CN116445519A - 一种糖基转移酶及其在生物合成丁香脂素葡萄糖苷中的应用 - Google Patents
一种糖基转移酶及其在生物合成丁香脂素葡萄糖苷中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了霍山石斛DhUGT34基因编码的糖基转移酶在生物合成丁香脂素葡萄糖苷中的应用，属于生物技术领域。DhUGT34基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或与SEQ IDNO.1所示序列完全互补配对，或为编码如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列。在体外利用DhUGT34蛋白进行酶催化的生物合成法得到丁香脂素葡萄糖苷，为合成丁香脂素糖苷提供新的方法。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体的是涉及一种丁香脂素的糖基化方法。
背景技术
丁香脂素是由两个芥子醇单元骈合而成的木脂素类化合物，是大血藤、杜仲等多种药用植物的重要活性物质。现代药理学研究表明，左旋和右旋丁香脂素均可促进神经元和神经突出分支的生长，且其中较为常见的右旋丁香脂素还具有抗炎、抗氧化、抗抑郁、刺激T细胞和B细胞增值等多种生物学活性。与大多数化合物一致，丁香脂素在自然界中多以其葡萄糖苷的形式存在。相较于苷元，糖苷的毒性更小，水溶性和稳定性更高；在药理活性上，丁香脂素葡萄糖苷在保留苷元原有活性的基础上兼具抗肝毒素和抗菌作用，因此丁香脂素葡萄糖苷在临床上具有更好的应用前景。
目前，糖苷类化合物通常有三种获取方式：植物提取、化学合成及生物合成。植物提取法工艺相对复杂，且大部分糖苷化合物在植物中的含量较低，提取过程需消耗大量药用植物资源，获取成本较高。化学合成法当前大多采用的保护-偶联-去保护的方式合成糖苷，具有效率高，选择性好等优点，但在糖基化过程中加入的基团保护剂及生产过程中出现的副产物大多无法实现再利用，容易对环境造成污染。另外，丁香脂素特殊的骈合结构在合成糖苷时会产生较多难以分离的异构体，且位于4号位的酚羟基糖基化较一般的醇羟基困难的多，这些原因导致当前关于化学合成丁香脂素葡萄糖苷的报道较少。相较而言，酶法糖基化具有高度的底物专一性和区域选择性，步骤简单，环境污染小，且符合绿色化学的理念。因此以工程酶催化为主体的生物合成法是生产多数糖苷化合物的理想方式。
糖基转移酶是生物体内糖苷合成通路中的关键酶，它可催化糖基从活化的供体分子转移到黄酮、蒽醌、香豆素、萜类等天然产物上形成其对应的糖苷化合物。碳水化合物活性酶数据库(Carbohydrate-active enzyme database，CAZy)中已收录的糖基转移酶数目已超过100万个，其中功能被表征的糖基转移酶，多数是以黄酮类化合物为催化底物，而木脂素类的糖基转移酶当前报道相对较少，且催化丁香脂素的糖基转移酶目前还未被报道。
发明内容
本发明主要针对上述技术问题，提供一种丁香脂素糖基化的方法，以解决现存化学合成丁香脂素糖苷系列的不足。
具体地，本发明提供如下技术方案：
一方面，本发明提供一种糖基转移酶基因，其序列为编码包含如SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的核苷酸序列，或与编码包含如SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的核苷酸序列全互补配对的序列。
在一个优选的实施例中，上述糖基转移酶基因序列为编码包含如SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的核苷酸序列，或与编码包含如SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的核苷酸序列全互补配对的序列。
在一个优选的实施例中，上述糖基转移酶基因序列为编码包含如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列，或与编码包含如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列全互补配对的序列。
