CN102703461A - 水稻抗病相关基因c3h12和它在改良水稻抗病性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及包含水稻抗病相关基因C3H12的分离克隆、功能验证和应用。C3H12基因编码CCCH类蛋白质，它能够赋予水稻抵抗由细菌性病原菌-白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)引起的病害。将该片段与其外源调节序列连接后转入水稻，超量表达C3H12的转基因水稻对白叶枯病的抵抗能力显著增强。

Description

水稻抗病相关基因C3H12和它在改良水稻抗病性中的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及一个水稻抗病相关基因C3H12的分离克隆、功能验证和应用研究。本发明分离克隆的C3H12基因是水稻抗病反应中的正调控因子。超量表达C3H12基因的转基因植株的抗白叶枯病能力显著提高。

背景技术

植物在生长的过程中，受到多种病原物的侵害。植物病原物的种类繁多，包括病毒、细菌、真菌和线虫等。病原物侵入植物导致两种结果：(1)病原体成功的在寄主植物内繁殖，引起相关的病症；(2)寄主植物产生抗病反应，杀死病原物或阻止其生长。利用抗性基因资源改良植物的抗病性，是预防病害同时又保护环境的根本出路。

植物的抗病反应是多基因参于调控的复杂过程。参于植物抗病反应的基因分为两类：(1)受体基因【包括模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)基因和主效抗病(resistance，R)基因】；(2)抗病相关基因(Kou和Wang，2010)。相对于受体基因，抗病相关基因的数量庞大。

抗病相关基因编码的蛋白质参于合成植物体内的抗病信号分子、参于抗病信号传导、阻止抗病信号传导或参于防卫反应等。这类基因的共同特点是病原诱导后它们的表达量升高或减少，或者是它们编码的蛋白质的修饰发生变化。因此人们可以根据病原诱导前后基因的表达量的差异或者蛋白质分子量的变化大规模地鉴定植物抗病相关基因(Schenk等，2000；Zhou等，2002；Chu等，2004；曾亚等，2008)。目前，人们对抗病相关基因的认识有限。根据已有报道，绝大多数抗病相关基因单独作用时的抗性水平可能比主效抗病基因小。但根据下述原因，它们是值得大力开发的基因资源：(1)由于绝大多数抗病相关基因的产物不需要直接与病原物相互作用，这类基因是具有持久抗性的基因资源；(2)大多数抗病相关基因参于的抗病反应没有病原特异性，因此它们是具有广谱抗性的基因资源；(3)这类基因的资源丰富。但是，水稻中虽然鉴定了很多抗病相关基因(Zhou等，2002；Chu等，2004)，这些基因在水稻抗病反应中的作用机理、以及单个抗病相关基因是否会引起水稻抗病表型的改变都不清楚。

水稻是世界上重要的粮食作物，但病害的影响常常造成其产量和品质的下降。水稻白叶枯病由白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)引起，是世界上对水稻危害最大的细菌性病害(过崇俭，1995)。发掘和利用优良抗性基因资源改良水稻是控制病害的发生、减少或避免水稻病害所带来的损失最经济有效的措施。

与主效抗病基因的应用相比，抗病相关基因的应用能提供植物更为广谱及长效的抗性。通过超量表达作为抗病反应正调控因子的抗病相关基因进行水稻品种的改良，将进一步增强植物的抗病性，拓宽植物的抗谱。这些方面是采用常规植物育种改良技术所不能达到的。

发明内容

本发明的目的是分离克隆水稻中携带的一个抗病相关基因完整DNA片段，并利用超量表达技术通过使目标基因在转基因受体中超量表达鉴定该基因在抗病反应过程中所起作用，为利用这个基因改良水稻品种或其它植物抵御病害的能力奠定基础。申请人将这个基因命名为C3H12。

本发明涉及分离一种包含C3H12基因的水稻DNA片段并鉴定其功能，该片段赋予植物对由白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)所引起的病害产生抗病反应。其中，所述片段如序列表SEQ ID NO：1所示，或者基本上相当于SEQ ID NO：1所示的DNA序列，或者其功能相当于SEQ ID NO：1所示序列的亚片段。对其序列进行分析表明，它编码的蛋白质具有CCCH类锌指蛋白质的保守结构域，表明其属于CCCH类锌指蛋白质家族。超量表达序列表SEQ ID NO：1所示序列可以增强水稻对白叶枯病的抗性。

