CN104520433A - 产生pha的基因工程微生物 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于一种天然产生PHA的微生物的基因工程形式，其与具有编码聚羟基烷羧酸酯(PHA)合成酶的至少一个基因的野生型微生物相比具有增加的拷贝数，并最终引起在24小时后微生物以与野生型相比至少1.2倍的量来过量产生中链长度的PHA或长链长度的PHA，其中用于评估过量产生的参考条件是含有15mM辛酸钠的经修改的MM培养基。另外，在微生物中PHA的产生可以被编码PHA降解中涉及的蛋白质的基因的失活有利地影响，这导致微生物的化合物增加的生产而没有随着时间的PHA含量的下降。本发明的微生物可用于PHA的商业生产。本发明还涉及用于产生PHA的方法。

Description

产生PHA的基因工程微生物
本发明涉及聚羟基烷羧酸酯(PHA)的生物合成领域。本发明尤其涉及具有编码PHA合成酶的至少一种基因的基因工程微生物，与野生型微生物相比，其繁殖稳定且增加拷贝数，其中，基因工程使微生物过量产生中链长度或长链长度的PHA。
PHA属于聚合物类型，其为由可再生资源生产的生物可降解的和生物相容性的塑性材料(3-羟基脂肪酸的聚酯)，可广泛的用于工业和生物医学应用(Williams&Peoples,1996,Chemtech 26:38-44)。PHA通过多种细菌合成，并且由于其替代常规的基于石油化学的塑料以保护环境免受塑料废物的有害影响的潜在用途而已经被广泛地研究。
根据PHA的侧链长度和其生物合成途径，可将其分为两类。具有短的侧链的那些是结晶热塑性塑料，例如PHB、(R)-3-羟基丁酸的均聚物，而具有长的侧链的PHA更具弹性。前者已经知道约70年了(Lemoigne&Roukhelman,1925,Ann Des Fermentation,527-536)，而后者是相对近期发现的(deSmet等人,1983,J.Bacteriof.154:870-78)。然而，在该命名之前，已经识别了包含具有5至16个碳原子的较长侧链(R)-3-羟基酸单元和(R)-3-羟基丁酸单元二者的生物来源的PHA(Wallen&Roweder 1975,Environ.Sci.Technol.8:576-79)。已经识别了产生含有5至16个碳原子的一种或更多种长侧链羟基酸单元和(R)-3-羟基丁酸的共聚物的多种细菌(Steinbuchel&Wiese,1992,Appl.Microbiol.Biotechnol.37:691-97；Valentin等人,1992,Appl.Microbiol.Biotechnol.36:507-14；Valentin等人,Appl.Microbiol.Biotechnol.1994，40：710-16；Abe等人,1994,Int.J.Biol.Macromol.16:115-19；Lee等人,1995,Appl.Microbiol.Biotechnol.42:901-09；Kato等人,1996,Appl.Microbiol.Biotechnol.45:363-70；Valentin等人,1996,Appl.Microbiol.Biotechnol.46:261-67和美国专利号4876331)。这些共聚物可以被称为PHB-co-HX(其中X为具有6个或更多个碳原子的烯羧酸酯(alkenoate)或3-羟基烷羧酸酯)。特定的二元共聚物的一个有用例子为PHB-co-3-羟基己酸酯(PHB-co-3H H)(Brandl等人，1989，Int.J.Biol.Macromol.11:49-45；Amos&McInerey,1991,Arch.Microbiol.155:103-06；美国专利号5292860)。
尽管由于PHA作为可再生资源用于生物可降解的热塑性塑料和生物聚合物(如上述的)的潜在用途而已经对其进行广泛地研究，并且已经商业开发和销售(Hrabak,1992,FEMS Microbiol.Rev.103:251-256)，但是其生产成本远高于常规的基于石油化学的塑料的生产成本。这对其更为广泛的应用构成了主要障碍(Choi&Lee,1997,Bioprocess Eng.17:335-342)。如上所述，许多细菌产生PHA，例如，真养产碱杆菌(Alcaligenes eutro phus)、肥大产碱杆菌(Alcaligenes latus)、棕色固氮菌(Azotobacter vinlandii)、嗜酸假单胞菌(Pseudomonas acitophila)、Pseudomonas oleovarans、大肠杆菌(Escherichiacoli)、富养红球菌(Rhodococcus eutropha)、紫色色素杆菌(Chromobacteriumviolaceum)、酒色着色菌(Chromatium vinosum)、泊库岛食烷菌(Alcanivoraxborcumensis)等。在现有技术中已知所有这些产生PHA的细菌产生细胞内PHA并且将其累积在PHA颗粒中(Steinbuchel,1991,Biomaterials,第123-213页)。
与基于石油化学的塑料相比，使得PHA生产昂贵且因此不利的主要方面在于难以高产率来生产材料和难以从累积PHA的细菌细胞中回收所产生的PHA。为了降低PHA的总生产成本，据认为有效回收工艺的开发通常是必要的：其通常目的在于通过i)适当的溶剂，ii)PHA的次氯酸盐提取和/或iii)非PHA细胞材料的消化进行的细胞破碎(Lee,1996,Biotech,Bio-eng.49:1-14)。
在工业规模上，可获得的微生物仍提供相对少的PHA，这使得利用这些微生物产生PHA在经济上是不可行的。例如，在将恶臭假单胞菌U(Pseudomonasputida U)的野生型细胞在经修改的包含辛酸钠(15mM)作为碳源的MM培养基中培养，在第一个24小时期间，在微生物中仅累积了24.4％的PHA。现有技术中已知的用于基于PHA生产的微生物的所有方法在生产期间需要大量水，以及用于PHA回收的化学试剂和/或酶，这是对降低生产成本的障碍。因此，迫切需要用于PHA生产的替代策略。
除了整体低的微生物的PHA生产之外，在特定培养阶段所累积的PHA的量开始减少。这种减少的原因可以追溯至以下事实：微生物产生PHA作为食物储存材料，其在变化的环境中作为快速能量来源和还原能力提供给细菌。所有独立生存的微生物实行某种碳源管理到了可能的程度，而许多动物和植物通常调节碳源摄取以满足代谢需求，其他生物，尤其是经受过可用碳源大幅波动的机会性环境微生物能够捕获过量的碳源并管理其利用，如一方面通过消耗和生长，另一方面通过转化保存以储存聚合物。在可容易代谢的储存产品和更加惰性的细胞内储存产品，在某种程度上还有细胞外存储产品之间的相互转化是该机制的核心。甚至调节碳源摄取的生物体也利用这种相互转化用于微调它们的碳源管理以最优化其细胞代谢网络和机体生理生态过程。
如以上所提及的，PHA是微生物界中广泛利用的储存产品。为了允许微生物中以PHA储存的碳源的利用，对生物而言至关重要的是在微生物需要额外的碳源时能够将PHA转化成羟基烷羧酸酯(即，单体)。负责将聚合物转化为单独的单体单元的是PHA解聚酶。
由于微生物含有负责PHA产生和降解的两种类型蛋白质，生物体确保其生存和发展的关键问题是调节PHA合成酶与PHA解聚酶的相对量，这是通过酶的调节生成来确定的(Uchino等人,2007；Ren等人,2009a；以及de Eugenio等人,2010a,2010b)。然而，迄今为止，对控制聚合与解聚合过程的因子知之甚少。例如，仅敲除假单胞菌菌株中的PHA解聚酶并不导致提高的PHA累积(Huisman等人,1991；Solaiman等人,2003)。因此，事实证明仅消除负责PHA解聚的基因来有效地增加微生物中PHA的含量是不够的。
增加微生物中PHA生成的不同途径是操控在微生物中负责PHA生成的PHA合成酶。例如，已发现PHA基因的代谢工程是用于提高中链长度的PHA生成的良好策略。之前的研究试图通过phaCl的过表达来增加恶臭假单胞菌中的PHA产率(Kraak等人,1997；Prieto等人,1999；Conte等人,2006；Kim等人,2006；Ren等人,2009b)。然而，这些研究遇到了以下问题：含有PhaC的质粒在其对于生长不重要时丢失并且在细胞中施加不利影响。结果，经修改的微生物经繁殖后不稳定，且丢失了负责PHA过量产生的遗传信息。在其他情况中，得到了较少的PHA累积，因为启动子的高诱导性并不总是必然伴有高活性的基因产物(Diederich等人，1994；Ren等人，2009).