在一个优选的实施例中，上述糖基转移酶基因序列为编码如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列，或与编码如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列全互补配对的序列。
在一个优选的实施例中，上述糖基转移酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，或与SEQ ID NO.1所示序列完全互补配对的核苷酸序列。
另一方面，本发明提供一种糖基转移酶，其氨基酸序列包含如SEQ ID NO.4所示序列。
在一个优选的实施例中，上述糖基转移酶的氨基酸序列包含如SEQ ID NO.3所示序列。
在一个优选的实施例中，上述糖基转移酶的氨基酸序列为包含如SEQ ID NO.2的序列。
在一个优选的实施例中，上述糖基转移酶的氨基酸序列为如SEQ ID NO.2所示序列。
另一方面，本发明提供一种糖基转移酶基因在合成丁香脂素糖苷系列糖苷类化合物中的应用，所述糖基转移酶基因的核酸序列为编码包含如SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的核苷酸序列，或与编码包含如SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的核苷酸序列全互补配对的序列。
在一个优选的实施例中，上述糖基转移酶基因序列为编码包含如SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的核苷酸序列，或与编码包含如SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的核苷酸序列全互补配对的序列。
在一个优选的实施例中，上述糖基转移酶基因序列为编码包含如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列，或与编码包含如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列全互补配对的序列。
在一个优选的实施例中，上述糖基转移酶基因序列为编码如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列，或与编码如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列全互补配对的序列。
在一个优选的实施例中，上述糖基转移酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，或与SEQ ID NO.1所示序列完全互补配对的核苷酸序列。
另一方面，本发明提供一种糖基转移酶在合成丁香脂素糖苷系列糖苷类化合物中的应用，所述糖基转移酶的氨基酸序列包含如SEQ ID NO.4所示序列。
在一个优选的实施例中，上述糖基转移酶的氨基酸序列包含如SEQ ID NO.3所示序列。
在一个优选的实施例中，上述糖基转移酶的氨基酸序列包含如SEQ ID NO.2所示序列。
在一个优选的实施例中，上述糖基转移酶的氨基酸序列为如SEQ ID NO.3所示序列。
另一方面，本发明提供一种合成丁香脂素糖苷系列糖苷类化合物方法，所述方法包含如下步骤：
1)获得包含如SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的糖基转移酶；
2)利用步骤1)中的糖基转移酶在酶活反应体系中催化合成丁香脂素糖苷系列糖苷类化合物。
在一个优选的实施例中，通过原核表达获得上述糖基转移酶。
在一个优选的实施例中，通过化学合成获得上述糖基转移酶。
在一个优选的实施例中，酶活反应体系中含有上述糖基转移酶、UDP-Glc以及(±)-丁香脂素。
在一个优选实施例中，酶活反应体系中还含有二价阳离子。
在一个优选实施例中，酶活反应体系的反应温度为10-70℃。
在一个优选实施例中，酶活反应体系的PH为8.0-10.0。
