CN101466837A - 生产杂种种子的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供生产非天然杂种种子的方法。还公开了用于赋予作物可诱导的不育性的特异性miRNA和miRNA识别位点，以及包含此内源miRNA识别位点的重组DNA构建体。

Description

生产杂种种子的方法
优先权要求和相关申请的参考
[0001]本申请要求于2005年10月13日提交的美国临时专利申请60/726,106号和2006年8月7日提交的美国临时专利申请60/836,246号的优先权，所述临时专利申请整体在此引入作为参考。
序列表的引入
[0002]文件“38-21(54232)A.rpt”(文件大小为61kb，于2005年10月12日刻录，于2005年10月13日随美国临时申请60/726,106提交)、“38-21(54232)B.rpt”(文件大小为68kb，于2006年8月7日刻录，于2006年8月7日随美国临时申请60/836,246提交)和“38-21(54232)C.rpt”(文件大小为70kb，于2006年9月19日刻录，于2006年9月20日随美国临时申请xx/xxx,xxx提交)中包含的序列表整体在此引入作为参考。
发明领域
[0003]本发明公开了生产杂种种子的方法，以及可用于所述方法的可诱导不育的转基因植物和分子构建体。
发明背景
[0004]杂种种子，即通过密切相关植物的杂交或异体受精产生的种子，可被培育成具有“杂种优势”或任一个亲代植物不具有的期望性状组合的子代杂种植物(其通常为近交植物)。杂种植物可展现出优良的农艺学性能特征，包括改善的植物大小、产量、营养组成、疾病抗性、除草剂耐受性、逆境忍耐(热、冷、干旱、营养、盐)、气候适应性和其它需要性状。
[0005]有效的杂种种子生产要求异花传粉比自花传粉占优势。许多作物的杂种种子生产的主要限制在于没有简单、可靠且经济的在至少一个亲代(尤其是雄性亲代，以产生雄性不育，同时使雌性配子完整并易于由适宜的花粉供体传粉)中产生不育性的方法。在不需要例如由家养植物至其野生亲缘植物进行花粉传播的情况下，或者在不需要花受精的情况下，例如对在传粉后的环境中萎凋的观赏花卉而言，雄性不育也是有用的。
[0006]雄性不育例如可通过物理去除含雄性配子的器官实现。在某些物种中，这是直截了当但耗费人力并因此昂贵的过程(例如在玉米中去雄)。在其它物种中，这种物理去雄由于植物构造而有难度。不涉及人工或物理去雄的替代技术可显著降低成本。
[0007]业已描述了化学杀配子剂作为产生雄性不育植物的方法。通常，此化学杀配子剂是除草化合物，其在合适的发育期或性成熟之前施加于植物时能够杀或有效地终止植物雄性配子的发育，同时使植物的雌性配子或至少它们的显著部分能够进行异花传粉。例如，草甘膦耐受性已被遗传工程入玉米中(美国专利号5,554,798)，除草剂草甘膦(N-膦酰甲基甘氨酸)作为杀配子剂的用途以及无性和雌性耐草甘膦但雄性对草甘膦敏感的转基因植株公开于美国专利号4,735,649和PCT国际专利申请公布号WO99/46396A2。但是，杀死大部分雄性配子但留下足量的仍能够受精的雌性配子所需的草甘膦水平经常导致植株枯萎或萎黄。因此，使用草甘膦作为杀配子剂的主要缺点在于由对配子没有足够选择性引起的植物毒性副作用，一般来说对大部分化学杀配子剂都是如此。
[0008]使用化学杀配子剂商业化生产杂种种子主要受限于它们一般对配子没有选择性。具有远超过无性组织的某些靶向配子选择性的化合物就所破坏的配子性别而言一般是无差别的。因此，应高度需要改善化学杀配子剂的选择性的方法。甚至更需要的方法应是提供为雄性不育的第一种亲代植物和为雌性不育的第二种亲代植物，由此确保所产生的种子是两种亲代植物之间杂交的结果，而不是自花受精的结果。
[0009]本发明提供生产杂种种子的方法，并另外提供在这些方法中可用的重组DNA构建体、含此构建体的转基因植物染色体、细胞、植物和种子。重组DNA构建体、转基因植物染色体、细胞、植株和种子以及它们用于制备杂种种子的方法提供了使用除草剂作为化学杀配子剂的极大改善的方法。本发明的重组DNA构建体包括外源微RNA(microRNA)识别位点，使得可以表达编码赋予除草剂耐受性的蛋白的信使RNA，所述蛋白受控于其中转录重组DNA构建体的植物的内源微RNA。
[0010]微RNA(miRNA)是非编码蛋白的RNA，一般为约19个至约25个核苷酸(在植物中通常为约20-24个核苷酸)，其引导目标转录物的反式切割，负调节参与多种调节和发育途径的基因表达(Bartel(2004)Cell，116：281-297)。在某些情况下，miRNA用于引导siRNA初级转录物的同步加工(参见Allen等(2005)Cell，121：207-221)。
[0011]某些微RNA基因(MIR基因)业已被鉴别，并可在数据库中公开获得(“miRBase”，可在microrna.sanger.ac.uk/sequences在线获得)。申请人已在2005年12月15日提交的美国专利申请11/303,745中公开了新的MIR基因、成熟miRNA和miRNA识别位点。其它的MIR基因和成熟miRNA还公开于美国专利申请公布号2005/0120415和2005/144669A1。已报道MIR基因在基因组中既分离又聚类地存在于基因间区域中，但也可以完整地或部分地位于其它基因(编码蛋白和不编码蛋白)的内含子中。关于miRNA生物发生的最新综述，参见Kim(2005)Nature Rev.Mol.Cell Biol.，6：376-385。至少在某些情况下，MIR基因的转录可处于MIR基因自身启动子的启动控制之下。MIR基因转录可能一般由RNA聚合酶II介导(参见例如Aukerman和Sakai(2003)Plant Cell，15：2730-2741；Parizotto等(2004)Genes Dev.，18：2237-2242)，因此能进行已用于其它聚合酶II转录基因的基因沉默方法。初级转录物(其可为多顺反子的)称为“pri-miRNA”，是可相当大(几千碱基)的miRNA前体分子，包含一个或多个局部双链区或“发夹”区以及通常的mRNA的5’“帽”和聚腺苷酸尾。参见例如Kim(2005)Nature Rev.Mol.Cell Biol.，6：376-385中的图1。
[0012]在植物细胞中，一般认为微RNA前体分子主要在核中被加工。在植物中，miRNA和siRNA通过截然不同的DICER样(DCL)酶形成，在拟南芥(Arabidopsis)中一般认为核DCL酶是成熟miRNA形成所需要的(Xie等(2004)PLoS Biol.，2：642-652)。其它有关微RNA生物发生和功能的综述例如可见于Bartel(2004)Cell，116：281-297；Murchison和Hannon(2004)Curr.Opin.Cell Biol.，16：223-229；以及Dugas和Bartel(2004)Curr.Opin.Plant Biol.，7：512-520。因此，可依据RNA(例如成熟miRNA或miRNA前体RNA分子的RNA序列)或依据DNA(例如对应于成熟miRNA RNA序列的DNA序列或编码MIR基因或MIR基因片段或miRNA前体的DNA序列)描述微RNA。
[0013]估计MIR基因家族占至少某些基因组的1％，能够影响或调节全部基因的约1/3的表达(参见例如Tomari等(2005)Curr.Biol.，15：R61-64；G.Tang(2005)Trends Biochem.Sci.，30：106-14；Kim(2005)Nature Rev.Mol.Cell Biol.，6：376-385)。因为miRNA在包括动物和植物的真核生物中是重要的调节元件，所以miRNA的转基因抑制例如可引致对重要生物过程的理解或允许某些例如可用于生物技术应用的途径的操作(例如细胞分化、增殖和凋亡的调节)。参见例如O′Donnell等(2005)Nature，435：839-843；Cai等(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，102：5570-5575；Morris和McManus(2005)Sci.STKE，pe41(stke.sciencemag.org/cgi/reprint/sigtrans；2005/297/pe41.pdf)。微RNA(MIR)基因具有识别性特征，包括植物物种间的保守性、稳定的回折结构和通过Dicer样酶加工特异性miRNA/miRNA*双链体(Ambros等(2003)RNA，9：277-279)。这些特征已用于鉴别miRNA及其在植物中的对应基因(Xie等(2005)Plant Physiol.，138：2145-2154；Jones-Rhoades和Bartel(2004)Mol.Cell，14：787-799；Reinhart等(2002)Genes Dev.，16：1616-1626；Sunkar和Zhu(2004)Plant Cell，16：2001-2019)。公开可获得的微RNA基因在miRBase按目录分类(Griffiths-Jones等(2003)Nucleic Acids Res.，31：439-441)。
[0014]MiRNA在拟南芥(Arabidopsis)的非常特定的细胞类型中表达(参见例如Kidner和Martienssen(2004)Nature，428：81-84，Millar和Gubler(2005)Plant Cell，17：705-721)。抑制可限于侧面、边缘或细胞类型之间的其它区域，一般认为是正确的细胞类型模式化和特化所需要的(参见例如Palatnik等(2003)Nature，425：257-263)。发现含内源性miR171识别位点的GFP报告基因的抑制将表达限于转基因拟南芥中的特定细胞(Parizotto等(2004)Genes Dev.，18：2237-2242)。业已在mRNA的所有区域中证实了miRNA的识别位点，包括5’非翻译区、编码区和3’非翻译区，表明miRNA靶向位点相对于编码序列的定位可能未必影响抑制(参见例如Jones-Rhoades和Bartel(2004)，Mol.Cell，14：787-799，Rhoades等(2002)Cell，110：513-520，Allen等(2004)Nat.Genet.，36：1282-1290，Sunkar和Zhu(2004)Plant Cell，16：2001-2019)。
[0015]本文公开的成熟miRNA由一般属于在远缘相关的植物物种之间保守的规范家族的MIR基因加工。这些MIR基因以及编码它们的成熟miRNA例如还可用于改变发育途径，例如通过影响细胞分化或形态发生(参见例如Palatnik等(2003)Nature，425：257-263；Mallory等(2004)Curr.Biol.，14：1035-1046)，以用作工程过的(非天然的)miRNA的序列来源，所述miRNA设计用于沉默非由天然miRNA序列靶向的转录物的序列(参见例如Parizotto等(2004)Genes Dev.，18：2237-2242；另参见美国专利申请公布号2004/3411A1和2005/0120415)和稳定dsRNA。在需要抑制MIR基因编码的miRNA的情况下，MIR基因自身(或其天然5’或3’非翻译区或其天然启动子或参与其转录的其它元件)可用作基因抑制的靶基因(例如通过本发明的方法)。MIR基因的启动子可具有非常特异性的表达模式(例如细胞特异性的、组织特异性的或时间特异性的)，因此可用于重组构建体，以诱导它们有效连接的DNA序列的这种特异性转录。
[0016]本发明提供使用重组DNA构建体生产杂种种子的方法，所述构建体包含对应于在作物中具有特异性表达模式的新的成熟miRNA的识别位点。本发明的重组DNA构建体转录为RNA，所述重组DNA构建体包含：(a)可由成熟miRNA识别的至少一个外源miRNA识别位点，所述成熟miRNA在植物的生殖组织中特异性表达；和(b)编码赋予除草剂耐受性的蛋白的信使RNA。这些构建体可用于制备和使用转基因植物染色体、细胞、植物和种子，包括例如可用于生产杂种种子的可诱导不育的转基因植物。
发明概述
[0017]一方面，本发明提供生产非天然杂种种子的方法，包括以下步骤：(a)提供可诱导不育的第一种转基因亲代植物，其在其基因组中包含转录为RNA的重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含：(i)至少一个可由成熟miRNA识别的外源miRNA识别位点，所述成熟miRNA在第一种亲代植物的生殖组织中特异性表达；和(ii)编码赋予第一种除草剂耐受性的蛋白的第一种信使RNA，其中成熟miRNA特异性抑制该蛋白在生殖组织中的表达，且其中第一种亲代植物的不育性可通过将第一种除草剂应用于第一种亲代植物来诱导；(b)使第一种亲代植物与第二种亲代植物在其中不育性已在第一种亲代植物中被诱导的条件下杂交，由此产生非天然杂种种子。
[0018]另一方面，本发明提供生产杂种种子的方法，包括以下步骤：(a)提供第一种亲代植物，其包括由第一种转基因植物细胞培育的转基因植物，所述第一种转基因植物细胞在其基因组中包含转录为RNA的第一种重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含：(i)至少一个可由第一种成熟miRNA识别的外源miRNA识别位点，和(ii)编码赋予第一种除草剂耐受性的蛋白的第一种信使RNA，其中第一种成熟miRNA在第一种亲代植物的雄性生殖组织中特异性表达，由此特异性抑制该蛋白在雄性生殖组织中的表达，其中第一种亲代植物的雄性不育可通过将第一种除草剂应用于第一种亲代植物来诱导；(b)提供第二种亲代植物，其包括由第二种转基因植物细胞生长的转基因植物，所述第二种转基因植物细胞在其基因组中包含转录为RNA的第二种重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含：(i)至少一个可由第二种成熟miRNA识别的外源miRNA识别位点，和(ii)编码赋予第二种除草剂耐受性的蛋白的第二种信使RNA，其中第二种成熟miRNA在第二种亲代植物的雌性生殖组织中特异性表达，由此特异性抑制该蛋白在雌性生殖组织中的表达，且第二种亲代植物的雌性不育可通过将第二种除草剂应用于第二种亲代植物来诱导；(c)将第一种除草剂和第二种除草剂应用于亲代植物，由此在第一种亲代植物中诱导雄性不育和在第二种亲代植物中诱导雌性不育；(d)使第一种和第二种亲代植物杂交，其中第一种亲代植物的胚珠由第二种亲代植物的花粉授粉，由此产生杂种种子。
[0019]在独立的方面，本发明提供可诱导不育的转基因植物，其在其基因组中包含转录为RNA的重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含：(a)至少一个可由成熟miRNA识别的外源miRNA识别位点，所述成熟miRNA在植物的生殖组织中特异性表达；和(b)编码赋予除草剂耐受性的蛋白的信使RNA；其中成熟miRNA特异性抑制该蛋白在生殖组织中的表达，且其中转基因植物的不育性可通过将除草剂应用于该植物来诱导。
[0020]在又一方面，本发明提供转录为RNA的重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含：(a)至少一个可由成熟miRNA识别的外源miRNA识别位点，所述成熟miRNA在植物的生殖组织中特异性表达；和(b)编码赋予除草剂耐受性的蛋白的信使RNA。
[0021]本发明的其它具体实施方案在以下的详述中公开。
附图简述
