WO1995006722A1

WO1995006722A1 - Procede permettant de transformer une monocotyledone avec un scutellum d'embryon immature

Info

Publication number: WO1995006722A1
Application number: PCT/JP1994/001442
Authority: WO
Inventors: Hideaki Saito; Yuji Ishida; Yukoh Hiei; Toshihiko Komari
Original assignee: Japan Tobacco Inc.
Priority date: 1993-09-03
Filing date: 1994-09-01
Publication date: 1995-03-09
Also published as: PT672752E; DE69433809T2; ES2220913T3; AU687863B2; US7939328B1; DK0672752T3; CA2148499A1; EP0672752A1; JP3329819B2; EP0672752A4; CA2148499C; AU7546094A; DE69433809D1; ATE267870T1; EP0672752B1

Description

明細書

未熟胚の胚盤を用いた単子葉植物の形質転換方法

技術分野

本発明は、単子葉植物の形質転換方法に関する。

背景技術

単子葉植物の形質転換方法としては、従来より、エレクトロポレーシヨン法、ポリエチレングリコール法（PEG法）、パーティクルガン法その他が知られている。

エレクトロポレーション法は、プロトプラス卜と目的の DN Aを混合し、電気刺激で細胞膜に穴を開けることにより DNAを細胞内に導入し形質転換を図る方法である。この方法で種々の遺伝子が単子葉植物、特にイネに導入されている

(Toriyama K. et al.， 1988; Biotech. 6:1072-1074, Shimamoto K. et al. , 1989; Nature 338:274-276, Rhodes C. A. et al. , 1988; Science 240:204 - 207

：) 。しかしながら、この方法は、 1) プロトプラストからの個体再生系が確立されている植物種のみに適応可能である、 2) プロトプラストから'個体再生までには数力月を要するので、形質転換体を得るのに時間がかかる、 3) 培養期間が長期化するので、それに伴う培養変異の頻度が高くなり、正常な形質転換体を得る頻度が低くなる、という問題点を有する。

PEG法は、目的遺伝子とプロトプラストとを混合し、 PEGで処理することによって遺伝子の導入を図る方法であり、エレク卜口ポレーシヨン法とは電気刺激が P E Gに変わつた点で異なる。導入効率はェレクトロポレーション法よりはいくぶん低いと考えられる。この方法で形質転換体を得た報告はあるものの、広く用いられているとは言い難い。プロトプラストを用いるため、エレクトロボレ一シヨン法と同様な問題点を持つ（Zhang W. et al. , 1988; Theor. Appl. Genet. 76 :835 - 840， Datta S. K. et al. , 1990; Biotech. 8:736-740 ) 。

また最近、弱い酵素処理をしたトウモロコシ未熟胚およびカルスに電気刺激によって遺伝子を導入する方法が報告された（D'Halluin L et al. , 1992; Plant

Cell 4:1495-1505 ) 。導入された遺伝子の存在は再分化植物体においても確認されている。し力、し、まだこの方法での形質転換の成功例は一報のみである。パーティクルガン法は、目的の遺伝子を微細な金属粒子に付着させ、金属粒子を高速で細胞あるいは組織に撃ち込むことによって形質転換を行わせる方法である。従って、原理的にはあらゆる組織を対象に形質転換を行なうことができ、特にプロトプラス卜からの再生系が確立されていない植物種に有効であるとされている。

今までにトウモロコシではタイプ IIカルス（Armstrong L. and Green C. E.， 1985; Planta 164:207-214 ) を材料にパーティクルガン法により形質転換を行ない、そこから正常な稔性を有する形質転換体を得た報告がいくつかある (Gordon- Kamm . J. et al. , 1990; Plant Cell 2:603-618, Fro聽 M. E. et al. , 1990; Biotech. 8:833-839, Walters D. A. et al. , 1992; Plant Mol. Biol. 18:189-200 Vain P. et al.， 1993; Plant Cell Rep. 12:84 - 88) 。しかし、これらの報告のほとんどは、培養容易性の品種を材料として使用しており、まだ、あらゆる品種に適用できる技術には至っていない。

Vasil らはパーティクルガンによってコムギのェンブリオジヱニックカルスにパスタ、ビアラフォス等の除草剤の主成分であるホスフィノスリシンをァセチル化する b a r遺伝子（Thompson, C. J. et al. , 1987; EMBO J. 6:2519-2523 ) と GUS遺伝子を導入し、パスタ抵抗性のカルスおよび再生植物体を得た。これらのカルスおよび再生植物体における、導入遺伝子の産物である酵素の活性を確認し、また b a r遺伝子が存在することをサザン分析で確認した（Vasil V. et al., 1992; Biotech. 10:667-674) 。

Liらはパーティクルガンによってィネの未熟胚ぉよびェンブリオジェニック力ルスにハイグロマイシン抵抗性遺伝子を導入後、選抜を行ない、ハイグロマイシン抵抗性再生植物体を得た。この植物体でのハイグロマイシン抵抗性遺伝子の存在をサザン分析で確認した。この後代の種子のハイグロマイシン抵抗性は 3 ： 1 の分離が見られた（Li L. et al. , 1993; Plant Cell Rep. 12:250-255) 。

Christouらはパーティクルガンによってイネの未熟胚に b a r、ハイグロマイシン抵抗性遺伝子および G U S遺伝子を導入し、ハイグロマイシンまたはビアラフォスに抵抗性で GU S活性を示す植物体を得て、導入遺伝子の存在をサザン分析によって確認した（Christou P. et al. , 1991; Biotech. 9:957-962) 。 Kozielらはパ一ティクルガンによってトウモロコシ未熟胚に b a r遺伝子と B t毒素合成遺伝子を導入し、ホスフィノスリシン抵抗性植物体を得た。この植物体は B t毒素蛋白の合成と、サザン分析により導入遺伝子の存在が確認された (Koziel M. G. et al.， 1993; Biotech. 11:194-200) 。

その他の方法としては、 1) 種子、胚と DN Aの共存培養 (Topfer R. et al.， 1989; Plant Cell 1:133-139， Ledoux L. et al. , 1974; Nature 249:17-21) 、

2) 花粉管への処理（Luo and Wu 1988; Plant Mol. Biol. Rep. 6:165- ) 、

3) リボソーム法 (Caboche M. 1990; Physiol. Plant. 79:173-176, Gad A. E. et al. , 1987; Theor, A卯 1. Genet. 75:30-36 ) があるが、形質転換の効率、再現性、あるいは汎用性に関して問題があり、一般的な方法とは言い難い。

一方、ァグロパクテリゥム属細菌の T iプラスミドをベクタ一として用いた遺伝子導入法は、タバコ、ペチュニア、ナタネ等の双子葉作物の形質転換法として普遍的に用いられている。しかしながら、ァグロパクテリゥム属細菌の宿主は双子葉植物のみに限られ、単子葉植物には寄生しないとされている（De Cleene M. 1976; Bot. Rev. 42:389-466 ) 。

ァグロパクテリゥムによる単子葉植物の形質転換に関してはアスパラガス (Bytebier B. et al.， 1987; Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84:5345-5349) 、そしてャム (Dioscorea bulbifera ) (Schaferw, et al. , 1987; Nature 327: 529-532) で報告されているが、その他の単子葉植物、特にイネ科作物にはこの方法を適用できないとされている（Potrykus I. 1990; Biotechnology 8:535-543

) o

Grimsleyらはァグロバクテリゥムの T一 DN Aの中にトウモロコシストリ一クウィルス（Maize streak virus) の D N Aを挿入したものをトウモロコシ生長点に接種したところ、トウモロコシストリークウィルスの感染を確認したことを報告している。トウモロコシストリ一クウィルスの DN Aを接種しただけではこのような感染症状が認められないことから、上の観察はァグロバクテリウムがトウモロコシに DN Aを導入することができることを示すものと解釈している (Grimsley et al. , 1987; Nature 325:177-179 ) 。し力、し、ウィルスは核ゲノムに組み込まれなくても増殖する可能性があるので、この結果は T— DNAが核に組み込まれたことを示すものではない。その後、感染効率はトウモロコシの茎頂の生長点に接種したときが最も高く (Grimsley et al. , 1988 ; Biotech. 6 : 185 -189 ) 、感染にはァグロバクテリゥムのプラスミドの V i r C遺伝子が必須であることを示した（Grimsley et al. , 1989 ; ol. Gen. Genet. 217: 309-316 ) 。

