KR101155994B1 - 김에서 유래된 고온내성 단백질 및 그의 유전자 ηｔｒ２ - Google Patents

Abstract

본 발명은 김으로부터 유래된 것으로서, 세균류, 해조류 및 식물체에 고온내성을 부여하는 서열번호1의 단백질 및 이를 암호화하는 유전자 상기 유전자(서열번호2)를 포함하는 재조합벡터 및 상기 재조합벡터에 의한 형질전환체에 관한 것이다.
본 발명에 의하면, 온도가 올라가면 생육이 정지되어 생산량이 급감하는 경향이 있는 김에서 본 발명에 의한 유전자의 발현을 증대시킴으로써 고온내성을 부여하여 김의 생산성을 증대시킬 수 있다.
또한 바이오에너지 생산을 위한 다양한 해조류에 본 발명에 의한 유전자를 적용함으로써 해조류의 바이오메스의 생산을 증대시킬 수 있게 된다.

Description

김에서 유래된 고온내성 단백질 및 그의 유전자 ΗＴＲ２{Protein and its Gene ΗＴＲ２ of laver, giving High-Temperature-Resistance}

본 발명은 김으로부터 분리된 것으로서, 세균류, 해조류 및 식물체에 고온내성을 부여하는 단백질 및 이를 암호화하는 유전자 상기 유전자를 포함하는 재조합벡터 및 상기 재조합벡터에 의한 형질전환체에 관한 것이다.

해양생물은 지구상에 서식하는 생물종의 약 80%를 차지하고 있으며, 해조류는 식품, 비료, 건강식품 등으로 이용될 뿐만 아니라, 유용물질의 생산, 신 물질 탐색 및 biomonitoring 이나 bioremediation 등을 위한 소재로도 활용되는 중요한 생물자원이자 유전자원이다. 특히 김은 미역, 다시마와 함께 우리나라에서 양식 생산되고 있는 대표 해조류이다.

대부분의 유용한 해조류들이 밀물 때는 물에 잠기고 썰물 때는 물 위로 드러나는 조간대(김, 톳, 파래 등)와, 항상 바닷물에 잠겨있지만 그리 깊지 않은 아조대(미역, 청각, 모자반 등)에서 서식하기 때문에 양식도 해안의 조간대나 아조대에서 이루어지고 있다.

특히 조간대에서 양식되는 해조류의 경우, 주기적으로 고온의 직사광선에 노출되므로 많은 개체들이 사멸하거나 생육이 지체되는 현상이 자주 발생된다.

한편, 지구 온난화 현상에 따라 해수의 온도가 점차 증가하는 경향이 있다. 양식장 해수의 온도가 상승하면 해조류의 생산량이 급감하는 문제가 발생한다.

본 발명은 김, 클라미도모나스 등의 조류(algae)에 고온내성을 부여하는 단백질 및 유전자 등을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 해조류 뿐만 아니라 세균류 및 식물체에 고온내성을 부여하는 단백질 및 유전자 등을 제공하는 것을 목적으로 한다.

전술한 목적을 달성하기 위한 본 발명은, 모무늬돌김(Porphyra seriata)으로부터 분리한 것으로서 개체에 고온내성을 부여하는 하기와 같은 서열번호1의 단백질에 관한 것이다.

<서열번호1>

MAASKTLAAAFAVALLALLTLTAAAPAADTAAADAATAAYDALHVEGISGAAEAPALDGLTDRSGYYRCRSYFVCGSKKVKVPVKHSHPCYYKEAPSILKSSRSSGLCRPDPYSCKPATCIGWRKCTCDACKTVIFTHNIWCEK

본 발명에 의한 상기 단백질은 144개의 아미노산으로 구성된 약 15kDa의 단백질(pI, 8.42)이다.

본 발명은 또한, 상기 단백질을 암호화하는 유전자, 바람직하기로는 하기 서열번호2를 포함하는 cDNA에 관한 것이다.

