CN105274120B - 一种抗烟草花叶病毒的N′au基因及其克隆方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及烟草花叶病毒（TMV）抗性基因N' au的分离克隆与育种应用。本发明公开了烟草抗TMV基因N'au的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的多肽的氨基酸如SEQ ID NO.2所示。将种质资源包含的N'au基因通过常规育种手段转育至感TMV主栽烟草品种中，可得到非转基因抗TMV烟草品种。本发明的N'au基因在主栽烟草品种中具有核苷酸一致率高的同源序列，因此常规育种容易获得较短的携带N'au基因的渐渗片段单株，从而获得连锁累赘较小的抗TMV品种。该基因能同时抗TMV的U1和Cg株系，本发明所述的新抗病基因N'au对于培育抗TMV烟草具有重大应用前景。

Description

一种抗烟草花叶病毒的N′au基因及其克隆方法和应用

技术领域

本发明属于植物保护技术领域，进一步属于烟草病毒防治技术领域，具体涉及一种抗烟草花叶病毒的N'au基因及其克隆方法和应用。

背景技术

烟草花叶病毒病（Tobacco mosaic virus, TMV）是中国重要的烟草病害，每年造成的损失位列十大烟草侵染性病害名单前列(朱贤朝，2002)。TMV病毒存在TMV-Cg株系和TMV-U1株系等株系分化，其中，TMV-U1株系是烟草上的主要危害株系。中国烤烟主栽品种K326和云烟87等均不抗TMV-U1株系，一般主要采取培育无毒苗、药剂防治和销毁田间病残体等措施防治，对控制TMV的发生和流行上有一定的效果，但TMV在局部田块爆发的情况仍然时有发生，造成较大的经济损失（朱贤朝，2002）。因此，种植TMV抗病品种依然是防控TMV最根本、最经济有效的手段；而对抗病品种的要求是抗性高、无产量劣势、无农艺性状劣势。

目前，烤烟的TMV抗源主要来源于烟草野生种心叶烟（Nicotiana glutinosa），其抗性由一个显性单基因（N）控制，N基因抗TMV-U1株系。N基因于1994年被克隆，是植物中克隆的第一个NBS类抗病基因（Whitham,1994）。N基因的基因组序列大小为6656 bp，包括5个外显子和4个内含子，属于TIR-NBS-LRR类型抗病基因。在其编码蛋白的N端编码一个与果蝇Toll蛋白及哺乳动物白细胞介素-1受体(Toll/interleukin-I receptor，TIR)的胞外域相似的结构，还编码核苷酸结合位点(nucleotide-binding-site，NBS)和富含亮氨酸的重复序列(1eucine-rich repeat，LRR)结构域（Whitham,1994）。N基因的抗病机理为在病毒侵染位点出现过敏性坏死斑（枯斑），通过诱导产生的细胞过敏性死亡限制TMV在植物体内的移动。在介导了过敏反应后，烟草植株能够获得系统性抗性，对TMV或其它类似病原的再次入侵产生广谱抗性（Whitham,1994）。通过一系列的常规杂交和回交转育，N基因的抗性从心叶烟先转育至香料烟中，后转育至烤烟品种中（Bagley, 2002）。采用杂交育种转育N基因的抗性，实际上是转育携带N基因的染色体片段（简称为N导入片段）。世界上抗TMV烤烟育种利用的抗TMV基因几乎都是N基因。代表性品种是较早商业化种植的携带N基因渐渗片段的抗TMV烤烟品种Coker176和Speight H20。由于产量较低、上部叶落黄较慢等连锁累赘，携带N基因的烤烟品种不能满足生产的迫切需要。与N基因紧密连锁的来源于心叶烟的染色体片段存在连锁累赘、已被育种利用的TMV抗源的遗传背景狭窄和常规育种手段的局限性，导致抗TMV烤烟育种缺乏突破性进展。因此，在烟草种质资源库中筛选、鉴定新的抗TMV基因具有重大意义。

另外，烟草野生种存在一种N'基因，对应的无毒基因为烟草花叶病毒属病毒的外壳蛋白基因（Coat protein，简写为CP），属于CC-NBS-LRR类抗病基因(Sekine et al.，2012)。N'基因抗TMV-Cg株系但不抗TMV-U1株系。

为此，本发明希望寻找到一种能抗TMV病毒的新基因。

发明内容

本发明第一目的在于提供一种抗烟草花叶病毒的N'au基因；第二目的在于提供一种所述抗烟草花叶病毒的N'au基因的克隆方法；第三目的在于提供一种所述抗烟草花叶病毒的N'au基因编码的多肽；第四目的在于提供一种所述抗烟草花叶病毒的N'au基因的瞬时表达载体；第五目的在于提供一种所述抗烟草花叶病毒的N'au基因的瞬时表达载体的构建方法；第六目的在于提供一种所述抗烟草花叶病毒的N'au基因的应用；第七目的在于提供一种根据所述抗烟草花叶病毒的N'au基因的应用所得到的烟草品种、及其种子和无性繁殖体；第八目的在于提供一种所述抗烟草花叶病毒的N'au基因的表达盒；第九目的在于提供一种所述抗烟草花叶病毒的N'au基因的转基因细胞系；第十目的在于提供一种含所述抗烟草花叶病毒的N'au基因的重组菌。

本发明第一目的是这样实现的，所述抗烟草花叶病毒的N'au基因的碱基序列如SEQ ID No.1所示。

本发明第二目的是这样实现的，所述抗烟草花叶病毒的N'au基因的克隆方法包括如下步骤：

（1）以Nicotiana alata的总 DNA为模板，进行PCR扩增，使用的用上下游引物分别为：

N'-H8-F：5’-ATGGAGATTGGCTTAGCAGT-3’，

N'-H8-R：5’-TCACAGGCATTCACAATCGA-3’；

（2）将得到的PCR产物进行回收和纯化；

（3）测序。

本发明第三目的是这样实现的，所述抗烟草花叶病毒的N'au基因编码的多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明第四目的是这样实现的，所述抗烟草花叶病毒的N'au基因的瞬时表达载体包括N'au基因和载体pHellsgate 8。

本发明第五目的是这样实现的，所述抗烟草花叶病毒的N'au基因的瞬时表达载体的构建方法为采用限制性内切酶XhoI和XbaI酶切载体pHellsgate 8，胶回收的N'au PCR扩增产物, 使用一步法无缝克隆试剂盒与线性pHellsgate 8载体连接。