在一个优选实施例中，酶活反应体系具体为20μg纯化糖基转移酶、5mM Mg2+、14mMβ-巯基乙醇、5mM UDP-Glc、0.5mM(±)-丁香脂素，用50mM，pH＝9.0的Tris-HCl缓冲液补充至200μL，于50℃反应12h。
在一个优选实施例中，酶活反应体系为上述反应体系的各组分含量的等比例扩大或缩小，PH＝9.0，于50℃反应12h。
在一个优选的实施例中，上述糖基转移酶的氨基酸序列包含如SEQ ID NO.3所示序列。
在一个优选的实施例中，上述糖基转移酶的氨基酸序列包含如SEQ ID NO.2所示序列。
在一个优选的实施例中，上述糖基转移酶的氨基酸序列为如SEQ ID NO.3所示序列。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1)本发明相较于现有技术，本发明是首次利用酶催化的生物合成法得到丁香脂素葡萄糖苷，较化学合成法具有步骤更简单、污染更小、产物更单一等优点。
2)本发明中的糖基转移酶对左旋和右旋丁香脂素均具有催化活性，可分别生成对应旋光性的丁香脂素单、双葡萄糖苷。
3)本发明中的该糖基转移酶具有非常好的热稳定性。
4)本发明中的该糖基转移酶无金属离子依赖性，但Mg2+、Mn2+、Ca2+和Ba2+可提高其催化活性。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式，对本发明的方法及其有益效果进行详细说明。
图1为以霍山石斛cDNA为模板扩增目的基因片段的电泳结果图；
图2为Nde I和BamH I双酶切重组质粒的电泳验证图；
图3为pET-28a(+)-DhUGT34融合蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳图；
图4A为(-)-丁香脂素及其葡萄糖苷的标准品和糖基化产物的UV色谱图；
图4B为(-)-丁香脂素糖基化产物的单糖苷质谱图；
图4C为(-)-丁香脂素糖基化产物的双糖苷质谱图；
图5A为(+)-丁香脂素及其葡萄糖苷的标准品和糖基化产物的UV色谱图；
图5B为(+)-丁香脂素糖基化产物的单糖苷质谱图；
图5C为(+)-丁香脂素糖基化产物的双糖苷质谱图；
图6A为本发明的糖基转移酶以(-)-丁香脂素为底物时的反应温度、pH、金属离子、反应时间的折线图；
图6B为本发明的糖基转移酶以(-)-丁香脂素为底物时的动力学参数图。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另有定义，本申请所使用的所有技术和科技术语具有本申请所属技术领域的普通技术人员所通常理解的相同含义。
实施例1
目标糖基转移酶基因的克隆
1、提取霍山石斛茎段RNA，按照反转录试剂盒(R333，南京诺唯赞生物科技股份有限公司)操作说明将其反转录成cDNA，利用PCR技术克隆目的基因，具体引物信息为：
上游引物：5'ATGGATAACGGAGCAAGGCA 3'
下游引物：5'CTACGCCGTCGGGAAACTC 3'
PCR反应体系为：2×Phanta Max Master Mix(Dye Plus)(P515，南京诺唯赞生物科技股份有限公司)25μL，上下游引物各2μL，模板50-100ng，dd H2O补至50μL。PCR扩增程序为：①95℃反应3min；②95℃反应15s、60℃反应45s、72℃反应60s，共循环35次；③72℃延伸5min。反应结束后，用1％琼脂糖凝胶电泳检测产物大小，电泳图见图1(M：DL 2000marker；Lane 1：DhUGT34基因)
2、将扩增产物与T载体相连(C601，南京诺唯赞生物科技股份有限公司)，并转化至大肠杆菌DH5α中，挑选单菌落于LB培养基中培养并进行菌液PCR验证，菌液PCR反应体系为：12.5μL Green Taq Mix(P131，南京诺唯赞生物科技股份有限公司)，上下游引物各1μL，2μL模板(菌液)，以dd H2O补至25μL。将菌液PCR结果正确的样本送去测序。
测序所得核苷酸序列如SEQ ID NO.1，与基因组序列相似度为99％，以实际基因克隆所得的测序结果为准。该基因序列含有1419个核苷酸，编码472个氨基酸(SEQ ID NO.2所示)。
SEQ ID NO.1:
