CN103773782A - 棉花二酯酰甘油酰基转移酶基因（GhDGAT2-5）及其在植物育种中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种棉花二酯酰甘油酰基转移酶基因、含有所述基因的表达载体，以及所述基因在制备改良植物品种中的应用；本发明同时还提供了干扰所述基因表达的特异性基因序列，含有所述特异性基因序列的表达载体，以及所述特异性基因序列在制备转基因棉花中的应用。

Description

棉花二酯酰甘油酰基转移酶基因(GhDGAT2-5)及其在植物育种中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，主要涉及一种棉花二酯酰甘油酰基转移酶基因、干扰其表达的植物表达载体以及所述棉花二酯酰甘油酰基转移酶基因在棉花育种中的应用。

背景技术

棉花是世界上最重要的天然纤维作物，也是最重要的经济作物。我国是世界上最大的纺织品生产国和消费国，棉纺织品是我国出口创汇的重要支柱产业，棉花产业在我国的国民经济中具有举足轻重的地位。随着社会经济的发展，我国可耕地面积在逐年减少，粮棉争地矛盾十分突出，棉花生产受到严峻挑战，因此必须改良棉花品种，提高单位产量来应对这种挑战。棉花的产量和品质性状为多基因控制的数量性状。而且，产量与品质性状之间存在遗传上的负相关。棉花栽培品种主要是陆地棉，而优良纤维品质基因主要源于二倍体的瑟伯氏棉（纤维强度）、异常棉（纤维强度与细度）以及四倍体的海岛棉（纤维强度与细度）等。这些优良性状基因的利用，在常规育种中受到诸多限制。如二倍体的瑟伯氏棉与异常棉为野生种，与四倍体陆地棉杂交后，存在远缘杂交带来的农艺性状差、后代难于稳定、周期长、容易引入一些不利基因等问题。即便是同为四倍体的海岛棉与陆地棉杂交，同样存在后代分离大、难于稳定，产量-品质负连锁关系仍难打破等问题（Culp和Harrell，1979）。自1984年我国棉花亩产突破60kg以来，近20年来的平均年产量均在100kg左右。同样，美国棉花的单位面积产量也已进入了停滞不前的平台期，单靠现有的棉花遗传种质资源和常规育种手段已经难以大幅度提高棉花产量（Meredith，2000；Seagull RW等,2004,J Cotton Sci,,8,105-111）。因此，要进一步提高棉花的单位面积产量，改良纤维品质，应该寻找新的育种途径。

棉花纤维是由胚珠外珠被表层细胞经分化突起、伸长和细胞壁增厚而形成的，整个发育过程可分为：纤维原始细胞分化、纤维伸长（初生壁形成）、次生壁形成和纤维脱水成熟四个时期（Zhong,2001）。由于棉纤维是从胚珠表皮直接发育而来，因此，其产量、品质的形成与胚珠发育密切相关。棉花胚珠在开花受精后直接发育为种子，在此发育过程中不仅有胚的形成，而且还有作为主要贮藏物质场所的子叶的形成。棉花子叶中的贮藏物质以蛋白质和脂肪为主，它们的含量呈极显著负相关（王延琴等，2003）。植物种子中储存的脂肪酸常以三酰甘油酯(TAGs)的形式存在，即在甘油骨架上附连三个脂肪酸的形式。而脂肪酸成分主要是16至18碳或含一至三个双键的脂肪酸，如硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸等。脂肪酸代谢主要是在质体和内质网中进行的，首先，合成脂肪酸的碳源主要是蔗糖，在种子中通过糖酵解途径将其转变成己糖，并氧化成乙酰CoA（乙酰辅酶A）。而TAG合成的骨架成分甘油3-磷酸也是通过糖酵解的中间产物合成的。随后，在质体中经乙酰CoA羧化酶（ACC）将乙酰CoA合成为丙二酰单酰CoA。然后脂肪酸合成酶复合物(FAS)以丙二酸单酰CoA为底物进行连续的聚合反应，经过数次循环聚合反应后，脂肪酸的合成可在酰基-ACP硫酯酶或酰基转移酶的作用下终止。而终止聚合后的不同碳链长度的酰基ACP，在酰基CoA合成酶的作用下合成酰基CoA，并从质体转运到内质网或胞质中。最后利用贮存在胞质中的酰基CoA池，在内质网上通过三种不同的酰基转移酶，即甘油3-磷酸酰基转移酶(G3P-AT)、溶磷脂酸酰基转移酶(LPA-AT)和二酰甘油酰基转移酶(DGAT)，分别在甘油上连接脂肪酸以合成三酰甘油酯和结构磷脂（Cahoon等，Curr Opin Plant Biol.2007，10:236-44）。前人的研究（Shockey等，Plant Cell2006,18:2294-2313；Kroon等，Phytochemistry2006,67:1166-1176）发现，在发育的种子中，DGAT催化酰基CoA和二酰甘油酯合成TGA的最后一步，虽然对于多种酰基转移酶之间的相互作用不清楚，但DGAT在油脂的合成中为关键限速步骤，直接影响种子中TAG的含量和成分已经明确。