本发明第六目的是这样实现的，所述抗烟草花叶病毒的N'au基因的应用是通过染色体片段导入、或基因导入、或基因编辑得到含N'au基因的烟草植株。

本发明的第七目的是这样实现的，根据所述抗烟草花叶病毒的N'au基因的应用所得到的烟草品种、及其种子和无性繁殖体。

本发明的第八目的是这样实现的，所述抗烟草花叶病毒的N'au基因的表达盒。

本发明的第九目的是这样实现的，所述抗烟草花叶病毒的N'au基因的转基因细胞系。

本发明的第十目的是这样实现的，所述抗烟草花叶病毒的N'au基因的重组菌。

本发明提供的对TMV-U1和TMV-Cg株系均有抗性的N'au基因具有重要的应用价值，通过杂交育种、转基因、基因突变等手段培育出广谱抗性的烟草品种。常规育种容易获得携带N'au基因且连锁累赘较小的抗TMV品种。经研究发现：N'au基因在栽培烟草品种如云烟87等中存在相似性较高的同源序列，携带N'au基因的渐渗片段容易与栽培品种发生交换，容易获得携带N'au的渐渗片段较短的单株，因此，常规育种容易获得携带N'au基因且连锁累赘较小的抗TMV品种。与之相比，携带N基因的烟草野生种心叶烟的渐渗片段较长、且与在栽培烟草品种如云烟87的核苷酸同源性较低，携带N基因的渐渗片段很难与栽培品种发生交换，常规育种难以获得较短的渐渗片段单株，因此，难以获得携带N基因且连锁累赘较小的抗TMV品种。

附图说明

图1为4种烟草品种接种TMV-U1株系病毒；

图中：A为N. alata (PI42334)，表现枯斑；B为Coker176，表现枯斑；C为N. sylverstris（PI555569），表现花叶、无枯斑；D为K326，表现脉明花叶、无枯斑。

图2为使用分子标记N1/N2和E1/E2检测N基因；

图中：1为N. alata (PI42334)； 2为Coker176；3为N. sylverstris （PI555569）；4为K326；M为2000 bp分子量标准。

图3为4种烟草品种分别接种TMV-U1 CP、TMV-Cg CP和空白的瞬时表达载体农杆菌；

图中：A为N. alata (PI42334)；B为Coker176；C为N. sylverstris（PI555569）；D为K326；1为接种TMV-U1 CP的瞬时表达载体农杆菌；2为接种TMV-Cg CP的瞬时表达载体农杆菌；3为接种空白的瞬时表达载体农杆菌。

图4为N'au基因PCR扩增结果；

图中：1为ddH₂O（阴性对照）；2为N. sylvestris DNA（阳性对照）；3为N. alata (PI42334) DNA；5K为5 kb分子量标准。

图5为将含N'au和N'基因的瞬时表达载体农杆菌接种本氏烟（N. benthamiana）。

图中：A为接种N'au+TMV-U1 CP瞬时表达载体农杆菌；B为接种N'au+TMV-Cg CP瞬时表达载体农杆菌；C为接种N'au+BLK瞬时表达载体农杆菌；D为接种N'+TMV-U1 CP瞬时表达载体农杆菌；E为N'+TMV-Cg CP瞬时表达载体农杆菌；F为接种N'+BLK（F）组合瞬时表达载体农杆菌。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换，均落入本发明保护范围。

本发明所述的一种抗烟草花叶病毒的N'au基因，其碱基序列如SEQ ID No.1所示。所述N'au基因是一种CC-NBS-LRR基因，不仅能抗烟草花叶病毒的TMV-U1株系，同时还能抗TMV-Cg株系。

根据本发明提供的SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列信息，本领域技术人员可以通过以下方法容易地获得功能等同的基因：（1）通过基因组数据库检索获得；（2）以SEQ IDNO.1为探针筛选烟草基因组文库或cDNA文库获得；（3）根据SEQ ID NO.1序列信息设计寡核苷酸引物，用PCR扩增方法从烟草的基因组和cDNA中获得；（4）在N’基因序列的基础上用基因编辑方法改造获得；（5）用化学合成的方法获得该基因。（6）通过将缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的突变得到。

另外，在自然界可能存在与本发明SEQ ID NO.1所示的多核苷酸和SEQ ID NO.2所示的多肽共有显著序列相同性的变体。这些变体可以是天然存在的，也可能是由人为产生。与SEQ ID NO.1所示的序列相比，天然变体内一个或多个位置处删除和/或添加和/或取代一种或多种核苷酸。由于遗传密码的简并性，多核苷酸的保守变体也包括编码SEQ ID NO.2所示多肽的氨基酸序列的那些序列。天然产生的变体可通过用熟知的分子生物学技术鉴定，例如用聚合酶链式反应（PCR）和本领域已知杂交技术。人为产生的变体还包括合成来源的多核苷酸，如用定点诱变生成但仍与本文公开的天然产生序列共有显著序列相同性的变体多核苷酸，且因此获得抗TMV-U1株系抗性。通常，这些变体与SEQ ID NO.1所示的序列具有95%以上的序列一致率。

多核苷酸变体还可通过比较SEQ ID NO.2所示的序列与变体所编码的多肽的氨基酸序列评估。任何两种多肽之间的序列一致率可用序列比对程序和参数计算，比较两种多肽共有的序列相同性百分比。一般来说，两种编码的多肽之间的序列一致率应在95％以上。

所述序列一致率可采用MEGA,BLAST等分子生物学方法计算。

此外， SEQ ID NO.1所示的序列可从烟草属的其他成员中分离，并通过PCR、杂交和其他方法来进行同源性鉴定。根据与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或其变体和片段的序列相同性，分离出且具有抗TMV-U1株系功能的序列。此类序列包括SEQ ID NO.1所示序列的直系同源物序列。“直系同源物”是源自共同祖先基因且由于物种形成而在不同物种中发现的基因。在不同物种中发现：基因在其核苷酸序列和/或其编码蛋白序列具有95％以上的序列相同性时被认为是直系同源物。直系同源物的功能通常在物种间高度保守。