ATGGATAACGGAGCAAGGCAACCTCACATTGTCTTCTTCCCCAGTGCCGGCATGGGCCACATTTTACCCATGGCCGAGCTCGCCAAACTCCTCGTCGACCGCCACCACTTCACCGTTACCTTCATCACCTTTTCCGAATACTCGAACAAAACACAGGACGCTTTCCTCGCCTCCCTCCCTTCCTCCATCACCTCCCTTTCCCTTCCCCCAATCCCTCTCTCCGATCTTCCCGAAAATTCCGCCGTTGAAACCCGCATGTCCATTGCCGCAGCCCGCTCAGTCCCTCACCTGCGCTCCCTCCTCCTACCCCTCCTGTCCTCAACGCGTCTCGTCGCCTTCATCGCCGATCTCTTCACCACCGCCGGCTGCGACGCCGCGAAAGCCCTCAAAATTCGACATTTCATCTTCATCCCCACGAATTTACTCTTCGTCACCCTCATGTTCCATCTCCCCGCTCTCAACGCCGAGCTCTCCTGCGATTTCTGGGAGCTCGAGCAGCCAGTTCTCCTTCCCGGCTACCCCCCCATCCCCGGCACCGAAATCCTCCACCCGCTTCAAGACCGGAAGAACGAATGCTACAGATGGATGCTTGAGCACGCCAAGCGTTACCGTGAAGCGGAAGGCATTTTGGTAAACACCTTCGACGCAATCGAACCAGAGGCCGCGAACCTTCTCAAGAAAGAAGAACCAGGTCGGGCCACGGTGTACGCCGTCGGCCCGCTGATTCGCGCTCACGCAGTCTCCGGCGAGGAAGGTGCCCACTGCTTAAGATGGCTCGATTCACAGCCAACCGGATCCGTTCTTTTCGTCTCCTTCGGCAGCGTGGGATCTCATTCAACGGAGCAACTAGGCGAGCTCGCGCTGGGATTAGAGGCGAGTGGGCAACGTTTCCTCTGGGTTGTTCGAACCCCCGTCGATCTAAAATCTGTTGGGTCTAATTACATCGAGGCGCAGAACGCAGACAACCCATTAGCGTATTTACCTGAAGGGTTTTTGGAGCGGACGAAAGGGGTTGGCTTGGTGGTTCCTTCCTGGGCACCGCAAGTGGATATTTTGGCTCATTCTTCAACTGGTGGATTTTTGTCGCACTGTGGATGGAACTCGACCTTGGAGAGCATGTCGCGTGGCGTGCCGATGATTGTTTGGCCGCTATTTGCAGAACAGAGGATGAACGCGGTCATGATGGTAGAGGGAGCGAAGGTGGCGATGAGGTTAAAGGCGAGGAAAGATGGAATTTTTGACAGAAAGAAGATTAGCCGGGTTGTGAAGAACTTGATGGAGGGGGAGGAAGGTGAGAGGTTGAGGAAGAGGGCAAAGGAGCTTCAGGTGGAGGCGGCGGCCGCGATGACTGAAGGTGGTTCGTCATCGGTAGCGCTGGCAGCGTTTGCGGAGAAATTGAAGAGTTTCCCGACGGCGTAG
SEQ ID NO.2:
MDNGARQPHIVFFPSAGMGHILPMAELAKLLVDRHHFTVTFITFSEYSNKTQDAFLASLPSSITSLSLPPIPLSDLPENSAVETRMSIAAARSVPHLRSLLLPLLSSTRLVAFIADLFTTAGCDAAKALKIRHFIFIPTNLLFVTLMFHLPALNAELSCDFWELEQPVLLPGYPPIPGTEILHPLQDRKNECYRWMLEHAKRYREAEGILVNTFDAIEPEAANLLKKEEPGRATVYAVGPLIRAHAVSGEEGAHCLRWLDSQPTGSVLFVSFGSVGSHSTEQLGELALGLEASGQRFLWVVRTPVDLKSVGSNYIEAQNADNPLAYLPEGFLERTKGVGLVVPSWAPQVDILAHSSTGGFLSHCGWNSTLESMSRGVPMIVWPLFAEQRMNAVMMVEGAKVAMRLKARKDGIFDRKKISRVVKNLMEGEEGERLRKRAKELQVEAAAAMTEGGSSSVALAAFAEKLKSFPTA
