CN109295072A - 一种烟草烟碱合成调控基因NtERF115及其克隆方法与应用 - Google Patents

一种烟草烟碱合成调控基因NtERF115及其克隆方法与应用 Download PDF

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曾建敏
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刘勇
黄昌军
吴兴富
徐向丽
贺晓辉
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Abstract

本发明公开了一种烟草烟碱合成调控基因NtERF115及其克隆方法与应用，烟碱合成调控基因NtERF115核苷酸序列如SEQ ID：No.1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID：No.2所示。本发明还公开了烟碱合成调控基因NtERF115的克隆方法，具体步骤包括：A、确定NtERF115基因序列；B、提取烟草RNA，反转录得到第一链cDNA；C、根据NtERF115基因序列设计合成特异性引物，以cDNA作为模板，进行PCR扩增；D、回收和纯化PCR产物；E、纯化产物与载体连接，转化感受态细胞；F、筛选阳性克隆，对阳性克隆PCR扩增、测序。通过调控NtERF115基因的表达，可提高烟草烟叶中烟碱含量。

Description

一种烟草烟碱合成调控基因NtERF115及其克隆方法与应用
技术领域
本发明属于遗传工程技术领域，具体涉及一种烟草烟碱合成调控基因NtERF115的克隆方法与应用。
背景技术
烟草（Nicotiana tabacum）是重要的经济作物，是茄科一年生草本植物。烟碱是栽培烟草重要的特征化合物，占烟草总生物碱的95%左右。
ERF (Ethylene Responsive Factor) 转录因子基因是调控烟碱合成重要的调控因子。烟草中调控烟碱合成的NIC2遗传位点已被发现是由至少7个ERF基因组成，如ERF189等。ERF类转录因子基因调控烟碱合成的分子机理也逐渐清晰，可以通过直接结合烟碱合成途径基因启动子中的GCC-box 来激活该基因的表达，进而增强烟碱的合成。我们通过对茉莉素处理后烟草BY-2细胞系的转录组进行分析后获得NtERF115基因，并进行了理论研究和应用实践，发现过表达NtERF115能够显著提高烟草烟叶中烟碱含量，为利用植物基因工程技术提高烟叶中烟碱含量提供了靶标基因。
国际上一些知名烟草公司和研究机构正研究利用生物技术手段提高烟草烟碱含量，以提高烟草品质，降低电子烟等产品的烟碱原料生产成本。目前，我国也深入研究烟碱合成的调控机理，为培育高烟碱低焦油烟草品种提供理论基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种烟草烟碱合成调控基因NtERF115；第二目的在于提供所述的烟草烟碱合成调控基因NtERF115的克隆方法；第三目的在于提供所述的烟草烟碱合成调控基因NtERF115的应用。
本发明的第一目的是这样实现的，所述的烟草烟碱合成调控基因NtERF115的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。
本发明的第二目的是这样实现的，包括以下步骤：
A、确定NtERF115基因序列；
通过分析茉莉素处理后BY-2细胞的转录组数据，获得受茉莉素正向调控ERF家族基因1个，序列比对发现该基因为NtERF115。根据该基因序列设计基因克隆引物：
正向引物：5’- CGGGATCCATGAATCCCAATAATGCAACCT-3’；
反向引物：5’- ATGCGGCCGCTTATAGCAGCATTTGTAGGTTC -3’；
B、提取烟草根组织RNA，反转录得到第一链cDNA；
C、以反转录得到的第一链cDNA作为模板，利用NtERF115基因克隆引物进行PCR扩增，选用Phusion高保真扩增酶反应体系，体系总体积50 μL，包括：200 ng cDNA，5×Phusion HF反应缓冲液10 μL，10 mM dNTP 1 μL，2 U的Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase，10μM的正反向引物各1 μL，补水至50 μL。 PCR反应在Mastercycler® pro扩增仪上进行，反应程序为：98℃，30秒；98℃，7秒，57℃，30秒，72℃，30秒，35个循环；72℃延伸7分钟，回收和纯化PCR产物；
