CN110922461B

CN110922461B - 水稻耐旱相关转录因子OsAE10及其编码基因和应用

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Publication number: CN110922461B
Application number: CN201911246830.1A
Authority: CN
Inventors: 赵宝存; 赵慧; 赵利利; 王聪; 宋芳媛; 张嫒媛
Original assignee: Hebei Normal University
Current assignee: Hebei Normal University
Priority date: 2019-12-08
Filing date: 2019-12-08
Publication date: 2022-04-08
Anticipated expiration: 2039-12-08
Also published as: CN110922461A

Abstract

本发明属于基因工程及作物育种技术领域，具体涉及一种水稻耐旱相关转录因子OsAE10及其编码基因和应用。所述水稻转录因子OsAE10，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。OsAE10过表达提高了转基因水稻在不同发育时期的耐旱性，同时改善了耐逆相关的生理指标。因此，在水稻中提高OsAE10基因的表达量，可以上调其下游耐旱相关基因的表达量，提高了植株的耐旱性，提高水稻在干旱条件下的生长状态，因此OsAE10基因可用于农作物耐旱品种的培育。

Description

水稻耐旱相关转录因子OsAE10及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于基因工程及作物育种技术领域，具体涉及一种水稻耐旱相关转录因子OsAE10及其编码基因和应用。

背景技术

AP2/ERF家族是高等植物中广泛存在的一大类转录因子。转录因子家族在植物生长，发育和对环境胁迫的响应中起着重要作用。

玉米AP2/ERF转录因子ZmRAP2.7，参与了支柱根的发育。

在拟南芥的根老化和伤口对根再生的研究发现，AP2/ERF转录因子ABR1和ERF109被伤口迅速诱导，作为伤口信号诱导植物生长素的生物合成，促进根的再生。

水稻的一个AP2/ERF转录因子HL6在毛状体萌发中起关键调节作用，控制水稻中的毛状体形成。

苜蓿(Medicago sativa L.)中鉴定了159个ERF基因，其中多个ERF基因对盐，干旱和低温胁迫有响应。

水稻冷胁迫下的转录组分析发现，多个ERF转录因子响应了冷冻胁迫。

拟南芥(Arabidopsis thaliana)的AP2/EREBP家族的RAP2.6基因具有响应非生物胁迫的功能，能够提高转基因植株对ABA的敏感性和种子萌发及生长阶段对非生物胁迫的耐受性。

综上所述，植物中ERF类转录因子是植物应对各种胁迫的重要转录因子家族。在水稻(Oryza sativa)中已经发现139个ERF转录因子家族成员，其中大多成员的功能没有被鉴定。

发明内容

本发明的目的是提供水稻耐旱相关转录因子。

本发明的再一目的是提供编码上述水稻耐旱相关转录因子的基因。

本发明的再一目的是提供含编码上述水稻耐旱相关转录因子的基因的重组载体。

本发明的目的在于提供一种上述水稻耐旱相关转录因子的基因应用。

根据本发明的水稻转录因子OsAE10，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示：MCGGAILAELIPSAPAARRVTAGHVWPGDANKAKKKGARADDFEAAFRDFDNDSDDEEMMVEEAEEEEATSEHKPFVFRAKKAAAAASSRRRKPAQYRGVRRRPWGKWAAEIRDPVKGIRVWLGTFTNAEAAALAYDDAARAIRGDRAKLNFPSATTPDTRKRGRATAAAAPAVKATPVINLVEEEDEEEVAAAMASIKYEPETSESSESNALPDFSWQGMSASDEFAVAAAALSLDSDDDLAKKRPRTEPEDTTDSGSGDDTDALFDALLFADQYNHFNGGAYESLDSLFSADAVQTTAAAAAADQGMGLWSFDDGCCLVDVEASLSF。