实施例2
保守结构域预测
将实施例1中的SEQ ID NO.2提交到InterProScan预测其保守结构域(选择CDD和pFAM数据库)，结果显示该序列含有CDD数据库的GT1_Gtf-like结构域，以及Pfam数据库的UDPGT结构域。
GT1_Gtf-like结构域为如SEQ ID NO.3所示的序列，UDPGT结构域为如SEQ IDNO.4所示的序列。上述2个序列均是糖基转移酶保守结构域，可能为SEQ ID NO.2发挥特殊催化作用相关。
SEQ ID NO.3：
PHIVFFPSAGMGHILPMAELAKLLVDRHHFTVTFITFSEYSNKTQDAFLASLPSSITSLSLPPIPLSDLPENSAVETRMSIAAARSVPHLRSLLLPLLSSTRLVAFIADLFTTAGCDAAKALKIRHFIFIPTNLLFVTLMFHLPALNAELSCDFWELEQPVLLPGYPPIPGTEILHPLQDRKNECYRWMLEHAKRYREAEGILVNTFDAIEPEAANLLKKEEPGRATVYAVGPLIRAHAVSGEEGAHCLRWLDSQPTGSVLFVSFGSVGSHSTEQLGELALGLEASGQRFLWVVRTPVDLKSVGSNYIEAQNADNPLAYLPEGFLERTKGVGLVVPSWAPQVDILAHSSTGGFLSHCGWNSTLESMSRGVPMIVWPLFAEQRMNAVMMVEGAKVAMRLKARKDGIFDRKKISRVVKNLMEGEEGERLRKRAKELQVEAAAA
SEQ ID NO.4：
GSVLFVSFGSVGSHSTEQLGELALGLEASGQRFLWVVRTPVDLKSVGSNYIEAQNADNPLAYLPEGFLERTKGVGLVVPSWAPQVDILAHSSTGGFLSHCGWNSTLESMSRGVPMIVWPLFAEQRMNAVMMVEGAKVAMRLK
实施例2
pET-28a(+)-DhUGT34重组质粒的构建及融合蛋白的诱导表达
1、设计带有表达载体pET-28a(+)多克隆酶切位点的特异引物，其引物序列为：
上游引物：5'gtgccgcgcggcagccatatgATGGATAACGGAGCAAGGCA 3'
下游引物：5'acggagctcgaattcggatccCTACGCCGTCGGGAAACTC 3'
2、以测序正确的T载体为模板，用上述特异引物扩增目标基因，利用胶回收试剂盒(DC301，南京诺唯赞生物科技股份有限公司)回收目PCR产物，通过同源重组酶(C112，南京诺唯赞生物科技股份有限公司)将基因连接至经Nde I和BamH I双酶切过的pET-28a(+)载体中。随后连接产物被转化至DH5α感受态细胞中，并于LB培养基中培养。如图2所示(M：DL 5000marker；Lane 1：经双酶切处理的重组质粒)，所得的重组质粒经Nde I和BamH I限制性内切酶酶切后，得到了三段条带，其中后两条带是因DhUGT34基因的793号碱基存在一个BamH I酶切位点所致。
3、将得到的重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)细胞中，并挑选阳性克隆子至LB培养基中培养，当OD600＝0.6～0.8(以无菌LB培养基为对照)时，加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.5mM，16℃过夜诱导表达目的蛋白。
4、收集诱导表达后的菌体，悬浮于pH＝9.0的Tris-HCl缓冲液中，并超声破碎，所得上清即为粗酶液。根据融合蛋白上的His-Tag标签，采用镍亲和层析柱纯化目的蛋白，利用不同浓度的咪唑溶液洗脱目的蛋白，最后以10％的SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的分子量及纯度。如图3所示(M：15-150kDa蛋白Marker；Lane 1：粗酶液；Lane 2：纯化后的蛋白酶液)，粗酶液存在较多杂带，且无法判断目的基因的表达情况；而纯化后的蛋白酶液在电泳图中条带单一，大小与理论蛋白加上重组标签的分子量相符，表明该蛋白在上清液中成功表达，且纯化出的蛋白可用于后续实验。为提高纯化蛋白的浓度，用30kDa超滤管离心浓缩目的蛋白，并用BCA蛋白定量试剂盒(E 112，南京诺唯赞生物科技股份有限公司)检测蛋白浓度，浓度为1.85mg/mL。