这些尝试不成功的原因可以在涉及微生物中PHA的生成、存储和降解的许多不同蛋白质中找到。多数微生物具有多于一个的PHA合成酶，因此，增加一种合成酶的基因拷贝数会使微生物耗尽对生成其他PHA合成酶重要的代谢物，这导致微生物中仅中等提高的PHA合成。
此外，颗粒结合蛋白(phasin)在微生物中对PHA颗粒稳定起重要作用。例如，颗粒结合蛋白控制PHA颗粒的数量和大小(Grage等人，1999)，其生成介于细胞质与PHA颗粒疏水核心之间的中间相，由此防止各个颗粒聚结(Steinbuchel等人,1995；York等人,2002)。还已经提出颗粒结合蛋白PhaF以及一些球形转录因子(如Crc)对PhaC活性的调节是重要的(Prieto等人,1999b；Casta-neda等人,2000；essler&Witholt,2001；Hoffmann&Rehm,2005；Ren等人,2010)。P.putida KT2440(Galan等人,2011)中的最近研究已经证明PhaF在颗粒分离中起重要作用，而甚至缺少这种颗粒结合蛋白使得细胞质中的这些包含体结块。
因此，这对修饰微生物提出了相当大的挑战：所述修饰使得微生物以显著程度过量产生PHA，且同时确保导致过量产生的该修饰在微生物经繁殖后稳定，并且确保在PHA微生物的操作中涉及的蛋白质都不被严重地影响以使得过度补偿期望的结果。对于目前所尝试的多数途径，另外还难以找到PHA累积处于其峰值的精确时间点，且难以在PHA分解前回收PHA。
在WO 2007/017270 Al中已经描述了一种途径，就这方面而言其在一定程度上已经成功，其中泊库岛食烷菌已经通过消除类tesB基因而被修饰。该基因编码硫酯酶，硫酯酶将(R)-3-羟基-酰基-CoA中间体转化成相应的酸。这是重要的副反应，其使微生物耗尽对PHA合成而言重要的中间体。虽然这种途径由于实现较高的PHA累积而已经被证明在一定程度上是成功的，但是有待观察是否经修饰的微生物具有需要的稳定性以允许成功实施进入工业规模的PHA生产。
另一个途径为过表达PHA合成酶如已经由Kim等人(2006,Biotechnol.Prog.22:1541-1546)描述的在p.putida KCTC1639中的phaC1和phaC2。在该研究中，将另外的phaC1和phaC2基因的拷贝通过质粒引入微生物中，其中，所述基因不受启动子控制。Kim等人描述了在经修饰的微生物中PHA合成酶的活性多于野生型的活性的1.6倍。虽然在过表达phaC1的微生物的情况下可以观察到增加的PHA生产(至多约0.8g/l)，但是过表达phaC2的微生物并未表现出相对于野生型而言增加了PHA产生。该观察可能是由于phaC2合成酶的非活性形式的形成引起的。
另外一个途径是将PHA合成酶基因插入微生物中，这在其野生型形式中不产生PHA。例如，WO 99/14313、DE 44 17 169 Al或Qi等人(1997,FEMSMicrobiol,Lett.157:155-162)描述了将PHA合成酶基因引入大肠杆菌(E coli.)中。然而，在这些经改造的微生物中，所生产的PHA的产率非常低，使得它们不适合PHA的工业生产。
最后，Cat等人(2009,Biores.Technol.100:2265-2270)已经报道了通过敲除P.putida KT 2442.中的PHA解聚酶基因提高PHA生产。在该研究中，在将微生物在高碳源浓度例如12g/l存在下培养时，可以观察到PHA生产的增加。
尽管有这些进步，但是仍存在对基因修饰的微生物的需求，所述基因修饰的微生物具有增加的PHA过量产生且同时经繁殖后是稳定的，因为它们不会丢失为此目的而插入的遗传信息。本申请满足这个需求。
发明的简要说明
本申请的一个目的是提供基因工程微生物，其中在微生物中负责中链长度的PHA或长链长度PHA的过量产生的遗传信息经繁殖后是稳定的。本发明的另一个目的是修饰微生物，使得避免暴露于培养基一定时间后PHA下降，并且同时增加PHA累积的百分比。另外，本申请的另一目的是修饰微生物，使得防止在已经累积PHA之后发生显著的PHA降解。
本发明基于以下发现：通过修饰产生PHA的微生物以使得它们与具有编码PHA合成酶的至少一个基因的野生型微生物相比增加的拷贝数可以实现这些目标。优选地，在另外的拷贝中存在的基因编码phaC2或其同系物。当在本申请中使用该术语时，野生型微生物是指当微生物在自然界中出现时的典型形式。优选地，天然形式的野生型微生物包含编码PHA合成酶的至少一种基因。
术语“同系物”在本申请的实践中定义为基本上具有相同的功能但是具有不同(尽管相似)的亲本肽序列和结构的蛋白质或肽。本申请的上下文中，术语“同源百分比”和“序列相似度”可互换地使用。在本申请的实践中，优选同系物相对于亲本肽应当具有至少40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、最优选至少95％的序列一致性。用于比较两个序列的数学算法的一个优选非限制性实例是Karlin等人的算法(1993,PNAS 90:5873-5877)。将该算法引入NBLAST程序中，该程序可以用于识别相对于本发明的核酸序列具有期望的一致性的序列。
因此，本申请的一个主要方面是天然的产生PHA的微生物的基因工程形式，其与具有编码PHA合成酶的至少一种基因的野生型微生物相比具有增加的拷贝数，其中所述增加的拷贝数提供均衡性的所述PHA合成酶的过量产生，并最终使微生物在24小时后以与野生型相比至少1.2倍的量过量产生中链长度的PHA或长链长度的PHA，其中用于评估过量产生的参考条件是含有15mM辛酸钠的经修改的MM培养基。在一个优选实施方案中，基因工程微生物经繁殖后是稳定的且优选地与具有编码PHA合成酶的至少一个基因的野生型微生物相比具有另一个拷贝。
已经出乎意料地发现，这些基因修饰的微生物允许由便宜且容易获得的原料高成本效率地产生PHA，所述原料包括来源于植物脂肪和植物油的脂肪酸。已经观察到本发明微生物提供高的PHA峰值浓度，根据培养条件，甚至在一些情况下在仅24小时后达到峰值浓度。此外，本发明微生物表现出高的遗传稳定性并且融合微生物中的多个PHA颗粒以形成单个PHA颗粒。这进而大大地简化了从微生物中回收PHA，因为它们可以用非氯化溶剂如丙酮提取，并具有与用氯化溶剂提取相当的产率。
术语“基因工程的”(或基因修饰的)是指人工操控本发明的微生物、其基因和/或基因产物(多肽)。
优选地，本发明微生物经繁殖后是稳定的。“经繁殖后稳定”(如该术语在本申请的实践中应当被理解的)是指，生物体在经过多倍(例如5或更高倍数)繁殖周期后保持遗传信息且不丢失遗传信息。
如以上所述的，本发明微生物优选经繁殖后是稳定的，这意味着在繁殖和/培养的微生物中保持了基因修饰。除了这种稳定性之外，优选的是微生物不需要抗生素的压力来保存基因修饰。这种微生物对于PHA生产是高度有利的，因为可以省略抗生素的添加，从而消除了抗生素污染PHA的风险。在本申请的一个优选实施方案中，本发明微生物由此在繁殖和/或培养期间保持其基因修饰，而与受抗生素的存在或不存在无关。
术语“均衡性过表达”是指过表达为使得以小于由增加的拷贝数可预期的量产生由过表达产生的蛋白质。例如，如果野生型包含基因的一个拷贝而基因修饰的微生物包含两个拷贝，可以预期基因修饰的微生物产生与野生型相比约两倍的蛋白质。蛋白质的量可以由生长期的微生物中的固有PHA合成酶的活性来估算。术语均衡性过表达意思是：过表达优选地仅导致24小时候生长期中的固有PHA合成酶活性相对于野生型微生物而言增加至多0.6倍，优选至多0.5倍，更优选至多0.35倍，最优选至多0.2倍。
通过使用“均衡性过表达”，确保了没有大量无活性蛋白质形成。例如，蛋白质的大量的(或不均衡的)过表达可导致形成包涵体，其以非活性形式并作为不溶解的蛋白质包含蛋白质。因此，尽管过表达了蛋白质，但观察不到增加的蛋白质活性。确保均衡性过表达的一种方法是利用渗漏启动子(leakypromoter)系统，其即使在诱导物不存在的情况下也使蛋白质产生受抑制。
在本申请的一个优选实施方案中，过量产生至少部分是由增加的编码PHA合成酶的至少一个基因的拷贝数引起的。在另一个优选实施方案中，微生物含有多于一个拷贝的基因是编码PhaC2合成酶的基因。在本发明的实践中已经发现，插入phaC2基因或其同系物的多拷贝与有益效果相关，特别地phaC2的超表达涉及PHA颗粒的形态变化，其看上去聚结在一起，尤其在对数生长相期间如此。
此外，据认为在渗漏启动子控制下的PhaC2合成酶基因的多拷贝的插入影响PHA代谢中涉及的其他蛋白质，以使得微生物的整体PHA生产和存储系统不受负面影响。
