CN102952774A

CN102952774A - 一种工程菌及其在生产中长链3-羟基脂肪酸中的应用

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Publication number: CN102952774A
Application number: CN2012104229010A
Authority: CN
Inventors: 陈国强; 郑美; 曾国栋
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2012-10-30
Filing date: 2012-10-30
Publication date: 2013-03-06
Anticipated expiration: 2032-10-30
Also published as: CN102952774B

Abstract

本发明公开了一种工程菌及其在生产中长链3-羟基脂肪酸中的应用。本发明提供的工程菌，是将出发菌进行如下（a）和（b）的改造得到的重组菌：（a）灭活PHA合成酶基因；（b）导入硫酯酶基因；所述出发菌为产聚羟基脂肪酸酯的细菌。利用本发明提供的工程菌以某一中长链脂肪酸为单一碳源时，发酵液中可得到高产量、高纯度的、与提供脂肪酸碳源的结构高度一致的3-羟基脂肪酸产物。本发明的方法可用于高产量、高纯度的3-羟基脂肪酸的生产，应用前景广阔。

Description

一种工程菌及其在生产中长链3-羟基脂肪酸中的应用

技术领域

本发明涉及属于基因工程和微生物发酵的领域，具体涉及一种工程菌及其在生产中长链3-羟基脂肪酸（3-HA）中的应用。

背景技术

3-羟基脂肪酸（3-HA）是新型生物材料聚羟基脂肪酸酯（PHA）的常见单体。由于其特殊的手性结构，3-羟基脂肪酸在药物、抗生素、维生素、香料及信息素的合成中可做为重要的前体。

根据碳链骨架的长度，3-羟基脂肪酸可分为短链和中长链两类：前者的碳链长度为3-5，后者的碳链长度为6-14。其中中长链3-羟基脂肪酸可作为抗癌药物等重要药物合成的前体。

3-羟基脂肪酸传统的生产方法是化学合成法，还可通过胞外PHA降解法和胞内PHA降解法等获得。由于这些方法工艺复杂、生产投入大、产物纯度不高，难以分离而导致生产成本高。

发明内容

本发明的目的是提供一种工程菌及其在生产中长链3-羟基脂肪酸中的应用。

本发明提供的工程菌，是将出发菌进行如下（a）和（b）的改造得到的重组菌：（a）灭活PHA（聚羟基脂肪酸）合成酶基因；（b）导入硫酯酶基因；所述出发菌为产聚羟基脂肪酸酯的细菌。所述出发菌可为产聚羟基脂肪酸酯均聚物的细菌。

所述PHA合成酶为将3-羟基脂肪酸乙酰辅酶A（3-hydroxyacyl-CoA）合成为聚羟基脂肪酸的酶。

所述出发菌具体可为嗜虫假单胞菌LAC25，它是嗜虫假单胞菌L48的β-氧化代谢被削弱的突变体，其基因组中的fadA基因、fadB基因、PSEEN0664基因、PSEEN4635基因、PSEEN4636基因被敲除。

所述“灭活PHA合成酶基因”是通过灭活PHA合成酶-降解酶操纵子基因实现的。

所述PHA合成酶-降解酶操纵子基因包括phaC1基因、phaC2基因和phaZ基因；所述phaC1基因如序列表的序列1自5’末端第1-1680位核苷酸所示；所述phaZ基因如序列表的序列1自5’末端第1745-2584位核苷酸所示；所述phaC2基因如序列表的序列1自5’末端第2678-4357位核苷酸所示。所述PHA合成酶-降解酶操纵子基因具体如序列表的序列1所示。