实施例3
体外酶活检测
1、酶活反应体系：在1.5ml离心管中加入20μg纯化蛋白、5mM Mg2+、14mMβ-巯基乙醇、5mM UDP-Glc、0.5mM(±)-丁香脂素，用50mM，pH＝8.0的Tris-HCl缓冲液补充至200μL，于37℃水浴锅中反应12h，待反应结束后，用三倍量的乙酸乙酯萃取三遍，合并萃取液于旋转蒸发仪上45℃旋干，后用甲醇超声溶解，14000rpm离心5min，取上清液进LC-MS检测。
2、HPLC条件
HPLC型号：Waters ACQUITY Arc
流动相：A相：0.1％甲酸水溶液；B相：乙腈。
洗脱梯度：0-5min：5％-20％B；5-8min：20％-22％B；8-17min：22-25％B；17-23min：25-35％B；23-25min：35-50％B；25-32min：50-95％B；32-37min：95％ B；37-38min：95-5％ B；38-42min：5％ B。
检测波长：272nm。
3、LC-MS条件：
色谱柱型号：Waters ACQUITY UPLC BEH C18 column(2.1×100mm,1.7μm)
流动相：A相：0.1％甲酸水溶液；B相：乙腈。
洗脱梯度：0-0.5min：5％ B；0.5-1.5min：5-10％ B；1.5-4min：10-25％ B；4-7min：25-35％ B；7-9.5min：35-65％ B；9.5-10.5min：65-85％ B；10.5-11.5min：85-95％B；11.5-12.5min：95％ B；12.5-13.5min：95-5％ B；13.5-15min：5％ B。
质谱条件：电喷雾离子源；采集模式为AutoMS2；负离子模式；毛细管电压3500V；鞘气温度350℃，流速11L/min；干燥气温度325℃，流速8L/min；质荷比扫描范围为100-1700m/z；碰撞电压175V；碰撞能量15-50eV。
5、检测结果：
通过比对标准品的保留时间和相对分子质量，发现重组酶pET-28a(+)-DhUGT34对左旋、右旋丁香脂素的催化产物的主峰质荷比较底物多出162(产物增加的分子量为一个葡萄糖和脱去一分子水后的差值)，证明该产物为单葡萄糖苷。另外还观察到有少部分单糖苷继续接纳糖供体变为双糖苷。以上结果表明pET-28a(+)-DhUGT34重组酶可催化丁香脂素生成其单、双糖苷，其中单糖苷是其主要产物。
实施例3
重组蛋白pET-28a(+)-DhUGT34酶促动力学参数检测
为进一步了解重组蛋白的催化特性，我们检测了pH、温度、金属离子、反应时间对丁香脂素催化活性的影响。以(-)-丁香脂素为反应底物，UDP-Glc为糖供体，β-巯基乙醇为抗氧化剂。
1、温度：在总体积为200μL的Tris-HCl(50mM，pH＝8.0)反应体系中加入了14mMβ-巯基乙醇，5mM UDP-Glc，20μg蛋白，0.5mM底物，在4、20、30、37、40、42、50、60、70℃下反应12h，对反应的最适温度进行考察。
2、pH：在总体积为200μL、50mM的不同缓冲液(pH＝5.0-6.0的柠檬酸-柠檬酸钠、pH＝6.0-8.0的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠、pH＝7.0-9.0的Tris-HCl、pH＝9.0-10.0的碳酸钠-碳酸氢钠)体系中包含了14mMβ-巯基乙醇，5mM UDP-Glc，20μg蛋白，0.5mM底物，在不同类型缓冲液中50℃反应12h，对反应的最适pH进行考察。
3、金属离子：在总体积为200μL的Tris-HCl(50mM，pH＝9.0)反应体系中加入了14mMβ-巯基乙醇，5mM UDP-Glc，20μg纯化蛋白，0.5mM底物，5mM的二价金属离子，于50℃下反应12h。观察不同的二价金属离子及EDTA·2Na对催化效率的影响。
