CN102311958B - 油菜光合作用相关基因BnGLK1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了油菜光合作用相关基因BnGLK1及其应用。本发明中所使用的BnGLK1基因是下列核苷酸序列之一：1)序列表中BnGLK1的DNA序列如SEQ ID NO.1所示或与序列表中SEQ ID NO.1限定的DNA序列具有70％以上同源性DNA序列。2)BnGLK1蛋白序列是具有序列表中SEQ ID NO.2氨基酸残基序列或是将SEQ ID NO.2中的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代缺失或添加且具有与SEQ ID NO.2的序列相同活性的衍生蛋白质。利用拟南芥作为受体的转基因结果证实，BnGLK1基因的过量表达提高了植物的光合效率，进而提高了拟南芥种子中的含油量。因此光合作用相关基因BnGLK1在油菜及其他油料作物的含油量育种中具有很好的应用前景。

Description

油菜光合作用相关基因BnGLK1及其应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体地说，本发明涉及一种油菜光合作用相关基因BnGLK1。本发明提供了该基因的核苷酸序列、蛋白序列及其同源序列，同时还涉及该基因在作物含油量育种中的用途。

背景技术

油料作物生产不仅在国民经济和社会发展中占有重要地位，也是促进中国农业可持续发展的主要因素之一。目前中国的植物油生产量仅能满足国内1/2-2/3的消费需求，大量依赖进口，是世界上最大的油料进口国。油菜是中国最主要的油料作物之一，菜籽油在中国的食用油约占40％。中国油菜年种植面积700万公顷，菜籽产量超过1,000万吨，面积和总产均为世界第一位，分别占全世界的1/3。目前经过几代育种学家的努力，通过传统育种途径已经使油菜单产提高了许多，进一步通过传统育种途径大幅度提高产量的难度很大。但中国的菜籽比其它国家生产的含油量低，长江流域油菜质量普查结果显示，2004年油菜商品籽含油量为39.1％，比同年加拿大商品籽(42.6％)的低3.5个百分点。因此，大幅提高中国油菜含油量成为油菜育种的主要目标，也是解决中国对菜籽油需求量增加最有效的途径之一。油菜种子含油量属数量性状，其遗传受微效多基因控制，并且环境影响很大，在传统育种方法上有一定难度。现在人们越来越多地把重点放在含油量相关功能基因的分离上，并利用这些基因进行相关的基因工程品种改良争取从根本上改善种子的品质，提高油含量。

脂肪酸和油脂的生物合成途径在植物体内研究的已较为透彻，从不同物种中已经有相当多的相关基因得到分离和鉴定，研究也表明不同物种脂肪酸和油脂合成的化学途径基本上是相同的(Lung and Weselake 2006，Snyder 2009)。种子油脂合成的主要前体包括乙酰辅酶A，NAD(P)H和ATP。这些合成前体的来源和调控直接影响油脂积累的速率和数量(Voelker 2001)。它们的来源也一直被重点研究，但由于代谢途径的复杂性和冗余性，它们的具体来源仍还存在许多争议(Rawsthorne 2002)。乙酰辅酶A是所有脂肪酸碳骨架合成的最初底物，同样也是许多细胞代谢的重要中间产物，在细胞中大量合成也大量消耗。叶绿体内的丙酮酸脱氢酶，乙酰辅酶A合成酶，肉碱乙酰转移酶以及细胞质的ATP柠檬酸裂合酶都有可能参与了乙酰辅酶A的合成(Neuhaus and Emes 2000)。Schwender等(2004)的研究证明油菜油脂合成所需的丙酮酸并不像以前所认为的全部是通过糖酵解途径产生，而是核酮糖二磷酸羧化酶(Rubisco)在菜籽中独立于Calvin循环(光合作用的暗反应)发挥作用，使从胚珠光合作用产物中制造的脂肪酸更多，暗示CO2在油脂合成过程可能也起着很重要的前体作用。脂肪酸合成所需的ATP和NAD(P)H，在光照条件下一般认为是由光反应提供(Ruuska等2004)，但也存在一定争议，如Eastmond(1998)证明在脂肪酸合成中所需ATP和NAD(P)H仅靠光的贡献是不够的，还需要从细胞质中获得。在黑暗中及缺乏叶绿体的组织中，磷酸戊糖氧化途径是还原态NAD(P)H最有可能的来源，但也有研究表明同时还需要其他几个途径如糖酵解等才能提供足够的还原力(Schwender等2003)。最近在油菜和拟南芥中的研究结果显示，种子内的光合作用对含油量的贡献率在40％左右(Fernando 2005，Setsuko 2008)。而对磷酸戊糖途径的抑制反而增加了种子的含油量，表明相对于其提供用于脂肪酸合成的还原力NADPH，抑制磷酸戊糖途径来增加碳源可以更有效的增加油脂含量(Setsuko 2008)。