本发明所述的一种抗烟草花叶病毒的N'au基因的克隆方法包括如下步骤：

（1）以Nicotiana alata的总 DNA为模板，进行PCR扩增，使用的用上下游引物分别为：

N'-H8-F ：5’-ATGGAGATTGGCTTAGCAGT-3’，

N'-H8-R：5’-TCACAGGCATTCACAATCGA-3’；

（2）将得到的PCR产物进行回收和纯化；

（3）测序。

所述PCR的反应体系总体积为50 μL，其中100 ng/μL DNA 样品4.0 μL，5×PCRbuffer 10.0 μL，dNTPs （2.5 mmol/L each）4 μL，10 μmol/L的 引物N'-H8-F 和N'-H8-R各2.0 μL，PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 1μL，ddH₂O 27μL。所述PCR的反应条件为：98℃ 2 min，98 ℃ 10 s，52 ℃ 15 s，68 ℃ 5 min，38个循环，68 ℃ 10 min。

所述测序的方式可以采用直接测序，也可使用TA载体克隆测序。

本发明所述的一种抗烟草花叶病毒的N'au基因编码的多肽，其氨基酸序列如SEQID No.2所示。

本发明所述的一种抗烟草花叶病毒的N'au基因的瞬时表达载体包括N'au基因和载体pHellsgate 8。所述瞬时表达载体的构建方法为采用限制性内切酶XhoI和XbaI酶切载体pHellsgate 8，胶回收的N'au基因的PCR扩增产物, 使用一步法无缝克隆试剂盒与线性pHellsgate 8载体连接。作为本发明的一种优选，所述一步法无缝克隆试剂盒为One StepCloning Kit ClonExpress^TM II。

本发明所述的一种抗烟草花叶病毒的N'au基因的应用为通过染色体片段导入、基因导入和/或基因编辑得到含N'au基因的烟草植株。其中，将染色体片段导入的方法包括杂交育种、原生质体融和/或染色体片段导入代换系或导入系转育至目的烟草中，得到抗TMV病毒的烟草新品种。首先，通过利用编码SEQ ID NO.1所示序列的功能分子标记或连锁的分子标记，或者人工接种TMV方法，从烟草属植物中筛选获得包含N'au基因的种质资源；所述的种质资源包含烟草野生种、栽培种、以及野生种与栽培种的杂交种。然后，通过杂交、回交等育种手段，将该抗性提高的烟草材料育成商业品种，改良烟草主栽品种对TMV的抗性。

基因导入是将外源的抗性基因导入目的烟草中，包括将外源基因转入后导入（即转基因）和直接导入，转基因最常用的方法为农杆菌转化法；直接导入的方法包括显微注射、花粉管通道法、电导、基因枪等常规生物学方法转化烟草细胞或组织，并将转化的组织培育成植株。

基因编辑是近年来发展起来的可以对基因组完成精确修饰的一种技术，可完成基因定点InDel突变、敲入、多位点同时突变和小片段的删失等，可在基因组水平上进行精确的基因编辑。通过对N'au基因的同源体（Homology）进行精确的基因编辑，使编辑后的同源体获得抗TMV-U1和抗TMV-Cg株系的功能。

根据所述抗烟草花叶病毒的N'au基因的应用可以得到新的抗TMV烟草品种、及其种子和无性繁殖体。另外，还可以开发一些基因工程产品，包括所述抗烟草花叶病毒的N'au基因的表达盒，转基因细胞系和重组菌等。

下面结合实施例进行进一步的说明和验证。

如无特殊说明，下述各实施例使用的均为常规方法；如无特殊说明，所用的试验材料均为自常规生化试剂公司购买得到的。烟草材料为N. sylverstris（PI555569）、N. alata（PI42334）、本氏烟（N. benthamiana）、Coker176、K326，均来自云南省烟草农业科学研究院。TMV-U1株系和TMV-Cg株系病毒来自云南省烟草农业科学研究院。TMV-U1和TMV-Cg的cDNA通过常规方法提取病毒侵染的烟草叶片总RNA，总RNA通过常规反转录方法获得。

Gateway LR clonase Enzyme Mix kit、pENTR 2B载体购自Invitrogen公司，农杆菌GV3101购自Invitrogen公司。pHellsgate 8 载体购自thermofisher公司。质粒DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、DNA片段纯化试剂盒购自QIAGEN公司。大肠杆菌(Escherichia coli) DH 5α；限制性内切酶、反转录试剂盒、DNA Marker、PrimeSTAR GXLDNA Polymerase、T4 DNA聚合酶及T4 DNA连接酶、壮观霉素均购自大连宝生物公司和Roche公司。RNA提取试剂盒Trizol购自Invitrogen公司，检测TMV的ELISA试剂盒和试纸条购自Agdia公司。

农杆菌培养与接种方法：瞬时表达载体质粒转化农杆菌（Agrobacterium tumefaciens） GV3101。阳性克隆在2 mL LB抗生素（50 mg/L利福平，50 mg/L壮观霉素)培养基震荡培养活化，28 ℃, 210 r/min，30 h。取150 μL活化菌液至10 mL LB 培养基（含10 mmol/L吗啉乙磺酸(MES) (pH 5.6), 40 μmol/L乙醚丁香酮（acetosyringone），50 mg/L利福平，50 mg/L壮观霉素）。28 ℃, 210 r/min，培养16 h后，4700 r/min，离心5 min收集菌体。用浸润缓冲液 (10 mmol/LMgCl₂, 10 mmol/L MES, 200 μmol/L acetosyringone)悬浮调整至菌液 OD₆₀₀=0.6。室温放置3 h, 用2 mL注射器浸润4周大小的烟苗叶片。烟苗接种后25～28 ℃的光照培养室中培养7d，调查观察过敏坏死（HR反应）。

实施例1：N. alata (PI42334)抗TMV-U1株系的N'au基因的发现与功能验证

（1）N. alata (PI42334)抗TMV-U1株系，抗性不同于N基因

取N. sylverstris（PI555569），N. alata (PI42334)，Coker176，K326等4种烟草品各栽15株（盆栽），4～5片叶时，分别接种TMV-U1株系和空白对照。接种后的第5、7、14天调查记录症状。

病毒接种第7天的结果表明：N. alata (PI42334)和Coker176抗TMV-U1株系，N. sylverstris和K326感TMV-U1株系（表1，图1）。这说明N. alata (PI42334)和Coker176中存在抗TMV-U1株系的抗病基因。

