ES2729635T3 - Modificación genómica usando sistemas de polinucleótido guía/endonucleasa Cas y métodos de uso - Google Patents

Modificación genómica usando sistemas de polinucleótido guía/endonucleasa Cas y métodos de uso Download PDF

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Abstract

Un polinucleótido guía que comprende: (i) un primer dominio de secuencia de nucleótidos que es complementario a una secuencia de nucleótidos en un ADN diana; y, (ii) un segundo dominio de secuencia de nucleótidos que interactúa con una endonucleasa Cas, en donde el primer dominio de secuencia de nucleótidos y el segundo dominio de secuencia de nucleótidos están compuestos por ácidos desoxirribonucleicos (ADN), ácidos ribonucleicos (ARN) o una combinación de los mismos, en donde el polinucleótido guía comprende ADN.

Description

DESCRIPCIÓN
Modificación genómica usando sistemas de polinucleótido guía/endonucleasa Cas y métodos de uso
Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de los Estados Unidos n.° 61/868706, presentada el 22 de agosto de 2013, la solicitud provisional de los Estados Unidos n.° 61/882532, presentada el 25 de septiembre de 2013, la solicitud provisional de los Estados Unidos n.° 61/937045, presentada el 07 de febrero de 2014, la solicitud provisional de los Estados Unidos n.° 61/953090, presentada el 14 de marzo de 2014 y la solicitud provisional de los Estados Unidos n.° 62/023239, presentada el 11 de julio de 2014.
Campo
La divulgación se refiere al campo de la biología molecular, en particular, a métodos para alterar el genoma de una célula.
Antecedentes
La tecnología de ADN recombinante ha permitido insertar secuencias de ADN exógeno en el genoma de un organismo, por lo tanto, alterando el fenotipo del organismo.
Un método para insertar o modificar una secuencia de ADN implica la recombinación de homólogos de ADN mediante la introducción de una secuencia de ADN transgénica flanqueada por secuencias homólogas a la diana genómica. La Patente de los Estados Unidos número 5.527.695 describe la transformación de células eucariotas con secuencias de ADN dirigidas a una secuencia predeterminada del ADN del eucariota. Específicamente, se analiza el uso de la recombinación de sitio específico. Las células transformadas se identifican mediante el uso de un marcador de selección incluido como parte de las secuencias de ADN introducidas.
Se ha demostrado que las roturas de doble cadena genómicas de sitio específico inducidas artificialmente en células vegetales se repararon mediante recombinación de homólogos con ADN suministrado de forma exógena usando dos vías diferentes. (Puchta et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:5055-5060; Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos n.° 2005/0172365A1 publicada el 4 de agosto de 2005; Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos n.° 2006/0282914 publicada el 14 de diciembre de 2006; documento WO 2005/028942 (publicado el 2 de junio de 2005),
Ya que el aislamiento, clonación, transferencia y recombinación de segmentos de ADN, incluyendo secuencias codificantes y secuencias no codificantes, se lleva a cabo más convenientemente usando enzimas endonucleasas de restricción, gran parte de las investigaciones se ha centrado en estudiar y diseñar endonucleasas, tal como en el documento WO 2004/067736 publicado el 12 de agosto de 2004; Patente de los Estados Unidos n.° 5.792.632 concedida a Dujon et al., 11 de agosto de 1998; Patente de los Estados Unidos n.° 6.610.545 B2 concedida a Dujon et al., 26 de agosto de 2003; Chevalier et al., (2002) Mol Cell 10:895-905; Chevalier et al., (2001) Nucleic Acids Res 29:3757-3774; Seligman et al., (2002) Nucleic Acids Res 30:3870-3879.
Aunque se han desarrollado varias estrategias para apuntar a un sitio específico para la modificación en el genoma de una célula, sigue habiendo necesidad de métodos más eficientes y efectivos para producir un organismo, tal como, pero sin limitación, levaduras y plantas fértiles, que tengan un genoma alterado que comprenda modificaciones específicas en una región definida del genoma de la célula.
Breve sumario
En el presente documento se divulgan composiciones y métodos que emplean un sistema de polinucleótido guía/endonucleasa Cas para la modificación genómica de una secuencia diana en el genoma de una célula u organismo, para edición génica y para insertar un polinucleótido de interés en el genoma de una célula u organismo. Los métodos y las composiciones divulgados en el presente documento emplean un sistema de polinucleótido guía/endonucleasa Cas para proporcionar un sistema eficaz para modificar o alterar sitios diana y editar secuencias de nucleótidos de interés en el genoma de una célula, en donde el polinucleótido guía está formado por una secuencia de ADN, ARN o una combinación de ADN-ARN. Las células incluyen, pero sin limitación, células no humanas, animales, bacterianas, fúngicas, de insecto, de levadura y vegetales. Una vez que se ha identificado una diana genómica, pueden emplearse una variedad de métodos para modificar adicionalmente los sitios diana, de tal forma que contiene una variedad de polinucleótidos de interés. También se divulgan métodos de cruzamiento y métodos para seleccionar plantas utilizando un sistema de polinucleótido guía y endonucleasa Cas. También se divulgan en el presente documento construcciones de ácido nucleico, células, levaduras, plantas, células vegetales, explantes, semillas y granos que tienen el sistema de polinucleótido guía/endonucleasa Cas. En el presente documento también se divulgan composiciones y métodos para identificar una secuencia de nucleótidos en el genoma de una célula. La secuencia de nucleótidos que se va a editar (la secuencia de nucleótidos de interés) puede localizarse dentro o fuera de un sitio diana que se reconoce por una endonucleasa Cas.
Por lo tanto, en una primera realización de la divulgación, la composición comprende un polinucleótido guía que comprende: (i) un primer dominio de secuencia de nucleótidos que es complementario a una secuencia de nucleótidos en un ADN diana; y, (ii) un segundo dominio de secuencia de nucleótidos que interactúa con una endonucleasa Cas, en donde el primer dominio de secuencia de nucleótidos y el segundo dominio de secuencia de nucleótidos están compuestos por ácidos desoxirribonucleicos (ADN), ácidos ribonucleicos (ARN) o una combinación de los mismos, en donde el polinucleótido guía comprende ADN, en donde, preferentemente, el polinucleótido guía es una secuencia de ADN o una secuencia de combinación de ARN-ADN. El % de complementación entre el primer dominio de secuencia de nucleótidos (dominio de direccionamiento variable) y la secuencia diana puede ser de al menos el 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %. El primer dominio de secuencia de nucleótido (dominio VT) comprende una serie contigua de 12 a 30 nucleótidos.
En una realización, el primer dominio de secuencia de nucleótidos (dominio VT) y el segundo dominio de secuencia de nucleótidos del polinucleótido guía están ubicados en una sola molécula. En otra realización, el segundo dominio de secuencia de nucleótidos (dominio de reconocimiento de endonucleasa Cas) comprende dos moléculas separadas que son capaces de hibridar a lo largo de una región de complementariedad.
En otra realización, la composición comprende un polinucleótido guía, en donde el primer dominio de secuencia de nucleótidos es una secuencia de ADN y el segundo dominio de secuencia de nucleótidos se selecciona entre el grupo que consiste en una secuencia de ADN, una secuencia de ARN y una combinación de las mismas.
En otra realización, la composición comprende un polinucleótido guía, en donde el primer dominio de secuencia de nucleótidos y/o el segundo dominio de secuencia de nucleótidos comprende al menos una modificación que proporciona opcionalmente una característica beneficiosa adicional, en donde dicha al menos una modificación se selecciona entre el grupo que consiste en un remate 5', una cola poliadenilada 3', una secuencia de riboswitch, una secuencia de control de la estabilidad; una secuencia que forma un dúplex de ARNbc, una modificación o secuencia que dirige el polinucleótido guía a una ubicación subcelular, una modificación o secuencia que posibilita el seguimiento, una modificación o secuencia que proporciona un sitio de unión para proteínas, un ácido nucleico bloqueado (LNA), un nucleótido de 5-metil dC, un nucleótido de 2,6-diaminopurina, un nucleótido de 2'-fluoro A, un nucleótido de 2'-fluoro U; un nucleótido de 2'-O-metil ARN, un enlace fosforotioato, enlace a una molécula de colesterol, enlace a una molécula de polietilenglicol, enlace a una molécula espaciadora 18, un enlace covalente 5' a 3' o cualquier combinación de los mismos. La característica beneficiosa adicional puede ser una estabilidad modificada o regulada, un direccionamiento subcelular, seguimiento, un marcador fluorescente, un sitio de unión para una proteína o complejo de proteína, afinidad de unión modificada a una secuencia diana complementaria, resistencia modificada a la degradación celular o una permeabilidad celular aumentada.
En otra realización, la composición comprende un complejo de polinucleótido guía/endonucleasa Cas, en donde el polinucleótido guía comprende (i) un primer dominio de secuencia de nucleótidos que es complementario a una secuencia de nucleótidos en un ADN diana; y (ii) un segundo dominio de secuencia de nucleótidos que interactúa con una endonucleasa Cas, en donde dicho polinucleótido guía comprende ADN, en donde, preferentemente, el polinucleótido guía es una secuencia de ADN o una secuencia de combinación de ARN-ADN, en donde dichos polinucleótido guía y endonucleasa Cas son capaces de formar un complejo que permite a la endonucleasa Cas introducir una rotura bicatenaria en dicho sitio diana.
En otra realización, la composición comprende un complejo de polinucleótido guía/endonucleasa Cas, en donde el primer dominio de secuencia de nucleótidos y/o el segundo dominio de secuencia de nucleótidos de dicho polinucleótido guía comprende al menos una modificación que proporciona opcionalmente una característica beneficiosa adicional, en donde dicha al menos una modificación se selecciona entre el grupo que consiste en un remate 5', una cola poliadenilada 3', una secuencia de riboswitch, una secuencia de control de la estabilidad; una secuencia que forma un dúplex de ARNbc, una modificación o secuencia que dirige el polinucleótido guía a una ubicación subcelular, una modificación o secuencia que posibilita el seguimiento, una modificación o secuencia que proporciona un sitio de unión para proteínas, un ácido nucleico bloqueado (LNA), un nucleótido de 5-metil dC, un nucleótido de 2,6-diaminopurina, un nucleótido de 2'-fluoro A, un nucleótido de 2'-fluoro U; un nucleótido de 2'-O-metil ARN, un enlace fosforotioato, enlace a una molécula de colesterol, enlace a una molécula de polietilenglicol, enlace a una molécula espaciadora 18, un enlace covalente 5' a 3' o cualquier combinación de los mismos.
En otra realización, la composición comprende una planta o semilla que comprende el polinucleótido guía o el complejo de polinucleótido guía/endonucleasa Cas de la invención.
En otra realización, el método comprende un método para modificar un sitio diana en el genoma de una célula, comprendiendo el método proporcionar un polinucleótido guía a una célula que tiene una endonucleasa Cas, en donde dicho polinucleótido guía comprende ADN, en donde, preferentemente, el polinucleótido guía es una secuencia de ADN o una secuencia de combinación de ARN-ADN, en donde dichos polinucleótido guía y endonucleasa Cas son capaces de formar un complejo que permite a la endonucleasa Cas introducir una rotura bicatenaria en dicho sitio diana.
En otra realización, el método comprende un método para modificar un sitio diana en el genoma de una célula, comprendiendo el método proporcionar un polinucleótido guía y una endonucleasa Cas a una célula, en donde dicho polinucleótido guía comprende ADN, en donde, preferentemente, el polinucleótido guía es una secuencia de ADN o una secuencia de combinación de ARN-ADN, en donde dichos polinucleótido guía y endonucleasa Cas son capaces de formar un complejo que permite a la endonucleasa Cas introducir una rotura bicatenaria en dicho sitio diana.
En otra realización, el método comprende un método para introducir un polinucleótido de interés en un sitio diana en el genoma de una célula, comprendiendo el método: a) proporcionar un polinucleótido guía, un ADN donante y una endonucleasa Cas a una célula, en donde dicho polinucleótido guía comprende ADN, en donde, preferentemente, el polinucleótido guía es una secuencia de ADN o una secuencia de combinación de ARN-ADN, en donde dichos polinucleótido guía y endonucleasa Cas son capaces de formar un complejo que permite a la endonucleasa Cas introducir una rotura bicatenaria en dicho sitio diana; b) poner en contacto la célula de (a) con un ADN donante que comprende un polinucleótido de interés; y,
c) identificar al menos una célula de (b) que comprende en su genoma el polinucleótido de interés integrado en dicho sitio diana, en donde preferentemente, el ADN donante y la endonucleasa Cas se introducen en dicha célula usando al menos una construcción de ADN recombinante capaz de expresar el ADN donante y/o la endonucleasa Cas.
En otra realización, el método comprende un método para modificar un sitio diana en el genoma de una célula, comprendiendo el método: a) proporcionar a una célula un nucleótido cr, una primera construcción de ADN recombinante capaz de expresar un ARNtracr y un segundo ADN recombinante capaz de expresar una endonucleasa Cas, en donde dicho nucleótido cr es una secuencia de desoxirribonucleótido o una combinación de una secuencia de desoxirribonucleótido y ribonucleótido, en donde dicho nucleótido cr, dicho ARNtracr y dicha endonucleasa Cas son capaces de formar un complejo que permite a la endonucleasa Cas introducir una rotura bicatenaria en dicho sitio diana; y b) identificar al menos una célula que tiene una modificación en dicho sitio diana, en donde la modificación se selecciona entre el grupo que consiste en (i) un reemplazo de al menos un nucleótido, (ii) una eliminación de al menos un nucleótido, (iii) una inserción de al menos un nucleótido y (iv) cualquier combinación de (i) -(iii).
En otra realización, el método comprende un método para modificar un sitio diana en el genoma de una célula, comprendiendo el método: a) proporcionar a una célula un nucleótido tracr, una primera construcción de ADN recombinante capaz de expresar un ARNcr y un segundo ADN recombinante capaz de expresar una endonucleasa Cas, en donde dicho nucleótido tracr se selecciona entre una secuencia de desoxirribonucleótido o una combinación de una secuencia de desoxirribonucleótido y ribonucleótido, en donde dicho nucleótido tracr, dicho ARNcr y dicha endonucleasa Cas son capaces de formar un complejo que permite a la endonucleasa Cas introducir una rotura bicatenaria en dicho sitio diana; y b) identificar al menos una célula que tiene una modificación en dicho sitio diana, en donde la modificación se selecciona entre el grupo que consiste en (i) un reemplazo de al menos un nucleótido, (ii) una eliminación de al menos un nucleótido, (iii) una inserción de al menos un nucleótido y (iv) cualquier combinación de (i) -(iii).
En otra realización, el método comprende un método para introducir un polinucleótido de interés en un sitio diana en el genoma de una célula, comprendiendo el método: a) introducir en una célula una primera construcción de ADN recombinante capaz de expresar un polinucleótido guía y una segunda construcción de ADN recombinante capaz de expresar una endonucleasa Cas, en donde dicho polinucleótido guía comprende ADN, en donde, preferentemente, el polinucleótido guía es una secuencia de ADN o una secuencia de combinación de ARN-ADN, en donde dichos polinucleótido guía y endonucleasa Cas son capaces de formar un complejo que permite a la endonucleasa Cas introducir una rotura bicatenaria en dicho sitio diana; b) poner en contacto la célula de (a) con un ADN donante que comprende un polinucleótido de interés; y c) identificar al menos una célula de (b) que comprende en su genoma el polinucleótido de interés integrado en dicho sitio diana.
En otra realización, el método comprende un método para editar una secuencia de nucleótidos en el genoma de una célula, comprendiendo el método introducir un polinucleótido guía, un molde de modificación de polinucleótido y al menos una endonucleasa Cas en una célula, en donde dicho polinucleótido guía comprende ADN, en donde, preferentemente, el polinucleótido guía es una secuencia de ADN o una secuencia de combinación de ARN-ADN, en donde la endonucleasa Cas introduce una rotura bicatenaria en un sitio diana en el genoma de dicha célula, en donde dicho molde de modificación de polinucleótido comprende al menos una modificación de nucleótidos de dicha secuencia de nucleótidos.
En otra realización, la composición comprende una planta o semilla que comprende un polinucleótido guía y una endonucleasa Cas9, en donde dicho polinucleótido guía comprende ADN, en donde, preferentemente, el polinucleótido guía es una secuencia de ADN o una secuencia de combinación de ARN-ADN, en donde dicha endonucleasa Cas9 y el polinucleótido guía son capaces de formar un complejo y crear una rotura bicatenaria en un sitio diana genómico de dicha planta.
En otra realización, la composición comprende una planta o semilla que comprende una construcción de ADN recombinante y un polinucleótido guía, en donde dicho polinucleótido guía comprende ADN, en donde, preferentemente, el polinucleótido guía es una secuencia de ADN o una secuencia de combinación de ARN-ADN, en donde dicha construcción de ADN recombinante comprende un promotor unido operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica una endonucleasa Cas optimizada para plantas, en donde dicha endonucleasa Cas optimizada para plantas y el polinucleótido guía son capaces de formar un complejo y crear una rotura bicatenaria en un sitio diana genómico de dicha planta.
En el presente documento también se divulga un método para seleccionar una planta que comprende un sitio diana alterado en su genoma vegetal, comprendiendo el método: a) obtener una primera planta que comprende al menos una endonucleasa Cas capaz de introducir una rotura bicatenaria en un sitio diana en el genoma vegetal; b) obtener una segunda planta que comprende un polinucleótido guía que es capaz de formar un complejo con la endonucleasa Cas de (a), en donde el polinucleótido guía no comprende únicamente ácidos ribonucleicos, c) cruzar la primera planta de (a) con la segunda planta de (b); d) evaluar la descendencia de (c) respecto de una alteración en el sitio diana y e) seleccionar una planta descendiente que posee la alteración deseada de dicho sitio diana.
A continuación se describen realizaciones adicionales de los métodos y composiciones de la presente divulgación.
Breve descripción de los dibujos y el listado de secuencias
La divulgación puede entenderse más completamente a partir de la siguiente descripción detallada y los dibujos adjuntos y el listado de secuencias, que forman parte de la presente solicitud. Las descripciones de secuencia contienen los códigos de tres letras para los aminoácidos
Figuras
La figura 1A muestra un polinucleótido guía dúplex que contiene una doble molécula que comprende un primer dominio de secuencia de nucleótidos (citado como dominio de direccionamiento variable o dominio VT (de Variable Targeting domain)) que es complementario a una secuencia de nucleótidos en un ADN diana y un segundo dominio de secuencia de nucleótidos (citado como dominio de reconocimiento de endonucleasa Cas o dominio CER (de Cas Endonuclease Recognition) que interactúa con un polipéptido de endonucleasa Cas. El dominio CER del polinucleótido guía dúplex comprende dos moléculas separadas que se hibridan junto con una región de complementariedad. Las dos moléculas separadas pueden ser ARN, ADN y/o secuencias de combinación de ARN-ADN. La primera molécula del polinucleótido guía dúplex que comprende un dominio VT unido a un dominio CER (mostrado como nucleótido cr) se cita como "ADNcr" (cuando está compuesto de una serie contigua de nucleótidos de ADN) o "ARNcr" (cuando está compuesto de una serie contigua de nucleótidos de ARN) o "ADNcr-ARN (cuando está compuesto de una combinación de nucleótidos de ADN y ARN). La segunda molécula del polinucleótido guía dúplex que comprende un dominio CER (mostrado como nucleótido tracr) se cita como "ARNtracr" (cuando está compuesto de una serie contigua de nucleótidos de ARN) o "ADNtracr" (cuando está compuesto de una serie contigua de nucleótidos de ADN) o "ADNtracr-ARN (cuando está compuesto de una combinación de nucleótidos de ADN y ARN).
La figura 1B muestra un polinucleótido guía sencillo que comprende un primer dominio de secuencia de nucleótidos (citado como dominio de direccionamiento variable o dominio VT (de Variable Targeting domain)) que es complementario a una secuencia de nucleótidos en un ADN diana y un segundo dominio de nucleótidos (citado como dominio de reconocimiento de endonucleasa Cas o dominio CER (de Cas Endonuclease Recognition) que interactúa con un polipéptido de endonucleasa Cas. Por "dominio" se entiende una serie contigua de nucleótidos que pueden ser ARN, ADN y/o secuencias de combinación de ARN-ADN. El polinucleótido guía individual comprende un nucleótido cr (que comprende un dominio VT unido a un dominio CER) unido a un nucleótido tracr (que comprende un dominio CER) con una secuencia de nucleótido enlazadora (mostrada como un bucle). El polinucleótido guía individual que está formado por secuencias del nucleótido cr y el nucleótido tracr puede citarse como "ARN guía individual" (cuando está compuesto de una serie contigua de nucleótidos de ARN) o "ADN guía individual" (cuando está compuesto de una serie contigua de nucleótidos de ADN) o "ARN-ADN guía individual" (cuando está compuesto por una combinación de nucleótidos de ARN y ADN).
La figura 2A-2C muestra casetes de expresión para la expresión de Cas9, ARNcr y ARNtracr. La figura 2A muestra un gen de Cas9 de maíz con codones optimizados (que codifica una endonucleasa Cas9) que contiene un intrón de ST-LS1 de patata, una secuencia de localización nuclear amino-terminal de SV40 (SV40 NLS) y una NLS carboxilo-terminal de VirD2 (VirD2 NLS), unida operativamente a un promotor de ubiquitina de planta (UBI Pro) (SEQ ID NO: 5). El gen de Cas9 optimizado de maíz (solo la secuencia codificante de Cas9, sin NLS) corresponde a las posiciones de nucleótidos 2037-2411 y 2601-6329 de la SEQ ID NO: 5, residiendo el intrón de patata en las posiciones 2412-2600 de la SEQ ID NO: 5. SV40 NLS se encuentra en las posiciones 2010-2036 de la SEQ ID NO: 5. VirD2 NLS se encuentra en las posiciones 6330-6386 de la SEQ ID NO: 5. La figura 2B muestra un promotor de U6 polimerasa III de maíz unido operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica una molécula de ARNcr unida operativamente a un terminador U6 de maíz. El casete de expresión de ARNcr optimizado de maíz resultante se lista en la SEQ ID NO: 8. La figura 2C muestra un promotor de U6 polimerasa III de maíz unido operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica una molécula de ARNtracr unida operativamente a un terminador U6 Pol III de maíz. El casete de expresión de ARNtracr optimizado de maíz resultante se lista en la SEQ ID NO: 9.
La figura 3A muestra un complejo de sistema de ARN guía dúplex/endonucleasa Cas9 y ADN diana relativo a la secuencia de PAM adecuadamente orientada (AGG) en la secuencia diana de LIGCas-3 de maíz (SEQ ID NO: 14, tabla 1). El ARN guía dúplex (fondos gris más claros) comprende una molécula de ARNcr (SEQ ID NO: 10) que contiene un dominio variable de direccionamiento (dominio VT) emparejado por bases a la hebra complementaria de la secuencia diana de LIGCas-3 y una molécula de ARNtracr (SEQ ID NO: 11) que comprende parte del dominio
CER. La endonucleasa Cas9 se representa en color gris oscuro. Los triángulos apuntan hacia el sitio de escisión de ADN esperado tanto en las hebras de ADN tanto con sentido como antisentido. La figura 3B muestra un complejo de ARN guía individual/endonucleasa Cas9 que interactúa con el sitio diana genómico de LIGCas-3 en relación con la secuencia de PAM adecuadamente orientada (AGG) en el sitio diana de LIGCas-3 genómico de maíz (SEQ ID NO: 14, tabla 1). El ARN guía individual (fondo gris claro, SEQ ID NO: 96) es una fusión entre un ARNcr y ARNtracr y comprende un dominio de direccionamiento variable que es complementario a una hebra de
ADN del sitio genómico de ADN bicatenario. La endonucleasa Cas9 se muestra en color gris oscuro. Los triángulos apuntan hacia el sitio de escisión de ADN esperado tanto en las hebras de ADN tanto con sentido como antisentido.
Las figuras 4A-4C muestran un alineamiento y recuento de las 10 principales mutaciones más frecuentes de NHEJ inducidas por el sistema de ARN guía/endonucleasa Cas optimizado para maíz descrito en el presente documento en el locus genómico de maíz de Liguleless 1. Las mutaciones se identificaron mediante secuenciación profunda.
También se indican la secuencia de PAM y el sitio de escisión esperado. Las eliminaciones o inserciones como resultado de una NHEJ imperfecta se muestran mediante un "-" o un nucleótido subrayado en fuente cursiva, respectivamente. En la figura 4A, la secuencia de referencia (SEQ ID NO: 23) representa el locus de LIGCas-1 no modificado con el sitio diana subrayado. Las secuencias que comprenden las mutaciones 1-10 del sitio diana de LIGCas-1 corresponden a las SEQ ID NO: 24-33, respectivamente. En la figura 4B, la secuencia de referencia
(SEQ ID NO: 23) representa el locus de LIGCas-2 no modificado con el sitio diana subrayado. Las secuencias que comprenden las mutaciones 1-10 del sitio diana de LIGCas-2 corresponden a las SEQ ID NO: 34-43, respectivamente. En la figura 4C, la secuencia de referencia (SEQ ID NO: 44) representa el locus de LIGCas-3 no modificado con el sitio diana subrayado. Las secuencias que comprenden las mutaciones 1-10 del sitio diana de LIGCas-3 corresponden a las SEQ ID NO: 45-54, respectivamente.
La figura 5 muestra un complejo de sistema de polinucleótido guía dúplex/endonucleasa Cas9 y ADN diana en relación con la secuencia de PAM orientada de manera adecuada en la secuencia diana de LIGCas-3 de maíz
(SEQ ID NO: 14, tabla 1). El ARN guía dúplex (fondos gris más claros) comprende una molécula de ARNtracr (SEQ
ID NO: 55) que contiene un dominio variable de direccionamiento (dominio VT) emparejado por bases a la hebra complementaria de la secuencia diana de LIGCas-3 y una molécula de ARNtracr (SEQ ID NO: 11) que comprende parte del dominio CER. La endonucleasa Cas9 se muestra en color gris oscuro. Los triángulos apuntan hacia el sitio de escisión de ADN esperado tanto en las hebras de ADN tanto con sentido como antisentido.
Las figuras 6A-6B muestran alineamientos y recuentos de las 3 principales mutaciones más frecuentes de NHEJ inducidas o bien por un sistema de ARN guía dúplex/endonucleasa Cas optimizado para maíz (figura 6A) o por un sistema de polinucleótido guía dúplex/endonucleasa Cas optimizado para maíz (figura 6B) descrito en el presente documento en el locus genómico de Liguleless 1 de maíz. Las mutaciones se identificaron mediante secuenciación profunda. También se indican la secuencia de PAM y el sitio de escisión esperado. Las eliminaciones o inserciones como resultado de una NHEJ imperfecta se muestran mediante un "-" o un nucleótido subrayado en fuente cursiva, respectivamente. En la figura 6A, las mutaciones de NHEJ se originaron de casetes de expresión de ARNcr sintético más ARNtracr y Cas9. La secuencia de referencia (SEQ ID NO: 44) representa el locus de LIGCas-3 no modificado con el sitio diana subrayado. Las secuencias que comprenden las mutaciones 1-3 del sitio diana de LIGCas-3 corresponden a las SEQ ID NO: 56-58, respectivamente. En la figura 6B, las mutaciones de NHEJ se originaron de casetes de expresión de ADNcr sintético más ARNtracr y Cas9. La secuencia de referencia (SEQ ID
NO: 44) representa el locus de LIGCas-3 no modificado con el sitio diana subrayado. Las secuencias que comprenden las mutaciones 1-3 del sitio diana de LIGCas-3 corresponden a las SEQ ID NO: 59-61, respectivamente.
La figura 7 ilustra la disrupción del gen ADE2 de levadura en el cromosoma 15 con la secuencia codificante de
URA3 y 305 pb de secuencia del gen ADE2 duplicado, que da como resultado la cepa de exploración de levadura ADE:URA3:DE2.
La figura 8 ilustra el esquema mediante el cual puede monitorizarse la actividad de escisión en la cepa de exploración de levadura ADE:URA3:DE2. En caso de que se escinda el sitio diana de URA3, pueden usarse las duplicaciones de secuencia de ADE2 que flanquean a la secuencia codificante de URA3 como molde para la reparación por recombinación de homólogos de la rotura bicatenaria de ADN. Como se ilustra por las líneas discontinuas que parten de las regiones de la duplicación de secuencia ADE2 en la configuración a DE:URA3:DE2 a la configuración ADE2, la reparación mediada por recombinación de homólogos de la rotura bicatenaria da como resultado la pérdida de la secuencia codificante del gen URA3 y la ganancia de un gen ADE2 funcional.
La figura 9 muestra la escala numérica y la sectorización en rojo/blanco correspondiente de las colonias de levadura usadas para cuantificar la actividad de escisión. Debido a que el fenotipo de sectorización es una medición cualitativa de la actividad de escisión, se implementó un sistema de puntuación numérica de 0-4. Una puntuación de 0 indica que no se observaron sectores blancos (sin corte); una puntuación de 4 indica colonias completamente blancas (corte completo del sitio de reconocimiento); las puntuaciones de 1-3 indican fenotipos de sectorización blanca intermedios (y grados intermedios de corte del sitio de reconocimiento).
Secuencias
es la secuencia de nucleótidos del gen de Cas9 de Streptococcus pyogenes M1 GAS (SF3 es la secuencia de nucleótidos del intrón ST-LS1 de patata.
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es la secuencia de aminoácidos del amino N-terminal de SV40.
La SEQ ID NO: 4 es la secuencia de aminoácidos del carboxilo terminal de la endonucleasa de borde de AD de VirD2 bipartito de Agrobacterium tumefaciens.
La SEQ ID NO: 5 es la secuencia de nucleótidos de un casete de expresión que expresa la Cas9 optimizada de maíz.
La SEQ ID NO: 6 es la secuencia de nucleótidos del promotor de U6 polimerasa III de maíz.
La SEQ ID NO: 7 es la secuencia de aminoácidos de la señal de localización nuclear de SV40.
La SEQ ID NO: 8 es la secuencia de nucleótidos de un casete de expresión de ARNcr optimizado de maíz que contiene el dominio de direccionamiento variable que se dirige a la secuencia diana de LIGCas-3.
La SEQ ID NO: 9 es la secuencia de nucleótidos de un casete de expresión de ARNtracr optimizado de maíz. La SEQ ID NO: 10 es la secuencia de nucleótidos de un ARNcr que contiene un dominio de direccionamiento variable que se dirige a la secuencia diana de LIGCas-3.
La SEQ ID NO: 11 es la secuencia de nucleótidos del ARNtracr de Streptococcus pyogenes M1 GAS (SF370). La SEQ ID NO: 12 es la secuencia de nucleótidos del sitio diana genómico de LIGCas-1 de maíz más la secuencia de PAM.
La SEQ ID NO: 13 es la secuencia de nucleótidos del sitio diana genómico de LIGCas-2 de maíz más la secuencia de PAM.
La SEQ ID NO: 14 es la secuencia de nucleótidos del sitio diana genómico de LIGCas-3 de maíz más la secuencia de PAM.
Las SEQ ID NO: 15-22 son secuencias de nucleótidos de cebadores de la PCR.
La SEQ ID NO: 23 es la secuencia de nucleótidos de la secuencia de referencia no modificada para el locus LIGCas-1 y LIGCas-2 (figura 4A-4B).
Las SEQ ID NO: 24-33 son las secuencias de nucleótidos de las mutaciones 1-10 para el locus LIGCas-1 (figura 4A).
Las SEQ ID NO: 34-43 son las secuencias de nucleótidos de las mutaciones 1-10 para el locus LIGCas-2 (figura 4B).
La SEQ ID NO: 44 es la secuencia de nucleótidos de la secuencia de referencia no modificada para LIGCas-3 (figura 4C).
Las SEQ ID NO: 45-54 son las secuencias de nucleótidos de las mutaciones 1-10 para el locus LIGCas-3 (figura 4C).
La SEQ ID NO: 55 es la secuencia de nucleótidos de un ADNcr (formado por ácidos desoxirribonucleicos) que contiene un dominio de direccionamiento variable que se dirige a la secuencia diana de LIGCas-3.
Las SEQ ID NO: 56-58 son las secuencias de nucleótidos de las mutaciones 1-3 para el locus de LIGCas-3 (que se origina a partir casetes de expresión de ARNcr sintético más ARNtracr y Cas9) (figura 6A).
Las SEQ ID NO: 59-61 son las secuencias de nucleótidos de las mutaciones 1-3 para el locus de LIGCas-3 (que se origina a partir casetes de expresión de ADNcr sintético más ARNtracr y Cas9) (figura 6B).
La SEQ ID NO: 62 es la secuencia de nucleótidos de un dominio de direccionamiento variable de un nucleótido cr (ARNcr) que no incluye ninguna modificación en su secuencia de ribonucleótidos.
La SEQ ID NO: 63 es la secuencia de nucleótidos de un CER de un nucleótido cr (ARNcr) que no incluye ninguna modificación en su secuencia de ribonucleótidos.
La SEQ ID NO: 64 es la secuencia de nucleótidos de un dominio de direccionamiento variable de un nucleótido cr (ARNcr), que incluye enlaces fosforotioato en el extremo 5' de su secuencia de nucleótidos (G*C*G*). En el listado de secuencias, el primer N en el extremo 5' representa un ribonucleótido de G con un enlace fosforotioato, el segundo N representa un ribonucleótido de C con un enlace fosforotioato y un tercer N representa un ribonucleótido de G con un enlace fosforotioato.
La SEQ ID NO: 65 es la secuencia de nucleótidos de un dominio CER de un nucleótido cr (ARNcr) que incluye enlaces fosforotioato próximo al extremo 3' de su secuencia de nucleótidos (U*U*U*). En el listado de secuencias, los N en las posiciones decimonovena, vigésima y vigesimoprimera representan ribonucleótidos de U con enlaces fosforotioato.
La SEQ ID NO: 66 es la secuencia de nucleótidos de un dominio de direccionamiento variable de un nucleótido cr (ARNcr) que incluye nucleótidos de 2'-O-metil ARN en su extremo 5' (mGmCmG). En el listado de secuencias, el primer N en el extremo 5' representa un ribonucleótido de 2'-O-metil G, el segundo N representa un ribonucleótido de 2'-O-metil C y el tercer N representa un ribonucleótido de 2'-O-metil G.
La SEQ ID NO: 67 es la secuencia de nucleótidos de un dominio CER de un nucleótido cr (ARNcr) que incluye nucleótidos de 2'-O-metil ARN próximos al extremo 3' de su secuencia de nucleótidos (mUmUmG). En el listado de secuencias, el N en la vigésima posición representa un ribonucleótido de 2'-O-metil U, el N en la vigesimoprimera posición representa un ribonucleótido de 2'-O-metil U y el N en la vigesimosegunda posición representa un ribonucleótido de 2'-O-metil G.
La SEQ ID NO: 68 es la secuencia de nucleótidos de un dominio de direccionamiento variable de un nucleótido cr (ARNcr) que incluye nucleótidos de 2'-O-metil ARN para cada nucleótido. En el listado de secuencias, el primer N en el extremo 5' representa un ribonucleótido de 2'-O-metil G, un N en la segunda posición representa un ribonucleótido de 2'-O-metil C, un N en la tercera posición representa un ribonucleótido de 2'-O-metil G, un N en la cuarta posición representa un ribonucleótido de 2'-O-metil U, un N en la quinta posición representa un ribonucleótido de 2'-O-metil A, un N en la sexta posición representa un ribonucleótido de 2'-O-metil C, un N en la séptima posición representa un ribonucleótido de 2'-O-metil G, un N en la octava posición representa un ribonucleótido de 2'-O-metil C, un N en la novena posición representa un ribonucleótido de 2'-O-metil G, un N en la décima posición representa un ribonucleótido de 2'-O-metil U, un N en la undécima posición representa un ribonucleótido de 2'-O-metil A, un N en la duodécima posición representa un ribonucleótido de 2'-O-metil C, un N en la decimotercera posición representa un ribonucleótido de 2'-O-metil G, un N en la decimocuarta posición representa un ribonucleótido de 2'-O-metil U, un N en la decimoquinta posición representa un ribonucleótido de 2'-O-metil G, un N en la decimosexta posición representa un ribonucleótido de 2-O-metil U y un N en la decimoséptima posición representa un ribonucleótido de 2-O-metil G.
La SEQ ID NO: 69 es la secuencia de nucleótidos de un dominio CER de un nucleótido cr (ARNcr) que incluye nucleótidos de 2'-O-metil ARN para cada nucleótido. En el listado de secuencias, el primer N en el extremo 5' representa un ribonucleótido de 2'-O-metil G, un N en la segunda posición representa un ribonucleótido de 2-O-metil U, un N en la tercera posición representa un ribonucleótido de 2'-O-metil U, un N en la cuarta posición representa un ribonucleótido de 2'-O-metil U, un N en la quinta posición representa un ribonucleótido de 2'-O-metil U, un N en la sexta posición representa un ribonucleótido de 2'-O-metil A, un N en la séptima posición representa un ribonucleótido de 2'-O-metil G, un N en la octava posición representa un ribonucleótido de 2'-O-metil A, un N en la novena posición representa un ribonucleótido de 2'-O-metil G, un N en la décima posición representa un ribonucleótido de 2'-O-metil C, un N en la undécima posición representa un ribonucleótido de 2'-O-metil U, un N en la duodécima posición representa un ribonucleótido de 2'-O-metil A, un N en la decimotercera posición representa un ribonucleótido de 2'-O-metil U, un N en la decimocuarta posición representa un ribonucleótido de 2'-O-metil G, un N en la decimoquinta posición representa un ribonucleótido de 2'-O-metil C, un N en la decimosexta posición representa un ribonucleótido de 2'-O-metil U, un N en la decimoséptima posición representa un ribonucleótido de 2'-O-metil G, un N en la decimoctava posición representa un ribonucleótido de 2'-O-metil U, un N en la decimonovena posición representa un ribonucleótido de 2'-O-metil U, un N en la vigésima posición representa un ribonucleótido de 2'-O-metil U, un N en la vigesimoprimera posición representa un ribonucleótido de 2'-O-metil U y un N en la vigesimosegunda posición representa un ribonucleótido de 2'-O-metil G.
La SEQ ID NO: 70 es la secuencia de nucleótidos de un dominio de direccionamiento variable de un nucleótido cr (ADNcr) que no incluye ninguna modificación en su secuencia de desoxirribonucleótidos.
La SEQ ID NO: 71 es la secuencia de nucleótidos de un CER de un nucleótido cr (ADNcr) que no incluye ninguna modificación en su secuencia de desoxirribonucleótidos.
La SEQ ID NO: 72 es la secuencia de nucleótidos de un dominio de direccionamiento variable de un nucleótido cr (ADNcr), que incluye un nucleótido de ácido nucleico bloqueado (+T) en su secuencia de nucleótidos. En el listado de secuencias, un N en la decimosexta posición representa una base de ácido nucleico bloqueado de T.
La SEQ ID NO: 73 es la secuencia de nucleótidos de un dominio de direccionamiento variable de un nucleótido cr (ADNcr), que incluye tres nucleótidos de ácido nucleico bloqueado (+C, T, T) en su secuencia de nucleótidos. En el listado de secuencias, un N en la decimosegunda posición representa una base de ácido nucleico bloqueado de C, un N en la decimocuarta posición representa una base de ácido nucleico bloqueado de T y un N en la decimosexta posición representa una base de ácido nucleico bloqueado de T.
La SEQ ID NO: 74 es la secuencia de nucleótidos de un dominio de direccionamiento variable de un nucleótido cr (ADNcr), que incluye seis nucleótidos de ácido nucleico bloqueado (+C, C,+T,+C,+T,+T) en su secuencia de nucleótidos. En el listado de secuencias, un N en la sexta posición representa una base de ácido nucleico bloqueado de C, un N en la octava posición representa una base de ácido nucleico bloqueado de C, un N en la décima posición representa una base de ácido nucleico bloqueado de T, un N en la decimosegunda posición representa una base de ácido nucleico bloqueado de C, un N en la decimocuarta posición representa una base de ácido nucleico bloqueado de T y un N en la decimosexta posición representa una base de ácido nucleico bloqueado de T.
La SEQ ID NO: 75 es la secuencia de nucleótidos de un dominio de direccionamiento variable de un nucleótido cr (ADNcr), que incluye tres nucleótidos de ácido nucleico bloqueado (+C, T, T) en su secuencia de nucleótidos y enlaces fosforotioato próximos al extremo 5' de su secuencia de nucleótidos (G*C*G*) En el listado de secuencias, un primer N en el extremo 5' representa un desoxirribonucleótido de G con un enlace fosforotioato, un N en la segunda posición representa un desoxirribonucleótido de C con un enlace fosforotioato, un N en la tercera posición representa un desoxirribonucleótido de G con un enlace fosforotioato, un N en la decimosegunda posición representa una base de ácido nucleico bloqueado de C, un N en la decimocuarta posición representa una base de ácido nucleico bloqueado de T y un N en la decimosexta posición representa una base de ácido nucleico bloqueado de T.
La SEQ ID NO: 76 es la secuencia de nucleótidos de un dominio CER de un nucleótido cr (ADNcr) que incluye tres nucleótidos de ácido nucleico bloqueado (T*T*T) próximos al extremo 3' de la secuencia de nucleótidos. En el listado de secuencias, los N en las posiciones decimonovena, vigésima y vigesimoprimera representan desoxirribonucleótidos de T con enlaces fosforotioato. La SEQ ID NO: 77 es la secuencia de nucleótidos de un dominio de direccionamiento variable de un nucleótido cr (ADNcr) que incluye un nucleótido de 5-metil dC en su secuencia de nucleótidos. En el listado de secuencias, un N en la decimosegunda posición representa un desoxirribonucleótido de 5-metil dC.
La SEQ ID NO: 78 es la secuencia de nucleótidos de un dominio de direccionamiento variable de un nucleótido cr (ADNcr) que incluye tres nucleótidos de 5-metil dC en su secuencia de nucleótidos. En el listado de secuencias, los N en las posiciones sexta, octava y duodécima representan desoxirribonucleótidos de 5-metil dC.
La SEQ ID NO: 79 es la secuencia de nucleótidos de un dominio de direccionamiento variable de un nucleótido cr (ADNcr) que incluye un nucleótido de 2,6-diaminopurina en su secuencia de nucleótidos. En el listado de secuencias, un N en la undécima posición representa un desoxirribonucleótido de 2,6-diaminopurina.
La SEQ ID NO: 80 es la secuencia de nucleótidos de un dominio de direccionamiento variable de un nucleótido cr (ADNcr) que incluye dos nucleótidos de 2,6-diaminopurina en su secuencia de nucleótidos. En el listado de secuencias, los N en las posiciones quinta y undécima representan desoxirribonucleótidos de 2,6-diaminopurina. La SEQ ID NO: 81 es la secuencia de nucleótidos de un dominio de direccionamiento variable de un nucleótido cr (ADNcr) que incluye nucleótidos de ácido nucleico bloqueado próximos al extremo 5' de su secuencia de nucleótidos. En el listado de secuencias, el primer N en el extremo 5' representa una base de ácido nucleico bloqueado de G, el segundo N representa una base de ácido nucleico bloqueado de C y el tercer N representa una base de ácido nucleico bloqueado de G.
La SEQ ID NO: 82 es la secuencia de nucleótidos de un dominio CER de un nucleótido cr (ADNcr) que incluye nucleótidos de ácido nucleico bloqueado próximos al extremo 3' de la secuencia de nucleótidos. En el listado de secuencias, un N en la vigésima posición representa una base de ácido nucleico bloqueado de T, un N en la vigesimoprimera posición representa una base de ácido nucleico bloqueado de T y un N en la vigesimosegunda posición representa una base de ácido nucleico bloqueado de G.
La SEQ ID NO: 83 es la secuencia de nucleótidos de un dominio de direccionamiento variable de un nucleótido cr (ADNcr) que incluye enlaces fosforotioato próximos al extremo 5' de su secuencia de nucleótidos. En el listado de secuencias, un primer N en el extremo 5' representa un desoxirribonucleótido de G con un enlace fosforotioato, un segundo N representa un desoxirribonucleótido de C con un enlace fosforotioato y un tercer N representa un desoxirribonucleótido de G con un enlace fosforotioato.
