CN113373125A - 黄酮-o-甲基转移酶及其在汉黄芩素、异汉黄芩素和苏荠苧黄酮合成中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种黄酮‑O‑甲基转移酶，其包括如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5所示氨基酸序列的黄酮‑8‑甲基转移酶以及如SEQ ID No.6、SEQ ID No.7所示氨基酸序列的黄酮‑7‑甲基转移酶中的一种或多种，并提供了编码该氨基酸序列的核苷酸序列、以及含有编码上述氨基酸的多核苷酸序列的重组载体、重组宿主细胞及其应用。本发明中上述黄酮‑O‑甲基转移酶能够用于黄酮如汉黄芩素、异汉黄芩素和苏荠苧黄酮等的合成以及，能够催化具有相似结构的黄酮类物质的合成和甲基化反应，为工业化大规模发酵生产或酶转化方法生产甲基化黄酮类化合物奠定基础。

Description

黄酮-O-甲基转移酶及其在汉黄芩素、异汉黄芩素和苏荠苧黄 酮合成中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及五条黄酮-8-甲基转移酶、两条黄酮-7-甲基转移酶及其在黄酮如汉黄芩素、异汉黄芩素和苏荠苧黄酮等合成中的应用，还涉及利用这些酶生物合成甲基化黄酮的方法。

背景技术

汉黄芩素(5,7-二羟基-8-甲氧基黄酮)、异汉黄芩素(5,8-二羟基-7-甲氧基黄酮)、苏荠苧黄酮(5-羟基-7,8-二甲氧基黄酮)(三种黄酮的结构如下所示)是传统中草药黄芩和半枝莲的有效成分，对癌症的关键靶点具有较强的抑制作用。 8位和7位的甲基化是上述化合物的主要结构特点。在植物天然产物的生物合成过程中，甲基化的过程是通过依赖于S-腺苷-L-甲硫氨酸的甲基转移酶 (methyltransferase)催化进行的，这一类酶具有较强的底物和催化部位专一性。

2013年，Anna Berim和David R.Gang在紫花罗勒(Ocimum basilicum L.) 中都发现了两种可以催化黄酮8位甲基化的酶，分别为ObF8OMT-1和 ObPFOMT-1，两者都可以以pilosin为底物合成石吊兰素，并于2018年实现了二者在酿酒酵母中的功能性表达。黄芩(Scutellaria baicalensis)中的汉黄芩素的合成是由白杨素经过8位羟基化随后进行8位甲基化而来，黄芩中的8位甲基转移酶在2019年得到鉴定。

唇形科植物半枝莲(Scutellaria barbata)中曾经提取出过汉黄芩素、异汉黄芩素、苏荠苧黄酮等甲基化黄酮类化合物，但是目前尚无半枝莲来源的黄酮8 位甲基转移酶(F8OMT)和黄酮7位甲基转移酶(F7OMT)的相关报道，因此本领域迫切需要筛选到相应的F8OMT和F7OMT并开发一种生物法合成汉黄芩素、异汉黄芩素和苏荠苧黄酮的方法。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种黄酮-O-甲基转移酶，其包括：具有如SEQ ID NO.1、2、3、4或5所示氨基酸序列的黄酮-8-甲基转移酶，和/或具有如SEQ IDNO.6或7所示氨基酸序列的黄酮-7-甲基转移酶。

本发明还提供编码所述黄酮-O-甲基转移酶的多核苷酸，其核苷酸序列如 SEQ IDNO.8、9、10、11、12、13或14所示。其中核苷酸序列SEQ ID NO.8、 9、10、11和12分别编码具有如SEQ ID NO.1、2、3、4或5所示氨基酸序列的黄酮-8-甲基转移酶，核苷酸序列SEQ IDNO.13和14分别编码具有如SEQ ID NO.6 或7所示氨基酸序列的黄酮-7-甲基转移酶。

本发明还提供一种重组载体，其包含上述编码所述黄酮-O-甲基转移酶的多核苷酸。

根据本发明，所述重组载体包括本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、动物细胞病毒、逆转录病毒或其他载体。适用于本发明的载体包括但不限于：穿梭质粒载体；在细菌中表达的基于T7启动子的表达载体，如pET-28a等；在酵母中表达的载体，如YEp系列载体等；在哺乳动物细胞中表达的破MSXND表达载体等。只要能在宿主细胞内稳定复制和存在，任何载体都可以用于构建重组表达载体。优选质粒载体，如穿梭质粒载体。

本发明还提供一种重组的宿主细胞，其包括一种、两种或更多种所述包含上述编码所述黄酮-O-甲基转移酶的多核苷酸的重组载体。

根据本发明，所述宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞如哺乳动物细胞。优选的实例包括大肠杆菌、酵母等。

根据本发明的实施方案，所述重组宿主细胞转入了一种、两种或更多种所述包含编码黄酮-8-甲基转移酶的多核苷酸的重组载体，和/或一种、两种或更多种所述包含编码黄酮-7-甲基转移酶的多核苷酸的重组载体。

根据本发明的实施方案，所述重组宿主细胞还可以表达其他需要的酶，如黄酮羟化酶(如黄酮8-羟化酶(F8H))，P450还原酶(CPR)等。

本发明还提供了所述黄酮-O-甲基转移酶的应用，其用于8-O-甲基黄酮、7-O-甲基黄酮或7,8-二甲氧基黄酮化合物的合成中。优选地，可用于汉黄芩素、异汉黄芩素或苏荠苧黄酮的合成中。

本发明还提供一种合成8-O-甲基黄酮的方法，其包括以下步骤：采用具有如SEQID NO.1、2、3、4或5所示氨基酸序列的黄酮-8-甲基转移酶进行催化的步骤。

优选地，本发明提供一种合成汉黄芩素的方法，其包括以下步骤：采用具有如SEQID NO.1、2、3、4或5所示氨基酸序列的黄酮-8-甲基转移酶催化去甲汉黄芩素的步骤；或者包括以下步骤：采用具有如SEQ ID NO.1、2、3、4或5 所示氨基酸序列的黄酮-8-甲基转移酶以及黄酮-8-羟化酶催化白杨素的步骤。

根据本发明的实施方案，所述黄酮-8-甲基转移酶和所述黄酮-8-羟化酶可以是酶本身的形式，也可以是转入了包含编码所述酶的多核苷酸的重组载体的重组宿主细胞形式。

根据本发明的合成8-O-甲基黄酮的方法，其包括以下步骤：

步骤(1)：构建重组载体，其包含编码具有如SEQ ID NO.1、2、3、4或5所示氨基酸序列的黄酮-8-甲基转移酶的多核苷酸；

步骤(2)：将一种、两种或更多种步骤(1)获得的重组载体转入宿主细胞；

步骤(3)：将步骤(2)获得的重组宿主细胞与底物一起发酵，产生8-O-甲基黄酮。

优选地，所述8-O-甲基黄酮是汉黄芩素或苏荠苧黄酮。

优选地，所述底物是去甲汉黄芩素或白杨素。

根据本发明的实施方案，所述重组宿主细胞还可以表达其他需要的酶，如黄酮-7-O-甲基转移酶、黄酮羟化酶(如黄酮8-羟化酶(F8H))，P450还原酶 (CPR)等。