表1 4种烟草品种接种TMV-U1株系的结果

注：HR为抗病反应；花叶为染病症状。

已有文献报道：Coker176中存在抗TMV-U1株系的N基因，并开发了检测N基因的特异分子标记N1/N2和E1/E2 (Lewis, 2005)。为了验证N. alata (PI42334)中抗病基因与N基因的关系，取4种烟草品种叶片，用QIAGEN试剂盒提取DNA，采用N基因的特异分子标记N1/N2和E1/E2进行PCR检测。结果（表1，图2）显示：除Coker176外，其他3种烟草品种的检测结果均为阴性。表明N. alata (PI42334)对TMV-U1株系的抗性基因并非N基因，N. alata(PI42334)中存在一种抗TMV-U1株系的新抗性基因，命名为N'au基因。

（2）N. alata (PI42334)抗TMV-U1的无毒基因确定

构建TMV-U1 CP和 TMV-Cg CP基因瞬时表达载体：TMV-U1 和 TMV-Cg株系的外壳蛋白基因（缩写为CP）瞬时表达载体采用修饰的pHellsgate 8 载体构建。TMV-U1 和 TMV-Cg株系的CP基因分别采用如下引物对扩增病毒的cDNA。

U1-CP-F：5’-AAAAAGCAGGCTATGTCTTACAGTATCACTACTCCATCTC-3’；

U1-CP-R：5’-AGAAAGCTGGGTTCAAGTTGCAGGACCAGAGG -3’；

Cg-CP-F：5’-AAAAAGCAGGCTATGTCTTACAACATCACGAGCTCG-3’；

Cg-CP-R：5’-AGAAAGCTGGGTCTATGTAGCTGGCGCAGTAGTCC-3’。

扩增片段按照pHellsgate 8 载体试剂盒说明书方法插入pHellsgate 8 载体。attB位点采用如下引物对进行扩增。

attB1_adapter：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3’；

attB2_adapter：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3’。

扩增片段利用BP反应pDONR221 (Invitrogen)载体试剂盒说明书方法插入pDONR221 (Invitrogen)载体，然后采用Gateway®技术的LR反应插入到表达载体pHellsgate 8 上。

为了确定N. alata (PI42334)中与TMV-U1株系互作的无毒基因，采用TMV-U1 CP和 TMV-Cg CP的瞬时表达载体农杆菌和空白载体农杆菌对照，用2 mL注射器接种烟草。接种前用注射器针头在合适的烟叶上均匀打孔，浸润接种4～5片叶的N. sylverstris（PI555569），N. alata (PI42334)，Coker176和K326各5株，每株接种最大的2片叶，接种后避光培养1～2d后，在28℃光照培养室培养第7、10天调查HR反应。

结果（表2，图3）表明：N. alata (PI42334)接种TMV-U1 CP的农杆菌表现为HR反应，这说明N. alata (PI42334)中与TMV-U1株系互作的无毒基因为CP。Coker176接种TMV-U1 CP的农杆菌瞬时表达载体无HR反应，这说明Coker176与TMV-U1株系互作的无毒基因并非CP，进一步表明：N. alata (PI42334)中的抗TMV-U1株系的抗病基因不同于Coker176中的N基因。N. alata (PI42334)、N. sylverstris（PI555569）和K326接种TMV-Cg CP的农杆菌都表现为HR反应，这表明3份烟草材料中均存在与TMV-Cg CP互作的抗病基因，Coker176接种TMV-Cg CP的农杆菌的HR反应不典型。根据已有文献报道：N. sylverstris（PI555569）中与tobamovirus CP互作的抗病基因为N'（Sekine，2012），K326中也存在N'基因。试验结果证明：N. alata (PI42334)的确存在与N. sylverstris（PI555569）N'基因功能不同的新基因。

表2 N. alata (PI42334)中与TMV-U1株系互作的无毒基因

实施例2：N. alata (PI42334)的N'au基因克隆与序列分析

（1）烟草总DNA的提取：取烟草新鲜嫩叶，采用QIAGEN DNeasy Plant Mini试剂盒提取烟草总基因组DNA。采用紫外分光光度法（Nanodrop）和琼脂糖凝胶电泳法初步检测DNA质量。质量合格的DNA样品，用0.5×TE溶液稀释至100 ng/μL，保存备用。

（2）N'au基因的克隆：以N. alata （PI42334）和N. sylvestris （PI555569）的DNA为模板，用引物N'-H8-F （5’-ATGGAGATTGGCTTAGCAGT-3’）和引物N'-H8-R（5’-TCACAGGCATTCACAATCGA-3’）进行PCR扩增。PCR的反应体系总体积为50 μL，其中100 ng/μLDNA 样品4.0 μL，5×PCR buffer 10.0 μL，dNTPs（2.5 mmol/L each）4 μL，10 μmol/L的引物N'-H8-F 和N'-H8-R各2.0 μL，PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 1μL，ddH₂O 27μL。所用试剂购自宝生物公司。PCR的反应条件为：98 ℃ 2 min，98 ℃ 10 s，52 ℃ 15 s，68 ℃5 min，38个循环，68 ℃ 10 min。

（3）PCR产物回收与纯化：将PCR产物在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳，电泳缓冲液为1×TAE，当电泳指示剂溴酚蓝在120V，60min条件下迁移至足够分离DNA片段时，取下凝胶，用凝胶图像分析系统记录结果，如图4所示。在紫外灯下割下DNA片段凝胶。用胶回收试剂盒（QIAGEN公司出品）回收DNA。

（4）PCR产物测序：胶回收的PCR产物，送宝生物公司测序。N'au基因的DNA序列如序列表的SEQ ID No.1所示，开放阅读框为序列表SEQ ID No.1的序列自5’端第1位至第4143位。

实施例3： N'au基因所编码的多肽序列

根据N'au基因的核苷酸序列，采用分子生物学软件MEGA6推导出N'au基因所编码的多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

实施例4：N'au和N'基因瞬时表达载体构建

载体pHellsgate 8采用限制性内切酶XhoI和XbaI酶切，胶回收的N'au和N'扩增产物采用One Step Cloning Kit ClonExpress^TM II （Vazyme，中国南京）与线性pHellsgate8载体连接。