D、纯化产物与载体连接，通过试剂盒反应与TOPO载体连接，连接体系与过程如下： 4μL纯化产物、1μL salt solution、1μL PCR®-BluntⅡ-TOPO 混匀，25℃，水浴30min；将连接好的载体通过热激转化大肠杆菌DH5α，加液体培养基振荡培养后涂布至含100mg/L 卡那霉素的LB平板上过夜培养，挑取菌落进行培养，取2mL菌液提取质粒，进行质粒PCR检测，对阳性克隆进行测序。
本发明的第三目的是这样实现的，所述的烟草烟碱合成调控基因NtERF115在获得烟碱含量显著提高的转基因植株中的应用；即所述的烟草烟碱合成调控基因NtERF115用于提高烟草烟叶的烟碱含量。
本发明从烟草中得到一个烟草烟碱合成调控基因NtERF115，具体步骤为：通过分析茉莉素处理后BY-2细胞的转录组数据，获得受茉莉素正向调控ERF家族基因1个，序列比对发现该基因为NtERF115。根据该基因序列信息设计基因特异引物进行PCR反应，得到目的产物；对目的产物测序，得到NtERF115基因序列；利用农杆菌介导的遗传转化方法获得NtERF115基因的过表达（OE）株系，对NtERF115进行功能鉴定，结果表明NtERF115基因具有提高烟草烟碱含量的功能。NtERF115基因的发现，为调控烟草烟碱的合成提供了基因资源。
附图说明
图1为NtERF115基因的克隆；
图2为菌落PCR检测重组过表达载体Pk2-ERF115的农杆菌转化效果；
图3为T1代过表达株系目标基因表达水平分析；
图4为T1代转基因株系烟叶烟碱含量分析。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
本发明所述的烟草烟碱合成调控基因NtERF115的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO：1所示。
所述的烟草烟碱合成调控基因NtERF115编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明所述的烟草烟碱合成调控基因NtERF115的克隆方法，其特征在于包括以下步骤：
A、确定NtERF115基因序列；
通过分析茉莉素处理后BY-2细胞的转录组数据，获得受茉莉素正向调控ERF家族基因1个，序列比对发现该基因为NtERF115。根据该基因序列设计基因克隆引物：
正向引物：5’- CGGGATCCATGAATCCCAATAATGCAACCT-3’；
反向引物：5’- ATGCGGCCGCTTATAGCAGCATTTGTAGGTTC -3’；
B、提取烟草根组织RNA，反转录得到第一链cDNA；
C、以反转录得到的第一链cDNA作为模板，利用NtERF115基因克隆引物进行PCR扩增，选用Phusion高保真扩增酶反应体系，体系总体积50 μL，包括：200 ng cDNA，5×Phusion HF反应缓冲液10 μL，10 mM dNTP 1 μL，2 U的Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase，10μM的正反向引物各1 μL，补水至50 μL。 PCR反应在Mastercycler® pro扩增仪上进行，反应程序为：98℃，30秒；98℃，7秒，57℃，30秒，72℃，30秒，35个循环；72℃延伸7分钟，回收和纯化PCR产物；
D、纯化产物与载体连接，通过试剂盒反应与TOPO载体连接，连接体系与过程如下： 4μL纯化产物、1μL salt solution、1μL PCR®-BluntⅡ-TOPO 混匀，25℃，水浴30min；将连接好的载体通过热激转化大肠杆菌DH5α，加液体培养基振荡培养后涂布至含100mg/L 卡那霉素的LB平板上过夜培养，挑取菌落进行培养，取2mL菌液提取质粒，进行质粒PCR检测，对阳性克隆进行测序。
C步骤中所述的特异性引物（正反向引物）为：
正向引物：5’- CGGGATCCATGAATCCCAATAATGCAACCT-3’；
