CN102433349A - 小麦法呢基焦磷酸合酶基因TaFPS及其分离克隆、酶活性测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学领域，涉及一种参与小麦叶绿素、类胡萝卜素等类异戊二烯物质合成的关键酶基因法呢基焦磷酸合酶基因TaFPS的分离克隆、酶蛋白的原核表达、酶蛋白的分离纯化及酶活性体外检测技术。为进一步构建法呢基焦磷酸合酶基因的真核生物基因表达载体并转化相应作物，尤其是靠次生代谢获取重要商业价值的植物，探讨法呢基焦磷酸合酶基因在受体植物中的过量表达与次生代谢产物、作物籽粒大小及粒重等重要农艺性状的关系，进而提高农作物产量，以及对法呢基焦磷酸合酶基因内含子、外显子及启动子结构进行剖析，研究启动子功能、开发有关分子标记提供重要技术储备。

Description

小麦法呢基焦磷酸合酶基因TaFPS及其分离克隆、酶活性测定方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种参与小麦叶绿素、类胡萝卜素等类异戊二烯物质合成的关键酶基因法呢基焦磷酸合酶基因TaFPS的分离克隆、酶蛋白的原核表达、酶蛋白的分离纯化及酶活性体外检测技术。

背景技术

类异戊二烯物质存在于所有生物体中，在植物中含量尤其丰富，是维持植物生长发育、光合作用等所必需的重要有机物质。目前，已经发现了3万余种植物类异戊二烯，而且这个数字还在逐年增加。该类物质在生物体中具有各种不同的作用，可作为光合色素(如叶绿素、类胡萝卜素)、生长物质和植物激素(细胞分裂素、脱落酸、赤霉素和油菜素内酯)、膜结构的一部分如谷甾醇、电子传递受体如质体醌、作为葡萄糖基化反应中葡萄糖的受体如多萜醇，并能调控细胞的生长(如异戊烯基蛋白，细胞分裂素)。此外，很多植物类异戊二烯还具有重要的商业价值如作为食物香料、饮料、维生素A、D、E，天然杀虫剂如除虫菊素和橡胶等。

类异戊二烯物质的生物合成主要由甲羟戊酸途径中的一系列酶酶促合成的，法呢基焦磷酸合酶(FPS；EC2.5.1.1/EC2.5.1.10)是该代谢途径中分支点的关键酶，通过类异戊二烯1′-4顺序缩合的方式催化异戊烯焦磷酸(IPP)和二甲基丙烯焦磷酸(DMAPP)，首先形成栊牛儿基焦磷酸(GPP)，然后与另一分子异戊烯焦磷酸缩合形成一个多分支点的、特别重要的中间产物法呢基焦磷酸(FPP)，是控制整个代谢途径的限速酶之一。目前已分别从拟南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryza sativa)、玉米(Zea mays)、高粱(Sorghum bicolor)、橡胶(Hevea brasiliensis)等40种植物中分离克隆了法呢基焦磷酸合酶基因，在本发明申请之前，还没有公开或发表过关于从小麦(Triticum aestivum)中分离克隆法呢基焦磷酸合酶基因TaFPS、编码蛋白酶的原核基因表达、酶蛋白的分离纯化及其酶活性体外检测和动力学参数等研究资料信息。

发明内容

针对现有技术中在小麦中法呢基焦磷酸合酶基因相关技术的缺失，本发明的发明人提供了一整套关于小麦特别是品种“济南13”法呢基焦磷酸合酶基因TaFPS克隆、编码蛋白酶的原核基因表达、酶蛋白的分离纯化及其酶活性体外检测和动力学参数测定的技术。测得自小麦品种济南13克隆获得的法呢基焦磷酸合酶对底物二甲基丙烯焦磷酸(DMAPP)、异戊烯焦磷酸(IPP)和栊牛儿基焦磷酸(GPP)的V_max分别为22.7±1.5、73.5±16.9和73.0±10.8μmol/min/mg；K_M值分别为0.84±0.14、1.83±0.79和1.51±0.43μM；Kcat分别为1.67±0.11、5.42±1.25和5.38±0.80S^-1，Kcat/K_M分别为1.99x10⁶、2.96x10⁶和3.56x10⁶M^-1S^-1，由此证明克隆的小麦法呢基焦磷酸合酶基因具有天然生物学功能。本发明为进一步构建法呢基焦磷酸合酶基因的真核生物基因表达载体并转化相应作物，尤其是靠次生代谢获取重要商业价值的植物，探讨法呢基焦磷酸合酶基因在受体植物中的过量表达与次生代谢产物、作物籽粒大小及粒重等重要农艺性状的关系，进而提高农作物产量，以及对法呢基焦磷酸合酶基因内含子、外显子及启动子结构进行剖析，研究启动子功能、开发有关分子标记提供重要技术储备。