本发明还提供一种合成7-O-甲基黄酮的方法，其包括以下步骤：采用具有如SEQID NO.6或7所示氨基酸序列的黄酮-7-甲基转移酶进行催化的步骤。

优选地，本发明提供一种合成异汉黄芩素的方法，其包括以下步骤：采用具有如SEQ ID NO.6或7所示氨基酸序列的黄酮-7-甲基转移酶催化去甲汉黄芩素的步骤；或者包括以下步骤：采用黄酮-8-羟化酶以及具有如SEQ ID NO.6或 7所示氨基酸序列的黄酮-7-甲基转移酶催化白杨素的步骤。

优选地，本发明还提供一种合成苏荠苧黄酮的方法，其包括以下步骤：采用具有如SEQ ID NO.1、2、3、4或5所示氨基酸序列的黄酮-8-甲基转移酶以及具有如SEQ ID NO.6或7所示氨基酸序列的黄酮-7-甲基转移酶催化去甲汉黄芩素的步骤；或者包括以下步骤：采用黄酮-8-羟化酶、具有如SEQ ID NO.1、2、 3、4或5所示氨基酸序列的黄酮-8-甲基转移酶以及具有如SEQ ID NO.6或7所示氨基酸序列的黄酮-7-甲基转移酶催化白杨素的步骤。

根据本发明，所述黄酮-7-甲基转移酶和所述黄酮-8-羟化酶可以是酶本身的形式，也可以是转入了包含编码所述酶的多核苷酸的重组载体的宿主细胞形式。

根据本发明的合成7-O-甲基黄酮的方法，其包括以下步骤：

步骤(1)：构建重组载体，其包含编码具有如SEQ ID NO.6或7所示氨基酸序列的黄酮-7-甲基转移酶的多核苷酸；

步骤(2)：将一种、两种或更多种步骤(1)获得的重组载体转入宿主细胞；

步骤(3)：将步骤(2)获得的重组宿主细胞与底物一起发酵，产生7-O-甲基黄酮。

优选地，所述7-O-甲基黄酮是异汉黄芩素或苏荠苧黄酮。

优选地，所述底物是去甲汉黄芩素或白杨素。

根据本发明的实施方案，所述重组宿主细胞还可以表达其他需要的酶，如黄酮-8-O-甲基转移酶、黄酮羟化酶(如黄酮8-羟化酶(F8H))，P450还原酶 (CPR)等。

应理解，在本发明范围内中，只要不违反本领域的常规知识，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

有益效果

本发明的黄酮-8-甲基转移酶(F8OMT)和黄酮-7-甲基转移酶(F7OMT)具有良好的催化合成O-甲基化黄酮的活性，它们能够用于黄酮如汉黄芩素、异汉黄芩素和苏荠苧黄酮等的合成，能够催化具有相似结构的含有7-O-甲基和/或8-O- 甲基取代基的黄酮类化合物的合成和甲基化反应，为工业化大规模发酵生产或酶转化方法生产甲基化黄酮类化合物奠定了基础。

附图说明

图1为重组质粒Y33-FOMT的质粒图谱示意图。

图2为重组质粒Y22-FOMT的质粒图谱示意图。

图3为半枝莲黄酮-O-甲基转移酶的进化分析图。

图4为半枝莲来源的黄酮-O-甲基转移酶催化去甲汉黄芩素8位甲基化反应合成汉黄芩素和7位甲基化生成异汉黄芩素的HPLC-MS分析图。

图5为半枝莲来源的SbarF7OMT和黄芩来源的SbaiF7OMT催化去甲汉黄芩素7位甲基化生成异汉黄芩素的HPLC-MS分析图。

图6为酿酒酵母工程菌株催化去白杨素为底物合成汉黄芩素和异汉黄芩素的HPLC分析图。

图7为SbarF8OMT和SbarF7OMT催化去甲汉黄芩素8位和7位甲基化反应合成苏荠苧黄酮的HPLC-MS分析图。

图8为生物法合成的异汉黄芩素的¹H和¹³C NMR谱图。

图9为去甲汉黄芩素为底物在黄酮-O-甲基转移酶的作用下生成甲基化黄酮化合物的示意图。

图10为白杨素为底物在黄酮-O-甲基转移酶的作用下生成甲基化黄酮化合物的示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。

如果没有特别说明，本发明中所用的基因序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，实施例中所用的材料均为市售产品。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1编码核苷酸的获得与载体构建

根据本发明提供的核苷酸序列信息(SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14)，进行基因合成。以穿梭质粒YCPlac33-PE为载体，在酶切位点SalI和XbaI之间插入外源序列，利用Gibson组装方法进行重组载体构建(图1)。另外，对于SEQ ID No.14还以穿梭质粒YCPlac22-PE为载体，在酶切位点SalI和XbaI之间插入外源序列，利用Gibson组装方法进行重组载体构建(图2)。

实施例2产汉黄芩素酿酒酵母宿主菌的构建

2.1以去甲汉黄芩素为底物生产汉黄芩素

利用常规醋酸锂转化方法将实施例1中所述的包括核苷酸序列SEQ ID No.8 或SEQ ID No.9或SEQ ID No.10或SEQ ID No.11或SEQ ID No.12的重组载体转化入酿酒酵母宿主菌W303-1B中，挑取可以在尿嘧啶缺陷的完全(CM)培养基上长出的克隆，以浓度为1mM的去甲汉黄芩素为底物发酵生产汉黄芩素。

2.2以白杨素为底物生产汉黄芩素

利用常规醋酸锂转化方法将实施例1中所述包括核苷酸序列SEQ ID No.12 的重组载体转化入含有黄酮-8-羟化酶(F8H)及P450还原酶(CPR)的酿酒酵母宿主菌中，挑取可以在色氨酸和尿嘧啶缺陷的CM培养基上长出的克隆，以浓度为1mM的白杨素为底物发酵生产汉黄芩素。

实施例3产异汉黄芩素酿酒酵母宿主菌的构建

3.1以去甲汉黄芩素为底物生产异汉黄芩素

利用常规醋酸锂转化方法将实施例1中所述的包括核苷酸序列SEQ ID No. 13或SEQ ID No.14的重组载体转化入酿酒酵母宿主菌W303-1B中，挑取可以在尿嘧啶缺陷的CM培养基上长出的克隆，以浓度为1mM的去甲汉黄芩素为底物发酵生产异汉黄芩素。

