BRPI0922641A2 - integração objetivada no locus de zp15 - Google Patents

Abstract

INTEGRAÇÃO OBJETIVADA NO LOCUS DE Zp15. A invenção refere-se a métodos e composições para integração objetivada de uma sequência oxógena em um locus de ZP de planta, por exemplo, para a expressão de um polipeptídeo de interesse.

Description

f Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "'NTEGRAÇÃO ) OBJETIVADA NO LOCUS DE Zp15".

DECLARAÇÃO DE DIREITOS A INVENÇÕES FEITA SOB PESQUISA

CUSTEADA PELO GOVERNO FEDERAL Não aplicável.

CAMPO TÉCNICO í A presente invenção está no campo de engenharia genômica de planta, particulammente integração objetivada de um transgene em um gene Zp15 de planta.

ANTECEDENTES A biotecnologia tem emergido como uma ferramenta essencial em -: esforços para ir de encontro ao desafio de aumento da demanda global pela Fm produção de alimento. Abordagens convencionais para aprimoramento da pro- a dutividade agrícola, por exemplo, rendimento intensificado ou resistência mani- puladaapestes, contam com melhoramento por mutação ou introdução de no- Vos genes nos genomas de espécies de safra por meio de transformação. Am- bos os processos são inerentemente não específicos e relativamente ineficien- tes. Por exemplo, métodos convencionais de transformação de planta distribu- em DNA exógeno que se integram no genoma em locais aleatórios. Assim, de formaa identificar e isolar linhagens transgênicas com atributos desejáveis, é necessário gerar milhares de eventos de integração aleatória única e subse- quentemente realizar triagem quanto aos indivíduos desejados. Como um resul- tado, a manipulação convencional de traços de uma planta é trabalhosa, con- some tempo e imprevisível. Além disso, a natureza aleatória dessas integra- çõestornadifícil prever se efeitos pleiotrópicos em virtude de ruptura não inten- cional do genoma ocorreu. Como um resultado, a geração, isolamento e carac- terização de linhagens de planta com genes ou traços manipulados têm sido um processo extremamente trabalhoso e de alto custo, com uma baixa probabi- lidade de sucesso. A modificação gênica objetivada supera os desafios logísticos de práticas convencionais em sistemas de planta e, como tal, tem sido um objetivo há muito desejado, mas elusivo em pesquisa de biologia de planta básica e bio-

P tecnologia agrícola. Contudo, foi provado até recentemente que, com exceção U de "objetivação gênica" via seleção de fármaco positiva-negativa em arroz ou o uso de sítios de restrição pré-manipulados, modificação genômica objetivada em todas as espécies de planta, modelo e safra, é muito difícil. Terada et al. (2002) Nat Biotechnol 20(10): 1030; Terada et al. (2007) Plant Physiol 144(2): 846; D'Halluin et a/. (2008) Plant Biotechnology J. 6(1): 93.

í Recentemente, métodos e composições para clivagem objetivada de DNA genômico foram descritos. Tais eventos de clivagem objetivada podem ser usados, por exemplo, para induzir à mutagênese objetivada, induzir a dele- çõesobjetivadasde sequências de DNA celular e facilitar a recombinação obje- tivada em um /ocus cromossômico predeterminado. Vide, por exemplo, Publica- : ções de Patente dos Estados Unidos 20030232410; 20050208489; TA 20050026157; 20050064474; e 20060188987 e Publicação Internacional WO - 2007/014275, as divulgações das quais são incorporadas por referência em suas totalidades para todas as finalidades. A Publicação de Patente U.S. No. 20080182332 descreve o uso de nucleases do dedo de zinco (Zinc Finger Nu- cleases - ZFNs) não canônicas para modificação objetivada de genomas de planta e o Pedido de Patente U.S. No. 12/284.888 descreve a interação objeti- vada ZFN-mediada em um /ocus EPSPS de planta.

Contudo, permanece uma necessidade por composições e métodos para integração objetivada estável em loci adicionais dentro do genoma de uma planta para estabelecimento de modificações genéticas estáveis, hereditárias na planta e sua prole.

SUMÁRIO A presente invenção proporciona métodos e composições para ex- pressão de um ou mais produtos de uma sequência de ácido nucleico exógena (isto é, uma proteína ou uma molécula de RNA) que tenha sido integrada em um gene Zp15 em uma célula de planta. Conforme mostrado aqui, a integração de uma ou mais sequências exógenas em ou próximo do /ocus de Zp15 não pareceprejudicar a capacidade da planta hospedeira de regenerar, florescer ou produzir sementes e, opcionalmente, permite transmissão hereditária da(s) se- quências(s) exógena(s) durante as gerações. As sequências de ácido nucleico

' exógenas podem compreender, por exemplo, um ou mais genes ou moléculas D de cDNA ou qualquer tipo de sequência de codificação ou não codificação, bem como um ou mais elementos de controle (por exemplo, promotores). Por exem- plo, genes de tolerância ao herbicida podem ser integrados nesse locus para produzirplantas de safra com a resistência ao herbicida desejada. Células con- tendo ácidos nucleicos exógenos em ou próximo do /ocus de Zp15 também po- ' dem contribuir para o gametófito (linhagem germinativa) e, portanto, ser trans- mitidas para a prole em gerações subsequentes. Aintegração da sequência de ácido nucleico exógena em um gene Zp15é facilitada por clivagem de fita dupla objetivada do genoma no locus de Zp15. Clivagem é objetivada a um gene Zp15 mediante o uso de proteínas de - fusão compreendendo um domínio de ligação a DNA, tal como um domínio de = ligação a DNA de meganuclease, um domínio de ligação a DNA de zíper de . leucina, uma proteína do dedo de zinco (Zinc Finger Protein - ZFP) ou combi- nações quiméricas dos antes mencionados, o qual é manipulado para se ligar a uma sequência dentro do locus de Zp15 selecionado e um domínio de clivagem ou um meio-domínio de clivagem. Tal clivagem estimula a integração de se- quências de polinucleotídeo exógenas em ou próximo do sítio de clivagem. In- tegração de sequências exógenas pode se processar por meio de mecanismos dependentes de homologia e independentes de homologia.

Em um aspecto, são divulgados aqui domínios de ligação a DNA manipulados (por exemplo, ZFPs, meganucleases ou zíperes de leucina) que se ligam a um sítio-alvo em um gene Zp15. O domínio de ligação a DNA pode compreender, por exemplo, qualquer um dos domínios de ligação a DNA de dedo de zinco manipulados compreendendo as hélices de reconhecimento mostradas na Tabela 1. Qualquer um dos domínios de ligação a DNA descritos aqui pode ainda compreender um domínio funcional, por exemplo, um domínio de clivagem ou meio-domínio de clivagem. Em algumas modalidades, o meio- domínio de clivagem pode ser de uma endonuclease de restrição do tipo IIS, tal — como fFoklouStsl. Em outras modalidades, o domínio de clivagem pode com- preender uma endonuclease "homing", por exemplo, uma endonuclease "ho- ming" com um domínio de ligação a DNA modificado.

IT Em outro aspecto, são divulgadas aqui plantas ou sementes com- ; preendendo uma sequência exógena integrada no /ocus de Zp15. Em determi- nadas modalidades, a sequência exógena é integrada no gametófito da planta. Em outro aspecto, é divulgado aqui um método para expressão do produtodeuma sequência de ácido nucleico exógena em uma célula, o método compreendendo: (a) expressão de uma primeira proteína de fusão na célula, a primeira proteína de fusão compreendendo um primeiro domínio de ligação a DNA (por exemplo, uma ZFP) e um primeiro meio-domínio de clivagem, em que o domínio de ligação a DNA tenha sido manipulado para se ligar a um primeiro sítio-alvo em um gene Zp15 do genoma da célula; (b) expressão de uma se- gunda proteína de fusão na célula, a segunda proteína de fusão compreenden- " do um segundo domínio de ligação a DNA e um segundo meio-domínio de cli- À vagem, em que o segundo domínio de ligação a DNA se liga a um segundo sí- - tio-alvo no gene Zp15 do genoma da célula, em que o segundo sítio-alvo é dife- rente do primeiro sítio-alvo; e (c) contato da célula com um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de ácido nucleico exógena e uma primeira se- quência de nucleotídeo que é homóloga à primeira sequência em um gene Zp15; em que ligação da primeira proteína de fusão ao primeiro sítio-alvo e li- gação da segunda proteína de fusão ao segundo sítio-alvo posiciona os meio- domínios de clivagem de modo que o genoma da célula seja clivado no gene Zp15, desse modo, resultando em integração da sequência exógena no geno- ma da célula no gene Zp15 e expressão do produto da sequência exógena.

A sequência de ácido nucleico exógena pode compreender uma sequência que codifica um ou mais polipeptídeos funcionais (por exemplo, um —cDNA),com ou sem um ou mais promotores e/ou pode produzir uma ou mais sequências de RNA (por exemplo, via um ou mais cassetes de expressão de ShRNA) as quais conferem traços desejáveis à planta. Tais traços incluem, mas não estão limitados a, resistência ou tolerância ao herbicida; resistência ou tole- rância a insetos; resistência ou tolerância a doenças (virais, bacterianas, fúngi- cas,pornematoide); tolerância e/ou resistência a estresse, conforme exemplifi- cado por resistência ou tolerância à estiagem, calor, frio, congelamento, umida- de excessiva, estresse por sal; estresse oxidativo; rendimentos aumentados;

] teor e composição alimentícia; aparência física; esterilidade masculina; veloci- . dade de secagem; sustentabilidade; abundância; quantidade e qualidade de amido; quantidade e qualidade de óleo; qualidade e quantidade de proteína; composição de aminoácido; e semelhantes. Naturalmente, quaisquer dois ou —maisácidosnucleicosexógenos de qualquer descrição, tais como aqueles que Ú conferem resistência ao herbicida, insetos, doenças (virais, bacterianas, fúngi- ' cas, por nematoide) ou estiagem, esterilidade masculina, velocidade de seca- gem, sustentabilidade, abundância, propriedades de amido, quantidade e quali- dade de óleo ou aqueles que aumentam o rendimento ou qualidade nutricional podem ser empregados, conforme desejado. Em determinadas modalidades, a sequência de ácido nucleico compreende uma sequência que codifica uma pro- . teína de resistência a herbicida (por exemplo, o gene AAD-1 (Aryloxy Alkanoate ' Dioxygenase - Dioxigenase de Arilóxi Alcanoato), o gene AAD-12 ou o gene de . acetil transferase de fosfinotricina (Phosphinothricin Acetyl Transferase - PAT) eloufragmentos funcionais dos mesmos. Expressão da sequência integrada pode ser acionada por um promotor operavelmente ligado à sequência integra- da. Alternativamente, a sequência integrada é sem promotor e a transcrição é acionada pelo promotor de Zp15 endógeno.

Em determinadas modalidades, o polinucleotídeo ainda compreen- de uma segunda sequência de nucleotídeo que é homóloga a uma segunda sequência no gene Zp15. A segunda sequência de nucleotídeo pode ser idênti- ca à segunda sequência no gene Zp15. Além disso, em modalidades compre- endendo primeira e segunda sequências de nucleotídeo, a primeira sequência de nucleotídeo pode ser idêntica à primeira sequência no gene Zp15 e a se- — gundasequência de nucleotídeo pode ser homóloga, mas não idêntica, a uma segunda sequência no gene Zp15. Em qualquer um dos métodos descritos a- qui, as primeira e segunda sequências de nucleotídeo fianqueiam a sequência exógena. Em determinadas modalidades, o polinucleotídeo é um plasmídeo.

Em outras modalidades, o polinucleotídeo é uma molécula de DNA linear. Em outro aspecto, é proporcionado aqui um método para integra- ção de uma sequência exógena no gene Zp15 no genoma de uma célula, o mé- todo compreendendo: (a) expressão de uma primeira proteína de fusão na í célula, a primeira proteína de fusão compreendendo um primeiro domínio de ligação a DNA (por exemplo, uma ZFP) e um primeiro meio-domínio de cliva- gem, em que o primeiro domínio de ligação a DNA foi manipulado para se ligar a um primeiro sítio-alvo no locus de Zp15 no genoma da célula; (b) expressão de uma segunda proteína de fusão na célula, a segunda proteína de fusão À compreendendo um segundo domínio de ligação a DNA (por exemplo, uma É ZFP) e um segundo meio-domínio de clivagem, em que o segundo domínio de ligação a DNA se liga a um segundo sítio-alvo no locus de Zp15 no genoma da célula, em que o segundo sítio-alvo é diferente do primeiro sítio-alvo; e (c) con- tatodacélula com um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de ácido nucleico exógena; em que ligação da primeira proteína de fusão ao primeiro B sítio-alvo e ligação da segunda proteína de fusão ao segundo sítio-alvo posicio- | nam os meio-domínios de clivagem de modo que o genoma da célula seja cli- h vado no locus de Zp15, desse modo, resultando em integração dependente de homologia da sequência exógena no genoma da célula dentro do locus de Zp15. Em determinadas modalidades, uma sequência exógena que codifica um polipeptídeo funcional é inserida no gene Zp15.

Em qualquer um dos métodos descritos aqui, os primeiro e segundo meio-domínios de clivagem podem ser de uma endonuclease de restrição do tipollS, por exemplo, Fokl ou Stsl. Além disso, em qualquer um dos métodos descritos aqui, pelo menos uma das proteínas de fusão pode compreender uma alteração na sequência de aminoácido da interface de dimerização do meio- domínio de clivagem, por exemplo, de modo que heterodímeros obrigatórios dos meio-domínios de clivagem sejam formados.

Em qualquer um dos métodos descritos aqui, a célula de planta po- de compreender uma célula de planta monocotiledônea ou dicotiledônea. Em determinadas modalidades, a célula de planta é uma planta de safra, por e- xemplo, milho.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 representa os resultados de análise de sequência e- xemplificativos de produtos da amplificação de Zp15 a partir de gDNA de milho Hill derivado de células submetidas à expressão transitória do par de ZFP %25

7M75 ' (sítios de ligação sublinhados) e revela uma inserção NHEJ de 6 bp (negrito) no : sítio de clivagem esperado.

A Figura 2 representa resultados de análise de sequência exempli- ficativos de produtos da amplificação de Zp15 de gDNA de milho Hill derivado —decélulassubmetidas à expressão transitória do par de ZFP $24 (sítios de liga- À ção sublinhados) e revela uma deleção de 3 bp no sítio de clivagem esperado. ' A Figura 3 é uma representação esquemática do construto desig- nado pDAB7489. A Figura 4 é um esquema representando um cassete de expressão degene de tolerância a herbicida exemplificativo que codifica um gene AAD.

A Figura 5 é um esquema representando o construto designado . PDAB7490. A Figura 6 representa o alinhamento de um evento de integração ” objetivada (Targeted Integration - TI) em que o fragmento doador de Zp15 de milhodotipo silvestre (Wild Type - WD), bem como as regiões de borda 5' e 3' que unem as sequências doadoras integradas, são alinhados.

A Figura 7 é um esquema mostrando o construto designado PDAB104101. A Figura 8 é um esquema representando o cassete de expressão dePAT.

A Figura 9 é um esquema representando o construto designado PDAB104107. A Figura 10 é um esquema representando o construto designado PDAB104104. A Figura 11 é um esquema representando o construto designado PDAB104105. A Figura 12 é um esquema representando o construto designado PDAB104106. A Figura 13 é um esquema representando o construto designado —pDAB104100. A Figura 14 é um esquema representando o construto designado PDAB104103.

' A Figura 15 é um esquema representando o construto designado . PDAB104102.

DESCRIÇÃO DETALHADA A presente invenção refere-se a métodos e composições para inte- gração objetivada (TI) em um gene Zp15 de planta, o qual reside sobre o cro- ' mossomo 6 em milho. Usando proteínas de fusão compreendendo domínios de ] ligação a DNA (por exemplo, ZFPs, meganucleases ou zíperes de leucina) e domínios de nuclease, uma sequência inserida (doadora) pode ser operavel- mente ligada a um promotor exógeno ou pode ser sem promotor. Se sem pro- motor, transcrição do quadro de leitura aberto integrado pode ocorrer a partir do promotor do gene Zp15 endógeno nos tecidos promotor-especificados. Uso de - um doador sem promotor diminui a probabilidade de integração aleatória do doador e/ou ativação supérflua de um gene endógeno pelo promotor trazido " sobre o doador.

Composições úteis para clivagem e recombinação objetivada em um gene Zp15 incluem proteínas de fusão compreendendo um domínio de cli- vagem (ou um meio-domínio de clivagem) e um domínio de ligação a DNA (por exemplo, uma ZFP), polinucleotídeos que codificam essas proteínas e combi- nações de polipeptídeos e polinucleotídeos que codificam polipeptídeos. Um domínio de ligação de dedo de zinco pode compreender um ou mais dedos de zinco (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais dedos de zinco) e pode ser manipulado para se ligar a qualquer sequência dentro de um gene Zp15. A pre- sença de tal proteína (ou proteínas) de fusão em uma célula resultará em liga- ção da(s) proteína(s) de fusão a seu(s) sítio(s) de ligação e clivagem dentro do geneZp15endógeno.

Geral A prática dos métodos, bem como preparo e uso das composições divulgadas aqui empregam, a menos que de outro modo indicado, técnicas convencionais em biologia molecular, bioquímica, estrutura e análise de croma- tina, química computacional, cultura de célula, DNA recombinante e campos relacionados, conforme dentro da capacidade no campo. Essas técnicas são totalmente explicadas na literatura. Vide, por exemplo, Sambrook et al.

í MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Segunda edição, Cold ' Spring Harbor Laboratory Press, 1989 e Terceira edição, 2001; Ausubel et al, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987 e atualizações periódicas; a série METHODS IN ENZ YMOLOGY, Academic Press, San Diego; Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND i FUNCTION, Terceira edição, Academic Press, San Diego, 1998; METHODS IN í ENZYMOLOGY, Vol. 304, "Chromatin" (P.M. Wassarman e A. P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999; e METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, "Chromatin Protocols" (P.B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa,

1999. Definições . Os termos "ácido nucleico", "polinucleotídeo" e "oligonucleotídeo" são usados permutavelmente e referem-se a um polímero de deoxirribonucleo- F tídeo ou ribonucleotídeo, em conformação linear ou circular e na forma fita sim- plesou dupla. Para fins da presente invenção, esses termos não devem ser construídos como limitativos com relação ao comprimento de um polímero. Os termos podem abranger análogos conhecidos de nucleotídeos naturais, bem como nucleotídeos que são modificados nas porções de base, açúcar e/ou fos- fato (por exemplo, partes principais de fosforoticato). Em geral, um análogo de um nucleotídeo em particular tem a mesma especificidade de pareamento de base; isto é, um análogo de A realizará pareamento de base com T.

Os termos "polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína" são usados per- mutavelmente para referir-se a um polímero de resíduos de aminoácido. O ter- mo também se aplica a polímeros de aminoácido nos quais um ou mais amino- ácidossão análogos químicos ou derivados modificados de um aminoácido que ocorre naturalmente correspondente.

"Ligação" refere-se a uma interação não covalente, sequência- específica entre macromoléculas (por exemplo, entre uma proteína e um ácido nucleico). Nem todos os componentes de uma interação de ligação precisam sersequência-específicos (por exemplo, contatos com resíduos de fosfato em uma parte principal de DNA), contanto que a interação como um todo seja se- quência-específica. Tais interações são, em geral, caracterizadas por uma

' constante de dissociação (K1) de 10º M ou menor. "Afinidade" refere-se à in- NR tensidade de ligação: a afinidade de ligação aumentada estando correlacionada a uma menor Kg. Uma "proteína de ligação" é uma proteína que é capaz de ligação não covalentemente à outra molécula. Uma proteína de ligação pode se ligar, Í por exemplo, a uma molécula de DNA (uma proteína de ligação a DNA), uma Á molécula de RNA (uma proteína de ligação a RNA) e/ou uma molécula de pro- teína (uma proteína de ligação à proteína). No caso de uma proteína de ligação à proteína, ela pode se ligar a si mesma (para formar homodímeros, homotri- meros, etc.) e/ou ela pode se ligar a uma ou mais moléculas de uma proteína ou proteínas diferentes. Uma proteína de ligação pode ter mais de um tipo de : atividade de ligação. Por exemplo, proteínas do dedo de zinco têm atividade de ligação a DNA, ligação a RNA e ligação à proteína. . Uma "proteína de ligação a DNA de dedo de zinco" (ou domínio de ligação) é uma proteína ou um domínio dentro de uma proteína maior que se liga ao DNA de uma maneira sequência-específica através de um ou mais de- dos de zinco, os quais são regiões de sequência de aminoácido dentro do do- mínio de ligação cuja estrutura é estabilizada mediante coordenação de um íon de zinco. O termo proteína de ligação a DNA de dedo de zinco é, frequente- mente, abreviado como proteína de dedo de zinco ou ZFP.

Domínios de ligação de dedo de zinco podem ser "manipulados" para se ligar a uma sequência de nucleotídeo predeterminada. Exemplos não limitativos de métodos para manipulação de proteínas de dedo de zinco são design e seleção. Uma proteína de dedo de zinco projetada é uma proteína que —nãoocorrena natureza cujo design/composição resulta principalmente de crité- rios racionais. Critérios racionais para design incluem aplicação de regras de substituição e algoritmos computadorizados para processamento de informação em um banco de dados que armazena informação de designs de ZFP e dados de ligação existentes. Vide, por exemplo, Patentes US 6.140.081; 6.453.242; e

6.534.261; vide também documentos WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 e WO 03/016496.

Uma proteína de dedo de zinco "selecionada" é uma proteína não

' encontrada na natureza cuja produção resulta primariamente de um processo : empírico, tal como exibição de fago (“phage display”), contenção para interação ou seleção de híbrido. Vide, por exemplo, documentos US 5.789.538; US

5.925.523; US 6.007.988; US 6.013.453; US 6.200.759; WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970 WO | 01/88197 e WO 02/099084.

' O termo "sequência" refere-se a uma sequência de nucleotídeo de qualquer comprimento, a qual pode ser DNA ou RNA; pode ser linear, circular ou ramíficada e pode ser fita simples ou fita dupla. O termo "sequência doado- ra"refere-se a uma sequência de nucleotídeo que é inserida em um genoma. Uma sequência doadora pode ser de qualquer comprimento, por exemplo, entre . 2 e 10.000 nucleotídeos de comprimento (ou qualquer valor inteiro entre os mesmos ou acima dos mesmos), de preferência entre cerca de 100 e 1.000 . nucleotídeos de comprimento (ou qualquer inteiro entre os mesmos), mais pre- ferivelmente entre cerca de 200 e 500 nucleotídeos de comprimento.

