CN105039394A - 一种获得蓖麻油酸含量提高的蓖麻新材料的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种获得蓖麻油酸含量提高的蓖麻新材料的方法，具体步骤如下：分离磷脂酶C基因的两个片段；构建含有磷脂酶C基因的RNAi植物表达载体；含有磷脂酶C基因的RNAi植物表达载体转化农杆菌：用冻融法将构建好的含有磷脂酶C基因的RNAi表达载体pBI-C1-IN-C2质粒转化农杆菌感受态细胞，用PCR的方法筛选农杆菌阳性克隆；用农杆菌介导法对蓖麻子叶节进行遗传转化，获得转基因抗性植株；对转基因抗性植株进行检测。本发明通过RNAi技术，沉默蓖麻油生物合成过程中的关键酶基因-磷脂酶C基因的表达，阻止非羟基脂肪酸进入三酰基甘油，增加种子中蓖麻油酸含量，针对性强，从而进一步提高蓖麻种子中蓖麻油含量。提高蓖麻种子中蓖麻油含量的速度快，效果显著。

Description

一种获得蓖麻油酸含量提高的蓖麻新材料的方法

技术领域

本发明涉及植物转基因技术领域，具体是一种获得蓖麻油酸含量提高的蓖麻新材料的方法。

背景技术

蓖麻是一种用途很广、经济效益很大的非食用油料作物。蓖麻种子用于榨油，种子含油量在50％左右，蓖麻油及其深加工后产品的用途非常广泛，已经涉及到生产生活的各个方面，因此，对蓖麻油的生物合成过程进行深入的研究，努力提高种子中蓖麻油(即粗脂肪)含量具有非常显著的经济价值。蓖麻油的主要成分为高级脂肪酸的甘油三酸酯，蓖麻油中有8种脂肪酸，棕榈酸、硬脂酸、花生酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、花生一烯酸和蓖麻油酸。蓖麻油酸是蓖麻粗脂肪的主要成分，也是蓖麻油重要产品-癸二酸的原料。

在中国，由于蓖麻产量低、收购价格低，导致蓖麻种植面积大量萎缩，蓖麻种子供不应求，所以蓖麻的首要育种目标一直是高产，只是在最近几年才开始注重其品质，即含油率，但是也只是以百粒重、种仁率、种仁中粗脂肪含量为指标的较多，少数品种提到粗脂肪中蓖麻油酸的含量，这种评价不够直观。

在国外，蓖麻油生物合成的相关研究起步较早。关于蓖麻油的生物合成过程，目前已逐渐被Jiann-TsyhLin等人研究清楚，对蓖麻油的生物合成过程及其所涉及的关键酶的研究相对较多，主要集中在油酰基-12-羟基化酶(leoyl-12-hydroxylase)，该酶催化2-油酰基卵磷脂(2-oleoyl-PC)形成2-蓖麻油酰基-卵磷脂(2-Ricinoleoyl-PC)，也有报道通过基因工程手段将该酶的基因转到其他植物中来验证酶功能的研究。尚未见通过转基因的方式获得蓖麻油含量提高的蓖麻新材料的研究。

磷脂酶C基因，也是功能基因，是蓖麻油生物合成过程中的关键酶的基因。磷脂酶C在蓖麻油生物合成过程中催化2-油酰基卵磷脂(2-oleoyl-PC)形成1-酰基-2-油酰基甘油(1-Acyl-2-oleoyl-sn-glycerol)，该酶被抑制后，可阻止非羟基脂肪酸进入三酰基甘油，从而增加种子中蓖麻油酸的含量。但是，目前尚未见使蓖麻内源的磷脂酶C基因沉默，提高种子内蓖麻油酸含量，从而提高蓖麻种子中蓖麻油含量的报道。

