JP2015226537A - Zp15遺伝子座内への標的組込み - Google Patents
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Abstract
Description
適用されない。
本開示は、トウモロコシの第6染色体上に位置する植物Zp15遺伝子内への標的組込み(TI)のための方法および組成物に関する。DNA結合ドメイン(例えば、ZFP、メガヌクレアーゼ、またはロイシンジッパー)およびヌクレアーゼドメインを含む融合タンパク質を用いることによって、挿入された(ドナー)配列を外因性プロモーターに操作可能に連結させることができ、またはプロモーターがなくてもよい。プロモーターがない場合、組み込まれたオープン・リーディング・フレームの転写は、プロモーター特定の組織における内在性Zp15遺伝子プロモーターによって生じ得る。プロモーターがないドナーの使用によって、前記ドナーのランダムな組込みの可能性および/または前記ドナー上に保持されたプロモーターによる内在性遺伝子の疑似活性化は低下する。
当該方法の実施、ならびに本明細書に開示される組成物の調製および使用は、特に指定のない限り、分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、計算化学、細胞培養、組換えDNA、ならびに当該技術分野の技術の範囲内にある関連分野における従来技術を利用する。これらの技術は文献で十分に説明されている。例えば、Sambrookら,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,Second edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989およびThird edition,2001;Ausubelら,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John Wiley&Sons,New York,1987および定期的に更新したもの;the series METHODS IN ENZYMOLOGY,Academic Press,San Diego;Wolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION,Third edition,Academic Press,San Diego,1998;METHODS IN ENZYMOLOGY,Vol.304,“Chromatin”(P.M.WassarmanおよびA.P.Wolffe,eds.),Academic Press,San Diego,1999;ならびにMETHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,Vol.119,“Chromatin Protocols”(P.B.Becker,ed.)Humana Press,Totowa,1999を参照されたい。
「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、代替可能に用いられ、線状または環状の構造で、かつ一本鎖または二本鎖のいずれかの形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのポリマーを表す。本開示上、これらの用語は、ポリマーの長さについて制限するものとして解釈されるべきではない。前記用語は、天然ヌクレオチドの既知の類似体、ならびに塩基、糖および/またはリン酸塩部分(例えば、ホスホロチオエート骨格)において改変されているヌクレオチドを包含し得る。一般に、特定のヌクレオチドの類似体は同じ塩基対合特異性を有し、すなわちAの類似体はTと塩基対合する。
開示される方法および組成物には、切断ドメイン(または切断ハーフドメイン)およびDNA結合ドメイン(例えば、ZFP、メガヌクレアーゼ、またはロイシンジッパー)を含み、前記DNA結合ドメイン(例えば、ジンクフィンガードメイン、メガヌクレアーゼ、またはロイシンジッパー)が、植物Zp15遺伝子座内の配列に結合することによって切断ドメイン(または切断ハーフドメイン)の活性を前記配列の付近に向けさせ、それによってZp15内での切断(例えば、二本鎖断裂)を誘導する融合タンパク質が含まれる。本開示の別の部分で示すように、ジンクフィンガードメインは、実質的に任意の所望の配列に結合するように遺伝子操作されていてよい。したがって、1つ以上のDNA結合ドメイン(例えば、ZFP)は、植物Zp15遺伝子内の1つ以上の配列に結合するように遺伝子操作されていてよい。DNA結合ドメイン(例えば、ZFP)および切断ドメインを含む融合タンパク質(あるいは、それぞれがDNA結合ドメインおよび切断ハーフドメインを含む2つの融合タンパク質)の細胞内での発現は、Zp15遺伝子における切断をもたらす。
