KR20240048579A - 신규한 단백질, 이를 포함하는 플로레틴 제조용 조성물 및 제조 방법 - Google Patents

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KR20240048579A
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Abstract

본 발명은 신규한 단백질, 이를 포함하는 플로레틴 제조용 조성물 및 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 신규한 단백질은 β-글루코시데이스 활성이 우수하며, 상기 단백질을 포함하는 플로레틴 제조용 조성물 및 제조 방법으로 넓은 범위의 pH 조건 하에서 독성물이나 환경오염을 유발하는 부산물의 발생 없이 높은 수율로 플로레틴을 제조할 수 있다

Description

신규한 단백질, 이를 포함하는 플로레틴 제조용 조성물 및 제조 방법{NOVEL PROTEIN, COMPOSITION AND METHOD FOR PRODUCING PHLORETIN COMPRISING THE SAME}
본 발명은 신규한 단백질, 이를 포함하는 플로레틴 제조용 조성물 및 제조 방법에 관한 것이다.
생체촉매(biocatalyst)는 다양한 화학 반응을 촉매할 수 있는 정제된 효소 및 전세포(whole cells)와 같은 생물학적 시스템이다. 효소는 광범위한 분자를 기질로 받아들일 수 있으며, 광범위한 범위의 화학 물질에 대해 높은 촉매 활성을 나타내기 때문에 화학물질의 합성, 바이오센서 및 환경 정화 분야에서 생체촉매로 활용된다. 특히, 효소를 이용한 생물전환 기술은 기존의 화학합성법으로는 합성하기 어려운 입체특이적(stereoselectivity) 및 위치특이적(regioselectivity) 반응을 촉매하여 친환경적으로 고순도의 화학물질을 생산할 수 있다.
β-글루코시데이스 (β-glucosidase)는 식물, 동물, 미생물에서 널리 발견되며, 글리코시드 결합을 가수분해하여 β-D-글루코실 (β-D-glucosyl) 잔기를 방출하는 것이다. 일반적으로 살아있는 유기체에서 발견되며, 포도당 대사에서 중요한 역할을 한다.
β-글루코시데이스는 식품 발효 산업에서 이소플라본 글리코사이드와 피리독신 글루코시드와 같은 많은 종류의 글리코시드를 가수분해할 수 있기 때문에 광범위하게 연구되고 있으며, 특히 과일 와인의 향을 개선하기 위해 연구되고 있다. 또한, 바이오 에너지 분야에서 리그노셀룰로오스 바이오매스를 발효당으로 전환하기 위해 사용될 수 있으며, 이는 환경에 대한 화석 연료의 영향과 이러한 비재생 연료의 부족을 완화하는 데 도움이 된다.
락토바실러스(Lactobacillus) 유래 β-글루코시데이스는 다른 미생물에서 유래한 β-글루코시데이스에 비해 산업적 적용 시 노출되는 높은 산, 에탄올 농도, 금속, 첨가제 및 저온 등에서 높은 활성을 보존할 수 있기 때문에 산업적 잠재력이 높다. 하지만, 낮은 발현으로 인해 야생형 락토바실러스 배양액으로부터 얻은 β-글루코시데이스의 농도는 일반적으로 매우 낮다. 실제 사용을 위해서는 β-글루코시데이스의 고생산이 필수적이며, 유전공학은 β-글루코시데이스의 외인성 고효율 발현을 달성하기 위한 효과적인 수단이다.
