CN116874574B - 一种烟草小G蛋白调控因子RhoGDI及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种烟草小G蛋白调控因子RhoGDI及其应用，涉及植物基因工程技术领域，其技术要点为：所述烟草小G蛋白调控因子为基因RhoGDI，所述基因RhoGDI来自普通烟NC89，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述基因RhoGDI编码的蛋白质RhoGDI的氨基酸序列见SEQ ID NO：2所示。所述基因RhoGDI与烟草花叶病毒(TMV)感病相关基因NtRHO1相互作用，调控TMV感病相关基因NtRHO1表达，从而在烟草抗TMV中应用。本发明克服了现有技术中采用化学农药对其防治毒性较大、易残留污染环境、对人畜有害，持续地使用还会使植物产生抗药性的问题，将本发明方案应用于烟草病毒防治，对于可持续发展及环境安全有着重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种烟草小G蛋白调控因子RhoGDI及其应用。
背景技术
烟草花叶病毒(Tobaccomosaicvirus；TMV)是一种单链、正义RNA病毒，寄主多、分布广，是最具经济重要性的植物病毒之一。在烟草种植区，烟草或其他茄科植物都会遭受该病毒的侵染和为害。TMV侵染植物后，会快速繁殖并到达生长点以外的任何部位，出现叶片发黄、叶片畸形生长等表型，受感染的叶片斑驳污损，植株系统叶上呈典型花叶病症。TMV病害的大规模发生会严重影响经济作物的产量和品种，造成巨大的经济损失。因此，研究RhoGDI对TMV的抗病作用，揭示植物防御应答及抗病策略，为农业可持续发展提供科学支撑，具有重大现实意义和实用价值。
目前，现有技术中采用化学农药对其防治毒性较大、易残留污染环境、对人畜有害，持续地使用还会使植物产生抗药性。因此，明确烟草抗TMV的机制，克隆相关的抗病基因被越来越多地应用于病毒防治，这对于烟草产业的可持续发展及环境安全有着重要的意义。
为此，本发明旨在提供一种烟草小G蛋白调控因子RhoGDI及其应用，以解决现有技术中化学农药对TMV防治毒性较大、易残留污染环境、对人畜有害，持续地使用还会使植物产生抗药性的问题。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述问题，提供一种烟草小G蛋白调控因子RhoGDI及其应用。
为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种烟草小G蛋白调控因子RhoGDI，所述烟草小G蛋白调控因子RhoGDI为基因RhoGDI，所述基因RhoGDI来自普通烟NC89(Nicotianatabacumcv.NC89)，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述基因RhoGDI编码的蛋白质RhoGDI的氨基酸序列见SEQID NO：2所示。
本发明还提供了一种烟草小G蛋白调控因子RhoGDI的应用，所述基因RhoGDI与TMV感病相关基因NtRHO1相互作用，调控TMV感病相关基因NtRHO1表达。
进一步地，所述基因RhoGDI调控TMV感病相关基因NtRHO1表达的方法为：
构建RhoGDI的过表达载体，将RhoGDI基因全长正向插入PCM1307载体的酶切位点BamHI和KpnI之间，将获得的该基因的过表达载体导入普通烟NC89中。
进一步地，所述的RhoGDI过表达载体在烟草抗TMV中应用。
本发明上述方案涉及的序列如下：
SEQ ID NO：1(RhoGDI基因序列)：
ATGATGGAGGGTGGCAACAACAAAGAGGAAGCAGGTCCATCACGTGGCCTTAACTTTAGTGAAG
