ES2202805T3 - Gen de la piruvato deshidrogenasa quinasa de plantas. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere al aislamiento, la purificación, la caracterización y la utilización de un gen mitocondrial (SEQ ID NO:1) (pYA5; ATCC No 209562) de piruvato - deshidrogenada - quinasa (PDHK) de Brassinacea (específicamente Arabidopsis thaliana). La invención se refiere también al ADN aislado y purificado de dicha secuencia y a procedimientos de regulación de la síntesis de ácidos grasos del contenido en aceite de semillas, del peso/dimensión de semillas, del tiempo de floración, del crecimiento vegetativo, de la frecuencia respiratoria y de la duración de generación mediante el gen y a tejidos y plantas transformados mediante dicho gen. La invención se refiere también a tejidos y a semillas de plantas así como a plantas transgénicas que tiene un genoma que contiene una secuencia de ADN introducida de SEQ ID NO:1 o una parte de SEQ ID NO:1 caracterizada porque la secuencia ha sido introducida según una orientación sentido o antisentido, y a procedimientos de producciónde dichas plantas y semillas de plantas. La invención se refiere, además a secuencias de ADN sensiblemente homólogas de plantas, que codifican proteínas con secuencias de aminoácidos deducidas que presentan una identidad de al menos un 25% y una similitud de al menos un 50%, aisladas y/o caracterizadas por procedimientos conocidos mediante informaciones de la secuencia de SEQ ID NO:1 , y a partes de longitud reducidas todavía capaces de funcionar como inhibidores de la expresión génica utilizados en tecnologías antisentido, de cosupresión o de tecnologías de silenciamiento de gen.

Description

Gen de la piruvato deshidrogenasa quinasa de plantas.

Campo técnico

Esta invención se refiere a los genes de plantas útiles para la manipulación genética de las características de las plantas. Más específicamente, la invención se refiere a la identificación, aislamiento e introducción de genes útiles, por ejemplo, para alterar el contenido en aceite de las semillas, el tamaño de las semillas, el tiempo de florecimiento y/o de generación, o el crecimiento vegetativo de las plantas comerciales de cultivo.

Antecedentes de la técnica

A través de una coordinación de las reacciones lumínicas y oscuras de la fotosíntesis, las plantas asimilan CO_{2} en la formación de azúcares. Por medio de las reacciones anabólicas y catabólicas del metabolismo, estos azúcares son la base del crecimiento vegetal, y definitivamente de la productividad de las plantas. En el proceso del crecimiento vegetal, la respiración, la cual implica el consumo de O_{2} y el catabolismo de azúcares u otros sustratos para producir CO_{2}, juegan un papel central en proporcionar una fuente de energía, reducción de equivalentes y un ordenamiento de los intermediarios (esqueletos de carbono) así como la construcción de los bloques para muchos procesos biosintéticos esenciales. Es conocido que dos plantas cualquiera con las misma tasas fotosintéticas difieren a menudo tanto en la producción total de biomasa como en la producción cosechable.

Por lo tanto, la relación entre la tasa de respiración y l productividad del cultivo ha sido uno de los tópicos más estudiados en la fisiología vegetal. En un sentido bioquímico, la respiración puede tomarse como compuesta de glicólisis, la ruta oxidativa de las pentosas fosfato, el ciclo de Krebs (o del ácido tricarboxílico,TCA) y el sistema de transporte electrónico mitocondrial. Los productos intermediarios de la respiración son necesarios para el crecimiento en los tejidos meristemáticos, el mantenimiento de la fitomasa existente, el aporte de nutrientes, y el transporte intracelular de materiales inorgánicos. En la soja hay evidencia de que un incremento en la tasa de respiración en la vaina puede conducir a un aumento en el crecimiento de las semillas (Sinclair y col. 1987), mientras que un decremento en la respiración puede dar como resultados un crecimiento reproductivo decrecido (Gale, 1974). La respiración es, por lo tanto, importante tanto para ambas fases anabólica y catabólica del metabolismo.

Aunque las rutas del metabolismo del carbono en las células vegetales son bastante bien conocidas, el control del flujo de carbono a través de esas rutas in vivo es pobremente comprendido en la actualidad. El complejo mitocondrial piruvato deshidrogenasa (mtPDC), el cual cataliza la descarboxilación oxidativa del piruvato para dar acetil CoA, es el punto de entrada primario de los carbohidratos en el Ciclo de Krebs. El complejo mtPDC une el metabolismo glicolítico del carbono con el ciclo de Krebs, y, debido a la naturaleza irreversible de esta reacción, el complejo piruvato deshidrogenasa (PDC) es un sitio particularmente importante para la regulación.

El PDC mitocondrial se ha estudiado intensivamente en sistemas de mamíferos, y el conocimiento disponible acerca de la estructura molecular del mtPDC en plantas está grandemente basado en los estudios del mtPDC de mamíferos. El mtPDC contiene las enzimas E1 (EC 1.24.1), E2 (EC 2.3.1.12) y E3 (EC 1.8.1.4) y sus grupos prostéticos asociados, tiamina Ppi, ácido lipóico, y FAD, respectivamente. Los componentes E1 y E3 se organizan alrededor de un núcleo de E2. Los componentes E1 y E3 son polipéptidos de una sola cadena. En contraste, la enzima E1 consite en dos subunidades, E1\alpha y E1\beta. Sus funciones precisas permanecen sin esclarecerse. Se piensa que otra subunidad, la proteína de unión a E3, juega un pael en el anclaje de E3 al núcleo E2. La kinasa y la fosfatasa de E1 son subunidades regulatorias asociadas (Grof y col., 1995).

Las plantas son únicas en tener complejos PDH en dos isoformas, una localizada en la matriz mitocondrial como en el resto de las células eucarióticas y la otra localizada en el cloroplasto o en el estroma de los plastos (Randall y col., 1989).Aunque tanto la isoforma plastidial como la mitocondrial del complejo PDH son muy sensibles a la regulación por retroalimentación de sus productos, sólo el complejo PDH mitocondrial se regula a través de inactivación/reactivación mediante fosforilación /defosforilación reversible (Miernyk y Randall, 1987; Gemel y Randall, 1992; Grof y col., 195). Más específicamente, la actividad del PDC mitocondrial (mtPDC) se regula a través de regulación por retroalimentación de sus productos (NADH y acetilCoA) y el estado de fosforilación del PDCmt se determina por la acción combinada de la fosforilación reversible de la subunidad E1\alpha de por la quinasa de PDC (PDCK) y su defosforilación por la fosfatasa de PDC. La PDCK fosforila e inactiva, mientras que la PDC fosfatasa defosforila y reactiva el complejo. La máxima actividad de PDC también parece variar con el desarrollo, con la máxima actividad catalítica observada durante la germinación de las semillas y durante el desarrollo temprano de las semillas (por ejemplo en los cotiledones postgerminativos, Hill y col., 1992; Grof y col., 1995).

El acetil-CoA, el producto de PDC, es también el sustrato primario para los ácidos grasos saturados. Mientras se sabe que la biosíntesis de los ácidos grasos en las plantas se lleva a cabo en los plastos, el origen de la acetil CoA usada para la síntesis de ácidos grasos en los plastos ha sido el sujeto de mucha especulación. Permanece como una pregunta importante que no se ha resuelto. Debido al papel central del acetil CoA en muchos procesos metabólicos, es probable que la más de una ruta pueda contribuir a mantener la reserva de acetil CoA (Ohlrogge y Browse, 1995).

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Una escuela de pensamiento toma el punto de vista de que el cabono para la síntesis de ácidos grasos deriva directamente de los productos de la fotosíntesis. En este escenario, el 3-fosfoglicerato (3-PGA) daría origen al piruvato, lo cual se convertiría en acetil CoA mediante piruvao dfeshidrogenasa en los pastos (Liedvogel, 1986). Esta hipótesis tiene varios aspectos atrayentes, pero también varias preguntas no estudiadas: (1) la síntesis de ácidos grasos ocurre en los plastos fotosintéticos (cloroplastos) y no fotosintéticos (en la raíz, los cotiledones que se desarrollan en el embrión, en los leucoplastos del endospermo); (2) algunos plastos pueden carecer de 3-fosfoglicerato mutasa (Keinig and Liedvogel, 1980), una enzima esencial para convertir 3-PGA, el producto inmediato de la fijación de CO_{2} a piruvato; (3) el acetato es el sustrato preferido para la síntesis de ácidos grasos usando plastos aislados intactos, y hay evidencia de que existe en plastos un sistema multienzimático que incluye acetil CoA sintetasa y acetil CoA carboxilasa, el cual dirige al acetato para formar parte de los lípidos (Roughan y Ohlrogge, 1996). Es casi cierto que al menos algo del acetil CoA en los plastos se forma mediante la piruvato deshidrogenasa plastídica, usando piruvato importado del citosol o producido localmente mediante la glicólisis plastidial. Otra posibilidad, especialmente en los tejidos no fotosistéticos (por ejemplo, raíces y embriones en desarrollo), es que el acetil CoA generado en la mitocondria, es un medio alternativo para proporcionar motivos acetato para la síntesis de ácidos grasos (Ohlrogey Brows, 1995).El acetil CoA generado en la mitocondria puede ser hidrolizado para producir acetato libre, el cual puede moverse en el interior del plasto para su conversión a acetil CoA vía la acetil CoA sintetasa plastidial, un enzima con una actividad de 5 a 15 veces mayor que la tasa de síntesis de ácidos grasos in vivo (Roughan y Ohlrogge, 1994). Alternativamente, la acetil CoA mitocondrial puede convertirse en acetilcarnitina y transportarse directamente dentro del plasto. Por lo tanto, en teoría, el complejo piruvato deshidrogenasa mitocondrial tiene un papel importante que jugar en la biosíntesis de ácidos grasos (véase la figura 1 de los dibujos adjuntos). La prueba de esta hipótesis se ha entorpecido por las dificultades de medir directamente la existencia de acetato en el citosol.

El PDC mitocondrial (mtPDC) es un complejo de múltiples subunidades regulado estrechamente. Como se mencionó previamente, uno de los componentes reguladores clave de este complejo es la PDH kinasa (PDHK). La PDHK funciona como un regulador negativo inactivando la PDH vía fosforilación. Mediante modulación de la PDCK, la actividad de PDC puede modificarse por ingeniería genética.

Se han hecho varios intentos para incrementar o dirigir el carbono adicional hacia la biosíntesis de ácidos grasos. Las dianas han incluido acetil Coa carboxilasa modificada genéticamente y genes de expresión de la piruvato quinasa a través de técnicas de sobreexpresión y e mRNA antisentido con éxito limitado o ninguno.

Sin embargo, hay muchos ejemplos de modificaciones exitosas para el metabolismo de las plantas que se han logrado mediante ingeniería genética para transferir nuevos genes o para alterar la expresión de los genes existentes en plantas. Ahora es posible rutinariamente introducir genes en varias especies de plantas de importancia agronómica para mejorar las características de los cultivos (por ejemplo, el aceite de semillas o el contenido/la composición de almidón en los tubérculos; mejora de la harina; resistencia frente a herbicidas, enfermedades, o insectos; tolerancia a metales pesados, etc.) (Somerville, 1993; Kishore y Somerville, 1993; Mackenzie y Jain, 1997).

Por ejemplo, los incrementos en las proporciones de algunos ácidos grasos estratégicos y en las cantidades de aceite de semillas se han logrado mediante la introducción de varios genes de biosíntesis de ácidos grasos y de aciltransferasa en cultivos de semillas de aceite. Esto incluyó las siguintes demostraciones: la expresión de una construcción antisentido ala estearoil-ACP \Delta9 desaturasa en Brassicaceae conduce a un incremento en el nivel de ácido esteárico (Knutzon y col., 1992). La expresión de una acil-ACP tioesterasa de ácidos grasos de cadena media de la Bahía de California en Brassicaceae se demostró que incrementó el contenido en ácido láurico (12:0) Voelker y col., 1992; 1996). La expresión de una Jojoba beta cetoacilCoA sintasa en Brassicaceae baja en ácido erúcico conduce a un incremento del nivel de ácido erúcico (22:1); el efecto que siguió a la expresión en cultivos de altos en ácido erúcico fue despreciable (Lassner y col., 1996). Las proporciones incrementadas de ácido oleico en Brassica napus y en soja se han logrado silenciando la desnaturasa microsomal FAD2 (\Delta12) (Hitz y col., 1995; Kinney, 1995; 1997). La transformación de Arabidopsis thaliana y colza (Brassica napus) con una sn-2 aciltransferasa de levadura dió como resultado aceites de semillas con proporciones incrementadas de 22:1 y otros ácidos grasos de cadena larga e incrementos significativos en el contenido de aceite de las semillas (Zou y col., 1997).

La deposición de almidón también se ha alterado mediante ingeniería genética. Mediante la expresión de un gen mutante de E. Coli glgC16 que codifica una ADP fosforilasa de glucosa en tubérculos de patatas, se logró un incremento en la acumulación de almidón (Stark y col., 1992).

Sin embargo, debido a que un gen de PDHK no se ha clonado hasta este momento de ninguna planta, hasta ahora, ninguna modificación genética se ha dirigido a la posibilidad de alterar el flujo de carbono, incrementar la síntesis de ácidos grasos, el contenido de aceite o la talla de las semillas, alterar el tiempo de floración y/o generación, el crecimiento vegetativo, o la respiración/productividad de la planta mediante modulación de la actividad PDH mitocondrial de la planta.