我们通过抑制陆地棉胚珠发育过程中GhDGAT2-5基因的表达，降低成熟种子的油脂含量，提高了其蛋白质含量，最终达到增加种子重量和纤维产量的目的，从而在农业生产中创造更大的经济效益和社会效益。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种分离自棉花的棉花二酯酰甘油酰基转移酶基因（GhDGAT2-5），具有如SEQ ID NO.1所示的序列。所述棉花二酯酰甘油酰基转移酶基因编码的蛋白质，其具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

本发明还提供了含有所述棉花二酯酰甘油酰基转移酶基因的表达载体。优选地，所述表达载体具有如图2B所示的结构。

本发明的又一个目的是提供一种提高植物种子含油量的方法，包括将所述的二酯酰甘油酰基转移酶基因（GhDGAT2-5）整合进入植物构建转基因植物，并使所述二酯酰甘油酰基转移酶基因在植物种子中表达的步骤。

本发明的另一个目的是提供一种干扰所述棉花二酯酰甘油酰基转移酶基因表达的特异性基因干扰序列，具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。以及含有所述特异性基因干扰序列的干扰表达载体，优选地，所述干扰表达载体具有如图3B所示的结构。

本发明的又一个目的是提供一种转基因棉花的制备方法，包括以下步骤：

（1）构建含有如3B所示结构的干扰表达载体；

（2）将所述干扰表达载体转化宿主，获得转化体；

（3）将所述转化体转化棉花，获得转基因棉花。

本发明的又一个目的是提供一种提高棉花种子蛋白质含量和纤维产量的方法，包括构建干扰SEQ ID NO.1所示序列的二酯酰甘油酰基转移酶基因（GhDGAT2-5）表达的干扰表达载体并转化到棉花宿主中，干扰所述棉花二酯酰甘油酰基转移酶基因表达的步骤。

本发明的又一个目的是提供所述棉花二酯酰甘油酰基转移酶基因或干扰所述棉花二酯酰甘油酰基转移酶基因表达的特异性基因干扰序列基因在改良植物品种中的应用。

具体地，本发明以烟草为例，提高烟草种子含油量的方法是通过在烟草种子中特异表达本发明所述的棉花二酯酰甘油酰基转移酶基因，以增加烟草种子中TAG的量，最终达到提高烟草种子含油量的目的。本发明提高棉花种子蛋白质含量和纤维产量的方法，是通过在棉花中表达一种陆地棉甘油二酯酰酰基转移酶基因的一段特异序列，干扰陆地棉甘油二酯酰酰基转移酶基因的表达，以增加棉花种子中蛋白质含量和种子重量，提高纤维产量目的。试验结果证明，将该基因在烟草中正义表达后，烟草种子的含油量最高可提高7.15%。同时，在陆地棉中表达该基因的特异片段，干扰该基因的表达，转基因棉花种子重量增加的幅度在9.9%到71.82%之间，蛋白质含量的增幅为0.08%～2.42%，纤维的增幅为11.2%～35.4%。本发明方法简便易行，效果显著，不仅能提高棉花种子的蛋白质含量，提高棉籽饼的饲料利用价值，而且，能增加棉花纤维产量产生巨大的经济效益。

附图说明

图1:陆地棉甘油二酯酰酰基转移酶（GhDGAT2-5）的同源性比对。

Mt：苜蓿，Gm：大豆，Jc：麻风树，Vv：葡萄，Ag：花生，Oe：油橄榄，Rc：蓖麻，At：拟南芥，Ha：向日葵，Pt：杨树，Bn：油菜，Zm：玉米，Sb：高粱，Eo：油棕，Os：水稻，Hv：大麦，Gh：棉花

