CN103882045B - 生产丙酮酸的菌株及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生产丙酮酸的菌株及其构建方法，其构建方法如下：将D‑氨基酸氧化酶基因DAAO通过EcoRI或BamHI克隆在pUC57质粒中获得质粒pUC57‑DAAO，以质粒pUC57‑DAAO为模板进行基因扩增，将基因DAAO扩增获得的产物克隆至质粒pET28a或pET21a中，选取培养得到质粒中连接上含有DAAO的DNA片段的阳性克隆质粒，将上述构建好的阳性克隆质粒转化进表达宿主菌BL21(DE3)中，选取培养得到能够将D‑丙氨酸转化为丙酮酸的第一菌株；D‑氨基酸氧化酶基因DAAO片段大小为1124bp，含有核酸内切酶NdeI和EcoRI的酶切位点。上述构建得到的菌株能够直接通过生物转换法将D‑丙氨酸转化为丙酮酸。

Description

生产丙酮酸的菌株及其构建方法

技术领域

本发明涉及一种丙酮酸的生产领域，具体而言，本发明提供了一种用于从生产丙酮酸的菌株及该菌株的构建方法。

背景技术

丙酮酸是一种α-酮酸，在生物化学代谢途径中扮演重要的角色。作为一种重要的有机酸，丙酮酸不仅是人体三羧酸循环和氨基酸合成过程中重要的中间体，同时在食品、化工和制药工业及科学研究中有着广泛的用途。在制造工业中，常被用作食品添加剂、重量控制添加剂、保健食品和抗氧化剂等。同时，因为丙酮酸既具有活性的酮基又具有活性羧基基团，因此常被作为一种重要的原材料广泛的用于化工、制药和农业化学品生产中，如其可以作为合成L-酪氨酸、N-乙酰-D-甘露糖胺丙酮酸及（R）-苯乙酰甲醇等制药前体的原料。

目前丙酮酸的生产方法主要有化学法和生物法。其中，化学法生产丙酮酸在工业上主要是通过使酒石酸脱水和去羰基来合成。这种生产丙酮酸的方法操作简单，但是污染重、成本高。生物法生产丙酮酸主要包括直接发酵、酶催化法和全细胞转化法。发酵生产丙酮酸的菌株包括多种维生素缺陷型的酵母Torulopsis glabrata、硫辛酸缺陷性的大肠杆菌和酵母菌株。目前酵母菌发酵生产的丙酮酸产量最高，可达135g/L，转化率达0.54g/g。另外，重组大肠杆菌YYC202发酵生产丙酮酸的最高产量为110g/L，转化率为0.87g/g。

发酵法生产丙酮酸有很多缺陷。由糖发酵生产丙酮酸的产率一直较低。另外，从发酵液中分离丙酮酸是一个复杂而且昂贵的过程。生物催化法作为一种替代方法应运而生。生物催化法生产丙酮酸可以通过全细胞催化或者酶催化完成。其中，全细胞催化生产丙酮酸是通过生物催化底物直接进行转化，不需要复杂的生长培养基，减少了下游分离纯化的成本。例如，在优化条件下，使用Pseudomonas sp.g31菌株进行生物转化，能够在24h内将100mM的富马酸转化为94mM的丙酮酸。另外，使用大肠杆菌YYC202进行全细胞转化由葡萄糖生产丙酮酸，最高转化率为0.93g/g，这是发酵生产无法达到的。

实现工业化生物转化法生产丙酮酸的关键是使用价格低于丙酮酸的原材料通过高效的转化方法进行生产。目前，可用于生物催化法生产丙酮酸的底物主要包括D-丙氨酸、1，2-丙二醇，延胡索酸以及乳酸等。目前，已经有多种涉及的关键酶基因被克隆并进行了研究，但是使用这些酶进行生物转化的条件还未优化。

为了实现全细胞催化法生产丙酮酸，需要选择从较低成本的原材料出发，通过设计高效的生物催化途径实现丙酮酸生产，并通过对反应途径中关键酶蛋白活性进行优化以及对生物转化条件的优化来获得高效生物催化生产丙酮酸的方法。

发明内容

本发明的首要目的是提供一种生产丙酮酸的菌株及其构建方法，其可有效的用于生物转换法生产丙酮酸。

一种生产丙酮酸菌株的构建方法，其构建方法如下：

将D-氨基酸氧化酶基因DAAO通过EcoRI或BamHI克隆在pUC57质粒中获得质粒pUC57-DAAO，以质粒pUC57-DAAO为模板进行基因扩增，将基因DAAO扩增获得的产物克隆至质粒pET28a或pET21a中，选取培养得到质粒中连接上含有DAAO的DNA片段的阳性克隆质粒，将上述构建好的阳性克隆质粒转化进表达宿主菌BL21(DE3)中，选取培养得到能够将D-丙氨酸转化为丙酮酸的第一菌株；

D-氨基酸氧化酶基因DAAO片段大小为1124bp，含有核酸内切酶NdeI和EcoRI的酶切位点。

上述构建得到的菌株能够直接通过生物转换法将D-丙氨酸转化为丙酮酸。

附图说明

图1为质粒pET28a-RgDAAO的示意图；

图2为质粒pACYCDuet-1-katE-alaR的示意图。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步的说明，并不构成对本发明实质内容的限制。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径购买得到。

操作1D-氨基酸氧化酶基因的合成与克隆

D-氨基酸氧化酶（D-amino acid oxidase，DAAO）的合成与克隆，分为以下几个操作：

步骤1：D-氨基酸氧化酶（D-amino acid oxidase，DAAO）的全基因合成：

通过全基因合成法，分别合成来自Cyprinus carpio、Rhodotorula gracilis和Trigonopsis variabilis的D-氨基酸氧化酶基因。基因合成由金唯智生物科技（北京）有限公司完成。合成的基因通过EcoRV克隆在pUC57质粒中。三个基因分别命名为CcDAAO、RgDAAO和TvDAAO。