与本发明相关的现有技术一：关于蓖麻转基因方面的研究，国外只有两例成功报道，Sujatha等于2005年首次报道用农杆菌介导法获得了转结构基因的蓖麻植株，Malathi等于2006年报道获得了转功能基因，即抗虫基因的蓖麻植株。国内，有3例进行蓖麻功能基因的克隆和载体构建研究。高颖等克隆了蓖麻抗盐碱基因PAL；黄凤兰等和陈永胜等分别克隆了毒蛋白A链基因，并构建了用于共抑制的重复表达载体和用于RNAi的表达载体，并对蓖麻进行了遗传转化；刘鹏等克隆了蓖麻矮化相关基因——细胞色素P450基因，构建了该基因的RNAi表达载体，并对蓖麻进行了遗传转化。

现有技术一的缺点：国外两例蓖麻转基因成功的案例，都是使得外源基因(所转的基因)在蓖麻这一植物体内表达，并且所转的基因一个是结构基因，另一个为抗虫基因。国内进行蓖麻基因克隆和载体构建的研究，涉及的是功能基因，包括蓖麻抗盐碱基因PAL斜体、毒蛋白A链基因、矮化相关基因P450。目前，尚未见通过转基因的方式获得蓖麻油酸含量提高的蓖麻新材料的研究。

与本发明相关的现有技术二：由于蓖麻育种的首要目标一直是高产，对品种的品质即含油量的研究一直被重视得不够。在蓖麻品种审定时，多数品种以亩产、百粒重、种仁率、种仁中粗脂肪含量为指标的较多，少数品种提到粗脂肪中蓖麻油酸的含量。在作物常规育种中，通常通过单株选择的方式获得综合性状良好的材料，再利用这样的材料进行杂优利用。在蓖麻的杂优利用过程中，首先注重的是产量性状，通常选择高产性状好、配合力良好，并且含油量高的材料，再利用这样的材料进行杂优利用获得新品种。

现有技术二的缺点：该技术对提高种子中蓖麻油含量的速度较慢，效果是逐渐才能表现出来的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种针对性强、效果显著的获得蓖麻油酸含量提高的蓖麻新材料的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种获得蓖麻油酸含量提高的蓖麻新材料的方法，具体步骤如下：

(1)分离磷脂酶C基因的两个片段；

(2)构建含有磷脂酶C基因的RNAi植物表达载体；

(3)含有磷脂酶C基因的RNAi植物表达载体转化农杆菌；

(4)用农杆菌介导法对蓖麻子叶节进行遗传转化，获得转基因抗性植株；

(5)对转基因抗性植株进行检测。

作为本发明进一步的方案：所述步骤(1)中分离磷脂酶C基因的两个片段的方法，具体步骤如下：

1)用试剂盒法提取蓖麻种子中的总RNA；

2)用逆转录试剂盒将mRNA逆转录成cDNA；

3)用Primer-premier5.0软件设计引物：据NCBI中发布的蓖麻磷脂酶C基因的mRNA序列号XM_002511121.1，利用Primer-premier5.0软件设计两对引物，分别命名为C1S与C1X、C2S与C2X，应用DNAMAN软件分析基因序列内部的限制性酶切位点，并根据pMD18-T-Simple-Vector、pHANNIBAL、pBI-121质粒上的多克隆位点的情况，以及引物前端加酶切位点和保护碱基的原则，设计各条引物序列；