根据本发明的水稻转录因子OsAE10的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示：

ATGTGCGGCGGAGCGATCCTTGCGGAGCTCATACCGAGCGCGCCGGCGGCGAGGCGCGTCACGGCGGGC CACGTCTGGCCGGGCGACGCCAACAAGGCCAAGAAGAAGGGCGCGCGCGCCGACGACTTCGAGGCCGCGTTCCGCGA CTTCGACAACGACTCCGATGACGAGGAGATGATGGTGGAGGAGGCGGAGGAGGAGGAGGCGACCTCCGAGCACAAGC CGTTCGTCTTCCGCGCCAAGAAGGCGGCGGCGGCGGCGTCGAGCAGGCGCAGGAAGCCGGCGCAGTACAGGGGCGTG CGGCGCCGGCCGTGGGGGAAGTGGGCGGCGGAGATCCGCGACCCCGTCAAGGGCATCCGCGTCTGGCTCGGCACCTT CACCAACGCCGAGGCCGCCGCGCTCGCCTACGACGACGCCGCGCGCGCCATCCGCGGGGACAGGGCCAAGCTCAACT TCCCTTCCGCTACCACCCCTGACACCCGCAAGCGCGGCCGCGCCACCGCCGCCGCCGCCCCGGCCGTCAAGGCGACC CCGGTCATCAACCTCGTCGAGGAGGAGGACGAGGAGGAGGTCGCCGCCGCCATGGCGTCCATCAAGTACGAGCCCGA GACCAGCGAGAGCTCCGAGTCGAACGCCCTCCCGGACTTCTCCTGGCAGGGCATGTCGGCCTCCGACGAGTTCGCCG TCGCCGCGGCGGCGCTGTCGCTCGACAGCGACGACGACCTCGCCAAGAAGCGTCCGAGGACCGAGCCGGAGGACACC ACCGACTCCGGCTCCGGCGACGACACCGACGCGCTGTTCGACGCGCTGCTGTTCGCCGACCAGTACAACCACTTCAA CGGCGGCGCCTACGAGTCCCTGGACAGCCTGTTCAGCGCCGACGCCGTGCAGACCACCGCCGCCGCCGCCGCCGCCG ACCAGGGCATGGGGCTCTGGAGCTTCGACGACGGCTGCTGCCTCGTCGACGTCGAGGCCAGCTTGTCCTTCTAG

该基因的编码框内没有内含子，包含全长蛋白的编码序列)。

根据本发明的具体实施方式，从野生型日本晴水稻基因组中克隆了一个OsAE10基因，编码的蛋白序列全长329个氨基酸。OsAE10基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

根据本发明的具体实施方式，通过实验证实该OsAE10基因受干旱和ABA的诱导表达；OsAE10蛋白具有转录激活活性，定位在细胞核里，是ERF亚家族转录因子；OsAE10过表达调节了转基因水稻的生理指标，提高了转基因水稻幼苗期和分蘖期的耐旱性。证明OsAE10基因上调表达提高了转基因水稻对干旱的耐受性，这对解释水稻的耐旱机制和培育耐旱作物具有重要意义。

本发明取得的有益效果如下：

本发明克隆了一个AP2/EREBP家族中的ERF亚家族的转录因子OsAE10基因。

实验证明OsAE10受20％PEG和5μM ABA的诱导表达，OsAE10定位在细胞核里，具有转录激活活性，是一个响应非生物胁迫的ERF类转录因子。

对过表达转基因水稻不同发育阶段的耐旱性检测发现，OsAE10上调表达提高了转基因水稻在萌发阶段、幼苗期及分蘖期的耐旱性，表明OsAE10参与了水稻的耐旱过程。

OsAE10过表达调节了转基因水稻的耐旱相关的生理指标，推测该基因通过脯氨酸进行渗透调节，减少膜脂质的氧化胁迫，减小气孔的开度来提高植株的耐旱性。

OsAE10过表达提高了转基因水稻在不同发育时期的耐旱性，同时改善了耐逆相关的生理指标。因此，在水稻中提高OsAE10基因的表达量，可以上调其下游耐旱相关基因的表达量，提高了植株的耐旱性，提高水稻在干旱条件下的生长状态，OsAE10基因可用于农作物耐旱品种的培育。