ACAAGAGAAAGGAGGAGTTAGAAGAGGGAGATAGTGAGGAAGATGAGCATAATCAAGATTCTGC
TACTGATATTATTACAACAAGTTATGTACCTGGTCCTCTCCTTTCTCTCAAAGATCAAATTGAA
AAGGACAAGGAGGATGAGAGCTTGAGGAGGTGGAAAGAGAAGCTGCTTGGTTGCCTGGAAAGTG
ACTTAAATGGACAAATGGAACCTGAAGTTAAGTTCCACTCAGTTGGAATTCTTTCCTCCGACTT
TGAGGAGATAAATACTCCATTGCCTGTTAAAGAAGGCCAGAGCAAATCTGTTCTTTTTACCCTC
AGGGAGGGCTCAGAGTACCGGCTTAAGCTAACATTTAGTGTTCTGCACAATATTGTTTCTGGCT
TGGCTTACACAAATACAGTATGGAAGGCCGGTCTTCAAGTTGATCAAAGTAAGGGAATGCTGGG
CACCTTTGCTCCTCAGCGAGAACCTTATATACATATGTTAGAAGAGGAGACCACTCCATCAGGT
GCACTTGCAAGAGGAACATATACAGCTAAACTTAAGTTTGTGGATGATGACAAAAGATGTCATT
TGGAGCTCAACTATTCGTTTGAAATAAGCAAGGGTAGGTAG
SEQ ID NO：1(RhoGDI蛋白序列)：
MMEGGNNKEEAGPSRGLNFSEDKRKEELEEGDSEEDEHNQDSATDIITTSYVPGPLLSLKDQIE
KDKEDESLRRWKEKLLGCLESDLNGQMEPEVKFHSVGILSSDFEEINTPLPVKEGQSKSVLFTL
REGSEYRLKLTFSVLHNIVSGLAYTNTVWKAGLQVDQSKGMLGTFAPQREPYIHMLEEETTPSGALARGTYTAKLKFVDDDKRCHLELNYSFEISKGR*
与现有技术相比，本方案的有益效果：
1、本发明的方案从普通烟NC89中克隆得到一个烟草感病基因NtRHO1的调控因子RhoGDI，它能与NtRHO1相互作用，编码的蛋白为RhoGDI，。RhoGDI可用于基因工程抗病，将其核苷酸序列插入过表达载体PCM1307中，得到该基因的过表达载体导入普通烟NC89中，可以提高普通烟NC89对TMV的抗性。
2、本发明克服了现有技术中采用化学农药对其防治毒性较大、易残留污染环境、对人畜有害，持续地使用还会使植物产生抗药性的问题，将本发明方案应用于烟草病毒防治，对于可持续发展及环境安全有着重要的意义。
附图说明
图1是本发明实施例中RhoGDI在TMV侵染后的烟草叶片中实时荧光定量qRT-PCR分析(X轴：0dpi、4dpi、8dpi、12dpi、16dpi和20dpi分别表示烟草受TMV侵染后的不同时；Y轴：RhoGDI在受TMV侵染后的表达量倍数)；
图2是本发明实施例中RhoGDI过表达载体构建图谱；
图3是本发明实施例中利用瞬时沉默和瞬时过表达技术研究RhoGDI在烟草抗TMV中的效应；
图4是本发明实施例中PCM1307-RhoGDI过表达载体转化普通烟NC89的T0代阳性转基因植物鉴定图；
图5是本发明实施例中PCM1307-RhoGDI过表达载体转化普通烟NC89的T1代阳性转基因植株接种TMV后的表型图；
图6是本发明实施例中RhoGDI过表达稳定遗传材料T1代受TMV侵染后病毒积累量检测。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明的实施例及附图，对本发明的技术方案进行进一步详细地描述，。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