4)用降落PCR的方法分离磷脂酶C基因的两个特异性片段；

5)用胶回收试剂盒回收特异性片段；

6)C1、C2特异性片段分别与pMD18-T-Simple-Vector克隆载体连接；

7)连接产物转化大肠杆菌感受态细胞；

8)用PCR和酶切的方法筛选大肠杆菌阳性克隆；

9)大肠杆菌阳性克隆提交生物公司进行序列测序：测序结果表明蓖麻磷脂酶C基因的C1、C2片段碱基长度分别是803bp、458bp。

作为本发明进一步的方案：所述步骤(2)中用逆转录试剂盒将mRNA逆转录成cDNA的方法，具体步骤如下：

1)用限制性内切酶和胶回收试剂盒从克隆载体上分别酶切、回收磷脂酶C基因两个特异性片段；

2)用限制性内切酶将内含子从pHANNIBAL载体上切下，用胶回收试剂盒回收；

3)用限制性内切酶将植物表达载体质粒pBI-121线性化；

4)用连接酶将磷脂酶C基因的两个特异性片段、内含子和pBI-121连接在一起；

5)连接产物转化大肠杆菌感受态细胞；

6)用PCR和酶切的方法筛选大肠杆菌阳性克隆：设计的引物上游在pBI-121的35S启动子上，下游则在内含子和C1片段上，引物分别命名为NS1和NX1、C1S1和C1X1；

7)大肠杆菌阳性克隆提交生物公司进行序列测序：经测序，证明所构建的含有磷脂酶C基因的RNAi植物表达载体pBI-C1-IN-C2结构正确。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤(4)获得转基因抗性植株的方法，具体步骤如下：

1)蓖麻子叶节预培养；

2)用活化好的含有磷脂酶C基因RNAi表达载体质粒的农杆菌浸染蓖麻子叶节；

3)农杆菌与子叶节共培养；

4)用除菌剂除去子叶节上的农杆菌；

5)用卡那霉素对子叶节进行抗性筛选；

6)转基因抗性苗进行驯化移栽，得到转基因抗性植株的种子。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤(5)中对转基因抗性植株进行检测的方法，具体步骤如下：

1)分子检测包括：DNA水平对转基因抗性植株叶片采用PCR检测，RNA水平对种子采用荧光定量PCR检测，蛋白质水平对种子采用Western-Blot检测；

2)生物学检测：测定转基因抗性植株和对照非转基因植株种子中蓖麻油酸含量和总蓖麻油含量，步骤包括：用乙醚萃取蓖麻籽油；油脂皂化后的脂肪酸采用三氟化硼-甲醇溶液进行甲酯化；利用气相色谱-质谱-计算机联用技术分离、鉴定蓖麻油酸含量和总蓖麻油含量。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明通过RNAi技术，沉默蓖麻油生物合成过程中的关键酶基因-磷脂酶C基因的表达，阻止非羟基脂肪酸进入三酰基甘油，增加种子中蓖麻油酸含量，针对性强，从而进一步提高蓖麻种子中蓖麻油含量。提高蓖麻种子中蓖麻油含量的速度快，效果显著，种子中粗脂肪含量为53.61-56.15％，提高了2.54％；蓖麻油酸含量为46.33-49.31％，提高了2.98％。

附图说明

图1为本发明中磷脂酶C基因RNAi表达载体的构建示意图。

图2为本发明中从蓖麻种子中提取蓖麻总RNA的结果示意图。

图3为本发明中mRNA逆转录成cDNA的电泳检测结果示意图。

图4为本发明中蓖麻磷脂酶C基因的片段C1、C2的PCR扩增结果示意图。

图5为本发明中重组质粒pMD-C1的PCR结果示意图。

图6为本发明中重组质粒pMD-C1的XbaI、KpnI双酶切结果示意图。

图7为本发明中重组质粒pMD-C2的PCR结果示意图。

图8为本发明中重组质粒pMD-C2的SmaI、HindIII双酶切结果示意图。

图9为本发明中用EcoRI、HindIII将内含子从pHANNIBAL上酶切的结果示意图。

图10为本发明中用SmaI、XbaI对表达载体pBI-121双酶切的结果示意图。

图11为本发明中RNAi表达载体pBI-C1-IN-C2的PCR检测结果示意图。

图12为本发明中RNAi表达载体pBI-C1-IN-C2酶切检测结果示意图。

图13为本发明中RNAi表达载体pBI-C1-IN-C2转化农杆菌后的PCR鉴定结果示意图。

图14为本发明中分子检测时DNA水平对转基因抗性植株叶片采用PCR检测示意图。

图15为本发明中分子检测时RNA水平对种子采用荧光定量PCR检测示意图。

图16为本发明中分子检测时蛋白质水平对种子采用Western-Blot检测示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。