在另一个优选实施方案中，PHA合成酶基因的表达因此受渗漏启动子系统调节。渗漏启动子系统允许启动子控制的基因的转录，但是与系统中启动子用相应活化剂激活的系统相比具有被抑制的效率。渗漏启动子系统优选是基于蛋白质的启动子系统，更优选是T7聚合酶/T7聚合酶启动子系统。在一个甚至更优选的实施方案中，在T7聚合酶/T7聚合酶启动子系统中T7聚合酶的产生包含能够在暴露于小分子后诱导形成T7聚合酶的诱导物。这种系统具有增加的益处：其通过添加导致诱导T7聚合酶形成的小分子可以选择性触发T7聚合酶的产生。然后这进而触发PHA合成酶产生。在一个特定的优先实施方案中，小分子是3-甲基-苯甲酸酯。
天然地产生PHA的微生物的一个高度优选的创造性基因工程形式是在莱布尼兹研究所DSMZ德国微生物和细胞培养物保藏中心以DSM 26224保藏(保藏日期为2013年4月9日)的假单胞菌属的基因工程形式，其在下文中将被指定为PpU10-33。
在本申请的实践中进一步优选的是，其与具有编码PHA合成酶的至少一个基因的野生型微生物相比，除了增加的拷贝数之外，基因工程微生物还在编码PHA降解中涉及的蛋白质的至少一个基因中含有至少一个修饰。已经发现在微生物中这样的修饰组合导致对所观察的PHA累积的协同效应。在一个优选的实施方案中，在所述微生物中编码PHA降解中涉及的蛋白质的至少一个基因中的至少一个修饰导致所述基因完全或部分失活，优选地导致所述基因完全失活。这种微生物也称为敲除相应基因的微生物。
基因敲除突变体可以通过本领域技术人员已知的任意合适的方法制备。然而，优选的是基因的完全或部分失活是通过双重组交换事件途径实现的。
在一个特定优选的实施方案中，PHA降解中涉及的蛋白质是PHA解聚酶，优选地是PhaZ或其同系物。另外，优选的，基因工程微生物中编码PHA降解中涉及的蛋白质的基因含有至少一个修饰，其仅含有在所述微生物中编码PHA降解中涉及的蛋白质的单个基因，其即，仅修饰该基因。换言之，优选的是微生物不含有可以取代所述微生物中PHA降解中涉及的酶的任何其他酶。
天然地产生PHA的微生物的一个高度优选的创造性基因工程形式是在莱布尼兹研究所DSMZ德国微生物和细胞培养物保藏中心以DSM 26225保藏(保藏日期为2013年4月9日)的假单胞菌属的基因工程形式，其中所述的天然地产生PHA的微生物包含编码PHA合成酶的基因的多拷贝和失活的phaZ基因二者。该微生物在下文中将被指定为PpU 10-33-ΔphaZ。
典型的羟基酸单元聚酯(PHA)含有具有5至6个碳原子的侧链羟基酸单元[(R)-3-羟基酸单元]。在本发明的实践中，术语“长链长度的PHA”意在涵盖每个单体(分子)含有至少12个碳原子、优选地至少14个碳原子的PHA，而5至12个碳原子的意在用“中链长度的PHA”表示。在一个优选的实施方案中，基因工程微生物过量产生中链长度的PHA。
在本发明的一个特别优选实施方案中，基因工程微生物是由基因工程引起的，即，例如，插入与具有编码PHA合成酶的至少一个基因的野生型相比增加的拷贝数，和/或在编码所述微生物中的PHA降解中涉及的蛋白质的至少一个基因中插入至少一个修饰，以在24小时后与野生型相比以至少1.2倍(重量)、优选至少1.5倍(重量)以及特别地至少2倍(重量)的量过量产生PHA，其中用于评估过量产生的参考条件是含有15mM辛酸钠的修改MM培养基。
形成本申请的基因工程微生物的基础的微生物不受任何方式限制，只是该微生物必须具有编码PHA合成酶的至少一个基因。优选地，微生物还应当具有编码在所述微生物中PHA降解中涉及的至少一个基因、更优选单个基因。
根据本发明的创造性微生物优选地选自产生PHA的细菌，特别地选自恶臭假单胞菌、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、荧光假单胞菌(Pseudo monas fluorescens)、嗜酸假单胞菌(Pseudomonas acitophila)、Pseudomonas olevarans、热液海源菌(Idiomarina loihiensis)、泊库岛食烷菌、不动杆菌属(Acinetobacter sp.)、新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)、真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)、肥大产碱杆菌(Alcaligenes latus)、棕色固氮菌、富养红球菌(Rhodococcuseutropha)、青紫色素杆菌(Chromobacterium violaceum)或酒色着色菌(Chromatium vinosum)。根据本发明的一个特别地优选的微生物是恶臭假单胞菌菌株，更优选地是恶臭假单胞杆菌U。
已经观察到，本发明的微生物在不存在诱导物分子的情况下表现出PHA合成酶的过量产生。出乎意料地，通过非诱导的微生物的PHA产生匹配或甚至超过用诱导物处理的相同微生物的PHA产生。这表明经诱导的微生物可以超越过表达的PHA合成酶的最佳量，这导致形成合成酶的非活性形式例如包涵体或不溶解的形式。因此，本发明的另一方面是如上所述的基因工程微生物，其中所述微生物能够在没有添加诱导物分子的情况下产生PHA。这对于工业规模的PHA生产具有优势，因为可以省去昂贵的诱导物和来自生产工艺的潜在污染风险。
还已经出乎意料地观察到，本申请的微生物生产与野生型相比具有不同形貌的PHA，因为各个细胞均产生减少的PHA数目或者甚至仅单个PHA颗粒。因此，本申请的另一方面是如上所述的基因工程微生物，其中所述微生物与野生型细胞相比每个微生物能够产生减少数目的细胞内PHA颗粒，优选地为单个细胞内PHA颗粒的形式。据认为单个颗粒的形成与减少的PHA稳定化酶的量相关，这简化了PHA分离与纯化。
还出乎意料地观察到本申请的微生物产生PHA更快且在某些情况下在长的时间内维持高水平的累积PHA。因此，本申请的另一方面是如上所述的基因工程微生物，其中所述微生物在暴露于含有辛酸钠的经修改MM培养基24小时后能够产生最大含量的PHA，并且优选地也能够在最初24小时累积期后至少48小时的时间内将PHA含量维持在最大PHA含量的±20重量％范围内，其中用于评估PHA产生的参考条件是含有15mM辛酸钠的修改MM培养基。
本发明的另一方面涉及用于产生PHA的方法，其包括以下步骤：
a.培养本发明的微生物或细胞和
b.从培养基中回收PHA。
用于在合适的条件下培养微生物或细胞的标准方法是现有技术中众做周知的。例如，参见以下实施例、材料以及Sambrook&Russell(2001)。PHA可以通过常规程序从培养基中回收，所述程序包括通过离心或过滤从培养基中分离细胞，沉淀或过滤成分(PHA)，随后纯化，例如通过层析程序如离子交换、层析、亲和层析或相似的本领域认可的程序来纯化。
优选的是在上述过程中的PHA是利用具有3至8个碳原子的酮、优选用丙酮提取的。与提取溶剂无关，提取优选在60℃或更低的温度下、优选在20至40℃进行。
在本申请的一个特别优选的实施方案中，方法不涉及或不需要添加诱导物分子来引发PHA过量产生和/或过量产生PHA合成酶。此外，在本申请的实践中不必要在抗生素存在下培养本发明的微生物，原因是已经出乎意料地发现所微生物中所引入的修饰是稳定的，即使在不存在抗生素的情况下也是如此。这种抗生素包括但不限于亚碲酸盐(Tellurite)、利福平(Rifampicin)和卡那霉素(Kanamycin)。
作为用于上述过程的碳原料，可以利用容易获得的且便宜的可得自植物脂肪和植物油的脂肪酸。这种脂肪酸的优选实施例包括饱和羧酸例如己酸、庚酸、辛酸和葵烯酸，以及不饱和脂肪酸例如1-十一碳烯酸、油酸或亚油酸。此外可以将多元醇用作原料，例如优选甘油。
本发明的另一方面涉及本发明的微生物、核酸、载体和/或细胞用于过量产生PHA、尤其是中链长度PHA和/长链长度PHA的用途。
附图简要说明
图1.以下细胞的电子显微照片：PpU(a-c)；未诱导的PpU 10-33细胞(d-f)和经诱导的PpU 10-33细胞(g-i)；未诱导的(j-l)和经诱导的(m-o)ΔphaZ-PpU10-33细胞。培养物在含有35mM辛酸钠作为碳源的修改MM培养基中生长(以15mM和20mM两次给予)并在31小时(a、d、g、j、m)、48小时(b、e、h、k、n)和72小时(c、f、i、l、o)取样。
图2.pha基因的表达和P.Putida U中PHA的累积。各柱状图显示PpU(各个编号的第一列)、非诱导的PpU 10-33((a)和(c)中各个编号的第二列)、经诱导的PpU10-33((a)和(c)中各个编号的第三列)、非诱导的ΔphaZ-PpU10-33((b)中各个编号的第二列)和经诱导的ΔphaZ-PpU 10-33((b)中各个编号的第二列)中pha基因表达的归一化倍数增长。在图(c)中，还以带圆点的直线(PpU)、下方的带三角形的虚线(经诱导的PpU 10-33)、圆点(非诱导的PpU 10-33)、上方的带三角形的虚线(非诱导的ΔphaZ PpU 10-33)以及带矩形的虚线(经诱导的ΔphaZ PpU10-33)显示PHA浓度。