实施例5：验证N'au基因具有抗TMV-U1和TMV-Cg的生物学功能

为了确定N. alata (PI42334)中的N'au基因具有抗TMV-U1和TMV-Cg的生物学功能，构建N'au和N'的农杆菌瞬时表达载体。其中，N'au的瞬时表达载体构建与实施例4相同，N'的瞬时表达载体的构建与实施例4相同。

构建完成后，使用农杆菌浸润接种以下瞬时表达载体组合：N'au+U1CP；N'au+CgCP；N'au+BLK。N'+U1CP；N'+CgCP；N'+BLK，其中BLK为空白瞬时表达载体。浸润接种烟草野生种本氏烟（N. benthamiana）。接种4～5片时期的本氏烟10株，每株接种2片最大叶片。接种后第7、10天调查HR反应。

结果表明（表3，图5）：N'au同时与TMV-U1 CP和TMV-Cg CP 浸润时在本氏烟上产生HR反应，而N'与TMV-U1 CP共浸润本氏烟无HR反应。这表明N'au具有抗TMV-U1和TMV-Cg株系的生物学功能，N'不具有抗TMV-U1株系的生物学功能。在抗TMV-U1株系的生物学功能上，N' au和N'具有明显差异。

表 3 N'au与TMV-U1 CP和TMV-Cg CP浸润产生HR反应

实施例6：N'au基因的常规育种应用

将烟草属植物中包含SEQ ID NO.1所示N'au基因的染色体片段，通过常规育种手段转育至目的烟草中。通过利用N'au的功能分子标记或连锁的分子标记，或者人工接种TMV方法，从烟草属植物中筛选获得包含N'au基因种质资源。种质资源包含烟草野生种、野生种与栽培烟草的杂交种和栽培种。利用常规杂交育种或者原生质体融合或者染色体片段导入等技术手段，将种质资源中包含N'au基因的染色体片段导入目的烟草，获得TMV抗性提高的非转基因烟草材料。通过杂交和回交等育种手段，将该抗性提高的烟草材料育成商业品种，改良烟草主栽品种对TMV的抗性。

实施例7：N'au基因的基因编辑育种应用

将目的烟草中N'au基因的同源体（Homology），通过生物技术修饰获得等同于N'au的功能，得到抗病性提高的烟草。通过克隆获得目的烟草中的N'au基因的同源体，测序获得N'au基因的同源体的核苷酸序列和氨基酸序列，通过序列比对分析，找出N'au基因的同源体与N'au的氨基酸序列和核苷酸差异。通过PCR突变、与TMV-U1 CP农杆菌瞬时表达载体共浸润接种等方法，找出决定N'au抗TMV-U1株系而N'au基因的同源体不抗TMV-U1株系的关键差异核苷酸。通过诱变、基因编辑等分子生物学技术，将N'au基因的同源体的关键差异核苷酸修饰为N'au基因对应的多核苷酸序列，使修饰后的N'au基因的同源体获得抗TMV-U1株系的功能。

综上所述，N'au基因是一种既不同于N基因，也不同于N'基因的新抗病基因，能够同时抗TMV-U1和TMV-Cg株系，在实际生产中具有广泛的应用前景。

参考文献：

朱贤朝,王彦亭,王智发. 2002.中国烟草病害.北京:中国农业出版社, 152-162.

Bagley C A. 2002. Controlling tobacco mosaic virus in tobacco throughresistance. M.S. thesis. Virginia Polytechnic Inst. and State Univ.,Blacksburg, VA.

Lewis R S, Milla S R, Levin J S. 2005. MolecuLar and geneticcharacterization of Nicotiana glutinosa L. chromosome segments in tobaccomosaic virus-resistant tobacco accessions. Crop Sci, 45: 2355-2362.

Whitham S, Dinesh-Kumar S P, Choi D, et al.. 1994. The product of thetobacco mosaic virus resistance gene N: Similarity to Toll and theInterleukin-1 receptor. Cell, 78: 1101-1115.

Sekine K T, Tomita R, Takeuchi S, et al. 2012. Functionaldifferentiation in the leucine-rich repeat domains of closely related plantvirus-resistance proteins that recognize common avr proteins. Mol PlantMicrobe Interact., 25(9):1219-1229.