Uma "sequência homóloga, não idêntica" refere-se a uma primeira sequência a qual compartilha um grau de identidade de sequência com uma segunda sequência, mas cuja sequência não é idêntica àquela da segunda se- quência. Por exemplo, um polinucleotídeo compreendendo a sequência do tipo silvestre de um gene mutante é homólogo e não idêntico à sequência do gene mutante. Em determinadas modalidades, o grau de homologia entre as duas sequências é suficiente para permitir recombinação homóloga entre as mesmas, utilizando mecanismos celulares normais. Duas sequências homólogas não idênticas podem ser de qualquer comprimento e seu grau de não homologia pode ser tão pequeno quanto um único nucleotídeo (por exemplo, para correção de uma mutação de ponto genética por meio de recombinação homóloga objetivada) ou tão grande quanto 10 ou mais quilobases (por exemplo, para inserção de um gene em um sítio ectópico predeterminado em um cromossomo). Dois polinucleotídeos compreendendo as sequências homólogas não idênticas não precisam ser do mesmo comprimento. Por exemplo, um polinucleotídeo exógeno (isto é, polinucleotídeo doador) de entre 20 e 10.000 nucleotídeos ou pares de nucleotídeo pode ser

' usado.

: Técnicas para determinação de identidade de sequência de ácido nucleico e aminoácido são conhecidas no campo. Tipicamente, tais técnicas incluem determinação da sequência de nucleotídeo do mRNA para um gene e/oudeterminação da sequência de aminoácido codificada pelo menos e com- é paração dessas sequências com uma segunda sequência de nucleotídeo ou ' aminoácido. Sequências genômicas podem também ser determinadas e com- paradas desse modo. Em geral, identidade refere-se a uma correspondência nucleotídeo-a-nucleotídeo ou aminoácido-a-aminoácido exata de duas sequên- ciasde polinucleotídeo ou polipeptídeo, respectivamente. Duas ou mais se- quências (polinucleotídeo ou aminoácido) podem ser comparadas determinan- do-se sua identidade percentual. A identidade percentual de duas sequências, quer sequências de ácido nucleico ou aminoácido, é o número de combinações - exatas entre duas sequências alinhadas dividido pelo comprimento das se- — quênciasmais curtas e multiplicado por 100. Um alinhamento aproximado para sequências de ácido nucleico é proporcionado pelo algoritmo de homologia lo- cal de Smith e Waterman, Advances in Applied Mathematics 2: 482489 (1981).

Esse algoritmo pode ser aplicado a sequências de aminoácido usando a matriz de escore desenvolvida por Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, MO. Dayhoffed, supl. 3: 353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., EUA e normalizada por Gribskov, Nucl. Acids Res. 14(6): 6745-6763 (1986). Uma implementação exemplificativa desse algoritmo para determinar a identidade percentual de uma sequência é fornecida pelo Genetics Computer Group (Madison, WI) no aplicativo "BestFit". Programas adequados —paracálculoda identidade ou similaridade percentual entre sequências são, em geral, conhecidos na técnica, por exemplo. Outro programa de alinhamento é o BLAST, usado com os parâmetros de default. Por exemplo, o BLASTN e BLASTP podem ser usados utilizando os seguintes parâmetros de default: có- digo genético = padrão; filtro = nenhum; fita = ambas; corte = 60; esperado = 10; Matriz = BLOSUM62; Descrições = 50 sequência; escolhido por = HIGH SCORE; Bancos de Dados = não redundante, traduções no GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS + Swiss Protein + Spupdate + PIR. Detalhes

1 desses programas podem ser encontrados na internet. Com relação às se- . quências descritas aqui, a faixa de graus desejados de identidade de sequência é aproximadamente 80% a 100% e qualquer valor inteiro entre os mesmos. Ti- picamente, as identidades percentuais entre as sequências são pelo menos 70- 75%, de preferência 80-82%, mais preferivelmente 85-90%, ainda mais preferi- À velmente 92%, mais preferivelmente 95% e, ainda mais preferivelmente, 98% Í de identidade de sequência.

Alternativamente, o grau de similaridade de sequência entre polinu- cleotídeos pode ser determinado por meio de hibridização de polinucleotídeos sob condições que permitam a formação de duplas estáveis entre regiões ho- mólogas, seguido por digestão com nuclease(s) específica(s) para fita simples e " determinação de tamanho dos fragmentos digeridos. Duas sequências de ácido nucleico ou duas de polipeptídeo são substancialmente homólogas uma à outra - quando as sequências exibem pelo menos cerca de 70%-75%, de preferência 80%-82%, mais preferivelmente 85%-90%, ainda mais preferivelmente 92%, mais preferivelmente 95% e, ainda mais preferivelmente, 98% de identidade de sequência sobre um comprimento definido das moléculas, conforme determina- do usando os métodos acima. Conforme usado aqui, substancialmente homó- logo refere-se também à sequências mostrando identidade completa a uma se- —quênciade DNA ou polipeptídeo especificada. Sequências de DNA que são substancialmente homólogas podem ser identificadas em um experimento de hibridização de Southern, por exemplo, sob condições estringentes, conforme definido para esse sistema em particular. Definição de condições de hibridiza- ção apropriadas está dentro da capacidade no campo. Vide, por exemplo, Sambrook et al, supra; Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, edito- res B.D. Hames e S.J. Higgins, (1985) Oxford; Washington, DC; IRL Press). Hibridização seletiva de dois fragmentos de ácido nucleico pode ser determinada como segue. O grau de identidade de sequência entre duas molé- culas de ácido nucleico afeta a eficiência e resistência de eventos de hibridiza- çãoentretais moléculas. Uma sequência de ácido nucleico parcialmente idênti- ca inibirá, pelo menos parcialmente, a hibridização de uma sequência comple- tamente idêntica a uma molécula-alvo. Inibição de hibridização da sequência

' completamente idêntica pode ser avaliada usando ensaios de hibridização que . são bem-conhecidos no campo (por exemplo, Southern (DNA) blot, Northern (RNA) blot, hibridização em solução ou semelhante; vide Sambrook, et al, Mo- lecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.). Tais ensaios podem ser conduzidos usando graus variados de i seletividade, por exemplo, usando condições variáveis de baixa à alta estrin- : gência.

Se condições de baixa estringência são empregadas, a ausência de ligação não específica pode ser avaliada usando uma sonda secundária que carece mesmo de um grau parcial de identidade de sequência (por exemplo, uma sonda tendo menos de cerca de 30% de identidade de sequência com a molécula-alvo) de modo que, na ausência de eventos de ligação não específica,

- a sonda secundária não se hibridize ao alvo.

Quando de utilização de um sistema de detecção baseado em hi- 7 bridização, uma sonda de ácido nucleico é escolhida que é complementar a umasequência de ácido nucleico de referência e, então, através de seleção de condições apropriadas, a sonda e a sequência de referência hibridizam seleti- vamente ou se ligam uma à outra para formar uma molécula dupla.

Uma molé- cula de ácido nucleico que é capaz de hibridização seletiva a uma sequência de referência sob condições de hibridização moderadamente estringentes se hibri- diza,tipicamente, sob condições que permitem a detecção de uma sequência de ácido nucleico-alvo de pelo menos cerca de 10-14 nucleotídeos de compri- mento tendo pelo menos aproximadamente 70% de identidade de sequência com a sequência da sonda de ácido nucleico selecionada.

Condições de hibri- dização estringentes permitem, tipicamente, a detecção de sequências de ácido —nucleico-alvode pelomenos cerca de 10-14 nucleotídeos de comprimento ten- do uma identidade de sequência de mais de cerca de 90-95% com a sequência da sonda de ácido nucleico selecionada.

Condições de hibridização úteis para hibridização de sonda/sequência de referência, onde a sonda e a sequência de referência têm um grau específico de identidade de sequência, podem ser de- terminadas conforme é conhecido no campo (vide, por exemplo, Nucleic Acid Hvbridization: A Practical Approach, editores B.D.

Hames e S.J.

Higgins, (1985)

Oxford; Washington, DC; IRL Press).

" Condições para hibridização são bem-conhecidas por aqueles ver- . sados no campo. Estringência de hibridização refere-se ao grau até o qual as condições de hibridização desfavorecem a formação de híbridos contendo nu- cleotídeos erroneamente correspondentes, com maior estringência correlacio- nadaauma menor tolerância para híbridos erroneamente correspondentes. É Fatores que afetam a estringência de hibridização são bem-conhecidos por a- " queles versados no campo e incluem, mas não estão limitados a, temperatura, pH, resistência iônica e concentração de solventes orgânicos tais como, por exemplo, formamida e sulfóxido de dimetila. Conforme é conhecido por aqueles versados no campo, a estringência de hibridização pode ser aumentada por maiores temperaturas, menor resistência iônica e menores concentrações de : solvente. Com relação às condições de estringência para hibridização, é - bem-conhecido no campo que numerosas condições equivalentes podem ser empregadas para estabelecer uma estringência particular variando, por exem- plo, os seguintes fatores: o comprimento e natureza das sequências, composi- ção de base das várias sequências, concentrações de sais e outros componen- tes de hibridização, a presença ou ausência de agentes de bloqueio nas solu- ções de hibridização (por exemplo, sulfato de dextrana e polietileno glicol), tem- peraturada reação de hibridização e parâmetros de tempo, bem como variando as condições de lavagem. A seleção de um conjunto particular de condições de hibridização é selecionada seguindo métodos padrões no campo (vide, por e- xemplo, Sambrook, et a/., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Segunda Edição, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.).

"Recombinação" refere-se a um processo de troca de informação genética entre dois polinucleotídeos. Para fins da presente invenção, "recombi- nação homóloga (Homologous Recombination - HR)" refere-se à forma especia- lizada de tal troca que ocorre, por exemplo, durante reparo de rupturas de fita dupla em células. Esse processo requer homologia de sequência de nucleotí- deo,usauma molécula "doadora" como molde para reparo de uma molécula- "alvo" (isto é, uma que experimentou a ruptura de fita dupla) e é variadamente conhecido como "conversão gênica sem cruzamento" ou "conversão gênica de f trato curto" porque ele leva à transferência de informação genética do doador " para o alvo.

Sem desejar estar preso por qualquer teoria em particular, tal trans- ferência pode envolver correção de correspondência errônea de DNA hetero- duplex que se forma entre o alvo rompido e o doador e/ou "anelamento de fita sintese-dependente", no qual o doador é usado para ressintetizar informação i genética que se tornará parte do alvo e/ou processos relacionados.

Tal HR es- É pecializada frequentemente resulta em uma alteração da sequência da molécu- la-alvo, de modo que parte ou toda a sequência do polinucleotídeo doador é incorporada no polinucleotídeo-alvo. "Clivagem" refere-se à ruptura da parte principal covalente de uma molécula de DNA.

Clivagem pode ser iniciada através de uma variedade de P métodos incluindo, mas não limitado a, hidrólise enzimática ou química de uma ligação de fosfodiéster.

Clivagem de fita simples e clivagem de fita dupla são õ possíveis e clivagem de fita dupla pode ocorrer como um resultado de dois e- ventosde clivagem de fita simples distintos.

Clivagem de DNA pode resultar na produção de extremidades cegas ou extremidades alternadas.

Em determina- das modalidades, polipeptídeos de fusão são usados para clivagem de DNA fita dupla-alvo.

Um "domínio de clivagem" compreende uma ou mais sequências polipeptídicasas quais possuem atividade catalitica para clivagem de DNA.

Um domínio de clivagem pode estar contido em uma única cadeia polipeptídica ou atividade de clivagem pode resultar da associação de dois (ou mais) polipeptídeos.

Um "meio-domínio de clivagem" é uma sequência polipeptídica a qual, em conjunto com um segundo polipeptídeo (quer idêntico ou diferente) forma um complexo tendo atividade de clivagem (de preferência atividade de clivagem de fita dupla). "Cromatina" é a estrutura de nucleoproteína compreendendo o genoma celular.

Cromatina celular compreende ácido nucleico, primariamente DNAeproteína, incluindo proteinas cromossômicas de histona e não-histona.

À maioria da cromatina celular eucariota existe na forma de nucleossomas, em que um núcleo de nucleossoma compreende aproximadamente 150 pares de í base de DNA associado a um octâmero compreendendo duas de cada uma das p histonas H2A, H2B, H3 e H4; e DNA ligante (de comprimento variável, depen- dendo do organismo) se estende entre os núcleos de nucleossoma. Uma molé- cula de histona H1 está, em geral, associada ao DNA ligante. Para fins da pre- sente invenção, o termo "cromatina" se destina a abranger todos os tipos de À nucleoproteína celular, procariota e eucariota. A cromatina celular inclui croma- Â tina cromossômica e epissomal.

Um "cromossomo" é um complexo de cromatina compreendendo todo ou uma parte do genoma de uma célula. O genoma de uma célula é, fre- quentemente, caracterizado por seu cariótipo, o qual é a coleção de todos os cromossomos que compreendem o genoma da célula. O genoma de uma célula > pode compreender um ou mais cromossomos.

Um "epissoma" é um ácido nucleico de replicação, complexo de f nucleoproteína ou outra estrutura compreendendo um ácido nucleico que não é partedo cariótipo cromossômico de uma célula. Exemplos de epissomas inclu- em plasmídeos e determinados genomas virais.

Uma "região acessível" é um local na cromatina celular no qual um sítio-alvo presente no ácido nucleico pode ser ligado por uma molécula exóge- na a qual reconhece o sítio-alvo. Sem desejar estar preso por qualquer teoria emparticular, acredita-se que uma região acessível é uma que não está engol- fada em uma estrutura nucleossômica. A estrutura distinta de uma região aces- sível pode, frequentemente, ser detectada por sua sensibilidade a sondas quí- micas e enzimáticas, por exemplo, nucleases.

Um "sítio-alvo" ou "sequência-alvo" é uma sequência de ácido nu- cleicoque define uma porção de um ácido nucleico à qual uma molécula de ligação se ligará, contanto que existam condições suficientes para ligação. Por exemplo, a sequência 5-GAATTC-3' é o sítio-alvo para a endonuclease de res- trição EcoRI|.

Uma molécula "exógena" é uma molécula que normalmente não es- tápresente em uma célula, mas pode ser introduzida em uma célula através de um ou mais métodos genéticos, bioquímicos ou outros. A "presença normal na célula" é determinada com relação ao estágio de desenvolvimento e condições í ambientais particulares da célula. Assim, por exemplo, uma molécula que está R presente apenas durante desenvolvimento embriônico do músculo é uma molé- cula exógena com relação a uma célula muscular em adultos. Similarmente, uma molécula induzida por choque térmico é uma molécula exógena com rela- çãoaumacélulanão induzida por choque térmico. Uma molécula exógena po- i de compreender, por exemplo, uma sequência de codificação para qualquer à polipeptídeo ou fragmento do mesmo, uma versão funcional de uma molécula endógena não funcional ou uma versão não funcional de uma molécula endó- gena normalmente funcional. Adicionalmente, uma molécula exógena pode compreender uma sequência de codificação de outra espécie que é um ortólo- go de um gene endógeno na célula hospedeira.

N' Uma molécula exógena pode ser, dentre outras coisas, uma pe- quena molécula, tal como gerada em um processo químico combinatorial ou - uma macromolécula, tal como uma proteína, ácido nucleico, carboidrato, lipídio, glicoproteína, lipoproteína, polissacarídeo, qualquer derivado modificado das moléculas acima ou qualquer complexo compreendendo uma ou mais das mo- léculas acima. Ácidos nucleicos incluem DNA e RNA, podem ser fita simples ou dupla; podem ser lineares, ramificados ou circulares; e podem ser de qualquer comprimento. Ácidos nucleicos incluem aqueles capazes de formação de du- plas, bem como ácidos nucleicos que formam tripletos. Vide, por exemplo, Pa- tentes U.S. Nos. 5.176.996 e 5.422.251. Proteínas incluem, mas não estão limi- tadas a, proteínas de ligação a DNA, fatores de transcrição, fatores de remode- lamento de cromatina, proteínas de ligação a DNA metilado, polimerases, meti- lases, demetilases, acetilases, deacetilases, quinases, fosfatases, integrases, recombinases, ligases, topoisomerases, girases e helicases.

Uma molécula exógena pode ser do mesmo tipo de molécula que uma molécula endógena, por exemplo, uma proteína ou ácido nucleico exóge- no. Por exemplo, um ácido nucleico exógeno pode compreender um genoma viral infeccioso, um plasmídeo ou epissoma introduzido em uma célula ou um cromossomo que normalmente não está presente na célula. Métodos para a introdução de moléculas exógenas em células são conhecidos por aqueles ver- sados no campo e incluem, mas não estão limitados a, transferência lipídio-

: mediada (isto é, lipossomas, incluindo lipídios neutros e catiônicos), eletropora- R ção, injeção direta, fusão celular, bombardeamento de partícula, coprecipitação com fosfato de cálcio, transformação de nanopartícula, transferência mediada por DEAE-dextrana e transferência mediada por vetor viral. Ao contrário, uma molécula "endógena" é uma que normalmente ' está presente em uma célula em particular em um estágio de desenvolvimento ' em particular sob condições ambientais particulares. Por exemplo, um ácido nucleico endógeno pode compreender um cromossomo, o genoma de uma mi- tocôndria, cloroplasto ou outra organela ou um ácido nucleico epissomal que ocorrenaturalmente. Moléculas endógenas adicionais podem incluir proteínas, por exemplo, fatores de transcrição e enzimas. : Conforme usado aqui, o termo "produto de um ácido nucleico exó- geno" inclui produtos de polinucleotídeo e polipeptídeo, por exemplo, produtos - de transcrição (polinucleotídeos, tal como RNA) e produtos de tradução (polipeptídeos).

Uma molécula de "fusão" é uma molécula na qual duas ou mais moléculas subunitárias são ligadas, por exemplo, covalentemente. As molécu- las subunitárias podem ser o mesmo tipo de molécula ou podem ser tipos qui- micos diferentes de moléculas. Exemplos do primeiro tipo de molécula de fusão incluem, mas não estão limitados a, proteínas de fusão (por exemplo, uma fu- são entre um domínio de ligação a DNA de ZFP e um domínio de clivagem) e ácidos nucleicos de fusão (por exemplo, um ácido nucleico que codifica a prote- ina de fusão descrita supra). Exemplos do segundo tipo de molécula de fusão incluem, mas não estão limitados a, uma fusão entre um ácido nucleico de for- mação detripleto eum polipeptídeo e uma fusão entre um ligante da ranhura menor e um ácido nucleico.

Expressão de uma proteína de fusão em uma célula pode resultar de distribuição da proteína de fusão à célula ou distribuição de um polinucleoti- deo que codifica a proteína de fusão a uma célula, em que o polinucleotídeo é transcrito e o transcrito é traduzido, para gerar a proteína de fusão. Trans- junção, clivagem de polipeptídeo e ligação de polipeptídeo também podem estar envolvidos em expressão de uma proteína em uma célula. Métodos para

' distribuição de polinucleotídeo e polipeptídeo a células são apresentados em . alguma parte na presente invenção.

Um "gene", para fins da presente invenção, inclui uma região de DNA que codifica um produto gênico (vide infra), bem como todas as regiões de DNAasquaisregulam a produção do produto gênico, quer tais sequências re- i gulatórias estejam ou não adjacentes a sequências de codificação e/ou transcri- ' tas. Consequentemente, um gene inclui, mas não está necessariamente limita- do a, sequências promotoras, terminadores, sequências regulatórias de tradu- ção, tais como sítios de ligação ribossômica e sítios de entrada ribossômica internos, intensificadores, silenciadores, isoladores, elementos limítrofes, ori- gens de replicação, sítios de fixação de matriz e regiões de controle de locus. BR "Expressão gênica" refere-se à conversão da informação, contida em um gene, em um produto gênico. Um produto gênico pode ser o produto 7 direto de um gene (por exemplo, mRNA, tRNA, rRNA, RNA antissenso, RNA de interferência, ribozima, RNA estrutura! ou qualquer outro tipo de RNA) ou uma proteína produzida através de tradução de um mRNA. Produtos gênicos tam- bém incluem RNAs os quais são modificados através de processos tais como "capeamento", poliadenilação, metilação e edição e proteínas modificadas, por exemplo, através de metilação, acetilação, fosforilação, ubiquitinação, ADP- ribosilação, miristilação e glicosilação.

"Modulação" de expressão gênica refere-se a uma alteração na ati- vidade de um gene. Modulação de expressão pode incluir, mas não está limita- da a, ativação gênica e repressão gênica.

Células de "planta" incluem, mas não estão limitadas a, células de — plantas monocotiledôneas (monocots) ou dicotiledôneas (dicots). Exemplos não limitativos de monocots incluem plantas de cereal, tais como milho, arroz, ceva- da, aveia, trigo, sorgo, centeio, cana-de-açúcar, abacaxi, cebola, banana e co- co. Exemplos não limitativo de dicots incluem tabaco, tomate, girassol, algodão, beterraba sacarínica, batata, alface, melão, soja, canola (colza) e alfafa. Células de plantapodem ser de qualquer parte da planta e/ou de qualquer estágio de desenvolvimento de uma planta.

Uma "região de interesse" é qualquer região de cromatina celular f tal como, por exemplo, um gene ou uma sequência de não codificação dentro F ou adjacente a um gene, na qual é desejável ligar uma molécula exógena. Li- gação pode ser para fins de clivagem de DNA objetivada e/ou recombinação objetivada. Uma região de interesse pode estar presente em um cromossomo, umepissoma, um genoma organelar (por exemplo, mitocondrial, cloroplasto) ou É um genoma viral infeccioso, por exemplo. Uma região de interesse pode estar , dentro da região de codificação de um gene, dentro de regiões de não codifica- ção transcritas tais como, por exemplo, sequências líderes, sequências "trailer" ou íntrons ou dentro de regiões não transcritas, quer a montante ou a jusante daregiãode codificação. Uma região de interesse pode ser tão pequena quan- to um único par de nucleotídeo ou até 2.000 pares de nucleotídeo de compri- mento ou qualquer valor integral de pares de nucleotídeo. Os termos "ligação operativa" e "operativamente ligado" (ou "opera- - velmente ligado" são usados permutavelmente com referência a uma justaposi- çãodedoisoumais componentes (tais como elementos de sequência) na qual os componentes estão dispostos de modo que ambos os componentes funcio- nam normalmente e permitem a possibilidade de que pelo menos um dos com- ponentes possa mediar uma função que é exercida sobre pelo menos um dos outros componentes. À guisa de ilustração, uma sequência regulatória de transcrição, tal como um promotor, é operativamente ligada a uma sequência de codificação se a sequência regulatória de transcrição controla o nível de transcrição da sequência de codificação em resposta à presença ou ausência de um ou mais fatores regulatórios de transcrição. Uma sequência regulatória de transcrição é, em geral, operativamente ligada em cis com uma sequência de codificação, mas não precisa ser diretamente adjacente à mesma. Por e- xemplo, um intensificador é uma sequência regulatória de transcrição que é operativamente ligada a uma sequência de codificação, mesmo embora eles não sejam contíguos.