反向引物：5’- ATGCGGCCGCTTATAGCAGCATTTGTAGGTTC -3’；
D步骤中所述的培养基为：称取胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g溶解于1L蒸馏水中，高温灭菌（121℃，25min）后使用。
本发明所述的烟草烟碱合成调控基因NtERF115的应用为所述的烟草烟碱合成调控基因NtERF115在用于获得烟叶烟碱含量显著提高的转基因植株中的应用。
所述获得烟叶烟碱含量显著提高转基因植株的方法包括以下步骤：
A、过表达（OE）载体- pK2-ERF115的构建；
（1）以云烟87根的cDNA为模板，利用基因特异引物进行扩增，得到大小约为0.7kb的基因片段。
（2）将回收的基因片段进行TOPO克隆，连接到PCR®-BluntⅡ-TOPO（3.5kb）载体后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取质粒进行测序检测。
（3）由于基因克隆上下游引物分别带有BamH I、Not I的识别位点，因此选择这两个酶对检测正确的质粒样品进行双酶切检测，将目的基因片段胶回收；对pENTR™2B进行BamH I、Not I双酶切后将目的载体片段胶回收。将目的基因、载体片段进行连接、转化感受态细胞DH5α，PCR扩增检测获得构建成功的重组质粒pENTR™2B-ERF115。
（4）pENTR™2B-ERF115和pK2GW7进行 LR反应后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到表达载体pK2-ERF115。
B、烟草的遗传转化；
采用冻融法转化质粒pK2-ERF115进入农杆菌C58C1感受态细胞，涂布在含壮观霉素和利福平的LB平板上28℃生长两天后，进行菌落PCR检测，检测结果呈阳性，表明重组质粒pK2-ERF115已转入农杆菌。
C、过表达（OE）载体导入烟草、培养转基因植株；
a、挑取含有目标重组载体的农杆菌克隆，在含有壮观霉素和利福平的LB平板上划线，28℃培养2~3天；刮取划线菌斑接菌于含有壮观霉素和利福平的LB培养基中，28℃，220rpm振荡培养，菌液浓度达到OD=0.5~0.8时6,000rpm离心5分钟富集菌体，弃上清，再用20mL液体MS培养基重悬菌体，得到含目标载体的农杆菌悬浮菌液；
b、将烟草叶片置于500mL广口瓶中，加入适量75%乙醇，漂洗30秒；弃乙醇，加入0.1%的HgCl2溶液，置摇床上室温振荡5分钟；弃HgCl2溶液，用无菌水冲洗6遍；
c、将烟草叶片取出，用无菌吸水纸吸去表面液体，使用剪刀将无菌叶片切成约1cm×1cm的小片，将切成小片的烟草叶片放入含目标载体的悬浮菌液中，静置15~20min；取出烟草叶片，使用无菌滤纸吸去多余菌液，于含有6-BA （0.02mg/L）、NAA （2mg/L）的MS培养基中25℃暗培养两天；随后，把烟草叶片转入分化培养基中，切口接触培养基，于温室条件下分化培养；分化培养基为含有6-BA （0.5mg/L）、NAA （0.1mg/L）、卡那霉素（100mg/L）、头孢霉素（500mg/L）的MS培养基，每2~3周继代培养1次，切口处逐渐长出愈伤组织，最终分化出芽；
d、将长至3~5cm的芽切下，转入MS培养基诱导生根，取出生根后的转化植株用自来水洗净培养基，移植于灭菌的营养土中；
e、转化植株经NtERF115基因特异引物PCR验证扩增，鉴定转基因阳性植株。
下面以具体实施例对本发明做进一步说明：
实施例1——NtERF115基因的分离克隆
通过分析茉莉素处理后BY-2细胞的转录组数据，获得受茉莉素正向调控ERF家族基因1个，序列比对发现该基因为NtERF115。根据该基因序列设计基因克隆引物进行PCR反应，得到目的产物；对目的产物测序，得到NtERF115基因序列；其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，编码229个氨基酸，如序列表SEQIDNO.2所示。
提取云烟87根部RNA，抽提使用Trizol试剂盒（Invitrogen,按该试剂盒提供的说明书操作）。
取2μg RNA进行反转录，利用PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser（TAKARA）试剂盒进行基因组DNA去除并反转录（按试剂盒操作手册操作）。