本发明提供的小麦法呢基焦磷酸合酶基因TaFPS的编码区基因序列如SeqID No：1所示，其编码的氨基酸序列如Seq ID No：2所示。

上述的小麦品种济南13中的法呢基焦磷酸合酶基因TaFPS是从小麦品种济南13中克隆获得的，其中小麦品种济南13中该基因cDNA总长为1399bp，翻译起始密码子ATG自49位核苷酸开始，终止密码子TAG位于1111位核苷酸处，在1310位核苷酸处有polyA尾巴。因此，小麦品种济南13TaFPS全长cDNA包括1个48bp的5′非编码区、1065bp编码区和1个257bp的3′非编码区，编码一条包含354aa的多肽，分子量约为42kDa，其基因序列及氨基酸序列如Seq ID No：3所示；

本发明的发明人提供了该基因的具体的分离克隆方法及其原核表达及酶活性检测的方法为：

1.小麦叶片RNA的分离提取

根据Trizol试剂盒的说明书进行。获得的RNA保存在DEPC水中备用。

2.第一链cDNA的合成

按照Takara反转录试剂盒说明书进行。

3.基因中间序列扩增、连接与转化

根据植物中FPS氨基酸序列的高度保守区设计基因中间序列扩增引物，扩增小麦FPS的相应序列。上游引物为：DFFPS：5′TGGTGTATTGAATGGCTTCAAGC3′，其基因序列如Seq ID No：4所示；下游引物为：DRFPS：5′TCATCCTGAACTTGAAAGTATGCTCCCAT3′，其基因序列如Seq ID No：5所示。根据一定条件进行PCR，利用DNA胶回收试剂盒回收461bp特异条带。

将回收的DNA片段与pGEM-T Easy载体进行连接。利用热激法转化大肠杆菌DH 5α，挑取阳性克隆，制备质粒DNA并进行DNA测序，通过NCBI比对获得目的基因片段。

4.利用RACE技术快速获得基因末端序列

4.1RACE引物设计

根据所获得的461bp的基因中间序列，设计5′RACE和3′RACE引物。

5′RACE引物(DRFPS)：5′TCATCCTGAACTTGAAAGTATGCTCCCAT3′，其基因序列如Seq ID No：5所示；

3′RACE引物(Fps-1S)：5′ACGGCTTCAGGGCAGTTGTTGGA3′，其基因序列如SeqID No：6所示。

4.2基因末端序列快速扩增

根据Clontech Laboratories INC的SMART^TmRACE cDNA Amplification kit的方法快速扩增基因的5′和3′末端，筛选重组子，并测序。

4.3基因中间序列和RACE序列使用Contig Express 9.1拼接全长序列，然后对所得的contig序列进行人工校对。

5基因全长序列的扩增

5.1基因全长引物的设计

根据中间序列和RACE序列contig结果，设计全长扩增引物。

上游引物序列为FPS-2F：5′GCTCCTTCTCGTCCCTTCT3′，其基因序列如Seq IDNo：7所示

下游引物序列为1FPS-2R.1：5′TAGCACCGTAGTTTATTGTTG3′，其基因序列如Seq ID No：8所示；

5.2全长基因的PCR扩增

以第一链cDNA为模板扩增全长目的基因，进行全长基因PCR产物的胶回收、连接、转化、PCR重组子检测、质粒提取和测序，获得全长序列为1399bp。

6基因的原核表达

6.1基因原核表达引物设计

根据所得全长序列测序结果，利用DNAMAN软件把所得的基因序列翻译成氨基酸序列，然后同NCBI已知生物法呢基焦磷酸合酶氨基酸序列进行比对来确定小麦法呢基焦磷酸合酶基因的ORF，设计连入pLM1表达载体的引物。在基因的5′端，设计带有核糖体结合位点(AGGAGGA)、限制性内切酶SalI酶切位点(GTCGAC)、起始密码子、6个组氨酸密码子以及含有法呢基焦磷酸合酶基因中编码7个氨基酸的正向引物：5′CGCGCGTCGACAGGAGGAATTTAAAATGAGAGGATCGCATCATCACCACCATCACGCGGCGGCGGCGGTGGCGTTGTC3′基因序列如Seq ID No：9所示；在基因的3′端，设计具有限制性内切酶Hind III酶切位点(AAGCTT)、终止密码子(TAG)以及含有编码7个氨基酸的反向引物：5′CTGCAGAAGCTTCTATTTCTGCCTCTTGTAGATCTTC3′，基因序列如Seq IDNo：10所示。