所述“灭活PHA合成酶-降解酶操纵子基因”具体可通过同源重组实现。用于所述同源重组的功能DNA片段中包括上游同源片段和下游同源片段。所述功能DNA片段中，在所述上游同源片段和所述下游同源片段之间还可具有筛选标记基因。所述筛选标记基因具体可为Gm^r（硫酸庆大霉素抗性基因）基因。所述功能DNA片段中，所述上游同源片段可如序列表的序列4自5’末端第10至510位核苷酸所示，所述下游同源片段可如序列表的序列4自5’末端第1372至1835位核苷酸所示。所述Gm^r基因具体可如序列表的序列4自5’末端第523-1356位核苷酸所示。所述功能DNA片段具体可如序列表的序列4自5’末端第10至1835位核苷酸所示。所述功能DNA片段具体通过重组质粒导入所述出发菌并与所述出发菌发生所述同源重组。所述重组质粒具体可为将所述功能DNA片段插入pK18mobsacB质粒的多克隆位点得到的重组质粒。

所述硫酯酶可如序列表的序列3所示或序列表的序列6所示。所述硫酯酶基因可如序列表的序列2或序列表的序列5所示。所述硫酯酶基因可通过质粒导入所述出发菌。所述质粒为pSPH09质粒或重组质粒pZGD01。所述重组质粒pZGD01具体为将质粒中大肠杆菌来源的硫酯酶基因（该硫酯酶如序列表的序列3所示，该硫酯酶基因具体如序列表的序列2所示）替换为编码序列表的序列6所示蛋白质的DNA分子（具体为序列表的序列5所示的双链DNA分子）得到的重组质粒。所述重组质粒pZGD01具体为将质粒pSPH09的NdeI和EcoRI酶切位点之间的小片段替换为编码序列表的序列6所示蛋白质的DNA分子（具体为序列表的序列5所示的双链DNA分子）得到的重组质粒。

本发明还保护一种工程菌，是将出发菌进行如下（a）和（b）的改造得到的重组菌：（a）灭活脂肪酸β氧化代谢途径相关基因和PHA合成酶基因；（b）导入硫酯酶基因；所述出发菌为产聚羟基脂肪酸酯的细菌。

所述产聚羟基脂肪酸酯的细菌为能产一种或多种单体碳链长度不少于6的中长链单体羟基脂肪酸酯的菌株，优选为假单胞菌属（Pseudomonas spp）菌株，更加优选为嗜虫假单胞菌（Pseudomonas entomophila），进一步优选为嗜虫假单胞菌L48。

本发明还保护以上任一所述工程菌在生产3-羟基脂肪酸中的应用。所述3-羟基脂肪酸具体可为3-羟基癸酸（3HD）、3-羟基十二酸（3HDD）或3-羟基十四酸（3HTD）。

假单胞菌是生产中长链聚羟基脂肪酸酯的主要菌种。脂肪酸β-氧化代谢循环是其获得聚羟基脂肪酸酯合成前体3-羟基脂肪酸乙酰辅酶A（3-hydroxyacyl-CoA）的重要途径。抑制或敲除产PHA菌中的与β-氧化代谢途经相关基因可以提高PHA中特定单体组分的含量。3-hydroxyacyl–CoA也可作为3HA的合成前体。硫酯酶具有水解3-羟基3-hydroxyacyl–CoA的活性。

利用本发明提供的工程菌以某一中长链脂肪酸为单一碳源时，发酵液中可得到高产量、高纯度的、与提供脂肪酸碳源的结构高度一致的3-羟基脂肪酸产物。本发明的方法可用于高产量、高纯度的3-羟基脂肪酸的生产，应用前景广阔。