Descripción de la invención

Un objeto de la invención es identificar, aislar y caracterizar una secuencia de la piruvato deshidrogenasa quinasa (en gen y en cDNA) de Arabidopsis y usar esta secuencia en la manipulación genética de las plantas.

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Otro objeto de la invención es proporcionar un procedimiento para construir un vector conteniendo la longitud total de la secuencia de PDHK o una porción significativa de la secuencia de PDHK de Arabidopsis, en una orientación antisentido bajo el control de un promotor o bien constitutivo o bien específico de semilla, para reintroducirlo en Arabidopsis o para reintroducirlo en otras plantas.

Otro objeto de la invención es proporcionar un procedimiento para construir un vector conteniendo la longitud total de la secuencia de PDHK de Arabidopsis, en una orientación sentido bajo el control de o bien un promotor constitutivo o bien un promotor específico de semillas, para reintroducirlo en Arabidopsis o para reintroducirlo en otras plantas.

Otro objeto de la invención es proporcionar un procedimiento de modificar Arabidopsis y otras plantas para cambiar sus contenidos de aceite en semillas.

Otro objeto de la invención es proporcionar un procedimiento de modificar Arabidopsis y otras plantas para cambiar su peso y talla media de semillas.

Otro objeto de la invención es proporcionar un procedimiento de modificar Arabidopsis y otras plantas para cambiar su tasa de respiración durante el desarrollo.

Otro objeto de la invención es proporcionar un procedimiento de modificar Arabidopsis y otras plantas para cambiar las características de su crecimiento vegetativo.

Otro objeto de la invención es proporcionar un procedimiento de modificar Arabidopsis y otras plantas para cambiar su tiempo de floración y otras características de su crecimiento generativo.

Otro objeto más de la invención es proporcionar un procedimiento de modificar Arabidopsis y otras plantas para cambiar el periodo requerido para alcanzar la madurez de las semillas.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se ha proporcionado, aislado y purificado ácido desoxiribonucléico (DNA) de SEQ ID Nº:1 (pYA5; ATCC Nº 209562).

De acuerdo con otro objeto más de la presente invención, se proporcionó un vector que contenía SEQ ID Nº:1 o una parte del mismo, para la introducción del gen en una orientación antisentido (por ejemplo, pAsYA5; ATCC Nº 209561) dentro de una célula vegetal, y un procedimiento para preparar un vector que contiene SEQ ID NO: 1 o una parte de la misma, para la introducción del gen en una orientación sentido en una célula vegetal.

La invención también se refiere a plantas transgénicas y semillas de planta que tienen un genoma que contiene una secuencia de DNA introducida de SEQ ID NO: 1 y a un procedimiento para producir tales plantas y semillas de planta.

La invención también se refiere a secuencias de DNA sustancialmente homólogas de plantas con secuencias de aminoácidos de una identidad del 25% o mayor, y de una similaridad del 50% o mayor, aisladas y/o caracterizadas por procedimientos conocidos usando la información de secuencia de SEQ ID Nº:1; y se apreciará por personas expertas en la técnica, y a las partes de longitud reducida que permanecerán capaces de funcionar como inhibidores de la expresión de los genes mediante su uso en una aplicación antisentido o cosupresora (Transwitch; Jorgensen y Napoli, 1994). Se apreciará por personas expertas en la técnica que los cambios pequeños en las identidades de los nucleotidos en una secuencia génica específica pueden dar como resultado una efectividad reducida o realzada de los genes, y que, en algunas aplicaciones (por ejemplo, antisentido o cosupresoras), las secuencias parciales frecuentemente trabajan con la misma efectividad que las completas. Las formas en las cuales la secuencia génica puede variarse o acortarse son bien conocidas para las personas expertas en la técnica, como las formas de probar la efectividad de los genes alterados. Todas estas variaciones de los genes son, por lo tanto, reivindicadas como parte de la presente invención.

Expuesta más generalmente, la presente invención se refiere a el aislamiento, purificación y caracterización de un gen de una piruvato deshidrogenasa quinasa mitocondrial (PDHK) de las Brassicaceae (específicamente Arabidopsis thaliana) y demostrando su utilidad en la regulación de la síntesis de ácidos grasos, contenido en aceite de las semillas, tamaño/peso de las semillas, tiempo de floración, crecimiento vegetativo, tasa de respiración y tiempo de generación. Hasta ahora, no hay datos concretos disponibles sobre la estructura de las subunidades reguladoras de las PDC de las plantas (PDCK y PDC fosfatasa).

El gen de la PDHK se clonó y caracterizó en el curso de experimentos diseñados para complementar una E. coli mutante, JC201 (Coleman, 1990) con una librería de cDNA de plantas (A. thaliana). Mediante la expresión del cDNA como una proteína de fusión en E. Coli, su función se estableció como una PDKH en un ensayo de proteínquinasas donde se fosoforilaron específicamente las subunidades E1\alpha /E1\beta de PDH de mamífero (el sustrato específico de la PDHK). La estructura de la PDHK de A. thaliana es significativamente homólogas a su correlativa en mamíferos, particularmente entre los dominios funcionales.

La PDHK de la invención es útil en la manipulación de la actividad PDH, y en la tasa de respiración en plantas. Por ejemplo, mediante la transformación de las plantas con una construcción que contiene el gen parcial PDHK en una construcción con una orientación antisentido o en el sentido correcto, bajo el control de promotores o bien constitutivos o bien específicos de tejido, la expresión de la PDHK mitocondrial puede silenciarse en algún grado mediante los fenómenos de las secuencias antisentido o de la cosupresión (Traswitch) (De Lange y col., 1995; Mol y col., 1990; Jorgensen y Napoli, 1994; Kinnev, 1995) respectivamente. Esto puede resultar en una actividad de PDH incrementada, y, por tanto, en una producción o disponibilidad del acetil CoA generado por las mitocondrias incrementada, o en una tasa de respiración incrementada.

Alternativamente, mediante sobreexpresión del gen completo de la PDHK, selectivamente, de una forma tejidoespecífica, la actividad de la PDH mitocondrial puede regularse negativamente, lo que resulta en unas tasas de respiración disminuidas en los tejidos, tales como hojas o tubérculos, para disminuir el mantenimiento de la respiración y de este modo incrementar la acumulación de biomasa

Algunas de las manipulaciones y desarrollos que hacen posible el uso del gen de PDHK o una parte del mismo incluyen, pero no están limitadas a, los siguientes: semillas con el contenido en ácidos grasos y aceite incrementado o disminuido, plantas que exhiben tiempos de floración tempranos o tardíos (medidos en términos de días después de plantar o sembrar la semilla) plantas con crecimiento vegetativo incrementado o disminuido (biomasa), plantas con sistemas radicales capaces de aguantar bajas temperaturas del suelo o congelación; plantas con tejidos que exhiben una capacidad incrementada de acumular biopolímeros los cuales consisten en restos acetil y precursores, tales como ácidos polialcanoicos y ácidos polihidroxibutíricos (Padgette y col., 1997).

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra el papel central jugado por el acetil CoA en la respiración mitocondrial y en la biosíntesis plastidial de ácidos grasos. El complejo mitocondrial piruvato deshidrogenasa (PDC) decarboxila oxidativamente al piruvato para producir acetil CoA. Las plantas son únicas porque tienen formas mitocondriales y plastidiales de la PDC. El complejo mitocondrial piruvato deshidrogenasa juega un papel clave en la regulación de la generación de acetil CoA y en la disponibilidad de restos acetil para varias reacciones catabólicas y anabólicas en las células vegetales. La PDC mitocondrial se regula negativamente mediante fosforilación de la subunidad E1\alpha mediante piruvato deshidrogenasa quinasa (PDCK=PDHK), y regulada positivamente mediante defosforilación de la PDC mediante piruvato deshidrogenasa fosfatasa (PDCP). Los motivos acetil generados en la mitocondria pueden encontrar su ruta dentro del ciclo del ácido tricarboxílico (TCA), pero también dentro del compartimento de los plastos, donde las unidades de acetato son usadas definitivamente por las enzimas de la ruta de la síntesis de ácidos grasos (FAS) para sintetizar ácidos grasos. Estos se incorporan automáticamente dentro de la membrana y también almacenan glicerolípidos. Otras abreviaturas: PDC, complejo piruvato deshidrogenasa; OAA, oxalaacetato; ACS, acetil CoA sintetasa; ACH, acetil CoA hidrolasa; DHAP, dihidroxiacetona fosfato.

La figura 2 muestra la secuencia nucleotídica [SEQ ID Nº:1] y la secuencia de aminoácidos deducida [SEQ ID Nº:2] del cDNA de la PDH de Arabidopsis thaliana (clon YA5).

La figura 3 muestra el alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la PDH quinasa de Arabidopsis (Ya5p) [SEQ ID Nº:2] con otras quinasas de cetoácidos mitocondriales de mamíferos: Pdhk I, subunidad I de la PDH quinasa porcina [SEQ ID Nº:3]; Pdhk II, subunidad II de la PDH quinasa porcina [SEQ ID Nº:4]; y Bckdhk, cadena ramificada de la quinasa porcina de la \alpha-cetoácido deshidrogenasa [SEQ ID Nº:5]. Los puntos indican nexos. Residuos aminoácidos idénticos son resaltados en letra negrita mayúscula.

La figura 4 muestra la estructura en rueda helicoidal predicha (ángulo=100º) de los 24 residuos aminoácidos en el extremo N-terminal de la proteína YA5 (piruvato deshidrogenasa quinasa, PDHK). La secuencia líder N-terminal de la proteína YA5 se corresponde bien con la mayoría de las secuencias mitocondriales diana (Rosie y Schatz, 1988) consistentes en una extensión de amino ácidos enriquecidos en residuos hidrofóbicos y oponiendo residuos cargados positivamente. Los residuos clave hidrofóbicos (V_{3}, F_{10}, L_{18}, y W_{21}) y positivamente cargada (K_{5}, K_{12} y H_{21}) se encuentran en lados opuestos del motivo de la rueda helicoidal en esta secuencia mitocondrial diana, y están resaltados mediante \bullet sobre el propio residuo, y por ? en el siguiente en residuo número.

La figura 5 muestra los resultados del análisis por gel de blot (Southern, 1975) del gen de YA5 (PDHK) de Arabidopsis thaliana. El DNA genómico se digirió con Pstl + Xbal (ruta 1), Xbal (ruta 2), Pstl (ruta 3), Pvull + Spel (ruta 4), Spel (ruta 5) y Pvull (ruta 6). Ninguna de esas enzimas tiene un sitio de restricción interno en el cDNA de YA5 (aproximadamente unas 1,5 Kb) bajo condiciones altamente restrictivas. Todas las digestiones muestran sólo un fragmento de hibridación, lo que sugiere que lo más probable es que el gen de PDHK represente un gen de una sola copia en Arabidopsis thaliana.

La figura 6 representa un gel blot de análisis de RNA (northern) del mRNA de YA5 (PDHK) de la distribución de su abundancia en los tejidos. El RNA se extrajo de flores (F), tejido vegetativo (hojas de la plántula (H)), silícuas jóvenes en desarrollo (SJ) y silícuas maduras (MS). El análisis muestra que en todos los tejidos se observó una banda de RNA hibridado de cerca de 1,5 Kb, pero la abundancia del mRNA de YA5 varió considerablemente de tejido a tejido. Las hojas jóvenes de la plántula (H) muestran el nivel más alto de expresión de YA5, mientras que significativos, pero más bajos, niveles de expresión se observaron en las silicuas en desarrollo (semillas).

Las figuras 7a, 7b, 7c y 7d mostraron los resultados de los experimentos en los cuales el cDNA de la PDHK YA5 se expresó como una proteína de fusión en E. coli y las pruebas condujeron a confirmar su función como una PDH quinasa. El cDNA de YA5 se expresó como una proteína de fusión en E. coli como se muestra en la figura 7ª. El análisis mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE) revela que el lisado de E. coli transformada con la A. thaliana PDHK (YA5)tiene una proteína de fusión inducida muy fuertemente de M_{r} aproximadamente de 45 kDa, la cual es la masa predecida del producto del gen de fusión de la PDHK de A. thaliana (42 kD + 3kD His TAG). La figura 7b muestra las subunidades de PDH del complejo E1\alpha/E1\beta de mamíferos (obtenidas por cortesía del Doctor M. Patel de la Universidad de Búfalo). Las proteínas se han coexpresado en E. coli, para proporcionar un sustrato para probar la capacidad de la PDKH par fosforilar la subunidad E1 del complejo PDH. Las figuras 7c y 7d son autorradiogramas de incorporación radiactiva de ^{32}P (desde \gamma-^{32}P-ATP) dentro de la subunidad E1 del complejo E1\alpha/E1\beta. Los recuadros izquierdos de 7c y 7d muestran la fosforilación del complejo PDH E1\alpha/E1\beta dependiente del tiempo (tiempos de incubación de 2, 5, 10, 15, ó 20 minutos) in vitro por la acción de la PDHK de la planta (producto del clon de YA5 expresado en E. coli), confirmando su función como una piruvato deshidrogenasa quinasa, la primera clonada de plantas. En la figura 7c la reacción control (panel a mano derecha) contiene lisado YA5 + lisado de E. coli control sin sustrato E1\alpha/E1\beta. No hay evidencia de fosforilación del complejo E1\alpha/E1\beta. En la figura 7d la reacción control (panel a mano derecha) contiene lisado de E. coli control (sin inserto YA5) + el sustrato E1\alpha/E1\beta. De nuevo, no hay evidencia de fosforilación del complejo E1\alpha/E1\beta.