Com relação a polipeptídeos de fusão, o termo "operativamente li- gado"pode referir-se ao fato de que cada um dos componentes desempenha a mesma função em ligação ao outro componente conforme seria se não estives- sem ligados. Por exemplo, com relação a um polipeptídeo de fusão no qual um i domínio de ligação a DNA de ZFP é fundido a um domínio de clivagem, o do- : mínio de ligação a DNA de ZFP e o domínio de clivagem estão em ligação ope- rativa se, no polipeptídeo de fusão, a porção de domínio de ligação a DNA de ZFP é capaz de se ligar a seu sítio-alvo e/ou seu sítio de ligação, enquanto que odomínio de clivagem é capaz de clivar o DNA na proximidade do sítio-alvo.

Á Um "fragmento funcional" de uma proteína, polipeptídeo ou ácido À nucleico é uma proteína, polipeptídeo ou ácido nucleico cuja sequência não é idêntica à proteína, polipeptídeo ou ácido nucleico de comprimento total, ainda que retenha a mesma função que a proteína, polipeptídeo ou ácido nucleico de comprimento total.

Um fragmento funcional pode possuir mais, menos ou o mesmo número de resíduos que a molécula nativa correspondente e/ou pode V conter uma ou mais substituições de aminoácido ou nucieotídeo.

Métodos para determinação da função de um ácido nucleico (por exemplo, função de codifi- í cação, capacidade de hibridização a outro ácido nucleico) são bem-conhecidos nocampo.

Similarmente, métodos para determinação de função de proteína são bem-conhecidos.

Por exemplo, a função de ligação a DNA de um polipeptídeo pode ser determinada, por exemplo, através de ensaios de ligação a filtro, desvio de mobilidade eletroforética ou imunoprecipitação.

Clivagem de DNA pode ser avaliada por meio de eletroforese em gel.

Vide Ausubel et al/., supra.

A capacidade de uma proteína de interagir com outra proteína pode ser determinada, por exemplo, através de coimunoprecipitação, ensaios com dois híbridos ou complementação, genética e bioquímica.

Vide, por exemplo, Fields et al. (1989) Nature 340: 245-246; Patente U.S.

No. 5.585.245 e documento PCT WO 98/44350. Sítios-Alvo Os métodos e composições divulgados incluem proteínas de fusão compreendendo um domínio de clivagem (ou um meio-domínio de clivagem) e um domínio de ligação a DNA (por exemplo, ZFP, meganuclease ou zíper de leucina), nas quais o domínio de ligação a DNA (por exemplo, domínio de dedo de zinco, meganuclease ou zíper de leucina), através de ligação a uma se- quência em um /ocus de Zp15 em uma planta, direciona a atividade do domínio de clivagem (ou meio-domínio de clivagem) para a proximidade da sequência e,

: consequentemente, induz à clivagem (por exemplo, uma ruptura em fita dupla) em Zp15. Conforme apresentado em alguma parte na presente invenção, um domínio de dedo de zinco pode ser manipulado para se ligar a virtualmente qualquer sequência desejada. Consequentemente, um ou mais domínios de ligaçãoaDNA (por exemplo, ZFPs) podem ser manipulados para se ligar a uma À ou mais sequências em um gene Zp15 de planta. Expressão de uma proteína É de fusão compreendendo um domínio de ligação a DNA (por exemplo, ZFP) e um domínio de clivagem (ou de duas proteínas de fusão, cada uma compreen- dendo um domínio de ligação a DNA e um meio-domínio de clivagem), em uma célula, realiza clivagem no gene Zp15.

Seleção de uma sequência em um Zp15 para ligação através de : um domínio de dedo de zinco (por exemplo, um sítio-alvo) pode ser realizada, por exemplo, de acordo com os métodos divulgados na Patente US cocedida - No. 6.453.242 (17 de setembro de 2002), a qual também divulga métodos para designdeZFPs que se ligam a uma sequência selecionada. Será evidente para aqueles versados no campo que simples inspeção visual de uma sequência de nucleotídeo também pode ser usada para seleção de um sítio-alvo. Consequen- temente, qualquer meio para seleção de sítio-alvo pode ser usado nos métodos descritos aqui.

Para domínios de ligação a DNA de ZFP, sítios-alvo são, em geral, compostos de uma pluralidade de subsítios-alvo adjacentes. Um subsítio-alvo refere-se à sequência (usualmente um tripleto de nucleotídeo ou uma quadru- pleto de nucleotídeo que pode se sobrepor por um nucleotídeo com uma qua- drupleto adjacente) ligada por um dedo de zinco individual. Vide, por exemplo, —documentoWWO02/077227.$Se afita com a qual uma proteína de dedo de zinco faz a maioria dos contatos é designada como a "fita de reconhecimento primá- rio" de fita-alvo ou "fita de contato primário", algumas proteínas do dedo de zin- co se ligam a um tripleto de três bases na fita-alvo e uma quarta base sobre a fita não-alvo. Um sítio-alvo geralmente tem um comprimento de pelo menos 9 — nucleotídeos e, consequentemente, é ligado através de um domínio de ligação de dedo de zinco compreendendo pelo menos três dedos de zinco. Contudo, ligação, por exemplo, de um domínio de ligação com 4 dedos a um sítio-alvo de

Á 12 nucleotídeos, um domínio de ligação de 5 dedos a um sítio-alvo de 15 nu- cleotídeos ou um domínio de ligação de 6 dedos a um sítio-alvo de 18 nucleotí- deos também é possível. Conforme será evidente, a ligação de domínios de ligação maiores (por exemplo, 7, 8, 9 ou mais dedos) a sítios-alvo maiores tam- 5 bémé possível.

Í Não é necessário que um sítio-alvo seja um múltiplo de três nucleo- á tídeos. Por exemplo, em casos nos quais interações fita-cruzada ocorrem (vide, por exemplo, Patente U.S. No. 6.453.242 e documento WO 02/077227), um ou mais dos dedos de zinco individuais de um domínio de ligação a múltiplos de- dospodem;se ligar a subsítios de um quadrupleto em sobreposição. Como um resultado, uma proteína com três dedos pode se ligar a uma sequência de 10 B nucleotídeos, em que o décimo nucleotídeo é parte de um quadrupleto ligado por um dedo terminal, uma proteína com quatro dedos pode se ligar a uma se- f quência de 13 nucleotídeos, em que o décimo terceiro nucleotídeo é parte de um quadrupleto ligado por um dedo terminal, etc.

O comprimento e natureza de sequências ligantes de aminoácido entre dedos de zinco individuais em um domínio de ligação a múltiplos dedos também afetam a ligação a uma sequência-alvo. Por exemplo, a presença de um assim denominado "ligante não canônico", "ligante longo" ou "ligante estru- turado" entre dedos de zinco adjacentes em um domínio de ligação a múltiplos dedos pode permitir que esses dedos se liguem a subsítios os quais não são imediatamente adjacentes. Exemplos não limitativos de tais ligantes são descri- tos, por exemplo, na Patente U.S. No. 6.479.626 e documento WO 01/53480. Consequentemente, um ou mais subsítios, em um sítio-alvo para um domínio —deligaçãoadedo de zinco, podem ser separados uns dos outros por 1,2,3,4, 5 ou mais nucleotídeos. Para proporcionar mais um exemplo, um domínio de ligação de quatro dedos pode se ligar a um sítio-alvo de 13 nucleotídeos com- preendendo, em sequência, dois subsítios de 3 nucleotídeos contíguos, um nu- cleotídeo interveniente e dois subsítios de tripleto contíguos.

A distância entre sequências (por exemplo, sítios-alvo) refere-se ao número de nucleotídeos ou pares de nucleotídeo intervenientes entre duas se- quências, conforme medido a partir das bordas das sequências mais próximas i umas das outras. ' Em determinadas modalidades nas quais a clivagem depende da li- gação de duas moléculas de fusão de domínio de dedo de zinco/meio-domínio . de clivagem a sítios-alvo distintos, os dois sítios-alvo podem estar sobre fitas de — DNA opostas. Em outras modalidades, ambos os sítios-alvo estão sobre a Í mesma fita de DNA. f Domínios de Ligação a DNA Qualquer domínio de ligação a DNA pode ser usado nos métodos divulgados aqui. Em determinadas modalidades, o domínio de ligação a DNA compreende uma proteína do dedo de zinco. Um domínio de ligação de dedo de zinco compreende um ou mais dedos de zinco. Miller et al. (1985) EMBOJ. by 4: 1609-1614; Rhodes (1993) Scientific American Fev.: 56-65; Patente U.S. No.

6.453.242. Os domínios de ligação de dedo de zinco descritos geralmente in- f cluem 2, 3, 4, 5, 6 ou mesmo mais dedos de zinco.

Tipicamente, um único domínio de dedo de zinco tem cerca de 30 aminoácidos de comprimento. Estudos estruturais demonstraram que cada do- mínio de dedo de zinco (motivo) contém duas beta folhas (mantida em um beta giro o qual contém os dois resíduos de cisteína invariáveis) e uma alfa hélice (contendo os dois resíduos de histidina invariáveis), os quais são mantidos em umaconformação particular através de coordenação de um átomo de zinco pe- las duas cisteínas e as duas histidinas.

Dedos de zinco incluem dedos de zinco C2H7> canônicos (isto é, a- queles nos quais o fon de zinco é coordenado por dois resíduos de cisteina e dois de histidina) e dedos de zinco não canônicos tais como, por exemplo, de- —dosdezincoCsH (aqueles nos quais o íon de zinco é coordenado por três resí- duos de cisteina e um resíduo de histidina) e dedos de zinco C, (aqueles nos quais o íon de zinco é coordenado por quatro resíduos de cisteína). Vide tam- bém documento WO 02/057293 e também Publicação de Patente U.S. No. 20080182332 com relação a ZFPs não canônicas para uso em plantas.

Um domínio de ligação de dedo de zinco manipulado pode ter uma nova especificidade de ligação, comparado com uma proteína de dedo de zinco que ocorre naturalmente. Métodos de manipulação incluem, mas não estão limi-

É tados a, design racional e vários tipos de seleção. Design racional inclui, por ' exemplo, uso de bancos de dados compreendendo sequências de nucleotídeo tripletos (ou quadrupletos) e sequências de aminoácido de dedo de zinco indivi- duais, nas quais cada sequência de nucleotídeo tripleto ou quadrupleto está associada a uma ou mais sequências de aminoácido de dedos de zinco as Í quais se ligam à sequência tripleto ou quadrupleto em particular. ] Métodos de seleção exemplificativos, incluíndo exibição de fago (“phage display”) e sistemas com dois híbridos, são divulgados nas Patentes U.S. Nos. 5.789.538; 5.925.523; 6.007.988; 6.013.453; 6.410.248; 6.140.466;

6.200.759;e 6.242.568; bem como documentos WO 98/37 186; WO 98/53057; WO 00/27878; WO 01/88197 e GB 2.338.237. E Intensificação de especificidade de ligação para domínios de dedo de zinco foi descrita, por exemplo, no documento cocedido WO 02/077227. - Uma vez que um dedo de zinco individual se liga a uma sequência detrêsnucleotídeos (isto é, tripleto) (ou uma sequência de quatro nucleotídeos a qual pode se sobrepor, por um nucleotídeo, com o sítio de ligação de quatro nucleotídeos de um dedo de zinco adjacente), o comprimento de uma sequên- cia à qual um domínio de ligação de dedo de zinco se liga (por exemplo, uma sequência-alvo) determinará o número de dedos de zinco em um domínio de ligação de dedo de zinco manipulado. Por exemplo, para ZFPs nas quais os motivos de dedo não se ligam a subsítios em sobreposição, uma sequência- alvo de seis nucleotídeos é ligada por domínios de ligação com dois dedos; uma sequência-alvo de nove nucleotídeos é ligada por um domínio de ligação com três dedos; uma sequência-alvo de seis nucleotídeos é ligada por um do- —míniodeligaçãocom dois dedos; uma sequência-alvo de nove nucleotídeos é ligada por um domínio de ligação com três dedos, etc. Conforme mencionado aqui, sítios de ligação para dedos de zinco individuais (isto é, subsítios) em um sítio-alvo não precisam ser contíguos, mas podem ser separados por um ou vários nucleotídeos, dependendo do comprimento e natureza de sequência de aminoácido entre os dedos de zinco (isto é, os ligantes interdedo) em um domí- nio de ligação de múltiplos dedos. Em um domínio de ligação de dedo de zinco a múltiplos dedos, de-

i dos de zinco adjacentes podem ser separados por sequências ligantes de ami- .- noácido de aproximadamente 5 aminoácidos (os assim denominados ligantes interdedo "canônicos") ou, alternativamente, por um ou mais ligantes não canô- nicos.

Vide, por exemplo, Patentes U.S. cocedidas Nos. 6.453.242 e 6.534.261. Paradomíniosde dedo de zinco manipulados compreendendo mais de três de- Á dos, inserção de ligantes interdedo mais longos (não canônicos) entre alguns Í dos dedos de zinco pode ser desejável em alguns casos, uma vez que isso po- de aumentar a afinidade e/ou especificidade de ligação pelo domínio de ligação.

Vide, por exemplo, Patente U.S.

No. 6.479.626 e documento WO 01/53480. Consequentemente, domínios de ligação de dedo de zinco com múltiplos dedos podem também ser caracterizados com relação à presença e localização de | ligantes interdedo não canônicos.

Por exemplo, a um domínio de ligação de dedo de zinco com seis dedos compreendendo três dedos (unidos por dois li- a gantes interdedo canônicos), um ligante longo e três dedos adicionais (unidos —pordoisligantes interdedo canônicos) são denotados uma configuração 2x3. Similarmente, a um domínio de ligação compreendendo dois dedos (com um ligante canônico entre os mesmos), um ligante longo e dois dedos adicionais (unidos por um ligante canônico) são denotados uma configuração 2x2. Uma proteína compreendendo três unidades com dois dedos (em cada uma das quaisosdoisdedos são unidos por um ligante canônico) e na qual cada unida- de com dois dedos é unida à unidade com dois dedos adjacentes por um ligan-

te longo é referida como uma configuração 3x2. A presença de um ligante interdedo longo ou não canônico entre dois dedos de zinco adjacentes em um domínio de ligação a múltiplos dedos frequentemente permite que os dois dedos se liguem a subsítios os quais não são imediatamente contíguos na sequência-alvo.

Consequentemente, podem haver vãos de um ou mais nucleotídeos entre subsítios em um sítio-alvo; isto é, um sítio-alvo pode conter um ou mais nucleotídeos que não são contatados por um dedo de zinco.

Por exemplo, um domínio de ligação de dedo de zinco 2x2 podese|ligaraduas sequências com seis nucleotídeos separadas por um nu- cleotídeo, isto é, ele se liga a um sítio-alvo de 13 nucleotídeos.

Vide também Moore et a/. (2001a) Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 98: 1432-1436; Moore et al.

' (2001b) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 1437-1441 e documento WO 01/53480. A Conforme mencionado anteriormente, um subsítio-alvo é uma se- quência de três ou quatro nucleotídeos que é ligada por um único dedo de zin- co. Para determinadas finalidades, uma unidade com dois dedos é denotada Bs 5 um"módulode ligação". Um módulo de ligação pode ser obtido, por exemplo, selecionando dois dedos adjacentes no contexto de uma proteína de múltiplos dedos (geralmente três dedos) a qual se liga a uma sequência-alvo de seis nu- cleotídeos em particular. Alternativamente, módulos podem ser construídos por meio de montagem de dedos de zinco individuais. Vide também documentos WO 98/53057 e WO 01/53480.

Alternativamente, o domínio de ligação a DNA pode ser derivado de . uma nuclease. Por exemplo, as sequências de reconhecimento das endonucle- ases e meganucleases "homing", tais como |-Scel, I-Ceul, VI-Pspl, Pl-Sce, |- ' ScelV, FCsml, -Pant, |-Sceil, |-Ppol, FScelll, -Crel, -Tevl, HTevll e |-Tevill são conhecidas. Vide também Patente U.S. No. 5.420.032; Patente U.S. No.

6.833.252; Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3379-3388; Dujon ef al. (1989) Gene 82: 115-118; Verier et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125- 1127; Jasin (1996) Trends Genet. 12: 224-228; Gimble ef a/. (1996) J. Mol. Biol. 263: 163-180; Argast et al. (1998) J. Mol. Biol. 280: 345-353 e o catálogo da NewEngland Biolabs. Além disso, a especificidade de ligação a DNA de endo- nucleases e meganucleases "homing" pode ser manipulada para se ligar a sí- tios-alvo não naturais. Vide, por exemplo, Chevalier et al. (2002) Molec. Cell 10: 895-905; Epinat et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31: 2952-2962; Ashworth et al. (2006) Nature 441: 656-659; Paques et al. (2007) Current Gene Therapy 7: 49- 66; Publicação de Patente U.S. No. 20070117128.

Como outra alternativa, o domínio de ligação a DNA pode ser deri- vado de uma proteína de zíper de leucina. Zíperes de leucina são uma classe de proteínas que estão envolvidas em interações proteína-proteína em muitas proteínas regulatórias eucariotas que são fatores transcricionais importantes associados à expressão gênica. O zíper de leucina refere-se a um motivo estru- tural em comum compartilhado nesses fatores de transcrição através de vários reinos, incluindo animais, plantas, leveduras, etc. O zíper de leucina é formado

' por dois polipeptídeos (homodímero ou heterodímero) que se ligam a sequên- . cias de DNA específicas de uma maneira onde os resíduos de leucina são uni- formemente espaçados através de uma a-hélice, de modo que os resíduos de leucina dos dois polipeptídeos terminam sobre a mesma face da hélice.

A es- : 5 pecificidadedeligaçãoa DNA de zíperes de leucina pode ser utilizada nos do- mínios de ligação a DNA divulgados aqui. ' Em algumas modalidades, o domínio de ligação a DNA é um domí- nio manipulado a partir de um efetuador TAL derivado do patógeno de planta Xanthomonas (vide Boch et al, (2009) Science, 29 de outubro de 2009 (10.1126/science.117881) e Moscou e Bogdanove, (2009) Science, 29 de outu- bro de 2009 (10.1126/science.1178817). . Domínios de Clivagem Conforme mencionado acima, o domínio de ligação a DNA pode es- . tar associado a um domínio de clivagem (nuclease). Por exemplo, endonuclea- ses"homing" podem ser modificadas quanto à sua especificidade de ligação a DNA, ao mesmo tempo em que retêm a função de nuclease.

Além disso, prote- ínas do dedo de zinco também podem ser fundidas a um domínio de clivagem para formar uma nuclease de dedo de zinco (ZFN). A porção de domínio de clivagem das proteínas de fusão divulgadas aqui pode ser obtida a partir de qualquer endonuclease ou exonuclease.

Endonucleases exemplificativas das quais um domínio de clivagem pode ser derivado incluem, mas não estão limi- tadas a, endonucleases de restrição e endonucleases "homing". Vide, por e- xemplo, Catálogo de 2002-2003, New England Biolabs, Beverly, MA; e Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3379-3388. Enzimas adicionais as quais —clivam DNA são conhecidas (por exemplo, Nuclease SI; nuclease de feijão-da- China; DNase | pancreática; nuclease microcócica; endonuclease HO de leve- dura; vide também Linn et a/. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993). Exemplos não limitativos de endonucleases e meganucleases "homing" incluem |-Scel, -Ceul, VI-Pspl, Pl-Sce, |-ScelV, FCsml, |-Panl, |-Scell, 1I-Ppol,|-Scelll, -Crel, FTeul, -Tevil e |-Tevill são conhecidos.

Vide também Pa- tente U.S.

No. 5.420.032; Patente U.S.

No. 6.833.252; Belfort et al. (1997) Nu- cleic Acids Res. 25: 3379-3388; Dujon et a/. (1989) Gene 82: 115-118; Perler ef i al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet. 12: . 224-228; Gimble et a/. (1996) J. Mol. Biol. 263: 163-180; Argast et al. (1998) J. Mol. Biol. 280: 345-353 e o catálogo da New England Biolabs. Uma ou mais dessas enzimas (ou fragmentos funcionais das mesmas) podem ser usadas como uma fonte de domínios de clivagem e meio-domínios de clivagem.

À Endonucleases de restrição (enzimas de restrição) estão presentes À em muitas espécies e são capazes de ligação sequência-específica ao DNA (em um sítio de reconhecimento) e clivagem de DNA em ou próximo do sítio de ligação. Determinadas enzimas de restrição (por exemplo, Tipo ISS) clivam o DNAemsítiosremovidos do sítio de reconhecimento e têm domínios de ligação e clivagem separáveis. Por exemplo, a enzima Fokl do tipo IIS catalisa a cliva- V gem de DNA fita dupla em 9 nucleotídeos a partir de seu sítio de reconhecimen- to sobre uma fita e 13 nucleotídeos a partir de seu sítio de reconhecimento so- í bre a outra. Vide, por exemplo, Patentes US 5.356.802; 5.436.150 e 5.487.994; bem como Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4275-4279; Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2764-2768; Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 883-887; Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269: 31, 978-31,

982. Assim, em uma modalidade, proteínas de fusão compreendem o domínio de clivagem (ou meio-domínio de clivagem) de pelo menos uma enzima de res- triçãodoTipollSe um ou mais domínios de ligação a dedo de zinco, os quais podem ou não ser manipulados.

Uma enzima de restrição do Tipo IIS exemplificativa, cujo domínio de clivagem é separável do domínio de ligação é Fokl. Essa enzima em particu- lar é ativa como um dímero. Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA95:

10.570-10.575. consequentemente, para fins da presente invenção, a porção da enzima Fokl usada nas proteínas de fusão divulgadas é considerada um meio- domínio de clivagem. Assim, para clivagem de fita dupla objetivada e/ou substi- tuição objetivada de sequências celulares usando fusões de dedo de zinco- Fokl, duas proteínas de fusão, cada uma compreendendo um meio-domínio de clivagem de Fokl, podem ser usadas para reconstituir um domínio de clivagem cataliticamente ativo. Alternativamente, uma única molécula polipeptídica contendo um domínio de ligação de dedo de zinco e dois meio-domínios de í clivagem de Fokl também pode ser usada.

Parâmetros para clivagem . objetivada e alteração de sequência objetivada usando fusões de dedo de zinco-Fokl são proporcionados em alguma parte na presente invenção.

