CN116334019A - 一种udp-糖基转移酶及其在合成黄酮糖苷衍生物中的应用 - Google Patents

一种udp-糖基转移酶及其在合成黄酮糖苷衍生物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种来源于乌拉尔甘草的糖基转移酶基因UGT73AC11及其编码的蛋白。本发明通过对乌拉尔甘草基因组数据库的系统分析，从乌拉尔甘草细胞中克隆得到一种来源于UGT73AC11及其编码的蛋白，在大肠杆菌细胞中成功异源表达，并验证其催化功能，同时偶联蔗糖合酶GuSuS1和糖基转移酶UGT73AC11构建UDP循环再生系统，该系统可催化用于合成新甘草苷。本发明解决了能特异性糖基化黄酮C‑7OH位点糖基化修饰且具有广谱性催化功能的糖基转移酶缺乏的问题，为后续合成具有药用前景的新型黄酮糖苷衍生物相关研究提供了一定的依据，同时提供的UDP循环再生体系也极大简便了新甘草苷糖基化修饰过程。

Description

一种UDP-糖基转移酶及其在合成黄酮糖苷衍生物中的应用
技术领域：
本发明涉及一个来源于乌拉尔甘草的UDP-糖基转移酶及编码基因，同时涉及一种由甘草来源的蔗糖合酶与该UDP-糖基转移酶参与的酶法合成黄酮糖苷衍生物的方法，属于生物工程与技术领域。
背景技术：
黄酮类(flavonoid)化合物是许多药用植物的主要功能成分之一，因其具有抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗风湿、抗氧化等多种药理活性而在医药领域被广泛应用。但是，黄酮碳骨架结构的强疏水性极大地限制了其溶解性和生物利用度，进而限制了其工业应用价值。糖基化修饰是改善黄酮溶解性及生物利用度的强有力手段。通过在特定位点引入糖基，使其疏水部分具有更多的亲水性羧基和羟基，从而获得更有效的糖苷衍生物。近年来，许多黄酮糖苷衍生物被合成并展现出更好的生理活性，能更好地应用于药物研发。因此，以黄酮类化合物为前体开发低毒性、高药效的黄酮糖苷衍生物类药物受到广泛关注。
虽然植物可作为获得糖苷衍生物的重要来源，但由于培育周期长，糖苷衍生物含量低，提取过程繁杂，导致植物提取法难以实现糖苷衍生物高效地工业化生产，无法满足广大的市场需求。化学合成法通常因其反应步骤复杂、反应条件苛刻且涉及多种有毒有害的化学试剂，而不具备环境可持续性。同时，繁琐的羟基和羧基保护/去保护过程使得化学法难以实现区域选择性强的精准糖基化修饰。相比之下，生物合成法通常催化效率高、反应条件温和、对环境友好，而且酶的特异性催化能够将一个糖基转移到受体底物的特定位点实现区域选择性强的糖基化修饰，可见酶法是获得糖苷衍生物的重要方法。
以尿苷二磷酸-糖(UDP-Sugar)为糖供体将糖基转移到受体的羟基、羧基、氨基和巯基等活性位点的UDP-糖基转移酶(UDP-Glycosyltransferase,UGT)是各种天然产物糖基化修饰的关键酶。目前，UGT已被大量鉴定并通过酶设计成为高效的生物催化剂，用于合成具有巨大价值的糖苷衍生物。尽管已报道许多对黄酮具有糖基化活性的UGT，但大多都只能实现特定黄酮糖基化，如甘草素的糖基化修饰。目前鲜有能实现广谱性黄酮糖基化的UGT，且少有能实现黄酮C-7OH位点糖基化修饰的UGT的报道，而黄酮C-7OH位点修饰得到的7-O糖苷衍生物(如新甘草苷)具有重要药理活性。因此，能特异性糖基化黄酮C-7OH位点且具有广谱性催化的UGT缺乏是合成具有药用前景的新型黄酮糖苷衍生物的一大瓶颈。
糖基化修饰所利用的糖供体，如UDP-葡萄糖(UDP-glucose，UDP-Glc)价格昂贵，不利于糖苷衍生物的规模化工业生产。针对黄酮的葡萄糖基化修饰，亟需通过构建UDP-Glc合成途径来降低糖基化修饰的成本。蔗糖合酶能够实现以廉价蔗糖和UDP为原料的UDP-Glc的合成，尽管目前已有大量利用蔗糖合酶和糖基转移酶实现植物天然产物低成本糖基化修饰的报道，但还未见利用蔗糖合酶实现7-O黄酮苷低成本合成的报道。
因此，挖掘合适的UGT来实现黄酮的7-O糖基化修饰并将其与蔗糖合酶偶联构建级联循环体系，同时实现副产物UDP的循环利用，将为黄酮糖苷衍生物的规模化工业生产提供新方向。
发明内容：
本发明的目的是挖掘并表征乌拉尔甘草(Glycyrrhiza uralensis)来源的UDP-糖基转移酶，该糖基转移酶能实现黄酮的7-O糖基化修饰且具有广谱性，提供该糖基转移酶的基因及其编码的蛋白质，同时提供一种偶联蔗糖合酶和糖基转移酶的级联循环体系用于合成黄酮糖苷衍生物。
第一方面，本发明提供一种乌拉尔甘草来源的UDP-糖基转移酶UGT73AC11，所述蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.1，所述蛋白的基因核苷酸序列SEQ ID No.2。