将反转录得到的第一链cDNA作为模板，用于PCR扩增NtERF115基因全长，并设计特性行引物如下：
正向引物：5’- CGGGATCCATGAATCCCAATAATGCAACCT-3’；
反向引物：5’-ATGCGGCCGCTTATAGCAGCATTTGTAGGTTC -3’；
PCR反应体系为50 μL，包括：200 ng cDNA，5×Phusion HF反应缓冲液10 μL，10 mMdNTP 1 μL，2 U的Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase，10 μM的正反向引物各1 μL，补水至50 μL。 PCR反应在Mastercycler® pro扩增仪上进行，反应程序为：98℃，30秒；98℃，7秒，57℃，30秒，72℃，30秒，35个循环；72℃延伸7分钟。
产物经1%（1g/100mL电泳缓冲液）琼脂糖凝胶电泳分离，扩增结果产生一条单一PCR条带，见图1。用QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN，德国）回收扩增条带，提取步骤参照试剂盒使用说明。回收纯化的DNA与TOPO载体（Invitrogen ZERO BluntII-TOPO -PCRCloning kit）连接，按说明书操作。连接产物利用热激法转化大肠杆菌DH5α，在含有100mg/L卡那霉素的LB固体平板中筛选阳性克隆，挑取5个克隆测序（大连宝生物工程有限公司）。
测序结果表明该基因核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示，通过测序、比对确定是本发明需要的目的基因：NtERF115。NtERF115基因包括690bp的开放阅读框；编码229个氨基酸。
实施例2——过表达（OE）载体-pK2-ERF115的构建；
（1）以云烟87根的cDNA为模板，利用基因特异引物进行扩增，得到大小约为0.7kb的基因片段。
（2）将回收的基因片段进行TOPO克隆，连接到PCR®-BluntⅡ-TOPO（3.5kb）载体后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取质粒进行测序检测。
（3）由于基因克隆上下游引物分别带有BamH I、Not I的识别位点，因此选择这两个酶对检测正确的质粒样品进行双酶切检测，将目的基因片段胶回收；对pENTR™2B进行BamH I、Not I双酶切后将目的载体片段胶回收。将目的基因、载体片段进行连接、转化感受态细胞DH5α，PCR扩增检测获得构建成功的重组质粒pENTR™2B-ERF115。
（4）pENTR™2B-ERF115和pK2GW7进行 LR反应后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到表达载体pK2-ERF115。
实施例3 ——烟草的遗传转化
a、采用冻融法转化质粒pK2-ERF115进入农杆菌C58C1感受态细胞，涂布在含壮观霉素和利福平的LB平板上28℃生长两天后，进行菌落PCR检测，检测结果呈阳性，表明重组质粒pK2-ERF115已转入农杆菌。
b、挑取含有目标重组载体的农杆菌克隆，在含有壮观霉素和利福平的LB平板上划线，28℃培养2~3天；刮取划线菌斑接菌于含有壮观霉素和利福平的LB培养基中，28℃，220rpm振荡培养，菌液浓度达到OD=0.5~0.8时6,000rpm离心5分钟富集菌体，弃上清，再用20mL液体MS培养基重悬菌体，得到含目标载体的农杆菌悬浮菌液；
c、将烟草叶片置于500mL广口瓶中，加入适量75%乙醇，漂洗30秒；弃乙醇，加入0.1%的HgCl2溶液，置摇床上室温振荡5分钟；弃HgCl2溶液，用无菌水冲洗6遍；
d、将烟草叶片取出，用无菌吸水纸吸去表面液体，使用剪刀将无菌叶片切成约1cm×1cm的小片，将切成小片的烟草叶片放入含目标载体的悬浮菌液中，静置15~20min；取出烟草叶片，使用无菌滤纸吸去多余菌液，于含有6-BA （0.02mg/L）、NAA （2mg/L）的MS培养基中25℃暗培养两天；随后，把烟草叶片转入分化培养基中，切口接触培养基，于温室条件下分化培养；分化培养基为含有6-BA （0.5mg/L）、NAA （0.1mg/L）、卡那霉素（100mg/L）、头孢霉素（500mg/L）的MS培养基，每2~3周继代培养1次，切口处逐渐长出愈伤组织，最终分化出芽；