La SEQ ID NO: 84 es la secuencia de nucleótidos de un dominio de direccionamiento variable de un nucleótido cr (ADNcr) que incluye nucleótidos de 2'-O-metil ARN próximos al extremo 5' de su secuencia de nucleótidos. En el listado de secuencias, un primer N en el extremo 5' representa un ribonucleótido de 2'-O-metil G, un segundo N representa un ribonucleótido de 2'-O-metil C y un tercer N representa un ribonucleótido de 2'-O-metil G.
La SEQ ID NO: 85 es la secuencia de nucleótidos de un dominio CER de un nucleótido cr (ADNcr) que incluye nucleótidos de 2'-O-metil ARN próximos al extremo 3' de la secuencia de nucleótidos. En el listado de secuencias, un N en la vigésima posición representa un ribonucleótido de 2'-O-metil U, un N en la vigesimoprimera posición representa un ribonucleótido de 2'-O-metil U y un N en la vigesimosegunda posición representa un ribonucleótido de 2'-O-metil G.
La SEQ ID NO: 86 es la secuencia de nucleótidos de un dominio de direccionamiento variable de un nucleótido cr (ADNcr) que incluye nucleótidos de 2'-O-metil ARN en cada nucleótido, excepto T de su secuencia de nucleótidos. En el listado de secuencias, un primer N en el extremo 5' representa un ribonucleótido de 2'-O-metil G, un N en la segunda posición representa un ribonucleótido de 2'-O-metil C, un N en la tercera posición representa un ribonucleótido de 2'-O-metil G, un N en la quinta posición representa un ribonucleótido de 2'-O-metil A, un N en la sexta posición representa un ribonucleótido de 2'-O-metil C, un N en la séptima posición representa un ribonucleótido de 2'-O-metil G, un N en la octava posición representa un ribonucleótido de 2'-O-metil C, un N en la novena posición representa un ribonucleótido de 2'-O-metil G, un N en la undécima posición representa un ribonucleótido de 2'-O-metil A, un N en la duodécima posición representa un ribonucleótido de 2'-O-metil C, un N en la decimotercera posición representa un ribonucleótido de 2'-O-metil G, un N en la decimoquinta posición representa un ribonucleótido de 2'-O-metil G y un N en la decimoséptima posición representa un ribonucleótido de 2'-O-metil G.
La SEQ ID NO: 87 es la secuencia de nucleótidos de un dominio CER de un nucleótido cr (ADNcr) que incluye nucleótidos de 2'-O-metil ARN en cada nucleótido, excepto T de la secuencia de nucleótidos. En el listado de secuencias, un primer N en el extremo 5' representa un ribonucleótido de 2'-O-metil G, un N en la sexta posición representa un ribonucleótido de 2'-O-metil A, un N en la séptima posición representa un ribonucleótido de 2'-O-metil G, un N en la octava posición representa un ribonucleótido de 2'-O-metil A, un N en la novena posición representa un ribonucleótido de 2'-O-metil G, un N en la décima posición representa un ribonucleótido de 2'-O-metil C, un N en la duodécima posición representa un ribonucleótido de 2'-O-metil A, un N en la decimocuarta posición representa un ribonucleótido de 2'-O-metil G, un N en la decimoquinta posición representa un ribonucleótido de 2'-O-metil C, un N en la decimoséptima posición representa un ribonucleótido de 2'-O-metil G y un N en la vigesimosegunda posición representa un ribonucleótido de 2'-O-metil G.
La SEQ ID NO: 88 es la secuencia de nucleótidos de la Cas9 con codones optimizados de Saccharomyces cerevisiae.
La SEQ ID NO: 89 es la secuencia de nucleótidos del promotor de T7 del bacteriófago T7.
La SEQ ID NO: 90 es la secuencia de nucleótidos de la secuencia diana ADE:URA3:DE2 (sin incluir la secuencia de PAM). Las SEQ ID NO: 91-95 son las secuencias de nucleótidos de endonucleasas Cas9.
La SEQ ID NO: 96 es la secuencia de nucleótidos de un ARN guía individual que se dirige a la secuencia diana de LIGCas-3 (figura 3B).
Descripción detallada
La presente divulgación incluye composiciones y métodos para la modificación genómica de una secuencia diana en el genoma de una célula. Los métodos y composiciones emplean un sistema de polinucleótido guía/endonucleasa Cas para proporcionar un sistema eficaz para modificar sitios diana en el genoma de una célula. Las células incluyen, pero sin limitación, células animales, bacterianas, fúngicas, de insecto, de levadura y vegetales, así como plantas y semillas producidas mediante los métodos descritos en el presente documento. Una vez que se ha identificado una diana genómica, pueden emplearse una variedad de métodos para modificar adicionalmente los sitios diana, de tal forma que contiene una variedad de polinucleótidos de interés. También se divulgan métodos de fitomejoramiento que utilizan un sistema de polinucleótido guía/endonucleasa Cas. También se divulgan composiciones y métodos para editar una secuencia de nucleótidos en el genoma de una célula. La secuencia de nucleótidos que se va a editar (la secuencia de nucleótidos de interés) puede localizarse dentro o fuera de un sitio diana que se reconoce por una endonucleasa Cas.
Los locus de CRISPR (del inglés, Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas) (también conocidos como SPIDR, del inglés, SPacer Interspersed Direct Repeats, repeticiones directas intercaladas por espaciador) constituyen una familia de locus de ADN recientemente descrita. Los locus de CRISPR consisten en repeticiones de ADN cortas y altamente conservadas (normalmente de 24 a 40 pb, repetidas de 1 a 140 veces, también denominadas repeticiones de CRISPR) que son parcialmente palindrómicas. Las secuencias repetidas (normalmente específicas para una especie) están interespaciadas por secuencias variables de longitud constante (normalmente de 20 a 58, dependiendo del locus de CRISPR (documento WO2007/025097 publicado el 1 de marzo de 2007)).
Los locus de CRISPR se reconocieron inicialmente en E. coli (Ishino et al. (1987) J. Bacterial. 169:5429-5433; Nakata et al. (1989) J. Bacterial. 171:3553-3556). Se han identificado secuencias cortas interespaciadas similares en Haloferax mediterranei, Streptococcus pyogenes, Anabaena y Mycobacterium tuberculosis (Groenen et al. (1993) Mol. Microbiol. 10:1057-1065; Hoe et al. (1999) Emerg. Infect. Dis. 5:254-263; Masepohl et al. (1996) Biochim. Biophys. Acta 1307:26-30; Mojica et al. (1995) Mol. Microbiol. 17:85-93). Los locus de CRISPR difieren de otras SSR en la estructura de las repeticiones, que se han denominado repeticiones cortas regularmente espaciadas (SRSR) (Janssen et al. (2002) OMICS J. Integ. Biol. 6:23-33; Mojica et al. (2000) Mol. Microbiol. 36:244-246). Las repeticiones son elementos cortos que se producen en agrupaciones, que siempre están espaciadas regularmente por secuencias variables de longitud constante (Mojica et al. (2000) Mol. Microbiol. 36:244-246).
El gen Cas incluye un gen que está generalmente acoplado, asociado o próximo a o en la vecindad de locus de CRISPR flanqueantes. Las expresiones "gen Cas", "gen asociado con CRISPR (Cas)" se usan indistintamente en el presente documento. Se presenta una amplia revisión de la familia de proteínas Cas en Haft et al. (2005) Computational Biology, PLoS Comput Biol 1(6): e60. doi:10.1371/journal.pcbi.0010060. Como se describe en el presente documento, se han descrito 41 familias de genes asociados con CRISPR (Cas), además de las cuatro familias de genes anteriormente conocidas. Se muestra que los sistemas CRISPR pertenecen a diferentes clases, con diferentes patrones de repetición, conjuntos de genes e intervalos de especies. El número de genes Cas en un locus de CRISPR dado puede variar entre especies.
La endonucleasa Cas se refiere a una proteína Cas codificada por un gen de Cas, en donde dicha proteína Cas es capaz de introducir una rotura bicatenaria en una secuencia de ADN diana. La endonucleasa Cas desenrolla el dúplex de ADN en estrecha proximidad con el sitio diana genómico y escinde ambas hebras de ADN tras el reconocimiento de una secuencia diana mediante un polinucleótido guía, pero únicamente si el motivo adyacente protoespaciador (PAM) correcto está aproximadamente orientado en el extremo 3' de la secuencia diana (figura 3A, figura 3B).
En una realización, la endonucleasa Cas es una endonucleasa Cas9 que es capaz de introducir una rotura bicatenaria en un sitio diana de ADN, en donde se posibilita la escisión de ADN en una ubicación específica mediante a) complementariedad de emparejamiento de bases entre el sitio diana de ADN y el dominio de direccionamiento variable del polinucleótido guía y b) la presencia de un motivo protoespaciador adyacente (PAM) corto inmediatamente adyacente al sitio diana de ADN.
En una realización, el gen de endonucleasa Cas es una endonucleasa Cas9, tal como, pero sin limitación, los genes de Cas9 listados en las SEQ ID NO: 462, 474, 489, 494, 499, 505 y 518 del documento WO2007/025097 publicado el 1 de marzo de 2007. En otra realización, el gen de endonucleasa Cas es de una endonucleasa Cas9 optimizada para plantas, maíz o soja (figura 1A). En otra realización, el gen de endonucleasa Cas está unido operativamente a una señal de direccionamiento nuclear de SV40 cadena arriba de la región codónica de Cas y una señal de localización nuclear de VirD2 bipartita (Tinland et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7442-6) cadena debajo de la región codónica de Cas.
En una realización, el gen de endonucleasa Cas es un gen de endonucleasa Cas9 de SEQ ID NO: 1, 91, 92, 93, 94, 95 o los nucleótidos 2037-6329 de la SEQ ID NO: 5 o cualquier fragmento funcional o variante del mismo.
Las expresiones "fragmento funcional", "fragmento que es funcionalmente equivalente" y "fragmento funcionalmente equivalente" se usan indistintamente en el presente documento. Estos términos se refieren a una porción o subsecuencia de una secuencia de endonucleasa Cas en la que se conserva la capacidad para crear una rotura bicatenaria.
Las expresiones "variante funcional", "variante que es funcionalmente equivalente" y "variante funcionalmente equivalente" se usan indistintamente en el presente documento. Estos términos se refieren a una variante de la endonucleasa Cas en la que se conserva la capacidad para crear una rotura bicatenaria. Los fragmentos y variantes pueden obtenerse mediante métodos, tales como mutagénesis de sitio dirigido y construcción sintética.
En una realización, el gen de endonucleasa Cas es un gen de Cas9 de Streptococcus pyogenes optimizado para codones de plantas que puede reconocer cualquier secuencia genómica de la forma N(12-30)NGG que en principio pueda usarse como diana.
Las endonucleasas son enzimas que escinden el enlace fosfodiéster en una cadena de polinucleótido e incluye endonucleasas de restricción que escinden el ADN en sitios específicos sin dañar las bases. Las endonucleasas de restricción incluyen endonucleasas de tipo I, tipo II, tipo III y tipo IV, que incluyen adicionalmente subtipos. En los sistemas de tipo I y tipo III, las actividades metilasa y de restricción están contenidas en un solo complejo. Las endonucleasas también incluyen meganucleasas, también conocidas como endonucleasas de asentamiento (HEasas), que al igual que las endonucleasas de restricción, se unen a y cortan en un sitio de reconocimiento específico, aunque los sitios de reconocimiento para las meganucleasas son normalmente más largos, aproximadamente 18 pb o más (solicitud de patente w O-PCT PCT/US12/30061, presentada el 22 de marzo de 2012). Las meganucleasas se han clasificado en cuatro familias basándose en los motivos de secuencia conservados (Belfort M y Perlman P S J. Biol. Chem. 1995;270:30237-30240). Estos motivos participan en la coordinación de iones metálicos y la hidrólisis de enlaces fosfodiéster. Las HEasas son notables por sus sitios de reconocimiento largos y por tolerar algunos polimorfismos de secuencia en sus sustratos de ADN. La convención de nomenclatura para las meganucleasas es similar a la convención para otra endonucleasa de restricción. Las meganucleasas también se caracterizan por el prefijo F-, I- o PI- para las enzimas codificadas por ORF independientes, intrones e inteínas, respectivamente. Una etapa en el proceso de recombinación implica la escisión de polinucleótidos en o próxima al sitio de reconocimiento. Esta actividad de escisión puede usarse para producir una rotura bicatenaria. Para revisiones de recombinasas de sitio específico y sus sitios de reconocimiento, véase, Sauer (1994) Curr Op Biotechnol 5:521-7; y Sadowski (1993) FASEB 7:760-7. En algunos ejemplos, la recombinasa es de las familias de integrasa o resolvasa.
Las nucleasas efectoras TAL son una nueva clase de nucleasas específicas de secuencia que pueden usarse para producir roturas bicatenarias en secuencias diana específicas en el genoma de una planta u otro organismo. (Miller et al. (2011) Nature Biotechnology 29:143-148). Las nucleasas de dedo de cinc (ZFN) incluyen agentes inductores de roturas bicatenarias formados por un dominio de unión a ADN de dedo de cinc y un dominio de agente inductor de rotura bicatenaria. La especificidad de sitio de reconocimiento está conferida por el dominio de dedo de cinc, que normalmente comprende dos, tres o cuatro dedos de cinc, por ejemplo, que tiene una estructura C2H2, aunque se conocen y se han diseñado otras estructuras de dedo de cinc. Los dominios de dedo de cinc son susceptibles para diseñar polipéptidos que se unen específicamente a una secuencia de reconocimiento de polinucleótido seleccionada. Los ZNF consisten en un dominio de dedo de cinc de unión a ADN diseñado unido a un dominio de endonucleasa no específico, por ejemplo, un dominio de nucleasa de una endonucleasa de tipo IIs, tal como FokI. Pueden fusionarse funcionalidades adicionales al dominio de unión a dedo de cinc, incluyendo dominios activadores transcripcionales, dominios represores de la transcripción y metilasas. En algunos ejemplos, se necesita la dimerización del dominio de nucleasa para la actividad de escisión. Cada dedo de cinc reconoce a tres pares de bases consecutivos en el ADN diana. Por ejemplo, se usa un dominio de 3 dedos reconocido por una secuencia de 9 nucleótidos contiguos, con un requerimiento de dimerización de la nucleasa, dos conjuntos de tripletes de dedos de cinc, para unirse a una secuencia de reconocimiento de 18 nucleótidos.
En una realización de la divulgación, la composición comprende una planta o semilla que comprende un polinucleótido guía y una endonucleasa Cas9, en donde dicho polinucleótido guía comprende ADN, en donde, preferentemente, el polinucleótido guía es una secuencia de ADN o una secuencia de combinación de ARN-ADN, en donde dicha endonucleasa Cas9 y el polinucleótido guía son capaces de formar un complejo y crear una rotura bicatenaria en un sitio diana genómico de dicha planta.
Las bacterias y arqueas han desarrollado evolutivamente defensas inmunitarias denominadas repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR, del inglés Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/sistemas asociados con CRISPR (Cas) que usan ARN corto para dirigir la degradación de ácidos nucleicos exógenos (documento WO2007/025097, publicado el 1 de marzo de 2007). El sistema CRISPR/Cas de tipo II de bacterias emplea un ARNcr y ARNtracr para guiar a la endonucleasa Cas a su diana de ADN. El ARNcr (ARN de CRISPR) contiene la región complementaria a una hebra de la diana de ADN bicatenario y forma emparejamientos de bases con el ARNtracr (ARN de CRISPR transactivador) que forma un dúplex de ARN que dirige a la endonucleasa Cas para escindir la diana de ADN.
Como se usa en el presente documento, la expresión "polinucleótido guía", se refiere a una secuencia de polinucleótido que puede formar un complejo con una endonucleasa Cas y permite a la endonucleasa Cas para reconocer y opcionalmente escindir un sitio diana de ADN. El polinucleótido guía puede ser una sola molécula o una doble molécula. La secuencia de polinucleótido guía puede ser una secuencia de ARN, una secuencia de ADN o una combinación de las mismas (una secuencia de combinación de ARN-ADN). Opcionalmente, el polinucleótido guía puede comprender al menos un nucleótido, enlace fosfodiéster o modificación de enlace, tal como, pero sin limitación, ácido nucleico bloqueado (LNA), 5-metil dC, 2,6-diaminopurina, 2'-fluoro A, 2'-fluoro U, 2'-O-metil ARN, enlace fosforotioato, enlace a una molécula de colesterol, enlace a una molécula de polietilenglicol, enlace a una molécula espaciadora 18 (cadena de hexaetilenglicol) o enlace covalente de 5' a 3' que da como resultado la circularización. En algunos aspectos de la presente divulgación, el polinucleótido guía no solo comprende ácidos ribonucleicos (ARN). Un polinucleótido guía que comprende únicamente ácidos ribonucleicos también se denomina un "ARN guía". Sin embargo, en realizaciones de la invención, el polinucleótido guía comprende ADN.
El polinucleótido guía puede ser una molécula doble (también citada como polinucleótido guía dúplex) que comprende un primer dominio de secuencia de nucleótidos (citado como dominio de direccionamiento variable o dominio VT (de Variable Targeting secuencia domain)) que es complementario a una secuencia de nucleótidos en un ADN diana y un
segundo dominio de secuencia de nucleótidos (citado como dominio de reconocimiento de endonucleasa Cas o
dominio CER (de Cas Endonuclease Recognition) que interactúa con un polipéptido de endonucleasa Cas (figura 1A).
El dominio CER del polinucleótido guía de molécula doble comprende dos moléculas separadas que se hibridan junto
con una región de complementariedad (figura 1A). Las dos moléculas separadas pueden ser ARN, ADN y/o secuencias
de combinación de ARN-ADN. En un aspecto de la presente divulgación, el polinucleótido guía dúplex no comprende
únicamente ácidos ribonucleicos (ARN), tal como se muestra en, por ejemplo, pero sin limitación, la figura 3A). En
realizaciones de la invención, el polinucleótido guía comprende ADN. En algunas realizaciones, la primera molécula
del polinucleótido guía dúplex que comprende un dominio VT unido a un dominio CER (mostrado como nucleótido cr
en la figura 1A) se cita como "ADNcr" (cuando está compuesto de una serie contigua de nucleótidos de ADN) o "ARNcr"
(cuando está compuesto de una serie contigua de nucleótidos de ARN) o "ADNcr-ARN (cuando está compuesto de
una combinación de nucleótidos de ADN y ARN). En algunas realizaciones, la segunda molécula del polinucleótido
guía dúplex que comprende un dominio CER (mostrado como nucleótido tracr en la figura 1A) se cita como "ARNtracr"
(cuando está compuesto de una serie contigua de nucleótidos de ARN) o "ADNtracr" (cuando está compuesto de una
serie contigua de nucleótidos de ADN) o "ADNtracr-ARN (cuando está compuesto de una combinación de nucleótidos
de ADN y ARN).
El polinucleótido guía individual también puede ser una sola molécula que comprende un primer dominio de secuencia
de nucleótidos (citado como dominio de direccionamiento variable o dominio VT) que es complementario a una
secuencia de nucleótidos en un ADN diana y un segundo dominio de nucleótidos (citado como dominio de
reconocimiento de endonucleasa Cas o dominio CER) que interactúa con un polipéptido de endonucleasa Cas (figura
1B). Por "dominio" se entiende una serie contigua de nucleótidos que pueden ser ARN, ADN y/o secuencia de
combinación de ARN-ADN. El dominio VT y/o el dominio CER de un polinucleótido guía individual puede comprender
una secuencia de ARN, una secuencia de ADN o una secuencia de combinación de ARN-ADN. En algunas
realizaciones, el polinucleótido guía individual comprende un nucleótido cr (que comprende un dominio VT unido a un
dominio CER) unido a un nucleótido tracr (que comprende un dominio CER), en donde el enlace es una secuencia de
nucleótidos que comprende una secuencia de ARN, una secuencia de ADN o una secuencia de combinación de ARN-ADN (figura 1B). El polinucleótido guía individual que está formado por secuencias del nucleótido cr y el nucleótido
tracr puede citarse como "ARN guía individual" (cuando está compuesto de una serie contigua de nucleótidos de ARN)
o "a Dn guía individual" (cuando está compuesto de una serie contigua de nucleótidos de ADN) o "ARN-ADN guía
individual" (cuando está compuesto por una combinación de nucleótidos de ARN y ADN). Sin embargo, en
realizaciones de la invención, el polinucleótido guía comprende ADN.
Una ventaja del uso de un polinucleótido guía individual frente a un polinucleótido guía dúplex es que solo se necesita
producir el casete de expresión para expresar el polinucleótido guía individual.
Las expresiones "dominio de direccionamiento variable" o "dominio VT" se usan indistintamente en el presente
documento y se refieren a una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una hebra (secuencia de
nucleótidos) de un sitio diana de ADN bicatenario. El % de complementación entre el primer dominio de secuencia de
nucleótidos (dominio VT) y la secuencia diana puede ser de al menos el 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 63 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %,
75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %,
93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %. El dominio de direccionamiento variable puede tener al menos
12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleótidos de longitud. En algunas
realizaciones, el dominio de direccionamiento variable comprende una serie contigua de 12 a 30 nucleótidos. El
dominio de direccionamiento variable puede estar formado por una secuencia de ADN, una secuencia de ARN, una
secuencia de ADN modificada, una secuencia de ARN modificada (véanse, por ejemplo, las modificaciones descritas
en el presente documento) o cualquier combinación de las mismas.
Las expresiones "dominio de reconocimiento de endonucleasa Cas" o "domino CER" de un polinucleótido guía se
usan indistintamente en el presente documento y se refieren a una secuencia de nucleótidos (tal como un segundo
dominio de secuencia de nucleótidos de un polinucleótido guía), que interactúa con un polipéptido de endonucleasa
Cas. El dominio CER puede estar formado por una secuencia de ADN, una secuencia de ARN, una secuencia de ADN
modificada, una secuencia de ARN modificada (véanse, por ejemplo, las modificaciones descritas en el presente
documento) o cualquier combinación de las mismas.
La secuencia de nucleótidos que enlaza el nucleótido cr y el nucleótido tracr del polinucleótido guía individual puede
comprender una secuencia de ARN, una secuencia de ADN o una secuencia de combinación de ARN-ADN. En una
realización, la secuencia de nucleótidos que une el nucleótido cr y el nucleótido tracr de un polinucleótido guía
individual puede tener al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 nucleótidos de longitud. En otra realización, la secuencia de nucleótidos
que enlaza el nucleótido cr y el nucleótido tracr del polinucleótido guía individual puede comprender una secuencia de
tetrabucle, tal como, pero sin limitación, una secuencia de tetrabucle de GAAA.
La modificación de la secuencia de nucleótidos del polinucleótido guía, el dominio VT y/o el dominio CER puede seleccionarse entre, pero sin limitación, el grupo que consiste en un remate 5', una cola poliadenilada 3', una secuencia de riboswitch, una secuencia de control de la estabilidad, una secuencia que forma un dúplex de ARNbc, una modificación o secuencia que dirige el polinucleótido guía a una ubicación subcelular, una modificación o secuencia que posibilita el seguimiento, una modificación o secuencia que proporciona un sitio de unión para proteínas, un ácido nucleico bloqueado (LNA), un nucleótido de 5-metil dC, un nucleótido de 2,6-diaminopurina, un nucleótido de 2'-fluoro A, un nucleótido de 2'-fluoro U; un nucleótido de 2'-O-metil ARN, un enlace fosforotioato, enlace a una molécula de colesterol, enlace a una molécula de polietilenglicol, enlace a una molécula espaciadora 18, un enlace covalente 5' a 3' o cualquier combinación de los mismos. Estas modificaciones pueden dar como resultado al menos una característica beneficiosa adicional, en donde la característica beneficiosa adicional se selecciona entre el grupo de una estabilidad modificada o regulada, un direccionamiento subcelular, seguimiento, un marcador fluorescente, un sitio de unión para una proteína o complejo de proteína, afinidad de unión modificada a una secuencia diana complementaria, resistencia modificada a la degradación celular y una permeabilidad celular aumentada.
En una realización de la divulgación, la composición comprende un polinucleótido guía que comprende: (i) un primer dominio de secuencia de nucleótidos (dominio VT) que es complementario a una secuencia de nucleótidos en un ADN diana; y, (ii) un segundo dominio de secuencia de nucleótidos (dominio CER) que interactúa con una endonucleasa Cas, en donde el primer dominio de secuencia de nucleótidos y el segundo dominio de secuencia de nucleótidos están compuestos por ácidos desoxirribonucleicos (ADN), ácidos ribonucleicos (ARN) o una combinación de los mismos, en donde el polinucleótido guía comprende ADN, en donde, preferentemente, el polinucleótido guía es una secuencia de ADN o una secuencia de combinación de ARN-ADN. El % de complementación entre el primer dominio de secuencia de nucleótidos (dominio de direccionamiento variable) y la secuencia diana puede ser de al menos el 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 63 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %.
En una realización de la divulgación, el primer dominio de secuencia de nucleótidos (dominio VT) y el segundo dominio de secuencia de nucleótidos (dominio CER) del polinucleótido guía están ubicados en una sola molécula. En otra realización, el segundo dominio de secuencia de nucleótidos (dominio de reconocimiento de endonucleasa Cas) comprende dos moléculas separadas que son capaces de hibridar a lo largo de una región de complementariedad.
En otra realización, la composición comprende un polinucleótido guía, en donde el primer dominio de secuencia de nucleótidos es una secuencia de ADN y el segundo dominio de secuencia de nucleótidos se selecciona entre el grupo que consiste en una secuencia de ADN, una secuencia de ARN y una combinación de las mismas.
En una realización, la composición comprende un polinucleótido guía, en donde el primer dominio de secuencia de nucleótidos (dominio VT) es una secuencia de ADN y el segundo dominio de secuencia de nucleótidos (dominio CER) se selecciona entre el grupo que consiste en una secuencia de ADN, una secuencia de ARN y una combinación de las mismas.
El polinucleótido guía y la endonucleasa Cas son capaces de formar un complejo, citado como el "complejo de polinucleótido guía/endonucleasa Cas", que permite a la endonucleasa Cas introducir una rotura bicatenaria en un sitio diana de ADN.
En una realización, la composición comprende un complejo de polinucleótido guía/endonucleasa Cas, en donde el polinucleótido guía comprende (i) un primer dominio de secuencia de nucleótidos que es complementario a una secuencia de nucleótidos en un ADN diana; y (ii) un segundo dominio de secuencia de nucleótidos que interactúa con una endonucleasa Cas, en donde dicho polinucleótido guía comprende ADN, en donde, preferentemente, el polinucleótido guía es una secuencia de ADN o una secuencia de combinación de ARN-ADN, en donde dichos polinucleótido guía y endonucleasa Cas son capaces de formar un complejo que permite a la endonucleasa Cas introducir una rotura bicatenaria en dicho sitio diana.
En otra realización, la composición comprende un complejo de polinucleótido guía/endonucleasa Cas, en donde el primer dominio de secuencia de nucleótidos (dominio VT) y el segundo dominio de secuencia de nucleótidos (dominio CER) del polinucleótido guía están compuestos de ácidos desoxirribonucleicos (ADN), ácidos ribonucleicos (ARN) o una combinación de los mismos, en donde el polinucleótido guía comprende ADN, en donde, preferentemente, el polinucleótido guía es una secuencia de ADN o una secuencia de combinación de ARN-ADN.
En una realización, el polinucleótido guía puede introducirse en la célula vegetal directamente usando bombardeo de partículas.
Cuando el polinucleótido guía comprende únicamente secuencias de ARN (también denominado "ARN guía") puede introducirse directamente introduciendo una molécula de ADN recombinante que comprende la secuencia de ADN guía correspondiente unida operativamente a un promotor específico de plantas que es capaz de transcribir el polinucleótido guía en dicha célula vegetal. Dichos polinucleótidos de ARN guía se encuentran fuera del alcance de la invención. La expresión "ADN guía correspondiente" se refiere a una molécula de ADN que es idéntica a la molécula de ARN pero que tiene una "T" sustituyendo a cada "U" de la molécula de ARN.
En algunas realizaciones, el polinudeótido guía se introduce mediante bombardeo de partículas o transformación por Agrobacterium de una construcción de ADN recombinante que comprende el ADN guía correspondiente unido operativamente a un promotor de U6 polimerasa III de planta.
Las expresiones "sitio diana", "secuencias diana", "ADN diana", "locus diana", "sitio diana genómico", "secuencia diana genómica" y "locus diana genómico" se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a una secuencia de polinucleótido en el genoma (incluyendo el ADN cloroplástico y mitocondrial) de una célula en el que se induce una rotura bicatenaria en el genoma de la célula mediante una endonucleasa Cas. El sitio diana puede ser un sitio endógeno en el genoma de una célula u organismo o como alternativa, el sitio diana puede ser heterólogo para la célula u organismo y por lo tanto no es de origen natural en el organismo o el sitio diana puede encontrarse en una ubicación genómica heteróloga, en comparación con donde se produce en la naturaleza. Como se usa en el presente documento, las expresiones "secuencia diana endógena" y "secuencia diana nativa" se usan indistintamente en el presente documento para referirse a una secuencia diana que es endógena o nativa para el genoma de una célula u organismo y se encuentra en la posición endógena o nativa de esa secuencia diana en el genoma de una célula u organismo. Las células incluyen, pero sin limitación, células animales, bacterianas, fúngicas, de insecto, de levadura y vegetales, así como plantas y semillas producidas mediante los métodos descritos en el presente documento.
En una realización, el sitio diana puede ser similar a un sitio de reconocimiento de ADN o sitio diana que se reconoce específicamente y/o al que se une un agente inductor de roturas bicatenarias, tal como una endonucleasa LIG3-4 (Publicación de Patente de los Estados Unidos 2009-0133152 A1 (publicada el 21 de mayo de 2009) o una meganucleasa MS26++ (Solicitud de Patente de los Estados Unidos 13/526912, presentada el 19 de junio de 2012).
Un "sitio diana artificial" o una "secuencia diana artificial" se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a una secuencia diana que se ha introducido en el genoma de una célula u organismo, tal como, pero sin limitación, una planta o levadura. Dicha secuencia diana artificial puede tener una secuencia idéntica a la de una secuencia diana endógena o nativa en el genoma de una célula, pero estar ubicada en una posición diferente (es decir, una posición no endógena o no nativa) en el genoma de una célula u organismo.
Un "sitio diana alterado", "secuencia diana alterada", "sitio diana modificado", "secuencia diana modificada" se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a una secuencia diana como se divulga en el presente documento que comprende al menos una alteración cuando se compara con una secuencia diana no alterada. Dichas "alteraciones" incluyen, por ejemplo:
(i) reemplazo de al menos un nucleótido, (ii) una eliminación de al menos un nucleótido, (iii) una inserción de al menos un nucleótido o (iv) cualquier combinación de (i) -(iii).
Los métodos para modificar un sitio diana genómico de un organismo, tal como, pero sin limitación, una planta o levadura se divulgan en el presente documento.
En una realización, un método para modificar un sitio diana en el genoma de una célula vegetal comprende proporcionar un polinucleótido guía a una célula que tiene una endonucleasa Cas, en donde dicho polinucleótido guía comprende ADN, en donde, preferentemente, el polinucleótido guía es una secuencia de ADN o una secuencia de combinación de ARN-ADN, en donde dichos polinucleótido guía y endonucleasa Cas son capaces de formar un complejo que permite a la endonucleasa Cas introducir una rotura bicatenaria en dicho sitio diana. Este método puede comprender además identificar al menos una célula que tiene una modificación en dicha diana, en donde la modificación en dicho sitio diana se selecciona entre el grupo que consiste en (i) un reemplazo de al menos un nucleótido, (ii) una eliminación de al menos un nucleótido, (iii) una inserción de al menos un nucleótido y (iv) cualquier combinación de (i) -(iii). Este método también puede comprender adicionalmente introducir un ADN donante en dicha célula, en donde dicho ADN donante comprende un polinucleótido de interés.
Además, se proporciona un método para modificar un sitio diana en el genoma de una célula, comprendiendo el método proporcionar un polinucleótido guía y una endonucleasa Cas a una célula, en donde dicho polinucleótido guía comprende ADN, en donde, preferentemente, el polinucleótido guía es una secuencia de ADN o una secuencia de combinación de ARN-ADN, en donde dichos polinucleótido guía y endonucleasa Cas son capaces de formar un complejo que permite a la endonucleasa Cas introducir una rotura bicatenaria en dicho sitio diana. Este método puede comprender además identificar al menos una célula que tiene una modificación en dicha diana, en donde la modificación en dicho sitio diana se selecciona entre el grupo que consiste en (i) un reemplazo de al menos un nucleótido, (ii) una eliminación de al menos un nucleótido, (iii) una inserción de al menos un nucleótido y (iv) cualquier combinación de (i) -(iii). Este método también puede comprender adicionalmente introducir un ADN donante en dicha célula, en donde dicho ADN donante comprende un polinucleótido de interés.
Además, se proporciona un método para modificar un sitio diana en el genoma de una célula, comprendiendo el método: a) proporcionar a una célula un nucleótido cr, una primera construcción de ADN recombinante capaz de expresar un ARNtracr y un segundo ADN recombinante capaz de expresar una endonucleasa Cas, en donde dicho nucleótido cr es una secuencia de desoxirribonucleótido o una combinación de una secuencia de desoxirribonucleótido y ribonucleótido, en donde dicho nucleótido cr, dicho ARNtracr y dicha endonucleasa Cas son capaces de formar un complejo que permite a la endonucleasa Cas introducir una rotura bicatenaria en dicho sitio diana; y b) identificar al menos una célula que tiene una modificación en dicho sitio diana, en donde la modificación se selecciona entre el grupo que consiste en (i) un reemplazo de al menos un nucleótido, (ii) una eliminación de al menos un nucleótido, (iii) una inserción de al menos un nucleótido y (iv) cualquier combinación de (i) - (iii).
Además, se proporciona un método para modificar un sitio diana en el genoma de una célula, comprendiendo el método: a) proporcionar a una célula un nucleótido tracr, una primera construcción de ADN recombinante capaz de expresar un ARNcr y un segundo ADN recombinante capaz de expresar una endonucleasa Cas, en donde dicho nucleótido tracr se selecciona entre una secuencia de desoxirribonucleótido o una combinación de una secuencia de desoxirribonucleótido y ribonucleótido, en donde dicho nucleótido tracr, dicho ARNcr y dicha endonucleasa Cas son capaces de formar un complejo que permite a la endonucleasa Cas introducir una rotura bicatenaria en dicho sitio diana; y b) identificar al menos una célula que tiene una modificación en dicho sitio diana, en donde la modificación se selecciona entre el grupo que consiste en (i) un reemplazo de al menos un nucleótido, (ii) una eliminación de al menos un nucleótido, (iii) una inserción de al menos un nucleótido y (iv) cualquier combinación de (i) - (iii).
La longitud del sitio diana puede variar e incluye, por ejemplo, sitios diana que tienen al menos 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más nucleótidos de longitud. Además, es posible que el sitio diana pueda ser palindrómico, es decir, la secuencia en una hebra se lee igual en el sentido contrario en la hebra complementaria. El sitio de corte/escisión puede encontrarse dentro de la secuencia diana o el sitio de corte/escisión puede encontrarse fuera de la secuencia diana. En otra variación, la escisión puede producirse en posiciones de nucleótidos inmediatamente en frente entre sí para producir un corte de extremos romos o, en otros casos, las incisiones pueden escalonarse para producir salientes monocatenarios, también denominados "extremos pegajosos", que pueden ser o bien salientes 5' o bien salientes 3'.
También pueden usarse variantes activas de sitios diana genómicos. Dichas variantes activas pueden comprender al menos un 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de identidad de secuencia respecto del sitio diana dado, en donde las variantes activas conservan la actividad biológica y por lo tanto, son capaces de ser reconocidas y escindidas por una endonucleasa Cas. Los ensayos para medir la rotura bicatenaria de un sitio diana por una endonucleasa se conocen en la técnica y en general, miden la actividad general y la especificidad del agente en los sustratos de ADN que contienen sitios de reconocimiento.
Pueden emplearse diversos métodos y composiciones para obtener una célula u organismo que tiene un polinucleótido de interés insertado en un sitio diana para una endonucleasa Cas. Dichos métodos pueden emplear recombinación de homólogos para posibilitar la integración del polinucleótido de interés en el sitio diana. En un método proporcionado, se proporciona un polinucleótido de interés a la célula en una construcción de ADN donante. Como se usa en el presente documento, "ADN donante" es una construcción de ADN que comprende un polinucleótido de interés que se va a insertar en el sitio diana de una endonucleasa Cas. Opcionalmente, la construcción de ADN donante puede comprender además una primera y una segunda región de homología que flanquea al polinucleótido de interés. Las regiones de homología primera y segunda del ADN donante comparten homología con una primera y una segunda región genómica, respectivamente, presentes en o flanqueando al sitio diana del genoma de la planta. Por "homología" se entiende secuencias de ADN que son similares. Por ejemplo, una "región de homología con una región genómica" que se encuentra en el ADN donante es una región de ADN que tiene una secuencia similar a una "región genómica" dada en el genoma de la planta. Una región de homología puede tener cualquier longitud que sea suficiente para promover la recombinación de homólogos en el sitio diana escindido. Por ejemplo, la región de homología puede comprender al menos 5-10, 5-15, 5-20, 5-25, 5-30, 5-35, 5-40, 5-45, 5-50, 5-55, 5-60, 5-65, 5-70, 5-75, 5-80, 5-85, 5­ 90, 5-95, 5-100, 5-200, 5-300, 5-400, 5-500, 5-600, 5-700, 5-800, 5-900, 5-1000, 5-1100, 5-1200, 5-1300, 5-1400, 5­ 1500, 5-1600, 5-1700, 5-1800, 5-1900, 5-2000, 5-2100, 5-2200, 5-2300, 5-2400, 5-2500, 5-2600, 5-2700, 5-2800. 5­ 2900, 5-3000, 5-3100 o más bases de longitud, de tal forma que la región de homología tiene una homología suficiente para sufrir recombinación de homólogos con la región genómica correspondiente. "Suficiente homología" indica que dos secuencias de polinucleótido tienen una similitud estructural suficiente para actuar como sustratos para una reacción de recombinación de homólogos. La similitud estructural incluye la longitud general de cada fragmento de polinucleótido, así como la similitud de secuencia de los polinucleótidos. La similitud de secuencia puede describirse por el porcentaje de identidad de secuencia a lo largo de la longitud completa de las secuencias y/o mediante regiones conservadas que comprenden similitudes localizadas, tales como nucleótidos contiguos que tienen una identidad de secuencia del 100 % y porcentaje de identidad de secuencia a lo largo de una porción de la longitud de las secuencias.
La cantidad de homología o identidad de secuencia compartida por una diana y un polinucleótido donante puede variar e incluye longitudes totales y/o regiones que tienen valores integrales unitarios en los intervalos de aproximadamente 1-20 pb, 20-50 pb, 50-100 pb, 75-150 pb, 100-250 pb, 150-300 pb, 200-400 pb, 250-500 pb, 300-600 pb, 350-750 pb, 400-800 pb, 450-900 pb, 500-1000 pb, 600-1250 pb, 700-1500 pb, 800-1750 pb, 900-2000 pb, 1-2,5 kb, 1,5-3 kb, 2-4 kb, 2,5-5 kb, 3-6 kb, 3,5-7 kb, 4-8 kb, 5-10 kb o hasta e incluyendo la longitud total del sitio diana. Estos intervalos incluyen cada uno de los números enteros dentro del intervalo, por ejemplo, el intervalo de 1-20 pb incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20 pb. La cantidad de homología también puede describirse mediante el porcentaje de identidad de secuencia a lo largo de la longitud alineada completa de los dos polinucleótidos, que incluye el porcentaje de identidad de secuencia de al menos un 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %. Una homología suficiente incluye cualquier combinación de longitud de polinucleótido, porcentaje de identidad de secuencia global y opcionalmente, regiones conservadas de nucleótidos contiguos o porcentaje de identidad de secuencia local, por ejemplo, una homología suficiente puede describirse como una región de 75-150 pb que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia respecto de una región del locus diana. Una homología suficiente también puede describirse por la capacidad predicha de dos polinucleótidos para hibridar específicamente en condiciones de alta rigurosidad, véase, por ejemplo, Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY); Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Eds (1994) Current Protocols, (Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc); y, Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular BiologyHybridization with Nucleic Acid Probes, (Elsevier, Nueva York).
Como se usa en el presente documento, una "región genómica" es un segmento de un cromosoma en el genoma de una célula vegetal que está presente a cada lado del sitio diana o, como alternativa, también comprende una porción del sitio diana. La región genómica puede comprender al menos 5-10, 5-15, 5-20, 5-25, 5-30, 5-35, 5-40, 5-45, 5-50, 5-55, 5-60, 5-65, 5-70, 5-75, 5-80, 5-85, 5-90, 5-95, 5-100, 5-200, 5-300, 5-400, 5-500, 5-600, 5-700, 5-800, 5-900, 5­ 1000, 5-1100, 5-1200, 5-1300, 5-1400, 5-1500, 5-1600, 5-1700, 5-1800, 5-1900, 5-2000, 5-2100, 5-2200, 5-2300, 5­ 2400, 5-2500, 5-2600, 5-2700, 5-2800, 5-2900, 5-3000, 5-3100 o más bases, de tal forma que la región genómica tiene una homología suficiente para sufrir recombinación de homólogos con la región de homología correspondiente.
La región de homología del ADN donante puede tener homología respecto de cualquier secuencia que flanquee al sitio diana. Aunque en algunas realizaciones las regiones de homología comparten una homología de secuencia significativa respecto de la secuencia genómica inmediatamente flanqueante al sitio diana, se reconoce que las regiones de homología pueden diseñarse para que tengan una homología suficiente respecto de regiones que pueden encontrarse más allá del 5' o 3' respecto del sitio diana. En otras realizaciones más, las regiones de homología también pueden tener homología con un fragmento del sitio diana, junto con regiones genómicas cadena abajo. En una realización, la primera región de homología comprende adicionalmente un primer fragmento del sitio diana y la segunda región de homología comprende un segundo fragmento del sitio diana, en donde los fragmentos primero y segundo son disímiles.
Como se usa en el presente documento, "recombinación de homólogos" se refiere al intercambio de fragmentos entre dos moléculas de ADN en los sitios de homología. La frecuencia de la recombinación de homólogos se ve influenciada por una serie de factores. Los diferentes organismos varían respecto a la cantidad de recombinación de homólogos y la proporción relativa de recombinación de homólogos a no homólogos. En general, la longitud de la región de homología afecta a la frecuencia de eventos de recombinación de homólogos: cuanto más larga sea la región de homología, mayor será la frecuencia. La longitud de la región de homología necesaria para observar recombinación de homólogos también es variable entre especies. En muchos casos, se han utilizado al menos 5 kb de homología, pero se ha observado recombinación de homólogos con tan poco como 25-50 pb de homología. Véase, por ejemplo, Singer et al., (1982) Cell 31:25-33; Shen y Huang, (1986) Genetics 112:441-57; Watt et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4768-72, Sugawara y Haber, (1992) Mol Cell Biol 12:563-75, Rubnitz y Subramani, (1984) Mol Cell Biol 4:2253-8; Ayares et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5199-203; Liskay et al., (1987) Genetics 115:161-7.
La alteración del genoma de una célula vegetal, por ejemplo, mediante recombinación de homólogos (HR), es una potente herramienta de ingeniería genética. A pesar de la baja frecuencia de recombinación de homólogos en las plantas superiores, hay unos cuantos ejemplos de recombinación de homólogos exitosa de genes endógenos vegetales. Los parámetros para la recombinación de homólogos en plantas se han investigado principalmente rescatando genes marcadores de selección truncados escindidos. En estos experimentos, los fragmentos de ADN homólogo tenían normalmente entre 0,3 kb a 2 kb. Las frecuencias observadas para la recombinación de homólogos se encontraron en el orden de 10'4 a 10'5. Véase, por ejemplo, Halfter et al., (1992) Mol Gen Genet 231:186-93; Offringa et al., (1990) EMBO J 9:3077-84; Offringa et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7346-50; Paszkowski et al., (1988) EMBO J 7:4021-6; Hourda y Paszkowski, (1994) Mol Gen Genet 243:106-11; y Risseeuw et al., (1995) Plant J 7:109-19.