6.2基因原核表达载体的构建

包括基因原核表达序列PCR扩增产物的酶切、酶切产物与载体的连接、转化、阳性克隆重组子PCR鉴定、酶切鉴定、质粒DNA提取、DNA测序验证。

6.3法呢基焦磷酸合酶基因表达

首先进行法呢基焦磷酸合酶蛋白表达条件的优化，包括IPTG浓度、诱导温度的优化等。根据确定的优化条件，进行法呢基焦磷酸合酶蛋白的大量表达。

7法呢基焦磷酸合酶蛋白的纯化

利用离子交换柱分离纯化法呢基焦磷酸合酶蛋白。过柱纯化的蛋白质，装于透析袋中在一定溶液中透析去盐，纯化的蛋白质于-86℃保存备用。

8采用分光光度计检测克隆获得的法呢基焦磷酸合酶活性：

测得法呢基焦磷酸合酶对底物二甲基丙烯焦磷酸(DMAPP)、异戊烯焦磷酸(IPP)和栊牛儿基焦磷酸(GPP)的V_max分别为22.7±1.5、73.5±16.9和73.0±10.8μmol/min/mg；K_M值分别为0.84±0.14、1.83±0.79和1.51±0.43μM；Kcat分别为1.67±0.11、5.42±1.25和5.38±0.80S^-1，Kcat/K_M分别为1.99x10⁶、2.96x10⁶和3.56x10⁶M^-1S^-1，由此证明克隆的小麦法呢基焦磷酸合酶基因具有天然生物学功能。

本发明为进一步构建法呢基焦磷酸合酶基因的真核生物基因表达载体并转化相应作物，尤其是靠次生代谢获取重要商业价值的植物，探讨法呢基焦磷酸合酶基因在受体植物中的过量表达与次生代谢产物、作物籽粒大小及粒重等重要农艺性状的关系，进而提高农作物产量，以及对法呢基焦磷酸合酶基因内含子、外显子及启动子结构进行剖析，研究启动子功能、开发有关分子标记提供重要技术储备。

附图说明

图1为小麦品种济南13法呢基焦磷酸合酶氨基酸序列示意图；

图2为小麦叶片RNA电泳图谱，

图中1为DNA Marker I；2-6为小麦济南13的RNA样品；

图3为小麦法呢基焦磷酸合酶基因中间序列PCR产物电泳图谱，

图中1DNA marker；2-11为小麦济南13法呢基焦磷酸合酶基因中间序列的PCR产物，长度为461bp；

图4为小麦品种济南13法呢基焦磷酸合酶基因末端序列快速扩增PCR产物电泳图，

图中A1为DNA marker；A2为3′RACE PCR产物，大小为869bp；B1为DNAmarker；B2为5′RACE PCR产物，大小为748bp；

图5为小麦品种济南13法呢基焦磷酸合酶基因的全长cDNA电泳图，cDNA全长为1399bp；

图6为小麦品种济南13法呢基焦磷酸合酶基因的ORF的PCR扩增电泳图，引物FPS-PLM1-F/FPS-PLM1-R的PCR扩增产物长度为1102bp；

图7为含有小麦法呢基焦磷酸合酶基因ORF的pLM1质粒酶切电泳图，

图中对含有目的基因的阳性克隆的质粒DNA利用Sal I和Hind III双酶切后，获得1085bp的目的片段；

图8为原核基因表达载体pLM1结构示意图，

图中Ampcilin表示氨苄青霉素抗性，T7promoter为启动子，poly linker为多克隆位点，EcoRI和Hind III为多克隆位点边缘的限制性内切酶；

图9为纯化的小麦品种济南13法呢基焦磷酸合酶蛋白SDS-PAGE电泳图，

图中1为纯化的蛋白；2为蛋白质分子量标准；

图10为小麦法呢基焦磷酸合酶活性检测方法示意图。

具体实施方式

实施例1(小麦叶片RNA提取)

(1)用蛭石于恒温培养箱(28℃)培养小麦品种济南13长至三叶期。

(2)液氮中将叶片研磨至粉末状，移到DEPC处理的EP管中。

(3)加入适量RNAiso Plus。

(4)室温下静置5min。

(5)加入1/5RNAiso Plus体积的氯仿。振荡至乳白状。

(6)室温下静置5min。

(7)12000g，4℃离心15min。

(8)上清移到新的DEPC处理的EP管中，加入与上清等体积的异丙醇，混匀。室温下静置10min。

(9)12000g，4℃离心10min。

(10)向沉淀中加入1mL用DEPC水配制的75％乙醇。12000g 4℃离心5min。

(11)保留沉淀，通风橱中干燥至无色。

(12)加入40μL DEPC水溶解。半小时后分装并电泳检测。取0.5μL和0.8μL RNA样品，1.0％琼脂糖非变性凝胶电泳，电压140V，电泳30min，凝胶成像系统拍照纪录，结果如图2所示。

实施例2(cDNA第一条链的合成)

按照Takara反转录试剂盒的说明进行。

(1)在microtube管中配制下列混合液

(2)在PCR仪上进行下列条件的变性、退火反应：65度5分钟——冰上急冷。

(3)在上述Microtube管中配制下列反转录反应液。

(4)在PCR仪上按下列条件进行反转录反应：42℃，60min；70℃，15min；4℃冷却。

实施例3(中间序列扩增)

1中间序列的引物设计

用Primer5.0引物设计软件和DNAMAN软件，根据植物中FPS的氨基酸序列的高度保守区设计引物。

上游引物DFFPS：5′TGGTGTATTGAATGGCTTCAAGC3′(Seq ID No：4)