图2：2A是陆地棉甘油二酯酰酰基转移酶基因（GhDGAT2-5）正义表达载体的构建流程图；2B是正义表达载体pCB2012-GhDGAT2-5的结构图。

其中载体主要元件标示，gus::npt：β-葡萄糖酸苷酶与新霉素磷酸转移酶的融合基因；nos：终止子；kanamycin：卡那霉素抗性基因；35S：来源于花椰菜花叶病毒的植物组成性启动子；CaMV35S poly A：35S终止子；35S P：35S组成型启动子；T-Border：T-DNA插入边界。

图3：3A是陆地棉甘油二酯酰酰基转移酶基因干扰表达载体的构建流程图；3B是干扰表达载体p5-35S-GhDGAT2-5RNAi的结构图。

载体主要元件标示，Km：卡那霉素抗性基因；35S：来源于花椰菜花叶病毒的植物组成性启动子；gus::npt：β-葡萄糖酸苷酶与新霉素磷酸转移酶的融合基因；poly A：35S终止子；35S P：35S组成型启动子；LB：T-DNA左边界；RB：T-DNA右边界。

图4是T₀代不同转基因烟草株系中GhDGAT2-5基因的表达量

35S::GhDGAT2-5转基因烟草10个株系与野生型进行GhDGAT2-5的表达分析，结果Nt3#、Nt13#表达水平较高，分别比野生型提高了600～850倍。Nt3、Nt4、Nt7、Nt8、Nt9、Nt10、Nt11、Nt2、Nt13和Nt15：不同的烟草T0代转基因株系，WT：野生型烟草。

图5是T₀代不同转基因烟草株系中种子油脂含量

通过测定野生型和转基因植株种子中的油脂含量，结果发现所有转基因株系种子的油脂含量均高于野生型。野生型烟草种子的脂质含量为38.66%，转化GhDGAT2-5基因的转基因T₀代烟草种子的油脂含量均在40%以上，Nt13达到了41.44%。相比与野生型脂质含量，转基因植株提高了5.6%和7.18%。Nt3、Nt13：T₀代转基因烟草植株，WT：野生型烟草。

图6：转基因棉花胚珠中GhDGAT2-5基因的表达量检测

提取转基因植株和野生型冀棉14的40DPA胚珠的RNA，反转录成cDNA，用于分析GhDGAT2-5基因在转基因植株中的表达量。实时定量PCR分析结果表明：与野生型棉花的GhDGAT2-5基因表达水平相比，1-3#株系抑制了68%，1-5#和5-2#株系抑制了约86%，尤其是转基因棉花1-7#,1-8#,2-7#,3-8#,4-1#,4-5#等六个株系，GhDGAT2-5基因的表达抑制达90%以上。

图7：转基因棉花种子大小的变化

1-3：35S1-3植株种子，4-1:35S4-1植株种子，1-7:35S1-7植株种仁，WT：野生型种子和种仁。A1、A2：转基因35S1-3、35S4-1植株的棉籽大小与野生型（WT）的比较。A3：转基因35S1-7植株的棉籽仁大小与野生型的比较。由图A可见转基因棉花种子和种仁均大于野生型的。

B1、B2为野生型和T₀转基因棉花种子大小测定结果的柱形图，由图可见：T₀代转基因种子的长和宽均大于野生型，其中长度增加了5.3%～29%，宽度增加了21.9%～24.3%，表明转基因棉花种子的体积增加了。

图8:陆地棉甘油二酯酰酰基转移酶基因（GhDGAT2-5）在陆地棉不同组织及胚珠各个发育阶段的表达测定。

A：flower：花，stem：茎，root：根，petiole：叶柄，ovule40d：开花后40天的胚珠；B：ovule xd：开花后不同天数的胚珠。

利用实时定量RT-PCR检测了GhDGAT2-5基因在冀棉14的根、茎、叶、花等不同组织中的表达，结果显示GhDGAT2-5基因在茎和叶柄中的表达水平极低，在胚珠中的表达水平比根的高10倍。进一步检测了GhDGAT2-5基因在棉花胚珠0～40d发育时期的表达水平，结果表明该基因在0d～10d其表达量呈现一个小高峰，15d～30d表达量较低，而在35d～40d表达较高。