3.2以白杨素为底物生产异汉黄芩素

利用常规醋酸锂转化方法将实施例1中所述包括核苷酸序列SEQ ID No.14 的重组载体转化入含有黄酮-8-羟化酶(F8H)及P450还原酶(CPR)的酿酒酵母宿主菌中，挑取可以在色氨酸和尿嘧啶缺陷的CM培养基上长出的克隆，以浓度为1mM的白杨素为底物发酵生产汉黄芩素。

实施例4产苏荠苧黄酮酿酒酵母宿主菌的构建

利用常规醋酸锂转化方法将实施例1中所述的包括核苷酸序列SEQ ID No. 12的YCPlac33-PE重组载体与包括核苷酸序列SEQ ID No.14的YCPlac22-PE重组载体共转化入酿酒酵母宿主菌W303-1B中，挑取可以在尿嘧啶和色氨酸缺陷的CM培养基上长出的克隆，以浓度为1mM的去甲汉黄芩素为底物发酵生产苏荠苧黄酮。

实施例5发酵生产汉黄芩素、异汉黄芩素、苏荠苧黄酮

5.1酿酒酵母工程菌株种子液培养

选用CM培养基(购自索莱宝生物科技有限公司)(配方：YNB w/o AA(0.67％)，葡萄糖(2g/L)，Dropout powder(0.083％)，其中Dropout powder 中含有(mg/L)：苏氨酸150，酪氨酸30，缬氨酸150，赖氨酸30，谷氨酸100，丝氨酸150，天冬氨酸100，甲硫氨酸20，苯丙氨酸50，异亮氨酸30，精氨酸20；其它营养成分(mg/L)：腺嘌呤50，尿嘧啶50，组氨酸100，亮氨酸100，色氨酸100(氨基酸))，液体培养基调pH为5.6，固体培养基加1.5％琼脂粉(购自索莱宝生物科技有限公司)，调pH为6.5。分别在平板上挑取单克隆到含有4mL 灭过菌的培养基的24孔板中，于30℃、200rpm条件下对酿酒酵母工程菌株进行过夜培养。

5.2发酵生产

将种子液以1:50的接种比例接种到灭菌后的24孔板中，加入终浓度为1mM 的相应底物，在30℃、800rpm条件下发酵培养4天。

实施例6反应产物的HPLC-MS鉴定

6.1发酵结束后，取900μL样品，加入等体积的无水甲醇，用超声清洗仪进行超声30min。12000rpm离心10min，上清液做高效液相分析。

6.2HPLC、LC-MS检测条件

HPLC分析：

仪器：岛津高效液相色谱仪1200

色谱柱：Kinetex H15-168747(4.6×250mm)，紫外检测器，检测波长290nm。

流动相：A相为0.1％甲酸；B相为乙腈；C相为甲醇

起始浓度：A:73％B:22％C:5％。

流速：1mL/min

柱温：30℃

检测器：PDA检测器

梯度洗脱程序：(浓度为B相百分比)

MS分析：

质谱仪：Bruker-micrOTOF-II：

ESI离子源，正离子模式

核质比(m/z)：50-1000

氮气流速：6.0升/分钟

温度：180℃

雾化器压力：1bar

探头电压：14.5KV。

6.3半枝莲来源的黄酮-O-甲基转移酶功能鉴定

根据半枝莲转录组测序结果分析得到12条黄酮-O-甲基转移酶候选序列(图 3)，以去甲汉黄芩素为底物发酵表达黄酮-O-甲基转移酶的酿酒酵母菌株，经过 HPLC检测结果显示，SbarFOMT-1、SbarFOMT-6、SbarFOMT-7、SbarFOMT-11、 SbarFOMT-12可以催化去甲汉黄芩素生成新产物，出峰时间为28.20min，与汉黄芩素标品相一致(图4A)，质谱结果显示(图4B)该新产物分子量为m/z,285 [M+H]⁺，这与汉黄芩素标品的分子量一致，确定该物质是汉黄芩素。其中 SbarFOMT-12的催化活性最优，将SbarFOMT-12命名为SbarF7OMT。SbarFOMT-4生成一个新物质，出峰时间为27.50min(图4A)，质谱结果显示该新产物分子量为m/z,285[M+H]⁺(图4C)，推测该物质为汉黄芩素的同分异构体，经过核磁结构分析确定该物质与之前专利CN104926768A中报道的化学法合成的异汉黄芩素结构相一致，确认新合成的化合物为异汉黄芩素(图8)，将SbarFOMT-4命名为SbarF7OMT。

6.4黄芩来源的黄酮-O-甲基转移酶功能鉴定

筛选到黄芩来源的SbarF7OMT同源序列Sbai154288，以去甲汉黄芩素为底物发酵表达Sbai154288的酿酒酵母菌株，经过HPLC检测结果显示，Sbai154288 可以去甲汉黄芩素生成一个新产物，出峰时间为27.50min与汉黄芩素标品相一致(图5A)，质谱结果显示(图5B)该新产物分子量为(m/z,285[M+H]+)，这与汉黄芩素标品的分子量一致，确定该物质是汉黄芩素。将Sbai154288命名为SbaiF7OMT。

6.5以白杨素为底物生产汉黄芩素和异汉黄芩素

以1mM白杨素为底物,发酵菌株W303-F8H-SbarF7OMT和 W303-F8H-SbaiF7OMT，产物进行HPLC检测。结果显示，27.50min时两者都可以催化白杨素生成异汉黄芩素(图6A)。以1mM白杨素为底物，发酵菌株W303-F8H-SbarF8OMT，产物进行HPLC检测。由于底物白杨素出峰时间与汉黄芩素出峰时间区分度相差不大，因此利用质谱提取分子量[M+H]⁺285进行结果分析显示。提取质谱图，发现菌株W303-F8H-SbarF8OMT可以催化白杨素生成新产物，并且与汉黄芩素标品出峰时间相一致(图6B)，分子量相一致(图 6C，图6D)，确定新产物为汉黄芩素。

6.6以去甲汉黄芩素为底物生产苏荠苧黄酮

以1mM去甲汉黄芩素为底物,发酵菌株W303-SbarF8OMT&SbarF7OMT，产物进行HPLC检测。结果显示，33.55min时催化白杨素生成新产物，并且与苏荠苧黄酮标品出峰时间相一致(图7A)。质谱结果显示该新产物分子量为(m/z, 299[M+H]⁺)(图7B)，这与苏荠苧黄酮标品的分子量一致，确定该物质是苏荠苧黄酮。

实施例7NMR(核磁共振)鉴定发酵产物化学结构

7.1将甘油菌接种到含有4mL灭菌的尿嘧啶缺陷CM培养基的玻璃试管中，于30℃、200rpm条件下对酿酒酵母工程菌株进行过夜培养。将种子液以1:50的接种比例接种到灭菌后的2L尿嘧啶缺陷CM培养基中，加入终浓度为0.5mM的去甲汉黄芩素，在30℃、200rpm条件下发酵培养4天。发酵结束后，5000rpm离心10min，上清液用等体积的乙酸乙酯进行萃取；细胞沉淀用100mL甲醇进行萃取，并超声30min，将甲醇进行旋蒸，剩余水分用等体积乙酸乙酯萃取；合并所有乙酸乙酯用旋转蒸发仪蒸干；重复萃取两次；用20mL甲醇清洗旋蒸瓶内壁，离心，将浓缩后的产物利用制备液相进行分离纯化。