Gould らはトウモロコシの生長点に針で傷をつけた後カナマイシン抵抗性遺伝子と G U S遺伝子を持つた強病原性ァグロバクテリゥム E H A 1を接種し、処理後の生長点をカナマイシンで選抜したところ、抵抗性を示す植物体を得た。この後代の種子が導入した遺伝子を持つことを確認するためサザン分析を行つたところ、一部の種子で導入遺伝子が確認された（Gould J. et al.， 1991 ; Plant Physiol. 95 :426-434) 。このことはァグロバクテリゥム処理された生長点から力ナマイシン選抜により得られた植物体には形質転換細胞と非形質転換細胞が混在していたことを示す（キメラ現象）。

Mooneyらは、ァグロバクテリゥムを用いて小麦の胚にカナマイシン抵抗性遺伝子の導入を試みた。まず、胚を酵素で処理し、細胞壁に傷をつける処理をし、その後ァグロバクテリゥムを接種した。処理したカルスのうち極めて少数のカナマィシン抵抗性と思われるカルスが増殖したが、このカルスから植物体の再生はできなかった。また、カナマイシン抵抗性遺伝子の存在をサザン分析で確認したところ、全ての抵抗性カルスで導入遺伝子の構造変異がみられた（Mooney P. A. et al.， 1991 ; Plant Cell, Tissue, Organ Culture 25 : 209-218 ) 。

Raineri らはイネの胚盤に傷をつけた後、強病原性のァグロパクテリゥム A 2 8 1 (pTiBo542) をイネの 8品種に処理したところ、日本晴、藤坂 5号の 2 品種で腫瘍状の組織の増殖がみられた。さらに、 T— D N Aからホルモン合成遺伝子を除いた T iプラスミドにカナマイシン抵抗性遺伝子と G U S遺伝子を挿入したプラスミドを持つァグロバクテリゥムをイネの胚に接種したところカナマイシン抵抗性カルスの増殖がみられた。この抵抗性カルスでは G U S遺伝子の発現が認められたが、形質転換植物を得ることはできなかった。これらのことから、ァグロバクテリゥムの T一 D N Aがィネの細胞に導入されたと解釈している

(Raineri et al.， 1990 ; Biotech. 8 : 33-38) 。

このように、イネ、トウモロコシ、コムギ等のイネ科の作物でもァグロバクテリゥムによる遺伝子導入が可能であることを示唆する研究報告が現れてきている力何れも再現性に問題があるほか、導入した遺伝子の確認についても不完全で、説得できる結果が示されていなかった（Potrykus I. 1990 ; Biotech. 8 : 535 -543) 。

Chanらは 2， 4— D共存下で 2日間培養したイネ未熟胚に付傷後、ジャガイモ懸濁培養細胞を含む培地中で npt 11遺伝子と G U S遺伝子を持つたァグロバクテリウムを接種した。処理した未熟胚を G418添加培地上で培養したところ誘導されたカルスから再分化植物体が得られた。再分化植物体およびその後代の植物体での G U S遺伝子の所在をサザン分析で確認したところ、再分化当代、後代いずれの植物体でも導入遺伝子の存在が認められたことを報告している（Chan M. T. et al.， 1993 ; Plant Mol. Biol. 22:491-506) 。この結果は、ァグロパクテリゥムによるイネの形質転換を支持するものであるが、形質転換効率は 1. 6%と非常に低く、供試した未熟胚数 250に対し、正常な生長を示した再生植物体は 1個体に過ぎなかった。イネの未熟胚を摘出するには多大な労力を要するため、このように低い形質転換効率では実用的なレベルにあるとは言い難い。

発明の開示

上述のように、イネ科作物における遺伝子導入法は、エレクトロポレーシヨン法およびパーティクルガン法が主流である。エレクトロポレーシヨン法の場合、プロトプラストを用いるため、再生植物を得るまで長期間を要し、多大な労力がかかり、また長期間の培養により高頻度で変異体が出現するという危険性がある。また、この方法はプロトプラストからの再分化系が確立されていない作物、例えばトウモロコシには適用できない。細胞をプロトプラスト化しない程度の酵素処理をした未熟胚に電気刺激により遺伝子導入を行なう方法（D'Halluin K. et al. , 1992 ) も報告されているが、まだ成功例は一例のみであり、今のところ一般的な手法とは言い難い。そこで、上述のように、トウモロコシに対しては、夕ィプ I Iカルスあるいは未熟胚を用いたパーティクルガン法が試みられている。パーティクルガンを用いた場合、形質転換体が得られる可能性は高いが、パーティクルガンという特別な装置が必要であり、この装置なしには形質転換は不可能である。また微細な金属微粒子の飛散による、実験者に対する危険性も考えられる。またトウモロコシに対しては、生長点組織にァグロパクテリゥムを感染させることが試みられている（Gould J . et al. ， 1991 ) 。しかし生長点を単離する作業は多くの労力を要し、大量に調製することは必ずしも容易ではない。また本願発明者がこの手法によってトウモロコシ形質転換体の作出を試みたが、形質転換体は得られなかった（表 1 ) 。

従って、本発明の目的は従来の方法に比較して、形質転換から植物体の再生までの時間が短く、プロトプラス卜からの植物体の再生が確立されていない植物に対しても普遍的に適用することができ、特殊な装置を必要とせず、さらに用いる材料の調製が容易な単子葉植物の形質転換方法を提供することである。

本願発明者らは、ァグロパクテリゥムで処理する単子葉植物の植物組織、ァグロバクテリゥムの処理条件、及びバイナリ—ベクタ—の構成等が遺伝子導入効率に及ぼす影響等を鋭意研究した結果、単子葉植物の脱分化処理していな、未熟胚をァグロバクテリゥム属細菌を用いて飛躍的に高い効率で形質転換ができること、そしてこの方法には再現性があり、これによれば上記目的を達成することができることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、所望の遺伝子を含有するァグロバクテリゥム属細菌で単子葉植物の脱分化処理していな L、未熟胚の胚盤を形質転換することから成る、単子葉植物の形質転換方法を提供する。

本発明の方法により、イネ、トウモロコシ、コムギ、ォォムギ等のイネ科植物を始めとする単子葉植物に目的の外来遺伝子を再現性良く導入することが初めて可能になった。ァグロバクテリゥムを用いた単子葉植物の形質転換方法はこれまでにもあるが、前述のとおり確立された方法とは言い難い。し力、し、本発明ではこれまでに用いられていな L、脱分化処理していな L、未熟胚に本発明で改良した方法でァグロバクテリウムを接種することにより、極めて容易に遺伝子を導入することができた。本発明の方法では材料調製が容易な未熟胚を用いるので、生長点を用いる従来技術に比べて供試材料を容易に得ることができる。また、形質転換は未熟胚の胚盤になされるため、プロトプラス卜を形質転換する場合に比べて植物体再生までの時間が短く、変異の頻度が低下する。また、スーパ—バイナリーベクターを用いれば、トウモロコシや一部のィネ品種のように培養が困難な品種にも高い効率で遺伝子を導入することが可能である。

図面の簡単な説明

図 1は、本発明の方法に用いることができるァグロパクテリゥム属細菌に含まれるプラスミドの一例である pTOK162 の構造と本発明の実施例で用いたプラスミド p T O K 2 3 2の構築方法を示す図である。