e、将长至3~5cm的芽切下，转入MS培养基诱导生根，取出生根后的转化植株用自来水洗净培养基，移植于灭菌的营养土中；
f、转化植株经NtERF115基因特异引物PCR验证扩增，鉴定转基因阳性植株。
实施例4 ——转基因植株分析
T1代转基因株系提取总RNA，利用TaKaRa公司PrimeScriptTM RT reagent Kit反转录试剂盒合成cDNA作为模板进行实时荧光定量PCR分析，获得过表达（OE）株系进行表型分析（图3）。T1代转基因株系实验结果表明，NtERF115基因过表达株系与对照相比烟叶烟碱含量显著提高（Student’s t-test, P<0.05）（图4），表明NtERF115基因正向调控烟草烟碱的合成。
SEQUENCE LISTING
<110> 云南省烟草农业科学研究院
<120> 一种烟草烟碱合成调控基因NtERF115及其克隆方法与应用
<130> 2018
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 690
<212> DNA
<213> NtERF115核苷酸序列
<400> 1
atgaatccca ataatgcaac cttctctttc tctgagcttg atttccttca atcaatagaa 60
aaccatcttc tgaattatga ttccgatttt tctgaaattc tttcgccgat gagttcaagt 120
aacgcattgc ctaatagtcc tagctcaagt tttggcagct tcccttcggc agaaaatagc 180
ttggatacct ctctttggga tgaaaacttt gaggaaacaa taccaaatct ccaacttgaa 240
gaaaagtccg agtccgagga ggaaacaaag gggcatgtgg tggcgcgtga gaaaaccacg 300
acacaagatt ggagacggta cataggagtt aaacggcggc cgtgggggac gttttcggcg 360
gagataaggg acccggagag aagaggcgcg agattatggc taggaactta cgagacccca 420
gaggacgcag cattggctta cgatcaagcc gctttcaaaa tccgcagctc gagagctcgg 480
ctcaattttc ctcacttaat tggatcaaac atgcctaagc cggctagagt tacagcgaga 540
cgtagccgta cgcgctcacc cgagccatcg tcttcttcat gcacctcatc atcagaaaag 600
gggacaagaa aaaggaaaat agatttgata aattccatag ccaaagcaaa atttattcgt 660
catagctgga acctacaaat gctgctataa 690
<210> 2
<211> 229
<212> PRT
<213> NtERF115氨基酸序列
<400> 2
Met Asn Pro Asn Asn Ala Thr Phe Ser Phe Ser Glu Leu Asp Phe Leu
1 5 10 15
Gln Ser Ile Glu Asn His Leu Leu Asn Tyr Asp Ser Asp Phe Ser Glu
20 25 30
Ile Leu Ser Pro Met Ser Ser Ser Asn Ala Leu Pro Asn Ser Pro Ser
35 40 45
Ser Ser Phe Gly Ser Phe Pro Ser Ala Glu Asn Ser Leu Asp Thr Ser
50 55 60
Leu Trp Asp Glu Asn Phe Glu Glu Thr Ile Pro Asn Leu Gln Leu Glu
65 70 75 80