虽然单一的改变脂肪酸和油脂合成途径中的一系列酶如ACCase，GPAT，DGAT等可以调控含油量的变化(Roesler 1997，Jain 2000，Weselake 2008，Zheng2008)，但也有一些基因能够在代谢途径的上游位置以一种更有效的方式来对脂肪酸和油脂的合成进行整体的调控。最近研究表明，植物胚胎发育相关的转录因子通过影响一系列的生化途径包括糖酵解、脂肪酸代谢、蛋白质合成等中的众多酶类，来调控种子成熟过程中储藏产物的增加(Gutierrez 2007，Verdier andThompson 2008，Santos 2008)。通过对模式植物拟南芥突变体的筛选，鉴定了一系列调控种子油脂积累的转录因子如LEC1、LEC2、WRI1、GLABRA2等(Shen 2006，Baud 2007b，Mu 2008)。然而，由于多数转录因子的功能丰余性增加了研究其调控油脂含量的复杂性，目前为止仍有一些转录因子的作用机制未知(To 2008，Gao 2009)。

上述植物种子含油量的研究多是以种子作为研究对象，重点集中在种子内脂肪酸合成代谢及早期胚胎发育两个方面。通过本实验室对油菜多年的研究结果表明，油菜种子含油量主要由母体基因型控制。针对高低油油菜品系的正反交种子的含油量测定表明，母体效应对含油量的影响占84％，而花粉直感效应仅为16％。由于正反交种子基因型相同，而角果皮是油菜角果成熟期最重要的源器官，多项生理生化数据表明角果皮光合作用效率与种子含油量具有正相关关系。而根据高低油材料的基因差异表达分析及F2群体的含油量QTL定位，我们选择了一个光合作用相关基因BnGLK1作为影响含油量的候选基因作进一步分析。

GLK(Golden2-like)基因编码GARP核转录因子，目前在玉米、拟南芥及绿藻等植物中被发现。GLK基因调节叶绿体的发育，具有两个同源基因GLK1和GLK2。在拟南芥和苔藓中两个GLK基因是功能冗余的，只有glk1、glk2的双突变体才出现一定的表型。拟南芥双突变体叶片为淡绿色，叶肉细胞的叶绿体较小，且类囊体膜分散难以形成叶绿体基粒。与发育异常的叶绿体一致，双突变体的蛋白尤其是核编码的光合作用相关的基因大量减少，从而导致植株光合效率下降。

目前已从拟南芥、玉米、绿藻等植物中分离到光合作用相关基因GLK1基因。但在本发明申请之前，国内没有人公开或发表过关于油菜BnGLK1基因和蛋白序列，同时也无该类基因用于调控油菜种子含油量的相关报道。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种油菜光合作用相关基因BnGLK1序列。本发明中所使用的光合作用相关基因BnGLK1是包括SEQ ID NO.1的DNA序列或与序列表中SEQ ID NO.1限定的DNA序列具有70％以上同源性序列，也包括在添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而产生的突变体等位基因或衍生物。

本发明的另一个目的是在于提供了一类油菜光合作用相关基因BnGLK1在调控植物种子(如拟南芥和油菜)含油量中的应用。

为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术措施：

油菜BnGLK1的获得：

1)在NCBI数据库中检索已发表的拟南芥GLK1基因序列(At2g20570)，并以此编码区序列BLAST NCBI EST数据库，寻找与之同源的油菜GLK1基因的EST序列，并设计基因编码序列的两侧引物(BnGLK1正向引物：[5’-ATGTTAGCTCTCTCTCCGG-3’]，反向引物：[5’-TCAGGCACAAGRCGCGGTC-3’])。

2)以油菜cDNA第一链为模板进行RT-PCR扩增，将扩增得到的片段进行测序，获得油菜GLK1基因序列，一种油菜基因BnGLK1(一种DNA分子)，其碱基序列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。该基因的氨基酸序列由核苷酸序列推导而来，一种编码油菜BnGLK1蛋白，其序列为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

通过上述方法获得了油菜光合作用相关基因BnGLK1基因，采用一种提高某基因表达活性的转基因拟南芥，其特征在于转基因植物表现为BnGLK1基因表达量增加。

其具体技术措施是：

提供了一种PCR8/GW/TOPO质粒(invitrogen公司，商业途径获得)，可以与表达载体质粒重组构建基因表达质粒。

提供了一种质粒表达载体Pearleygate100(invitrogen公司，从商业途径获得)，它含有35S启动子和翻译控制件。

提供了一种可在植物中表达的宿主菌，农杆菌(根癌农杆菌GV3101，invitrogen公司，商业途径获得)。

本发明提供了一种能够过量表达BnGLK1转基因拟南芥的方法，其特征在于拟南芥中BnGLK1含量增加。一种油菜基因BnGLK1，其应用过程包括下列步骤：

1)将克隆得到的油菜BnGLK1分别与PCR8/GW/TOPO质粒连接，命名为topo-BnGLK1，利用PCR8/GW/TOPO质粒与质粒表达载体Pearleygate100可以体外重组的特性将BnGLK1转移至表达载体，命名为Pearleygate100-BnGLK1；

