CN108285898B - 水稻Xa4基因及在改良水稻多种农艺性状中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及水稻Xa4基因及在改良水稻多种农艺性状中的应用。本发明包含水稻主效抗白叶枯病基因Xa4的分离克隆、功能验证。Xa4基因介导水稻对白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)快速抗病反应；该基因也调控水稻的茎杆强度和株高。携带Xa4基因的水稻高抗白叶枯病，穗下茎杆强度提高，株高降低。Xa4基因的这些功能特点可以抵抗病害的损害，降低茎秆折断和植株倒伏的风险，为水稻稳产提供了潜在保障。

Description

水稻Xa4基因及在改良水稻多种农艺性状中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域。具体涉及到一个水稻主效抗病基因Xa4的分离克隆、功能验证和应用研究。将该基因转入水稻，转基因水稻可以产生Xa4介导的高抗白叶枯病菌的防卫反应，同时增强茎秆强度，降低水稻的株高。

背景技术

白叶枯病是世界水稻生产中最严重的细菌性病害，由稻黄单胞杆菌的致病变种白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)引起；水稻遭受白叶枯病危害后造成减产，严重时甚至绝收(Kou和Wang，2013)。

控制白叶枯病流行的最好的方法是改良水稻品种的抗性，而优良抗性基因资源的发掘则是实现上述目标的前提。植物的主效抗病基因调控的抗病反应抗性强、反应快，通常是育种工作者首选的抗性基因资源。

目前已被命名的主效抗白叶枯病基因有30多个，但是报道被分离克隆的主效抗白叶枯病基因仅有8个：包括显性主效抗病基因Xa1、Xa3/Xa26、Xa10、Xa21、Xa27和隐性主效抗病基因xa5、xa13、xa25；另外多个主效抗白叶枯病基因(Xa4、Xa7、Xa22(t)、Xa23、xa24、Xa31(t))被精细定位(Xiang等，2006；储昭晖和王石平，2007；Wu等，2008；Wang等，2009；Liu等，2011；Tian等，2014)。

主效抗病基因Xa4是一个在我国和其他亚洲国家的育种中广泛应用的基因。它首先在水稻品种IR20，IR22和IR1529-680-3中被鉴定出来(Petpisit等，1977)。该基因具有全生育期抗性，主要抗白叶枯病菌菲律宾生理小种1、5、7、8和10以及我国7个白叶枯病菌生理小种中的6个小种(生理小种1、2、3、4、6和7)，被认为具有持久抗性(Reddy和Bentur，2000；胡珂鸣和王石平，2009)。

倒伏是制约水稻高产稳产的另一个重要因素。水稻倒伏多发生在抽穗后，谷粒灌浆期，使植株得不到足够的光照而影响光合作用的进行，进而减产；在地面湿度较大的情况下，倒伏后的水稻谷粒可能会发芽，霉烂，严重影响稻米品质(Setter等，1997)。株高是影响水稻倒伏的重要因素。过高植株消耗营养，限制了产量潜力的发挥。第一次绿色革命的重要标志之一就是水稻矮化育种的成功(Hedden，2003)，提高了水稻的单产。在此基础上，育种人员以半矮秆材料为亲本进行杂交稻育种，利用亲本材料中的半矮秆基因调控杂交稻的株高，产生较强的矮化效应，从而避免杂种优势向株高优势转化，更多地转化为产量优势，实现了水稻单产的再次飞跃。茎秆的机械强度不足也是水稻倒伏的重要原因。在水稻灌浆后期，穗重不断增加，遇到大风或其他机械作用，如果茎秆的机械强度不足，一旦承受不住穗部或植株上部的重量而很容易发生大面积倒伏。因此，发掘和鉴定调控水稻株高和茎秆强度的基因，实现对水稻株高和茎秆强度的定向改良，可以有效减轻倒伏对水稻产量和品质的影响，对提高水稻生产潜力具有重要的应用价值。

Xa4基因在我国的水稻品种改良中具有很好的应用前景，获得Xa4基因克隆将有利于最有效地利用这一优良基因资源。另外，获得Xa4基因克隆也是研究水稻抗病机理、茎秆强度和株高调控机理的前提。揭示水稻抗白叶枯病的机理以及茎秆强度和株高调控机理可以更好的控制和降低白叶枯病菌对水稻的危害以及有目标的改良水稻茎秆强度和株高。同时，对克隆的抗病基因的修饰和改造，可以人为控制和增加植物的抗病性，拓宽植物的抗谱。这些方面是采用常规植物育种和改良技术所不能达到的。

发明内容

本发明的目的涉及分离和应用一种包含Xa4基因的DNA片段，该片段赋予水稻对白叶枯病菌所引起的病害产生特异性的抗病反应，同时控制水稻株高。其中，所述片段如序列表SEQ ID NO：1所示。对序列表SEQ ID NO:1所示序列进行生物信息学分析表明，该DNA序列编码一个细胞壁偶联激酶，它包含与细胞壁紧密相连，类似表皮生长因子重复区的结构域和蛋白激酶结构域(丝氨酸/苏氨酸激酶)，预测为一个细胞壁蛋白质。

可以在基因组中、mRNA和cDNA中，采用PCR技术，扩增到本发明中的核苷酸序列中任何感兴趣的一段或与其同源的片段。例如，所扩增的序列用于蛋白质的表达、用作探针筛选文库、测序或其它目的等。采用以上技术，可以分离到包含Xa4基因的序列，将这一序列与合适的载体连接，可以转入植物细胞，产生抗性增强和株高降低的转基因植物。

本发明为同时增强水稻对细菌性病害－白叶枯的抗性和降低水稻株高提供了一种新的方法。这些方法包括将克隆的Xa4基因转入水稻，改良水稻抗性和株高。特别是可以用遗传转化技术在植株中累加多个抗病基因，而不会产生传统育种技术中伴随出现的遗传连锁累赘。本发明能够进一步提供或应用利用上述DNA片段获得的抗病和株高降低的转基因植株和相应的种子，创建育种基础材料，以供不同育种需求。