附图说明

图1显示本发明的水稻OsAE10基因在干旱和ABA处理下的表达量变化；

图2显示本发明的水稻OsAE10蛋白的亚细胞定位；

图3显示本发明的水稻OsAE10蛋白的转录激活活性鉴定；

图4显示对本发明获得的OsAE10过表达转基因水稻的分子鉴定；

图5显示本发明的OsAE10转基因水稻在干旱条件下的萌发率；

图6显示本发明的OsAE10转基因水稻在幼苗期的耐旱性鉴定；

图7显示本发明的OsAE10转基因水稻在分蘖期的耐旱性鉴定；

图8显示本发明的OsAE10基因过表达对耐旱相关的不同生理指标的影响。

具体实施方式

实验材料：供试植物材料为野生型水稻(Oryza sativa)日本晴(Nipponbare)和OsAE10过表达转基因水稻。

供试菌种：大肠杆菌DH5α菌种、农杆菌EHA105菌种、酵母菌AH109。

实施例1 OsAE10基因的表达受干旱和ABA诱导表达

一、OsAE10基因在不同处理条件下的表达模式分析

对野生型水稻分别进行20％PEG和5μM ABA处理，分别取处理0h，1h，6h和24h时的叶片为材料，用Trizol分别提取不同材料的总RNA，反转录后进行定量PCR分析，检测OsAE10的转录水平。用于检测OsAE10基因的引物序列如下：正向引物为:5′-TCAACTTCCCTTCCGCTACCAC-3′；反向引物为:5′-ACCTCCTCCTCGTCCTCCTCCT-3′。用于检测内参基因(actin)的表达量的引物为：正向引物为:5′-TGGCATCTCTCAGCACATTCC-3′；反向引物为:5′-TGCACAATGGATGGGTCAGA-3′。OsAE10基因在不同处理条件下的表达模式见图1。结果表明，OsAE10基因在20％PEG处理6h时，上调倍数达到1.9倍；而在5μM ABA处理后先下调表达，在处理6h时表达量上调至对照的3.4倍。可见，OsAE10的表达受干旱和ABA诱导表达，是一个响应干旱胁迫的耐逆相关基因。

实施例2 OsAE10基因的克隆及其编码蛋白的转录因子特征分析

一、OsAE10基因的克隆

设计PCR引物序列，正向引物为：5′-GCAAAAGAAAAGCAGCAAC-3′，反向引物为：5′-AAGGAACCAGGACGAACAC-3′，以实施例1中用于定量实验的干旱胁迫6h的cDNA为模板，按照常规PCR程序，进行RT-PCR扩增，对扩增产物进行电泳，回收、加A，与T-载体连接后转化大肠杆菌DH-5α，筛选阳性克隆后进行测序，获得测序正确的克隆命名为pT-OsAE10，完成基因克隆。

二、OsAE10蛋白定位于细胞核里

构建OsAE10与GFP融合表达载体p1300-OsAE10::GFP，将p1300-OsAE10::GFP质粒与对照p1300-GFP分别转化农杆菌，分别获得阳性菌后进行摇培，集菌后分别注射烟草表皮细胞，注射后培养40-48h内取叶片进行confocal观察。结果发现，转化p1300-GFP的烟草表皮细胞的细胞核和细胞膜中都有绿色荧光，而转化p1300-OsAE10::GFP的烟草中只在细胞核中发现绿色荧光(图2)，证明OsAE10蛋白定位在细胞核中。

三、OsAE10蛋白具有转录激活活性

pGBKT7-OsAE10质粒构建成功后转化酵母菌AH109，获得转化成功的酵母菌后，分别挑取5-6个克隆，分别用超纯水悬浮，并梯度稀释至10倍、100倍，分别取不同的悬浮液各2μL点在SD/Trp-/His-培养基上，于28℃培养箱静置培养3d后观察结果。以pGBKT7空载体的转化结果做为对照。结果显示，pGBKT7和pGBKT7-OsAE10转化的酵母菌均能在SD/Trp-培养基上正常生长；在SD/Trp-/His-培养基上pGBKT7的转化子不能生长，而pGBKT7-OsAE10的转化子则能正常生长。同时分别将一缺培养基上生长2d的包含质粒pGBKT7或pGBKT7-OsAE10的酵母菌液点于干净滤纸上，经液氮冻融裂解后进行X-gal显色反应。结果表明，含pGBKT7的酵母菌没有被染蓝，而含pGBKT7-OsAE10的酵母菌被染蓝了，表明OsAE10蛋白成功激活报告基因His和LacZ的表达(图3)。上述结果表明OsAE10蛋白在酵母中具有转录激活活性。

综合实验一、二和三的结果表明，本发明克隆了OsAE10基因，其编码蛋白是定位在细胞核里的、具有转录激活活性的转录因子。

实施例3 OsAE10基因的耐旱功能鉴定

构建pMDC32-OsAE10过表达载体，转化农杆菌EHA105；得到鉴定正确的转化子后，分别转化日本晴水稻，获得转基因水稻植株。分别对获得的不同转基因株系水稻进行DNA和RNA水平鉴定(图4)后培养3-4代，获得转基因纯合株系用于下列实验。