图9：转基因棉花株系种子籽指的统计。

A表示T₀代籽指测定结果的柱形图，由图可见转基因棉花的籽指升高，野生型棉花的籽指为10.002g，转基因35S4-1植株的籽指最高为14.55g，六个不同的转化子，其籽指均高于野生型，增加的幅度在19%和45%之间。B表示T₁代籽指测定结果的柱形图，其中，T₁代转基因棉花分别来源于3-8株系和5-2株系，命名为3-8-1#,3-8-3#,3-8-4#和5-2-2#，3-8#株系的T₁代对照是Null1，5-2株系的T₁代对照是Null2。对照Null1的籽指为6.023g，转基因棉花3-8-1#,3-8-3#,3-8-4#提高的幅度在71.82%和26.48%之间。Null2的籽指为7.68g，转基因棉花5-2-2#的籽指提高了9.9%。Null：从转基因棉花中分离出的非转基因对照。

图10：T₀代不同转基因棉花株系种子油脂含量测定

选择GhDGAT2-5基因表达水平较低的T₀代转基因棉花种子，索氏抽提法提取棉籽油脂。结果显示：野生型棉花种子的含油量为25.96%，而抑制GhDGAT2-5基因的T₀代转基因棉花种子的含油量均低于野生型棉花，其中植株1-5#的含油量为21.12%，是所测株系中最低的。相较于野生型油脂含量，转基因植株降低了4%～18.64%。转基因植株1-3#,1-7#,1-8#,4-1#做了三个重复，经t-测验分析，植株1-8#,4-1#的平均含油量与WT的差异均达到显著水平(0.01＜p＜0.05)，植株1-7#的平均含油量与WT的差异达到极显著水平（p＜0.01）。

35S1-3,35S1-5,35S1-7,35S1-8,35S4-1,35S5-2为不同的T0代转基因植株，WT:野生型棉花。

图11：T₀代不同转基因棉花株系种子的蛋白含量测定

采用凯氏定氮法测定了8个转基因株系种子的粗蛋白质含量，根据蛋白的测定结果，转基因植株4-1#的棉籽蛋白含量与野生型相比基本没有变化，其他五个植株的棉籽蛋白含量都上升了，增幅为0.08%～2.42%，经t-测验分析，植株1-8#的蛋白含量呈现显著性差异(0.01＜p＜0.05)。所以，与野生型相比，转基因植株的棉籽蛋白含量总体趋势是升高的。

图12：T₀代不同转基因棉花纤维产量测定

A：T₀代转基因棉花的衣分，B：T₀代转基因棉花的纤维长度，C：T₀代转基因棉花的衣指，35S1-3,35S1-7,35S1-8,35S4-1,35S5-2为不同的T₀代转基因植株，WT:野生型棉花。

与野生型相比，1-7#转基因棉花的衣分增加了0.94%，1-3#,1-8#,4-1#,5-2#转基因棉花的衣分降低了0.55%～0.6%（图12A）；而4-1#,5-2#转基因棉花成熟棉纤维长度分别比野生型对照减少了12.6%,7.6%，1-3#转基因棉花成熟棉纤维长度增加了1.34%（图12B）；除植株1-3#外，T₀代转基因棉花植株衣指都比野生型高，增幅为11.2%～35.4%（图12C）。表明抑制GhDGAT2-5的表达，T₀代转基因棉花纤维的衣分变化不大，纤维长度有所下降，而衣指增加了。

图13：T₁代不同转基因棉花纤维产量测定

A：T₁代转基因棉花的衣分，B：T₁代转基因棉花的纤维长度，C：T₁代转基因棉花的衣指。35S3-8-1,35S3-8-3,35S3-8-4,35S5-2-2分别为T₁代的转基因株系，Null1，Null2分别为35S3-8和35S5-2的对照。

对于T₁代转基因棉花的种子，分析了纤维的衣分，长度及衣指等相关指标：对照Null1的纤维长度是3.15cm，衣分是40.27%，衣指是4.06g，对照Null2的纤维长度是3.23cm，衣分是39.24%，衣指是4.958g。与对照相比（图13C），3-8-4#株系的衣指略微降低，3-8-1#,3-8-3#,5-2-2#三个株系的衣指增幅为30.8%～53.4%。转基因5-2-2#株系的衣分提高了20.8%，其他三个株系的衣分与野生型基本一致（图13A）。转基因株系3-8-1#,3-8-3#,3-8-4#的纤维长度下降了1.1%～4.4%，转基因株系5-2-2#的纤维长度增加了5.2%（图13B）。