La figura 8 muestra la actividad piruvato deshidrogenasa mitocondrial (PCC) en hojas de plantas de A. thaliana no transformada de tipo salvaje (n-WT) y en plantas transgénicas T_{2} conteniendo una secuencia antisentido constitutivamente expresada de piruvato deshidrogenasa kinasa (PDHK) designadas como líneas YA5. La mitocondria aislada de las hojas de las líneas transgénicas YA5 de A. thaliana que contienen una construcción antisentido PKDH constitutivamente expresada, tiene una actividad de PDC elevada comparada con mitocondrias aisladas de hojas de plantas control no transformadas.

La figura 9 muestra la actividad de la citrato sintasa mitocondrial en hojas de plantas de A. thaliana no transformadas de tipo salvaje (n-WT) y de plantas transgénicas T_{2} conteniendo una secuencia antisentido constitutivamente expresada de piruvato deshidrogenasa kinasa (PDHK) designadas como líneas YA5. La mitocondria aislada de líneas transgénicas de A. thaliana transformadas con una construcción antisentido PKDH constitutivamente expresada tienen niveles elevados de citrato sintasa, además de la PDC elevada, comparada con mitocondrias aisladas de hojas de plantas control no transformadas.

La figura 10 muestra el contenido en aceite (expresado como \mugramos totales de ácidos grasos por cada 100 semillas) en semillas aisladas de A. thaliana controles no transformadas (nt-WT Con), y semillas T_{2} controles transgénicas sólo con el plásmido pBI121, y transgénicas con la secuencia antisentido piruvato deshidrogenasa quinasa (PDHK), designadas como líneas YA5. El tiempo para alcanzar el estado generativo (iniciación floral) está reducido en las líneas YA5 de A. thaliana transformadas con una construcción PDHK antisentido, comparadas con los controles no transformados o transformados que contienen sólo el gen marcador de selección (transformadas con pBI121), pero sin PDHK antisentido.

La figura 11 muestra el tiempo (expresado en días tras la plantación) para alcanzar la fase de iniciación floral (generativa) en controles no transformados de A. thaliana (nt-WT) y la generación T_{2} de los controles transgénicos sólo con el plásmido pBI121 (pBI121), y los transgénicos con la piruvato deshidrogenasa quinasa (PDKH) antisentido, designados como líneas YA5. El tiempo para alcanzar la fase generativa (iniciación floral) se reduce en las líneas YA5 de A. thaliana transformadas con una construcción antisentido PDHK expresada constitutivamente, comparadas con los controles no transformados o con los transformados que contienen sólo el gen marcador de selección (transformados con pBI121), pero sin PDHK antisentido.

La figura 12 muestra los pesos secos del tejido vegetativo brotado a 31 después de plantar en controles no transformados de A. thaliana (WT), y la generación de T_{2} controles transgénicas con sólo el plásmido pBI121, y transgénicas con la secuencia antisentido piruvato deshidrogenasa quinasa (PDHK), designadas como líneas YA5. El crecimiento del tejido brotado se reduce en las líneas YA5 de A. thaliana transformadas con una construcción PDHK antisentido expresada constitutivamente, comparadas con los controles no transformados o transformantes que contienen sólo el gen marcador de selección (transformados con Pbi121), pero sin secuencia PDHK antisentido.

La figura 13 muestra el número medio de hojas en roseta presentes al entrar en la fase generativa, en las plantas controles no transformada de A. thaliana, y en la generación de T_{2} controles transgénicas con sólo el plásmido pBI121, y en las transgénicas con la secuencia antisentido piruvato deshidrogenasa quinasa (PDHK), designadas como líneas YA5. El número medio de hojas en roseta por planta se reduce en las líneas YA5 de A. thaliana transformadas con una construcción PDHK antisentido expresada constitutivamente, comparadas con los controles no transformados o transformantes que contienen sólo el gen marcador de selección (transformados con Pbi121), pero sin secuencia PDHK antisentido. La fase de crecimiento vegetativo perturbada en las líneas transgénicas con la secuencia antisentido PDHK (véase también figura 12) correlaciona bien con el fenotipo floral temprano (ver también figura 11).

Los mejores modos de llevar a cabo la invención

Los mejores modos de llevar a cabo la invención son patentes a partir de la siguiente descripción de los resultados de experimentos y pruebas que se han llevado a cabo por los inventores.

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Los inventores eligieron usar el modelo bien aceptado de sistema vegetal Arabidopsis thaliana para el clonaje de PDHK, como un sistema hospedador para ingeniería genética para alterar la expresión de PDHK, y para estudiar los efectos de la expresión alterada de PDHK en varios procesos de desarrollo y metabólicos vegetales.

Esto es debido a que en años anteriores, la Arabidopsis thaliana, una típica planta con flores, ha ganado una popularidad aumentada como un sistema modelo para el estudio de la biología vegetal. Como resultado de la facilidad con la cual esta planta se presta al trabajo tanto en la genégica clásica como en la molecular, Arabidopsis ha venido a usarse ampliamente como un organismo modelo en la genética molecular, el dearrollo, la fisiología y la bioquímica de plantas (Meyerowitz y Chang, 1985; Meyerowitz, 1987; Goodman y col., 1995). Este modelo de planta dicotiledónea está asimismo cercanamente relacionado con les especies cultivadas de Brassica y ello incrementada el que parezca que la información concerniente al control genético de los procesos biológicos básicos en Arabidopsis sea extrapolable a otras especies (Lagercrantz et al., 1996).

De hecho, hay numerosos ejemplos en los que los estudios de biología molecular y bioquímica de una ruta metabólica particular o proceso de desarrollo y la posibilidad de modificar por ingeniería genética una planta para provocar cambios en dicha ruta o proceso metabólico, se ha probado primero en el modelo vegetal Arabidopsis, y ha mostrado producir fenotipos similares en otras plantas, particularmente en plantas de cultivo.

Por ejemplo, el gen asociado a la membrana extraplastidial oleato (18:1) \Delta12 (omega-6) desaturasa, FAD2, se estudió originalmente y se clonó eventualmente de Arabidopsis thaliana, mediante la identificación de la lesión encontrada en un mutante defectivo de A. thaliana en la desaturación de oleato para producir linoleato (18:2) en el eje de fosfatidilcolina. Esto da como resultado un fenotipo de ácido oleico elevado en el aceite de las semillas de A. thaliana (Okuley y col., 1994). La modificación por ingeniería genética tanto de soja (Glycine max.) como de canola [variedad de colza] B. napus para silenciar el/los gen(es) originales de FAD2 de una forma específica de semillas mediante aproximaciones antisentido o cosupresoras, da como resultado similares fenotipos de ácido oleico elevado en el aceite de semillas (Kinney, 1995; 1997).

La expresión transgénica de un gen sn-2 aciltransferasa de levadura (SLC1-1) para lograr un aceite de semillas mejorado y un contenido en ácido graso de cadena muy larga se realizó primero en Arabidopsis, y, más tarde, mostró producir fenotipos similares en experimentos con la colza transgénica (B. napus) (Zou y col., 1997). La Arabidopsis thaliana ha mostrado repetidamente ser ella misma un sistema modelo útil para llevar a cabo ingeniería metabólica de vías (por ejemplo, biosíntesis de lípidos, fotosíntesis) o procesos (organogénesis, desarrollo reproductivo, etc.) metabólicos comunes a todas las plantas superiores.

En el área del metabolismo secundario/transducción de señales, un activador transcripcional específico de la vía de la antocianina de la monocotiledónea maiz designado como R (el factor de transcripción myc implicado en la activación de genes biosintéticos para la producción de antocianina en las células aleurone de las mazorcas de maiz), se expresó en la dicotiledónea Arabidopsis, lo que causó un una pigmentación por antocianinas aumentada en las inflorescencias. La expresión subsiguiente en otra dicotiledónea, el tabaco (Nicotiana tabacum), dio como resultado cambios similares en la pigmentación floral (Lloyd y col, 1992). Estos experimentos demostraron que la totalidad de las rutas comunes a todas las plantas con flores pueden ser coordinadamente controladas a través de la introducción de reguladores transcripcionales, y que los mecanismos son comunes a diversas especies de plantas.

En el contexto de la invención presente, todas las células vegetales sufren que la respiración mitocondrial y estos procesos ubicuos se vean afectados por la actividad de la PDC y sus reguladores PDCK y PDCP como se explicó previamente. Así, muchos de los efectos observados siguiendo la ingeniería genética para modular la expresión de PDCK en Arabidopsis puede esperarse que resulten en fenotipos similares cuando se llevan a cabo en todas las otras plantas.

Hay un número de vías por las cuales los genes y las construcciones génicas pueden introducirse en plantas, y una combinación de las técnicas de transformación vegetal y de cultivo de tejidos se ha integrado exitosamente dentro de estrategias efectivas para la creación de plantas transgénicas de cultivo. Estos procedimientos, los cuales pueden usarse en la presente invención, se han revisado extensivamente en otros sitios (Potrykus, 1991; Vasil, 1994; Walden y Wingender, 1995; Songstad y col., 1995) y son bien conocidos por las personas expertas en la técnica. Por ejemplo, una persona experta en la técnica se dará ciertamente cuenta de que, además de la transformación de Arabidopsis mediada por Agrobacterium mediante infiltración por aspiración (Bechtold y col., 1993) o por inoculación en herida (Katavic y col, 1994), es igualmente posible transformar otras especies de plantas y cultivos, usando transformación mediada por el plásmido Ti de Agrobacterium (por ejemplo, por infección de una herida en el peciolo del hipocotilo (DeBlock y col., 1989) o de los cotiledones (Moloney y col., 1989), procedimientos de bombardeo de partículas/biolísticos (Sandford y col., 1987; Nehra y col., 1994; Becker y col., 1994) o procedimientos de transformación del protoplasto mediada por polietilenglicol (Rhodes y col., 1988; Shimamoto y col., 1989).

Como también será patente para las personas expertas en la técnica, y como se revisó extensivamente en otros sitios (Meyer, 1995; Datla y col., 1997), es posible usar promotores vegetales para dirigir deliberadamente la regulación al alza o a la baja de la expresión transgénica usando promotores constitutivos (por ejemplo, aquellos basados en CaMV35S), o mediante el uso de promotores, los cuales pueden dirigir la expresión génica a células particulares, tejidos (por ejemplo, el promotor de nabo para la expresión de transgenes en el desarrollo de los cotiledones en las semillas), órganos (por ejemplo, raíces), a un estado de desarrollo particular, o en respuesta a un estímulo externo particular (por ejemplo, golpe de calor).

Las plantas particularmente preferidas para su modificación de acuerdo con la presente invención incluyen borago (Borago spp.), canola, ricino (Ricinus comunis), grano de cacao (Theobroma cacao), maiz (Zea mays), algodón (Gossypium spp.), Crambe spp., Cuphea spp., lino (Linum spp.), Lesquerella y Limnanthes spp., Linola, nasturtium (Tropaeoleum spp.), Oenothera spp., olivo (Olea spp.), palma (Elaeis spp.), cacahuete (Arachis spp.), colza, cártamo (Carthamus spp.), soja (Glycine y Soja spp.), girasol (Helianthus spp.), tabaco (Nicotiana spp), Vermonia spp., trigo (Triticum spp.); cebada (Hordeum spp.); arroz (Oryza spp.); avena (Avena spp.), sorgo (Sorghum spp.), centeno (Secale spp.) u otros miembros de la familia de las Gramineae.

Resultados Clonaje de cDNA y análisis de secuencia del clon YA5 (planta PDHK).

Una planta con una secuencia de cDNA PDHK diseñada YA5 se identificón y clonó durante experimentos diseñados para complementar un mutante E. coli JC201 (Coleman, 1990) con una librería de cDNA de Arabidopsis thaliana. El mutante E. coli JC201 se ha descrito como un mutante deficiente en actividad ácido lisofosfatídico aciltransferasa (LPAT; EC 2.3.1.51), y poseedor de un fenotipo de crecimiento sensible a la temperatura (Coleman, 1990). Los plásmidos generados a partir de una biblioteca de expresión de A. thaliana \lambda-YES (Elledge y col., 1991) se usó para transformar el mutante E. coli JC201. Unas condiciones de temperatura restrictivas (44ºC) se aplicaron a las colonias supervivientes seleccionadas. Los cDNAs se aislaron de los transformantes no sensibles a temperatura. Se encontró que el clon YA5 era capaz de complementar o rescatar la sensibilidad a temperatura de JC201, pero no se pudo detectar elevación de la actividad LPAT en lisados del trasnformante. Así, el mecanismo subyacente a la capacidad de complementar la sensibilidad a temperatura de JC201 permanece sin aclarar. Aún así, otros muchos clones complementarios también se ha encontrado que rescatan el fenotipo sensible a temperatura de JC201, indicando que la complementación de la temperatura puede ocurrir en la transformación con cDNAs que tienen funciones no relacionadas con LPAT (Taylor y col., 1992a, Zou y Taylor, 1994).