図 2は、図 1と同様に pSBlの構造とプラスミド p S B 1 3 1の構築方法を示す図である。

発明を実施するための最良の形態

本発明の方法により形質転換される単子葉植物は、特に限定されるものではなく、イネ、トウモロコシ、ォォムギ、コムギ、アスパラガスその他、いかなる単子葉植物にも適用可能である。もっとも、イネ、トウモロコシ、ォォムギ及びコムギ等を包含するイネ科植物が好ましく、とりわけトウモロコシが好ましい。本発明において、未熟胚とは受粉後の登熟過程にある未熟種子の胚を言う。また、本発明の方法に供される未熟胚のステージ（熟期）は特に限定されるものではなく、受粉後いかなる時期に採取されたものであってもよい。もっとも、受精後 2日以降のものが好ましい。また、後述の形質転換後、後述の方法により、脱分化し、正常な個体を再生する能力を有するカルスを誘導できる未熟胚胚盤を用いることが好ましい。また、未熟胚はインブレツド、インブレツド間の F l、ィンブレツドと自然受粉品種間の F 1、市販 F 1品種の未熟胚であることが好ましい。

また、本発明において、脱分化処理とは、植物組織の分化した細胞を脱分化培地において培養し、無秩序に増殖するカルス等の未分化状態の細胞塊を得るための処理である。

形質転換に用いられるァグロバクテリウム属細菌は、 T iプラスミド又は R i プラスミドを持つ、従来より双子葉植物の形質転換に用いられているものを用いることができる。これらのものの多くは Agrobacterium tumefaciens 由来の T i プラスミドのヴィルレンス領域（vir 領域）由来の D N A領域を含むベクタ一を有しており、植物に付与しょうとする形質を担う遺伝子はこのベクター中に挿入されるか、またはこのベクターとは別のプラスミド中に存在し、相同組換え等により T iプラスミド中に n vivo で揷入されるものである。また、小鞠らは、 Agrobacterium tumefaciens A 281という強病原性の、形質転換効率が極めて高い株 (Hood, E. E. et al. , 1984; Biotech. 2:702-709、 Hood, E. E. et al. ,

1986; J. Bacteriol. 168:1283-1290 、 Komari, T. et al.， 1986; J. Bacteriol. 166:88-94、 Jin, S. et al. , 1987; J. Bacteriol. 169:4417-4425

、 Komari, T. , 1989; Plant Science 60:223-229、 ATCC 37349) に含まれる T iプラスミド pTIBo542のヴィルレンス領域（vir領域）由来の DN A領域を含むベクタ一（本明細書において、このベクターを「スーパーバイナリ一べク夕一」と呼ぶことがある）を開発した（特開平 4 - 222527号）。本発明では、このようなスーパーバイナリベクタ一を好ましく用いることができる。

このようなスーパーバイナリ一べクターの例として pTOK162 (特開平 4 - 222527号）を挙げることができる。その構造を図 1に示す。このプラスミドは、大腸菌および Agrobacterium tumefaciens 中で増殖可能である pT0K154 と呼ばれるプラスミド（T iプラスミドから誘導された公知の pGA472プラスミドと pVCKlOl と呼ばれる公知の広宿主域プラスミドから後述の方法により構築された、 T領域を含むプラスミド）に pTiBo542のヴィルレンス領域由来の既にクロ一ン化されていた上記 15. 2キロベースの Kpnl断片（virB， virG, VirC各遺伝子を含む）を組み込んだものである。この pT0K154 には、 T領域の 2つの境界配列とその間に単子葉植物に導入しょうとする遺伝子としてカナマイシン耐性遺伝子が配列されており、この例は、単子葉植物に導入しょうとする遺伝子が pTiBo542 のヴィルレンス領域由来のクローン化された DN A断片を含有するプラスミド上に配置されている例である。

単子葉植物に組み込もうとする所望の遺伝子は、上記プラスミドの T— DNA 領域中の制限酵素部位に常法により組み込むことができ、プラスミドが有する薬剤耐性等の適当な選択マ—力—に基づいて選択することができる。もっとも、図

1に示す PTOK162 のように、大型で多数の制限部位を持つものは、通常のサブクローンニングの手法では所望の D N Aを T領域内に導入することが必ずしも容易でないことがある。このような場合には Agrobacterium tumefaciens細胞内の vivo系での相同組換え（Herrera- Estrella, L. et al. , 1983; EMBO J. 2:987 - 995、 Horsch, R. H. et al.， 1984 ; Science 223 : 496- 498 ) を利用することにより、目的の D N Aを pTOK162 に導入することが可能になる。すなわち、例えば、先ず、 PTOK162 を Agrobacterium tumefaciens に導入しておいて、この菌をさらに所望 D N Aを導入した pBR322と呼ばれるプラスミド（類似のプラスミドを含む）を導入する。 PTOK162 の D N Aには pBR322と相同な部分があるので、 PBR322誘導体は相同配列を介した組換えにより PTOK162 に組み込まれることになる。 pBR322は pTOK162 と異なり Agrobacterium tumefaciens 中では複製できないので、このような組み込まれた状態（pTOK162 : :pBR322 誘導体という）でなければ Agrobacterium tumefaciens 中で生存することができない。そして、 pTOK162 と PBR322誘導体の各々に特異的な特性（薬剤耐性等）について選抜すれば、 pTOK162 : : pBR322 誘導体を有する Agrobacterium tumefaciens を得ることができる。さらに、 pTOK162 を有する Agrobacterium tumefaciens に各種のプラスミドを導入して研究したところ、 pBR322誘導体の選抜マーカ一としては、トランスポゾン T n 7 (De Greve, H. H. et al.， 1981 ; Plasmid 6 : 235-248 ) 由来のスぺクチノマイシン耐性遺伝子（S P ) が優れていることが判明した。従って、すでに所望の遺伝子が PBR322にクローン化されている場合には、 S P遺伝子をそのプラスミドに揷入すれば、 Agrobacterium tumefaciens 内の相同組換えにより、 PTOK162 の T領域に所望の遺伝子を導入することができる。またその他の場合には、 pBR322由来の D N Aと S P遺伝子から構成されるプラスミドを用意しておいて、これに所望の遺伝子を挿入する方法も考えられる。この際、 T領域の境界配列を活用すれば、最終的に、 PTOK162 上において、カナマイシン耐性遺伝子と所望の遺伝子を別々の T領域中に配置することも可能である。カナマイシン耐性をマーカーとして植物を形質転換した場合、両 T領域とも導入される場合も相当の比率で生じるわけであるので、目的遺伝子の導入は十分達成できる。また、両 T 領域が別々の染色体に組み込まれる場合もあり得るので、後に目的の遺伝子を力ナマイシン耐性遺伝子から分離することも可能となる。

寄主となるァグロパクテリゥム属細菌としては、特に限定されないが、 Agrobacterium tumefaciens を好ましく用いることができる。

プラスミドを Agrobacterium tumefaciens 等のァグロバクテリゥム属細菌に導入する操作は従来法により行うことができ、例えば、細菌の三系交雑手法

(Ditta, G. et al.， 1980 ; Pro. Natl. Acad. Sci. USA 77 : 7347-7351 ) により行うことができる。

このようにして調製されるァグロパクテリゥム属細菌には、 pTOK162 由来のヴィルレンス能力の高い D N Aが含まれるので、高、効率で単子葉植物の形質転換を行うことが可能である。

尚、本発明においては、単子葉植物に導入しょうとする遺伝子は、従来の技術と同様に T領域の境界配列の間に配置されるものであるが、ァグロパクテリゥム属細菌中で、 T iプラスミド上に配置されてもよく、または他のプラスミド上に配置されてもよい。