一、胁迫条件下OsAE10过表达转基因水稻种子的萌发率检测

将野生型和不同OsAE10过表达株系的种子消毒后点种到1/2MS0、1/2MS+20％PEG及1/2MS+3μM ABA的培养基上进行萌发，并统计萌发率。结果发现，在1/2MS0的培养基上，野生型水稻和OsAE10过表达株系的种子的萌发率基本上一致；而在含20％PEG和ABA的培养基上，OsAE10过表达株系的种子萌发率远远高于野生型的萌发率(图5)。

二、OsAE10过表达转基因水稻幼苗的耐旱性检测

将萌发后正常生长3d的OsAE10过表达转基因水稻株系和野生型日本晴水稻幼苗转移到含20％PEG的1/2MS培养基上进行处理，7d后对水稻地上部分的长度进行测量并统计数据。结果表明，1/2MS培养基上的对照组中3个OsAE10过表达转基因株系与野生型日本晴的地上部分的长度没有显著差异；20％PEG处理后，3个OsAE10过表达转基因株系的株高均高于野生型日本晴的。上述实验结果表明OsAE10基因的上调表达增强了转基因水稻幼苗对干旱胁迫的耐受性(图6)。

三、OsAE10过表达转基因水稻分蘖期耐旱性检测

将不同株系的水稻萌发7d后，选取长势一致的幼苗转移到花盆中，移栽时将转基因株系和野生型对照的幼苗种在同一个花盆中。在温室正常培养30d后停止浇灌进行旱处理，随时观察表型。结果表明，旱处理15d后，日本晴水稻茎部和叶片枯萎、变黄，OsAE10过表达转基因水稻幼苗的叶片更绿，更挺拔(图7)。上述实验表明OsAE10基因上调表达提高了转基因水稻在分蘖期的耐旱性。

综合实验一、实验二和实验三的结果，表明OsAE10基因上调表达提高了转基因水稻的耐旱性，是水稻耐旱的正调节子。

实施例4 OsAE10过表达改善了细胞的耐逆相关生理指标

对旱胁迫处理3d的不同水稻株系为材料，进行了叶绿素含量、脯氨酸含量、丙二醛含量、DAB染色、不同开度气孔的统计及失水率等耐逆相关生理指标的检测，检测结果显示，旱处理条件下，过表达转基因水稻株系的叶绿素含量、脯氨酸含量(图8中的A和B)和全闭气孔的比率(图中的8E)均高于野生型日本晴的相应指标，丙二醛的含量(图8中的C)和失水率(图8中的F)却低于日本晴的；而且，OsAE10过表达转基因水稻的DAB染色的颜色比野生型水稻的浅(图8)，表明过表达植物的过氧化物清除能力比野生型强(图8中的D)。可见，旱胁迫后的生理指标测定的数据与表型结果一致，表明OsAE10上调表达导致了转基因植物在生理水平发生综合改变，提高了水稻的耐旱能力。

由此可见，OsAE10基因提高了转基因水稻在旱胁迫条件下的叶绿素含量和脯氨酸含量，降低了转基因水稻的丙二醛含量，提高了细胞对过氧化物的清除能力及胁迫条件下全闭气孔的比率，降低了转基因水稻的失水率。上述实验结果从表型和生理水平证明了OsAE10基因上调表达提高了转基因植物对干旱的耐受性，对解释水稻耐旱机制和培育耐旱作物具有重要意义。

序列表

<110> 河北师范大学

<120> 水稻耐旱相关转录因子OsAE10及其编码基因和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 329