序列表

SEQ ID No.1

<110> 云南省烟草农业科学研究院

<120> 一种抗烟草花叶病毒的N'au基因及其克隆方法和应用

<130> 2015

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 4143

<212> DNA

<213> Nicotiana alata

<400> 1

atggagattg gcttagcagt tggaggtgca tttctatctt cagctttgaa tgttctcttt 60

gataggcttg ctcctcaggg cgagctgctc aagatgtttc agagggacaa acatgatgtt 120

cgattattaa agaagctgag aattaccttg cttggtcttc aggctgtact atgtgatgca 180

gagaataaga aggcatcaaa tcaatacgtg agccagtggc ttaatgagct tcaagatgct 240

gtggacagtg ctgaaaactt aatggaagaa atcaattatg aagttctgag acttaaggtg 300

gaaggtcagt atcaaaatct tggagaaaca agcaaccagc aagtaagtga cctcaacttg 360

tgcttgagtg atgaattttt ccttaacata aaggacaagt tggaagacgc cattgaaata 420

ttggaggagt tggaaaagca aatcggtcgc cttgatctaa caaagtatct tgattcagat 480

aaacaagaaa ctagaagact ttcaacttct gtggttgatg actctgatat ctttggcagg 540

cagaatgaaa tagaggaatt ggtgggccgt ttattatctg ttgctgtaaa tggcaaaaat 600

ttgacagtaa ttcctattgt tggaatggct gggattggca agacaacact tgctaaagtt 660

gtttacaatg atgagaaggt gaaagaccat tttgatttga aagcttggtt ttgtgtgtct 720

gaaccatatg atgctttcag aataacaaaa gggttacttc aagaaatagg ctcatttgac 780

ttaaagatgg ataacaatct taatcagcta caagtcaaat tgaaggaaag cttaaagggc 840

aaaaaatttc ttattgttct ggatgatgtt tggaatgaca actataatgc atgggatgac 900

ttgaaaaatc tttttgttca aggaaatgca ggaagtacga tcattgtgac gacacgtaag 960

aaaagtgttg ccaagacgat gggtaatgag caaattagca tggatacttt gtctagtgat 1020

gtctcttggt ctttattcaa aagacatgca tttgacaaca tggatcctaa ggagcatcca 1080

gaacatgtag aagttgggaa agaaatcgta gctaagtgca aaggactgcc tttagctctg 1140

aagacgcttg ctggcatttt acgttccaaa tcagagattg aagggtggaa acgtattttg 1200

agaagtgaag tatgggagct gccagacaat ggcatattac cagcattgat gttgagctac 1260

aacgatcttc ctgcacattt aaagcaatgt ttttcctact gtgcaatatt tccgaaagat 1320

tatccatttc ggaaaaaaca agtcattcag ttgtggattg ccaatggtct agtacagggg 1380

ttgcaaaaat atgaaacaat tgaagattta ggcaacctat tctttctcga gttgcaatca 1440

aggtcacttt tcgaaagggt cccagagtct tctaaaaata atgcagagaa attcttaatg 1500

catgaccttg tcaatgattt ggcccaagtt gcatcttcaa aactttgtgt taggttggaa 1560

gagtaccaag agtctcatat gttgaaaaga agtcgacaca tgtcctattc aatgggctat 1620

gctgactttg aaaagttgca acctctctac aaattggagc agctcaggac attgcttcca 1680

atatacaata tcgagctata tggttcttct ctaagcaaga gggtgttgct taacatattg 1740

ccaagattaa catccttaag ggcactatca ttgtctcgtt ataatatcaa ggagttacca 1800

gatgtcttgt ttatcaaatt aaaactccta agattggtgg acctttcttt gacgcagata 1860

atacagttac cggattcaat ttgtgtgctc tataacttgg agatacttct cttgtcatct 1920

tgtgaatttc ttaaagagtt accgaggcag atggagaagt tgataaactt gcgtcacctt 1980

gacattagcg gcagttctcg cttgatgatg ccgctacatt tgagcaagtt gaaaagcctt 2040

catgtgttat tgggagctga atttcttgta ggtgatcgga gtggttcgag aatggaagat 2100

ttgggtgaac tatgcaactt gtatggaact ctatcaattc gacagttgga aaatgtggcg 2160

gatagaaggg aagctttgaa ggcaaacata agaggaaagg agcatattga gaagttatta 2220

ttggagtgga ctgtaagtat tgcggacagt tcacaaaatg aaagagacat acttggtgag 2280

gtacatccaa atccaaacat aaaagaactt gcgatcaatg gatatagagg gacaaacttt 2340

ccaaattggc tagctgatta ttcattttct gagctggtgg aattgtctct aagtaattgc 2400

aaggactgtt attccttgcc agcattaggc cagcttcctt ctttgaaatt ccttgcaatt 2460

cgagggacgc atcgaataat agaggtgact gaagaatttt atggtagctc gtcctccaaa 2520

aagcctttta attctcttga aaagcttgat tttgcagaga tgttggagtg ggagcagtgg 2580

catgtactag gaaatgggga gttccctgta cttcaacacc tttcaattga agattgcccc 2640

aagttgattg gaaagttgcc tgaaaatctt tgttctctga caaaattgac aatttcacat 2700

tgtccggaac tcaatctgga gacacctgta aaatttccaa gtctaaaaaa gtttgaagtt 2760

gaaggttctc ctaagattgg agttcttttt gatcatgctg aactgttttt gtctcaactt 2820

cagggtatga aacagatagt tgaattatat atcagtgatt gtcactctct tacctccttg 2880

cccattagca gtctgccaaa taccttgaaa gtaataagga taaagcattg tgagaaattg 2940

aaattggagt cgtcagttgg taagatgatt tctagaggaa gtaacatgtt tcttgaaagt 3000

ttggaactgg aagaatgtga ttctatagat gatgtatcac ctgagttggt cccatgtgca 3060

cgctatctga gagtagaaaa ttgtctaagc cttactagac ttattattcc caatggggct 3120

gaagatctca aaattaagaa atgtgagaat cttgaaatac tttcggtggc tcagacgacg 3180

cccttgtgta acttgttaat tagcaactgc gagaagctga agtcgttgcc agaacatatg 3240

caggagctcc ttccatctct tagagatctg tatctggaaa attgttcaga aatagtgtcc 3300

ttttctgaag gaggattgcc cttcaattta gaaatcctcg ggatccagga ttgtggtgaa 3360

ctggtgaata gacgaaagga gtggaattta cagggactcc cctctctcac atatttagac 3420