下游引物DRFPS：5′TCATCCTGAACTTGAAAGTATGCTCCCAT3′。(Seq ID No：5)

PCR体系为：cDNA 2ul、buffer 1.5μL、Taq酶0.3μL、dNTP 0.7μL、DFFPS 0.6μL、DRFFPS 0.6μL、ddH2O 9.8μL。

PCR程序为：94℃3min、94℃45s、55℃45s、72℃1min、72℃6min，32cycles。

2中间序列的PCR结果检测

取8μL PCR扩增产物与1μL溴酚蓝混匀，点入1.5％琼脂糖凝胶中，在120V电压下电泳45min，紫外凝胶成像系统观察并照相。如图3所示PCR得到一461bp的DNA片段，结果如图3所示。

3扩增片段的回收

PCR产物经常规琼脂糖凝胶(TaKaRa Agarose，1.5％浓度)电泳，在紫外灯(波长302nm)下观察，割取目的DNA条带。以DNA胶回收试剂盒(TaKaRa Agarose GelDNA Purification Kit Ver2.0，大连宝生物产品)回收特异条带。

(1)在紫外灯下用干净、无菌手术刀片切除含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体，此时应注意尽量切除不含有目的DNA部分的凝胶。

(2)向胶块中加入胶块融化液DR-I Buffer。

(3)混匀后75℃加热融化胶块，此时应间断振荡混合，使胶块充分融化(约610min)。

(4)加入DR-I Buffer 1/2体积量的DR-II Buffer，吹吸混匀，当分离461bp的DNA片段时，在上述溶液中再加入终浓度为20％的异丙醇。

(5)将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。

(6)将上述操作的溶液转移至Spin Column中，12000rpm，离心1min，弃滤液。将滤液再加入Spin Column中，离心一次，可以提高DNA回收率。

(7)加入500μL Rinse A，12000rpm离心1min，弃滤液。

(8)加入700μL Rinse B，12000rpm离心1min，弃滤液。

(9)重复8一次。

(10)将Spin Column安置于新的1.5mL离心管上，在Spin Column膜中央处加入25μL 60℃预热的灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1min。

(11)12000rpm离心1min，洗脱DNA，-20℃保存DNA备用。

4回收产物的电泳检测

取5μL回收的中间序列PCR产物，用1.5％琼脂糖凝胶中电泳检测回收效率。

5PCR产物的连接

根据回收片段的浓度确定产物和pGEM-T Easy Vector之间的比例。连接步骤如下：

(1)加入DNA 3.75μL，T载体0.25μL，轻轻混匀。

(2)45℃水浴5min，立即转入冰上5min。

(3)再加入T4 DNA连接酶0.5μL和2xRapid Ligation Buffer0.5μL混匀，于PCR仪上16℃连接16h以上。

6转化、培养

(1)将5μL连接液加入含50μL感受态细胞的离心管中，吹吸混匀，冰上放置30min。

(2)42℃水浴热激90s，立即冰浴2min。

(3)加入950μL LB液体培养基，置于37℃摇床，230rpm振荡培养1h，使细胞复苏并表达抗性。

(4)3000rmp离心3min。于超净工作台中去900μL上清，留100μL。

(5)取70μL菌液均匀地涂布于LB固体培养基上，剩余30μL涂布在另外一个LB固体培养基上。37℃倒置培养12～16h，直至出现菌落。

7阳性重组子鉴定

用灭菌枪头挑取单个白斑菌落于4mL含有100μg/mL Amp的LB液体培养基中，230rpm，37℃过夜振荡培养。以菌液为模板，用PCR方法对含有插入片段的克隆进行筛选。菌液PCR反应体系和反应程序参照以上方法。取2.5μL PCR反应产物，经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。

8质粒DNA提取

(1)取1500μL菌液加入Eppendorf管中，12000rpm，离心1min，弃上清，沥干残液。

(2)加250μL solution I，置于涡旋振荡器上振荡，充分悬浮菌体。

(3)加250μL solution II，轻轻颠倒混匀4-6次，室温下1min。整个过程不要超过5min。

(4)加350μL solution III，轻轻混匀，室温下放置5min。

(5)12000rmp，离心10min。

(6)取上清液，移入柱中。8000rmp离心2min。

(7)去废液，加入500μL washing solutions，10000rmp，1min。

(8)重复(7)。

(9)去废液，柱子于10000rmp离心2min。

(10)柱子室温下放置10min。

(11)将柱子套到新的Eppendorf管中，加入50μL Elution Buffer。室温下放置2min，10000rmp离心2min。(Elution Buffer预热到60℃效果最好)

(12)-20℃保存备用。

9质粒DNA浓度检测和测序

取2.5μL质粒于1.0％琼脂糖凝胶中电泳检测浓度。取15个阳性质粒送上海生工生物技术有限公司测序。

10DNA序列分析

通过DNAMAN和NCBI比对分析，获得小麦法呢基焦磷酸合酶基因的部分序列。

实施例4(通过RACE技术快速获得末端序列)