El cDNA YA5 se secuenció a partir de ambas cadenas en un Biosistema Modelo Aplicado 373A Sistema de Secuenciación de DNA utilizando el Kit Terminador del Ciclo de Secuenciación Taq DyeDeoxy™ (Applied Biosystems, Inc.). La secuencia de nucleótidos de las 1.457 kb de cDNA de YA5 (pYA5; ATCC 209562) [SEQ ID Nº:1] y su secuencia de aminoácidos deducida [SEQ ID Nº:2] se muestran en la figura 2. Una muestra del cDNA de YA5 (PYA5) se depositó el 18 de Diciembre de 1997 en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) de 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, Estados Unidos, bajo el número de acceso ATCC 209562. La secuencia revela una región 5' de 103 nucleótidos no traducida, y una región no traducida de 235 nucleótidos seguida por una cola de poliA. YA5 tiene un marco de lectura abierto de 1098 pares de bases que codifica un polipéptido de 366 aminoácidos, con un peso molecular calculado de 41,37 kDa. Las secuencias alrededor del codon de iniciación AUG están en buen acuerdo con las secuencias consenso derivadas de otras especies de plantas (Lutcke y col., 1987). Hay una codon de parada dentro del marco cadena arriba del codon de inicio, lo que indica que YA5 es un cDNA de longitud completa. El punto isoeléctrico calculado de la proteína YA5 es 6,68 y su carga neta a pH 7,0 se ha calculado en -1,48.

Alineamiento de la secuencia de aminoácidos

Como se muestra en la figura 3, las comparaciones de la secuencia de aminoácidos deducida [SEQ ID Nº:2] de la proteína YA5 (Ya5p) del banco de datos de NCBI reveló un alto grado de homología con las quinasas mitocondriales de mamíferos responsables de la fosforilación e inactivación de complejos \alpha-cetoácido deshidrogenasa (Harris y col., 1992), incluyendo el complejo piruvato deshidrogenasa (PDC), el complejo \alpha-cetoglutarato deshidrogenasa (KGDC) y el complejo \alpha-cetoácido deshidrogenasa de cadena ramificada (BCKDHC). Estos complejos de mamífero están situados en la matriz mitocondrial (Damuni y col., 1984) y son similares tanto en estructura como en función (Nobukuni y col., 1990). Los cDNAs que codifican la piruvato deshidrogenasa quinasa de mamíferos (OPDHK) y la \alpha-cetoácido deshidrogenasa quinasa de cadena ramificada (BCKDHK) se han clonado y las secuencias de aminoácidos de estas proteinquinasas son altamente homólogas entre sí (Popov y col., 1992; 1993; 1994).

La proteína YA5 (Ya5p) es idéntica en un 28,6% y similar en un 83,7% a PDKI (Popov y col., 1993) e idéntica en un 32,3% y similar en un 88,4% a PDKII (Popov y col., 1994), ambas subunidades de la PDH quinasa porcina. La Ya5p es también idéntica en un 28,8% y similar en un 84,1% a BCKDHK (Popov y col., 1992). La similaridad de secuencia se extiende sobre la secuencia completa, pero las diferencias de secuencia y el alineamiento de .los huecos ocurren por toda la secuencia, particularmente hacia los extremos amino y carboxiterminal.

La SEQ ID Nº:1 de la invención actual y la PDHK y la BCKDHK de mamíferos no exhiben una homología significativa con las serina/treonina proteinquinasas conocidas. Más bien, se halló un grado mucho mayor de homología en la secuencia con miembros de la familia de las histidina proteinquinasas procarióticas. Como se muestra en la figura 3, las regiones más homólogas suelen estar en los motivos conservados que definen los dominios funcionales de la histidina quinasa. Los miembros de la familia de las histidina proteinquinasas tienen cinco regiones que se conservan altamente (Parkinson y Kofoid, 1992). Los cinco motivos son fácilmente identificables en la secuencia de aminoácidos de YA5 deducida, con el mismo orden y espaciamiento conservado en las proteínas bacterianas. En el extremo C-terminal, el dominio catalítico (Block V) con un lazo rico en glicina de Gly^{320}-X-Gly^{322}-X-Gly^{324} [SEQ ID Nº:7] igual que la secuencia que lo circunda, es la extensión más larga de aminoácidos que exhibe alta identidad. El Bloque III con la secuencia consenso de Asp^{278}-X-Gly^{280}-X-Gly^{282} [SEQ ID Nº:8] característica de las proteínas de unión a adenosíntrifosfato (ATP), y el Bloque IV con un Phe^{292} invariante, se localizan en las posiciones definidas como el núcleo central del dominio catalítico. Una región altamente conservada definida como Bloque II (Glu^{238}-Leu-X-Lys-Asn^{242}-X-X-Arg-Ala^{246}) [SEQ ID Nº: 9] del dominio catalítico también se encontró en las proximidades de su sitio hacia el extremo N-terminal. El residuo de histidina (His^{121}) conservado en YA5, PDKI y PDKII probablemente representaría el Bloque I, del que se ha propuesto que está implicado en la autofosforilación.

La secuencia líder N-terminal de la proteína YA5 se corresponde bien con la mayoría de las secuencias diana mitocondriales (Rosie y Schatz, 1988), que consisten en una extensión de aminoácidos enriquecida en residuos hidrófobos (V_{3}, F_{10}, L_{14}, V_{18}, y W_{21}) y residuos positivamente cargados (K_{5}, K_{12} y H_{19}) se encontraron en lados opuestos del motivo de rueda helicoidal en esta secuencia diana mitocondrial. La proteína YA5 carece de motivos diana obvios típicamente hallados en las proteínas objetivo de los peroxisomas (por ejemplo, la secuencia del motivo objetivo de los peroxisomas del extremo C- terminal no eliminada Ser-Lys-Leu (SKL); Mullen y col., 1997).

Organización genómica y expresión del gen YA5 en A. thaliana

El DNA genómico se digirió con [Xbal + Pstl], Xbal, Pstl, [Pvull + Spel], Spel, y Pvull (no hay sitios internos de restricción en el cDNA de YA5 para estos enzimas). El DNA digerido se sometió a continuación a un gel de blot de DNA (Southern, 1975) y se híbrido con el cDNA de YA5 marcado con ^{32}P bajo condiciones de hibridación altamente restrictivas. Como se muestra en la figura 5, todas las reacciones de digestión producen sólo un fragmento de hibridación (banda en el gel), indicando que el gen YA5 muy probablemente está presente como una copia única en el genoma de Arabidopsis.

Para determinar la abundancia relativa y la distribución tisular del transcrito del gen YA5, un análisis de hibridación mediante gel blot del RNA (northern blot), que se muestr en la figura 3, fue llevado a cabo al RNA extraído de las plántulas, las inflorescencias (flores), las silicuas jóvenes y las silicuas maduras de A. thaliana . En todos los tejidos se observó una banda de hibridación de aproximadamente 1,5 kb, pero la abundancia del mRNA de YA5 varió considerablemente de tejido a tejido. Las plántulas jóvenes mostraron el nivel más alto de expresión, mientras que velores significativos pero más bajos de expresión se observaron en las silicuas en desarrollo (semillas).

Expresión de YA5 en E. coli y confirmación de su función como una quinasa de PDH

La cadena completa de DNA de YA5 (YA5F) se clonó en pBluescript en una orientación 5'-3' de T7-T3. Se sintetizó un cebador que comprendía el sitio teórico de iniciación de la traducción Ompdk (AGGAGAGACTCGAGGCTTATGGCAGTGAAG) [SEQ ID Nº:6] para incluir un sitio de restricción Xhol. Se usaron el cebador Ompdk y el cebador T_{3} en una reacción de PCR para amplificar la región codificante de YA5 desde YA5F. Se digirieron los fragmentos resultantes de la PCR con Hind III (el sitio Hind III está presente en el extremo 3' hacia el codon de terminación) y Xhol; y se clonaron dentro del vector pTrcHisB vector (Clontech) para generar la construcción pZTa5. El análisis por SDS-PAGE con lisados de E. coli estimulada con IPTG que contienen pZTa5 y el vector de control pTrcHisB (figura 7a), carriles [en el gel] 1 ("YA5") y 2 ("Control"), respectivamente), revelaron que el transformante pZTa5 (figura 7ª, carril 1 "YA5") exhibió una proteína de fusión muy fuertemente inducida de M_{r} \approx 45 kD, la cual es la masa predicha del producto del gen del producto de fusión PDHK de A. thaliana (\approx 42 kD + 3 kD His TAG).

La actividad de la proteinquinasa de una línea de E. coli que expresa la proteína YA5 se probó esencialmente como se describión por Liu y col., (1995). Los sustratos de fosforilación de proteínas, las subunidades humanas E1\alpha y E1\beta coexpresadas en y purificadas desde E. coli M15, se obtuvieron del Dr. M. S. Patel del Departamento de Bioquímica, Escuela de Medicina y Ciencias Biomédicas, Universidad Estatal de Nueva York en Buffalo, Buffalo, Nueva York (figura 7b). Este sistema de coexpresión de E1\alpha y E1\beta se ha usado extensivamente en el estudio de la regulación de la fosforilación de PDC E_{1} en sistemas de mamíferos (Korotchkina y Patel, 1995). Se combinaron 20-25 \mug de E1\alpha/E1\beta con aproximadamente 10 \mug de la proteína YA5 acumulada en el citosol de E. coli en un volumen final de 100 \mul conteniendo 20 mM de fosfato potásico, pH 7,0, 1mM de cloruro de magnesio, 2mM de ditiotreitol, 0,1 mM de EDTA y 200 \muM de ATP frío, para los experimentos de fosforilación (mostrados en las figuras 7c y 7d). La mezcla se preincubó a temperatura ambiente durante 5 minutos, y a continuación se añadió para empezar el ensayo 5\muCi^{32}P-\gamma-ATP. Después de 2, 5, 10, 15 y 20 minutos, las alícuotas de 20 \mul se retiran y la reacción se para con 20 \mul de una mezcla desnaturalizante de SDS. Las muestras se separaron en un 10% de SDS-PAGE y autoradiografiadas.

Las figuras 7c y 7d son autorradiogramas de incorporación radiactiva de ^{32}P (procedente de \gamma-^{32}P-ATP) dentro de la subunidad E1 del complejo E1\alpha/E1\beta. Los paneles a mano izquierda de 6(c) y 6(d) muestran la fosforilación in vitro del sustrato complejo E1\alpha/E1\beta por la acción de la proteína vegetal de fusión PDHK (clon YA5), confirmando su función como una piruvato deshidrogenasa quinasa, la primera clonada desde plantas. En la figura 7c, la reacción de control (panel a mano derecha) contiene lisado YA5 + lisado de E. coli control (sin el inserto YA5). No hay evidencia de fosforilación del sustrato E1\alpha/E1\beta. En la figura 7d la reacción control (panel a mano derecha) contiene lisado de E. coli control (sin inserto YA5) + el complejo sustrato E1\alpha/E1\beta. No hay evidencia de fosforilación de E1\alpha/E1\beta en este control tampoco.

Síntesis de construcciones YA5 para la transformación de plantas Construcción antisentido YA5 (antisentido PDKH) para expresión constitutiva

El cDNA de YA5 contiene sitios de restricción internos BamHI (nt 628) y Ncol (nt 1176). El fragmento BamHI y Ncol se liberó de YA5F y se clonó dentro de los sitios respectivos en pBI524 (Datla y col., 1993), en una orientación antisentido, y se sitúa entre el promotor tandem de del virus mosaico de la coliflor y el terminador de la nopalina sintasa. El módulo antisentido YA5 se separó a continuación del pBI524 mediante Hindi y EcoRI, y se clonaron dentro de los sitios respectivos del vector pRD400 (Datla y col., 1992). El vector antisentido binario final pAsYA5/pRD400 (una muestra del cual se depositó el 18 de diciembre de 1997 bajo los términos del Acuerdo de Budapest en la Colección de Cultivos Tipo de América (ATCC) de 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, bajo el número de acceso ATCC 209561) se introdujo dentro de la cadena GV3101 de Agrobacterium tumefasciens (llevando el plásmido ayudante pMP90; Koncz y Schell, 1986) mediante electroporación.

Construcciones YA5 antisentido y de sentido parcial con expresión específica de semilla

Se escindió un fragmento de 875 pares de bases del cDNA de YA5 mediante una digestión con BamHI (proporcionado por Pharmacia) y el fragmento se ligó dentro del plásmido pDH1, el cual contiene el promotor de nabo específico de semillas (pDH1, el cual proporcionó amablemente el Dr. P. S. Covello, NRC/PBI). El módulo y el inserto (o bien en orientación sentido o bien en orientación antisentido) se escindieron mediante una digestión parcial con Hindi y EcoRI, y los fragmentos de DNA separados en geles de agarosa y purificados usando el Kit de Geneclean II (Bio 101 Inc.). Se ligaron a continuación los fragmentos dentro de pRD400 digerido con Hindi/EcoRI. Los vectores binarios finales pNAsYA5/pRD400 (construcción antisentido) o pNSYA5/pRD400 (construcción de sentido parcial), se introdujeron dentro de la cadena de Agrobacterium tumefasciens GV3101 (llevando el plásmido ayudante pMP90; Koncz y Schell, 1986) por electroporación.