7.2制备液相分离条件

HPLC分析：

仪器：Agilent1260型液相色谱仪

色谱柱：Ultimate XB-C18(21.2×250mm)，紫外检测器，检测波长290nm。

流动相：A相为超纯水；B相为甲醇

起始浓度：A:40％B:60％

流速：10mL/min

柱温：30℃

检测器：MWD检测器

梯度洗脱程序：(浓度为B相百分比)

7.3异汉黄芩素分离纯化

以实施例7.1中所浓缩后的发酵产物利用制备液相进行分离，进样量900μL/次经过制备液相分析检测结果显示，去甲汉黄芩素出峰时间为23-26min，异汉黄芩素出峰时间为36-38min，开启收集器收集36-38min的样品，重复20次。所得液体浓缩蒸干，加入500uL氘代DMSO进行溶解，进行600MHZ核磁检测。

7.4NMR(核磁共振)鉴定发酵新产物异汉黄芩素化学结构

在DMSO-d6中，在600MHz的Bruker Avance III光谱仪上获得1H和13C NMR谱。化学位移(δ)以ppm表示，J代表耦合常数。对于分离纯化的异汉黄芩素的核磁结果如图8所示1H-NMR(600MHz,DMSO-d6):δ12.34(1H,s),8.14 (2H,d),7.60(3H,m),6.97(1H,s),6.58(1H,s),3.91(3H,s)；13C-NMR(600MHz, DMSO-d6):δ182.57,163.39,153.09,154.54,144.55,132.11,130.87,129.12, 126.58,126.36,104.64,104.078,35.84,56.39。与先前报道的化学合成的结构鉴定结果相一致。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 黄酮-O-甲基转移酶及其在汉黄芩素、异汉黄芩素和苏荠苧黄酮合成中的应用

<130> CPCN20110117

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 356

<212> PRT

<213> Scutellaria barbata

<400> 1

Met Ala Leu Ala Asn Thr Leu Leu Asp Ala Glu Ala His Leu Trp Asn

1 5 10 15

His Thr Phe Asn Phe Ile Asn Ser Met Ser Leu Lys Cys Ala Ile Gln

20 25 30

Leu Ala Ile Pro Asp Ala Ile His Lys His Gly Lys Pro Met Thr Leu

35 40 45

Ser Gln Leu Val Glu Ala Leu Ala Ile Asn Lys Ala Lys Ser Asn Gly

50 55 60

Leu Tyr Arg Leu Met Arg Ile Leu Thr His Ser Lys Phe Phe Asp Gln

65 70 75 80

Ala Lys Ile His Arg Glu Gly Glu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Ala Tyr