可以采用已经克隆的C3H12基因作探针，从cDNA和基因组文库中筛选到本发明的基因或同源基因。同样，采用PCR(polymerase chain reaction)技术，也可以从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到本发明的C3H12基因以及任何感兴趣的一段DNA或与其同源的一段DNA。采用以上技术，可以分离得到包含C3H12基因的序列或者包含一段C3H12基因的序列，将这一序列与合适的载体连接，可以转入植物细胞超量表达C3H12基因，产生抗病转基因植物。采用这种转基因技术创造抗病植物是传统育种技术所不能达到的。

本发明为增强水稻对白叶枯病菌的抗性提供了一种新的方法。这种方法包括将C3H12基因完整编码区的基因组片段与能够超量表达目标基因的载体连接、转入感病水稻，通过超量表达C3H12基因改良水稻对白叶枯病的抗性。

在本发明的实施例部分，申请人阐述了C3H12基因的分离、功能验证和应用过程以及该基因的特点。

附图说明

序列表是本发明分离克隆的水稻C3H12基因的核苷酸序列和它编码的蛋白质的氨基酸序列。

图1：本发明鉴定和分离克隆水稻抗病相关基因C3H12以及验证C3H12基因功能的流程图。

图2：用定量RT-PCR技术分析白叶枯病菌PXO61侵染后抗病水稻品种明恢63和感病水稻品种珍汕97中C3H12基因的表达变化。对照是接种PXO61前的样品；其他是接种PXO61后的样品。每个样品中C3H12基因的表达量是相对于接种前珍汕97样品中C3H12基因的表达量。

图3：C3H12基因的结构和遗传转化DNA片段的结构。“ATG”和“TAA”分别是翻译起始密码和终止密码。数字示每一种结构的核苷酸数目。

图4：本发明采用的遗传转化载体pU1301的物理图谱。

图5：T₁代遗传转化植株中的C3H12基因的表达量与表型共分离。对照为水稻感病品种牡丹江8(遗传转化的受体)。病斑面积为接种白叶枯病菌PXO61两周后的数据。遗传转化植株中C3H12基因的表达量是相对于对照牡丹江8中C3H12基因的表达量。星号(*)示表达量升高植株的病斑面积显著(P＜0.01)小于对照。

具体实施方式

本发明的前期研究工作结果发现，在水稻-病原互作中，籼稻中的cDNA序列EI38D7表达量发生改变，提示EI38D7代表的基因可能参于抗病反应(Zhou等，2002；Wen等，2003)。EI38D7代表的基因编码CCCH类蛋白质，它没有已知抗病受体蛋白的结构特征；因此推测EI38D7代表的基因可能是一个抗病相关基因。根据Wang等(2008)对水稻CCCH基因家族成员的命名，EI38D7代表的基因是C3H12。为了验证这一分析推测，产生了本发明。

以下实施例中进一步定义本发明，图1描述了鉴定和分离克隆C3H12基因以及验证C3H12基因功能的流程。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。

实施例1：C3H12基因在不同水稻品种中的表达模式分析

为了进一步证实C3H12基因是否参于抗病反应的调控，本发明采用定量反转录-PCR(quantitative reverse transcription-PCR，qRT-PCR)技术(Qiu等，2007)，分析了C3H12基因在不同水稻品种接种白叶枯病菌株PXO61(菲律宾生理小种1；Sun等，2004)后的表达模式。白叶枯病菌接种采用剪叶法对成株期的水稻进行接种(Sun等，2004)。白叶枯病菌菌株PXO61由菲律宾国际水稻研究所惠赠(Sun等，2004)。白叶枯病菌的培养遵循已经公开发表的方法(Sun等，2004)。接种后分不同时间点取接种叶片抽提总RNA(Zhou等，2002)。取1～5μg总RNA用DNaseI(购自美国Invitrogen公司)处理15分钟以去除基因组DNA污染，然后参照Zhou等(2002)的方法，使用oligo(dT)₁₅寡聚引物和M-MLV反转录酶(购自美国Promega公司)进行反转录。采用实时定量PCR分析试剂盒

Green PCR Master Mix(购自宝生物工程(大连)有限公司)，根据该试剂盒使用说明书，在ABI 7500 Real-Time PCRsystem(购自美国Applied Biosystems公司)仪器上进行实时定量PCR反应。用水稻内源肌动蛋白(actin)基因的表达量衡量、并均一化样品RNA含量(Qiu等，2007)。qRT-PCR分析中的C3H12基因特异PCR引物是38D7RT1F(5′-ACCGAGTGAAAAGGAGTGTGCATAT-3′)和38D7RT1R(5′-AAGCCATAGCATTGAAAAGTTCTGG-3′)，肌动蛋白基因PCR引物是actinF(5′-TGCTATGTACGTCGCCATCCAG-3′)和actinR(5′-AATGAGTAACCACGCTCCGTCA-3′)。