任意のDNA結合ドメインを、本明細書に開示される方法において用いることができる。ある実施態様では、DNA結合ドメインはジンクフィンガータンパク質を含む。ジンクフィンガー結合ドメインは、1つ以上のジンクフィンガーを含む。Millerら,(1985)EMBO J.4:1609−1614;Rhodes(1993)Scientific American Feb.:56−65;米国特許第6,453,242号。本明細書に記載されるジンクフィンガー結合ドメインは、概して2、3、4、5、6、またはさらに多くのジンクフィンガーを含む。
前述のように、DNA結合ドメインは、切断(ヌクレアーゼ)ドメインと関連していてもよい。例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼは、ヌクレアーゼ機能を維持している一方で、そのDNA結合特異性を改変されていてもよい。さらに、ジンクフィンガータンパク質はまた、切断ドメインと融合して、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)を形成してもよい。本明細書に開示される融合タンパク質の切断ドメイン部分は、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから獲得され得る。切断ドメインが由来し得る例示的エンドヌクレアーゼには、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが含まれるが、これに制限されない。例えば、2002−2003カタログ,New England Biolabs,Beverly,MA;およびBelfortら,(1997)Nucleic Acids Res.25:3379−3388を参照されたい。DNAを切断するさらなる酵素が既知である(例えば、S1ヌクレアーゼ;マングビーンヌクレアーゼ;膵臓DNaseI;ミクロコッカスヌクレアーゼ;酵母HOエンドヌクレアーゼ;Linnら,(eds.)Nucleases,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1993も参照されたい)。ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼの制限されない例には、I−SceI、I−CeuI、PI−PspI、PI−Sce、I−SceIV、I−CsmI、I−PanI、I−SceII、I−PpoI、I−SceIII、I−CreI、I−TevI、I−TevII、およびI−TevIIIが含まれる。米国特許第5,420,032号;米国特許第6,833,252号;Belfortら,(1997)Nucleic Acids Res.25:3379−3388;Dujonら,(1989)Gene 82:115−118;Perlerら,(1994)Nucleic Acids Res.22,1125−1127;Jasin(1996)Trends Genet.12:224−228;Gimbleら,(1996)J.Mol.Biol.263:163−180;Argastら,(1998)J.Mol.Biol.280:345−353;およびthe New England Biolabsカタログも参照されたい。1つ以上のこれらの酵素(またはその機能性フラグメント)を、切断ドメインおよび切断ハーフドメインの供給源として用いることができる。
融合タンパク質(およびそれをコードするポリヌクレオチド)の設計および構築のための方法は、当業者に既知である。例えば、DNA結合ドメイン(例えば、ジンクフィンガードメイン)および制御または切断ドメイン(もしくは切断ハーフドメイン)、および融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む融合タンパク質の設計および構築のための方法は、参照することによりそれらの全体として本明細書に組み入れられている、共同所有の米国特許第6,453,242号および第6,534,261号、ならびに米国特許出願公報第2007/0134796号および第2005/0064474号に記載されている。ある実施態様では、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを構築する。これらのポリヌクレオチドをベクター内に挿入することができ、かつ前記ベクターを細胞内に導入することができる(ベクターおよび細胞内にポリヌクレオチドを導入するための方法に関するさらなる開示のために、下記を参照されたい)。
開示される方法および組成物を用いて、植物の細胞クロマチンのZp15遺伝子におけるDNAを切断することができ、それによって前記遺伝子座への外因性配列の安定的な標的組込みが容易になる。本明細書に記載されるように、内在性Zp15遺伝子の機能の喪失は植物細胞に十分に許容され、かつこの遺伝子内に組み込まれた配列が広範に転写され、組み込まれた配列の遺伝的伝達のための生殖細胞系の改変を有する植物を作出する。したがって、Zp15は外因性配列の標的組込みのための所望の部位である。
本明細書に記載されるような1つ以上の融合タンパク質(例えば、ZFN)をコードする核酸を、複製および/または発現のために、原核細胞または真核細胞内への形質転換用ベクター内にクローニングすることができる。ベクターは、原核細胞用ベクター、例えばプラスミドまたはシャトルベクター、昆虫細胞用ベクター、あるいは真核細胞用ベクターであってよい。融合タンパク質をコードする核酸を、植物細胞への投与のための発現ベクター内にクローニングすることもできる。