Glu Lys Ser Glu Ser Glu Glu Glu Thr Lys Gly His Val Val Ala Arg
85 90 95
Glu Lys Thr Thr Thr Gln Asp Trp Arg Arg Tyr Ile Gly Val Lys Arg
100 105 110
Arg Pro Trp Gly Thr Phe Ser Ala Glu Ile Arg Asp Pro Glu Arg Arg
115 120 125
Gly Ala Arg Leu Trp Leu Gly Thr Tyr Glu Thr Pro Glu Asp Ala Ala
130 135 140
Leu Ala Tyr Asp Gln Ala Ala Phe Lys Ile Arg Ser Ser Arg Ala Arg
145 150 155 160
Leu Asn Phe Pro His Leu Ile Gly Ser Asn Met Pro Lys Pro Ala Arg
165 170 175
Val Thr Ala Arg Arg Ser Arg Thr Arg Ser Pro Glu Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Ser Cys Thr Ser Ser Ser Glu Lys Gly Thr Arg Lys Arg Lys Ile Asp
195 200 205
Leu Ile Asn Ser Ile Ala Lys Ala Lys Phe Ile Arg His Ser Trp Asn
210 215 220
Leu Gln Met Leu Leu
225
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 正向引物
<400> 3
cgggatccat gaatcccaat aatgcaacct 30
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> 反向引物
<400> 4
atgcggccgc ttatagcagc atttgtaggt tc 32

Claims (8)

1.一种烟草烟碱合成调控基因NtERF115，其特征在于所述的烟草烟碱合成调控基因NtERF115的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.根据权利要求1所述的烟草烟碱合成调控基因NtERF115，其特征在于所述的烟草烟碱合成调控基因NtERF115编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3.一种权利要求1或2所述的烟草烟碱合成调控基因NtERF115的克隆方法，其特征在于包括以下步骤：
A、确定NtERF115基因序列；
根据烟草BY-2细胞转录组分析获得NtERF115基因序列，利用此序列设计基因克隆引物：
正向引物：5’- CGGGATCCATGAATCCCAATAATGCAACCT-3’；
反向引物：5’- ATGCGGCCGCTTATAGCAGCATTTGTAGGTTC -3’；
B、提取烟草根组织RNA，反转录得到第一链cDNA；
C、根据NtERF115基因序列设计合成特异性引物，以反转录得到的第一链cDNA作为模板，进行PCR扩增，选用Phusion高保真扩增酶反应体系，体系总体积50 μL，包括：200 ngcDNA，5×Phusion HF反应缓冲液10 μL，10 mM dNTP 1 μL，2 U的Phusion® High-FidelityDNA Polymerase，10 μM的正反向引物各1 μL，补水至50 μL； PCR反应在Mastercycler®pro扩增仪上进行，反应程序为：98℃，30秒；98℃，7秒，57℃，30秒，72℃，30秒，35个循环；72℃延伸7分钟，回收和纯化PCR产物；
D、纯化产物与载体连接，通过试剂盒反应与TOPO载体连接，连接体系与过程如下： 4μL纯化产物、1μL salt solution、1μL PCR®-BluntⅡ-TOPO混匀，25℃，水浴30min；将连好的载体通过热激转化大肠杆菌DH5α，加液体培养基振荡培养后涂布至含100mg/L 卡那霉素的LB平板上过夜培养，挑取菌落进行菌液培养、质粒提取和PCR检测，对阳性克隆进行测序。