在本发明的实施例部分，申请人详细阐述了Xa4基因的分离过程，功能验证，该基因的特点和潜在的应用价值。

附图说明

序列表SEQ ID NO:1是本发明分离克隆的Xa4基因的序列和它编码的蛋白质的氨基酸序列。

图1：本发明鉴定和分离克隆水稻抗病基因Xa4以及验证Xa4基因功能的流程图。

图2：用定量RT-PCR技术分析Xa4的候选基因WAK和它的等位基因wak在抗病水稻家系IRBB4和感病水稻家系IR24中的表达模式。附图标记说明：在苗期(四叶期)和成株期(孕穗期)接种白叶枯病菌PXO61。对照(ck)是接种PXO61前的样品；其他是接种PXO61后不同时间点的样品。每个样品中WAK基因或wak基因的表达量是相对于对照样品中WAK基因或wak基因的表达量。

图3：遗传转化DNA片段和Xa4候选基因WAK的结构。附图标记说明：“ATG”和“TGA”分别是翻译起始密码和终止密码。数字表示每一种结构的核苷酸数目。

图4：携带Xa4候选基因WAK和其自身启动子(P_WAK)的遗传转化载体D174OI(图A)和WAK抑制表达遗传转化载体D173RI(图B)的外源DNA插入位点结构。附图标记说明：遗传转化载体D174OI具有pCAMBIA1301载体的结构特征，D173RI具有pDS1301载体的结构特征。LB和RB代表载体上的T-DNA左和右边界；GUS代表载体上的β－葡萄糖苷酸酶基因(标记基因)；Hpt代表载体上的潮霉素磷酸转移酶基因(筛选基因)。NOS代表载体上的napoline合成酶多聚腺嘌呤信号；35S代表载体上的花椰菜花叶病毒启动子；AdhI代表载体上的玉米乙醇脱氢酶基因内含子I；OCS代表载体上的章鱼碱合成酸基因终止子；Waxy-a代表载体上的水稻Waxy基因内含子。

图5：两个T₁代遗传转化家系(D174OI1和D174OI7)对白叶枯病菌PXO61的抗性与遗传转化基因(WAK)的报告基因GUS共分离。附图标记说明：水稻家系IR24是遗传转化的受体材料(感病对照)，水稻家系IRBB4是遗传转化基因WAK的供体(抗病对照)。字母“a”表示与感病对照(IR24)相比，阳性遗传转化植株的病斑长度显著(P<0.01)减小。

图6：T₀代遗传转化植株(D173RI)对白叶枯病菌PXO61的抗性减弱与WAK基因的表达量降低相关。附图标记说明：水稻家系IRBB4是遗传转化的受体和抗病对照；水稻家系IR24为感病对照。“RNAi”代表遗传转化载体中的基因特异性RNAi构件。字母“a”和“b”分别表示与对照(IRBB4)相比，遗传转化植株的病斑长度分别在P<0.01和P<0.05的水平上显著增长。

图7：T₁代遗传转化家系(D173RI3、D173RI9、D173RI11和D173RI13)中植株对白叶枯病菌PXO61的抗性减弱与WAK基因表达量下降共分离，也与遗传转化载体中的RNAi构件的存在相关。附图标记说明：水稻家系IRBB4是遗传转化的受体和抗病对照；水稻家系IR24为感病对照。

图8：携带Xa4基因的遗传转化植株(D174OI)和抑制Xa4基因表达的遗传转化植株(D173RI)的抗谱分析。附图标记说明：水稻家系IR24是D174OI植株的遗传转化的受体和感病对照；水稻家系IRBB4是D173RI植株的遗传转化的受体和抗病对照。水稻材料在孕穗期接种白叶枯病菌PXO61、PXO71、PXO112和PXO99。

图9：用定量RT-PCR技术分析Xa4基因的组织表达模式。

图10：携带Xa4基因的遗传转化材料(D174OI)在水稻灌浆期的茎秆抗折力测定。附图标记说明：“+”为阳性遗传转化株系；“-”为同一T₀植株分离出的阳性株系。

具体实施方式

以下实施例中进一步定义本发明。图1描述了鉴定和分离克隆Xa4基因以及验证其功能的流程。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征、并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。

实施例1：确定Xa4的候选基因

本发明的前期研究工作中用籼稻(Oryza sativa L.ssp.indica)家系IRBB4和IR24构建的F₂分离群体精细定位了主效抗病基因Xa4(Sun等，2003)。IRBB4和IR24是近等基因系，二者的遗传背景相同，但是IRBB4因为携带Xa4基因而抗病，IR24因为不携带Xa4而感病(Sun等，2003)。Xa4基因介导病原特异性的抗病反应；携带Xa4的水稻特异性地抗某些白叶枯病菌生理小种(Sun等，2003)。IRBB4和IR24的种子由国际水稻研究所惠赠。根据上述精细定位的结果和本发明研究人员对Xa4基因区段部分DNA片段测序的结果，推测该区段中的一个WAK(wall-associated kinase)类基因可能是Xa4的候选基因。

为了证实WAK基因是否参于抗病反应的调控，本发明研究人员采用定量反转录-PCR(quantitative reverse transcription-PCR,qRT-PCR)技术(Qiu等，2007)，分析了接种白叶枯病菌菌株PXO61(Sun等，2004)后，抗病水稻家系IRBB4中WAK基因的表达模式和WAK基因的等位基因wak在感病水稻家系IR24中的表达模式。白叶枯病菌接种采用剪叶法分别对苗期和成株期的水稻进行接种(Sun等，2004)。白叶枯病菌菌株PXO61由国际水稻研究所惠赠(Sun等，2004)。白叶枯病菌的培养遵循已经公开发表的方法(Sun等，2004)。接种后分不同时间点取接种叶片抽提总RNA(Zhou等，2002)。总RNA的抽提采用TRIzol Reagent(美国Invitrogen公司)。操作方法按公司提供的试剂盒说明书进行。

取1～5μg总RNA用DNaseI(美国Invitrogen公司)处理15分钟以去除基因组DNA污染，然后参照Zhou等(2002)的方法，使用oligo(dT)₁₅寡聚引物和M-MLV反转录酶(美国Promega公司)进行反转录。采用实时定量PCR分析试剂盒