图3.P.putida U中用于超表达phaC2的基因组织的两部分系统。该图显示被整合进染色体的两个载体：pCNB1mini-Tn5xylS/Pm::T7pol和pUTminiTn5-Tel-T7phaC2。
图4.以下微生物中随着时间的PHA产生：野生型PpU(方形)以及非诱导的基因工程构造PpU10-33(实心环形)、经诱导的PpU(空心环形)、非诱导的ΔphaZ-PpU 10-33(实心矩形)和经诱导的ΔphaZ-PpU 10-33(空心矩形)。
图5.在存在和不存在相应抗生素的情况下，当在作为底物的辛酸盐(20mM)和MM+0.1％YE培养基中培养时，PpU和PpU 10-33-ΔphaZ的生物量和PHA产率。结果是指复制数。
在下文中，通过实施例的方式进一步说明本申请，但是所述实施例无意于以任何方式限制本申请的范围。
实施例
实验步骤
在本工作中所使用的微生物和载体、细菌菌株、突变体和质粒汇总于附录1中。
培养基条件
除非另有说明，大肠杆菌和恶臭假单胞菌在Luria Miller Broth(LB)中培养并分别在37℃和30℃下孵育。在需要的情况下，向培养基中加入的抗生素如下：利福平(Rf，固体培养基中20μg ml-1，液体培养基中5μg ml-1)、卡那霉素(Km，固体培养基中25μg ml-1，液体培养基中12.5μg ml-1)、氨苄青霉素(Ap，100μg ml-1)、亚碲酸盐(Tel，100μg ml-1)、庆大霉素(Gm，30μgml-1)、氯霉素(Cm，30μg ml-1)、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG，70μM)和5-溴代-4-氯代-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷(XGal，34μg ml-1)。
DNA操控
所有的基因程序按Sambrook&Russell(2001)所描述的进行。利用相应的Qiagen试剂盒(德国)按照制造商的使用说明进行基因组和质粒DNA的提取、琼脂糖凝胶纯化和PCR清洗。在本工作中使用的所有DNA修饰酶(限制性内切酶、DNA连接酶、碱性磷酸酶等)均购自NEB(美国马萨诸塞州)。聚合酶链式反应(PCR)在Eppendorf vapo.protect Thermal Cycler(德国)中进行。50μl PCR反应混合物由以下成分组成：2μl经稀释的染色体DNA(50μg ml-1)、1×PCR缓冲液和2mM MgCl2(PROMEGA Co.,USA)、0.2μΜ的各引物(Eurofinsmgw操纵子)、0.2mM dNTPs(Amersham,GE Healthcare,英国)、1.25U Go-Taq热启动聚合酶(PROMEGA Co.，美国)。PCR循环条件为：起始步骤96℃/10分钟，随后为96℃/30秒至60℃/30秒、72℃/1分钟的30个循环，最后补充72℃/5分钟。通过三亲本杂交实验将质粒转移到假单胞菌菌株(Selvaraj&Iyer，1983；Herrero等人，1990)完成。简单地说，将带有自杀质粒pCNBlmini-Tn5xylSPm::T7pol或pUTminiTn5-Tel-phaC2的E.coli CC 18λpir供体菌株、E.coliRK600辅助菌株以及假单胞杆菌受体菌株分别培养8小时，以0.75:1:2的比例混合，用LB清洗两次。在硝化纤维素滤器上收集悬浮液，并于30℃在LB板上孵育过夜。然后将在滤器上生长的细菌重悬于3ml无菌盐溶液(NaCl 0.9％)中，并将连续稀释液接种于补充以相应选择抗生素的LB琼脂。将板于30℃孵育过夜，通过PCR确认在板上生长的转化结合子克隆。
DNA测序
利用一组特定的寡核苷酸或通用引物M13F和M13R进行用于测序的PCR反应(附录3)。10μl反应混合物由6-12ng纯化的PCR产物(或200-300ng质粒)、2μl BigDye Ready Reaction Mix、1μl BigDye测序缓冲液和1μl特异性引物(25μΜ)组成。循环条件包括：起始步骤96℃/1分钟，随后96℃/20秒-52℃-58℃/20秒-60℃/4分钟的25个循环，和60℃/1分钟的最后补充步骤。用双脱氧链终止法确定核苷酸序列(Big Dye Terminator v3.1试剂盒，AppliedBiosystems，美国福斯特市)。用Qiagen DyeEx 2.0Spin Kit(德国)纯化PCR产物。将团粒重悬于20μl水中，然后加载到ABI PRISM 3130遗传分析仪(Applied Biosystems，美国加利福尼亚州)。将所获得的部分序列与非冗余核苷酸数据库中的已知序列比对(www.ncbi.nlm.nih.gov)。利用Softberry(http://linuxl.softberry.com/cgi-bin/programs/gfindb/bprom.pl)、Prom-Scan(http://molbiol-tools.ca/promscan/)和PDBG在线http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)；以及Arnold(http://rna.igmors.u-psud.fr/toolbox/amold/index.php#Results)生物信息学工具来识别潜在的转录启动子区域和端子。
phaC2超表达菌株PpU10-33的设计和构造
PpU10-33是恶臭固氮菌U衍生的，其中用T7聚合酶启动子：T7聚合酶系统来驱动phaC2基因表达的额外拷贝。T7聚合酶系统由两个染色体整合的盒组成：一个含有从T7聚合酶启动子表达的phaC2基因，另一个含有T7聚合酶基因，该基因从Pm启动子表达且受来源于TOL质粒的同源苯甲酸酯/苯甲酸酯可诱导的XylS调节因子调节。phaC2盒构造如下：将P.putita U的phaC2基因从pBBRlMCS-3-phaC2质粒中切除(Arias等人，2008)，克隆进pUC18NotI/T7载体(Herrero等人，1993)，并通过测序确认基因的正确取向。然后将phaC2基因和T7启动子作为盒转移进入pUTminiTn5-Tel载体中(Sanchez-Romero等人，1998)。首先，通过滤膜接合法将miniTn5衍生物pCNB 1xylS/Pm::T7pol转移至P.putida U，然后通过Km选择标记物进行选择(Harayama等人1989；Herrero等人，1993)。由于转座子在基因组中的整合基本上是随机的，并且不同插入位点可显著地影响被插入的基因的转录水平，所以准备了约100个转移结合子的池用于第二次转移。将该池的5mL LB培养物孵育3小时(30℃，180rpm)，并使用受体的池用于pUTmini-Tn5-Tel-T7phaC2构造的转移。通过当转移结合子转化亚碲酸盐(选择标记物)时其显示的黑色容易地对转移结合子计分，随后通过PCR确认。随后针对PhaC2和PHA(结果)的水平对两个盒的插入位点不同的最终受体计分，选择最好的并将其指定为PpU 10-33。
PpU 10-33中phaZ的敲除与互补
通过利用1983年Quant&Hynes和1991年Donnenberg&Kaper描述的方法完成phaZ基因的删除，其涉及双重组事件和通过致死sacB基因的表达来选择所需要的突变体。首先，通过GENERT AG(德国)合成在phaZ基因附近含有ORFs的DNA，其编码PHaC1和PhaC2合成酶；随后将该基因克隆进含有Gm和SacB选择标记物的pJQ200SK载体。然后将杂交质粒通过三亲本杂交引入PpU10-33菌株。在含有Gm+km和Tel的板上选择其中质粒通过单交换整合进入染色体中的转移结合子，并通过PCR确认。随后在有10％蔗糖的LB板上选择来源于第二次重组的删除突变体，对针对Gm的敏感度计分，并通过PCR进一步分析以确认删除的位置和程度。为此，使用了在用于同源重组的片段之外或之内退火的两个不同启动子组，名称分别为PhaCl-check-F/PhaC2-check-R和RT-phaZ F_PpU/RT-phaZ R_PpU。选择了一个删除突变体并指定为ΔphaZ PpU10-33。为了删除突变体的互补，通过PCR(phaZ-F-KpnI lphaZ-R-XbaI)将phaZ基因(921bp)扩增，然后克隆进入pBBRlMCS-5载体中。针对其Gm抗性选择转移结合子并进一步通过PCR确认。
荧光显微镜法