ァグロパクテリゥム属細菌で単子葉植物の未熟胚を形質転換する方法は、未熟胚をァグロパクテリゥム属細菌と単に接触させることにより行うことができる。例えば、 1 0 ^ϋ 〜1 0 ^{1 1}細胞/ m 1程度の細胞濃度のァグロパクテリゥム属細菌懸濁液を調製し、この懸濁液中に未熟胚を 3〜1 0分間程度浸漬後、固体培地上で数日間共存培養することにより行うことができる。形質転換に供する未熟胚は、 2， 4—D共存下での培養等の脱分化処理を行うことなく、未熟胚をそのまま形質転換処理に供する。従来、ァグロパクテリゥム属細菌を用いた植物の形質転換方法では、ァグロバクテリウム属細菌と接触させる前に、 2 , 4— Dとの共存培養等の脱分化処理を行つていたが、本願発明者らはこの脱分化処理が不要であることを見出した。よって、本発明の方法は、従来の方法に比べて簡便であるという利点を有する。さらに、植物によっては、特にトウモロコシでは、形質転換処理の前に脱分化処理を行うと、形質転換効率が低下するので、このような植物では、前処理を行わない本発明の方法により形質転換効率を高めることができる。また、従来、ァグロバクテリウム属細菌で植物を形質転換する際に、感染効率が高くなるように、植物に傷をつけたり、酵素処理して細胞壁をある程度溶解してからァグロバクテリウム属細菌を感染させていた。本発明の方法では、このような前処理を行ってもよいが、本願発明者らは、このような前処理を行わなくても効率良く形質転換が行えることを見出した。特に、トウモロコシの場合には、付傷すると形質転換後にカルスへ誘導する効率が低下するので、このような前処理を行わないことが好まし t、。

形質転換した未熟胚は、その後、公知の方法（Green, C. E. and Phillips, R. L.， 1975 ; Crop Science 15： 417-421, Duncan, D. R. et al. , 1985 ; Planta 165 ; 322-332) により脱分化され、脱分化状態で形質転換細胞の選抜、増殖を行うことが好ましい。選抜は、前記所望の遺伝子の発現に基づいて行うことができる。脱分化状態の細胞は、正常個体再生能力を有するカルスであることが好ましい。形質転換細胞からの植物体の再生は公知の方法（Luppotto, E. and Lusardi, H. C. 1988 ; Maydica XXXI 1 1 : 163-177 ) により行うことができる。これにより所望の形質を獲得した植物体、好ましくは、所望の形質を獲得し、正常稔性を有する形質転換植物体を再生することができる。なお、これらの具体的操作の一例が下記実施例に詳述されている。

実施例

以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

( 1 ) 供試組織の調製

( i ) トウモロコシの品種

トウモロコシ品種 P3732、 A188、 H84、 B37Ht、 Mol7Ht、 W117Ht、 Oh43、 H99 、 W64A Ht rhm 、 Fl (A188 x Black Mexican Sweet), Fl (A188 x B73Ht) , Fl (B73Ht x A188) 、 FKH84 x A188)、 Fl (Mol7Ht x A188) 、 FKC103 x A188) を材料として選定した。 P3732 は磐田酪農協同組合より入手。全てのインブレツド及び Black Mexican Sweet のいずれの品種も農林水産省生物資源研究所から入手した。

(ii) イネの品種

日本稲品種、月の光を選定して供試した。

(iii)トウモロコシ茎頂組織の調製

トウモロコシ種子を 70% エタノールに 1分間、 1¾次亜塩素酸ナトリウムに 5分間浸漬後滅菌水で 3回洗浄した。洗浄後 L S固体培地（ L S主要塩類、 L S微量塩類 (Linsmaier E. and Skoog F. 1965 ; Physiol. Plant. 18 : 100-127) 、 0. 5 mg ml ニコチン酸、 0. 5 mg 1ピリドキシン塩酸塩、 1 mg 1チアミン塩酸塩、 100 mg 1ミオイノシトール、 100 mg, 1カザミノ酸、 700 mg'lプロリン、 20 g 1ショ糖、 2.3 g 1 ゲルライ卜）に置床し 25°C、照明下で培養した。約 4日後、発芽した幼苗から頂端分裂組織を含む約 0. 1 x 0. 3 mmの組織を切り出し材料とした。

(iv) トウモロコシ未熟胚の調製

花粉受粉後約 14日目に雌穂から長さ 1〜2mmの未熟胚を無菌的に単離した。

(V) イネ未熟胚の調製

開花後、 7〜 1 2日.目の未熟種子を穎を除去した後、 70¾ エタノールに 30 秒、 1%次亜塩素酸ナトリゥムに 10分間浸漬することにより消毒した後、未熟胚を取り出し供試材料とした。

(2) T iプラスミド

ハイグロマイシン抵抗性遺伝子（HPT) 、ホスフィノスリシン（PPT) 抵抗性遺伝子（b a r) および GU S遺伝子を T iプラスミドの T— DNA領域に組み込んだ、以下のプラスミドを作製した。

( i ) p I G 1 21 Hm：

ヒマの力タラ一ゼ遺伝子の第 1ィントロンを含む GU S遺伝子と、ハイグロマイシン抵抗性遺伝子と連結したプラスミド（中村ら、 1 991 ；植物バイオテクノロジー Π (現代化学増刊、 pp.123- 132) 。名古屋大学、中村氏より入手）。 (ii) p TOK 232 ：

( a ) イントロン G U Sおよびハイグロマイシン抵抗性遺伝子の中間べク夕一 PTOK229 への導入

Tn 7由来のスぺクチノマイシン抵抗性遺伝子を含む Clal断片（2.5kb ) をクレノー処理により末端を平滑化し、これを pUC 1 9の Sma l部位に揷入し、アンピシリンおよびスぺクチノマイシン抵抗性遺伝子を持つプラスミド p TOK 107 (5. 2 k b) を得た。 pTOK 1 07を E c oR I、 H i n d ΙΠで処理し、スぺクチノマイシン抵抗性遺伝子を含む 2. 5 k b断片を PGA482の E c oR I、 H i n dIII 断片（2. 7 k b) と連結し、スぺクチノマイシン抵抗性遺伝子と H i n d III 、 Hp a I部位を含む p TOK 170 (5. 2 k b) を得た。

35 Sプロモーターにヒマの力タラ一ゼの第 1イントロンと GU S遺伝子を連結したベクター p I G 221 (Ohta et al. , 1990，名古屋大学中村氏より譲渡）を E c oR Iで切断後クレノー酵素により末端を平滑化し H i n dill リンカ一

(p CAAGCTTG；夕カラ酒造コ一ド 4660 P) を揷入した。 35 Sプロモータ一およびイントロン GU Sを含む断片を H i n d III により切り出し、 35 Sプロモータ一にハイグロマイシン抵抗性遺伝子を連結した p G L 2 (J. Paszkowski, Friedrich Miescher Institute より入手）の H i n dill 部位に揷入し p G L 2— I G (7. 6 k b ) を得た。なお、 p G L 2は p DH 5 1

(Pietrazak et al. , 1986; Nucleic Acids Research 14： 5857-5868) にハイク" ロマイシン抵抗性遺伝子（Gritz L. and Davis J. 1983; Gene 25:179-188 ) を揷入したものである。 p TOK l 7 0を H p a I処理して得られた断片を pGL 2— I Gの Pv ull断片（5. 2 k b) と連結し p T OK 229 ( 1 0. 1 k b) を得た。

(b) スーパ一バイナリ一ベクター p TOK 162への導入

スーパーバイナリ一べクターに強病原性ァグロバクテリウム A 28 1由来の v i r B. v i r C. v i r G遺伝子を挿入して得たスーパ一バイナリ一べクター pTOK l 62への目的遺伝子（ハイグロマイシン抵抗性遺伝子、イントロン G US遺伝子）の導入は相同組換えによって行なった。すなわち、両ベクターは大腸菌プラスミド p BR 322に由来する部位を持つので、スぺクチノマイシン、カナマイシンで選抜された菌には両プラスミドの組換えによって生じたブラスミドのみが含まれることになる。スーパ一バイナリーベクタ一にハイグロマイシン抵抗性遺伝子、イントロン GU S遺伝子が組み込まれたプラスミドを p T 0 K 232と呼ぶ（図 1参照）。