图14：油脂、糖酵解及蛋白合成途径中的关键基因在转基因棉花1-7#中的表达

以1-7#植株40DPA的胚珠cDNA为检测对象，实时定量PCR分析显示：乙酰辅酶A羧化酶（ACCase）的表达变化不明显。FAD家族中除FAD2表达水平基本不变，其他三个基因的表达水平都高于野生型，尤其是FAD7基因，增加了约4.5倍；KASI、KASII的表达量与野生型相比提高了1倍以上；LPAAT、PAP、ACCase四个基因的表达水平变化不明显；而ROD1基因的表达水平下降了50%以上。与野生型陆地棉相比，GPAC、PDHα的表达水平提高了2.5倍以上，而PFK的表达水平略低于野生型。蛋白质合成中的2个关键基因GPT和GS基因的表达水平分别降低了39.1%和36%。

具体实施方式

以下结合附图对本发明进行进一步的详细说明，但以下说明并不对本发明进行限定,任何对本发明的变形和改变，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求所定义的范围。

本发明实例中的试剂药品未做具体说明的均为普通市售，材料方法未做具体说明的均参考《分子克隆实验指南》(Sambrook和Russell,2001)。

【实施例1】陆地棉甘油二酯酰酰基转移酶基因（GhDGAT2-5）的克隆

利用EASYspin植物RNA快速提取试剂盒（Aidlab）提取棉花胚珠的RNA。参照SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit（clontech）说明书进行cDNA的合成，用作GhDGAT2-5基因克隆的模板。最后用设计合成的该基因的特异引物1&2（SEQ ID NO.4&5），以上述的cDNA为模板，扩增该基因的完整cDNA序列。扩增条件如下：

扩增程序为：94℃，2min；94℃，15sec，56℃，30sec，68℃，1.5min，35个循环。扩增完成后，琼脂糖电泳并回收相应DNA条带，克隆至平端载体后寄至华大公司测序验证。结果显示获得的GhDGAT2-5基因序列如SEQ ID NO.1所示。其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。在NCBI数据库中，选择来自不同物种的甘油二酯酰酰基转移酶进行同源性比对，有MtDGAT2(XP_003612436.1)，GmDGAT2(XP_003534223.1)，EoDGAT2(ACO35365.1)，JcDGAT2(AEZ56254.1)，VvDGAT2(XP_002263626.1)，AgDGAT2(AEO11794.1)，RcDGAT2(XP_002528531.1)，AtDGAT2(NP_566952.1)，HaDGAT2(ABU50328.1)，PtDGAT2(XP_002317635.1)，BnDGAT2(ACO90187.1)，ZmDGAT1(NP_001150174.1)，SbDGAT2(XP_002452652.1)，OsDGAT2(NP_001047917.1)，OeDGAT2(ADG22608.1)，HvDGAT2(BAJ98415.1)。由图1可知：GhDGAT2-5蛋白同这些来自不同物种的甘油二酯酰酰基转移酶蛋白一样，存在着保守结构域Pfam Domain,transmembran helixregion，表明所克隆的棉花GhDGAT2-5基因编码甘油二酯酰酰基转移酶。

【实施例2】目的基因RNA干扰序列的克隆

以陆地棉基因组DNA为模板，利用上述的GhDGAT2-5基因特异引物（SEQID NO.4&5），按照下面的条件扩增该基因的DNA片段：

扩增程序为：94℃，2min；94℃，15sec，56℃，30sec，68℃，2min，5个循环。扩增完成后，琼脂糖电泳并回收相应DNA条带。按照（Xiao YH YM,Hou L,Pei Y2006Direct amplification of intron-containing hairpin RNA constructfrom genomic DNA.Biotechniques41:548-552）的方法，利用合成的RNA干扰特异引物（SEQ ID NO.6&7），扩增并克隆GhDGAT2-5基因的RNA干扰序列，具体序列如SEQ ID NO.3所示。