85 90 95

Cys Leu Thr Glu Ala Ser Arg Leu Leu Leu Ser Asp Glu Pro Thr Ser

100 105 110

Lys Gly Ser Phe Ala Leu Ala Pro Leu Ser Pro Ile Met Met Asp Pro

115 120 125

Trp His His Met Ser Glu Trp Phe Arg Asn Glu Ser Pro Ser Pro Phe

130 135 140

Glu Thr Lys His Gly Met Thr Leu Trp Glu Tyr Ala Lys Ile Asp Gln

145 150 155 160

Gly Phe Asn Met Leu Phe Asn Glu Ala Met Ala Ser Asp Ala Glu Pro

165 170 175

Leu Thr Ser Ile Leu Ile Lys Glu Cys Arg Gln Val Phe Glu Gly Leu

180 185 190

Arg Ser Met Val Asp Val Ala Gly Gly Thr Gly Ala Thr Ala Lys Asn

195 200 205

Ile Val Asp Ala Phe Pro Gly Leu Lys Cys Val Val Leu Asp Leu Pro

210 215 220

His Val Val Ala Gly Leu Glu Gly Gly Glu Asp Leu Ser Phe Val Asp

225 230 235 240

Gly Asp Met Phe Glu Ser Ile Pro His Ala His Ala Val Phe Leu Lys

245 250 255

Trp Ile Leu His Asn Trp Ser Asp Glu Glu Ser Val Asn Ile Leu Lys

260 265 270

Lys Cys Lys Glu Ala Ile Thr Pro Tyr Asp Gly Gly Lys Val Ile Ile

275 280 285

Val Asp Val Val Val Asp Asp Lys Ile Arg Glu Asp Ala Gly Ser Ile

290 295 300

Glu Thr His Leu Phe Phe Asp Met Gln Met Met Ile Gln Leu Gly Gly

305 310 315 320

Lys Glu Arg Thr Glu Lys Glu Trp Thr Asn Ile Phe Phe Thr Ala Gly

325 330 335

Phe Asn Ser Tyr Lys Ile Thr Pro Ile Leu Gly Phe Arg Ser Leu Ile

340 345 350

Glu Val Phe Pro

355

<210> 2

<211> 247

<212> PRT

<213> Scutellaria barbata

<400> 2

Met Ala Lys Asn Gly Glu Asn His Leu Asn Gln Ala Lys Glu Phe Pro

1 5 10 15

Asp Phe Gly His Lys Ser Ile Leu Gln Ser Asp Ala Leu Tyr Gln Tyr

20 25 30

Ile Leu Glu Thr Ser Val Tyr Pro Asn Glu Ala Lys Pro Met Lys Glu

35 40 45

Leu Arg Glu Leu Thr Ala Lys His Ser Lys Ser Ile Met Cys Thr Ser

50 55 60

Ala Asp Glu Ala Gln Phe Leu Asn Ile Leu Val Lys Leu Met Asn Ala

65 70 75 80

Lys Asn Thr Met Glu Ile Gly Val Phe Thr Gly Tyr Ser Leu Leu Ala

85 90 95

Thr Ala Leu Ala Leu Pro His His Gly Lys Ile Leu Ala Ile Asp Ile

100 105 110

Asn Arg Asp Asp Tyr Glu Leu Gly Leu Pro Ile Ile Lys Lys Ala Gly

115 120 125

Val Ala His Lys Ile Asp Phe Arg Gln Gly Gln Ala Leu Pro Ile Leu

130 135 140

Asp Gln Met Ile Gln His Arg Glu Tyr His Gly Thr Phe Asp Phe Ile

145 150 155 160

Phe Val Asp Ala Asp Lys Asn Asn Tyr Trp Asn Tyr His Glu Arg Ala

165 170 175

Val Glu Leu Ile Lys Ile Gly Gly Val Ile Gly Tyr Asp Asn Thr Leu

180 185 190

Trp Leu Ala Ser Val Val Ala Pro Pro Asp Ala Pro Leu His Glu Val

195 200 205

Ile Met Cys Gly Arg Glu Tyr Ile Met Glu Phe Asn Lys Lys Val Ala

210 215 220

Ala Asp Pro Arg Val Glu Ile Thr Gln Leu Ser Leu Gly Asp Gly Ile

225 230 235 240

Thr Leu Cys Arg Arg Leu Ala

245

<210> 3

<211> 253

<212> PRT

<213> Scutellaria barbata

<400> 3

Met Ala Ala Asn Val Glu Thr Ser Ile Gln Thr Gln Glu Thr Gln Asn

1 5 10 15

Gln Pro Ala Arg His Gln Glu Val Gly His Lys Ser Leu Leu Gln Ser

20 25 30

Asp Ala Leu Tyr Gln Tyr Ile Leu Glu Thr Ser Val Tyr Pro Arg Glu

35 40 45

Pro Glu Ala Met Lys Glu Leu Arg Glu Ile Thr Ala Lys His Pro Trp

50 55 60

Asn Ile Met Thr Thr Ser Ala Asp Glu Gly Gln Phe Leu Asn Met Leu

65 70 75 80

Leu Lys Leu Ile Asn Ala Lys Asn Thr Met Glu Ile Gly Val Tyr Thr

85 90 95

Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Thr Ala Leu Ala Leu Pro Asp Asp Gly Lys