RACE是基于PCR技术基础上由已知一段cDNA片段，通过向两端延伸扩增从而获得完整的3′端和5′端的方法。该方法同筛库法相比较，有许多优点：首先RACE技术是通过PCR技术实现的，无需建立cDNA文库，可以在很短的时间内获得有价值的信息。其次，只要引物设计正确，在初级产物基础上就可以获得感兴趣基因的全长。再次，该技术节约了实验时间和经费。

1RACE引物的设计

根据所获得的461bp的基因中间序列，设计5′RACE和3′RACE引物。

5′RACE引物(DRFPS)：5′TCATCCTGAACTTGAAAGTATGCTCCCAT3′；(Seq ID No：5)

3′RACE引物(Fps-1S)：5′ACGGCTTCAGGGCAGTTGTTGGA3′。(Seq ID No：6)

2第一链cDNA合成

(1)①对于5′-RACE-Ready cDNA

②对于3′-RACE-Ready cDNA

RNA                     2μL

3′-CDS primer A        1μL

DEPC water              2μL

(2)微离心。

(3)在PCR仪上进行70℃2min。

(4)冰上放置2min，微离心。

(5)向上管中分别加入：

(6)涡旋并离心。

(7)在PCR仪上进行42℃1.5h

(8)分别加入100μL 的Tricine-EDTA Buffer。

(9)72℃7min。

(10)-20℃保存3个月。

3RACE快速扩增末端序列

(1)准备Master Mix

(2)涡旋，微离心。

(3)①对于5′-RACE

②对于3′-RACE

(4)混匀，离心。

(5)PCR程序：

5′-RACE PCR程序：94℃1min、94℃35s、60℃35s、72℃2min，35个循环，72℃8min。扩增出一约700bp的DNA片段。

3′-RACE PCR程序：94℃3min、94℃30s、66℃30s、72℃3min，30个循环，72℃6min。扩增出一约800bp的DNA片段。

所得的PCR产物经1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，并照相，结果如图4所示。

4RACE PCR产物纯化、连接、转化步骤

RACE PCR产物纯化方法：

PCR产物经常规琼脂糖凝胶(TaKaRa Agarose，1.5％浓度)电泳，在紫外灯(波长302nm)下观察，割取目的DNA条带。以DNA胶回收试剂盒(TaKaRa Agarose GelDNA Purification Kit Ver2.0，大连宝生物产品)回收特异条带。

(1)在紫外灯下用干净、无菌手术刀片切除含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体，此时应注意尽量切除不含有目的DNA部分的凝胶。

(2)向胶块中加入胶块融化液DR-I Buffer。

(3)混匀后75℃加热融化胶块，此时应间断振荡混合，使胶块充分融化(约6～10min)。

(4)加入DR-I Buffer 1/2体积量的DR-II Buffer，吹吸混匀，当分离400bp左右的DNA片段时，在上述溶液中再加入终浓度为20％的异丙醇。

(5)将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。

(6)将上述操作的溶液转移至Spin Column中，12000rpm，离心1min，弃滤液。将滤液再加入Spin Column中，离心一次，可以提高DNA回收率。

(7)加入500μL Rinse A，12000rpm离心1min，弃滤液。

(8)加入700μL Rinse B，12000rpm离心1min，弃滤液。

(9)重复8一次。

(10)将Spin Column安置于新的1.5mL离心管上，在Spin Column膜中央处加入25μL 60℃预热的灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1min。

(11)12000rpm离心1min，洗脱DNA，-20℃保存DNA备用。

连接方法：

根据回收片段的浓度确定产物和pGEM-T Easy Vector之间的比例。连接步骤如下：

(1)加入DNA 3.75μL，T载体0.25μL，轻轻混匀。

(2)45℃水浴5min，立即转入冰上5min。

(3)再加入T4 DNA连接酶0.5μL和2x Rapid Ligation Buffer0.5μL混匀，于PCR仪上16℃连接16h以上。

转化方法：

(1)将5μL连接液加入含50μL感受态细胞的离心管中，吹吸混匀，冰上放置30min。

(2)42℃水浴热激90s，立即冰浴2min。

(3)加入950μL LB液体培养基，置于37℃摇床，230rpm振荡培养1h，使细胞复苏并表达抗性。

(4)3000rmp离心3min。于超净工作台中去900μL上清，留100μL。

(5)取70μL菌液均匀地涂布于LB固体培养基上，剩余30μL涂布在另外一个LB固体培养基上。37℃倒置培养12～16h，直至出现菌落。

5RACE PCR产物重组子的筛选

筛选方法一：用5′-RACE引物和3′-RACE引物对白斑的菌液进行菌液PCR。

筛选方法二：用T7和SP6引物进行菌液PCR。程序为：94℃3min、94℃45s、64℃45s、72℃2min，35cycles，72℃10min。

6中间序列和RACE序列使用Contig Express 9.1拼接全长序列

打开contig Express 9.1软件，输入″Project---Add Fragments---From ABIfile...″。在″Import Sequence From″对话框中选择测序公司发给的ABI文件，点击″Assemble---Assemble Selected Fragments″。然后对所得的contig序列进行人工校对。