Expresión constitutiva del gen YA5 antisentido (antisentido PDHK) en Arabidopsis thaliana

Se usó Agrobacterium conteniendo el pAsYA5/pRD400 para transformar Arabidopsis mediante infiltración por aspiración (Bechtold y col., 1993). Además, será patente para las personas expertas en la técnica que la transformación de Arabidopsis también se puede llevar a cabo por inoculación en herida (Katavic y col., 1994). De forma similar, alguien experto en la técnica será consciente de que la transformación de otras especies vegetales es posible usando la transformación mediada por el plásmido Ti de Agrobacterium (por ejemplo, por infección de herida en el peciolo del hipocotilo (DeBlock y col., 1989) o de los cotiledones (Moloney y col., 1989)), procedimientos de bombardeo de partículas/biolísticos (Sandford y col., 1987; Nehra y col., 1994; Becker y col., 1994) o procedimientos de transformación del protoplasto mediada por polietilenglicol (Rhodes y col., 1988; Shimamoto y col., 1989). Las construcciones pueden ser dirigidas por promotores constitutivos o específicos de tejido (por ejemplo semilla, raíz, etc.), como también será patente para personas expertas en la técnica.

Como controles, las plantas o bien no se transformaron (nt), o bien se transformaron sólo con el vector pBI121 (Jefferson y col., 1987; sin el inserto PDHK- antisentido pero conteniendo el marcador de selección de kanamicina y el gen marcador de \beta-glucuronidasa). Las plantas control y las transgénicas se dejaron crecer al mismo tiempo bajo condiciones idénticas en cámaras de crecimiento como se describió por Katavic y col., 1995.

Los análisis de los resultados del gel blot de DNA (Southern, 1975) confirmaron que todas las líneas transgénicas PDHK antisentido (designadas como líneas YA5 23, 31, 32, 52, 95, 104) tuvieron al menos un inserto por genoma para el gen PDHK en una orientación antisentido. Como se esperaba, el control de tipo salvaje no transformado y el control transgénico (sólo con el plásmido) pBI121 sólo tienen un único inserto por genoma, consistente con el análisis Southern original (véase la figura 5).

Análisis de la actividad piruvato deshidrogenasa (PDH) en un aislado de mitocondria de A. thaliana de plantas transgénicas PDHK antisentido

El tejido del brote se recogió de plantas transgénicas de Arabidopsis thaliana que contenían la construcción antisentido de PDHK, y de plantas control no transformadas, y se aislaron mitocondrias intactas. La actividad de la piruvato deshidrogenasa (PDH) se determinó mediante el procedimiento de Reid y col., (1977). Como se muestra en la figura 8, la actividad de la PDH en mitocondrias aisladas de las hojas de plantas transgénicas PDHK antisentido, se elevó del 20 al 350%, comparado con la actividad PDH en mitocondrias aisladas de controles no transgénicos.

Análisis de las actividades de las enzimas del ciclo de Krebs en mitocondrias aisladas de Arabidopsis thaliana transgénias con PDHK antisentido

Las actividades de las enzimas del ciclo de Krebs citrato sintasa, fumarasa y succinato deshidrogenasa se elevaron significativamente en mitocondrias aisladas de hojas de plantas transgénicas PDHK, comparadas con las respectivas actividades en mitocondrias aisladas de controles no transformados de tipo salvaje (n-WT). Las actividades de la citrato sintasa se elevaron alrededor de 160-240% (figura 9), mientras que las actividades de la fumarasa se elevaron alrededor de 65-120%, y las actividades de la succinato deshidrogenasa se elevaron alrededor de 10-65% en las plantas transgénicas PDHK antisentido, comparadas con las correspondientes actividades de las plantas n-WT que permanecieron al 100%. Estos resultados sugieren que la respiración mitocondrial se incrementa en los transgénicos PDHK antisentido debido a una disponibilidad incrementada de acetilCoA generado mediante una actividad PDC mejorada (debida a la regulación a la baja de la expresión de PDHK, un regulador negativo de PDC).

Análisis de la composición de los ácidos grasos y el contenido de aceites, y pesos medios de semilla en semillas T_{2} de A. thaliana PDHK antisentido y plantas transgénicas controles pBI121

Las silicuas maduras y las semillas se aislaron de transformantes PDHK antisentido y de controles, o bien no transformados o bien transformados con pBI121 (sin PDHK antisentido, pero con un gen de resistencia a kanamicina) y se determinaron sus respectivos contenidos en aceite, composiciones grasas acilo de los aceites de las semillas, pesos medios de las semillas y número de silícuas por cada segmento de tallo de 15 cm.

Como se muestra en la figura 10, el contenido de aceite en su conjunto, expresado en \mug de ácidos grasos totales/100 semillas, se elevó significativamente en los transformantes PDHK antisentido, en un 8,5-26,5% y en un 15,4-34,6%, comparados con los controles transformantes pBI121 y los controles no transformantes, respectivamente. Esto indica que el flujo general de restos acetilo en los lípidos de almacenamiento de la semilla se incrementa por una mayor contribución del acetato generado en la mitocondria. Lo último se permite por el incremento de la actividad de la PDH mitocondrial, debida a la regulación a la baja del regulador negativo PDHK, en los transformantes antisentido PDHK.

La tabla 1 muestra el contenido en aceite y el peso medio de las semillas aisladas de las líneas de A. thaliana transformadas con una construcción PDKH antisentido expresada constitutivamente en comparación con las semillas transformadas sólo con el plásmido (pBI121) y con los controles no transformados. Tanto la cantidad de aceite como el peso medio de las semillas son más altos en los transformantes PDHK antisentido.

TABLA 1 Contenido medio de aceite en la semilla y peso medio de la semilla en semillas controles no transformadas y semillas de plantas transgénicas T_{2} del control pBI121 y de plantas transgénicas YA5 antisentido (A/S PDHK).

Línea de A. thaliana	Contenido de aceite en la semilla	Peso de la semilla (mg/400 semillas)
	(mg de aceite/400 semillas)
Control no Transformado	3,13	7,40
Control PBI121 (sólo plásmido)	3,30	7,21
A/S YA5 31	3,89	9,02
A/S YA5 32	3,66	8,55
A/S YA5 52	3,75	8,61
A/S YA5 95	3,68	8,70
A/S YA5 104	3,87	8,83

El número medio de silicuas por cada segmento de 15 cm del tallo erguido no se afectó significativamente en las líneas de A. thaliana transformadas con una construcción PDKH antisentido expresada constitutivamente (designadas como líneas YA5), en comparación con las plantas controles transformadas sólo con el plásmido (pBI121) y no transformadas. Tras la propagación de la generación T_{2} de semillas, las plantas de A. thaliana no transformadas de tipo salvaje y las plantas de A. thaliana transgénicas control pBI121 produjeron respectivamente 30 \pm 3 silicuas y 31 \pm 4 silicuas, por cada segmento de 15 cm de tallo erguido. Las íneas transgénicas YA5 PDHK antisentido 31, 32, 52, 95 y 204 produjeron respectivamente 23 \pm 3, 27 \pm 3, 27 \pm 3, 26 \pm 3, y 24 \pm 3 silicuas por cada 15 cm de tallo erguido.

El número medio de semillas T_{3} por silicua no resultó significativamente afectado. Por ejemplo, el control transformante pBI121 produjo 49,4 \pm 6,6 semillas T_{3} por silicua (n = 5-6 silicuas maduras muestreadas a partir de 4 plantas transgénicas individuales de cada línea). Esto indica que la producción de semillas (índice de cosecha) no se afectó adversamente en los transformantes PDHK antisentido.

La tabla 2 muestra la composición acilgrasa de los aceites de semilla aislados de líneas de A. thaliana transformadas con una construcción PDKH antisentido expresada constitutivamente en comparación con aceite de semillas de controles transformados sólo con el plásmido (pBI121) y no transformados. La construcción PDHK antisentido afecta a un punto muy temprano en la ruta de biosíntesis de ácidos grasos/bioensamblaje de lípidos, es decir, permite una mayor disponibilidad de residuos acetilo para la biosíntesis plastidial de ácidos grasos. Así, mientras que el flujo total de carbono a través de la ruta de los lípidos dentro de los lípidos de almacenaje se incrementó en las semillas de las plantas transgénicas antisentido PDHK, la composición de ácidos grasos de los aceites acumulados no se cambió marcadamente (tabla 2).

(Tabla pasa a página siguiente)

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Análisis de los tiempos de floración de plantas transgénicas de A. thaliana PDHK antisentido y controles pBI121

Las plantas transgénicas PDHK antisentido muestran una transición significativamente más temprana de la fase de crecimiento vegetativa a la generativa, es decir, una iniciación más temprana de la fase generativa (formación de flores) (regitrado mediante control del tiempo, como días después de plantar: d.d.p.) comparados con los controles no transformados y los controles sólo con el plásmido pBI121. Como se muestra en la figura 11, del 30 al 50% de las transgénicas PDKH antisentido florecieron tan pronto como a los 31 días d.d.p., en comparación con sólo el 1,4% en los controles. Este fenotipo de floración temprana fue incluso más dramático a los 34 días d.d.p., cuando el 50-75% de las plantas PDHK antisentido estaban en la fase generativa comparadas con sólo el 4-8% de las plantas control. La mayoría de las plantas PDHK antisentido florecieron plenamente (90% de iniciación floral, o mayor) en el día 39 d.d.p., pero el control no transformado y los controles sólo con el plásmido pBI121 no alcanzaron dicho estado hasta 46 d.d.p.

El tiempo para alcanzar la maduración también fue más corto en las A. thaliana transgénicas PDKH antisentido. Por ejemplo, a 68 días después de plantarlas, todas las líneas transgénicas han desarrollado plenamente silicuas y más de la mitad de ellas eran marrones y maduras. Bajo las condiciones de crecimiento usadas por los inventores, la diferencia en tiempo de maduración fue de aproximadamente 68-70 días para las líneas transgénicas PDHK antisentido, comparados con los aproximadamente 75-77 días para las plantas control.

Dado que el tiempo de generación en las plantas control de Arabidopsis es de aproximadamente 75 días bajo las condiciones utilizadas por los inventores, una floración y un fenotipo maduro de 5 a 8 días más tempranos en las plantas PDHK antisentido representa un acortamiento del tiempo de generación del 10%, aproximadamente. Una modificación similar del tiempo de floración, al extender el rango geográfico de cultivo, es una meta importante para los cultivos de Brassica (Lagercrantz y col., 1996). En las Brassicaceae relacionadas (por ejemplo, en Canola), esto permitiría la ventaja de una cosecha más temprana (por ejemplo en las Praderas Canadienses) y permitiría un cultivo más norteño (Murphy y Scarth, 1994). Los daños por las heladas tardías en climas templados podrían evitarse mediante una maduración más temprana, y esto podría también aliviar significativamente los problemas asociados con el vaciado tardío de clorofila de las semillas maduras (el cual puede conducir al "aceite verde" durante el procesamiento, lo que hace necesarias etapas caras de decoloración).

Los datos de los inventores demostraron que la respiración incrementada puede acelerar la transición de la fase vegetativa a la generativa del crecimiento vegetal. Es interesante destacar que el efecto opuesto, es decir, un retraso en el tiempo de florecimiento, se observó en plantas transgénicas en las cuales la citrato sintasa estaba regulada a la baja mediante tecnología antisentido, lo cual resultó en una tasa de respiración decrecida en tejidos vegetativos (Landschütze y col., 1995). Así, el tiempo de floración puede acelerarse mediante respiración incrementada y retrasarse mediante respiración reducida.

Análisis del crecimiento vegetativo de plantas transgénicas de A. thaliana PDHK antisentido y controles pBI121

El fenotipo de floración temprana de las transgénicas PDHK antisentido se correlaciona con un patrón alterado de crecimiento vegetativo. Hubo una acumulación reducida de masa vegetativa del tejido de los brotes (figura 12) que correlacionó con un número reducido de hojas en roseta producidas en las plantas transgénicas en la época en que las plantas pasaron a la fase de crecimiento generativa (iniciación floral) (figura 13).

Para resumir, las líneas de A. thaliana transformadas con una construcción PDHK antisentido expresada constitutivamente (designadas como líneas YA5) exhiben tanto crecimiento vegetativo alterado como fenotipos de floración temprana, comparadas con los controles no transformados o con los transformantes que contienen sólo el gen marcador de selección (transformadas con pBI121), pero sin PDHK antisentido. La diferencia con respecto al fenotipo de patrón alterado de crecimiento vegetativo de las transgénicas antisentido PDKH (YA5) (plantas más pequeñas con menos rosetones comparadas con los controles n-WT y pBI121) fue claramente visible a aproximadamente 3 semanas de plantar, y aún más evidente aproximadamente 1 semana después (30-31 días después de plantar). Aproximadamente a los 31 días después de plantar, el fenotipo de florecimiento temprano también fue aparente en las líneas transgénicas PDHK antisentido. Muchas de las plantas comienzan a florecer o muestran iniciación de meristemo floral visible (yema floral), mientras que no hubo evidencia de tal desarrollo en los controles n-WT y pBI121. A entre 40 y 42 días después de plantar, el fenotipo de florecimiento temprano de las líneas transgénicas PDHK fue muy aparente, con la mayoría o todas las transgénicas plenamente florecidas con flores abiertas, mientras que los controles n-WT y pBI121 muestran una frecuencia mucho más baja de florecimiento.