前述のように、DNA構築物を様々な従来技術によって所望の植物宿主内へ(例えば、そのゲノム内へ)導入することができる。そのような技術を見直すために、例えば、Weissbach&Weissbach,Methods for Plant Molecular Biology(1988,Academic Press,N.Y.)Section VIII,pp.421−463;およびGrierson&Corey,Plant Molecular Biology(1988,2d Ed.),Blackie,London,Ch.7−9を参照されたい。
公的に入手可能な遺伝子地図(Lawrence,C.ら,(2004)NAR 32:393−397;トウモロコシのインターネットのデータベース)およびトウモロコシのドラフトゲノム配列に基づき、第6染色体の短腕上にあるZp15遺伝子座を、位置およびZp15について入手可能な情報に基づくZFNを用いた改変の標的として選択した。トウモロコシ由来の15kDのβゼインをコードする遺伝子(Zp15)のゲノム構造および配列は、公に記載されかつ注釈が付されている(Wooら,(2001)Plant Cell 13(10):2297−2313)。Zp15遺伝子に対する配列は、参照することにより本明細書に組み入れられている、GenBankアクセス番号AF371264に記載されている。
P67F 5’−CGTATGAATTCATTGACAACC−3’(配列番号:1)
P68F 5’−ATGATCTATCTGTAAATCC−3’(配列番号:2)
P69F 5’−CGTCATGCAACGCAACATTCC−3’(配列番号:3)
P73F 5’−AAGAACATCACAAGTTATGC−3’(配列番号:4)
P74F 5’−TCATGTGGATCCAAGGCATC−3’(配列番号:5)
が含まれるが、これに制限されない。
P70R 5’−ATGTGTGTCGTCTTACTGC−3’(配列番号:6)
P71R 5’−CAGTAGTAGGGCGGAATG−3’(配列番号:7)
P72R 5’−GGGCAGCTGGTACTG−3’(配列番号:8)
P75R 5’−CTATAATCGATGTAGAGC−3’(配列番号:9)
P76R 5’−CTATGCTTTGTCTATAGTCG−3’(配列番号:10)
が含まれるが、これに制限されない。
ZFNに対する発現ベクターを組み立てるために、ライブラリーアーカイブから選択したまたは新たに合成したZFNコード遺伝子の任意の所定の対に対して適用可能である、段階的なモジュラークローニング方式を考案した。
ZFN対によるDSBの誘導を試験した。内在性Zp15遺伝子の意図される標的部位においてDSBを効率的に誘導し得るZFN対を同定した。ZFN誘導性断裂の部位において小さなDNA欠失/挿入をもたらすことが既知である非相同末端結合(NHEJ)によるDSB修復のエラーを起こしやすい性質を利用して、内在性Zp15遺伝子標的部位に効率的に結合かつ切断するZFN対を選択した。
Zp15における切断活性を有する設計されたZFNが、外因性配列の組込みを促進し得るかどうかを試験するために、本発明者らは、例示的な外因性の除草剤耐性遺伝子であるスフィンゴモナス・ヘルビシドボランス由来のAAD−1(ATCC700291)をコードする自律的遺伝子カセットを保持するドナーDNA分子を構築した。AAD−1は、アリールオキシアルカノエート・ジオキシゲナーゼ酵素をコードし、アリールオキシフェノキシプロピオン酸系除草剤に対する耐性を与える(国際特許WO2005/107437,WO2008141154A2)。当業者であれば、関連したADD−12遺伝子等の他の除草剤耐性遺伝子を含むが、これに制限されない他の外因性核酸を、ドナーDNA分子内に同様に組み入れることができるということを理解するであろう。この除草剤耐性遺伝子ドナーにおいて、プロモーター配列はO.サティバのアクチンに由来しており(GenBankアクセス番号S44221およびX63830)、かつターミネーター配列はZ.メイスのL.リパーゼに由来している(GenBankアクセス番号L35913)。
Zp15に相同な領域を含有するドナー構築物を以下のように作製した。Zp15遺伝子に対して相同な隣接部を含有するプラスミド骨格を、Zp15遺伝子の対応する標的部位内への任意のドナーDNA配列の組込みが可能になるように遺伝子操作した。ここに例示したプラスミド骨格は、基本プラスミドベクターpBC SK(−)ファージミド(3.4kbp)(Stratagene,La Jolla,CA)に由来したものであった。この手法には4つの工程があった。
Zp15HRドナーNotI(205)F:5’−GCGGCCGCATGCAAGAGCTGTTGATC−3’(配列番号:97)
Zp15HRドナーMfeI(1025)R:5’−CAATTGCCGGCGTAGTAGGGCGCCGCCGCCAGC−3’(配列番号:98)