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 1

Met Cys Gly Gly Ala Ile Leu Ala Glu Leu Ile Pro Ser Ala Pro Ala

1 5 10 15

Ala Arg Arg Val Thr Ala Gly His Val Trp Pro Gly Asp Ala Asn Lys

20 25 30

Ala Lys Lys Lys Gly Ala Arg Ala Asp Asp Phe Glu Ala Ala Phe Arg

35 40 45

Asp Phe Asp Asn Asp Ser Asp Asp Glu Glu Met Met Val Glu Glu Ala

50 55 60

Glu Glu Glu Glu Ala Thr Ser Glu His Lys Pro Phe Val Phe Arg Ala

65 70 75 80

Lys Lys Ala Ala Ala Ala Ala Ser Ser Arg Arg Arg Lys Pro Ala Gln

85 90 95

Tyr Arg Gly Val Arg Arg Arg Pro Trp Gly Lys Trp Ala Ala Glu Ile

100 105 110

Arg Asp Pro Val Lys Gly Ile Arg Val Trp Leu Gly Thr Phe Thr Asn

115 120 125

Ala Glu Ala Ala Ala Leu Ala Tyr Asp Asp Ala Ala Arg Ala Ile Arg

130 135 140

Gly Asp Arg Ala Lys Leu Asn Phe Pro Ser Ala Thr Thr Pro Asp Thr

145 150 155 160

Arg Lys Arg Gly Arg Ala Thr Ala Ala Ala Ala Pro Ala Val Lys Ala

165 170 175

Thr Pro Val Ile Asn Leu Val Glu Glu Glu Asp Glu Glu Glu Val Ala

180 185 190

Ala Ala Met Ala Ser Ile Lys Tyr Glu Pro Glu Thr Ser Glu Ser Ser

195 200 205

Glu Ser Asn Ala Leu Pro Asp Phe Ser Trp Gln Gly Met Ser Ala Ser

210 215 220

Asp Glu Phe Ala Val Ala Ala Ala Ala Leu Ser Leu Asp Ser Asp Asp

225 230 235 240

Asp Leu Ala Lys Lys Arg Pro Arg Thr Glu Pro Glu Asp Thr Thr Asp

245 250 255

Ser Gly Ser Gly Asp Asp Thr Asp Ala Leu Phe Asp Ala Leu Leu Phe

260 265 270

Ala Asp Gln Tyr Asn His Phe Asn Gly Gly Ala Tyr Glu Ser Leu Asp

275 280 285

Ser Leu Phe Ser Ala Asp Ala Val Gln Thr Thr Ala Ala Ala Ala Ala

290 295 300

Ala Asp Gln Gly Met Gly Leu Trp Ser Phe Asp Asp Gly Cys Cys Leu

305 310 315 320

Val Asp Val Glu Ala Ser Leu Ser Phe

325

<210> 2

<211> 990

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 2

atgtgcggcg gagcgatcct tgcggagctc ataccgagcg cgccggcggc gaggcgcgtc 60

acggcgggcc acgtctggcc gggcgacgcc aacaaggcca agaagaaggg cgcgcgcgcc 120

gacgacttcg aggccgcgtt ccgcgacttc gacaacgact ccgatgacga ggagatgatg 180

gtggaggagg cggaggagga ggaggcgacc tccgagcaca agccgttcgt cttccgcgcc 240

aagaaggcgg cggcggcggc gtcgagcagg cgcaggaagc cggcgcagta caggggcgtg 300

cggcgccggc cgtgggggaa gtgggcggcg gagatccgcg accccgtcaa gggcatccgc 360

gtctggctcg gcaccttcac caacgccgag gccgccgcgc tcgcctacga cgacgccgcg 420

cgcgccatcc gcggggacag ggccaagctc aacttccctt ccgctaccac ccctgacacc 480

cgcaagcgcg gccgcgccac cgccgccgcc gccccggccg tcaaggcgac cccggtcatc 540

aacctcgtcg aggaggagga cgaggaggag gtcgccgccg ccatggcgtc catcaagtac 600

gagcccgaga ccagcgagag ctccgagtcg aacgccctcc cggacttctc ctggcagggc 660

atgtcggcct ccgacgagtt cgccgtcgcc gcggcggcgc tgtcgctcga cagcgacgac 720

gacctcgcca agaagcgtcc gaggaccgag ccggaggaca ccaccgactc cggctccggc 780

gacgacaccg acgcgctgtt cgacgcgctg ctgttcgccg accagtacaa ccacttcaac 840

ggcggcgcct acgagtccct ggacagcctg ttcagcgccg acgccgtgca gaccaccgcc 900

gccgccgccg ccgccgacca gggcatgggg ctctggagct tcgacgacgg ctgctgcctc 960

gtcgacgtcg aggccagctt gtccttctag 990

Claims

1. 水稻转录因子OsAE10用于提高植物的耐旱性的应用，其中，所述植物为水稻，所述水稻转录因子OsAE10的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.一种提高植物耐旱性的方法，其特征在于，在所述植物中过表达水稻转录因子OsAE10的基因，其中，所述植物为水稻，所述水稻转录因子OsAE10的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。