附图说明

图1为pK18mobSacB质粒的结构示意图。

图2为pSPH09质粒的结构示意图，tesB基因即大肠杆菌来源的硫酯酶的编码基因。

图3为pZGD01质粒的结构示意图，PTE1基因即酿酒酵母来源的硫酯酶的编码基因，酿酒酵母来源的硫酯酶又称酿酒酵母棕榈酰辅酶A水解酶。

图4为实施例2中以正癸酸为碳源发酵产物气象色谱分离谱图。

图5为实施例2中以正癸酸为碳源发酵产物经质谱鉴定为3-羟基癸酸。

图6为实施例2中以正十二酸为碳源发酵产物气象色谱分离谱图。

图7为实施例2中以正十二酸碳源发酵产物经质谱鉴定为3-羟基十二酸。

图8为实施例2中以正十四酸为碳源发酵产物气象色谱分离谱图。

图9为实施例2中以正十四酸为碳源发酵产物经质谱鉴定为3-羟基十四酸。

具体实施方式

以下实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

以下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。所用酶试剂均购自MBI Fermentas公司，提取质粒所用的试剂盒购自北京博迈德科技发展公司，回收DNA片段所用的试剂盒购自美国omega公司，相应的操作步骤按照产品说明书进行。所有培养基如无特别说明均用去离子水配制，培养基灭菌条件为：115℃加热20分钟。

LB液体培养基（pH7.0-7.2）：5g/L酵母提取物（购自英国OXID公司，产品目录号LP0021），10g/L蛋白胨（购自英国OXID公司，产品目录号LP0042），10g/L NaCl，其余为水。LB固体培养基（pH 7.0-7.2）：5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl，18g/L琼脂，其余为水。4YLB液体培养基（pH7.0-7.2）：12g/L蛋白胨，24g/L酵母提取物，其余为水。实际培养过程中，为维持质粒的稳定性，可向培养基中添加一定浓度的抗生素。

嗜虫假单胞菌LAC25（Pseudomonas entomophila LAC25简称菌株LAC25）,提及Pseudomonas entomophila LAC25的文献：Chung,A.L.,Jin,H.L.,Huang,L.J.,Ye,H.M.,Chen,J.C.,Wu,Q.,Chen,G.Q.,2011.Biosynthesis and characterizationof poly(3-hydroxydodecanoate)by β-oxidation inhibited mutant of Pseudomonasentomophila L48.Biomacromolecules.12,3559-3566；嗜虫假单胞菌LAC25是野生型嗜虫假单胞菌L48的β-氧化代谢被削弱的突变体，其基因组中的fadA基因、fadB基因、PSEEN0664基因、PSEEN4635基因、PSEEN4636基因被敲除，fadA基因编码酮酰辅酶A硫解酶（英文全称为3-ketoacyl-CoA thiolase），fadB基因编码3-羟基酰酯辅酶A脱氢酶（英文全称为3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase），PSEEN 0664基因和PSEEN 4635基因编码乙酰辅酶A乙酰转移酶（英文全称为acetyl-CoAacetyltransferase）；嗜虫假单胞菌LAC25基因组中的PHA合成酶-降解酶操纵子元件（phaC1-phaZ-phaC2)如序列表的序列1所示，包括phaC1基因、phaC2基因和phaZ基因（序列1自5’末端第1-1680位核苷酸为phaC1基因，第1745-2584位核苷酸为phaZ基因，第2678-4357位核苷酸为phaC2基因）。phaC1基因为编码聚羟基脂肪酸合成酶C1（polyhydroxyalkanoate synthase C1）的基因。phaC2基因为编码聚羟基脂肪酸合成酶C2（polyhydroxyalkanoate synthase C2）的基因。phaZ基因为编码聚羟基脂肪酸降解酶（polyhydroxyalkanoate depolymerase）的基因。

pSPH09质粒（物理图谱如图2所示，在EcoRI和NheI酶切位点之间为大肠杆菌来源的硫酯酶基因，该基因如序列表的序列2序列所示，编码序列表的序列3所示的蛋白质）：提及pSPH09质粒的文献：Chung,A.,Liu,Q.,Ouyang,S.P.,Wu,Q.,Chen,G.Q.,2009.Microbial production of 3-hydroxydodecanoic acid by pha operon and fadBAknockout mutant of Pseudomonas putida KT2442 harboring tesB gene.Appl.Microbiol.Biotechnol.83,513-519.。

pK18mobsacB质粒（用于基因敲除的自杀载体，结构示意图见图1）：购自theNational Institute of Genetics,Japan。

Saccharomyces cerevisiae（酿酒酵母）：购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号2.1619。