合成的三个基因的序列分别为：

CcDAAO:A273T255C254G262|GC%:49.43%|Length:1044

ATGAGGGTGTGCATCATTGGAGCGGGGGTCATCGGCCACTCCACTGCTCAGAGCATCTACCAGCACTTCCACGACAGGATCGCCCCTCTCACCATAGAGGTGTATGCTGATGTCTTCACTCCACTCACCACCAGCGACGGGGCAGCTGGACTCTGGCAGCCGTATCTCTATGACAAGGGGAATGTGCAAGAAACTAAATGGAACAAAGAGACGTTTCAGTATCTACTAAGTTGCCTCAGCTCTCCAGATTCTGTGAGAATGGGAATCTTCCTCCAGTCTGGCTATAATCTGTGCACTGAACCCCTGCCGGACCCCTCATTTAAAGACACTGTGTTGGGCTTTCGCAAGCTGACTCAACGTGAACTAGACATGTTCCCAGGATACAGTTTTGGGTGGTTCAACACTGCTCTCATGGTTGAAGGAAAAACATACCTGCCCTGGCTTATGGACTGGCTAAGACAAAGAAAGGTCAAGTTTTATCAGAGGAAGATTGGTTCATTTAAAGAGCTGGCAGACATCGGTGCTGATGTTATCATCAACTGCTCTGGTGTACGATCAGGAGACCTTCAGCCTGATCCTGAGCTCCAGCCAGGCAGAGGACAGATCATTAAGGTAGACGCTCCCTGGTTAAAACACTGGATCCTTACACATGATTCCTCATCAGGAGTTTATAACTCACCGTACATCATTCCTGGGAGTCGTTTAGTCACTGTGGGTGGAGTTTTCCAAATAGGAAACTGGAATCTGCAGAACAGTTCTGTGGACCATAAAGGAATCTGGGAAGCTGCCTGCAAGCTTGATCCCAGTCTACAGCATGCGCGGATAGTAGAGGACTGGACTGGTCTCAGGCCTGCACGCAGCAAAGTTAGACTGGAGAGAGAGACCATACGATCTGGACCAACCTCATTTGAGGTCATTCATAACTACGGACATGGAGGTTTTGGACTGACCATCCATCGTGGATGTGCTGAGGAAGCTGCTCGTCTCTTTGGTCAGATCCTGGAGCAGAAAGGCCTGCTAGCACACTCTAAATCACGTCTCTAA

CcDAAO的核苷酸序列如SEQIDNO.11所示；

RgDAAO:A221T194C345G347|GC%:62.51%|Length:1107

ATGCACTCGCAGAAGCGCGTCGTTGTCCTCGGATCAGGCGTTATCGGTCTGAGCAGCGCCCTCATCCTCGCTCGGAAGGGCTACAGCGTGCATATTCTCGCGCGCGACTTGCCGGAGGACGTCTCGAGCCAGACTTTCGCTTCACCATGGGCTGGCGCGAATTGGACGCCTTTCATGACGCTTACAGACGGTCCTCGACAAGCAAAATGGGAAGAATCGACTTTCAAGAAGTGGGTCGAGTTGGTCCCGACGGGCCATGCCATGTGGCTCAAGGGGACGAGGCGGTTCGCGCAGAACGAAGACGGCTTGCTCGGGCACTGGTACAAGGACATCACGCCAAATTACCGCCCCCTCCCATCTTCCGAATGTCCACCTGGCGCTATCGGCGTAACCTACGACACCCTCTCCGTCCACGCACCAAAGTACTGCCAGTACCTTGCAAGAGAGCTGCAGAAGCTCGGCGCGACGTTTGAGAGACGGACCGTTACGTCGCTTGAGCAGGCGTTCGACGGTGCGGATTTGGTGGTCAACGCTACGGGACTTGGCGCCAAGTCGATTGCGGGCATCGACGACCAAGCCGCCGAGCCAATCCGCGGGCAAACCGTCCTCGTCAAGTCCCCATGCAAGCGATGCACGATGGACTCGTCCGACCCCGCTTCTCCCGCCTACATCATTCCCCGACCAGGTGGCGAAGTCATCTGCGGCGGGACGTACGGCGTGGGAGACTGGGACTTGTCTGTCAACCCAGAGACGGTCCAGCGGATCCTCAAGCACTGCTTGCGCCTCGACCCGACCATCTCGAGCGACGGAACGATCGAAGGCATCGAGGTCCTCCGCCACAACGTCGGCTTGCGACCTGCACGACGAGGCGGACCCCGCGTTGAGGCAGAACGGATCGTCCTGCCTCTCGACCGGACAAAGTCGCCCCTCTCGCTCGGCAGGGGCAGCGCACGAGCGGCGAAGGAGAAGGAGGTCACGCTTGTGCATGCGTATGGCTTCTCGAGTGCGGGATACCAGCAGAGTTGGGGCGCGGCGGAGGATGTCGCGCAGCTCGTCGACGAGGCGTTCCAGCGGTACCACGGCGCGGCGCGGGAGTCGAAGTTGTAG