なお、図 1及び後述の図 2において、「SP」はスぺクチノマイシン抵抗性遺伝子、「HPT」はハイグロマイシン抵抗性遺伝子、「NPT」はカナマイシン抵抗性遺伝子、「TC」はテトラサイクリン抵抗性遺伝子、「 B A R」はホスフィノスリシン抵抗性遺伝子、「 I G」はイントロン GU S遺伝子、「BR」は丁 — D N Aの右ボーダー配列、「 B L」は T一 D N Aの左ボーダー配列、「v i r B， C, G」は強病原性ァグロバクテリゥム A 28 1由来の v i r領域、「0 R I」は C 0 1 E 1の複製開始点、「C 0 S」はラムダファージの COS部位、「K」は制限酵素 Kp n l部位、「Η」は制限酵素 H i n dlll 部位を示す。

( i i i ) pSB131

(a) pSB131の構築

pTOK170 を BamHI および Bglll で切断後閉環し、 pYS138とした。 pYS138を EcoRI および Asp718I で切断し、 T4 DNAポリメラ一ゼ処理後、 Sailリンカ一（5'- GGTCGACC-3') を揷入し閉環し pYS151を作成した。 pYS151を Sailで切断し、この部位に、 GA643 (An et al.， Plant Molecular Biology Manual A3:l- 19， Kluwer Academic, Dordrecht 、 1988) の T— DNAを含む 4.7 kbの Sail断片を導入し PTO 235 を作成した。 PTOK235 を SacII 部位で切断し、 T4 DNAポリメラ一ゼにより平滑末端化後、 Hindlll リンカ— （5'- CAAGCTTG - 3') を揷入し閉環し、得られたプラスミドを pTOK246 と命名した。 pT0K246 を Hindlll および EcoRI で切断し、 T— DN A中の大部分の DNAを除去した後、 35S プロモーターにホスフィノスリシンァセチルトランスフェラ一ゼ遺伝子（特表平卜 503434) を接続した遺伝子（b a r遺伝子、植物にホスフィノス ' Jシン耐性を付与する能力を有する）を含む 2.2 kbの Hindi II- EcoRI 断片を揷入し pSB25 を得た。さらに、 pSB25 を Hindlll で切断し、 pIG221より単離した、 35S プロモーターとィント口ン GUS を含む 3.1 kbの Hindlll 断片を揷入し pSB31 を作製した。すなわち、 pSB31 は、 T — DNA領域中に、植物中で発現するィント口ン GUS遺伝子とホスフィノスリシン耐性遺伝子（b a r) を含む中間ベクターである。

(b ) pNBlの構築

pVCKlOl (Knauf et al.， Plasmid 8:45 - 54 、 1982) を EcoRI により切断し、 T4 DNAポリメラーゼで処理後閉環することによつて EcoRI 部位を削除した。さらに、 Bglll で切断後閉環する操作を行ったところ、 Bglll 部位が削除できたので、このプラスミドを pVCKlOlQと命名した。 (：1(1010を^11(3111 と Xholで切断し、 Hindlll- Sailで切断した pUC18 と結合し pTOK150 を作成した。 ρΤΟΚ150 を Hindlll で切断し、 T4 DNAポリメラ一ゼ処理後 EcoRI リンカ一（5 '- CCGAATTCGG - 3') を揷入し閉環することにより、 Hindi II 部位を EcoRI 部位に変換し、 ρΤΟΚ239 とした。 pGA482を Hpalで切断し、 Xholリンカ一（5'- CCTCGAGG - 3') を揷入し閉環して PTOK236 を作成した。 PTOK236 を Xbalおよび EcoRI で分解し、 2.6 kb 断片を単離した。 pTOK239 を EcoRI および Xbalで切断し、 2.7 kb 断片を除去し、 PTOK236 の 2.7 kb Xbal -EcoRI 断片を挿入し閉環して pNBlを作成した。 pNBlは、ァクセプタ一ベクターの 1種である力、'、 T一 DNAゃヴィルレンス領域由来の DN Aなどは含んでいない。

(c) pSBlの構築

pNBlを Kpnlで切断し'、 TiBo542 (American Type Culture Collection 受託番号 37349 ) のヴィルレンス領域の virBおよび virG遺伝子を含む 15.2 kb Kpnl断片を揷入して閉環して pSBlとした。 pSBlは、ァクセプタ一ベクタ一の一種であり、これに、 T— DN Aを含む中間ベクターを組込んだハイプリッドベクターを作成した場合、ヘルパープラスミドと組合わせることにより、スーパーバイナリ一ベクタ一を構成することができる。

(d) pSB31 の pSBlへの導入

PTOK232 の場合と同様に、 pSB31 を相同組換えによって pSBlに導入することによって PSB131を作出した（図 2参照）。

(3 ) 寄主ァグロバクテリゥム

T-DNA領域を削除した菌系、 LBA4404 と EHA101とを寄主バクテリアとして使用した。 LBA4404 はへルバ—プラスミド（vir領域を完全な形で持つ） PAL4404 を有する菌系であり、 American Type Culture Collectionより入手可能である (ATCC 37349) 。 EHA101はへルパープラスミドの vir領域が強病原性ァグロバクテリウム A281由来であり、 Hood E. E. et al. 1986 (上掲）から入手可能である。

(2) 項で述べた種々のバイナリ一ベクタ一をこれら 2種類のァグロパクテリゥムに導入し、以下の菌系を遺伝子導入用として用いた。これらのプラスミドをァグロバクテリウムに導入する方法は細菌の三系交雑手法（Mtta G. et al. , 1980; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:7347- 7351) によった。

LBA4404(pTOK232) LBA4404(pSB131)

EHA101(pIG121Hm)

(4) ァグロバクテリウム懸濁液の調整

AB培地（Drlica K. A. and Kado C. I. 1974; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71:3677-3681 ) 上で 3 ~ 10日間培養したァグロパクテリゥムのコロニーを白金耳でかきとり、トウモロコシへの接種には細菌懸濁用 L S培地（L S主要塩類、 LS微量塩類、 0.5 mg ml ニコチン酸、 0.5 mg /1ピリドキシン塩酸塩、 1 mg 1チアミン塩酸塩、 100 mg lミオイノシトール、 1.5 mg l 2, 4—D、 l g l カザミノ酸、 100〃Mァセトシリンゴン、 0.2 M ショ糖、 0.2 M グルコース）に、イネへの接種には修正 A A培地（AA主要無機塩類、 AAアミノ酸及び AA ビタミン類（Toriyama K. and Hinata K. 1985; Plant Sci. 41 :179 - 183 ) ヽ MS微量塩類（Murashige, T. and Skoog, F. 1962; Physiol. Plant. 15:473- 497) 、 1.0 1 カザミノ酸、 100 /Mァセトシリンゴン、 0.2 M ショ糖、 0.2 M グルコース）に各々懸濁し、菌濃度を 3~5 X 10⁹ 細胞 1に調整し用いた。

(5) 接種および培養条件

供試組織を滅菌水で洗浄後、茎頂組織はガラス針（自家製）で穿刺後、未熟胚はそのまま上述のァグロパクテリゥム懸濁液に 3〜 10分間浸漬した。浸漬処理後、茎頂組織は 100 Mァセトシリンゴン、 20 g 1ショ糖、 10 g'lグルコースを含む修正 L S培地（LS主要塩類、 L S微量塩類、 0.5 mg ml ニコチン酸、 0.5 mg 1ピリドキシン塩酸塩、 1 mg lチアミン塩酸塩、 100. mg 1ミオイノシトール、 0.1 mg 1力イネチン、 1.0 mg 1カザミノ酸、 2.3 g 1 ゲルライ卜）に移植し、 25て、照明下で 2〜 3日間培養した。その後、 250 mg 1セフォ夕キシムを含む滅菌水で洗浄し、同濃度のセフォタキシムを含む L S培地で培養を続けた。浸漬処理後のトウモロコシ未熟胚は 100 〃Mァセトシリンゴン、 20 g 1ショ糖、 10 g

