CN102492693B

CN102492693B - 棉纤维特异性hb转录因子基因knat7的鉴定及应用

Info

Publication number: CN102492693B
Application number: CN2011103968449A
Authority: CN
Inventors: 李学宝; 龚思颖; 孙翔; 赵黎莉
Original assignee: Huazhong Normal University
Current assignee: Huazhong Normal University
Priority date: 2011-12-05
Filing date: 2011-12-05
Publication date: 2013-07-10
Anticipated expiration: 2031-12-05
Also published as: CN102492693A

Abstract

本发明公开了棉纤维特异性HB转录因子基因KNAT7的鉴定及应用。棉花纤维特异性KNAT7属于homeobox(HB)转录因子基因家族成员，该基因序列中没有内含子，其cDNA全长为1244bp。KNAT7基因编码的蛋白质为300个氨基酸，分子量为33.8kDa。KNAT7在棉纤维中特异表达，其转录产物在细胞伸长后期和次生壁加厚初期的纤维中大量积累。在酵母中表达KNAT7基因能促使宿主细胞纵向伸长，转基因拟南芥分析显示KNAT7在一定程度上影响次生壁组分的合成。上述实验结果证明KNAT7在棉纤维伸长和次生壁加厚过程中起重要作用，该基因对于改良棉纤维品质、增加棉花产量可能具有重要的应用价值。

Description

棉纤维特异性HB转录因子基因KNAT7的鉴定及应用

技术领域：

本发明涉及棉花基因，具体是棉花homeobox(HB)家族中的一个新成员基因KNAT7的棉纤维细胞特异性表达及功能鉴定，进而应用于棉纤维品质改良。

背景技术：

棉花是我国最重要的经济作物之一，棉纤维广泛应用于纺织工业。随着纺织工业快速发展和人民生活水平不断提高，纺织工业及其相关产业对棉纤维品质的要求愈来愈高。我国棉花产量据世界第一位，但棉花纤维品质较差，不能用作一些高附加值高质量纺织产品的生产原料。因此，我国每年需进口优质棉花100多万吨，造成国产原棉积压，纤维品质问题已成为制约我国棉花产业可持续发展的主要障碍之一。

植物细胞的次生生长是植物的重要生命活动之一，一年或多年生的微管植物发生细胞壁次生加厚以满足不断地对水分和营养的运输，同时，提供更大的机械支持力，以满足植物生长发育之需求。在一些发生次生生长的植物中，按发育时期可将细胞壁分为初生壁和次生壁。初生壁是在细胞生长时形成的一层较薄的能随着细胞生长而扩展的细胞壁，而次生壁是细胞停止生长后在初生壁和质膜之间形成的具有木质素或其它次生代谢产物沉积的多层结构的细胞壁。

植物的次生生长是一个复杂的细胞分化发育过程，这一过程是由许多功能基因的协同表达来驱动的。研究表明，很多转录因子如同源异型盒(HB)、MYB、NAC、AP2/EREBP、MADS、WRKY以及锌指蛋白等都参与次生壁的生物合成。目前，从杨树、拟南芥分离了一些参与次生壁合成的HB家族的转录因子，这类转录因子参与非生物胁迫应答，影响植物的生长与形态建成。但是，有关这类转录因子调控植物细胞次生壁形成的分子机制仍有许多细节不太清楚。关于棉纤维次生壁加厚时期特异表达的KNAT7基因的分离鉴定，以及它们在棉纤维细胞生长和细胞壁形成中的作用，未见研究报道。

植物homeobox(HB)基因是近二十年来发现的编码一类特殊转录调控因子的超基因家族。该基因家族编码的转录因子有一个显著特征：含有由60个氨基酸组成的高度保守的结构域-同源异型域(homeodomain，HD)。这类转录因子首先在果蝇中发现，随后在其它动物、植物和真菌中相继发现了类似的同源异型盒蛋白。目前从植物中发现的大量HB基因在基因大小、编码蛋白结构等方面都存在差异。根据水稻和拟南芥这两类模式生物，可以将植物HB类转录因子分六类：具有亮氨酸拉链结构的HD-Zip、编码锌指结构域的PHD-finger、Bell、ZF-HD、WOX和KNOX。KNOX蛋白在螺旋1与螺旋2之间存在三个额外的氨基酸(P-YP)，这使得它的HD区包括63个氨基酸，属于非典型的同源异型盒蛋白。KNOX的结构与人类的MEIS(myeloid ecotropic viral integration site)最为相似，除HD外，它们都具有一个保守的N末端区域，因而这个区域在KNOX家族和MEIS家族发现之后被命名为MEINOX域。根据基因核苷酸序列的相似性、内含子的插入位点、编码蛋白同源结构域中氨基酸序列的相似性以及表达模式的不同，可将KNOX分为三个亚家族：I类KNOX亚家族和II类KNOX亚家族(以下分别简称KNOXI和KNOXII)，以及目前在拟南芥中又发现的第三类，命名为KNATM，这类亚家族基因编码的蛋白缺少HD结构域。目前对KNOXI研究较为深入，它们是一类维持分生组织功能的重要基因。KNOXII的表达较为广泛，参与植物发育。例如，研究表明AtKNAT1、AtKNAT3、AtKNAT4和AtKNAT5参与拟南芥根的发育，AtKNAT7受次生壁合成的关键调控因子SND1的调节，影响次生壁的加厚。