RgDAAO的核苷酸序列如SEQIDNO.12所示；

TvDAAO:A241T292C286G252|GC%:50.23%|Length:1071

ATGGCTAAAATCGTTGTTATTGGTGCCGGTGTTGCCGGTTTAACTACAGCTCTTCAACTTCTTCGTAAAGGACATGAGGTTACAATTGTGTCCGAGTTTACGCCCGGTGATCTTAGTATCGGATATACCTCGCCTTGGGCAGGTGCCAACTGGCTCACATTTTACGATGGAGGCAAGTTAGCCGACTACGATGCCGTCTCTTATCCTATCTTGCGAGAGCTGGCTCGAAGCAGCCCCGAGGCTGGAATTCGACTCATCAACCAACGCTCCCATGTTCTCAAGCGTGATCTTCCTAAACTGGAAGGTGCCATGTCGGCCATCTGTCAACGCAACCCCTGGTTCAAAAACACAGTCGATTCTTTCGAGATTATCGAGGACAGGTCCAGGATTGTCCACGATGATGTGGCTTATCTAGTCGAATTTGCTTCCGTTTGTATCCACACCGGAGTCTACTTGAACTGGCTGATGTCCCAATGCTTATCGCTCGGCGCCACGGTGGTTAAACGTCGAGTGAACCATATCAAGGATGCCAATTTACTACACTCCTCAGGATCACGCCCCGACGTGATTGTCAACTGTAGTGGTCTCTTTGCCCGGTTCTTGGGAGGCGTCGAGGACAAGAAGATGTACCCTATTCGAGGACAAGTCGTCCTTGTTCGAAACTCTCTTCCTTTTATGGCCTCCTTTTCCAGCACTCCTGAAAAAGAAAATGAAGACGAAGCTCTATATATCATGACCCGATTCGATGGTACTTCTATCATTGGCGGTTGTTTCCAACCCAACAACTGGTCATCCGAACCCGATCCTTCTCTCACCCATCGAATCCTGTCTAGAGCCCTCGACCGATTCCCGGAACTGACCAAAGATGGCCCTCTTGACATTGTGCGCGAATGCGTTGGCCACCGTCCTGGTAGAGAGGGCGGTCCCCGAGTAGAATTAGAGAAGATCCCCGGCGTTGGCTTTGTTGTCCATAACTATGGTGCCGCCGGTGCTGGTTACCAGTCCTCTTACGGCATGGCTGATGAAGCTATTTCTTACGTCGAAAGAGCTCTTACTCGTCCAAACCTTTAG

TvDAAO的核苷酸序列如SEQIDNO.13所示。

步骤2：D-氨基酸氧化酶（D-aminoacidoxidase，DAAO）的克隆

用于D-氨基酸氧化酶克隆与表达的质粒见表1，以pET28a-RgDAAO质粒的构建为例，如图1所示，详细描述D-氨基酸氧化酶基因的表达质粒的构建过程。

以全基因合成获得的质粒pUC57-RgDAAO为模板，使用引物RgDAAO-up-NdeI/RgDAAO-down-EcoRI，扩增获得来自Rhodotorula gracilis菌株的D-氨基酸氧化酶基因RgDAAO，基因片段大小为1124bp，含有核酸内切酶NdeI和EcoRI的酶切位点。

扩增体系为：NewEngland Biolabs Phusion5X缓冲液10μl、dNTP(每种dNTP各10mM)1μl、DNA模板20ng、引物(10μM)各2μl、Phusion High-FidelityDNA聚合酶(2.5U/μl)0.5μl、蒸馏水33.5μl，总体积为50μl。

扩增条件为98℃预变性2分钟(1个循环)；98℃变性10秒、56℃退火10秒、72℃延伸30秒(30个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)。

克隆操作为：

将以引物RgDAAO-up-NdeI/RgDAAO-down-EcoRI扩增获得的RgDAAO基因的PCR片段进行清洗纯化，获得含有RgDAAO基因的DNA片段（1124bp）。酶切体系为：0.2μg的RgDAAODNA片段，2μl10*CutSmart Buffer（NewEngland Biolabs Phusion公司），1μlNdeI（NewEnglandBiolabs Phusion公司），1μlEcoRI-HF（NewEngland Biolabs Phusion公司），补充蒸馏水至20μl，37℃温浴10分钟。然后琼脂糖凝胶回收获得酶切好的含有RgDAAO的DNA片段。质粒pET28a的酶切体系：1μg的质粒pET28a，2μl10*CutSmart Buffer（NewEngland BiolabsPhusion公司），1μl NdeI（NewEngland Biolabs Phusion公司），1μl EcoRI-HF（NewEnglandBiolabs Phusion公司），补充蒸馏水至20μl，37℃温浴10分钟。然后琼脂糖凝胶回收获得酶切好的含有pET28a的DNA片段。连接体系：10ng酶切回收的pET28a片段，20ng RgDAAO的DNA片段，2μl Quick Ligation Reaction Buffer，加蒸馏水补充至10μl，然后加0.5μl QuickT4DNA Ligase，25℃放置10分钟，取5μl加入50μl Trans1感受态细胞中（购自北京全式金生物技术有限公司），冰浴30分钟。42℃热激30秒，立即置于冰上2分钟。加入250μl LB培养基，200rpm，37℃孵育1小时。取200μl菌液涂在含有卡那霉素（终浓度为50ug/ml）的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒（将RgDAAODNA片段克隆到pET28a中的质粒）进行测序验证，测序结果在酶切后的pET28a质粒中连接上了含有RgDAAO的DNA片段，证明质粒构建正确，质粒命名为pET28a-RgDAAO。

CcDAAO基因克隆所需质粒pET28a-CcDAAO的构建与转化同以上提到的pET28a-RgDAAO的构建与转化，所构建质粒见表1，所用引物见表2；

TvDAAO基因克隆所需质粒pET28a-CcDAAO的构建与转化同以上提到的pET28a-RgDAAO的构建与转化，只是用核酸内切酶BamHI替代所述中用的EcoRI，所构建质粒见表1，所用引物见表2；

RgDAAO基因克隆所需质粒pET21a-RgDAAO的构建与转化同以上提到的pET28a-RgDAAO的构建与转化，只是用质粒pET21a替代所用的pET28a，用氨苄青霉素替代所用的卡那霉素，所构建质粒见表1，所用引物见表2；

CcDAAO基因克隆所需质粒pET21a-CcDAAO的构建与转化同以上提到的pET28a-RgDAAO的构建与转化，只是用质粒pET21a替代所用的pET28a，用氨苄青霉素替代所用的卡那霉素，所构建质粒见表1，所用引物见表2；