请参阅图1-16，一种获得蓖麻油酸含量提高的蓖麻新材料的方法，具体步骤如下：

(1)分离磷脂酶C基因的两个片段：

1)用试剂盒法提取蓖麻种子中的总RNA：所用蓖麻材料为2129品系，从2129品系种子中提取蓖麻总RNA的结果见图2；

2)用逆转录试剂盒将mRNA逆转录成cDNA：mRNA逆转录成cDNA的电泳检测结果见图3；

3)用Primer-premier5.0软件设计引物：据NCBI中发布的蓖麻磷脂酶C基因的mRNA序列号XM_002511121.1，利用Primer-premier5.0软件设计两对引物，分别命名为C1S与C1X、C2S与C2X，应用DNAMAN软件分析基因序列内部的限制性酶切位点，并根据pMD18-T-Simple-Vector、pHANNIBAL、pBI-121质粒上的多克隆位点的情况，以及引物前端加酶切位点和保护碱基的原则，设计各条引物序列如下：

C1S：5’-GG(保护碱基)TCTAGA(XbaI)GAATCCAGCAATCAACG-3’

C1X：5’-GG(保护碱基)GGTACC(KpnI)TAGGAACATCGCAAAA-3’

C2S：5’-GG(保护碱基)CCCGGG(SmaI)ATCTGTGCCTGTTTATGC-3’

C2X：5’-GG(保护碱基)AAGCTT(HindIII)CCCTTAGTGCCTCGTAT-3’；

4)用降落PCR的方法分离磷脂酶C基因的两个特异性片段：蓖麻磷脂酶C基因的片段C1、C2的PCR扩增结果见图4；

5)用胶回收试剂盒回收特异性片段；

6)C1、C2特异性片段分别与pMD18-T-Simple-Vector克隆载体连接；

7)连接产物转化大肠杆菌感受态细胞；

8)用PCR和酶切的方法筛选大肠杆菌阳性克隆：

重组质粒pMD-C1的PCR结果见图5，XbaI、KpnI双酶切结果见图6，

重组质粒pMD-C2的PCR结果见图7，SmaI、HindIII双酶切结果见图8；

9)大肠杆菌阳性克隆提交生物公司进行序列测序：测序结果表明蓖麻磷脂酶C基因的C1、C2片段碱基长度分别是803bp、458bp；这两个序列的长度与预期的PCR产物长度一致，应用DNAMAN软件对这两个序列进行分析，与GenBank中序列号为gb|XM_002511121.1|的蓖麻磷脂酶C基因(参照)比对，同源性分别为99.86％、97.95％。

(2)构建含有磷脂酶C基因的RNAi植物表达载体：含有磷脂酶C基因的RNAi植物表达载体构建过程见图9；

1)用限制性内切酶和胶回收试剂盒从克隆载体上分别酶切、回收磷脂酶C基因两个特异性片段：重组质粒pMD-C1的XbaI、KpnI双酶切结果见图6，重组质粒pMD-C2的SmaI、HindIII双酶切结果见图8；

2)用限制性内切酶将内含子从pHANNIBAL载体上切下，用胶回收试剂盒回收：用EcoRI、HindIII将内含子从pHANNIBAL上酶切的结果见图9；

3)用限制性内切酶将植物表达载体质粒pBI-121线性化：用SmaI、XbaI对表达载体pBI-121双酶切，进行1线性2化，酶切结果见图10；

4)用连接酶将磷脂酶C基因的两个特异性片段、内含子和pBI-121连接在一起；

5)连接产物转化大肠杆菌感受态细胞；

6)用PCR和酶切的方法筛选大肠杆菌阳性克隆：

设计的引物上游在pBI-121的35S启动子上，下游则在内含子和C1片段上，引物分别命名为NS1和NX1、C1S1和C1X1。RNAi表达载体pBI-C1-IN-C2的PCR检测结果见图11，酶切检测结果见图12；

