CN102787122A - 一个控制水稻抽穗期基因OsEHD4及其突变体和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，涉及一个控制水稻抽穗期基因OsEHD4及其突变体和应用。该基因编码一个CCH类锌指蛋白，野生型基因序列如SEQIDNO.1所示，在长、短日照条件下都促进开花。突变基因基因的DNA序列如SEQIDNO.3所示。通过转基因实验证明了该基因具有使水稻抽穗期提前的功能。

Description

一个控制水稻抽穗期基因OsEHD4及其突变体和应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一个控制水稻抽穗期基因OsEHD4及其突变体和应用。 

技术背景

开花（水稻表现为抽穗）是高等植物从营养发育向生殖发育阶段的重要转变，主要由自身遗传机制和环境信号共同影响。植物通过感知随季节同步变化的周围环境（如日照长短和温度等）来完成有性繁殖。开花时间（水稻中称为抽穗期）同时也是一个重要的农艺性状，它决定了作物种植的季节性和地域适应性。水稻（Oryza sativa L.）作为我国乃至世界最重要的粮食作物之一，其产量的提高对解决未来全球粮食问题具有十分重要的战略意义。长期以来，传统的杂交育种由于在品种间地域适应性的不同造成了种质资源多样性局限，从而大大限制了水稻产量和品质等重要农艺性状的进一步提高。因此研究水稻开花调控的分子遗传机理对于水稻品种改良及品种推广具有重要的应用意义。 

通过植物育种家和植物学家近百年来对开花的研究发现，植物的开花时间受很多因素的影响，主要包括光周期、温度及雨水等外界因素和植物生理状况（如年龄和叶片数）等内部因素（Baurle等，The timing of developmental transitions in plants,Cell,(2006):655-664）。其中，光周期是影响植物开花最重要的环境信号之一。光周期途径是指植物具有感知日照长短并且利用它来决定起始开花的合适时间。根据对光周期的感知能力，植物可以分为长日作物、短日作物和中日作物。拟南芥是一种长日模式植物，它在长日条件下开花更早，在短日条件下开花会延迟；而水稻，一种短日模式作物，在短日条件下开花更早，在长日条件下开花延迟，同时，还具有临界日长响应。 

过去的几十年，人们对开花的遗传机制了解得更加深入。GIGANTEA(GI)-CONSTANT (CO)-FLOWERING LOCUS T(FT)途径在控制拟南芥光周期开花中起着核心作用，而这条途径在水稻中也存在（Yano,M.et al.(2000)Plant Cell 12,2473–2483;Takahashi,Y.,Shomura,A.,Sasaki,T.&Yano,M.(2001)Proc Natl Acad Sci USA 98,7922–7927;Kojima,S,,Takahashi,Y.&Kobayashi,Y.(2002)Plant Cell Physiol 43,1096–1105）。然而，水稻和拟南芥对光周期响应不同的生物学现象暗示它们可能受到不同的遗传机制调控。在水稻中，由Ehd1介导了一条独特的开花途径。Ehd1不存在于拟南芥中。借助于QTL检测和大量突 变体的研究，已经克隆了一些调控水稻开花的基因（Doi,K.et al.(2004)Genes.Dev.18,926-936;Xue,W.Y.et al.(2007)Nat.Genet.40,761–767;Wei,X.J.et al.(2010)Plant.Physiol.153,1747–1758）。它们主要调控Ehd1的表达水平来调节开花时间，暗示在水稻光周期开花的调控上，Ehd1扮演着重要角色。 

迄今为止，在水稻、小麦、大麦、玉米、大豆、棉花、烟草、玉米、向日葵、番茄、黄瓜、马铃薯、桑树等几乎所有高等植物中都发现了开花相关的突变体。其突变基因直接或间接影响开花时间，特别是光周期和节律钟途径，导致各种生理及发育上的缺陷，从而引起植物开花时间的改变。抽穗期突变体是研究水稻地域适应性利用的理想材料。目前，虽然在水稻中已鉴定出一些抽穗期突变体和QTL位点，但大多数研究仅局限于基因的初步定位。深入研究这些抽穗期突变体的突变基因对于扩大水稻品种间地域适应性利用效率和提高杂交稻遗传多样性具有重要的应用价值。 