TvDAAO基因克隆所需质粒pET21a-CcDAAO的构建与转化同以上提到的pET28a-RgDAAO的构建与转化，只是用质粒pET21a替代所用的pET28a，用核酸内切酶BamHI替代所述中用的EcoRI，用氨苄青霉素替代所用的卡那霉素，所构建质粒见表1，所用引物见表2；

表1本发明中用于丙酮酸生物催化中所使用的质粒

表2本发明中使用的引物

操作2、D-氨基酸氧化酶（D-amino acid oxidase，DAAO）表达菌株的构建

将操作1步骤2中构建好的质粒转化进表达宿主菌BL21(DE3)，进行DAAO的表达。

以RgDAAO表达菌株的构建为例，具体实施操作如下：

步骤1：从平板上挑取验证正确的克隆Trans10（pET28a-RgDAAO)，接到4mlLB培养基中（含有终浓度为50g/ml的卡那霉素），在37度，250转/分钟条件下过夜培养。使用质粒提取试剂盒（Axygen公司）进行质粒提取，按照试剂盒操作说明书操作。提取的质粒存于-20度，备用。

步骤2：取1μl操作一中提取的质粒，加入50μl BL21(DE3)感受态细胞中（购自北京全式金生物技术有限公司），冰浴30分钟，42℃热激30秒，立即置于冰上2分钟。加入500μlLB培养基，200rpm，37℃孵育1小时。取200μl菌液涂在含有卡那霉素（终浓度为50ug/ml）的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒（将RgDAAODNA片段克隆到pET28a中的质粒）进行测序验证，测序结果在酶切后的pET28a质粒中连接上了含有RgDAAO的DNA片段，证明转化正确。获得一种用于表达RgDAAO的菌株，记为BM-P01。

以同样的方法，分别转化pET28a-TvDAAO和pET28a-CcDAAO，获得分别用于表达TvDAAO和CcDAAO的菌株BM-P02和BM-P03。

以同样的方法，分别转化pET21a-RgDAAO、pET21a-TvDAAO和T21a-CcDAAO，获得分别用于表达RgDAAO、TvDAAO和CcDAAO的菌株BM-P04、BM-P05和BM-P06。

操作3、D-氨基酸氧化酶（D-amino acid oxidase，DAAO）的表达与粗酶液的制备

步骤1：从平板上挑取用于表达DAAO的克隆，接到4ml LB培养基中，37度，250转/分钟过夜培养。按照1%的接菌量将培养物转接到50ml新鲜的LB培养基中，37度，250转/分钟培养至OD550=0.6，加入终浓度为1mM的IPTG，30度，150转/分钟继续培养24小时。

将培养好的细胞离心收集，5000转/分钟，离心5分钟。使用溶液I（Tris-HCl，pH8.0，含1mM EDTA和0.1M NaCl），洗涤细胞2次后，将细胞存于-80度，备用。

步骤2：将以上保存于-80度的细胞中加入3ml溶液II（磷酸钾缓冲液，pH8.0，含1M的FAD）悬浮细胞。使用超声破碎仪破碎细胞，一个循环为5分钟（3s/5s，30%*950W），破碎细胞。14000转/分钟离心破碎液30分钟，弃沉淀，获得的上清液作为用于酶活测定的粗酶液。

在本发明中，如无特殊说明，则DAAO的表达与粗酶液制备以本操作所述方法为标准方法。

操作4、D-氨基酸氧化酶（D-amino acid oxidase，DAAO）的酶活测定方法的建立

按照操作3中所述方法制备用于DAAO酶活测定的粗酶液，进行酶活测定。

酶活测定的反应体系：700L粗酶液与700L溶液III（0.1M D-丙氨酸，溶解于0.1MTris-HCl缓冲液中，pH8.0）混匀，37度，水浴反应10分钟，使用HPLC对反应液进行检测。酶活单位定义为：每分钟生成1mol丙酮酸所需要的酶量。

HPLC检测条件：使用安捷伦(Agilent-1200)高效液相色谱仪对反应液中的组分进行测定。反应液中丙酮酸的浓度测定采用伯乐(Biorad)公司的Aminex HPX–87H有机酸分析柱。

粗酶液中蛋白浓度的检测使用Bio-Rad的蛋白定量试剂盒进行测定，操作按照试剂盒说明书进行。使用酶标仪检测595nm吸光值的测定。对照为牛血清蛋白（BSA）。

酶活计算公式为：

Sp(mol/min mg Pr)=（[pyruvate]mol/L*反应体积L）/([Pr]mg/mL*酶液体积L*反应时间min)

结果见表3，在表达的三个DAAO中，CcDAAO活性较差，RgDAAO使用表达载体pET28a优于pET21a，而TvDAAO使用表达载体pET21a优于pET28a。含有对照质粒pET28a或者pET21a的克隆中未检测到DAAO的活性。

表3DAAO在标准测定条件下的活性

操作5、D-氨基酸氧化酶（D-amino acid oxidase，DAAO）表达条件的优化

为了提高DAAO的活性，对其表达过程中关键条件进行了优化。

步骤1：培养过程中添加D-丙氨酸及酶活测定缓冲液对DAAO活性的影响

D-氨基酸氧化酶的表达能够消耗胞内D-丙氨酸。D-丙氨酸是细菌细胞壁合成的重要组分，DAAO过量表达从而消耗D-丙氨酸可能引起细胞无法正常代谢。因此，在培养基中添加D-丙氨酸可能能够减少过量表达DAAO对细胞代谢的影响。以使用pET28a表达载体进行表达的DAAO为例，按照操作4中描述的方法进行诱导表达并制备粗酶液，除了在培养过程中在LB培养液中添加终浓度为10mM的D-丙氨酸。或者按照操作3中描述的方法进行诱导表达并制备粗酶液，除了在培养过程中在LB培养液中添加终浓度为10mM的D-丙氨酸，并且在粗酶液制备过程中使用焦磷酸缓冲液pH8.0（FAD）替代磷酸缓冲液pH8.0（FAD）悬浮细胞。按照操作4中所述的方法进行酶活计算。结果如表4，可以看出在现有条件下添加D-丙氨酸并未提高DAAO的活性。使用磷酸盐缓冲液pH8.0（FAD）更适合DAAO活性测定。