Se ha comprobado la recombinación de homólogos en insectos. En Drosophila, Dray y Gloor descubrieron que es suficiente tan poco como 3 kb de homología molde: diana para copiar un gran segmento de ADN no homólogo en la diana con una eficacia razonable (Dray y Gloor, (1997) Genetics 147:689-99). Usando integración de ADN mediada por FLP en un FRT diana en Drosophila, Golic et al., demostraron que la integración era aproximadamente 10 veces más eficaz cuando el donante y la diana compartían 4,1 kb de homología, en comparación con 1,1 kb de homología (Golic et al., (1997) Nucleic Acids Res 25:3665). Los datos de Drosophila indican que son suficientes 2-4 kb de homología para un direccionamiento eficaz, pero hay ciertas evidencias de que puede ser suficiente una homología mucho menor, en el orden de aproximadamente 30 pb a aproximadamente 100 pb (Nassif y Engels, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1262-6; Keeler y Gloor, (1997) Mol Cell Biol 17:627-34).
También se ha logrado la recombinación de homólogos en otros organismos. Por ejemplo, se necesitaron al menos 150-200 pb de homología para la recombinación de homólogos en el protozoo parásito Leishmania (Papadopoulou y Dumas, (1997) Nucleic Acids Res 25:4278-86). En el hongo filamentoso, Aspergillus nidulans, se ha logrado el reemplazo génico con tan poco como 50 pb de homología flanqueante (Chaveroche et al., (2000) Nucleic Acids Res 28:e97). También se ha demostrado el reemplazo génico dirigido en el ciliado, Tetrahymena thermophila (Gaertig et al., (1994) Nucleic Acids Res 22:5391-8). En mamíferos, la recombinación de homólogos ha tenido más éxito en ratones usando líneas de células madre embrionarias pluripotentes (ES) que pueden crecer en cultivo, transformarse, seleccionarse e introducirse en un embrión de ratón. Los embriones que portan células ES transgénicas insertadas se desarrollan como descendencia modificada genéticamente. Mediante el cruzamiento endógamo entre hermanos, pueden obtenerse ratones homocigotos que portan los genes deseados. Se proporciona una revisión del proceso en Watson et al., (1992) Recombinant DNA, 2.a Ed., (Scientific American Books distribuido por WH Freeman & Co.); Capecchi, (1989) Trends Genet 5:70-6; y Bronson, (1994) J Biol Chem 269:27155-8. La recombinación de homólogos en mamíferos distintos de ratones se ha visto limitada por la falta de células madre con la capacidad de poder trasplantarse a ovocitos o de desarrollar embriones. Sin embargo, McCreath et al., Nature 405:1066-9 (2000) comunicaron una recombinación de homólogos exitosa en ovejas mediante la transformación y selección en células de fibroblastos embrionarios primarios.
Una vez que se ha inducido una rotura bicatenaria en el ADN, se activa el mecanismo de reparación del ADN de la célula para reparar la rotura. Los mecanismos de reparación de ADN propensos a errores pueden producir mutaciones en los sitios de rotura bicatenaria. El mecanismo de reparación más común para unir los extremos rotos es la vía de unión de extremos no homólogos (NHEJ) (Bleuyard et al., (2006) DNA Repair 5:1-12). La integridad estructural de los cromosomas se conserva normalmente mediante la reparación, pero existe la posibilidad de que se produzcan eliminaciones, inserciones u otros reordenamientos (Siebert y Puchta, (2002) Plant Cell 14:1121-31; Pacher et al., (2007) Genetics 175:21-9). Los dos extremos de una rotura bicatenaria son los sustratos más prevalentes de la NHEJ (Kirik et al., (2000) EMBO J 19:5562-6), aunque si se producen dos roturas bicatenarias diferentes, pueden ligarse los extremos libres de las diferentes roturas y dar como resultado eliminaciones cromosómicas (Siebert y Puchta, (2002) Plant Cell 14:1121-31) o traslocaciones cromosómicas entre diferentes cromosomas (Pacher et al., (2007) Genetics 175:21-9).
También pueden ligarse moléculas de ADN episómicas en la rotura bicatenaria, por ejemplo, integración de ADN-T en roturas bicatenarias cromosómicas (Chilton y Que, (2003) Plant Physiol 133:956-65; Salomon y Puchta, (1998) EMBO J 17:6086-95). Una vez que se ha alterado la secuencia alrededor de las roturas bicatenarias, por ejemplo, por las actividades exonucleasa implicadas en la maduración de las roturas bicatenarias, las vías de conversión génica pueden restaurar la estructura original en caso de que se encuentre disponible una secuencia homóloga, tal como un cromosoma homólogo en células somáticas que no se encuentren en división o una cromátida hermana tras la replicación del ADN (Molinier et al., (2004) Plant Cell 16:342-52). Las secuencias de ADN ectópicas o epigénicas también pueden servir como molde de reparación del ADN para la recombinación de homólogos (Puchta, (1999) Genetics 152:1173-81).
Como alternativa, la rotura bicatenaria puede repararse mediante recombinación de homólogos entre secuencias de ADN homólogas. Una vez se ha alterado la secuencia alrededor de la rotura bicatenaria, por ejemplo, por las actividades exonucleasa implicadas en la maduración de las roturas bicatenarias, las vías de conversión génica pueden restaurar la estructura original en caso de que se encuentre disponible una secuencia homóloga, tal como un cromosoma homólogo en células somáticas que no se encuentren en división o una cromátida hermana tras la replicación del ADN (Molinier et al., (2004) Plant Cell 16:342-52). Las secuencias de ADN ectópicas o epigénicas también pueden servir como molde de reparación del ADN para la recombinación de homólogos (Puchta, (1999) Genetics 152:1173-81).
Las roturas de ADN bicatenarias parecen ser un factor eficaz para estimular las vías de recombinación de homólogos (Puchta et al., (1995) Plant Mol Biol 28:281-92; Tzfira y White, (2005) Trends Biotechnol 23:567-9; Puchta, (2005) J Exp Bot 56:1-14). Usando agentes de rotura del ADN, se observó un aumento de dos a diez veces de la recombinación de homólogos entre repeticiones de ADN homólogas construidas artificialmente en plantas (Puchta et al., (1995) Plant Mol Biol 28:281-92). En protoplastos de maíz, los experimentos con moléculas de ADN lineales demostraron una recombinación de homólogos potenciada entre plásmidos (Lyznik et al., (1991) Mol Gen Genet 230:209-18).
En algunas realizaciones, los métodos proporcionados en el presente documento comprenden poner en contacto una célula con un ADN donante y una endonucleasa Cas. Una vez se ha introducido una rotura bicatenaria en el sitio diana mediante la endonucleasa Cas, las regiones de homología primera y segunda del ADN donante pueden sufrir recombinación de homólogos con sus regiones de homología genómicas correspondientes, dando como resultado el intercambio de ADN entre el donante y el genoma.
Así pues, los métodos proporcionados dan como resultado la integración del polinucleótido de interés del ADN donante en la rotura bicatenaria en el sitio diana en el genoma de una célula u organismo, alterando de este modo el sitio diana original y produciendo un sitio diana genómico alterado.
En una realización de la divulgación, el método comprende un método para introducir un polinucleótido de interés en un sitio diana en el genoma de una célula, comprendiendo el método: a) proporcionar un polinucleótido guía, un ADN donante y una endonucleasa Cas a una célula, en donde dicho polinucleótido guía comprende ADN, en donde, preferentemente, el polinucleótido guía es una secuencia de ADN o una secuencia de combinación de ARN-ADN, en donde dichos polinucleótido guía y endonucleasa Cas son capaces de formar un complejo que permite a la endonucleasa Cas introducir una rotura bicatenaria en dicho sitio diana; b) poner en contacto la célula de (a) con un ADN donante que comprende un polinucleótido de interés; y c) identificar al menos una célula de (b) que comprende en su genoma el polinucleótido de interés integrado en dicha diana. El polinucleótido guía, la endonucleasa Cas y el ADN donante pueden introducirse por cualquier medio conocido en la técnica. Estos medios incluyen, pero sin limitación, el suministro directo de cada componente mediante bombardeo de partículas, suministro mediante uno o más casetes de expresión de ADN recombinante o cualquier combinación de los mismos.
En algunas realizaciones de la divulgación, el método comprende un método para introducir un polinucleótido de interés en un sitio diana en el genoma de una célula, en donde el ADN donante y la endonucleasa Cas se introducen en dicha célula usando al menos una construcción de ADN recombinante capaz de expresar el ADN donante y/o la endonucleasa Cas; y/o, en donde el polinucleótido guía se introduce directamente mediante bombardeo de partículas.
En otra realización de la divulgación, el método comprende un método para introducir un polinucleótido de interés en un sitio diana en el genoma de una célula, comprendiendo el método: a) introducir en una célula una primera construcción de ADN recombinante capaz de expresar un polinucleótido guía y una segunda construcción de ADN recombinante capaz de expresar una endonucleasa Cas, en donde dicho polinucleótido guía comprende ADN, en donde, preferentemente, el polinucleótido guía es una secuencia de ADN o una secuencia de combinación de ARN-ADN, en donde dichos polinucleótido guía y endonucleasa Cas son capaces de formar un complejo que permite a la endonucleasa Cas introducir una rotura bicatenaria en dicho sitio diana; b) poner en contacto la célula de (a) con un ADN donante que comprende un polinucleótido de interés; y c) identificar al menos una célula de (b) que comprende en su genoma el polinucleótido de interés integrado en dicho sitio diana.
El ADN donante puede introducirse por cualquier medio conocido en la técnica. Por ejemplo, se proporciona una célula u organismo, tal como, pero sin limitación, una planta o levadura que tiene un sitio diana. El ADN donante puede proporcionarse mediante cualquier método de transformación conocido en la técnica, incluyendo, por ejemplo, transformación mediada por Agrobacterium o bombardeo con partículas biolísticas. El ADN donante puede estar presente de manera transitoria en la célula o puede introducirse mediante un replicón vírico. En presencia de la endonucleasa Cas y el sitio diana, se inserta el ADN donante en el genoma transformado.
Otra estrategia usa ingeniería de proteínas de endonucleasas de asentamiento para alterar sus especificidades diana. Las endonucleasas de asentamiento, tales como I-SceI o I-CreI, se unen y escinden a secuencias de reconocimiento de ADN relativamente largas (18 pb y 22 pb, respectivamente). Se predice que estas secuencias se producen de manera natural de manera infrecuente en un genoma, normalmente solo 1 o 2 sitios/genoma. La especificidad de escisión de una endonucleasa de asentamiento puede cambiarse mediante diseño racional de sustituciones de aminoácidos en el dominio de unión a ADN y/o ensamblaje combinatorio y selección de monómeros mutados (véase, por ejemplo, Arnould et al., (2006) J Mol Biol 355:443-58; Ashworth et al., (2006) Nature 441:656-9; Doyon et al., (2006) J Am Chem Soc 128:2477-84; Rosen et al., (2006) Nucleic Acids Res 34:4791-800; y Smith et al., (2006) Nucleic Acids Res 34:e149; Lyznik et al., (2009) Publicación de Patente de los Estados Unidos n.° 20090133152A1; Smith et al., (2007) Publicación de Patente de los Estados Unidos n.° 20070117128A1). Se ha demostrado que las meganucleasas modificadas por ingeniería genética pueden escindir sitios mutantes afines sin ampliar su especificidad. Se introdujo un sitio de reconocimiento artificial específico para la nucleasa de asentamiento I-SceI de levadura de tipo silvestre en genoma de maíz y se detectaron mutaciones de la secuencia de reconocimiento en el 1 % de las plantas de F1 analizadas cuando se introdujo una I-SceI transgénica mediante cruzamiento y se activó mediante escisión génica (Yang et al., (2009) Plant Mol Biol 70:669-79). De un modo más práctico, se usó como diana el locus de liguleless de maíz usando una endonucleasa monocatenaria modificada por ingeniería genética diseñada basándose en la secuencia de meganucleasa I-CreI. Se detectaron mutaciones de la secuencia de reconocimiento del locus de liguleless seleccionado en un 3 % de las plantas transgénicas de T0 cuando se introdujo la nucleasa de asentamiento diseñada mediante transformación mediada por Agrobacterium de embriones inmaduros (Gao et al., (2010) Plant J 61:176-87).
En el presente documento se describen adicionalmente polinucleótidos de interés y reflejan los mercados e intereses comerciales de los implicados en el desarrollo del cultivo. Los cultivos y mercados de interés cambian y a medida que las naciones en desarrollo se abren a los mercados globales, también surgirán nuevos cultivos y tecnologías. Además, a medida que aumenta la comprensión de los rasgos y características agronómicos, tales como el rendimiento y la heterosis, la elección de la ingeniería genética cambiará en consonancia.
Edición genómica usando el sistema de polinucleótido guía/endonucleasa Cas.
Como se describe en el presente documento, el sistema de polinucleótido guía/endonucleasa Cas puede usarse en combinación con un molde de modificación de polinucleótido administrado conjuntamente para permitir la edición de una secuencia de nucleótido genómica de interés. Aunque existen numerosos sistemas para producir roturas bicatenarias, sus aplicaciones prácticas para la edición genética pueden verse restringidas debido a la frecuencia relativamente baja de roturas bicatenarias (DSB) inducidas. Hasta ahora, muchos métodos de modificación genómica se basan en el sistema de recombinación de homólogos. La recombinación de homólogos (HR) puede proporcionar medios moleculares para hallar secuencias de ADN genómico de interés y modificarlas de acuerdo con las especificaciones experimentales. La recombinación de homólogos se produce en células somáticas vegetales con una frecuencia baja. El proceso puede potenciarse hasta un nivel práctico para la ingeniería genómica introduciendo roturas bicatenarias (DSB) en sitios diana de endonucleasas seleccionados. El reto ha sido producido DSB de manera eficiente en sitios genómicos de interés, ya que hay un sesgo en la direccionalidad de la transferencia de información entre dos moléculas de ADN que interactúan (la rota actúa como aceptora de la información genética). En el presente documento se describe el uso de un sistema de polinucleótido guía/Cas que proporciona una especificidad de escisión genómica flexible y da como resultado una alta frecuencia de roturas bicatenarias en un sitio diana de ADN, posibilitando de este modo una edición génica eficiente en una secuencia de nucleótidos de interés, en donde la secuencia de nucleótidos de interés que se va a editar puede estar ubicada dentro o fuera del sitio diana reconocido y escindido por una endonucleasa Cas.
Un "nucleótido modificado" o "nucleótido editado" se refiere a una secuencia de nucleótido de interés que comprende al menos una alteración cuando se compara con su secuencia de nucleótidos no modificada. Dichas "alteraciones" incluyen, por ejemplo: (i) reemplazo de al menos un nucleótido, (ii) una eliminación de al menos un nucleótido, (iii) una inserción de al menos un nucleótido o (iv) cualquier combinación de (i) -(iii).
La expresión "molde de modificación de polinucleótido" se refiere a un polinucleótido que comprende al menos una modificación de polinucleótidos cuando se compara con la secuencia de nucleótidos que se va a editar. Una modificación de nucleótidos puede ser al menos una sustitución, adición o eliminación de nucleótidos. Opcionalmente, el molde de modificación de polinucleótido puede comprender adicionalmente secuencias de nucleótidos homólogas que flanquean a la al menos una modificación de nucleótidos, en donde las secuencias de nucleótidos homólogas flanqueantes proporcionan homología suficiente a la secuencia de nucleótidos deseada que se va a editar.
En una realización, la divulgación describe un método para editar una secuencia de nucleótidos en el genoma de una célula, comprendiendo el método introducir un polinucleótido guía, un molde de modificación de polinucleótido y al menos una endonucleasa Cas en una célula, en donde dicho polinucleótido guía comprende ADN, en donde, preferentemente, el polinucleótido guía es una secuencia de ADN o una secuencia de combinación de ARN-ADN, en donde la endonucleasa Cas introduce una rotura bicatenaria en un sitio diana en el genoma de dicha célula, en donde dicho molde de modificación de polinucleótido comprende al menos una modificación de nucleótidos de dicha secuencia de nucleótidos. Las células incluyen, pero sin limitación, células animales, bacterianas, fúngicas, de insecto, de levadura y vegetales, así como plantas y semillas producidas mediante los métodos descritos en el presente documento. El nucleótido que se va a editar puede estar ubicado dentro o fuera de un sitio diana reconocido y escindido por una endonucleasa Cas. En una realización, la al menos una modificación de nucleótidos no es una modificación en un sitio diana reconocido y escindido por una endonucleasa Cas. En otra realización, hay al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 900 o 1000 nucleótidos entre el al menos un nucleótido que se va a editar y el sitio diana genómico.
La secuencia de nucleótido que se va a editar puede ser una secuencia que es endógena, artificial, preexistente o transgénica para la célula que se está editando. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos en el genoma de una célula puede ser un transgén que está incorporado de manera estable en el genoma de una célula. La edición de dicho transgén puede dar como resultado un fenotipo o genotipo deseado adicional. La secuencia de nucleótidos en el genoma de una célula también puede ser una secuencia mutada o preexistente que era endógena o artificial desde el origen, tal como un gen endógeno o un gen mutado de interés.
En una realización la secuencia de nucleótidos puede ser un promotor, en donde la edición del promotor da como resultado uno cualquiera de los siguientes o una combinación cualquiera de los siguientes: una actividad de promotor aumentada, una especificidad de tejido de promotor aumentada, una actividad de promotor reducida, una especificidad de promotor de tejido reducida, una mutación de elementos de unión a ADN y/o una eliminación o adición de elementos de unión a ADN.
En una realización, la secuencia de nucleótidos puede ser una secuencia reguladora en el genoma de una célula. Una secuencia reguladora es un segmento de una molécula de ácido nucleico que es capaz de aumentar o reducir la expresión de genes específicos en un organismo. Los ejemplos de secuencias reguladoras incluyen, pero sin limitación, activadores de la transcripción, represores de la transcripción y represores de la traducción, factores de corte y empalme, miARN, ARNip, miARN artificiales, una caja de c Aa T, una caja de CCAAT, una caja Pribnow, una caja de TATA, elementos SECIS y señales de poliadenilación. En algunas realizaciones, la edición de un elemento regulador da como resultado una traducción de proteínas, escisión de ARN, corte y empalme de ARN o terminación transcripcional alterados.
Modificaciones de secuencia reguladora usando el sistema de polinucleótido guía/endonucleasa Cas
En una realización, la secuencia de nucleótidos que se va a modificar puede ser una secuencia reguladora, tal como un promotor, en donde la edición del promotor comprende reemplazar el promotor (también citado como un "intercambio de promotor" o "reemplazo de promotor") o un fragmento de promotor por un promotor diferente (también citado como promotor de reemplazo) o fragmento de promotor (también citado como fragmento de promotor de reemplazo), en donde el reemplazo del promotor da como resultado uno cualquiera de los siguientes o una combinación cualquiera de los siguientes: una actividad de promotor aumentada, una especificidad de tejido de promotor aumentada, una actividad de promotor reducida, una especificidad de promotor de tejido reducida, una actividad de promotor nueva, una actividad de promotor inducible, una ventana de expresión génica aumentada, una modificación del tiempo o del progreso de desarrollo de la expresión génica en la misma capa celular u otra capa celular (tal como, pero sin limitación, superar el tiempo de expresión génica en el tapetum de las anteras de maíz (documento US 5.837.850 concedido el 17 de noviembre de 1998), una mutación de elementos de unión a ADN y/o una eliminación o adición de elementos de unión a ADN. El promotor (o fragmento de promotor) que se va a modificar puede ser un promotor (o fragmento de promotor) que es endógeno, artificial, preexistente o transgénico para la célula que se está editando. El promotor de reemplazo (o fragmento de promotor de reemplazo) puede ser un promotor (o fragmento de promotor) que es endógeno, artificial, preexistente o transgénico para la célula que se está editando.
En una realización, la secuencia de nucleótidos puede ser un promotor, en donde la edición del promotor comprende el reemplazo de un promotor de ARGOS 8 por un promotor GOS2 PRO:GOS2-intrón de Zea mays.
En una realización, la secuencia de nucleótidos puede ser un promotor, en donde la edición del promotor comprende el reemplazo de un promotor EPSPS1 nativo de un promotor de ubiquitina vegetal.
En una realización, la secuencia de nucleótidos puede ser un promotor, en donde la edición del promotor comprende reemplazar un promotor NPK1 de maíz endógeno con un promotor RAB17 de maíz inducible por estrés.
En una realización, la secuencia de nucleótidos puede ser un promotor, en donde el promotor que se va a editar se selecciona entre el grupo que comprende el promotor PEPC1 de Zea mays (Kausch et al, Plant Molecular Biology, 45: 1-15, 2001), el promotor de ubiquitina de Zea mays (UBI1ZM PRO, Christensen et al, Plant Molecular Biology 18: 675­ 689, 1992), el promotor Rootmet2 de Zea mays (documento US 7.214.855), el promotor de actina de arroz (Os -ACTIN PRO, documento US 5.641.876; McElroy et al, The Plant Cell, Vol 2, 163-171, febrero de 1990), el promotor RRC3 de sorgo (documento US 2012/0210463 presentado el 13 de febrero de 2012), el promotor g Os 2 de Zea mays (documento US 6.504.083), el promotor ACO2 de Zea mays (Solicitud de los Estados Unidos 14/210.711, presentada el 14 de marzo de 2014) o el promotor de oleosina de Zea mays (documento US 8466341 B2).
En otra realización, el sistema de polinucleótido guía/endonucleasa Cas puede usarse en combinación con un molde de modificación de polinucleótido o secuencia de ADN donante suministrado conjuntamente para permitir la inserción de un promotor o elemento promotor en una secuencia de nucleótidos genómica de interés, en donde la inserción del promotor (o la inserción del elemento promotor) da como resultado uno cualquiera de los siguientes o una combinación cualquiera de los siguientes: una actividad de promotor aumentada (fuerza del promotor aumentada), una especificidad de tejido de promotor aumentada, una actividad de promotor reducida, una especificidad de promotor de tejido reducida, una actividad de promotor nueva, una actividad de promotor inducible, una ventana de expresión génica aumentada, una modificación del tiempo o progreso del desarrollo de la expresión génica, una mutación de elementos de unión a ADN y/o una adición de elementos de unión a ADN. Los elementos promotores que se van a insertar pueden ser, pero sin limitación, elementos primarios de promotor (tales como, pero sin limitación, una caja de CAAT, una caja de CCAAT, una caja Pribnow, y/o una caja de TATA, secuencias de regulación de la traducción y/o un sistema represor para la expresión inducible (tal como elementos de represor/operador/inductor del operador TET o elementos de represor/operador/inductor de sulfonilurea (Su)). El elemento de respuesta a la deshidratación (DRE) se identificó originariamente como un elemento promotor de acción en cis en el promotor del gen sensible a la sequía rd29A, que contiene una secuencia primaria conservada de 9 pb, TACCGACAT (Yamaguchi-Shinozaki, K., y Shinozaki, K. (1994) Plant Cell 6, 251-264). La inserción de DRE en un promotor endógeno puede conferir una expresión inducible por sequía del gen cadena abajo. Otro ejemplo es elementos sensibles a ABA (ABRE), que contienen una secuencia consenso (C/T)ACGTGGC que se encuentra presente en numerosos genes ABA y/o regulados por estrés (Busk P. K., Pages M.(1998) Plant Mol. Biol. 37:425-435). La inserción del potenciador 35S o el potenciador MMV en una región promotora endógena aumentará la expresión génica (Patente de los Estados Unidos 5196525). El promotor (o elemento de promotor) que se va a modificar puede ser un promotor (o elemento de promotor) que es endógeno, artificial, preexistente o transgénico para la célula que se está editando.
En una realización, el sistema de polinucleótido guía/endonucleasa Cas puede usarse para insertar un elemento potenciador, tal como, pero sin limitación, un potenciador 35S del virus del mosaico de la coliflor, delante de un promotor FMT1 endógeno para potenciar la expresión del FMT1.
En una realización, puede usarse el sistema de polinucleótido guía/endonucleasa Cas para insertar un componente del sistema represor/operador/inductor del operador TET o un componente del sistema de represor/operador/inductor de sulfonilurea (Su) en genomas vegetales para generar o controlar sistemas de expresión inducible.
En otra realización, puede usarse el sistema de polinucleótido guía/endonucleasa Cas para permitir la eliminación de un promotor o elemento promotor, en donde la eliminación del promotor (o la eliminación del elemento promotor) da como resultado uno cualquiera de los siguientes o una combinación cualquiera de los siguientes: un locus génico permanentemente inactivado, una actividad de promotor aumentada (fuerza del promotor aumentada), una especificidad de tejido de promotor aumentada, una actividad de promotor reducida, una especificidad de promotor de tejido reducida, una actividad de promotor nueva, una actividad de promotor inducible, una ventana de expresión génica aumentada, una modificación del tiempo o progreso del desarrollo de la expresión génica, una mutación de elementos de unión a ADN y/o una adición de elementos de unión a ADN. Los elementos promotores que se van a eliminar pueden ser, pero sin limitación, elementos primarios de promotor, elementos potenciadores de promotor o elementos del potenciador 35S. El promotor o fragmento de promotor que se va a eliminar puede ser endógeno, artificial, preexistente o transgénica para la célula que se está editando.
En una realización, el sistema de polinucleótido guía/endonucleasa Cas puede usarse para eliminar el promotor ARGOS 8 presente en un genoma de maíz, como se describe en el presente documento.
En una realización, el sistema de polinucleótido guía/endonucleasa Cas puede usarse para eliminar un elemento potenciador 35S presente en un genoma vegetal, como se describe en el presente documento.
Modificaciones de terminador usando el sistema de polinucleótido guía/endonucleasa Cas
En una realización, la secuencia de nucleótido que se va a modificar puede ser un terminador, en donde la edición del terminador comprende el reemplazo del terminador (también citado como un "intercambio de terminador" o "reemplazo de terminador") o fragmento de terminador con un terminador diferente (también citado como terminador de reemplazo) o fragmento de terminador (también citado como fragmento de terminador de reemplazo), en donde el reemplazo del terminador da como resultado uno cualquiera de los siguientes o una combinación cualquiera de los siguientes: una actividad del terminador aumentada, una especificidad de tejido del terminador aumentada, una actividad del terminador reducida, una especificidad de tejido del terminador reducida, una mutación de elementos de unión a ADN y/o una eliminación o adición de elementos de unión a ADN. El terminador (o fragmento de terminador) que se va a modificar puede ser un terminador (o fragmento de terminador) que es endógeno, artificial, preexistente o transgénico para la célula que se está editando. El terminador de reemplazo (o fragmento de terminador de reemplazo) puede ser un terminador (o fragmento de terminador) que es endógeno, artificial, preexistente o transgénico para la célula que se está editando.
En una realización, la secuencia de nucleótidos que se va a modificar puede ser un terminador, en donde el terminador que se va a editar se selecciona entre el grupo que comprende terminadores de los genes Argos 8 o SRTF18 de maíz u otros terminadores, tales como el terminador Pinll de patata, el terminador de actina de sorgo (SB-ACTIN TERM, documento WO 2013/184537 A1, publicado en diciembre de 2013), SB-GKAF TERM de sorgo (documento WO2013019461), terminador T28 de arroz (OS-T28 TERM, documento WO 2013/012729 A2), AT-T9 TERM (documento WO 2013/012729 A2) o GZ-W64A TERM (documento US7053282).
En una realización, el sistema de polinucleótido guía/endonucleasa Cas puede usarse en combinación con un molde de modificación de polinucleótido o secuencia de ADN donante suministrado conjuntamente para permitir la inserción de un terminador o elemento terminador en una secuencia de nucleótidos genómica de interés, en donde la inserción del terminador (o la inserción del elemento terminador) da como resultado uno cualquiera de los siguientes o una combinación cualquiera de los siguientes: una actividad del terminador aumentada (fuerza del terminador aumentada), una especificidad de tejido del terminador aumentada, una actividad del terminador reducida, una especificidad de tejido del terminador reducida, una mutación de elementos de unión a ADN y/o una adición de elementos de unión a ADN.
El terminador (o elemento de terminador) que se va a insertar puede ser un terminador (o elemento de terminador) que es endógeno, artificial, preexistente o transgénico para la célula que se está editando.
En otra realización, puede usarse el sistema de polinucleótido guía/endonucleasa Cas para permitir la eliminación de un terminador o elemento terminador, en donde la eliminación del terminador (o la eliminación del elemento terminador) da como resultado uno cualquiera de los siguientes o una combinación cualquiera de los siguientes: una actividad del terminador aumentada (fuerza del terminador aumentada), una especificidad de tejido del terminador aumentada, una actividad del terminador reducida, una especificidad de tejido del terminador reducida, una mutación de elementos de unión a ADN y/o una adición de elementos de unión a ADN. El terminador o fragmento de terminador que se va a eliminar puede ser endógeno, artificial, preexistente o transgénica para la célula que se está editando.
Modificaciones adicionales de secuencia reguladora usando el sistema de polinucleótido guía/endonucleasa Cas
En una realización, el sistema de polinucleótido guía/endonucleasa Cas puede usarse para modificar o reemplazar una secuencia reguladora en el genoma de una célula. Una secuencia reguladora es un segmento de una molécula de ácido nucleico que es capaz de aumentar o reducir la expresión de genes específicos en un organismo y/o es capaz de alterar la expresión específica de tejido de genes en un organismo. Los ejemplos de secuencias reguladoras incluyen, pero sin limitación, la región 3' UTR (región no traducida), la región 5' UTR, activadores de la transcripción, potenciadores de la transcripción, represores de la transcripción, represores de la traducción, factores de corte y empalme, miARN, ARNip, miARN artificiales, elementos promotores, potenciador 35S de CAMV, elementos potenciadores de MMV (documento PCT/US14/23451, presentado el 11 de marzo de 2013), elementos SECIS, señales de poliadenilación y sitios de poliubiquitinación. En algunas realizaciones, la edición (modificación) o reemplazo de un elemento regulador da como resultado una traducción de proteínas, escisión de ARN, corte y empalme de ARN, terminación de la transcripción o modificación postraduccional alterados. En una realización, pueden identificarse elementos reguladores en un promotor y pueden editarse o modificarse estos elementos reguladores para optimizar estos elementos reguladores para la regulación positiva o negativa del promotor.
En una realización, la secuencia genómica de interés que se va a modificar es un sitio de poliubiquitinación, en donde la modificación de los sitios de poliubiquitinación da como resultado una tasa modificada de degradación de proteínas. El marcador de ubiquitina condena a las proteínas a la degradación por proteasomas o autofagia. Se sabe que los inhibidores de proteasomas provocan una sobreproducción de proteínas. Las modificaciones efectuadas en una secuencia de ADN que codifica una proteína de interés pueden dar como resultado al menos una modificación de aminoácidos de la proteína de interés, en donde dicha modificación posibilita la poliubiquitinación de la proteína (una modificación postraduccional) que da como resultado la modificación de la degradación de la proteína.
En una realización, la secuencia genómica de interés que se va a modificar es un sitio de poliubiquitinación en un gen EPSPS de maíz, en donde el sitio de poliubiquitinación modificado da como resultado un contenido de proteína aumentado debido a una menor velocidad de degradación de la proteína EPSPS.
En una realización, la secuencia genómica de interés que se va a modificar es un sitio intrónico, en donde la modificación consiste en la inserción de un motivo potenciador de intrones en el intrón, que da como resultado la modulación de la actividad transcripcional del gen que comprende dicho intrón.
En una realización, la secuencia genómica de interés que se va a modificar es un sitio intrónico, en donde la modificación consiste en el reemplazo del intrón EPSP1 de la soja por un intrón 1 de ubiquitina de soja, como se describe en el presente documento.
En una realización, la secuencia genómica de interés que se va a modificar es un sitio intrónico o de UTR, en donde la modificación consiste en insertar al menos un microARN en dicho sitio intrónico o de UTR, en donde la expresión del gen que comprende el sitio intrónico o de UTR también da como resultado la expresión de dicho microARN, que a su vez puede silenciar cualquier gen diana del microARN sin alterar la expresión génica del gen nativo/transgén que comprende dicho intrón.
En una realización, puede usarse el sistema de polinucleótido guía/endonucleasa Cas para posibilitar la eliminación o mutación de un factor de transcripción de dedo de cinc, en donde la eliminación o mutación del factor de transcripción de dedo de cinc da como resultado o posibilita la creación de un mutante de factor de transcripción de dedo de cinc negativo dominante (Li et al 2013 Rice zinc finger protein DST enhances grain production through controlling Gn1a/OsCKX2 expression PNAS 110:3167-3172). La inserción de un solo par de bases cadena abajo del dominio de dedo de cinc da como resultado un desplazamiento del marco y produce una nueva proteína que sigue pudiendo unirse a ADN sin actividad de transcripción. La proteína mutante competirá por la unión a promotores del gen de citocinina oxidasa y bloqueará la expresión del gen de citocinina oxidasa. La reducción de la expresión del gen de citocinina oxidasa aumentará el nivel de citocinina y promoverá el crecimiento del panículo en el arroz y el crecimiento de la mazorca en el maíz y aumentará el rendimiento en condiciones normales y de estrés.
Modificaciones de sitios de corte y empalme y/o introducción de sitios de corte y empalme alternativos usando el sistema de polinucleótido guía/endonucleasa Cas
La síntesis de proteínas utiliza moléculas de ARNm que surgen a partir de moléculas de pre-ARNm sometidas al proceso de maduración. Las moléculas de pre-ARNm se rematan, cortan y empalman y estabilizan mediante la adición de colas de poliA. Las células eucariotas han desarrollado un complejo proceso de corte y empalme que da como resultado variantes alternativas de las moléculas de pre-ARNm originales. Algunas de estas pueden no producir moldes funcionales para la síntesis de proteínas. En células de maíz, el proceso de corte y empalme se ve afectado por sitios de corte y empalme en los sitios de unión de exón-intrón. Un ejemplo de un sitio de corte y empalme canónico es AGGT. Las secuencias codificantes de genes pueden contener una serie de sitios de corte y empalme alternos que pueden afectar a la eficacia general del proceso de maduración del pre-ARNm y como tales, pueden limitar la acumulación de proteínas en las células. El sistema de polinucleótido guía/endonucleasa Cas puede usarse en combinación con un molde de modificación de polinucleótido administrado conjuntamente para editar un gen de interés para introducir un sitio de corte y empalme canónico en una unión descrita o cualquier variante de un sitio de corte y empalme que cambie el patrón de corte y empalme de las moléculas de pre-ARNm.
En una realización, la secuencia de nucleótidos de interés que se va a modificar es un gen EPSPS de maíz, en donde la modificación del gen consiste en modificar sitios de corte y empalme alternativos, que da como resultado la producción potenciada de los transcritos de gen y productos génicos (proteínas) funcionales.
En una realización, la secuencia de nucleótido de interés que se va a modificar es un gen, en donde la modificación del gen consiste en la edición de los límites de intrones de genes cortados y empalmados de manera alterna para alterar la acumulación de variantes de corte y empalme.
Modificaciones de secuencias de nucleótidos que codifican una proteína de interés usando el sistema de polinucleótido guía/endonucleasa Cas
En una realización, el sistema de polinucleótido guía/endonucleasa Cas puede usarse para modificar o reemplazar una secuencia codificante en el genoma de una célula, en donde la modificación o el reemplazo da como resultado uno cualquiera de los siguientes o una combinación cualquiera de los siguientes: una actividad de proteína (enzima) aumentada, una funcionalidad de proteína aumentada, una actividad de proteína reducida, una funcionalidad de proteína reducida, una mutación de sitio específico, un intercambio de dominio de proteína, una supresión génica de la proteína, una nueva funcionalidad de proteína, una funcionalidad de proteína modificada.
En una realización, la supresión génica de la proteína se debe a la introducción de un codón de parada en la secuencia codificante de interés.
En una realización, la supresión génica de la proteína se debe a la eliminación de un codón de inicio en la secuencia codificante de interés.
Fusiones de aminoácidos y/o proteínas usando el sistema de polinucleótido guía/endonucleasa Cas
En una realización, puede usarse el sistema de polinucleótido guía/endonucleasa Cas con o sin una secuencia de polinucleótido administrada conjuntamente para fusionar una primera secuencia codificante que codifica una primera proteína a una segunda secuencia codificante que codifica una segunda proteína en el genoma de una célula, en donde la fusión de la proteína da como resultado uno cualquiera de los siguientes o una combinación cualquiera de los siguientes: una actividad de proteína (enzima) aumentada, una funcionalidad de proteína aumentada, una actividad de proteína reducida, una funcionalidad de proteína reducida, una nueva funcionalidad de proteína, una funcionalidad de proteína modificada, una nueva localización de la proteína, un nuevo tiempo de expresión de la proteína, un patrón de expresión de la proteína modificado, una proteína quimérica o una proteína modificada con funcionalidad de fenotipo dominante.
En una realización, puede usarse el sistema de polinucleótido guía/endonucleasa Cas con o sin una secuencia de polinucleótido administrada conjuntamente para fusionar una primera secuencia codificante que codifica una señal de localización de cloroplastos a una segunda secuencia codificante que codifica una proteína de interés, en donde la fusión de proteínas da como resultado el direccionamiento de la proteína de interés al cloroplasto.
En una realización, puede usarse el sistema de polinucleótido guía/endonucleasa Cas con o sin una secuencia de polinucleótido administrada conjuntamente para fusionar una primera secuencia codificante que codifica una señal de localización de cloroplastos a una segunda secuencia codificante que codifica una proteína de interés, en donde la fusión de proteínas da como resultado el direccionamiento de la proteína de interés al cloroplasto.
En una realización, puede usarse el sistema de polinucleótido guía/endonucleasa Cas con o sin una secuencia de polinucleótido administrada conjuntamente para fusionar una primera secuencia codificante que codifica una señal de localización de cloroplastos (por ejemplo, un péptido de tránsito en cloroplastos) a una segunda secuencia codificante, en donde la fusión de la proteína da como resultado una proteína modificada con una funcionalidad de fenotipo dominante.
Silenciamiento génico mediante la expresión de una repetición invertida en un gen de interés usando el sistema de polinucleótido guía/endonucleasa Cas
En una realización, puede usarse el sistema de polinucleótido guía/endonucleasa Cas en combinación con una secuencia de polinucleótido administrada conjuntamente para insertar un fragmento génico invertido en un gen de interés en el genoma de un organismo, en donde la inserción del fragmento génico invertido puede permitir la creación in vivo de una repetición invertida (horquilla) y da como resultado el silenciamiento de dicho gen endógeno.
En una realización, la inserción del fragmento génico invertido puede dar como resultado la formación de una repetición invertida creada in vivo (horquilla) en un promotor nativo (o modificado) de un gen y/o en un extremo 5' nativo del gen nativo. El fragmento génico invertido puede comprender además un intrón, que puede dar como resultado un silenciamiento potenciado del gen diana.
Eliminación genómica para la caracterización de locus de rasgos
El mapeo de rasgos en el fitomejoramiento de plantas normalmente da como resultado la detección de regiones cromosómicas que albergan uno o más genes que controlan la expresión de un rasgo de interés. Para un rasgo cualitativo, puede usarse el sistema de polinucleótido guía/endonucleasa Cas para eliminar genes candidatos en las regiones cromosómicas identificadas para determinar si la eliminación del gen afecta a la expresión del rasgo. Para rasgos cuantitativos, la expresión de un rasgo de interés está regida por múltiples locus de rasgos cuantitativos (QTL) con diversos efectos-tamaños, complejidades y significaciones estadísticas a lo largo de uno o más cromosomas. En caso de efecto negativo o de regiones QTL perjudiciales que afectan a un rasgo complejo, puede usarse el sistema de polinucleótido guía/endonucleasa Cas para eliminar regiones completas delimitadas mediante mapeo preciso asistido por marcadores y para dirigir regiones específicas para su eliminación o reordenamiento selectivos. Asimismo, puede manipularse la variación de presencia/ausencia (PAV) o la variación del número de copias (CNV) con eliminación selectiva de genoma usando el sistema de polinucleótido guía/endonucleasa Cas.
En una realización, la región de interés puede estar flanqueada por dos secuencias diana de polinucleótido guía/endonucleasa Cas. El corte puede efectuarse de manera concurrente. El evento de eliminación podría ser la reparación de los dos extremos cromosómicos son la región de interés. Los resultados alternativos podrían incluir inversiones de la región de interés, mutaciones en los sitios de corte y duplicación de la región de interés.
Métodos para identificar al menos una célula vegetal que comprende en su genoma un polinucleótido de interés integrado en el sitio diana.
Adicionalmente, se divulgan métodos para identificar al menos una célula vegetal que comprende en su genoma un polinucleótido de interés integrado en el sitio diana. Se encuentra disponible una variedad de métodos para identificar aquellas células vegetales con inserción en el genoma en o próxima al sitio diana sin usar un fenotipo de marcador de selección. Dichos métodos pueden interpretarse como un análisis directo de una secuencia diana para detectar cualquier cambio en la secuencia diana, incluyendo, pero sin limitación, métodos de la PCR, métodos de secuenciación, digestión con nucleasas, transferencias de Southern y cualquier combinación de los mismos. Véase, por ejemplo, la solicitud de patente de los Estados Unidos US 12/147.834.
El método también comprende recuperar una planta de la célula vegetal que comprende un polinucleótido de interés integrado en su genoma. La planta puede ser estéril o fértil. Se reconoce que puede proporcionarse cualquier polinucleótido de interés, integrarse en el genoma de la planta en el sitio diana y expresarse en una planta.
Los polinucleótidos/polipéptidos de interés incluyen, pero sin limitación, secuencias codificantes de tolerancia a herbicidas, secuencias codificantes insecticidas, secuencias codificantes nematicidas, secuencias codificantes antimicrobianas, secuencias codificantes antifúngicas, secuencias codificantes antivíricas, secuencias codificantes de tolerancia al estrés abiótico y biótico o secuencias que modifican rasgos de las plantas, tales como rendimiento, calidad del grano, contenido de nutrientes, calidad y cantidad del almidón, fijación y/o utilización del nitrógeno, contenido y/o composición de ácidos grasos y aceites. Los polinucleótidos de interés más específicos incluyen, pero sin limitación, genes que mejoran el rendimiento de cultivos, polipéptidos que aumentan la deseabilidad de los cultivos, genes que codifican proteínas que confieren resistencia al estrés abiótico, tal como sequía, nitrógeno, temperatura, salinidad, metales tóxicos u oligoelementos o aquellos que confieren resistencia a toxinas, tales como plaguicidas y herbicidas o al estrés biótico, tal como ataques por hongos, virus, bacterias, insectos y nematodos y el desarrollo de enfermedades asociadas con estos organismos. Las categorías generales de genes de interés incluyen, por ejemplo, aquellos genes implicados en la información, tales como dedos de cinc, aquellos implicados en la información, tales como cinasas y aquellos implicados en funciones constitutivas, tales como proteínas de choque térmico. Las categorías de transgenes más específicas, por ejemplo, incluyen genes que codifican rasgos importantes para la agronomía, resistencia a insectos, resistencia a enfermedades, resistencia a herbicidas, fertilidad o esterilidad, características del grano y productos comerciales. Los genes de interés incluyen, en general, aquellos implicados en el metabolismo de aceites, almidón, carbohidratos o nutrientes, así como aquellos que afectan al tamaño del grano, la carga de sacarosa y similares que pueden acumularse o usarse en combinación con otros rasgos, tales como, pero sin limitación, resistencia a herbicidas, descritos en el presente documento.
Los rasgos importantes en agronomía, tales como el contenido de aceites, almidón y proteína pueden alterarse genéticamente además del uso de métodos de fitomejoramiento. Las modificaciones incluyen aumentar el contenido de ácido oleico, aceites saturados e insaturados, aumentar los niveles de lisina y azufre, proporcionar aminoácidos esenciales y también la modificación del almidón. Se describen modificaciones de la proteína hordotionina en las Patentes de los Estados Unidos n.° 5.703.049, 5.885.801, 5.885.802 y 5.990.389. Otro ejemplo es la proteína de semilla rica en lisina y/o azufre codificada por la albúmina 2S de la soja, descrita en la Patente de los Estados Unidos n.° 5.850.016 y el inhibidor de quimiotripsina de la cebada, descrito en Williamson et al. (1987) Eur. J. Biochem. 165:99-106.