7)大肠杆菌阳性克隆提交生物公司进行序列测序：经测序，证明所构建的含有磷脂酶C基因的RNAi植物表达载体(pBI-C1-IN-C2)结构正确；

(3)含有磷脂酶C基因的RNAi植物表达载体转化农杆菌：用冻融法将构建好的含有磷脂酶C基因的RNAi表达载体(pBI-C1-IN-C2)质粒转化农杆菌感受态细胞，用PCR的方法筛选农杆菌阳性克隆，结果见图13；

(4)用农杆菌介导法对蓖麻子叶节进行遗传转化，获得转基因抗性植株；

1)蓖麻子叶节预培养：刚切完的蓖麻子叶节接种后预培养；

2)用活化好的含有磷脂酶C基因RNAi表达载体质粒的农杆菌浸染蓖麻子叶节；

3)农杆菌与子叶节共培养：子叶节用农杆菌浸染之后进行共培养；

4)用除菌剂除去子叶节上的农杆菌；

5)用卡那霉素对子叶节进行抗性筛选；

6)转基因抗性苗进行驯化移栽，得到转基因抗性植株的种子；

(5)对转基因抗性植株进行检测：

1)分子检测包括：DNA水平对转基因抗性植株叶片采用PCR检测，RNA水平对种子采用荧光定量PCR检测，蛋白质水平对种子采用Western-Blot检测，分别见图14、15、16；

2)生物学检测：测定转基因抗性植株和对照非转基因植株种子中蓖麻油酸含量和总蓖麻油含量，用质谱法进行分析。步骤包括：用乙醚萃取蓖麻籽油；油脂皂化后的脂肪酸采用三氟化硼-甲醇溶液进行甲酯化；利用气相色谱-质谱-计算机联用技术分离、鉴定蓖麻油酸含量和总蓖麻油含量。

转基因抗性植株与对照非转基因植株种子各项指标检测结果见表1。

表1转基因抗性植株与对照非转基因植株种子各项指标检测结果

测试指标	对照非转基因植株种子	转基因抗性植株种子
			种子百粒重(g)	33.17±0.11	34.26±0.17
种仁百粒重(g)	25.22±0.24	26.49±0.16
			种子中粗脂肪含量(％)	53.61±0.21	56.15±0.11
种子中蓖麻油酸含量(％)	46.33±0.19	49.31±0.14

本发明通过RNAi技术，沉默蓖麻油生物合成过程中的关键酶基因-磷脂酶C基因的表达，阻止非羟基脂肪酸进入三酰基甘油，增加种子中蓖麻油酸含量，针对性强，从而进一步提高蓖麻种子中蓖麻油含量。提高蓖麻种子中蓖麻油含量的速度快，效果显著，种子中粗脂肪含量为53.61-56.15％，提高了2.54％；蓖麻油酸含量为46.33-49.31％，提高了2.98％。

上面对本专利的较佳实施方式作了详细说明，但是本专利并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本专利宗旨的前提下作出各种变化。

Claims (5)

1.一种获得蓖麻油酸含量提高的蓖麻新材料的方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)分离磷脂酶C基因的两个片段；