发明内容：

本发明的目的在于提供一个在棉纤维次生壁加厚时期优势表达的新基因KNAT7，分析其蛋白亚细胞定位、转录激活活性及其在酵母细胞中表达对宿主细胞形态的影响，以研究其功能，为解析纤维细胞次生壁加厚的分子机制，改良棉纤维的品质提供新的科学资料。

申请人采用比较基因组学和生物信息学等研究方法，利用申请人所构建了棉花纤维cDNA文库，分离鉴定了一个在纤维次生壁加厚时期优势表达的基因KNAT7。该基因不含内含子，其cDNA全长序列为1244bp，开放阅读框为903bp，编码一个含300个氨基酸的蛋白质，分子量为33.8kDa。

与已知的拟南芥KNOX蛋白序列相比较，棉花KNAT7与KNOXII的AtKNAT7蛋白的同源性较高，其序列相似性达到80％。棉花KNAT7蛋白具有KNOX蛋白的典型结构和保守序列，包含MEINOX结构域(由KNOX1和KNOX2两个亚结构域组成)、ELK结构域、GSE和HD结构域(见图1)。

为获取棉花KNAT7基因的基因组DNA全长序列，申请人在其开放阅读框(ORF)两端设计一对引物(见表1)，以棉花基因组DNA为模板，在94℃-5min，1个循环；94℃-1min，58℃-1min，72℃-2min，32个循环的PCR反应条件下得到该基因的DNA序列。测序结果显示，棉花KNAT7基因的DNA序列与其cDNA序列相同，没有内含子插入。

为验证KNAT7基因编码的蛋白是否为转录因子，申请人分析了该蛋白的亚细胞定位以及转录激活活性。构建了pBI121-KNAT7：GFP融合表达载体，转化棉花下胚轴，观察转化3个月的转基因愈伤组织，KNAT7：GFP融合蛋白定位于细胞核中(见图2)。为了分析转录激活活性，构建了pGBKT7/pGADT7-KNAT7分别转化酿酒酵母菌株Y187和AH109，并经PCR(聚合酶链式反应)检测阳性克隆。将在SD/-Trp平板上生长的AH109阳性转化子划线SD/-Trp/-Ade平板，结果显示转入KNAT7的AH109菌株在SD/-Trp/-Ade平板上不能生长(图3A)；将在SD/-Trp平板上生长的Y187阳性转化子进行显色反应，检测LacZ报告基因是否被激活表达，结果显示X-gal显色后，8小时内转入pGBKT7-KNAT4的菌落没有出现蓝色(图3B)，以上结果说明GhKNAT7不具备自激活效应。

定量RT-PCR(逆转录PCR)进一步分析KNAT7基因在棉花各组织/器官中的表达以及受激素诱导的情况。结果如图4A所示，KNAT7基因在纤维中特异表达。该基因在纤维起始期和伸长前期表达量较低，在纤维伸长后期和次生壁开始加厚时表达量逐渐升高，在20DPA纤维中表达量最高。利用50μM ABA、5μM IAA、5μM KT、5μM GA、0.1μM BL、500μM ACC和100μM SA离体胚处理15DPA纤维4小时，结果显示KNAT7不受激素诱导(图4B)。