第二方面，本发明提供一种偶联糖基转移酶和蔗糖合酶的体外多酶级联体系，用于合成新甘草苷(结构如式一所示)。
Figure BDA0003784441540000021
附图说明:
图1为本发明实施例3中UGT73AC11重组蛋白表达的SDS-PAGE图，M为蛋白标准分子量大小泳道，1为20％咪唑洗脱所得目标蛋白的泳道。
图2为本发明实施例5中UGT73AC11糖基供体特异性检测转化率图。
图3为本发明实施例5中UGT73AC11糖基受体特异性检测转化率图。
图4为本发明实施例5中UGT73AC11催化甘草素和UDP-Glc反应的最适pH图。
图5为本发明实施例5中UGT73AC11催化甘草素和UDP-Xyl反应的最适pH图。
图6为本发明实施例5中UGT73AC11催化甘草素和UDP-Glc、UDP-Xyl反应的最适温度图。
图7为本发明实施例5中UGT73AC11催化甘草素和UDP-Glc、UDP-Xyl反应的热稳定性图。
图8为本发明实施例6中UGT73AC11和GuSUS1-Δ9偶联实现UDP-葡萄糖循环再生的糖基修饰的反应进程图。
图9为本发明实施例7中甘草素葡萄糖苷的1H谱图。
图10为本发明实施例7中甘草素葡萄糖苷的13C谱图。
图11为本发明实施例7中甘草素木糖苷的1H谱图。
图12为本发明实施例7中甘草素木糖苷的13C谱图。
图13为本发明实施例7中为甘草素-7-O-葡萄糖苷LC-MS结果图。
图14为本发明实施例7中为异甘草素-7-O-葡萄糖苷LC-MS结果图。
图15为本发明实施例7中为柚皮素-7-O-葡萄糖苷LC-MS结果图。
图16为本发明实施例7中为野黄芩素-7-O-葡萄糖苷LC-MS结果图。
图17为本发明实施例7中为木犀草素-7-O-葡萄糖苷LC-MS结果图。
图18为本发明实施例7中为芹菜素-7-O-葡萄糖苷LC-MS结果图。
图19为本发明实施例7中为山奈酚-7-O-葡萄糖苷LC-MS结果图。
图20为本发明实施例7中为橙皮素-7-O-葡萄糖苷LC-MS结果图。
具体实施方式：
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1：糖基转移酶UGT73AC11基因的获得
根据甘草基因组数据库筛选，分析得到糖基转移酶UGT73AC11的基因序列，设计上下游引物并加入酶切位点，5′端的BamHI和3′端的XhoI：
UGT73AC11-F：5’>AGCAAATGGGTCGCGGATCCATGGACCCTGAAACTGCAGG<3’
UGT73AC11-R：5’>TGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTCTGCGGGGTTTGAGCTCCT<3’
以乌拉尔甘草cDNA为模板，使用ExTaq酶进行PCR扩增，得1404bp片段的UGT73AC11基因。UGT73AC11基因完整核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
实施例2：构建糖基转移酶UGT73AC11工程菌
为构建表达糖基转移酶UGT73AC11的大肠杆菌工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-UGT73AC11，以克隆所得糖基转移酶UGT73AC11基因片段(SEQ ID No.2所示)为模板进行PCR扩增。PCR反应体系为：模板1μL,上下游引物各2μL，Primer star mix(宝生物公司)25μL，用双蒸水补足50μL。PCR反应条件：预变性98℃1min，变性98℃10s、退火58℃5s、延伸72℃1min30 s，循环30次，72℃10min，4℃保存。
将克隆得到的糖基转移酶UGT73AC11基因分别使用Thermo琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收进行纯化回收。对原核表达载体pET28a用限制性内切酶BamHI、XhoI进行双酶切，酶切体系：BamHI 2μL和XhoI 2μL，10×digest buffer 5μL，DNA片段30μL，用双蒸水补足50μL的酶切体系,酶切条件为37℃、2h。酶切后使用Thermo琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收酶切产物。
使用Gibson Assembly法(采用NEB官方网站https://international.neb.com/推荐的方法)对插入片段糖基转移酶基因与线性化的载体pET28a进行无缝连接。通过标准热休克法将连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂布于含有100mg/L卡那霉素的固体LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，20g/L琼脂糖)平板上，37℃过夜培养。