<서열번호2>

ATG GCG GCT TCC AAG ACC CTC GCC GCC GCG TTT GCC GTT GCG CTC CTG GCA CTC CTG ACC CTG ACC GCC GCC GCC CCC GCA GCG GAC ACT GCC GCC GCC GAC GCC GCA ACC GCC GCG TAC GAC GCG CTG CAC GTT GAG GGC ATC TCG GGC GCG GCG GAG GCA CCC GCC CTC GAC GGC CTC ACC GAC CGG TCG GGC TAC TAC CGC TGC CGC TCC TAC TTT GTG TGC GGC AGC AAG AAG GTG AAA GTG CCT GTC AAG CAC TCG CAC CCG TGC TAC TAC AAG GAG GCG CCG TCG ATC CTC AAG TCG TCC CGC AGC AGC GGC CTG TGC CGG CCG GAC CCG TAC AGC TGC AAG CCC GCC ACG TGC ATC GGC TGG CGC AAG TGC ACG TGC GAT GCG TGC AAG ACG GTG ATC TTC ACC CAT AAC ATC TGG TGC GAG AAG TGA

본 발명에서, 상기 단백질 및 유전자는 특성(고온특성)을 유지하는 범위 내에서 적절하게 치환, 결실, 삽입 등과 같은 변형이 가능하며, 이렇게 변형된 단백질 및 유전자도 본 발명의 권리범위에 해당됨은 당업자에게 있어 당연한 것이다.

또한 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 재조합 벡터를 세균류, 해조류 및 식물체로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 숙주에 도입시켜 수득되는 형질전환체에 관한 것이다.

이상과 같이 본 발명에 의한 단백질과 유전자는, 해조류 등에 고온내성을 부여하므로 유용유전자로 활용할 수 있다.

즉, 본 발명에 의하면, 온도가 올라가면 갯병에 걸리거나 생리적 장애를 받아 생산량이 급감하는 경향이 있는 김에서 본 발명에 의한 유전자의 발현을 증대시킴으로써 고온내성을 부여하여 김의 생산성을 증대시킬 수 있다.

또한 바이오에너지 생산을 위한 다양한 해조류에 본 발명에 의한 유전자를 적용함으로써 해조류의 바이오메스의 생산을 증대시킬 수 있게 된다.

도 1은 서열번호1의 단백질 서열과, 서열번호2의 cDNA 및 그 전후의 염기 서열을 보여주는 도표.
도 2는 본 발명에 의한 HTR2 유전자가 고온에서 다량 발현됨을 보여주는 RT-PCR 결과 사진.
도 3은 본 발명에 의한 HTR2 유전자를 함유하는 클라미도모나스용 발현벡터 pCR102_HTR2의 개념도.
도 4는 본 발명에 의한 HTR2 유전자가 클라미도모나스에서도 고온내성을 나타냄을 보여주는 사진.

이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 첨부된 도면은 본 발명의 기술적 사상의 내용과 범위를 쉽게 설명하기 위한 예시일 뿐, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 한정되거나 변경되는 것은 아니다. 또한 이러한 예시에 기초하여 본 발명의 기술적 사상의 범위 안에서 다양한 변형과 변경이 가능함은 당업자에게는 당연할 것이다.

특히, 하기 실시예에서는 본 발명에 의한 유전자를 플라스미드 pCR102에 삽입하여 발현벡터를 제작?사용하였으나, 숙주의 특성에 적합한 다양한 종류의 플라스미드를 활용할 수 있음은 당업자에게 자명하다 할 것이다.

본 발명자들은 다양한 품종의 김 엽상체를 정상 온도의 생육조건과 고온 처리조건에서 자라게 한 뒤, 이들이 생성한 ESTs를 비교하여 통해 고온 조건에서 발현이 증가된 ESTs들을 선별하였다. 이어서 선별된 ESTs 중에서 가장 우수한 고온 내성을 나타내는 유전자를 분리하고, 이를 HTR2(High Temperature Response gene2)라 명명하였다.

고온에 의해 발현이 증가되는 본 발명에 의한 유전자 HTR2는 모무늬돌김(Porphyraseriata seriata) 유래의 것으로서 144개의 아미노산으로 구성된 약 15.2 kDa의 basic protein (pI = 8.4)을 암호화하고 있으며, 지금까지 보고된 유전자와는 유사성이 없는 새로운 유전자로 판단된다.