(2)构建含有磷脂酶C基因的RNAi植物表达载体；

(3)含有磷脂酶C基因的RNAi植物表达载体转化农杆菌；

(4)用农杆菌介导法对蓖麻子叶节进行遗传转化，获得转基因抗性植株；

(5)对转基因抗性植株进行检测。

2.根据权利要求1所述的获得蓖麻油酸含量提高的蓖麻新材料的方法，其特征在于，所述步骤(1)中分离磷脂酶C基因的两个片段的方法，具体步骤如下：

1)用试剂盒法提取蓖麻种子中的总RNA；

2)用逆转录试剂盒将mRNA逆转录成cDNA；

3)用Primer-premier5.0软件设计引物：据NCBI中发布的蓖麻磷脂酶C基因的mRNA序列号XM_002511121.1，利用Primer-premier5.0软件设计两对引物，分别命名为C1S与C1X、C2S与C2X，应用DNAMAN软件分析基因序列内部的限制性酶切位点，并根据pMD18-T-Simple-Vector、pHANNIBAL、pBI-121质粒上的多克隆位点的情况，以及引物前端加酶切位点和保护碱基的原则，设计各条引物序列；

4)用降落PCR的方法分离磷脂酶C基因的两个特异性片段；

5)用胶回收试剂盒回收特异性片段；

6)C1、C2特异性片段分别与pMD18-T-Simple-Vector克隆载体连接；

7)连接产物转化大肠杆菌感受态细胞；

8)用PCR和酶切的方法筛选大肠杆菌阳性克隆；

9)大肠杆菌阳性克隆提交生物公司进行序列测序：测序结果表明蓖麻磷脂酶C基因的C1、C2片段碱基长度分别是803bp、458bp。

3.根据权利要求1所述的获得蓖麻油酸含量提高的蓖麻新材料的方法，其特征在于，所述步骤(2)中用逆转录试剂盒将mRNA逆转录成cDNA的方法，具体步骤如下：

1)用限制性内切酶和胶回收试剂盒从克隆载体上分别酶切、回收磷脂酶C基因两个特异性片段；

2)用限制性内切酶将内含子从pHANNIBAL载体上切下，用胶回收试剂盒回收；

3)用限制性内切酶将植物表达载体质粒pBI-121线性化；

4)用连接酶将磷脂酶C基因的两个特异性片段、内含子和pBI-121连接在一起；

5)连接产物转化大肠杆菌感受态细胞；

6)用PCR和酶切的方法筛选大肠杆菌阳性克隆：设计的引物上游在pBI-121的35S启动子上，下游则在内含子和C1片段上，引物分别命名为NS1和NX1、C1S1和C1X1；

7)大肠杆菌阳性克隆提交生物公司进行序列测序：经测序，证明所构建的含有磷脂酶C基因的RNAi植物表达载体pBI-C1-IN-C2结构正确。

4.根据权利要求1所述的获得蓖麻油酸含量提高的蓖麻新材料的方法，其特征在于，所述步骤(4)获得转基因抗性植株的方法，具体步骤如下：

1)蓖麻子叶节预培养；

2)用活化好的含有磷脂酶C基因RNAi表达载体质粒的农杆菌浸染蓖麻子叶节；

3)农杆菌与子叶节共培养；

4)用除菌剂除去子叶节上的农杆菌；

5)用卡那霉素对子叶节进行抗性筛选；

6)转基因抗性苗进行驯化移栽，得到转基因抗性植株的种子。

5.根据权利要求1所述的获得蓖麻油酸含量提高的蓖麻新材料的方法，其特征在于，所述步骤(5)中对转基因抗性植株进行检测的方法，具体步骤如下：

1)分子检测包括：DNA水平对转基因抗性植株叶片采用PCR检测，RNA水平对种子采用荧光定量PCR检测，蛋白质水平对种子采用Western-Blot检测；

2)生物学检测：测定转基因抗性植株和对照非转基因植株种子中蓖麻油酸含量和总蓖麻油含量，步骤包括：用乙醚萃取蓖麻籽油；油脂皂化后的脂肪酸采用三氟化硼-甲醇溶液进行甲酯化；利用气相色谱-质谱-计算机联用技术分离、鉴定蓖麻油酸含量和总蓖麻油含量。