本申请发明人将普通烟(Nicotiana tabacumcv.NC89)，在光密度为60μM m-2s-1，光周期为12h光照/12h黑暗，生长温度为24℃的条件下培养。本申请发明人在研究中发现，小G蛋白NtRHO1受TMV侵染后显著下调，在抗TMV的过程中起负向调控作用。通过酵母双杂实验发现小G蛋白NtRHO1的与其调控因子RhoGDI存在相互作用，且在TMV侵染后RhoGDI的表达量显著上调。利用瞬时沉默和瞬时过表达技术，对RhoGDI进行功能验证。结果显示，在接种TMV-GFP后，瞬时沉默RhoGDI植株积累了更多的TMV，瞬时过表达RhoGDI植株能抵抗TMV的侵染。进一步利用农杆菌介导的遗传转化技术，将过表达载体PCM1307-RhoGDI转化到普通烟NC89中获得转基因过表达RhoGDI阳性植株。分子鉴定和抗性鉴定结果表明，过表达RhoGDI植株抵抗TMV能力增强，表明该基因在烟草抗TMV过程中发挥正调控作用。下面将结合实施例来详细说明本发明。
实施例1：克隆RhoGDI基因
用TRIZOL(Invitrogen)提取样品叶片的总RNA，利用Ⅲ1st StrandcDNA Synthesis SuperMix for qPCR(YEASEN)合成反转录第一条链，得到样品的cDNA。通过NCBI网站blast到一段681bp的核苷酸序列，编码227个氨基酸，该基因命名为RhoGDI。根据核苷酸序列设计特异性引物：
F1(cgggatccatgatggagggtggcaacaa)和
R1(ggggtaccctacctacccttgcttattt)；得到RhoGDI片段。
实施例2：RhoGDI受TMV诱导的表达特征
把普通烟的种子播撒于营养土中发芽，露白后移苗到花盆中。在普通烟培养至5周大时，选取大小长势一致的幼苗，在其上位第3-4叶片轻度地撒上石英砂，机械摩擦接种TMV，对照组用0.02M的磷酸缓冲液(pH＝7.0)代替TMV接种。接种TMV后继续培养20天。分别在接种TMV的第0、4、8、12、16、20天取样，将样品存放于-80℃冰箱内保存备用。提取样品叶片的总RNA，反转录得到样品的cDNA。
应用能特异性扩增RhoGDI的F2引物(atgatggagggtggcaacaa)和R2引物(acttgttgtaataatatcag)，对该基因在受TMV侵染普通烟样品中进行qRT-PCT分析。qRT-PCR反应在Q-PCR仪上扩增。20μL反应体系中含2μL cDNA，10μL HieffUniversalBlue qPCR SYBR Green Master Mix(YEASEN)，0.5μL引物F1和0.5μL引物R1。扩增参数为：95℃2min，然后95℃10sec，60℃30sec，40个循环。反应结束后，计算相对表达量：根据得到的Cq值计算目标基因在受TMV侵染后不同时间点相对阴性对照组的相对表达量，即2-CT。其中CT＝(CT.Target-CT.Tublin)Time X-(CT.Target-CT.Tublin)Time 0。TimeX代表任意时间点，T0代表未处理时间点。结果表明：在烟草叶片中，RhoGDI受TMV侵染后8dpi表达量上调至最高，RhoGDI可能与TMV抗性呈正相关。
实施例3：RhoGDI过表达载体的构建
利用上述RhoGDI的cDNA为模板，以可特异性扩增RhoGDI基因片段的引物F1和R1进行PCR扩增，回收扩增片段。用BamHI和KpnI双酶切将扩增目的片段目标插入到载体PCM1307启动子后面的多克隆位点BamHI和KpnI之间。由此获得RhoGDI基因的过表达载体PCM1307-RhoGDI。
实施例4：利用农杆菌介导的瞬时表达技术将RhoGDI基因过表达载体转入烟草叶片