实施例5(法呢基焦磷酸合酶基因全长序列的扩增)

1引物的设计

根据中间序列和RACE序列contig结果，设计全长引物。

上游引物序列为FPS-2F：5′GCTCCTTCTCGTCCCTTCT3′(Seq ID No：7)

下游引物序列为1FPS-2R.1：5′TAGCACCGTAGTTTATTGTTG3′(Seq ID No：8)

2全长基因的PCR扩增

以第一链cDNA为模板扩增全长TaFPS基因，其PCR体系为：water 9.3μL、10x PCR buffer 1.5μL、dNTP 0.7μL、P1 0.6μL、P2 0.6μL、LATag 0.3μL、DMSO 2μL。

PCR程序为：94℃5min、94℃45s、63℃45s、72℃2min、72℃10min，35cycles。

3全长基因PCR产物的胶回收、连接、转化、菌液PCR重组子检测、质粒提取和测序

全长基因PCR产物纯化方法：

PCR产物经常规琼脂糖凝胶(TaKaRa Agarose，1.5％浓度)电泳，在紫外灯(波长302nm)下观察，割取目的DNA条带。以DNA胶回收试剂盒(TaKaRa Agarose GelDNA Purification Kit Ver2.0，大连宝生物产品)回收特异条带。

(1)在紫外灯下用干净、无菌手术刀片切除含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体，此时应注意尽量切除不含有目的DNA部分的凝胶。

(2)向胶块中加入胶块融化液DR-I Buffer。

(3)混匀后75℃加热融化胶块，此时应间断振荡混合，使胶块充分融化(约6～10min)。

(4)加入DR-I Buffer 1/2体积量的DR-II Buffer，吹吸混匀，当分离400bp左右的DNA片段时，在上述溶液中再加入终浓度为20％的异丙醇。

(5)将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。

(6)将上述操作的溶液转移至Spin Column中，12000rpm，离心1min，弃滤液。将滤液再加入Spin Column中，离心一次，可以提高DNA回收率。

(7)加入500μL Rinse A，12000rpm离心1min，弃滤液。

(8)加入700μL Rinse B，12000rpm离心1min，弃滤液。

(9)重复(8)一次。

(10)将Spin Column安置于新的1.5mL离心管上，在Spin Column膜中央处加入25μL 60℃预热的灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1min。

(11)12000rpm离心1min，洗脱DNA，-20℃保存DNA备用。

连接方法：

连接步骤如下：

(1)加入DNA 3.75μL，T载体0.25μL，轻轻混匀。

(2)45℃水浴5min，立即转入冰上5min。

(3)再加入T4 DNA连接酶0.5μL和2x Rapid Ligation Buffer0.5μL混匀，于PCR仪上16℃连接16h以上。

转化方法：

(1)将5μL连接液加入含50μL感受态细胞的离心管中，吹吸混匀，冰上放置30min。

(2)42℃水浴热激90s，立即冰浴2min。

(3)加入950μL LB液体培养基，置于37℃摇床，230rpm振荡培养1h，使细胞复苏并表达抗性。

(4)3000rmp离心3min。于超净工作台中去900μL上清，留100μL。

(5)取70μL菌液均匀地涂布于LB固体培养基上，剩余30μL涂布在另外一个LB固体培养基上。37℃倒置培养12～16h，直至出现菌落。

菌液PCR重组子检测

用灭菌枪头挑取单个白斑菌落于4mL含有100μg/mL Amp的LB液体培养基中，230rpm，37℃过夜振荡培养。以菌液为模板，用PCR方法对含有插入片段的克隆进行筛选。菌液PCR反应体系和反应程序参照以上方法。取2.5μL PCR反应产物，经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。

质粒提取

(1)取1500μL菌液加入Eppendorf管中，12000rpm，离心1min，弃上清，沥干残液。

(2)加250μL solution I，置于涡旋振荡器上振荡，充分悬浮菌体。

(3)加250μL solution II，轻轻颠倒混匀4-6次，室温下1min。整个过程不要超过5min。

(4)加350μL solution III，轻轻混匀，室温下放置5min。

(5)12000rmp，离心10min。

(6)取上清液，移入柱中。8000rmp离心2min。

(7)去废液，加入500μL washing solutions，10000rmp，1min。

(8)重复(7)。

(9)去废液，柱子于10000rmp离心2min。

(10)柱子室温下放置10min。

(11)将柱子套到新的Eppendorf管中，加入50μL Elution Buffer。室温下放置2min，10000rmp离心2min。(Elution Buffer预热到60℃效果最好)

(12)-20℃保存备用。

测序：

取2.5μL质粒于1.0％琼脂糖凝胶中电泳检测浓度。取15个阳性质粒送上海生工生物技术有限公司测序。

实施例6(法呢基焦磷酸合酶基因的原核表达)