현재, 상업적으로 이용 가능한 β-글루코시데이스는 3종이 있다. 아몬드(Almond) 유래 β-글루코시데이스(sigma-aldrich)는 크루드(crude) 형태로 제공되며, 아스페르길루스 니제르(Aspergillus niger) 유래 글루코시데이스(sigma-aldrich)는 α- 및 β-글루코시데이스를 포함하고 있다. 또한, ACRO Biosystems(미국) 사의 사람 유래 글루코실세라미데이스(glucosylceramidase)는 재조합 단백질로 20 μg 기준 약 418,500원으로 초고가이다. sigma-aldrich에서 구입 가능한 β-글루코시데이스는 원물의 차이에 따라 활성이 일정하지 않고 크루드 형태로 제공하기 때문에 타 효소의 활성이 남아 있을 수 있으며 고가이므로 산업적 적용이 어렵다. 따라서, 산업적으로 적용 가능한 효소활성이 일정하고 불순물이 없는 형태의 β-글루코시데이스의 개발이 요구된다.
플로레틴(phloretin)은 천연 페놀의 한 종류인 다이하이드로칼콘(dihydrochalcone)이며, 사과, 배 등 즙이 많은 과실 및 사과나무 잎 등 식물에서 발견된다. 플로레틴은 항염, 항암 등 다양한 생물학적 및 약리학적 활성을 나타내며 화장품 성분으로 사용된다. 또한 플로레틴이 사람의 건강에 유익한 역할을 하는 것으로 알려져 있고 천연물 연구의 중요한 관심이 되고 있다.
플로레틴을 포함하는 식품첨가물, 건강 보조 식품, 건강 기능성 식품, 의약품, 화장품 및 바이오소재 등의 생산을 위해 플로레틴의 합성 또는 식물 원물로부터의 추출이 필요하다. 복잡한 구조의 폴리페놀화합물인 플로레틴은 화학적 방법으로 생산하기 어려우며, 식물 원료에서 추출할 경우 수득율이 낮거나 원료의 수급과 원물의 차이에 따라 수득율이 상이할 수 있고, 단일물질로 정제하기 어려울 수 있다. 따라서 플로레틴의 산업적 활용을 위해 고순도의 플로레틴을 제공하는 기술이 요구된다.
본 발명에서는, 신규 β-글루코시데이스를 제공하고 이를 이용하여 화학적으로 합성되기 어려운 플라보노이드 비배당체를 선택적으로 생산할 수 있는 기술을 제공한다.
한국등록특허 제1816600호
본 발명은 β-글루코시데이스(β-glucosidase) 활성이 우수한 신규한 단백질을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 넓은 범위의 pH 조건 하에서 높은 수율로 플로레틴(phloretin)을 제조할 수 있는 상기 신규한 단백질을 포함하는 플로레틴 제조용 조성물 및 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질.
2. 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자.
3. 위 1의 단백질을 포함하는 플로레틴(phloretin) 제조용 조성물.
4. 플로리진(phlorizin)을 위 1의 단백질과 반응시키는 단계를 포함하는 플로레틴(phloretin) 제조 방법.
5. 위 4에 있어서, 상기 반응은 pH 3 내지 pH 9 버퍼 하에 수행되는, 플로레틴 제조 방법.
6. 위 4에 있어서, 상기 반응 후에 에틸 아세테이트를 처리하는 단계를 더 포함하는, 플로레틴 제조 방법.
7. 위 4에 있어서, 상기 반응 결과물의 원심 분리 상층액으로부터 플로레틴을 수득하는 단계를 더 포함하는, 플로레틴 제조 방법.
본 발명의 신규한 단백질을 포함하는 플로레틴(phloretin) 제조용 조성물 및 제조 방법은 넓은 범위의 pH 조건 하에서 독성물이나 환경오염을 유발하는 부산물의 발생 없이 높은 수율로 플로레틴을 제조할 수 있다.
도 1은 형질전환체에서 과발현되어 분리 및 정제된 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 SDS-PAGE로 확인한 사진이다.
도 2는 정제된 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질의 β-glucosidase (베타-글루코시데이스) 활성을 확인한 것이다.
도 3은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질의 최적 pH(도 3A) 및 온도(도 3B)를 나타내는 그래프이다.
도 4는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질의 Vmax와 Km을 나타내는 그래프이다.