【实施例3】DNA片段回收、载体构建并大肠杆菌转化

紫外灯下，用洁净的刀片切下含目的片段的琼脂糖凝胶块，按照试剂盒（Roche公司）的方法回收相应的DNA片段。载体构建的具体流程见附图2～3，主要是利用该基因的特异扩增引物，从陆地棉35dpa后的胚珠cDNA中扩增出该基因，然后利用限制性内切酶BamHI和SpeI将该片段克隆到表达载体pCB2012中并置于35S启动子调控下，从而构建GhDGAT2-5基因的正向表达载体（图2B）。GhDGAT2-5基因RNA干扰表达载体的构建流程如图3所示，利用该基因的RNAi特异引物，按照Xiao等（Xiao YH YM,Hou L,Pei Y2006Direct amplification of intron-containing hairpin RNA construct from genomic DNA.Biotechniques41:548-552）的方法从陆地棉基因组中扩增出特异DNA片段并克隆到pBSks中。进而利用限制性内切酶BamHI和KpnI将该片段克隆到表达载体p5中并置于35S启动子调控下，从而构建GhDGAT2-5基因的RNAi表达载体（图3B）。所有限制性内切酶均购自Roche公司,按照使用说明书操作。

回收的片段与载体片段的连接体系为:

载体DNA片段与外源连接产物DNA片段摩尔比为1:3，16℃连接12h。之后将连接产物转化大肠杆菌DH5α。

【实施例4】农杆菌及烟草和棉花的遗传转化

用电激法将构建的植物表达载体质粒导入农杆菌LBA4404。

参考Bio-RAD MicroPulser用户说明书，将上述植物表达载体通过电激转化法导入农杆菌LBA4404。

超量正向表达载体整合到烟草基因组

利用农杆菌介导的叶盘转化法（Horsch,et al.,1985），对烟草进行遗传转化，将获得的转基因烟草植株通过GUS染色的方法进行筛选，将GUS染色呈阳性植株种植于温室中，常规管理，成熟后收集种子进行油脂含量和成分分析。GhDGAT2-5基因在T₀代不同转基因烟草株系的叶片中的表达水平如图4所示；T₀代不同转基因烟草种子油脂含量测定结果如图5所示。

超量RNA干扰表达载体整合到陆地棉基因组

采用农杆菌介导的方法对棉花进行遗传转化(Luo et al.，2007)，将获得的转基因棉花植株通过GUS染色的方法进行筛选，将GUS染色呈阳性的幼苗置于清水中，22℃培养1周后移栽至温室中，进行正常管理。转基因棉花T₀代植株胚珠中GhDGAT2-5基因的表达量检测结果如图6所示。转基因棉花T₀代种子和种仁与野生型的比较如图7所示。

【实施例5】陆地棉和烟草各个组织RNA的提取及定量PCR分析

利用EASYspin植物RNA快速提取试剂盒（Aidlab）提取棉花和烟草各个组织的RNA。参照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（MBI）说明书进行cDNA一链的逆转录，用作定量RT-PCR分析模板。采用iQ SYBR GreenSupermix(BIO-RAD)试剂分析目的基因的相对表达量。内标基因选择陆地棉的Ghhis3基因（AF024716）和烟草的Ncactin基因，引物为GhHIS1（5’-GAA GCCTCA TCG ATA CCG TC-3’）和GhHIS2（5’-CTA CCA CTA CCA TCA TGGC-3’），分别如SEQ ID NO.10&11所示；以及ACT1（5’GAT GGT GTC AGCCAC ACT GTC3’）和ACT2（5’ATG CTG CTA GGA GCC AGT GC3’），分别如SEQ ID NO.12&13所示。GhDGAT2-5基因定量PCR引物为，引物1（5’GGT GGA AAC CAG GTG GCA AGC TC3’）和引物2（5’GCA CTT CCA GAACCT CTT CGG CA3’），分别如SEQ ID NO.8&9所示。其余基因的定量PCR引物见序列表SEQ ID NO.14至43所示。扩增条件为：95℃预变性3min；95℃变性20s，56℃退火20s，72℃延伸30s，40个循环。