在1.5ml微量离心管中将1毫升培养物与2滴尼罗红二甲亚砜(0.25mg/ml)溶液混合，于4℃以6500转每分钟离心5分钟。用2ml MgCl2(10mM)洗沉淀物两次，重悬于500μl溶液中，将5-10μl细胞悬浮液放置在显微镜载玻片上。利用装备有Cy3滤镜(EX BP 550/25,BS FT 570,EM BP 605/70)(ZEISS,Jena,德国)和AxloVision rel 4.6.3软件的ZEISS Axio Imager Al落射荧光显微镜可以看到PHA颗粒的存在和形貌。以1.1秒的曝光时间使细胞成像(Bassas等人，2009)。
透射电子显微镜法
在4℃下，在生长培养基中用2％戊二醛和5％甲醛固定细菌，用二甲砷酸盐缓冲液(0.1M二甲砷酸盐，0.01M CaCl2，0.01M MgCl2，0.09M蔗糖，pH6.9)冲洗，在室温下用1％锇水溶液锇化1小时。然后将样品在分级系列丙酮(10％、30％、50％、70％、90％、和100％)中脱水，每个步骤30分钟。70％丙酮脱水步骤包括2％醋酸双氧铀，并且执行过夜。利用根据用于固体树脂的Spurr配方的环氧树脂浸润样品，所述环氧树脂为一种用于电镜的低粘度环氧树脂包埋介质(Spurr,1969)。用纯树脂的浸润进行数天。用金刚石刀切成超薄切片，用醋酸双氧铀和柠檬酸铅复染，在TEM910透射电子显微镜(Carl Zeiss，德国)中以80kV加速电压检查。利用线复制品以带刻度的放大倍率拍摄图像，并用具有ITEM-软件(Olympus Soft Imaging Solutions,德国)的慢速扫描CCD-Camera(ProScan,1024x1024,Scheuring,德国)数字化地记录。
RNA操控
从生长阶段过程中(4h、7h、24h、27h、31h、48h和55h)的培养物中取样品(3ml)并立即与等体积的RNA保护缓冲液(Qiagen，德国)混合。室温下孵育5分钟后，将悬浮液以13000转每分钟离心，弃去上清液，将沉淀物在-80℃保存。利用包括脱氧核糖核酸酶处理的RNeasy迷你试剂盒(Qiagen,德国)按照制造商的使用说明提取总RNA。最后，在100μl不含核糖核酸酶的水中洗脱RNA并保存在-80℃。RNA的完整度通过甲醛琼脂糖凝胶电泳评估，浓度和纯度通过分光光度计确定(分光光度计ND-100,peQIab-biotechnologieGmbH,德国)。
cDNA利用10μg总RNA和随机引物在20μl反应体系中进行。所有试剂(包括Superscript III RT)购自Invitrogen(USA)且反应根据制造商的方案进行。将其中未添加Superscript III RT的样品用作阴性对照。在cDNA合成后，用1M NaOH将残留的RNA沉淀，以65℃孵育10分钟，随后在25℃孵育10分钟。立即用KCl 1M平衡反应。然后利用PCR纯化试剂盒(Qiagen)将产生的cDNA纯化，用分光光度计测量浓度和纯度。用DEPC水将cDNA稀释至100ng/μl并在4℃保存。
相对RT-PCR分析
借助于引物3(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/)和Oligo Calc(http://www.basic.northwestem.edu/biotools/oligocalc.html)生物信息工具设计用于RT-PCR分析(Eurofins mgw Operon,德国)的寡核苷酸，该寡核苷酸汇总于附录2。各个组设计成具有相似的G+C含量，因此具有相似的退火温度(约60℃)，并具有大小不长于300bp的扩增子，不存在预测的发夹环、双链体或引物-去引物(dimmer)结构。按照用于实验设计的MIQE指南(Bustin等人，2009)。首先，分析各组引物的最佳PCR条件，利用标准组样品(染色体DNA)作为模板确定退火温度和引物浓度。通过熔点曲线分析和扩增条带的凝胶可视化确定引物特异性。用cDNA池确定引物有效性并在五个点上进行连续的4倍稀释序列以执行标准曲线。执行标准PCR方案，对每次稀释执行三次。在所有情况下，所测量的有效性在89％至100％之间。对于该分析，使用了CFX96TM实时PCR检测系统(Bio-Rad，美国)和CFX管理软件(版本1.5.534.0511,Bio-Rad)。鉴于良好的变异系数值和约0.5-1的M值，利用存在于CFS软件中的geNorm法并且考虑到在不同实验条件之间和时间点之间的目标稳定性来选择用于数据归一化的适宜参考基因。测试了数个候选基因，包括“管家”基因(rpsL)、在一般代谢中涉及的其他基因(gltA、gap-1、proCl、proC2)、细胞分裂(mreB、ftsZ)或信号功能(ffH)，最后选择gltA和proC2作为参考基因。对于相对RT-PCR，为了数据归一化，执行实验的三个重复，包括总是在各个板中的内部校准器。将没有cDNA的样品用作阴性对照。PCR反应含有12.5μl的iQTMSYBR Green Supermix(2×)(Bio-Rad，美国)、1μl正向引物(10μΜ)、1μl逆向引物(10μΜ)、2μl cDNA(1/10稀释)，并用至多20μl的milliQ水进行反应。PCR循环条件为：50℃/2分钟和95℃/10分钟，随后95℃/15秒-60℃/30秒-72℃/30秒，40个循环，最后补充72℃/10分钟。在各个循环结束时测量荧光。对于熔点曲线，设定初始变性步骤在95℃/10分钟，随后以0.5℃/5秒从65℃增加到95℃，然后继续信号采集。用采用均数的标准偏差和归一化表达方法(ΔΔ(Ct))的CFX软件(Bio-Road，美国)计算目标基因的相对表达比例。以表达的归一化倍数增长来表示数值。
用于PHA产生的培养条件
将3-苯甲酸甲酯(3-MB)作为用于通过Pm启动子激活XylS转录激活因子的诱导物，所述Pm启动子驱动T7聚合酶基因，其进而触发phaC2合成酶的表达。为了确定用于PpU 10-33中phaC2表达/PHA合成的最佳条件，在不同条件下提高3-MB(从0.2至3mM)、诱导次数(OD550nm 0.4-1.5)和碳源浓度。用在具有20mM琥珀酸盐的MM琼脂板上30℃下培养过夜的细胞悬浮液接种于含有400ml MM修改培养基(Martinez-Bianco等人，1990)加上0.1％酵母提取物、15mM辛酸钠以及合适的抗生素的锥形瓶。然后将锥形瓶以180转每分钟在旋转振荡器(INFORS AG,瑞士)于30℃下孵育。一旦培养物OD550nm达到约0.8，将培养物分成两份(1升锥形瓶中含有200ml)，然后向锥形瓶中的一个添加3-MB至最终浓度0.5mM。同时，第二次加入辛酸钠(20mM)。对于野生型对照菌株，程序是相同的但是没有诱导。每24小时收集一次样品并测定生物量(CDW，细胞干重)、PHA、OD550nm、尼罗红染色和NH4 +浓度。对于CDW测定，样品在80℃干燥24小时，并以原始培养物的g/l表示。
PHA提取和纯化
将培养样品于4℃以6500xg离心15分钟(Allegra 25R,Beckman Coulter,美国)，在蒸馏水中清洗沉淀物两次，然后在-59℃和0.140mbar下冻干(Lyophilizer alpha 1-4 LSC,Christ,德国)。从生长期取5ml样品以监测PHA产生并按如上所述冻干。如前所述的，用10ml氯仿于80℃提取经冻干的生物量3小时(Basas-Galia等人，2012)。PHA含量(重量％)被定义为由PHA表示的CDW百分比。
NMR分析
对于1H-NMR分析，将5-10mg聚合物溶解于0.7ml的CDCl3，使用5-10mg的聚合物用于记录13C谱。在300K下在Bruker DPX-300NMR波谱仪上记录1H谱和13C谱，所述波谱仪锁定于溶剂CDCl3的氘共振。以相对于溶剂信号的ppm给出化学位移(1H：7.26，13C 77.3)，以Hz给出耦合常数。全部使用标准Bruker脉冲程序。
检测PHA的分子量
在具有色谱柱Styragel HR5E并装备有2414示差检测器(Waters，美国)的HPLC系统中(Waters 2695Alliance separations Module)，通过凝胶渗透色谱法测定平均分子量。在45℃，以流速0.5ml/分钟(等度的)，用四氢呋喃(THF)作为洗脱剂。样品浓度和进样体积分别为0.5mg/ml和50μl。利用聚苯乙烯标准物试剂盒获得分子量范围在10000-700000g/mol的标准曲线。
PHA的热性能
利用10-20mg用于分析的经纯化的聚合物，通过差示扫描量热法(DSC)测定微生物聚酯的热性能，用DSC-30(Mettler Toledo Instruments，美国)执行DSC分析。将样品放置在铝盘上，在氮气条件下(80ml/分钟)以10℃/分钟从-100℃加热至400℃。所有数据是通过STARe系统采集和处理软件(MettlerToledo)获得。