1法呢基焦磷酸合酶基因原核表达引物设计

根据所得全长序列测序结果，利用DNAMAN软件把所得基因序列翻译成氨基酸序列，同NCBI公布的已知生物氨基酸序列进行比对来确定小麦法呢基焦磷酸合酶基因的ORF，然后设计连入pLM1表达载体的引物。上游引物为5′CGCGCGTCGACAGGAGGAATTTAAAATGAGAGGATCGCATCATCACCACCATCACGCGGCGGCGGCGGTGGCGTTGTC3′(Seq ID No：9)；下游引物为5′CTGCAGAAGCTTCTATTTCTGCCTCTTGTAGATCTTC3′(Seq ID No：10)。

2法呢基焦磷酸合酶基因原核表达序列的PCR扩增

以法呢基焦磷酸合酶全长基因并且不含有突变碱基的质粒为模板，进行PCR扩增，其PCR体系为：water 9.3μL、10x GC-PCR I buffer 1.5μL、dNTP 0.7μL、P1 0.6μL、P2 0.6μL、LA-Tag 0.3μL。

PCR程序为：94℃5min、94℃45s、64℃45s、72℃2min、72℃10min，35cycles。所得PCR产物送上海生工测序。

3法呢基焦磷酸合酶基因原核表达序列PCR扩增产物的酶切

利用fermentas公司的Sal I和Hind III限制性内切酶对纯化的PCR和pLM I分别进行酶切。然后胶回收酶切产物。方案如下：

(1)向0.5mL离心管中依次加入：

(2)37℃3h，然后80℃30min灭活酶。同时用1.2％的胶电泳检测酶切结果。

(3)对酶切正确的片段进行胶回收。

4酶切产物的连接和转化

根据回收片段浓度确定目的片段产物和pLM I酶切片段之间连接的比例，两者混匀后加入适量NEB公司的T4 DNA Ligase和2x Ligation Buffer。涡旋混匀，离心。在PCR仪上16℃连接16h以上。连接完成以后，转化E.coil Dh5α菌株。涂布在只含amp抗生素的LB固体培养基上倒置培养16h。

5阳性克隆重组子PCR、酶切鉴定及质粒提取

挑取培养基上的白斑，用LB液体培养基过夜培养。然后做菌液PCR。对正确的阳性质粒送上海生工测序以确保没有在PCR等操作过程中引入突变。

6法呢基焦磷酸合酶蛋白表达条件的优化

(1)IPTG浓度的优化

1)从含有重组质粒的表达菌株新鲜菌液中分别取出30μL接种至含10mL的LB液体培养基(其中含100μg/mL氨苄青霉素)的试管中。

2)37℃、200rpm振荡培养至菌液OD600值约为0.8时，加入IPTG至终浓度分别为0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mmol/L。

3)37℃诱导8h。5000r/min 10-15min离心收集菌体。

4)用等体积的去离子灭菌水冲洗菌体。5000r/min 10-15min离心收集菌体。

5)用1mL start Buffer(20mM磷酸钾，PH7.4，0.5M NaCl)重悬菌体。

6)加入5mg lysozyme(溶解酶)，37℃1小时。

7)-80℃放置大于1小时。

8)30℃水浴解冻。

9)超声破碎细胞10s，间隔30s。(130瓦)共1min。

10)收集菌体并经超声波破碎，进行SDS-PAGE电泳、染色、脱色、观察并分析电泳结果。

(2)诱导温度的优化

1)从含有重组质粒的表达菌株新鲜菌液中分别取出30μL接种至含10mL的LB液体培养基(其中含100μg/mL氨苄青霉素)的试管中。

2)37℃、200rpm振荡培养至菌液OD600值约为0.8时，加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L，于37℃下130rpm诱导表达8h，或于室温条件下(约15℃)130rpm过夜表达。收集菌体并破碎处理，进行SDS-PAGE电泳、染色、脱色、观察并分析电泳结果，结果如图9所示。

7法呢基焦磷酸合酶蛋白的大量表达

(1)将阳性重组质粒转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)。

(2)挑单克隆于10mL LB培养基(Amp浓度为100mg/L)中培养过夜。

(3)取5mL/10mL过夜培养的含有目的基因质粒的BL21(DE3)菌液加到500mLLB培养(Amp浓度为100mg/L)。37℃摇床培养约2.5h，至OD600＝0.8时，加入IPTG(终浓度为0.5mM)(2.5mL 100mM IPTG或59.5mg)。