Green PCR Master Mix(宝生物工程大连有限公司)、并根据试剂盒使用说明书操作，在ABI 7500 Real-Time PCRsystem(美国Applied Biosystems公司)仪器上进行实时定量PCR反应。用水稻内源肌动蛋白(actin)基因的表达量衡量、并均一化样品RNA含量(Qiu等，2007)。qRT-PCR分析中的WAK和wak基因特异PCR引物是WAKRealF(5′-ACGGGAGCCTCGAGACAGT-3′)和WAKRealR(5′-CCAGGCTTGATATCCCCATGT-3′)，肌动蛋白基因PCR引物是actinF(5′-TGCTATGTACGTCGCCATCCAG-3′)和actinR(5′-AATGAGTAACCACGCTCCGTCA-3′)。

水稻家系IRBB4抗白叶枯病菌菌株PXO61，水稻家系IR24不抗PXO61(Sun等，2003)。实验结果显示无论在苗期或是成株期接种白叶枯病菌PXO61后，均可以诱导WAK基因和wak基因在水稻家系IRBB4和IR24中表达，但是诱导趋势有差异(图2)。苗期接种PXO61后，抗病水稻IRBB4中的WAK基因的表达在30分钟就开始诱导上升表达，2小时到达诱导最高峰；而在感病水稻IR24中，wak基因的表达呈一种相反的模式：接种PXO61后先抑制wak基因表达，随后其表达量缓慢上升，在接种12小时达到最高表达量(图2)。在成株期，WAK基因在IRBB4中的最大表达诱导峰值远远大于wak基因在感病水稻品种IR24中的最大表达诱导峰值(图2)。上述结果提示：WAK基因可能参于调控水稻和抗白叶枯病菌的互作，增强该基因表达可能可以提高水稻的抗病性，反之减弱该基因表达可能会降低水稻的抗病性。

实施例2：Xa4候选基因的结构和编码产物分析

1.基因末端序列分析

总RNA抽提参照实施例1所述方法，随后采用宝生物工程大连有限公司的Oligotex-dT30<Super>mRNA Purification Kit(From Total RNA)抽提mRNA，再采用宝生物工程大连有限公司的SMART RACE cDNA Amplification Kit试剂盒，通过5’-RACE(rapidamplification of cDNA end)和3’-RACE分析方法，确定水稻家系IRBB4中的Xa4候选基因WAK的5’和3’末端序列，操作按宝生物工程大连有限公司提供的试剂盒说明书进行。进行5’-RACE第一轮扩增的引物是WAK WA2(5′-CCACCGAGATGTTCACGAT-3′)和UPM(试剂盒自带)；第二轮扩增引物是WAKWA1(5′-AATGGGTAGGGGATGTCCA-3′)和NUP(试剂盒自带)；进行3’-RACE第一轮扩增的引物是WAKK1R(5′-GCTTGTCTTTGAGTTCATCCCT-3′)和UPM；第二轮扩增引物是WAK7F(5′-TAGAAGCCTCCCGGTAGAATTT-3′)和NUP；然后通过电泳回收目标大小的片段，用pGEM-T Vector System I试剂盒(美国Promega公司)对回收片段进行克隆。最后对克隆进行测序分析。

2.基因内部结构的确定

采用GenScan(http://genes.mit.edu/GENSCAN.html)软件对包含WAK基因区段的基因组DNA序列进行分析，预测存在三个内含子和四个外显子，采用跨越内含子的三对PCR引物WAKWS1(5′-GAGATGCGCGTCTACTCTCC-3′)和WAKE3R(5′-CGCACTCACTATGTTCGCTCT-3′)、WAK8F(5′-TGGTAGTTCCGACGGTGCTTG-3′)和WAKK1F(5′-GGCTTCTATCGTCATACTTGGC-3′)、WAK9F(5′-AGGAACCTTCTATTACTTGTTACGG-3′)和WAKK1F扩增基因组DNA和RNA反转录产物，RT-PCR产物均比从基因组中扩增出的产物小，说明确实存在三个内含子。将RT-PCR产物克隆、测序、与基因组DNA序列比较，确定了各内含子长度及的剪切位点。采用WAK基因区段的其它引物进行RT-PCR、5’RACE和3’RACE分析，没有再发现其它内含子的存在。

比较分析WAK基因的基因组序列和cDNA序列，确定WAK基因由5887个核苷酸组成，包含四个外显子和三个内含子(图3)。第一个外显子由783个核苷酸组成，它包括由184个核苷酸组成的5′端非翻译区(UTR)(位于序列表SEQ ID NO：1的1－184bp处)和由599个核苷酸组成的编码区(位于序列表SEQ ID NO：1的185－783bp处)；第一个内含子由2489个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的784－3272bp处)；第二个外显子(即第二段编码区)由251个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的3273－3523bp处)；第二个内含子由203个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的3524－3726bp处)；第三个外显子(即第三段编码区)由177个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的3727－3903bp处)；第三个内含子由123个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的3904－4026bp处)；第四个外显子由1861个核苷酸组成，它包括由1097个核苷酸组成的第四段编码区(位于序列表SEQ ID NO：1的4027－5123bp处)和由764个核苷酸组成的5′端UTR(位于序列表SEQ ID NO：1的5124－5887bp处)。

前人曾经报道籼稻品种特青携带Xa4基因(Li等，1999)。本发明研究人员采用PCR扩增方法从籼稻品种特青中扩增了WAK的等位基因的编码区和启动子区(大约ATG上游564个核苷酸)，序列分析显示IRBB4和特青中的WAK基因的编码区和启动子区的DNA序列完全一致。

3.基因编码产物分析

WAK基因编码一个长度为707个氨基酸蛋白质。用Blastp方法分析(Altschul等，1997)，推测该基因编码一个细胞壁偶联的激酶类蛋白质。预测显示该蛋白质的氨基末端有两个保守的结构域：与动物中表皮生长因子同源区域(EGF)和钙依赖的表皮生长因子同源区域(CaEGF)。WAK基因编码的羧基末端是一个类似于蛋白激酶结构，它具有丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶的保守的结构域。