采用菌落PCR和测序方法鉴定转化子。菌落PCR体系：模板LB平板单菌落，UGT73C11上下游引物各1μL，2×Taq mix(北京聚合美生物科技有限公司)10μL，用双蒸水补足20μL.PCR条件：预变性94℃5min，变性94℃30s、退火58℃30s、延伸72℃1min 30s，循环30次，72℃10min，4℃保存。经菌落PCR验证含有正确目标条带的转化子送DNA测序(金唯智生物科技有限公司)，确定大肠杆菌工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-UGT73AC11构建成功。
实施例3：大肠杆菌基因工程菌的发酵
(1)挑取测序正确的大肠杆菌工程菌单菌落，接种到40mL含1‰卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、转速200rpm的震荡培养箱中下过夜孵育，获得初级种子液。
(2)将4mL初级种子液接种至400mL不含抗生素的LB液体培养基，于37℃、200rpm条件下孵育约3h至OD600＝0.6，随后添加异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.1mM，继续将发酵液在16℃和200rpm条件下过夜震荡孵育。
(3)将发酵液在16℃、200rpm条件下继续过夜震荡培养16-20h以获得IPTG诱导表达的目标蛋白。
(4)将发酵液在12000rpm下离心3分钟，以收集含目标蛋白的菌体细胞。然后添加50mL 50mM PBS缓冲液(pH 7.0)将菌体细胞重悬。
(5)通过高压破碎仪将菌体细胞充分破碎，将目标蛋白释放到胞外。
(6)在13000rpm下离心25分钟获得上清液，并作为粗酶液保存于4℃。
实施例4：糖基转移酶的纯化
(1)样品前处理：粗酶液经0.45μm水系滤膜过滤后，使用装有HisTrapTM FF(5mL)镍柱的AKTA蛋白纯化系统(GE Healthcare)纯化带有His-tag标签的目标蛋白。
(2)柱平衡：用超纯水以1mL/min速度冲洗镍柱以替换柱子中的20％乙醇，随后用蛋白上样液A(50mM PBS，25mM咪唑，pH 7.0)以1mL/min流速平衡镍柱。
(3)上样：将(1)中已处理样品通过衡流泵以1mL/min流速泵入AKTA蛋白纯化仪并收集流穿峰，流穿峰可用于反复上样以提高目标蛋白挂柱率。上样结束后，再次用蛋白上样液A平衡柱子以除去未与柱子结合的蛋白。
(4)洗脱；用蛋白洗脱液B(1M咪唑)：蛋白上样液A＝1：4的比例洗脱镍柱上悬挂的目标蛋白，保存于4℃。
(5)浓度的测定及SDS-PAGE验证；利用NanoDrop 2000检测洗脱所得目标蛋白的浓度，利用SDS-PAGE确定目标蛋白条带及分子量大小。
实施例5：糖基转移酶UGT73AC11酶学性质的测定
(1)UGT73AC11受体底物特异性的检测
反应总体积为100μL，含有56.6μg酶(50mM PBS缓冲液，pH 7.0)，0.5mM不同受体底物(甘草素、异甘草素、黄芩素、汉黄芩素、芹菜素、橙皮素、槲皮素、木犀草素、山奈酚、白杨素、柚皮素、大豆苷元、光甘草定、甘草苷、新甘草苷、异甘草苷、黄芩苷、野黄芩苷、汉黄芩苷、橙皮素-7-O-葡萄糖苷、异槲皮苷)和1mM UDP-Glc。将体系在35℃水浴中反应1h，然后加入400μL甲醇终止反应。
样品经0.45μm有机系滤膜过滤，使用岛津LC-30A型超高效液相色谱仪UHPLC系统进行检测，色谱柱型号为Shim-pack GIST-HP C18(3μm，2.1x150)。黄酮类受体底物检测方法如下；流动相A：乙腈，流动相B：1‰磷酸；0-4.50min：65％B，4.50-6.00min：65-50％B，6.00-12.00：50-35％B，12.00-16.00min：35-15％B，16.00-18.00min：15-80％B，18.00-20.00min：80％B，流速为0.2mL/min，检测波长为270和320nm双波长。
(2)UGT73AC11糖供体底物特异性的检测
反应总体积为100μL，含有56.6μg酶(50mM PBS缓冲液，pH 7.0)、0.5mM甘草素和1mM糖供体(UDP-Glc、UDP-Xyl、UDP-Rha、UDP-Ara、UDP-Gal、UDP-GlcA)。将体系在35℃水浴中反应1h，然后加入400μL甲醇终止反应。样品经0.45μm有机系滤膜过滤后用UHPLC进行检测。
(3)UGT73AC11最适温度的测定