100 105 110

Ile Leu Ala Met Asp Ile Asn Lys Glu Asn Tyr Glu Leu Gly Leu Pro

115 120 125

Val Ile Glu Lys Ala Gly Val Ala His Lys Ile Asp Phe Lys Glu Gly

130 135 140

Pro Ala Leu Pro Val Leu Asp Glu Met Ile Lys Asp Gly Lys Tyr His

145 150 155 160

Gly Ser Phe Asp Phe Ile Phe Val Asp Ala Asp Lys Asp Asn Tyr Ile

165 170 175

Asn Tyr His Lys Arg Leu Ile Glu Leu Val Lys Val Gly Gly Val Ile

180 185 190

Gly Tyr Asp Asn Thr Leu Trp Asn Gly Ser Val Val Ala Pro Pro Asp

195 200 205

Ala Pro Leu Arg Lys Tyr Val Arg Tyr Tyr Arg Asp Phe Val Leu Glu

210 215 220

Leu Asn Lys Ala Leu Ala Ala Asp Pro Arg Ile Glu Ile Cys Gln Leu

225 230 235 240

Pro Val Gly Asp Gly Ile Thr Leu Cys Arg Arg Ile Thr

245 250

<210> 4

<211> 234

<212> PRT

<213> Scutellaria barbata

<400> 4

Met Ile Glu Lys Tyr Asn Arg Thr Ile Leu Gln Ser Asp Val Leu Ser

1 5 10 15

Lys Tyr Ile Leu Glu Thr Ser Ala Tyr Pro Arg Glu His Gln Gln Leu

20 25 30

Lys Glu Leu Arg Glu Ala Thr Val Gln Lys Tyr Lys Ser Trp Ser Leu

35 40 45

Met Asn Val Pro Val Asp Glu Gly Leu Phe Ile Ser Met Leu Leu Lys

50 55 60

Ile Met Asn Ala Lys Lys Thr Ile Glu Val Gly Val Phe Thr Gly Tyr

65 70 75 80

Ser Leu Leu Ser Thr Ala Leu Ala Leu Pro Asp Asp Gly Lys Ile Ile

85 90 95

Ala Ile Asp Pro Asp Lys Glu Ala Tyr Glu Thr Gly Leu Pro Ser Ile

100 105 110

Glu Lys Ala Asn Val Ala His Lys Ile His Phe Ile His Ser Ala Gly

115 120 125

Ile Ala Cys Leu Asp Asp Leu Ile Thr Asn Gly Glu Glu Gly Thr Phe

130 135 140

Asp Phe Ala Phe Val Asp Ala Asp Lys Ala Asn Tyr Ile Ser Tyr His

145 150 155 160

Glu Lys Leu Leu Lys Leu Val Lys Ile Gly Gly Val Ile Gly Tyr Asp

165 170 175

Asn Ser Leu Trp Phe Gly Thr Val Ala His Pro Glu Asn Asp Glu Met

180 185 190

Leu Asp Phe Val Lys Thr Cys Arg Ala Tyr Thr Val Glu Leu Asn Ser

195 200 205

Phe Leu Ala Ser Asp Ser Arg Ile Glu Leu Ala His Leu Ser Ile Gly

210 215 220

Asp Gly Leu Thr Leu Cys Arg Arg Leu Lys

225 230

<210> 5

<211> 252

<212> PRT

<213> Scutellaria barbata

<400> 5

Met Thr Thr Gly Asn Gly Asp Ala Pro Val Ile Lys Asn Ala His Ser

1 5 10 15

Asp Ile Asp Ser Thr Asn Lys Thr Leu Leu Lys Ser Asp Ala Leu Tyr

20 25 30

Lys Tyr Val Leu Asp Thr Thr Val Leu Pro Arg Glu Pro Glu Cys Met

35 40 45

Arg Asp Leu Arg Leu Ile Thr Asp Lys His Gln Trp Gly Phe Met Gln

50 55 60

Ser Ser Ala Asp Glu Ala Gln Leu Leu Gly Met Leu Leu Lys Met Ala

65 70 75 80

Gly Ala Lys Arg Thr Ile Glu Val Gly Val Phe Thr Gly Tyr Ser Leu

85 90 95

Leu Ala Thr Ala Leu Ala Leu Pro Glu Asp Gly Lys Val Val Ala Ile

100 105 110

Asp Pro Asp Arg Glu Ser Tyr Glu Ile Gly Arg Pro Phe Leu Glu Lys

115 120 125

Ala Gly Val Ala His Lys Val Asp Phe Arg Glu Gly Lys Gly Leu Glu

130 135 140

Lys Leu Asp Glu Leu Leu Ala Glu Glu Ala Ala Ala Gly Arg Glu Ala

145 150 155 160

Ala Phe Asp Phe Ala Phe Val Asp Ala Asp Lys Pro Asn Tyr Val Lys

165 170 175

Tyr His Glu Gln Leu Leu Gln Leu Val Arg Val Gly Gly His Ile Val

180 185 190

Tyr Asp Asn Thr Leu Trp Ala Gly Thr Val Ala Leu Pro Pro Asp Thr

195 200 205

Pro Leu Ser Asp Leu Asp Arg Arg Phe Ser Val Ala Ile Arg Asp Leu

210 215 220

Asn Ser Arg Leu Ala Ala Asp Pro Arg Ile Asp Val Cys Gln Leu Ala

225 230 235 240

Ile Ala Asp Gly Ile Thr Ile Cys Arg Arg Leu Val

245 250

<210> 6

<211> 364

<212> PRT

<213> Scutellaria barbata

<400> 6

Met Ala Leu Pro Asn Ala Leu Ala Asn Ser Ser Thr Gln Glu Ile Ile

1 5 10 15

Asp Ala Gln Ser His Val Trp Asn His Ile Leu Asn Phe Val Asn Ser

20 25 30

Met Ser Leu Lys Cys Ala Leu Leu Leu Ala Ile Pro Asp Ile Ile His

35 40 45

Lys His Gly Lys Pro Met Thr Leu Ser Glu Leu Ala Asn Ala Ile Pro

50 55 60

Ile Asn Lys Ala Lys Phe Asn Asp Leu Tyr Gln Leu Met Arg Leu Leu

65 70 75 80

Thr His Ser Lys Phe Phe Asp Asn Val Met Ile Ser Lys Ser Glu Asp

85 90 95

Asp Glu Asp Glu Glu Glu Ala Tyr Cys Leu Thr Gly Ala Ser His Leu

100 105 110

Leu Leu Arg Asp Glu Pro Leu Thr Leu Val Tyr Leu Thr Leu Leu Thr

115 120 125

Leu Asp Pro Ile Ile Met Asp Pro Gly His Cys Met Ser Glu Trp Phe

130 135 140

Gln Asn Glu Asp Pro Thr Ala Phe Val Thr Lys Gln Gly Ile Pro Phe

145 150 155 160

Trp Glu Tyr Ala Lys Gly Asp Glu Arg Leu Asn Val Leu Phe Asn Lys

165 170 175

Ser Met Ser Gly Asp Gly Val Ala Cys Asn Ile Leu Val Lys Asp Cys

180 185 190

Arg Gln Val Phe Glu Gly Leu Lys Ser Met Val Asp Val Gly Gly Gly

195 200 205

Asn Gly Ala Thr Ala Arg Asp Ile Ser Asp Ala Phe Pro Gly Leu Lys

210 215 220

Cys Thr Val Leu Asp Leu Pro Gln Val Val Ala Gly Leu Glu Gly Ser

225 230 235 240

Glu Asn Val Asn Tyr Val Ser Gly Asp Met Phe Glu Phe Ile Pro His

245 250 255

Ala Asp Ala Ile Phe Phe Lys Thr Ile Phe His Asn Trp Glu Asp Glu

260 265 270

Asn Cys Val Lys Val Leu Lys Arg Cys Lys Glu Ala Ile Val Arg Ser

275 280 285

Lys Asn Asn Gly Gly Lys Val Ile Ile Ile Asp Met Val Val Asp Asp

290 295 300

Lys Lys Lys Asp Asp Ile Gly Thr Ala Thr Gln Leu Cys Leu Gly Leu

305 310 315 320

Leu Met Thr Ile Leu Phe Arg Gly Lys Glu Arg Thr Glu Lys Glu Trp

325 330 335

Ala Lys Ile Phe Phe His Ala Gly Phe His Asn Tyr Lys Ile His Pro

340 345 350

Val Phe Gly Leu Arg Ser Leu Ile Glu Val Phe Pro

355 360

<210> 7

<211> 358

<212> PRT

<213> Scutellaria baicalensis

<400> 7

Met Ala Leu Pro Lys Ala Leu Ala Asn Ser Ser Thr Glu Glu Ile Leu

1 5 10 15

Glu Ala Gln Ser His Val Trp Asn His Ile Leu Ser Phe Ile Asn Ser

20 25 30