[0022]图1A图示了如在实施例1中描述的本发明的非限制性重组DNA构建体。为用于土壤杆菌(Agrobacterium)介导的植物细胞转化，一般在每种构建体中都包含至少一个T-DNA边界(未显示)。这些构建体包含启动子元件(“pro”)、侧接非蛋白编码DNA的一侧或两侧的内含子、可选的终止子元件(“ter”)、用于抑制至少一个第一种靶基因的至少一个第一种基因抑制元件(“GSE”或“GSE1”)，并可以任选地包含用于抑制至少一个第二种靶基因的至少一个第二种基因抑制元件(“GSE2”)、用于表达至少一个目标基因的至少一个基因表达元件(“GEE”)或这两种。在包含基因表达元件的实施方案中，基因表达元件可邻接内含子(在其外部)定位。在该实施方案的一个变体中(未显示)，基因抑制元件(嵌入到侧接非蛋白编码DNA的一侧或两侧的内含子中)位于终止子的3’。在本发明的其它构建体中(未显示)，基因抑制元件(未嵌入内含子的)位于终止子的3’(参见实施例22)。图1B图示了与本发明的那些构建体截然不同的重组DNA构建体的实例。这些构建体可包含邻接内含子定位或位于两个分散的内含子之间(也就是说没有嵌入到单个内含子中)的基因抑制元件，或者可以包含基因表达元件，其包含嵌入到内含子当中的基因抑制元件，所述内含子侧接蛋白编码DNA(例如组成基因表达元件的蛋白编码外显子)的两侧。
[0023]图2图示了可用于如实施例1所述的本发明重组DNA构建体的基因抑制元件和可转录外源DNA的多种非限制性实例。在以单链描绘处(图2A至2E)，这些单链常规地以5’至3’(左至右)转录方向显示，其中箭头指示反义序列(箭头的头部指向左侧)或有义序列(箭头的头部指向右侧)。在以双链(反向平行)转录物描绘处(图2F和2G)，5’和3’转录方向如所示。实线、虚线和点线表示靶向不同目标基因的序列。
[0024]这些基因抑制元件和可转录的外源DNA可包括：包含至少一个反义DNA区段的DNA，所述反义DNA区段对至少一个第一种靶基因的至少一个区段是反义的，或包含多个拷贝的至少一个反义DNA区段的DNA，所述反义DNA区段对至少一个第一种靶基因的至少一个区段是反义的(图2A)；包含至少一个有义DNA区段的DNA，所述有义DNA区段为至少一个第一种靶基因的至少一个区段，或者包含多个拷贝的至少一个有义DNA区段的DNA，所述有义DNA区段为至少一个第一种靶基因的至少一个区段(图2B)；转录为RNA并包含至少一个反义DNA区段和至少一个有义DNA区段的DNA，所述RNA通过形成双链RNA用于抑制至少一个第一种靶基因，所述反义DNA区段对至少一个靶基因的至少一个区段是反义的，所述有义DNA区段为至少一个第一种靶基因的至少一个区段(图2C)；转录为RNA并包含多个连续反义DNA区段和多个连续有义DNA区段的DNA，所述RNA通过形成单个双链RNA用于抑制至少一个第一种靶基因，所述反义DNA区段对至少一个第一种靶基因的至少一个区段是反义的，所述有义DNA区段为至少一个第一种靶基因的至少一个区段(图2D)；转录为RNA并包含多个反义DNA区段和多个有义DNA区段的DNA，所述RNA通过形成多个双链RNA用于抑制至少一个第一种靶基因，所述反义DNA区段对至少一个第一种靶基因的至少一个区段是反义的，所述有义DNA区段为至少一个第一种靶基因的至少一个区段，其中所述多个反义DNA区段和多个有义DNA区段以一连串反向重复序列排列(图2E)；和包含来源于miRNA的核苷酸的DNA或包含siRNA的核苷酸的DNA(图2F)。图2F图示了双链RNA(dsRNA)的多种非限制性排列，所述双链RNA可由可用于本发明的重组DNA构建体的基因抑制元件和可转录外源DNA的实施方案转录。当形成这样的dsRNA时，其可抑制一种或多种靶基因，并可以形成单个双链RNA或多个双链RNA，或者单个dsRNA“茎”或多个“茎”。在形成多个dsRNA“茎”时，它们可以“锤头”或“三叶草”排列进行排列。间隔DNA是任选的，可包括转录为RNA的序列(例如靶基因或适体的反义序列的大环)，所述RNA采用的二级结构或三维构象赋予转录物需要的特征，例如增加的稳定性、增加的体内半衰期或者细胞或组织特异性。
[0025]图3图示了如实施例2详述的多个玉米组织中的所示成熟miRNA的表达水平。
[0026]图4图示了可转录DNA序列的非限制性实例，其包含外源miRNA识别位点、靶向叶绿体的TIC809和位于3’非翻译区的miRNA162识别位点(为粗体文本)(SEQ ID NO.176)，如在实施例3中详述。还显示了翻译的氨基酸序列。
[0027]图5图示了可转录DNA序列的非限制性实例，其包含外源miRNA识别位点、非靶向叶绿体的TIC809和位于3’非翻译区的miRNA164识别位点(为粗体文本)(SEQ ID NO.177)，如在实施例3中详述。还显示了翻译的氨基酸序列。
[0028]图6图示了由玉米胚乳克隆的miR167g微RNA(SEQ IDNO.178)的强且特异性的胚乳表达，如在实施例4中详述。玉米(LH59)组织的RNA的RNA印迹用对SEQ ID NO.178特异性的末端标记的成熟miR16722聚体LNA探针(图6A)或用约400bp的miR167g基因特异性探针(图6B)探测。玉米组织的转录谱确证了RNA印迹结果(图6C)；对应于miR167g的转录物在胚乳组织中丰富且特异性地表达(丰度如下分类：>5000，高丰度，97个百分点；700-5000，中等丰度，20个百分点；400-700，平均丰度；200-400，低丰度；<200，未检测到)。选择的简写：“DAP”或“DA”，授粉后天数；“WK”，整粒，“endo”，胚乳。
[0029]图7图示了基因组聚类的部分注释图，包括miR167a和miR167g基因和成熟miRNA以及启动子元件(例如TATA盒)的位置，在该图中标示的miR167g启动子序列如在实施例4中详述。缩写：“PBF”，谷醇溶蛋白结合因子；“ARF”生长素响应(生长素结合)因子；“NIT2”，氮相关基因的活化物；“LYS14”，结合UASLYS的元件，UASLYS是赋予Lys14依赖性活化和己二酸半醛依赖性活化和明显阻抑的上游活化元件；“GLN3”，结合谷胺酰胺合成酶的氮上游活化序列的元件。
[0030]图8图示了在实施例5中详述的结果。图8A图示了SEQ IDNO.184的预测miRNA前体SEQ ID NO.186的回折结构；成熟miRNA位于碱基106-126，对应的miRNA*位于碱基156-175，还发现另一种丰富的miRNA位于回折结构茎中的碱基100-120。“计数”指小RNA在所分析的381,633个推定miRNA序列的过滤组中的出现次数。图8B图示了大豆组织中miRNA前体SEQ ID NO.186的转录谱。图8C图示了大豆组织中成熟miRNA(SEQ ID NO.184)的预测靶多酚氧化酶(SEQ ID NO.200)的转录谱。
[0031]图9图示了在实施例5中详述的结果。图9A图示了SEQ IDNO.187的预测miRNA前体SEQ ID NO.189的回折结构；成熟miRNA位于碱基163-183，miRNA*位于碱基18-63。“计数”指小RNA在所分析的381,633个推定miRNA序列的过滤组中的出现次数。图9B图示了大豆组织中成熟miRNA(SEQ ID NO.187)的预测靶多酚氧化酶(SEQ ID NO.251)的转录谱。
[0032]图10图示了在实施例5中详述的结果。图10A图示了SEQID NO.190的预测miRNA前体SEQ ID NO.192的回折结构；成熟miRNA位于碱基87-107，miRNA*位于碱基150-169。“计数”指小RNA在所分析的381,633个推定miRNA序列的过滤组中的出现次数。
[0033]图11图示了在实施例5中详述的结果。图11A图示了SEQID NO.193的预测miRNA前体SEQ ID NO.195的回折结构；成熟miRNA位于碱基61-81，miRNA*位于碱基109-129。“计数”指小RNA在所分析的381,633个推定miRNA序列的过滤组中的出现次数。
[0034]图12图示了在实施例5中详述的结果。图12A(顶部)图示了SEQ ID NO.196的其中一种预测miRNA前体SEQ ID NO.198的回折结构；成熟miRNA位于碱基157-178，miRNA*位于碱基72-93。图12A(底部)图示了SEQ ID NO.196的另一种预测miRNA前体SEQID NO.199的回折结构；成熟miRNA位于碱基123-144，miRNA*位于碱基58-79。“计数”指小RNA在所分析的381,633个推定miRNA序列的过滤组中的出现次数。图12B(顶部)图示了大豆组织中miRNA前体SEQ ID NO.198的转录谱。图12B(底部)图示了大豆组织中miRNA前体SEQ ID NO.199的转录谱。
[0035]图13和14图示了探针组序列的转录谱，所述探针组序列已被鉴别为包含尤其可用于本发明方法并具有期望的表达谱(即在雌性生殖组织(图13)或在雄性生殖组织(图14)中)的miRNA基因(在表6中给出)，如在实施例6中详述。
发明详述
[0036]除非另有定义，否则使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的一般技术人员的通常理解相同的含义。一般地讲，使用的命名法和下述的制造或实验室程序是本领域众所周知并常用的。对这些程序使用常规方法，例如本领域和多个一般性文献中提供的那些方法。除非另有定义，否则在本说明书的文本中的核酸序列在从左向右读时以5’-3’方向给出。在术语以单数提供的情况下，发明人还考虑了该术语的复数所描述的本发明方面。在引入作为参考的参考文献中使用的术语和定义中有矛盾的情况下，本申请中所使用的术语应具有给出的定义。使用的其它技术术语具有它们在使用其的领域中的一般含义，如多种技术词典所例举的。发明人无意限于实施机制和模式。其中提供的参考文献仅用于阐述目的。
用于生产非天然杂种种子的方法
[0037]本发明的第一方面提供生产非天然杂种种子的方法，包括以下步骤：(a)提供可诱导不育的第一种转基因亲代植物，其在其基因组中包含转录为RNA的重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含：(i)至少一个可由成熟miRNA识别的外源miRNA识别位点，所述成熟miRNA在第一种亲代植物的生殖组织中特异性表达；和(ii)编码赋予第一种除草剂耐受性的蛋白的第一种信使RNA，其中成熟miRNA特异性抑制该蛋白在生殖组织中的表达，且其中第一种亲代植物的不育性可通过将第一种除草剂应用于第一种亲代植物来诱导；(b)使第一种亲代植物与第二种亲代植物在其中不育性已在第一种亲代植物中被诱导的条件下杂交，由此产生非天然杂种种子。
[0038]植物：本发明的方法包括提供可诱导不育的转基因植物，其可用作亲代植物，优选为通过种子繁殖的作物，例如在标题“制备和使用转基因植物细胞和转基因植物”之下描述的那些作物。优选植物的非限制性实例包括玉米、水稻、小麦、燕麦、大麦、黑麦、黑小麦、黍、高粱、昆诺阿藜、苋、荞麦、牧草、草坪草、苜蓿、棉花、红花、向日葵、大豆、油菜、油菜籽、亚麻、花生、菜豆、豌豆、小扁豆、苜蓿、莴苣、芦笋、朝鲜蓟、芹菜、胡萝卜、萝卜、甘蓝、羽衣甘蓝、芥菜、椰菜、花椰菜、芽甘蓝、芜箐、球茎甘蓝、黄瓜、甜瓜、西葫芦、笋瓜、洋葱、大蒜、韭菜、葱、细香葱、番茄、茄子、胡椒、灯笼果、甜菜、牛皮菜、菠菜、观赏植物和林木。特别优选的植物包括玉米、水稻、小麦、棉花、红花、向日葵、大豆、油菜和油菜籽。在特别优选的实施方案中，该方法可用于生产非天然杂种玉米种子。
[0039]不育性：所述“不育性”是指不能成功生产能育子代种子。雄性不育包括例如不能生产能够使雌性配子受精的雄性配子(例如成熟的能育花粉粒)，或者不能生产对能够正常受精雌性配子的雄性配子所必需的雄性生殖结构(例如花粉囊、雄蕊、花丝)。雌性不育包括例如不能生产能够被受精的雌性配子，或者不能生产完整发育的种子(无论是能发芽的还是不育的)，或者不能生产能够发芽并发育为正常子代植物的能育子代种子。
[0040]生殖组织：在其中不育性为雄性不育的可诱导不育的转基因植物的实施方案中，生殖组织是雄性生殖组织。雄性生殖组织包括对雄性配子发育出育性(即具有受精雌性配子的能力)必需的任何组织，例如花粉或任何发育期的雄性配子、花粉囊、雄蕊、花丝、穗和其它雄性花瀑、营养组织和其它涉及雄性亲代植物受精雌性亲代植物的能力的结构。
[0041]在其中不育性为雌性不育的可诱导不育的转基因植物的实施方案中，生殖组织是雌性生殖组织。雌性生殖组织包括对雌性配子发育出育性(即具有被雄性配子受精的能力，更优选地具有生产完全发育的种子的能力(无论是能育的还是不育的)，在许多实施方案中，最优选地具有生产能够发芽并发育为正常子代植物的能育子代种子的能力)必需的任何组织。雌性生殖组织包括例如胚珠或任何发育期的雌性配子、须、雌蕊和其它雌性花瀑、种皮、果实、花轴或穗轴或其它营养组织、支持组织或保护组织，和任何其它涉及雌性亲代植物被雄性亲代植物受精、产生完全发育的种子或产生能育子代种子的能力的结构。在某些实施方案中，不育性导致受精胚珠不能发育成能育种子，“生殖组织”指受精胚珠(例如接合子或任何发育期的胚，或受精胚珠发育为种子所需要的母性组织，例如胚乳或其它营养组织)。
[0042]成熟miRNA：所述“成熟miRNA”是指由miRNA前体(例如pri-miRNA或pre-miRNA)加工的小RNA(“微RNA”)，其能够识别并结合RNA转录物中的特异性序列(“miRNA识别位点”)并引导该转录物的切割。优选的成熟miRNA包括在植物的生殖组织中特异性表达的成熟miRNA。在本发明的非限制性实施方案中，成熟miRNA是作物miRNA，例如玉米miRNA或大豆miRNA。可用于本发明的miRNA的非限制性实例在操作性实施例中提供，包括但不限于在表1、2、3、4、5和6中鉴别的miRNA，包括具有SEQ ID NO.297、SEQID NO.302、SEQ ID NO.314、SEQ ID NO.319、SEQ ID NO.323、SEQ ID NO.328、SEQ ID NO.333或SEQ ID NO.338的miRNA。
[0043]miRNA识别位点：重组DNA构建体转录为包含一个或多个外源miRNA识别位点的RNA，所述外源miRNA识别位点可为一个或多个拷贝的相同外源miRNA识别位点或一个或多个拷贝的不同外源miRNA识别位点。外源miRNA识别位点可位于转录的RNA中的任何位置，在转录的RNA中不存在成熟miRNA时，转录产生可翻译为期望的除草剂耐受蛋白的信使RNA，在转录的RNA中存在成熟miRNA时，成熟miRNA结合RNA转录物并抑制信使RNA的表达。一个或多个外源miRNA识别位点可位于信使RNA的编码区或非编码区中。在多个实施方案中，外源miRNA识别位点位于以下的至少一个当中：(a)信使RNA的5’至编码序列的区域；(b)信使RNA的3’至编码序列的区域；和(c)信使RNA。在一个优选实施方案中，至少一个miRNA识别位点位于信使RNA的3’非翻译区。在多个实施方案中，重组DNA构建体还包含至少一个选自以下的元件：(a)植物启动子；(b)基因抑制元件；(c)内含子；(d)基因表达元件；(e)转录为能够结合配体的RNA适体的DNA；(f)转录为能够结合配体的RNA适体的DNA和转录为能够调节靶序列表达的调节RNA的DNA，其特征在于调节取决于调节RNA的构象，而调节RNA的构象受RNA适体的结合状态的变构影响；和(g)至少一个T-DNA边界。这些额外的元件在下文的标题“包含重组DNA构建体的可诱导不育的转基因植物”之下详述。
[0044]由具有期望的表达模式(即在雄性或雌性生殖组织中的特异性表达)的成熟miRNA识别的任何miRNA识别位点在本发明的实施方案中都是有用的。多个miRNA识别位点可用于在期望的生殖组织组合中特异性抑制蛋白表达。例如，重组DNA构建体可包含多个识别位点，其中每个识别位点都由在不同的雄性(或雌性)生殖组织(例如在花粉中表达的miRNA和在穗中表达的miRNA)中具有特异性表达的miRNA识别。适宜的成熟miRNA或其对应的miRNA识别位点的选择通过本领域技术人员已知的方法进行，包括在本文提供的操作性实施例中详述的那些方法。方法包括由完整植株或种子或选定组织克隆成熟miRNA或miRNA前体分子(pre-miRNA、pri-miRNA)、基于生物信息学的miRNA鉴定、miRNA或miRNA前体分子的DNA印迹、确定miRNA启动子表达模式等。在非限制性实施方案中，miRNA识别位点由来源于在表1-6中鉴别的MIR序列的回折结构的成熟miRNA识别；特别优选的是由在表6中鉴别的成熟miRNA识别的miRNA识别位点。