1グルコースを含む L S D 1. 5共存培地（ L S主要塩類、 L S微量塩類、 0.5 mg ml ニコチン酸、 0.5 mg 1ピリドキシン塩酸塩、 1 mg 1チアミン塩酸塩、 100 mg 1ミオイノシトール、 1.5 mg 1 2, 4一 D、 700 mg l プロリン、 500 mg 1 ME S、 8 β 1 寒天）に移植し、 25°C、暗黒下で 1〜 5日間培養した。その後、洗浄することなく（洗浄すると形質転換植物の再生効率が低下）接種未熟胚を 250 mg. 1 セフォタキシムを含む L S D 1 . 5カルス増殖培地（ L S D 1 . 5 共存培地からグルコース、ァセトシリンゴンを除いた組成）で培養を続けた。また、浸漬処理後のィネ未熟胚はァセトシリンゴン、ショ糖、グルコースを同濃度で含む 2 N 6固体培地（N 6 の無機塩およびビタミン類（Chu C. C. 1978 Pro Symp. Plant Tissueし ulture, Science Press Peking, pp 43-50 ) 1 g 1 カザミノ酸、 2 mg. 1 2， 4— D、 2 g 1 ゲルライ卜）に移植し、 2 5 °C、暗黒下で 2〜 5日間培養した。その後、接種未熟胚を 250 mg lセフォタキシムを含む滅菌水で洗浄し、同濃度のセフォタキシムを含む 2 N 6固体培地で 3日〜 1週間培養を行なった。

( 6 ) G U S活性の調査方法

共存培養処理直後、組織を 0. 1¾ Triton X- 100 を含む 0. 1 M リン酸緩衝液 (pH6. 8) に浸漬し、 3 7てで 1時間静置した。リン酸緩衝液でァグロバクテリウムを除去した後、 1. 0 mM 5 —ブロモ一 4 一クロ口— 3 —インドリル一 /3— D—ダルク口ン酸（X - glue)および 20% メタノールを含むリン酸緩衝液を添加した。 3 7 で 2 4時間処理した後、青色の呈色を示す組織を顕微鏡下で観察し、供試組織数に対する百分率で表した。また、選抜処理後得られた形質転換細胞と考えられるハィグロマイシンあるいはホスフィノスリシン抵抗性カルスおよび形質転換植物体での G U S活性の判定に際しては、抵抗性カルスおよび植物体の一部を切取り同様な方法により G U S染色を行った。

( 7 ) 形質転換細胞の選抜と植物体再分化

ァグロバクテリゥムを接種したトウモロコシ未熟胚を 250 mg 1セフオタキシムおよび 0 〜100 mg 1ハイグロマイシンまたは 0 〜20 mg 1 PPT を含む L S D 1 . 5カルス増殖培地で約 8 週間培養し抵抗性のカルスを選抜した。この抵抗性カルスを 30 mg 1 ハイグロマイシンまたは 0 〜20 m 1 PPT を含む L S Z培地 ( L S D 1 . 5カルス増殖培地から 2， 4—Dを除き、 50 mg 1 ゼァチンを加えた組成）に置床し、 2 5 °C照明下で培養し再分化を行った。

イネ未熟胚を 250 mg 1 セフオタキシムおよび 50 mg 1ハイグロマイシンを含む 2 N 6固体培地で 3〜4 週間培養し、抵抗性のカルスを選抜した。さらに、この抵抗性カルスを 100 mg/1ハイグロマイシンを含む N 6 一 7培地（N 6無機塩類、 N 6 ビタミン類、 2 g 1 カザミノ酸、 1 mg l 2 , 4— D、 0. 5 mg l 6 B A、 30 g, 1 ソルビトール、 20 g 1 ショ糖、 2 g 1 ゲルライト）で 2〜3 週間培養したのち、 50 mg l ハイグロマイシンを含む植物体再生用の N 6 S 3培地（1 2 濃度 N 6主要無機塩類、 N 6微量無機塩類、 N 6 ビタミン類、 1 g 1 力ザミノ酸、 0. 2 m 1 NAA、 1 mg 1 力イネチン、 3 g 1 ゲルライ卜）に移植した。なお、培地にはすべて 250 mg/Ί セフォタキシムを添加した。

( 8 ) トウモロコシ形質転換次世代における導入遺伝子の発現

LBA4404(pSB131) を接種し PPT選抜により得られた形質転換当代植物を自殖し次世代種子を得た。これらの種子を播種後約 2 週間目の幼苗から葉片を採取し G U S遺伝子の発現を調査した。またこれらの幼苗の葉の一部に 500 倍に希釈したパスタ（Hoechst, PPTを主成分とする除草剤）液を塗布し 2 週間目に PPT 抵抗性を調査した。さらに形質転換当代植物を非形質転換植物（品種 A188) と交配後約 2 週間目の未熟胚を採取し 10 mg/l PPT を含む LSD1. 5カルス誘導培地に置床した。 25°C、暗黒下で 3 週間培養後カルス形成の有無を指標に PPT抵抗性を調査した。 LBA4404(pTOK233)を接種しハイグロマイシン選抜により得られた形質転換植物も非形質転換植物（品種 A188) と交配し、次世代植物の幼苗で G U S遺伝子の発現を調査した。

( 9 ) サザン法による導入遺伝子の分析

菌系 LBA4404(pSB131) を接種し、 PPT選抜により得られた形質転換体当代および次世代のトウモロコシ幼苗から小鞠らの方法（Komari et al. , 1989 ; Theor. Appl. Genet. 77 : 547- 552)に従い D N Aを抽出し、抽出した D N Aに制限酵素 BamHI を処理し、 G U S遺伝子および b a r遺伝子をプローブとしたサザン法による導入遺伝子の検出を行った。 T— D N A内部の BamHI サイトから Lボーダー配列の末端までの D N A領域の長さは G U S遺伝子で約 2. 3kb、 b a r遺伝子で約 2. 7kb である（図 2 ) 。なおサザン法については Molecular Cloning (Sambrook et al. 1989 ; Cold Spring Harbor Laboratory Press ) に § 載の方法に従って行った。

( 1 0 ) トウモロコシ茎頂組織への遺伝子導入 Gould らの報告 (Gould J. et al.， 1991 ; Plant Physiol. 95 :426-434) による生長点組織（茎頂組織）を材料とした形質転換が可能であることを確認するため、前述のァグロパクテリゥム菌系 EHA101 (pIG121Hm)を単離したトウモロコシ茎頂組織に処理し、生長した植物体での G U S活性を調査した。ァグロバクテリウム非処理の組織では、ずれも G U S遺伝子の発現はみられなかつたが、ァグロバクテリウム処理した組織では針で穿刺した部分に G U S遺伝子の発現が小さな点状に認められた。しかし、その後培養を続けた植物体で G U S活性を調査したところ、 G U S遺伝子の発現を示すものは全くなかった。生長点近傍は非常に微細な組織であり、そこに.穿刺しァグロパクテリゥムを感染させることは容易でな、。本実験の結果から生長点近傍へのァグロバクテリゥムによる形質転換には生長点の切り出し、穿刺などに熟練した技術が必要であると考えられた。

表 1 トウモロコシ茎頂組織への遺伝子導入

供試品種はいずれも P3732

( 1 1 ) トウモロコシ未熟胚への接種

トウモロコシ未熟胚を材料として、ァグロパクテリゥムを処理した場合、供試したいずれの品種でも高率で G U S遺伝子の発現がみられた。 G U S遺伝子の発現部位は肉眼ではつきりと確認できる大きさであり、広範囲の細胞で遺伝子発現がなされた。また、 EHA 1 0 1 (pIG121Hm) L B A 4404 (pTOK232)および L B A 4404 (pSB131)の菌系間での遺伝子発現率の差は認められなかった。これらのことからァグロバクテリゥムによる形質転換法において、未熟胚は安定して高率の感染を示す適当な材料であると判断される。

表 2 トウモロコシ未熟胚への G U S遺伝子導入効率

B S: Black Mexican Sweet 菌系 l:EHA101(pIG121Hm)， 2 :LBA4404(pTOK232), 3:LBA4404(pSB131)