表4D-ala对DAAO活性的影响

注：以标准条件下BM-P01测得的酶活定义为100%。

步骤2：培养基中含氧量对DAAO活性的影响

以按照操作4中所述标准条件下酶活较好的BM-P01和BM-P05为例，检测培养过程中含氧量对DAAO活性的影响。按照操作4中所述的方法培养诱导细胞，除了加入IPTG诱导后转速更换为120转/分钟；按照操作5中所述的方法进行酶活测定。结果如表5，培养过程中含氧量对于BM-P01影响较小，RgDAAO在低含氧量的情况下DAAO活性优于高含氧量条件下活性。但是对BM-P05来讲，低含氧量条件下TvDAAO的活性没有在高含氧量条件下好。同时，从结果中可以看出，降低诱导过程中的转速能够有效地提高DAAO的活性。

表5培养基中含氧量对DAAO活性的影响

注：以标准条件下BM-P01测得的酶活定义为100%。

综合以上结果，BM-P01菌株中RgDAAO的活性一直比较稳定，而且优于其他菌株中表达的DAAO的活性。因此，选取BM-P01进行接下来的生物转化研究。

操作6、生物转化法使用D-丙氨酸生产丙酮酸

按照操作3中所述方法培养并诱导BM-P01中RgDAAO的表达，从50mL培养液中获得的细胞用0.1M磷酸钾缓冲液pH8.0（FAD）悬浮，使OD550约为10。加入80，000IU过氧化氢酶（catalase，sigma公司），1MD-丙氨酸（89g/L），起始反应，每隔3小时取样1mL，用同操作5中HPLC检测方法检测生成的丙酮酸浓度。同时使用BM-P07作为对照。

结果显示，BM-P01能够在24小时的时间内将1M的D-丙氨酸转化为丙酮酸，丙酮酸产量达87g/L，转化率达98%。对照菌株BM-P07中未检测到丙酮酸生成。

操作7、丙氨酸消旋酶基因和过氧化氢酶基因的克隆与表达

为了实现能够从L-丙氨酸直接生物催化生成丙酮酸，并且减少反应过程中生成的过氧化氢对丙酮酸的进一步分解，本发明克隆并表达了丙氨酸消旋酶基因alaR和过氧化氢酶基因katE。分为以下两个操作：

步骤1：alaR基因的克隆与表达

以枯草芽孢杆菌168（来自ATCC，编号23857）的基因组DNA为模板，使用引物alaRup-NdeI/alaR down-XhoI，扩增枯草芽孢杆菌的丙氨酸消旋酶基因alaR。引物序列为：

alaR up-NdeI：GGAGAGCATATGAGCACAAAACCTTT（SEQ ID NO：1），

alaR down-XhoI：CGCTGCCTCGAGTTAATTGCTTATATTTACC（SEQ ID NO：2）。

扩增体系为：NewEngland Biolabs Phusion5X缓冲液10μl、dNTP(每种dNTP各10mM)1μl、DNA模板20ng、引物(10μM)各2μl、Phusion High-FidelityDNA聚合酶(2.5U/μl)0.5μl、蒸馏水33.5μl，总体积为50μl。

扩增条件为：98℃预变性2分钟(1个循环)；98℃变性10秒、56℃退火10秒、72℃延伸30秒(30个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)。扩增产物克隆到pACYCDuet-1质粒的NdeI和XhoI酶切位点，获得质粒pACYCDuet-1-alaR。

克隆操作为：

将以引物alaR up-NdeI/alaR down-XhoI扩增获得的alaR基因的PCR片段进行清洗纯化，获得含有alaR基因的DNA片段（1192bp）。酶切体系为：0.2μg的alaR DNA片段，2μl10*CutSmart Buffer（NewEngland Biolabs Phusion公司），1μl NdeI（NewEnglandBiolabs Phusion公司），1μl XhoI（NewEngland Biolabs Phusion公司），补充蒸馏水至20μl，37℃温浴10分钟。然后琼脂糖凝胶回收获得酶切好的含有alaR的DNA片段。质粒pACYCDuet-1的酶切体系：1μg的质粒pACYCDuet-1，2μl10*CutSmart Buffer（NewEnglandBiolabs Phusion公司），1μl NdeI（NewEngland Biolabs Phusion公司），1μl XhoI（NewEngland Biolabs Phusion公司），补充蒸馏水至20μl，37℃温浴10分钟。然后琼脂糖凝胶回收获得酶切好的含有pACYCDuet-1的DNA片段。连接体系：10ng酶切回收的pACYCDuet-1片段，20ng alaR的DNA片段，2μl Quick Ligation Reaction Buffer，加蒸馏水补充至10μl，然后加0.5μl Quick T4DNA Ligase，25℃放置10分钟，取5μl加入50μl Trans1-T1感受态细胞中（购自北京全式金生物技术有限公司），冰浴30分钟。42℃热激30秒，立即置于冰上2分钟。加入250μl LB培养基，200rpm，37℃孵育1小时。取200μl菌液涂在含有氯霉素（终浓度为34g/ml）的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒（将alaR DNA片段克隆到pACYCDuet-1中的质粒）进行测序验证，测序结果在酶切后的pACYCDuet-1质粒中连接上了含有alaR的DNA片段，证明质粒构建正确，质粒命名为pACYCDuet-1-alaR。