4.WAK基因和wak基因编码产物的差别

WAK基因在水稻家系IR24中的等位基因wak编码结构相同的产物，但是在编码区存在一个碱基的差异，由C(WAK)变为G(wak)(位于序列表SEQ ID NO：1的第640位碱基)，导致第152位氨基酸由天冬氨酸(D)变为谷氨酸(E)。

实施例3：Xa4候选基因的功能验证

1.采用功能互补实验验证候选基因的功能

(1)由WAK自身启动子调控的WAK基因遗传转化载体的构建

本发明研究人员首先采用功能互补实验，验证Xa4的候选基因WAK是否具有抗病功能。前人曾经报道籼稻品种特青携带Xa4基因(Li等，1999)。用限制性内切酶BamHI从特青BAC克隆(Zhang等，1996)25p4上获得约10kb包含完整WAK基因、启动子区以及尾部序列的片段(图3)。同时，用限制性内切酶BamHI酶切遗传转化载体pCAMBIA1301(Sun等，2004)；酶切完毕，用虾碱性磷酸酶去磷酸化；用氯仿:异戊醇(体积比24:1)抽提、纯化酶切产物。用包含WAK基因的酶切回收片段和纯化好的载体做连接反应。通过酶切验证阳性克隆，获得的重组质粒载体被命名为D174OI(图4A)。

(2)遗传转化和分析D174OI遗传转化植株

采用农杆菌介导的遗传转化方法(Ge等，2005)，将D174OI载体导入感病水稻IR24。获得的遗传转化植株被命名为D174OI。本发明共获得独立转化植株9株。对全部T₀代转化植株在孕穗期阶段接种白叶枯病菌菌株PXO61，接种14天后调查病斑长度。与遗传转化受体(野生型)IR24以及遗传转化阴性植株相比,所有的阳性遗传转化植株的抗性显著增强(P<0.01)(表1)。

表1.T₀代遗传转化植株(D174OI)对白叶枯病菌菌株PXO61的反应

⁽¹⁾每株转化基因植株接种3－6片叶，14天后调查病斑和病叶长度，每个数据来自于多个叶片的平均值。

⁽²⁾阴性转化植株，其它植株为阳性转化植株。

为了验证遗传转化植株抗性增强是转入的基因所致，对在T₀代抗性增强的2株遗传转化植株(D174OI1和D174OI7)的T₁代家系进行遗传转化的报告基因GUS(β-葡萄糖醛酸酶)和抗性共分离分析。在孕穗期时接种白叶枯病菌PXO61，接种14天后调查病斑长度，并取样提取DNA，采用GUS基因的PCR引物Gus2F(5’-CCAGGCAGTTTTAACGATCAGTTCGC-3’)和Gus2R(5’-GAGTGAAGATCCCTTTCTTGTTACCG-3’)扩增检测阳性遗传转化植株。分析发现遗传转化植株的抗性增强和GUS基因共分离(图5)。说明遗传转化植株的抗性增强是因为转入的WAK基因的存在，该基因是一个抗白叶枯病基因。

2.通过抑制目标基因表达验证候选基因的功能

(1)抑制WAK基因表达遗传转化载体的构建

本发明研究人员同时采用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术、通过抑制抗病水稻IRBB4中WAK基因的表达，从另一个侧面验证该基因的功能。该技术途径主要通过将目标基因的部分片段以反向重复的形式与能够表达双链RNA(double strand RNA,dsRNA)的载体连接，通过遗传转化将该载体导入植物中。获得的转化植株大量表达与目标基因部分片段同源的dsRNA。这些dsRNA迅速形成短干扰RNA(short interfering RNA,siRNA)，与目标基因的转录本(mRNA)互补配对，在细胞内特殊酶的作用下使目标基因的转录本降解，从而在mRNA水平上抑制目标基因的功能(Smith等，2000；McGinnis等，2005)。研究者可以通过转基因植株表型的改变，验证目标基因的功能。该技术用于农杆菌介导的遗传转化的载体是pDS1301，它是常用的水稻遗传转化RNAi载体(Cao等，2007b；Yuan等，2007)。该载体携带具有组成型表达的花椰菜花叶病毒启动子，能够组成性抑制目标基因的表达(图4中的B图)。本发明研究人员首先从水稻IRBB4中抽取总RNA，通过反转录获得cDNA。用WAK基因特异性的PCR引物WAK10F(5′-AGACTAGTGGTACCTAGAGGCGATGGCAGGAA-3′)(下划线代表用于载体连接的接头中的SpeI KpnI限制性内切酶消化位点)和WAK10R(5′-AAGAGCTCGGATCCCCCGATGAGGCGGACAA-3′)(下划线代表用于载体连接的接头中的SacIBamHI限制性内切酶消化位点)以IRBB4的cDNA为模板，扩增得到长502个核苷酸的WAK基因的cDNA片段(位于序列表SEQ ID NO：1的3824-3903bp和4027－4448bp处)。用限制性内切酶KpnI和BamHI分别消化酶切该cDNA片段、加入了BamHI和KpnI酶切位点的中间载体pGEM-G(美国Promega公司)和遗传转化载体pDS1301，酶切完全后在65℃水浴10min灭活限制性内切酶。将酶切片段在0.8％琼脂糖凝胶电泳后切胶回收目的条带。用T4-DNA连接酶将WAK的cDNA片段分别与中间载体pGEM-G和遗传转化载体pDS1301进行连接。将连接好的载体利用电转化的方法(Wilson和Gough,1988)转入大肠杆菌菌株DH10B(Sun等，2004)。所用电转化仪为Electroporator 2510(德国eppendorf公司)，操作参照Electroporator 2510工作手册进行，转化的电压为1800V，电容为10μF,2500V脉冲放电，时间参数为5毫秒/样品。通过BamHI和KpnI酶切筛选外源片段正向插入的阳性克隆。

用SacI和SpeI酶切携带WAK的cDNA片段的pGEM-G载体质粒和已经连入第一链WAK的cDNA片段的pDS1301载体质粒。酶切完全后在65℃水浴10min灭活限制性内切酶。用T4-DNA连接酶将WAK的cDNA片段连接到携带WAK的cDNA片段的pDS1301质粒的SacI/SpeI酶切位点。用上述电转化方法将连接好的载体转入大肠杆菌菌株DH10B，通过SacI和SpeI双酶切反应筛选阳性克隆，阳性克隆命名为D173RI(图4中的B图)。