atcatccatc gcggtttcga aaactgggat attatctgcg agttgccttg ctctattcga 3480

agtcttacca tagacaattt gaaaacattt agcagccaag ttctcaaaag cctcacctct 3540

cttgaatatc tatgtacttc taatttacct caaattcagt tactgttgga agaagggctt 3600

cccacatctc ttttaatgct aacattatct caccatggtg agctccattc cctaccgacc 3660

gacggtcttc ggcgcctcac ttcgcttcaa cgtctacgca tcgataattg ccctaatctc 3720

caatatgttc cagaatcaac gtttccctct tccctctctg agctacatat tagtagctgt 3780

agttttctcc aatcgcttcg agaatcagcg ctgtcctcct ccctctctaa tcttttcatc 3840

tacacttgcc ctaatctcca atctctaatg ctgccctcct ccctctttga gctgcatatc 3900

attgattgcc gtaatctcca atctcttcca gaatcagcgc tgcccccctc cctctctaag 3960

ttaatcatcc ttacatgccc taatctccaa tctcttccag taaaagggat gccctcttcc 4020

atctcttttc tgtctattat tgactgccca ttgctcaaac caagtctaga atttgagaag 4080

ggcgaatact ggccaaatat tgctcatatt cccaccatag tgatcgattg tgaatgcctg 4140

tga 4143

SEQ ID No.2

<110> 云南省烟草农业科学研究院

<120> 一种抗烟草花叶病毒的N'au基因及其克隆方法和应用

<130> 2015

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1380

<212> PRT

<213> Nicotiana alata

<400> 1

Met Glu Ile Gly Leu Ala Val Gly Gly Ala Phe Leu Ser Ser Ala Leu

1 5 10 15

Asn Val Leu Phe Asp Arg Leu Ala Pro Gln Gly Glu Leu Leu Lys Met

20 25 30

Phe Gln Arg Asp Lys His Asp Val Arg Leu Leu Lys Lys Leu Arg Ile

35 40 45

Thr Leu Leu Gly Leu Gln Ala Val Leu Cys Asp Ala Glu Asn Lys Lys

50 55 60

Ala Ser Asn Gln Tyr Val Ser Gln Trp Leu Asn Glu Leu Gln Asp Ala

65 70 75 80

Val Asp Ser Ala Glu Asn Leu Met Glu Glu Ile Asn Tyr Glu Val Leu

85 90 95

Arg Leu Lys Val Glu Gly Gln Tyr Gln Asn Leu Gly Glu Thr Ser Asn

100 105 110

Gln Gln Val Ser Asp Leu Asn Leu Cys Leu Ser Asp Glu Phe Phe Leu

115 120 125

Asn Ile Lys Asp Lys Leu Glu Asp Ala Ile Glu Ile Leu Glu Glu Leu

130 135 140

Glu Lys Gln Ile Gly Arg Leu Asp Leu Thr Lys Tyr Leu Asp Ser Asp

145 150 155 160

Lys Gln Glu Thr Arg Arg Leu Ser Thr Ser Val Val Asp Asp Ser Asp

165 170 175

Ile Phe Gly Arg Gln Asn Glu Ile Glu Glu Leu Val Gly Arg Leu Leu

180 185 190

Ser Val Ala Val Asn Gly Lys Asn Leu Thr Val Ile Pro Ile Val Gly

195 200 205

Met Ala Gly Ile Gly Lys Thr Thr Leu Ala Lys Val Val Tyr Asn Asp

210 215 220

Glu Lys Val Lys Asp His Phe Asp Leu Lys Ala Trp Phe Cys Val Ser

225 230 235 240

Glu Pro Tyr Asp Ala Phe Arg Ile Thr Lys Gly Leu Leu Gln Glu Ile

245 250 255

Gly Ser Phe Asp Leu Lys Met Asp Asn Asn Leu Asn Gln Leu Gln Val

260 265 270

Lys Leu Lys Glu Ser Leu Lys Gly Lys Lys Phe Leu Ile Val Leu Asp

275 280 285

Asp Val Trp Asn Asp Asn Tyr Asn Ala Trp Asp Asp Leu Lys Asn Leu

290 295 300

Phe Val Gln Gly Asn Ala Gly Ser Thr Ile Ile Val Thr Thr Arg Lys

305 310 315 320

Lys Ser Val Ala Lys Thr Met Gly Asn Glu Gln Ile Ser Met Asp Thr

325 330 335

Leu Ser Ser Asp Val Ser Trp Ser Leu Phe Lys Arg His Ala Phe Asp

340 345 350

Asn Met Asp Pro Lys Glu His Pro Glu His Val Glu Val Gly Lys Glu

355 360 365

Ile Val Ala Lys Cys Lys Gly Leu Pro Leu Ala Leu Lys Thr Leu Ala

370 375 380

Gly Ile Leu Arg Ser Lys Ser Glu Ile Glu Gly Trp Lys Arg Ile Leu

385 390 395 400

Arg Ser Glu Val Trp Glu Leu Pro Asp Asn Gly Ile Leu Pro Ala Leu

405 410 415

Met Leu Ser Tyr Asn Asp Leu Pro Ala His Leu Lys Gln Cys Phe Ser

420 425 430

Tyr Cys Ala Ile Phe Pro Lys Asp Tyr Pro Phe Arg Lys Lys Gln Val

435 440 445

Ile Gln Leu Trp Ile Ala Asn Gly Leu Val Gln Gly Leu Gln Lys Tyr

450 455 460

Glu Thr Ile Glu Asp Leu Gly Asn Leu Phe Phe Leu Glu Leu Gln Ser

465 470 475 480

Arg Ser Leu Phe Glu Arg Val Pro Glu Ser Ser Lys Asn Asn Ala Glu

485 490 495

Lys Phe Leu Met His Asp Leu Val Asn Asp Leu Ala Gln Val Ala Ser

500 505 510

Ser Lys Leu Cys Val Arg Leu Glu Glu Tyr Gln Glu Ser His Met Leu

515 520 525

Lys Arg Ser Arg His Met Ser Tyr Ser Met Gly Tyr Ala Asp Phe Glu

530 535 540

Lys Leu Gln Pro Leu Tyr Lys Leu Glu Gln Leu Arg Thr Leu Leu Pro

545 550 555 560

Ile Tyr Asn Ile Glu Leu Tyr Gly Ser Ser Leu Ser Lys Arg Val Leu

565 570 575

Leu Asn Ile Leu Pro Arg Leu Thr Ser Leu Arg Ala Leu Ser Leu Ser

580 585 590

Arg Tyr Asn Ile Lys Glu Leu Pro Asp Val Leu Phe Ile Lys Leu Lys

595 600 605

Leu Leu Arg Leu Val Asp Leu Ser Leu Thr Gln Ile Ile Gln Leu Pro

610 615 620

Asp Ser Ile Cys Val Leu Tyr Asn Leu Glu Ile Leu Leu Leu Ser Ser

625 630 635 640

Cys Glu Phe Leu Lys Glu Leu Pro Arg Gln Met Glu Lys Leu Ile Asn

645 650 655

Leu Arg His Leu Asp Ile Ser Gly Ser Ser Arg Leu Met Met Pro Leu

660 665 670