[0045]目标RNA转录物的切割和随后的目标RNA的抑制依赖于成熟miRNA及其关连miRNA识别位点之间的碱基配对。因此，至少一个外源miRNA识别位点被设计得对成熟miRNA具有足够的序列互补性，以允许被成熟miRNA识别和结合。在植物中，miRNA与其识别位点的序列互补性通常较高，例如21个核苷酸(就为21个核苷酸长的成熟miRNA而言)中有19、20或21个完全互补，即约90％或以上的互补性。对任何长度(例如20、21、22、23和24个核苷酸)的植物miRNA的识别位点优选类似的互补性程度。结合识别位点的成熟miRNA的序列要求以及用于预测结合给定序列的miRNA的方法例如论述于Llave等(2002)Science，297：2053-2056，Rhoades等(2002)Cell，110：513-520，Jones-Rhoades和Bartel(2004)Mol.Cell，14：787-799，Schwab等(2005)Developmental Cell，8：517-527，和Xie等(2005)PlantPhysiol.，138：2145-2154。在设计miRNA识别位点以及其在信使RNA中或邻近信使RNA的确切位置时，还优选避免具有不需要的特征的序列，这些序列编码不需要的多肽，如在下文的标题“靶基因”之下描述。在设计作为要表达的转基因的信使RNA时，在不需要由成熟miRNA抑制的情况下避免外源miRNA识别位点的无意导入。
[0046]特异性表达：所述“在生殖组织中特异性表达”是指成熟miRNA在生殖组织中以足以允许miRNA特异性抑制蛋白在生殖组织中的表达的水平被转录，也就是说，显著抑制赋予除草剂耐受性的蛋白在生殖组织中的表达，但不显著抑制同一蛋白在非生殖组织的组织中的表达。表达的显著抑制包括相对于对照细胞(即包含类似重组DNA构建体的细胞，例如转录为RNA的重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含编码赋予除草剂耐受性的蛋白的相同信使RNA，但不包含可由在植物的生殖组织中特异性表达的成熟miRNA识别的外源miRNA识别位点)中的表达至少30％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的表达抑制。在优选的实施方案中，成熟miRNA特异性抑制蛋白在生殖组织中的表达，达到在施用除草剂时足以引致生殖组织不育的程度。本领域技术人员会认识到，在某些情况下，以中等乃至低表达水平的除草剂耐受蛋白足可获得对除草剂的耐受性。因此，不需要在非生殖组织的组织中完全不存在成熟miRNA，也不需要除草剂耐受蛋白的表达在生殖组织中完全被抑制。
[0047]赋予除草剂耐受性的蛋白：可使用任何赋予植物对除草剂耐受性的蛋白。在许多实施方案中，除草剂为内吸收性除草剂。可用于本发明若干方面的除草剂的非限制性实例包括草甘膦、麦草畏、草铵膦、磺酰脲类、咪唑啉酮、溴苯腈、茅草枯、麦草畏、环己二酮(cyclohezanedione)、原卟啉原氧化酶抑制剂和异噁唑草酮除草剂。赋予草甘膦耐受性的蛋白的非限制性实例包括5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(“EPSPS”或“aroA”，参见美国专利号5,627,061、5,633,435、6,040,497和5,094,945)、草甘膦氧化还原酶(“GOX”，参见美国专利号5,463,175)、草甘膦脱羧酶(参见美国专利申请公布号2004/0177399)、草甘膦N-乙酰转移酶(“GAT”，参见美国专利申请公布号2003/0083480)或提供对草甘膦抗性的任何其它基因。一个特别优选的实施方案是来自根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株CP4的“epsps-cp4”或5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶；美国专利号5,633,435公开了epsps-cp4的核酸序列和氨基酸序列、含该基因的转化载体和制备草甘膦抗性植株的方法。赋予对其它除草剂耐受性的蛋白的非限制性实例包括麦草畏单加氧酶，其赋予对植物生长激素样除草剂如麦草畏的耐受性(参见美国专利申请公布号2003/0115626、2003/0135879)；草丁膦乙酰转移酶(“pat”或“bar”)，其赋予对草丁膦或草铵膦的耐受性(参见美国专利号5,646,024、5,561,236、5,276,268、5,637,489和US 5,273,894；另参见欧洲专利申请EP 275,957)；2，2-二氯丙酸脱卤素酶，其赋予对2，2-二氯丙酸(“茅草枯”)的耐受性(参见PCT专利申请公布号WO99/27116)；乙酰羟基酸合酶或乙酰乳酸合酶，其赋予对乙酰乳酸合酶抑制剂如碘酰脲、咪唑啉酮、三唑嘧啶、嘧啶基氧基苯甲酸酯和苯酞的耐受性(参见美国专利号6,225,105、5,767,366、4,761,373、5,633,437、6,613,963、5,013,659、5,141,870、5,378,824和5,605,011)；卤代芳基腈水解酶(“Bxn”)，其赋予对溴苯腈的耐受性(参见美国专利号4,810,648；另参见PCT专利申请公布号WO89/00193和WO87/04181A1)；修饰的乙酰辅酶A羧化酶，其赋予对环己二酮(“烯禾啶”)和芳氧基苯氧基丙酸酯(“氟吡禾灵(haloxyfop)”)的耐受性(参见美国专利号6,414,222)；二氢蝶酸合酶(“sul I”)，其赋予对磺酰胺除草剂的耐受性(参见美国专利号5,597,717、5,633,444和5,719,046)；32kDa光系统II多肽(“psbA”)，其赋予对三嗪除草剂的耐受性(参见Hirschberg等(1983)Science，222：1346-1349)；邻氨基苯甲酸合酶，其赋予对5-甲基色氨酸的耐受性(参见美国专利号4,581,847)；二氢皮考啉二酸合酶(“dap A”)，其赋予对氨基乙基半胱氨酸的耐受性(参见PCT专利申请公布号WO89/11789)；八氢番茄红素去饱和酶(“crtI”)，其赋予对哒嗪酮除草剂如达草灭的耐受性(参见日本专利公布号JP06343473)；羟苯基丙酮酸双加氧酶，其赋予对环丙基异噁唑除草剂如异噁唑草酮的耐受性(参见美国专利号6,268,549；另参见PCT专利申请公布号WO96/38567)；修饰的原卟啉原氧化酶I(“protox”)，其赋予对原卟啉原氧化酶抑制剂的耐受性(参见美国专利号5,939,602)；芳氧基链烷酸酯双加氧酶(“AAD-1”)，其赋予对含芳氧基链烷酸酯部分的除草剂的耐受性(参见PCT专利申请公布号WO05/107437)，所述除草剂的实例包括苯氧基植物生长激素(例如2，4-D和2，4-滴丙酸)、吡啶氧基植物生长激素(例如氟草烟和绿草定)、芳氧基苯氧基丙酸酯(AOPP)乙酰辅酶A羧化酶(ACC酶)抑制剂，(例如氟吡禾灵、喹禾灵和禾草灵)和5-取代的苯氧基乙酸酯原卟啉原氧化酶IX抑制剂(例如吡草醚和氟胺草酯)。
[0048]亲代植物的组合：本发明的方法可使用多种组合的第一种亲代植物和第二种亲代植物进行。在所述方法的许多实施方案中，第二种亲代植物耐受第一种除草剂；例如，第二种亲代植物可在其基因组中包含赋予第一种除草剂耐受性的转基因。本发明包括所述方法的实施方案，其中：(a)生殖组织是雄性生殖组织，第一种亲代植物是可诱导的雄性不育的，第二种亲代植物是正常可育的；或者(b)生殖组织是雄性生殖组织，第一种亲代植物是可诱导的雄性不育的，第二种亲代植物是雌性不育的；或者(c)生殖组织是雄性生殖组织，第一种亲代植物是可诱导的雄性不育的，第二种亲代植物是可诱导的雌性不育的；或者(d)生殖组织是雌性生殖组织，第一种亲代植物是可诱导的雌性不育的，第二种亲代植物是正常可育的；或者(e)生殖组织是雌性生殖组织，第一种亲代植物是可诱导的雌性不育的，第二种亲代植物是雄性不育的；或者(f)生殖组织是雌性生殖组织，第一种亲代植物是可诱导的雌性不育的，第二种亲代植物是可诱导的雄性不育的。
[0049]在所述方法的一个实施方案中，生殖组织是雄性生殖组织，第一种亲代植物是可诱导的雄性不育的，第二种亲代植物包括可诱导的雌性不育的、转基因的第二种亲代植物，其在其基因组中包含转录为RNA的重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含(i)至少一个可由第二种成熟miRNA识别的外源miRNA识别位点，所述成熟miRNA在第二种亲代植物的雌性生殖组织中特异性表达，和(ii)编码赋予对第二种除草剂耐受性的第二种蛋白的第二种信使RNA；其中第二种成熟miRNA特异性抑制第二种蛋白在雌性生殖组织中的表达，且其中第二种亲代植物的雌性不育可通过向第二种亲代植物施用第二种除草剂来诱导。在另一个实施方案中，生殖组织是雌性生殖组织，第一种亲代植物是可诱导的雌性不育的，第二种亲代植物包括可诱导的雄性不育的、转基因的第二种亲代植物，其在其基因组中包含转录为RNA的重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含：(i)至少一个可由第二种成熟miRNA识别的外源miRNA识别位点，所述成熟miRNA在第二种亲代植物的雄性生殖组织中特异性表达，和(ii)编码赋予对第二种除草剂耐受性的第二种蛋白的第二种信使RNA；其中第二种成熟miRNA特异性抑制第二种蛋白在雄性生殖组织中的表达，且其中第二种亲代植物的雄性不育可通过将第二种除草剂施用于第二种亲代植物诱导。在这些实施方案中，第一种和第二种信使RNA可为相同的，或者可为不同的。在这些实施方案中，第一种除草剂和第二种除草剂可为相同的，或者可为不同的。在某些情况下，第一种除草剂和第二种除草剂中的至少一种包括内吸收性除草剂。在优选的实施方案中，第一种除草剂和第二种除草剂中的至少一种包括选自以下的至少一种除草剂：草甘膦、麦草畏、草铵膦、磺酰脲、咪唑啉酮、溴苯腈、2，2-二氯丙酸、乙酰乳酸合酶抑制剂、环己二酮、芳氧基苯氧基丙酸酯、磺酰胺除草剂、三嗪除草剂、5-甲基色氨酸、氨基乙基半胱氨酸、哒嗪酮除草剂、环丙基异噁唑除草剂、原卟啉原氧化酶抑制剂和含包含芳氧基链烷酸酯部分的除草剂。
[0050]在所述方法的一个实施方案中，第一种亲代植物为可诱导不育的转基因植物，其在其基因组中包含转录为RNA的重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含：(i)至少一个可由在植物的雄性生殖组织中特异性表达的成熟miRNA识别的外源miRNA识别位点；和(ii)编码赋予除草剂耐受性的蛋白的信使RNA，其中成熟miRNA特异性抑制蛋白在雄性生殖组织中的表达，且其中转基因植物的雄性不育可通过将除草剂施用于植物来诱导，第二种亲代植物是正常可育的。为诱导第一种亲代植物的雄性不育，优选按照导致第一种亲代植物不能生产对第二种亲代植物的正常受精必需的雄性配子(或雄性生殖结构)的方案施用除草剂。在这样的实施方案中，第二种亲代植物一般耐受用于诱导第一种亲代植物的雄性不育的相同除草剂，因此第一种和第二种亲代植物可用相同除草剂处理，优选同时(例如一起在大田中)处理。第一种和第二种亲代植物的杂交产生的种子为第二种亲代植物对第一种亲代植物授粉的结果。
[0051]在所述方法的另一个实施方案中，第一种亲代植物为可诱导不育的转基因植物，其在其基因组中包含转录为RNA的重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含：(i)至少一个可由在植物的雌性生殖组织中特异性表达的成熟miRNA识别的外源miRNA识别位点；和(ii)编码赋予除草剂耐受性的蛋白的信使RNA，其中成熟miRNA特异性抑制该蛋白在雌性生殖组织或受精卵中的表达，且其中转基因植物的雌性不育可通过将除草剂施用于植物来诱导，第二种亲代植物是正常可育的。为诱导第一种亲代植物的雌性不育，优选按照例如导致第一种亲代植物不能生产能够被受精的雌性配子或不能生产完全发育的种子(无论是能育的还是不育的)或不能生产能够发芽并发育为正常子代植物的能育子代种子的方案下施用除草剂。在这样的实施方案中，第二种亲代植物一般耐受用于诱导第一种亲代植物的雌性不育的相同除草剂，因此第一种和第二种亲代植物可用相同除草剂处理，优选同时处理。第一种和第二种亲代植物的杂交产生的种子为第一种亲代植物对第二种亲代植物授粉的结果。
[0052]本发明的另一方面提供生产非天然杂种种子的方法，其包括以下步骤：(a)提供第一种亲代植物，其包括由第一种转基因植物细胞(例如第一种转基因玉米细胞)培育的转基因植物，所述第一种转基因植物细胞在其基因组中包含转录为RNA的第一种重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含(i)至少一个可由第一种成熟miRNA识别的外源miRNA识别位点，和(ii)编码赋予第一种除草剂耐受性的蛋白的第一种信使RNA，其中第一种成熟miRNA在第一种亲代植物的雄性生殖组织中特异性表达，由此特异性抑制蛋白在雄性生殖组织中的表达，且其中第一种亲代植物的雄性不育可通过向第一种亲代植物施用第一种除草剂来诱导；(b)提供第二种亲代植物，其包括由第二种转基因植物细胞(例如第二种转基因玉米细胞)培育的转基因植物，所述第二种转基因植物细胞在其基因组中包含转录为RNA的第二种重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含(i)至少一个可由第二种成熟miRNA识别的外源miRNA识别位点，和(ii)编码赋予第二种除草剂耐受性的蛋白的第二种信使RNA，其中所述第二种成熟miRNA在第二种亲代植物的雌性生殖组织中特异性表达，由此特异性抑制蛋白在雌性生殖组织中的表达，且其中第二种亲代植物的雌性不育可通过向第二种亲代植物施用第二种除草剂来诱导；(c)将第一种除草剂和第二种除草剂施用于亲代植物，由此在第一种亲代植物中诱导雄性不育和在第二种亲代植物中诱导雌性不育；(d)使第一种和第二种亲代植物杂交，其中第一种亲代植物的胚珠由第二种亲代植物的花粉授粉，由此产生非天然杂种种子(例如非天然杂种玉米种子)。
[0053]在实施用于生产杂种种子的任一种方法时，“培育”指通过由第一种转基因植物细胞直接再生培育转基因植物，或者培育再生的转基因植物的转基因子代植物。由转基因植物细胞直接再生转基因植物或培育转基因子代植物(包括近交子代植物和杂种子代植物)的方法在本领域众所周知，在本文的标题“制备和使用转基因植物细胞和转基因植物”之下描述。
[0054]第二种信使RNA可与第一种信使RNA相同或不同。在多个实施方案中，第一种信使RNA和第二种信使RNA(a)是相同的；或者(b)是不同的，并编码蛋白的不同区段；(c)是不同的，并编码不同蛋白的区段。在优选的实施方案中，第一种和第二种信使RNA(无论是相同的还是不同的)赋予对相同除草剂的耐受性，这提供了用一种除草剂处理混合的第一种和第二种亲代植物的大田的便利性；在需要时，除草剂以一次或多次施用，以便诱导第一种亲代植物的雄性不育和第二种亲代植物的雌性不育。在某些情况下，第一种信使RNA编码赋予对除草剂耐受性的第一种蛋白，第二种信使RNA编码赋予对相同除草剂耐受性的第二种不同蛋白；非限制性实例是第一种和第二种蛋白选自全部赋予草甘膦耐受性的一组蛋白(包括5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶、草甘膦乙酰转移酶和草甘膦脱羧酶)的情况。在其它实施方案中，第一种和第二种信使RNA赋予对两种不同除草剂的耐受性，优选第一种和第二种亲代植物在它们的基因组中均包含编码两种蛋白的DNA，每种蛋白都赋予对两种除草剂之一的耐受性，使得第一种和第二种亲代植物这二者的大田可用两种除草剂处理(同时或单独地)。在所述方法的多个实施方案中，第一种除草剂和第二种除草剂(a)是相同的；或者(b)是不同的(其中第一种和第二种亲代优选对第一种和第二种除草剂这二者均具有耐受性)。