도 5는 시중의 아몬드 유래 베타-글루코시데이스(도 5의 Almond) 및 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질(도 5의 NGI14)을 이용하여 플로리진(phlorizin)으로부터 플로레틴(phloretin)이 생성된 것을 확인한 크로마토그램이다.
도 6은 시중의 아몬드 유래 베타-글루코시데이스(도 6의 Almond) 및 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질(도 6의 NGI14)을 이용하여 플로리진으로부터 플로레틴의 생성에 미치는 pH 영향을 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질에 관한 것이다.
상기 단백질은 β-글루코시데이스(β-glucosidase) 효소일 수 있다.
이는 락토바실러스(Lactobacillus) 속 미생물로부터 유래한 효소일 수 있다. 상기 락토바실러스 속 미생물은 예를 들면 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 단백질은 글리코시드(glycoside) 결합에 대한 가수 분해 활성을 가질 수 있다. 상기 가수 분해 활성은 구체적으로 β-D-글루코오스(β-D-glucose)의 방출을 수반하는, 말단 비환원 β-D-글루코실 잔기(β-D-glucosyl residues)를 가수 분해하는 활성일 수 있다.
상기 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어질 수 있고, 또는 상기 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내(즉, 단백질이 동일한 생물학적 활성을 나타내는 범위)에서 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합에 의해서 상이한 서열을 가지는 아미노산의 변이체들 또는 단편들일 수 있다. 상기 단백질의 기능은 β-글루코시데이스 효소 활성일 수 있고, 상기 β-글루코시데이스 효소 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드 수준에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 경우에 따라서는 인산화 (phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화 (acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화 (farnesylation) 등으로 변형될 수 있다.
본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자에 관한 것이다.
상기 유전자는 서열번호 2의 염기 서열로 이루어진 것일 수 있다.
상기 유전자는 암호화 영역으로부터 발현되는 상기 단백질 또는 이의 활성 단편의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 암호화 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 또한 암호화 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변이가 이루어질 수 있다. 예를 들어, 상기 유전자는 상기 단백질과 동등한 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 한, 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있다.
상기 유전자를 이용하여 상기 단백질을 제조할 수 있다. 예를 들어, 상기 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제작하고, 이를 숙주 세포에 도입하여 숙주 세포를 형질전환시킨 후, 이를 배양하여 이로부터 상기 단백질을 분리하고 정제할 수 있다.
상기 재조합 발현 벡터는 예를 들어 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파지 벡터 또는 바이러스 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 재조합 발현 벡터는 프로모터(promoter), 터미네이터(terminator), 인핸서(enhancer) 등과 같은 발현 조절 서열 또는 분비를 위한 서열 등이 상기 숙주 세포의 종류에 따라 적합하게 조합된 것일 수 있다. 또한 상기 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에 벡터가 제대로 들어갔는지 확인하기 위한 선택 마커를 추가로 포함할 수 있고, 복제 가능한 발현 벡터인 경우 복제 기원을 더 포함할 수 있다.
상기 재조합 발현 벡터는 발현 단백질의 정제를 용이하게 하기 위한 서열을 더 포함할 수 있다. 예를 들어 발현 단백질을 암호화하는 유전자에 작동 가능하도록 분리정제용 태그를 암호화하는 유전자를 더 포함할 수 있다. 상기 분리정제용 태그는 예를 들어 GST, poly-Arg, FLAG, 히스티딘-태그(His-tag), c-myc 또는 이들 중 둘 이상을 순차적으로 연결한 것일 수 있다.
상기 재조합 발현 벡터를 상기 숙주 세포에 도입시키는 방법은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법이 제한 없이 사용될 수 있다. 예를 들어, 열 충격법 또는 전기 충격법 등의 방법으로 수행될 수 있다.
상기 숙주 세포는 박테리아, 효모, 대장균, 진균류, 식물 세포 또는 동물 세포일 수 있다. 구체적인 예를 들면, 상기 숙주 세포는 대장균(E. coli BL21(DE3), DH5α 등) 또는 효모 세포(Saccharomyces 속, Pichia 속 등)일 수 있다.