实施例1：恶臭假单胞菌U中phaC2的超表达
设计了两部分的用于PpU PhaC2合成酶的基于微型转座子的超表达系统，其由以下两部分构成：(i)特殊化的mini-Tn5，pCNB1xylS/Pm::T7pol，其由XylS-3-苯甲酸甲酯(3-MB)-调节的启动子Pm表达T7聚合酶；和(ii)杂交pUT-miniTn5-Tel衍生物，其由T7聚合酶启动子表达phaC2(见图3)。两个微型转座子组件单独并随机地插入P.putida U(下文中为“PpU”)染色体中。在两轮筛选后选出最佳的PHA生产者，所述两轮筛选涉及通过细胞蛋白的SDS-PAGE分离来半定量PhaC2生产，和通过尼罗红染色的细胞的荧光显微镜法检查PHA颗粒形成。该菌株被指定为PpU10-33。
在下文中，将非诱导培养物称作NI，将用0.5mM的3-MB诱导的细胞成为I。分析phaC2基因的剂量对重组菌株PpU10-33中PHA浓度的影响。培养物分别在具有辛酸钠的修改的MM中生长，所述辛酸钠以15mM和20mM分两次给予(第二次是在诱导时给予)。对于两个菌株PpU和PpU10-33均在48小时后达到峰值生物量生产(分别为3.1和3.2g 1-1CDW)。结果示于表1中：
表1：菌株PpU、PpU10-33和PpU10-33-ΔphaZ的生物量产率
与野生型和非诱导细胞(24.4％和34.6％)相比，暴露于3-MB的细胞在培养的第一个24小时期间能够累积更高的PHA量(44％)。结果示于以下表2和图4中：
表2：未诱导的(NI)和经诱导的(I)PpU10-33-ΔphaZ、PpU和PpU10-33的PHA产率
培养物在具有35mM辛酸钠(以15mM和20mM分两次给予)的修改MM中生长，并用0.5mM的3-MB以0.8的OD550nm诱导(I)或不诱导(NI)。
在24小时时，超表达菌株中的PHA水平比亲本菌株中的PHA水平高约50％，但在48小时时比亲本菌株中的PHA水平低约25％，在72小时时二者相似，这表明PhaC2的增加导致PHA的短暂增加，这进而驱使解聚化活性增加直至水平正常化。重要地，在PpU的情况下，细胞干重的PHA百分比(重量％)在48小时后突然从35重量％降至7重量％，在经诱导的PpU 10-33培养物的情况下，从39％降至15％。
没有对在24小时时在PHA累积方面PpU10-33的非诱导型培养物还显示高于野生型菌株的50％增加的原因作进一步研究，但假设为反应了T7启动子的渗漏(也通过RT-PCR结果表明)。用两个菌株培养48小时时，在PpU的情况下获得3.07g/l的最高生物量水平、在PpU10-33的情况下获得2.67g/l(未诱导型，NI)和2.73g/l(诱导型，I)的最高生物量水平(图1A，表1)，和获得分别为1.08g/l、0.74g/l以及1.07g/l的PHA累积(图4，表2)。在48小时后，生物量和PHA水平下降，PHA水平比生物量水平更显著地减少或降低。在几乎所有取样时间，PpU10-33菌株给出以生物量百分比表示的更高的PHA产率。与PpU中产率24重量％和在未诱导的PpU10-33细胞中的产率35重量％相比(表2)，在该实验中测得的最高PHA产率44重量％是在24小时时PpU10-33诱导细胞中获得的。在48小时时，与PpU中35重量％和PpU10-33培养物中40重量％相比，PHA的最高绝对产率，41％的细胞干重(CDW)是在未诱导10-33细胞中获得的。因此，诱导的影响主要在相对初期的培养物中看到。重要地，在PpU的情况下，PHA的百分比(重量％)在48小时后突然降至7重量％，在PpU 10-33的情况下降至15％-22％。
实施例2：ΔphaZ突变对PHA产生的影响
建立PpU10-33菌株的phaZ删除突变，其被指定为PpU10-33-ΔphaZ，随后对其PHA累积进行评估。如在图4中和表2中可以看到，突变体的培养物显示更高的PHA水平(62重量％)，且与产生PhaZ的菌株相比，这些水平被维持直到至少96个小时的培养。因此，ΔphaZ敲除的表现型表明PhaZ解聚酶是细胞中PHA累积和维持的主要决定子。
参考实施例：ΔphaZ-PpU10-33突变体的互补
为了使phaZ基因与所观察的表现型有因果关系，以及为了排除对pha群表达的任何间接影响，将phaZ基因PCR扩增，克隆进pBB1MCS-5质粒载体中，然后引入PpU 10-33-ΔphaZ菌株。然后评估被在互补的突变体PpU10-33-ΔphaZ pMC-phaZ中的PHA产生和维持，该突变体被指定为菌株pMC-phaZ。表3示出了PpU10-33菌株、其phaZ删除突变体及互补衍生物在具有辛酸钠(20mM)的修改MM中生长44小时后的生物量和PHA产率。
表3：对PHA累积产率的影响。缺陷的互补和PhaZ构造
三种菌株的生物量产率相似，为约2g/l，而PpU10-33菌株的PHA产率为21重量％，其突变体为41重量％，互补菌株为5重量％。据推测，在互补菌株中低于野生型PHA水平反映出较高的细胞解聚酶水平，所述较高的细胞解聚酶水平来源于位于多拷贝载体上的互补基因。
聚合物特征
因为PhaC2聚合酶的超表达和PhaZ解聚酶的失活可能带来正常细胞化学计量和PHA蛋白及相关蛋白质的活性中的变化，其他表现型的变化可能来源于这些基因操纵。为了分析这个可能性，通过透射电子显微镜(TEM)比较不同构造的细胞中PHA颗粒的超微结构。图1示出了PpU野生型菌株(图1A-C)每个细胞含有一个或两个限定的PHA颗粒，其均匀地分布在细胞质内，而PpU10-33phaC2超表达菌株(图1D-F)倾向于含有一个主要的颗粒，其形貌提示为较小颗粒的聚结。在经诱导的培养物中这特别地明显，尤其在中间对数生长期期间。phaZ删除突变体倾向于具有多个颗粒，其中一些颗粒具有提示颗粒融合的不规则边界(图1G-I)。显微镜分析还确认了图4中示出的结果，即在PpU和PpU10-33菌株中累积的细胞内PHA在培养48小时后开始减少，而缺少解聚酶的突变体维持累积的PHA直至实验终点。
假设PpU的两个PHA合成酶具有略微不同的底物特异性：PhaC2显示偏好3-羟基乙酰基-CoA而PhaC1偏向于3-羟基辛酰基-CoA(Arias等人，2008)，可能的是PpU10-33中PhaC2聚合酶的超表达会改变单体组成和/或所生产聚合物的物理化学性质。表4示出了由PpU、PpU10-33及其phaZ删除突变体在辛酸钠上生长期间所生产的PHA具有相似的组成，如通过NMR确定的，为P(3-羟基辛酸酯-co-3-羟基己酸酯)的共聚物，所述P由3-羟基辛酸酯(91.4-92.5％)和3-羟基己酸酯(7.5-8.6％)组成。
表4：来自不同菌株的PHA的物理化学性质
聚合物是从由修改MM辛酸盐35mM(以15mM和20mM分两次给予)中培养的PpU、PpU10-33以及PpU10-33-ΔphaZ未诱导的(NI)和经诱导的(I)细胞获得的。
a数量平均分子量；b重量平均分子量；
c多分散系数(Mw/Mn)；d熔融温度；e熔化焓；
f分解温度；3-HHx＝3-羟基己酸酯；3-HO＝3-羟基辛酸酯
另外，三种聚合物的玻璃转化温度，Tg-35.9℃至-40.8℃(表4)，与之前对中链长度(mcl)-PHA所描述的Tg一致，且它们具有相似的熔化温度(Tm，59-61℃)，这表明相似的结晶度等级。
然而，长度不同的聚合物：来自PpU亲本菌株和PpU10-33(PhaC2聚合酶超表达构造)的聚合物的分子量(Mw和Mn值)是相似的，分别为126-142kDa和74-77kDa，而来自PhaZ敲除的菌株的分子量更低的多，分别为96kDa和50kDa。
PpU、PpU10-33和PpU10-33-ΔphaZ中，通过相对RT-PCR的pha操纵子的转录分析
为了研究PHA转化和phaC2超表达及phaZ失活之间的关系，在三种菌株中，通过pha簇的相对RT-PCR(图2)进行转录分析。用于RT-PCR数据归一化的参考基因为gltA和proC2。
在野生型中，培养的第一个24小时期间，两种PHA聚合酶PhaC1和PhaC2在转录水平上没有检测到大的变化(P＞0.1)，且伴随着PHA累积的稳定增加。但是在4小时时，测量到phaZ转录的两倍增加(P＜0.001)，这对应于开始PHA产生，然后该转录回落至较低水平。在48小时时，与PHA累积的最大水平相关地，观察到phaC1转录的快速和实质性的增加(4.5倍，P＜0.0001)，以及并行地phaZ转录活性的六倍增加(P＜0.001)。随后为PHA含量(图2)、和phaC1和phaZ转录水平的快速降低。这些结果表明：一方面，phaC1转录和PHA累积的微调偶联，另一方面，phaZ转录和PHA转移的微调偶联。