Los rasgos comerciales también pueden estar codificados en un polinucleótido de interés que puede aumentar, por ejemplo, el almidón para la producción de etanol o proporcionar la expresión de proteínas. Otro uso comercial importante de plantas transformadas es la producción de polímeros y bioplásticos, tal como se define en la Patente de los Estados Unidos n.° 5.602.321. Los genes tales como p-cetotiolasa, PHBasa (polihidroxibutirato sintasa) y acetoacetil-CoA reductasa (véase Schubert et al. (1988) J. Bacteriol. 170:5837-5847) facilitan la expresión de polihidroxialcanoatos (PHA).
Pueden producirse derivados de las secuencias codificantes mediante mutagénesis de sitio dirigido para aumentar el nivel de aminoácidos preseleccionados en el polipéptido codificado. Por ejemplo, el gen que codifica el polipéptido rico en lisina (BHL) de la cebada procede del inhibidor de quimiotripsina de la cebada, Solicitud de los Estados Unidos con n.° de serie 08/740.682, presentada el 1 de noviembre de 1996 y el documento WO 98/20133. Otras proteínas incluyen proteínas vegetales ricas en metionina, tales como de semilla de girasol (Lilley et al. (1989) Proceedings of the World Congress on Vegetable Protein Utilization in Human Foods and Animal Feedstuffs, ed. Applewhite (American Oil Chemists Society, Champaign, Illinois), págs. 497-502); maíz (Pedersen et al. (1986) J. Biol. Chem. 261:6279; Kirihara et al. (1988) Gene 71:359); y arroz (Musumura et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:123). Otros genes agronómicamente importantes codifican látex, Floury 2, factores de crecimiento, factores de almacenamiento en semillas y factores de transcripción.
Los polinucleótidos que mejoran el rendimiento de cultivos incluyen genes enanizantes, tales como Rht1 y Rht2 (Peng et al. (1999) Nature 400:256-261) y aquellos que aumentan el crecimiento de la planta, tales como glutamato deshidrogenasa inducible por amonio. Los polinucleótidos que mejoran la deseabilidad de los cultivos incluyen, por ejemplo, aquellos que permiten a las plantas tener un contenido reducido de grasas saturadas, aquellos que potencian el valor nutricional de las plantas y aquellos que aumentan las proteínas del grano. Los polinucleótidos que mejoran la tolerancia a la sal son aquellos que aumentan o permiten el crecimiento de la planta en un ambiente de mayor salinidad que el ambiente nativo de la planta en la que se han introducido los genes de tolerancia a la sal.
Los polinucleótidos/polipéptidos que influencian la biosíntesis de aminoácidos incluyen, por ejemplo, antranilato sintasa (AS; EC 4.1.3.27) que cataliza la primera reacción de ramificación a partir de la vía de aminoácidos aromáticos para la biosíntesis de triptófano en plantas, hongos y bacterias. En las plantas, los procesos bioquímicos para la biosíntesis de triptófano están confinados en el cloroplasto. Véase, por ejemplo, la Publicación de los Estados Unidos 20080050506. Las secuencias de interés adicionales incluyen corismato piruvato liasa (CPL), que se refiere a un gen que codifica una enzima que cataliza la conversión del corismato en piruvato y pHBA. El gen c Pl mejor caracterizado se ha aislado de E. coli y tiene el número de registro de GenBank M96268. Véase, la Patente de los Estados Unidos n.° 7.361.811.
Estas secuencias de polinucleótido de interés pueden codificar proteínas implicadas en proporcionar resistencia a enfermedades o plagas. Por "resistencia a enfermedades" o "resistencia a plagas" se entiende que las plantas evitan los síntomas nocivos que son el resultado de las interacciones planta-patógeno. Los genes de resistencia a plagas pueden codificar resistencia a plagas que provocan grandes pérdidas de rendimiento, tales como el gusano de la raíz, el gusano trozador, el barrenador del maíz europeo y similares. Los genes de resistencia a enfermedades y de resistencia a insectos, tales como las lisozimas o las cecropinas para la protección antibacteriana o proteínas, tales como defensinas, glucanasas o quitinasas para la protección antifúngica o endotoxinas de Bacillus thuringiensis, inhibidores de proteasa, colagenasas, lectinas o glucosidasas para controlar nematodos o insectos, son todos ejemplos de productos génicos útiles. Los genes que codifican rasgos de resistencia a enfermedades incluyen genes de detoxificación, tal como contra la fumonisina (Patente de los Estados Unidos n.° 5.792.931); genes de avirulencia (avr) y resistencia a enfermedades (R) (Jones et al. (1994) Science 266:789; Martin et al. (1993) Science 262:1432; y Mindrinos et al. (1994) Cell 78:1089); y similares. Los genes de resistencia a insectos pueden codificar resistencia a plagas que provocan grandes pérdidas de rendimiento, tales como el gusano de la raíz, el gusano trozador, el barrenador del maíz europeo y similares. Dichos genes incluyen, por ejemplo, genes de proteína tóxica de Bacillus thuringiensis (Patentes de los Estados Unidos n.° 5.366.892; 5.747.450; 5.736.514; 5.723.756; 5.593.881; y Geiser et al. (1986) Gene 48:109); y similares.
Una "proteína de resistencia a herbicidas" o una proteína que resulte de la expresión de una "molécula de ácido nucleico que codifica resistencia a herbicidas" incluye proteínas que confieren a una célula la capacidad de tolerar una mayor concentración de un herbicida que las células que no expresan la proteína o para tolerar una cierta concentración de un herbicida durante un periodo de tiempo más prolongado que las células que no expresan la proteína. Los rasgos de resistencia a herbicidas pueden introducirse en las plantas mediante genes que codifican resistencia a herbicidas que actúan inhibiendo la acción de la acetolactato sintasa (ALS), en particular, los herbicidas de tipo sulfonilurea, genes que codifican resistencia a herbicidas que actúan inhibiendo la acción de glutamina sintasa, tales como fosfinotricina o basta (por ejemplo, el gen bar), glifosato (por ejemplo, el gen de EPSP sintasa y el gen GAT), inhibidores de HPPD (por ejemplo, el gen HPPD) u otros genes similares conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos n.° 7.626.077, 5.310.667, 5.866.775, 6.225.114, 6.248.876, 7.169.970, 6.867.293 y la Solicitud Provisional de los Estados Unidos n.° 61/401.456. El gen bar codifica resistencia al herbicida basta, el gen nptll codifica resistencia a los antibióticos kanamicina y geneticina y los mutantes del gen ALS codifican resistencia al herbicida clorsulfurón.
También pueden codificarse genes de esterilidad en un casete de expresión y proporcionar una alternativa al despanojado. Los ejemplos de genes usados de este modo incluyen genes de fertilidad masculina, tales como MS26 (véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos 7.098.388, 7.517.975 y 7.612.251), MS45 (véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos 5.478.369 y 6.265.640) o MSCA1 (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos 7.919.676). Las plantas de maíz (Zea mays L.) pueden cruzarse mediante técnicas tanto de autopolinización como de polinización cruzada. El maíz tiene flores masculinas, ubicadas en la borla y flores femeninas, ubicadas en la panícula, en la misma planta. Puede autopolinizarse ("autofecundación") o polinizarse de manera cruzada. En el maíz, la polinización natural se produce cuando el viento arrastra el polen de las borlas a los estigmas que sobresalen en la parte superior de las panículas incipientes. La polinización puede controlarse fácilmente mediante técnicas conocidas por los expertos en la materia. El desarrollo de híbridos de maíz requiere del desarrollo de líneas endógamas homozigotas, el cruzamiento de estas y la evaluación de los cruzamientos. El cruzamiento de pedigrí y la selección recurrente son dos de los métodos de fitomejoramiento usados para desarrollar líneas endógamas a partir de poblaciones. Los programas de fitomejoramiento combinan rasgos deseables de dos o más líneas endógamas o diversas fuentes de base amplia en grupos de fitomejoramiento a partir de los que se desarrollan nuevas líneas endógamas mediante autofecundación y selección de los fenotipos deseados. Una variedad de maíz hibrida es el cruce de dos de dichas líneas endógamas, pudiendo tener cada una de ellas una o más características deseables de las que carece la otra o que complementan a la otra. Los nuevos descendientes endógamos se cruzan con otras líneas endógamas y se evalúan los híbridos de estos cruces para determinar cuáles tienen potencial comercial. La descendencia híbrida de la primera generación se denomina F1. El híbrido de F1 es más vigoroso que sus progenitores endógamos. Este vigor híbrido o heterosis, puede manifestarse de muchas maneras, incluyendo un crecimiento vegetativo aumentado y crecimiento aumentado.
Puede producirse simiente de maíz híbrido mediante un sistema de esterilidad masculina que incorpora desborlado manual. Para producir simiente híbrida, se retira la borla masculina del progenitor endógamo hembra en crecimiento, que puede plantarse en diversos patrones de filas alternas con el progenitor endógamo masculino. Como consecuencia, siempre que haya un aislamiento suficiente de fuentes de polen de maíz exógeno, las panículas del endógamo hembra se fertilizarán únicamente con polen del endógamo macho. Por lo tanto, la semilla resultante es híbrida (F1) y formará plantas híbridas.
Las variaciones de campo que tienen impacto en el desarrollo de la planta pueden dar como resultado plantas que producen borlas después del completarse el desborlado del progenitor hembra. O, puede no haberse retirado completamente la borla de una planta endógama hembra durante el proceso de desborlado. En cualquier caso, el resultado es que la planta hembra producirá polen con éxito y algunas plantas hembras se autopolinizarán. Esto dará como resultado semillas del endógamo hembra que se recogerán junto con las semillas híbridas que se producen normalmente. Las semillas endógamas hembra no presentan heterosis y por lo tanto, no son tan productivas como la simiente de F1. Además, la presencia de simiente endógama hembra puede representar un riesgo de seguridad del germoplasma para la compañía que produzca el híbrido.
Como alternativa, el endógamo hembra puede desborlarse mecánicamente mediante una máquina. El desborlado mecánico es aproximadamente tan fiable como el desborlado manual, pero es más rápido y menos costoso. Sin embargo, la mayoría de máquinas de desborlado producen más daño a las plantas que el desborlado manual. Por lo tanto, ninguna forma de desborlado es completamente satisfactoria en la actualidad y sigue habiendo necesidad de alternativas que reduzcan adicionalmente los costes de producción y eliminen la autopolinización del progenitor hembra en la producción de simiente híbrida.
Las mutaciones que provocan esterilidad masculina en las plantas tienen el potencial de ser útiles en métodos para la producción de semillas híbridas para plantas de cultivo, tales como maíz y pueden reducir los costes de producción eliminando la necesidad de la laboriosa eliminación de las flores masculinas (también conocido como desborlado) de las plantas progenitoras maternas usadas como progenitoras del híbrido. Se han producido mutaciones que provocan esterilidad masculina mediante diversos métodos, tales como rayos X o irradiaciones UV, tratamientos químicos o inserciones de elementos transpondibles (ms23, ms25, ms26, ms32) (Chaubal et al. (2000) Am J Bot 87:1193-1201). La regulación condicional de los genes de fertilidad mediante "interruptores moleculares" de fertilidad/esterilidad podrían potenciar las opciones para diseñar nuevos sistemas de esterilidad masculina para la mejora de cultivos (Unger et al. (2002) T ransgenic Res 11:455-465).
Aparte de la identificación de nuevos genes que tengan impacto en la fertilidad masculina, sigue habiendo una necesidad de proporcionar un sistema fiable para producir esterilidad masculina genética.
En la Patente de los Estados Unidos n.° 5.478.369, se describe un método mediante el cual se marcó y clonó el gen de fertilidad masculina Ms45 en el cromosoma 9 del maíz. Anteriormente, se había descrito un gen de fertilidad masculina en el cromosoma 9, ms2, que nunca antes se había clonado y secuenciado. No es alélico para el gen citado en la patente terminada en 369. Véase Albertsen, M. y Phillips, R.L., "Developmental Cytology of 13 Genetic Male Sterile Loci in Maize" Canadian Journal of Genetics & Cytology 23:195-208 (enero de 1981). El único gen de fertilidad que se había clonado anteriormente era el gen de Arabidopsis descrito en Aarts, et al., anteriormente citado.
Los ejemplos de genes que se han descubierto posteriormente que son importantes para la fertilidad masculina son numerosos e incluyen el gen ABORTED MICROSPORES (AMS) de Arabidopsis, Sorensen et al., The Plant Journal (2003) 33(2):413-423); el gen MS1 de Arabidopsis (Wilson et al., The Plant Journal (2001) 39(2):170-181); el gen NEF1 (Ariizumi et al., The Plant Journal (2004) 39(2):170-181); el gen AtGPAT1 de Arabidopsis (Zheng et al., The Plant Cell (2003) 15:1872-1887); se ha demostrado que la mutación dde2-2 de Arabidopsis es eficaz en el gen alelo de óxido sintasa (Malek et al., Planta (2002)216:187-192); el gen faceless pollen-1 (flp1) de Arabidopsis (Ariizumi et al, Plant Mol. Biol. (2003) 53:107-116); el gen MALE MEIOCYTE DEATH1 de Arabidopsis (Yang et al., The Plant Cell (2003) 15: 1281-1295); el gen de dedo de cinc específico de tapetum, TAZ1 (Kapoor et al., The Plant Cell (2002) 14:2353-2367); y el gen TAPETUM DETERMINANT1 (Lan et al, The Plant Cell (2003) 15:2792-2804).
Otros mutantes o genes de fertilidad masculina conocidos de Zea mays se listan en la Patente de los Estados Unidos 7.919.676.
Otros genes incluyen cinasas y aquellos que codifican compuestos tóxicos para el desarrollo gametofítico masculino o femenino.
Además, se reconoce que el polinucleótido de interés también puede comprender secuencias antisentido complementarias a al menos una porción del ARN mensajero (ARNm) para una secuencia génica diana de interés. Los oligonucleótidos antisentido se construyen para hibridar con el ARNm correspondiente. Pueden efectuarse modificaciones de las secuencias antisentido en tanto que las secuencias se hibriden a e interfieran con la expresión del ARNm correspondiente. De esta manera, pueden usarse construcciones antisentido que tengan un 70 %, 80 % u 85 % de identidad de secuencia respecto de las secuencias antisentido correspondientes. Además, pueden usarse porciones de los nucleótidos antisentido para interrumpir la expresión del gen diana. En general, pueden usarse secuencias de al menos 50 nucleótidos, 100 nucleótidos, 200 nucleótidos o más.
Además, también puede usarse el polinucleótido de interés en la dirección sentido para suprimir la expresión de genes endógenos en plantas. Se conocen en la técnica métodos para suprimir la expresión génica en plantas usando polinucleótidos en la orientación sentido. Los métodos implican generalmente transformar plantas con una construcción de ADN que comprende un promotor que dirige la expresión en una planta unida operativamente a al menos una porción de una secuencia de nucleótidos que corresponde al transcrito del gen endógeno. Típicamente, dicha secuencia de nucleótidos tiene una identidad de secuencia sustancial respecto de la secuencia del transcrito del gen endógeno, generalmente más de aproximadamente un 65 % de identidad de secuencia, aproximadamente un 85 % de identidad de secuencia o más de aproximadamente un 95 % de identidad de secuencia. Véanse, las Patentes de los Estados Unidos n.° 5.283.184 y 5.034.323.
El polinucleótido de interés también puede ser un marcador fenotípico. Un marcador fenotípico es explorable o un marcador de selección que incluye marcadores visuales y marcadores de selección, ya sea un marcador de selección positiva o negativa. Puede usarse cualquier marcador fenotípico. Específicamente, un marcador de selección o explorable comprende un segmento de ADN que permite identificar o seleccionar en favor o en contra de una molécula o una célula que lo contiene, normalmente en condiciones particulares. Estos marcadores pueden codificar una actividad, tal como, pero sin limitación, producción de ARN, péptido o proteína o pueden proporcionar un sitio de unión para el ARN, péptidos, proteínas, compuestos o composiciones inorgánicos y orgánicos y similares.
Los ejemplos de marcadores de selección incluyen, pero sin limitación, segmentos de ADN que comprenden sitios de enzimas de restricción; segmentos de ADN que codifican productos que proporcionan resistencia contra compuestos por lo demás tóxicos, incluyendo antibióticos, tal como, espectinomicina, ampicilina, kanamicina, tetraciclina, Basta, neomicina fosfotransferasa II (NEO) e higromicina fosfotransferasa (HPT); segmentos de ADN que codifican productos que por lo demás están ausentes en la célula receptora (por ejemplo, genes de ARNt, marcadores auxotróficos); segmentos de ADN que codifican productos que pueden identificarse fácilmente (por ejemplo, marcadores fenotípicos, tales como p-galactosidasa, GUS; proteínas fluorescentes, tales como proteína fluorescente verde (GFP), cian (CFP), amarilla (YFP), roja (RFP) y proteínas de la superficie celular); la generación de nuevos sitios cebadores para la PCR (por ejemplo, la yuxtaposición de dos secuencias de ADN no yuxtapuestas con anterioridad), la inclusión de secuencias de a Dn sobre las que no ha activado o sobre las que ha activado una endonucleasa de restricción u otra enzima, agente químico, etc. modificador del ADN; y, la inclusión de una secuencia de ADN necesaria para una modificación específica (por ejemplo, metilación) que permite su identificación.
Los marcadores de selección adicionales incluyen genes que confieren resistencia a compuestos herbicidas, tales como glufosinato de amonio, bromoxinilo, imidazolinonas y 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D). Véanse, por ejemplo, Yarranton, (1992) Curr Opin Biotech 3:506-11; Christopherson et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6314-8; Yao et al., (1992) Cell 71:63-72; Reznikoff, (1992) Mol Microbiol 6:2419-22; Hu et al., (1987) Cell 48:555-66; Brown et al., (1987) Cell 49:603-12; Figge et al., (1988) Cell 52:713-22; Deuschle et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5400-4; Fuerst et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2549-53; Deuschle et al., (1990) Science 248:480-3; Gossen, (1993) Ph.D. Thesis, Universidad de Heidelberg; Reines et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1917-21; Labow et al., (1990) Mol Cell Biol 10:3343-56; Zambretti et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3952-6; Baim et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5072-6; Wyborski et al., (1991) Nucleic Acids Res 19:4647-53; Hillen y Wissman, (1989) Topics Mol Struc Biol 10:143-62; Degenkolb et al., (1991) Antimicrob Agents Chemother 35:1591-5; Kleinschnidt et al., (1988) Biochemistry 27:1094-104; Bonin, (1993) Ph.D. Thesis, Universidad de Heidelberg; Gossen et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. u Sa 89:5547-51; Oliva et al., (1992) Antimicrob Agents Chemother 36:913-9; Hlavka et al., (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlín); Gill et al., (1988) Nature 334:721-4. Los rasgos comerciales también pueden estar codificados en un gen o genes que podrían aumentar, por ejemplo, el almidón para la producción de etanol o proporcionar la expresión de proteínas. Otro uso comercial importante de plantas transformadas es la producción de polímeros y bioplásticos, tal como se define en la Patente de los Estados Unidos n.° 5.602.321. Los genes tales como p-cetotiolasa, PHBasa (polihidroxibutirato sintasa) y acetoacetil-CoA reductasa (véase Schubert et al. (1988) J. Bacteriol. 170:5837-5847) facilitan la expresión de polihidroxialcanoatos (PHA).
Los productos exógenos incluyen enzimas y productos vegetales, así como aquellos de otras fuentes, incluyendo procariotas y otros eucariotas. Dichos productos incluyen enzimas, cofactores, hormonas y similares. El nivel de proteínas, en particular proteínas modificadas tienen una distribución de aminoácidos mejorada para mejorar el valor de nutrientes de la planta, pueden aumentarse. Esto se logra mediante la expresión de dichas proteínas que tienen un contenido de aminoácidos mejorado.
Los transgenes, moléculas de ADN recombinante, secuencias de ADN de interés y polinucleótidos de interés pueden comprender una o más secuencias de ADN para el silenciamiento génico. Se conocen en la técnica métodos de silenciamiento génico que implican la expresión de secuencias de ADN en plantas e incluyen, pero sin limitación, cosupresión, supresión antisentido, interferencia de ARN bicatenario (ARNbc), interferencia de ARN en horquilla (ARNhp), interferencia de ARN en horquilla que contiene intrones (ARNihp), silenciamiento génico transcripcional e interferencia de micro ARN (miARN).
Como se usa en el presente documento, "ácido nucleico" significa un polinucleótido e incluye un polímero mono o bicatenario de bases de desoxirribonucleótido o ribonucleótido. Los ácidos nucleicos también pueden incluir fragmentos y nucleótidos modificados. Por lo tanto, los términos "polinucleótido", "secuencia de ácido nucleico", "secuencia de nucleótidos" y "fragmento de ácido nucleico" se usan indistintamente para indicar un polímero de ARN y/o ADN que es mono o bicatenario, que opcionalmente contiene bases de nucleótidos sintéticas, no naturales o alteradas. Los nucleótidos (normalmente encontrados en su forma 5'-monofosfato) se citan por sus denominaciones de una sola letra del siguiente modo: "A" para adenosina o desoxiadenosina (para ARN o ADN, respectivamente), "C" para citosina o desoxicitosina, "G" para guanosina o desoxiguanosina, "U" para uridina, "T" para desoxitimina, "R" para purinas (A o G), "Y" para pirimidinas (C o T), "K" para G o T, "H" para A o C o T, "I" para inosina y "N" para cualquier nucleótido.
"Fase abierta de lectura" se abrevia como ORF.
Las expresiones "subfragmento que es funcionalmente equivalente" y "subfragmento funcionalmente equivalente" se usan indistintamente en el presente documento. Estos términos se refieren a una porción o subsecuencia de un fragmento de ácido nucleico aislado en el que se conserva la capacidad para alterar la expresión génica o producir un determinado fenotipo, codifique o no el fragmento o subfragmento una enzima activa. Por ejemplo, el fragmento o subfragmento puede usarse en el diseño de genes para producir el fenotipo deseado en una planta transformada. Pueden diseñarse genes para su uso en supresión uniendo un fragmento de ácido nucleico o subfragmento del mismo, codifique o no una enzima activa, en la orientación sentido o antisentido en relación con una secuencia promotora vegetal.
La expresión "dominio conservado" o "motivo" significa un conjunto de aminoácidos conservados en posiciones específicas a lo largo de una secuencia alineada de proteínas relacionadas evolutivamente. Aunque los aminoácidos y otras posiciones pueden variar entre proteínas homólogas, los aminoácidos que se encuentran altamente conservados en posiciones específicas indican aminoácidos que son esenciales para la estructura, la estabilidad o la actividad de una proteína. Debido a que se identifican por su alto grado de conservación en secuencias alineadas de una familia de homólogos de proteínas, pueden usarse como identificadores o "firmas", para determinar si una proteína con una secuencia recién determinada pertenece a una familia de proteínas previamente identificada.
Los polinucleótidos y las secuencias de polipéptido, variantes de los mismos y las relaciones estructurales de estas secuencias pueden describirse por los términos "homología", "homólogo", "sustancialmente idéntico", "sustancialmente similar" y "sustancialmente correspondiente", que se usan indistintamente en el presente documento.
Estos se refieren a fragmentos de polipéptido o de ácido nucleico en donde los cambios en uno o más aminoácidos o bases de nucleótido no afectan a la función de la molécula, tal como la capacidad para mediar la expresión génica o para producir un cierto fenotipo. Estos términos también se refieren a modificaciones de fragmentos de ácido nucleico que no alteran sustancialmente las propiedades funcionales del fragmento de ácido nucleico resultante en relación con el fragmento inicial no modificado. Estas modificaciones incluyen la eliminación, sustitución y/o inserción de uno 0 más nucleótidos en el fragmento de ácido nucleico.
Las secuencias de ácido nucleico sustancialmente similares abarcadas pueden definirse por su capacidad para hibridar (en condiciones moderadamente rigurosas, por ejemplo, SSC 0,5X, SDS al 0,1 %, 60 °C) con las secuencias ejemplificadas en el presente documento o con cualquier porción de las secuencias de nucleótido divulgadas en el presente documento y que son funcionalmente equivalentes a cualquiera de las secuencias de ácido nucleico divulgadas en el presente documento. Las condiciones de rigurosidad pueden ajustarse para explorar respecto de fragmentos moderadamente similares, tal como secuencias homólogas de organismos relacionados de manera distante, con fragmentos altamente similares, tales como genes que duplican enzimas funcionales de organismos estrechamente relacionados. Los lavados después de la hibridación determinan las condiciones de rigurosidad.
La expresión "hibrida de manera selectiva" incluye referencia a la hibridación, en condiciones de hibridación rigurosas, de una secuencia de ácido nucleico a una secuencia diana de ácido nucleico especificada en un mayor grado (por ejemplo, al menos 2 veces por encima del fondo) que su hibridación a secuencias de ácido nucleico no diana y a la exclusión sustancial de ácidos nucleicos no diana. Las secuencias que hibridan de manera selectiva tienen normalmente aproximadamente al menos un 80 % de identidad de secuencia o un 90 % de identidad de secuencia, hasta e incluyendo un 100 % de identidad de secuencia (es decir, complementariedad completa) entre sí.
La expresión "condiciones rigurosas" o "condiciones de hibridación rigurosas" incluye referencia a condiciones en las que una sonda se hibridará de manera selectiva a su secuencia diana en un ensayo de hibridación in vitro. Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y serán distintas en circunstancias distintas. Mediante el control de la rigurosidad de las condiciones de hibridación y/o lavado, se pueden identificar secuencias diana que son un 100 % complementarias a la sonda (sondado de homólogos). Como alternativa, se pueden ajustar las condiciones de rigurosidad para permitir cierto grado de desemparejamiento en secuencias, de tal forma que se detectan menos grados de similitud (sondado heterólogo). En general, una sonda tiene menos de aproximadamente 1000 nucleótidos de longitud, opcionalmente, menos de 500 nucleótidos de longitud.
Típicamente, las condiciones rigurosas serán aquellas en las que la concentración de la sal es menor de aproximadamente 1,5 M de ion Na, normalmente, una concentración de ion Na (u otras sales) de aproximadamente 0,01 a 1,0 M a un pH de 7,0 a 8,3 y al menos a aproximadamente 30 °C para sondas cortas (por ejemplo, de 10 a 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 60 °C para sondas largas (por ejemplo, mayores de 50 nucleótidos). También pueden lograrse condiciones rigurosas con la adición de agentes desestabilizantes, tales como formamida. Las condiciones de baja rigurosidad ejemplares incluyen hibridación con una solución tamponadora de formamida del 30 al 35 %, NaCl 1 M, SDS al 1 % (dodecilsulfato de sodio) a 37 °C y un lavado en SSC de 1X a 2X (SSC 20X = NaCl 3,0 M/citrato trisódico 0,3 M) a de 50 a 55 °C. Las condiciones de rigurosidad moderada ejemplares incluyen hibridación en formamida del 40 al 45 %, NaCl 1 M, SDS al 1 % a 37 °C y un lavado en SSC de 0,5X a 1X a de 55 a 60 °C. Las condiciones de alta rigurosidad ejemplares incluyen hibridación en formamida al 50 %, NaCl 1 M, SDS al 1 % a 37 °C y un lavado en SSC 0.1X, a de 60 a 65 °C.
"Identidad de secuencia" o "identidad" en el contexto de secuencias de ácido nucleico o polipéptido se refiere a las bases de ácido nucleico o los restos de aminoácidos en dos secuencias que son iguales cuando se alinean para una correspondencia máxima a lo largo de una ventana de comparación especificada.
La expresión "porcentaje de identidad de secuencia" se refiere al valor determinado comparando dos secuencias alineadas de manera óptima a lo largo de una ventana de comparación, en donde la parte de la secuencia de polinucleótido o polipéptido en la ventana de comparación puede comprender adiciones o eliminaciones (es decir, huecos) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o eliminaciones) para un alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las cuales se encuentra la base de ácido nucleico o el resto de aminoácido idénticos en ambas secuencias para producir el número de posiciones emparejadas, dividiendo el número de posiciones coincidentes entre el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia. Los ejemplos útiles de porcentajes de identidad de secuencia incluyen, pero sin limitación, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % o cualquier porcentaje entero entre el 50 % al 100 %. Estas identidades pueden determinarse usando cualquiera de los programas descritos en el presente documento.
Los alineamientos de secuencia y los cálculos de porcentaje de identidad o similitud pueden determinarse usando una variedad de métodos de comparación diseñados para detectar secuencias homólogas que incluyen, pero sin limitación, el programa MegAlign™ del paquete de programas informáticos LASERGENE (DNa St AR Inc., Madison, WI). En el contexto de la presente solicitud, se entenderá que cuando se usa un programa informático de análisis para el análisis, los resultados del análisis estarán basados en los "valores por defecto" del programa citado, a menos que se especifique otra cosa. Como se usa en el presente documento, "valores por defecto" significa cualquier conjunto de valores o parámetros que se cargan originariamente en el programa informático cuando se ejecuta por primera vez.
El "método de alineamiento Clustal V" corresponde al método de alineamiento denominado Clustal V (descrito por Higgins y Sharp, (1989) CABIOS 5:151-153; Higgins et al., (1992) Comput Appl Biosci 8:189-191) y encontrado en el programa informático MegAlign™ del paquete de programas informáticos lAs ERGENE (DNASTAR Inc., Madison, WI). Para alineamientos múltiples, los valores por defecto corresponden a GAP PENALTY (penalización por hueco) = 10 y GAP LENGTH PENALTY (penalización por longitud de hueco) = 10. Los parámetros por defecto para alineamientos emparejados y el cálculo de porcentaje de identidad de secuencias de proteínas usando el método Clustal son KTUPLE=1, GAP PENALTY = 3, WINDOW (ventana) = 5 y DIAGONALS SAVED (diagonales salvadas) = 5. Para ácidos nucleicos, estos parámetros son KTUPLE = 2, GAP PENALTY = 5, WINDOW (ventana) = 4 y DIAGONALS SAVED (diagonales salvadas) = 4. Tras el alineamiento de las secuencias usando el programa Clustal V, es posible obtener un "porcentaje de identidad" viendo la tabla de "distancias de secuencias" en el mismo programa.
El "método de alineamiento Clustal W" corresponde al método de alineamiento denominado Clustal W (descrito por Higgins y Sharp, (1989) CABIOS 5:151-153; Higgins et al., (1992) Comput Appl Biosci 8:189-191) y encontrado en el programa informático MegAlign™ v6.1 del paquete de programas informáticos LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, WI). Parámetros por defecto para alineamiento múltiple (GAP PENALTY = 10, GAP LEn Gt H PENALTY = 0,2, Delay Divergen Seqs (%) (retraso de secuencias divergentes) = 30, DNA Transition Weight (peso de transición de ADN) = 0,5, Protein Weight Matrix (matriz de peso de proteínas) = Gonnet Series, DNA Weight Matrix (matriz de peso de ADN) = IUB). Tras el alineamiento de las secuencias usando el programa Clustal W, es posible obtener un "porcentaje de identidad" viendo la tabla de "distancias de secuencias" en el mismo programa.
A menos que se indique otra cosa, los valores de identidad/similitud de secuencia proporcionados en el presente documento se refieren al valor obtenido usando GAP Versión 10 (GCG, Accelrys, San Diego, CA) usando los siguientes parámetros: % de identidad y % de similitud para una secuencia de nucleótidos usando una ponderación de penalización por creación de huecos de 50 y una ponderación de penalización por extensión de huevos de 3 y la matriz de puntuación nwsgapdna.cmp; % de identidad y % de similitud para una secuencia de aminoácidos usando una ponderación por creación de hueco de 8 y una penalización por extensión de longitud de hueco de 2 y la matriz de puntuación BLOSUM62 (Henikoff y Henikoff, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915). GAP usa el algoritmo de Needleman y Wunsch, (1970) J Mol Biol 48:443-53, para hallar un alineamiento de dos secuencias completas que maximiza el número de coincidencias y minimiza el número de huecos. GAP toma en consideración todos los posibles alineamientos y crea el alineamiento con el mayor número de bases coincidentes y el menor número de huecos, usando una penalización por creación de hueco y una penalización por extensión de huevo en unidades de bases emparejadas.
"BLAST" es un algoritmo de búsqueda proporcionado por el National Center for Biotechnology Information (NCBI) usado para hallar regiones de similitud entre secuencias biológicas. El programa compara secuencias de nucleótidos o proteínas con bases de datos de secuencia y calcula la significación estadística de las coincidencias para identificar secuencias que tienen una similitud suficiente respecto de una secuencia de búsqueda, de tal forma que no se pueda predecir que la similitud se haya producido de manera aleatoria. BLAST informa de las secuencias identificadas y su alineamiento local respecto de la secuencia de búsqueda.
Es de sobra conocido por un experto en la materia que son útiles muchos niveles de identidad de secuencia en la identificación de polipéptidos de otras especies o modificados de manera natural o sintética, en donde dichos polipéptidos tienen la misma función o actividad u otra similar. Los ejemplos útiles de porcentajes de identidad incluyen, pero sin limitación, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % o cualquier porcentaje entero entre el 50 % al 100 %. De hecho, puede ser útil cualquier entero de identidad de aminoácidos del 50 % al 100 % para describir la presente divulgación, tal como un 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %,
79 %,
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97 %,
"Gen" incluye un fragmento de ácido nucleico que expresa una molécula funcional, tal como, pero sin limitación, una proteína específica, incluyendo secuencias reguladoras que preceden (secuencias no codificantes 5') y a continuación (secuencias no codificantes 3') de la secuencia codificante. "Gen nativo" se refiere a un gen tal como se encuentra en la naturaleza con sus propias secuencias reguladoras.
Un "gen mutado" es un gen que se ha alterado mediante intervención humana. Dicho "gen mutado" tiene una secuencia que difiere de la secuencia del gen no mutado correspondiente en al menos una adición, eliminación o sustitución de nucleótidos. En ciertas realizaciones de la divulgación, el gen mutado comprende una alteración que es el resultado de un sistema de polinucleótido guía/endonucleasa Cas como se divulga en el presente documento. Una planta mutada es una planta que comprende un gen mutado.
Como se usa en el presente documento, una "mutación dirigida" es una mutación en un gen nativo que se produjo alterando una secuencia diana en el gen nativo usando un método que implica un agente inductor de roturas bicatenarias que es capaz de inducir una rotura bicatenaria en el ADN de la secuencia diana, como se divulga en el presente documento o como se conoce en la técnica.
En una realización, la mutación dirigida es el resultado de una edición génica inducida por polinucleótido guía/endonucleasa Cas, como se describe en el presente documento. La mutación dirigida inducida por el polinucleótido guía/endonucleasa Cas puede producirse en una secuencia de nucleótido que está ubicada dentro o fuera del sitio genómico diana que se reconoce y escinde por una endonucleasa Cas.
El término "genoma", en el sentido aplicado a células vegetales, abarca no solo el ADN cromosómico encontrado dentro del núcleo, sino también el ADN de orgánulos encontrado en componentes subcelulares (por ejemplo, mitocondrias o plastidios) de la célula.
Un "gen con codones modificados" o "gen con codones preferidos" o "gen con codones optimizados" es un gen que tiene su frecuencia de uso de codones diseñada para imitar la frecuencia del uso de codones preferido de la célula hospedadora.
Un "alelo" es una de varias formas alternativas de un gen que ocupa un locus dado en un cromosoma. Cuando todos los alelos presentes en un locus dado en un cromosoma son iguales, esa planta es homocigota en ese locus. Si los alelos presentes en un locus dado en un cromosoma difieren, la planta es heterocigota en ese locus.
"Secuencia codificante" se refiere a una secuencia de polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos específica. "Secuencias reguladoras" se refiere a secuencias de nucleótidos ubicadas cadena arriba (secuencias no codificantes 5'), dentro o cadena abajo (secuencias no codificantes 3') de una secuencia codificante y que influyen en la transcripción, el procesamiento o la estabilidad del ARN o la traducción de la secuencia codificante asociada. Las secuencias reguladoras pueden incluir, pero sin limitación: promotores, secuencias líder de traducción, secuencias 5' no traducidas, secuencias 3' no traducidas, intrones, secuencias diana de poliadenilación, sitios de procesamiento de ARN, sitios de unión efectores y estructuras de tallo-bucle.
Una "secuencia de nucleótidos optimizada para plantas" es una secuencia de nucleótidos que se ha optimizado para una expresión aumentada en plantas, particularmente para una expresión aumentada en plantas o en una o más plantas de interés. Por ejemplo, puede sintetizarse una secuencia de nucleótidos optimizada para plantas modificando una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína, tal como, por ejemplo, un agente inductor de roturas bicatenarias (por ejemplo, una endonucleasa) como se divulga en el presente documento, usando uno o más codones preferidos para plantas para una expresión mejorada. Véase, por ejemplo, Campbell y Gowri (1990) Plant Physiol.
92:1-11 para un análisis del uso de codones preferido para hospedadores.
Se encuentran disponibles en la técnica métodos para sintetizar genes preferidos para plantas. Véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos n.° 5.380.831 y 5.436.391 y Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498. Se sabe que modificaciones adicionales de secuencia potencian la expresión génica en un hospedador vegetal. Estos incluyen, por ejemplo, la eliminación de: una o más secuencias que codifican señales de poliadenilación espurias, una o más señales de sitio de corte y empalme de exón-intrón, una o más repeticiones de tipo transposón y otras secuencias similares bien caracterizadas que pueden ser perjudiciales para la expresión génica. El contenido de G-C de la secuencia puede ajustarse a niveles promedio para un hospedador vegetal dado, como se calcula por referencia a genes conocidos expresados en la célula hospedadora vegetal. Cuando sea posible, la secuencia se modifica para evitar una o más estructuras de ARNm secundarias en horquilla predichas. Por lo tanto, una "secuencia de nucleótidos optimizada para plantas" de la presente divulgación comprende una o más de dichas modificaciones de secuencia.
"Promotor" se refiere a una secuencia de ADN capaz de controlar la expresión de una secuencia codificante o ARN funcional. La secuencia promotora consiste en elementos proximales y más distales cadena arriba, citándose estos últimos elementos normalmente como potenciadores. Un "potenciador" es una secuencia de ADN que puede estimular la actividad promotora y puede ser un elemento innato del promotor o un elemento heterólogo insertado para potenciar el nivel de especificidad de tejido de un promotor. Los promotores pueden obtenerse en su totalidad de un gen nativo o estar compuestos de diferentes elementos obtenidos de diferentes promotores hallados en la naturaleza y/o incluso comprenden segmentos de ADN sintéticos. Los expertos en la materia entienden que diferentes promotores pueden dirigir la expresión de un gen en diferentes tejidos o tipos celulares o en diferentes estadios del desarrollo o en respuesta a diferentes condiciones ambientales. Se reconoce además que ya que en la mayoría de los casos los límites exactos de las secuencias reguladoras no se han definido completamente, los fragmentos de ADN con cierta variación pueden tener una actividad promotora idéntica. Los promotores que provocan que un gen se exprese en la mayoría de tipos celulares la mayor parte del tiempo se denominan habitualmente "promotores constitutivos".
Se ha demostrado que ciertos promotores son capaces de dirigir la síntesis de ARN a una mayor velocidad que otros. Estos se denominan "promotores fuertes". Se ha demostrado que otros promotores concretos dirigen la síntesis de ARN a mayores niveles solo en tipos de células o tejidos particulares y normalmente se denominan "promotores específicos de tejido" o "promotores preferidos de tejido" en caso de que los promotores dirijan la síntesis de ARN preferentemente en ciertos tejidos, pero también en otros tejidos a niveles reducidos. Ya que los patrones de expresión de un gen quimérico (o genes quiméricos) introducido en una planta se controlan usando promotores, hay un interés continuo en el aislamiento de nuevos promotores que sean capaces de controlar la expresión de un gen quimérico (o genes quiméricos) a ciertos niveles en tipos de tejido específicos o en estados de desarrollo de la planta específicos.
Se descubren constantemente nuevos promotores de diversos tipos útiles en células vegetales; pueden encontrarse numerosos ejemplos en la compilación de Okamuro y Goldberg, (1989) en The Biochemistry of Plants, Vol. 115, Stumpf y Conn, eds (Nueva York, NY: Academic Press), págs. 1-82.
"Secuencia líder de traducción" se refiere a una secuencia de polinucleótido ubicada entre la secuencia promotora de un gen y la secuencia codificante. La secuencia líder de traducción se encuentra presente en el ARNm completamente procesado cadena arriba de la secuencia de inicio de la traducción. La secuencia líder de traducción puede afectar al procesamiento del transcrito primario en ARNm, a la estabilidad del ARNm o a la eficacia de la traducción. Se han descrito ejemplos de secuencias líder de traducción (por ejemplo, Turner y Foster, (1995) Mol Biotechnol 3:225-236).
"Secuencias no codificantes 3'", "terminador de la transcripción" o "secuencias de terminación" se refieren a secuencias de ADN ubicadas cadena debajo de una secuencia codificante e incluyen secuencias de reconocimiento de poliadenilación y otras secuencias que codifican señales reguladoras capaces de afectar al procesamiento del ARNm o a la expresión génica. La señal de poliadenilación se caracteriza normalmente por afectar a la adición de tramos de ácido poliadenílico al extremo 3' del precursor del ARNm. El uso de diferentes secuencias 3' no codificantes se ilustra por Ingelbrecht et al., (1989) Plant Cell 1:671-680.
"Transcrito de ARN" se refiere al producto resultante de la transcripción catalizada por ARN polimerasa de una secuencia de ADN. Cuando el transcrito de ARN es una copia complementaria perfecta de la secuencia de ADN, se denomina transcrito primario. Un transcrito de ARN se denomina ARN maduro cuando es una secuencia de ARN procedente del procesamiento postranscripcional del transcrito primario. "ARN mensajero" o "ARNm" se refiere al ARN que se encuentra sin intrones y que puede traducirse en una proteína por parte de la célula. "ADNc" se refiere a un ADN que es complementario a y se sintetiza a partir de, un molde de ARNm usando la enzima retrotranscriptasa. El ADNc puede ser monocatenario o convertirse en su forma bicatenaria usando el fragmento Klenow de ADN polimerasa I. El ARN "sentido" se refiere a un transcrito de ARN que incluye el ARNm y puede traducirse en una proteína dentro de una célula o in vitro. "ARN antisentido" se refiere a un transcrito de ARN que es complementario a la totalidad o parte de un transcrito diana primario o ARNm y que bloquea la expresión de un gen diana (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos n.° 5.107.065). La complementariedad de un ARN antisentido puede ser con cualquier parte del transcrito génico específico, es decir, en la secuencia 5' no codificante, la secuencia 3' no codificante, intrones o la secuencia codificante. "ARN funcional" se refiere a ARN antisentido, ARN de ribozima u otro ARN que puede no traducirse pero que aun así, tiene un efecto en procesos celulares. Los términos "complemento" y "complemento inverso" se usan indistintamente en el presente documento respecto de los transcritos de ARNm y se pretende que defina el ARN antisentido del mensaje.
La expresión "unido operativamente" se refiere a la asociación de secuencias de ácido nucleico en un solo fragmento de ácido nucleico, de tal forma que la función de una está regulada por la otra. Por ejemplo, un promotor está unido operativamente con una secuencia codificante cuando es capaz de regular la expresión de esa secuencia codificante (es decir, la secuencia codificante está bajo el control transcripcional del promotor). Las secuencias codificantes pueden unirse operativamente a secuencias reguladoras en una orientación sentido o antisentido. En otro ejemplo, las regiones de ARN complementarias pueden estar unidas operativamente, tanto directa como indirectamente, en 5' respecto del ARNm diana o en 3' respecto del ARNm diana o dentro del ARNm diana o una primera región complementaria se encuentra en 5' y su complemento se encuentra en 3' respecto del ARNm diana.
Se conocen bien en este campo técnicas convencionales de ADN recombinante y clonación molecular y se describen con más detalle en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1989). Los métodos de transformación son bien conocidos por los expertos en la materia y se describen más adelante.