Um domínio de clivagem ou meio-domínio de clivagem pode ser qualquer porção de uma proteína que retém a atividade de clivagem ou que À retém a capacidade de muiltimerizar (por exemplo, dimerizar) para formar um Í domínio de clivagem funcional.

Enzimas de restrição do Tipo IIS exemplificativas são descritas na Publicação Internacional cocedida WO 2007/014275, incorporada por referência aquinaíntegra.

Para intensificar a especificidade de clivagem, domínios de cliva- | gem também podem ser modificados.

Em determinadas modalidades, variantes do meio-domínio de clivagem são empregadas onde essas variantes minimizam '" ou previnem a homodimerização dos meio-domínios de clivagem.

Exemplos —nãolimitativos de tais meio-domínios de clivagem modificados são descritos em detalhes no documento WO 2007/014275, aqui incorporado por referência na íntegra.

Vide, também, Exemplos.

Em determinadas modalidades, o domínio de clivagem compreende um meio-domínio de clivagem manipulado (também refe- rido como mutantes com domínio de dimerização) que minimizam ou previnem ahomodimerização são conhecidos por aqueles versados no campo e descri- tos, por exemplo, nas Publicações de Patente U.S.

Nos. 20050064474 e 20060188987, incorporadas por referência aqui na íntegra.

Resíduos de amino- ácido nas posições 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537 e 538 de Fokl são todos alvo para influenciar a dimerização dos meio-domínios de clivagem de Fokl.

Vide, por exemplo, Publicações de Patente U.S.

Nos. 20050064474 e 20060188987; Publicação de Patente Inter- nacional WO 07/139898; Miller et al. (2007) Nat.

Biotechnol. 25(7): 778-785. Meio-domínios de clivagem de Fokl manipulados adicionais que formam heterodímeros obrigatórios também podem ser usados nas ZFNs des- critas aqui.

Em uma modalidade, o primeiro meio-domínio de clivagem inclui mutações em resíduos de aminoácido nas posições 490 e 528 de Fokl e o se- gundo meio-domínio de clivagem inclui mutações em resíduos de aminoácido

Ô 486 e 499.

r Em determinadas modalidades, o domínio de clivagem compreende dois meio-domínios de clivagem, ambos os quais são parte de um único polipeptídeo compreendendo um domínio de ligação, um primeiro meio-domínio õ 5 declivageme um segundo meio-domínio de clivagem. Os meio-domínios de clivagem podem ter a mesma sequência de aminoácido ou diferentes sequên- D cias de aminoácido, na medida em que eles funcionem para clivar o DNA. Em geral, duas proteínas de fusão são requeridas para clivagem se as proteínas de fusão compreendem meio-domínios de clivagem. Alternativa- mente, uma única proteína compreendendo dois meio-domínios de clivagem pode ser usada. Os dois meio-domínios de clivagem podem ser derivados da py mesma endonuclease (ou fragmentos funcionais da mesma) ou cada meio- domínio de clivagem pode ser derivado de uma endonucilease diferente (ou í fragmentos funcionais das mesmas). Além disso, os sítios-alvo para as duas proteínas de fusão são, de preferência, dispostos, um com relação ao outro, de modo que ligação das duas proteínas de fusão a seus respectivos sítios-alvo coloca os meio-domínios de clivagem em uma orientação espacial um com re- lação ao outro, de modo a permitir que a clivagem dos meio-domínios forme um domínio de clivagem funcional, por exemplo, através de dimerização. Assim, emdeterminadas modalidades, as bordas próximas dos sítios-alvo são separa- das por 5-8 nucleotídeos ou por 15-18 nucleotídeos. Contudo, qualquer número integral de nucleotídeos ou pares de nucleotídeo podem estar intervenientes entre dois sítios-alvo (por exemplo, de 2 a 50 nucleotídeos ou mais). Em geral, o ponto de clivagem reside entre os sítios-alvo. Proteínas de Fusão Métodos para design e construção de proteínas de fusão (e polinu- cleotídeos que codificam as mesmas) são conhecidos por aqueles versados no campo. Por exemplo, métodos para o design e construção de proteínas de fu- são compreendendo domínios de ligação de DNA (por exemplo, domínios de dedo de zinco)e domínios regulatórios ou de clivagem (ou meio-domínios de clivagem) e polinucleotídeos que codificam tais proteínas de fusão são descritos nas Patentes U.S. cocedidas Nos. 6.453.242 e 6.534.261 e Publica-

Á ções de Pedido de Patente U.S. 2007/0134796 e 2005/0064474; aqui incorpo- ' rados por referência na íntegra. Em determinadas modalidades, polinucleotí- deos que codificam as proteínas de fusão são construídos. Esses polinucleotí- deos podem ser inseridos em um vetor e o vetor pode ser introduzido em uma ' 5 célula(vide abaixo para divulgação adicional com relação a vetores e métodos para introdução de polinucleotídeos em células).

É Em determinadas modalidades dos métodos descritos aqui, uma nuclease de dedo de zinco compreende uma proteína de fusão compreendendo um domínio de ligação de dedo de zinco e um meio-domínio de clivagem da enzima de restrição Fokl e duas de tais proteínas de fusão são expressas em uma célula. Expressão de duas proteínas de fusão em uma célula pode resultar . de distribuição das duas proteínas à célula; distribuição de uma proteína e um ácido nucleico que codifica uma das proteínas à célula; distribuição de dois áci- 7 dos nucleicos, cada um codificando uma das proteínas, à célula; ou através de distribuição de um único ácido nucleico, que codifica ambas as proteínas, à célula. Em modalidades adicionais, uma proteína de fusão compreende uma única cadeia polipeptídica compreendendo dois meio-domínios de clivagem e um domínio de ligação de dedo de zinco. Nesse caso, uma única proteína de fusão é expressa em uma célula e, sem desejar estar preso pela teoria, acredita-se que clive o DNA como um resultado de formação de um dímero intramolecular dos meio-domínios de clivagem.

Em determinadas modalidades, os componentes das proteínas de fusão (por exemplo, fusões de ZFP-FoKkl) são dispostos de modo que o domínio de dedo de zinco esteja mais próximo do amino término da proteína de fusão e o meio-domínio de clivagem esteja mais próximo do carbóxi término. Isso espelha a orientação relativa do domínio de clivagem em domínios de clivagem de dimerização que ocorrem naturalmente, tais como aqueles derivados da enzima Fokl, nos quais o domínio de ligação a DNA está mais próximo do amino término e o meio-domínio de clivagem está mais próximo do carbóxi término. Nessas modalidades, acredita-se que dimerização dos meio-domínios de clivagem para formar uma nuclease funcional ocorra mediante ligação das proteínas de fusão a sítios sobre fitas de DNA opostas, com as extremidades 5'

' dos sítios de ligação estão próximas umas das outras.

- Em modalidades adicionais, os componentes das proteínas de fusão (por exemplo, fusões ZFN-Fokl) são dispostos de modo que o meio- domínio de clivagem esteja mais próximo do amino término da proteína de fusãoeodomíniode dedo de zinco esteja mais próximo do carbóxi término. í Nessas modalidades, acredita-se que dimerização dos meio-domínios de Ê clivagem forme uma nuclease funcional através de ligação das proteínas de fusão a sítios sobre fitas de DNA opostas, com as extremidades 3' dos sítios de ligação estando próximas uma da outra. Em outras modalidades adicionais, uma primeira proteína de fusão contém o meio-domínio de clivagem mais próximo do amino término da D proteína de fusão e o domínio de dedo de zinco mais próximo do carbóxi término e uma segunda proteína de fusão está disposta de modo que o domínio y'" de dedo de zinco esteja mais próximo do amino término da proteína de fusão e omeio-domínio de clivagem esteja mais próximo do carbóxi término. Nessas modalidades, ambas as proteínas de fusão se ligam à mesma fita de DNA, com o sítio de ligação da primeira proteína de fusão contendo o domínio de dedo de Zinco mais próximo do carbóxi término localizado no lado 5' do sítio de ligação da segunda proteína de fusão contendo o domínio de dedo de zinco mais próximo do amino término. Em determinadas modalidades das proteínas de fusão divulgadas, a sequência de aminoácido entre o domínio de dedo de zinco e o domínio de clivagem (ou meio-domínio de clivagem) é denotada o "ligante ZC". O ligante ZC deve ser distinguido dos ligantes interdedo discutidos acima. Vide, por exemplo, Publicações de Patente U.S. 20050064474A1 e 20030232410 e Pu- blicação de Patente Internacional WOO05/084190 para detalhes sobre a obten- ção de ligantes ZC que otimizam a clivagem. Em uma modalidade, a invenção proporciona uma ZFN compreen- dendo uma proteína de dedo de zinco tendo uma ou mais das sequências de aminoácido de hélice de reconhecimento mostradas na Tabela 1. Em outra mo- dalidade, é proporcionado aqui um vetor de expressão de ZFP compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica uma ZFP tendo uma ou mais héli-

á ces de reconhecimento mostradas na Tabela 1. : Integração Objetivada Os métodos e composições divulgados podem ser usados para cli- var DNA em um gene Zp15 da cromatina celular de planta, o que facilita a inte- ' 5 gração objetivada estável de uma sequência exógena no locus.

Conforme des- crito aqui, perda de função de genes Zp15 endógenos é bem tolerada por célu- |) las de planta e sequências integradas dentro desse gene são amplamente des- critas e geram plantas com modificações na linhagem germinativa para trans- missão hereditária da sequência integrada.

Consequentemente, o Zp15 é um sítio desejável para integração objetivada de sequências exógenas.

Para integração objetivada em Zp15, um ou mais domínios de liga- p ção a DNA (por exemplo, ZFPs) são manipulados para se ligar a um sítio-alvo em ou próximo do sítio de clivagem predeterminado e uma proteína de fusão í compreendendo o domínio de ligação a DNA manipulado e um domínio de cli- vagemé expresso em uma célula.

Quando de ligação da porção de ligação a DNA (por exemplo, dedo de zinco) da proteína de fusão ao sítio-alvo, o DNA é clivado, de preferência via uma ruptura de fita dupla, próximo do sítio-alvo pelo domínio de clivagem.

A presença de uma ruptura de fita dupla no locus de Zp15 facilita a integração de sequências exógenas via recombinação homóloga.

Assim, o poli- nucleotídeo compreendendo a sequência exógena a ser inserida no gene Zp15 incluirá uma ou mais regiões de homologia com um gene Zp15 para facilitar a recombinação homóloga.

Qualquer sequência de interesse (sequência exógena) pode ser in- troduzida em um /ocus de Zp15 conforme descrito aqui.

Sequências exógenas exemplificativas incluem, mas não estão limitadas a, qualquer sequência de codificação polipeptídica (por exemplo, cDNAs), promotores, intensificadores e outras sequências regulatórias (por exemplo, sequências de RNA de interferência, cassetes de expressão de shRNA, tags de epitopo, genes marcadores, sítios de reconhecimento de enzima de clivagem, sítios e vários tipos de construtos de expressão.

Tais sequências podem ser prontamente obtidas usando técnicas de biologia molecular padrões (clonagem, síntese, etc.)

i e/ou estão comercialmente disponíveis.

- Além das moléculas de fusão descritas aqui, substituição objetivada de uma sequência genômica selecionada também envolve a introdução da sequência de substituição (ou doadora). A sequência doadora pode ser y 5 introduzida na célula antes de, concorrentemente com ou subsequentemente à expressão da(s) proteína(s) de fusão. O polinucleotíideo doador contém À homologia suficiente ao Zp15 para sustentar recombinação homóloga (ou reparo homologia-dirigido) entre o mesmo e a sequência genômica de Zp15 com a qual ele tem homologia. Aproximadamente 25, 50, 100, 200, 500, 750,

1.000, 1.500, 2.000 nucleotídeos ou mais de homologia de sequência entre uma sequência doadora e uma genômica (ou qualquer valor integral entre 10e N 2.000 nucleotídeos ou mais) sustentarão a recombinação homóloga entre as mesmas. Em determinadas modalidades, os braços de homologia têm menos '" de 1.000 pares de base de comprimento. Em outras modalidades, os braços de —homologia têm menos de 750 pares de base de comprimento. Vide também Pedido de Patente Provisória U.S. No. 61/124.047, a qual é incorporada aqui por referência. Sequências doadoras podem oscilar, quanto ao comprimento, de 10 a 5.000 nucleotídeos (ou qualquer valor integral de nucleotídeos entre os mesmos) ou mais. Será prontamente evidente que a sequência doadora, tipi- camente, não é idêntica à sequência genômica que ela substitui. Por exemplo, a sequência do polinucleotídeo doador pode conter uma ou mais alterações, inserções, deleções, inversões ou reestruturações de uma base com relação à sequência genômica, contanto que homologia suficiente com as sequências cromossômicas esteja presente. Alternativamente, uma sequência doadora po- de conter uma sequência não homóloga flanqueada por duas regiões de homo- logia. Adicionalmente, sequências doadoras podem compreender uma molécula de vetor contendo sequências que não são homólogas à região de interesse na cromatina celular. Geralmente, a(s) região(ões) homóloga(s) de uma sequência —doadoraterá(ão) pelo menos 50% de identidade de sequência a uma sequência genômica com a qual recombinação é desejada. Em determinadas modalida- des, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 99,9% de identidade de se-

á quência estão presentes. Qualquer valor entre 1% e 100% de identidade de : * sequência pode estar presente, dependendo do comprimento do polinucleotí- deo doador. Uma molécula doadora pode conter várias regiões descontinuas de / 5 —homologiaàcromatina celular. Por exemplo, para inserção objetivada de se- quências normalmente não presentes em uma região de interesse, as referidas Í sequências podem estar presentes em uma molécula de ácido nucleico e flan- queada por regiões de homologia a uma sequência gênica na região de inte- resse. Moléculas doadoras também podem ser inseridas no locus de Zp15 para servir como um reservatório para uso posterior. Por exemplo, uma molécu- b la doadora homóloga a um gene endógeno, mas contendo uma mutação de interesse, pode ser inserida no /ocus de Zp15. Em seguida, ZFNs específicas r ao gene endógeno podem ser introduzidas, as quais clivarão o locus endógeno eamolécula doadora no locus de Zp15 o qual contém a mutação de interesse. O DSB resultante no genoma pode, então, se tornar o sítio de integração para a molécula doadora liberada do locus de Zp15. Dessa forma, a eficiência de inte- gração objetivada de uma sequência doadora em qualquer região de interesse pode ser grandemente aumentada, uma vez que o método não conta com cap- tação simultânea de ácidos nucleicos que codificam as ZFNs e aqueles das sequências doadoras.

Moléculas doadoras também podem ser inseridas no locus de Zp15 para servir como um sítio-alvo para subsequentes inserções. Por exemplo, uma molécula doadora compreendida de sequências de DNA que contêm sítios de reconhecimento para designs de ZFN adicionais pode ser inserida no locus de Zp15. Subsequentemente, designs de ZFN adicionais podem ser gerados e expressos em células, de modo que a molécula doadora original seja clivada e modificada através de reparo ou recombinação homóloga. Dessa forma, inte- grações reiterativas de moléculas doadoras podem ocorrer no locus de Zp15.

Para simplificar os ensaios (por exemplo, hibridização, PCR, diges- tão com enzima de restrição) para determinação de inserção com sucesso da sequência doadora, determinadas diferenças de sequência podem estar pre-

. sentes na sequência doadora quando comparado com a sequência genômica de Zp15. De preferência, se localizadas em uma região de codificação, tais dife- renças de sequência de nucleotídeo não alterarão a sequência de aminoácido ou farão alterações de aminoácido silenciosas (isto é, alterações as quais não afetama estrutura ou função da proteína). O polinucleotídeo doador pode, op- ] cionalmente, conter alterações em sequências correspondendo aos sítios de , ligação com domínio de ligação a DNA na região de interesse para impedir cli- vagem de sequências doadoras que tenham sido introduzidas na cromatina celular por meio de recombinação homóloga.

O polinucleotídeo doador pode ser DNA ou RNA, fita simples ou fita dupla e pode ser introduzido em uma célula na forma linear ou circular. Se in- troduzido na forma linear, as extremidades da sequência doadora podem ser S protegidas (por exemplo, contra degradação exonuclieolítica) através de méto- - dos conhecidos por aqueles versados no campo. Por exemplo, um ou mais re- — síduos de dideoxinucleotídeo são adicionados ao 3' término de uma molécula linear e/ou oligonucleotídeos autocomplementares são ligados a uma ou ambas as extremidades. Vide, por exemplo, Chang et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 4959-4963; Nehils et a/. (1996) Science 272: 886-889. Métodos adicio- nais para proteção de polinucleotídeos exógenos contra degradação incluem, mas não estão limitados a, adição de grupo(s) amino terminal(is) e o uso de ligações internucleotídeo modificadas tais como, por exemplo, resíduos de fos- forotioatos, fosforamidatos e O-metil ribose ou deoxirribose.

Um polinucleotídeo pode ser introduzido em uma célula como parte de uma molécula de vetor tendo sequências adicionais tais como, por exemplo, origensdereplicação, promotores e genes que codificam resistência a antibióti- co. Além disso, os polinucleotídeos doadores podem ser introduzidos como áci- do nucleico "nu", como um ácido nucleico em complexo com um agente, tal como uma nanopartícula, lipossoma ou poloxâmero ou pode ser distribuído por bactérias ou vírus (por exemplo, Agrobacterium, Rhizobium sp. NGR234, Sino- rhizoboium meliloti, Mesorhizobium loti, vírus mosaico do tabaco, vírus X da batata, vírus mosaico da couve-flor e vírus mosaico do veio de cassava). Vide, por exemplo, Chung et al. (2006) Trends Plant Sci. 11(1): 144.

í Parece que a presença de uma ruptura de fita dupla em uma se- - quência celular, acoplada à presença de uma molécula de DNA exógena tendo homologia a uma região adjacente a ou que envolve a ruptura, ativa mecanis- mos celulares os quais reparam a ruptura por meio de transferência de informa- “ 5 çãodesequênciada molécula doadora para a sequência celular (por exemplo, genômica ou cromossômica); isto é, através de um processo de reparo homo- logia-dirigido, também conhecido como "conversão gênica". Os métodos da Requerente combinam, vantajosamente, as poderosas capacidades de objeti- vação de ZFPs manipuladas com um domínio de clivagem (ou meio-domínio de clivagem) para objetivar especificamente genes parálogos, tais como genes Zp15, de modo que clivagem da sequência-alvo produz uma ruptura de fita du- ! pla na região do genoma onde inserção de sequências exógenas é desejada. Para alteração de uma sequência cromossômica, não é necessário í que toda a sequência do doador seja copiada para o cromossomo, contanto queo bastante da sequência doadora seja copiado para realizar a alteração de sequência desejada.

A eficiência de inserção de sequências doadoras através de re- combinação homóloga é inversamente relacionada à distância, no DNA celular, entre a ruptura de fita dupla e o sítio no qual recombinação é desejada. Em ou- traspalavras, maiores eficiências de recombinação homóloga são observadas quando a ruptura de fita dupla está mais próxima do sítio no qual recombinação é desejada. Em casos nos quais um sítio preciso de recombinação não é prede- terminado (por exemplo, o evento de recombinação desejado pode ocorrer so- bre um intervalo de sequência genômica), o comprimento e sequência do ácido —nucleicodoador, junto com o(s) sítio(s) de clivagem, são selecionados para ob- ter o evento de recombinação desejado. Em casos nos quais o evento desejado é projetado para alterar a sequência de um único par de nucleotídeo em uma sequência genômica, a cromatina celular é clivada dentro de 10.000 nucleotí- deos sobre qualquer lado desse par de nucleotídeo. Em determinadas modali- dades,clivagem ocorre dentro de 1,000, 500, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 ou 2 nucleotídeos ou qualquer valor integra! entre 2 e 1.000 nucle- otídeos, sobre qualquer lado do par de nucleotídeo cuja sequência tem de ser

. alterada.

Conforme detalhado acima, os sítios de ligação para duas proteínas de fusão, cada uma compreendendo um domínio de ligação de dedo de zinco e um meio-domínio de clivagem, podem estar localizados 5-8 ou 15-18 nucleotí- — deosde distância, conforme medido a partir da borda de cada sítio de ligação mais próximo do outro sítio de ligação e clivagem ocorre entre os sítios de liga- f ção. Se clivagem ocorre em um único sítio ou em múltiplos sítios entre os sítios de ligação não é relevante, uma vez que as sequências genômicas clivadas são substituídas pelas sequências doadoras. Assim, para alteração eficiente da se- quênciade um único par de nucleotídeo através de recombinação objetivada, o ponto mediano da região entre os sítios de ligação está dentro de 10.000 nu- cleotídeos desse par de nucleotídeo, de preferência dentro de 1.000 nucleotí- Í deos ou 500 nucleotídeos ou 200 nucleotídeos ou 100 nucleotídeos ou 50 nu- 2 cleotídeos ou 20 nucleotídeos ou 10 nucleotídeos ou 5 nucleotídeos ou 2 nu- — cleotídeos ou um nucleotídeo ou no par de nucleotídeo de interesse.

Em determinadas modalidades, um cromossomo homólogo pode servir como o polinucleotídeo doador. Assim, por exemplo, correção de uma mutação em um heterozigoto pode ser obtida manipulando proteínas de fusão as quais se ligam a e clivam a sequência mutante sobre um cromossomo, mas nãoclivama sequência do tipo silvestre sobre o cromossomo homólogo. A rup- tura de fita dupla sobre o cromossomo trazendo a mutação estimula um pro- cesso de "conversão gênica" baseado em homologia no qual a sequência do tipo silvestre do cromossomo homólogo é copiada para o cromossomo clivado, assim, restaurando duas cópias da sequência do tipo silvestre.

São também proporcionados métodos e composições que podem intensificar os níveis de recombinação objetivada incluindo, mas não limitado a, o uso de fusões de domínio funcional-ZFP adicionais para ativar a expressão de genes envolvidos em recombinação homóloga tais como, por exemplo, ge- nes de planta do grupo de epistase RAD54 (por exemplo, AtRad54, AtRad51) e genes cujos produtos interagem com os produtos gênicos antes mencionados. Vide, por exemplo, Klutstein M, et al. Genetics. Abril de 2008; 178(4): 2389-97.

Similarmente, fusões de domínio funcional-ZFP podem ser usadas,

' em combinação com os métodos e composições divulgados aqui, para reprimir F a expressão de genes envolvidos em união terminal não homóloga (por exem- plo, Ku70/80, XRCCA, poli(ADP ribose) polimerase, DNA ligase 4). Vide, por exemplo, Riha et al. (2002) EMBO 21: 2819-2826; Freisner et a/. (2003) Plant J. : 5 34:427H440; Chen et al. (1994) European Joumal of Biochemistry 224: 135-

142. Métodos para ativação e repressão de expressão gênica usando fusões ] entre um domínio de ligação de dedo de zinco e um domínio funcional são di- vulgados, por exemplo, nas Patentes US cocedidas 6.534.261; 6.824.978 e

6.933.113. Métodos de repressão adicionais incluem o uso de oligonucleotídeos antissenso e/ou pequeno RNA de interferência (siRNA ou RNAi) ou shRNAs objetivados à sequência do gene a ser reprimido.