为进一步研究棉花KNAT7基因的功能，构建pREP-5N-KNAT7酵母表达载体，随后将重组质粒转化裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)细胞。在pREP质粒中，KNAT7的表达受到nmt-1启动子的调控。nmt-1启动子的活性受外源VB1的抑制，即当培养基中缺乏VB1(诱导培养基)时，启动下游基因的表达。对包含pREP-KNAT7质粒的酵母在诱导或非诱导培养基中培养一段时间后的细胞形态进行观察分析，实验结果如图5所示。对照酵母细胞(包含pREP-5N空质粒)无论在非诱导还是在诱导培养基中，形态没有差异(图5A，5B和5C)。KNAT7转基因酵母(包含pREP-KNAT7质粒)在非诱导培养基中形态与对照类似(图5D)，而在诱导培养基中细胞长度比在非诱导条件下显著增长(图5E和图5F)。从转基因酵母中随机选取10个细胞系，测量其在非诱导和诱导条件下的细胞长度，统计分析结果显示KNAT7转基因酵母在诱导条件下是在非诱导条件下的细胞长度的2-3倍(图5G)。以上实验结果表明，棉花KNAT7基因在裂殖酵母中异源表达可以显著改变细胞的形态，促使细胞纵向伸长。

KNAT7mRNA在次生壁形成时期的棉纤维中大量积累，表明这些基因产物在纤维细胞次生壁加厚过程中可能起重要作用。构建了棉花KNAT7过量表达和显性抑制载体转化拟南芥和棉花，已经获得6个株系的过量表达转基因拟南芥植株，7个株系的显性抑制转基因拟南芥植株(KNAT7AtDR)，9个株系的显性抑制转基因棉花植株(KNAT7GhDR)。初步的表型分析结果显示，显性抑制的转基因拟南芥和棉花在表型上与野生型有一定程度的差异(如图6和图7)。

本发明的优点：

1、提供了一个棉花新基因KNAT7的全长cDNA序列及其编码的蛋白质序列，分析亚细胞定位，并通过酵母双杂交系统检测转录因子的转录活性，证实了该基因编码的蛋白属于KONX转录因子家族。

2、棉花KNAT7的转录产物在处于次生壁加厚期的棉纤维细胞中大量积累，而且该基因的表达能显著促使酵母细胞纵向伸长。

3、棉花KNAT7显性抑制转基因拟南芥和棉花与野生型表型上存在差异，这些实验结果表明KNAT7参与了棉纤维的发育，在纤维伸长以及次生壁加厚过程中起重要作用。

本发明通过以下附图和实施进行进一步阐述，但并不限制本发明的范围。

附图说明

图1.棉花KNAT7编码蛋白结构分析

图中：MEINOX(KNOX1和KNOX2亚结构域)、GSE、ELK和HD(homeodomain)。

图2.棉花KNAT7蛋白亚细胞定位分析

图中：A-明场下KNAT7：GFP-转基因拟南芥根的局部放大；B-暗视野下的荧光照片；C-光照片和细胞叠加后的图像。

图3.棉花KNAT7转录激活活性分析

图中：A为SD/-Ade/-Trp平板上划线检测：转入pGBKT7空载体的AH109(BD)和Y187(BD)菌株，转入pGBKT7-KNAT7融合载体的AH109(BD-KNAT7)和Y187(BD-KNAT7)菌株；B为X-gal滤纸显色：依次为阴性、阳性菌株、转入pGBKT7空载体的Y187和AH109菌株，转入pGBKT7-KNAT7的Y187和AH109菌株。

图4.棉花KNAT7基因的表达以及受激素诱导分析

图中：A为实时荧光定量RT-PCR分析KNAT7基因在棉花不同组织/器官中的差异表达(R根；C，子叶；L，叶片；H，下胚轴；P，花瓣；A，花药；0-10O，0-10天龄胚珠；3-20F，3-20天龄纤维)；B为将50μM ABA、5μM IAA、5μM KT、5μM GA、0.1μM BL、500μM ACC和100μM SA添加到BT培养基中，离体胚处理15DPA纤维4小时，以不添加激素的15DPA纤维作为对照。

图5.过量表达棉花KNAT7基因的裂殖酵母细胞形态分析

图中：(A-C)在非诱导(A)或诱导(B和C)培养基上生长的包含pREP5N空质粒的对照酵母细胞；

(D-F)在非诱导(D)或诱导(E和F)培养基上生长的包含pREP-KNAT7质粒的酵母细胞；

(C和F)DAPI特异性对细胞核染色。

对诱导前后酵母长度测量统计：“**”指经过生物统计学分析，过量表达KNAT7的转基因酵母细胞长度与对照有极显著差异(P值＜0.01)，n＝50。

图6.转基因拟南芥表型分析

T3代KNAT7AtDR转基因拟南芥与野生型相比，莲座叶的叶片卷曲。

图中：A、B和E为野生型拟南芥；C和D为KNAT7AtDR转基因拟南芥；F为KNAT7AtDRL1-1-1；G为KNAT7AtDRL23-1-1。

图7.转基因棉花表型分析

T1代KNAT7GhDR转基因棉花与野生型相比叶片扭曲变形。

图中：A-野生型棉花；B-KNAT7GhDR转基因棉花；C-野生型与转基因棉花叶片比较。

表1KNAT7基因全长DNA序列克隆引物及RT-PCR引物

具体实施方式：

1、棉花KNAT7基因的全长cDNA分离克隆

从棉纤维cDNA文库(按Li XB等，2002，Molecular characterization of the cottonGhTUB1 gene that is preferentially expressed in fiber.Plant Physiol 130：666-674中的方法进行)中分离一个KONX家族的新基因，命名为KNAT7。