"PCR" o "reacción en cadena de la polimerasa" es una técnica para la síntesis de segmentos de ADN específicos y consiste en una serie de ciclos repetitivos de desnaturalización, hibridación y extensión. Típicamente, se desnaturaliza térmicamente un ADN bicatenario y se hibridan a baja temperatura al a Dn dos cebadores complementarios a los extremos 3' del segmento diana y después se extienden a una temperatura intermedia. Un conjunto de estas tres etapas consecutivas se denomina un "ciclo".
El término "recombinante" se refiere a una combinación artificial de dos segmentos de secuencia por lo demás separados, por ejemplo, mediante síntesis química o manipulación de segmentos aislados de ácidos nucleicos mediante técnicas de ingeniería genética.
Los términos "plásmido", "vector'' y "casete" se refieren a un elemento extracromosómico que normalmente porta genes que no forman parte del metabolismo central de la célula y normalmente se encuentra en forma de ADN bicatenario. Dichos elementos pueden ser secuencias de replicación autónoma, secuencias que se integran en el genoma, secuencias de fagos o de nucleótidos, en forma lineal o circular, de un ADN o ARN mono o bicatenario, obtenidas de cualquier fuente, en las que se ha unido o recombinado una serie de secuencias de nucleótidos en una sola construcción que es capaz de introducir un polinucleótido de interés en una célula. "Casete de transformación" se refiere a un vector específico que contiene un gen exógeno y que tiene elementos además del gen exógeno que facilitan la transformación de una célula hospedadora particular. "Casete de expresión" se refiere a un vector específico que contiene un gen exógeno y que tiene elementos además del gen exógeno que permiten la expresión de ese gen en un hospedador extraño.
Las expresiones "molécula de ADN recombinante", "construcción recombinante", "construcción de expresión", "construcción" y "construcción de ADN recombinante" se usan indistintamente en el presente documento. Una construcción recombinante comprende una combinación artificial de fragmentos de ácido nucleico, por ejemplo, secuencias reguladoras y codificantes que no se encuentran en su totalidad juntas en la naturaleza. Por ejemplo, una construcción puede comprender secuencias reguladoras y secuencias codificantes que proceden de diferentes fuentes o secuencias reguladoras y secuencias codificantes procedentes de la misma fuente, pero dispuestas de una manera diferente que la encontrada en la naturaleza. Dicha construcción puede usarse sola o puede usarse en conjunción con un vector. En caso de que se use un vector, la elección del vector depende del método que se usará para transformar células hospedadoras, como es bien sabido por los expertos en la materia. Por ejemplo, puede usarse un vector plasmídico. El experto en la materia será consciente de los elementos genéticos que han de estar presentes en el vector para transformar, seleccionar y propagar con éxito células hospedadoras. El experto en la materia reconocerá también que diferentes eventos de transformación independientes pueden dar como resultado diferentes niveles y patrones de expresión (Jones et al., (1985) EMBO J 4:2411-2418; De Almeida et al., (1989) Mol Gen Genetics 218:78-86) y por lo tanto, que normalmente se exploran múltiples eventos para obtener líneas que presenten el nivel y patrón de expresión deseado. Dicha exploración puede lograrse usando ensayos de biología molecular, bioquímicos y otros convencionales, incluyendo análisis de Southern del ADN, análisis de Northern de la expresión de ARNm, PCR, PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR), PCR de retrotranscripción (RT-PCR), análisis de inmunotransferencia de la expresión de proteínas, ensayos enzimáticos o de actividad y/o análisis fenotípico.
El término "expresión", tal como se usa en el presente documento, se refiere a la producción de un producto final funcional (por ejemplo, un ARNm, polinucleótido guía o una proteína) en forma precursora o madura.
El término "introducido" significa proporcionar un ácido nucleico (por ejemplo, construcción de expresión) o proteína en una célula. Introducido incluye referencia a la incorporación de un ácido nucleico en una célula eucariota o procariota, donde puede incorporarse el ácido nucleico en el genoma de la célula, e incluye referencia a la provisión transitoria de un ácido nucleico o proteína a la célula. Introducido incluye referencia a métodos de transformación estable o transitoria, así como cruzamiento sexual. Por lo tanto, "introducido" en el contexto de insertar un fragmento de ácido nucleico (por ejemplo, una construcción de ADN recombinante/construcción de expresión) en una célula, significa "transfección" o "transformación" o "transducción" e incluye referencia a la incorporación de un fragmento de ácido nucleico en una célula eucariota o procariota, donde el fragmento de ácido nucleico puede incorporarse ene l genoma de la célula (por ejemplo, cromosoma, plásmido, plastidio o ADN cromosómico), convertido en un replicón autónomo o expresado de forma transitoria (por ejemplo, ARNm transfectado).
Proteína "madura" se refiere a un polipéptido procesado postraduccionalmente (es decir, uno del que se han retirado los pre o propéptidos presentes en el producto de traducción primario). Proteína "precursora" se refiere al producto primario de la traducción del ARNm (es decir, con pre y propéptidos aún presentes). Los pre y propéptidos pueden ser, pero sin limitación, señales de localización intracelular.
"Transformación estable" se refiere a la transferencia de un fragmento de ácido nucleico en un genoma de un organismo hospedador, incluyendo genomas tanto nucleares como de orgánulos, que da como resultado herencia genéticamente estable. Por el contrario, "transformación transitoria" se refiere a la transferencia de un fragmento de ácido nucleico en el núcleo u otro orgánulo que contenga ADN, de un organismo hospedador, dando como resultado expresión génica sin integración o herencia estable. Los organismos hospedadores que contienen los fragmentos de ácido nucleico transformados se denominan organismos "transgénicos".
El desarrollo comercial de germoplasmas genéticamente mejorados también ha avanzado hasta el punto de introducir múltiples rasgos en plantas de cultivo, a menudo citado como estrategia de apilamiento de genes. En este enfoque, pueden introducirse múltiples genes que confieren diferentes características de interés en una planta. El apilamiento de genes puede lograrse por muchos medios, incluyendo, pero sin limitación, la cotransformación, retrotransformación y cruzamiento de líneas con diferentes genes de interés.
El término "planta" se refiere a plantas enteras, órganos de plantas, tejidos de plantas, semillas, células vegetales, semillas y descendencia de los mismos. Las células vegetales incluyen, sin limitación, células de semillas, cultivos en suspensión, embriones, regiones meristemáticas, tejido de callo, hojas, raíces, brotes, gametofitos, esporofitos, polen y micrósporas. Las partes de plantas incluyen tejidos diferenciados y no diferenciados, incluyendo, pero sin limitación, raíces, vástagos, brotes, hojas, pólenes, semillas, tejido tumoral y diversas formas de células y cultivos (por ejemplo, células individuales, protoplastos, embriones y tejido de callo). El tejido de planta puede encontrarse en una planta o en un órgano de planta, tejido o cultivo celular. La expresión "órgano de planta" se refiere a tejido de planta o a un grupo de tejidos que constituyen una parte morfológica y funcionalmente distinta de una planta. El término "genoma" se refiere al complemento completo de material genético (genes y secuencias no codificantes) que está presente en cada célula de un organismo o virus u orgánulo; y/o un conjunto completo de cromosomas heredados como una unidad (haploide) de un progenitor. "Descendencia" comprende cualquier generación posterior de una planta.
Una planta transgénica incluye, por ejemplo, una planta que comprende en su genoma un polinucleótido heterólogo introducido mediante una etapa de transformación. El polinucleótido heterólogo puede estar integrado de manera estable en el genoma, de tal forma que el polinucleótido se pasa a las generaciones posteriores. El polinucleótido heterólogo puede estar integrado en el genoma solo o como parte de una construcción de ADN recombinante. Una planta transgénica también puede comprender más de un polinucleótido heterólogo en su genoma. Cada polinucleótido heterólogo puede conferir un rasgo diferente a la planta transgénica. Un polinucleótido heterólogo puede incluir una secuencia que tiene como origen una especie exógena o, si es de la misma especie, puede estar sustancialmente modificado respecto de su forma nativa. Transgénico puede incluir cualquier célula, línea celular, callo, tejido, parte de planta o planta, cuyo genotipo se ha alterado mediante la presencia de ácido nucleico heterólogo que incluye aquellos transgénicos alterados inicialmente de este modo, así como aquellos creados mediante cruces sexuales o propagación asexual a partir del transgénico inicial. Las alteraciones del genoma (cromosómicas o extracromosómicas) mediante métodos de fitomejoramiento convencionales, mediante el procedimiento de edición genómica descrito en el presente documento que no da como resultado una inserción de un polinucleótido exógeno o mediante eventos de origen natural, tales como fertilización cruzada aleatoria, infección vírica no recombinante, transformación bacteriana no recombinante, transposición no recombinante o mutación espontánea no deben considerarse como transgénicas.
En una realización de la divulgación, la composición comprende una planta o semilla que comprende una construcción de ADN recombinante y un polinucleótido guía, en donde dicho polinucleótido guía comprende ADN, en donde, preferentemente, el polinucleótido guía es una secuencia de ADN o una secuencia de combinación de ARN-ADN, en donde dicha construcción de ADN recombinante comprende un promotor unido operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica una endonucleasa Cas optimizada para plantas, en donde dicha endonucleasa Cas optimizada para plantas y el polinucleótido guía son capaces de formar un complejo y crear una rotura bicatenaria en un sitio diana genómico de dicha planta.
En otra realización de la divulgación, la composición comprende además un polinucleótido de interés integrado en un sitio diana genómico de dicha planta.
En otra realización de la divulgación, la composición comprende además una modificación en el sitio diana genómico, en donde la modificación se selecciona entre el grupo que consiste en (i) un reemplazo de al menos un nucleótido, (ii) una eliminación de al menos un nucleótido, (iii) una inserción de al menos un nucleótido y (iv) cualquier combinación de (i) -(iii).
En el presente documento también se divulga una planta o semilla que comprende al menos una secuencia diana alterada, en donde la al menos una secuencia diana alterada originaria de una secuencia diana correspondiente que se reconoció y escindió por un complejo de polinucleótido guía/endonucleasa Cas, en donde la endonucleasa Cas es capaz de introducir una rotura bicatenaria en dicho sitio diana en el genoma de la planta, en donde dicho polinucleótido guía no solo comprende ácidos ribonucleicos.
En el presente documento también se divulga una planta o semilla que comprende una secuencia de nucleótidos modificada, en donde la secuencia de nucleótidos modificada se produjo proporcionando un polinucleótido guía, un molde de modificación de polinucleótido y al menos una endonucleasa Cas en una célula, en donde dicho polinucleótido guía no solo comprende ácidos ribonucleicos, en donde la endonucleasa Cas es capaz de introducir una rotura bicatenaria en un sitio diana en el genoma de la planta, en donde dicho molde de modificación de polinucleótido comprende al menos una modificación de nucleótidos de dicha secuencia de nucleótidos.
En ciertas realizaciones de la divulgación, una planta fértil es una planta que produce gametos masculinos y femeninos viables y es auto-fértil. Dicha planta auto-fértil puede producir una planta descendiente sin la contribución de cualquier otro gameto de una planta y el material genético contenido en el mismo. Otras realizaciones de la divulgación pueden implicar el uso de una planta que no es auto-fértil, debido a que la planta no produce gametos masculinos o gametos femeninos o ambos, que sean viables o de otro modo capaces de fertilización. Como se usa en el presente documento, una "planta estéril masculina" es una planta que no produce gametos masculinos que sean viables o de otro modo capaces de fertilización. Como se usa en el presente documento, una "planta estéril femenina" es una planta que no produce gametos femeninos que sean viables o de otro modo capaces de fertilización. Se reconoce que las plantas masculinas estériles y femeninas estériles pueden ser femeninas fértiles y masculinas fértiles, respectivamente. Además se reconoce que una planta fértil masculina (pero estéril femenina) puede producir una descendencia viable cuando se cruza con una planta fértil femenina y que una planta fértil femenina (pero estéril masculina) puede producir descendencia viable cuando se cruza con una planta fértil femenina.
Un "centimorgan" (cM) o "unidad de mapa" es la distancia entre dos genes, marcadores, sitios diana, locus o cualquier par de los mismos ligados, en donde un 1 % de los productos de la meiosis son recombinantes. Por lo tanto, un centimorgan es equivalente a una distancia igual a un 1 % de frecuencia de recombinación media entre los dos genes, marcadores, sitios diana, locus o cualquier par de los mismos ligados.
Métodos de fitomejoramiento y métodos para seleccionar plantas utilizando un sistema de ARN guía y endonucleasa Cas de dos componentes.
La presente divulgación es útil en el fitomejoramiento de plantas que comprenden uno o más rasgos transgénicos. Muy frecuentemente, los rasgos transgénicos se insertan aleatoriamente a lo largo del genoma de la planta como consecuencia de sistemas de transformación basados en Agrobacterium, biolística u otros procedimientos comúnmente empleados. Más recientemente, se han desarrollado protocolos de direccionamiento génico que permiten la inserción de transgenes dirigida. Una tecnología importante, la integración de sitio específico (SSI), permite el direccionamiento de un transgén a la misma ubicación cromosómica que un transgén previamente insertado. Las meganucleasas diseñadas a medida y las meganucleasas de dedo de cinc diseñadas a medida permiten a los investigadores diseñar nucleasas para que actúen de manera específica en ubicaciones cromosómicas y permiten el direccionamiento de transgenes al sitio cromosómico escindido por estas nucleasas.
Los sistemas usados en la actualidad para ingeniería genética de precisión de genomas eucariotas, por ejemplo, genomas de plantas, se basan en endonucleasas de asentamiento, meganucleasas, nucleasas de dedo de cinc y nucleasas efectoras similares a activadores de la transcripción (TALEN), que requieren la ingeniería de proteínas de novo para cada nuevo locus diana.
El sistema de polinucleótido guía/endonucleasa Cas9 altamente específico descrito en el presente documento, puede personalizarse más fácilmente y por lo tanto, es más útil cuando el objetivo es la modificación de muchas secuencias diana diferentes. En una realización, la divulgación aprovecha la naturaleza multicomponente del sistema de polinucleótido guía/Cas, con su componente constante de proteína, la endonucleasa Cas y su componente de direccionamiento variable y fácilmente reprogramable, el polinucleótido guía. Como se describe en el presente documento, el polinucleótido guía puede comprender un ADN, ARN o una secuencia de combinación de a DN-ARN, lo que lo hace muy personalizable y por lo tanto, más útil cuando el objetivo es la modificación de una o varias secuencias diana diferentes. En realizaciones de la invención, el polinucleótido guía comprende ADN.
El sistema de polinucleótido guía/Cas descrito en el presente documento es especialmente útil para ingeniería genómica, especialmente ingeniería genómica de plantas, en circunstancias donde el corte fuera de la diana de la nucleasa puede ser tóxico para las células diana. En una realización del sistema de polinucleótido guía/Cas descrito en el presente documento, el componente constante, en forma de un gen de Cas9 con expresión optimizada, se integra de manera estable en el genoma diana, por ejemplo, genoma vegetal. La expresión del gen de Cas9 se encuentra bajo el control de un promotor, por ejemplo, promotor de plantas, que puede ser un promotor constitutivo, un promotor específico de tejido o promotor inducible, por ejemplo, inducible por temperatura, inducible por estrés, inducible por un estadio del desarrollo o promotor inducible químicamente. En ausencia del dominio de direccionamiento variable, del polinucleótido guía, la proteína Cas no es capaz de reconocer y cortar el ADN y por lo tanto, su presencia en la planta debe tener pocas o ninguna consecuencia. Por lo tanto, una ventaja clave del sistema de polinucleótido guía/Cas descrito en el presente documento es la capacidad de crear y mantener una línea celular u organismo transgénico capaz de expresar de manera estable la proteína Cas con pocas o ninguna consecuencia en la viabilidad celular. A fin de inducir el corte en sitios genómicos deseados para lograr modificaciones genéticas dirigidas, los polinucleótidos guía pueden introducirse mediante diversos métodos en células que contienen el gen Cas integrado de manera estable y expresado. Por ejemplo, los polinucleótidos guía pueden sintetizarse química o enzimáticamente e introducirse en las células que expresan Cas mediante métodos de suministro directo, tales como bombardeo de partículas o electroporación.
Como alternativa, los genes capaces de expresar de manera eficaz polinucleótidos guía en las células diana pueden sintetizarse químicamente, enzimáticamente o en un sistema biológico y estos genes pueden introducirse en las células que expresan Cas mediante métodos de suministro directos, tales como bombardeo de partículas, electroporación o métodos de suministro biológico, tales como suministro de ADN mediado por Agrobacterium.
En el presente documento también se divulga un método para seleccionar una planta que comprende un sitio diana alterado en su genoma vegetal, comprendiendo el método: a) obtener una primera planta que comprende al menos una endonucleasa Cas capaz de introducir una rotura bicatenaria en un sitio diana en el genoma vegetal; b) obtener una segunda planta que comprende un polinucleótido guía que es capaz de formar un complejo con la endonucleasa Cas de (a), en donde el polinucleótido guía no comprende únicamente ácidos ribonucleicos, c) cruzar la primera planta de (a) con la segunda planta de (b); d) evaluar la descendencia de (c) respecto de una alteración en el sitio diana y e) seleccionar una planta descendiente que posee la alteración deseada de dicho sitio diana.
En el presente documento también se divulga un método para seleccionar una planta que comprende un sitio diana alterado en su genoma vegetal, comprendiendo el método: a) obtener una primera planta que comprende al menos una endonucleasa Cas capaz de introducir una rotura bicatenaria en un sitio diana en el genoma vegetal; b) obtener una segunda planta que comprende un polinucleótido guía y un ADN donante, en donde el polinucleótido guía no solo comprende ácidos ribonucleicos, en donde dicho polinucleótido guía es capaz de formar un complejo con la endonucleasa Cas de (a), en donde dicho ADN donante comprende un polinucleótido de interés; c) cruzar la primera planta de (a) con la segunda planta de (b); d) evaluar la descendencia de (c) respecto de una alteración en el sitio diana y e) seleccionar una planta descendiente que comprende el polinucleótido de interés insertado en dicho sitio diana.
En el presente documento también se divulga un método para seleccionar una planta que comprende un sitio diana alterado en su genoma vegetal, comprendiendo el método seleccionar al menos una planta descendiente que comprende una alteración en un sitio diana en su genoma vegetal, en donde dicha planta descendiente se obtuvo mediante cruzamiento de una primera planta que expresa al menos una endonucleasa Cas con una segunda planta que comprende un polinucleótido guía y un ADN donante, en donde el polinucleótido guía no solo comprende ácidos ribonucleicos, en donde dicha endonucleasa Cas es capaz de introducir una rotura bicatenaria en dicho sitio diana, en donde dicho ADN donante comprende un polinucleótido de interés.
Como se divulga en el presente documento, puede usarse un sistema de polinucleótido guía/Cas que media el direccionamiento génico en métodos para dirigir la inserción de transgenes y/o para producir locus de rasgos transgénicos complejos que comprenden múltiples transgenes de un modo similar al divulgado en el documento WO2013/0198888 (publicado el 1 de agosto de 2013) donde en lugar de usar un agente inductor de roturas bicatenarias para introducir un gen de interés, se usa un sistema de polinucleótido guía/Cas como se divulga en el presente documento. En una realización, un locus de rasgo transgénico complejo es un locus genómico que tiene múltiples transgenes unidos genéticamente entre sí. Mediante la inserción de transgenes independientes a 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1,2 o incluso 5 centimorgan (cM) entre sí, los transgenes pueden formarse como un solo locus genético (véase, por ejemplo, la Solicitud de Patente de los Estados Unidos 13/427.138 o la Solicitud PCT PCT/US2012/030061). Después de seleccionar una planta que comprende un transgén, las plantas que contienen (al menos) un transgén pueden cruzarse para formar una F1 que contiene ambos transgenes. En la descendencia de estas F1 (F2 o BC1), 1/500 de la descendencia podría tener los dos transgenes diferentes recombinados en el mismo cromosoma. Después, puede crearse el locus completo en forma de un solo locus genético con ambos rasgos transgénicos. Este proceso puede repetirse para apilar tantos rasgos como se desee.
Las proteínas pueden alterarse de diversas maneras incluyendo sustituciones, eliminaciones, truncamientos e inserciones de aminoácidos. Se conocen generalmente métodos para dichas manipulaciones. Por ejemplo, pueden prepararse variantes de secuencia de aminoácidos de las proteínas mediante mutaciones en el ADN. Los métodos para la mutagénesis y alteraciones de la secuencia de nucleótidos incluyen, por ejemplo, Kunkel, (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-92; Kunkel et al., (1987) Meth Enzymol 154:367-82; Patente de los Estados Unidos n.° 4.873.192; Walker y Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, Nueva York) y las referencias citados en los mismos. Puede encontrarse orientación acerca de las sustituciones de aminoácidos que no es probable que afecten a la actividad biológica de la proteína, por ejemplo, en el modelo de Dayhoff et al., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl Biomed Res Found, Washington, D.C.). Pueden ser preferibles las sustituciones conservativas, tales como el intercambio de un aminoácido por otro aminoácido que tenga propiedades similares. No se espera que las eliminaciones, inserciones y sustituciones de aminoácidos conservativas produzcan cambios radicales en las características de la proteína y puede evaluarse el efecto de cualquier sustitución, eliminación, inserción o combinación de las mismas mediante ensayos de exploración rutinarios. Se conocen ensayos de actividad de rotura bicatenaria y generalmente miden la actividad y la especificidad general del agente en sustratos de ADN que contienen sitios diana.
Se conoce una variedad de métodos para la introducción de secuencias de nucleótidos y polipéptidos en un organismo, incluyendo, por ejemplo, transformación, cruzamiento sexual y la introducción del polipéptido, ADN o ARNm en la célula.
Los métodos para poner en contacto, proporcionar y/o introducir una composición en diversos organismos se conocen e incluyen, pero sin limitación, métodos de transformación estable, métodos de transformación transitoria, métodos mediados por virus y cruzamiento sexual. La transformación estable indica que el polinucleótido introducido se integra en el genoma del organismo y puede heredarse por la descendencia del mismo. La transformación transitoria indica que la composición introducida solo se expresa o está presente de manera temporal en el organismo.
Los protocolos para introducir polinucleótidos y polipéptidos en plantas pueden variar dependiendo del tipo de planta o célula vegetal usada como diana para la transformación, tal como monocotiledóneas o dicotiledóneas. Los métodos adecuados para introducir polinucleótidos y polipéptidos en células vegetales y su posterior inserción en el genoma vegetal incluyen microinyección (Crossway et al., (1986) Biotechniques 4:320-34 y Patente de los Estados Unidos n.° 6.300.543), transformación de meristemos (Patente de los Estados Unidos n.° 5.736.369), electroporación (Riggs et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602-6, transformación mediada por Agrobacterium (Patentes de los Estados Unidos n.° 5.563.055 y 5.981.840), transferencia génica directa (Paszkowski et al., (1984) EMBO J 3:2717-22) y aceleración de partículas biolísticas (Patentes de los Estados Unidos n.° 4.945.050; 5.879.918; 5.886.244; 5.932.782; Tomes et al., (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment" en Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg y Phillips (Springer-Verlag, Berlín); McCabe et al., (1988) Biotechnology 6:923-6; Weissinger et al., (1988) Ann Rev Genet 22:421-77; Sanford et al., (1987) Particulate Science and Technology 5:27-37 (cebolla); Christou et al., (1988) Plant Physiol 87:671-4 (soja); Finer y McMullen, (1991) In Vitro Cell Dev Biol 27P:175-82 (soja); Singh et al., (1998) Theor Appl Genet 96:319-24 (soja); Datta et al., (1990) Biotechnology 8:736-40 (arroz); Klein et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4305-9 (maíz); Klein et al., (1988) Biotechnology 6:559-63 (maíz); las Patentes de los Estados Unidos n.° 5.240.855; 5.322.783 y 5.324.646; Klein et al., (1988) Plant Physiol 91:440-4 (maíz); Fromm et al., (1990) Biotechnology 8:833-9 (maíz); Hooykaas-Van Slogteren et al., (1984) Nature 311:763-4; patente de los Estados Unidos n.° 5.736.369 (cereales); Bytebier et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5345-9 (Lilíaceas); De Wet et al., (1985) en The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman et al., (Longman, Nueva York), págs. 197-209 (polen); Kaeppler et al., (1990) Plant Cell Rep 9:415-8) y Kaeppler et al., (1992) Theor Appl Genet 84:560-6 (transformación mediada por bigotes); D'Halluin et al., (1992) Plant Cell 4:1495-505 (electroporación); Li et al., (1993) Plant Cell Rep 12:250-5; Christou y Ford (1995) Annals Botany 75:407-13 (rice) y Osjoda et al., (1996) Nat Biotechnol 14:745-50 (maíz mediante Agrobacterium tumefaciens).
Como alternativa, los polinucleótidos pueden introducirse en plantas poniendo en contacto las plantas con un virus o ácidos nucleicos víricos. En general, dichos métodos implican incorporar un polinucleótido en una molécula de ADN o ARN vírico. En algunos ejemplos, puede sintetizarse inicialmente un polipéptido de interés como parte de una poliproteína vírica, que posteriormente se procesa mediante proteólisis in vivo o in vitro para producir la proteína recombinante deseada. Se conocen métodos para introducir polinucleótidos en plantas y expresar una proteína codificada en los mismos que implican moléculas de ADN o ARN vírico, véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos n.° 5.889.191, 5.889.190, 5.866.785, 5.589.367 y 5.316.931. Los métodos de transformación transitoria incluyen, pero sin limitación, la introducción de polipéptidos, tales como un agente inductor de roturas bicatenarias, directamente en el organismo, la introducción de polinucleótidos, tales como polinucleótidos de ADN y/o ARN y la introducción del transcrito de ARN, tal como un ARNm que codifica un agente inductor de roturas bicatenarias, en el organismo. Dichos métodos incluyen, por ejemplo, microinyección o bombardeo con partículas. Véanse, por ejemplo, Crossway et al., (1986) Mol Gen Genet 202:179-85; Nomura et al., (1986) Plant Sci 44:53-8; Hepler et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2176-80; y, Hush et al., (1994) J Cell Sci 107:775-84.
El término "dicotiledónea" se refiere a la subclase de plantas angiospermas también conocida como "dicotyledoneae" e incluye referencia a plantas enteras, órganos de plantas (por ejemplo, hojas, vástagos, raíces, etc.), semillas, células vegetales y la descendencia de las mismas. Célula vegetal, como se usa en el presente documento, incluye, sin limitación, semillas, cultivos en suspensión, embriones, regiones meristemáticas, tejido de callo, hojas, raíces, brotes, gametofitos, esporofitos, polen y micrósporas.
El término "cruzado", "cruce" o "cruzamiento", en el contexto de la presente divulgación, significa la fusión de gametos mediante polinización para producir descendencia (es decir, células, semillas o plantas). El término abarca tanto cruces sexuales (la polinización de una planta por otra) y autofecundación (autopolinización, es decir, cuando el polen y el óvulo proceden de la misma planta o de plantas genéticamente idénticas).
El término "introgresión" se refiere a la transmisión de un alelo deseado de un locus deseado de un fondo genético a otro. Por ejemplo, la introgresión de un alelo deseado en un locus específico puede transmitirse a al menos una planta descendiente mediante un cruzamiento sexual entre dos plantas progenitoras, donde al menos una de las plantas progenitoras tiene el alelo deseado en su genoma. Como alternativa, por ejemplo, la transmisión de un alelo puede producirse mediante recombinación entre dos genomas donantes, por ejemplo, en un protoplasto fusionado, donde al menos uno de los protoplastos donantes tiene el alelo deseado en su genoma. El alelo deseado puede ser, por ejemplo, un transgén o un alelo seleccionado de un marcador o QTL.
Los métodos de aislamiento de ADN, purificación, clonación molecular, construcción de vectores y de verificación/caracterización convencionales están bien establecidos, véase, por ejemplo, Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, n Y). Los vectores y construcciones incluyen plásmidos circulares y polinucleótidos lineales, que comprenden un polinucleótido de interés y opcionalmente, otros componentes, incluyendo enlazadores, adaptadores, regiones reguladoras, intrones, sitios de restricción, potenciadores, aisladores, marcadores de selección, secuencias de nucleótidos de interés, promotores y/u otros sitios que ayudan a la construcción o el análisis del vector. En algunos ejemplos, un sitio de reconocimiento y/o un sitio diana pueden estar contenidos en un intrón, secuencia codificante, 5' UTR, 3' UTR y/o regiones reguladoras.
La presente divulgación proporciona adicionalmente construcciones de expresión para la expresión en una levadura o planta, célula vegetal o parte de planta de un sistema de polinucleótido guía/Cas que es capaz de unirse a y crear una rotura bicatenaria en un sitio diana. En una realización, las construcciones de expresión de la divulgación comprenden un promotor unido operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica un gen Cas y un promotor unido operativamente a un polinucleótido guía de la presente divulgación. El promotor es capaz de dirigir la expresión de una secuencia de nucleótido unida operativamente en una célula vegetal.
Un promotor es una región de ADN implicada en el reconocimiento y la unión de la ARN polimerasa y otras proteínas para iniciar la transcripción. Un promotor de plantas es un promotor capaz de iniciar la transcripción en una célula vegetal, para una revisión de los promotores de plantas, véase, Potenza et al., (2004) In Vitro Cell Dev Biol 40:1-22. Los promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, el promotor central del promotor Rsyn7 y otros promotores constitutivos desvelados en el documento WO99/43838 y la patente de los Estados Unidos n.° 6.072.050; el promotor central de CaMV 35S (Odell et al., (1985) Nature 313:810-2); actina de arroz (McElroy et al., (1990) Plant Cell 2:163-71); ubiquitina (Christensen et al., (1989) Plant Mol Biol 12:619-32; Christensen et al., (1992) Plant Mol Biol 18:675-89); pEMU (Last et al., (1991) Theor Appl Genet 81:581-8); MAS (Velten et al., (1984) EMBO J 3:2723-30); promotor ALS (Patente de los Estados Unidos n.° 5.659.026) y similares. Se describen otros promotores constitutivos en, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos n.° 5.608.149; 5.608.144; 5.604.121; 5.569.597; 5.466.785; 5.399.680; 5.268.463; 5.608.142 y 6.177.611. En algunos ejemplos, puede usarse un promotor inducible. Los promotores inducibles por patógenos inducidos después de la infección por un patógeno incluyen, pero sin limitación, aquellos que regulan la expresión de proteínas PR, proteínas SAR, beta-1,3-glucanasa, quitinasa, etc.
Pueden usarse promotores regulados por productos químicos para modular la expresión de un gen en una planta mediante la aplicación de un regulador químico exógeno. El promotor puede ser un promotor inducible por productos químicos, donde la aplicación del producto químico induce expresión génica, o un promotor reprimible por productos químicos, donde la aplicación del producto génico reprime la expresión génica. Los promotores inducibles por productos químicos incluyen, pero sin limitación, el promotor de In2-2 de maíz, activado por protectores contra herbicidas de bencenosulfonamida (De Veylder et al., (1997) Plant Cell Physiol 38:568-77), el promotor GST de maíz (GST-II-27, documento WO93/01294), activado por compuestos electrófilos hidrófilos usados como herbicidas antes de la emergencia y el promotor PR-1a de tabaco (Ono et al., (2004) Biosci Biotechnol Biochem 68:803-7) activado por ácido salicílico. Otros promotores regulados por productos químicos incluyen promotores sensibles a esteroides (véase, por ejemplo, el promotor inducible por glucocorticoides (Schena et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10421-5; McNellis et al., (1998) Plant J 14:247-257); promotores inducibles por tetraciclina y represibles por tetraciclina (Gatz et al., (1991) Mol Gen Genet 227:229-37; Patentes de los Estados Unidos n.° 5.814.618 y 5.789.156).
Los promotores preferidos por tejidos pueden utilizarse para dirigir la expresión potenciada en un tejido vegetal particular. Los promotores preferidos por tejidos incluyen, por ejemplo, Kawamata et al., (1997) Plant Cell Physiol 38:792-803; Hansen et al., (1997) Mol Gen Genet 254:337-43; Russell et al., (1997) Transgenic Res 6:157-68; Rinehart et al., (1996) Plant Physiol 112:1331-41; Van Camp et al., (1996) Plant Physiol 112:525-35; Canevascini et al., (1996) Plant Physiol 112:513-524; Lam, (1994) Results Probl Cell Differ 20:181-96; y Guevara-Garcia et al., (1993) Plant J 4:495-505. Los promotores preferidos por hojas incluyen, por ejemplo, Yamamoto et al., (1997) Plant J 12:255-65; Kwon et al., (1994) Plant Physiol 105:357-67; Yamamoto et al., (1994) Plant Cell Physiol 35:773-8; Gotor et al., (1993) Plant J 3:509-18; Orozco et al., (1993) Plant Mol Biol 23:1129-38; Matsuoka et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:9586-90; Simpson et al., (1958) EMBO J 4:2723-9; Timko et al., (1988) Nature 318:57-8. Los promotores preferidos por raíces incluyen, por ejemplo, Hire et al., (1992) Plant Mol Biol 20:207-18 (gen de glutamina sintasa específico para la raíz de la soja); Miao et al., (1991) Plant Cell 3:11-22 (glutamina sintasa (GS) citosólica); Keller y Baumgartner, (1991) Plant Cell 3:1051-61 (elemento de control específico de raíz en el gen de GRP 1.8 de haba); Sanger et al., (1990) Plant Mol Biol 14:433-43 (promotor específico de raíz de manopina sintasa de A. tumefaciens (MAS)); Bogusz et al., (1990) Plant Cell 2:633-41 (promotores específicos de raíz aislados de Parasponia andersonii y Trema tomentosa); Leach y Aoyagi, (1991) Plant Sci 79:69-76 (genes inductores de raíces rolC y rolD de A. rhizogenes); Teeri et al., (1989) EMBO J 8:343-50 (genes TR1' y TR2' inducidos por heridas de Agrobacterium); promotor del gen VfENOD-GRP3 (Kuster et al., (1995) Plant Mol Biol 29:759-72); y promotor rolB (Capana et al., (1994) Plant Mol Biol 25:681-91; gen de faseolina (Murai et al., (1983) Science 23:476-82; Sengopta-Gopalen et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3320-4). Véanse también, las Patentes de los Estados Unidos n.° 5.837.876; 5.750.386; 5.633.363; 5.459.252; 5.401.836; 5.110.732 y 5.023.179.
Los promotores preferidos de semillas incluyen tanto promotores específicos de semillas activos durante el desarrollo de la semilla, así como promotores de germinación de semillas activos durante la germinación de las semillas. Véase, Thompson et al., (1989) BioEssays 10:108. Los promotores preferidos de semillas incluyen, pero sin limitación, Cim1 (mensaje inducido por citocinina); cZ19B1 (zeína de 19 kDa de maíz); y milps (mioinositol-1-fosfato sintasa); (documento WO00/11177; y Patente de los Estados Unidos 6.225.529). Para dicotiledóneas, los promotores preferidos de semillas incluyen, pero sin limitación, p-faseolina de judías, napina, p-conglicinina, lectina de soja, cruciferina y similares. Para monocotiledóneas, los promotores preferidos de semillas incluyen, pero sin limitación, zeína de 15 kDa de maíz, zeína de 22 kDa, gamma zeína de 27 kDa, waxy, shrunken 1, shrunken 2, globulina 1, oleosina y nuc1. Véase también el documento WO00/12733, donde se divulgan promotores preferidos de semillas de los genes END1 y END2.
Un marcador fenotípico es un marcador explorable o de selección que incluye marcadores visuales y marcadores de selección, ya sea un marcador de selección positiva o negativa. Puede usarse cualquier marcador fenotípico. Específicamente, un marcador de selección o explorable comprende un segmento de ADN que permite identificar o seleccionar en favor o en contra de una molécula o una célula que lo contiene, normalmente en condiciones particulares. Estos marcadores pueden codificar una actividad, tal como, pero sin limitación, producción de ARN, péptido o proteína o pueden proporcionar un sitio de unión para el a Rn , péptidos, proteínas, compuestos o composiciones inorgánicos y orgánicos y similares.
Los ejemplos de marcadores de selección incluyen, pero sin limitación, segmentos de ADN que comprenden sitios de enzimas de restricción; segmentos de ADN que codifican productos que proporcionan resistencia contra compuestos por lo demás tóxicos, incluyendo antibióticos, tal como, espectinomicina, ampicilina, kanamicina, tetraciclina, Basta, neomicina fosfotransferasa II (NEO) e higromicina fosfotransferasa (HPT); segmentos de ADN que codifican productos que por lo demás están ausentes en la célula receptora (por ejemplo, genes de ARNt, marcadores auxotróficos); segmentos de ADN que codifican productos que pueden identificarse fácilmente (por ejemplo, marcadores fenotípicos, tales como p-galactosidasa, GUS; proteínas fluorescentes, tales como proteína fluorescente verde (GFP), cian (CFP), amarilla (y Fp ), roja (RFP) y proteínas de la superficie celular); la generación de nuevos sitios cebadores para la PCR (por ejemplo, la yuxtaposición de dos secuencias de ADN no yuxtapuestas con anterioridad), la inclusión de secuencias de a Dn sobre las que no ha activado o sobre las que ha activado una endonucleasa de restricción u otra enzima, agente químico, etc. modificador del ADN; y, la inclusión de una secuencia de ADN necesaria para una modificación específica (por ejemplo, metilación) que permite su identificación.
Los marcadores de selección adicionales incluyen genes que confieren resistencia a compuestos herbicidas, tales como glufosinato de amonio, bromoxinilo, imidazolinonas y 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D). Véanse, por ejemplo, Yarranton, (1992) Curr Opin Biotech 3:506-11; Christopherson et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6314-8; Yao et al., (1992) Cell 71:63-72; Reznikoff, (1992) Mol Microbiol 6:2419-22; Hu et al., (1987) Cell 48:555-66; Brown et al., (1987) Cell 49:603-12; Figge et al., (1988) Cell 52:713-22; Deuschle et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5400-4; Fuerst et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2549-53; Deuschle et al., (1990) Science 248:480-3; Gossen, (1993) Ph.D. Thesis, Universidad de Heidelberg; Reines et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1917-21; Labow et al., (1990) Mol Cell Biol 10:3343-56; Zambretti et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3952-6; Baim et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5072-6; Wyborski et al., (1991) Nucleic Acids Res 19:4647-53; Hillen y Wissman, (1989) Topics Mol Struc Biol 10:143-62; Degenkolb et al., (1991) Antimicrob Agents Chemother 35:1591-5; Kleinschnidt et al., (1988) Biochemistry 27:1094-104; Bonin, (1993) Ph.D. Thesis, Universidad de Heidelberg; Gossen et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. u Sa 89:5547-51; Oliva et al., (1992) Antimicrob Agents Chemother 36:913-9; Hlavka et al., (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlín); Gill et al., (1988) Nature 334:721-4.
Las células que tienen la secuencia introducida pueden cultivarse o regenerarse en plantas usando condiciones convencionales, véase por ejemplo, McCormick et al., (1986) Plant Cell Rep 5:81-4. Estas plantas pueden cultivarse y o bien polinizarse con la misma estirpe transformada o con una estirpe transformada o no transformada diferente y la descendencia resultante tiene la característica deseada y/o comprende el polinucleótido introducido o el polipéptido identificado. Pueden cultivarse dos o más generaciones para asegurar que el polinucleótido se mantiene de manera estable y se hereda y se recogen semillas.
Puede usarse cualquier planta, incluyendo plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas. Los ejemplos de plantas monocotiledóneas que pueden usarse incluyen, pero sin limitación, maíz (Zea mays), arroz (Oryza sativa), centeno (Secale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), mijo (por ejemplo, mijo perla (Pennisetum glaucum), mijo proso (Panicum miliaceum), mijo de cola de zorro (Setaria italica), mijo africano (Eleusine coracana)), trigo (Triticum aestivum), caña de azúcar (Saccharum spp.), avena (Avena), cebada (Hordeum), pasto varilla (Panicum virgatum), piña (Ananas comosus), plátano (Musa spp.), palma, plantas ornamentales, céspedes y otras hierbas. Los ejemplos de plantas dicotiledóneas que pueden usarse incluyen, pero sin limitación, soja (Glycine max), colza (Brassica napus y B. campestris), alfalfa (Medicago sativa), tabaco (Nicotiana tabacum), Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), girasol (Helianthus annuus), algodón (Gossypium arboreum) y cacahuete (Arachis hypogaea), tomate (Solanum lycopersicum), patata (Solanum tuberosum) etc.
Los transgenes, moléculas de ADN recombinante, secuencias de ADN de interés y polinucleótidos de interés pueden comprender uno o más genes de interés. Dichos genes de interés pueden codificar, por ejemplo, una proteína que proporciona una ventaja agronómica a la planta.
Selección asistida por marcadores y fitomejoramiento de plantas
Una motivación principal para el desarrollo de marcadores moleculares en una especie de cultivo es el potencial de eficacia aumentada en el fitomejoramiento de plantas mediante selección asistida por marcadores (MAS). Los alelos marcadores genéticos o como alternativa, los locus de rasgos cuantitativos (alelos QTL) se usan para identificar plantas que contienen un genotipo deseado en uno o más locus y que se espera que transfieran el genotipo deseado, junto con un fenotipo deseado a su descendencia. Los alelos marcadores genéticos (o alelos QTL) pueden usarse para identificar plantas que contienen un genotipo deseado en un locus o en varios locus ligados o no ligados (por ejemplo, un haplotipo) y que se podría esperar que transfieran el genotipo deseado, junto con un fenotipo deseado a su descendencia. Se apreciará que a efectos de MAS, el término marcador puede abarcar locus tanto marcadores como QTL.
Tras determinarse que un fenotipo y un locus cromosómico polimórfico, por ejemplo, un locus marcador o QTL, se segregan juntos, es posible usar estos locus polimórficos para seleccionar respecto de alelos correspondientes al fenotipo deseado - un proceso denominado selección asistida por marcadores (MAS). En resumen, se detecta un ácido nucleico correspondiente al ácido nucleico marcador en una muestra biológica de una planta que se va a seleccionar. Esta detección puede tomar la forma de hibridación de una sonda de ácido nucleico a un marcador, por ejemplo, usando hibridación específica de alelo, análisis de transferencia de Southern, análisis de transferencia de Northern, hibridación in situ, hibridación de cebadores seguido de amplificación PCR de una región del marcador o similares. Se conoce bien en la técnica una variedad de procedimientos para detectar marcadores. Después de verificar la presencia (o ausencia) de un marcador particular en la muestra biológica, se selecciona la planta, es decir, se usa para producir plantas descendientes mediante fitomejoramiento selectivo.
Los fitomejoradores necesitan combinar rasgos de interés con genes para alto rendimiento y otros rasgos deseables para desarrollar variedades de plantas mejoradas. La exploración de grandes números de muestras puede ser cara, laboriosa y poco fiable. El uso de marcadores y/o ácidos nucleicos genéticamente ligados es un método eficaz para seleccionar plantas que tengan los rasgos deseados en programas de fitomejoramiento. Por ejemplo, una ventaja de la selección asistida por marcadores frente a las evaluaciones en campo es que puede efectuarse MAS en cualquier época del año, independientemente de la estación de crecimiento. Además, los efectos ambientales son irrelevantes para la selección asistida por marcadores.
Cuando se segrega una población para múltiples locus que afectan a una o múltiples dianas, la eficacia de MAS en comparación con la exploración fenotípica es incluso mayor debido a que pueden procesarse todos los locus juntos en el laboratorio a partir de una sola muestra de ADN.
Los mecanismos de reparación del ADN de las células son la base para introducir ADN extraño o inducir mutaciones en genes endógenos. La recombinación de homólogos de ADN es una forma especializada de reparación del ADN con la que las células reparan el ADN usando una secuencia homóloga. En las plantas, la recombinación de homólogos del ADN sucede con frecuencias demasiado bajas como para usarse de manera rutinaria en el direccionamiento génico o edición génica hasta que se descubrió que el proceso puede estimularse mediante roturas bicatenarias del ADN (Bibikova et al., (2001) Mol. Cell Biol. 21:289-297; Puchta y Baltimore, (2003) Science 300:763; Wright et al., (2005) Plant J. 44:693-705).