재조합 발현 벡터가 도입된 숙주 세포, 즉 형질전환체를 배양하는 방법은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법이 제한 없이 사용될 수 있으며, 배양 온도, 배양 시간 및 배지 조건 등은 통상의 기술자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
배양된 형질전환체로부터 상기 단백질을 분리 및 정제하는 방법은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법이 제한 없이 사용될 수 있다. 예를 들어, 분리의 경우 원심분리 또는 여과 등이 사용될 수 있으며, 정제의 경우 염석(예컨대, 황산암모늄 침전, 인산나트륨 침전), 용매 침전(아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 및 침전), 투석, 겔 여과, 이온 교환, 칼럼 크로마토그래피, 한외 여과 또는 이들 중 둘 이상의 조합이 사용될 수 있다.
본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 포함하는 플로레틴(phloretin) 제조용 조성물에 관한 것이다.
상기 단백질은 전술한 범위 내의 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물을 이용하면 플로리진(phlorizin)으로부터 플로레틴을 제조할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 조성물은 산성 조건뿐만 아니라 염기성 조건을 포함하는 넓은 범위의 pH 조건 하에서 독성물이나 환경오염을 유발하는 부산물의 발생 없이 플로리진으로부터 높은 수율의 플로레틴을 제조할 수 있다.
본 발명은 플로리진(phlorizin)을 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 반응시키는 단계를 포함하는 플로레틴(phloretin) 제조 방법에 관한 것이다.
상기 단백질은 전술한 범위 내의 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 반응에서 플로리진은 상기 단백질과 반응하여 β-D-글루코오스(β-D-glucose)의 방출을 수반하며 플로레틴으로 전환될 수 있다.
상기 반응은 상기 단백질의 활성이 유지되는 pH 범위의 버퍼 하에서 수행될 수 있고, 상기 pH 범위는 예를 들면 pH 2 내지 pH 10, pH 3 내지 pH 9, pH 3 내지 pH 7 또는 pH 3 내지 pH 6일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 반응은 상기 단백질의 활성이 유지되는 온도 범위에서 수행될 수 있고, 상기 온도 범위는 예를 들면 20℃ 내지 60℃, 25℃ 내지 50℃ 또는 30℃ 내지 45℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 제조 방법은 상기 반응 후에 에틸 아세테이트를 처리하는 단계를 더 포함할 수 있다.
에틸 아세테이트를 처리함으로써 상기 반응을 종료시킬 수 있다.
에틸 아세테이트는 상기 반응의 반응물인 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 또는 플로리진과 반응하여 플로리진이 상기 단백질과 반응하지 못하도록 하는 것일 수 있다.
본 발명의 제조 방법은 에틸 아세테이트 처리 후에 상기 반응 결과물의 원심 분리 상층액으로부터 플로레틴을 수득하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 상층액으로부터 플로레틴을 수득하는 방법은 당업계에 공지된 방법이 제한없이 사용될 수 있다. 예를 들어 상층액에 용매(예컨대, 에탄올, 아세톤, 클로로폼, 포타슘아세테이트 등)를 첨가하여 플로레틴을 침전시키는 방법 또는 상층액의 용매를 증발시키는 방법 등이 사용될 수 있다. 상기 용매 증발은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법이 제한 없이 사용될 수 있으며, 이는 예를 들어 가열, 진공 증발 또는 가스를 이용한 증발일 수 있다. 상기 상층액으로부터 플로레틴을 수득하는 방법의 구체적인 예시로는 상층액의 용매를 질소가스를 이용하여 증발시키는 것일 수 있다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명한다.
실시예
실시예 1. 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 정제
1-1. 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 클로닝 및 형질전환
락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)에서 유래한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 얻기 위해 서열번호 2의 염기서열을 기초로 다음 표 1과 같이 서열변호 3과 4의 프라이머를 각각 설계하였다.