. Como uma alternativa a ou além disso, ativação de expressão de produtos gênicos envolvidos em recombinação homóloga, fusões dessa proteí- f na (ou fragmentos funcionais da mesma) com um domínio de ligação de dedo dezinco objetivo ao Zp15, pode ser usada para recrutar essas proteínas (prote- ínas de recombinação) à região de interesse, desse modo, aumentando sua concentração local e ainda estimulando processos de recombinação homóloga. Alternativamente, um polipeptídeo envolvido em recombinação homóloga, con- forme descrito acima (ou um fragmento funcional do mesmo) pode ser parte de umaproteínade fusão tripla compreendendo um domínio de ligação de dedo de zinco, um domínio de clivagem (ou meio-domínio de clivagem) e a proteína de recombinação (ou fragmento funcional da mesma). Proteínas adicionais envol- vidas em conversão gênica e remodelamento de cromatina relacionado à re- combinação, as quais podem ser usadas nos métodos e composições antes mencionados, incluem acetil transferases de histona (por exemplo, Esalp, Tip60), metil transferases de histona (por exemplo, Dotlp), quinases de histona e fosfatases de histona. Vide também Bhat et a/. (1999) Plant 7.33: 455-469. Aumentos adicionais na eficiência de recombinação objetivada em células compreendendo uma molécula de fusão de dedo de zinco/nuclease e umamoléculade DNA doadora são obtidos bloqueando as células na fase G2 do ciclo celular, quando processos de reparo acionados por homologia estão maximamente ativos. Tal interrupção pode ser obtida através de uma série de í formas. Por exemplo, as células podem ser tratadas, por exemplo, com fárma- E cos, compostos e/ou pequenas moléculas as quais influenciam a progressão do ciclo celular, de forma a interromper as células na fase G2. Moléculas exempli- ficativas desse tipo incluem, mas não estão limitadas a, compostos os quais b 5 afetam a polimerização de microtúbulo (por exemplo, vinblastina, nocodazol, Taxol), compostos que interagem com o DNA (por exemplo, cis-platina(l!), diclo- E reto de diamina, Cisplatina, doxorrubicina) e/ou compostos que afetam a sínte- se de DNA (por exemplo, timidina, hidroxiureia, L-mimosina, etoposídeo, 5- fluorouracila). Aumentos adicionais na eficiência de recombinação são obtidos mediante ouso de inibidores de deacetilase de histona (HDAC) (por exemplo, butirato de sódio, tricostatina A), os quais alteram a estrutura da cromatina para p tornar o DNA genômico mais acessível à máquina de recombinação celular. Métodos adicionais para interrupção do ciclo celular incluem super- f expressão de proteínas as quais inibem a atividade das quinases CDK do ciclo celular, por exemplo, mediante introdução de um cDNA que codifica a proteína na célula ou por meio de introdução, na célula, de uma ZFP manipulada a qual ativa expressão do gene que codifica a proteína. Interrupção do ciclo celular é também obtida inibindo a atividade de ciclinas e CDKs, por exemplo, usando métodos de RNAi (por exemplo, Patente U.S. No. 6.506.559) ou mediante in- trodução,na célula, de uma ZFP manipulada a qual reprime a expressão de um ou mais genes envolvidos em progressão do ciclo celular tais como, por exem- plo, genes de ciclina e/ou CDK. Vide, por exemplo, Patente U.S. cocedida No.

6.534.261 para métodos de síntese de proteínas do dedo de zinco manipuladas para regulação de expressão gênica.

Alternativamente, em determinados casos, clivagem objetivada é conduzida na ausência de um polinucleotídeo doador (de preferência na fase S ou G2) e recombinação ocorre entre cromossomos homólogos.

Vetores de Expressão Um ácido nucleico que codifica uma ou mais proteínas de fusão (porexemplo,ZFNs), conforme descrito aqui, pode ser clonado em um vetor para transformação em células procariotas ou eucariotas para replicação e/ou expressão. Vetores podem ser vetores procariotas, por exemplo, plasmídeos ou

- vetores "shuttle", vetores de inseto ou vetores eucariotas. Um ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão também pode ser clonado em um vetor de í expressão para administração a uma célula de planta. Para expressar as proteínas de fusão (por exemplo, ZFNs), se- — quências que codificam as proteínas de fusão são, tipicamente, subclonadas É em um vetor de expressão que contém um promotor para dirigir a transcrição. ' Promotores bacterianos e eucariotas adequados são bem-conhecidos na técni- ca e descritos, por exemplo, em Sambrook et al, Molecular Cloning, A Labora- tory Manual (2º ed. 1989; 3º ed., 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expres- sion:ALaboratory Manual (1990); e Current Protocols in Molecular Biology (Au- subel et a/., supra). Sistemas de expressão bacterianos para expressão da ZFP estão disponíveis, por exemplo, em E. coli, Bacillus sp e Salmonella (Palva et É al, Gene 22: 229-235 (1983)). Kits para tais sistemas de expressão estão co- p mercialmente disponíveis. Sistemas de expressão para células de mamífero, levedura e células de inseto são bem-conhecidos por aqueles versados no campo e também estão comercialmente disponíveis.

O promotor usado para dirigir a expressão de um ácido nucleico que codifica proteína de fusão depende da aplicação em particular. Por exem- plo, um promotor constitutivo forte adequado para a célula hospedeira é, tipi- camente, usado para expressão e purificação de proteínas de fusão.

Em contraste, quando uma proteína de fusão é administrada in vivo para regulação de um gene de planta (vide a seção "Distribuição de Ácido Nu- cleico a células de Planta" abaixo), um promotor constitutivo ou induzível é u- sado, dependendo do uso particular da proteína de fusão. Exemplos não limita- tivosdepromotores de planta incluem sequências derivadas de ubiquitina-3 de A. thaliana (ubi-3) (Callis, et al, 1990, J. Biol. Chem. 265: 12486-12493); sintase de manopina de A. Tumefaciens (Amas) (Petolino et al, Patente U.S. No.

6.730.824); e/ou Vírus Mosaico do Veio de Cassava (CSVMV) (Verdaguer et al., 1996, Plant Molecular Biology 31: 1129-1139). Vide também Exemplos.

Além do promotor, o vetor de expressão contém, tipicamente, uma unidade de transcrição ou cassete de expressão que contém todos os elemen- tos adicionais requeridos para a expressão do ácido nucleico em células hos-

Í pedeiras, quer procariotas ou eucariotas. Um cassete de expressão típico, as- " sim, contém um promotor operavelmente ligado, por exemplo, a uma sequência de ácido nucleico que codifica a proteína de fusão e sinais requeridos, por e- xemplo, para poliadenilação eficiente do transcrito, término de transcrição, sítios . 5 deligaçãoribossômica ou término de tradução. Elementos adicionais do casse- te podem incluir, por exemplo, intensificadores, sinais de junção heterólogos ] e/ou um sinal de localização nuclear (Nuclear Localization Signal - NLS).

O vetor de expressão usado em particular para transportar a infor- mação genética para a célula é selecionado com relação ao uso pretendido das proteínas de fusão, por exemplo, expressão em plantas, animais, bactérias, fungos, protozoários, etc. (vide vetores de expressão descritos acima). Vetores . de expressão bacterianos e animais padrões são conhecidos na técnica e são descritos em detalhes, por exemplo, Publicação de Patente US. h 20050064474A1 e Publicações de Patente Internacionais WOO5/084190, WO05/014791 e WOO03/080809.

Métodos padrões de transfecção podem ser usados para produzir linhagens de células bacterianas, de mamífero, levedo ou inseto que expres- sam grandes quantidades de proteína as quais podem, então, ser purificadas usando técnicas padrões (vide, por exemplo, Colley et al., J. Biol. Chem. 264: 17619-17622 (1989); Guide to Protein Purification, in Methods in Enzymology, vol. 182 (Deutscher, ed., 1990)). Transformação de células eucariotas e proca- riotas é realizada de acordo com técnicas padrões (vide, por exemplo, Morrison, J. Bact. 132: 349-351 (1977); Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology 101: 347-362 (Wu et a/., eds., 1983).

Qualquer um dos procedimentos bem-conhecidos para introdução de sequências de nucleotídeo estranhas em tais células hospedeiras pode ser usado. Esses incluem o uso de transfecção com fosfato de cálcio, polibreno, fusão de protoplasto, eletroporação, métodos de ultrassom (por exemplo, sono- poração), lipossomas, microinjeção, DNA "nu", vetores de plasmídeo, vetores virais, epissomais e integrativos e qualguer um dos outros métodos bem- conhecidos para introdução de DNA genômico, cDNA, DNA sintético clonado ou outro material genético estranho em uma célula hospedeira (vide, por exem-

É plo, Sambrook et a/., supra). É necessário apenas que o procedimento de en- - genharia genética usado em particular seja capaz de introduzir com sucesso pelo menos um gene na célula hospedeira capaz de expressão da proteína de escolha. bp 5 Distribuição de Ácido Nucleico a Células de Planta Conforme notado acima, construtos de DNA podem ser introduzi- Ê dos (por exemplo, no genoma) em um hospedeiro vegetal desejado através de uma variedade de técnicas convencionais. Para revisões de tais técnicas vide, por exemplo, Weissbach & Weissbach Methods for Plant Molecular Biology (1988,Academic Press, N.Y.) Seção VIII, páginas 421463; e Grierson & Corey, Plant Molecular Biology (1988, 2º Ed.), Blackie, Londres, Capítulos 7-9. ; Por exemplo, o construto de DNA pode ser introduzido diretamente no DNA genômico da célula de planta usando técnicas tais como eletroporação f e microinjeção de protoplastos de células de planta ou os construtos de DNA podem ser introduzidos diretamente no tecido de planta usando métodos biolís- ticos, tal como bombardeamento de partícula de DNA (vide, por exemplo, Klein et al. (1987) Nature 327: 70-73). Alternativamente, o construto de DNA pode ser introduzido na célula de planta via transformação de nanopartícula (vide, por exemplo, Pedido de Patente US No. 12/245.685, o qual é incorporado aqui por referência em sua totalidade). Alternativamente, os construtos de DNA podem ser combinados com regiões de flanqueamento/borda de T-DNA adequadas e introduzidos em um vetor hospedeiro Agrobacterium tumefaciens convencional. Técnicas de transformação mediadas por Agrobacterium tumefaciens, incluindo desarme e uso de vetores binários, são bem descritas na literatura científica. Vide, por exemplo, Horsch et al. (1984) Science 233: 496-498 e Fraley et al. | (1983) Proc. Naf'l. Acad. Sci. USA 80: 4803.

Além disso, transferência gênica pode ser obtida usando bactérias que não Agrobaciterium ou vírus, tais como Rhizobium sp. NGR234, Sinorhizo- boium meliloti, Mesorhizobium loti, vírus X de batata, vírus mosaico da couve- florevírusmosaico do veio de cassava e/ou vírus mosaico de tabaco. Vide, por exemplo, Chung et al. (2006) Trends Plant Sci. 11(1): 1-4. As funções de virulência do hospedeiro Agrobacterium tumefaciens

. dirigirão a inserção de uma T-fita contendo o construto e marcador adjacente ao DNA de célula de planta quando a célula é infectada pela bactéria usando vetor Í de T DNA binário (Bevan (1984) Nuc. Acid Res. 12: 8711-8721) ou o procedi- mento de cocultura (Horsch et al. (1985) Science 227: 1229-1231). Em geral, o sistemade transformação com Agrobacterium é usado para manipular plantas É dicotiledôneas (Bevan et al. (1982) Ann. Rev. Genet 16: 357-384; Rogers et al. a (1986) Methods Enzymol. 118: 627-641). O sistema de transformação de Agro- bacterium pode também ser usado para transformar, bem como transferir, DNA para plantas e células de plantas monocotiledôneas. Vide Patente U.S. No.

5.591.616; Hernalsteen ef al. (1984) EMBO 73: 3039-3041; Hooykass-Van S- logteren et al. (1984) Nature 311: 763-764; Grimsley et a/. (1987) Nature 325: 1677-179; Boulton et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12: 31-40; e Gould et al. (1991) h Plant Physiol. 95: 426-434. F Métodos alternativos de transferência e transformação gênica in- cluem,mas não estão limitados a, transformação de protoplasto através de cap- tação mediada por eletroporação, cálcio ou polietileno glicol (PEG) de DNA "nu" (vide Paszkowski et al. (1984) EMBO J 3: 2717-2722, Potrykus et al. (1985) Mo- lec. Gen. Genet. 199: 169-177; Fromm et al. (1985) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82: 5824-5828; e Shimamoto (1989) Nature 338: 274-276) e eletroporação de tecidos de planta (D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4: 1495-1505). Métodos adi- cionais para transformação de célula de planta incluem microinjeção, captação de DNA mediada por carbureto de silício (Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Re- porter 9: 415-418) e bombardeamento de microprojétil (vide Klein et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85: 4305-4309; e Gordon-Kamm et al. (1990) Plant Cell2:603-618).

Os métodos e composições divulgados podem ser usados para in- serir sequências exógenas em um local predeterminado (por exemplo, um gene Zp15) em um genoma de célula de planta. Isso é útil uma vez que expressão de um transgene introduzido em um genoma de planta depende criticamente de seusítio deintegração. Consequentemente, genes que codificam, por exemplo, tolerância a herbicida, resistência a inseto, nutrientes, antibióticos ou moléculas terapêuticas podem ser inseridos, através de recombinação objetivada, em re-

Í giões do genoma de uma planta favoráveis à sua expressão. p Células de planta transformadas as quais são produzidas através de qualquer uma dessas técnicas de transformação podem ser cultivadas para regenerar uma planta inteira a qual possui o genótipo transformado e, assim, o LE 5 fenótipo desejado.

Tais técnicas de regeneração contam com manipulação de determinados fitormônios em um meio de crescimento de cultura tecidual, tipi- Í camente contando com um marcador biocida e/ou herbicida o qual tenha sido introduzido junto com as sequências de nucleotídeo desejadas.

A regeneração de planta a partir de protoplastos cultivados é descrita em Evans et al., "Proto- plastslisolation and Culture" em Handbook of Plant Cell Culture, páginas 124- 176, Macmíillian Publishing Company, New York, 1983; e Binding, Regeneration p of Plants, Plant Protoplasts, páginas 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985. Re- generação também pode ser obtida a partir de caule, explante, órgãos, polens, " embriões de planta ou partes dos mesmos.

Tais técnicas de regeneração são descritas, em geral, em Klee et al. (1987) Ann.

Rev. of Plant Phys. 38: 467-486. Ácidos nucleicos introduzidos em uma célula de planta podem ser usados para conferir traços desejados a essencialmente qualquer planta.

Uma ampla variedade de plantas e sistemas de célula de planta podem ser manipu- lados quanto às características fisiológicas e agronômicas desejadas descritas —aquiusando os construtos de ácido nucleico da presente invenção e os vários métodos de transformação mencionados acima.

Em modalidades preferidas, plantas e células de planta-alvo para manipulação incluem, mas não estão limi- tadas a, aquelas plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas, tais como safras, incluindo safras de grãos (por exemplo, trigo, milho, arroz, painço, cevada), sa- fras de fruta (por exemplo, tomate, maçã, pêra, morango, laranja), safras de forragem (por exemplo, alfafa), safras de vegetais de raiz (por exemplo, cenou- ra, batata, beterrabas sacarínicas, inhame), safras de vegetais folhosos (por exemplo, alface, espinafre); plantas de floração (por exemplo, petúnia, rosa, crisântemo), coníferas e pinheiros (por exemplo, pinheiro, pinho); plantas usa- dasemfitoterapia (por exemplo, plantas que acumulam metal pesada); safras oleosas (por exemplo, girassol, colza) e plantas usadas para fins experimentais (por exemplo, Arabidopsis). Assim, os métodos e composições divulgados têm

Á uso sobre uma ampla faixa de plantas incluindo, mas não limitado a, espécies - dos gêneros Asparagus, Avena, Brassica, Citrus, Citrullus, Capsicum, Cucurbi- ta, Daucus, Erigeron, Glycine, Gossypium, Hordeum, Lactuca, Lolium, Lycoper- sicon, Malus, Manihot, Nicotiana, Orychophragmus, Oryza, Persea, Phaseolus, D 5 Pisum,Pyrus, Prunus, Raphanus, Secale, Solanum, Sorghum, Triticum, Vitis, Vigna e Zea.

Ê Aqueles versados no campo reconhecerão que, após a sequência exógena ser estavelmente incorporada em plantas transgênica e confirmada como sendo operável, ela pode ser introduzida em outras plantas através de cruzamento sexual. Qualquer uma de uma série de técnicas padrões de melho- ramento pode ser usada, dependendo da espécie a ser cruzada.

D Uma célula, caule, tecido de planta ou planta transformada pode ser identificado e isolado por meio de seleção ou triagem do material vegetal f manipulado quanto a traços codificados pelos genes marcadores presentes so- breobDNA de transformação. Por exemplo, seleção pode ser realizada cres- cendo o material vegetal manipulado sobre meios contendo uma quantidade inibitória do antibiótico ou herbicida ao qual o construto gênico de transforma- ção confere resistência. Ainda, plantas e células de planta transformadas tam- bém podem ser identificadas por meio de triagem das atividades de quaisquer genesmarcadores visíveis (por exemplo, os genes de B-glucuronidase, lucife- rase, B ou CI) que possam estar presentes sobre os construtos de ácido nuclei- co recombinante. Tais metodologias de seleção e triagem são bem-conhecidas por aqueles versados no campo.

Métodos físicos e bioquímicos também podem ser usados para i- dentificartransformantes de planta ou célula de planta contendo construtos gê- nicos inseridos. Esses métodos incluem, mas não estão limitados a: 1) análise de Southern ou amplificação por PCR para detecção e determinação da estru- tura do inserto de DNA recombinante; 2) Northern blot, proteção com SIRNase, extensão de iniciador ou amplificação por PCR com transcriptase reversa para — detecçãoe exame dos transcritos de RNA dos construtos gênicos; 3) eletrofo- rese em gel de proteína, técnicas de Western blot, imunoprecipitação ou imu- noensaios enzima-ligados (ELISA), onde os produtos do construto gênico são

: proteínas. Técnicas adicionais, tais como hibridização in situ, coloração enzimá- . tica e imunocoloração, também podem ser usados para detectar a presença ou expressão do construto recombinante em órgãos e tecidos específicos de uma planta. Os métodos para fazer todos esses ensaios são bem-conhecidos por aqueles versados no campo.

Á Os efeitos de manipulação gênica usando os métodos divulgados ã aqui podem ser observados, por exemplo, através de Northern blots do RNA (por exemplo, mRNA) isolado dos tecidos de interesse. Tipicamente, se o mR- NA está presente ou a quantidade de MRNA aumentou, pode se admitir que o transgene correspondente está sendo expresso. Outros métodos de medição de atividade do polipeptídeo codificado e/ou gene podem ser usados. Diferen- tes tipos de ensaios enzimáticos podem ser usados, dependendo do substrato í usado e do método de detecção de aumento ou diminuição de um produto ou - subproduto de reação. Além disso, os níveis de polipeptídeo expresso podem sermedidos imunoquimicamente, isto é, ELISA, RIA, ELA e outros ensaios ba- seados em anticorpo bem-conhecidos por aqueles versados no campo, tal co- mo através de ensaios de detecção eletroforéticos (com coloração ou Western blotting). Como um exemplo não limitativo, a detecção das proteínas AAD-1 e PAT usando um ensaio ELISA é descrita no Pedido de Patente U.S. No. 11/587.893, referência a qual é aqui incorporada por referência na íntegra. O transgene pode ser seletivamente expresso em alguns tecidos da planta ou em alguns estágios de desenvolvimento ou o transgene pode ser expresso em substancialmente todos os tecidos de planta, substancialmente ao longo de to- do o ciclo de vida. Contudo, qualquer modo de expressão combinatorial é tam- bém aplicável.

A presente invenção também abrange sementes das plantas trans- gênicas descritas acima em que a semente tem o transgene ou construto gêni- co. A presente invenção ainda abrange a prole, clones, linhagens de célula ou células das plantas transgênicas descritas acima, em que a referida prole, clo- ne, linhagem de célula ou célula tem o transgene ou produto gênico.

Proteínas de fusão (por exemplo, ZFNs) e vetores de expressão que codificam proteínas de fusão podem ser administrados diretamente à plan-

' ta para regulação gênica, clivagem objetivada e/ou recombinação. Em determi- - nadas modalidades, a planta contém múltiplos genes-alvo parálogos. Sabe-se que plantas podem conter múltiplos genes parálogos. Assim, uma ou mais pro- teinas de fusão ou vetores de expressão que codificam proteínas de fusão dife- : 5 rentes podem ser administrados a uma planta de forma a objetivar um ou mais genes Zp15 na planta.

A administração de quantidades eficazes é através de qualquer uma das vias normalmente usadas para introdução de proteínas de fusão em contato com a célula de planta a ser tratada. As ZFPs são administradas atra- vésdemuitas maneiras adequadas, de preferência com veículos aceitáveis. Métodos adequados de administração de tais moduladores estão disponíveis e . bem-conhecidos por aqueles versados no campo e, embora mais de uma via possa ser usada para administrar uma composição em particular, um via parti- í cular pode, frequentemente, proporcionar uma reação mais imediata e mais eficazdo que outra via.

Veículos também podem ser usados e são determinados, em parte, pela composição que está sendo administrada, bem como pelo método usado para administrar a composição em particular. Consequentemente, há uma am- pla variedade de formulações adequadas de veículos que estão disponíveis.

EXEMPLOS Abaixo estão exemplos de modalidades específicas para realização da presente invenção. Os exemplos são oferecidos para fins ilustrativos apenas e não se destinam a limitar o escopo da presente invenção de qualquer forma.