4、反应时间：在总体积为200μL的Tris-HCl(50mM，pH＝9.0)反应体系中加入了14mMβ-巯基乙醇，5mM UDP-Glc，20μg蛋白，0.5mM底物，5mM的Ba2+,于50℃下反应2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24h，检测不同的反应时间内，酶催化效率的变化规律。
5、米氏常数Km：酶活反应体系总体积为200μL，其中包括：10μg蛋白与5mM的UDP-Glc，底物浓度为50-300μM(分别为50、100、150、200、250、300μM)，用pH＝9.0、50mM的Tris-HCl补充至200μL，在50℃下反应30min，然反应结束后立即用等体积预冷的甲醇终止反应，14000rpm高速离心5min后，取20μL进HPLC检测，液相条件如上。米氏常数是通过米氏方程与双倒数作图法法(Lineweaver-Burk plot)计算获得。
6、检测结果：
重组蛋白pET-28a(+)-DhUGT34催化丁香脂素的最佳反应温度为50℃，且在60℃时仍有一定的催化效率，表明该重组蛋白对高温具有较强的耐受性；重组蛋白的最佳反应pH为9.0，且在Tris-HCl中的反应速率较碳酸钠-碳酸氢钠中高得多；重组蛋白对金属离子没有依赖性，但Ba2+、Ca2+、Mn2+和Mg2+可提高其催化效率；重组蛋白的催化效率在一定范围内与反应时间呈现正相关，且随着反应时间的延长缓慢增加，但在12h时反应速率已达90％左右，因此选取12h为该催化反应的最佳时间。最终通过计算，得出上述重组蛋白对(-)-丁香脂素的Km值为95.35μM。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对上述实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (10)
1.一种糖基转移酶基因，其序列为编码包含如SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的核苷酸序列，或与编码包含如SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的核苷酸序列全互补配对的序列。
2.一种糖基转移酶，其氨基酸序列包含如SEQ ID NO.4所示序列。
3.一种糖基转移酶基因在合成丁香脂素糖苷系列糖苷类化合物中的应用，所述糖基转移酶基因的序列为编码包含如SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的核苷酸序列，或与编码包含如SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的核苷酸序列全互补配对的序列。
4.一种糖基转移酶在合成丁香脂素糖苷系列糖苷类化合物中的应用，所述糖基转移酶序列包含如SEQ ID NO.4所示序列。
5.一种合成丁香脂素系列糖苷类化合物方法，所述方法包含如下步骤：
1)获得包含如SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的糖基转移酶；
2)利用上述糖基转移酶在酶活反应体系中催化合成丁香脂素糖苷系列糖苷类化合物。
6.如权利要求5所述的一种合成丁香脂素糖苷系列糖苷类化合物方法，其特征在于，步骤1)中通过原核表达获得糖基转移酶或通过化学合成获得糖基转移酶。
7.如权利要求5所述的一种合成丁香脂素糖苷系列糖苷类化合物方法，其特征在于，步骤2)中酶活反应体系中含有上述糖基转移酶、UDP-Glc以及(±)-丁香脂素。
8.如权利要求5所述的一种合成丁香脂素糖苷系列糖苷类化合物方法，其特征在于，步骤2)中酶活反应体系中还含有二价阳离子。
9.如权利要求5所述的一种合成丁香脂素糖苷系列糖苷类化合物方法，其特征在于，步骤2)中酶活反应体系的反应温度为10-70℃。
10.如权利要求5所述的一种合成丁香脂素糖苷系列糖苷类化合物方法，其特征在于，步骤2)中酶活反应体系的PH为8.0-10.0。
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