在PpU10-33菌株的情况下，如所预期的，发现phaC2基因的表达在培养期间整个过程中高于PpU亲本菌株中的表达(P＜0.008)，尤其在其峰值48小时时如此(3.5倍，P＜0.0001)。令人关注地，该菌株中phaC1的表达通常低于PpU中的表达，尤其在7小时、24小时和48小时时经诱导的菌株中，这表明phaC2的超表达负面地影响phaC1的表达(图2)。但是，尽管phaC2的超表达导致phaC1降低表达，但是联合的细胞合成酶活性还是导致增加的PHA产生。PpU10-33中phaZ的转录水平趋向于与亲本菌株中的转录水平相似，除了在24小时时之外，其为更高，这与phaC2的更高表达相关，且在大于48小时的培养物中其也是更高的，这与更高水平的PhaC2和PHA一致。因此，PhaC2聚合酶和解聚酶合成也有强的偶联。
在PpU10-33-D phaZ菌株中，当与野生型相比时，培养期间全过程中观察到显著地更高的phaC2转录水平(P 0.0005-0.017)，这与所获得的更高的PHA产率一致(60重量％至66重量％，见图4)。在phaC1的情况下，在24小时和38小时时也测量到更高的水平，但仅在phaC2是经诱导的时候时如此(P＜0.0017)。
因此，phaZ的失活不仅防止已合成的PHA的转化和回收，还允许更高的PHA聚合酶的转录水平。
用于从PpU菌株回收PHA的溶剂提取方法
在不同溶剂系统中研究用于经修饰的PpU菌株中产生PHA的提取条件，所述溶剂系统选自氯仿、二氯甲烷和丙酮。提取在两个不同的温度下进行，即室温(RT)和80℃，并使用三次提取(30分钟、1小时、3小时和18小时)。在本实验中所使用的冻干细胞是按照对于P.putida U及其衍生物的标准培养条件获得的：在含有200ml培养基并用辛酸(10+20mM)作为底物的1L玻璃瓶中，以温度30℃，转速200转每分钟，将三种菌株在MM+0.1YE中培养72小时。突变体菌株(PpU10-33和PpU10-33-ΔphaZ)不是经诱导的。将40mg冻干的生物量样品放置在提取管中，重悬于相应溶剂并在上述不同条件下提取。PHA回收百分比是参考起始的40mg冻干生物量而言的(表5)。将典型的用氯仿提取(3小时80℃)作为对照。
表5 使用不同溶剂、提取时间和温度的PHA回收(重量％)
结果是三次重复的均数±标准偏差。CH2Cl2:二氯甲烷CHCl3:氯仿
在PpU10-33-ΔphaZ中，没有观察到条件之间的显著区别，PHA回收百分比范围为56重量％至59重量％。然而，在PpU(野生型)和单一体变体中，当使用丙酮作为溶剂时，PHA回收百分比为21重量％至28重量％，而对于其他溶剂，回收百分比为约31重量％至34重量％。
为了评价菌株之间是否存在区别，假设对于对照条件(氯仿，3小时80℃)PHA回收为最大值(100％)，计算PHA回收相对百分比。在氯仿作为提取溶剂的情况下，在任何菌株中都没有观察到显著区别。但是，在ΔphaZ突变体中PHA回收相对百分比略微较高(96-98相对％)，而对于野生型和单突变体回收为约91-93相对％。
当用二氯甲烷作为溶剂时观察到相似的行为。ΔphaZ突变体显示PHA回收相对百分比为96-100相对％，而两外两个菌株显示PHA回收值为93-96相对％。
当用丙酮作为溶剂时，可以观察最显著的区别。在所测试的试剂之间，丙酮是最环境友好的一个，但同时也可能是具有最低提取能力的溶剂。后一方面可能是阐明双突变体(PpU10-33-ΔphaZ)和两外两个菌株(PpU和PpU10-33)之间PHA回收百分比的区别的关键。
ΔphaZ突变体为显示最高回收产率为97-98相对％的突变体。出乎意料地，在提取3小时或18小时后，没有观察到区别，这表明3小时的提取已经足够。相比之下，在另外两个菌株(PpU和PpU10-33)中，提取3小时后，PHA回收相对百分比分别急剧地下降为64相对％和74相对％。对于野生型和单突变体，在提取18小时后，这些百分比在一定程度上分别增加到至多76相对％和78相对％。
值得注意的是，用丙酮作为溶剂并短时间提取(30分钟)所获得的结果显示相对PHA回收百分比的最高差别，即对于野生型(PpU)和单突变体(PpU10-33)为50-55相对％，在双突变体(PpU 10-33-ΔphaZ)中为86相对％。因此，丙酮是其中菌株显示最为明显的差别的溶剂，其中双突变体(PpU10-33-ΔphaZ)为表现出最高的相对PHA回收产率的菌株。
因此，对于菌株PpU10-33-ΔphaZ，丙酮表示取代PHA回收工艺中的氯仿的同样好的且环境友好的替代溶剂。此外，结果表明，效果很大程度上受细胞形貌即PHA颗粒聚结促进。
PpU10-33-ΔphaZ的底物依赖性PHA产生的优化
工程菌株最初在三种不同培养基(E2，MM+0.1％YE和C-Y(2N))中培养，测试了八种不同的底物(己酸盐(C6)、庚酸盐(C7)、辛酸盐(C8)、癸酸盐(C10)、10-十一碳烯酸盐(C11:1)、油酸、亚油酸和甘油)。培养基具有以下组成：
1.Vogel&Borner(1956,J,Biol.Chem.218:97-106)所描述的E2培养基。
2.Martinez-Blanko等人(1990,J,Biol.Chem,265；7084-7090)所描述的MM培养基+0.1％酵母提取物。
3.Choi等人(1994,Appl,Environ,Microbiol.60:3245-3254)所描述的C-Y培养基，其具有常规或两倍(C-Y(2N))的氮源浓度(0.66和1.32g/l(NH4)2SO4)。
在MM+0.1％YE和C-Y(2N)培养基中获得了最佳结果，因此，在这两种培养基中使用八种底物和使用P.putida U野生型(PpU)作为对照进行动态生产研究。在所有菌株/培养基/底物组合物中每24小时进行取样以测定生物量和PHA生产。在表6中编辑了所测试的不同培养条件中关于PHA生产的最好的生产率以及收获时间。
表6 用P.putida U(PpU)和工程菌种PpU 10-33-ΔphaZ在两种不同培养基MM+0.1％YE和C-Y(2N)中培养所获得的生物量和PHA生产产率
C6：己酸盐；C7：庚酸盐；C8：辛酸盐；C10：癸酸盐；C11：1：10-十一碳烯酸盐
在所测的多数底物中，工程菌中PHA产生比野生型的高，其获得6％至300％的增量。当在以己酸盐或10-十一碳烯酸盐为碳源的两个培养基中培养时，PpU-10-33-ΔphaZ显示差的聚合物产生。相比之下，当PpU-10-33-ΔphaZ在利用十一碳烯酸盐作为底物的C-Y(2N)中生长时，观察到PHA产生的显著增加，且PHA产率比用相同碳源在MM+0.1％YE中所获得的PHA产率大。当在C-Y(2N)中培养时，双突变体在24小时内能够累积达2.48g/L(53.0重量％)的PHA，而在MM+0.1％YE中其用了72小时来生产1.21g/L(48.6重量％)的PHA。相比之下，当PpU-10-33ΔphaZ用辛酸盐培养时，获得相似的生产水平，其在两个培养基中均达到1.82-1.86g/L(55.0-56.0重量％)的PHA产生。
总之，在甘油、油酸和亚油酸中PHA峰值生产需要更长的培养时间。在甘油的情况下，突变体的PHA累积比野生型高(分别为21-23重量％，8-15重量％)。用油酸和(部分地)亚油酸观察到相似的模式，尽管二者允许更高的PHA累积百分比(35-42重量％)，即使对于野生型(8-15重量％)有显著增加，PHA生产与其他所测底物相比也更低。
当在MM+0.1％YE/辛酸盐、MM+0.1％YE/油酸和C-Y(2N)/癸酸盐中培养时，菌株PpU-10-33ΔphaZ显示最高的PHA产率。为了提高PHA生产，这三种培养基/底物组合物中的任何一个是按比例放大至小规模(5L)台式生物反应器的好的候选。
不存在抗生素压力下PHA产生的研究
为了促进按比例放大工艺和减少发酵成本，研究了在抗生素压力下突变菌株的维持。工程菌种通常在利福平(Rf)、卡那霉素(Km)和亚碲酸盐(Tell)下保存。亚碲酸盐(Tell)的存在及其在培养物中的氧化使得液体培养基变暗，这影响生物量测量和回收。因此，在以下研究中从培养物中省略抗生素。将有和没有亚碲酸盐的培养物进行评价其对生产产率的影响。研究显示没有变化可以被检测到。此外，为了研究存在利福平和卡那霉素在生物量和聚合物生产中的影响，在用辛酸盐为底物，分别地对野生型具有和没有利福平(Rf)对于工程菌具有和没有组合物利福平-卡那霉素(Rf+Km)的无机物培养基MM+0.1％YE中，培养野生型和工程菌株。这些研究的结果示于图5中。