(2)遗传转化和分析D173RI遗传转化植株

本发明研究人员采用上述遗传转化方法将D173RI载体转入抗病水稻IRBB4中，共得到52株独立转化植株。与对照和转基因阴性植株相比，大部分T₀代阳性遗传转化植株表现出不同程度的感病(图6)。为进一步验证转化植株的抗病能力的减弱是否与WAK基因表达量相关，研究人员采用上述定量RT-PCR方法随机检测了其中14株T₀代转化植株中WAK基因的相对表达量。实验结果显示转化植株中WAK基因的表达量变化与植株的抗病表型变化密切相关(图6)。抗病性减弱的转化植株中WAK基因的表达量与对照材料IRBB4相比明显减少。而抗病表型无明显变化的阴性转化植株中WAK基因表达量与IRBB4相比无明显降低。另外，用RNAi载体的PCR引物PMCGF(5’-GGCTCACCAAACCTTAAACAA-3’)和PMCGR(5’-CTGAGCTACACATGCTCAGGTT-3’)扩增基因特异性RNAi构件，结果显示WAK基因的表达量降低的转化植株都是阳性遗传转化植株。这些结果说明遗传转化植株对白叶枯病菌的抗性的减弱可能是因为WAK基因的表达量降低；抑制水稻中WAK基因的表达，可减弱水稻对白叶枯病的抗性。

为了进一步验证遗传转化植株对白叶枯病菌的抗性的减弱是否与抑制WAK基因的表达有关，本发明的研究人员检测了在T₀代抗性减弱的4株遗传转化植株(D173RI3，D173RI9，D173RI11和D173RI13)的T₁代家系。DNA水平检测表明，遗传转化植株的抗性减弱同遗传转化载体所携带的RNAi构件相关(图7)。另外，定量RT-PCR分析结果显示遗传转化植株的WAK基因表达量降低与遗传转化植株的抗性减弱共分离(图7)，即：与对照抗病水稻IRBB4相比所有抗性显著减弱的植株中的WAK基因的表达量都下降，而抗性与对照相比无显著变化的植株，目标基因的表达量无显著变化；进一步证明遗传转化植株的抗性的减弱是因为抑制了WAK基因后表达量下降所至。

综合上述结果，遗传转化植株的抗性是由WAK基因提供的；从而确定WAK基因就是Xa4基因。

3.遗传转化植株的抗谱分析

前人遗传研究发现，Xa4基因介导病原特异性抗病反应；携带Xa4基因的水稻家系IRBB4抗白叶枯病菌PXO61、PXO71、PXO112，但是不抗白叶枯病菌PXO99(Ogawa等，1986；Yoshimura等，1995)。本发明的研究人员对处于孕穗期的携带Xa4基因的遗传转化株系(D174OI)和Xa4基因表达被抑制的遗传转化株系(D173RI)接种白叶枯病菌菌株PXO61、PXO71、PXO112和PXO99，这些菌株均由菲律宾国际水稻研究所惠赠(Sun等，2004；Cao等，2007a)。与遗传转化受体水稻IR24相比，携带Xa4基因的遗传转化株系D174OI1-4和D174OI7-9对PXO61、PXO71和PXO112的抗性增强，其抗性水平与携带Xa4基因的IRBB4相似；而这些遗传转化株系对PXO99表现为感病(图8)。与遗传转化受体水稻IRBB4相比，Xa4基因表达被抑制的遗传转化株系D173RI11-7和D173RI13-3对PXO61、PXO71和PXO112表现为感病，其感病水平与感病水稻IR24基本相似(图8)。携带目标基因的遗传转化株系(D174OI)具有病原特异性的抗病反应，进一步证明WAK基因就是Xa4。

实施例4：Xa4基因影响株高和茎秆强度

抗病水稻家系IRBB4和感病水稻家系IR24虽然是近等基因系，但是这两个家系的株高有明显差别(表2)。组织表达分析显示，Xa4基因在茎秆中的表达量最高(图9)。田间观察发现，将Xa4基因导入其感病近等基因系IR24中，不仅可以增强转基因植株的抗病性，还会产生株高变化。为了进一步分析Xa4基因是否影响株高，本发明研究人员对两个携带Xa4基因的遗传转化纯合株系(D174OI1-4和D174OI7-9)进行了进一步分析；这两个株系具有IR24的背景。在自然未接种病原菌条件下，感病水稻IR24植株的平均株高比其近等基因系IRBB4植株的平均株高要高大约10cm。携带Xa4基因的遗传转化株系(D174OI1-4和D174OI7-9)与遗传转化受体IR24相比，株高显著变矮，平均株高减少约15％；而阴性遗传转化植株的株高与IR24差别不大(表2)。这些结果提示，Xa4基因不仅可以促进水稻抗病，还调控水稻株高，使水稻株高变矮。

表2.遗传转化植株(D174OI)在灌浆期的株高分析

⁽¹⁾每株挑选最高的茎干，从根部起量至穗顶端，记录为该株株高，每个数据来自于10株独立单株的平均值。

⁽²⁾遗传转化阴性植株。

另外，抗病水稻家系IRBB4的茎秆机械强度同感病水稻家系IR24相比，也有显著差异。IR24穗下第一节和第二节茎秆的平均抗折力同IRBB4相比，分别下降33％和26％(图10)。两个携带Xa4基因的遗传转化纯合株系(D174OI1-4和D174OI7-9)穗下第一节和第二节茎秆的平均抗折力同IRBB4相同，而分离出来的阴性株系的茎秆的平均抗折力同IR24相同(图10)。这些结果提示，Xa4基因还可以增强水稻茎秆的强度。

综合以上结果，育种工作者可以利用Xa4基因同时改良水稻对白叶枯病的抗性；增强穗下茎秆强度，防止水稻灌浆阶段茎秆折断，影响水稻成熟；降低水稻的株高，减小倒伏的风险，为水稻稳产提供保障。因此，Xa4是一个多功能的基因，它正向调控多种影响产量的农艺性状。