Esforços foram feitos para assegurar precisão com relação aos números usados (por exemplo, quantidades, temperaturas, etc.), mas algum erro e desvio experimental pode, naturalmente, ser permitido. Exemplo 1: Identificação e Caracterização do Locus Alvo de Zp15 Baseado em mapas genéticos publicamente disponíveis (Lawren- ce, C. ef al. (2004) NAR 32: 393-397; banco de dados de milho na internet) e na sequência de genoma extraída de milho, o locus de Zp15 sobre o braço curto do cromossomo 6 foi escolhido como um alvo para modificação usando ZFNs baseado em localização e informação disponível sobre o gene Zp15. A estrutu-

Ê ra e sequência genômica de um gene que codifica beta zeína de 15 kKD (Zp15) . de milho foram descritas e anotadas no domínio público (Woo et al. (2001) Plant Cell 13(10): 2297-2313). A sequência para o gene Zp15 é descrita no nú- mero de acesso ao GenBank AF37 1264, o qual é incorporado aqui por referên- p 5 cia A sequência genômica do Zp15 foi usada como "query" em bancos É de dados de genoma TIGR e Maize GDB usando algoritmos BLAST.

Várias sequências com homologia de sobreposição ao Zp15 incluindo, mas não limita- do a, dois contigs (AZM5. 16782 e ZMGSStuc11-12-04.8785.1) e vários ESTs (M72708, M13507, M12147, AYIO03640 e AF371264) foram identificados.

Ba- seado na sequência desses acessos, bem como na sequência do Zp15, múlti- plos oligonucleotídeos curtos foram projetados para uso como iniciadores de PCR usando o programa Primer3 (Rozen, S. e Skaletsky, H.J. (2000) Primeri on [' the WWW for general users and for biologist programmers.

Em: Krawetz S, Mi- senerS(eds.) Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Bio- logy.

Humana Press, Totowa, NJ, páginas 365-386; também disponível na in- ternet). Esses iniciadores incluem, mas não estão limitados a, os seguintes oligonucleotídeos na orientação para frente: P67F 5'-CGTATGAATTCATTGACAAÇCC - 3* (SEQ ID NO:1) P6RF 5'-ATGATCTATCTIGIAAÁTCCO=3' (SEQID NO:2) P69F 5'- CGTCATGCAACGCAACATTCC — 3* (SEQ TD NO:3) P7T3IF 5'-AAGAACATCACAAGTTATGC -3* (SEQID NO:4) P7aF 5S'-TCATGTGGATCCAAGGCATO—3* (SEG ID NO:5) Além disso, os iniciadores incluem, mas não estão limitados a, os seguintes oligonucleotídeos na orientação reversa: P70R S$'-ATGTGTGTCGTCTTACTGC-23' (SEQ ID NO:6) P7IR 5º -CAGTAGTAGGGCGGAATG —3' (SEQID NO:7) P72R 5º - GGGCAGCTGGTACTG — 3” (SEQ ID NO:8) P75R 5' -CTATAATCGATGTAGAGEC — 3' (SEQ 1D NO:9) P76R 5º -CTATGCITIGICTATAGTOG - 3" (SEQ ID NO:10)

' Todos os iniciadores de oligonucleotídeo foram sintetizados por e - adquiridos da Integrated DNA Technologies (IDT, Coralville, LA). Amplificações de gDNA da variedade de milho Hi-ll foram realizadas sobre um PCR Thermal Cycler usando 30 ng de gDNA. Um fragmento de amplificação de 2.215 bp, cor- : 5 respondendo ao gene Zp15 de Hi-1l, foi isolado e clonado no plasmídeo pCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Análise de sequência desse fragmento revelou que ! a estrutura genômica de Zp15 da variedade de milho Hi-ll contém dois éxons e um pequeno íntron de 31 bp (SEQ ID NO: 126). Designs para ZFN objetivada ao Zp15 são focalizados sobre as regiões de codificação do gene Zp15 da vari- edadede milho Hill.

Exemplo 2: Design de Nucleases de Dedo de Zinco Objetivadas ao Gene , Zp15 de Milho De forma a montar vetores de expressão para ZFNs, um esquema '| de clonagem modular em etapas foi projetado o qual é aplicável para qualquer determinado par de genes que codificam ZFN selecionados do arquivo de bibli- oteca ou sintetizados de novo.

ZFNs objetivadas ao Zp15, primeiro, sofreram triagem usando a tri- agem por ensaio com levedura conforme descrito em Doyon et al. (2008) Natu- re Biotechnology 26(6): 702 e Pedido de Patente U.S. No. 12/284.887. Resumi- damente, todo o/ocusde Zp15foi introduzido no locus HO no genoma de leve- dura de forma a comparar diretamente a atividade de ZFN em diferentes sítios de ligação dentro do gene-alvo; ZFNs sofreram triagem quanto à sua capacida- de de induzir a DSB no gene repórter usando um ensaio repórter (MEL1), con- forme descrito em Doyon et al.

Baseado nos resultados desses ensaios de sistema proxy, foi con- firmado que vários pares de ZFN testados eram capazes de induzir a DSBs dentro do Zp15.

Após pré-triagem de levedo, os pares de ZFN foram, então, subclo- nados em vetores de expressão de milho específicos. Conforme descrito na Publicação de Patente U.S. No. 20080182332, um vetor incluindo segmentos reprojetados e sintetizados de um sinal de localização nuclear (NLS) derivado do domínio de nuclease op-2 e Fokl de milho utilizando a tendência de códon f para milho foi modificado com uma única inserção de nucleotídeo (C) a jusante do sítio Xho | único para criar um sítio Sac | extra. Um vetor similar foi modifica- do para incluir a sequência ribossômica 2A do vírus Thosea asigna. Os casse- tes gênicos que codificam ORFs de proteínas do dedo de zinco individuais fo- ram clonados em qualquer um desses vetores via sítios de restrição Kon | e | BamH | e subsequentemente os dois vetores foram combinados via sítios de É restrição Bgl IV - Xho |, proporcionando um construto intermediário que conti- nha um cassete incluindo 2 domínios de codificação de ZFN flanqueados por sítios de restrição Nco | e Sac |.

O cassete Nco VSac | dessa construção intermediária foi excisado via digestão com enzima de restrição e ligado na parte principal de plasmídeo pDAB387?2, o qual contém um promotor do gene de ubiquitina-1 de milho (Shar- f rock et al. (1992) Plant Mol Biol. 18(4): 675) e sequências terminadoras do gene - de peroxidase catiônica raiz de milho preferencial (Patente US No. 7.179.902).

Os plasmídeos resultantes incluem os genes de ZFN, mais os mar- cadores selecionáveis relevantes para manutenção de plasmídeo e sítios de flanqueamento attl para manipulação conveniente usando o sistema GATEWAY" da Invitrogen (Carlsbad, CA). Cada um dos construtos de ZFN gerados usando esse esquema de clonagem foi transformado em células DH5a def. coliesubsequentemente mantidos sob a seleção apropriada.

A Tabela 1 mostra ZFNs objetivadas ao Zp15 exemplificativas que foram usadas para experimentos de integração objetivada no locus de Zp15. À sequência de DNA-alvo para a ZFN é mostrada na segunda coluna (sítios-alvo de DNA indicados em letras maiúsculas; nucleotídeos não contatados indicados emletrasminúsculas)e as terceira à sexta coluna mostram a sequência de a- minoácido da região de reconhecimento (aminoácidos =1 a +6, com relação ao início da hélice) de cada um dos dedos de zinco (F1 a F4) na proteína. Também fornecido na primeira coluna da Tabela 1 é um número de identificação para cada proteína.

Tabela 1 Nome ítio-; CaGGGCTGCAGGGCHA | DRSHLTR | RSDNLRE | RSDOVISE | RSAHLSR tacagogetag (SEQ ID (SEQ1D (SEQ ID (SEQID (SEQ ID 11742 | NO11 NO:12) | NOS NO-14) NO:15) gcAGGGGCAGGGCAtA | OSGSLTR | RSDHLTA | DRSHLTR | RSDHLTO goattacagag (SEQ ID (SEQ ID (SEQID (SEQID (SEQID - 11743 | NO:A6 NO;1 NO:18 NO-12) NO:18; CIGAGGCAGCCGCADtA | OSGDLTR | DRSDLSR | QGSGDLTR RSDNLTR cagesegetag (SEQ ID (SEG ID (SEQID (SEQ1D (SEQID A NO:19 NO:20 NO:21 NO20) NO:22; acTcCGCGTAGGGGIa | RSDHLSR RSDNLTT RSDDLTR DSSDRKK cageoegeegge (SEQ ID (SEQ ID (SEG ID (SEQID (SEQD 11753 | NO NO:24 NO:25) NO:26) NO27) acTcCGOGTAGGGGI | RSDHLSE | RNDNRKN | RSDDLTR | DSSDRK! cagecegecage (SEQ ID (SEQID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID 11754 | NO:23) NO:29) NO30) NO:26) NO27) agccecacrecAGece | DRSDLSR OSSDLTR RSDHLSE TSSTRKT gotagoggegae (SEG ID (SEQ ID (SEQID (SEQ1D (SEQ ID 11755 | NO31 NOZ21 NO:32 0:29 NO:33; agccGCAGIGCAGCCOS | DRSDLSR | QOSSDLTR | RSDALSE | RSSTRKE & gotageggcage (SEQ ID (SEQID (SEQ ID (SEQID (SEQ ID 11756 | NOS1 NO21) NO:32 NO:29) NO:35) COTÇAGGTACTCCGOgt | R$DTLS ARSTRIN | OSSHCIR | OSADRTK .: agogatacago (SEQ ID (SEQID (SEQ ID (SEQ !D (SEQ ID NO:38) NO:3 9:38 —NO:39) NO:40) gccoGETaSCOGCEGE: | REDDLTR | RSDDLTR RSOTLSA | RNQDRKT gecctactacge (SEQ ID (SEQ ID (SEG ID (SEQ ID (SEQ ID 11758 | NO41 NO:26 NO:26) —NO:42) 0:43) geACTGCGGCTGCCIa | DRSDLSR | OSSDLRR | RSDDLTR | QSSDLTR gatacicageg (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID 11759 | NO NO21 NO45) NO 26) NO:32 cgcoGoeTATCCSCA9 | DRSHLSR | RSDALAR | OSSHLTR | RSDDRKT cogagegecata (SEQ ID (SEQ ID (SEO ID (SEQ ID (SEQID 11760 | NO:46) NO:47 NO:48) NO:39) 0:49) egccGEGTATGGGCARS | GSGSLTR | RSDHLTT | QSSHLTR | RSDDRKT cegagegeçato (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ1D 11761 | NO:46) NO:1 NO:51 NO:39) NO:49) gecGGETGTGGGCAÇe | ASGSLTR | RSDHLTT | RSOSLLR | RSDNLRE cgagegecatat (SEQ ID (SEQID (SEQID (SEQ ID (SEQ ID 62 | NO:S2' NO:1 NO:51 NO:53) NO:13 agrAGGGCGCCGCCge | RSDNLTT DRSDLSR DRSHLTR RSDNLTT cagegagetaea (SEQ ID (SEQ ID (SEQID (SEQ ID 11763 | NÓ:54) NOZ25) NOZ1 NO:12 tTGGGCAGCCGAGEg | RSONLAR | DRSDLSR | OSGSLIR | RSDHLTT ccataticcage (SEQID (SEQ ID (SEQID (SEQID (SEQ ID 11766 IO: NO:56 NO21 NO:17) NO:51 taT AGCCGAGEg | RSDNLSR DNSTRKT | QSGSLTR RSDHLTT ccatottecage (SEQ ID (SEQID (SEQID (SEQID (SEQID 11767 | NO:55 NO:58) NO:59) | NOIZ NO:51 caGC CTAGTAGGGOCES DRSHLTR | RSDNLTT | RSONLST | RSADLSR egocgeragegg (SEQ 1 (SEQID (SEQID (SEQ ID (SEQID 11768 | NO:60) NO 12) NO25 NO-61 NO:62 coGCGTAGIAGÉGCEC RSDDLTR | RSDHLTO | RSONLST | RSADLSR cgcegecagega (SEQ ID (SEQ ID (SEQID (SEQID (SEQID 11769 | NO:SO NR NO:28) NO:18) NO:61 NO:62 caGCCGCTCCGGÇAÃAC | QOSGSLTR | RSDDRKT | QGSSDLSR | DRSDLSR agtactaceage (SEQ ID (SEQ ID (SEQID (SEQID (SEQID 11770 | NO:64' NOA7) NO49 NO:65 NO:21

- acATGGCGCTCGGCTA | GSSDLSR | RNDDRKK | RSDDLTR | RSDALTO Eecacacecage (SEQ (D (SEQ ID (SEQID (SEQ ID (SEQID 11771 | NO:66) NO:65 NO6 NO:26) NO68 - IgGCAGCCCAGGGTcte | OSSHLTR | RSDNLRE | DRSDLSR | OSSDLTR asceccatage (SEQ 1D (SEQ ID (SEQID (SEQ ID (SEQID 11772 | NO:69) NO:39 NO:13) NO:21 NO32Z caGCTGCTGCTGCTAt | OSSDLSR | OSSDLRR QOSSDLSR OSSDLRR geatcagaget (SEG ID (SEQ ID (SEQD (SEQID (SEQID NO:70). —— O:65) NO45) NO:65) NO45) - CGCCCAGCTACCGcac | RSDSLSA DNSNRIK RSDNLSE ASKTRKN caacecetata (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQGID (SEQID 11774 | NO:28 NO:34 NO:50) NO: NO63 ' trGTACTGGTAGAGICe | RSDNLAR QOSGSLTR RSDVLSE QOSGSLTR acocatageca (SEQ ID (SEG ID (SEQID (SEGID (SEQID 1775 | NO:71 NO:56: NO1 NO: 14! NO1 tGTACTGGTAGAGIS | RSONLAR | QSGSLTR | RSDALSN | TSSARTT acecatagess (SEQ ID (SEQID (SEQÍD (SEG D (SEQGID 11776 | NO:71 10:56 o:1 NO:72 10:73) ascCCCTGIGGCGTCKe | DRSALSR | DRSHLAR | RSDTLSA | DRSTRITT coctaceatte (SEQ ID (SEQID (SEQID (SEGID (SEQID 11717 | NO:74) NO7S) NO<76) NO:42 NO" gtGCGGTAGCTGGECa | RSDHLSR | OSSDLRR OSGALAR RSDDLTR getagtadogt (SEQ ID (SEQ ID (SEQID (SEQD (SEQID - 11778 | NO:78) NO2A4 NO 4 NO:78: NO26 gtGCGGTAGCTGGGca | RSDHLST HSDTRKK QOSGALAR RSDDLTR gctagtaciagt (SEQ ID (SEQ ID (SEQ1D (SEQ IO (SEQID bp 7719 |NO78) | NOSSO NO:81 NO:79; NoZ26) | agGCGEGGGCTTGACÇEA | RSDSLSV QNQHRIN RSDHLSR RSDDLTR agttagaagesa (SEQ ID (SEQ1D (SEG ID (SEQ ID (SEQID 11780 | NO:62) NO:83 0:84 0:24 NO:26 BAATGGAAAAAACÇGcia | RSDDLSK | RNDHRKN | QGRSNLVR | RSDALTO asettetgtot (SEQ ID (SEQID (SEQD (SEG ID (SEQID 11781 | NO:85 NO;86: NO:8 NO:88 NO-68 UGT ACGoga | RSDTLSO | ONATRIN | RSDALSR | RSDALAR grratactcas (SEQ ID (SEQ1O (SEQ ID (SEG ID (SEQID 1 NO:89: NO:80 NO:S1 NO:92 NO:48) — JuGTGGTGCCAACGaga | REDTLSQ OQKATRIT RSDALSR RSDALAR gecatacicas (SEQ ID (SEGID (SEQID (SEQID (SEQID 11783 | NOS9) NO:80: NO:93) NO:92 NO:48 BOGTGGTGcCAACGGAa | RSDHLSE | QNANRKT RSDALSR RSDALAR gecatacicac (SEQ ID (SEGID (SEQ ID (SEQ ID (SEQID | 11784 | NOSSO NQO:29! NO:94 NO:S2 NO:48) T CaATCACGCCGGTAÇe | QSGALAR | RSDDRKT | RSDTLSO | DSSARKK a dee ES TES ESTES 11785 | NOS) - NO:78; NO 49) NOBO) NO:98) Será evidente que ZFNs podem ser prontamente inseridas em par- tes principais de C2H2 ou C3H e que uma variedade de sequências pode ser usada para unir a proteína de dedo de zinco e o domínio de clivagem.

Vide Pu- blicação de Patente U.S. 20080182332, particularmente Tabela 6, com relação atais sequências, referência a qual é incorporada aqui por referência na ínte- gra.

Exemplo 3: Ruptura ZFN-mediada de Zp15 em células de milho Indução de DSB por pares de ZFN foi testada.

Pares de ZFN que são capazes de produção eficiente de DSB no sítio-alvo pretendido do gene

. Zp15 endógeno foram identificados. A natureza propensa a erro de reparo DSB através de união terminal não homóloga (NHEJ), a qual é conhecida por gerar pequenas deleções/inserções de DNA no local de uma ruptura induzida por ZFN, foi utilizada para selecionar pares de ZFN os quais se ligam e clivam efici- entemente o sítio-alvo do gene Zp15 endógeno. : ZFNs foram transitoriamente expressas em células de milho cuiti- ' vadas e análise de sequência do /ocus alvo no sítio de clivagem previsto foi conduzida. Por exemplo, um plasmídeo pDAB7468 que codifica o par de ZFN tt 25 (11768/11766 hélices de reconhecimento mostradas acima) foi distribuído viatransformação WHISKERS'Y-mediada em culturas de célula de milho Hi-!!, conforme descrito no Pedido de Patente U.S. No. 12/001.939, o qual é incorpo- rado aqui por referência na íntegra. Após 24 ou 72 horas de expressão transitó- " ria, a sequência-alvo de ZFN rompida resultante foi amplificada do DNA genô- Pr mico isolado e clonada no vetor de plasmídeo pCR2.1. O gDNA foi submetido à digestão por restrição usando a enzima Bsu36l, seguido por amplificação da sequência-alvo de Zp15 e clonagem dos produtos de PCR no vetor de plasmí- deo pCR2.1. Colônias individuais do produto da amplificação clonado foram analisadas por meio de digestões por restrição do DNA de plasmídeo, seguido por eletroforese em gel de agarose (produtos da amplificação clonados que mostraram resistência à clivagem pela enzima de restrição Bsu361 foram consi- derados como contendo mutações que destroem o sítio de restrição associado ao sítio de clivagem de ZFN).

Análise de sequência direta de 192 clones revelou uma inserção de 6 bp (Figura 1). Em outro exemplo, o plasmídeo pDAB7467 que codifica o par dezZFNH24(11753/11750 hélices de reconhecimento mostradas acima) foi distribuído diretamente em culturas de célula de milho e, após 24 ou 72 horas de expressão transitória, a sequência-alvo de ZFN foi amplificada e clonada no vetor de plasmídeo pCR2.1. Análise de sequência direta de 192 clones revelou uma deleção de 3 bp (Figura 2) no sítio de clivagem preciso. A inserção e dele- çãodescritas aqui são o início de reparo NHEJ de um DSB induzido no sítio- alvo e indica que as ZFNs 24 e 25 têm atividade de clivagem no focus de 2p15 endógeno em células de milho.

í O mesmo processo foi realizado usando ZFN 25 ou 28, mas antes de triagem de colônias através de digestão com enzima de restrição, 192 clo- nes independentes foram diretamente sequenciados.

Uma inserção de 6 bp foi detectada (Figura 2, superior). " 5 Tomados juntos, esses dados demonstram que uma exposição transitória a ZFNs é insuficiente para induzir a um DSB objetivado no locus de Í Zp15 em células de milho cultivadas.

Exemplo 4: Integração Objetivada no locus de Zp15 De forma a testar se ZFNs projetadas com atividade em Zp15 pode- riamacionara integração de sequências exógenas, foram construídas molécu- las de DNA doadoras trazendo um cassete gênico autônomo que codifica um ' gene de resistência a herbicida exógeno exemplificativo, AAD-1 de Sphingomo- nas herbicidovorans (ATCC 700291). AAD-1 codifica a enzima dioxigenase de í arilóxi alcanoato e confere resistência a herbicidas de ariloxifenóxi propionato (Patentes Internacionais WO 2005/107437, WO2008141154 A2). Aqueles ver- sados no campo apreciarão que outros ácidos nucleicos exógenos poderiam ser similarmente incorporados em moléculas doadoras de DNA incluindo, mas não limitado a, outros genes de tolerância a herbicida, tal como o gene AAD-12 relacionado.

Nesse doador de gene de tolerância a herbicida, a sequência pro- motora é derivada de actina de O. sativa (números de acesso ao GenBank S44221 e X63830) e sequências terminadoras são derivadas de lipase de Z. mays (Número de Acesso ao GenBank L35913). A.

Construção de Molécula de DNA Doadora Construtos doadores contendo regiões de homologia ao Zp15 fo- —ramgerados como segue.

Uma parte principal de plasmídeo contendo flancos de homologia para o gene Zp15 foi manipulada para permitir a integração de qualquer sequência de DNA doadora no sítio-alvo correspondente do gene Zp15. A parte principal de plasmídeo exemplificada aqui se originou com o vetor de plasmídeo de base fagemídeo pBC SK(-) (3,4 kbp) (Stratagene, La Jolla, CA). Houveram quatro etapas nesse processo.

Primeiro, o plasmídeo de base foi preparado linearizando 3 ug de pPBC SK(-) usando as endonucleases de restrição Spe | e Sal | (New England

Á Biolabs, Beverly, MA). O vetor de subclonagem de 3,3 kbp digerido com Spe . VSal |, pBC SK(-), foi excisado em gel e purificado de acordo com as orienta- ções do fabricante usando o kit QIAQUICK Gel Extraction (QIAGEN Inc., Valen- cia, CA). " 5 Segundo, os flancos de 5'- & 3'-homologia foram isolados do Zp15 usando os seguintes iniciadores de oligonucleotídeo, que foram sintetizados | pela Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA): Zp15HRPoador Noti(205)F: 5*- GCGGCCGCATGCAAGAGCTGTTGATC -3' (SEQ 1D NO:97) Zp15HRDoador Mfel(1025)R: 5*- CAATTGCCGGCGTAGTAGGECGCOGCCOGCÇAGE -3* (SEQ ID NO:98) Zp1 5SHRDoador Mfel(1025)F: 5*- f CAATTGGTGTGGGCAGCCGAGCGCCATGTTCCAG - 3” (SEQ ID NO:99) Zp1SHRDoador Sall(2270)R 5º - í GTCGACCGATACTGATGCGGACCGTCCACCTTGTC - 3' (SEQ ID NO: 100).