2)将步骤1)中制备的载体Pearleygate100-BnGLK1转入根癌农杆菌GV3101，再导入拟南芥植株中；

3)筛选阳性植株。

种植拟南芥T0代所收获的种子，待10天左右喷洒除草剂(Liberty，Invitrogen公司)用于筛选阳性植株，叶片DNA提取后进行PCR鉴定，最终确认基因已导入的阳性植株。

本发明中所用的术语“转基因植物”是指含有导入的基因并能够稳定地增强或抑制所导入的基因表达并产生具有特定的生物学性状的植物。

克隆本发明中所述的获得油菜光合作用相关基因BnGLK1的方法是本领域中所常采用的方法。提取植物叶片DNA是常用的分子生物学技术，提取mRNA的方法也有多种成熟的技术，试剂盒(TRIzol Reagent)可从商业途径获得(Invitrogen公司)，而构建cDNA文库也是常用的分子生物学技术。构建本发明中所述的载体构建和将载体转染入植株所用到的酶切、连接、花序侵染等方法也是本领域中常用技术。其中所涉及的质粒(入门载体PCR8/GW/TOPO，质粒表达载体Pearleygate100)，转染用媒体(如根癌农杆菌GV3101和所用试剂成分如蔗糖、6-BA等)可从商业途径获得。

GLK(Golden2-like)基因编码GARP核转录因子，目前在玉米、拟南芥及绿藻等植物中被发现。GLK基因调节叶绿体的发育，具有两个同源基因GLK1和GLK2。在拟南芥和苔藓中两个GLK基因是功能冗余的，只有glk1、glk2的双突变体才出现一定的表型。拟南芥双突变体叶片为淡绿色，叶肉细胞的叶绿体较小，且类囊体膜分散难以形成叶绿体基粒。与发育异常的叶绿体一致，双突变体的蛋白尤其是核编码的光合作用相关的基因大量减少，从而导致植株光合效率下降。

本发明的优点在于：

本发明是国内外首次公开油菜光合作用相关基因BnGLK1序列，目前该类基因可调控植物种子含油量的功能没有相关报道。利用拟南芥作为受体的转基因结果证实，BnGLK1基因的过量表达提高了植物的光合效率，进而提高了拟南芥种子中的含油量。本发明实验结果表明转BnGLK1基因拟南芥的种子含油量与野生型受体对照相比均有较大幅度的提高(最高可达20％)。因此，本发明提出可利用BnGLK1的过量表达来增强植物光合效率以便用于油料作物的高油品种选育。

附图说明

图1油菜BnGLK1基因编码区序列的克隆，长度为1.4kb左右。

图2植物表达载体示意图

将BnGLK1基因编码区序列与PCR8/GW/TOPO质粒连接后筛选正向载体，获得PCR8/GW/TOPO-BnGLK1，然后PCR8/GW/TOPO-BnGLK1质粒与表达载体Pearleygate100进行重组，并筛选阳性克隆获得Pearleygate100-BnGLK1。

图3BnGLK1转基因株系与野生型对照及glk1、glk2双突变体叶片之间的对比图中可以明显看出与野生型对照及glk1、glk2双突变体叶片相比，转基因株系叶片颜色更深。

具体实施方式

通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)，或Draper等人(Blackwell科学出版社，1988)所述的条件，或按照所用试剂制造厂商所建议的条件。

1.油菜光合作用相关基因BnGLK1的获得

在NCBI数据库中检索已发表的拟南芥GLK1基因序列(At2g20570)，并以此编码区序列BLAST NCBI EST数据库，寻找与之同源的油菜GLK1基因的EST序列，并设计基因编码序列的两侧引物(BnGLK1正向引物：[5’-ATGTTAGCTCTCTCTCCGG-3’]，反向引物：[5’-TCAGGCACAAGACGCGGTC-3’]，用于从油菜中扩增BnGLK1的对应序列。

1、提取油菜mRNA。

RNA的提取(TRIZOL TM Kit提取RNA)

液氮研磨100mg材料

A.加1mlTRIZOL，室温(20-25℃，下同)放置5min。

B.加入200ul氯仿，剧烈振荡30s，室温放置2min。

C.12000g，15min，4℃，取上清至新管中，加入500ul异丙醇，混匀后室温放置15min。

D.12000g，15min，4℃，去上清，加入1ml70％(无水酒精与H20的体积比)乙醇。

E.7500g，7min，4℃，去上清，空气干燥。

F.DEPC-H₂O溶解。

2、cDNA第一链的反转录采用RevertAid H Minus First Strand cDNASynthesis Kit(Fermentas)，操作参照所用试剂盒说明进行。