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SEQUENCE LISTING

<110> 华中农业大学

<120> 水稻Xa4基因及在改良水稻多种农艺性状中的应用

<130> Sequence

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5887

<212> DNA

<213> Oryza Sativa

<220>

<221> gene

<222> (1)..(5887)

<220>

<221> 5' UTR

<222> (1)..(184)

<220>

<221> exon

<222> (185)..(783)

<220>

<221> Intron

<222> (784)..(3272)

<220>

<221> exon

<222> (3273)..(3523)

<220>

<221> Intron

<222> (3524)..(3726)

<220>

<221> exon

<222> (3727)..(3903)

<220>

<221> Intron

<222> (3904)..(4026)

<220>

<221> exon

<222> (4027)..(5123)

<220>

<221> 3' UTR

<222> (5124)..(5887)

<400> 1

gtatataaag acaatatata taggcatgtt cactggaaat taatcgcagc aaacgtacat 60

atactcctag ctagctagta acgttacgac catcgatcga acgcctagca acattaatta 120

attaactata gtagctagca tgcgacaacg acgagtgatt ctttgcaggt acctcatcca 180

tgct atg gca gca gcc gcc gca ctt tct gcg gtg gcg cct ggg cag cgg 229

Met Ala Ala Ala Ala Ala Leu Ser Ala Val Ala Pro Gly Gln Arg

1 5 10 15

ccc gcg gac tgc ccg agc gag tgc ggc ggc gtg gac atc ccc tac cca 277

Pro Ala Asp Cys Pro Ser Glu Cys Gly Gly Val Asp Ile Pro Tyr Pro

20 25 30

ttc ggc gtg gac aac tgc tcc tgg ccg ggt cct gat gac ttc acc atc 325

Phe Gly Val Asp Asn Cys Ser Trp Pro Gly Pro Asp Asp Phe Thr Ile

35 40 45

atc tgc aaa tat agc agg ccg tac tac agg ggc gcg gag atc gtg aac 373

Ile Cys Lys Tyr Ser Arg Pro Tyr Tyr Arg Gly Ala Glu Ile Val Asn

50 55 60

atc tcg gtg gag gca ggg gag atg cgc gtc tac tct ccc gtg gtc tcc 421

Ile Ser Val Glu Ala Gly Glu Met Arg Val Tyr Ser Pro Val Val Ser

65 70 75

cag tgc tac aac tca tcc aac acc acg gac tct gac gga ttc gag ttc 469

Gln Cys Tyr Asn Ser Ser Asn Thr Thr Asp Ser Asp Gly Phe Glu Phe

80 85 90 95

ttg cgg ctc aac atc acc aac acg ccg ttc ctg gtc gct ccg gag aga 517

Leu Arg Leu Asn Ile Thr Asn Thr Pro Phe Leu Val Ala Pro Glu Arg

100 105 110

aac gag ttc acg gcc atc ggc tgt gcc acg ttg gcg tgg cta tgg ggc 565

Asn Glu Phe Thr Ala Ile Gly Cys Ala Thr Leu Ala Trp Leu Trp Gly

115 120 125

aga gac gat ggg agc tac ttg acc ggc tgc atc tcg acg tgc gcg agc 613

Arg Asp Asp Gly Ser Tyr Leu Thr Gly Cys Ile Ser Thr Cys Ala Ser

130 135 140

ttg gcg acg gct gcc aag gac cgt gac cca tgt acg ggg ctg ggt tgc 661

Leu Ala Thr Ala Ala Lys Asp Arg Asp Pro Cys Thr Gly Leu Gly Cys

145 150 155

tgc cag gtg ccc tcc atc ccg gcc aac ctt agc gtc tta aat att tcc 709

Cys Gln Val Pro Ser Ile Pro Ala Asn Leu Ser Val Leu Asn Ile Ser

160 165 170 175

ttg ggc aca ggc atc gcc aac gtt gcc tgg gaa gaa agt ccc tgt agc 757

Leu Gly Thr Gly Ile Ala Asn Val Ala Trp Glu Glu Ser Pro Cys Ser

180 185 190

tac gcc ttc gtg gcc gaa aaa cac tg gtacgtaact aagtacgaac 803

Tyr Ala Phe Val Ala Glu Lys His Trp

195 200

acatacctac tacttcatac atctattttt atttttgata gtgatatttc taaatcagaa 863

aaatttactt ttgataggta tatttcaatc caaccattta ttcttttaat gactttcttg 923

gatttaatgc gtgaatctcc attctttcac acaaaattgg ctacatgagc atcaagaaat 983

gtaaatatta ttatatcgct tgtttacgag gaataactaa tactccacta gtatgtttaa 1043

atggatgata agtagaatta tttattcttg gtcattgtgc caagataaaa tatgactatc 1103

aaaggactct atctatcgtc tagactcacg aatttgaata catatatatg gatggataca 1163

cggatctata tctctatctc tactatttta agttttcgtt aatactttag tacgtagttt 1223

gtatttgagt cggtttttaa atccgttcgc ttttcaaaat acataaggag tcatacaagg 1283

aattctttta aaaaacttgc atgctaactg ggatgagcga gaattagact cctaattgca 1343

tcagaattcc taccaagaca taagaaaaca acgtatatga tatggttatt atccgtccca 1403

acttagatat caaatactat ctcaaagtaa aattcacatt tactttttag ataaaataaa 1463