Reações de amplificação por PCR foram realizadas usando reagen- tes fornecidos com o kit LA TAQ PCR (TaKaRa Biotechnology Inc. Otsu, Shiga, Japão). O coquetel de reação de PCR consistia em: 5 ul. de 10X Tampão LA PCRTY || (Mg2*), 20 ng de molde de fita dupla (DNA genômico de milho Hi-1!), 10 pmo!l de iniciador de oligonucleotídeo para a frente, 10 pmol de iniciador de oligonucleotídeo reverso, 8 ul. de mistura de dNTP (2,5 mM cada dNTP), 33,5 ul de H2O, 0,5 uL (2,5 unidades) de DNA Polimerase TaKaRa LA Taq'T", 1 gota de óleo mineral Os iniciadores Zp15HRDoadorNotl(205)F e Zp15HRDoadorMfel(1025)R foram usados para uma reação e os iniciadores Zp15HRDoadorMfel(1025)F e Zp15HRDoadorSali(2270)R foram usados para a segunda reação. Reações de PCR foram realizadas usando um Perkin-Elmer Cetus, 48-Sample DNA Thermal Cycler (Norwalk, CT) sob as seguintes condi- ções de ciclo: 94ºC,4 min/1 ciclo; 98ºC, 20 seg, 65ºC, 1 min, 68ºC, 1 min/30 ciclos; 72ºC, 5 min/1 ciclo; 4º C/manutenção.

Quinze (15) nu! de cada reação de PCR foram submetidos à eletro- poração e os fragmentos amplificados foram visualizados com luz UV e os ta- manhos de fragmento estimados por meio de comparação com "ladder" de —DNAde1kbp.Clones de plasmídeo esperados foram diagnosticados pela pre-

' sença de fragmentos de DNA de 825 bp para o 5'-fragmento ou 1.250 bp para o E 3"-fragmento. Esses fragmentos foram excisados em gel e purificados de acor- do com as orientações do fabricante usando o kit QIAquick Gel Extraction (QIAGEN Inc., Valencia, CA). Fragmentos purificados foram, então, clonados - 5 noplasmídeopCR2.1 usando o kit TOPO TA CLONINGPQ e transformados em células de E. coli quimicamente competentes ONE SHOTO TOP 10 (Invitrogen Í Life Technologies, Carisbad, CA) de acordo com o protocolo do fabricante.

Colônias individuais contendo o fragmento 5' de 825 bp ou o fragmento 3' de 1.250 bp foram identificadas e confirmadas via digestão com enzima de restrição e dados de sequenciamento. Colônias contendo o fragmento 5' de 825 bp foram confirmadas via uma digestão com enzima de R restrição Mfe | e Not | (New England Biolabs, Beverly, MA). Colônias contendo o fragmento 3' de 1.250 bp foram identificadas e confirmadas via digestão com f enzima de restrição usando Sa/| (New England Biolabs, Beverly, MA). Clones deplasmídeo esperados foram diagnosticados pela presença de fragmentos de DNA inseridos de 825 bp (5-fragmento) ou 1.250 bp (3'-fragmento), além do vetor pCRO2.1 de 3,9 kbp. Reações de sequenciamento de fita dupla dos clo- nes de plasmídeo foram realizadas conforme descrito pelo fabricante usando o kit CEQTY DTCS-Quick Start (Beckman-Coulter, Palo Alto, CA). As reações fo- ram purificadas usando Performa DTR Gel Filtration Cartridges (Edge BioSys- tems, Gaithersburg, MD), conforme descrito pelos protocolos do fabricante. Re- ações de sequência foram analisadas sobre um Beckman-Coulter CEQT”M 2000 XL DNA Analysis System e caracterização de nucleotídeo realizada usando um SEQUENCHER'Y versão 4.1.4 (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI). As sequências de fragmentos de 5'- e 3-homologia de Zp15 são indicadas em SEQ ID NO: 127 e SEQ ID NO: 128.

Terceiro, o flanco de 3'-homologia foi ligado no plasmídeo de base, como segue. Clones que continham a sequência do flanco de 3'-homologia cor- reta foram digeridos com enzimas de restrição e um fragmento de DNA foi exci- sadoem gele purificado usando o kit QIAquick Gel Extraction (QIAGEN Inc., Valencia, CA). Esses fragmentos foram ligados em um plasmídeo de base puri- ficado, previamente digerido com Spe 1/Sal | (vide acima), em uma proporção

à de vetor:inserto de 1:5 usando 500 unidades de DNA Ligase T4 (Invitrogen Life r Technologies, Carlsbad, CA) em um volume de reação de 20 uL sob condições de incubação de 16 horas em um banho de água a 16ºC.

Cinco (5) uL da rea- ção de ligação foram subsequentemente transformados em células de E. coli " 5 quimicamente competentes One SHOTG Top 10 (Invitrogen Life Technologies, Carilsbad, CA) e colocados sobre meios contendo seleção por antibiótico.

Colô- Í nias putativas foram isoladas e digeridas com as enzimas de restrição Spe | e Sal | (New England Biolabs, Beverly, MA) para identificar clones os quais conti- nham o fragmento 3' ligado.

Quarto, o flanco de 5"-homologia foi ligado no plasmídeo contendo o flanco de 3'-homologia.

O plasmídeo contendo o flanco de 3'- homologia, des- . crito na etapa três acima, foi digerido com endonucleases de restrição Mfe | e Not | (New England Biolabs, Beverly, MA) durante 1 hora a 37ºC.

O plasmídeo í digerido com Not !/ Mfe | contendo o flanco de 3' -homologia foi excisado em ge! epurificado de acordo com as orientações do fabricante usando o kit QIAquick Gel Extraction (QIAGEN Inc., Valencia, CA). Fragmentos isolados do doador de flanco de 5'-homologia gerados através de digestão com enzima de restrição usando as enzimas de restrição Mfe | e Not 1 foram produzidos e ligados com o plasmídeo contendo o flanco de 3'-homologiaem uma reação de ligação de 20 ul usando uma proporção de vetor:inserto de 1:5 e 500 unidades de DNA Ligase T4 (Invitrogen Life Techno- logies, Carlsbad, CA). As reações de ligação foram incubadas durante 16 horas em um banho de água a 16ºC.

Após a ligação, 5 uL da reação de ligação foram transformados em células DH5a'"" Quimicamente Competentes MAX EFFICIENCYO (Invitrogen Life Technologies, Carisbad, CA), conforme as recomendações do fabricante.

Colônias individuais foram selecionadas e DNA de plasmídeo foi isolado e dige- rido com a enzima de restrição Not | (New England Biolabs, Beverly, MA) para identificar plasmídeos os quais continham um fragmento integrado do doador do flanco de 5'-homologia.

Ao plasmídeo resultante foi fornecido o nome PDAB7489 (Figura 3). Um cassete de expressão de gene de tolerância a herbicida com-

] preendendo uma unidade transcricional de planta (PTU) contendo promotor, - gene de tolerância a herbicida e sequências de término de poliadenilação (poli- A) foi construído.

A sequência promotora é derivada de actina 1 de O. sativa (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2, 163-171; Acesso ao GenBank S44221 e A- : 5 cessoao GenBank X63830). O gene de tolerância a herbicida compreendia o gene AAD-1 (dioxigenase de arilóxi alcanoato), o qual confere resistência a h herbicidas de ariloxifenóxi propionato (WO 2005/107437). A versão do gene utilizada foi a versão f3, a qual inclui uma sequência códon-otimizada para ex- pressão em plantas.

As sequências terminadoras são derivadas de lipase de Z. mays(clonedecDNA de lipase de milho com Número de Acesso ao GenBank L35913). Essa sequência de milho compreende a região não traduzida 3'/região de término de transcrição para o gene AAD-71. O cassete de expressão de gene de tolerância a herbicida é mostrado na Figura 4. - Para gerar esse cassete, os seguintes iniciadores de oligonucleoti- deoforam sintetizados pela Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, LA) sob condições de dessalinização padrão e diluídos com água para uma concen- tração de 0,125 ug/uL: OsActAadlv.3ZmLipMÍíeIF 5' -CAATTGGTCATTCATATGCTTGAGAAGAG — 3" (SEQ TD NO:101) OsActAadIiv.3ZmLipMfelIR 5º - CAATTGAGCACTTAAAGATCTTITAGAAG — 3' (SEQ ID NO:102) Reações de amplificação por PCR foram realizadas usando o kit LA TAQ PCR (TaKaRa Biotechnology Inc., Otsu, Shiga,, Japão). O coquetel de reaçãode PCR compreendia: 5 ul. de 10X Tampão LA PCRTY |! (Mg2*), 20 ng de molde de fita dupla (DNA de plasmídeo pDAB3878), 10 pmo!l de iniciador de oligonucleotídeo para a frente, 10 pmol de iniciador de oligonucleotídeo reverso, 8 ul de mistura de dNTP (2,5 mM cada), 33,5 ul. de HO, 0,5 uL (2,5 unidades) de DNA Polimerase TaKaRa LA Taq'"“, 1 gota de óleo mineral.

As reações de PCRforam realizadas usando um Perkin-Elmer Cetus, 48-Sample DNA Ther- mal Cycler (Nonwalk, CT) sob as seguintes condições de ciclo: 94ºC, 4 min/1 ciclo; 98ºC, 20 seg, 55ºC, 1 min, 68ºC, 3 min/30 ciclos; 72ºC, 5 min/1 ciclo; 4ºC/manutenção.

Quinze (15) py! de cada reação de PCR foram submetidos à eletroforese a 100 V durante 1 hora em géis de agarose TAE a 1,0% suplemen-

' tados com brometo de etídio a 0,5%. Fragmentos amplificados foram visualiza- p dos com luz UV e o tamanho do fragmento estimado por meio de comparação com o "ladder" de DNA de 1 kbp. Produtos de PCR esperados foram diagnosticados pela presença . 5 deumfragmentode DNA de 2,7 kbp (AAD-1 PTU). Esse fragmento foi excisado em gel e purificado de acordo com as orientações do fabricante usando o kit ] QIAquick Gel Extraction (QIAGEN Inc., Valencia, CA). Fragmentos purificados foram, então, clonados no plasmídeo pCR2.1 usando o kit TOPO TA Cloningê& (com o vetor pCRG2.1) e células de E. coli quimicamente competentes One Shot& TOP 10 (Invitrogen Life Technologies, Carisbad, CA) de acordo com o protocolo do fabricante. ' Colônias individuais foram selecionadas, DNA de plasmídeo foi iso- ' lado e digerido com a enzima de restrição Mfe | (New England Biolabs, Beverly, R MA). Clones de plasmídeo esperados foram diagnosticados pela presença de um fragmento de DNA inserido de 2.674 bp (AAD-1 PTU), além do vetor p- CRO?2.1 de 3,9 kbp. Reações de sequenciamento de fita dupla de clones de plasmídeo foram realizadas conforme descrito pelo fabricante usando o kit CEQTY” DTCS-Quick Start (Beckman-Coulter, Palo Alto, CA). As reações foram purificadas usando Performa DTR Gel Filtration Cartridges (Edge BioSystems, Gaithersburg, MD), conforme descrito pelos protocolos do fabricante. Reações de sequência foram analisadas sobre um Beckman-Coulter CEQTM 2000 XL DNA Analysis System e caracterização de nucleotídeo realizada usando o SEQUENCHER versão 4.1.4 (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI). O fragmento restrito de um clone que continha a sequência de

2.674 bpcorretafoiexcisado em gel e purificado de acordo com as orientações do fabricante usando o kit QIAquick Gel Extraction (QIAGEN Inc., Valencia, CA). Esse fragmento foi, então, combinado em uma reação de ligação com PDAB7488 purificado (parte principal de plasmídeo) o qual tinha sido digerido com a enzima de restrição Mfe | e subsequentemente desfosforilado. Ligação foirealizada sob as seguintes condições: proporção de vetor:inserto de 1:5 e 500 unidades de DNA Ligase T4 (Invitrogen Life Technologies, Carisbad, CA) em um volume de reação de 20 uL sob condições de 16 horas de incubação em

. um banho de água a 16ºC. Cinco (5) ul. da reação de ligação foram subsequen- . temente transformados em células E. coliMAX EFFICIENCY6& DH5aTY quimi- camente competentes (Invitrogen Life Technologies, Carisbad, CA) e colocados em lâminas sob condições de seleção descritas pelo fabricante. v 5 Colônias individuais foram selecionadas, DNA de plasmídeo foi iso- lado e digerido com a enzima de restrição Mfe | (New England Biolabs, Beverly, f MA). Os clones de plasmídeo esperados continham fragmentos de DNA de

2.674 bp (AAD-1 PTU) e 5.413bp (vetor pDAB7489). O plasmídeo resultante foi denominado pDAB7490 (Figura 5).

Culturas de célula embriogênica da variedade de milho Hi-ll (Arms- trong et al (1991) Maize Genet Crop Newsletter 65: 92-93) foram geradas, man- tidas e submetidas à simultânea transformação de plasmídeos que codificam À ZFN24 e a molécula doadora pDAB74290. A transformação e seleção de tecido : de caule e subsequente regeneração de transformantes são descritas no Pedi- dode Patente U.S. No. 12/001.939, referência a qual! é incorporada aqui por referência na íntegra. Para orientação adicional com relação a protocolos de transformação e seleção vide Petolino et al. (2000) Plant Cell Rept. 19: 781-

786. Após antese, as plantas foram autopolinizadas ou cruzadas com a varie- dade de milho DASSXH751. Semente de prole resultante foi colhida e seca. A regeneração de caule em plantas de milho férteis intactas é descrita no Pedido de Patente U.S. No. 12/001.939, particularmente Exemplo 22, referência a qual é aqui incorporada por referência na íntegra.

B. integração objetivada do cassete do gene AAD-1 no locus de Zp15 Dos eventos tolerantes a herbicida contendo uma molécula de DNA — doadora integrada que codifica um cassete gênico de tolerância a herbicida, espera-se que alguma proporção dos referidos eventos seja o produto de inte- gração objetivada de DNA doador no sítio de ruptura de fita dupla induzida por ZFN. De forma a diferenciar esses eventos de integração objetivada daqueles derivados de integração aleatória do cassete gênico de tolerância a herbicida, umaestratégiade genotipificação baseada em PCR usando uma combinação de iniciadores de PCR genoma-específicos e subsequentemente genoma- específicos mais doador-específicos foi utilizada.

f Genotipificação diferencial de integração objetivada versus aleatória do transgene AAD-1 em todos os eventos transformados tolerantes a herbicida foi realizada usando ensaios de PCR específicos ao locus de Zp15 e ao gene

AAD-1. Nos exemplos apresentados aqui, todos os iniciadores de oligonucleotíi-

G 5 deoforam sintetizados pela Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, LA) sob condições de dessalinização padrão e diluídos com água até uma concen-

í tração de 100 uM.

O conjunto a seguir de iniciadores de oligonucleotídeo para a frente e reverso foi projetado para se anelar a sequências de gDNA específicas para o gene Zp15 alvo que reside fora dos limites das sequências de DNA doa-

doras:

HB501E 5º- AAGGTCCCAAATCTGAGGÇATACÇTGTTGCOT -3' (SEQ ID NO:103) HB502r: 5": GAGGTCCTATGCTTTGTCTATAGTCGGCAG -3* (SEQ ID NO:104) : Um segundo conjunto de iniciadores de oligonucleotídeo para a . frente e reverso foi também criado para se anelar à sequência de gDNA especí- fica para o gene-alvo Zp15 fora dos limites das sequências doadoras de DNA, ainda que agrupadas dentro do primeiro par: HB503 f5'- GGCATACTGTTIGCTGCCCTGCTGGAAÁ -3' (SEQ ID NO:105) HB504r 5'- GACACCTATAATCGATGTAGAGCCGAAGAG -3* (SEQ ID NO:106)

Iniciadores de oligonucleotídeo para a frente e reverso foram adi- cionalmente criados para se anelar especificamente ao DNA doador correspon- dendo à região de codificação do gene de tolerância a herbicida AAD-1:

HB505f 5*- AGICCACCCCAGTGATCTCAGCACCA -3º (SEQ ID NO:107) HB506f 5*- AGIGGCTGGACAGCTATTCTCTCAAAGCGT -3' (SEQ ID NO:108) HB507r 5": ACGCTTTGAGAGAATAGCTGTCCAGCCACT -3* (SEQ ID NO:109) HB508r S*- TEGTGCTGAGATCACTGGGGTGGACT -3' (SEQ ID NO:110) Duas reações de amplificação primária distintas foram realizadas u- tilizando iniciadores que se ligam à região genômica de Zp15 e à molécula doa-

dora,dando origem a um amplicon que abrange o limite de integração entre o genoma e o doador.

A primeira reação se focalizou sobre o limite 5'- entre o genoma e o doador e usou o conjunto de iniciadores HB501f e HB507r.

A se- gunda reação se focalizou sobre o limite 3'- entre o doador e o genoma e usou í o conjunto de iniciadores HB505f e HB502r. DNA genômico foi isolado dos e- . ventos de milho Hi-ll transformados. Reações de amplificação por PCR primária foram realizadas usando reagentes fornecidos com o kit LA TAQ PCR (TaKaRa Biotechnology Inc., Otsu, Shiga, Japão). O coquetel de reação de PCR consis- tiaem:2,5u4lde 10X Tampão La Taq PCR'TY, 40-200 ng de molde de DNA ge- nômico fita dupla, iniciador de oligonucleotídeo para a frente a 10 uM, iniciador Í de oligonucleotídeo reverso a 10 uM, 2 ul de mistura de dNTP (2,5 mM cada), 16,25 pu! de HO, 0,25 ul (1,25 unidades) de DNA polimerase LA TaqT"., Asrea- ções de PCR foram realizadas usando um Bio-Rad, 96-Sample DNA Engine Tetrad2,Peltier Thermal Cycler (Hercules, CA) sob as seguintes condições de ciclo: 94ºC, 2 min/1 ciclo; 94ºC, 30 seg, 62ºC, 30 seg, 68ºC, 5 min/30 ciclos; Y' 4º Cimanutenção.

: Os produtos da reação de PCR primária foram subsequentemente h diluídos a 1:100 em H2O e usados como molde de DNA para duas reações de PCRsecundárias distintas. As reações secundárias também utilizam iniciadores que se ligam na região genômica de Zp15 e à molécula doadora, dando origem a um amplicon que abrange o limite de integração entre o genoma e o doador. Aidentidade dos iniciadores específicos determina se a amplificação está foca- lizada sobre o limite 5'- ou 3'- entre o genoma e o doador. A primeira reação se focalizousobre o limite 5'- entre o genoma e o doador e usou o conjunto de ini- ciadores HB503f e HB508r. A segunda reação se focalizou sobre o limite 3'- entre o doador e o genoma e usou o conjunto de iniciadores HB506f e HB504r. Ambas as reações consistiam no seguinte: 2,5 ul de 10X Tampão La Taq PCRTY”, 1 ul de molde [diluição a 1:50 da 1º Reação de PCR], iniciador de oli- —gonucleotídeo para a frente a 10 uM, iniciador de oligonucleotídeo reverso a 10 uM, 2 ul de mistura de dNTP (2,5 mM cada), 16,25 ul de H2O, 0,25 ul (1,25 uni- dades) de DNA polimerase LA Tag'"Y. As reações de PCR foram realizadas u- sando um Bio-Rad, 96-Sample DNA Engine Tetrad2, Peltier Thermal Cycler (Hercules, CA) sob as seguintes condições de ciclo: 94ºC, 2 min/1 ciclo; 94ºC, O seg,62ºC,30seg,68ºC,5 min/30 ciclos; 4º C/manutenção. Fragmentos de am- plificação por PCR esperados de 2.180 bp para o limite 5'- ou 2.980 bp para o limite 3'- foram observados.

Á Esses fragmentos foram excisados em gel e purificados de acordo . com as orientações do fabricante usando o kit QIAquick Gel Extraction (QIAGEN Inc., Valencia, CA). Fragmentos purificados foram subsequentemente clonados no plasmídeo pCR2.1 usando o kit TOPO TA CLONINGO (com o ve- Y 5 tor pcRO2.1) e células de E. coli quimicamente competentes ONE SHOTO TOP 10 (Invitrogen Life Technologies, Carisbad, CA) de acordo com o protocolo Í do fabricante. Clones individuais foram selecionados, DNA de plasmídeo foi isola- do e digerido com a enzima de restrição Eco RI (New England Biolabs, Beverly, MA).Clones de plasmídeo esperados foram diagnosticados pela presença dos fragmentos de DNA inseridos de tamanho apropriado, além do vetor pCRO2.1 ' de 3,9 kbp. y Reações de sequenciamento de fita dupla dos clones de plasmídeo í foram realizadas e caracterização e alinhamento de nucleotídeo foram realiza- dosusandoo SEQUENCHERT"” versão 4.1.4 (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI).

Dados de sequência selecionados derivados de um evento de inte- gração objetivado (evento ft147) do cassete gênico doador de AAD-71 inserido no gene alvo Zp15 são mostrados no alinhamento da Figura 6.

Produtos de PCR cuja amplificação primária se focalizou sobre o limite 5' ou 3' entre o genoma e o doador foram submetidos à amplificação se- cundária também focalizada sobre o limite 5'- ou 3'- entre o genoma e o doador. Alinhamento de fragmentos clonados correspondendo a esses produtos de am- plificação secundária com a sequência genômica de Zp15 do tipo silvestre, bem comoasequência esperada de um evento de integração objetivada, indica cla- ramente que a integração precisa de DNA doador no sítio-alvo ocorreu. A se- quência de nucleotídeo do /ocus genômico de Zp15, do limite genoma/doador, sequência de nucleotídeo das regiões doadoras correspondendo a flancos de homologia ao Zp15 e a sequência de nucleotídeo do cassete de tolerância a —herbicidaforam todas preservadas em múltiplos produtos de PCR clonados de- rivados desse evento. Portanto, esse evento representa um genoma no qual o reparo homologia-acionado de uma ruptura de fita dupla mediada por ZFN e

] integração objetivada de um DNA doador em um alvo gênico específico ocorre- - ram. Na Figura 6, foram mostrados dados de alinhamento de sequência deriva- dos de um único caule de milho transformado isolado representativo (evento 4147). Y 5 Eventos transformados adicionais que representam ocorrências de integração objetivada únicas foram obtidos, demonstrando que os métodos en- Í sinados aqui são reproduzíveis em caule de milho. Exemplo 5: Integração objetivada de PAT no locus de Zp15 Como uma outra exemplificação de métodos para integração objeti- vadade polinucleotídeos exógenos selecionados em /loci objetivados divulga- dos aqui, moléculas de DNA doadoras adicionais trazendo um cassete gênico ' autônomo que codifica PAT foram criadas e construídas para testar a integra- % ção de uma sequência doadora exógena dentro do lócus-alvo de Zp15 endóge- n no. ZFNs com atividade de clivagem específica do gene alvo Zp15 endógeno foramempregadas para criar um DSB nesse locus. Moléculas de DNA doado- ras trazendo um cassete gênico autônomo que codifica PAT de Streptomyces viridochromogenes e sequências de flanqueamento homólogas ao Zp15 foram subsequentemente integradas no DSB induzido por ZFN do alvo Zp15. O PAT codifica a enzima acetil transferase de fosfinotricina e confere resistência ao composto herbicida fosfinotricina (PPT) através de acetilação (Patente U.S. No.