2、KNAT7基因的DNA全长序列的克隆

在KNAT7基因ORF两端设计一对引物(见表1)，以棉花基因组DNA为模板，在94℃-5分钟，1个循环；94℃-1分钟，58℃-1分钟，72℃-2分钟，32个循环的PCR反应条件下得到了一个约1kb的DNA片段，将该片段插入到PBS-T载体中。利用PBS质粒上的T3和T7启动子对目的DNA片段进行测序。再用DNAstar软件分析所得的序列，与cDNA序列进行比较，分析内含子的大小和插入位置。

3、KNAT7蛋白亚细胞定位分析

1)、构建pBI121-KNAT7：GFP融合表达载体转化农杆菌LBA4404。

2)、农杆菌介导的棉花转化：农杆菌与棉花外植体共培养后生长出的新的愈伤组织在抗生素上筛选2-3个月。

3)、荧光观察：在激光共聚焦显微镜(Leica公司TCS SP5)下观察筛选培养的阳性愈伤组织，并记录荧光分布情况。

4、KNAT7转录激活活性检测

1)、将转入pGBKT7空载体的AH109(BD/Y187(BD)菌株和转入pGBKT7-KNAT7融合载体的AH109(BD-GhKNAT7)/Y187(BD-GhKNAT7)菌株SD/-Ade/-Trp平板上划线待生长2-3天后观察是否有新的菌落生长；

2)、X-gal滤纸显色：阴性、阳性菌株、转入pGBKT7空载体的Y187/AH109菌株和转入pGBKT7-KNAT7的Y187/AH109菌株集菌后在液氮中反复冻融三次后在加有β-巯基乙醇和X-gal的Z-buffer中显色。

5、实时荧光定量RT-PCR分析

1)、棉花各组织总RNA的提取(按蒋建雄、张天真，2003，利用CTAB/酸酚法提取棉花组织总RNA。棉花学报，15：166-167进行)；

2)、逆转录：按M-MLV逆转录酶(Promega公司)的使用说明书操作；

3)、实时荧光定量PCR：按荧光定量PCR试剂盒(TOYOBO)的使用说明书操作。以棉花持家基因GhUBI1作为内参，计算基因表达的相对值。为了得到最佳的实验效果，PCR扩增条件及引物效率都以目的基因的cDNA为模扳进行优化。该实验中每个组织采集3次样品，分别提取RNA，每个样品的RNA重复3次实时定量RT-PCR实验，最后统计9次实验结果，计算其平均值和标准差。

6、酵母转化、培养及形态观察

根据分子克隆技术，在KNAT7基因开放阅读框(ORF)两端引物加上BamHI和NotI酶切位点的回文序列，用于PCR扩增基因ORF片段。用相应的内切酶酶切该目的DNA片段后，重组到pREP-5N质粒中。酵母转化、培养及形态观察均按Li L等，2007，Molecularcharacterization of cotton GhTUA9gene specifically expressed in fiber and involved in cellelongation.J Exp Bot，58：3227-3238中的方法进行。