서열번호 프라이머 쌍 서열(5`-> 3`)
3 정방향 프라이머 CCGCGCGGCAGCCATATGTCAGAGTTCCCAGAAGG
4 역방향 프라이머 GTGGTGGTGCTCGAGCTATTCAGATTTCTCCGCTA
락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NGI14 균주 (GenBank ID: MT898568) 의 genomic DNA를 주형으로 하여 상기와 같이 설계된 서열변호 3, 4의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행함으로써 서열번호 2 의 염기 서열을 증폭하였다. 이 PCR 산물을 In-Fusion®HD Cloning Kit(TaKaRa , 일본)을 사용해 pET-28a(+) 벡터 (Novagen, 미국)에 삽입하여 재조합 발현벡터를 제작하였다. 서열번호 2 의 염기 서열이 발현벡터에 제대로 삽입된 것을 확인하기 위해 마크로젠(대한민국)에 의뢰하여 염기 서열을 확인하였으며, 이를 대장균 C2566 균주 (Novagen , 미국)에 형질전환하였다.
1-2. 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 과발현 및 정제
상기 형질전환체를 카나마이신(50 μg/mL)을 포함한 LB 배지 10 mL에 접종하고 37℃에서 12시간 이상 배양하였다. 이 종균 배양액 2.5 mL을 카나마이신(50 μg/mL) 을 포함한 LB 배지 250 mL에 접종하여 37 ℃에서 배양하였다. 흡광도가 600 nm에서 0.6이 될 때 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG)를 0.5 mM이 되도록 첨가하고 30℃에서 6시간 배양하여 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 과발현을 유도하였다.
서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 과발현이 유도된 형질전환체의 배양액을 4℃에서 4000 rpm으로 20분 동안 원심분리하여 형질전환체 펠렛을 회수하였다. 여기에 1 mM 페닐메틸설포닐 플루오리드(phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF)를 포함하는 평형 버퍼(20 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM 이미다졸, pH 7.4) 30 mL를 넣고 초음파분쇄기로 세포를 파쇄한 후 4℃에서 14000 rpm으로 30분 동안 원심분리하여 형질전환체의 세포 용해물인 상층액을 수득하였다.
상기 세포 용해물을 HisPur™ Ni-NTA Resin(Thermo Fisher Scientific, 미국)이 충진된 컬럼에 주입한 후 제조사가 제공하는 실험절차를 따라 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 분리 및 정제한 후 SDS-PAGE로 순도를 확인하였다 (도 1).
실시예 2. 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 활성 확인
2-1. 서열변호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 β-glucosidase 효소 활성 확인
상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질이 하기 반응식 1과 같은 β-glucosidase (베타-글루코시데이스) 효소로서 활성을 가질 것으로 예상하고 이를 확인하였다.
[반응식 1]
상기 실시예 1에서 정제한 서열번호 l의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 활성을 확인하기 위해, 서열번호 1의 단백질 100 μg을 2.5 mM 4-nitropheyl β-D-glucopyranoside (pNPG)가 포함된 100 mM 인산칼륨 버퍼(pH 5)에 넣고 총 부피를 200 μL로 맞추었다. 40℃에서 1시간 동안 반응 후 lM Na2CO3를 200 μL씩 주입하여 반응을 종결하였다. Microplate reader(Molecular Dev ices , 미국)를 사용하여 405 nm에서 흡광도를 측정한 후 흡광계수(ε 405 = 18300 M-1 cm-1) 를 이용하여 생성된 4-nitrophenol(pNP) 의 농도를 계산하였으며, 모든 실험은 3회 반복하였다. 그 결과, 상기 실시예 1에서 정제한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질(도 2의 NGI14)의 활성은 124 nmol/mg이었다 (도 2).