本研究通过对一个组织培养变异的水稻抽穗期突变体ehd4基因的图位克隆和功能分析，从分子水平揭示了控制水稻抽穗期性状的分子机理，且系统研究了该基因与成花素基因的关系，提出了利用OsEHD4基因进行水稻抽穗期遗传改良的方法。 

发明内容

本发明的目的是提供一个控制水稻抽穗期基因OsEHD4。 

本发明的另一目的是提供控制水稻抽穗期基因OsEHD4的突变基因。 

本发明的友谊目的是提供控制水稻抽穗期基因OsEHD4及其突变基因的应用。 

本发明的目的可通过如下技术方案实现： 

一个控制水稻抽穗期基因OsEHD4，它来自水稻，长度为8707bp，相应编码CCCH类锌指蛋白的832个氨基酸，其全序列为SEQ ID NO.1，其CDS序列如SEQ ID NO.2所示。 

所述的控制水稻抽穗期基因OsEHD4在水稻品种改良中的应用。 

所述的控制水稻抽穗期基因的突变基因osehd4，它来自水稻(Oryza sativa L.)，CDS序列长度为2499bp，序列见SEQ ID No.4，相应编码832个氨基酸，包含水稻锌指蛋白基因OsEHD4的第22位氨基酸的突变位点由色氨酸Trp（TGG）突变为终止密码子(TAG)，该基因全序列见SEQ ID NO.3。 

所述的控制水稻抽穗期基因的突变基因osehd4在水稻品种改良中的应用。 

用常规杂交或转基因的方法将osehd4基因转移到野生型材料中，可获得含有OsEHD4/osehd4杂合基因型，抽穗期较野生型稍晚的材料。可以调整水稻品种的地域适应性，为扩大水稻两系杂交稻制种的遗传多样性和可能性提供了技术基础。 

有益效果 

1、本发明公开了一种水稻锌指蛋白突变基因（osehd4基因）及其应用。该基因来自水稻（Oryza sativa L.），可作为目的基因导入水稻，使抽穗期延迟，或通过杂交选育，获得生育期适宜不同地区的水稻品种。检测出连锁标记Ehd4-MAS（与晚抽穗突变体中的ehd4基因的突变位点共分离），在水稻杂交育种中，利用Ehd4-MAS（SEQ ID NO.19,20）分子标记辅助选择晚抽穗Osehd4基因。 

2、本发明人提供的osehd4基因功能是参与植物的光周期开花途径，mRNA表达分析表明osehd4基因在水稻中组成性表达。 

3、本发明的osehd4基因来自水稻，所编码的蛋白质具有转录激活和核酸结合活性，其仅在稻属中具有较高的同源性，是水稻特有的开花时间调控基因。其中motif（CCCH）存在于高等动物和植物中。 

4、利用野生型OsEHD4基因作为目的基因构建植物表达载体，其转化可使晚抽穗突变体的水稻品种恢复正常。提供了osehd4基因的转基因应用方法。 

5、用转基因的方法将osehd4基因转移到野生型材料中，可获得含有OsEHD4/osehd4杂合基因型，具有较野生型晚抽穗的材料，为用于水稻两系杂交稻制种的可能性提供了技术基础。 

附图说明

图1.本发明的育种应用表型 

A图是ehd4突变体，野生型的田间表型图； 

B图表示OsEHD4突变位点，杂合位点及野生型纯合位点在Kita-ake和Nipponbare遗传背景下的表型，其中，WT表示相应材料的野生型，ehd4表示含有突变位点的突变体，HETE表示杂合型；横坐标ND表示自然条件，SD表示短日照条件，LD表示长日照条件。 

图2.OsEHD4的精细定位和转基因互补T2代结果。 

A图是OsEHD4初定位位点图； 

B图表示OsEHD4的精细定位区间； 

C表示OsEHD4的精细定位区间内候选基因； 

D图表示OsEHD4基因结构； 

E图表示转基因互补表型，其中，横坐标Kita-ake表示野生型粳稻Kita-ake，ehd4表示含有突变基因osehd4的水稻，#26、#34、#18、#24分别表示转基因株系，pEhd4：：Ehd4表示自身启动子驱动OsEHD4全长cDNA，pUbi：：Ehd4表示Ubi启动子驱动OsEHD4全长cDNA。 