[0055]使用除草剂施用方案，由此实现可诱导不育，优选没有产量损失或其它不需要的结果。除草剂施用是定时的，以便诱导不育。在类似的实施例中，发现含处于FMV35S组成型启动子控制之下的EPSPS的转基因棉花系(RR1445)在大部分营养细胞中具有高EPSPS表达，但在某些雄性生殖组织类型(花粉母细胞、雄性配子体和毡绒层)中具有低EPSPS表达；在4叶期后施用草甘膦产生雄性不育(参见Chen等(2006)Plant Biotechnol.J.，4：477-487，早先于2006年6月7日在线公布，doi：10.1111/j.1467-7652.2006.00203.x)。
[0056]在优选的实施方案中，所述方法可用于生产通过种子繁殖的作物的非天然杂种种子，例如在标题“制备和使用转基因植物细胞和转基因植物”之下描述的那些，例如玉米、水稻、小麦、黑麦、大麦、燕麦、黑小麦、黍、高粱、昆诺阿藜、苋、荞麦、牧草、草坪草、苜蓿、棉花、红花、向日葵、大豆、油菜、油菜籽、亚麻、花生、菜豆、豌豆、小扁豆、苜蓿、莴苣、芦笋、朝鲜蓟、芹菜、胡萝卜、萝卜、甘蓝、羽衣甘蓝、芥菜、椰菜、花椰菜、芽甘蓝、芜箐、球茎甘蓝、黄瓜、甜瓜、西葫芦、笋瓜、洋葱、大蒜、韭菜、葱、细香葱、番茄、茄子、胡椒、灯笼果、甜菜、牛皮菜、菠菜、观赏植物和林木。在特别优选的实施方案中，非天然杂种种子是玉米种子。还明确地要求保护使用包括所述方法的任一个实施方案在内的人类行为生产的非天然杂种种子。
包含重组DNA构建体的可诱导不育的转基因植物
[0057]本发明的独立方面包括可诱导不育的转基因植物，其在其基因组中包含转录为RNA的重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含：(a)至少一个可由在植物的生殖组织中特异性表达的成熟miRNA识别的外源miRNA识别位点；和(b)编码赋予除草剂耐受性的蛋白的信使RNA；其中成熟miRNA特异性抑制该蛋白在生殖组织中的表达，且其中转基因植物的不育性可通过向植物施用除草剂来诱导。在一个实施方案中，生殖组织是雄性生殖组织，不育性是雄性不育。在另一个实施方案中，生殖组织是雌性生殖组织，不育性是雌性不育。在又一个实施方案中，生殖组织包括受精胚珠，不育性导致受精胚珠不能发育为能育种子。
[0058]在优选的实施方案中，可诱导不育的转基因植物是通过种子繁殖的作物，例如玉米、水稻、小麦、燕麦、大麦、黑麦、黑小麦、黍、高粱、昆诺阿藜、苋、荞麦、牧草、草坪草、苜蓿、棉花、红花、向日葵、大豆、油菜、油菜籽、亚麻、花生、菜豆、豌豆、小扁豆、苜蓿、莴苣、芦笋、朝鲜蓟、芹菜、胡萝卜、萝卜、甘蓝、羽衣甘蓝、芥菜、椰菜、花椰菜、芽甘蓝、芜箐、球茎甘蓝、黄瓜、甜瓜、西葫芦、笋瓜、洋葱、大蒜、韭菜、葱、细香葱、番茄、茄子、胡椒、灯笼果、甜菜、牛皮菜、菠菜、观赏植物和林木。
[0059]重组DNA构建体：本发明提供的可诱导不育的转基因植物在其基因组中具有转录为RNA的重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含：(a)至少一个可由在植物的生殖组织中特异性表达的成熟miRNA识别的外源miRNA识别位点；和(b)编码赋予除草剂耐受性的蛋白的信使RNA；其中成熟miRNA特异性抑制该蛋白在生殖组织中的表达，且其中转基因植物的不育性可通过向植物施用除草剂来诱导。此重组DNA构建体可用于制备含此构建体的转基因植物染色体、细胞、植物和种子，它们全都对生产杂种种子特别有用。
[0060]在包括可诱导不育的转基因植物的实施方案在内的本发明的多个实施方案中，重组DNA构建体还包含选自以下的至少一个元件：(a)植物启动子；(b)基因抑制元件；(c)内含子；(d)基因表达元件；(e)转录为能够结合配体的RNA适体的DNA；(f)转录为能够结合配体的RNA适体的DNA和转录为能够调节靶基因表达的调节RNA的DNA，调节RNA的特征在于调节依赖于调节RNA的构象，而调节RNA的构象受所述RNA适体的结合状态的变构影响；和(g)至少一种T-DNA边界。可用于本发明的这些和其它元件(例如终止子和间隔DNA)在下文的标题“启动子”、“基因抑制元件”、“内含子”、“基因表达元件”、“适体”、“配体”、“调节RNA”、“T-DNA边界”、“终止子”和“间隔DNA”之下以及本文公开内容中的其它位置详述。这些不同元件可如何排列的非限制性实例示于图1和2。制备和使用本发明的重组DNA构建体的技术、制备含重组DNA构建体的转基因植物细胞和由其获得的转基因植物、种子和子代植物的技术以及测定转录重组DNA构建体的效果的技术，在标题“制备和使用重组DNA构建体”、“制备和使用转基因植物细胞和转基因植物”之下以及本文公开内容中的其它位置详述。
[0061]启动子：一般来说，重组DNA构建体包含与可转录的DNA有效连接的启动子。适宜的启动子包括能够在其中期望转录的植物细胞中转录DNA的任何启动子。适用于本发明的重组DNA构建体的非组成型启动子包括空间特异性启动子、时间特异性启动子和诱导型启动子。空间特异性启动子可包括在植物中有功能的细胞器、细胞、组织或器官特异性启动子(例如分别用于抑制第一种靶RNA在质体、根、花粉或种子中表达的质体特异性、根特异性、花粉特异性或种子特异性启动子)。在许多情况下，种子特异性、胚特异性、糊粉特异性或胚乳特异性启动子尤其有用。时间特异性启动子可包括趋向于在植物生长或生殖周期中的某些发育期当中或在日或夜的不同时间当中或在一年的不同季节启动表达的启动子。诱导型启动子包括由化学物质(例如外源或合成的化学物质以及内源信息素或其它发信号分子)或环境条件(例如但不限于生物应激或非生物应激(例如水分亏缺或干旱、热、冷、高或低营养或盐水平、高或低光级或者害虫或病原体感染))诱导的启动子。表达特异性启动子还可以包括一般组成型表达但表达程度或“强度”不同的启动子，包括通常被看做“强启动子”或“弱启动子”的启动子。因为miRNA识别位点提供了对信使RNA的组织选择性表达控制，所以在许多优选实施方案中启动子仅是组成型启动子。
[0062]可用于植物的启动子的非限制性具体实例尤其包括分离自土壤杆菌T-DNA的章鱼碱合酶启动子和花椰菜花叶病毒35S启动子，以及增强的启动子元件或嵌合启动子元件，例如与增强子元件(来自玉米(Zeamays)的热激蛋白70的内含子)连接的增强的花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子。在植物中有功能并可用于本发明若干方面的众多表达特异性启动子是本领域已知的。例如，美国专利5,837,848、6,437,217和6,426,446公开了根特异性启动子；美国专利6,433,252公开了玉米L3油质蛋白启动子；美国专利申请公布号2004/0216189公开了编码质体定位的醛缩酶的植物核基因的启动子；美国专利6,084,089公开了冷诱导型启动子；美国专利号6,140,078公开了盐诱导型启动子；美国专利6,294,714公开了光诱导型启动子；美国专利6,252,138公开了病原体诱导型启动子；美国专利申请公布号2004/0123347A1公开了水分亏缺诱导型启动子。
[0063]启动子元件可包括为非天然启动子或启动子元件或其同源物但可调节基因表达的核酸序列。这些“与基因无关的”调节序列的实例包括天然或人工设计的RNA序列，其包含配体结合区或适体和调节区(其可顺式作用或反式作用)。参见例如Isaacs等(2004)Nat.Biotechnol.，22：841-847，Bayer和Smolke(2005)Nature Biotechnol.，23：337-343，Mandal和Breaker(2004)Nature Rev.Mol.Cell Biol.，5：451-463，Davidson和Ellington(2005)Trends Biotechnol.，23：109-112，Winkler等(2002)Nature，419：952-956，Sudarsan等(2003)RNA，9：644-647，以及Mandal和Breaker(2004)Nature Struct.Mol.Biol.，11：29-35。可选择或设计此“调节核糖核酸”的特定空间或时间特异性，例如以仅在给定浓度的适宜配体存在(或不存在时)调节外源基因的翻译。
[0064]基因抑制元件：基因抑制元件可为任何合适长度的可转录DNA，针对重组DNA构建体用于抑制的每个靶基因一般包含至少约19个至约27个核苷酸(例如19、20、21、22、23或24个核苷酸)。在许多实施方案中，针对重组DNA构建体用于抑制的每个靶基因，基因抑制元件包括23个以上的核苷酸(例如超过约30个、约50个、约100个、约200个、约300个、约500个、约1000个、约1500个、约2000个、约3000个、约4000个或约5000个核苷酸)。靶基因在标题“靶基因”之下描述。
[0065]可用于本发明的重组DNA构建体的适宜基因抑制元件包含至少一个选自以下的元件(在某些实施方案中，为多个元件)：
(a)包含至少一个反义DNA区段的DNA，所述反义DNA区段对至少一个第一种靶基因的至少一个区段是反义的；
(b)包含多个拷贝的至少一个反义DNA区段的DNA，所述反义DNA区段对至少一个第一种靶基因的至少一个区段是反义的；
(c)包含至少一个有义DNA区段的DNA，所述有义DNA区段为至少一个第一种靶基因的至少一个区段；
(d)包含多个拷贝的至少一个有义DNA区段的DNA，所述有义DNA区段为至少一个第一种靶基因的至少一个区段；
(e)转录为RNA并包含至少一个反义DNA区段和至少一个有义DNA区段的DNA，所述RNA通过形成双链RNA抑制至少一个第一种靶基因，所述反义DNA区段对至少一个第一种靶基因的至少一个区段是反义的，所述有义DNA区段为至少一个第一种靶基因的至少一个区段；
(f)转录为RNA并包含多个连续反义DNA区段和多个连续有义DNA区段的DNA，所述RNA通过形成单个双链RNA抑制至少一个第一种靶基因，所述反义DNA区段对至少一个第一种靶基因的至少一个区段是反义的，所述有义DNA区段为至少一个第一种靶基因的至少一个区段；
(g)转录为RNA并包含多个反义DNA区段和多个有义DNA区段的DNA，所述RNA通过形成多个双链RNA抑制至少一个第一种靶基因，所述反义DNA区段对至少一个第一种靶基因的至少一个区段是反义的，所述有义DNA区段为至少一个第一种靶基因的至少一个区段，其中所述多个反义DNA区段和多个有义DNA区段以一连串反向重复序列排列；
(h)包含来源于miRNA、优选植物miRNA的核苷酸的DNA；
(i)包含siRNA的核苷酸的DNA；
(j)转录为能够结合配体的RNA适体的DNA；和
(k)转录为能够结合配体的RNA适体的DNA和转录为能够调节至少一种第一种靶基因的表达的调节RNA的DNA，其中所述调节取决于调节RNA的构象，而调节RNA的构象受RNA适体的结合状态的变构影响。
[0066]这些基因抑制元件的非限制性代表示于图2。这些基因抑制元件中的任一种，无论是转录为单个双链RNA还是转录为多个双链RNA，都可以设计用于抑制一个以上的靶基因，包括例如一个以上的靶基因的等位基因、来自单个物种的多个靶基因(或至少一个靶基因的多个区段)或者不同物种的靶基因。适体、调节RNA和配体在下文它们对应的标题下描述。
[0067]反义DNA区段：在一个实施方案中，对至少一个第一种靶基因的至少一个区段为反义的至少一个反义DNA区段包括对至少一个第一种靶基因的至少某个区段为反义或互补的DNA序列，并可包括多个反义DNA区段，即多个拷贝的至少一个反义DNA区段，其对至少一个第一种靶基因的至少一个区段为反义的。多个反义DNA区段可包括对至少一个第一种靶基因的多个区段、或多个拷贝的至少一个第一种靶基因的区段、或多个第一种靶基因的区段或这些的任何组合为反义或互补的DNA序列。多个反义DNA区段可融合为嵌合体，例如包含对一个或多个第一种靶基因的多个区段为反义并融合在一起的DNA序列。
[0068]与至少一个第一种靶基因的至少某个区段反义或互补(即可以形成Watson-Crick碱基对)的反义DNA序列优选与至少一个第一种靶基因的至少某个区段具有至少约80％或至少约85％或至少约90％或至少约95％的互补性。在一个优选实施方案中，与至少一个第一种靶基因的至少某个区段反义或互补的DNA序列与至少一个第一种靶基因的至少某个区段具有约95％至约100％的互补性。在至少一个反义DNA区段包含多个反义DNA区段的情况下，全部的多个反义DNA区段的互补程度可相同，但不是必需的。
[0069]有义DNA区段：在另一个实施方案中，为至少一个第一种靶基因的至少一个区段的至少一个有义DNA区段包括对应于至少一个第一种靶基因的至少某个区段的DNA序列(即具有与该区段相同或大致相同的序列)，并可以包括多个有义DNA区段，即多个拷贝的至少一个有义DNA区段，该区段对应于至少一个第一种靶基因的至少一个区段(即具有该区段的核苷酸序列)。多个有义DNA区段可包括为或对应于至少一个第一种靶基因的多个区段、或至少一个第一种靶基因的某个区段的多个拷贝、或多个第一种靶基因的区段或这些区段的任何组合的DNA序列。可将多个有义DNA区段融合为嵌合体，即可以包括对应于一个或多个第一种靶基因的多个区段并融合在一起的DNA序列。
[0070]对应于靶基因的至少某个区段的有义DNA序列优选与靶基因的至少某个区段具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％或至少约95％的序列同一性。在一个优选实施方案中，对应于靶基因的至少某个区段的DNA序列与靶基因的至少某个区段具有约95％至约100％的序列同一性。在至少一个有义DNA区段包含多个有义DNA区段的情况下，所有的多个有义DNA区段的序列同一性程度可相同，但不是必需的。
[0071]多个拷贝：在基因抑制元件包含多个拷贝的反义DNA序列或多个拷贝的有义DNA序列时，这些多个拷贝可以串联重复序列连续排列。在某些实施方案中，这些多个拷贝可端到端地连续排列，即以直接连接的串联重复序列排列。在某些实施方案中，这些多个拷贝可以中断的串联重复序列排列，其中一个或多个间隔DNA区段可邻接多个拷贝中的一个或多个定位。串联重复序列，无论是直接连接的还是中断的还是这二者的组合，都可以在连续排列中包含多个拷贝的一种反义DNA序列或多个拷贝的一种有义DNA序列，或者可以在连续排列中包含多个拷贝的一种以上的反义DNA序列或一种以上的有义DNA序列。
[0072]双链RNA：在那些其中基因抑制元件包含对至少一种靶基因的至少一个区段为反义的至少一个反义DNA区段或为至少一种靶基因的至少一个区段的至少一个有义DNA区段的实施方案中，由至少一个反义DNA或至少一个有义DNA转录的RNA可通过RNA依赖性RNA聚合酶的作用变成双链的。参见例如美国专利号5,283,184。
[0073]在其它实施方案中，基因抑制元件可包含转录为RNA的DNA，所述RNA通过形成双链RNA用于抑制至少一个第一种靶基因，并包含对至少一个靶基因的至少一个区段为反义的至少一个反义DNA区段(如在上文的标题“反义DNA区段”之下所述)和为至少一个第一种靶基因的至少一个区段的至少一个有义DNA区段(如在上文的标题“有义DNA区段”之下所述)。这样的基因抑制元件还可以包含间隔DNA区段。至少一个反义DNA区段中的每个都对至少部分的有义DNA区段互补，以便允许通过至少一个反义DNA区段和至少一个有义DNA区段的分子内杂交形成双链RNA。反义DNA区段和有义DNA区段之间的这种互补性可为100％互补，但不是必需的；在某些实施方案中，这种互补性优选可为至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％的互补性。