tctaataata atatgattaa aatagcattc acatgttgca acgcacaagt atttttctgt 1523

atatatagat atatattcaa aacccaatac gttaagttca tcttataata tgaaaaagag 1583

aatatactcc ctccgtccct aaatatttga cgccgttaac ttttttaaat atgtttgacc 1643

gttcgtctta ttcaaaaaaa tttaagtaat tattcattct ttttgattca ttgttaaatg 1703

tacttttatg tatatatata gttttaaata tttcataaaa gttttcaaat aagattaacg 1763

gtcaaatata tttaaaaaaa tcaacggtgt caaatattta gggacggagg gagtatataa 1823

gtacacaaaa tccattagta ttataattat atggatctaa ttattaatga taatgattat 1883

tcactctatt tggtgtccat actagtttaa tttattttga tgtatatcct tatatgtgac 1943

ggttctttaa aagaaacagc atgtacgtgt atcttcatat ccgttgtttt tactgagaac 2003

agcacatata tatcgacatc atatttgcgt tggttctcaa tgaaacaggc atatgagtgc 2063

agcataatat gcaatatttt acacatgcat ggtggatatt tttatatgtg catattgtgc 2123

cgtcacttat atgtgcatat ttttaataac ttttaaaatt atatgaagtt ggatgaagat 2183

aaattttact atactaagtt catagagttc aacgagatgt aacaactttg cagataattg 2243

atatatagct ttttcacttg ggattagtta tatgtccgaa tatactttag aaactcttgg 2303

accaatttgg atatataaat agacttttaa aattttaaac gacttcgtac gcgctataca 2363

aaagttatac gagaccatcg gatggcttat tggcttattg gggaaataag ccaaacggca 2423

tatttacaaa caaaaaataa tttgtgaata aaacttttat atacatgttc ttaataatct 2483

aaaaacaaag gctgaaaaat aaacttcaat gaaaaaacct caaaatcaac tccaaattta 2543

aagttgaaaa tttaaatttt ggctgataag tataagcata agcgaaaaga tgaggccgat 2603

aaagcttgac gagatctaaa attttgtagt ttataacctt ttcatttgaa ctcatttggg 2663

gtgcaacata cgcattatga atttttgacg ggagtagtaa caagatacat ttgttttcta 2723

acgacaaatg ctcgatagtt gagatgataa gaaagctgca catgcagata aaaggtctcg 2783

gatttgaatt ccacatttcc catgtgcacg tatttcgcat gaaaaatctc gtgacttgtg 2843

acttgcaaaa ttagaaatac tactctgggt tttaaatttg cacctaggaa attcaaaatg 2903

tagcaccact gtatttgccg gttttacttt agaatcgaaa tataatatgc ctaacaccaa 2963

atggtttaag aattaagtgg gttaacaaaa taaatggcac atggatgact ttcatgtgtg 3023

atgattctta ataaaaatta gcacatatat aattttcatt tgttacagtt cttaataaaa 3083

acctgaacat atgaaggtat atatgtgccg gttcttttaa ctttggctct atatgcatct 3143

tggggtgaat gagagattaa taccttattt gtgttagttt ttggataatc agtatatata 3203

gtattgtcac ttatttaatg tttttcagcc gtgaactgat tgtgcacctg ttgtccgtat 3263

gtgaatcag g tat aat ttc aac agg caa gat ttc gaa cgt gac ggt aaa 3312

Tyr Asn Phe Asn Arg Gln Asp Phe Glu Arg Asp Gly Lys

205 210

agc ttt gaa cac cgg gat gag aaa atg gta gtt ccg acg gtg ctt gac 3360

Ser Phe Glu His Arg Asp Glu Lys Met Val Val Pro Thr Val Leu Asp

215 220 225

tgg gcc atc agg aaa aat ggg tcg tgc ccg tca acc gga cag ggt gct 3408

Trp Ala Ile Arg Lys Asn Gly Ser Cys Pro Ser Thr Gly Gln Gly Ala

230 235 240 245

cct gcc tgt aag agc gaa cat agt gag tgc gtc aac gcc acc aac ggc 3456

Pro Ala Cys Lys Ser Glu His Ser Glu Cys Val Asn Ala Thr Asn Gly

250 255 260

aag ggc tac ctc tgc aat tgc tcc agg gga tac gcc ggc aat ccc tat 3504

Lys Gly Tyr Leu Cys Asn Cys Ser Arg Gly Tyr Ala Gly Asn Pro Tyr

265 270 275

agg gac gat gga tgc aaa a gttagttacg ttcttaatta gctcgctagc 3553

Arg Asp Asp Gly Cys Lys

280

tatcacctaa gcatagaatt cttctctaat tttattttgg atgctagatt agtatttaca 3613

gtacgtggtg atgattaatg acgagcatgc ttgcttagtg tttaaattta cttatttatg 3673

acttaattgt tctaactctt taatttgatt gtttatcacc aatacgtctg tag at 3728

Asn

att aat gag tgt aag gaa cct tct att act tgt tac ggt ggt agc aca 3776

Ile Asn Glu Cys Lys Glu Pro Ser Ile Thr Cys Tyr Gly Gly Ser Thr

285 290 295 300

tgc cag gac aca gac ggc agt tac gag tgc aaa tgc caa ttt gga tat 3824

Cys Gln Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Glu Cys Lys Cys Gln Phe Gly Tyr