籼稻品种明恢63因携带抗白叶枯病主效基因Xa3/Xa26和Xa25(t)而抗白叶枯病，籼稻品种珍汕97感白叶枯病(Chen等，2002；Sun等，2004；Xiang等，2006)。实验结果显示接种白叶枯病菌PXO61后，C3H12基因在抗病品种明恢63中(Oryza sativa ssp.indica)和感病品种珍汕97(O.sativa ssp.indica)中表达的表达量都降低(图2)。但是C3H12基因在明恢63(Chen等，2002；Sun等，2004；Xiang等，2006)中的表达量显著高于其在珍汕97的表达量(图2)。这一结果提示：C3H12基因可能参于抗白叶枯病反应的调控，增强该基因表达可能可以提高水稻的抗病性，而抗病主效基因的存在可能有助于增强它的表达。

实施例2：分离克隆C3H12基因和基因结构分析

1.C3H12基因结构的预测

以C3H12基因的cDNA序列EI38D7作模板，用BLAST方法(Altschul等，1997)检索粳稻全长cDNA数据库KOME(http://cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/)，发现EI38D7序列与该数据库中一条来自粳稻品种日本晴(Oryza sativa ssp.japonica)、长1656bp的全长cDNA序列(注册号：AK098948)高度同源。AK098948序列就是水稻全基因组序列中编号LOC_Os01g68860基因的cDNA序列。

2.从水稻品种明恢63中分离克隆C3H12基因的全长DNA片段

本发明利用粳稻日本晴的AK098948序列的非翻译区设计PCR引物38D7RT5UF5(5′-GCCACCGCGCGAGTGCACGT-3′)和38D7stop  (5′-GTGGTTTGGGTCACAACT-3′)，采用上述RT-PCR分析方法，从籼稻品种明恢63中扩增C3H12基因的全长cDNA。将扩增产物与

-T载体(购自美国Promega公司)连接，用PCR引物T7(5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′)和SP6(5′-ATTTAGGTGACACTATAG-3′)以及美国Applied Biosystems公司的测序试剂盒(Big Dye Kit)，根据试剂盒说明书以双脱氧核苷酸末端终止法对阳性克隆进行测序。序列拼接后得到一条长1669bp的DNA序列。与AK098948序列排列对比分析，证实明恢63和日本晴中的C3H12基因的cDNA序列完全一致。

利用明恢63中的C3H12基因的cDNA序列EI38D7作探针，筛选发明人所在实验室已有的明恢63细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome，BAC)文库(Peng等，1998)，发现BAC克隆BI16D13可能包含C3H12基因的全长基因。用限制性内切酶HindIII酶切BAC克隆BI16D13，将酶切片段与限制性内切酶HindIII酶切的去磷酸化的pUC19载体(购自美国Amersham Bioscience公司)平端连接，电转化大肠杆菌DH10B(购自美国Invitrogen公司)(电转化仪为eppendorf公司产品，本实施例所用电压为1800V，具体操作参考该仪器的使用说明书)。提取阳性克隆质粒，用PCR引物38D7RT5UF5、38D7stop和基因内部引物38D7RT5UR(5′-AGCTCCGAGGATGGCATC-3′)、38D7MF(5′-GGGTATGTGGCAGCAGATGA-3′)、38D7RT1F、38D7RT1R、38D7G2(5′-GCCTGTTTCATCTTCTGAGA-3′)、38D7G3(5′-GTAGGGTGACAACATTCCCT-3′)，采用上述测序方法对阳性克隆进行测序。序列拼接后得到一条长4398bp的DNA序列，它包括完整C3H12基因(图3)。