[0074]双链RNA可为单一dsRNA“茎”(有义和反义链之间的碱基配对区)的形式，或者可以具有多个dsRNA“茎”。在一个实施方案中，基因抑制元件可包含转录为RNA的DNA，所述RNA通过形成基本上单个的双链RNA用于抑制至少一个第一种靶基因，所述DNA包含对至少一个第一种靶基因的至少一个区段为反义的多个连续反义DNA区段和为至少一个第一种靶基因的至少一个区段的多个连续有义DNA区段；多个连续反义和多个连续有义区段可形成单个双链RNA“茎”或串联排列的多个“茎”(有或没有分隔多个“茎”的非碱基配对的间隔DNA)。在另一个实施方案中，基因抑制元件包含转录为RNA的DNA，所述RNA通过形成RNA的多个dsRNA“茎”用于抑制至少一个第一种靶基因，所述DNA包含多个对至少一个第一种靶基因的至少一个区段为反义的反义DNA区段和多个为至少一个第一种靶基因的至少一个区段的有义DNA区段，其中所述多个反义DNA区段和多个有义DNA区段以一系列dsRNA“茎”(例如但不限于“反向重复序列”)排列。该多个dsRNA“茎”还可以连续或聚簇排列，以形成串联反向重复序列或者类似于“锤头”或“三叶草”形状的结构。这些基因抑制元件的任一种还可以包含存在于dsRNA“茎”中(例如作为多个反义DNA区段或有义DNA区段之间的间隔物，或者作为碱基配对的反义DNA区段和有义DNA区段之间的间隔物)或双链RNA“茎”外部(例如作为分隔反向重复序列对的环区)的间隔DNA区段。在其中碱基配对的反义和有义DNA区段长度不等的情况下，较长的区段可用作间隔物。图2图示了这些基因抑制构建体的可能的实施方案。
[0075]miRNA：在又一个实施方案中，基因抑制元件可包含得自miRNA(微RNA)的核苷酸的DNA，即对应于目标病毒或真核生物(包括植物和动物，尤其是无脊椎动物)的天然miRNA的DNA序列，或来源于此天然miRNA但修饰得包含不对应于天然miRNA的核苷酸序列的DNA序列。尽管迄今为止还没有在真菌中报告miRNA，但万一存在真菌miRNA，则它们也适用于本发明。一个优选的实施方案包括含有的DNA包括来源于病毒或植物miRNA的核苷酸的基因抑制元件。
[0076]在非限制性实施例中，来源于miRNA的核苷酸可包括的DNA包含对应于天然miRNA的环区的核苷酸和选自靶基因序列的核苷酸。在另一个非限制性实施例中，来源于miRNA的核苷酸可包括来源于miRNA前体序列的DNA，例如天然pri-miRNA或pre-miRNA序列，或者对应于天然miRNA区域的核苷酸和选自靶基因序列数的核苷酸，使得整体结构(例如在pre-miRNA茎结构中的错配的布局)得以保留，以允许pre-miRNA被加工为成熟miRNA。在又一个实施方案中，基因抑制元件可包含的DNA包括来源于miRNA并能够诱导或引导内源转录物同步切割为反式作用siRNA的核苷酸，如Allen等(2005)Cell，121：207-221所述。因此，包括来源于miRNA的核苷酸的DNA可包括在miRNA或miRNA前体分子中的天然序列、合成序列或这二者。
[0077]siRNA：在又一个实施方案中，基因抑制元件可包括的DNA包含小干扰RNA(siRNA)的核苷酸。siRNA可为一种或多种天然siRNA(例如分离自非转基因真核生物或转基因真核生物的siRNA)，或者可为一种或多种预测具有siRNA活性的DNA序列(例如通过使用本领域已知的预测工具，参见例如Reynolds等(2004)NatureBiotechnol.，22：326-330)。多个天然或预计的siRNA序列可连接在嵌合siRNA序列中，用于基因抑制。包含siRNA的核苷酸的此DNA优选包含至少19个核苷酸，在某些实施方案中优选包括至少21个、至少22个、至少23个或至少24个核苷酸。在其它实施方案中，包含siRNA的核苷酸的DNA可包含显著多于21个的核苷酸，例如超过约50个、约100个、约300个、约500个、约1000个、约3000个或约5000个核苷酸或更多。
[0078]靶基因：基因抑制元件可设计用于抑制任何第一种靶基因。在某些实施方案中，构建体还包含用于抑制至少一个第二种靶基因的第二个基因抑制元件，其中第二个基因抑制元件邻接内含子定位。无论第一种还是第二种靶基因，靶基因都可以包含被靶向抑制的单个基因或部分单个基因，或者可以包含例如靶基因的多个连续区段、靶基因的多个非连续区段、靶基因的多个等位基因或者来自一个或多个物种的多个靶基因。
[0079]靶基因可为可翻译的(编码)序列，或者可以为非编码序列(例如非编码调节序列)，或这二者，并可以包含至少一个选自以下的基因：真核生物靶基因、非真核生物靶基因、微RNA前体DNA序列和微RNA启动子。靶基因对细胞(例如植物或动物的细胞)可为天然的(内源的)，其中本发明的重组DNA构建体被转录，或者对其中构建体被转录的植物或动物的害虫或病原体可为天然的。靶基因可为外源基因，例如植物中的转基因。靶基因可为被靶向抑制的天然基因，伴有或不伴有外源转基因的同时表达，例如通过在同一或单独的重组DNA构建体中包含基因表达元件。例如，可能需要用外源转基因同源物置换天然基因。
[0080]靶基因可包括被靶向抑制的单个基因或部分单个基因，或者可以包括例如靶基因的多个连续区段、靶基因的多个非连续区段、靶基因的多个等位基因或一个或多个物种的多个靶基因。靶基因序列可包括来自任何物种(包括但不限于非真核生物，例如细菌和病毒；真菌；植物，包括单子叶和双子叶植物，例如作物、观赏植物和非驯养的或野生植物；无脊椎动物，例如节肢动物、环节动物、线虫和软体动物；以及脊椎动物，例如两栖动物、鱼、鸟、驯养或野生动物乃至人)的任何序列。
[0081]本发明的一个方面提供重组DNA构建体，其中靶基因对其中要转录构建体的植物是外源的，但对植物的害虫或病原体(例如病毒、细菌、真菌、卵菌和无脊椎动物，例如昆虫、线虫和软体动物)是内源的。靶基因可包含多个靶基因，或一个或多个基因的多个区段。在一个优选实施方案中，一个或多个靶基因为植物的无脊椎害虫或病原体的一个或多个基因。这些重组DNA构建体尤其可用于提供对一种或多种植物害虫或病原体有抗性(例如对线虫(例如大豆异皮线虫或根结线虫)或害虫有抗性)的转基因植物。
[0082]靶基因可为可翻译的(编码)序列，或者可为非编码序列(例如非编码调节序列)，或这二者。靶基因的非限制性实例包括非翻译(非编码)序列，例如但不限于5’非翻译区、启动子、增强子或其它非编码转录区、3’非翻译区、终止子和内含子。靶基因包括编码微RNA、小干扰RNA、核糖体或核酶的RNA组分、核仁小RNA和其它非编码RNA的基因(参见例如在rfam.wustl.edu公开提供的非编码RNA序列；Erdmann等(2001)Nucleic Acids Res.，29：189-193；Gottesman(2005)Trends Genet.，21：399-404；Griffiths-Jones等(2005)Nucleic Acids Res.，33：121-124)。靶基因的一个具体实例包括微RNA识别位点(即在成熟miRNA结合并诱导切割的RNA链上的位点)。靶基因的另一个具体实例包括转基因植物的害虫或病原体的天然微RNA前体序列，即编码微RNA的初级转录物，或由该初级转录物加工的RNA中间体(例如限于核的pri-miRNA或可由核输出至胞质的pre-miRNA)。参见例如Lee等(2002)EMBO Journal，21：4663-4670；Reinhart等(2002)Genes &Dev.，16：161611626；Lund等(2004)Science，303：95-98；以及Millar和Waterhouse(2005)Funct.Integr Genomics，5：129-135。靶基因还可以包括编码转录因子的基因和编码酶的基因的可翻译的(编码)序列，其涉及目标分子(例如但不限于氨基酸、脂肪酸和其它脂质、糖和其它碳水化合物、生物聚合物和次级代谢物，包括生物碱、萜类、聚酮化合物、非核糖体肽以及混合生物合成源的次级代谢物)的生物合成或分解代谢。
[0083]在许多优选实施方案中，靶基因是植物害虫或病原体的必需基因。必需基因包括害虫或病原体发育为可育生殖成体所需要的基因。必需基因包括在被沉默或抑制时导致生物体死亡(作为成体或于任何发育节段，包括配子)或生物体不能成功繁殖(例如雄性或雌性亲代的不育性或对接合体、胚或幼虫的致死性)的基因。线虫必需基因的描述见于例如Kemphues K.“Essential Genes”(2005年12月24日)，WormBook编辑，The C.elegans Research Community，WormBook，doi/10.1895/wormbook.1.57.1，可于www.wormbook.org在线获得。线虫必需基因的非限制性实例包括主要精子蛋白、RNA聚合酶II和几丁质合酶(参见例如美国专利申请公布号US20040098761A1)；其余的大豆异皮线虫必需基因在2006年2月23日申请的美国专利申请11/360,355中提供。昆虫基因的描述在果蝇(Drosophila)基因组数据库(可于flybase.bio.indiana.edu/在线获得)中可公开获得。业已通过基于细胞培养物的RNA干扰筛选分析了大部分预测的果蝇基因的功能，产生438个已鉴别的必需基因；参见Boutros等(2004)Science，303：832-835以及可于www.sciencemag.org/cgi/content/full/303/5659/832/DC1在线获得的支持材料。细菌和真菌必需基因的描述在必需基因数据库(“DEG”，可于tubic.tju.edu.cn/deg/在线获得)中提供；参见Zhang等(2004)NucleicAcids Res.，32：D271-D272。
[0084]无脊椎植物害虫包括但不限于线虫害虫、软体动物害虫(鼻涕虫和蜗牛)和昆虫害虫。目标植物病原体包括真菌、卵菌、细菌(例如引起叶出斑点、火疫、冠瘿和细菌性萎蔫病的细菌)、柔膜细菌和病毒(例如引起花叶病、脉结病、出斑点(flecking)、出斑点(spotting)或异常生长的病毒)。另参见G.N.Agrios，“Plant Pathology”(第4版)，Academic Press，San Diego，1997，635页关于真菌、细菌、柔膜细菌(包括支原体和螺原体)、病毒、线虫、寄生性高等植物和带鞭毛的原生动物的描述，所有这些都是目标植物害虫或病原体。另参见在美国植物病理学学会的“Common Names of Plant Diseases”上持续更新的植物害虫和病原体以及由它们引起的疾病的汇编，该汇编由美国植物病理学学会的植物疾病常用名标准化委员会编撰，1978-2005，可于www.apsnet.org/online/common/top.asp在线获得。
[0085]特定目标真菌植物病原体的非限制性实例包括例如引起白粉病、锈病、叶斑病和叶枯病、猝倒病、根腐病、颈腐病、棉铃腐病、茎溃疡病、枝溃疡病、维管萎蔫病、黑穗病或霉病的真菌，包括但不限于镰孢菌属(Fusarium spp.)、层锈菌属(Phakospora spp.)、丝核菌属(Rhizoctonia spp.)、曲霉属(Aspergillus spp.)、赤霉菌属(Gibberella spp.)、梨孢属(Pyricularia spp.)和链格孢属(Alternaria spp.)。真菌植物病原体的具体实例包括亚洲大豆锈菌病(Phakospora pachirhizi)、玉米锈病(Puccinia sorghi)、南方玉米锈病(Puccinia polysora)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)和其它镰刀菌属(Fusarium spp.)、交链孢属(Alternaria spp.)、青霉菌属(Penicillium spp.)、立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)、玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)、玉米小斑病菌(Bipolarismaydis)、玉米黑粉病菌(Ustilago maydis)、禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)(玉米赤霉菌(Gibberella zeae))、串珠镰刀菌(Fusariumverticilliodes)(串珠赤霉菌(Gibberella moniliformis))、F.proliferatum(藤仓赤霉(G.fujikuroi)var.intermedia)、胶孢镰刀菌(F.subglutinans)(尖粘镰刀菌(G.subglutinans))、马伊德壳色单隔孢(Diplodia maydis)、丝黑穗病菌(Sporisorium holci-sorghi)、禾生炭疽菌(Colletotrichumgraminicola)、大斑刚毛座腔菌(Setosphaeria turcica)、玉蜀黍出芽短梗霉菌(Aureobasidium zeae)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)和在美国专利6,194,636的表4和5中提供的众多真菌物种。植物病原体的非限制性实例包括先前分类为真菌但最近分类为卵菌的病原体。特定目标卵菌植物病原体的具体实例包括腐霉菌属(Pythium)成员(例如瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum))和疫霉菌属(Phytophthora)成员(例如晚疫霉菌(Phytophthora infestans)、大豆疫霉菌(Phytophthora sojae))以及引起霜霉病的生物体(例如甜菜霜霉病菌(Peronospora farinosa))。
[0086]细菌病原体的非限制性实例包括引起萎黄病的支原体和螺原体，例如引起玉米矮缩病的玉米矮缩螺原体(Spiroplasma kunkelii)；真细菌，例如燕麦假单胞菌(Pseudomonas avenae)、须芝草假单胞菌(Pseudomonas andropogonis)、玉米细菌性枯萎欧文氏菌(Erwiniastewartii)、丁香假单胞菌丁香致病变种(Pseudomonas syringae pv.syringae)、苛养木杆菌(Xylella fastidiosa)；以及在美国专利6,194,636的表3中列出的众多细菌物种。
[0087]特定目标病毒植物病原体的非限制性实例包括玉米矮花叶病毒(MDMV)、甘蔗花叶病毒(SCMV，以前称为MDMV B株)、小麦条纹花叶病毒(WSMV)、玉米枯黄矮小病毒(MCDV)、大麦黄矮病毒(BYDV)、香蕉束顶病毒(BBTV)和美国专利6,194,636的表2中列出的众多病毒。