(1 2) 前培養したトウモロコシ未熟胚への接種（比較例）

Chanらはイネのァグロパクテリゥムによる形質転換の材料に N RD培地（Ν_β 主要塩類、 Ν₆ 微量塩類、 Ν₆ ビタミン類、 3%ショ糖、 0. 8%ァガロース、 2mg 1 2， 4 - D) で 2 日間培養（脱分化処理）した未熟胚を用いている

(Chan M. T. et al. , 1993; Plant Mol. Biol. 22:49卜 506)。トウモロコシ未熟胚を用いた場合にもこの方法が有効であるかを確認するため、 L SD 1. 5カルス誘導培地で 2日間培養した未熟胚（品種 A 1 88) を材料にァグロパクテリゥムによる形質転換を試みた。接種および共存培養は前述の方法に従った。供試菌系は B4404(pSB131) とした。対照として採取直後の未熟胚を同様に試験に供した。共存培養 3日目に両試験区の未熟胚を GUS染色したところ、採取直後に接種処理を施した未熟胚のほとんどが染色されたのに対レ、前培養後にァグロパクテリゥムを接種した未熟胚では染色されるものは全く見られなかった（表 3) 。このことから、前培養した未熟胚を材料とした場合、トウモロコシの形質転換は達成されないことが明白である。

表 3 前培養したトウモロコシ未熟胚への G US遺伝子導入効率

(1 3) トウモロコシ形質転換細胞の確認

30 mg 1 および 50 rag 1 ハイグロマイシン添加培地上で選抜し、 75 mg 1 ハイグロマイシンを含む培地で抵抗性の確認をしたカルスを GUS染色したところ、カルス全体で GU S遺伝子の発現が認められた。このカルスから小鞠らの方法 (Komari et al. 1989; Theor. Appl. Genet. 77:547-552) に従い抽出した D N A を铸型とし、 G U S遺伝子を増幅させるプライマ一（5' - ATGTTACGTCCTGTAGAAAC-3 '、 5 ' -ATGGTGCGCCAGGAGAGTTG-3 ' ) を用いて複製連鎖反応 (PCR) を実施した。反応は、 1 β 1の DNA溶液、 5 pMの各々のプライマ一の混合物、 200 uMの dATP、 dCTP、 d GTPおよび dTTP、 PCR緩衝液（宝酒造社製）および 2.5 U の Amp 1 i t a q DNAポリメラ一ゼ（宝酒造社製）を使用して全容積 100 μ 1で行なった。反応は下記の温度のプロフアイルに従って 30周期を繰り返した； DNAサ一モサイクラ一（パーキンエルマ一セタス社製）中で： 1分間にわたり 94°C、 2分間にわたり 55°C、および 3分間にわたり 72°C。 PCR生成物を、 0.7%ァガロースゲル上で電気泳動によって分離した。ァグロパクテリゥム非感染カルスから抽出した DNAを铸型とした場合、 D N Aの増幅断片は検出されなかったが、 L B A 4 4 0 4

(p TOK 232) および抵抗性カルスから抽出した DNAを铸型とした場合、電気泳動によって 1. 8 k b pの増幅断片がェチヂゥムブ口マイド染色法により検出された。また、ァグロパクテリゥムの V i r G開始コドンを含む 795 b p の領域を増幅させるプライマ— （5'- GACGTTTATGAAGTAGGCGAGA- 3'、 5' - TAAAAACGCGAGGAGAAGATTG-3 ' ) を用いた P C Rを実施した。 L B A 4 4 0 4

(p TOK 232) を铸型とした場合 0. 8 k b pの増幅断片が検出されたが、抵抗性カルスおよびァグロパクテリゥム非感染カルスから抽出した DN Aを铸型とした場合、増幅断片は検出されなかった。このことから、抵抗性カルス全体でみられた GU S遺伝子の発現はカルスに付着したァグロパクテリゥムによるものではなく、導入された GUS遺伝子によるものであり、段階的にハイグロマイシン濃度を高めた培地上で増殖したコンパクトで、こぶ状のカルスは形質転換体であると考えられた。

(1 4) トウモロコシ形質転換植物体の選抜

共存培養後、 30〜100 mg 1のハイグロマイシンまたは 5 〜20 mg 1 の PPT を含む培地上で抵抗性カルスの選抜を行ったところ、ハイグロマイシン選抜では供試した未熟胚の 11~27¾ 、 PPT選抜では同じく 35〜64% から抵抗性カルスが得られた（表 4、 6) 。これらのカルスをハイグロマイシンまたは PPT を含む植物体再分化培地に置床したところ高率で植物体の再分化がみられた。再生した植物の葉を G U S染色したところ多くの個体で G U S遺伝子の発現が認められ（表 5， 6) 、これらは形質転換植物であると考えられた。形質転換植物の得られる頻度は特に PPT で選抜を行った場合に高く、また実験間での差も少なく常に供試した未熟胚の 10%以上のものから独立の形質転換植物が得られた（表 6 ) 。このことは本法が安定して高頻度で形質転換がなされる方法であることを示唆する。次に接種からカルス増殖まで同じ条件で培養、選抜された PPT抵抗性カルスを高濃度 (20 mg 1 ) の PPT を含む再分化培地と PPT を含まない再分化培地にそれぞれ置床し、再分化した植物体の G U S発現と調査したところ PPT を含む培地で再分化した植物体ではキメラ個体やエスケープ（GUS -）個体が少なく、再分化時の PPT 添加による選抜効果が確認された（表 7 )

表 4 ハイグロマイシン選抜によるトウモロコシ未熟胚の形質転換効率

ハイグロマイシン選抜は共存培養後、各濃度で 2 3 週間ずつ培養した ₍ 表 5 ハイグロマイシン選抜による形質転換植物体の選抜効率イク" イシン植物体 G U S +

実験抵抗性カルス数再生カルス数植物体数

1 64 11 5

2 15 8 7

3 20 3 2 表 6 PPT選抜による形質転換効率

各欄の未熟胚数および植物体数はクローンを含まない数

表 Ί 再分化培地中への ΡΡΤ 添加が再分化効率および形質転換効率に及ぼす影響

PPT添加濃度 + ： 20 mg. l, - ： 0 m 1

( 1 5 ) トウモロコシ形質転換当代における導入遺伝子のサザン解析

形質転換体の全 D N Aを BamHl で切断した断片に対して b a rおよび G U S遺伝子をプローブとしたサザン法により形質転換当代における導入遺伝子の検出を行つた。いずれの遺伝子をプローブとした場合でも供試した全ての個体で 1〜数コピーの導入遺伝子の存在が認められた（表 8 ) 。プラスミド pSB131の中では b a r遺伝子を含む BamHl 断片は 2. 7kb 、 G U S遺伝子を含む同断片は 2. 3kb であるのに対し供試した全ての形質転換体には約 3kb以上のバンドが認められた。このことは b a r、 G U Sの両遺伝子とも植物染色体に組み込まれたことを裏付けるものである。また検出された D N A断片の長さは由来の違う個体では全て異なった。これはトウモロコシの染色体への遺伝子導入箇所がそれぞれ異なることを示すものであり、植物体内でのバクテリァの残存によるものではないことが確認された。

表 8 サザン解析による形質転換当代における

導入遺伝子のコピー数

( 1 6 ) pTOK233 を導入したトウモロコシの次世代における導入遺伝子の発現と分析

ハイグロマイシンによる選抜後得られた形質転換植物と非形質転換植物を交配して得られた次世代植物の葉を GUS染色したところ GU S陽性と陰性の比は、ほぼ 1:1 に分離し予想された分離比に適合した（表 9) 。