4.根据权利要求3所述的烟草烟碱合成调控基因NtERF115的克隆方法，其特征在于C步骤中所述的特异性引物为：
正向引物：5’- CGGGATCCATGAATCCCAATAATGCAACCT-3’；
反向引物：5’- ATGCGGCCGCTTATAGCAGCATTTGTAGGTTC -3’；
根据权利要求3所述的烟草烟碱合成调控基因NtERF115的克隆方法，其特征在于D步骤中所述的培养基为：称取胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g溶解于1L蒸馏水中，高温灭菌（121℃，25min）后使用。
5.一种权利要求1所述的烟草烟碱合成调控基因NtERF115的应用，其特征在于所述的烟草烟碱合成调控基因NtERF115在获得烟碱含量显著提高的转基因植株中的应用。
6.根据权利要求6所述的烟草烟碱合成调控基因NtERF115的应用，其特征在于所述获得NtERF115转基因烟草的方法包括以下步骤：
A、 过表达隆载体-pK2-ERF115的构建
（1）以云烟87根的cDNA为模板，利用基因特异引物进行扩增，得到大小约为0.7kb的基因片段；
（2）将回收的基因片段进行TOPO克隆，连接到PCR®-BluntⅡ-TOPO（3.5kb）载体后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取质粒进行测序检测；
（3）由于基因克隆上下游引物分别带有BamH I、Not I的识别位点，因此选择这两个酶对检测正确的质粒样品进行双酶切检测，将目的基因片段胶回收；对pENTR™2B进行BamHI、Not I双酶切后将目的载体片段胶回收，将目的基因、载体片段进行连接、转化感受态细胞DH5α，PCR扩增检测获得构建成功的重组质粒pENTR™2B-ERF115；
（4）pENTR™2B-ERF115和pK2GW7进行 LR反应后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到表达载体pK2-ERF115；
B、烟草的遗传转化
采用冻融法转化质粒pK2-ERF115进入农杆菌C58C1感受态细胞，涂布在含壮观霉素和利福平的LB平板上28℃生长两天后，进行菌落PCR检测，检测结果呈阳性，表明重组质粒pK2-ERF115已转入农杆菌。
7.C、过表达（OE）载体导入烟草、培养转基因植株
a、挑取含有目标载体的农杆菌克隆，在含有壮观霉素和利福平的LB平板上划线，28℃培养2~3天；刮取划线菌斑接菌于含有壮观霉素和利福平的LB培养基中，28℃，220rpm振荡培养，菌液浓度达到OD=0.5~0.8时6,000rpm离心5分钟富集菌体，弃上清，再用20mL液体MS培养基重悬菌体，得到含目标载体的农杆菌悬浮菌液；
b、将烟草叶片置于500mL广口瓶中，加入适量75%乙醇，漂洗30秒；弃乙醇，加入0.1%的HgCl2溶液，置摇床上室温振荡5分钟；弃HgCl2溶液，用无菌水冲洗6遍；
c、将烟草叶片取出，用无菌吸水纸吸去表面液体，使用剪刀将无菌叶片切成约1cm×1cm的小片，将切成小片的烟草叶片放入含目标载体的悬浮菌液中，静置15~20min；取出烟草叶片，使用无菌滤纸吸去多余菌液，于含有6-BA （0.02mg/L）、NAA （2mg/L）的MS培养基中25℃暗培养两天；随后，把烟草叶片转入分化培养基中，切口接触培养基，于温室条件下分化培养；分化培养基为含有6-BA （0.5mg/L）、NAA （0.1mg/L）、卡那霉素（100mg/L）、头孢霉素（500mg/L）的MS培养基，每2~3周继代培养1次，切口处逐渐长出愈伤组织，最终分化出芽；
d、将长至3~5cm的芽切下，转入MS培养基诱导生根，取出生根后的转化植株用自来水洗净培养基，移植于灭菌的营养土中；
e、转基因植株经NtERF115基因特异引物PCR验证扩增，鉴定转基因阳性植株。
8.根据权利要求7所述的烟草烟碱合成调控基因NtERF115的应用，其特征在于C步骤b中所述的0.1%的HgCl2溶液配制方法为称取升汞0.1克，用少许酒精溶解，再加水定容至100mL。
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