Met Ser Leu Lys Cys Ala Leu Glu Leu Gly Ile Pro Asp Ile Ile His

35 40 45

Lys His Gly Lys Pro Met Ser Val Ser Glu Leu Val Glu Ala Ile Pro

50 55 60

Thr Asn Lys Ala Lys Ser Asn Glu Leu Asn Leu Leu Met Arg Leu Leu

65 70 75 80

Thr His Ser Lys Phe Phe Asp Met Ser Val Met Asn Asp Asp Glu Glu

85 90 95

Ala Tyr Ser Leu Thr Arg Ala Ser Tyr Leu Leu Leu Arg Asp Glu Pro

100 105 110

Leu Thr Leu Val His Leu Thr Leu Leu Ser Leu Asp Pro Ile Met Met

115 120 125

Asp Pro Gly His Tyr Met Ser Glu Trp Phe Lys Asn Glu Asp Leu Thr

130 135 140

Ser Phe Val Thr Gln Gln Gly Met Pro Phe Trp Gln Tyr Ala Lys Gly

145 150 155 160

Asp Glu Arg Leu Asn Glu Leu Phe Asn Lys Ser Met Ser Gly Asp Gly

165 170 175

Val Ser Leu Asn Val Leu Val Arg Asp Cys Arg Gln Val Phe Glu Gly

180 185 190

Leu Ser Ser Met Val Asp Val Gly Gly Gly Asn Gly Val Thr Ala Arg

195 200 205

Ser Ile Ser Asp Thr Phe Pro Gly Leu Lys Cys Thr Val Leu Asp Leu

210 215 220

Pro Gln Ala Val Ala Gly Leu Glu Gly Ser Glu Asn Val Ser Phe Val

225 230 235 240

Ser Gly Asp Met Phe His Phe Ile Pro His Ala Asp Ala Ile Leu Phe

245 250 255

Lys Asn Val Phe His Asn Trp Glu Asp Glu Glu Cys Val Lys Val Leu

260 265 270

Arg Asn Cys Lys Glu Ala Leu Gly Arg Gly Glu Lys Ser Gly Gly Lys

275 280 285

Val Ile Ile Ile Asp Met Val Val Asn Asp Lys Arg Lys Asp Asp Gln

290 295 300

Gly Thr Glu Thr Gln Leu Cys Leu Gly Leu Met Met Met Tyr Leu Phe

305 310 315 320

Arg Gly Lys Glu Arg Thr Glu Lys Glu Trp Ala Lys Leu Phe Phe Asp

325 330 335

Ser Gly Phe Arg Ser Tyr Lys Ile His Pro Val Leu Gly Leu Arg Ser

340 345 350

Val Ile Glu Val Phe Pro

355

<210> 8

<211> 1071

<212> DNA

<213> Scutellaria barbata

<400> 8

atggcattgg caaacacact tcttgatgct gaagctcatt tgtggaacca tacattcaac 60

ttcataaact ccatgtccct aaaatgtgcg attcaattag ctatacccga tgcaatccac 120

aaacacggaa agccaatgac actttctcag ctagttgaag ccctagccat caacaaagcc 180

aaatccaacg gtctctatcg cctaatgcga atcctcacac attccaagtt ctttgaccag 240

gccaagattc atcgggaggg cgaggaagag gaggaggagg cggcttactg tctcacagag 300

gcttctcggc tcttgctaag tgacgagccg actagcaaag ggtcttttgc acttgcccca 360

cttagcccta tcatgatgga tccatggcat catatgagtg agtggtttcg aaacgagtca 420

ccctcaccat ttgagaccaa acatgggatg acattgtggg agtatgctaa gattgatcaa 480

gggtttaata tgttgtttaa tgaggccatg gctagtgatg cagagccctt gactagtata 540

cttataaagg aatgtagaca agtgtttgag ggattgagat cgatggtgga tgtcgccggt 600

ggaaccggag caacggcaaa gaacatcgtc gatgcctttc cggggttgaa atgtgtagtt 660

cttgatcttc cacatgttgt tgctggctta gaagggggtg aggatctgag ctttgttgat 720

ggagatatgt tcgagtcaat tcctcatgcc catgcagttt ttctcaagtg gatattgcac 780

aattggagtg atgaagagag tgtgaatata ctaaagaaat gcaaagaagc aataactcca 840

tacgatggtg gaaaagtgat aattgttgat gtggttgttg atgataagat cagagaagat 900

gctggctcga ttgaaactca tttgttcttt gatatgcaaa tgatgataca acttggtgga 960

aaagagagaa ctgaaaagga gtggactaac atcttcttta ctgctggttt caattcttac 1020

aagattactc ccattttagg atttagatct ctgattgagg ttttcccata a 1071

<210> 9

<211> 744

<212> DNA

<213> Scutellaria barbata

<400> 9

atggcaaaga atggggaaaa tcatctgaat caagccaaag agttccctga ttttggccac 60

aagagtatct tgcaaagtga tgccctttat cagtatatac ttgaaactag tgtgtatcca 120

aatgaggcca aacccatgaa agaactgcgt gaattgacag caaaacattc aaagagtata 180

atgtgcacat cggcggatga agcacagttc ttaaacatac ttgtgaaact catgaatgct 240

aagaacacaa tggagattgg agtgtttact ggctattctc ttcttgccac tgccttggct 300

ctccctcatc atggaaagat tttggcaata gatataaacc gggatgacta tgaactaggg 360

cttcctataa ttaaaaaggc tggtgtagca cacaagattg attttagaca aggacaagca 420

ctccccattc tcgaccaaat gattcaacat agggaatatc atgggacgtt cgacttcata 480

tttgtggatg cagacaagaa caactattgg aactatcatg aaagggcagt agagctgatc 540

aagattgggg gagtgattgg gtacgacaac accctatggc ttgcaagtgt ggtggcacca 600

ccggatgcac cactccacga agtgataatg tgcggtagag agtacataat ggagttcaac 660

aagaaagtgg ctgctgatcc aagggtggag atcacacagc tctctttggg ggatggcatc 720

accctctgtc gtcgtcttgc ttga 744

<210> 10

<211> 762

<212> DNA

<213> Scutellaria barbata

<400> 10

atggcagcaa acgtggaaac aagcattcaa actcaggaaa ctcaaaatca accggctagg 60

catcaagagg tcggccacaa gagccttttg cagagcgatg ctctttatca gtatattctg 120

gaaaccagtg tgtatccgag agagcctgag gcgatgaaag agctcagaga aataactgca 180

aagcatccat ggaatattat gacgacatca gctgatgagg ggcagttttt gaacatgctt 240

ttaaagctga taaatgcgaa gaacacaatg gagattggcg tttacactgg ctactctctc 300

ttagccacag ctcttgctct tcctgatgat ggaaagattt tggctatgga cattaataaa 360

gagaattatg agctgggctt gcctgtaata gaaaaggcag gtgtagccca caaaattgat 420

tttaaagaag gtcctgcttt gcctgttctt gatgaaatga tcaaagatgg caaataccat 480

ggatcatttg acttcatatt tgtggatgct gataaggaca attacataaa ctaccacaag 540

aggctgattg aattggtcaa ggttggtggt gtgatcggct acgacaacac cttatggaac 600

gggtctgtgg tggccccacc agacgctcca ctaaggaagt acgttaggta ttatagggac 660

tttgtattgg agctcaataa ggctcttgct gctgatccaa gaattgagat ttgtcaactt 720

cctgtgggtg atgggattac tctgtgccgc cgcatcacct ga 762

<210> 11

<211> 705

<212> DNA

<213> Scutellaria barbata

<400> 11

atgattgaaa aatacaaccg caccattctc cagagcgatg tcctcagcaa gtacattttg 60

gaaacgagtg cctatcccag agaacatcaa caacttaaag agcttaggga agctacggtt 120

caaaagtaca aatcttggag tttgatgaac gtgcctgttg atgaagggct gtttatttcg 180

atgcttttga aaataatgaa tgcaaaaaag acaatagaag ttggggtttt cactggatac 240

tcgcttctct ctactgctct tgctctccct gatgatggca aaataattgc aattgatccc 300