取100μL的农杆菌GV3101感受态细胞在冰上融化，然后加入5μL的连接产物，轻轻混匀后，放在冰上静置25分钟；随后将混合液体在液氮中速冻5分钟，并迅速转移至37℃水浴锅中热激5分钟；然后又在于冰上静置5分钟；在离心管中加入无抗生素的LB培养液500mL，28℃条件下复苏2小时；待复苏完成后，5000rpm富集菌体，并取合适体积的复苏液用灭菌珠均匀涂布到含有相应抗生素的培养基上，28℃培养箱中倒置培养过夜。挑取阳性农杆菌菌株到含相应抗生素的LB培养基中，28℃培养12小时左右；待菌液生长起来后，取100μL的母液接种于5mL含相应抗生素的LB培养基中，28℃振荡培养10小时左右；待菌液OD 600达到0.8时，5000rpm离心3分钟，并用侵染缓冲液重悬菌体；将配置好的侵染菌液在室温条件下静置3-4小时后，用含PCM1307-RhoGDI载体的农杆菌进行侵染；PCM1307空载体做为阴性对照进行侵染；被侵染本氏烟大小约为3-4周，用1mL注射器吸取约500μL的混合农杆菌侵染液，缓慢的注射于平整光滑的叶片；侵染完成后的烟草放置在温室中进行培养，3天后用TMV-GFP侵染接种叶片，并观察后续叶片的表型。
实施例5：烟草瞬时过表达RhoGDI抗病毒能力检测
取实施例3中新鲜的叶片组织置于充分预冷的研钵中，并研磨至组织样品发白；准确称取0.1g研磨样品转移至2mL的离心管中，并加入适量的2×蛋白提取缓冲液，随后在漩涡振荡仪上充分混匀；随后将样品在90℃的恒温水浴锅中10-15分钟，目的是使蛋白质充分变性；将变性后的蛋白样品放置在离心机中，8000rpm离心10分钟，小心的吸取上清液并转移至新的1.5mL离心管中，液氮速冻后置于-20℃保存备用；
配置12％的分离胶及5％的浓缩胶；12％SDS-PAGE分离胶(H2O9.2mL；30％聚丙烯酰胺5.4mL；1.5MTis-HCl(pH＝8.8)5mL；10％SDS 100μL；10％APS100μL；TEMED10μL)；5％SDS-PAGE浓缩胶(H2O2.2mL；30％聚丙烯酰胺687μL；0.5MTis-HCl(pH＝6.8)1mL；10％SDS40μL；10％APS40μL；TEMED4μL)。待SDS-PAGE胶完全凝固后，可在水流下小心的拔出梳子，随后将胶板置于电泳槽中，加入适量的电泳缓冲液，并在胶孔中依次加入样品；将蛋白样品在120V电压中电泳约1-2小时，直至溴酚蓝指示剂电泳至分离胶底部；随后取出玻璃板，并小心的将玻璃板撬开，去除浓缩胶，将分离胶置于转膜夹子中的滤纸上(注意凝胶易碎，需小心操作)；裁剪一块与分离胶大小相同的PVDF膜，并将其浸泡在甲醇中；将经过甲醇浸泡的膜置于分离胶上，并在膜上再覆盖一层滤纸；将组装好的转膜夹子置于电泳槽中，按照“胶负膜正”的原则进行电泳；电泳时间为80V约2小时，并且转膜过程应在冰上进行；将PVDF膜置于25mL封闭液(NO-fatMilk2.5g；TBST50mL)中，并在摇床上封闭约2小时，封闭完成后，将膜置于一抗稀释液中，室温杂交2小时；完成一抗结合后，用TBST(1MTris-HCl(pH＝8.0)20mL；NaCl8.8g；Tween-201mL；H2O定容至1L)洗脱液对膜进行清洗，清洗4次，每次5分钟；将清洗完毕的PVDF膜置于二抗稀释液中，室温杂交1-2小时；完成二抗结合后，再次用TBST洗脱液对膜进行清洗，清洗4次，每次5分钟；将PierceTMECL化学发光液按照A液与B液1:1的比例混合；将显影液均匀的涂抹到膜上，并将膜置于凝胶成像系统上进行曝光；保存显影结果分析实验。
实施例6：叶盘法介导的RhoGDI过表达稳定遗传材料转化及基因功能验证