图3.插入目的基因的双元载体pCUbi1390的质粒图谱，其中pEhd4：：Ehd4表示自身启动子驱动OsEHD4全长cDNA，pUbi：：Ehd4表示Ubi启动子驱动OsEHD4全长cDNA。 

具体实施方式

实施例1水稻锌指蛋白突变基因的分子克隆 

1、突变基因osehd4位点的定位 

利用水稻晚抽穗突变体ehd4与抽穗正常的野生型水稻品种培矮Kita-ake进行正反杂交，得到的F₂群体进行遗传分析，结果表明ehd4的晚抽穗表型由隐性单基因控制。从ehd4突变体与9311衍生的BC₁F₂群体（25,000株）中，选取了871个晚抽穗隐性单株用于该突变体基因精细定位（图1）。2007年夏在中国农业科学院作物科学研究所网室种植，在抽穗时期鉴定表型，同时取样提取DNA。从BC₁F₂群体中随机挑出12个极端晚抽穗隐性单株和12个正常抽穗单株，用候选标记对这个小群体进行PCR扩增，而后分析候选标记与突变位点的连锁关系。发现位于第3染色体中部的SSR标记引物RM14282、RM14308（RM系列引物公知公用，见网站www.gramene.org）与突变基因连锁。进一步利用水稻基因组数据挖掘和设计了5对SSR和indel引物，编号为RM14286，EJ-4，EJ-5,RM6439，和RM14302随后将目的基因定位到物理距离为103kb的区间内（图2）。 

表1用于本发明精细定位及分子标记辅助选择的引物 

利用基因分析与预测软件（www.softberry.com）对这103kb区间进行基因预测，发现有16个开放阅读框（Open reading frame，ORFs），我们对这16个候选基因进行测序后发现一个为锌指蛋白（zinc finger）基因发生了突变，我们把它称为OsEHD4（LOC_Os03g02160）。 

2、突变基因osehd4的克隆 

用RT-PCR的方法，引物为SEQ ID NO.21，SEQ ID NO.22；将野生型OsEHD4和突变体osehd4目的基因区域编码区cDNA扩增出来，直接回收，并重复测序，然后用DNAstar分析软件进行比对分析。RT-PCR扩增程序如下:94℃2min,98℃10s,59℃30s,72℃3min,共35个循环，最后72℃延伸7min，4℃，Pause。 

序列分析发现，扩增出野生型OsEHD4基因的编码区cDNA（也称野生型OsEHD4基因）和扩增出突变体osehd4基因的编码区cDNA（也称突变基因osehd4)，进行比对，发现两者之间在第1外显子上存在单碱基差异，由第22位氨基酸的突变位点由色氨酸Trp（TGG）突变为终止密码子(TAG)，造成基因翻译提前终止，OsEHD4基因和突变体osehd4基因的全序列分别见SEQ ID NO.1,SEQ ID NO.3。 

3、突变基因osehd4、野生型OsEHD4基因的序列信息与特性分析 

野生型OsEHD4基因的编码区cDNA编码区为2499bp，序列见SEQ ID NO.2，编码832个氨基酸的93kDa蛋白，C端具有30个氨基酸的CCCH domain。通过搜索水稻基因组数据库，结果表明野生型OsEHD4基因为单拷贝基因，由3个外显子，2个内含子组成。仅野生型OsEHD4基因的CCCH domain与高等植物或动物等具有较高的同源性。其余部位未发现稻属以外的同源蛋白。 

突变基因osehd4在第1个外显子上发生单碱基突变，其他的序列信息及特性与野生型OsEHD4基因相同。 

4、突变基因osehd4，野生型OsEHD4基因的表达分析 

应用定量RT-PCR方法，引物为SEQ ID NO.25，SEQ ID NO.26；比较了突变基因osehd4和野生型OsEHD4基因的表达水平，结果表明，突变基因osehd4和野生型OsEHD4基因在根、茎、叶和穗中都表达，且在突变体和野生型之间没有差异。不同光周期处理条件和不同发育时期，突变体植株体内的突变基因osehd4和野生型植株体内野生型OsEHD4基因的表达也没有差异。这些结 果表明osehd4基因与OsEHD4基因组成性表达特性，且单碱基突变并不影响突变基因osehd4在ehd4突变体内的稳态表达。 