2-2. 최적 pH 및 최적 온도
상기 실시예 1에서 정제한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 최적 pH를 조사하기 위해 , 상기 서열번호 1의 단백질 20 μg을 2.5 mM pNPG가 포함된 200 μL의 100 mM 인산칼륨 버퍼 (pH 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9)에 넣고 50℃에서 30분 동안 반응 후 lM Na2CO3를 200 μL씩 주입하여 반응을 종결하였다. Microplatereader(Molecular Devices, 미국)를 사용하여 405 nm에서 흡광도를 측정한 후 흡광계수(ε 405 = 18300 M-1 cm-1) 를 이용하여 생성된 pNP의 농도를 계산하였으며 모든 실험은 3회 반복하였다. 그 결과, pNPG가 기질일 때 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질이 pH 4 내지 6 범위에서 활성을 나타내었고, pH 5에서 최대 활성(107 nmol/mg)을 나타내는 것을 확인하였다(도 3A).
상기 실시예 1에서 정제한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 최적 온도를 조사하기 위해, 상기 서열번호 l의 단백질 20 μg을 2.5 mM pNPG가 포함된 200 μL의 100 mM 인산칼슘 버퍼 (pH 5)에 넣고 20, 30, 40, 50, 60, 70, 또는 80℃에서 30분 동안 반응 후 lM Na2CO3를 200 μ L씩 주입하여 반응을 종결하였다. Microplate reader(Molecular Devices, 미국)를 사용하여 405 nm에서 흡광도를 측정한 후 흡광계수(ε 405 = 18300 M-1 cm-1) 를 이용하여 생성된 pNP의 농도를 계산하였으며 모든 실험은 3회 반복하였다. 그 결과, pNPG가 기질일 때 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질이 20 내지 60℃ 범위에서 활성을 나타내었고, 50℃에서 최대 활성 (101 nmol/mg)을 나타내는 것을 확인하였다(도 3B).
2-3. Kinetic parameters
상기 실시예 1에서 정제한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 Kinetic paramters(V max 및 K M )을 구하기 위해 상기 서열번호 1의 단백질 20 μg을 0, 1, 2, 5, 10, 15 또는 20 mM pNPG가 포함된 200 μL의 100 mM 인산칼슘 버퍼 (pH 5)에 넣고 50℃에서 10분 동안 반응 후 lM Na2CO3를 200 μL씩 주입하여 반응을 종결하였다. Microplate reader(Molecular Devices, 미국)를 사용하여 405 nm에서 흡광도를 측정한 후 흡광계수(ε 405 = 18300 M-1 cm-1)를 이용하여 생성된 pNP의 농도를 계산하였으며 모든 실험은 3회 반복하였다. 그 결과, pNPG가 기질일 때 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 V max 와 K M 은 각각 26 min-1과 7.4 mM이었다(도 4).
3. 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 이용한 플로레틴(phloretin ) 생산
3-1. 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 이용한 플로레틴 생산
[반응식 2]
상기 실시예 1에서 정제한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 이용하여 반응식 2와 같이 플로리진(phlorizin)에서 플로레틴(phloretin)을 생산하기 위해 상기 실시예 1에서 정제한 단백질 110 μg을 50 μM 플로리진이 포함된 50 mM 인산칼륨 버퍼(pH 5)에 넣고 37℃에서 24시간 동안 반응한 후 600 μL의 에틸 아세테이트를 넣고 반응을 종료하였다.