表 9 ハイグロマイシン選抜によるトウモロコシ

形質転換個体の次世代における導入遺伝子の発現

(1 7) _PSB131を導入したトウモロコシの次世代における導入遺伝子の発現対照品種の葉を G U S染色したところ全て陰性であつたのに対し、形質転換植物を自殖して得られた次世代の葉は 1 個体を除き全て陽性を示した。さらにこれらの植物体にバスタを塗布したところ対照品種の葉は約 2 週間で全て枯死したが形質転換次世代の葉は G U S陰性を示した個体を除き全て健全であつた（表 1 0) 。 GUS遺伝子の発現、 PPT抵抗性ともに 2 因子分離に適合する遺伝的分離を示した。次に対照品種より採取した未熟胚を PPT含有培地で培養したところ全ての未熟胚が増殖を抑制されカルス誘導はみられなかった。これに対し形質転換植物と非形質転換植物を交配して得られた次世代植物から採取した未熟胚では供試した両系統とも置床した未熟胚の約 50% からカルスが誘導され、その後同培地上で旺盛な増殖を示した（表 1 1) 。これらの増殖したカルスを GU S染色したところいずれのカルスでも全体が青色に呈色された。表 1 0 PPT選抜によるトウモロコシ形質転換個体の次世代における導入遺伝子の発現（幼苗での検定）

表 1 1 P P T選抜によるトウモロコシ形質転換個体の

次世代における導入遺伝子の発現（未熟胚による検定）

(1 8) pSB131を導入したトウモロコシの次世代における導入遺伝子のサザン解析

表 1 0に示した形質転換個体 No.21 を自殖して得られた次世代植物から DN Aを抽出し前述と同様の方法でサザン法による導入遺伝子の検出を行つた。植物体での G US遺伝子の発現が陰性、 PPT感受性であった個体を除き、全ての個体でいずれの遺伝子をプローブとした場合でも導入遺伝子の存在が認められた（表 12) 。導入遺伝子の存在が認められた個体はいずれも b a r、 GUSのコピー数が一致し、またそれぞれのバンドの長さは形質転換当代の個体のものと同一であった。以上の結果から本法によりァグロパクテリゥムを用いてトウモロコシに導入された遺伝子が植物の細胞の核に組み込まれメンデルの遺伝に従つて安定して後代に遺伝することが確認された。

表 1 2 サザン解析による形質転換次世代における

導入遺伝子のコピー数

(1 9) ィネ未熟胚への接種トウモロコシ未熟胚を材料としたときと同様に、イネ未熟胚においても高率で G U S遺伝子の発現が認められ、特にスーパーバイナリ一ベクターを有する菌系である LBA4404(pTOK232)を用いた場合に顕著に高い効率で G U S遺伝子の発現が認められた（表 1 3 ) 。

表 1 3 ィネ未熟胚への G U S遺伝子導入効率

この実験で使用した 2種類のバイナリ一ベクターはァグロバクテリゥムの細胞の中では G U S遺伝子は発現しないことから、共存培養後の G U S遺伝子を指標とした場合、ァグロパクテリゥムはトウモロコシおよびイネの細胞に遺伝子を導入できることが確認された。

( 2 0 ) イネ形質転換植物体の選抜

イネ未熟胚において、 50 mg 1 ハイグロマイシン添加培地上で抵抗性カルスの選抜を行ったところ、スーパーバイナリ一べク夕一を有する菌系を用いた場合に、顕著に高い効率で抵抗性カルスが得られた（表 1 4 ) 。これらは、選抜マーカーを含む植物体再生培地に移植することにより、容易に再生植物体が得られた (表 1 4 ) 。また、再生植物の葉における G U S発現を調査したところ、いずれの個体においても G U S遺伝子の発現が認められ、形質転換植物であると考えられた。ァグロバクテリウムの菌系 EHA101 (pIG121Hm)は、強病原性の pTiBo542のヴィルレンス領域を有するものの、スーパ一バイナリ一べクターを有していない。 Chanらが用いた菌系も同様な菌系であり、本実施例の結果と同様に非常に低い形質転換効率しか得られていない (Chan M. T. et al. , 1993 ; Plant Mol. Biol. 22 :491-506) 。これに対し、スーパーバイナリ一ベクターを有する菌系を用いることにより、飛躍的にに高い効率でイネ未熟胚から形質転換植物が得られることが本実施例において明かとなった。

表 1 4 ィネ未熟胚における形質転換体の選抜結果

HYG ：ハイグロマイシン

( 2 1 ) ィネ形質転換個体における導入遺伝子の確認

LBA4404(pTOK232)をイネ未熟胚に処理することにより得られた任意かつ独立な形質転換植物 3個体について、導入遺伝子の存在を複製連鎖反応（P C R ) 法により調査した。 G U S遺伝子および HPT遺伝子のブライマ一には構造領域の両端を用いた。対照として非形質転換体の D N Aおよび各遺伝子を有するプラスミド D N Aを用いた。その結果、 LBA4404(pTOK232)を処理することにより得られた形質転換体で、対照のプラスミドにおけるのと同様に、 3個体とも HPT遺伝子の 1. 1 kbの増幅断片が検出された。また、 G U S遺伝子についてもすべての個体で対照プラスミドと同様の 1. 8 kbの増幅断片が検出された。非形質転換体ではこれらの断片は検出されなかったことから、供試植物体はァグロバクテリゥムにより導入された遺伝子を有する形質転換植物体であることが確認された。

産業上の利用可能性

上述のように、本発明の方法は、従来の方法に比較して、形質転換から植物体の再生までの時間が短く、プロトプラストからの植物体の再生が確立されていない植物に対しても普遍的に適用することができ、特殊な装置を必要とせず、さらに用いる材料の調製が容易な単子葉植物の形質転換方法であるので、本発明は、有用な性質を有する単子葉植物の育種に利用可能である。

Claims

請求の範囲

I . 所望の遺伝子を含有するァグロバクテリゥム属細菌で単子葉植物の脱分化処理していない未熟胚の胚盤を形質転換し、形質転換個体を得ることからなる、単子葉植物の形質転換方法。

2 . 前記単子葉植物がィネ科植物である請求項 1記載の方法。

3 . 前記ィネ科植物がトウモロコシである請求項 2記載の方法。

4 . 前記ィネ科植物がイネである請求項 2記載の方法。

5 . 前記未熟胚を酵素処理や付傷するなどの前処理を行わず形質転換に供する請求項 1記載の方法。

6 . 前記単子葉植物がトウモロコシであり、前記未熟胚を酵素処理や付傷するなどの前処理を行わず形質転換に供する請求項 1記載の方法。

7 . 前記未熟胚胚盤を形質転換処理後、脱分化させ、脱分化状態で形質転換細胞の選抜、増殖を行う請求項 1ないし 6のいずれか 1項に記載の方法。

8 . 脱分化状態で選抜、増殖した形質転換細胞から正常稔性を有する形質転換個体を再生する請求項 7記載の方法。

9 . 前記ァグロパクテリゥム属細菌は、 T iまたは R iプラスミドを持つァグロノくクテリゥム属細菌であって、さらに Agrobacterium tumefaciens の T iプラスミド p T i B o 5 4 2のヴィルレンス領域由来の D N A断片を含むプラスミドを導入したァグロバクテリゥム属細菌である請求項 1ないし 8のいずれか 1項に記載の方法。

1 0 . 前記ァグロバクテリゥム属細菌は、 Agrobacterium tumefaciens である請求項 1ないし 9のいずれか 1項に記載の方法。

I I . 形質転換操作に用いるァグロパクテリゥム属細菌の菌濃度が 1 0。〜 1 0 ^{1 1}細胞 Zm 1である請求項 1ないし 1 0のいずれか 1項に記載の方法。

1 2 . 前記未熟胚は受粉後 2日以降の未熟胚である請求項 1ないし 1 1のいずれか 1項に記載の方法。

1 3 . 前記未熟胚胚盤が正常な個体を再生する能力を有するカルスを誘導できる未熟胚胚盤である請求項 1ないし 1 2のいずれか 1項に記載の方法。

1 4 . 形質転換細胞の選抜、増殖および再分化を行うため未熟胚から脱分化した培養組織が未熟胚の胚盤由来カルスである請求項 7又は 8に記載の方法。

1 5 . 前記の未熟胚がィンブレッド、インブレツド間の F 1、インブレツドと自然受粉品種間の F 1、市販 F 1品種のものである請求項 1の方法。