Mientras que el florecimiento y el tiempo de generación se acortó en las líneas YA5, el número medio de silicuas, el peso de las semillas y el contenido en aceite no fue afectado adversamente. Más bien, como se muestra en la tabla 1 y en la figura 10, tanto el peso medio de la semilla como el contenido medio de ácido graso/aceite por semilla se incrementaron en las líneas YA5.

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Procedimientos experimentales Técnicas generales de biología molecular

El aislamiento del DNA plasmídico, las digestiones de restricción, la modificación y la ligazón del DNA, la PCR, los geles de electroforesis de agarosa y poliacrilamida, la transformación y el cultivo de las líneas de E. coli, los geles de blot de análisis de DNA (Southern, 1975) y los geles de blot de análisis de RNA, fueron llevados a cabo de acuerdo con los procedimientos standard como se esbozaron por Sambrook y col. (1989).

Clonaje de YA5

Una librería \lambdaYES de expresión de cDNA de Arabidopsis thaliana (ecotipo Columbia) (Elledge y col., 1991) se obtuvo del Dr. Ronald Davis (Dept. de Bioquímica, Escuela de Medicina de la Universidad de Stanford, Stanford CA 94305). Los plásmidos se generaron por procedimientos de subclonaje automáticos como se describió por Elledge y col. (1991). Se obtuvo una teórica aciltransferasa ácida lisofosfatídica de Escherichia coli (LPAT, EC 2.3.1.51) mutante, JC201 (Coleman, 1990) del Dr. Jack Coleman (Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Centro Médico Universitario del Estado de Louisiana, Nueva Orleáns, LA 70112). La JC201 se transformó con los plásmidos generados de la librería \lambdaYES, y se seleccionó a la temperatura no permisiva de 44ºC (Coleman, 1992). El DNA YA5 del transformante insensible a temperatura se secuenció en un Applied Biosystems Modelo 373A de Sistema de Secuenciación usando el Kit Terminador del Ciclo de Secuenciación TaqDyeDeoxy™ (Applied Biosistems, Inc.). Las secuencias de nucleótidos y las secuencias deducidas de aminoácidos del clon YA5 se compararon con las secuencias disponibles en bancos de datos usando el programa FASTA (Pearson y Lipman, 1988).

Expresión de la proteína YA5 en E. coli

El cDNA completo de YA5 (YA5F) se clonó en pBluescript SK (+/-) en una orientación 5'-3' de T7-T3. Se sintetizó un cebador que comprende el sitio teórico de iniciación de traducción Ompdk (AGGAGAGACTCGAGGCTTATGGCAGTGAAG) [SEQ ID Nº:6] para incluir un sitio de restricción Xhol. Se usaron el cebador Ompdk y el cebador T_{3} en una reacción de PCR para amplificar la región codificante de YA5 desde YA5F. Se digirieron los fragmentos resultantes de la PCR con Hind III (el sitio Hind III está presente en el extremo 3' hacia el codon de terminación) y Xhol; y se clonaron dentro del vector pTrcHisB vector (Clontech) para generar la construcción pZTa5. El análisis por SDS-PAGE con lisados de E. coli estimulada con IPTG que contienen pZTa5 y el vector de control pTrcHisB, confirmaron que se sintetizó una proteína nueva de aproximadamente 45 kDa.

Ensayo de proteinquinasa con lisado de E. coli expresando YA5

Se ensayó la actividad de la proteinquinasa de la E. coli expresando la proteína YA5 esencialmente de la misma forma en que se ha descrito (Liu y col., 1995). Los sustratos de fosforilación de la proteína, La actividad de la proteinquinasa de una línea de E. coli que expresa la proteína YA5 se probó esencialmente como se describió por Liu y col., (1995). Los sustratos de fosforilación de proteínas, las subunidades humanas E1\alpha y E1\beta coexpresadas en y purificadas desde E. coli M15, se obtuvieron del Dr. M. S. Patel del Departamento de Bioquímica, Escuela de Medicina y Ciencias Biomédicas, Universidad Estatal de Nueva York en Buffalo, Buffalo, Nueva York. Este sistema de coexpresión de E1\alpha y E1\beta se ha usado extensivamente en el estudio de la regulación de la fosforilación de PDC E_{1} en sistemas de mamíferos (Korotchkina y Patel, 1995). Para llevar a cabo experimentos de fosforilación, se combinaron 20-25 \mug de E1\alpha/E1\beta con aproximadamente 10 \mug de la proteína YA5 acumulada en el citosol de E. coli en un volumen final de 100 \mul conteniendo 20 mM de fosfato potásico, pH 7,0, 1mM de cloruro de magnesio, 2mM de ditiotreitol, 0,1 mM de EDTA y 200 \muM de ATP frío, para los experimentos de fosforilación (mostrados en las figuras 7c y 7d). La mezcla se preincubó a temperatura ambiente durante 5 minutos, y a continuación se añadió para empezar el ensayo 5\muCi^{32}P-\gamma-ATP. Después de 2, 5, 10, 15 y 20 minutos, las alícuotas de 20 \mul se retiran y la reacción se para con 20 \mul de una mezcla desnaturalizante de SDS. Las muestras se separaron en un 10% de SDS-PAGE y se autoradiografiaron para revelar las proteínas marcadas con ^{32}P.

Construcción de un vector de transformación de plantas para expresión constitutiva

El cDNA de YA5 contiene sitios de restricción internos BamHI (nt 628) y Ncol (nt 1176). El fragmento BamHI y Ncol se liberó de YA5F y se clonó dentro de los sitios respectivos en pBI524 (Datla y col., 1993), en una orientación antisentido, bajo el control de un promotor tamdem 35S. El módulo YA5 antisentido se escindió a continuación de PBI524 mediante Hindi y EcoRI, y se clonó dentro del vector de transformación vegetal pRD400 (Datla y col., 1992).

Construcción de vectores de transformación de plantas YA5 antisentido y de sentido parcial para expresión específica de semilla

El cDNA de YA% completo (YA5F; 1,5 kb) se clonó en el plásmido pBluescript SK (+/-) (Stratagene) en una orientación 5'-3' de T7-T3. Un fragmento de 875 pares de bases se escindió mediante una digestión con BamHI (Pharmacia) y se ligó dentro del plásmido pDH1 el cual había sido previamente cortado con BamHI y defosforilado (tratado con 1/10 unidades de fosfatasa alcalina de intestino de ternera durante 1 hora a 37ºC). El plásmido pDH1 (proporcionado por el Dr. P. Covello, PBI/NRC) es el plásmido PE35SNT el cual ha sido manipulado de manera que el promotor tandem constitutivo 35S se ha escindido y reemplazado con el promotor de nabo específico de semilla, obtenido del plásmido pUC19. Las ligazones se llevaron a cabo a 4-12ºC durante toda una noche en un baño de agua, siguiendo las instrucciones proporcionadas por el fabricante. Las células de E. coli competentes (DH5\alpha, Gibco BRL) se transformaron mediante un procedimiento de choque térmico, con 50-100 ng de DNA transformante, plaqueado en un medio selectivo (LB con 50 \mug/ml de ampicilina) e incubado durante toda una noche a 37ºC. El DNA del plásmido Bluescript (10 ng) se usó como un control positivo para la transformación. Las células individuales transformadas se dejaron crecer durante toda una noche (37ºC, 225 r.p.m.) en 5 ml de medio LB con 50 \mug/ml de ampicilina.

La extracción y purificación del DNA se llevó a cabo con un kit Qiaprep Spin Miniprep (Quiagen). Las digestiones de restricción se llevaron a cabo con Hindi para verificar la presencia y la orientación de los insertos en el plásmido. En el caso de un inserto YA5 en una orientación antisentido, se obtuvieron dos fragmentos de aproximadamente 1,0 y 1,4 Kb, mientras que un inserto YA5 en una orientación sentido dio dos fragmentos de aproximadamente 1,08 y 0,6 Kb. El módulo y el inserto (o bien con orientación antisentido, o bien en el sentido correcto) se escindieron mediante una doble digestión parcial con Hindi y EcoRI (1 unidad/20 \mul de reacción durante 10 minutos a 37ºC). Los fragmentos de DNA correspondientes al módulo o bien con la orientación sentido o bien con la orientación antisentido, se purificaron del gel de agarosa utilizando un kit de Geneclean II (Bio 101, Inc.) y ligaron con el pásmido pRD400 digerido con Hindi/EcoRI. Los mejores resultados de ligazón se obtuvieron con una relación 1:10 plásmido-inserto en un volumen de reacción de 10 \mul, usando 1 \mul de ligasa T_{4} y tampón (New England Biolabs) a 4ºC durante toda una noche. La mezcla de reacción se calentó a 45ºC durante 5 minutos y se enfrió en hielo antes de agregar la ligasa. Al día siguiente, 1 \mul de ligasa T_{4} se añadió y la mezcla se dejó a temperatura ambiente por otras 3-4 horas. La identidad de cada construcción se reexaminó por digestión y secuanciación de DNA antes de la transformación de la planta.

Transformación de Arabidopsis thaliana

El protocolo de transformación se adaptó del que se describe por Bechtold y col., (1993). Las plantas del ecotipo Columbia de Arabidopsis thaliana se dejaron crecer en suelo húmedo a una densidad de 10-12 plantas por maceta, en macetas de 4 pulgadas cuadradas (10,16 cm. cuadrados), y cubiertas por una pantalla de nylon fija en su sitio con una banda elástica. Una vez que las plantas alcanzan el estado en el cual las flores comienzan justamente a emerger, las plantas se regaron, se podaron las flores incipientes y algunas hojas, y las plantas se infiltraron con una suspensión de Agrobacterium como se resume más adelante.

Para dejar crecer las Agrobacterium, se cultivaron durante de dos a tres días en una suspensión de medio LB conteniendo kanamicina a una concentración de 50 \mug/ml antes de tiempo. El día antes de la infiltración, este "cultivo de semillas" se añadió a 400 ml de medio LB conteniendo50 \mug/ml de kanamicina. Una vez que la absorbancia a 600 nm fue > 2,0, las células se cosecharon mediante centrifugación (5.000 x g, durante 10 minutos en un rotor a temperatura ambiente) y se resuspendieron en tres volúmenes de mecio de infiltración (1/2 de sales de Murashige y Skoog, vitaminas 1 x B5, 5,0% de sacarosa, 0,044 \muM de bencilaminopurina) a una densidad óptica de 0,8 a 600 nm. La suspensión de Agrobacterium se vertió a continuación dentro de un vaso de precipitados y las plantas en maceta se colocaron invertidas dentro del vaso de precipitados, de manera que las flores incipientes y las rosetas enteras se sumergieron. El vaso de precipitados se situó a continuación dentro de una gran campana de vidrio y se hizo el vacío mediante una bomba de vacío, hasta que las burbujas formadas en la hoja y la superficie del tallo y la disolución comenzaron a burbujear un poco, y a continuación la bomba de vacío se paró rápidamente. [Nota: el tiempo necesario y la presión variarán de una ejecución en el laboratorio a la siguiente, pero una buena infiltración aparece a la vista como uniformemente oscurecida, dejando en remojo en agua el tejido.] Las macetas se retiraron del vaso de precipitados, se colocaron de lado en una bandeja de plástico y se cubrieron con una cúpula de plástico para mantener la humedad. Al día siguiente las plantas se descubrieron, se colocaron de pie y se las permitió crecer durante aproximadamente 4 semanas en una cámara de crecimiento bajo condiciones de luz continua como se describe en Katavic y col., (1995). Cuando las silicuas están maduras y secas, se cosecharon las semillas y se seleccionaron los transformantes positivos.

Selección de los tranformantes teóricos (plantas transgénicas) y crecimiento y análisis de las plantas transgénicas

Las semillas cosechadas a partir de los experimentos de transformación por infiltración por aspiración se esterilizaron mediante un tratamiento durante 1 minuto en etanol, seguido a continuación de 5 minutos en una disolución en agua destilada estéril de 50% de lejía/0,05% de Tween 20™. A continuación las semillas se lavaron varias veces con agua destilada estéril. Las semillas se plaquearon resuspendiéndolas en agarosa estéril al 0,1% a temperatura ambiente (aproximadamente 1 ml. de agarosa por cada500-1000 semillas), y a continuación se aplicó un volumen equivalente a aproximadamente 2.000-4.000 semillas sobre placas de selección de 150 x 15 mm (1/2 x sales de Murashige y Skoog, 0,8% de agar, autoclave, enfriamiento y añadir vitaminas 1 x B5 y kanamicina a una concentración final de 50 \mug/ml). Las placas se secaron en una campana de flujo laminar hasta que las semillas no fluyeron cuando las placas se tocaron. Las placas se vernalizaron a continuación durante dos noches a 4ºC en la oscuridad, y a continuación se trasladaron a una cámara de crecimiento (las condiciones se describieron por Katavic y col., 1995). Después de 7-10 días, los transformantes se identificaron claramente como plantas de color verde oscuro con hojas secundarias verdes sanas y raíces que se extendían por encima y dentro de un medio selectivo.