3、以cDNA为模板进行PCR扩增(见图1)，得到了BnGLK1的cDNA序列，其碱基序列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。对应该核酸序列的蛋白质，其序列为SEQID NO：2所示的氨基酸序列。

2.油菜BnGLK1在调控拟南芥种子含油量中的应用

一种油菜基因BnGLK1，其具体应用过程是：

2.1BnGLK1表达载体的构建及拟南芥的转化

将PCR扩增得到的基因序列与TOPO入门载体(invitrogen公司)连接后，转化到感受态细胞DH5α(invitrogen公司)中，壮观酶素筛选，载体引物(T7引物)与基因引物(基因上游引物)扩增鉴定正向插入克隆，质粒经小量制备后与Pearleygate100(invitrogen公司)进行重组，并转化到感受态细胞DH5α中，卡那霉素筛选，其插入片段经载体引物(35S启动字序列引物)与基因引物(基因下游引物)PCR鉴定，示意图见图2。

拟南芥的转化过程：

试剂配制：渗透培养基(1L)：1/2xMurashige-Skoog；5％(质量比)蔗糖；0.5克MES；用KOH调至pH5.7；再加：10微升1mg/ml的6-BA母液；200微升SilwetL-77

转化步骤：

(1)制备好已转化了相应质粒的农杆菌(根癌农杆菌GV3101)菌液10ml，在转化前一天晚上，转入大瓶培养过夜，第二天取出使用时农杆菌液0.D600当在1.2到1.6之间。

(2)室温5000rpm离心15分钟。

(3)弃上清，将农杆菌沉淀悬浮于相应体积的渗透培养基里，使0.D600在0.8左右。

(4)将整个植株直接浸泡至农杆菌悬浮液30s。

(5)避光培养过夜，然后正常培养至结子。

2.2转基因拟南芥的筛选和验证

转化子的筛选：

将春化过的拟南芥种子种于浇过饱和PNS营养液的人工土中，并用保鲜膜罩上。两天后人工模拟自然条件光照(光照16小时，暗8小时)，三天后揭膜。

人工培养室条件：相对湿度80％，恒温20-240C，光照强度80-200umol/M2/S，光照周期为8h黑暗、16h光照培养。一周左右，喷除草剂筛选阳性植株。

PCR鉴定

(1)用于PCR的转化植株总DNA的提取

A.70％(体积比，下同)乙醇擦洗叶片，称取大约100mg。

B.加入600ul抽提缓冲液(0.2M Tris-Cl，0.25NaCl，25mM EDTA，0.5％SDS，pH 7.5)，室温快速研磨。

C.1.5ml Ependorff管中涡旋混匀5-10s。

D.12000rpm，25min，室温。取上清，加等体积异丙醇，-20摄氏度沉淀过夜。

E.12000rpm，15min，室温。加入70％乙醇200ul泡洗DNA沉淀。

F.12000rpm，15min，室温。去乙醇。倒置于纸巾上，待乙醇挥发干净。

G.加无菌水100ul溶解粗提DNA沉淀。用分光光度计测定或电泳估测其浓度。H.以总DNA为模板，进行PCR。

(2)PCR程序

PCR反应混合液的配比同质粒PCR鉴定，依据植物表达载体中目的基因及其上游35S启动子序列和基因下游引物[5’-TCAGGCACAAGRCGCGGTC-3’]，反应的时间和温度如下：

94℃    3min

94℃    45s，

59℃    45s

72℃    1min 30s，30cycles

72℃    5min

检测结果显示，大多数转化植株均能够扩增出预期大小的电泳条带，而阴性对照则没有，表明转基因拟南芥基因组中已经含有外源基因DNA片段。

2.3拟南芥转基因株系表型分析

叶片光合效率分析：利用野生型拟南芥为受体进行转基因，BnGLK1的过量表达叶片颜色变成深绿色(见图3)。通过对突变体、野生型对照及转基因株系的光合效率测定分析结果表明，过量表达BnGLK1的转基因株系叶片光合效率提高(见表1)，与野生型对照相比增加幅度在40％-130％。

种子含油量测定：通过对光合效率增加的转基因株系种子含油量的测定分析，结果表明与野生型对照相比，增加幅度最高达到20％左右。

表1.转BnGLK1转基因株系叶片光合效率和种子含油量的测定结果

Claims (3)

1.一种油菜基因BnGLK1，其碱基序列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

2.一种油菜基因BnGLK1编码的蛋白，其序列为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

3.权利要求1所述的一种油菜基因BnGLK1在调控拟南芥种子含油量中的应用。

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