1.棉花KNAT7基因的cDNA序列如下：

GCGGTGGCGG CCGCTCTAGA ACTAGTGGAT CCCCCGGGCT GCAGGAATTC GATCTTGAAT 60

TCATGCAAGA ACCAGGGTTA GGTATGATGA GTAGTGGTGG TGGGAGTGGT GGAATTGGAG 120

GGTTAAGCAG CGGAGAAGTG TCGGTTTCCG GTGAGCAGAA CCGACAGCTG AAGGCTGAGA 180

TAGCTGTTCA TCCGCTATAT GAGCAGCTAT TAGCAGCTCA TGTTTCTTGT CTCCGTGTGG 240

CAACGCCAAT CGACCAGTTG CCTTTGATTG ACGCACAGTT AGCACAATCT CATAACCTTC 300

TTAGATCTTA TGCTTCACAG CATCATCAAC ATGGTCATTC CCTATCACCC CATGAAAGAC 360

AGGAGCTCGA CAACTTCTTG GCACAATATT TGATAGTTCT GTGTACTTTC AAAGAACAGC 420

TTCAACAACA TGTCAGAGTC CATGCCATTG AAGCTGTCAT GGCTTGCCGT GAAATCGAAA 480

ATAACTTGCA AGCTCTTACT GGAGTCACAT TGGGTGAAGG AACAGGTGCA ACAATGTCAG 540

ATGATGAGGA TGATATGCAG ATGGACTTCT CTTTGGATCA ATCCGGCACC GATGGGCACG 600

ATTTAATGGG TTTTGGTCCC TTGATTCCTA CTGAATCCGA AAGATCTTTA ATGGAGAGGG 660

TTCGCCAGGA GCTCAAGATT GAATTGAAAC AGGGTTTTAA ATCTAGAATC GAAGATGTGA 720

GGGAGGAAAT TTTACGGAAA AGAAGGGCTG GGAAATTACC AGGTGACACA ACTACGGTGC 780

TAAAGAACTG GTGGCAACAA CACTCAAAGT GGCCATACCC AACTGAAGAT GATAAGGCCA 840

AACTTGTGGA GGAAACAGGA TTGCAGCTAA AGCAAATCAA CAACTGGTTC ATCAACCAGA 900

GGAAGCGTAA CTGGCATAGC AACTCTCAAT CTGTCACCTC TTTAAAGTCG AAGCGAAAAC 960

GGTAGAGGTG AATAAATTCA ATGAGAAATG GAGAAGAAGA AAGTTTGAGC ATGTTGATGT 1020

CAACTTCTTG CGGTAAATAG CTGTGGGCTA ACATTTTGTG AAGGTAAAGT GGGAAGTGAG 1080

GTGGTTTCAA GAAACCTAAG TACATAGATT GAGTTTTATA TGGCTTACAT GTTGTTTAGT 1140

GTGTAGAGTG GATTCGAGTT TCTAACAAAG TAAACATACT ATCAGACCTC ATTATTGTGA 1200

TGTATGTCTC ATCAAGCTTA TCGATACCGT CGACCTCGAG GGGG 1260

2.棉花KNAT7基因编码的蛋白质序列如下：

Met Gln Glu Pro Gly Leu Gly Met Met Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly

1 5 10 15

Ile Gly Gly Leu Ser Ser Gly Glu Val Ser Val Ser Gly Glu Gln Asn Arg

20 25 30

Gln Leu Lys Ala Glu Ile Ala Val His Pro Leu Tyr Glu Gln Leu Leu Ala

35 40 45 50

Ala His Val Ser Cys Leu Arg Val Ala Thr Pro Ile Asp Gln Leu Pro Leu

55 60 65

Ile Asp Ala Gln Leu Ala Gln Ser His Asn Leu Leu Arg Ser Tyr Ala Ser

70 75 80 85

Gln His His Gln His Gly His Ser Leu Ser Pro His Glu Arg Gln Glu Leu

90 95 100

Asp Asn Phe Leu Ala Gln Tyr Leu Ile Val Leu Cys Thr Phe Lys Glu Gln

105 110 115

Leu Gln Gln His Val Arg Val His Ala Ile Glu Ala Val Met Ala Cys Arg

120 125 130 135

Glu Ile Glu Asn Asn Leu Gln Ala Leu Thr Gly Val Thr Leu Gly Glu Gly

1 40 145 150

Thr Gly Ala Thr Met Ser Asp Asp Glu Asp Asp Met Gln Met Asp Phe Ser

155 160 165 170

Leu Asp Gln Ser Gly Thr Asp Gly His Asp Leu Met Gly Phe Gly Pro Leu

175 180 185

Ile Pro Thr Glu Ser Glu Arg Ser Leu Met Glu Arg Val Arg Gln Glu Leu

190 195 200

Lys Ile Glu Leu Lys Gln Gly Phe Lys Ser Arg Ile Glu Asp Val Arg Glu

205 210 215 220

Glu Ile Leu Arg Lys Arg Arg Ala Gly Lys Leu Pro Gly Asp Thr Thr Thr

225 230 235

Val Leu Lys Asn Trp Trp Gln Gln His Ser Lys Trp Pro Tyr Pro Thr Glu

240 245 250 255

Asp Asp Lys Ala Lys Leu Val Glu Glu Thr Gly Leu Gln Leu Lys Gln Ile

260 265 270

Asn Asn Trp Phe Ile Asn Gln Arg Lys Arg Asn Trp His Ser Asn Ser Gln

275 280 285

Ser Val Thr Ser Leu Lys Ser Lys Arg Lys Arg

290 295 300

Claims

1.一个棉花KNAT7基因的cDNA序列，其序列如下：