实施例1、工程菌的构建

一、重组质粒pALgSC（用于敲除嗜虫假单胞菌LAC25中的phaC1-phaZ-phaC2的自杀质粒）的构建

1、合成序列表的序列4所示的双链DNA分子，其中第10至510位核苷酸为上游同源片段（命名为H1片段），第517至1366位核苷酸为硫酸庆大霉素抗性基因（又称Gm^r基因，其中第523-1356位为开放阅读框），第1372至1835位核苷酸为下游同源片段（命名为H2片段）。

2、用限制性内切酶HindIII和NheI双酶切步骤1的双链DNA分子，回收酶切产物。

3、用限制性内切酶HindIII和NheI双酶切pK18mobsacB质粒，回收载体骨架（约5.5kb）。

4、将步骤2的酶切产物和步骤7的载体骨架连接，得到重组质粒pALgSC。根据测序结果，对重组质粒pALgSC进行结构描述如下：在pK18mobsacB质粒的HindIII和NheI酶切位点之间插入了序列表的序列4自5’末端第10至1835位核苷酸所示的双链DNA分子。

二、重组菌LAC31的构建

将重组质粒pALgSC电击转化嗜虫假单胞菌LAC25的感受态细胞，在含有50mg/l的硫酸卡那霉素和20mg/l硫酸庆大霉素的LB培养基平板上筛选阳性菌落，然后将阳性菌落进行PCR鉴定，PCR鉴定为阳性的即为重组菌LAC31。

感受态细胞的制备方法如下：将OD_600nm为0.5-1.0的菌液在冰水中放置15-30min，然后6000rpm、4°C离心5-10min，收集菌体，用15%甘油水溶液洗涤菌体，然后用100倍菌体体积的15%甘油水溶液重悬菌体，-80°C放置。

电击转化方法：电击参数为1.25KV、25uF。

PCR鉴定采用C1ZC2-H1-s和C1ZC2-H2-a组成的引物对，靶序列约为1.8kb。

C1ZC2-H1-s：5’-ATAAAGCTTATCCAGTACAGCCCGATCACC-3’；

C1ZC2-H2-a：5’-ATAGCTAGCTTGGGGTTCTCGAGGTAGTAGGC-3’。

三、硫酯酶过表达质粒的构建

1、以酿酒酵母的基因组为模板，采用PTE1F和PTE1R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

PTE1F:5’-TAACATATGAAAATGAGTGCTTCCAAAATG-3’（下划线标注限制性内切酶NdeI的酶切识别序列）；

PTE1R:5’-ATTGAATTCTTGTCCTCAGAACTTGGCTC-3’（下划线标注限制性内切酶EcoRI的酶切识别序列）。

2、用限制性内切酶NdeI和EcoRI双酶切步骤1的PCR扩增产物，回收酶切产物。

3、用限制性内切酶NdeI和EcoRI双酶切质粒pSPH09，回收约6kb的载体骨架。

4、将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒pZGD01。

根据测序结果，对重组质粒pZGD01进行结构描述如下：将质粒pSPH09的NdeI和EcoRI酶切位点之间的大肠杆菌来源的硫酯酶基因（tesB基因）替换为了序列表的序列5所示的双链DNA分子（酿酒酵母来源的酰基辅酶A硫酯酶基因，简称PTE1基因，编码序列表的序列6所示的蛋白质）。

重组质粒pZGD01的结构示意图见图3，PTE1为酰基辅酶A硫酯酶基因，Kan为硫酸卡那霉素抗性基因，Re promoter表示来自于真氧产碱杆菌（Ralstonia eutropha）的启动子序列，NdeI和EcoRI表示PTE1两端酶切位点。

