含第二锌指结合域和第二剪切半域，其中所述第二锌指结合域结合于植物细胞基因组中Zp15基因座中或其附近的第二靶位点，其中所述第二靶位点不同于所述第一靶位点；且其中第一融合蛋白至第一靶位点的结合，和第二融合蛋白至第二靶位点的结合，使所述剪切半域处于使得所述植物细胞的基因组在Zp15基因座中或其附近受剪切的位置。

4.权利要求3的方法，其中所述锌指结合域选自表1中所示的组。

5.权利要求3或4任一项的方法，其中所述剪切半域为天然或非天然存在的。

6.权利要求1或2的方法，其中所述双链剪切是由天然存在或非天然存在的大范围核酸酶、IIS型限制性酶或包含所述大范围核酸酶和所述IIS型限制性酶的融合蛋白造成的。

7.权利要求1至6任一项的方法，其中所述一种或多种外源核酸序列包含编码序列、调节序列或DNA结合域的靶位点。

8.权利要求7的方法，其中所述编码序列编码赋予下述的产物：除草剂抗性；除草剂耐受性；昆虫抗性；昆虫耐受性；疾病抗性；疾病耐受性；应激耐受性；应激抗性；氧化应激的变化；油产量的增加；食物内含物和构造的变化；物理外观的变化；雄性不育；枯倒；直立性；生产力；淀粉的量或质的变化；油质的变化；蛋白质的质或量的变化；氨基酸组成的变化；或其组合。

9.权利要求1至8任一项的方法，其中所述多核苷酸进一步包含与Zp15基因座中序列同源的核苷酸序列。

10.权利要求9的方法，其中所述同源核苷酸序列位于外源序列的侧翼(flank the exogenous sequence)。

11.权利要求1至10任一项的方法，其中所述多核苷酸进一步包含启动子。

12.权利要求1至11任一项的方法，其中一种或多种整合的外源序列传递至后续世代中的后代。

13.权利要求1至12任一项的方法，其中所述植物细胞是单子叶植物细胞。

14.权利要求13的方法，其中所述植物细胞是玉米细胞。

15.一种植物或植物部分，包含一种或多种通过权利要求1至14任一项的方法整合入Zp15基因座的外源序列。

16.一种种子，包含一种或多种通过权利要求1至14任一项的方法整合入Zp15基因座的外源序列。