Las plantas se transplantaron a suelo, crecieron hasta la madurez y las semillas maduras (la generación T_{2} como se define en Katavic y col., 1994) se recolectaron y analizaron. Las semillas T_{2} se propagaron. Los patrones de crecimiento vegetativo se siguieron midiendo los pesos secos de los brotes, y/o medinteel contaje del número de hojas en roseta presentes en el momento en que las plantas comienzan a entrar en su fase generativa (iniciación floral). La iniciación floral (comienzo de la fase generativa de crecimiento) se analizó registrando, en una base de datos diaria, el porcentaje de plantas en las cuales un brote floral apareció primero y/o el porcentaje de las plantas que han florecido (como describieron Zang y col., 1997). Los datos se presentaron el términos de porcentaje de plantas florecidas/floreciendo en un día dado después de plantar (d.d.p.).

Preparación de mitocondria de A. thaliana control no transformada y plantas transgénicas Anti-YA5

Todas las extracciones se llevaron a cabo a 4ºC. Una fracción enriquecida en mitocondrias se preparó por un procedimiento modificado de Ap Rees y col., (1993). Aproximadamente30 g de brotes recién recolectados se homogeinizan usando un Waring Bleder enfriado en 4 volúmenes de tampón de extracción (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, que contiene 300 mM de manitol, 5mM de EDTA, 0,1% de seroalbúmina bovina, 1% de PVPP (polivinilpirrolidona) y 9 mM de 2-mercaptoetanol. El homogenado se filtró a través de cuatro capas de gasa y una capa de Miralgodón y se se centrífugo a 2.000 x g durante 10 minutos. El sedimento se descartó, y el sobrenadante se centrífugo a 10.000 x g durante 30 minutos. El sedimento se resuspendió en el tampón de extracción menos el PVPP, y se usó como un preparación enriquecida en mitocondrias. Para las medidas de la actividad succinato deshidrogenasa, esta preparación se usó directamente. Para las medidas de PDC, fumarato y citrato sintasa, las mitocondrias recién preparadas se lisaron primero en la presencia de 0,1 (v/v) Triton X-100 pra librar las enzimas mitocondriales. El lisado con Tritón se clarificó por centrifugación a 27.000 x g, y el sobrenadante, que contiene enzimas solubilizadas, se concentró con un filtro concentrador Centricon-30 (Amicon). El concentrado resultante se usó como fuente de enzimas en un ensayo PDC. Las concentraciones de proteínas se estimaron por el procedimiento de Bradford (1976), usando seroalbúmina bovina como un estándar, y normalizado antes del ensayo.

Ensayo del complejo piruvato deshidrogenasa

El procedimiento usado para determinar el complejo piruvato deshidrogenasa (PDH) presente en las preparaciones de proteínas mitocondriales se modificó a partir del procedimiento de Reid y col., (1977). La mezcla de ensayo consiste en 0,1 mM de TPP, 5 mM de MgCl_{2}, 1,5 NAD^{+}, 0,1 mM de Coenzima A, 3,0 mM de cisteína-HCl y 1,5 mM de piruvato en 100 mM de Tricina pH 8,0 en un volumen final de 2 ml. Las reacciones se iniciaron por la adición de lisado mitocondrial concentrado. Las reacciones control contienen todos los componentes excepto piruvato. La mezcla de reacción se incubó a 30ºC y la formación de NADH se monitorizó a una longitud de onda de 340 nm a intervalos de 15 segundos durante 3 minutos, usando un espectrofotómetro DU 74 de Beckman.

Ensayo de la citrato sintasa

El procedimiento usado para medir la actividad de citrato sintasa presente en las preparaciones en proteína mitocondrial se modificó a partir del procedimiento de Srere (1969). La mezcla de reacción que contiene 0,2 mM 5',5'-ditiobis-2-ácido nitrobenzoico (DTNB), 0,1 mM acetil-CoA y lisado mitocondrial de proteínas, en 50 mM de Tris- HCl, pH 7,8, en un volumen final de reacción de 2ml, incubados a 30ºC. La absorción a 412 nm fue seguida por tres minutos para medir la posible actividad acetilCoA deacilasa. La reacción citrato sintasa se empezó a continuación mediante la adición de 0,5 mM de oxalacetato (OAA), y la liberación de Coenzima A (CoASH), el grupo SH el cual reacciona con el DTNB (agente químico de Ellman's) se siguió a 412 nm. El ión mercáptido resultante tiene una fuerte absorción (E = 13.600) a 412 nm. Las reacciones control contienen todos los componentes excepto OAA.

Ensayo de fumarasa

La actividad fumarasa presente en las preparaciones de proteína mitocondrial se ensayó por el procedimiento de Hill y Bradshaw (1969). La mezcla de reacción contuvo 25 mM de malato de sodio y proteínas del lisado mitocondrial en 50 mM de tampón fosfato de sodio, pH 7,5, en un volumen fina le reacción de 1 ml. Las reacciones se incubaron a 28ºC. La actividad fumarasa, medida por la formación de fumarato, se determinó espectrofotométricamente mediante monitorización del incremento en absorbancia a 250 nm, a intervalos de 15 segundos durante 2 minutos.

Ensayo de succinato deshidrogenasa

La actividad de la succinato deshidrogenasa mitocondrial se midió usando el procedimiento de Veeger y col., (1969). La mezcla de reacción contenía 1 mM de KCN, 40 mM de succinato, 1 mM de EDTA, 0,1% de BSA, 3 mM de K_{3}Fe(CN)_{6}, 0,1% de Tritón X-100 y mitocondrias no lisadas en 100 mM de tampón fosfato sódico a pH 7,5, en un volumen final de reacción de 1 ml. Las mezclas de reacción se incubaron a 28ºC. La reacción se inició por la adición de mitocondrias en un tampón de fosfato libre de oxígeno. La carga en absorbancia a 455 nm se controló espectrofotométricamente, a intervalos de 20 segundos durante 2 minutos. Las reacciones control contienen todos los componentes excepto succinato.

Análisis de lípidos en semilla de semillas de A. thaliana controles no transformadas y de transgénicos PDKH antisentido (AsYA5)

Las silicuas maduras y las semillas T_{2} y T_{3} se aislaron de transformantes PDKH antisentido (designados como líneas YA5) o transformantes control de pBI121 (sin PDHK antisentido, pero con un gen de resistencia a kanamicina) y las semillas y las silicuas también se aislaron de plantas control tipo salvaje no transformadas y sus respectivos contenidos de aceite en semilla, composiciones acilgrasas de los aceites de semillas, pesos medios de semilla, número de silicuas por cada segmento de 15 cm de tallo erguido y el número de semillas por silicua se determinaron como se describió por Zou y col., (1997). Todas las plantas se dejaron crecer en la misma cámara de crecimiento, al mismo tiempo y bajo idénticas condiciones de luz y temperatura, como se describió previamente (Katavic y col., 1995; Zou y col., 1997). Dado el tamaño y el peso extremadamente pequeños de las semillas, los análisis se llevaron a cabo en réplicas de 100 ó 400 semillas que se contaron cuidadosamente bajo un microscopio de disección. Las muestras de semillas se sembraron usando un politrón en cloroformo:isopropanol (2:1, [v/v]) conteniendo 0,2 p/v de hidroxitolueno butilado y tripentadecanoin como un estándar interno. Todas las otras condiciones para el aislamiento y análisis del total del contenido de ácidos grasos de la semilla y la composición de ácidos grasos de la semilla (expresada como tanto por ciento en peso del total de ácidos grasos) mediante cromatografía de gases se llevó a cabo como se detalló previamente (Taylor y col., 1992b; Taylor y col., 1995; Katavic y col., 1995; Zou y col., 1997). Los contenidos de aceite se expresaron o bien como \mug de ácidos grasos totales por muestra simple (véase tabla 1), calculadas asumiendo 3 moles de ácidos grasos por mol de triacilglicerol (aceite), como se describió por Zou y col., (1997).

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE:

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(A)

NOMBRE: National Research Council of Canada

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(B)

CALLE: 1200 Montreal Road

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(C)

CIUDAD: Ottawa

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(D)

ESTADO: Ontario

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(E)

PAÍS: Canadá

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(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): KIA OR6

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Gen de la Piruvato Deshidrogenasa Quinasa de Plantas

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 9

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(iv)

FORMA LEGIBLE POR COMPUTADOR:

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(A)

TIPO MEDIO: Disquete

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(B)

COMPUTADOR: IBM PC compatible

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D)

SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Versión #1,30 (EPO)

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(v)

DATOS DE SOLICITUD ACTUALES:

NÚMERO DE SOLICITUD: WO PCT/CA98/- - - -

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(vi)

DATOS DE SOLICITUD ANTERIORES:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 60/038.815

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

DATOS A ARCHIVAR: 10-FEB-1997

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(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 1:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 1457 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucléico

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(C)

CADENA: simple

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

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(iii)

HIPOTÉTICA: NO

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(iv)

ANTISENTIDO: NO

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(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Arabidopsis thaliana

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 1:

2

200

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 2:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 366 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: SÍ

\vskip0.666000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal

\vskip0.666000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Arabidopsis thaliana

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 2:

3

300

4

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 3:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 405 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal

\vskip0.666000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Subunidad I de la PDH quinasa porcina

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 3:

5

6

60

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 4:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 434 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal

\vskip0.666000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Subunidad II de la PDH quinasa porcina

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 4:

7

70

8

\newpage

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 5:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 412 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal

\vskip0.666000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Cadena ramificada de la subunidad II de la PDH quinasa porcina

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 5:

9

90

10

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 6:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 30 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 6:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

AGGAGAGACT CGAGGCTTAT GGCAGTGAAG

\hfill

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 7:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.666000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Arabidopsis thaliana

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Xaa Gly Xaa Gly}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 8:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(E)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.666000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Arabidopsis thaliana

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Xaa Gly Xaa Gly}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 9:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(E)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(F)

CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(G)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.666000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Arabidopsis thaliana

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Leu Xaa Lys Asn Xaa Xaa Arg Ala}

\newpage

Colección Americana de Cultivos Tipo

\vskip1.000000\baselineskip

12301 Parklawn Drive\bulletRockville, MD 20852 USA\bulletTeléfono: 301-231- 5519\bulletFAX:301-816-4366

\vskip1.000000\baselineskip

TRATADO DE BUDAPEST SOBRE RECONOCIMIENTO INTERNACIONAL DEL DEPÓSITO DE MICROORGANISMOS PARA PROPÓSITOS DE PROCEDIMIENTOS DE PATENTES

\vskip1.000000\baselineskip

IMPRESO INTERNACIONAL

\vskip1.000000\baselineskip

RECIBO EN EL CASO DE UN DEPÓSITO ORIGINAL EXPEDIDO CON ARREGLO A LA REGLA 7.3 Y ESTADO DE VIABILIDAD EXPEDIDO CON ARREGLO A LA REGLA 10.2

\vskip1.000000\baselineskip

A: (Nombre y Dirección del Depositante o Agente)

\vskip1.000000\baselineskip

National Research Council of Canada

\vskip1.000000\baselineskip

Attn: Dr. David C. Taylor

\vskip1.000000\baselineskip

Plant Biotechnology Institute, 110 Gymnasium Place

\vskip1.000000\baselineskip

Saskatoon, SK S7N 0W9

\vskip1.000000\baselineskip

Canada

\vskip1.000000\baselineskip

Depositado en Nombre de: National Research Council of Canada

\vskip1.000000\baselineskip

Referencia de Identificador por Depositante:	Designación ATCC
Plásmido PAsYA5	209561

\vskip1.000000\baselineskip

Los depósitos se acompañaron de:_________una descripción científica________una descripción taxonómica propuesta indicada más adelante.

\vskip1.000000\baselineskip

Los depósitos se recibieron el 18 de diciembre de 1997 por esta Autoridad de Depósito Internacional, y se han aceptado.

\vskip1.000000\baselineskip

A SU SOLICITUD

\vskip1.000000\baselineskip

X

\hskip1cm

Le informaremos de las solicitudes de las líneas durante 30 años.

\vskip1.000000\baselineskip

Las líneas se harán disponibles en una oficina de patentes adscrita al Tratado de Budapest certificando que alguien tiene derecho a recibirlas, o si una Patente de los Estados Unidos se expide citando las líneas, y ATCC recibe instrucciones de la United States Patent & Trademark Office o del depositario para liberar dichas líneas.

\vskip1.000000\baselineskip

Si los cultivos murieran o se destruyeran durante el periodo efectivo de este depósito, sería su responsabilidad reemplazarlos con cultivos vivos de lo mismo.

\vskip1.000000\baselineskip

Las líneas se mantendrán durante un periodo de al menos 30 años tras la fecha del depósito, o cinco años después del requerimiento más reciente de una muestra, lo que sea más largo. Los Estados Unidos y muchos otros países son firmantes del Tratado de Budapest.

\vskip1.000000\baselineskip

La viabilidad de los cultivos anteriormente citados se probó el 30 de diciembre de 1997. En esta fecha, los cultivos fueron viables.

\vskip1.000000\baselineskip

Autoridad de Depósito Internacional: Colección Americana de Cultivos Tipo, Rockville, Md. 20852 U.S.A.