Zp15HRドナーMfeI(1025)F:5’−CAATTGGTGTGGGCAGCCGAGCGCCATGTTCCAG−3’(配列番号:99)
Zp15HRドナーSalI(2270)R:5’−GTCGACCGATACTGATGCGGACCGTCCACCTTGTC−3’(配列番号:100)
を用いて、Zp15から5’および3’相同隣接部を単離した。
OsActAad1v.3ZmLipMfeIF 5’−CAATTGGTCATTCATATGCTTGAGAAGAG−3’(配列番号:101)
OsActAad1v.3ZmLipMfeIR 5’−CAATTGAGCACTTAAAGATCTTTAGAAG−3’(配列番号:102)
をIntegrated DNA Technologies社(Coralville,IA)によって標準的脱塩の条件下で合成し、0.125μg/μLの濃度まで水で希釈した。
除草剤耐性遺伝子カセットをコードする組み込まれたドナーDNA分子を含有する除草剤耐性事象のうち、前記事象のある割合は、ZFN誘導性二本鎖断裂の部位へのドナーDNAの標的組込みの産物であると予想されている。これらの標的組込み事象を除草剤耐性遺伝子カセットのランダムな組込みに由来するものと区別するために、ゲノム特異的およびそれに続くゲノム特異的、さらにドナー特異的PCRプライマーを用いたPCRに基づく遺伝子型同定ストラテジーを利用した。
HB501f:5’−AAGGTCCCAAATCTGAGGCATACTGTTGCT−3’(配列番号:103)
HB502r:5’−GAGGTCCTATGCTTTGTCTATAGTCGGCAG−3’(配列番号:104)
を、ドナーDNA配列の境界の外側に位置するZp15遺伝子標的に特異的なgDNAにアニールするように設計した。
HB503f:5’−GGCATACTGTTGCTGCCCTGCTGGAA−3’(配列番号:105)
HB504r:5’−GACACCTATAATCGATGTAGAGCCGAAGAG−3’(配列番号:106)
も、ドナーDNA配列の境界の外側のZp15遺伝子標的に特異的なgDNAにアニールするように設計し、しかしながら第一の対の中に入れ子にした。
HB505f:5’−AGTCCACCCCAGTGATCTCAGCACCA−3’(配列番号:107)
HB506f:5’−AGTGGCTGGACAGCTATTCTCTCAAAGCGT−3’(配列番号:108)
HB507r:5’−ACGCTTTGAGAGAATAGCTGTCCAGCCACT−3’(配列番号:109)
HB508r:5’−TGGTGCTGAGATCACTGGGGTGGACT−3’(配列番号:110)
本明細書に開示される標的遺伝子座内への選択された外因性ポリヌクレオチドの標的組込みのための方法のさらなる例示として、PATをコードする自律的遺伝子カセットを保持するさらなるDNAドナー分子を設計かつ構築し、内在性Zp15標的遺伝子座内への外因性ドナー配列の組込みを試験した。この遺伝子座でDSBを引き起こすために、内在性Zp15遺伝子標的の特異的切断活性を有するZFNを配置した。続いて、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス由来のPATをコードする自律的遺伝子カセットを保持するドナーDNA分子およびZp15に相同な隣接配列を、Zp15標的のZFN誘導性DSB内に組み込んだ。PATは、ホスフィノトリシン・アセチル・トランスフェラーゼ酵素をコードし、アセチル化によって除草活性化合物ホスフィノトリシン(PPT)に対する耐性を与える(米国特許第5,633,434号)。ホスフィノトリシンは、除草剤のリバティ、バスタ、およびイグナイトの活性成分である。PATコード配列を植物転写単位(PTU)として構築し、O.サティバのアクチン(GenBankアクセス番号S44221およびX63830)に由来するプロモーター配列、およびZ.メイスのL.リパーゼ(GenBankアクセス番号L35913)に由来するターミネーター配列を含有させた。
Zp15に相同な領域を含有するZp15ドナー構築物を、以下のように合成して作製した。pDAB7489由来のヌクレオチド4595−5346(5’相同配列;配列番号:111)およびヌクレオチド21−796(3’相同配列;配列番号112)を含むZp15相同領域を設計した。この相同領域は、5’および3’相同エレメントの間にMfeIクローニング部位、ならびに5’および3’末端にNotI制限酵素認識部位を含んでいた。このDNA配列(配列番号:113)を合成し、カナマイシン耐性ColE1型プラスミドであるpMK内のSacIおよびKpnIクローニング部位(Gene Art Ag,Regensburg,Germany)に挿入した。結果として生じたドナープラスミドはpDAB104101と称され(図7)、Zp15遺伝子の対応する標的部位内への対象の任意のDNA配列の組込みを可能にする、Zp15遺伝子に対する相同隣接部を含有している。
DC001 5’−CCAGTGCAATTGGGTCATTCATATGCTTGAGAAG−3’(配列番号:114)
DC002 5’ −CCAGTGCAATTGAATTCAGCACTTAAAGATCTTTAG−3’(配列番号:115)