四、重组工程菌LAC31（pSPH09）和重组工程菌LAC31（pZGD01）的构建

1、重组工程菌LAC31（pSPH09）的构建

将质粒pSPH09电击转化重组菌LAC31感受态细胞，在含有50μg/mL硫酸卡那霉素的LB培养基平板上筛选阳性菌落，然后将阳性菌落进行PCR鉴定，PCR鉴定为阳性的即为重组工程菌LAC31（pSPH09）。

感受态细胞的制备方法同步骤二的1。电击转化方法同步骤二的1。

PCR鉴定采用tesBF和tesBR组成的引物对，靶序列约为1100bp。

texBF：5'-GCCAGTTCCAGGGCAGAT-3'；

tesBR：5'-CAAGGCGATTAAGTTGGGTAA-3'。

2、重组工程菌LAC31（pZGD01）的构建

将质粒pZGD01电击转化重组菌LAC31感受态细胞，在含有50μg/mL硫酸卡那霉素的LB培养基平板上筛选阳性菌落，然后将阳性菌落进行PCR鉴定，PCR鉴定为阳性的即为重组工程菌重组工程菌LAC31（pZGD01）。

PCR鉴定采用PTE1F和PTE1R组成的引物对，靶序列约为1100bp。

实施例2、利用重组工程菌LAC31（pSPH09）生产中长链3-羟基脂肪酸

一、利用重组工程菌LAC31（pSPH09）生产3-羟基癸酸

1、将重组工程菌LAC31（pSPH09）接种至20mL LB培养基（含50μg/mL硫酸卡那霉素），30℃，200rpm培养12小时，获得一级种子液。

2、将步骤1得到的一级种子液以5%的接种量接种至含12g/L正癸酸的4YLB培养基，得到初始体系，初始体系中，重组工程菌LAC31（pSPH09）的浓度为OD600nm=0.45（实际应用中，0.3-0.6均可）。

3、将步骤2得到的初始体系30℃，200rpm培养48小时，得到终止体系。

4、检测终止体系中的菌体细胞干重和发酵上清的3-羟基脂肪酸含量，检测方法为气象色谱法，具体参见文献：Chung,A.,Liu,Q.,Ouyang,S.P.,Wu,Q.,Chen,G.Q.,2009.Microbial production of 3-hydroxydodecanoic acid by pha operon andfadBA knockout mutant of Pseudomonas putida KT2442 harboring tesB gene.Appl.Microbiol.Biotechnol.83,513-519.）。

气象色谱图谱见图4（箭头标注目标峰）。收集箭头标注的目标峰并进行GC-MS分析，结果见图5。

以正癸酸为碳源，重组工程菌LAC31（pSPH09）发酵后，细胞干重为0.96±0.04g/L，发酵上清中的3-羟基脂肪酸（3-HA）浓度为1.38±0.01g/L，且3-HA的组分经GC-MS检测为3-羟基癸酸（3-HD）。证明本发明的方法可用于高纯度的3-HD的发酵生产。

二、利用重组工程菌LAC31（pSPH09）生产3-羟基十二酸

1、同步骤一的1。

2、将步骤1得到的一级种子液以5%的接种量接种至含12g/L正十二酸的4YLB培养基，得到初始体系，初始体系中，重组工程菌LAC31（pSPH09）的浓度为OD600nm=0.45（实际应用中，0.3-0.6均可）。

3、同步骤一的3。

4、同步骤一的4。

气象色谱图谱见图6（箭头标注目标峰）。收集箭头标注的目标峰并进行GC-MS分析，结果见图7。

以正十二酸为碳源，重组工程菌LAC31（pSPH09）发酵后，细胞干重为1.24±0.25g/L，发酵上清中的3-HA浓度为4.41±0.07g/L，且3-HA的组分经GC-MS检测为3-羟基十二酸（3-HDD）。证明本发明的方法可用于高纯度的3-HDD的发酵生产。

