CN103805613B - 一种锌指蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程领域，具体的说是一种CCCH锌指蛋白基因PdC3H17及其应用。CCCH锌指蛋白基因PdC3H17的碱基序列如SEQIDNo.1中所示。所述PdC3H17基因作为促进杨树茎秆增粗，进而缩短其育种周期的调控基因的应用。本发明从杂交杨（Populus deltoides）中克隆得到的PdC3H17基因，具有广泛的应用前景和极大的经济价值。

Description

一种锌指蛋白及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体的说是一种CCCH锌指蛋白基因PdC3H17及其应用。

背景技术

杨树具有基因组小，易于转化，生长快速等特点，是研究林木遗传发育及基因工程改良的模式植物，同时也是重要的经济树种，在我国广泛种植，主要用作造纸、建筑用料以及能源原料。但长期以来，杨树存在育种周期长、生物产量低等突出问题。因此，挖掘、利用与杨树茎秆木质部调控相关的重要基因不仅有助于加深对林木茎秆次生木质部分子调控机理的理解，而且可为增加杨树生物量和纤维含量等方面提供理论依据和应用指导。

杨树茎秆木质部主要包含纤维素、半纤维素和木质素，受一个由NAC、MYB等基因家族参与的网络调控（Du et al.,2009;Zhong et al.,2011），与拟南芥次生细胞壁形成的调控机制类似（Demura et al.,2012）。其中，杨树PtrWND2B和PtrWND6B基因是拟南芥SND1的同源基因，过量表达导致转基因植株不同器官细胞壁的异位增厚（Zhong et al.,2010;2011）。PtrMYB2、PtrMYB3、PtrMYB20、PtrMYB21是拟南芥MYB46的同源基因，过表达能促进木质部形成基因的大量表达（McCarthy et al.,2010;Zhong etal.,2011;2013）。

最近研究发现，拟南芥AtC3H14基因可能参与了次生细胞壁的形成。例如，它是MYB46的直接靶标，在体外能够促进次生细胞壁形成基因的表达(Ko et al.,2009;Kim et al.,2012)。研究发现，杨树PdC3H17是拟南芥AtC3H14的同源基因，可能参与杨树次生木质部的形成。

木材作为一种重要的工业原料，对其研究意义重大。但传统的改良措施对于生长周期相对较长的林木类植物的改造功效十分有限，因此需要提供一种能够表达杨树木质部的发育的基因材料。

发明内容

本发明目的在于提供一种CCCH锌指蛋白基因PdC3H17及其应用。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种CCCH锌指蛋白基因PdC3H17，CCCH锌指蛋白基因PdC3H17的碱基序列如SEQIDNo.1中所示。

CCCH锌指蛋白基因PdC3H17的编码蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.2中所示。

一种CCCH锌指蛋白基因PdC3H17的应用，所述PdC3H17基因作为促进杨树茎秆增粗，进而缩短其育种周期的调控基因的应用。

一种植物表达载体，载体带有所述CCCH锌指蛋白基因SEQIDNo.1核苷酸序列。

所述植物为杨树或桉树。

一种植物表达载体的应用，所述植物表达载体在促进植物茎秆增粗中的应用。

本发明所具有的优点：

1.本发明从杨树中获得茎秆木质部特异表达的PdC3H17基因；

2.本发明通过获得的茎秆木质部特异表达的PdC3H17基因，构建PdC3H17基因的过表达载体，进而获得了茎秆显著增粗的转基因杨树，其具有较大的研究价值和应用潜力。

附图说明

图1为本发明实施例提供的RT-PCR分析杨树PdC3H17基因的组织表达模式图；其中，Rt，根；ML，老叶；YL，嫩叶；XL，茎；杨树PdUBQ10基因用作内参，结果显示这个基因在杨树茎中特异表达。

图2为本发明实施例提供的杨树PdC3H17基因过表达载体的构建示意图。

图3为本发明实施例提供的RT-PCR分析PdC3H17在转基因杨树中的表达水平示意图。其中，Control,转入空载体的转基因杨树；2，3，6，10，13，转基因杨树株系。杨树PdUBQ10基因用作内参。

图4为本发明实施例提供的杨树PdC3H17转基因植株的表型分析图。其中，左图：温室生长6个月的植株。右图：杨树茎的横切面。Control,转入空载体的转基因杨树；PdC3H17-OE，PdC3H17过表达株系。Bar=200μm。

具体实施方式

实验所涉及的药品均购自Sigma公司、Fermentas公司、Thermo Fisher公司、上海生工公司。具体实验操作依据《分子克隆》。

实施例1杨树CCCH锌指蛋白基因PdC3H17的分子克隆

1.杨树PdC3H17基因的克隆

取培养室生长6个月左右的杨树茎秆，利用CTAB法提取其总RNA，利用RT-PCR技术扩增PdC3H17基因的全长cDNA（参见SEQ ID No.1），最后将其连入pMD19-T中测序。扩增条件为：95℃5min预变性；9430s,55℃40s,72℃1min,35个循环；72℃8min片段延伸。扩增引物为：