3.C3H12基因结构分析

比较分析C3H12基因的基因组序列和cDNA序列，确定C3H12基因由4398个核苷酸组成，包含七个外显子和六个内含子。第一个外显子由320个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的1-320bp处)；它包括由148个核苷酸组成的5’端非翻译区(untranslated region，UTR)(位于序列表SEQ IDNO：1的1-148bp处)和由172个核苷酸组成的编码区(位于序列表SEQ ID NO：1的149-320bp处)。第一个内含子由553个核苷酸组成(位于序列表SEQ IDNO：1的321-873bp处)。第二个外显子由162个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的874-1035bp处)。第二个内含子由373个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的1036-1408bp处)。第三个外显子由62个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的1409-1470bp处)。第三个内含子由482个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的1471-1952bp处)。第四个外显子由120个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的1953-2072bp处)。第四个内含子由94个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的2073-2166bp处)。第五个外显子由295个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的2167-2461bp处)。第五个内含子由749个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的2462-3210bp处)。第六个外显子由327个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的3211-3537bp处)。第六个内含子由478个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的3538-4015bp处)。第七个外显子由383个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的4016-4398bp处)；它包括由179个核苷酸组成编码区(位于序列表SEQ ID NO：1的4016-4194bp处)和由204个核苷酸组成的3’端UTR(位于序列表SEQ IDNO：1的4195-4398bp处)。

4.C3H12基因编码产物的分析

C3H12基因的编码区由1317个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的149-4194bp范围内)，编码一个长度为439个氨基酸的蛋白质。根据Wang等(2008)的CCCH蛋白质家族的分类，C3H12蛋白属于典型的CCCH类蛋白。它属于CCCH蛋白中的第三亚类，具有五个保守的CX₈CX₅CX₃H锌指结构域。

实施例3：C3H12基因的功能验证

1.遗传转化载体的构建

本发明所用载体是pU1301(图4)。pU1301是常用的水稻遗传转化载体(Cao等，2007；Qiu等，2007；Ding等，2008)。它是携带具有组成型超量表达特征的玉米泛素(Ubiquitin)基因启动子的农杆菌介导的遗传转化载体。

将实施例2第2节所述携带包含C3H12基因的5991个核苷酸组成的DNA片段的重组pUC19质粒(图3)用限制性内切酶Kpn I和BamH I消化。同时，用限制性内切酶Kpn I和BamH I消化遗传转化载体pU1301，用氯仿∶异戊醇(体积比为24∶1)抽提，纯化酶切产物，用包含C3H12基因的酶切片段和纯化好的pU1301载体做连接反应。通过测序验证阳性克隆，获得的重组质粒被命名为D74U。

2.遗传转化和转化植株的共分离分析

采用农杆菌介导的遗传转化方法(Lin和Zhang，2005)将D74U导入感病水稻品种牡丹江8(黑龙江大学惠赠)。获得的遗传转化植株被命名为D74UM(其中前面部分即D74U为遗传转化载体名称，M代表水稻品种牡丹江8)。本发明共获得独立转化植株27株，其中12株为单拷贝植株(表1)。对全部T₀转化植株在成株期阶段接种白叶枯病菌株PXO61；与对照牡丹江8相比，部分T₀转化植株的抗性显著抗性提高(P＜0.05)(表1)。

表1.T₀代遗传转化植株(D74UM)对白叶枯病菌株PXO61的反应

⁽¹⁾每株遗传转化基因植株接种3-5片叶，14天后调查病斑和病叶长度，每个数据来自于多个叶片的平均值。

⁽²⁾由于植株过于弱小，没有取到样品检测拷贝数。

将T₀代抗性增强的4株遗传转化植株(D74UM3、D74UM17、D74UM18和D74UM23)的T₁代家系进行基因表达量和抗性共分离分析。在水稻孕穗期时接种白叶枯病菌PXO61，接种14天后调查，同时取样抽取水稻新鲜叶片总RNA，采用上述qRT-PCR分析方法检测植株中C3H12基因的表达量。结果显示遗传转化植株中C3H12基因表达量与抗性共分离(图5)；与对照牡丹江8相比所有抗性显著增强的植株中的C3H12基因的表达量都增强，而抗性与对照相比无显著变化的植株目标基因的表达量无显著变化。进一步证明遗传转化植株的抗性增强是因为超量表达C3H12基因所至。

这些研究结果说明C3H12基因的编码产物在水稻抗白叶枯病反应中发挥正调控因子的作用。超量表达C3H12基因，可增强水稻对白叶枯病的抗性。

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Claims (4)

1.一种分离的对白叶枯病产生抗性的抗病相关基因C3H12，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

2.一种分离的对白叶枯病产生抗性的抗病相关基因C3H12，它的编码序列如序列表SEQID NO：1所示。

3.权利要求1或2所述的基因在增强水稻对白叶枯病抗性中的应用。

4.权利要求3所述的应用，其特征包括通过超量表达基因C3H12，培育抗白叶枯病水稻的方法。

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