反应总体积为100μL，含有53.9μg酶(50mM PBS缓冲液，pH 7.0)、1mM UDP-糖(UDP-Glc或UDP-Xyl)和0.5mM甘草素。反应体系在25℃至60℃(25、30、35、40、45、50、55、60℃)的不同温度水浴中反应10min，然后加入400μL甲醇终止反应。样品经0.45μm有机系滤膜过滤后用UHPLC进行检测。
(4)UGT73AC11最适pH的测定
反应总体积为100μL，包括53.9μg UGT73AC11、1mM UDP-糖(UDP-Glc或UDP-Xyl)和0.5mM甘草素，调节体系不同pH(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0)，将体系置于35℃水浴中反应1h，然后加入400μL甲醇终止反应。样品经0.45μm有机系滤膜过滤后用UHPLC进行检测。
(5)UGT73AC11热稳定性的测定
设定甘草素的初始浓度范围(5、10、20、30、40、50、60、80、100、150、200mM)，反应混合物(100μL)如下：1μL UDP糖(0.1mM溶于水)，1μL甘草素(5mM-200mM溶于二甲基亚砜)，61.2μg酶(50mM PBS缓冲液，pH 7.0)。3分钟后，用400μL甲醇终止反应。
(6)UGT73AC11米氏动力学常数的测定
将纯化的酶置于35℃水浴中，第一小时内每30分钟一次，第一小时后每小时一次，将水浴中的50μL酶(57.3μg)添加到100μL总体积中，其中含有1mM UDP糖和0.5mM甘草素。在35℃下培养10分钟后，添加400μL甲醇以终止反应。
实施例6：偶联蔗糖合酶和糖基转移酶的UDP循环再生体系
以甘草素为底物，通过偶联蔗糖合酶和糖基转移酶可以实现甘草素的葡萄糖基化修饰，以UDP和蔗糖为初始原料，首先在蔗糖合酶GuSUS1-Δ9的催化下生成UDP-葡萄糖，接着在糖基转移酶的催化下生成新甘草苷，副产物UDP可以循环使用。
反应总体积为200μL，含有63.2μg蔗糖合酶(50mM PBS缓冲液，pH 7.0)、56.6μg糖基转移酶(50mM PBS缓冲液，pH 7.0)、6mM甘草素、24mM UDP和240mM蔗糖。将体系在35℃水浴中反应，于1h、2h、3h、4h、5h和6h定时取样监测反应，然后加入400μL甲醇终止反应。样品经0.45μm有机系滤膜过滤后用UHPLC进行检测。
实施例7：甘草素葡萄糖基化和木糖基化产物的LC-MS和NMR表征
首先进行产物的制备，同时进行500个100μL体积的反应，每个反应体系如下：60.1μg酶(50mM PBS缓冲液，pH 7.0)，1mM UDP-糖和0.5mM甘草素。在第1个小时内每10分钟取样一次，在第1个小时后每小时取样一次，持续300分钟，并添加400μL甲醇以终止反应，样品经0.45μm有机系滤膜过滤后用UHPLC进行检测。
为了获得用于NMR分析的纯产物，用5mL注射器将上述反应混合物注入配备有LC-20AR仪器的半制备液相色谱(岛津公司)。流动相为乙腈和0.1％甲酸，总流速为5mL/min，梯度如下：a＝乙腈，B＝含0.1％甲酸的水；0-27分钟，65％B；27-36分钟，65-50％B；36-50min，50-35％B；50-60分钟，35-80％B。收集目标峰，然后用旋蒸仪将收集的目标峰中的有机相蒸干，剩余水相在-80℃冰箱中冷冻过夜，然后用冷冻干燥机干燥，得到白色纯品粉末。
(1)LC-MS表征
将产物溶解于甲醇中，利用安捷伦LC-MS分析仪器(Agilent 6460Triple QuadLC-MS)进行检测，获得一级质谱和二级质谱。
(2)NMR表征
将约2.5mg纯产物溶于氘代甲醇中，通过Bruker Ascend 700M核磁共振波谱仪获得产物的1H和13C图谱，1H谱图灵敏度为4012.5(0.1％EB)，13C谱图灵敏度为2534.4(ASTM)。

Claims (4)

1.一种糖基转移酶UGT73AC11，其特征在于糖基转移酶UGT73AC11的氨基酸序列如SEQID No.1所示。
2.如权利要求1所述的糖基转移酶，其特征在于编码糖基转移酶UGT73AC11基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.如权利要求1所述的糖基转移酶UGT73AC11在合成黄酮糖基化衍生物中的应用，其特征在于所述新甘草苷为如式一所示的结构。
Figure FDA0003784441530000011
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于制备体系包括蔗糖合酶、糖基转移酶、蔗糖、尿苷二磷酸和甘草素。
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