を用いたPCRによって、プラスミドpDAB102256から増幅した。
pDAB7489内のZp15 3’相同配列を切り取ることによって改変し、一方でpDAB7489内のZp15 5’相同配列は同じ状態のままである、Zp15に相同な領域を含有する別のドナー構築物を作製した。切り取った3’相同領域を、Integrated DNA Technologies社(Coralville,IA)によって合成されたプライマー:
DC003 5’−CTAATCGTCGACTCGTCAAGCCCCGCCTTTAAAT−3’(配列番号:117)
DC004 5’ −CTAATCCAATTGGTGTGGGCAGCCGAGCG−3’(配列番号:118)
を用いてPCRによってpDAB7489から作製した。
トウモロコシ亜種Hi−IIの胚発生細胞培養物(Armstrongら,(1991)Maize Genet Coop Newsletter 65:92−93)を作製し、維持し、かつZFN24およびドナー分子をコードするプラスミドの同時形質転換にかけた。ドナー分子には、ここに記載されるもの;pDAB104102、pDAB104103、pDAB104104、およびpDAB104105が含まれる。カルス組織の形質転換および選択、ならびにその後の形質転換体の再生は、米国特許出願第12/001,939号、特に実施例19に記載されており、この参考文献は参照することによりその全体として本明細書に組み入れられている。形質転換および選択のプロトコールに関するさらなるガイダンスのために、Petolinoら,(2000)Plant Cell Rept.19:781−786を参照されたい。開花後、植物を自己授粉またはDAS5XH751等のトウモロコシ亜種と異種交配させることができる。結果として生じた後代種子を収穫かつ乾燥させることができ、これらの種子由来の植物を分析して、標的組込み事象の遺伝性を証明することができる。無傷の、稔性のトウモロコシ植物へのカルスの再生は、米国特許出願第12/001,939号、特に実施例22に記載されており、この参考文献は参照することによりその全体として本明細書に組み入れられている。
形質転換したカルス組織におけるZp15を標的としたPAT挿入を、PCRによって検出する。テンプレートゲノムDNAを、周知かつ植物DNEASYキット(QIAGEN社,Valencia,CA)等のよく用いられる方法、またはDellaporta(Dellaportaら,(1983)Plant Mol.Biol.Rep.1;19−21)の方法によって、カルス組織から抽出する。Zp15遺伝子座内へのAAD−1標的組込みを検出するためにすでに用いられているPAT特異的プライマーとZp15隣接配列プライマーとの併用によって、5’および3’Zp15相同領域におけるPAT標的挿入接合部の増幅がもたらされる。前記PAT特異的プライマーは、:
DC013 5’−CAATCGTAAGCGTTCCTAGCCTTCCAG−3’ (配列番号:120)
DC014 5’ −CTGGAAGGCTAGGAACGCTTACGATTG−3’(配列番号:121)
であってよい。具体的には、ドナーDNAがZp15遺伝子に対して直列方向(direct orientation)にPAT遺伝子を有する場合、ドナーDNA 5’Zp15相同配列に隣接するゲノム領域内のプライマーHB501fまたはHB503fを、PATタンパク質コード領域内のプライマーDC013(配列番号:120)とともに用いて、PAT−Zp15 5’インサート接合部を検出する。同様に、ドナーDNAがZp15遺伝子に対して非直列方向(indirect orientation)にPAT遺伝子を有する場合、プライマーHB501fまたはHB503fを、PATタンパク質コード領域内のプライマーDC014(配列番号:121)とともに用いて、PAT−Zp15 5’インサート接合部を検出する。ドナーDNAがZp15遺伝子に対して非直列方向にPAT遺伝子を有する場合、PAT−Zp15 3’インサート接合部の検出のために、プライマーHB502rまたはHB504rをプライマーDC013(配列番号:120)とともに用いて、インサート接合部を検出する。同様に、ドナーDNAがZp15遺伝子に対して直列方向にPAT遺伝子を有する場合、プライマーHB502rまたはHB504rをプライマーDC014(配列番号:121)とともに用いて、PAT−Zp15 3’インサート接合部を検出する。
HB501f/HB503f+DC013(5’)=2.6kbp(pDAB104103),2.6kbp(pDAB104104)
HB501f/HB503f+DC014(5’)=1.6kbp(pDAB104105),1.7kbp(pDAB104102)
HB502r/HB504r+DC013(3’)=3.2kbp(pDAB104105),3.2kbp(pDAB104102)
HB502r/HB504r+DC014(3’)=1.2kbp(pDAB104103),1.2kbp(pDAB104104)
である。
DC−S1 5’−CCAACTGGACAATAGTCTCCAC−3’(配列番号:122)