按照操作2中所述方法抽提质粒pACYCDuet-1-alaR，并存于-20度备用。

步骤2过氧化氢酶基因katE的克隆与表达：

以大肠杆菌（来自ATCC，编号8739）的基因组DNA为模板，使用引物katE up-SacI/katE down-SalI，扩增大肠杆菌的过氧化氢酶katE。引物序列为：

katE-up-SacI：ggcgGAGCTCATGTCGCAACATAACGAAAAG

katE-down-SalI：ggcgGTCGACTCAGGCAGGAATTTTGTCA

扩增体系为：NewEngland Biolabs Phusion5X缓冲液10μl、dNTP(每种dNTP各10mM)1μl、DNA模板20ng、引物(10μM)各2μl、Phusion High-FidelityDNA聚合酶(2.5U/μl)0.5μl、蒸馏水33.5μl，总体积为50μl。

扩增条件为：98℃预变性2分钟(1个循环)；98℃变性10秒、56℃退火10秒、72℃延伸1分钟(30个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)。扩增产物克隆到pACYCDuet-1-alaR质粒（本操作操作1中得到的质粒）的SacI和SalI酶切位点，获得质粒pACYCDuet-1-katE-alaR。

克隆操作为：

将以引物katE up-SacI/katE down-SalI扩增获得的katE基因的PCR片段进行清洗纯化，获得含有katE基因的DNA片段（1192bp）。酶切体系为：0.2μg的katE DNA片段，2μl10*CutSmart Buffer（NewEngland Biolabs Phusion公司），1μl SacI-HF（NewEnglandBiolabs Phusion公司），1μl SalI-HF（NewEngland Biolabs Phusion公司），补充蒸馏水至20μl，37℃温浴10分钟。然后琼脂糖凝胶回收获得酶切好的含有katE的DNA片段。质粒pACYCDuet-1-alaR的酶切体系：1μg的质粒pACYCDuet-1-alaR，2μl10*CutSmart Buffer（NewEngland Biolabs Phusion公司），1μl SacI-HF（NewEngland Biolabs Phusion公司），1μl SalI-HF（NewEngland Biolabs Phusion公司），补充蒸馏水至20μl，37℃温浴10分钟。然后琼脂糖凝胶回收获得酶切好的含有pACYCDuet-1-alaR的DNA片段。连接体系：10ng酶切回收的pACYCDuet-1-alaR片段，20ng katE的DNA片段，2μl Quick Ligation ReactionBuffer，加蒸馏水补充至10μl，然后加0.5μl Quick T4 DNALigase，25℃放置10分钟，取5μl加入50μl Trans1-T1感受态细胞中（购自北京全式金生物技术有限公司），冰浴30分钟。42℃热激30秒，立即置于冰上2分钟。加入250μlLB培养基，200rpm，37℃孵育1小时。取200μl菌液涂在含有氯霉素（终浓度为34g/ml）的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒（将katEDNA片段克隆到pACYCDuet-1-alaR中的质粒）进行测序验证，测序结果在酶切后的pACYCDuet-1-alaR质粒中连接上了含有katE的DNA片段，证明质粒构建正确，质粒命名为pACYCDuet-1-katE-alaR，如图2所示。

按照操作2中所述方法抽提质粒pACYCDuet-1-katE-alaR，并存于-20度备用。

操作8、生物转化法使用L-丙氨酸生产丙酮酸菌株的构建及应用

将操作7中构建得到的质粒pACYCDuet-1-katE-alaR电转化入BM-P01中，构建获得用于将L-丙氨酸转化为丙酮酸的菌株BM-P09，见表6。

质粒电转化：

步骤1：液体培养BM-P01至OD550=0.5，4度，5000转/分钟条件下离心收集细胞，弃上清液

步骤2：用冰预冷的灭菌水20mL悬浮细胞，并在同样条件下离心，弃上清液。

步骤3：重新用10mL冰预冷的灭菌水洗涤细胞，并在同样条件下离心，弃上清液。

步骤4：重复步骤3一次，弃上清，并用100L灭菌水悬浮细胞。

步骤5：取50L步骤4中获得的细胞，加入1L质粒pACYCDuet-1-katE-alaR，冰上放置2分钟，转移至0.2cm的Bio-Rad电击杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1ml LB培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，75rpm，37℃孵育1小时。取200μl菌液涂在含有卡那霉素和氯霉素(终浓度分别为50g/ml和34g/ml)的LB平板上，37℃过夜培养，挑取单克隆培养，并命名为BM-P09。

生物催化：

按照操作3中所述方法培养诱导BM-P09中RgDAAO、KatE和AlaR的表达，从50mL培养液中获得的细胞用0.1M磷酸钾缓冲液pH8.0（FAD）悬浮，使OD550约为10。加入1ML-丙氨酸（89g/L），起始反应，每隔3小时取样1mL，用同操作4中HPLC检测方法检测生成的丙酮酸浓度。

结果显示，BM-P09能够在30小时的时间内将1M的L-丙氨酸转化为丙酮酸，丙酮酸产量达85g/L，转化率达95%。

表6本发明中用于丙酮酸生物催化所使用的菌株

Claims (6)

1.一种生产丙酮酸菌株的构建方法，其构建方法如下：

将D-氨基酸氧化酶基因DAAO通过EcoRI或BamHI克隆在pUC57质粒中获得质粒pUC57-DAAO，以质粒pUC57-DAAO为模板进行基因扩增，将基因DAAO扩增获得的产物克隆至质粒pET28a或pET21a中，选取培养得到质粒中连接上含有DAAO的DNA片段的阳性克隆质粒，将上述构建好的阳性克隆质粒转化进表达宿主菌BL21(DE3)中，选取培养得到能够将D-丙氨酸转化为丙酮酸的第一菌株；