305 310 315

aga ggc gat ggc agg aag aat gag agt cag aag gga cga tgc caa ccc 3872

Arg Gly Asp Gly Arg Lys Asn Glu Ser Gln Lys Gly Arg Cys Gln Pro

320 325 330

ata att ccc gct gct ata gcc aat gca ata g gtaaaccgat agagtgttaa 3923

Ile Ile Pro Ala Ala Ile Ala Asn Ala Ile

335 340

ttcttaacta ctccaacacg tagcaatata aatttaattt gctacctatt agcaaatgtg 3983

gatcaacact gtatatcttt atcttatgtt tctttgtatg cag cg att gtt tgc 4037

Ala Ile Val Cys

345

att gtg att gtt ctc ttg ggc ctt ttc tgg ttg cct aag aga tgg aag 4085

Ile Val Ile Val Leu Leu Gly Leu Phe Trp Leu Pro Lys Arg Trp Lys

350 355 360

cgg aga gtg ttc ttc gat aat aac ggt ggt cgc cta ctg aag gat atg 4133

Arg Arg Val Phe Phe Asp Asn Asn Gly Gly Arg Leu Leu Lys Asp Met

365 370 375

gac atc atc gtt ttc act gag aag gaa ctc aac aag ata aca aac aag 4181

Asp Ile Ile Val Phe Thr Glu Lys Glu Leu Asn Lys Ile Thr Asn Lys

380 385 390

aag cgc act aag att gga gag ggc gcc ttt ggc gag gtc tac aag ggg 4229

Lys Arg Thr Lys Ile Gly Glu Gly Ala Phe Gly Glu Val Tyr Lys Gly

395 400 405 410

aac cac aat aac caa ccg gtt gct gtc aag tac tcc atc gca aag aac 4277

Asn His Asn Asn Gln Pro Val Ala Val Lys Tyr Ser Ile Ala Lys Asn

415 420 425

atg act caa aca cat tac aaa gac gtc gtc gag agc ata aac caa aac 4325

Met Thr Gln Thr His Tyr Lys Asp Val Val Glu Ser Ile Asn Gln Asn

430 435 440

gta ttc cag act gtt ttt cgt cag tca aaa gtt cca cca tca aca ccg 4373

Val Phe Gln Thr Val Phe Arg Gln Ser Lys Val Pro Pro Ser Thr Pro

445 450 455

ggc cag aat gca gtc gtc aac gag ata aag gtt cag ctg cag atc cgg 4421

Gly Gln Asn Ala Val Val Asn Glu Ile Lys Val Gln Leu Gln Ile Arg

460 465 470

cac ccc aac att gtc cgc ctc atc ggg tgc tgc atg gaa aca gag gtc 4469

His Pro Asn Ile Val Arg Leu Ile Gly Cys Cys Met Glu Thr Glu Val

475 480 485 490

ccc atg ctt gtc ttt gag ttc atc cct aac ggg agc ctc gag aca gtt 4517

Pro Met Leu Val Phe Glu Phe Ile Pro Asn Gly Ser Leu Glu Thr Val

495 500 505

ctc cat ggt atc gat cga tgc agc ctt tct ctc cag caa cgc ctg gac 4565

Leu His Gly Ile Asp Arg Cys Ser Leu Ser Leu Gln Gln Arg Leu Asp

510 515 520

atc gcg atc ggc tct gca gag gct ctt gcc tac atg cat tgg cac ggc 4613

Ile Ala Ile Gly Ser Ala Glu Ala Leu Ala Tyr Met His Trp His Gly

525 530 535

cat cat cag atc ata cat ggg gat atc aag cct ggc aac att ctc ctt 4661

His His Gln Ile Ile His Gly Asp Ile Lys Pro Gly Asn Ile Leu Leu

540 545 550

ggt gac aat ctc atg cct aag gtc tcc gac ttt gga tca tct gag ctc 4709

Gly Asp Asn Leu Met Pro Lys Val Ser Asp Phe Gly Ser Ser Glu Leu

555 560 565 570

acg ttg aaa gtc aag cgt gca ggg aag tgg aac gta tat gct gac atg 4757

Thr Leu Lys Val Lys Arg Ala Gly Lys Trp Asn Val Tyr Ala Asp Met

575 580 585

aac tac atc gac cct gtg tac atc aag aca ggc gat ttc acg gat aag 4805

Asn Tyr Ile Asp Pro Val Tyr Ile Lys Thr Gly Asp Phe Thr Asp Lys

590 595 600

agc gat gta tat agt ttt ggg gtt gtg ctc cta gag ctc atc acc agg 4853

Ser Asp Val Tyr Ser Phe Gly Val Val Leu Leu Glu Leu Ile Thr Arg

605 610 615

aag aag gcc aag tat gac gat aga agc ctc ccg gta gaa ttt gtc agc 4901

Lys Lys Ala Lys Tyr Asp Asp Arg Ser Leu Pro Val Glu Phe Val Ser

620 625 630

cat tat gag gat gaa gac aca agg agg aaa atg tat gac cag gac atg 4949

His Tyr Glu Asp Glu Asp Thr Arg Arg Lys Met Tyr Asp Gln Asp Met

635 640 645 650

ttg cct acc gag gcc tcg cat cct cac tgc atg gag tgt ctt gac aga 4997

Leu Pro Thr Glu Ala Ser His Pro His Cys Met Glu Cys Leu Asp Arg

655 660 665

atg gcc gat att gtg ctc cgt tgt ctt gaa aat gaa gtg ggc aag agg 5045

Met Ala Asp Ile Val Leu Arg Cys Leu Glu Asn Glu Val Gly Lys Arg

670 675 680

cca acc atg gct gag gtg cta gag gag ctt aag aag ttg tta cca ttg 5093

Pro Thr Met Ala Glu Val Leu Glu Glu Leu Lys Lys Leu Leu Pro Leu

685 690 695

cta acc acg acg ccg gtc gaa ctc gtg tag aagatgattg gtacgttctc 5143

Leu Thr Thr Thr Pro Val Glu Leu Val

700 705

cgtcttgaga gtttctcgat attgatccta tatcagattt gaagttggtt tggttatacg 5203

cattccatgt tatatatata tttttaatga gttgaacgtg gtgtgccctt tatgtgtggt 5263

tcttgtacta ctaagtatat aattaagctg aaatccagct agtactagta ttacatcatg 5323

ttgtaattta agctgtacct aagcttgtcg gtgatttatc tcactctata ctagcatatg 5383

atgtcacgca tacgcgtgac tttacgatcc tgctatgtga tatgtatatg agcatatata 5443

aacttgtcat gccaacaatg ttccatcaag tatgtttagg gaattgtagt tgatcttcaa 5503

tttttagaat ttgaatttag gataatttta gttctttctt gccctaccct cttttcttga 5563

ttgctaggat cagaggtgca aatctaccta aaattattct tactaatgaa ctctcaacct 5623

actaatctat aactaatata aatattcgta tttttccggt cgtcacatct aatttcgtct 5683

gatttttcgt ccatacgcat tccgattagg ttagcgatag tgtcacaccc caatctggta 5743

ccgccgtaca acggcacctg acaggagcgt gtcgtaggga aaacggcgcg aaccgcttcc 5803

tacgaaaccg cgatctcggt actagtccca ggacatagtg ctggtaccca cggtgacaaa 5863

tatgaatcat agcaatcctt aaaa 5887

Claims (2)

1.赋予水稻对白叶枯病菌产生抗性、增强茎杆强度和降低株高的DNA片段，所述DNA片段是序列表SEQ ID NO：1中1-5887位碱基所示的核苷酸序列。

2.一种同时增强水稻对白叶枯病的抗性和茎杆强度以及降低株高的方法，该方法包括将权利要求1的DNA片段连接上合适的启动子转入水稻，增强水稻对白叶枯病的抗性和茎杆强度，同时使水稻株高降低。

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