[0088]尤其处于但不限于南半球地区(包括南美和中美洲)特定目标无脊椎害虫包括蚜虫、玉米根虫、夜蛾、夜蛾科(noctuideae)、薯虫、盲蝽属(Lygus spp.)、任何半翅类昆虫、同翅类昆虫或异翅类昆虫、任何鳞翅类昆虫、任何鞘翅类昆虫、线虫、切根虫、穗虫、粘虫、蛀虫、卷叶蛾等。本发明特别包含的节肢动物害虫包括多种切根虫物种，包括切根虫(Agrotis repleta)、小地老虎(Agrotis ipsilon)、切根虫(Aniclaignicans)、斑点夜蛾(granulate cutworm)(Feltia subterranea)、“gusanoáspero”(Agrotis malefida)；地中海粉螟(Anagasta kuehniella)、方颈谷盗(Cathartus quadricollis)、跳甲(Chaetocnema spp)、米蛾(Corcyracephalonica)、玉米根虫或“vaquita de San Antonio”(Diabotica speciosa)、甘蔗螟虫(Diatraea saccharalis)、小玉米茎蛀虫(Elasmopalpuslignosellus)、褐蝽(Euschistus spp.)、玉米穗虫(Helicoverpa zea)、长角谷盗(Laemophloeus minutus)、稻草尺蛾(Mocis latipes)、锯胸粉扁(Oryzaephilus surinamensis)、大斑粉螟(Pyralis farinalis)、印度谷螟(Plodia interpunctella)、玉米叶蚜(Rhopalosiphum maidis)、brownburrowing bug或“chinche subterranean”(Scaptocoris castanea)、麦二叉蚜(Schizaphis graminum)、谷象(Sitophilus zeamais)、麦蛾(Sitotrogacerealella)、秋天行军虫(Spodoptera frugiperda)、大谷盗(Tenebroidesmauritanicus)、二点红蜘蛛(Tetranychus urticae)、赤拟谷盗(Triboleumcastaneum)、斜纹夜蛾(Alabama argillacea)、棉象虫(Anthonomusgrandis)、棉蚜(Aphis gossypii)、甘薯粉虱(Bemisia tabaci)、多种蓟马物种(蓟马属(Frankliniella spp.))、棉花穗虫(Helicoverpa zea)、“orugabolillera”(例如Helicoverpa geletopoeon)、烟草夜蛾幼虫(Heliothisvirescens)、椿(Nezara viridula)、棉红铃虫(Pectinophora gossypiella)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、细须螨(叶螨属(Tetranychus spp.))、烟蓟马(Thrips tabaci)、温室粉虱(Trialeurodes vaporarium)、豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)、玉米斑点叶甲或“astilo moteado”(Astylusatromaculatus)、“oruga de la alfalfa”(Colias lesbia)、“chinche marrón”或“chinche de los cuernos”(Dichelops furcatus)、“alquiche chico”(Edessamiditabunda)、斑蝥虫(豆芫菁属(Epicauta spp.))、“barrenador del brote”(夜小卷蛾(Epinotia aporema))、“oruga verde del yuyo Colorado”(Loxostege bifidalis)、根结线虫(根结线虫属(Meloidogyne spp.))、“orugacuarteadora”(Mocis repanda)、南方绿椿象(Nezara viridula)、“chinchede la alfalfa”(Piezodorus guildinii)、苜蓿绿夜蛾(Plathypena scabra)、大豆夜蛾(Pseudoplusia includens)、尺蛾“isoca medidora del girasol”(Rachiplusia nu)、yellow woolybear(Spilosoma virginica)、yellowstripedarmyworm(Spodoptera ornithogalli)、多种根象虫(象甲科)、多种铁线虫(叩甲科)和多种蛴螬(金龟科)。本发明特别包含的线虫害虫包括玉米线虫害虫(刺线虫属(Belonolaimus spp.)、毛刺线虫属(Trichodorus spp.)、长针线虫属(Longidorus spp.)、锥线虫属(Dolichodorus spp.)、粒线虫属(Anguina spp.)、根腐线虫属(Pratylenchus spp.)、根结线虫属(Meloidogyne spp.)、胞囊线虫属(Heterodera spp.))、大豆线虫害虫(大豆孢囊线虫(Heterodera glycines)、根结线虫属(Meloidogyne spp.)、刺线虫属(Belonolaimus spp.))、香蕉线虫害虫(Radopholus similis、根结线虫属(Meloidogyne spp.)、螺旋线虫属(Helicotylenchus spp.))、甘蔗线虫害虫(Heterodera sacchari、短体线虫属(Pratylenchus spp.)、根结线虫属(Meloidogyne spp.))、橙线虫害虫(半穿刺线虫属(Tylenchulus spp.)、穿孔线虫属(Radopholus spp.)、刺线虫属(Belonolaimus spp.)、短体线虫属(Pratylenchus spp.)、剑线虫属(Xiphinema spp.))、咖啡线虫害虫(根结线虫属(Meloidogyne spp.)、短体线虫属(Pratylenchus spp.))、椰子树线虫害虫(伞滑刃线虫属(Bursaphelenchus spp.))、番茄线虫害虫(根结线虫属(Meloidogyne spp.)、刺线虫属(Belonolaimus spp.)、珍珠线虫属(Nacobbus spp.))、葡萄线虫害虫(根结线虫属(Meloidogyne spp.)、剑线虫属(Xiphinema spp.)、半穿刺线虫属(Tylenchulus spp.)、环线虫属(Criconemella spp.))、柠檬和酸橙线虫害虫(半穿刺线虫属(Tylenchulusspp.)、穿孔线虫属(Radopholus spp.)、刺线虫属(Belonolaimus spp.)、短体线虫属(Pratylenchus spp.)、剑线虫属(Xiphinema spp.))、可可线虫害虫(根结线虫属(Meloidogyne spp.)、肾形线虫(Rotylenchulusreniformis))、菠萝线虫害虫(根结线虫属(Meloidogyne spp.)、短体线虫属(Pratylenchus spp.)、肾形线虫(Rotylenchulus reniformis))、番木瓜线虫害虫(根结线虫属(Meloidogyne spp.)、肾形线虫(Rotylenchulusreniformis))、柚子线虫害虫(半穿刺线虫属(Tylenchulus spp.)、穿孔线虫属(Radopholus spp.)、刺线虫属(Belonolaimus spp.)、短体线虫属(Pratylenchus spp.)、剑线虫属(Xiphinema spp.)和蚕豆线虫害虫(根结线虫属(Meloidogyne spp.))。
[0089]害虫的靶基因可包括无脊椎动物的主要精子蛋白、α微管蛋白、β微管蛋白、空泡ATP酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶、RNA聚合酶II、几丁质合酶、细胞色素、miRNA、miRNA前体分子、miRNA启动子的基因以及其它基因，例如在美国专利申请公布号2006/0021087 A1、PCT专利公布号PCT/US05/11816中和在美国专利申请公布号2004/0098761 A1的表II中公开的基因。病原体的靶基因可包括病毒翻译起始因子、病毒复制酶、miRNA、miRNA前体分子、真菌微管蛋白、真菌空泡ATP酶、真菌几丁质合酶、真菌MAP激酶、真菌PaclTyr/Thr磷酸酶、参与营养运输的酶(例如氨基酸转运体或糖转运体)、参与真菌细胞壁生物合成的酶、角质素酶(cutinase)、黑素生物合成酶、聚半乳糖醛酸酶、果胶酶、果胶裂解酶、纤维素酶、蛋白酶的基因，与植物毒力基因相互作用的基因和参与病原体在感染植物中的侵入和复制的其它基因。因此，靶基因对其中要转录重组DNA构建体的植物不需要是内源的。本发明的重组DNA构建体可在植物中转录，用于抑制可侵扰植物的病原体或害虫的基因。
[0090]适宜的靶基因的具体的非限制性实例还包括氨基酸分解代谢基因(例如但不限于编码赖氨酸-酮戊二酸还原酶(LKR)和酵母氨酸脱氢酶(SDH)的玉米LKR/SDH基因及其同源物)、玉米醇溶蛋白基因、参与脂肪酸合成的基因(例如植物微粒体脂肪酸去饱和酶和植物酰基-ACP硫酯酶，例如但不限于在美国专利号6,426,448、6,372,965和6,872,872中公开的那些酶)、参与其中对调节一种或多种中间体的水平可能有意义的多步生物合成途径的基因，例如编码用于聚羟基链烷酸酯生物合成的酶的基因(参见例如美国专利第5,750,848号)；和编码细胞周期控制蛋白的基因，例如具有细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂样活性的蛋白(参见例如在国际专利申请公布号WO 05007829A2中公开的基因)。靶基因可包括编码不需要的蛋白(例如变应原或毒素)或用于生物合成不需要的化合物的酶(例如不需要的调味或气味组分)的基因。因此，本发明的一个实施方案是通过抑制变应原或毒素改善的转基因植物或这类植物的组织，例如具有降低的变应原性的花生、大豆或小麦籽粒。靶基因可包括涉及果实成熟如聚半乳糖醛酸酶的基因。靶基因可包括其中表达优选限于特定细胞或组织或发育阶段的基因，或其中表达优选为瞬时的基因，也就是说，其中不一定需要组成性或整体性抑制或扩散到许多组织的抑制的基因。因此，适宜的靶基因的其它实例包括编码蛋白的基因，所述蛋白在转基因植物中表达时使转基因植物抗害虫或病原体(参见例如在美国专利第5,763,245号中公开的胆固醇氧化酶的基因)；其中表达为害虫或病原体诱导的基因；以及可诱导或恢复育性的基因(参见例如在美国专利第6,759,575号中描述的barstar/barnase基因)。
[0091]可通过设计一种或多种基因抑制元件，以包含与非靶基因序列基本不相同的区域，使本发明的重组DNA构建体设计用于更特异性地抑制靶基因。非靶基因可包括任何预期在转录重组DNA构建体的植物中或可与由重组DNA构建体转录的RNA接触的生物体中被沉默或抑制的基因。非靶基因序列可包括来自任何物种(包括但不限于非真核生物，例如细菌，和病毒；真菌；植物，包括单子叶和双子叶植物，例如作物、观赏植物和非驯养的或野生植物；无脊椎动物，例如节肢动物、环节动物、线虫和软体动物；以及脊椎动物，例如两栖动物、鱼、鸟、驯养或野生动物乃至人)的任何序列。
[0092]在一个实施方案中，靶基因是对给定物种如给定的植物(例如但不限于农学上或商业上重要的植物，包括单子叶和双子叶植物)为内源的基因，非靶基因可为例如非靶物种如另一个植物物种的基因，或者病毒、真菌、细菌、无脊椎动物、或脊椎动物乃至人的基因。一个非限制性实例为其中基因抑制元件设计用于抑制靶基因的情况，所述靶基因为对单个物种(例如西方玉米根虫(Diabrotica virgiferavirgifera LeConte))为内源的基因，但不抑制非靶基因例如来自相关甚至密切相关的物种(例如北方玉米根虫(Diabrotica barberi Smith andLawrence)或南方玉米根虫(Diabrotica undecimpunctata))的基因。
[0093]在其它实施方案(例如需要抑制多个物种之间的靶基因的情况)中，可能需要设计基因抑制元件来抑制其中要沉默靶基因的多个物种共有的靶基因序列。因此，可选择对一个分类特异性的(例如对属、科乃至更大的分类如门(例如节肢动物)特异性的)但对其它分类(例如植物或脊椎动物或哺乳动物)非特异性的基因抑制元件。在该实施方案的一个非限制性实例中，可选择用于基因沉默的基因抑制元件，以便靶向病原性真菌(例如镰孢菌属(Fusarium spp.))但不靶向有益真菌的任何基因序列。
[0094]在该实施方案的另一个非限制性实例中，可选择用于在玉米根虫中进行基因沉默的基因抑制元件，以对叶甲(Diabrotica)属的所有成员都是特异性的。在该实施方案的又一个实例中，可选择此靶向叶甲(Diabrotica)的基因抑制元件，以便不靶向来自有益的鞘翅类昆虫(例如通常称为瓢虫的食肉性瓢虫(predatory coccinellid beetle))或其它有益的昆虫物种的任何基因序列。
[0095]用于沉默靶基因的RNA的需要的特异性程度取决于多种因素。例如，用于沉默靶基因的RNA包括双链RNA(dsRNA)，因此因素可包括预期通过Dicer或dicer样蛋白的作用产生的较小dsRNA片段的大小，以及降低dsRNA抑制非靶基因的潜力的相对重要性。例如，在预期dsRNA片段为21个碱基对大小的情况下，一个特别优选的实施方案包括用于沉默靶基因的RNA，所述靶基因编码与非靶基因序列基本不同的区域，例如其中包含至少21个核苷酸的每个连续片段都匹配非靶基因序列的21个连续核苷酸中的21个以下(例如21个以下，或20个以下，或19个以下，或18个以下，或17个以下)核苷酸的区域。在另一个实施方案中，与非靶基因序列基本不同的区域包括其中包含至少19个核苷酸的每个连续片段都匹配非靶基因序列的19个连续核苷酸中的19个以下(例如19个以下，或18个以下，或17个以下，或16个以下)核苷酸的区域。
[0096]在某些实施方案中，可能需要设计用于沉默靶基因的RNA，以包含预期不产生不需要的多肽的区域，例如通过筛选用于沉默靶基因的RNA的可编码已知的不需要多肽或这些多肽的紧密同源物的序列。不需要的多肽包括但不限于与已知的变应原性多肽同源的多肽和与已知的多肽毒素同源的多肽。编码这些潜在不需要的变应原性肽的公开可获得的序列是可用的，例如食品变态反应研究和资源计划(FARRP)变应原数据库(可在allergenonline.com获得)或食品安全数据库的生物技术信息(可在www.iit.edu/～sgendel/fa.htm获得)(另参见例如Gendel(1998)Adv.Food Nutr.Res.，42：63-92)。不需要的序列还可以包括例如那些注释为已知毒素或潜在的或已知的变应原的多肽序列，这些多肽序列包含在公开可获得的数据库中，例如GenBank、EMBL、SwissProt等，它们可通过Entrez系统(www.ncbi.nih.gov/Entrez)检索。不需要的潜在变应原性肽序列的非限制性实例包括大豆的大豆球蛋白、花生的油质蛋白和凝集素、小麦的麦谷蛋白、得自牛乳的酪蛋白、乳清蛋白和乳球蛋白，以及得自多种贝类的原肌球蛋白(allergenonline.com)。不需要的潜在毒性肽的非限制性实例包括破伤风梭菌(Clostridium tetani)的破伤风毒素tetA、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的腹泻毒素，以及毒液，例如岩螺属(Conus spp.)的芋螺毒素以及节肢动物和爬行动物的神经毒素(www.ncbi.nih.gov/Entrez)。
[0097]在一个非限制性实例中，筛选用于沉默靶基因的RNA，以消除那些所编码多肽与已知的变应原或毒素在8个连续氨基酸内具有完全的同源性或在至少80个氨基酸内具有至少35％同一性的可转录序列；这样的筛选可在两个方向对任何可能读框、对以AUG(在对应的DNA中为ATG)开始的潜在可读框或对所有可能的读框进行，与它们是否以AUG(或ATG)开始无关。当获得“命中结果”或匹配时，即在鉴定出所编码的潜在多肽与已知的变应原或毒素在8个连续氨基酸内具有完全同源性(或在至少约80个氨基酸内具有至少约35％同一性)的序列时，可在选择序列用于沉默靶基因的RNA时避免、消除或改变对应于命中结果的核酸序列。
[0098]可通过本领域技术人员已知的众多方法中的任一种避免、消除或改变不需要的序列。在某些情况下，结果可为一般认为天然不存在的新序列。例如，可将“干净的”序列一起连接成在用于沉默靶基因的RNA中使用的新嵌合序列，由此避免某些序列。