D-氨基酸氧化酶基因DAAO片段大小为1124 bp，含有核酸内切酶NdeI和EcoRI的酶切位点；D-氨基酸氧化酶基因DAAO为RgDAAO；质粒pUC57-DAAO为质粒pUC57-RgDAAO，所述的RgDAAO来自Rhodotorula gracilis的D-氨基酸氧化酶基因；RgDAAO的序列为：ATGCACTCGCAGAAGCGCGTCGTTGTCCTCGGATCAGGCGTTATCGGTCTGAGCAGCGCCCTCATCCTCGCTCGGAAGGGCTACAGCGTGCATATTCTCGCGCGCGACTTGCCGGAGGACGTCTCGAGCCAGACTTTCGCTTCACCATGGGCTGGCGCGAATTGGACGCCTTTCATGACGCTTACAGACGGTCCTCGACAAGCAAAATGGGAAGAATCGACTTTCAAGAAGTGGGTCGAGTTGGTCCCGACGGGCCATGCCATGTGGCTCAAGGGGACGAGGCGGTTCGCGCAGAACGAAGACGGCTTGCTCGGGCACTGGTACAAGGACATCACGCCAAATTACCGCCCCCTCCCATCTTCCGAATGTCCACCTGGCGCTATCGGCGTAACCTACGACACCCTCTCCGTCCACGCACCAAAGTACTGCCAGTACCTTGCAAGAGAGCTGCAGAAGCTCGGCGCGACGTTTGAGAGACGGACCGTTACGTCGCTTGAGCAGGCGTTCGACGGTGCGGATTTGGTGGTCAACGCTACGGGACTTGGCGCCAAGTCGATTGCGGGCATCGACGACCAAGCCGCCGAGCCAATCCGCGGGCAAACCGTCCTCGTCAAGTCCCCATGCAAGCGATGCACGATGGACTCGTCCGACCCCGCTTCTCCCGCCTACATCATTCCCCGACCAGGTGGCGAAGTCATCTGCGGCGGGACGTACGGCGTGGGAGACTGGGACTTGTCTGTCAACCCAGAGACGGTCCAGCGGATCCTCAAGCACTGCTTGCGCCTCGACCCGACCATCTCGAGCGACGGAACGATCGAAGGCATCGAGGTCCTCCGCCACAACGTCGGCTTGCGACCTGCACGACGAGGCGGACCCCGCGTTGAGGCAGAACGGATCGTCCTGCCTCTCGACCGGACAAAGTCGCCCCTCTCGCTCGGCAGGGGCAGCGCACGAGCGGCGAAGGAGAAGGAGGTCACGCTTGTGCATGCGTATGGCTTCTCGAGTGCGGGATACCAGCAGAGTTGGGGCGCGGCGGAGGATGTCGCGCAGCTCGTCGACGAGGCGTTCCAGCGGTACCACGGCGCGGCGCGGGAGTCGAAGTTGTAG；

基因RgDAAO进行基因扩增和克隆所选用的引物分别如下：

以来自ATCC、编号23857的枯草芽孢杆菌168的基因组DNA为模板，基因扩增枯草芽孢杆菌的丙氨酸消旋酶基因alaR，将基因alaR扩增获得的产物克隆到质粒pACYCDuet-1的NdeI和XhoI酶切位点构建得到质粒pACYCDuet-1-alaR；

以来自ATCC、编号8739的大肠杆菌的基因组DNA为模板，基因扩增大肠杆菌的过氧化氢酶基因katE，将基因katE扩增获得的产物克隆到质粒pACYCDuet-1-alaR的SacI和SalI酶切位点构建得到质粒pACYCDuet-1-katE-alaR；

将构建得到的质粒pACYCDuet-1-katE-alaR电转化入第一菌株中，构建获得能够将L-丙氨酸转化为丙酮酸的第二菌株；

基因alaR、katE进行基因扩增和克隆所选用的引物分别如下：

2.如权利要求1所述的生产丙酮酸菌株的构建方法，其特征在于，质粒pUC57-DAAO为模板进行DAAO基因扩增的具体操作为：

扩增体系为：NewEngland Biolabs Phusion 5X缓冲液10μl、dNTP1μl且每种dNTP各10mM、DNA模板20ng、10μM的引物各2μl、2.5U/μl的Phusion High-Fidelity DNA聚合酶0.5μl、蒸馏水33.5μl，总体积为50μl；

扩增条件为：98℃预变性2分钟，1个循环；98℃变性10秒、 56℃退火10秒、72℃延伸30秒，30个循环；72℃延伸10分钟，1个循环；

DAAO基因扩增产物克隆至pET28a或pET21a质粒中的具体操作为：

将基因DAAO扩增获得的DAAO基因的PCR片段进行清洗纯化，获得含有DAAO基因的DNA片段，共1124bp；

酶切体系为：0.2μg的DAAO DNA片段，2μl 10*CutSmart Buffer，1μl NdeI，1μl EcoRI-HF，补充蒸馏水至20μl，37℃温浴10分钟，然后琼脂糖凝胶回收获得酶切好的含有DAAO的DNA片段；

质粒pET28a或pET21a的酶切体系：1μg的质粒pET28a或pET21a，2μl 10*CutSmartBuffer，1μl NdeI，1μl EcoRI-HF，补充蒸馏水至20μl，37℃温浴10分钟，然后琼脂糖凝胶回收获得酶切好的含有pET28a的DNA片段；

连接体系：10ng酶切回收的pET28a片段，20ng RgDAAO的DNA片段，2μl Quick LigationReaction Buffer，加蒸馏水补充至10μl，然后加0.5μl Quick T4 DNA Li gase，25℃放置10分钟，取5μl加入50μl Trans1感受态细胞中，冰浴30分钟；

42℃热激30秒，立即置于冰上2分钟；加入250μl LB培养基，200rpm，37℃孵育1小时；取200μl菌液涂在含有终浓度为50ug/ml的卡那霉素的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒。

3.如权利要求2所述的生产丙酮酸菌株的构建方法，其特征在于，将构建好的阳性克隆质粒转化进表达宿主菌BL21(DE3)中的具体操作为：

步骤1：将阳性克隆质粒接到4ml LB培养基中，培养基中含有终浓度为50g/ml的卡那霉素，在37度，250转/分钟条件下过夜培 养，使用质粒提取试剂盒进行质粒提取，提取的质粒存于-20度备用；