DC−S2 5’−CATCGCCACTATATACATACC-3’(配列番号:123)
およびPATタンパク質コード配列に特異的であるもの:
DC−S3 5’−CGTCTCAATGTAATGGTTAACG−3’(配列番号:124)
DC−S4 5’−GCCCAGCGTAAGCAATACCAG−3’(配列番号:125)
を含むが、これに制限されない。
Zp15遺伝子座を標的とするAAD−1遺伝子カセットを保持するトランスジェニックカルス事象を作出した(事象138)。事象138のT0植物を再生し、雌性植物としてDAS5XH751雄性植物と交配させた。結果として生じたT1種子を植え付け、T1植物を成長させた。
Claims (16)
- 植物細胞のゲノム内に1つ以上の外因性核酸配列を組み込む方法であって、前記植物細胞のゲノムにおけるZp15遺伝子座においてまたは近隣において二本鎖切断を引き起こし、それによって前記Zp15遺伝子座におけるまたは近隣における前記細胞のゲノム内への前記1つ以上の外因性配列を含むポリヌクレオチドの組込みをもたらす工程を含む方法。
- 前記1つ以上の外因性配列の産物を発現させる工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記二本鎖切断が、
(a)前記細胞内で第一の融合タンパク質を発現させる工程であって、前記第一の融合タンパク質は第一のジンクフィンガー結合ドメインおよび第一の切断ハーフドメインを含んでおり、前記第一のジンクフィンガー結合ドメインは前記植物細胞のゲノム内のZp15遺伝子座におけるまたは近隣における第一の標的部位に結合するように遺伝子操作されている工程;ならびに
(b)前記細胞内で第二の融合タンパク質を発現させる工程であって、前記第二の融合タンパク質は第二のジンクフィンガー結合ドメインおよび第二の切断ハーフドメインを含んでおり、前記第二のジンクフィンガー結合ドメインは前記植物細胞のゲノム内のZp15遺伝子座におけるまたは近隣における第二の標的部位に結合し、前記第二の標的部位は前記第一の標的部位とは異なり、かつ前記第一の融合タンパク質の前記第一の標的部位への結合および前記第二の融合タンパク質の前記第二の標的部位への結合により、前記切断ハーフドメインは前記植物細胞のゲノムが前記Zp15遺伝子座においてまたは近隣において切断されるように位置する工程
によって引き起こされる、請求項1または2に記載の方法。 - 前記ジンクフィンガー結合ドメインが表1に示した群から選択される、請求項3に記載の方法。
- 前記切断ハーフドメインが天然に存在しているまたは天然には存在していないものである、請求項3または4に記載の方法。
- 前記二本鎖切断が、天然に存在しているまたは天然には存在していないメガヌクレアーゼ、IIS型制限酵素、あるいは前記メガヌクレアーゼおよび前記IIS型制限酵素を含む融合タンパク質によって引き起こされる、請求項1または2に記載の方法。
- 前記1つ以上の外因性核酸配列が、コード配列、制御配列、またはDNA結合ドメインに対する標的部位を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記コード配列が、:除草剤抵抗性;除草剤耐性;害虫抵抗性;害虫耐性;病害抵抗性;病害耐性;ストレス耐性;ストレス抵抗性;酸化ストレスの変化;油分の収量増大;食物の含有量および構成の変化;見た目の変化;雄性不稔;ドライダウン;耐倒伏性;多産;デンプンの量または質の変化;油分の質の変化;タンパク質の質または量の変化;アミノ酸組成の変化、あるいはその組み合わせを与える産物をコードする、請求項7に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドが前記Zp15遺伝子座内の配列に相同であるヌクレオチド配列をさらに含む、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記相同なヌクレオチド配列が前記外因性配列に隣接する、請求項9に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドがプロモーターをさらに含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- 1つ以上の組み込まれた外因性配列が次世代の後代に伝達される、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記植物細胞が単子葉植物細胞である、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記植物細胞がトウモロコシ細胞である、請求項13に記載の方法。
- 請求項1から14のいずれか一項に記載の方法によってZp15遺伝子座内に組み込まれた1つ以上の外因性配列を含む、植物または植物部位。
- 請求項1から14のいずれか一項に記載の方法によってZp15遺伝子座内に組み込まれた1つ以上の外因性配列を含む、種子。
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