gacaaagaag catatgagac tggtttgccc agcattgaga aggcaaatgt ggctcacaaa 360

attcacttca tccattctgc tggcatcgct tgcttggatg acctcatcac caacggggaa 420

gaaggcacat tcgattttgc ttttgtggat gcggacaaag caaactacat cagctatcat 480

gagaaactat tgaaattggt taagatcggg ggagttatcg gctacgacaa ctccctatgg 540

ttcggtactg tggcacatcc tgagaatgat gagatgttag actttgtgaa gacttgtaga 600

gcctatacgg tcgagttgaa ctcttttctt gcaagtgatt ctcgtatcga acttgcccat 660

ctttctattg gggatggact cactttgtgc agacgtctca aatga 705

<210> 12

<211> 759

<212> DNA

<213> Scutellaria barbata

<400> 12

atgacgaccg gcaatggcga cgcaccggtg atcaagaacg cccacagcga catcgacagc 60

accaacaaga cgctgctcaa gagcgacgcc ctgtacaagt atgtcctgga cacgacggtg 120

ctgccacggg agccggagtg catgcgcgat ctgcgcctca tcacggacaa gcaccagtgg 180

gggttcatgc agtcgtcggc ggatgaggcg cagctgctgg ggatgctgct gaagatggcc 240

ggagcgaaga ggacaatcga ggtgggtgtc ttcaccggct actcgctgct ggcgacggcg 300

ctggcgctgc cggaggacgg gaaggtggtg gcgatcgacc cggacaggga gagctacgag 360

atcgggcggc cgttcttgga gaaggccggg gtggcgcaca aggtggactt ccgcgagggg 420

aaggggctgg agaagctgga cgagctgctc gccgaggagg cggcggcggg gcgcgaggcg 480

gcgttcgact tcgcgttcgt ggacgcggac aagcccaact acgtcaagta ccacgagcag 540

ctgctgcagc tggtgcgcgt cggcgggcac atcgtgtacg acaacacgct gtgggccggc 600

acggtggcgc tgccgccgga cacgccgctg tcggacctgg accggaggtt ctccgtcgcc 660

atcagggacc tcaactccag gctcgccgcc gacccgcgca tcgacgtctg ccagctcgcc 720

atcgccgacg gcatcaccat ctgccgccgc ctcgtgtga 759

<210> 13

<211> 1095

<212> DNA

<213> Scutellaria barbata

<400> 13

atggcgttgc ctaatgcact tgcaaattca tccacacaag agattattga tgctcaatcc 60

catgtgtgga accacatttt aaacttcgta aactccatgt ccctcaaatg tgcacttcta 120

ttagctatac ctgatataat tcacaaacat ggcaagccaa tgacactttc tgaattagcc 180

aatgccatcc ccatcaacaa agcaaaattc aatgaccttt accaactaat gcgacttcta 240

acgcattcca agttcttcga caatgtcatg atctctaaaa gcgaggatga tgaagatgag 300

gaggaggctt attgtctcac aggggcttcg catctcttac tgagagacga gcccttgacc 360

ttggtgtatc tgacccttct cacactcgac ccgattataa tggatccggg gcattgtatg 420

agtgagtggt tccaaaacga ggaccccaca gcatttgtta ccaaacaagg gattccattt 480

tgggagtatg ccaaaggtga tgagagacta aatgtgctgt ttaataagtc catgtctgga 540

gatggagttg cgtgtaacat acttgttaaa gattgtagac aagtttttga gggtttgaaa 600

tcgatggtgg atgtcggagg cggcaacggg gccacggcca gagatatttc ggacgccttt 660

ccgggattga aatgcactgt tcttgacctt ccacaagttg ttgcaggctt ggaagggtct 720

gagaatgtga actacgtcag cggtgacatg tttgagttca tacctcatgc tgatgcgatt 780

ttctttaaga cgatattcca caactgggag gacgagaatt gtgttaaagt actaaaaaga 840

tgcaaagaag caatagttag aagcaagaac aatggtggaa aggtgatcat tattgatatg 900

gttgtggatg ataagaaaaa agatgatata ggaactgcaa cacaactctg cttgggtttg 960

ttaatgacga ttttattcag agggaaagag agaactgaga aagagtgggc taagatcttc 1020

ttccacgctg gctttcacaa ctataagata catcctgtct ttggattgag atctttgatt 1080

gaggtttttc catga 1095

<210> 14

<211> 1077

<212> DNA

<213> Scutellaria baicalensis

<400> 14

atggcattgc ctaaagcact tgcaaattca tcaacagaag agattcttga ggctcaatct 60

catgtgtgga accacatatt gagcttcata aactccatgt ccctaaaatg tgcacttgaa 120

ttaggtatac cagatataat ccacaaacat ggcaagccaa tgagtgtttc cgaattagtc 180

gaagccatcc cgaccaacaa agcaaaatcg aacgaactaa accttctaat gcgacttcta 240

acgcattcca agttcttcga catgagtgtc atgaacgatg atgaagaggc gtatagtctc 300

acacgggcct cgtatctctt gctgagagac gagcccttga ccttggtgca cctaaccctg 360

ctctcactcg acccgatcat gatggacccg gggcactaca tgagtgagtg gttcaagaat 420

gaggacctca catcatttgt tacccaacaa gggatgccat tttggcagta cgcaaaaggt 480

gatgagagac ttaatgaatt gtttaataag tccatgtctg gagatggagt ttcgttgaac 540

gtacttgtta gagattgcag acaggtcttt gagggtttgt catcaatggt ggacgtcgga 600

ggcggcaacg gggtcacggc cagaagcatc tccgacacct ttcccgggtt gaaatgcact 660

gttcttgacc ttccacaagc tgttgcaggc ttggaagggt ctgagaatgt gagctttgtt 720

agtggtgaca tgtttcactt cattcctcat gctgatgcca ttttgtttaa gaacgtattc 780

cacaactggg aggacgagga gtgtgttaaa gtactaagaa attgcaaaga agcacttggt 840

cgaggtgaga agagtggtgg aaaggtgata ataattgata tggtcgtgaa tgataagaga 900

aaagatgatc aaggaactga aacacaactg tgcttgggtt tgatgatgat gtatttgttc 960

cgaggaaaag agagaactga gaaagagtgg gctaagctct tcttcgattc gggctttcga 1020

agctataaga tacatcctgt cttagggttg agatctgtga ttgaggtttt tccatga 1077

Claims (9)

1.一种黄酮-O-甲基转移酶，其包括：具有如SEQ ID NO.1、2、3、4或5所示氨基酸序列的黄酮-8-甲基转移酶，和/或具有如SEQ ID NO.6或7所示氨基酸序列的黄酮-7-甲基转移酶。

2.编码权利要求1所述的黄酮-O-甲基转移酶的多核苷酸，其核苷酸序列如SEQ IDNO.8、9、10、11、12、13或14所示。

3.一种重组载体，其包含权利要求2所述的编码黄酮-O-甲基转移酶的多核苷酸。

4.一种重组的宿主细胞，其包括一种、两种或更多种权利要求3所述的重组载体。

5.权利要求1所述的黄酮-O-甲基转移酶的应用，其用于8-O-甲基黄酮、7-O-甲基黄酮或7,8-二甲氧基黄酮化合物的合成中；优选地，其用于汉黄芩素、异汉黄芩素或苏荠苧黄酮的合成中。

6.一种合成8-O-甲基黄酮的方法，其包括以下步骤：采用权利要求1中所述的黄酮-8-甲基转移酶进行催化的步骤；

优选地，所述黄酮-8-甲基转移酶是酶本身的形式，或者是权利要求4所述的重组宿主细胞形式；

优选地，所述8-O-甲基黄酮是汉黄芩素或苏荠苧黄酮。

7.根据权利要求6所述的方法，其包括以下步骤：

步骤(1)：构建重组载体，其包含编码具有如SEQ ID NO.1、2、3、4或5所示氨基酸序列的黄酮-8-甲基转移酶的多核苷酸；

步骤(2)：将一种、两种或更多种步骤(1)获得的重组载体转入宿主细胞；

步骤(3)：将步骤(2)获得的重组宿主细胞与底物一起发酵，产生8-O-甲基黄酮；

优选地，所述底物是去甲汉黄芩素或白杨素。

8.一种合成7-O-甲基黄酮的方法，其包括以下步骤：采用具有如SEQ ID NO.6或7所示氨基酸序列的黄酮-7-甲基转移酶进行催化的步骤；

优选地，所述黄酮-7-甲基转移酶是酶本身的形式，或者是权利要求4所述的重组宿主细胞形式；

优选地，所述7-O-甲基黄酮是异汉黄芩素或苏荠苧黄酮。

9.根据权利要求8所述的方法，其包括以下步骤：

步骤(1)：构建重组载体，其包含编码具有如SEQ ID NO.6或7所示氨基酸序列的黄酮-7-甲基转移酶的多核苷酸；

步骤(2)：将一种、两种或更多种步骤(1)获得的重组载体转入宿主细胞；

步骤(3)：将步骤(2)获得的重组宿主细胞与底物一起发酵，产生7-O-甲基黄酮；

优选地，所述底物是去甲汉黄芩素或白杨素。

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