实施例2锌指蛋白基因OsEHD4(即野生型OsEHD4基因）的转基因应用试验及锌指蛋白基因突变基因osehd4的功能验证 

（一）含有OsEHD4编码区cDNA表达载体的构建 

用Pst I酶切潮霉素抗性表达载体pCUbi1390(中国农科院生物所路铁钢研究员提供；中国农科院博士论文，彭昊，2005)，回收载体片段，备用；以PCR介导在野生型EHD4基因cDNA序列两端分别加入重组接头（接头引物序列为SEQ ID NO.23，SEQ ID NO.24）重组接入pCUbi1390载体，测序确认，载体图谱如图3所示。 

（二）农杆菌介导转化 

以农杆菌菌株EHA105为介导，将上述构建的野生型OsEHD4基因重组载体导入具有osehd4突变基因受体材料ehd4突变体（该品系是由晚抽穗突变体ehd4与野生型Kitaa-ke杂交，然后经过3代回交，5代自交得到的粳稻品系，经分子鉴定含有突变基因osehd4)： 

（1）28℃培养含重组OsEHD4的农杆菌16hr，收集菌体，并稀释到含有100μmol/L的N6液体培养基中至浓度为OD₆₀₀≈0.5，获得菌液； 

（2）将培养至一个月的水稻成熟胚胚性愈伤组织与上述菌液混合侵染30min，滤纸吸干菌液后转入共培养培养基（N6固体共培养培养基，Sigma公司购买）中，24℃共培养3天； 

（3）将上述愈伤接种在含有150mg/L潮霉素B（Sigma公司购买）的N6固体筛选培养基上第一次筛选16天； 

（4）挑取健康愈伤转入200mg/L潮霉素B的N6固体筛选培养基上第二次筛选，每15天继代一次； 

（5）挑取抗性愈伤转入含有150mg/L潮霉素B的分化培养基上分化； 

（6）分化成苗的再生水稻植株即为所获得的OsEHD4基因的转基因植株。 

（三）转基因植株分子鉴定及osehd4基因功能验证 

野生型锌指蛋白基因OsEHD4的转基因植株，经PCR分子检测(引物为SEQ ID NO.19，SEQ ID NO.20)、T₁代分离实验及恢复表型植株抽穗期分析，证实了锌指蛋白基因OsEHD4转化成功(见图2E)。其表型为转基因前的晚抽穗（osehd4基因为隐性基因）转变为转基因后的正常抽穗（OsEHD4基因为显性基因）。验证了转基因前的晚抽穗性状是由osehd4基因控制的。 

本领域技术人员熟知，osehd4突变基因的转基因应用方法同本实施例野生型OsEHD4的转 基因应用方法。用转基因的方法将该突变基因转移到野生型材料中，获得含有OsEHD4/osehd4杂合基因型，具有较野生型晚抽穗的材料，利用这种半显性突变，可以定向调节目的品种的抽穗期。 

本发明所涉及公知公用品种如下： 

水稻晚抽穗突变体（ehd4)（公知公用品种，粳稻品种Kita-ake） 

9311（公知公用品种，籼稻品种）。 

Claims (4)

1.一个控制水稻抽穗期基因OsEHD4，它来自水稻，长度为8707bp，相应编码CCCH类锌指蛋白的832个氨基酸，其全序列为SEQ ID NO.1，其CDS序列如SEQ ID NO.2所示。

2.权利要求1所述的控制水稻抽穗期基因OsEHD4在水稻品种改良中的应用。

3.权利要求1所述的控制水稻抽穗期基因的突变基因osehd4，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其CDS序列如SEQ ID NO.4所示。

4.权利要求3所述的控制水稻抽穗期基因的突变基因osehd4在水稻品种改良中的应用。

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