El significado de las abreviaturas es el siguiente: "s" significa segundos, "min" significa minutos, "h" significa horas, "d" significa días, " jl" significa microlitros, "ml" significa mililitros, "l" significa litros, " |jM" significa micromolar, "mM" significa milimolar, "M" significa molar, "mmol" significa milimoles, "jimol" significa micromoles, "g" significa gramos, " jg " significa microgramos, "ng" significa nanogramos, "U" significa unidades, "pb" significa pares de bases y "kb" significa kilobases.
Ejemplos
La presente divulgación se define adicionalmente en los siguientes ejemplos, en los que las partes y porcentajes son en peso y los grados son Celsius, a menos que se indique otra cosa. Debe entenderse que estos ejemplos, aunque indican realizaciones de la divulgación, se proporcionan solamente a modo de ilustración. A partir del análisis anterior y de estos ejemplos, un experto en la materia puede determinar las características esenciales de la presente divulgación y pueden producir diversos cambios y modificaciones de la divulgación para adaptarla a diversos usos y condiciones. Dichas modificaciones pueden encontrarse dentro del alcance de las realizaciones adjuntas.
Ejemplo 1
Casetes de expresión optimizados para maíz para un sistema de polinucleótido guía dúplex/endonucleasa Cas para la modificación genómica en plantas de maíz
En este ejemplo, los casetes de expresión para la endonucleasa Cas9 y el ARN de CRISPR (ARNcr) maduro de origen natural completamente procesado y el ARN de CRISPR transactivante (ARNtracr) pertenecientes al sistema inmunitario vírico adaptativo de tipo II de S. pyogenes como de describe en Deltcheva et al. (2011) Nature 471:602-7 y Jinek et al. (2012) Science 337:816-21 están optimizados para maíz para examinar su uso como herramientas de ingeniería genómica.
Como se muestra en la figura 1A, las moléculas de nucleótido cr y nucleótido tracr compuestas enteramente por nucleótidos de ARN en este ejemplo, forman un dúplex formado por una primera secuencia de nucleótido citada como el dominio de "direccionamiento variable" (VT) y un segundo dominio de secuencia de nucleótidos, citado como el dominio de "reconocimiento de endonucleasa Cas" (CER). El dominio CER de un dúplex de polinucleótido de ARNcr y ARNtracr comprende dos moléculas separadas (una secuencia de nucleótidos 3' del dominio VT ubicado en el nucleótido cr y un nucleótido tracr) que se hibridan a lo largo de una región de complementariedad (figura 1A). El dominio VT ayuda a facilitar el reconocimiento del sitio diana de ADN mientras que el dominio CER promueve el reconocimiento por la proteína Cas9. Junto con la secuencia de motivo adyacente protoespaciador (PAM), ambos dominios del dúplex de polinucleótido de ARNcr/ARNtracr funcionan para guiar la escisión del sitio diana de ADN por la endonucleasa Cas y en el presente documento se citará como "polinucleótido guía dúplex", "ARN guía dúplex" o "dúplex de ARNcr/ARNtracr", como se describe en el ejemplo 1 de la Solicitud Provisional de los Estados Unidos 61/868706, presentada el 22 de agosto de 2013.
Para probar un sistema de polinucleótido guía dúplex/endonucleasa Cas en maíz, se optimizó para codones de maíz el gen de Cas9 de Streptococcus pyogenes M1 GAS (SF370) (SEQ ID NO: 1) mediante técnicas convencionales conocidas en la técnica y se introdujo el intrón ST-LS1 de patata (SEQ ID NO: 2) para eliminar su expresión en E. coli y Agrobacterium (figura 2A). Para facilitar la localización nuclear de la proteína Cas9 en células de maíz, se incorporaron las secuencias de localización nuclear monopartita de virus de simio 40 (SV40) (MAPKKKRKV, SEQ ID NO: 3) y de endonucleasa de borde de ADN-T de VirD2 bipartito de Agrobacterium tumefaciens (KRPRDRHDGELGGRKRAR, SEQ ID NO: 4) en los extremos amino y carboxilo del marco abierto de lectura de Cas9, respectivamente (figura 2A). El gen de Cas9 optimizado para maíz se unió operativamente a un promotor de maíz constitutivo o regulado mediante técnicas de biología molecular convencionales. En la figura 2A se ilustra un ejemplo del casete de expresión de Cas9 optimizado para maíz (SEQ ID NO: 5) que contiene un gen de Cas9 optimizado para maíz con un intrón ST-LS1, la señal de localización nuclear amino-terminal de SV40 (NLS) y la NLS carboxilo-terminal de VirD2 dirigida por un promotor de ubiquitina de plantas.
Para conferir una expresión de ARNcr y ARNtracr eficiente en células de maíz, de tal forma que los dúplex de polinucleótido ARNcr/ARNtracr puedan guiar a la proteína Cas9 para que escinda los sitios diana de ADN in vivo, se aislaron el promotor de U6 polimerasa III de maíz (SEQ ID NO: 6) y el terminador de U6 polimerasa III de maíz (TTTTTTTT) que residen en el cromosoma 8 y se fusionaron operativamente como fusiones 5' y 3' terminales, respectivamente, a las secuencias codificantes de ADN del ARNcr y el ARNtracr usando técnicas de biología molecular convencionales, generando casetes de expresión como los ilustrados en la figura 2B y la figura 2C. Las secuencias de los casetes de expresión de ARNcr y ARNtracr optimizadas para maíz resultantes pueden encontrarse en la SEQ ID NO: 8 (casete de expresión de ARNcr con un dominio VT que se dirige al sitio diana de LIGCas-3 (tabla 1) y la SEQ ID NO: 9 (casete de expresión de ARNtracr)).
Como se muestra en la figura 3A, la molécula de ARNcr necesita una región de complementariedad para la diana de ADN (dominio VT) que tiene aproximadamente 12-30 nucleótidos de longitud y cadena arriba de una secuencia PAM para el reconocimiento y la escisión del sitio diana (Gasiunas et al. (2012) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109:E2579-86, Jinek et al. (2012) Science 337:816-21, Mali et al. (2013) Science 339:823-26 y Cong et al. (2013) Science 339:819-23). Para facilitar la rápida introducción de secuencias diana de ADN genómico de maíz en la construcción de expresión de ARNcr, se introdujeron dos sitios diana de endonucleasa de restricción Bbsl de tipo IIS en una orientación en tándem invertida con la escisión orientada en una dirección saliente, como se describe en Cong et al. (2013) Science 339:819-23. Tras la escisión, la endonucleasa de restricción de tipo IIS corta sus sitios diana del plásmido de expresión de ARNcr, generando salientes que permiten la clonación direccional en fase de los oligos dúplex que contienen el sitio diana de ADN genómico de maíz deseados en el dominio VT. En el ejemplo mostrado, solo se usaron secuencias diana que comienzan con un nucleótido de G para promover la expresión favorable de polimerasa III del ARNcr.
La expresión tanto del gen de endonucleasa Cas como de las moléculas de ARNcr y ARNtracr permite la formación del sistema de dúplex de ARN guía/endonucleasa Cas (también citado como complejo de ARNcr/ARNtracr/endonucleasa Cas) ilustrado en la figura 3A (SEQ ID NO: 10-11).
Ejemplo 2
El sistema de dúplex de ARN guía/endonucleasa Cas escinde el ADN cromosómico en maíz e introduce mutaciones mediante unión de extremos no homólogos imperfecta
Para comprobar si el sistema de dúplex de ARN guía/endonucleasa Cas optimizado para maíz descrito en el ejemplo 1 podría reconocer, escindir y mutar el ADN cromosómico de maíz mediante las vías de reparación de unión de extremos no homólogos (NHEJ) imprecisas, se usaron como diana para la escisión tres secuencias diana genómicas (véase la tabla 1) y se examinaron mediante secuenciación profunda respecto de la presencia de mutaciones de NHEJ.
T l 1. n i i n n mi m íz in r i n l x r i n ARN r.
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El casete de expresión de endonucleasa Cas9 optimizado para maíz, los casetes de expresión de ARNcr que contienen los dominios VT específicos para maíz complementarios a la hebra antisentido de las secuencias diana genómicas de maíz listadas en la tabla 1 y el casete de expresión de ARNtracr se administraron conjuntamente a 60­ 90 embriones de maíz inmaduros Hi-II mediante suministro mediado por partículas (véase el ejemplo 7) en presencia de los genes BBM y WUS2 (véase el ejemplo 8). Los embriones de maíz Hi-II transformados con los casetes de expresión de Cas9 y de ARN guía largo (como se describen en la Solicitud Provisional de Patente de los Estados Unidos 61/868706, presentada el 22 de agosto de 2013) que se dirigen al sitio diana genómico de LIGCas-3 para la escisión sirvieron como control positivo y los embriones transformados únicamente con el casete de expresión de Cas9 sirvieron como control negativo. Después de 7 días, se agruparon los 20-30 embriones más uniformemente transformados de cada tratamiento y se extrajo el ADN genómico total. La región que rodea al sitio diana previsto se amplificó por la PCR con la mezcla maestra para PCR Phusion® HighFidelity (New England Biolabs, M0531L) añadiendo a las secuencias necesarias códigos de barras específicos de amplicón y secuenciación Illumina usando cebadores "con cola" mediante dos rondas de PCR. Los cebadores usados en la reacción de PCR primaria se muestran en la tabla 2 y los cebadores usados en la reacción PCR secundaria fueron AATGAT ACGGCGACCACCGAGAT CT ACACT CTTTCCCT ACACG (directo, SEQ ID NO: 21) y CAAGCAGAAGACGGCATA (inverso, SEQ ID NO: 22).
Figure imgf000042_0002
Las amplificaciones por la PCR resultantes se purificaron con una columna de purificación por centrifugación para PCR, la concentración se midió con un ensayo fluorométrico basado en colorante Hoechst, se combinaron en la relación equimolar y se llevó a cabo una secuenciación profunda de 100 nucleótidos de longitud en un secuenciador personal MiSeq de Illumna con adición de PhiX control V3 al 30-40 % (v/v) (Illumina, FC-110-3001) para compensar el sesgo de secuencia. Solo aquellas lecturas con >1 indel de nucleótidos que surge en la ventana de 10 nucleótidos centrada sobre el sitio esperado de escisión y no hallado en un nivel similar en control negativo se clasificaron como mutaciones de NHEJ. Las lecturas de mutantes de NHEJ con la misma mutación se contaron y agruparon en una sola lectura y se confirmó visualmente las 10 mutaciones más prevalentes surgían en el sitio de escisión esperado. Después, se usaron los números totales de mutaciones NHEJ confirmadas visualmente para calcular el % de lecturas mutantes, basándose en el número total de lecturas de una longitud adecuada que contienen una coincidencia perfecta con el código de barras y el cebador directo.
La frecuencia de las mutaciones NHEJ recuperadas mediante secuenciación profunda para el sistema de dúplex de ARN guía/endonucleasa Cas que se dirige a tres dianas de LIGCas (SEQ ID NO: 12-14) en comparación con el sistema de ARN guía largo/endonucleasa Cas que se dirige al mismo locus se muestra en la tabla 3. Los diez tipos más prevalentes de mutaciones de NHEJ recuperadas basándose en el sistema de ARN guía dúplex/endonucleasa Cas se muestran en la figura 4A (correspondiente a las SEQ ID NO: 24-33, en donde la SEQ ID NO: 23 es la secuencia de maíz de referencia que comprende el sitio diana de LIGCas-1), la figura 4B (correspondiente a las SEQ ID NO: 34-43, en donde la SEQ ID NO: 23 es la secuencia de maíz de referencia que comprende el sitio diana de LIGCas-2) y la figura 4C (correspondiente a las SEQ ID NO: 45-54, en donde la SEQ ID NO: 44 es la secuencia de maíz de referencia que comprende el sitio diana de LIGCas-3).
Tomados en conjunto, estos datos indican que el sistema de dúplex de ARN guía/endonucleasa Cas optimizado para maíz descrito en el presente documento escinde el ADN cromosómico de maíz y genera mutaciones de NHEJ imperfecta.
Tabla 3. Porcentaje (%) de lecturas de mutante en el locus diana de Liguleless 1 de maíz producidos mediante el sistema de dúplex de ARN guía/endonucleasa Cas, en comparación con el sistema de ARN guía largo/endonucleasa
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Ejemplo 3
Puede usarse ácido desoxirribonucleico (ADN) para guiar a la proteína Cas9 para escindir ADN cromosómico de maíz e introducid mutaciones mediante unión de extremos no homólogos imperfecta
Como se ha descrito previamente en Gasiunas et al. (2012) Proc. Natl. Acad. Sci.USA 109:E2579-86, Jinek et al. (2012) Science 337:816-21, Mali et al. (2013) Science 339:823-26 y Cong et al. (2013) Science 339:819-23, los ácidos ribonucleicos o el ARN han sido las únicas moléculas descritas que guían a una endonucleasa Cas9 para reconocer y escindir un sitio diana de ADN específico. En este ejemplo, los presentes inventores proporcionan evidencias de que una nueva clase de moléculas, los ácidos desoxirribonucleicos (ADN), también pueden usarse para guiar a la endonucleasa Cas para reconocer y escindir los sitios diana de ADN cromosómico, dando como resultado la recuperación de mutaciones de NHEJ imperfectas.
En este ejemplo, los presentes inventores usaron un polinucleótido guía dúplex que formado por un primer dominio de secuencia de nucleótidos, citado como el dominio de "direccionamiento variable" (VT) y un segundo dominio de secuencia de nucleótidos, citado como el dominio de "reconocimiento de endonucleasa Cas" (CER), en donde el dominio de direccionamiento variable es una serie contigua de ácidos desoxirribonucleicos (ADN). El dominio CER del polinucleótido guía dúplex comprendía dos moléculas separadas, una molécula de ADN que estaba ligada al dominio VT de la molécula de nucleótido cr (figura 1B) e hibridada a lo largo de una región de complementariedad a una segunda molécula (el nucleótido tracr, figura 1A) que consiste en una serie contigua de nucleótidos de ácido ribonucleico (ARN) (citado como ARNtracr). En este ejemplo, el nucleótido cr del polinucleótido guía dúplex (figura 1A) consistía únicamente en nucleótidos de ADN y en el presente documento se denomina ADNcr.
La secuencia de ADNcr que contiene el dominio VT que se dirige al sitio diana de LIGCas-3 (tabla 1) (SEQ ID NO: 55) se sintetizó en Integrated DNA Technologies, Inc. con un grupo fosfato 5' y se purificó mediante PAGE y después se usó para comprobar si un complejo de polinucleótido de ADNcr-ARNtracr/endonucleasa Cas como se ilustra en la figura 5 podía reconocer y escindir sitios diana de ADN cromosómico de maíz, dando como resultado la recuperación de mutaciones de NHEJ.
Para determinar la concentración de suministro óptimo para las moléculas de ADNcr sintético, se coadministraron diferentes concentraciones de ADNcr (20 ng, 50 ng, 100 ng, 1 |jg y 5 |jg) junto con casetes de expresión de ARNtracr y Cas9 optimizados para maíz a 60-90 embriones inmaduros Hi-II y se ensayaron respecto de la presencia de mutaciones de NHEJ, como se describe en el ejemplo 2. Los embriones transformados solo con los casetes de expresión de Cas9 y ARNtracr sirvieron como control negativo. Como se muestra en la tabla 4, se detectaron mutaciones de NHEJ con una concentración de suministro de ADNcr óptima próxima a 50 ng.
Para comparar la actividad mutacional de NHEJ con el complejo de polinucleótido guía dúplex ADNcr-ARNtracr/endonucleasa Cas (figura 5) con un complejo de dúplex de a Rn guía(ARNcr/ARNtracr)/endonucleasa Cas (figura 3A), se sintetizó un ARNcr que comprendía un dominio VT que se dirigía al sitio diana de LIGCas-3 (tabla 1) en Bio-Synthesis, Inc. con un grupo fosfato 5' y se purificó mediante PAGE (SEQ ID NO: 10). Después, se coadministraron independientemente 50 ng tanto del ADNcr como del ARNcr junto con los casetes de expresión de ARNtracr y ADN de Cas9 optimizados para maíz y se ensayaron las mutaciones de NHEJ como se ha descrito anteriormente. El experimento de transformación se llevó a cabo dos veces para demostrar la reproducibilidad. Los controles negativos consistieron en embriones de maíz Hi-II transformados con 50 ng de ADNcr, el casete de expresión de Cas9 o 50 ng de ADNcr más el casete de expresión de ARNtracr.
Como se muestra en las tablas 4 y 5, las mutaciones de NHEJ resultantes del sistema de polinucleótido guía dúplex de ADNcr-ARNtracr/endonucleasa Cas se identificaron cuando el ADNcr se administró en combinación con casetes de expresión de ARNtracr y ADN de Cas9, en comparación con la ausencia de mutaciones de NHEJ en los controles de solo Cas9, solo ADNcr, solo ADNcr más ARNtracr y solo ARNtracr más Cas9. Las principales 3 mutaciones de NHEJ de ARNcr más abundantes se muestran en la figura 6A (SEQ ID NO: 56, 57, 58, en donde la SEQ ID NO: 44 es la secuencia de referencia no modificada para el locus de LIGCas-3) y las principales 3 mutaciones de NHEJ de ADNcr más abundantes se muestran en la figura 6B (SEQ ID NO: 59, 60, 61, en donde la SEQ ID NO: 44 es la secuencia de referencia no modificada para el locus de LIGCas-3) se comparan y se muestran en la figura 6 (SEQ ID NO: 44, 56­ 61).
Tomados en conjunto, estos datos indican que los ácidos desoxirribonucleicos (ADN) también pueden usarse para guiar a endonucleasas Cas en un complejo de polinucleótido guía dúplex de ADNcr-ARNtracr/endonucleasa Cas (figura 4) para escindir ADN cromosómico de maíz, dando como resultado mutaciones de NHEJ imprecisas.
Tabla 4. Porcentaje (%) de lecturas mutantes en el locus diana de Liguleless 1 de maíz producidas mediante diferentes concentraciones de moléculas de ADNcr administradas de manera transitoria coadministradas con x r i n ARN r r ADN
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Tabla 5. Comparación del porcentaje (%) de lecturas mutantes en el locus diana de Liguleless 1 de maíz producidas mediante ADNcr administrado de manera transitoria o moléculas de ARNcr coadministradas con casetes de x r i n ARN r r ADN ^
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Ejemplo 4
Modificación de componentes de ácido nucleico del sistema de polinucleótido guía/endonucleasa Cas para aumentar la actividad y especificidad de la escisión
En este ejemplo, se describe la modificación de la base de nucleótidos, la unión de enlace fosfodiéster o la topografía molecular de los componentes de ácido nucleico de guía del sistema de polinucleótido guía/endonucleasa Cas para aumentar la actividad y la especificidad de la escisión.
Como se muestra en la figura 1A y la figura 1B, los componentes de ácido nucleico del polinucleótido guía incluyen un dominio de direccionamiento variable (VT) y un dominio de reconocimiento de endonucleasa Cas (CER). El dominio VT es responsable de interactuar con el sitio diana de ADN mediante emparejamientos de bases de nucleótidonucleótido directos, mientras que el dominio CER es necesario para un reconocimiento adecuado de la endonucleasa Cas (figura 3A y figura 3B). Junto con la secuencia de PAM necesaria, ambos dominios de los componentes de ácido nucleico del sistema de polinucleótido guía/endonucleasa Cas funcionan ligando el reconocimiento de sitio diana de ADN con la escisión del sitio diana por la endonucleasa Cas (figura 3A y figura 3B).
Dada la interacción directa del dominio VT con el sitio diana de ADN, pueden utilizarse modificaciones de base de nucleótidos en el dominio VT para alterar las relaciones de emparejamientos de bases de nucleótido-nucleótido que facilitan el reconocimiento del sitio diana por la endonucleasa Cas. Dichas modificaciones pueden usarse para fortalecer la afinidad de unión a la secuencia de ADN diana complementaria, potenciando el reconocimiento del sitio diana del polinucleótido guía/endonucleasa Cas y/o su especificidad. Los ejemplos no limitantes de modificaciones de base de nucleótidos que pueden potenciar la afinidad y/o la especificidad de unión al sitio diana cuando se introducen en el dominio VT de un polinucleótido guía se listan en la tabla 6. Estas modificaciones pueden usarse individualmente o en combinación con el dominio VT.
Tabla 6. Modificaciones de base de nucleótidos para potenciar el emparejamiento de bases de nucleótidos con la n i i n ADN m l m n ri
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También pueden efectuarse modificaciones de nucleótidos similares a las mostradas en la tabla 6 en el dominio CER del polinucleótido guía sencillo o dúplex (figura 1A y figura 1B). Estas modificaciones pueden actuar fortaleciendo o estabilizando interacciones intermoleculares en el dominio CER de una molécula de nucleótido cr dúplex (por ejemplo, pero sin limitación, ARNcr, ADNcr o una combinación de los mismos) y una molécula de nucleótido tracr (por ejemplo, ARNtracr, ADNtracr o una combinación de los mismos) (figura 3A). Estas modificaciones también pueden ayudar a resumir las estructuras de nucleótido cr y nucleótido tracr (tales como, pero sin limitación, ARNcr/ARNtracr; ADNcr/ARNtracr; ARNcr/ADNtracr, ADNcr/ADNtracr) necesarias para un reconocimiento adecuado de la endonucleasa Cas en la estructura secundaria de los polinucleótidos guía comprendidos en una sola molécula (figura 3A y figura 3B).
Los ácidos nucleicos expresados o suministrados de manera transitoria a células sufren renovación o degradación. Para aumentar la vida útil efectiva o la estabilidad de los componentes de ácido nucleico del sistema de polinucleótido guía/endonucleasa Cas in vivo, pueden introducirse modificaciones de nucleótidos y/o enlaces fosfodiéster para reducir la degradación no deseada. Los ejemplos de modificaciones de nucleótidos y enlaces fosfodiéster resistentes a las nucleasas se muestran en la tabla 7 y pueden introducirse en uno cualquiera de los dominios VT y/o CER del polinucleótido guía. Pueden introducirse modificaciones en los extremos 5' y 3' de uno cualquiera de los restos de ácido nucleico que forman los dominios VT o CER para inhibir la actividad de escisión de exonucleasas, pueden introducirse en medio de la secuencia de ácido nucleico que forma los dominios VT o CER para frenar la actividad de escisión de endonucleasas o pueden introducirse a lo largo de las secuencias de ácido nucleico que forman los dominios VT o CER para proporcionar protección tanto contra exonucleasas como contra endonucleasas.
Tabla 7. Modificaciones de base de nucleótidos y enlace fosfodiéster para reducir la degradación por nucleasas no
.
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Para proporcionar resistencia contra la renovación o degradación en las células, los componentes de ácido nucleico del polinucleótido guía también pueden circularizarse, donde los extremos 5' y 3' están unidos entre sí covalentemente. El ARN circular puede ser más resistente a la degradación por nucleasas que el ARN lineal y puede persistir en células mucho después que los transcritos lineales correspondientes (Jeck et al. (2013) RNA 19:141-157).
También pueden introducirse modificaciones en uno cualquiera de los componentes de ácido nucleico del polinucleótido guía para aumentar su permeabilidad o suministro a las células. Dichas modificaciones podrían incluir, pero sin limitación, unión a colesterol, polietilenglicol y espaciador 18 (cadena de hexaetilenglicol).
Muchos de los polinucleótidos guía modificados mencionados pueden sintetizarse y administrarse transitoriamente mediante transformación mediada por partículas biolísticas, transfección o electroporación. El resto de componentes del sistema de polinucleótido guía/endonucleasa Cas necesarios para formar un complejo funcional capaz de unirse a y/o escindir un sitio diana de ADN cromosómico pueden coadministrarse como cualquier combinación de casetes de expresión de ADN, ARN, ARNm (rematado en 5' y poliadenilado) o proteína. También pueden establecerse establemente líneas celulares o transformantes que expresan la totalidad menos uno o dos de los componentes necesarios para formar un complejo de polinucleótido guía/endonucleasa Cas funcional, de tal forma que tras la administración transitoria de las guías de ácido nucleico modificadas anteriores, puede formarse un complejo de polinucleótido guía/endonucleasa Cas funcional. Los polinucleótidos guía modificados descritos anteriormente también pueden administrarse simultáneamente multiplexados para dirigirse a múltiples secuencias de ADN cromosómico diana para su escisión o corte.
Los polinucleótidos guía modificados anteriormente mencionados pueden usarse en plantas, animales, levaduras y bacterias o en cualquier organismo sometido a modificación genómica con el sistema de polinucleótido guía/endonucleasa Cas y usarse para introducir mutaciones de NHEJ imprecisas en el ADN cromosómico, cortar fragmentos de ADN cromosómico formados por ADN transgénico o endógeno, editar la composición de codones de los genes nativos o transgénicos mediante reparación de recombinación de homólogos con moldes de reparación de ADN donante e insertar en sitios específicos secuencias de ADN transgénicas o endógenas mediante reparación por recombinación de homólogos con moldes de reparación de ADN donantes.
Ejemplo 5
Examen del efecto de las modificaciones de bases de nucleótidos y enlaces fosfodiéster en el componente de polinucleótido guía del sistema de polinucleótido guía/endonucleasa Cas en maíz
En este ejemplo, se introducen algunas de las modificaciones de base de nucleótidos y enlace fosfodiéster descritas en el ejemplo 4 en el dominio VT y/o el dominio CER de un nucleótido cr y se analizarán métodos para evaluar el impacto de estas modificaciones en la capacidad de un sistema de polinucleótido guía dúplex/endonucleasa Cas para escindir ADN cromosómico de maíz.
Como se ilustra en la tabla 8, se introdujeron modificaciones de bases de nucleótidos y de enlace fosfodiéster individualmente o en combinación en el dominio VT y el dominio CER del componente de nucleótido cr (ARNcr o ADNcr) del sistema de polinucleótido guía dúplex/endonucleasa Cas que se dirige al sitio de LIGCas-3 (véase la tabla 1) para la escisión. Aunque en este ejemplo se examinan en combinación una serie de diferentes modificaciones de base de nucleótidos y enlace fosfodiéster, pueden preverse otras posibles combinaciones.
Se introducen modificaciones de bases de nucleótidos de ácido nucleico bloqueado (+), 5-metil dC (iME-dC) y 2,6-diaminopurina (i6diPr) en el dominio VT para aumentar la afinidad de unión a la secuencia diana de ADN complementaria y en el caso de las modificaciones de ácido nucleico bloqueado, también para aumentar la resistencia a las nucleasas in vivo. Todas las demás modificaciones diseñadas en los dominios tanto VT como CER en los extremos 5' y 3' o a lo largo de la secuencia de ARNcr o ADNcr se introducen para reducir el efecto de las nucleasas in vivo y aumentar la vida útil eficaz del componente de ARNcr o ADNcr.
Para examinar el efecto que tienen los componentes de ARNcr o ADNcr modificados descritos en la tabla 8 sobre la estabilidad de su complejo de polinucleótido guía modificado/endonucleasa Cas asociado para reconocer y escindir el sitio de LIGCas-3 (véase la tabla 1), se coadministraron las moléculas de ARNcr y ADNcr modificadas a embriones de maíz inmaduros Hi-II con casetes de expresión de ARNtracr y Cas9, como se describe en el ejemplo 3. Las moléculas de ARNcr o ADNcr coadministradas con casetes de expresión de ARNtracr y Cas9 sirvieron como comparadores. Los controles negativos consisten en embriones de maíz inmaduros transformados únicamente con el casete de expresión de ARNcr o ADNcr o de Cas9. Las frecuencias de mutaciones de NHEJ imperfectas, evaluadas como se describe en el ejemplo 2, se usan para evaluar el efecto de cada modificación de ARNcr o ADNcr en la actividad de escisión de la endonucleasa Cas en relación con los experimentos comparables de ARNcr o ADNcr no modificados.
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Ejemplo 6
Métodos para examinar el efecto de las modificaciones en los componentes de ácido nucleico del sistema de polinucleótido guía/endonucleasa Cas en levadura
En este ejemplo, se diseñan métodos de exploración en levaduras para identificar modificaciones óptimas en los componentes de ácido nucleico del sistema de polinucleótido guía/endonucleasa Cas que dan como resultado una actividad de escisión mejorada.
A. Cepa de exploración de levadura ADE:URA3:DE2
Para identificar modificaciones óptimas o combinaciones de las mismas en los componentes de ácido nucleico del sistema de polinucleótido guía/endonucleasa Cas en el ejemplo 4, se desarrolló una cepa de Saccharomyces cerevisiae para monitorizar cuidadosamente la actividad de escisión del sistema de polinucleótido guía/endonucleasa Cas. Esto se logra reemplazando el gen ADE2 nativo en el cromosoma 15 de la cepa de levadura BY4247 con un gen ADE2 parcialmente duplicado no funcional interrumpido por el gen URA3 (ADE:URA3:DE2) de levadura, como se muestra en la figura 7. Después, se diseña un sitio diana de polinucleótido guía/endonucleasa Cas adyacente a la secuencia de PAM adecuada contra el gen URA3 implantado, de tal forma que tras la escisión, puede repararse el gen de ADE2 interrumpido que contiene 305 pb de secuencia solapante duplicada mediante las vías de recombinación de homólogos intramolecular, dando como resultado la pérdida del gen URA3 y la ganancia de un gen ADE2 funcional, como se muestra en la figura 8. Pueden usarse medios que contienen ácido 5-fluoroorótico (5-FOA) o medios deficientes en adenina para seleccionar células donde se ha producido la escisión. La frecuencia de células de levadura recuperadas tras la selección puede usarse para cuantificar la eficacia de la escisión del sistema de polinucleótido guía/endonucleasa Cas cuando se examinan diferentes modificaciones en los componentes de ácido nucleico del sistema de polinucleótido guía/endonucleasa Cas.
Las células de levadura que contienen un gen ADE2 funcional como resultado de la escisión y reparación del locus de ADE:URA3:DE2 también pueden someterse a exploración fenotípica visual para la actividad de escisión. En ausencia de selección negativa con 5-FOA o adenina, los productos génicos de ADE2 funcionales dan como resultado un fenotipo blanco, mientras que los productos no funcionales dan como resultado un fenotipo rojo (Ugolini et al. (1996) Curr. Genet. 30:485-492). Para visualizar el fenotipo blanco o rojo, pueden emplacarse los transformantes de células de levadura individuales y dejarse crecer en una colonia lo suficientemente grande como para inspeccionarla visualmente. La cantidad de sectorización de blanco a rojo proporciona una indicación relativa a la cantidad de actividad de escisión. Ya que el fenotipo de sectorización es una medición cualitativa, puede implementarse un sistema de puntuación numérica de 0-4. Como se muestra en la figura 9, una puntuación de 0 indica que no se observaron sectores blancos (sin escisión del sitio diana); una puntuación de 4 indica colonias completamente blancas (corte completo del sitio de reconocimiento); las puntuaciones de 1-3 indican fenotipos de sectorización blanca intermedios (y grados intermedios de escisión del sitio diana).
B. Componente de Cas9 del sistema de polinucleótido guía/endonucleasa Cas
Para expresar de manera estable la endonucleasa Cas para su emparejamiento con los componentes de ácido nucleico modificado administrados transitoriamente descritos en el ejemplo 4, pueden optimizarse los codones del gen de Cas9 de Streptococcus pyogenes M1 GAS (SF370) para S. cerevisiae mediante técnicas convencionales conocidas en la materia (SEQ ID NO: 88) y puede incorporarse una secuencia de localización nuclear de SV40 (virus de simio 40) (SRADPKKKRKV, SEQ ID NO: 7) en el extremo carboxilo para facilitar la localización nuclear. El marco abierto de lectura de Cas9 resultante se fusionará después operativamente al promotor GAL1 inducible de levadura y el terminador CYC1. Después, se colocará el casete de expresión de Cas9 resultante en un vector de levadura de replicación autónoma CEN6 que contiene un marcador de selección LEU2.
Para poder evaluar el suministro transitorio tanto del componente Cas9 como de los componentes de ácido nucleico modificados descritos en el ejemplo 4, el gen de Cas9 también puede administrarse como ARNm. Para generar ARNm de Cas9 optimizado para S. cerevisiae, puede usarse la PCR para amplificar el marco abierto de lectura de Cas9 optimizado para S. cerevisiae y la señal de localización nuclear asociada en la cola de la secuencia del promotor T7 necesario (TAATACGACTCACTATAGGG, SEQ ID NO: 89), justo en 5' del sitio de inicio de la traducción ATG. El molde lineal resultante que contiene el promotor T7 puede usarse después para transcribir el ARNm de Cas9 rematado o no rematado con o sin poliadenilación in vitro.
También puede administrarse transitoriamente el componente de Cas9 en forma de una proteína con los componentes de ácido nucleico modificados. La proteína Cas9 con la señal de localización nuclear carboxilo terminal asociada puede expresarse y purificarse mediante técnicas convencionales similares a las descritas por Fonfara et al. (2013) Nucl. Acids Res. doi:10.1093/nar/gkt1074 o mediante otros métodos.
C. Componentes de ácido nucleico del sistema de polinucleótido guía/endonucleasa Cas
Puede ser ventajoso emparejar el suministro transitorio de componentes de ARNcr o ARNtracr modificados con el ARNcr o ARNtracr no modificado correspondiente expresado de manera estable. Para facilitar la expresión estable del ARNcr y el ARNtracr en levaduras, pueden generase casetes de expresión de ARNcr y ARNtracr optimizados para S. cerevisiae. Pueden fusionarse operativamente el promotor SNR52 de ARN polimerasa III de levadura y el terminador SUP4 a los extremos de fragmentos de ADN que codifican las secuencias adecuadas de ARNcr y ARNtracr necesarias para el reconocimiento por la proteína Cas9 de S. pyogenes. Todos los casetes de expresión de ARNcr contendrán la secuencia diana ADE:URA3:De2 (GCAGACATTACGAATGCACA, SEQ ID NO: 90) en el dominio VT y se dirigirán al locus ADE:URA3:DE2 para la escisión. Después, se colocarán los casetes de expresión resultantes en un vector de levadura de replicación autónoma CEN6 que contiene un marcador de selección HIS3.
Para administrar transitoriamente ARNcr, ARNtracr o ARN guía no modificado, puede usarse la PCR para amplificar la secuencia de ARNcr, ARNtracr o ARN guía correspondiente en la cola de la secuencia de promotor T7 necesaria (TAATACGACTCACTATAGGG, SEQ ID NO: 89) justo en 5' del sitio de inicio transcripcional. El molde lineal resultante que contiene el promotor T7 puede usarse posteriormente para transcribir el ARNcr, ARNtracr o ARN guía largo correspondiente.
También se administrarán transitoriamente componentes de ácido nucleico modificados del sistema de polinucleótido guía/endonucleasa Cas como se indican en el ejemplo 4. Pueden introducirse modificaciones de base de nucleótido y/o de enlace fosfodiéster similares a las ilustradas en el ejemplo 5, tabla 8, de manera individual o en combinación en los componentes de ácido nucleico de ARNcr, ADNcr, ARNtracr, ADNtracr, ARN guía largo o ADN guía largo del sistema de polinucleótido guía/endonucleasa Cas y sintetizarse mediante técnicas convencionales.
Los ARN circulares, también analizados en el ejemplo 4, que contienen los dominios VT y CER necesarios capaces de formar un complejo funcional con la endonucleasa Cas pueden generarse in vitro, como se describe por Diegleman et al. (1998) Nucl. Acids Res. 26:3235-3241 y administrarse transitoriamente a células de levadura.
D. Transformación de componentes de polinucleótido guía/endonucleasa Cas en la cepa de levadura ADE:URA3:DE2
Los componentes del sistema de polinucleótido guía/endonucleasa Cas pueden administrarse a células de levadura ADE:URA3:DE2 usando métodos de transformación convencionales con acetato de litio, polietilenglicol (PEG), electroporación o biolística y monitorizarse su capacidad para escindir la diana de ADE:URA3:DE2. Los componentes de polinucleótido guía/endonucleasa Cas optimizados para levadura analizados en el ejemplo 6, secciones B y C, pueden administrarse como casetes de expresión en vectores de ADN plasmídicos de replicación autónoma de baja copia, en forma de moléculas transitorias sin replicación (tales como ARNm, proteína, ARN o ácidos nucleicos guía modificados) o en cualquier combinación de casetes de expresión de vector de ADN plasmídico y moléculas transitorias.
Ejemplo 7
Transformación de embriones inmaduros de maíz
La transformación puede lograrse mediante diversos métodos conocidos como eficaces en plantas, incluyendo suministro mediado por partículas, transformación mediada por Agrobacterium, administración mediada por PEG y electroporación.
a. Suministro mediado por partículas
La transformación de embriones inmaduros de maíz usando administración con partículas se lleva a cabo del siguiente modo: A continuación se presentan recetas de medios.
Las mazorcas se descascarillan y se esterilizan superficialmente en lejía Clorox al 30 % más detergente Micro al 0,5 % durante 20 minutos y se aclaran dos veces con agua estéril. Los embriones inmaduros se aíslan y se colocan con el eje del embrión hacia abajo (escutelo hacia arriba), 25 embriones por placa, en medio 560Y durante 4 horas y después se alinean en la zona diana de 2,5 cm en preparación para el bombardeo. Como alternativa, los embriones aislados se colocan en 560L (medio de iniciación) y se colocan en la oscuridad a temperaturas en el intervalo de 26 °C a 37 °C durante 8 a 24 horas antes de colocarlos en 560Y durante 4 horas a 26 °C antes del bombardeo, como se ha descrito anteriormente.
Se construyen plásmidos que contienen el agente inductor de roturas bicatenarias y el ADN donante usando técnicas de biología molecular convencionales y se bombardean junto con plásmidos que contienen los genes de desarrollo ODP2 (dominio AP2 del factor de transcripción o DP2 (proteína de desarrollo de óvulos 2); documento US20090328252 A1) y Wushel (documento US2011/0167516).
Los plásmidos y el ADN de interés se precipitan sobre partículas de oro de 0,6 pm (diámetro medio) usando un reactivo de transfección de lípido catiónico hidrosoluble como se expone a continuación. La solución de ADN se prepara sobre hielo usando 1 |jg de ADN plasmídico y opcionalmente otras construcciones para el bombardeo conjunto, tal como 50 ng (0,5 j l ) de cada plásmido que contiene los genes de desarrollo ODP2 (dominio AP2 del factor de transcripción ODP2 (proteína de desarrollo de óvulos 2); documento US20090328252 a 1) y Wushel. Al ADN premezclado, se le añaden en agua 20 j l de partículas de oro preparadas (15 mg/ml) y 5 j l del reactivo de transfección de lípido catiónico hidrosoluble y se mezclan cuidadosamente. Las partículas de oro se sedimentan en una microcentrifugadora a 10.000 rpm durante 1 min y se retira el sobrenadante. Se enjuaga cuidadosamente el sedimento resultante con 100 ml de EtOH al 100 % sin resuspender el sedimento y se retira cuidadosamente el enjuague de EtOH. Se añaden 105 j l de EtOH al 100 % y se resuspenden las partículas mediante sonicación breve. Después, se añaden 10 j l en el centro de cada macroportador y se deja secar durante aproximadamente 2 minutos antes del bombardeo.
Como alternativa, los plásmidos y el ADN de interés se precipitan sobre partículas de wolframio de 1,1 jm (diámetro medio) usando un procedimiento de precipitación con cloruro de calcio (CaCb) mezclando 100 j l de partículas de wolframio preparadas en agua, 10 j l (1 jg ) de ADN en tampón de Tris EDTA (1 jg de ADN total), 100 j l de CaCb 2,5 M y 10 j l de espermidina 0,1 M. Cada reactivo se añade secuencialmente a la suspensión de partículas de wolframio, con mezclado. La mezcla final se somete a ultrasonidos brevemente y se permite que se incube con agitación vorticial constante durante 10 minutos. Después del periodo de precipitación, los tubos se centrifugan brevemente, se retira el líquido y se lavan las partículas con 500 ml de etanol al 100 %, seguido de una centrifugación de 30 segundos. De nuevo, se retira el líquido y se añaden 105 j l de etanol al 100 % al sedimento de partículas de wolframio final. Para el bombardeo con pistola de partículas, se someten brevemente a ultrasonidos las partículas de wolframio/ADN. Se añaden 10 j l de las partículas de wolframio/ADN en el centro de cada macroportador, tras lo cual se dejan secar las partículas punteadas aproximadamente 2 minutos antes del bombardeo.
Se bombardean las mismas placas al nivel n.° 4 con una pistola Biorad Helium. Todas las muestras reciben un único disparo a 3,1 mPa (450 PSI), con un total de diez alícuotas tomadas de cada tubo de partículas preparadas/ADN.
Después del bombardeo, los embriones se incuban en 560P (medio de mantenimiento) durante 12 a 48 horas a temperaturas en el intervalo de 26 °C a 37 °C y después se dejan a 26 °C. Después de 5 a 7 días, se transfieren los embriones a medio de selección 560R que contiene 3 mg/litro de bialafos y se subcultivan cada 2 semanas a 26 °C. Después de aproximadamente 10 semanas de selección, se transfieren clones de callos resistentes a selección a medio 288J para iniciar la regeneración de la planta. Después de la maduración embrión somático (2-4 semanas), se transfieren embriones somáticos bien desarrollados a medio para germinación y se transfieren a una sala de cultivo iluminada. Aproximadamente 7-10 días después, se transfieren las plántulas en desarrollo a medio sin hormonas 272V en tubos durante 7-10 días hasta que las plántulas están bien establecidas. Las plantas se transfieren después a insertos en bandejas (equivalentes a maceta de 6,35 cm (2,5 pulgadas)) que contienen tierra para macetas y se cultivan durante 1 semana en una cámara de cultivo, se cultivaron posteriormente durante 1-2 semanas adicionales en el invernadero, después se transfirieron a 600 macetas clásicas (6,06 l (1,6 galones)) y se cultivaron hasta su madurez. Se monitorizaron las plantas y se puntuó la eficacia de la transformación y/o la modificación de capacidades regenerativas.
El medio de iniciación (560L) comprende 4,0 g/l de sales basales N6 (SIGMA C-1416), 1,0 ml/l de mezcla de vitaminas de Eriksson (1000X SIGMA-1511), 0,5 mg/l de tiamina HCl, 20,0 g/l de sacarosa, 1,0 mg/l de 2,4-D y 2,88 g/l de L-prolina (llevada hasta volumen con D-I H2O, después del ajuste hasta pH 5,8 con KOH); 2,0 g/l de Gelrite (añadido después de llevar hasta volumen con D-I H2O); y 8,5 mg/l de nitrato de plata (añadido después de esterilizar el medio y enfriar hasta temperatura ambiente).
El medio de mantenimiento (560P) comprende 4,0 g/l de sales basales N6 (SIGMA C-1416), 1,0 ml/l de mezcla de vitaminas de Eriksson (1000X SIg Ma -1511), 0,5 mg/l de tiamina HCl, 30,0 g/l de sacarosa, 2,0 mg/l de 2,4-D y 0,69 g/l de L-prolina (llevada hasta volumen con D-I H2O, después del ajuste hasta pH 5,8 con KOH); 3,0 g/l de Gelrite (añadido después de llevar hasta volumen con D-I H2O); y 0,85 mg/l de nitrato de plata (añadido después de esterilizar el medio y enfriar hasta temperatura ambiente).
El medio de bombardeo (560Y) comprende 4,0 g/l de sales basales N6 (SIGMA C-1416), 1,0 ml/l de mezcla de vitaminas de Eriksson (1000X S iGmA-1511), 0,5 mg/l de tiamina HCl, 120,0 g/l de sacarosa, 1,0 mg/l de 2,4-D y 2,88 g/l de L-prolina (llevada hasta volumen con D-I H2O, después del ajuste hasta pH 5,8 con KOH); 2,0 g/l de Gelrite (añadido después de llevar hasta volumen con D-I H2O); y 8,5 mg/l de nitrato de plata (añadido después de esterilizar el medio y enfriar hasta temperatura ambiente).
El medio de selección (560R) comprende 4,0 g/l de sales basales N6 (SIGMA C-1416), 1,0 ml/l de mezcla de vitaminas de Eriksson (1000X SIGMA-1511), 0,5 mg/l de tiamina HCl, 30,0 g/l de sacarosa y 2,0 g/l de 2,4-D (llevada hasta volumen con D-I H2O después del ajuste hasta pH 5,8 con KOH); 3,0 g/l de Gelrite (añadido después de llevar hasta volumen con D-I H2O); y 0,85 mg/l de nitrato de plata y 3,0 mg/l de bialafos (añadido después de esterilizar el medio y enfriar hasta temperatura ambiente).