\vskip1.000000\baselineskip

Firma de la persona que tiene autoridad para representar a la ATCC:

\vskip1.000000\baselineskip

Barbara M. Hailey

Fecha: 20 de enero de 1998

\vskip1.000000\baselineskip

Barbara M. Hailey, Administrador, Depósito de Patentes

\vskip1.000000\baselineskip

Cc: Kirby, Eades, Gale y Barker

\vskip1.000000\baselineskip

Colección Americana de Cultivos Tipo

\vskip1.000000\baselineskip

12301 Parklawn Drive\bulletRockville, MD 20852 USA\bulletTeléfono: 301- 231-5519\bulletFAX:301-816-4366

\vskip1.000000\baselineskip

TRATADO DE BUDAPEST SOBRE RECONOCIMIENTO INTERNACIONAL DEL DEPÓSITO DE MICROORGANISMOS PARA PROPÓSITOS DE PROCEDIMIENTOS DE PATENTES

\vskip1.000000\baselineskip

FORMA INTERNACIONAL

\vskip1.000000\baselineskip

RECIBO EN EL CASO DE UN DEPÓSITO ORIGINAL EXPEDIDO CON ARREGLO A LA REGLA 7.3 Y ESTADO DE VIABILIDAD EXPEDIDO CON ARREGLO A LA REGLA 10.2

\vskip1.000000\baselineskip

A: (Nombre y Dirección del Depositante o Agente)

\vskip1.000000\baselineskip

National Research Council of Canada

\vskip1.000000\baselineskip

Attn: Dr. David C. Taylor

\vskip1.000000\baselineskip

Plant Biotechnology Institute, 110 Gymnasium Place

\vskip1.000000\baselineskip

Saskatoon, SK S7N 0W9

\vskip1.000000\baselineskip

Canada

\vskip1.000000\baselineskip

Depositado en Nombre de: National Research Council of Canada

\vskip1.000000\baselineskip

Referencia de Identificador por Depositante:	Designación ATCC
Plásmido PAsYA5	209562

\vskip1.000000\baselineskip

Los depósitos se acompañaron de:________una descripción científica________ una descripción taxonómica propuesta indicada más adelante.

\vskip1.000000\baselineskip

Los depósitos se recibieron el 18 de diciembre de 1997 por esta Autoridad de Depósito Internacional, y se han aceptado.

\vskip1.000000\baselineskip

A SU SOLICITUD

\vskip1.000000\baselineskip

X

\hskip1cm

Le informaremos de las solicitudes de las líneas durante 30 años.

\vskip1.000000\baselineskip

Las líneas se harán disponibles en una oficina de patentes adscrita al Tratado de Budapest certificando que alguien tiene derecho a recibirlas, o si una Patente de los Estados Unidos se expide citando las líneas, y ATCC recibe instrucciones de la United States Patent & Trademark Office o del depositario para liberar dichas líneas.

\vskip1.000000\baselineskip

Si los cultivos murieran o se destruyeran durante el periodo efectivo de este depósito, sería su responsabilidad reemplazarlos con cultivos vivos de lo mismo.

\vskip1.000000\baselineskip

Las líneas se mantendrán durante un periodo de al menos 30 años tras la fecha del depósito, o cinco años después del requerimiento más reciente de una muestra, lo que sea más largo. Los Estados Unidos y muchos otros países son firmantes del Tratado de Budapest.

\vskip1.000000\baselineskip

La viabilidad de los cultivos anteriormente citados se probó el 2 de enero de 1998. En esta fecha, los cultivos fueron viables.

\vskip1.000000\baselineskip

Autoridad de Depósito Internacional: Colección Americana de Cultivos Tipo, Rockville, Md. 20852 U.S.A.

\vskip1.000000\baselineskip

Firma de la persona que tiene autoridad para representar a la ATCC:

\vskip1.000000\baselineskip

Barbara M. Hailey

Fecha: 20 de enero de 1998

\vskip1.000000\baselineskip

Barbara M. Hailey, Administrador, Depósito de Patentes

\vskip1.000000\baselineskip

Cc: Kirby, Eades, Gale y Barker

\vskip1.000000\baselineskip

REFERENCIAS RELEVANTES PARA LA INVENCIÓN ACTUAL

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Claims (35)

1. Ácido desoxirribonucléico (DNA) aislado y purificado, caracterizado porque dicho DNA incluye:

(i)

una secuencia acorde con la SEQ Nº: 1 (ATCC 209562);

(ii)

una parte de la longitud reducida de dicha secuencia i) continúa siendo capaz de funcionar como un inhibidor de la expresión génica mediante el uso de una aplicación antisentido o aplicación de cosupresión;

(iii)

una secuencia que codifica una proteína con una identidad de aminoácidos del 50% o mayor con la proteína codificada por SEQ ID Nº:1, en la que la identidad se mide sobre la secuencia completa de dicha secuencia que codifica una proteína con una identidad de aminoácidos del 50% o mayor con la proteína codificada por SEQ ID Nº:1, y dicha secuencia que codifica una proteína con una identidad de aminoácidos del 50% o mayor con la proteína codificada por SEQ ID Nº:1 continúa siendo capaz de funcionar como un inhibidor de la expresión génica mediante el uso de una aplicación antisentido o de cosupresión; o

(iv)

una parte de longitud reducida de la secuencia acorde con iii), en la que dicha parte de secuencia reducida codifica una proteína con una identidad de aminoácidos del 50% o mayor con la proteína codificada por SEQ ID Nº:1, en la que la identidad se mide sobre la secuencia completa de dicha secuencia que codifica una proteína con una identidad de aminoácidos del 50% o mayor con la proteína codificada por SEQ ID Nº:1, y dicha parte de longitud reducida de la secuencia acorde con iii) que codifica una proteína con un 50% o mayor de identidad de aminoácidos con la proteína codificada por SEQ ID Nº:1 continúa siendo capaz de funcionar como un inhibidor de la expresión génica mediante el uso de una aplicación antisentido o de cosupresión.

2. Ácido desoxirribonucléico (DNA) aislado y purificado caracterizado porque dicho DNA incluye secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos de acuerdo con SEQ ID Nº: 7, SEQ ID Nº: 8, y SEQ ID Nº: 9, y codifica una proteína piruvato deshidrogenasa quinasa.

3. Un vector de transformación de células vegetales, caracterizado porque dicho vector contiene la secuencia de ácido desoxirribonucleico de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

4. Un vector de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizado porque dicha secuencia está presente en dicho vector en una orientación antisentido.

5. Un vector de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizado porque dicha secuencia está presente en dicho vector en una orientación sentido.

6. Plásmido pYA5 (ATCC 209562).

7. Plásmido pYA5 (ATCC 209561).

8. Una planta que tiene un genoma, caracterizado porque el genoma contiene una secuencia de nucleótidos introducida de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

9. Una semilla de planta que tiene un genoma, caracterizado porque dicho genoma contiene una secuencia de nucleótidos introducida de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

10. Una planta genéticamente transformada, caracterizada porque su genoma se ha transformado mediante un vector de acuerdo con la reivindicación 3.

11. Una semilla de planta genéticamente transformada, caracterizada por que su genoma se ha transformado mediante un vector de acuerdo con la reivindicación 3.

12. Una planta como la de la reivindicación 10, caracterizada por exhibir una tasa de respiración alterada comparada con la de una planta genéticamente no modificada del mismo genotipo.

13. Una semilla de planta como la de la reivindicación 11, caracterizada porque dicha semilla produce una planta que exhibe una tasa de respiración alterada comparada con la de una planta genéticamente no modificada del mismo genotipo.

14. Una planta como la de la reivindicación 10, caracterizada por exhibir un contenido de aceite de semilla alterado comparado con el de una planta genéticamente no modificada del mismo genotipo.

15. Una semilla de planta como la de la reivindicación 11, caracterizada por exhibir un contenido de aceite de semilla alterado comparado con el de la semilla de una planta genéticamente no modificada del mismo genotipo.

16. Una planta como la de la reivindicación 10, caracterizada por exhibir un tiempo de floración alterado comparado con el de una planta genéticamente no modificada del mismo genotipo.

17. Una semilla de una planta como la de la reivindicación 11, caracterizada porque dicha semilla produce una planta que exhibe un tiempo de floración alterado comparado con el de una planta genéticamente no modificada del mismo genotipo.

18. Una planta como la de la reivindicación 10, caracterizada por exhibir una resistencia mejorada frente a temperaturas frías comparada con una planta genéticamente no modificada del mismo genotipo.

19. Una semilla de una planta como la de la reivindicación 11, caracterizada porque dicha semilla produce una planta que exhibe una resistencia mejorada frente a temperaturas frías comparada con una planta genéticamente no modificada del mismo genotipo.

20. Una planta como la de la reivindicación 10, caracterizada por exhibir una biomasa mejorada comparada con una planta genéticamente no modificada del mismo genotipo.

21. Una semilla de una planta como la de la reivindicación 11, caracterizada por que dicha semilla produce una planta que exhibe una biomasa mejorada comparada con una planta genéticamente no modificada del mismo genotipo.

22. Una planta como la de la reivindicación 10, caracterizada por exhibir una capacidad mejorada de acumulación de biopolímeros comparada con una planta genéticamente no modificada del mismo genotipo.

23. Una semilla de una planta como la de la reivindicación 11, caracterizada porque dicha semilla produce una planta que exhibe una capacidad mejorada de acumulación de biopolímeros comparada con una planta genéticamente no modificada del mismo genotipo.

24. Un procedimiento de producción de plantas transgénicas mediante la introducción de una secuencia nucleotídica dentro de un genoma de dicha planta, caracterizado porque dicha secuencia de nucleótidos es la secuencia de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

25. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 24, caracterizado porque dicha planta es un miembro de Brassicaceae.

26. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 24, caracterizada porque dicha planta es un miembro del grupo consistente en borago (Borago spp), Canola, ricino (Ricinus comunis), grano de cacao (Theobroma cacao), maiz (Zea mays), algodón (Gossypium spp.), Crambe spp., Cuphea spp., lino (Linum spp.), Lesquerella y Limnanthes spp., Linola, nasturtium (Tropaeoleum spp.), Oenothera spp., olivo (Olea spp.), palma (Elaeis spp.), cacahuete (Arachis spp.), colza, cártamo (Carthamus spp.), soja (Glycine y Soja spp.), girasol (Helianthus spp.), tabaco (Nicotiana spp), Vermonia spp., trigo (Triticum spp.); cebada (Hordeum spp.); arroz (Oryza spp.); avena (Avena spp.), sorgo (Sorghum spp.), centeno (Secale spp.) u otros miembros de la familia de las Gramineae.

27. Un procedimiento para cambiar el contenido de aceite de semillas de plantas mediante la introducción de un ácido nucleico en una construcción en sentido correcto o antisentido dentro de un vector de transformación de plantas, usando el vector para transformar el genoma de una planta o de la semilla de una planta, caracterizada porque dicha secuencia de ácidos nucleicos es la secuencia de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

28. Un procedimiento para cambiar el contenido de biopolímeros de una planta u órgano de almacenamiento de una planta introduciendo una construcción antisentido o en sentido correcto dentro de un vector de transformación de plantas, usando el vector para transformar el genoma de una planta o del órgano de almacenamiento de una planta, y a continuación dejar crecer la planta o el órgano de almacenamiento de una planta y extraer el biopolímero de la planta o del órgano de almacenamiento de una planta, caracterizado porque la construcción contiene la secuencia de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

29. Un procedimiento para modular el nivel de proteína PDHK en una planta, que comprende:

a)

una transformación estable de una célula vegetal con un polinucleótido PDHK vegetal unido de forma operable a un promotor, en el que el polinucleotido está en una orientación sentido o antisentido;

b)

dejar crecer la célula vegetal bajo las condiciones de crecimiento vegetal para producir una planta regenerada capaz de expresar el polinucleótido por un tiempo suficiente para modular el nivel de la proteína PDHK en la planta.

30. El procedimiento de la reivindicación 29, en el que el polinucleótido PDHK incluye una secuencia de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

31. El procedimiento de la reivindicación 29 o la reivindicación 30, en el que el nivel de la proteína PDHK se ha incrementado.

32. El procedimiento de la reivindicación 29 ó 30, en el que el nivel de la proteína PDHK ha decrecido.

33. Un procedimiento para controlar el flujo de carbono dentro del ciclo de Krebs en plantas, incluyendo la modulación del nivel de expresión de la proteína PDHK según el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32.

34. Un procedimiento para incrementar el contenido en aceite en una planta mediante la modulación del nivel de expresión de la proteína PDHK según el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32.

35. El procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 29 a 34, caracterizado porque dicha planta es un miembro del grupo consistente en borago (Borago spp), Canola, ricino (Ricinus comunis), grano de cacao (Theobroma cacao), maiz (Zea mays), algodón (Gossypium spp.), Crambe spp., Cuphea spp., lino (Linum spp.), Lesquerella y Limnanthes spp., Linola, nasturtium (Tropaeoleum spp.), Oenothera spp., olivo (Olea spp.), palma (Elaeis spp.), cacahuete (Arachis spp.), colza, cártamo (Carthamus spp.), soja (Glycine y Soja spp.), girasol (Helianthus spp.), tabaco (Nicotiana spp), Vermonia spp., trigo (Triticum spp.); cebada (Hordeum spp.); arroz (Oryza spp.); avena (Avena spp.), sorgo (Sorghum spp.), centeno (Secale spp.) u otros miembros de la familia de las Gramineae.