在生物量和聚合物生产中没有观察到区别，这意味着抗生素存在与否不影响生产产率。另外，被证实的是工程菌种的基因型不因没有抗生素而改变。两种菌株均如前所述的在没有抗生素下培养。在48小时和72小时时，将各个培养物的稀释液放在没有抗生素的LB板中，于30℃孵育24小时后，挑选50个克隆在具有抗生素的LB板上划线，于30℃孵育24小时以核实各个菌株中耐受模式的维持。孵育后，所有克隆在具有抗生素的板上生长，这表明不存在抗生素不影响耐药表现型，因此，在工程菌株中应当保存了耐受基因型。
所获得的结果表明双突变体PpU-10-33ΔphaZ的培养，没有抗生素(Rf+Km)压力和亚碲酸盐不影响PHA生产。
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附录1:所使用的菌株、突变体和质粒
附录2本研究中用于PT-PCR分析的寡核苷酸列表。编号(1,2)分别指示使用来自P.putida KT2440或P.putida U的DNA是否被用作模板。
附录3：所使用的其他寡核苷酸的列表
引物 序列(5′3′)
M13F GTAAAACGACGGCCAG
M13r AGGAAACAGCTATGAC
PhaC1-check-F GAATCGGTTGTGAAACTCATGCTC
PhaC2-check-R CCTTGCCATGGAAGTGGTAGTACAG
RT－phaZ F_PpU AGCAGTTTGCCCACGACTACC
RT-phaZ R_PpU GGTGGATCTTGTGCAGCCAGT
phaZ-F-KpnI GGGGTACCCCCACTTTTTCACGACAGAGTCGAACG
phaZ-R-XbaI GCTCTAGAGCGCAACACTCCCTCGTCTTACC
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种天然产生PHA的微生物的基因工程形式，其与具有编码聚羟基烷羧酸酯(PHA)合成酶的至少一个基因的野生型微生物相比具有增加的拷贝数，其中所述增加的拷贝数提供所述PHA合成酶的均衡性过量产生，并且其中所述基因工程使所述微生物在24小时后与所述野生型相比以至少1.2倍的量来过量产生中链长度的PHA或长链长度的PHA，其中用于评估所述过量产生的参考条件为含有15mM辛酸钠的经修改的MM培养基，并且所述基因工程形式在编码所述微生物中的PHA降解中涉及的蛋白质的至少一个基因中具有至少一个修饰，其中所述修饰使编码所述PHA降解中涉及的蛋白质的基因完全或部分失活，更优选地使所述基因完全失活，其中形成所述基因工程微生物的基础的所述微生物拥有编码PHA合成酶的基因。
2.权利要求1中所述的基因工程微生物，其中所述基因编码PhaC2合成酶或其同系物。
3.权利要求1或2中所述的基因工程微生物，其中所述PHA合成酶的表达由启动子系统调节，所述启动子系统优选为基于蛋白质的，更优选为T7聚合酶/T7聚合酶启动子系统。
4.权利要求1至3中任一项所述的基因工程微生物，其中所述PHA降解中涉及的蛋白质是PHA解聚酶，优选地是phaZ和其同系物。
5.权利要求1至4中任一项所述的基因工程微生物，其中所述基因修饰在经繁殖和/或培养的所述微生物中被维持，优选地在不存在或存在抗生素的两种情况下被维持。
6.前述权利要求中任一项所述的基因工程微生物，其中所述基因工程使所述微生物在24小时后与野生型相比优选地以至少1.5倍的量、更优选以至少2倍的量来过量产生中链聚羟基烷羧酸酯PHA，其中用于评估所述过量产生的参考条件为含有15mM辛酸钠的经修改的MM培养基。
7.前述权利要求中任一项所述的基因工程微生物，其中所述微生物选自恶臭假单胞菌、绿脓假单胞杆菌、丁香假单胞杆菌、荧光假单胞杆菌、嗜酸假单胞菌、Pseudomonas olevarans、热液海源菌、泊库岛食烷菌、不动杆菌属、新月柄杆菌、真养产碱菌属、肥大产碱杆菌、棕色固氮菌、富养红球菌、青紫色素杆菌或酒色着色菌，优选为恶臭假单胞菌菌株，更优选为恶臭假单胞杆菌U。
8.前述权利要求中任一项所述的基因工程微生物，其中所述微生物能够在没有添加诱导物分子的情况下产生PHA。
9.前述权利要求中任一项所述的基因工程微生物，其中所述微生物能够产生为单个细胞内颗粒形式的PHA。
10.前述权利要求中任一项所述的基因工程微生物，其中所述微生物在暴露于含有辛酸钠的经修改的MM培养基24小时后能够生产最大的PHA含量，并且优选地也能够将在所述最大的PHA含量±20重量％范围内的PHA含量维持至少48小时的时间。
11.一种用于产生PHA的方法，其包括以下步骤：
a.培养权利要求1至10中任一项所述的微生物；和
b.从培养基中回收PHA。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述方法不涉及或不需要添加用以引发所述微生物中的PHA过量产生和/或PHA合成酶过量产生的诱导物分子，和/或不涉及或不需要添加用以防止丢失基因修饰的抗生素。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其中所述PHA是利用具有3至8个碳原子的酮、优选丙酮在60℃或更低的温度下、优选地在20℃至40℃的温度下通过提取来回收的。
14.权利要求1至10中任一项所述的基因工程微生物用于过量产生中链长度PHA和/或长链长度PHA的用途。

Claims (15)

1.一种天然产生PHA的微生物的基因工程形式，其与具有编码聚羟基烷羧酸酯(PHA)合成酶的至少一个基因的野生型微生物相比具有增加的拷贝数，其中所述增加的拷贝数提供所述PHA合成酶的均衡性过量产生，并且其中所述基因工程使所述微生物在24小时后与所述野生型相比以至少1.2倍的量来过量产生中链长度的PHA或长链长度的PHA，其中用于评估所述过量产生的参考条件为含有15mM辛酸钠的经修改的MM培养基。
2.权利要求1中所述的基因工程微生物，其中所述基因编码PhaC2合成酶或其同系物。
3.权利要求1或2中所述的基因工程微生物，其中所述PHA合成酶的表达由启动子系统调节，所述启动子系统优选为基于蛋白质的，更优选为T7聚合酶/T7聚合酶启动子系统。
4.权利要求1至3中任一项所述的基因工程微生物，其还在编码所述微生物中的PHA降解中涉及的蛋白质的至少一个基因中具有至少一个修饰，其中所述修饰使编码所述PHA降解中涉及的蛋白质的基因完全或部分失活，更优选地使所述基因完全失活。
5.权利要求4中所述的基因工程微生物，其中所述PHA降解中涉及的蛋白质是PHA解聚酶，优选地是phaZ和其同系物。
6.权利要求1至5中任一项所述的基因工程微生物，其中所述基因修饰在经繁殖和/或培养的所述微生物中被维持，优选地在不存在或存在抗生素的两种情况下均被维持。
7.前述权利要求中任一项所述的基因工程微生物，其中所述基因工程使所述微生物在24小时后与野生型相比优选地以至少1.5倍的量、更优选以至少2倍的量来过量产生中链聚羟基烷羧酸酯PHA，其中用于评估所述过量产生的参考条件为含有15mM辛酸钠的经修改的MM培养基。
8.前述权利要求中任一项所述的基因工程微生物，其中所述微生物选自恶臭假单胞菌、绿脓假单胞杆菌、丁香假单胞杆菌、荧光假单胞杆菌、嗜酸假单胞菌、Pseudomonas olevarans、热液海源菌、泊库岛食烷菌、不动杆菌属、新月柄杆菌、真养产碱菌属、肥大产碱杆菌、棕色固氮菌、富养红球菌、青紫色素杆菌或酒色着色菌，优选为恶臭假单胞菌菌株，更优选为恶臭假单胞杆菌U。
9.前述权利要求中任一项所述的基因工程微生物，其中所述微生物能够在没有添加诱导物分子的情况下产生PHA。
10.前述权利要求中任一项所述的基因工程微生物，其中所述微生物能够产生为单个细胞内颗粒形式的PHA。
11.前述权利要求中任一项所述的基因工程微生物，其中所述微生物在暴露于含有辛酸钠的经修改的MM培养基24小时后能够生产最大的PHA含量，并且优选地也能够将在所述最大的PHA含量±20重量％范围内的PHA含量维持至少48小时的时间。
12.一种用于产生PHA的方法，其包括以下步骤：
a.培养权利要求1至11中任一项所述的微生物；和
b.从培养基中回收PHA。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述方法不涉及或不需要添加用以引发所述微生物中的PHA过量产生和/或PHA合成酶过量产生的诱导物分子，和/或不涉及或不需要添加用以防止丢失基因修饰的抗生素。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其中所述PHA是利用具有3至8个碳原子的酮、优选丙酮在60℃或更低的温度下、优选地在20℃至40℃的温度下通过提取来回收的。
15.权利要求1至11中任一项所述的基因工程微生物用于过量产生中链长度PHA和/或长链长度PHA的用途。
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