El medio de regeneración de plantas (288J) comprende 4,3 g/l de sales MS (GIBCO 11117-074), 5,0 ml/l de solución de reserva de vitaminas MS (0,100 g de ácido nicotínico, 0,02 g/l de tianamina HCl, 0,10 g/l de piridoxina HCl y 0,40 g/l de glicina llevada hasta volumen con D-I H2O refinado) (Murashige y Skoog (1962) Physiol. Plant. 15:473), 100 mg/l de mioinositol, 0,5 mg/l de zeatina, 60 g/l de sacarosa y 1,0 ml/l de ácido abscísico 0,1 mM (llevado hasta volumen con D-I H2O refinado después de ajustar hasta pH 5,6); 3,0 g/l de Gelrite (añadido después de llevar hasta volumen con D-I H2O); y 1,0 mg/l de ácido indolacético y 3,0 mg/l de bialafos (añadido después de esterilizar el medio y enfriar hasta 60 °C). El medio sin hormonas, (272V) comprende 4,3 g/l de sales MS (GIBCO 11117-074), 5,0 ml/l de solución de reserva de vitaminas MS (0,100 g/l de ácido nicotínico, 0,02 g/l de tianamina HCl, 0,10 g/l de piridoxina HCl y 0,40 g/l de glicina llevada hasta volumen con D-I H2O refinado), 0,1 g/l de mioinositol y 40,0 g/l de sacarosa llevada hasta volumen con D-I H2O refinado después de ajustar el pH hasta 5,6); y 6 g/l de bacto-agar (añadido después de llevar hasta volumen con D-I H2O refinado), esterilizado y enfriado a 60 °C.
b. Transformación mediada por Agrobacterium
La transformación mediada por Agrobacterium se llevó a cabo esencialmente como se describe en Djukanovic et al. (2006) Plant Biotech J 4:345-57. En resumen, se diseccionaron embriones inmaduros de 10-12 días de edad (0,8­ 2,5 mm de tamaño) de granos esterilizados y se colocaron en medio líquido (4,0 g/l de sales basales N6 (Sigma C-1416), 1,0 ml/l de mezcla de vitaminas de Eriksson (Sigma E-1511), 1,0 mg/l de tiamina HCl, 1,5 mg/l de 2,4-D, 0,690 g/l de L-prolina, 68,5 g/l de sacarosa, 36,0 g/l de glucosa, pH 5,2). Después de recoger los embriones, se reemplazó el medio con 1 ml de Agrobacterium a una concentración de DO550 de 0,35-0,45. Los embriones de maíz se incubaron con Agrobacterium durante 5 min a temperatura ambiente. después, se vertió la mezcla en una placa de medio que contenía 4,0 g/l de sales basales N6 (Sigma C-1416), 1,0 ml/l de mezcla de vitaminas de Eriksson (Sigma E-1511), 1,0 mg/l de tiamina HCl, 1,5 mg/l de 2,4-D, 0,690 g/l de L-prolina, 30,0 g/l de sacarosa, 0,85 mg/l de nitrato de plata, acetosiringona 0,1 nM y 3,0 g/l de Gelrite, pH 5,8. Los embriones se incubaron con el eje hacia abajo, en la oscuridad, durante 3 días a 20 °C, después se incubaron 4 días en la oscuridad a 28 °C, después se transfirieron a placas de medio nuevas que contenían 4,0 g/l de sales basales N6 (Sigma C-1416), 1,0 ml/l de mezcla de vitaminas de Eriksson (Sigma E-1511), 1,0 mg/l de tiamina HCl, 1,5 mg/l de 2,4-D, 0,69 g/l de L-prolina, 30,0 g/l de sacarosa, 0,5 g/l de tampón MES, 0,85 mg/l de nitrato de plata, 3,0 mg/l de bialafos, 100 mg/l de carbenicilina y 6,0 g/l de agar, pH 5,8. Los embriones se subcultivaron cada tres semanas hasta que se identificaron eventos transgénicos. La embriogénesis somática se indujo transfiriendo una pequeña cantidad de tejido en medio de regeneración (4,3 g/l de sales MS (Gibco 11117), 5,0 ml/l de solución madre de vitaminas MS, 100 mg/l de mioinositol, ABA 0,1 pM, 1 mg/l de IAA, 0,5 mg/l de zeatina, 60,0 g/l de sacarosa, 1,5 mg/l de bialafos, 100 mg/l de carbenicilina, 3,0 g/l de Gelrite, pH 5,6) e incubación en la oscuridad durante dos semanas a 28 °C. Todo el material con brotes y raíces visibles se transfirió a medio que contenía 4,3 g/l de sales MS (Gibco 11117), 5,0 ml/l de solución madre de vitaminas MS, 100 mg/l de mioinositol, 40,0 g/l de sacarosa, 1,5 g/l de Gelrite, pH 5,6 y se incubó con luz artificial a 28 °C. Una semana después, se movieron las plántulas a tubos de vidrio que contenían el mismo medio y se cultivaron hasta que se tomaron muestras y/o se trasplantaron en suelo.
Ejemplo 8
La expresión transitoria de BBM potencia la transformación
Pueden modificarse los parámetros del protocolo de transformación para asegurar que la actividad de BBM es transitoria. Un método de este tipo implica precipitar el plásmido que contiene BBM de un modo que permite la transcripción y la expresión, pero impide cualquier liberación posterior del ADN, por ejemplo, usando el agente químico PEI. En un ejemplo, el plásmido BBM se precipita sobre partículas de oro con p E i, mientras que el casete de expresión transgénico (UBI::moPAT~GFPm::PinII; moPAT es el gen PAT optimizado de maíz) que se va a integrar se precipita en partículas de oro usando el método de cloruro de calcio convencional.
En resumen, se recubrieron partículas de oro con PEI como se indica a continuación. En primer lugar, se lavaron las partículas de oro. Se pesaron treinta y cinco miligramos de partículas de oro, con un diámetro medio de 1,0 (A.S.I. n.° 162-0010) en un tubo de microcentrifugadora y se añadieron 1,2 ml de EtOH puro y se agitó vorticialmente durante un minuto. El tubo se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente y después se centrifugó a alta velocidad usando una microcentrifugadora durante 15 minutos a 4 °C. El sobrenadante se desechó y se añadió una alícuota fresca de 1,2 ml de etanol (EtOH), se agitó vorticialmente durante un minuto, se centrifugó durante un minuto y nuevamente se desechó el sobrenadante (esto se repite dos veces). Se añadió una alícuota fresca de 1,2 ml de EtOH y esta suspensión (partículas de oro en EtOH) se almacenó a -20 °C durante semanas. Para recubrir las partículas con polietilenimina (PEI; Sigma n.° P3143), se centrifugaron 250 pl de la mezcla de partículas de oro lavadas/EtOH y se desechó el EtOH. Las partículas se lavaron una vez en 100 pl de ddH2O para retirar el etanol residual, se añadieron 250 pl de PEI 0,25 mM, seguido de un pulso de ultrasonidos para suspender las partículas y después se sumergió el tubo en un baño de nieve carbónica/EtOH para congelar inmediatamente la suspensión, que después se liofilizó durante una noche. En este punto, las partículas secas recubiertas pueden almacenarse a -80 °C durante al menos 3 semanas. Antes de su uso, se enjuagaron las partículas 3 veces con alícuotas de 250 pl de tampón HEPES 2,5 mM, pH 7,1, con 1x pulso de ultrasonidos y después una rápida agitación vorticial antes de cada centrifugación. Después, se suspendieron las partículas en un volumen final de 250 pl de tampón HEPES. Se añadió una alícuota de 25 pl de las partículas a tubos nuevos antes de unir el ADN. Para unir el ADN no recubierto, se sometió a pulsos de ultrasonidos a las partículas, después se añadió 1 pg de ADN (en 5 pl de agua), seguido de mezclado pipeteando hacia arriba y hacia abajo unas cuantas veces con un dispositivo Pipetteman y se incubó durante 10 minutos. Se centrifugaron brevemente las partículas (es decir, 10 segundos), se retiró el sobrenadante y se añadieron 60 pl de EtOH. Las

Claims (22)

REIVINDICACIONES
1. Un polinucleótido guía que comprende:
(i) un primer dominio de secuencia de nucleótidos que es complementario a una secuencia de nucleótidos en un A d N diana; y,
(ii) un segundo dominio de secuencia de nucleótidos que interactúa con una endonucleasa Cas,
en donde el primer dominio de secuencia de nucleótidos y el segundo dominio de secuencia de nucleótidos están compuestos por ácidos desoxirribonucleicos (ADN), ácidos ribonucleicos (ARN) o una combinación de los mismos, en donde el polinucleótido guía comprende ADN.
2. El polinucleótido guía de la reivindicación 1, en donde
(a) el primer dominio de secuencia de nucleótidos y el segundo dominio de secuencia de nucleótidos están ubicados en una sola molécula;
(b) el segundo dominio de secuencia de nucleótidos comprende dos moléculas separadas que son capaces de hibridar a lo largo de una región de complementariedad;
(c) el primer dominio de secuencia de nucleótidos es una secuencia de ADN y el segundo dominio de secuencia de nucleótidos se selecciona entre el grupo que consiste en una secuencia de ADN, una secuencia de ARN y una combinación de las mismas;
(d) el primer dominio de secuencia de nucleótidos y el segundo dominio de secuencia de nucleótidos son secuencias de ADN; o
(e) el primer dominio de secuencia de nucleótidos y/o el segundo dominio de secuencia de nucleótidos comprende al menos una modificación, en donde dicha al menos una modificación se selecciona entre el grupo que consiste en un remate 5', una cola poliadenilada 3', una secuencia de riboswitch, una secuencia de control de la estabilidad, una secuencia que forma un dúplex de ARNbc, una modificación o secuencia que dirige el polinucleótido guía a una ubicación subcelular, una modificación o secuencia que posibilita el seguimiento, una modificación o secuencia que proporciona un sitio de unión para proteínas, un ácido nucleico bloqueado (LNA), un nucleótido de 5-metil dC, un nucleótido de 2,6-diaminopurina, un nucleótido de 2'-fluoro A, un nucleótido de 2'-fluoro U; un nucleótido de 2'-O-metil ARN, un enlace fosforotioato, enlace a una molécula de colesterol, enlace a una molécula de polietilenglicol, enlace a una molécula espaciadora 18, un enlace covalente 5' a 3' y cualquier combinación de los mismos.
3. El polinucleótido guía de la reivindicación 2, en donde la al menos una modificación proporciona una característica beneficiosa adicional que se selecciona entre el grupo que consiste en una estabilidad modificada o regulada, un direccionamiento subcelular, seguimiento, un marcador fluorescente, un sitio de unión para una proteína o complejo de proteína, afinidad de unión modificada a una secuencia diana complementaria, resistencia modificada a la degradación celular y una permeabilidad celular aumentada.
4. Un complejo de polinucleótido guía/endonucleasa Cas, en donde el polinucleótido guía comprende:
(i) un primer dominio de secuencia de nucleótidos que es complementario a una secuencia de nucleótidos en un ADN diana; y,
(ii) un segundo dominio de secuencia de nucleótidos que interactúa con una endonucleasa Cas,
en donde dicho polinucleótido guía comprende ADN, en donde dichos polinucleótido guía y endonucleasa Cas son capaces de formar un complejo que permite a la endonucleasa Cas introducir una rotura bicatenaria en dicho sitio diana.
5. El complejo de polinucleótido guía/endonucleasa Cas de la reivindicación 4, en donde
(a) el primer dominio de secuencia de nucleótidos y el segundo dominio de secuencia de nucleótidos del polinucleótido guía están formados por ácidos desoxirribonucleicos (ADN), ácidos ribonucleicos (ARN) o una combinación de los mismos, en donde el polinucleótido guía comprende ADN; o
(b) el primer dominio de secuencia de nucleótidos y/o el segundo dominio de secuencia de nucleótidos de dicho polinucleótido guía comprende al menos una modificación que proporciona una característica beneficiosa adicional, en donde dicha al menos una modificación se selecciona entre el grupo que consiste en un remate 5', una cola poliadenilada 3', una secuencia de riboswitch, una secuencia de control de la estabilidad; una secuencia que forma un dúplex de ARNbc, una modificación o secuencia que dirige el polinucleótido guía a una ubicación subcelular, una modificación o secuencia que posibilita el seguimiento, una modificación o secuencia que proporciona un sitio de unión para proteínas, un ácido nucleico bloqueado (LNA), un nucleótido de 5-metil dC, un nucleótido de 2,6-diaminopurina, un nucleótido de 2'-fluoro A, un nucleótido de 2'-fluoro U; un nucleótido de 2'-O-metil ARN, un enlace fosforotioato, enlace a una molécula de colesterol, enlace a una molécula de polietilenglicol, enlace a una molécula espaciadora 18, un enlace covalente 5' a 3' y cualquier combinación de los mismos.
6. El complejo de polinucleótido guía/endonucleasa Cas de la reivindicación 4 o 5, en donde la endonucleasa Cas es una endonucleasa Cas9.
7. Una planta o semilla que comprende el polinucleótido guía de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o el complejo de polinucleótido guía/endonucleasa Cas de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6.
8. Un método para modificar un sitio diana en el genoma de una célula, comprendiendo el método proporcionar
(a) un polinucleótido guía a una célula que tiene una endonucleasa Cas; o
(b) un polinucleótido guía y una endonucleasa Cas a una célula,
en donde dicho polinucleótido guía comprende ADN, en donde dichos polinucleótido guía y endonucleasa Cas son capaces de formar un complejo que permite a la endonucleasa Cas introducir una rotura bicatenaria en dicho sitio diana.
9. El método de la reivindicación 8, que además comprende
(a) proporcionar un ADN donante a dicha célula, en donde dicho ADN donante comprende un polinucleótido de interés; y/o
(b) identificar al menos una célula que tiene una modificación en dicha diana, en donde la modificación en dicho sitio diana se selecciona entre el grupo que consiste en (i) un reemplazo de al menos un nucleótido, (ii) una eliminación de al menos un nucleótido, (iii) una inserción de al menos un nucleótido y (iv) cualquier combinación de (i) -(iii).
10. El método de la reivindicación 8, en donde
(a) el polinucleótido guía se proporciona directamente mediante bombardeo de partículas; y/o
(b) en donde el polinucleótido guía es un polinucleótido guía individual que comprende un dominio de direccionamiento variable y un dominio de reconocimiento de endonucleasa Cas o en donde el polinucleótido guía es un polinucleótido guía dúplex que comprende una molécula de nucleótido cr y una molécula de nucleótido tracr.
11. El método de la reivindicación 8, en donde la célula se selecciona entre el grupo que consiste en una célula de animal no humano, bacteriana, fúngica, de insecto, de levadura y vegetal.
12. El método de la reivindicación 11, en donde la célula es una célula vegetal.
13. El método de la reivindicación 12, en donde la célula vegetal se selecciona entre el grupo que consiste en una célula y dicotiledónea o en donde la célula vegetal se selecciona entre el grupo que consiste en una célula de maíz, arroz, sorgo, centeno, cebada, trigo, mijo, avena, caña de azúcar, césped o pasto varilla, soja, colza, alfalfa, girasol, algodón, tabaco, cacahuete, patata, Arabidopsis y cártamo.
14. Un método para introducir un polinucleótido de interés en un sitio diana en el genoma de una célula, comprendiendo el método:
a) proporcionar un polinucleótido guía, un ADN donante y una endonucleasa Cas a una célula, en donde dicho polinucleótido guía comprende ADN, en donde dichos polinucleótido guía y endonucleasa Cas son capaces de formar un complejo que permite a la endonucleasa Cas introducir una rotura bicatenaria en dicho sitio diana; b) poner en contacto la célula de (a) con un ADN donante que comprende un polinucleótido de interés; y, c) identificar al menos una célula de (b) que comprende en su genoma el polinucleótido de interés integrado en dicho sitio diana.
15. El método de la reivindicación 14, en donde el ADN donante y la endonucleasa Cas se introducen en dicha célula usando al menos una construcción de ADN recombinante capaz de expresar el ADN donante y/o la endonucleasa Cas.
16. Un método para modificar un sitio diana en el genoma de una célula, comprendiendo el método:
a) proporcionar a una célula (i) un nucleótido cr, una primera construcción de ADN recombinante capaz de expresar un ARNtracr y un segundo ADN recombinante capaz de expresar una endonucleasa Cas, en donde dicho nucleótido cr es una secuencia de desoxirribonucleótido o una combinación de una secuencia de desoxirribonucleótido y ribonucleótido, en donde dicho nucleótido cr, dicho ARNtracr y dicha endonucleasa Cas son capaces de formar un complejo que permite a la endonucleasa Cas introducir una rotura bicatenaria en dicho sitio diana; o (ii) un nucleótido tracr, una primera construcción de ADN recombinante capaz de expresar un ARNcr y un segundo ADN recombinante capaz de expresar una endonucleasa Cas, en donde dicho nucleótido tracr se selecciona entre una secuencia de desoxirribonucleótido o una combinación de una secuencia de desoxirribonucleótido y ribonucleótido, en donde dicho nucleótido tracr, dicho ARNcr y dicha endonucleasa Cas son capaces de formar un complejo que permite a la endonucleasa Cas introducir una rotura bicatenaria en dicho sitio diana; y,
b) identificar al menos una célula que tiene una modificación en dicho sitio diana, en donde la modificación se selecciona entre el grupo que consiste en (i) un reemplazo de al menos un nucleótido, (ii) una eliminación de al menos un nucleótido, (iii) una inserción de al menos un nucleótido y (iv) cualquier combinación de (i) -(iii).
17. Un método para editar una secuencia de nucleótidos en el genoma de una célula, comprendiendo el método introducir un polinucleótido guía, un molde de modificación de polinucleótido y al menos una endonucleasa Cas en una célula, en donde dicho polinucleótido guía comprende ADN, en donde la endonucleasa Cas introduce una rotura bicatenaria en un sitio diana en el genoma de dicha célula, en donde dicho molde de modificación de polinucleótido comprende al menos una modificación de nucleótidos de dicha secuencia de nucleótidos.
18. Una planta o semilla que comprende un polinucleótido guía y
(a) una endonucleasa Cas9; o
(b) una construcción de ADN recombinante que comprende un promotor unido operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica una endonucleasa Cas optimizada para plantas,
en donde dicho polinucleótido guía comprende ADN, en donde dicha endonucleasa Cas9 o endonucleasa Cas optimizada para plantas y el polinucleótido guía son capaces de formar un complejo y crear una rotura bicatenaria en un sitio diana genómico de dicha planta.
19. La planta de la reivindicación 18, que además comprende un polinucleótido de interés integrado en dicho sitio diana genómico de dicha planta o que además comprende una modificación en dicho sitio diana genómico, en donde la modificación se selecciona entre el grupo que consiste en (i) un reemplazo de al menos un nucleótido, (ii) una eliminación de al menos un nucleótido, (iii) una inserción de al menos un nucleótido y (iv) cualquier combinación de (i) -(iii).
20. La planta de la reivindicación 18, en donde la planta es una monocotiledónea o una dicotiledónea.
21. La planta de la reivindicación 20, en donde la monocotiledónea se selecciona entre el grupo que consiste en maíz, arroz, sorgo, centeno, cebada, trigo, mijo, avena, caña de azúcar, césped o pasto varilla o en donde la dicotiledónea se selecciona entre el grupo que consiste en soja, colza, alfalfa, girasol, algodón, tabaco, cacahuete, patata, Arabidopsis o cártamo.
22. El polinucleótido guía, complejo de polinucleótido guía/endonucleasa Cas, método, planta o semilla de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 o 17 a 21, en donde el polinucleótido guía es una secuencia de ADN o una secuencia de combinación de ARN-ADN.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2013010911A (es) 2011-03-23 2015-03-03 Pioneer Hi Bred Int Metodos para producir un locus de rasgo transgenico complejo.
US10323236B2 (en) 2011-07-22 2019-06-18 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
EP2861737B1 (en) 2012-06-19 2019-04-17 Regents Of The University Of Minnesota Gene targeting in plants using dna viruses
ES2926021T3 (es) * 2012-10-23 2022-10-21 Toolgen Inc Composición para escindir un ADN objetivo que comprende un ARN guía específico para el ADN objetivo y ácido nucleico codificador de proteína Cas o proteína Cas, y uso de la misma
DK2986729T3 (en) 2013-04-16 2018-10-29 Regeneron Pharma TARGETED MODIFICATION OF ROOT THROUGH
WO2014199358A1 (en) 2013-06-14 2014-12-18 Cellectis Methods for non-transgenic genome editing in plants
US20150044192A1 (en) 2013-08-09 2015-02-12 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a cas9 nuclease
AU2014308899B2 (en) 2013-08-22 2020-11-19 E. I. Du Pont De Nemours And Company Methods for producing genetic modifications in a plant genome without incorporating a selectable transgene marker, and compositions thereof
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US9526784B2 (en) 2013-09-06 2016-12-27 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
US9388430B2 (en) 2013-09-06 2016-07-12 President And Fellows Of Harvard College Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US9340799B2 (en) 2013-09-06 2016-05-17 President And Fellows Of Harvard College MRNA-sensing switchable gRNAs
US10584358B2 (en) 2013-10-30 2020-03-10 North Carolina State University Compositions and methods related to a type-II CRISPR-Cas system in Lactobacillus buchneri
WO2015070083A1 (en) 2013-11-07 2015-05-14 Editas Medicine,Inc. CRISPR-RELATED METHODS AND COMPOSITIONS WITH GOVERNING gRNAS
RU2685914C1 (ru) 2013-12-11 2019-04-23 Регенерон Фармасьютикалс, Инк. Способы и композиции для направленной модификации генома
US9840699B2 (en) 2013-12-12 2017-12-12 President And Fellows Of Harvard College Methods for nucleic acid editing
US10787654B2 (en) 2014-01-24 2020-09-29 North Carolina State University Methods and compositions for sequence guiding Cas9 targeting
ES2898460T3 (es) * 2014-02-27 2022-03-07 Monsanto Technology Llc Composiciones y procedimientos para la modificación genómica dirigida al sitio
US11439712B2 (en) 2014-04-08 2022-09-13 North Carolina State University Methods and compositions for RNA-directed repression of transcription using CRISPR-associated genes
US11584936B2 (en) * 2014-06-12 2023-02-21 King Abdullah University Of Science And Technology Targeted viral-mediated plant genome editing using CRISPR /Cas9
MX2017000422A (es) 2014-07-11 2017-05-01 Du Pont Composiciones y metodos para producir plantas resistentes al herbicida glifosato.
EP3177718B1 (en) 2014-07-30 2022-03-16 President and Fellows of Harvard College Cas9 proteins including ligand-dependent inteins
US10513711B2 (en) 2014-08-13 2019-12-24 Dupont Us Holding, Llc Genetic targeting in non-conventional yeast using an RNA-guided endonuclease
US10450584B2 (en) 2014-08-28 2019-10-22 North Carolina State University Cas9 proteins and guiding features for DNA targeting and genome editing
CN108064129A (zh) 2014-09-12 2018-05-22 纳幕尔杜邦公司 玉米和大豆中复合性状基因座的位点特异性整合位点的产生和使用方法
CN107406838A (zh) 2014-11-06 2017-11-28 纳幕尔杜邦公司 Rna引导的内切核酸酶向细胞中的肽介导的递送
NZ731962A (en) 2014-11-21 2022-07-01 Regeneron Pharma Methods and compositions for targeted genetic modification using paired guide rnas
CN107250148B (zh) 2014-12-03 2021-04-16 安捷伦科技有限公司 具有化学修饰的指导rna
WO2016094679A1 (en) 2014-12-10 2016-06-16 Regents Of The University Of Minnesota Genetically modified cells, tissues, and organs for treating disease
US20170369902A1 (en) 2014-12-16 2017-12-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Restoration of male fertility in wheat
US9840702B2 (en) 2014-12-18 2017-12-12 Integrated Dna Technologies, Inc. CRISPR-based compositions and methods of use
US20180179523A1 (en) * 2014-12-18 2018-06-28 Integrated Dna Technologies, Inc. Crispr-based compositions and methods of use
CN105821073B (zh) 2015-01-27 2021-08-10 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种通过基因瞬时表达对整株植物定点改造的方法
NZ733702A (en) * 2015-01-28 2022-04-29 Caribou Biosciences Inc Crispr hybrid dna/rna polynucleotides and methods of use
CA2971462A1 (en) 2015-02-04 2016-08-11 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel bt toxin receptors and methods of use
AU2016225179C1 (en) 2015-02-23 2022-11-03 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies
CN107406858A (zh) * 2015-02-25 2017-11-28 先锋国际良种公司 用于指导rna/cas内切核酸酶复合物的调节型表达的组合物和方法
EP3270685B1 (en) * 2015-03-19 2023-07-19 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for accelerated trait introgression
EP3553178A1 (en) 2015-03-27 2019-10-16 E. I. du Pont de Nemours and Company Soybean u6 small nuclear rna gene promoters and their use in constitutive expression of small rna genes in plants
KR102648489B1 (ko) * 2015-04-06 2024-03-15 더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티 Crispr/cas-매개 유전자 조절을 위한 화학적으로 변형된 가이드 rna
CA2985506A1 (en) 2015-05-15 2016-11-24 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Guide rna/cas endonuclease systems
DE102015006335A1 (de) 2015-05-19 2016-11-24 Kws Saat Se Verfahren und Konstrukte zur gezielten Nukleinsäure Editierung in Pflanzen
DE102015014252A1 (de) 2015-11-05 2017-05-11 Kws Saat Se Verfahren und Konstrukte zur gezielten Nukleinsäure Editierung in Pflanzen
EP3095870A1 (en) 2015-05-19 2016-11-23 Kws Saat Se Methods for the in planta transformation of plants and manufacturing processes and products based and obtainable therefrom
KR102451796B1 (ko) 2015-05-29 2022-10-06 노쓰 캐롤라이나 스테이트 유니버시티 크리스퍼 핵산을 사용하여 박테리아, 고세균, 조류 및 효모를 스크리닝하는 방법
WO2016196887A1 (en) 2015-06-03 2016-12-08 Board Of Regents Of The University Of Nebraska Dna editing using single-stranded dna
CA2983874C (en) 2015-06-15 2022-06-21 North Carolina State University Methods and compositions for efficient delivery of nucleic acids and rna-based antimicrobials
US20180305707A1 (en) * 2015-06-26 2018-10-25 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Gos2 regulatory elements and use thereof
US11279928B2 (en) * 2015-06-29 2022-03-22 Massachusetts Institute Of Technology Compositions comprising nucleic acids and methods of using the same
WO2017004261A1 (en) * 2015-06-29 2017-01-05 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modified crispr rna and modified single crispr rna and uses thereof
US10166255B2 (en) 2015-07-31 2019-01-01 Regents Of The University Of Minnesota Intracellular genomic transplant and methods of therapy
US9580727B1 (en) 2015-08-07 2017-02-28 Caribou Biosciences, Inc. Compositions and methods of engineered CRISPR-Cas9 systems using split-nexus Cas9-associated polynucleotides
EP3334832A4 (en) * 2015-08-14 2019-06-26 Institute Of Genetics And Developmental Biology, Chinese Academy Of Sciences METHOD FOR OBTAINING GLYPHOSATE-RESISTANT RICE BY DIRECTED NUCLEOTIDE SUBSTITUTION
US11236347B2 (en) 2015-08-28 2022-02-01 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Ochrobactrum-mediated transformation of plants
IL241462A0 (en) 2015-09-10 2015-11-30 Yeda Res & Dev Heterologous engineering of betalain pigments in plants
WO2017053729A1 (en) * 2015-09-25 2017-03-30 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Nuclease-mediated genome editing of primary cells and enrichment thereof
US11286480B2 (en) 2015-09-28 2022-03-29 North Carolina State University Methods and compositions for sequence specific antimicrobials
CA2999903C (en) * 2015-09-30 2023-10-24 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant epsp synthases and methods of use
US11732269B2 (en) * 2015-10-02 2023-08-22 Monsanto Technology Llc Recombinant maize B chromosome sequence and uses thereof
WO2017062855A1 (en) * 2015-10-09 2017-04-13 Monsanto Technology Llc Novel rna-guided nucleases and uses thereof
WO2017066175A1 (en) 2015-10-12 2017-04-20 E. I. Du Pont De Nemours And Company Protected dna templates for gene modification and increased homologous recombination in cells and methods of use
CA3001067A1 (en) 2015-10-16 2017-04-20 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Generating maize plants with enhanced resistance to northern leaf blight
CA2996326A1 (en) 2015-10-20 2017-04-27 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for marker-free genome modification
DK3350327T3 (en) 2015-10-23 2019-01-21 Caribou Biosciences Inc CONSTRUCTED CRISPR CLASS-2-NUCLEIC ACID TARGETING-NUCLEIC ACID
EP3365356B1 (en) 2015-10-23 2023-06-28 President and Fellows of Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
EP3159407A1 (en) * 2015-10-23 2017-04-26 Silence Therapeutics (London) Ltd Guide rnas, methods and uses
ES2953925T3 (es) * 2015-11-04 2023-11-17 Fate Therapeutics Inc Ingeniería genómica de células pluripotentes
WO2017079026A1 (en) 2015-11-06 2017-05-11 E. I. Du Pont De Nemours And Company Generation of complex trait loci in soybean and methods of use
CN106811479B (zh) * 2015-11-30 2019-10-25 中国农业科学院作物科学研究所 利用CRISPR/Cas9系统定点修饰ALS基因获得抗除草剂水稻的系统及其应用
CN108473999B (zh) 2015-11-30 2022-12-23 先锋国际良种公司 植物调节元件及其使用方法
WO2017096237A1 (en) * 2015-12-02 2017-06-08 Ceres, Inc. Methods for genetic modification of plants
CA3006781A1 (en) * 2015-12-07 2017-06-15 Arc Bio, Llc Methods and compositions for the making and using of guide nucleic acids
EP3387134B1 (en) 2015-12-11 2020-10-14 Danisco US Inc. Methods and compositions for enhanced nuclease-mediated genome modification and reduced off-target site effects
JP6888906B2 (ja) * 2015-12-11 2021-06-18 株式会社豊田中央研究所 生物体のゲノムの改変方法及びその利用
EP3390631B1 (en) 2015-12-18 2020-04-08 Danisco US Inc. Methods and compositions for t-rna based guide rna expression
WO2017106767A1 (en) * 2015-12-18 2017-06-22 The Scripps Research Institute Production of unnatural nucleotides using a crispr/cas9 system
WO2017112620A1 (en) 2015-12-22 2017-06-29 North Carolina State University Methods and compositions for delivery of crispr based antimicrobials
JP6871252B2 (ja) 2015-12-22 2021-05-12 パイオニア ハイ−ブレッド インターナショナル， インコーポレイテッド 組織優先的プロモーターおよびその使用方法
EA201891619A1 (ru) 2016-01-11 2019-02-28 Те Борд Оф Трастиз Оф Те Лилэнд Стэнфорд Джуниор Юниверсити Химерные белки и способы регулирования экспрессии генов
ES2875747T3 (es) 2016-01-11 2021-11-11 Univ Leland Stanford Junior Proteínas quiméricas y métodos de inmunoterapia
US20190017067A1 (en) * 2016-01-12 2019-01-17 Regents Of The University Of Minnesota Glyphosate tolerant plants having modified 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase gene regulation
WO2017132239A1 (en) 2016-01-26 2017-08-03 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Waxy corn
US11542515B2 (en) * 2016-02-09 2023-01-03 Cibus Us Llc Methods and compositions for increasing efficiency of targeted gene modification using oligonucleotide-mediated gene repair
EP3426780A1 (en) 2016-03-11 2019-01-16 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel cas9 systems and methods of use
WO2017155715A1 (en) 2016-03-11 2017-09-14 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel cas9 systems and methods of use
WO2017155717A1 (en) 2016-03-11 2017-09-14 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel cas9 systems and methods of use
CN107312821A (zh) * 2016-04-25 2017-11-03 中国检验检疫科学研究院 用于转基因大米m12品系特异性基因成分精准定量检测的引物探针、试剂盒及方法
EP3464323B1 (en) 2016-05-27 2021-09-22 Aadigen, LLC Peptides and nanoparticles for intracellular delivery of genome-editing molecules
WO2017207589A1 (en) 2016-06-01 2017-12-07 Kws Saat Se Hybrid nucleic acid sequences for genome engineering
US10767175B2 (en) * 2016-06-08 2020-09-08 Agilent Technologies, Inc. High specificity genome editing using chemically modified guide RNAs
CN109312317A (zh) 2016-06-14 2019-02-05 先锋国际良种公司 Cpf1内切核酸酶用于植物基因组修饰的用途
CA3018430A1 (en) 2016-06-20 2017-12-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel cas systems and methods of use
US20190359992A1 (en) * 2016-06-28 2019-11-28 Cellectis Altering expression of gene products in plants through targeted insertion of nucleic acid sequences
GB2568182A (en) 2016-08-03 2019-05-08 Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
AU2017308889B2 (en) 2016-08-09 2023-11-09 President And Fellows Of Harvard College Programmable Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US11542509B2 (en) 2016-08-24 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
CN106350536B (zh) * 2016-08-28 2021-02-12 浙江大学 一种植物杂交体系及其应用
IL247752A0 (en) * 2016-09-11 2016-11-30 Yeda Res & Dev Compositions and methods for modulating gene expression for site-directed mutagenesis
WO2018052919A1 (en) * 2016-09-14 2018-03-22 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for genome editing via haploid induction
US20190225974A1 (en) 2016-09-23 2019-07-25 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Targeted genome optimization in plants
CN110462034A (zh) 2016-10-07 2019-11-15 综合Dna技术公司 化脓链球菌cas9突变基因和由其编码的多肽
US11242542B2 (en) 2016-10-07 2022-02-08 Integrated Dna Technologies, Inc. S. pyogenes Cas9 mutant genes and polypeptides encoded by same
EA201990924A1 (ru) 2016-10-13 2019-09-30 Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. Создание маиса, устойчивого к северной пятнистости листьев
KR102622411B1 (ko) 2016-10-14 2024-01-10 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 핵염기 에디터의 aav 전달
CN110520530A (zh) 2016-10-18 2019-11-29 明尼苏达大学董事会 肿瘤浸润性淋巴细胞和治疗方法
US11795453B2 (en) 2016-10-31 2023-10-24 Emendobio, Inc. Compositions for genome editing
WO2018085693A1 (en) * 2016-11-04 2018-05-11 Inari Agriculture, Inc. Novel plant cells, plants, and seeds
JP2019523011A (ja) * 2016-11-14 2019-08-22 インスティテュート・オブ・ジェネティクス・アンド・ディヴェロプメンタル・バイオロジー、チャイニーズ・アカデミー・オブ・サイエンシズＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ 植物における塩基編集のための方法
JP2019535287A (ja) 2016-11-22 2019-12-12 インテグレイテツド・デイー・エヌ・エイ・テクノロジーズ・インコーポレイテツド Ｃｒｉｓｐｒ／ｃｐｆ１システム及び方法
WO2018102131A1 (en) 2016-11-29 2018-06-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Transcriptional terminators for gene expression in plants
US9816093B1 (en) 2016-12-06 2017-11-14 Caribou Biosciences, Inc. Engineered nucleic acid-targeting nucleic acids
WO2018103686A1 (zh) * 2016-12-07 2018-06-14 中国科学院上海生命科学研究院 叶绿体基因组编辑方法
IL267024B2 (en) * 2016-12-08 2023-12-01 Intellia Therapeutics Inc Adapted leader RNAs for genomic editing
US11319552B2 (en) 2016-12-08 2022-05-03 Syngenta Participations Ag Methods for improving transformation frequency
US11293022B2 (en) 2016-12-12 2022-04-05 Integrated Dna Technologies, Inc. Genome editing enhancement
MX2019007546A (es) * 2016-12-22 2019-10-24 Monsanto Technology Llc Modificación genética de cultivos a base de edición del genómica y producción de plantas braquíticas.
NZ754739A (en) * 2016-12-22 2024-01-26 Intellia Therapeutics Inc Compositions and methods for treating alpha-1 antitrypsin deficiency
EA202091316A1 (ru) * 2016-12-22 2020-08-18 Тулджин Инкорпорейтид Обогащенный олеиновой кислотой растительный организм, имеющий генетически модифицированный fad2, и способ его получения
WO2018119359A1 (en) 2016-12-23 2018-06-28 President And Fellows Of Harvard College Editing of ccr5 receptor gene to protect against hiv infection
US11859219B1 (en) 2016-12-30 2024-01-02 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Methods of altering a target nucleotide sequence with an RNA-guided nuclease and a single guide RNA
CN106834341B (zh) * 2016-12-30 2020-06-16 中国农业大学 一种基因定点突变载体及其构建方法和应用
US20210032645A1 (en) * 2017-01-11 2021-02-04 Yeda Research And Development Co. Ltd. Targeted recombination between homologous chromosomes and uses thereof
CA3051585A1 (en) 2017-01-28 2018-08-02 Inari Agriculture, Inc. Novel plant cells, plants, and seeds
TW201839136A (zh) 2017-02-06 2018-11-01 瑞士商諾華公司 治療血色素異常症之組合物及方法
EP3589935A1 (en) 2017-03-03 2020-01-08 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Non-destructive assay for soybean seeds using near infrared analysis
CN107066944B (zh) * 2017-03-06 2019-11-05 北京数码视讯科技股份有限公司 一种手指指根的定位方法及装置
US11898179B2 (en) 2017-03-09 2024-02-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
WO2018165629A1 (en) 2017-03-10 2018-09-13 President And Fellows Of Harvard College Cytosine to guanine base editor
EP3601562A1 (en) 2017-03-23 2020-02-05 President and Fellows of Harvard College Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable dna binding proteins
BR112019020311A2 (pt) * 2017-03-30 2020-04-28 Pioneer Hi Bred Int epsp sintases de planta melhoradas e métodos de uso
WO2018183607A1 (en) 2017-03-30 2018-10-04 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods of identifying and characterizing gene editing variations in nucleic acids
US11814637B2 (en) 2017-03-31 2023-11-14 Pioneer Hi-Bred International, Inc Expression modulating elements and use thereof
EP3615552A1 (en) 2017-04-24 2020-03-04 DuPont Nutrition Biosciences ApS Methods and compositions of anti-crispr proteins for use in plants
EP3619305A1 (en) 2017-05-03 2020-03-11 KWS SAAT SE & Co. KGaA Use of crispr-cas endonucleases for plant genome engineering
EP3635118A4 (en) * 2017-05-05 2021-01-27 Institute Of Genetics And Developmental Biology Chinese Academy of Sciences PROCESSES FOR ISOLATING CELLS WITHOUT USING TRANSGENIC MARKER SEQUENCES
KR20200008137A (ko) * 2017-05-11 2020-01-23 인스티튜트 오브 제네틱스 앤드 디벨롭멘털 바이오롤지, 차이니즈 아카데미 오브 사이언시스 제초제 내성 유전자의 구축 및 그 용도
WO2018209320A1 (en) 2017-05-12 2018-11-15 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide rnas for use with crispr-cas9 in genome editing and transcriptional activation
WO2018213547A1 (en) * 2017-05-17 2018-11-22 Cold Spring Harbor Laboratory Compositions and methods for generating weak alleles in plants
GB201708665D0 (en) 2017-05-31 2017-07-12 Tropic Biosciences Uk Ltd Compositions and methods for increasing extractability of solids from coffee beans
GB201708662D0 (en) 2017-05-31 2017-07-12 Tropic Biosciences Uk Ltd Compositions and methods for increasing shelf-life of banana
WO2018220582A1 (en) 2017-05-31 2018-12-06 Tropic Biosciences UK Limited Methods of selecting cells comprising genome editing events
WO2018224861A1 (en) 2017-06-07 2018-12-13 International Rice Research Institute Increasing hybrid seed production through higher outcrossing rate in cytoplasmic male sterile gramineae plants and related materials and methods
WO2018237197A2 (en) * 2017-06-21 2018-12-27 Noble Research Institute, Llc CRISPR MEDIATED SELECTIVE GENE DISRUPTION IN PLANTS
WO2018237372A1 (en) 2017-06-23 2018-12-27 Cornell University RNA MOLECULES, METHODS FOR PRODUCING CIRCULAR RNA, AND METHODS OF TREATMENT
WO2019006418A2 (en) 2017-06-30 2019-01-03 Intima Bioscience, Inc. ADENO-ASSOCIATED VIRAL VECTORS FOR GENE THERAPY
WO2019014564A1 (en) 2017-07-14 2019-01-17 Editas Medicine, Inc. SYSTEMS AND METHODS OF TARGETED INTEGRATION AND GENOME EDITING AND DETECTION THEREOF WITH INTEGRATED PRIMING SITES
US11732274B2 (en) 2017-07-28 2023-08-22 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (PACE)
RU2020111575A (ru) 2017-08-22 2021-09-23 Напиджен, Инк. Модификация генома органелл с использованием направляемой полинуклеотидом эндонуклеазы
EP3676376A2 (en) 2017-08-30 2020-07-08 President and Fellows of Harvard College High efficiency base editors comprising gam
WO2019055141A1 (en) * 2017-09-14 2019-03-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODIFYING PLANT SIZE
CN111344403A (zh) * 2017-09-15 2020-06-26 利兰斯坦福初级大学董事会 遗传工程细胞的多元性产生和条形码编制
CA3072614A1 (en) * 2017-09-18 2019-03-21 Futuragene Israel Ltd. Tissue-specific expression control of della polypeptides
WO2019058253A1 (en) 2017-09-19 2019-03-28 Tropic Biosciences UK Limited MODIFICATION OF THE SPECIFICITY OF NON-CODING RNA MOLECULES FOR SILENCING GENE EXPRESSION IN EUKARYOTIC CELLS
CN111373046A (zh) 2017-09-25 2020-07-03 先锋国际良种公司 组织偏好性启动子和使用方法
US11603536B2 (en) 2017-09-29 2023-03-14 Inari Agriculture Technology, Inc. Methods for efficient maize genome editing
AU2018347545A1 (en) 2017-10-13 2020-04-16 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Systems and methods for cellular reprogramming of a plant cell
KR20200121782A (ko) 2017-10-16 2020-10-26 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 아데노신 염기 편집제의 용도
WO2019084306A1 (en) * 2017-10-26 2019-05-02 University Of Florida Research Foundation, Inc. METHOD FOR REDUCING GENOMIC COMPLEXITY AND DETECTING POLYMORPHISMS
WO2019099191A1 (en) * 2017-11-16 2019-05-23 Dow Agrosciences Llc Plant promoter for transgene expression
EP3707253A1 (en) 2017-12-15 2020-09-16 Danisco US Inc. Cas9 variants and methods of use
KR20210152597A (ko) * 2017-12-22 2021-12-15 (주)지플러스생명과학 키메라 게놈 조작 분자 및 방법
WO2019119822A1 (en) 2017-12-23 2019-06-27 Uwell Biopharma Inc. Pharmaceutical chimeric receptor composition and method thereof
CA3084365A1 (en) 2017-12-27 2019-07-04 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Transformation of dicot plants
CN111527638A (zh) * 2017-12-28 2020-08-11 日立造船株式会社 全固态电池及其制造方法和加工装置
CN109971763A (zh) * 2017-12-28 2019-07-05 未名生物农业集团有限公司 花期调控基因cmp1和相关的载体及其应用
WO2019144124A1 (en) 2018-01-22 2019-07-25 Inari Agriculture, Inc. Plant gene editing systems, methods, and compositions
US11220694B1 (en) 2018-01-29 2022-01-11 Inari Agriculture, Inc. Rice cells and rice plants
US11802288B1 (en) 2018-01-29 2023-10-31 Inari Agriculture Technology, Inc. Methods for efficient soybean genome editing
US11926835B1 (en) 2018-01-29 2024-03-12 Inari Agriculture Technology, Inc. Methods for efficient tomato genome editing
EP3749767A1 (en) 2018-02-05 2020-12-16 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies
MA51788A (fr) 2018-02-05 2020-12-16 Vertex Pharma Substances et méthodes pour traiter des hémoglobinopathies
EP3752647B1 (en) * 2018-02-15 2022-05-25 The Broad Institute, Inc. Cell data recorders and uses thereof
US20210105962A1 (en) * 2018-02-22 2021-04-15 Elsoms Developments Ltd Methods and compositions relating to maintainer lines
WO2019173125A1 (en) 2018-03-09 2019-09-12 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods for modification of fatty acids in soybean
WO2019177978A1 (en) * 2018-03-12 2019-09-19 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Use of morphogenic factors for the improvement of gene editing
BR112020019198A2 (pt) 2018-03-23 2021-02-17 Pioneer Hi-Bred International, Inc. método para identificar um gene r em uma planta, método para obter uma planta resistente a doenças, planta modificada tendo resistência aumentada a uma doença, método para introduzir uma variante alélica de um gene nlr01, construto de dna recombinante, célula de planta transgênica e planta transgênica
CN110396523B (zh) * 2018-04-23 2023-06-09 中国科学院分子植物科学卓越创新中心 一种重复片段介导的植物定点重组方法
CN110408647A (zh) * 2018-04-28 2019-11-05 青岛清原化合物有限公司 一种生物突变体库的构建方法
US20210087573A1 (en) * 2018-05-07 2021-03-25 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for homology-directed repair of cas endonuclease mediated double strand breaks
WO2019213910A1 (en) * 2018-05-10 2019-11-14 Syngenta Participations Ag Methods and compositions for targeted editing of polynucleotides
GB2589246A (en) 2018-05-16 2021-05-26 Synthego Corp Methods and systems for guide RNA design and use
CN108642077A (zh) * 2018-05-18 2018-10-12 江苏省农业科学院 基于CRISPR/Cas9基因编辑技术选育绿豆不育突变体的方法及专用gRNA
WO2019226553A1 (en) * 2018-05-21 2019-11-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Modification of glutamine synthetase to improve yield in plants
EP3802887A2 (en) 2018-05-25 2021-04-14 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Systems and methods for improved breeding by modulating recombination rates
EP3575402A1 (en) * 2018-06-01 2019-12-04 Algentech SAS Gene targeting
US11866719B1 (en) 2018-06-04 2024-01-09 Inari Agriculture Technology, Inc. Heterologous integration of regulatory elements to alter gene expression in wheat cells and wheat plants
US11608506B2 (en) 2018-06-26 2023-03-21 Regents Of The University Of Minnesota Delivery of developmental regulators to plants for the induction of meristematic tissue with genetic alterations
BR112020026640A2 (pt) 2018-06-28 2021-04-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Métodos para selecionar plantas transformadas
US20210324398A1 (en) 2018-06-29 2021-10-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Edited nac genes in plants
CA3108767A1 (en) * 2018-06-30 2020-01-02 Inscripta, Inc. Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells
BR112021002792A2 (pt) 2018-08-13 2021-06-29 Pioneer Hi-Bred International, Inc. novos receptores de toxinas inseticidas e métodos de uso
CN112955540A (zh) * 2018-08-30 2021-06-11 因思科瑞普特公司 在自动化模块和仪器中对经核酸酶经编辑的序列的改进的检测
US11479762B1 (en) 2018-08-31 2022-10-25 Inari Agriculture Technology, Inc. Compositions, systems, and methods for genome editing
CN109136258A (zh) * 2018-09-06 2019-01-04 先正达参股股份有限公司 小麦中基因编辑效率的优化
WO2020072248A1 (en) 2018-10-01 2020-04-09 North Carolina State University Recombinant type i crispr-cas system
BR112021004235A2 (pt) * 2018-10-02 2021-05-18 Monsanto Technology Llc composições e métodos para transferência de biomoléculas para células feridas
CA3109984A1 (en) * 2018-10-16 2020-04-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Genome edited fine mapping and causal gene identification
US11407995B1 (en) 2018-10-26 2022-08-09 Inari Agriculture Technology, Inc. RNA-guided nucleases and DNA binding proteins
EP3874050A1 (en) 2018-10-31 2021-09-08 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods for ochrobactrum-mediated plant transformation
CA3111092A1 (en) 2018-10-31 2020-05-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods for ochrobactrum-mediated gene editing
EP3874048A1 (en) * 2018-11-01 2021-09-08 Keygene N.V. Dual guide rna for crispr/cas genome editing in plants cells
US11434477B1 (en) 2018-11-02 2022-09-06 Inari Agriculture Technology, Inc. RNA-guided nucleases and DNA binding proteins
US11518999B1 (en) 2018-11-09 2022-12-06 Inari Agriculture Technology, Inc. Plant transformation
WO2020117553A1 (en) * 2018-12-04 2020-06-11 Syngenta Crop Protection Ag Gene silencing via genome editing
JPWO2020122195A1 (ja) * 2018-12-12 2021-10-21 国立大学法人九州大学 ゲノム編集された細胞の製造方法
US10934536B2 (en) 2018-12-14 2021-03-02 Pioneer Hi-Bred International, Inc. CRISPR-CAS systems for genome editing
US11453885B1 (en) 2019-02-19 2022-09-27 Inari Agriculture Technology, Inc. Plant transformation
AU2020239058B2 (en) * 2019-03-11 2024-02-01 Colorado State University Research Foundation Herbicide tolerant plants and production and detection of same
GB201903521D0 (en) 2019-03-14 2019-05-01 Tropic Biosciences Uk Ltd No title
GB201903520D0 (en) 2019-03-14 2019-05-01 Tropic Biosciences Uk Ltd Modifying the specificity of non-coding rna molecules for silencing genes in eukaryotic cells
GB201903519D0 (en) 2019-03-14 2019-05-01 Tropic Biosciences Uk Ltd Introducing silencing activity to dysfunctional rna molecules and modifying their specificity against a gene of interest
BR112021018606A2 (pt) 2019-03-19 2021-11-23 Harvard College Métodos e composições para editar sequências de nucleotídeos
US20230175020A1 (en) * 2019-03-27 2023-06-08 Emendobio Inc. Compositions and methods for promoting gene editing of cxcr4 gene
US20220170033A1 (en) 2019-03-27 2022-06-02 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant explant transformation
MX2021012158A (es) 2019-04-05 2022-01-06 Danisco Us Inc Métodos para la integración de una secuencia de adn donante en el genoma de bacillus usando constructos de adn recombinante lineal y composiciones de los mismos.