(4)室温条件下130rmp摇床培养过夜。

(5)5000r/min 10-15min离心收集菌体。用等体积的去离子灭菌水冲洗菌体。5000r/min 10-15min离心收集菌体。

8蛋白的纯化

(1)用40mL start Buffer(20mM磷酸钾，PH7.4，0.5M NaCl)重悬菌体。

(2)加入5mg lysozyme(溶解酶)，37℃1小时。

(3)-80℃放置大于1小时。

(4)30℃水浴解冻。

(5)超声破碎细胞10s，间隔30s。(130瓦)。

(6)7000r离心15min，上清用于蛋白纯化。

(7)Hi-Trap柱与0.45μm的过滤器、注射器连接好，取5mL灭菌水缓慢注入柱中去除柱中的乙醇。

(8)再取3mL 0.1M硫酸镍注入柱中，用5mL去离子水洗掉没有结合的镍离子，然后用5mL start Buffer平衡。

(9)取10-20mL上清注入柱中

(10)用5mL start Buffer洗柱。

(11)5mL wash Buffer(20mM磷酸钾，PH7.4，0.5M NaCl，50mM imidazole咪唑)洗柱。

(12)用5mL elution Buffer(20mM磷酸钾，PH7.4，0.5M NaCl，500mMimidazole咪唑)溶解蛋白，用1.5mL离心管收集，每管收集1mL。

9纯化蛋白的透析去盐

将过柱纯化的蛋白质移于透析袋中，在含有5％甘油、5mMβ-巯基乙醇、20mMTris-HCl缓冲液(PH7.5)的磁力搅拌器中4℃透析20小时，中间换透析液3次。纯化的蛋白质于-86℃冰箱中保存备用。

实施例7(小麦法呢基焦磷酸合酶活性测定)

小麦法呢基焦磷酸合酶的活性、动力学参数的测定，利用焦磷酸酶将酶促反应产生的焦磷酸转化成单磷酸并与钼酸盐反应形成无色Keggin型磷酸钼酸盐复合物(Pmo^VI ₁₂O₄₀ ^3-)，被β-巯基乙醇还原形成在830nm具有吸收峰的蓝色复合物(PMo^V ₄Mo^VI ₈O₄₀ ^7-)，可用分光光度计检测，具体实验如下。

1在96孔平板酶标仪的每个孔里依次加入下列试剂，使反应体系的总体积为100μL。

77.5μl H2O，

50mM Tris，5μL(1M)

2mM MgCl2，5μL(40mM)

5mg/ml BSA，5μL(100mg/ml)

1mM DTT，5μL(20mM)

0.5μL IPP(200μg/200μL)

0.5μL DMAPP(200μg/200μL)或GPP

0.1μg FPPS(可根据情况调整)

混匀后放入酶标仪中37℃反应5min。

2取出96孔板加入0.5μL pyrophosphatase，放入酶标仪中37℃反应5min。

3取出96孔板加入10μL钼酸铵，放入酶标仪中37℃反应5min。

4取出96孔板加入10μL β-巯基乙醇，5μL Eikonogen Reagent，放入酶标仪中37℃反应20min。

5取出96孔板拿下盖子，放入酶标仪中读830nm处吸光度。

酶动力学参数的测定：对IPP的K_M值的测定，首先固定DMAPP的浓度为33.6μM，测定IPP的5个不同浓度下的酶活力单位；对DMAPP的K_M值的测定，首先固定IPP的浓度为33.6μM，测定DMAPP的5个不同浓度下的酶活力单位；对GPP的K_M值的测定，首先固定IPP的浓度为33.6μM，测定GPP的5个不同浓度下的酶活力单位，然后根据米氏公式y＝ax/(b+x)，利用SigmaPlot12即可获得K_M值和Vmax值。

最终测得自小麦品种济南13克隆获得的法呢基焦磷酸合酶对底物二甲基丙烯焦磷酸(DMAPP)、异戊烯焦磷酸(IPP)和栊牛儿基焦磷酸(GPP)的V_max分别为22.7±1.5、73.5±16.9和73.0±10.8μmol/min/mg；K_M值分别为0.84±0.14、1.83±0.79和1.51±0.43μM；Kcat分别为1.67±0.11、5.42±1.25和5.38±0.80S^-1，Kcat/K_M分别为1.99x10⁶、2.96x10⁶和3.56x10⁶M^-1S^-1，由此证明克隆的小麦法呢基焦磷酸合酶基因具有天然生物学功能；

本发明为进一步构建法呢基焦磷酸合酶基因的真核生物基因表达载体并转化相应作物，尤其是靠次生代谢获取重要商业价值的植物，探讨法呢基焦磷酸合酶基因在受体植物中的过量表达与次生代谢产物、作物籽粒大小及粒重等重要农艺性状的关系，进而提高农作物产量，以及对法呢基焦磷酸合酶基因内含子、外显子及启动子结构进行剖析，研究启动子功能、开发有关分子标记提供重要技术储备。

Claims (2)

1.小麦法呢基焦磷酸合酶基因TaFPS的编码区基因序列如SeqID No：1所示，其编码的氨基酸序列如Seq ID No：2所示。

2.如权利要求1所述的小麦法呢基焦磷酸合酶基因TaFPS在构建法呢基焦磷酸合酶基因的真核生物基因表达载体并转化相应作物上的应用。

Images