三、利用重组工程菌LAC31（pSPH09）生产3-羟基十四酸

1、同步骤一的1。

2、将步骤1得到的一级种子液以5%的接种量接种至含12g/L正十四酸的4YLB培养基，得到初始体系，初始体系中，重组工程菌LAC31（pSPH09）的浓度为OD600nm=0.45（实际应用中，0.3-0.6均可）。

3、同步骤一的3。

4、同步骤一的4。

气象色谱图谱见图8（箭头标注目标峰）。收集箭头标注的目标峰并进行GC-MS分析，结果见图9。

以正十四酸为碳源，重组工程菌LAC31（pSPH09）发酵后，细胞干重为1.51±0.09g/L，发酵上清中的3-HA浓度为6.45±0.68g/L，且3-HA的组分经GC-MS检测为3-羟基十四酸（3-HTD）。证明本发明的方法可用于高纯度的3-HTD的发酵生产。

实施例3、利用重组工程菌LAC31（pZGD01）生产中长链3-羟基脂肪酸

用重组工程菌LAC31（pZGD01）代替重组工程菌LAC31（pSPH09）其它均同实施例2。

以正癸酸为碳源，重组工程菌LAC31（pZGD01）发酵后，细胞干重为1.08±0.01g/L，发酵上清中的3-HA浓度为1.75±0.06g/L，且3-HA的组分经GC-MS检测为3-HD。证明本发明的方法可用于高纯度的3-HD的发酵生产。

以正十二酸为碳源，重组工程菌LAC31（pZGD01）发酵后，细胞干重为0.90±0.09g/L，发酵上清中的3-HA浓度为4.59±0.14g/L，且3-HA的组分经GC-MS检测为3-HDD。证明本发明的方法可用于高纯度的3-HDD的发酵生产。

以正十四酸为碳源，重组工程菌LAC31（pZGD01））发酵后，细胞干重为1.99±0.15g/L，发酵上清中的3-HA浓度为2.65±0.13g/L，且3-HA的组分经GC-MS检测为3-HTD。证明本发明的方法可用于高纯度的3-HTD的发酵生产。

Claims

1.一种工程菌，是将出发菌进行如下（a）和（b）的改造得到的重组菌：

（a）灭活PHA合成酶基因；

（b）导入硫酯酶基因；

所述出发菌为产聚羟基脂肪酸酯的细菌。

2.如权利要求1所述的工程菌，其特征在于：所述出发菌为嗜虫假单胞菌LAC25。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述“灭活PHA合成酶基因”是通过灭活PHA合成酶-降解酶操纵子基因实现的。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述PHA合成酶-降解酶操纵子基因包括phaC1基因、phaC2基因和phaZ基因；所述phaC1基因如序列表的序列1自5’末端第1-1680位核苷酸所示；所述phaZ基因如序列表的序列1自5’末端第1745-2584位核苷酸所示；所述phaC2基因如序列表的序列1自5’末端第2678-4357位核苷酸所示。

5.如权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于：所述硫酯酶为序列表的序列3或序列表的序列6所示。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述硫酯酶基因如序列表的序列2或序列表的序列5所示。

7.一种工程菌，是将出发菌进行如下（a）和（b）的改造得到的重组菌：

（a）灭活脂肪酸β氧化代谢途径相关基因和PHA合成酶基因；

（b）导入硫酯酶基因；

所述出发菌为产聚羟基脂肪酸酯的细菌。

8.如权利要求6所述的工程菌，其特征在于：所述产聚羟基脂肪酸酯的细菌为能产一种或多种单体碳链长度不少于6的中长链单体羟基脂肪酸酯的菌株，优选为假单胞菌属（Pseudomonas spp）菌株，进一步优选为嗜虫假单胞菌（Pseudomonasentomophila）。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述“灭活PHA合成酶基因”是通过灭活PHA合成酶-降解酶操纵子基因实现的。

10.权利要求1至9中任一所述工程菌在生产3-羟基脂肪酸中的应用。