计算各材料中目的基因和内标的比值，可得目的基因在不同器官组织中的相对表达量。如图4所示，转GhDGAT2-5基因烟草10个株系中GhDGAT2-5的表达分析结果，Nt3#、Nt13#表达水平较高，分别比野生型提高了600～850倍。图6所示为转基因棉花胚珠中GhDGAT2-5基因的表达情况。与野生型相比，转基因棉花1-7#,1-8#,2-7#,3-8#,4-1#,4-5#等六个株系，GhDGAT2-5基因的表达抑制达90%以上，达到预期的实验目标。图8显示了GhDGAT2-5基因在野生型冀棉14的根、茎、叶、花等不同组织中的表达检测结果，表明该基因主要在胚珠，特别是在开花35d后的胚珠中优势表达。图14显示以1-7#植株40DPA的胚珠cDNA为检测对象，对油脂、蛋白代谢途径中关键基因表达的检测结果。脂质代谢途径的FAD家族中除FAD2表达水平基本不变，其他三个基因的表达水平都高于野生型，尤其是FAD7基因，增加了约4.5倍；KASI、KASII的表达量与野生型相比提高了1倍以上；而ROD1基因的表达水平下降了50%以上。蛋白质合成中的2个关键基因GPT和GS基因的表达水平分别降低了39.1%和36%。

【实施例6】转基因烟草种子和棉花种仁油脂含量测定

待抽提样品的处理：将成熟的烟草种子或剥去种皮的棉仁置于烘干箱，50℃烘干48h，然后用球磨机将样品磨碎成粉状(球磨机打磨频率为20次/s，持续1min)，将磨碎的样品用滤纸包好装入索氏抽提器的工作站。

样品的抽提：利用索氏抽提器，按说明书的方法提取样品总油脂并进行种子油脂含量的测定。

通过测定野生型和转基因烟草种子中的油脂含量，结果如图5所示：野生型烟草种子的脂质含量为38.66%，转化GhDGAT2-5基因的转基因T₀代烟草种子的油脂含量均在40%以上，Nt13达到了41.44%。相比与野生型脂质含量，转基因植株提高了5.6%和7.18%。

通过测定野生型和转基因棉花种子中的油脂含量，结果如图10所示：野生型棉仁的含油量为25.96%，而抑制GhDGAT2-5基因的T₀代转基因棉仁的含油量均低于野生型棉花，其中植株1-5#的含油量为21.12%，是所测株系中最低的。相较于野生型油脂含量，转基因植株降低了4%～18.64%，其中，植株1-8#,4-1#的平均含油量与WT的差异均达到显著水平(0.01＜p＜0.05)，植株1-7#的平均含油量与WT的差异达到极显著水平（p＜0.01）。

【实施例7】GhDGAT2-5基因干扰表达的转基因棉花农艺性状的测定

棉籽大小的测定：

选取T₀代棉籽，其中每个转基因植株选取90粒种子，设置3次重复，利用游标卡尺分别测定转基因的棉籽的大小。结果如图7B所示，T₀代转基因种子长度增加了5.3%～29%，宽度增加了21.9%～24.3%。

棉花衣指、籽指、衣分的测定：

选100粒籽棉，轧花后，分别称量100粒棉花纤维重量（也称衣指）和100粒种子重量（也称籽指），测量棉花的衣分（棉纤维重量在棉籽和纤维总重的百分比）。每个转基因植株选取300粒籽棉，3次重复。

T₀代转基因棉花的测定结果如图12所示，其中转基因棉花的衣分变化不明显，除1-7#的衣分增加了0.94%外，1-3#,1-8#,4-1#,5-2#棉花的衣分降低的范围在0.55%～0.6%之间（图12A）；但是，转基因棉花的衣指增加显著，除1-3#植株外，T₀代转基因棉花植株衣指都比野生型高，而且增幅达到11.2%～35.4%（图12C）。转基因棉花衣指增加，衣分变化不明显的原因是由于籽指增加的原因，因此实验表明，抑制GhDGAT2-5的表达，可增加T₀代转基因棉花纤维的产量。

继续测定T₁代转基因棉花结果如图13，以T₁代转基因棉花中分离的非转基因材料Null为对照，分析了纤维的衣分及衣指等指标：对照Null1的衣分是40.27%，衣指是4.06g，对照Null2的衣分是39.24%，衣指是4.958g。与对照相比（图13A），3-8-3#株系的衣分略微升高，为41.08%；3-8-1#,3-8-4#的衣分略有降低,分别为37.24%和38.75%。5-2-2#株系的衣分比对照增加明显，为47.42%增幅达到了20.8%。衣指的测定结果表明（图13C）：3-8-4#株系的衣指略微降低，3-8-1#,3-8-3#,5-2-2#三个株系衣指的增加较明显，增幅在30.8%～53.4%之间，表明转基因株系的纤维产量得到提高。