상기 반응액을 4℃에서 3000 rpm으로 10분 동안 원심분리 후 상층액을 새 튜브에 옮겨 질소가스로 용매를 증발시킨 후 180 μL의 9% 아세토나이트릴 용매를 넣고 녹여 샘플을 준비하였다. 상기와 같이 준비된 샘플 30 μL를 Gemini C18 column( 4. 6× 150 mm ; Phenomenex , 미국)과 SPD-20A UV-Visible detector(Shimadzu, 일본)가 장착된 LC-20AD 고성능 액체 크로마토그래피(high performance 1 iquid chromatography(HPLC , Shimadzu, 일본)에 주입하여 분석하였다. 이동상으로 0.1% 포름산과 0.5% 메탄올이 함유된 물(이동상 A) 과 아세토나이트릴(이동상 B) 를 사용하였고, 1 mL/ 분의 유속으로 55분 동안 흘려주었는데, 0-11분 동안은 9% B로, 11-13분 동안은 9-15% B로, 13-20분 동안은 15-17% B로, 20-37분 동안은 17-60% B로, 37-37.5분 동안은 60-100% B로, 37.5-38.5분 동안은 100% B로, 38.5-55분 동안은 100-9% B로 흘려주었으며, 285 nm에서 검출하였다. 그리고 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 생성물을 정량화하기 위해 시판되는 플로리진과 플로레틴을 각각 Sigma-Aldrich(미국)과 TCI(일본)에서 구입하여 스탠다드로 사용하였다.
HPLC 분석 결과, 플로리진과 플로레틴의 스탠다드는 각각 30분과 35분에서 검출되었다(도 5). 상기 서열변호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질(도 5의 NGI14)은 플로리진을 플로레틴으로 완전히 전환하였으며 수득율은 82%이었다. 같은 반응 조건에서 시중의 아몬드 유래 β-glucosidase(Sigma-Aldrich미국)(도 5의 Almond)는 플로리진을 플로레틴으로 75% 전환하였으며, 남아 있는 플로리진은 18%이었다(도 5). 따라서, 플로리진으로부터 플로레틴을 생산할 때 시중의 β-glucosidase보다 본 발명의 서열번호 l의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 이용하는 것이 더 효율적이다.
3-2. pH의 영향
상기 실시예 1에서 정제한 서열변호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 이용한 플로레틴(phloretin) 생산의 최적 pH를 조사하기 위해, 상기 서열번호 1의 단백질 또는 시중의 아몬드 유래 β-glucosidase을 50 μM 플로리진(phlorizin)이 포함된 200 μL의 100 mM 인산칼륨 버퍼 (pH 2, 3, 4, 5 , 6, 7, 8 또는 9)에 넣고 37℃에서 24시간 동안 반응 후 600 μL의 에틸 아세테이트를 넣고 반응을 종료하였으며, 상기 실시예 3-1과 같은 방법으로 반응물을 분석하였다. 그 결과, 본 발명의 β-glucosidase와 시중의 β-glucosidase 모두 pH 4에서 최대활성을 나타내었으며, 시중의 β-glucosidase는 플로리진을 플로레틴으로 80% 전환하였고, 본 발명의 β-glucosidase은 88% 전환하였다. 또한, 시중의 β-glucosidase은 pH 3내지 6 범위에서 활성을 나타내었고, 본 발명의 β-glucosidase는 pH 3 내지 9 범위에서 활성을 나타내었으며 전 구간에서 시중의 β-glucosidase보다 높은 활성을 보였다(도 6). 따라서, 본 발명의 β-glucosidase는 산성 조건뿐만 아니라 염기성 조건에서도 높은 활성을 나타내므로 응용 범위가 더 넓을 것이라 예상된다.

Claims (7)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질.
  2. 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자.
  3. 청구항 1의 단백질을 포함하는 플로레틴(phloretin) 제조용 조성물.
  4. 플로리진(phlorizin)을 청구항 1의 단백질과 반응시키는 단계를 포함하는 플로레틴(phloretin) 제조 방법.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 반응은 pH 3 내지 pH 9 버퍼 하에 수행되는, 플로레틴 제조 방법.
  6. 청구항 4에 있어서, 상기 반응 후에 에틸 아세테이트를 처리하는 단계를 더 포함하는, 플로레틴 제조 방법.
  7. 청구항 4에 있어서, 상기 반응 결과물의 원심 분리 상층액으로부터 플로레틴을 수득하는 단계를 더 포함하는, 플로레틴 제조 방법.
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