共培养：取烟草无菌苗切去叶片，放在水中暂存，PCM1307-RhoGDI阳性农杆菌液富集后，用MS液体培养基(MS盐1.89g；蔗糖8g；H2O定容至400ml后用NaOH将pH调至5.8)重悬，叶片切成小片后在重悬叶中进行侵染5-10分钟。滤纸吸去表面多余菌液，移入共培养培养基(MS盐1.89g；蔗糖8g；H2O定容至400ml后用NaOH将pH调至5.8，加入琼脂粉3g；6-BA0.8mg；NAA0.4mg)中暗培养48h。
分化筛选：将共培养中的叶片转移到分化筛选培养基(MS盐1.89g；蔗糖8g；H2O定容至400ml后用NaOH将pH调至5.8，加入琼脂粉3g；6-BA 0.6mg；NAA 0.1mg)中。三周后，叶盘边缘分化出芽点，用镊子从其中拆分出完整的单个芽点。
伸长生根：将分离下来的芽点转移到伸长培养基(MS盐1.89g；蔗糖8g；H2O定容至400ml后用NaOH将pH调至5.8，加入琼脂粉3g；6-BA 0.04mg；NAA 0.1mg)中，三到四周便有生根的苗子出现，待植株根系强健时可打开组培瓶盖子炼苗1-2d，最后洗去根系附着的培养基残渣后将其移入土中，获得转基因材料10株。
鉴定：提取所有转基因材料的总蛋白，鉴定RhoGDI的表达量。根据Westernblot结果选出三株阳性植株，株系编号分别为：WT、OE-RhoGDI#1、OE-RhoGDI#6和OE-RhoGDI#8。分别播种WT、OE-RhoGDI#1、OE-RhoGDI#6和OE-RhoGDI#8，结果表明：接种TMV8dpi时观察到OE-RhoGDI阳性转化材料率先表现出花叶症状，表明OE-RhoGDI植株有更强的抗病毒能力，能更快地从TMV侵染的过程中恢复过来。分别提取植株中的总蛋白，检测叶片中TMV的含量，结果显示：OE-RhoGDI#1、OE-RhoGDI#6和OE-RhoGDI#8中TMV含量较WT更低。
综上所述，通过本发明的上述实施例，本发明从普通烟NC89中克隆得到一个烟草感病基因NtRHO1的调控因子RhoGDI，它能与NtRHO1相互作用，编码的蛋白为RhoGDI。RhoGDI可用于基因工程抗病，将其核苷酸序列插入过表达载体PCM1307中，得到该基因的过表达载体导入普通烟NC89中，可以提高普通烟NC89对TMV的抗性。本发明的方案克服了现有技术中采用化学农药对其防治毒性较大、易残留污染环境、对人畜有害，持续地使用还会使植物产生抗药性的问题，其能够应用于烟草病毒防治领域，且对于可持续发展及环境安全有着重要的意义。
以上具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (3)
1.一种烟草小 G 蛋白调控因子 RhoGDI 的应用，其特征是：所述烟草小 G 蛋白调控因子 RhoGDI 为基因 RhoGDI，所述基因 RhoGDI在烟草抗烟草花叶病毒 TMV 过程中发挥正调控作用，所述基因RhoGDI 核苷酸序列如 SEQ ID NO：1 所示；所述基因 RhoGDI 编码的蛋白质 RhoGDI 的氨基酸序列见 SEQ ID NO：2 所示。
2.如权利要求 1 所述的一种烟草小 G 蛋白调控因子 RhoGDI 的应用，其特征是：所述基因 RhoGDI 与烟草花叶病毒 TMV 感病相关基因 NtRHO1 相互作用，调控 TMV 感病相关基因 NtRHO1 表达，所述基因 RhoGDI 调控 TMV 感病相关基因 NtRHO1 表达的方法为：构建基因 RhoGDI 的过表达载体，将 RhoGDI 基因全长正向插入PCM1307 载体的酶切位点BamHI 和 KpnI 之间，将获得该基因的过表达载体导入普通烟 NC89 中。
3.如权利要求 2 所述的一种烟草小 G 蛋白调控因子 RhoGDI 的应用，其特征是：所述基因 RhoGDI 的过表达载体在烟草抗烟草花叶病毒 TMV 中的应用。
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