한편, 본 발명에 의한 HTR2 유전자로 고온 민감성 박테리아와, 모델 조류인 클라미도모나스를 형질전환한 결과, 이들 형질전환체가 고온에 대해 내성을 획득하였음을 확인하였다.

한편, 본 발명에 의한 HTR2 유전자는, 하기 실시예에 예시적으로 제시된 서열번호3, 4의 프라이머를 적용하여 모무늬돌김의 total DNA 또는 RNA를 주형으로 하여 통상의 PCR을 수행함으로써 이용하게 분리할 수 있다. 이에 상기 유전자의 기탁을 생략한다.

이하 실시예를 통해 본 발명을 상세히 설명한다.

실시예 1 : 김으로부터 고온내성 유전자의 분리

(1) 생체 및 시료의 준비

모무늬돌김(Porphyra seriata)은 해조류바이오연구센터로부터 입수하였다.

cDNA library 제작을 위해 김 엽상체를 배지에서 수확한 후 바로 액체질소를 이용하여 동결하였다. 고온처리를 위해 김 엽상체는 25^oC 배양기로 옮긴 후 6 시간 12 시간동안 배양한 후 수확하였다.

(2) RNA의 분리 및 cDNA library 제작

Total RNA는 준비된 시료로부터 TRI REAGENT^TM-RNA ISOLATION REAGENT 을 사용하여 제조회사에서 제시한 방법에 따라 추출하였다.

추출된 RNA는 RNase free DNA를 처리한 후 formaldehyde agarose gel electrophoresis를 통해 확인하였다. mRNA는 추출된 total RNA로부터 Absolute mRNA purification kit (Stratagene)를 사용하여 분리하였으며, ZAP Express cDNA Synthesis Kit" (Stratagene, San Diego, CA)를 사용하여 약 5ug의 mRNA로부터 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA중 약 500bp 이상의 cDNA만을 선별한 후 ZAP expression 벡터에 클로닝하였고, "Gigapack Gold III Packaging Extract" (Stratagene)를 이용하여 packaging하여 cDNA library를 제작하였다. 동일한 방법을 사용하여 정상 배양조건에서 자란 모무늬돌김 엽상체로부터 하나의 cDNA library를 제작하고, 또 성숙한 엽상체를 37℃ 조건에서 각각 6 시간, 12시간 동안 고온 처리한 모무늬돌김 엽상체로부터 cDNA library를 제작하였다.

(3) ESTs 생성 및 고온내성유전자의 분리

제작된 primary lambda phage library를 phagemid로 전환한 후 항생제가 포함된 한천배지에서 배양하였다. ESTs(Expressed Sequence Tags) 생성을 위해서 배지에서 자란 클론을 무작위적으로 선별하여 plasmid DNA를 추출한 후 T3 primer를 이용하여 cDNA의 5'-end로부터 한쪽 방향으로만 염기서열을 결정하였다. 염기서열 결정 후 벡터 sequence를 절단하고 low quality의 sequence 또는 서열의 길이가 100bp 이하인 서열을 제거하였다.

고온 조건에서 발현이 유도되거나 발현이 증가되는 유전자들을 찾기 위해 정상 배양조건의 모무늬돌김 cDNA library와 고온 처리 모무늬돌김 cDNA library로부터 생성된 ESTs를 함께 비교하였다. ESTs 비교를 통해 고온처리 조건에서 10배 이상 발현이 증가된 전사체만을 선별하여 이들 유전자를 high temperature responsive (HTR) gene이라 명명하였다.

선별한 HTR 유전자 중 HTR2는 435개의 염기를 가진 서열번호2와 같으며, 상기 단백질은 144개의 아미노산으로 구성된 약 15kDa의 서열번호1의 단백질(pI, 8.42)임을 확인하였다. 도 1에 서열번호1의 단백질 서열과, 서열번호2의 HTR2 cDNA 및 그 전후의 염기 서열을 도시하였다.

(4) 고온에서의 발현량 증가의 재확인

상기 분리된 HTR2 cDNA가 김의 고온배양시 발현량이 증가되는 것을 다음과 같이 재확인하였다.