His Leu Ser Lys Leu Lys Ser Leu His Val Leu Leu Gly Ala Glu Phe

675 680 685

Leu Val Gly Asp Arg Ser Gly Ser Arg Met Glu Asp Leu Gly Glu Leu

690 695 700

Cys Asn Leu Tyr Gly Thr Leu Ser Ile Arg Gln Leu Glu Asn Val Ala

705 710 715 720

Asp Arg Arg Glu Ala Leu Lys Ala Asn Ile Arg Gly Lys Glu His Ile

725 730 735

Glu Lys Leu Leu Leu Glu Trp Thr Val Ser Ile Ala Asp Ser Ser Gln

740 745 750

Asn Glu Arg Asp Ile Leu Gly Glu Val His Pro Asn Pro Asn Ile Lys

755 760 765

Glu Leu Ala Ile Asn Gly Tyr Arg Gly Thr Asn Phe Pro Asn Trp Leu

770 775 780

Ala Asp Tyr Ser Phe Ser Glu Leu Val Glu Leu Ser Leu Ser Asn Cys

785 790 795 800

Lys Asp Cys Tyr Ser Leu Pro Ala Leu Gly Gln Leu Pro Ser Leu Lys

805 810 815

Phe Leu Ala Ile Arg Gly Thr His Arg Ile Ile Glu Val Thr Glu Glu

820 825 830

Phe Tyr Gly Ser Ser Ser Ser Lys Lys Pro Phe Asn Ser Leu Glu Lys

835 840 845

Leu Asp Phe Ala Glu Met Leu Glu Trp Glu Gln Trp His Val Leu Gly

850 855 860

Asn Gly Glu Phe Pro Val Leu Gln His Leu Ser Ile Glu Asp Cys Pro

865 870 875 880

Lys Leu Ile Gly Lys Leu Pro Glu Asn Leu Cys Ser Leu Thr Lys Leu

885 890 895

Thr Ile Ser His Cys Pro Glu Leu Asn Leu Glu Thr Pro Val Lys Phe

900 905 910

Pro Ser Leu Lys Lys Phe Glu Val Glu Gly Ser Pro Lys Ile Gly Val

915 920 925

Leu Phe Asp His Ala Glu Leu Phe Leu Ser Gln Leu Gln Gly Met Lys

930 935 940

Gln Ile Val Glu Leu Tyr Ile Ser Asp Cys His Ser Leu Thr Ser Leu

945 950 955 960

Pro Ile Ser Ser Leu Pro Asn Thr Leu Lys Val Ile Arg Ile Lys His

965 970 975

Cys Glu Lys Leu Lys Leu Glu Ser Ser Val Gly Lys Met Ile Ser Arg

980 985 990

Gly Ser Asn Met Phe Leu Glu Ser Leu Glu Leu Glu Glu Cys Asp Ser

995 1000 1005

Ile Asp Asp Val Ser Pro Glu Leu Val Pro Cys Ala Arg Tyr Leu

1010 1015 1020

Arg Val Glu Asn Cys Leu Ser Leu Thr Arg Leu Ile Ile Pro Asn

1025 1030 1035

Gly Ala Glu Asp Leu Lys Ile Lys Lys Cys Glu Asn Leu Glu Ile

1040 1045 1050

Leu Ser Val Ala Gln Thr Thr Pro Leu Cys Asn Leu Leu Ile Ser

1055 1060 1065

Asn Cys Glu Lys Leu Lys Ser Leu Pro Glu His Met Gln Glu Leu

1070 1075 1080

Leu Pro Ser Leu Arg Asp Leu Tyr Leu Glu Asn Cys Ser Glu Ile

1085 1090 1095

Val Ser Phe Ser Glu Gly Gly Leu Pro Phe Asn Leu Glu Ile Leu

1100 1105 1110

Gly Ile Gln Asp Cys Gly Glu Leu Val Asn Arg Arg Lys Glu Trp

1115 1120 1125

Asn Leu Gln Gly Leu Pro Ser Leu Thr Tyr Leu Asp Ile Ile His

1130 1135 1140

Arg Gly Phe Glu Asn Trp Asp Ile Ile Cys Glu Leu Pro Cys Ser

1145 1150 1155

Ile Arg Ser Leu Thr Ile Asp Asn Leu Lys Thr Phe Ser Ser Gln

1160 1165 1170

Val Leu Lys Ser Leu Thr Ser Leu Glu Tyr Leu Cys Thr Ser Asn

1175 1180 1185

Leu Pro Gln Ile Gln Leu Leu Leu Glu Glu Gly Leu Pro Thr Ser

1190 1195 1200

Leu Leu Met Leu Thr Leu Ser His His Gly Glu Leu His Ser Leu

1205 1210 1215

Pro Thr Asp Gly Leu Arg Arg Leu Thr Ser Leu Gln Arg Leu Arg

1220 1225 1230

Ile Asp Asn Cys Pro Asn Leu Gln Tyr Val Pro Glu Ser Thr Phe

1235 1240 1245

Pro Ser Ser Leu Ser Glu Leu His Ile Ser Ser Cys Ser Phe Leu

1250 1255 1260

Gln Ser Leu Arg Glu Ser Ala Leu Ser Ser Ser Leu Ser Asn Leu

1265 1270 1275

Phe Ile Tyr Thr Cys Pro Asn Leu Gln Ser Leu Met Leu Pro Ser

1280 1285 1290

Ser Leu Phe Glu Leu His Ile Ile Asp Cys Arg Asn Leu Gln Ser

1295 1300 1305

Leu Pro Glu Ser Ala Leu Pro Pro Ser Leu Ser Lys Leu Ile Ile

1310 1315 1320

Leu Thr Cys Pro Asn Leu Gln Ser Leu Pro Val Lys Gly Met Pro

1325 1330 1335

Ser Ser Ile Ser Phe Leu Ser Ile Ile Asp Cys Pro Leu Leu Lys

1340 1345 1350

Pro Ser Leu Glu Phe Glu Lys Gly Glu Tyr Trp Pro Asn Ile Ala

1355 1360 1365

His Ile Pro Thr Ile Val Ile Asp Cys Glu Cys Leu

1370 1375 1380

Claims (5)

1.一种抗烟草花叶病毒的N'au基因，其特征在于所述抗烟草花叶病毒的N'au基因的碱基序列如SEQ ID No.1所示，所述N'au基因不仅能抗烟草花叶病毒的TMV-U1株系，还能抗TMV-Cg株系。

2.一种根据权利要求1所述抗烟草花叶病毒的N'au基因的克隆方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）以Nicotiana alata总 DNA为模板，进行PCR扩增，使用的用上下游引物分别为：

N'-H8-F：5’-ATGGAGATTGGCTTAGCAGT-3’，

N'-H8-R：5’-TCACAGGCATTCACAATCGA-3’；

（2）将得到的PCR产物进行回收和纯化；

（3）测序。

3.根据权利要求2所述的克隆方法，其特征在于所述PCR的反应体系总体积为50μL，其中100ng/μL DNA 样品4.0μL，5×PCR buffer 10.0μL，dNTPs 2.5mmol/L each 4μL，10μmol/L的引物N'-H8-F和N'-H8-R各2.0μL，PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 1μL，ddH₂O 27μL。

4.根据权利要求2所述的克隆方法，其特征在于所述PCR的反应条件为：98℃ 2min，98℃ 10s，52℃ 15s，68℃ 5min，38个循环，68℃ 10min。

5.一种根据权利要求1所述抗烟草花叶病毒的N'au基因编码的多肽，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。