籽指的测定结果见图9：无论是T₀还是T₁代转基因棉花的籽指均增加。其中T₀代转基因棉花籽指的测定结果显示，野生型棉花的籽指为10.002g，转基因35S4-1植株的籽指最高为14.55g，六个不同的转化子，其籽指均高于野生型，增加的幅度在19%和45%之间。T₁代转基因棉花分别来源于3-8株系和5-2株系，分别命名为3-8-1#,3-8-3#,3-8-4#和5-2-2#。3-8#株系的T1代对照是Null1，5-2株系的T1代对照是Null2。对照Null1的籽指为6.023g，转基因棉花3-8-1#,3-8-3#,3-8-4#提高的幅度在71.82%和26.48%之间。Null2的籽指为7.68g，转基因棉花籽指提高了9.9%。

T₀代棉花纤维长度分析

选取干燥、成熟的棉花纤维，从棉籽的中缝用针轻轻挑开，把纤维分成两半，用梳子轻轻梳理，将纤维梳理整齐，用直尺测量纤维长度，一个样品做4次重复。

按照上述方法对转基因T₀及T₁代纤维的长度进行了测定，结果显示转基因T₀代（图12B）纤维长度变化不明显，4-1#,5-2#转基因棉花成熟棉纤维长度分别比野生型对照减少了12.6%,7.6%，而1-3#转基因棉花成熟棉纤维长度增加了1.34%。T₁代转基因棉花结果如图13B所示，以T₁代转基因棉花中分离的非转基因材料Null为对照，Null1和Null2的纤维长度分别为3.15cm和3.23cm，转基因株系3-8-1#,3-8-3#,3-8-4#的纤维长度比对照下降了1.1%～4.4%，5-2-2#的纤维长度增加了5.2%。

上述实施例表明，本发明改良棉花农艺性状的方法，能够通过干扰特定基因的表达，达到改良棉花纤维产量和种子品质（蛋白含量）的目的。试验结果证明，经本发明改良的棉花纤维衣指增加，衣分、长度变化不明显，最终纤维产量提高，转基因棉花种子增大，其蛋白质含量增加，提高了棉籽的利用效率。本发明方法简便易行效果显著，具有很好的市场前景。

以上对本发明的详细描述并不限制本发明,本领域的技术人员可以根据本发明做出各种变形和改变,只要不脱离本发明的精神,均应属于本发明所附权利要求所定义的范围。

Claims (12)

1.一种分离的棉花二酯酰甘油酰基转移酶基因，具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2.权利要求1所述棉花二酯酰甘油酰基转移酶基因编码的蛋白质，其具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

3.含有如权利要求1所述棉花二酯酰甘油酰基转移酶基因的表达载体。

4.如权利要求3所述的表达载体，其特征在于，具有如图2B所示的结构。

5.一种提高植物种子含油量的方法，包括将权利要求1所述的二酯酰甘油酰基转移酶基因整合进入植物构建转基因植物，并使所述二酯酰甘油酰基转移酶基因在植物种子中表达的步骤。

6.权利要求1所述的基因在改良植物品种中的应用。

7.一种干扰表达载体，其含有干扰权利要求1所述棉花二酯酰甘油酰基转移酶基因表达的特异性基因干扰序列。

8.如权利要求7所述的干扰表达载体，其特征在于，所述特异性基因干扰序列如SEQ ID NO.3所示。

9.如权利要求8所述的干扰表达载体，其特征在于，具有如图3B所示的结构。

10.一种转基因棉花的制备方法，包括以下步骤：

（1）构建含有如权利要求9所述的干扰表达载体；

（2）将所述干扰表达载体转化宿主，获得转化体；

（3）将所述转化体转化棉花，获得转基因棉花。

11.一种提高棉花种子蛋白质含量和纤维产量的方法，包括构建干扰权利要求1所述基因表达的干扰表达载体并转化到棉花宿主中，干扰棉花二酯酰甘油酰基转移酶基因表达的步骤。

12.干扰棉花二酯酰甘油酰基转移酶基因表达的DNA在改良棉品种中的应用，其中所述的DNA具有如SEQ ID No.3所示的序列。

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