PdC3H17cDNAF:5’-ATGGAGAAAACAGAATCACCACC-3’；

PdC3H17cDNAR:5’-TCAACGAGGACCCAGCAGTA-3’；

序列表SEQ ID No.1为：

ATGGAGAAAACAGAATCACCACCGTCTGATTCAAAAACAGCTGCACAATCACCACCGTTGGATTGCCATCAAGCAAACGATCACGATCAATTCGCTTCCAATTTCACCTCTCTCTACCACTCGATTTTCCCGCCAAAACCTTCACGGCTCCCGAACTCGCTCTCTTTCACCCCCTCCACCACCGCCTCGCCTTCCTCCTCCTCCGCCGCAGATGAAATCTCCACGGAGAACCGCCTCCGCCAAGCTCGACTGATTCTCGAGTACCAGGACCTCTGTGATCACTACAATCTCTCTCTCGCGCGCCTCCAAACCCTAACTAATGAACTCGAGTTGATTCGTCGAGAAAATGCAGATCTCAGAGTCACAAATAGTGAGCTTGTCAAGCTTATCAGTCTCTCTTCTGAAGCAGCCGTGATGCAGCATCAGAACCGTACTTTTGGAAACAATCGTGATGTTGCATTTGAGAGAAGGAATAATGCTAATAACGTGGAGAGAGAAAGAGTGACGTTGCCGAAGAGTATTTCCGTCAGATCTAGTGGTTTTGTGAAGGTGAATCAAGCGGTTTCTGGTAATGTGAGTAACAATGGAGGCGGTCGCGGTAGTGCTAGCAGTAACTCAACTCGGTCTCGTGTGGCGAGTCAACAAGATCAACTCGTTTCTGGATCGATGCAGCAGAGGGTGTACGTGCCAGGAGGAGGGAAAAAGAGATCGGAGGAGGAAATAGCCGCTGGAATGGAGTTGGAGGTGTTTAATCAAGGGATGTGGAAGACAGAGCTATGCAACAAGTGGCAAGAGACAGGCACCTGTCCTTATGGTAACCATTGTCAGTTTGCTCATGGCATTGGCGAGCTACGTCCAGTTATCAGGCACCCAAGGTACAAGACTCAAGCTTGCCGCATGGTTCTTGCTGGCGGGGTTTGCCCGTATGGCCACAGATGCCACTTTCGCCACTCCCTCACTGACCAAGACAGGTTACTGCTGGGTCCTCGTTGA

（a）序列特征：

●长度：993

●类型：碱基序列

●链型：单链

●拓扑结构：线性

（b）分子类型：DNA

（c）假设：否

（d）反义：否

（e）最初来源：杂交杨的茎秆

序列表SEQ ID No.2为：

MEKTESPPSDSKTAAQSPPLDCHQANDHDQFASNFTSLYHSIFPPKPSRLPNSLSFTPSTTASPSSSSAADEISTENRLRQARLILEYQDLCDHYNLSLARLQTLTNELELIRRENADLRVTNSELVKLISLSSEAAVMQHQNRTFGNNRDVAFERRNNANNVERERVTLPKSISVRSSGFVKVNQAVSGNVSNNGGGRGSASSNSTRSRVASQQDQLVSGSMQQRVYVPGGGKKRSEEEIAAGMELEVFNQGMWKTELCNKWQETGTCPYGNHCQFAHGIGELRPVIRHPRYKTQACRMVLAGGVCPYGHRCHFRHSLTDQDRLLLGPR*

（a）序列特征：

●长度：330

●类型：氨基酸序列

●链型：单链

●拓扑结构：线性

（b）分子类型：蛋白质

（c）假设：否

（d）反义：否

（e）最初来源：杂交杨的茎秆

2.杨树PdC3H17基因的序列信息与特性分析

PdC3H17基因包含993bp的编码区（参见SEQ ID No.2），编码蛋白的分子量为36.7kDa，C端有一个由55个氨基酸组成的CCCH保守结构域，是典型的CCCH锌指蛋白。利用Clustalp软件对杨树PdC3H17和拟南芥CCCH家族成员进行序列比对，结果发现该基因与AtC3H14同源性最高，表明PdC3H17可能参与杨树茎秆木质部的发育。

3.杨树PdC3H17基因的表达模式分析

以培养室生长6个月的杨树为材料，选取其嫩叶（YL）、老叶（ML）、茎（XL）和根（Rt），利用CTAB法（Chai et al.,2012）分别提取其总RNA，反转录得到第一链cDNA。以PdC3H17cDNAF/R为引物，利用现有的RT-qPCR方法检测杨树PdC3H17基因在这四个组织中的表达情况。扩增条件为：95℃5min预变性；9430s,55℃40s,72℃1min,28个循环；72℃8min片段延伸。杨树PdUBQ10基因用作内参。结果表明，PdC3H17基因在茎中特异表达（参见图1）。