[0099]因为用于沉默靶基因的RNA包括双链RNA(dsRNA)，所以申请人认识到，在某些dsRNA介导的基因沉默中，不完全匹配的dsRNA序列有可能对基因沉默有效。例如，业已表明miRNA互补部位中心附近的错配对miRNA的基因沉默的作用强于更远处定位的错配。参见例如Mallory等(2004)EMBO J.，23：3356-3364中的图4。在另一个实施例中，业已报道，错配碱基对的位置和形成错配的核苷酸的同一性均影响给定siRNA沉默靶基因的能力，而除G：U摆动碱基对之外的腺嘌呤-胞嘧啶错配被良好耐受(参见Du等(2005)NucleicAcids Res.，33：1671-1677)。因此，包含在用于沉默靶基因的RNA中的dsRNA不需要总是与目标靶基因具有100％的序列同一性，而是一般应优选与目标靶基因具有显著的序列同一性，例如约95％、约90％、约85％或约80％序列同一性。相对于给予其它标准(例如但不限于与目标靶基因的序列同一性百分率或给定序列的预测基因沉默效率)的重要性，本领域技术人员应能够判断给予筛选预测对靶基因具有更高特异性的区域或预测不产生不需要的多肽的区域的重要性。例如，对于用于沉默靶基因的RNA可能需要在几种物种间有活性，因此本领域技术人员可确定，更重要的是在用于沉默靶基因的RNA中包含对几种目标物种特异性的区域，而筛选预测具有较高基因沉默效率的区域或预测产生不需要的多肽的区域不够重要。
[00100]RNA适体：核酸适体是通过主要不基于Watson-Crick碱基配对(相反，例如基于在互补的反向平行的核酸链之间发生的碱基配对，以形成双链核酸结构)的结合机制结合配体的核酸分子。参见例如Ellington和Szostak(1990)Nature，346：818-822。核酸适体一般包括允许适体形成二级结构(例如通过形成茎-环结构)的一级核苷酸序列，所述二级结构允许适体结合其配体。适体与其配体的结合优选是特异性的，使得适体可以区分结构相似的两种或多种分子(参见例如Bayer和Smolke(2005)Nature Biotechnol.，23：337-343)。但是，可用于本发明的适体可为单价的(结合一种配体)或多价的(结合一种以上的个体配体，例如结合两种或多种不同配体的一个单元)。参见例如Di Giusto和King(2004)J.Biol.Chem.，279：46483-46489，其描述了多价的环状DNA适体的设计和构建。
[00101]可用于本发明的适体可包括DNA、RNA、核酸类似物(例如肽核酸)、锁核酸、化学修饰的核酸或其组合。参见例如Schmidt等(2004)Nucleic Acids Res.，32：5757-5765，其描述了锁核酸适体。在本发明的优选实施方案中，适体为RNA适体。在特别优选的实施方案中，适体通过植物原位(in planta)转录产生。适体的实例可见于例如公开的适体数据库，其可在aptamer.icmb.utexas.edu在线获得(Lee等(2004)Nucleic Acids Res.，32(1)：D95-100)。
[00102]适体可通过本领域已知的众多方法设计用于给定配体，包括体外选择或定向进化技术。参见例如在Tuerk和Gold(1990)Science，249：505-510，Ellington和Szostak(1990)Nature，346：818-822，Ellington和Szostak(1992)Nature，355：850-852中描述的“SELEX”(“指数富集的配体系统进化”)，如Burke和Willis(1998)，RNA，4：1165-1175所述的通过嵌合SELEX选择双功能RNA适体，如Murphy等(2003)Nucleic Acids Res.，31：e110所述的使用结合磁性粒子的配体进行选择，Eulberg等(2005)Nucleic Acids Res.，33(4)：e45所述的自动化SELEX技术，以及如Ohuchi等(2005)Nucleic Acid Symposium Series，49：351-352所述的用于获得针对在细胞表面上表达的重组分子产生的适体的SELEX型技术。选择可用随机混合的RNA由部分结构化的RNA混合物(参见例如Davis和Szostak(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，99：11616-11621)或由变性RNA混合物(参见例如Geiger等(1996)NucleicAcids Res.，24：1029-1036)开始。给定RNA序列的次级结构模型、折叠和杂交行为可使用例如Zuker(2003)Nucleic Acids Res.，31：3406-3415所述的算法预测。因此，给定配体的适体可使用适宜的选择从头设计。适体设计和选择的一个非限制性实例详述于Weill等(2004)NucleicAcids Res.，32：5045-5058，其描述了多种结合ATP的适体的分离以及结合蛹虫草菌素(3’脱氧腺苷)的适体的次级选择。适体设计的另一个非限制性实例在Huang和Szostak(2003)RNA，9：1456-1463中给出，其描述了具有新特异性的新适体的体外进化和起始适体的新二级结构。
[00103]配体：用于本发明的配体可包括氨基酸或其生物合成或分解代谢中间体、肽、蛋白、糖蛋白、脂蛋白、碳水化合物、脂肪酸和其它脂质、类固醇、萜类、激素、核酸、芳族化合物、生物碱、天然产物或合成化合物(例如染料、药物、抗生素、除草剂)、无机离子和金属，简而言之，可包括可由核酸次级结构通过主要不基于Watson-Crick碱基配对的机制识别和结合的任何分子(或分子部分)。以此方式，配体和适体的识别和结合类似于抗原和抗体或者生物效应物和受体的识别和结合。配体可包括单个分子(或分子部分)，或两个或多个分子(或分子部分)的组合，并可以包括一个或多个大分子复合物(例如聚合物、脂质双层、脂质体、细胞膜或其它细胞结构或细胞表面)。参见例如Plummer等(2005)Nucleic Acids Res.，33：5602-5610，其描述了结合复合的小分子-蛋白表面的适体的选择；Zhuang等(2002)J.Biol.Chem.，277：13863-13872，其描述了昆虫中肠受体蛋白与脂筏的缔合，该结合影响苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)杀虫内毒素的结合；以及Homann和Goringer(1999)Nucleic Acids Res.，27：2006-2014，其描述了结合活锥体虫的适体。
[00104]特异性配体的非限制性实例包括维生素如辅酶B12和焦磷酸硫胺素、黄素单核苷酸、鸟嘌呤、腺嘌呤、S-腺苷甲硫氨酸、S-腺苷同半胱氨酸、辅酶A、赖氨酸、酪氨酸、多巴胺、葡糖胺-6-磷酸、咖啡因、茶碱、抗生素如氯霉素和新霉素、除草剂如草甘膦和麦草畏、蛋白(包括病毒或噬菌体壳蛋白以及无脊椎动物表皮或消化道表面蛋白)以及RNA(包括病毒RNA、转移RNA(t-RNA)、核糖体RNA(rRNA))和RNA聚合酶，例如RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)。适用于本发明的配体包括由苏云金芽孢杆菌杀虫内毒素识别的昆虫中肠刷状缘受体蛋白。参见例如Knight等(1995)J.Biol.Chem.，270：17765-17770，和Gill等(1995)J.Biol.Chem.，270：27277-27282，其描述了这类受体蛋白实例的分离、鉴别和克隆；Gomez等(2001)J.Biol.Chem.，276：28906-28912，和Daniel等(2002)Appl.Env.Microbiol.，68：2106-2112，其描述了用于鉴别这些受体蛋白的结合表位和研究它们的结合亲和力的技术；Jurat-Fuentes和Adang(2001)Appl.Env.Microbiol.，67：323-329，和Jurat-Fuentes等(2001)，Appl.Env.Microbiol.，67：872-879，其描述了包括检测刷状缘膜囊泡与内毒素的结合的膜印迹或表面等离子体共振的内毒素-受体结合测定。本发明的RNA适体结合的适宜配体的其它实例包括类固醇受体，例如雌激素受体、雄激素受体、类视黄醇受体和蜕化素受体(参见例如Saez等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97：14512-14517)。在配体为受体分子或受体复合物的情况下，本发明的RNA适体可任选地用作拮抗剂或激动剂。可用于本发明的一类RNA适体是不结合配体但为热响应性的“热开关”，也就是说适体的构象由温度决定。参见例如Box 3 in Mandal and Breaker(2004)Nature Rev.Mol.Cell Biol.，5：451-463。
[00105]适体可以其结合状态描述，即适体是否结合(或不结合)其对应配体。适体的结合位点(或一个或多个三维结合域)可被描述为被配体占据或未被配体占据。类似地，给定适体群可以结合或不结合配体的群部分描述。适体对其配体的亲和力可依据适体与配体的缔合(结合)速率以及配体与适体的解离速率描述，例如借助于平衡缔合常数(K)或本领域众所周知的其倒数亲和常数(Ka)。这些速率可通过类似于常用于确定配体和受体或抗原和抗体的结合动力学的那些方法的方法确定，例如但不限于平衡测定、竞争测定、表面等离子体共振和预测模型。可选择适体对其配体的亲和性，例如在适体的体外进化过程中，或者通过变成适体一级序列进一步改变，其中这样的改变可通过计算结合能量或例如Zuker(2003)Nucleic Acids Res.，31：3406-3415或Bayer和Smolke(2005)Nature Biotechnol.，23：337-343所述的算法指引。
[00106]适体的结合状态优选至少部分地决定了适体的二级结构(例如双链区或单链区的形成)和三维构象。在其中可转录的DNA还包括转录为能够调节靶序列表达的调节RNA的DNA的实施方案中，适体的结合状态变构性影响调节RNA的构象，并因此影响调节RNA调节靶序列表达的能力。
[00107]在一个优选实施方案中，适体(转录的RNA)侧接转录为能够形成双链RNA(dsRNA)的RNA的DNA。在这些实施方案的某一些当中，dsRNA通过RNAi(siRNA或miRNA)机制加工，由此将适体与转录物的其余部分切开。在其它的特别优选的实施方案中，位于适体侧翼的两个转录的RNA区在它们自身之间形成至少部分双链的RNA“茎”，其中适体用作茎-环结构中的“间隔区”或“环”；预期这种排列以类似于对DNA观察到的方式增强转录物的稳定性或半衰期(参见例如Di Giusto和King(2004)J.Biol.Chem.，279：46483-46489)。在其基因组中具有转录为这种具有增强的稳定性的适体的DNA的转基因植物是特别需要的，例如在适体用于抑制或杀死转基因植物的病原体或害虫的情况下。
[00108]调节RNA：在许多实施方案中，可转录的DNA还包括转录为能够调节靶序列表达的调节RNA的DNA，其中靶序列的调节取决于调节RNA的构象，而调节RNA的构象受RNA适体的结合状态的变构影响。适体与调节RNA结构域的这种组合通常被称为核开关。调节RNA典型地处于适体下游，但两个结构域可重叠；参见例如Najafi-Shoushtari和Famulok(2005)RNA，11：1514-1520，其描述了包含适体结构域并被黄素单核苷酸竞争性调节的发夹核酶和与适体结构域互补的寡核苷酸。在某些实施方案中，调节RNA与靶序列有效连接，“以顺式”起作用。在其它实施方案中，调节RNA与靶序列不有效连接，“以反式”起作用。
[00109]可选择任何靶序列，包括选自本发明的转基因植物的天然基因、转基因植物中的转基因和转基因植物的害虫或病原体的天然基因的一种或多种靶序列。靶序列可包括表达目标基因的序列(例如编码蛋白的RNA)，或抑制目标基因的序列(例如被加工为siRNA或miRNA的RNA，所述siRNA或miRNA再抑制目标基因)。靶序列可为可翻译的(编码)序列，或者可为非编码序列(例如非编码调节序列)，或这二者。靶序列可包括至少一个真核生物靶序列、至少一个非真核生物靶序列或这二者。靶序列可包括来自任何物种(包括但不限于非真核生物，例如细菌，和病毒；真菌；植物，包括单子叶和双子叶植物，例如作物、观赏植物和非驯养的或野生植物；无脊椎动物，例如节肢动物、环节动物、线虫和软体动物；以及脊椎动物，例如两栖动物、鱼、鸟、驯养或野生动物乃至人)的任何序列。适宜的靶序列在标题“靶基因”之下作为“靶基因”进一步描述。
[00110]在包含适体和调节RNA的核开关实施方案中，核开关通过任何适宜的机制调节靶序列的表达。一种非限制性机制是通过配体依赖性形成的内在终止子茎(通常在一行6个或更多个U残基之后的延长的茎-环结构)进行的转录调节，所述终止子茎使RNA聚合酶中断转录，例如在形成完整的mRNA之前。在“关闭”核开关中，在没有足够配体的情况下，未结合的适体结构域允许形成“反终止子茎”，其阻止形成内在的终止子茎，由此允许转录继续进行；因此，核开关的默认状态是“开”(即转录正常进行)，必须加入配体以关闭核开关。在使用该机制的“开启”核开关中，适体结构域必须为结合(配体被占据的)构象，以允许形成“反终止子茎”和允许转录。另一个机制是转录调节，其中配体结合在全长mRNA中引起结构改变，由此允许(或阻止)核糖体结合核糖体结合位点(RBS)；“反-反-RBS”茎和“反-RBS”茎的形成也被相互排除。在使用该机制的“开启”核开关中，没有配体允许形成反-反-RBS，并由此形成核糖体可与其结合的在结构上不受阻碍的RBS。转录调节和翻译调节这二者的组合也是有可能的。关于调节机制的详述，参见Mandal和Breaker(2004)Nature Rev.Mol.Cell Biol.，5：451-463。
[00111]在某些实施方案中，调节RNA包括核酶，例如自切割核酶、锤头核酶或肝素核酶。调节RNA的某些实施方案包括与靶序列互补或大致互补的RNA序列。一个非限制性实例是调节RNA包含与靶序列互补或大致互补的反义区段的情况。参见例如Bayer和Smolke(2005)Nature Biotechnol.，23：337-343，其中调节RNA包含与靶序列互补的反义区段和与反义区段互补的有义区段这二者，其中反义区段和有义区段能够彼此杂交，以形成分子内双链RNA。
[00112]在某些实施方案中，靶序列的调节涉及调节RNA与靶序列的Watson-Crick碱基配对(例如在反式作用实施方案中，参见例如Bayer和Smolke(2005)Nature Biotechnol.，23：337-343)。特别是对于这样的反式作用实施方案，适宜的靶序列包括在标题“靶基因”之下描述的靶基因。可通过设计调节RNA，以包含与非靶序列基本不相同的区域，使目标靶序列可被更特异性地靶向。非靶序列可包括任何其表达优选在转录重组DNA构建体的植物中或可与由重组DNA构建体转录的RNA接触的生物体中未被改变的基因。非靶序列可包括来自任何物种的任何序列(包括但不限于非真核生物，例如细菌，和病毒；真菌；植物，包括单子叶和双子叶植物，例如作物、观赏植物和非驯养的或野生植物；无脊椎动物，例如节肢动物、环节动物、线虫和软体动物；以及脊椎动物，例如两栖动物、鱼、鸟、驯养或野生动物乃至人)。
[00113]一个实施方案提供在其基因组中具有重组DNA构建体的转基因植物，所述重组DNA构建体包含可转录DNA，可转录DNA包含转录为能够结合配体的RNA适体的DNA，其中所述构建体可为杂交赋予化学可诱导的或可抑制的雄性不育性或育性。优选的实例使用含结合配体的适体的核开关，此核开关是已注册的物质，例如已被批准的除草剂。在非限制性实例中，具有处于雄性特异性启动子控制之下的雄性不育基因和草甘膦“关闭”核开关的转基因植物是雄性不育的，除非施用草甘膦。相反，具有处于雄性特异性启动子控制之下的雄性不育基因和草甘膦“开启”核开关的转基因植物只有在施用草甘膦时才是雄性不育的。