步骤2：取1μl步骤1中提取的质粒，加入50μl BL21(DE3)感受态细胞中，冰浴30分钟，42℃热激30秒，立即置于冰上2分钟，加入500μl LB培养基，200rpm，37℃孵育1小时，取200μl菌液涂在含有终浓度为50ug/ml的卡那霉素的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，选取培养得到能够将D-丙氨酸转化为丙酮酸的第一菌株。

4.如权利要求1所述的生产丙酮酸菌株的构建方法，其特征在于，基因扩增枯草芽孢杆菌的丙氨酸消旋酶基因alaR的具体操作为：

扩增体系为：NewEngland Biolabs Phusion 5X缓冲液10μl、dNTP1μl且每种dNTP各10mM、DNA模板20ng、10μM的引物各2μl、2.5U/μl的Phusion High-Fidelity DNA聚合酶0.5μl、蒸馏水33.5μl，总体积为50μl；

扩增条件为：98℃预变性2分钟，1个循环；98℃变性10秒、56℃退火10秒、72℃延伸30秒，30个循环；72℃延伸10分钟，1个循环；

alaR基因扩增产物克隆到pACYCDuet-1质粒NdeI和XhoI酶切位点的具体操作条件为：

将alaR基因扩增获得的alaR基因的PCR片段进行清洗纯化，获得含有alaR基因的DNA片段，1192bp；

酶切体系为：0.2μg的alaR DNA片段，2μl 10*CutSmart Buffer，1μl NdeI，1μl XhoI，补充蒸馏水至20μl，37℃温浴10分钟；然后琼脂糖凝胶回收获得酶切好的含有alaR的DNA片段；

质粒pACYCDuet-1的酶切体系：1μg的质粒pACYCDuet-1，2μl10*CutSmart Buffer，1μlNdeI，1μl XhoI，补充蒸馏水至20μl，37℃温浴10分钟；然后琼脂糖凝胶回收获得酶切好的含有pACYCDuet-1的DNA片段；

连接体系：10ng酶切回收的pACYCDuet-1片段，20ng alaR的DNA片段，2μl QuickLigation Reaction Buffer，加蒸馏水补充至10μl，然后加0.5μl Quick T4DNA Ligase，25℃放置10分钟，取5μl加入50μl Trans1-T1感受态细胞中，冰浴30分钟；42℃热激30秒，立即置于冰上2分钟,加入250μl LB培养基，200rpm，37℃孵育1小时，取200μl菌液涂在含有终浓度为34g/ml的氯霉素的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取将alaR DNA片段克隆到pACYCDuet-1中的质粒pACYCDuet-1-alaR。

5.如权利要求1所述的生产丙酮酸菌株的构建方法，其特征在于，基因扩增大肠杆菌的过氧化氢酶基因katE的具体操作条件为：

扩增体系为：NewEngland Biolabs Phusion 5X缓冲液10μl、dNTP1μl且每种dNTP各10mM、DNA模板20ng、10μM的引物各2μl、2.5U/μl的Phusion High-Fidelity DNA聚合酶0.5μl、蒸馏水33.5μl，总体积为50μl；

扩增条件为：98℃预变性2分钟，1个循环；98℃变性10秒、56℃退火10秒、72℃延伸1分钟，30个循环；72℃延伸10分钟，1个循环；

katE基因扩增产物克隆到pACYCDuet-1-alaR质粒的SacI和SalI酶切位点的具体操作为：

将katE基因扩增获得的katE基因的PCR片段进行清洗纯化，获得含有katE基因的DNA片段，1192bp；

酶切体系为：0.2μg的katE DNA片段，2μl 10*CutSmart Buffer，1μl SacI-HF，1μlSalI-HF，补充蒸馏水至20μl，37℃温浴10分钟，然后琼脂糖凝胶回收获得酶切好的含有katE的DNA片段；

质粒pACYCDuet-1-alaR的酶切体系：1μg的质粒pACYCDuet -1-alaR，2μl10*CutSmartBuffer，1μl SacI-HF，1μl SalI-HF，补充蒸馏水至20μl，37℃温浴10分钟；然后琼脂糖凝胶回收获得酶切好的含有pACYCDuet-1-alaR的DNA片段；

连接体系：10ng酶切回收的pACYCDuet-1-alaR片段，20ng katE的DNA片段，2μl QuickLigation Reaction Buffer，加蒸馏水补充至10μl，然后加0.5μl Quick T4DNA Ligase，25℃放置10分钟，取5μl加入50μl Trans1-T1感受态细胞中，冰浴30分钟；

42℃热激30秒，立即置于冰上2分钟；加入250μl LB培养基，200rpm，37℃孵育1小时；取200μl菌液涂在含有终浓度为34g/ml的氯霉素的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取将katE DNA片段克隆到pACYCDuet-1-alaR中的质粒pACYCDuet-1-katE-alaR。

6.如权利要求1所述的生产丙酮酸菌株的构建方法，其特征在于，质粒pACYCDuet-1-katE-alaR电转化入第一菌株中的具体操作为：

步骤1：液体培养第一菌株至OD550＝0.5，4度，5000转/分钟条件下离心收集细胞，弃上清液；

步骤2：用冰预冷的灭菌水20mL悬浮细胞，并在同样条件下离心，弃上清液；

步骤3：重新用10mL冰预冷的灭菌水洗涤细胞，并在同样条件下离心，弃上清液；

步骤4：重复步骤3一次，弃上清，并用100L灭菌水悬浮细胞；

步骤5：取50L步骤4中获得的细胞，加入1L质粒pACYCDuet-1-katE-alaR，冰上放置2分钟，转移至0.2cm的Bio-Rad电击杯；使用MicroPulser电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv，电击后迅速将1ml LB培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，75rpm，37℃孵育1小时，取200μl菌液涂在含有卡那霉素和氯霉 素的LB平板上，LB平板上卡那霉素和氯霉素的终浓度分别为50g/ml和34g/ml，37℃过夜培养，挑取能够将L-丙氨酸转化为丙酮酸的第二菌株。