모무늬돌김을 정상 배양온도(약 12℃)에서 24시간 이상 배양하다 25℃로 옮겨 배양하면서 소정의 시간간격으로 시료를 채취하고 total RNA를 추출하였다.

추출된 RNA를 주형으로 하여 다음과 같이 RT-PCR을 수행하였다. 추출한 RNA(1㎍)과 oligo(dT) primer 1㎕, 10mM dNTP Mix 1㎕를 넣고 총 부피를 13㎕로 하여 65℃에서 5분, ice에서 1분 처리하였다. 이어서 5ㅧFirst-strand Buffer 4㎕, 0.1mM DTT 1㎕, RNaseOUT^TM Recombinant RNase Inhibitor 1㎕, SuperScript^TMⅢ RT (Invitrogen) 1㎕를 넣고 총 반응부피를 20㎕로 하여 50℃에서 30~60분, 70℃에서 15분 incubation하였다.

RT-PCR을 위한 primer는 도 1에 도시된 서열번호2의 cDNA 및 그 전후의 염기 서열을 참조하여 하기 표 1과 같이 제작하여 사용하였다.

1% agarose gel에 전기 영동한 RT-PCR 결과를 도 2에 도시하였다.

도시된 바와 같이, 김의 고온배양 초기부터 상기 cDNA가 발현량이 서서히 증가하다가 12시간 이후에는 월등히 많이 발현됨을 확인할 수 있었다.

실시예 2 : 클라미도모나스에서의 고온내성 확인

본 발명에 의한 HTR2가 모델 해조류인 클라미도모나스에도 고온내성을 부여하는지를 조사하였다.

모무늬 돌김의 total RNA와, 하기 표 2의 프라이머를 이용하여 HTR2 유전자의 ORF 서열만 PCR 증폭한 후, 이를 통상의 방법에 따라 클라미도모나스 발현벡터인 pCR102의 NcoI과 EcoRV 자리에 삽입하여 HTR2 유전자를 발현을 위한 벡터 pCR102_HTR2 를 제작하였다(도 3 참조).

wild type인 Chlamydomonas reinhardtii cc-125에 통상의 방법[벡터가 hygromycin 내성유전자를 가지므로, glass bead transformation 방법으로 형질전환하여 2~3주 배양한 후 15mg/L hygromycin이 첨가된 배지에서 선발하는 방법]으로 상기 pCR102_HTR2를 도입하여 클라미도모나스 형질전환체를 얻었다.

pCR102_HTR2가 도입된 형질전환체가 10⁵~10³/㎖의 농도로 희석된 접종액 약 5㎕l를 고체배지에 접종하여 37℃의 고온조건에서 5일간 배양한 다음 25℃로 옮겨 배양하면서 7일 및 14일 후의 세포의 생장을 관찰하고 그 사진을 4에 도시하였다. 도면에서, W/T는 상기 wild type 균주를, V-체는 wild type 균주에 pCR102 벡터를 도입한 블랭크 균주를 의미한다. 콘트롤은 고온 처리 없이 계속 25℃에서 배양한 경우를 나타낸다.

도시된 바와 같이, W/T나 V-체의 경우 5일간의 고온처리에 의해 결국 사멸하였으나, 본 발명에 의한 HTR2가 도입된 형질전환 클라미도모나스는 고온처리에 의해 어느 정도 생장이 저해되었다가 정상온도로 옮기면 생장이 회복됨을 알 수 있다.

따라서, 김에서 유래된, 본 발명에 의한 HTR2가 다른 종에 대해서도 고온내성을 부여할 수 있음을 확인하였다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (5)

1. 김으로부터 분리된, 고온내성을 부여하는 서열번호1의 단백질.
   
2. 제1항에 의한 단백질을 암호화하는 유전자 HTR2(High Temperature Response gene2, 고온 내성 유전자2).
   
3. 제 2 항에 있어서,
   서열번호2를 포함하는 cDNA인 것을 특징으로 하는 유전자.
   
4. 제2항 또는 제3항에 의한 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
   
5. 제4항에 의한 재조합 벡터를 세균류, 해조류 및 식물체로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 숙주에 도입시켜 수득되는 것을 특징으로 하는 형질전환체.
   

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