5.633.434). a fosfinotricina é o ingrediente ativo dos herbicidas LIBERTY, BASTA e IGNITE. A sequência de codificação de PAT foi construída como uma unidade de transcrição de planta (Plant Transcription Unit - PTU) e continha uma sequência promotora derivada de actina de O. sativa (números de acesso aoGenBankS44221eX63830) e uma sequência terminadora derivada de lipa- se de Z. mays (número de acesso ao GenBank L35913). A. Construção de molécula de DNA doadora Um construto doador de Zp15 contendo regiões de homologia ao Zp15foi gerado sinteticamente como segue. Uma região de homologia ao Zp15 compreendendo os nucleotídeos 4595-5346 (sequência de homologia 5"; SEQ ID NO: 111) e nucleotídeos 21-796 (sequência de homologia 3'; SEQ ID NO: 112) apartir do pDAB7489 foi projetado. Essa região de homologia incluía sítios

Í de clonagem Mfe | entre os elementos 5' e 3' - homólogos e sítios de restrição . Not | nas extremidades 5' e 3. Essa sequência de DNA (SEQ ID NO: 113) foi sintetizada e inserida no plasmídeo do tipo ColE1 resistente à canamicina, pMK nos sítios de clonagem Sac | e Kpn 1 (Gene Art Ag, Regensburg, Alemanha). O - 5 — plasmídeo doador resultante foi designado pDAB104101 (Figura 7) e contém flancos de homologia para o gene Zp15 a fim de permitir a integração de qual- Í quer sequência de DNA de interesse no sítio-alvo correspondente do gene Zp15. Um cassete de expressão de gene de tolerância a herbicida com- preendendo um promotor contento PTU completo, gene de tolerância a herbici- da e sequências de término de poliadenilação (poliA) foi construído.

A sequên- cia do promotor é derivada de actina 1 de O. - sativa (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2: 163-171). Acesso ao GenBank 1 S44221 e Acesso ao GenBank X63830). O gene de tolerância a herbicida era o PAT.As sequências terminadoras são derivadas de lipase de Z. mays (clone de CDNA de lipase de milho com Número de Acesso ao GenBank 135913). Essa sequência de milho compreende a região de término de transcrição/região não traduzida 3' para o gene PAT.

O cassete de expressão de gene PAT de tole- rância a herbicida é mostrado na Figura 8. O cassete do gene PAT foi amplifcado de um plasmídeo PDAB102256 através de PCR usando iniciadores sintetizados pela Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA): DC00t 5º - CCAGTIGCAATTGGGTCATICATATGCTTGAGAAG — 3' (SEQID NO:114) DC002 5º - CCAGTGCAATTGAATICAGCACTTAAAGATCTTTAG - 3º (SEQ ID NO:115) Reações de amplificação por PCR foram realizadas usando DNA Polimerase PHUSIONTY (New England Biolabs, Beverly, MA) sob as seguintes condições de ciclo: 98ºC, 30 seg/1 ciclo; 98ºC 10 seg, 60ºC, 20 seg, 72ºC, 45 seg/9 ciclos; 98ºC, 10 seg, 72ºC, 60 seg/24 ciclos; 72ºC, 10 min/1 ciclo; 4ºC/manutenção.

A reação de PCR foi submetida à eletroforese em um gel de agarose TAE a 1,0%. Produtos de PCR esperados foram diagnosticados pela presença í de um fragmento de DNA de 2,3 kbp (PAT PUT). Esse fragmento foi excisado A em gel e purificado de acordo com as orientações do fabricante usando o kit QIAquick Gel Extraction (QIAGEN Inc., Valencia, CA). Fragmentos purificados foram, então, clonados no vetor pCR-Bluntll-TOPO usando o kit Zero Blunt W 5 TOPOPCR CIloninge células de E. coliquimicamente competentes One Shot& TOP 10 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) de acordo com o protocolo " do fabricante.

Colônias individuais foram selecionadas e o DNA de plasmídeo foi isolado e submetido à digestão com enzima de restrição e análise de sequên- cia.

Osinsertosde PAT clonados foram sequenciados para demonstrar a iden- tidade e fidelidade de sequência dos produtos de PCR clonados (SEQ ID NO: 116). Um de tais plasmídeos foi designado pDAB104107 (Figura 9) e foi subse- quentemente usado como a fonte do cassete do gene PAT para inserção nos ' novos vetores doadores de homologia de Zp15. O fragmento do gene PAT de 2,3 kbp foi recuperado do PDAB 104107 através de digestão com Mfe |, seguido por eletroforese em gel, excisão e purificação.

O plasmídeo doador de homologia de Zp15, PDAB 104101, foi também digerido com Mfe | e purificado em gel.Ligação do fragmento do gene PAT no pDAB104101 proporcionou clones nos quais o gene PATfoiinserido no sítio Mfe | em qualquer uma de duas orientações com rela- ção às sequências do gene Zp15, conforme determinado por meio de digestão com enzima de restrição diferencial.

O pDAB104104 (Figura 10) compreendia o gene PAT inserido na mesma orientação transcricional que o gene Zp15. O PDAB104105 (Figura 11) compreendia o gene PAT inserido na orientação o- —postacom relação ao gene Zp15. B.

Construção de molécula de DNA doadora adicional Outro construto doador contendo regiões de homologia ao Zp15foi gerado, no qual a sequência de homologia 3' de Zp15 no pDAB7489 foi altera- da por meio de truncamento, enquanto que a sequência de homologia 5' de Zp15nopDAB7489 permaneceu a mesma.

A região de homologia 3' truncada foi gerada a partir do pPDAB7489 através de PCR usando iniciadores sintetizados pela Integrated DNA Technolo-

Í gies, Inc. (Coralville, LA): J DC003 5' - CTAATCGTCGACTCGTCAAGCCCCGCCTTTAAAT — 3' (SEQID NO:117) DÇO04 5* - CTAATCCAATTGGTGTGGGCAGCOGAGCOG — 3º (SEQ ID NO:118) - Reações de amplificação por PCR foram realizadas usando DNA . Polimerase PHUSION HOT START (New England Biolabs, Beverly, MA) sobas seguintes condições de ciclo: 98ºC, 30 s/1 ciclo; 98ºC 10 seg, 72ºC, 15 seg/33 ciclos;72ºC,5min/1 ciclo; 4ºC/manutenção.

A reação de PCR foi submetida à eletroforese em um gel de agarose TAE a 1,0%. Produtos de PCR esperados foram diagnosticados pela presença de um fragmento de DNA de 0,8 kbp (homologia-3' de Zp15). Esse fragmento . foi excisado em gel e purificado de acordo com as orientações do fabricante 8 10 usandoo kit QIAquick Gel Extraction (QIAGEN Inc., Valencia, CA). Fragmentos í purificados foram, então, clonados no vetor pCR-Blunt!l-TOPO usando o Kit Ze- ro Blunt TOPO PCR Cloning e células de E. coli quimicamente competentes One Shot& TOP 10 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) de acordo com o protocolo do fabricante.

Colônias individuais foram selecionadas e submetidas a isolamento de DNA de plasmídeo e confirmação por meio de digestão com enzima de res- trição.

Insertos de homologia 3' de Zp15 foram sequenciados para demonstrar a identidade e fidelidade de sequência dos produtos de PCR clonados (SEQ ID NO: 119). Um de tais plasmídeos foi designado pDAB104106 (Figura 12) efoi subsequentemente usado como a fonte da nova sequência de homologia 3' de Zp15 para substituição no pDAB7489 a fim de criar um novo vetor doador de homologia de Zp15. PDAB7489 foi digerido sequencialmente com Mfe l e Sal le o fragmento de vetor de 4,2 kbp foi purificado em gel.

O pDAB104106 foi também digeridocom Mfele Salle o fragmento de 0,8 kbp compreendendo a sequên- cia de homologia 3' de Zp15 truncada foi purificado em gel.

Ligação e transfor- mação desses fragmentos purificados em ge! proporcionaram clones nos quais a sequência de homologia 3' de Zp15 truncada foi substituída pela sequência de homologia 3' de Zp15 original.

Esse plasmídeo foi designado pDAB104100

E (Figura 13) e foi usado como o recipiente para o gene PAT.

" O gene PAT foi removido do pDAB104107 por meio de digestão com Mfe |. Após eletroforese em gel, o fragmento gênico de PAT de 2,3 kbp foi purificado em gel. O plasmídeo doador de homologia de Zp15, pDAB104100, : 5 também foi digerido com Mfe | e purificado em gel. Ligação do gene PAT no PDAB104100 proporcionou clones nos quais o gene PAT estava inserido no Ô sítio Mfe | em qualquer uma de duas orientações com relação ao gene Zp15, conforme determinado por meio de digestão com enzima de restrição diferenci- al. O ppAB104103 (Figura 14) compreendia o gene PAT inserido na mesma orientação transcricional que o gene Zp15. O pDAB104102 (Figura 15) compre- endia o gene PAT inserido na orientação oposta com relação ao gene Zp15. C. Transformação de milho e recuperação de inserções Zp15-PAT objeti- vadas . Culturas de célula embriogênica da variedade de milho Hi-Il (Arms- trongetal(1991) Maize Genet Crop Newsletter 65: 92-93) foram geradas, man- tidas e submetidas à transformação simultânea de plasmídeos que codificam ZFN24 e molécula doadora. Moléculas doadoras incluem aquelas descritas a- qui; pPDAB104102, pD AB 104103, pD AB 104104 e pD AB 104105. A transfor- mação e seleção de tecido de caule e subsequente regeneração de transfor- mantes são descritas no Pedido de Patente U.S. No. 12/001.939, particular- mente Exemplo 19, referência a qual é aqui incorporada por referência na ínte- gra. Para orientação adicional com relação ao protocolo de transformação e seleção vide Petolino et al. (2000) Plant Cell Rept. 19: 781-786. Após antese, as plantas são autopolinizadas ou cruzadas com uma variedade de milho, tal como DAS5XH751.A semente de prole resultante pode ser colhida e seca e plantas dessas sementes podem ser analisadas para demonstrar a hereditarie- dade de eventos de integração objetivados. A regeneração de caule em plantas de milho férteis intactas é descrita no Pedido de Patente U.S. No. 12/001.939, particularmente Exemplo 22, referência a qual é aqui incorporada por referência naíntegra. D. Identificação de inserções de PAT Zp15-objetivadas Inserções de PAT Zp15-objetivadas em tecido de caule transforma-

72M75 ' do são detectadas através de PCR. Molde de DNA genômico é extraído do te- : cido de caule via métodos bem-conhecidos e comumente usados, tais como o kit Plant DNEASY (QIAGEN Inc., Valencia, CA) ou o método de Dellaporta (Del- laporta et al, (1983) Plant Mol. Biol. Rep. 1; 19-21). Uso de iniciadores específi- Lt 5 cosparaPAT em conjunto com os iniciadores de sequência de flanqueamento de Zp15 já usados para detectar integração objetivada de AAD-1 no locus de í Zp15 resulta na amplificação das junções de inserção objetivada de PAT nas regiões de homologia 5' e 3' de Zp15. Os iniciadores específicos para PAT po- dem ser: DC013 8 - CAATCGTAAGOGTTCCTAGCCOTTCOCAG — 3º (SEQTD NO:120) DC014 5º - CTGGAAGGCTAGGAACGCOTTACGATTG — 3” . (SEQ ID NQO:121) i 10 Especificamente, iniciadores HB501f ou HB503f na região genômi- ca que flanqueia o DNA doador da sequência de homologia 5' de Zp15 são u- sados em conjunto com o iniciador DC013 (SEQ ID NO: 120) na região de codi- ficação da proteína PAT para detectar junções de inserção PAT-Zp155' quando os DNAs doadores têm o gene PAT na orientação direta com relação ao gene Zp15. Da mesma forma, os iniciadores HB501f ou HB503f são usados em con- junto com o iniciador DC014 (SEQ ID NO: 121) na região de codificação da pro- teina PAT para detectar junções de inserção PAT-Zp15 5' quando os DNAs do- adores têm o gene PAT na orientação indireta com relação ao gene Zp15. Para detecção de junções de inserção PAT-Zp15 3', os iniciadores HB502r ou HB504rsão usados em conjunto com o iniciador DCO013 (SEQ ID NO: 120) para detectar junções de inserção quando os DNAs doadores têm o gene PAT na orientação indireta com relação ao gene Zp15. Da mesma forma, os iniciadores HB502r ou HB504r são usados em conjunto com o iniciador DCO014 (SEQ ID NO: 121) para detectar junções de inserção PAT-Zp15 3' quando os DNAs do- adorestêmo gene PAT na orientação direta com relação ao gene Zp15.

Reações de amplificação por PCR foram realizadas usando DNA Polimerase PHUSION HOT START (New England Biolabs, Beverly, MA) sob as seguintes condições de ciclo: 98ºC, 30 s/1 ciclo; 98ºC 10 seg, 72ºC, 15 seg/33

' ciclos; 72ºC, 5 min/1 ciclo; 4º C/manutenção.

Os produtos de PCR foram de- - compostos e identificados usando eletroforese em gel de agarose TAE.

Os ta- manhos esperados de fragmento do gel para os produtos de PCR de eventos de integração objetivada PAT - Zp15 em caule transgênico gerados usando os R 5 diferentes DNAs doadores de PAT-Zp15 são como segue: HB501f/HB503f + DC013 (5') = 2,6 kbp (pDAB104103), 2,6 kbp (PDAB 104104) Á HB501f/HB503f + DC014 (5) = 1,6 kbp (pDAB104105), 1,7 kbp (pDAB 104102) HB502r/HB504r + DC013 (3') = 3,2 kbp (PDAB104105), 3,2 kbp (pDAB 104102) HB502r/HB504r + DC014 (3') = 1,2 kbp (PDDAB104103), 1,2 kbp (PDAB 104104) Os produtos de PCR compreendendo as junções de integração ob- jetivada PAT - Zp15 5' e 3' são clonados e sequenciados usando métodos pa- drões conhecidos por aqueles versados no campo.

Por exemplo, os produtos de PCR são purificados do gel de agarose e clonados no plasmídeo pCR- ' Bluntll TOPO usando o kit TOPO BLUNT CLONINGO e células de E. coli qui- micamente competentes ONE SHOTG TOP 10 (Invitrogen Life Technologies, Carisbad, CA) de acordo com o protocolo do fabricante.

As junções de integração clonadas são, então, sequenciadas para demonstrar que o gene PAT está inserido no genoma de milho no locus de Zp15 por meio de recombinação homóloga via as sequências de homologia de Zp155'e3' que são incorporadas nos vetores de transformação doadores.

A- lém do vetor TOPO, iniciadores específicos M13 para a frente e M13 reverso, iniciadores específicos ao cassete do gene PAT são usados para obter sequên- cia completa dos clones de integração objetivados.

Iniciadores de PCR SEQ ID NO: 120 e SEQ ID NO: 121, os quais são específicos à sequência de codifica- çãodaproteína PAT, também são usados como iniciadores de sequenciamen- to.

Além disso, outros iniciadores também podem ser usados para sequencia- mento.

Esses incluem, mas não estão limitados a, aqueles que são específicos para o elemento promotor actina de arroz do cassete de PAT: DC-S1 S-CCAACTGGACAATAGTCTCCAC-3* (SEQ ID NO: 122) DC-S2 S"-CATCGCCACTATATAÇATACOS* (SEQ ID NO:123) e aqueles que são específicos para a sequência de codificação da proteína f PAT: " DC-S3 S-CGICTCAATGTAATGGTTAACG-3" (SEQ TD NO: 124) DCO-S4 5-GCCCAGCOGTAAGCAATACCAG-3" (SEQ ID NO:125) h Exemplo 6: Hereditariedade de integração objetivada de AAD-1 no locus b de Zp15 Um evento com caule transgênico trazendo o cassete do gene AAD-1 objetivado ao locus de Zp15 foi gerado (Evento 138). Plantas To do E- vento 138 foram regeneradas e cruzadas como fêmeas com os machos DASS5XH751. Sementes T, resultantes foram plantadas e plantas T, foram crescidas. . Plantas T, foram analisadas através de PCR para demonstrar a o- : 10 corrênciada integração objetivada AAD-1 - Zp15. Reações de amplificação por í PCR foram realizadas usando DNA Polimerase PHUSION HOT START (New England Biolabs, Beverly, MA) sob as seguintes condições de ciclo: 98ºC, 30 s/1 ciclo; 98ºC 10 seg, 72ºC 15 seg/33 ciclos; 72ºC, 5 min/1 ciclo; 4º C/manutenção. As reações de PCR foram analisadas através de eletroforese emgéisde agarose TAE a 1,0%. DNA genômico foi extraído de uma planta Tie usado como molde de DNA em reações de PCR com iniciadores agrupados criados para detectar a junção de integração AAD-1/Zp155'. Reações de PCR primárias e secundárias foram conduzidas usando os mesmos iniciadores usa- dos antes na análise do evento 147 com caule. Para PCR primária, os iniciado- resHB501feHBS507r foram usados. PCR primária proporcionou uma banda no tamanho esperado de 2,2 kbp. Uma alíquota da reação de PCR primária foi di- luída a 1:100 e usada como molde em PCR secundária usando iniciadores a- grupados HB503f e HB508r. PCR secundária também proporcionou uma banda no tamanho esperado de 2,2 kbp.

O produto de PCR secundário de 2,2 kbp foi clonado no pCR- Bluntll-TOPO usando o kit ZERO BLUNT TOPO PCR Cloning e células de E. coli quimicamente competentes ONE SHOT TOP 10 (Invitrogen Life Technolo- gies, Carisbad, CA) de acordo com o protocolo do fabricante. O DNA clonado foi sequenciado usando iniciadores específicos ao vetor de flanqueamento

: (M13 para a frente e M13 reverso). Descobriu-se que a sequência era idêntica . àquela esperada para uma integração objetivada de AAD-1 no locus de Zp15. Todas as patentes, pedidos de patente e publicações mencionados aqui são incorporados por referência na íntegra para todas as finalidades.

U 5 Embora divulgação tenha sido fornecida em alguns detalhes à gui- sa de ilustração e exemplo para fins de clareza de compreensão, será evidente " para aqueles versados no campo que várias alterações e modificações podem ser praticadas sem se desviar do espírito ou escopo da divulgação.

Consequen- temente, as descrições e exemplos precedentes não deverão ser construídos como !limitativos.

Claims (16)

1. - REIVINDICAÇÕES . 1. Método de integração de uma ou mais sequências de ácido nu- cleico exógenas no genoma de uma célula de planta, o método compreenden- do: NM 5 produção de uma clivagem de fita dupla no genoma da célula de planta em ou próximo de um /ocus de Zp15, desse modo, resultando em inte- í gração de um polinucleotídeo compreendendo a uma ou mais sequências exó- genas no genoma da célula em ou próximo do locus de Zp15.
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, ainda compreendendo expressão de um produto da uma ou mais sequências exógenas.
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a cliva- gem de fita dupla é feita por meio de: ii (a) expressão de uma primeira proteína de fusão na célula, a pri- : meira proteína de fusão compreendendo um primeiro domínio de ligação de dedodezincoe um primeiro meio-domínio de clivagem, em que o primeiro do- mínio de ligação de dedo de zinco foi manipulado para se ligar a um primeiro sítio-alvo em ou próximo de um locus de Zp15 no genoma da célula de planta; e (b) expressão de uma segunda proteína de fusão na célula, a se- gunda proteína de fusão compreendendo um segundo domínio de ligação de dedo de zincoe um segundo meio-domínio de clivagem, em que o segundo domínio de ligação de dedo de zinco se liga a um segundo sítio-alvo em ou próximo do locus de Zp15 no genoma da célula de planta, em que o segundo sítio-alvo é diferente do primeiro sítio-alvo; e em que ligação da primeira proteí- na de fusão ao primeiro sítio-alvo e ligação da segunda proteína de fusão ao segundo sítio-alvo posicionam os meio-domínios de clivagem de modo que o genoma da célula de planta em ou próximo do locus de Zp15 é clivado.
4. 4. Método de acordo com a reivindicação 3, em que os domínios de ligação de dedo de zinco são selecionados do grupo mostrado na Tabela 1.
5. 5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 ou 4, emqueosmeio-domínios de clivagem ocorrem naturalmente ou não ocorrem naturalmente.
6. 6. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a cliva-

   1 gem de fita dupla é feita por uma meganuclease que ocorre naturalmente ou - não ocorre naturalmente, uma enzima de restrição do Tipo IIS ou uma proteína de fusão compreendendo a meganuclease e a enzima de restrição do Tipo lIS.
7. 7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, emqueauma ou mais sequências de ácido nucleico exógenas compreende uma sequência de codificação, uma sequência regulatória ou um sítio-alvo para ? um domínio de ligação a DNA.
8. 8. Método de acordo com a reivindicação 7 em que a sequência de codificação codifica um produto que confere: resistência a herbicida; tolerância a herbicida; resistência a insetos; tolerância a insetos; resistência a doenças; tolerância a doenças; tolerância a estresse; resistência a estresse; uma altera- ção no estresse oxidativo; rendimentos aumentados de óleo; uma alteração na : composição ou teor alimentício; uma alteração na aparência física; esterilidade : masculina; velocidade de secagem; sustentabilidade; abundância; uma altera- çãonaquantidade ou qualidade de amido; uma alteração na qualidade de óleo; uma alteração na qualidade ou quantidade de proteína; uma alteração na com- posição de aminoácido ou combinações dos mesmos.
9. 9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que o polinucleotídeo ainda compreende sequências de nucleotídeo que são homólogas às sequências no locus de Zp15.
10. 10. Método de acordo com a reivindicação 9, em que as sequências de nucleotídeo homólogas flanqueiam a sequência exógena.
11. 11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que o polinucleotídeo ainda compreende um promotor.
12. 12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que uma ou mais das sequências exógenas integradas são transmitidas à prole em subsequentes gerações.
13. 13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, em que a célula de planta é uma célula de planta monocotiledônea.
14. 14. Método de acordo com a reivindicação 13, em que a célula de planta é uma célula de milho.
15. 15. Planta ou parte de planta compreendendo uma ou mais se-

    ' quências exógenas integradas em um /ocus de Zp15 através do método como - definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14.
16. 16. Semente compreendendo uma ou mais sequências exógenas integradas em um /ocus de Zp15 através do método como definido em qualquer " 5 umadas reivindicações 1a14.