实施例2杨树CCCH锌指蛋白基因PdC3H17的转基因应用

1.杨树PdC3H17基因过表达载体的构建

先将杨树PdC3H17基因全长cDNA连接到pGWC-T载体中，测序正确后，利用Gateway技术（Thermo Fisher公司说明书），通过基因重组将其插入到pH2GW7载体中，从而得到含有PdC3H17基因的植物过表达载体（参见图2）。

2.农杆菌介导转化杨树

选取生长4周左右且状态良好的杂交杨叶片,去除主脉和叶边缘,将其剪成大小一致的叶盘,放入分化培养基中黑暗预培养3天。同时，将PdC3H17过表达载体转入农杆菌EHA105，28℃培养至OD₆₀₀=1.0-1.3，制备成侵染液。将预培后的叶盘浸入制备好的侵染液中侵染20min,期间不断地摇动使叶盘与菌液充分接触;取出叶盘用无菌滤纸吸干多余菌液,放回原培养基中,黑暗共培养4天后转至筛选培养基（MS+0.5mg/l KT+1mg/l2,4-D+1mg/l Hyg）中;每15天换1次培养基,待可见芽出现,再把叶盘转至芽伸长培养基（MS+0.02mg/l TDE+2mg/l Hyg）,芽长至1-2cm时转入生根培养基（MS+2mg/l Hyg）诱导生根。

3.转基因植株分子鉴定

取生长1个月的候选转基因杨树叶片，在液氮中利用CTAB法提取其总RNA，用DNAase I（Sigma公司）去除可能污染的基因组DNA，然后利用反转录试剂盒（Fermentas公司）反转录成第一链cDNA。以PdC3H17cDNAF/R为引物，利用RT-PCR法检测其相对于对照植株（转化空的pH2GW7载体）的表达水平。扩增条件为：95℃5min预变性；9430s,55℃40s,72℃1min,28个循环；72℃8min片段延伸。杨树PdUBQ10基因用作内参。结果如图3所示，5个代表性转基因植株中PdC3H17基因的表达量比对照植株明显要高，表明这些植株确实是PdC3H17过表达植株。

4.过量表达PdC3H17基因促进转基因植株茎秆显著增粗

利用石蜡切片观察转基因杨树茎木质部的发育情况。具体步骤为：

(1)材料的选取及固定：利用锋利刀片取6个月植株茎基部0.5cm,置于4%多聚甲醛固定液中真空抽气2h,直到材料沉于管底,4℃过夜。

(2)脱水及透明：将上述过夜处理的植株茎基用1倍PBS清洗一次，乙醇梯度脱水（乙醇梯度比例为10%、30%、50%、80%、90%乙醇（体积百分比））后，利用无水乙醇(A)和二甲苯(B)按比例进行浸透，其体积比例分别为A/B=3/1,A/B=1/1,A/B=1/3,B，每步比例渗透1h。

(3)浸蜡及包埋：渗透处理后利用二甲苯(B)和石蜡(C)按比例进行蜡浸，其体积比例分别为B/C=3/1,B/C=1/1,B/C=1/3,C,每步浸蜡3h，而后62℃烘箱中进行。

(4)切片、展片及烘片：利用LeicaRM2235切片机(Leica公司)将材料切成8μm的薄片,置于42℃水浴锅中展片1-2min，使之吸附于世泰REF188105粘附载玻片(世泰公司)上,37℃烘片2天。

(5)脱蜡、二甲苯及染色：将附着有材料的载玻片置于二甲苯中脱蜡5min，脱蜡后,利用无水乙醇(A)和二甲苯(B)按比例进行梯度洗脱脱水，梯度比例为：A(无水乙醇)/B(二甲苯)=1/1,A,95%A,85%A,75%A,50%A,30%A（体积百分比），最后在0.5%TBO染液中染色15s。

(6)脱水及封片：将清水洗过的玻片依次在30%A,50%A,75%A,85%A,95%A,A及B中脱水至二甲苯中,每步30s,随后利用加拿大树胶将其封存。

(7)切片的观察：利用OLYMPUS DX51光学显微镜(Olympus公司)进行观察,拍照（参见图4）。

Claims (5)

1.一种CCCH锌指蛋白基因PdC3H17，其特征在于：CCCH锌指蛋白基因PdC3H17的碱基序列如SEQ ID No.1中所示。

2.按权利要求1所述的CCCH锌指蛋白基因PdC3H17的编码蛋白，其特征在于：CCCH锌指蛋白基因PdC3H17的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2中所示。

3.一种权利要求1所述的CCCH锌指蛋白基因PdC3H17的应用，其特征在于：所述PdC3H17基因作为促进杨树茎秆增粗，进而缩短其育种周期的调控基因的应用。

4.一种杨树表达载体，其特征在于：载体带有权利要求1所述CCCH锌指蛋白基因PdC3H17。

5.一种权利要求4所述的杨树表达载体的应用，其特征在于：所述杨树表达载体在促进植物茎秆增粗中的应用。