KR20210148270A (ko) 2019-04-05 2021-12-07 다니스코 유에스 인크. 이중 원형 재조합 dna 작제물 및 이의 조성물을 이용하여 바실러스의 게놈 내로의 폴리뉴클레오타이드를 통합하기 위한 방법
BR112021020311A2 (pt) * 2019-04-24 2021-12-14 Univ Oregon Health & Science Promotor, vetor de expressão, capsídeo, aav de fita simples, vírus adenoassociado, métodos para preparar o aav e para intensificar a expressão de gene e célula modificada
US11692197B2 (en) 2019-05-06 2023-07-04 Inari Agriculture Technology, Inc. Delivery of biological molecules to plant cells
CN110241121B (zh) * 2019-05-21 2022-03-29 南京农业大学 大豆E3泛素连接酶GmNLA1编码基因的应用
MX2021015795A (es) * 2019-06-19 2022-01-27 Betterseeds Ltd Un metodo para aumentar el rendimiento de cannabis a traves de la edicion de genes.
EP3990633A1 (en) 2019-06-25 2022-05-04 Inari Agriculture Technology, Inc. Improved homology dependent repair genome editing
US20210047651A1 (en) * 2019-07-12 2021-02-18 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for targeted insertion of selectable marker-free dna sequence in plants
US11746354B2 (en) 2019-07-19 2023-09-05 Inari Agriculture Technology, Inc. Homology dependent repair genome editing
CN110358767B (zh) * 2019-07-30 2021-06-08 湖北大学 一种基于CRISPR-Cas12a系统的运动发酵单胞菌基因组编辑方法及其应用
CN115244176A (zh) * 2019-08-19 2022-10-25 钟明宏 向导rna-cas蛋白复合物的缀合物
EP3798301A1 (en) * 2019-09-25 2021-03-31 KWS SAAT SE & Co. KGaA Promoter repression
CN114901302A (zh) 2019-11-05 2022-08-12 成对植物服务股份有限公司 Rna编码的dna置换等位基因的组合物和方法
CN112779266A (zh) * 2019-11-06 2021-05-11 青岛清原化合物有限公司 在生物体内创制新基因的方法及应用
JP2023510464A (ja) 2019-11-19 2023-03-14 プロタリクス リミテッド 形質転換細胞からの構築物の除去
EP4065720A4 (en) * 2019-11-25 2024-03-27 Syngenta Crop Protection Ag REGULATORY ELEMENTS BASED ON GLYCINE AND THEIR USES
AU2020395111A1 (en) * 2019-12-02 2022-06-02 The Regents Of The University Of California Engineering circular guide RNAs
CN111057713A (zh) * 2019-12-18 2020-04-24 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心） 一种适用于埃德菌FS110的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用
CA3167419A1 (en) * 2020-01-09 2021-07-15 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Two-step gene swap
US20210222183A1 (en) * 2020-01-22 2021-07-22 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Dominant crispr inverted-repeat alleles to down-regulate gene expression in heterozygous plants
US20230079816A1 (en) * 2020-02-12 2023-03-16 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Cas-mediated homology directed repair in somatic plant tissue
BR112022017197A2 (pt) 2020-02-28 2022-11-01 Pioneer Hi Bred Int Sistema de produção haploide duplicado de sorgo
US20230112792A1 (en) * 2020-03-13 2023-04-13 Pairwise Plants Services, Inc. Methods of introducing variation into plants and products produced therefrom
CA3170846A1 (en) * 2020-03-30 2021-10-07 Inari Agriculture Technology, Inc. Improved polynucleotides for expression of rna-guided nucleases and dna binding proteins in soybean
US20230193403A1 (en) 2020-04-02 2023-06-22 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel insecticidal toxin receptors and methods of use
BR112022020714A2 (pt) 2020-04-15 2022-12-20 Pioneer Hi Bred Int Identificação de gene efetor de patógeno vegetal e de resistência à doença, composições e métodos de uso
DE112021002672T5 (de) 2020-05-08 2023-04-13 President And Fellows Of Harvard College Vefahren und zusammensetzungen zum gleichzeitigen editieren beider stränge einer doppelsträngigen nukleotid-zielsequenz
EP4149243A1 (en) * 2020-05-13 2023-03-22 Nunhems B.V. Method for obtaining mutant plants by targeted mutagenesis
CN111778274A (zh) * 2020-06-09 2020-10-16 新疆生产建设兵团第六师农业科学研究所 一种通过基因编辑提高番茄耐贮藏性的方法
BR112022025167A2 (pt) 2020-06-12 2022-12-27 Pioneer Hi Bred Int Alteração de composição de semente em plantas
US11242534B1 (en) 2020-07-31 2022-02-08 Inari Agriculture Technology, Inc. INHT31 transgenic soybean
US11359210B2 (en) 2020-07-31 2022-06-14 Inari Agriculture Technology, Inc. INIR12 transgenic maize
US20240011043A1 (en) 2020-07-31 2024-01-11 Inari Agriculture Technology, Inc. Generation of plants with improved transgenic loci by genome editing
US11214811B1 (en) 2020-07-31 2022-01-04 Inari Agriculture Technology, Inc. INIR6 transgenic maize
US11369073B2 (en) 2020-07-31 2022-06-28 Inari Agriculture Technology, Inc. INIR12 transgenic maize
US11326177B2 (en) 2020-07-31 2022-05-10 Inari Agriculture Technology, Inc. INIR12 transgenic maize
WO2022031720A1 (en) * 2020-08-03 2022-02-10 Arcadia Biosciences, Inc. Dna constructs containing rna polymerase iii promoters from cannabis, and methods of their use
US20230309480A1 (en) 2020-08-18 2023-10-05 International Rice Research Institute Methods of increasing outcrossing rates in gramineae
BR112023002885A2 (pt) 2020-08-18 2023-03-21 Pioneer Hi Bred Int Genes de resistência a múltiplas doenças e seus empilhamentos genômicos
AU2021338707A1 (en) * 2020-09-10 2023-04-06 Monsanto Technology Llc Increasing gene editing and site-directed integration events utilizing meiotic and germline promoters
KR102579767B1 (ko) * 2020-09-21 2023-09-18 서울대학교산학협력단 eIF4E1 유전자 교정에 의해 포티바이러스 저항성이 증가된 유전체 교정 토마토 식물체의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 포티바이러스 저항성이 증가된 유전체 교정 토마토 식물체
US11976291B2 (en) 2020-09-28 2024-05-07 Inari Agriculture Technology, Inc. Genetically enhanced maize plants
US11198885B1 (en) 2020-09-28 2021-12-14 Inari Agriculture Technology, Inc. Genetic regulatory element
EP4225902A1 (en) 2020-10-05 2023-08-16 Protalix Ltd. Dicer-like knock-out plant cells
CN112481259B (zh) * 2020-11-24 2022-09-16 南昌大学 两种甘薯U6基因启动子IbU6的克隆与应用
WO2022125916A1 (en) * 2020-12-11 2022-06-16 Celanese International Corporation Foam formed from cellulose ester composition
EP4362662A1 (en) 2021-07-02 2024-05-08 Tropic Biosciences UK Limited Delay or prevention of browning in banana fruit
GB202109586D0 (en) 2021-07-02 2021-08-18 Tropic Biosciences Uk Ltd Method for editing banana genes
GB202112865D0 (en) 2021-09-09 2021-10-27 Tropic Biosciences Uk Ltd Resistance to black sigatoka disease in banana
GB202112866D0 (en) 2021-09-09 2021-10-27 Tropic Biosciences Uk Ltd Resistance to fusarium wilt in a banana
KR20240055811A (ko) 2021-09-10 2024-04-29 애질런트 테크놀로지스, 인크. 프라임 편집을 위한 화학적 변형을 갖는 가이드 rna
AU2022375817A1 (en) 2021-11-01 2024-05-09 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Polynucleotides for modifying organisms
WO2023102393A1 (en) 2021-11-30 2023-06-08 Pioneer Hi-Bred International, Inc. High efficiency large scale chromosomal genome manipulation
WO2023141540A2 (en) 2022-01-20 2023-07-27 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Polynucleotides for modifying organisms
WO2023172875A1 (en) * 2022-03-07 2023-09-14 Inedita Bio, Inc. Methods and compositions for intron mediated- expression of regulatory elements for trait development
CN114836446B (zh) * 2022-04-26 2023-12-19 上海交通大学 一种抗草甘膦的植物及其制法
EP4299733A1 (en) 2022-06-30 2024-01-03 Inari Agriculture Technology, Inc. Compositions, systems, and methods for genome editing
WO2024006802A1 (en) 2022-06-30 2024-01-04 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Artificial intelligence-mediated methods and systems for genome editing
WO2024005864A1 (en) 2022-06-30 2024-01-04 Inari Agriculture Technology, Inc. Compositions, systems, and methods for genome editing
WO2024005863A1 (en) 2022-06-30 2024-01-04 Inari Agriculture Technology, Inc. Compositions, systems, and methods for genome editing
EP4299739A1 (en) 2022-06-30 2024-01-03 Inari Agriculture Technology, Inc. Compositions, systems, and methods for genome editing
WO2024020360A1 (en) 2022-07-18 2024-01-25 Pairwise Plants Services, Inc. Mustard green plants named 'pwrg-1', 'pwrg-2,' and 'pwsgc'
WO2024026232A1 (en) * 2022-07-27 2024-02-01 Pioneer Hi-Bred International, Inc Guide rna trapped genome editing
WO2024023578A1 (en) 2022-07-28 2024-02-01 Institut Pasteur Hsc70-4 in host-induced and spray-induced gene silencing
WO2024036190A2 (en) 2022-08-09 2024-02-15 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Guide polynucleotide multiplexing
CN115762641B (zh) * 2023-01-10 2023-04-07 天津极智基因科技有限公司 一种指纹图谱构建方法及系统

Family Cites Families (205)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1230061A (en) 1916-02-25 1917-06-12 Joseph A Blanchette Oil-can.
US5380831A (en) 1986-04-04 1995-01-10 Mycogen Plant Science, Inc. Synthetic insecticidal crystal protein gene
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US5036006A (en) 1984-11-13 1991-07-30 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US5569597A (en) 1985-05-13 1996-10-29 Ciba Geigy Corp. Methods of inserting viral DNA into plant material
US5107065A (en) 1986-03-28 1992-04-21 Calgene, Inc. Anti-sense regulation of gene expression in plant cells
US5268463A (en) 1986-11-11 1993-12-07 Jefferson Richard A Plant promoter α-glucuronidase gene construct
US5608142A (en) 1986-12-03 1997-03-04 Agracetus, Inc. Insecticidal cotton plants
US5196525A (en) 1987-01-13 1993-03-23 University Of British Columbia DNA construct for enhancing the efficiency of transcription
US4873192A (en) 1987-02-17 1989-10-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Process for site specific mutagenesis without phenotypic selection
US5316931A (en) 1988-02-26 1994-05-31 Biosource Genetics Corp. Plant viral vectors having heterologous subgenomic promoters for systemic expression of foreign genes
US5990387A (en) 1988-06-10 1999-11-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Stable transformation of plant cells
US5023179A (en) 1988-11-14 1991-06-11 Eric Lam Promoter enhancer element for gene expression in plant roots
US5110732A (en) 1989-03-14 1992-05-05 The Rockefeller University Selective gene expression in plants
US5231020A (en) 1989-03-30 1993-07-27 Dna Plant Technology Corporation Genetic engineering of novel plant phenotypes
US5034323A (en) 1989-03-30 1991-07-23 Dna Plant Technology Corporation Genetic engineering of novel plant phenotypes
US5879918A (en) 1989-05-12 1999-03-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Pretreatment of microprojectiles prior to using in a particle gun
US5240855A (en) 1989-05-12 1993-08-31 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Particle gun
US5310667A (en) 1989-07-17 1994-05-10 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthases
US5322783A (en) 1989-10-17 1994-06-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Soybean transformation by microparticle bombardment
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US5641876A (en) 1990-01-05 1997-06-24 Cornell Research Foundation, Inc. Rice actin gene and promoter
EP0452269B1 (en) 1990-04-12 2002-10-09 Syngenta Participations AG Tissue-preferential promoters
EP0528857B1 (en) 1990-04-26 2002-01-30 Aventis CropScience N.V. New bacillus thuringiensis strain and its gene encoding insecticidal toxin
US5478369A (en) 1990-06-12 1995-12-26 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Nucleotide sequences mediating male fertility and method of using same
US5498830A (en) 1990-06-18 1996-03-12 Monsanto Company Decreased oil content in plant seeds
US5633435A (en) 1990-08-31 1997-05-27 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases
US5866775A (en) 1990-09-28 1999-02-02 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthases
US5932782A (en) 1990-11-14 1999-08-03 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant transformation method using agrobacterium species adhered to microprojectiles
US5277905A (en) 1991-01-16 1994-01-11 Mycogen Corporation Coleopteran-active bacillus thuringiensis isolate
US5459252A (en) 1991-01-31 1995-10-17 North Carolina State University Root specific gene promoter
US5399680A (en) 1991-05-22 1995-03-21 The Salk Institute For Biological Studies Rice chitinase promoter
GB9114259D0 (en) 1991-07-02 1991-08-21 Ici Plc Plant derived enzyme and dna sequences
EP0602064B1 (en) 1991-08-02 1998-12-16 Mycogen Corporation Novel microorganism and insecticide
DK0600993T3 (da) 1991-08-27 2000-05-08 Novartis Ag Proteiner medinsektdræbende egenskaber mod Homoptera-insekter samt anvendelse deraf til plantebeskyttelse
ATE276373T1 (de) 1991-10-04 2004-10-15 Univ North Carolina State Pathogenresistente transgene pflanzen
TW261517B (es) 1991-11-29 1995-11-01 Mitsubishi Shozi Kk
AU675923B2 (en) 1991-12-04 1997-02-27 E.I. Du Pont De Nemours And Company Fatty acid desaturase genes from plants
US5324646A (en) 1992-01-06 1994-06-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods of regeneration of Medicago sativa and expressing foreign DNA in same
US5474896A (en) 1992-05-05 1995-12-12 Institut Pasteur Nucleotide sequence encoding the enzyme I-SceI and the uses thereof
US5792632A (en) 1992-05-05 1998-08-11 Institut Pasteur Nucleotide sequence encoding the enzyme I-SceI and the uses thereof
US5401836A (en) 1992-07-16 1995-03-28 Pioneer Hi-Bre International, Inc. Brassica regulatory sequence for root-specific or root-abundant gene expression
HUT70467A (en) 1992-07-27 1995-10-30 Pioneer Hi Bred Int An improved method of agrobactenium-mediated transformation of cultvred soyhean cells
JP3818540B2 (ja) 1992-11-17 2006-09-06 イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー 植物由来のミクロソームデルタ−１２脂肪酸デサチュラーゼおよび関連酵素の遺伝子
EP0625006A4 (en) 1992-11-20 1996-04-24 Agracetus Transgenic cotton plants producing heterologous bioplastic.
IL108241A (en) 1992-12-30 2000-08-13 Biosource Genetics Corp Plant expression system comprising a defective tobamovirus replicon integrated into the plant chromosome and a helper virus
ATE205533T1 (de) 1993-01-13 2001-09-15 Pioneer Hi Bred Int Derivate von alpha-hordothionin mit höherem behalt an lysin
US5527695A (en) 1993-01-29 1996-06-18 Purdue Research Foundation Controlled modification of eukaryotic genomes
US5789156A (en) 1993-06-14 1998-08-04 Basf Ag Tetracycline-regulated transcriptional inhibitors
US5814618A (en) 1993-06-14 1998-09-29 Basf Aktiengesellschaft Methods for regulating gene expression
US5837850A (en) 1994-04-21 1998-11-17 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Regulatory element conferring tapetum specificity
US5593881A (en) 1994-05-06 1997-01-14 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis delta-endotoxin
US5633363A (en) 1994-06-03 1997-05-27 Iowa State University, Research Foundation In Root preferential promoter
US5736369A (en) 1994-07-29 1998-04-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Method for producing transgenic cereal plants
US5608144A (en) 1994-08-12 1997-03-04 Dna Plant Technology Corp. Plant group 2 promoters and uses thereof
US5792931A (en) 1994-08-12 1998-08-11 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Fumonisin detoxification compositions and methods
US7262055B2 (en) * 1998-08-25 2007-08-28 Gendaq Limited Regulated gene expression in plants
EP0711834A3 (en) 1994-10-14 1996-12-18 Nissan Chemical Ind Ltd New Bacillus strain and product for the control of harmful organisms
US5659026A (en) 1995-03-24 1997-08-19 Pioneer Hi-Bred International ALS3 promoter
WO1996038562A1 (en) 1995-06-02 1996-12-05 Pioneer Hi-Bred International, Inc. HIGH THREONINE DERIVATIVES OF α-HORDOTHIONIN
AR004938A1 (es) 1995-06-02 1999-04-07 Pioneer Hi Bred Internacional Inc Proteina derivada de alfa-hordotionina de alto contenido en metionina, secuencias de nucleotidos, arn y adn, cassete de expresion, vector detransformacion bacteriana, celulas bacterianas y vegetales transformadas, celula o cultivo de tejidos de maiz y metodo para potenciar el contenido de
US5837876A (en) 1995-07-28 1998-11-17 North Carolina State University Root cortex specific gene promoter
US5703049A (en) 1996-02-29 1997-12-30 Pioneer Hi-Bred Int'l, Inc. High methionine derivatives of α-hordothionin for pathogen-control
US5850016A (en) 1996-03-20 1998-12-15 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Alteration of amino acid compositions in seeds
US6072050A (en) 1996-06-11 2000-06-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Synthetic promoters
WO1998001575A1 (en) 1996-07-08 1998-01-15 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Transformation of zygote, egg or sperm cells and recovery of transformed plants from isolated embryo sacs
WO1998020133A2 (en) 1996-11-01 1998-05-14 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Proteins with enhanced levels of essential amino acids
US5981840A (en) 1997-01-24 1999-11-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for agrobacterium-mediated transformation
US7053282B1 (en) 1998-02-09 2006-05-30 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Alteration of amino acid compositions in seeds
ES2270227T3 (es) 1998-02-26 2007-04-01 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Promotor met-1 del maiz.
US6518485B1 (en) * 1998-06-04 2003-02-11 Westvaco Corporation Particle-mediated conifer transformation
ATE309362T1 (de) 1998-08-20 2005-11-15 Pioneer Hi Bred Int Samen-bevorzugende promotoren
AU5788299A (en) 1998-08-28 2000-03-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Seed-preferred promoters from (end) genes
US6504083B1 (en) 1998-10-06 2003-01-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize Gos-2 promoters
EP1173582B1 (en) 1999-04-29 2006-06-14 Syngenta Limited Herbicide resistant plants
US20100293669A2 (en) * 1999-05-06 2010-11-18 Jingdong Liu Nucleic Acid Molecules and Other Molecules Associated with Plants and Uses Thereof for Plant Improvement
US7868149B2 (en) * 1999-07-20 2011-01-11 Monsanto Technology Llc Plant genome sequence and uses thereof
US6603061B1 (en) * 1999-07-29 2003-08-05 Monsanto Company Agrobacterium-mediated plant transformation method
US20070083945A1 (en) 2000-03-10 2007-04-12 Byrum Joseph R Nucleic acid molecules and other molecules associated with plants
US6627797B1 (en) * 2000-03-21 2003-09-30 The Texas A&M University System Maize lipoxygenase polynucleotide and methods of use
US6683231B2 (en) 2000-06-02 2004-01-27 E. I. Du Pont De Nemours And Company High level production of p-hydroxybenzoic acid in green plants
MXPA03002572A (es) 2000-09-26 2004-08-12 Pioneer Hi Bred Int Secuencias de nucleotidos que intervienen en la fertilidad de los machos y metodo de su uso.
US7517975B2 (en) 2000-09-26 2009-04-14 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Nucleotide sequences mediating male fertility and method of using same
US7612251B2 (en) 2000-09-26 2009-11-03 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Nucleotide sequences mediating male fertility and method of using same
AU2001287862B2 (en) 2000-09-29 2006-12-14 Syngenta Limited Herbicide resistant plants
DE10131786A1 (de) 2001-07-04 2003-01-16 Sungene Gmbh & Co Kgaa Rekombinationssysteme und Verfahren zum Entfernen von Nukleinsäuresequenzen aus dem Genom eukaryotischer Organismen
US20090100536A1 (en) * 2001-12-04 2009-04-16 Monsanto Company Transgenic plants with enhanced agronomic traits
US20030186281A1 (en) 2001-12-21 2003-10-02 Wolfgang Hillen Modified tetracycline repressor protein compositions and methods of use
US7045684B1 (en) 2002-08-19 2006-05-16 Mertec, Llc Glyphosate-resistant plants
EP2559759A1 (en) 2003-01-28 2013-02-20 Cellectis Custom-made meganuclease and use thereof
ATE528402T1 (de) 2003-02-19 2011-10-15 Commw Scient Ind Res Org Effiziente genabschaltung in pflanzen unter verwendung von kurzen dsrna-sequenzen
IES20030696A2 (en) 2003-09-23 2005-03-23 Carsphairn Ltd A pipeline apparatus
ATE419367T1 (de) * 2003-11-18 2009-01-15 Bayer Bioscience Nv Verbesserte gezielte dna-insertion in pflanzen
US7214855B2 (en) 2003-12-22 2007-05-08 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize metallothionein 2 promoter and methods of use
EP1711614B1 (en) 2004-02-02 2009-01-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Ap2 domain transcription factor odp2 (ovule development protein 2) and methods of use
US7292055B2 (en) 2005-04-21 2007-11-06 Endicott Interconnect Technologies, Inc. Interposer for use with test apparatus
US20070016985A1 (en) 2005-07-18 2007-01-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Particle Preparation for Direct-Delivery Transformation
BRPI0612862A2 (pt) 2005-07-18 2010-11-30 Pioneer Hi Bred Int polinucleotìdeo isolado, método para obtenção de uma célula transformada, método para obtenção de uma planta transformada, método de produção de recombinação de dna de sìtio especìfico, biblioteca isolada, método de geração de biblioteca de moléculas e método para selecionar sìtio de recombinação frt modificado
DK3284833T3 (da) 2005-08-26 2022-02-07 Dupont Nutrition Biosci Aps Anvendelse af crispr-associerede gener (cas)
EP3339441A1 (en) * 2005-10-13 2018-06-27 Monsanto Technology LLC Methods for producing hybrid seed
DK2662442T3 (en) 2005-10-18 2015-07-06 Prec Biosciences Rationally designed mechanuclease with altered dimer formation affinity
EP2465341B1 (en) 2006-01-12 2014-12-17 Cibus Europe B.V. EPSPS Mutants
JP5296684B2 (ja) 2006-08-11 2013-09-25 モンサント テクノロジー エルエルシー アントラニル酸合成酵素の葉緑体標的発現による高トリプトファントウモロコシの生産
EP2078089B1 (en) 2006-10-31 2016-05-04 E. I. du Pont de Nemours and Company Soybean event dp-305423-1 and compositions and methods for the identification and/or detection thereof
WO2008083233A2 (en) 2006-12-29 2008-07-10 Dow Agrosciences Llc In vitro methods for the induction and maintenance of plant cell lines as single suspension cells with intact cell walls, and transformation thereof
EP2181193B1 (en) 2007-06-07 2017-10-25 Agriculture And Agri-food Canada Plant transformation with cell penetrating peptides
CN101849010A (zh) 2007-06-29 2010-09-29 先锋高级育种国际公司 用于改变单子叶植物细胞的基因组的方法
US7919676B2 (en) 2007-08-03 2011-04-05 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Msca1 nucleotide sequences impacting plant male fertility and method of using same
WO2009042164A1 (en) 2007-09-27 2009-04-02 Dow Agrosciences Llc Engineered zinc finger proteins targeting 5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase genes
US8722410B2 (en) 2007-10-05 2014-05-13 Dow Agrosciences, Llc. Methods for transferring molecular substances into plant cells
US8697857B2 (en) 2007-11-20 2014-04-15 E. I. Du Pont De Nemours And Company Soybean EF1A2 promoter and its use in constitutive expression of transgenic genes in plants
US8546553B2 (en) 2008-07-25 2013-10-01 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Prokaryotic RNAi-like system and methods of use
US20100076057A1 (en) 2008-09-23 2010-03-25 Northwestern University TARGET DNA INTERFERENCE WITH crRNA
WO2010062518A1 (en) 2008-10-28 2010-06-03 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Sulfonylurea-responsive repressor proteins
CA2747124C (en) 2008-12-17 2018-09-04 Dow Agrosciences Llc Targeted integration into the zp15 locus
HUE026053T2 (en) 2009-04-07 2016-05-30 Dow Agrosciences Llc Sequence-specific nuclease delivery by nanoparticle
US8466341B2 (en) 2009-05-04 2013-06-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize 17KD oleosin seed-preferred regulatory element
US20110167516A1 (en) 2009-12-30 2011-07-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for the introduction and regulated expression of genes in plants
CN102939383B (zh) 2009-12-30 2015-04-29 先锋国际良种公司 用于靶向多核苷酸修饰的方法和组合物
US8581036B2 (en) 2010-03-31 2013-11-12 Dow Agrosciences, Llc. Plant peptide gamma-zein for delivery of biomolecules into plant cells
BR112012028805A2 (pt) 2010-05-10 2019-09-24 The Regents Of The Univ Of California E Nereus Pharmaceuticals Inc composições de endorribonuclease e métodos de uso das mesmas.
CA2798941A1 (en) 2010-06-09 2011-12-15 E. I. Du Pont De Nemours And Company Regulatory sequences for modulating transgene expression in plants
CN103052713A (zh) 2010-07-07 2013-04-17 陶氏益农公司 官能化线性dna盒的生成及植物中量子点/纳米颗粒介导的投递
CA3065095C (en) 2010-07-07 2023-02-14 Dow Agrosciences Llc Method for introgressing a trait into a plant
WO2012016052A1 (en) 2010-07-28 2012-02-02 True Fit Corporation Fit recommendation via collaborative inference
US8916377B2 (en) 2011-02-15 2014-12-23 Pioneer Hi Bred International Inc Root-preferred promoter and methods of use
MX2013010911A (es) * 2011-03-23 2015-03-03 Pioneer Hi Bred Int Metodos para producir un locus de rasgo transgenico complejo.
AU2012230804B2 (en) 2011-03-23 2016-12-22 Corteva Agriscience Llc Quantum dot carrier peptide conjugates suitable for imaging and delivery applications in plants
US9726249B2 (en) 2011-05-13 2017-08-08 Mississippi State University Shock mitigating materials and methods utilizing spiral shaped elements
US20140113376A1 (en) 2011-06-01 2014-04-24 Rotem Sorek Compositions and methods for downregulating prokaryotic genes
CN104080914A (zh) 2011-06-21 2014-10-01 先锋国际良种公司 产生雄性不育植物的组合物和方法
US10059953B2 (en) 2011-07-15 2018-08-28 E I Du Pont De Nemours And Company Plant terminator sequences
CA2845312A1 (en) 2011-08-01 2013-02-07 Tagged, Inc. Systems and methods for asynchronous distributed database management
BR112014002611B8 (pt) 2011-08-02 2021-07-13 Pioneer Hi Bred Int construção recombinante e método de expressão de um polinucleotídeo heterólogo em uma planta
BR112014002622A2 (pt) 2011-08-03 2019-09-24 Du Pont método para introduzir no genoma de uma célula vegetal um sítio alvo para a integração específica de sítio, célula vegetal, parte de planta, planta ou semente, método para integrar um polinucleotídeo de interesse em um sítio alvo no genoma de uma célula vegetal
EP2748323B1 (en) 2011-08-22 2019-05-01 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Methods and means to modify a plant genome
BR112014010537A2 (pt) 2011-10-31 2017-05-02 Pioneer Hi Bred Int método para modular a sensibilidade ao etileno, planta transgênica, proteína isolada, sequência de polinucleotídeos isolada, polipeptídeo com atividade regulatória de etileno, método para aumentar o rendimento em uma planta, método para melhorar um parâmetro agronômico de uma planta, método de seleção assistida por marcador de uma planta
EP2776560A2 (en) 2011-11-07 2014-09-17 The University of Western Ontario Endonuclease for genome editing
AR089254A1 (es) 2011-12-15 2014-08-13 Dow Agrosciences Llc Metodo para transformacion mejorada utilizando agrobacterium
GB201122458D0 (en) 2011-12-30 2012-02-08 Univ Wageningen Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof
AR089793A1 (es) 2012-01-27 2014-09-17 Du Pont Metodos y composiciones para generar locus de rasgos transgenicos complejos
WO2013141680A1 (en) 2012-03-20 2013-09-26 Vilnius University RNA-DIRECTED DNA CLEAVAGE BY THE Cas9-crRNA COMPLEX
US9637739B2 (en) 2012-03-20 2017-05-02 Vilnius University RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex
CN104487577A (zh) 2012-05-18 2015-04-01 先锋国际良种公司 用于调控表达的诱导型启动子序列及使用方法
ES2960803T3 (es) 2012-05-25 2024-03-06 Univ California Métodos y composiciones para la modificación de ADN diana dirigida por RNA y para la modulación de la transcripción dirigida por RNA
WO2013184537A1 (en) 2012-06-04 2013-12-12 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Sb-actin terminator sequence for gene expression in plants
EP2861737B1 (en) * 2012-06-19 2019-04-17 Regents Of The University Of Minnesota Gene targeting in plants using dna viruses
CN116622704A (zh) 2012-07-25 2023-08-22 布罗德研究所有限公司 可诱导的dna结合蛋白和基因组干扰工具及其应用
UA119135C2 (uk) 2012-09-07 2019-05-10 ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі Спосіб отримання трансгенної рослини
US20140096284A1 (en) 2012-10-01 2014-04-03 Iowa State University Research Foundation, Inc. Method for the delivery of molecules lyophilized onto microparticles to plant tissues
ES2926021T3 (es) 2012-10-23 2022-10-21 Toolgen Inc Composición para escindir un ADN objetivo que comprende un ARN guía específico para el ADN objetivo y ácido nucleico codificador de proteína Cas o proteína Cas, y uso de la misma
BR112015009812A2 (pt) 2012-10-31 2017-08-22 Cellectis Método para a inserção genética específica em um genoma de planta, célula de planta transformada e seu uso, planta resistente a herbicidas, kit, vetor, e célula hospedeira
EP3617309A3 (en) 2012-12-06 2020-05-06 Sigma Aldrich Co. LLC Crispr-based genome modification and regulation
WO2014093479A1 (en) 2012-12-11 2014-06-19 Montana State University Crispr (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) rna-guided control of gene regulation
CN114634950A (zh) 2012-12-12 2022-06-17 布罗德研究所有限公司 用于序列操纵的crispr-cas组分系统、方法以及组合物
US20140310830A1 (en) 2012-12-12 2014-10-16 Feng Zhang CRISPR-Cas Nickase Systems, Methods And Compositions For Sequence Manipulation in Eukaryotes
SG10201912328UA (en) 2012-12-12 2020-02-27 Broad Inst Inc Delivery, Engineering and Optimization of Systems, Methods and Compositions for Sequence Manipulation and Therapeutic Applications
EP2931899A1 (en) 2012-12-12 2015-10-21 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, knock out libraries and applications thereof
EP3144390B1 (en) 2012-12-12 2020-03-18 The Broad Institute, Inc. Engineering of systems, methods and optimized guide compositions for sequence manipulation
IL239344B1 (en) 2012-12-12 2024-02-01 Broad Inst Inc Systems engineering, methods and optimal guiding components for sequence manipulation
ES2576128T3 (es) 2012-12-12 2016-07-05 The Broad Institute, Inc. Modificación por tecnología genética y optimización de sistemas, métodos y composiciones para la manipulación de secuencias con dominios funcionales
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
CN113355357A (zh) 2012-12-12 2021-09-07 布罗德研究所有限公司 对用于序列操纵的改进的系统、方法和酶组合物进行的工程化和优化
RU2015128052A (ru) 2012-12-13 2017-01-19 Дау Агросайенсиз Ллс Точный таргетинг генов в отношении конкретного локуса кукурузы
IL308158A (en) 2012-12-17 2023-12-01 Harvard College RNA-guided human genome engineering
JP6491113B2 (ja) 2013-02-25 2019-03-27 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド ヌクレアーゼ媒介性遺伝子破壊を増強するための方法および組成物
US10329574B2 (en) 2013-03-12 2019-06-25 E I Du Pont De Nemours And Company Methods for the identification of variant recognition sites for rare-cutting engineered double-strand-break-inducing agents and compositions and uses thereof
AU2014235794A1 (en) 2013-03-14 2015-10-22 Caribou Biosciences, Inc. Compositions and methods of nucleic acid-targeting nucleic acids
US10119133B2 (en) 2013-03-15 2018-11-06 The General Hospital Corporation Using truncated guide RNAs (tru-gRNAs) to increase specificity for RNA-guided genome editing
US20140273235A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Regents Of The University Of Minnesota ENGINEERING PLANT GENOMES USING CRISPR/Cas SYSTEMS
US10113162B2 (en) * 2013-03-15 2018-10-30 Cellectis Modifying soybean oil composition through targeted knockout of the FAD2-1A/1B genes
EP2981617B1 (en) 2013-04-04 2023-07-05 President and Fellows of Harvard College Therapeutic uses of genome editing with crispr/cas systems
WO2014186686A2 (en) 2013-05-17 2014-11-20 Two Blades Foundation Targeted mutagenesis and genome engineering in plants using rna-guided cas nucleases
WO2014194190A1 (en) 2013-05-30 2014-12-04 The Penn State Research Foundation Gene targeting and genetic modification of plants via rna-guided genome editing
SG10201913015XA (en) 2013-07-10 2020-02-27 Harvard College Orthogonal cas9 proteins for rna-guided gene regulation and editing
JP7019233B2 (ja) 2013-07-11 2022-02-15 モデルナティエックス インコーポレイテッド ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする合成ポリヌクレオチドおよび合成ｓｇＲＮＡを含む組成物ならびに使用方法
US20150044772A1 (en) 2013-08-09 2015-02-12 Sage Labs, Inc. Crispr/cas system-based novel fusion protein and its applications in genome editing
US20150044192A1 (en) 2013-08-09 2015-02-12 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a cas9 nuclease
AU2014308899B2 (en) 2013-08-22 2020-11-19 E. I. Du Pont De Nemours And Company Methods for producing genetic modifications in a plant genome without incorporating a selectable transgene marker, and compositions thereof
WO2015070083A1 (en) 2013-11-07 2015-05-14 Editas Medicine,Inc. CRISPR-RELATED METHODS AND COMPOSITIONS WITH GOVERNING gRNAS
JP2016537028A (ja) 2013-11-18 2016-12-01 クリスパー セラピューティクス アーゲー Ｃｒｉｓｐｒ−ｃａｓシステムの材料及び方法
US9840699B2 (en) 2013-12-12 2017-12-12 President And Fellows Of Harvard College Methods for nucleic acid editing
EP3097212A4 (en) 2014-01-24 2017-10-04 North Carolina State University Methods and compositions for sequences guiding cas9 targeting
ES2898460T3 (es) 2014-02-27 2022-03-07 Monsanto Technology Llc Composiciones y procedimientos para la modificación genómica dirigida al sitio
US11584936B2 (en) 2014-06-12 2023-02-21 King Abdullah University Of Science And Technology Targeted viral-mediated plant genome editing using CRISPR /Cas9
BR112017000621B1 (pt) 2014-07-11 2024-03-12 Pioneer Hi-Bred International, Inc Método para melhorar um traço agronômico de uma planta de milho ou de soja
MX2017000422A (es) 2014-07-11 2017-05-01 Du Pont Composiciones y metodos para producir plantas resistentes al herbicida glifosato.
US10450584B2 (en) 2014-08-28 2019-10-22 North Carolina State University Cas9 proteins and guiding features for DNA targeting and genome editing
CN108064129A (zh) 2014-09-12 2018-05-22 纳幕尔杜邦公司 玉米和大豆中复合性状基因座的位点特异性整合位点的产生和使用方法
NZ733702A (en) 2015-01-28 2022-04-29 Caribou Biosciences Inc Crispr hybrid dna/rna polynucleotides and methods of use
CN107406858A (zh) 2015-02-25 2017-11-28 先锋国际良种公司 用于指导rna/cas内切核酸酶复合物的调节型表达的组合物和方法
EP3270685B1 (en) 2015-03-19 2023-07-19 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for accelerated trait introgression
EP3553178A1 (en) 2015-03-27 2019-10-16 E. I. du Pont de Nemours and Company Soybean u6 small nuclear rna gene promoters and their use in constitutive expression of small rna genes in plants
CA2985506A1 (en) 2015-05-15 2016-11-24 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Guide rna/cas endonuclease systems
DE102015006335A1 (de) 2015-05-19 2016-11-24 Kws Saat Se Verfahren und Konstrukte zur gezielten Nukleinsäure Editierung in Pflanzen
AU2016270870A1 (en) 2015-06-02 2018-01-04 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for delivery of a polynucleotide into a plant
WO2017034971A1 (en) 2015-08-21 2017-03-02 Monsanto Technology Llc Enhanced recombination of genomic loci
WO2017062855A1 (en) 2015-10-09 2017-04-13 Monsanto Technology Llc Novel rna-guided nucleases and uses thereof
EP4089175A1 (en) 2015-10-13 2022-11-16 Duke University Genome engineering with type i crispr systems in eukaryotic cells
CA2996326A1 (en) 2015-10-20 2017-04-27 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for marker-free genome modification
WO2017155715A1 (en) 2016-03-11 2017-09-14 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel cas9 systems and methods of use
EP3426780A1 (en) 2016-03-11 2019-01-16 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel cas9 systems and methods of use
WO2017155717A1 (en) 2016-03-11 2017-09-14 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel cas9 systems and methods of use
CN109312317A (zh) 2016-06-14 2019-02-05 先锋国际良种公司 Cpf1内切核酸酶用于植物基因组修饰的用途
CA3018430A1 (en) 2016-06-20 2017-12-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel cas systems and methods of use

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