[00114]本发明的一种应用是提供配体活化的除草剂抗性系统，用于保护基因同一性(“基因锁”)，以及维持除草剂抗性自生植物控制。在一个实施方案中，将编码“开启”核开关的DNA序列插入到含“CP4”作为靶序列的表达盒中，以在转基因植物中条件化表达CP4，CP4是赋予草甘膦抗性的选择性标记epsps-cp4(来自根癌土壤杆菌菌株CP4的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶)。具有核开关控制的CP4表达盒的转基因植物仅在配体存在的情况下表达CP4，配体通过含配体的专利草甘膦制剂(例如通过叶喷雾)施用于植物。在施用时，配制的草甘膦除草剂活化CP4转录/翻译，并使转基因植物抗草甘膦。转基因植物对不含所述配体的属草甘膦制剂敏感。同样，该方法可应用于任何其它除草剂抗性基因/除草剂组合，例如麦草畏降解性氧化酶/麦草畏或抗生素抗性基因/抗生素组合。
[00115]在另一个实施方案中，靶序列是对给定物种内源的基因，所述给定物种例如为给定的植物(例如但不限于农学或商业上重要的植物，包括单子叶和双子叶植物)，非靶序列可为例如非靶物种(如另一个植物物种)的基因，或者病毒、真菌、细菌、无脊椎动物或脊椎动物乃至人的基因。一个非限制性实例为其中需要设计适体或调节RNA或这二者以便改变靶序列表达的情况，所述靶序列为对单个物种(例如西方玉米根虫(Diabrotica virgifera virgifera LeConte))为内源的基因，但不改变非靶序列如来自相关甚至密切相关的物种(例如北方玉米根虫(Diabrotica barberi Smith and Lawrence)或南方玉米根虫(Diabroticaundecimpunctata))的基因的表达。
[00116]在其它实施方案(例如需要改变多个物种之间的靶序列表达的情况)中，可能需要设计适体或调节RNA或这二者，以改变其中要改变靶序列表达的多个物种共有的靶序列的表达。因此，可选择对一个分类特异性的(例如对属、科乃至更大的分类如门(例如节肢动物)为特异性的)但对其它分类(例如植物或脊椎动物或哺乳动物)非特异性的适体或调节RNA或这二者。在该实施方案的一个非限制性实例中，可选择调节RNA，以便靶向病原性真菌(例如镰孢菌属(Fusariumspp.))，但不靶向有益真菌(例如有益的土壤菌根真菌)的任何基因序列。
[00117]在该实施方案的另一个非限制性实例中，可选择在玉米根虫中调节基因表达的适体或调节RNA或这二者，以对叶甲(Diabrotica)属的所有成员都是特异性的。例如，可选择包含靶向叶甲(Diabrotica)的抑制元件(例如反义RNA、双链RNA、微RNA或串联RNA重复序列)的调节RNA，以便不靶向来自有益的鞘翅类昆虫(例如通常称为瓢虫的食肉性瓢虫(predatory coccinellid beetle))或其它有益的昆虫物种的任何基因序列。
[00118]包含用于抑制靶基因的基因抑制元件(例如反义RNA、双链RNA、微RNA或串联RNA重复序列)的调节RNA所需要的特异性程度取决于多种因素。例如，在基因抑制元件包含双链RNA(dsRNA)的情况下，因素可包括预期通过Dicer作用产生的较小dsRNA片段的大小，以及降低dsRNA抑制非靶序列的潜力的相对重要性。例如，在预期dsRNA片段为21个碱基对大小的情况下，一个特别优选的实施方案可在调节RNA中包括能够形成dsRNA并编码与非靶序列基本不同的区域的序列，例如其中包含至少21个核苷酸的每个连续片段都匹配非靶序列的21个连续核苷酸中的21个以下核苷酸(例如21个以下，或20个以下，或19个以下，或18个以下，或17个以下)的区域。在另一个实施方案中，与非靶序列基本不同的区域包括其中包含至少19个核苷酸的每个连续片段都匹配非靶序列的19个连续核苷酸中的19个以下核苷酸(例如19个以下，或18个以下，或17个以下，或16个以下)的区域。
[00119]在某些实施方案中，可能需要设计适体、调节RNA或这二者，以包含预期不产生不需要的多肽的区域，例如通过筛选适体、调节RNA或这二者的可编码已知的不需要多肽或这些多肽的紧密同源物的序列。不需要的多肽包括但不限于与已知的变应原性多肽同源的多肽和与已知的多肽毒素同源的多肽。编码这些潜在不需要的变应原性肽的公开可获得的序列是可用的，例如食品变态反应研究和资源计划(FARRP)变应原数据库(可在allergenonline.com获得)或食品安全数据库的生物技术信息(可在www.iit.edu/～sgendel/fa.htm获得)(另参见例如Gendel(1998)Adv.Food Nutr.Res.，42：63-92)。不需要的序列还可以包括例如那些注释为已知毒素或潜在的或已知的变应原的多肽序列，这些多肽序列包含在公开可获得的数据库中，例如GenBank、EMBL、SwissProt等，它们可通过Entrez系统(www.ncbi.nih.gov/Entrez)检索。潜在不需要的变应原性肽序列的非限制性实例包括大豆的大豆球蛋白，花生的油质蛋白和凝集素，小麦的麦谷蛋白，得自牛乳的酪蛋白、乳清蛋白和乳球蛋白，以及得自各种贝类的原肌球蛋白(allergenonline.com)。潜在不需要的毒性肽的非限制性实例包括破伤风梭菌(Clostridium tetani)的破伤风毒素tetA、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的腹泻毒素，以及毒液，例如岩螺属(Conus spp.)的芋螺毒素以及节肢动物和爬行动物的神经毒素(www.ncbi.nih.gov/Entrez)。
[00120]在一个非限制性实施例中，可筛选所提出的适体、调节RNA或这二者，以消除那些所编码多肽与已知的变应原或毒素在8个连续氨基酸内具有完整同源性或在至少约80个氨基酸内具有至少35％的同一性的可转录序列；这样的筛选可在两个方向对任何可能的读框、对以ATG开始的潜在可读框或对所有可能的读框进行，与它们是否以ATG开始无关。当获得“命中结果”或匹配时，即鉴别出所编码的潜在多肽在8个连续氨基酸内与已知的变应原或毒素具有完整同源性(或在至少约80个氨基酸内具有至少约35％的同一性)的序列时，可在选择用于适体、调节RNA或这二者的序列时避免、消除或改变对应于命中结果的DNA序列。
[00121]可通过本领域技术人员已知的众多方法中的任一种避免、消除或改变不需要的序列。在某些情况下，结果可为一般认为天然不存在的新序列。例如，可通过将“干净的”序列一起连接成用于基因抑制元件的新嵌合序列避免某些序列。
[00122]在调节RNA包括用于沉默靶基因的双链RNA(dsRNA)的情况下，申请人认识到，在某些dsRNA介导的基因沉默中，不完全匹配的dsRNA序列有可能对基因沉默有效。例如，业已表明miRNA互补部位中心附近的错配对miRNA的基因沉默的作用比更远处定位的错配的作用更强。参见例如Mallory等(2004)EMBO J.，23：3356-3364中的图4。在另一个实例中，业已报道，错配碱基对的位置和形成错配的核苷酸的同一性均影响给定siRNA沉默靶序列因的能力，除G：U摆动碱基对之外的腺嘌呤-胞嘧啶错配被良好耐受(参见Du等(2005)Nucleic Acids Res.，33：1671-1677)。因此，包含双链RNA的调节RNA不需要总是与目标靶序列具有100％同一性，而是一般应优选与目标靶序列具有显著的序列同一性，例如约95％、约90％、约85％或约80％的序列同一性。相对于给予其它标准(例如但不限于与第一个目标靶序列的序列同一性百分率或给定序列的预测基因沉默效率)的重要性，本领域技术人员应能够判断给予筛选预测对第一个靶序列具有更高特异性的区域或预测不产生不需要的多肽的区域的重要性。例如，对于包含用于基因沉默的双链RNA的给定调节RNA可能需要在几种物种间有活性，因此本领域技术人员可确定，更重要的是在调节RNA区中包含对几种目标物种特异性的区域，而筛选预测具有较高基因沉默效率的区域或预测产生不需要的多肽的区域不够重要。
[00123]在许多实施方案中，转基因植物细胞在其基因组中具有重组DNA，该重组DNA包括可转录的DNA，此可转录的DNA包括(a)转录为能够结合配体的RNA适体的DNA，和(b)转录为能够调节靶序列表达的调节RNA的DNA，其中调节取决于调节RNA的构象，而所述调节RNA的构象受所述RNA适体的结合状态的变构影响。在这些实施方案中，适体与其配体的结合导致靶序列表达的特定改变，这种改变可为表达增加或降低，取决于重组DNA的设计。
[00124]在一个实施方案中，配体与RNA适体的结合导致靶序列的表达相对于没有结合时的表达增加。在另一个实施方案中，配体与RNA适体的结合导致靶序列的表达相对于没有结合时的表达降低。
[00125]某些实施方案以“自发可诱导性”为特征。在一个这样的实施方案中，配体与RNA适体的结合导致靶序列的表达相对于没有结合时的表达增加，其中表达增加导致配体的水平足以保持表达增加。在另一个实施方案中，配体与RNA适体的结合导致靶序列的表达相对于没有结合时的表达降低，表达降低导致配体的水平足以保持表达增加。
[00126]因此，本发明的另一方面是在植物细胞中改变目标基因表达的方法，包括在本发明的转基因植物细胞或来源于此转基因植物细胞的植物、子代植物或种子或其它植物组织中转录重组或异源DNA，所述重组或异源DNA转录为(a)能够结合配体的RNA适体，和(b)能够调节靶序列表达的调节RNA，其中调节取决于调节RNA的构象，其中调节RNA的构象受RNA适体的结合状态的变构影响，由此目标基因的表达相对于在没有重组DNA构建体转录时的其表达被改变。
[00127]内含子：本文使用的“内含子”或“内含子序列”一般指天然基因的非编码DNA序列，其在本发明的重组DNA构建体中保留了其由前mRNA转录物中被切除的天然能力，例如被发现具有结合的蛋白编码RNA区的天然内含子序列，其中天然内含子被剪接，使外显子在RNA离开核之前被组装为成熟mRNA。这种可切除的内含子具有5’剪接位点和3’剪接位点。内含子可为自剪接的或非自剪接的(即发生剪接需要酶或剪接体)，并可选择不同的剪接效率。
[00128]适用于本发明构建体的内含子可为病毒内含子(例如Yamada等(1994)Nucleic Acids Res.，22：2532-2537)、真核生物内含子(包括动物、真菌和植物内含子)、古细菌或细菌内含子(例如Belfort等(1995)J.Bacteriol.，177：3897-3903)，或者在其中要转录本发明的重组DNA构建体的植物中具有内含子样功能的任何天然或人工(例如Yoshimatsu和Nagawa(1989)Science，244：1346-1348)DNA序列。尽管基本上任何内含子都可在本发明的实施中用作嵌入DNA的宿主，但特别优选的内含子是增强在植物中的表达的内含子或来源于5’非翻译前导序列的内含子。在本发明的重组DNA构建体用于转化植物的情况下，尤其可优选植物源的内含子。尤其优选的植物内含子的实例包括水稻肌动蛋白1内含子(I-Os-Actl)(Wang等(1992)Mol.Cell Biol.，12：3399-3406；McElroy等(1990)Plant Cell，2：163-171)、玉米热激蛋白内含子(I-Zm-hsp70)(美国专利5,593,874和5,859,347)和玉米乙醇脱氢酶内含子(I-Zm-adhl)(Callis等(1987)Genes Dev.，1：1183-1200)。适用于本发明的内含子的其它实例包括烟草花叶病毒5’前导序列或“ω”前导序列(Gallie和Walbot(1992)Nucleic Acids Res.，20：4631-4638)、Shrunken-1(Sh-1)内含子(Vasil等(1989)Plant Physiol.，91：1575-1579)、玉米蔗糖合酶内含子(Clancy和Hannah(2002)Plant Physiol.，130：918-929)、热激蛋白18(hsp18)内含子(Silva等(1987)J.Cell Biol.，105：245)和82kd热激蛋白(hsp82)内含子(Semrau等(1989)J.Cell Biol.，109，p.39A，和Mettler等(1990年5月)NA.T.O Advanced Studies Instituteon Molecular Biology，Elmer，Bavaria)。
[00129]基因表达元件：重组DNA构建体还可以包含基因表达元件。任何的一种或多种目标基因都可以通过基因表达元件表达，包括编码序列或非编码序列或这二者，并可以包括天然序列或人工或嵌合序列或这二者。在基因表达元件编码蛋白的情况下，这些构建体优选包含功能性终止子元件，以允许基因表达元件的转录和翻译。在包含可诱导不育的转基因植物的实施方案中，基因表达元件可包含或者可另外为编码除草剂耐受蛋白的信使RNA。
[00130]在其中重组DNA构建体包含内含子的实施方案中，构建体还可以包含用于表达至少一个目标基因的基因表达元件，其中基因表达元件邻接内含子定位。在其它实施方案中，重组DNA构建体包含其中嵌入基因抑制元件和用于表达至少一个目标基因的基因表达元件的内含子，其中基因表达元件也位于内含子中；在这些情况下，基因表达元件可与自身也在内含子中的功能性终止子元件有效连接。由基因表达元件表达的目标基因可包括至少一个选自真核生物靶基因、非真核生物靶基因和微RNA前体DNA序列的基因。目标基因可包括单个基因或多个基因(例如多个拷贝的单个基因、单个基因的多个等位基因或包含多个物种的基因的多个基因)。在一个实施方案中，基因表达元件可包含自水解的肽序列，例如位于编码一种或多种多肽的多个序列之间(参见例如来自包括病毒、锥体虫和细菌在内的多个物种的2A和“2A样”自切割序列，由Donnelly等(2001)，J.Gen.Virol.，82：1027-1041公开)。在另一个实施方案中，基因表达元件可包括核糖体“跳跃”序列，例如位于编码一种或多种多肽的多个序列之间(参见例如Donnelly等(2001)，J.Gen.Virol.，82：1013-1025公开的口蹄疫病毒(FMDV)2A核糖体“跳跃”序列)。
[00131]目标基因可包括任何物种(包括但不限于非真核生物，例如细菌和病毒；真菌；植物，包括单子叶和双子叶植物，例如作物、观赏植物和非驯养的或野生的植物；无脊椎动物，例如节肢动物、环节动物、线虫和软体动物；以及脊椎动物，例如两栖动物、鱼、鸟和哺乳动物)的任何编码或非编码序列。由基因表达元件表达的非编码序列的非限制性实例包括但不限于5’非翻译区、启动子、增强子或其它非编码转录区、3’非翻译区、终止子、内含子、微RNA、微RNA前体DNA序列、小干扰RNA、核糖体或核酶的RNA组分、小核仁RNA和其它非编码RNA。目标基因的非限制性实例还包括但不限于可翻译(编码)序列，例如涉及目标分子(例如氨基酸、脂肪酸和其它脂质、糖和其它碳水化合物、生物聚合物，以及次级代谢物，包括生物碱、萜类化合物、聚酮化合物、非核糖体肽，和混合的生物合成源的次级代谢物)的生物合成或分解代谢的基因编码转录因子和基因编码酶。目标基因可为其中要转录本发明的重组DNA构建体的植物的天然基因，或者可为非天然基因。目标基因可为标记基因，例如编码抗生素、抗真菌或除草剂抗性的选择标记基因，或者编码容易检测的性状的标记基因(例如八氢番茄红素合酶或赋予植物特定色素的其它基因)，或编码可检测分子(例如荧光蛋白、萤光素酶或分别通过蛋白或核酸检测方法可检测的独特的多肽或核酸“标记”)的基因。选择标记是对鉴别成功加工的本发明构建体有特定用途的目标基因。
[00132]在本发明的某些实施方案中，重组DNA构建体设计用于抑制至少一种内源或外源基因和同时表达至少一种外源基因。在一个非限制性实例中，重组DNA构建体包含用于抑制内源(玉米)赖氨酸酮戊二酸还原酶/酵母氨酸脱氢酶(LKR/SDH)基因的基因抑制元件、用于表达外源(细菌)二氢皮考啉二酸合酶蛋白的基因表达元件，以及转录为RNA的DNA，所述DNA包含：(a)至少一个可由成熟miRNA识别的外源miRNA识别位点，所述成熟miRNA在植物的生殖组织中特异性表达；和(b)编码epsps-CP4的信使RNA，其中成熟miRNA特异性抑制epsps-CP4在生殖组织中的表达，其中转基因植物的不育性可通过向植物施用草甘膦诱导。这样的构建体对提供具有增强的赖氨酸水平和一般的草甘膦耐受性的玉米应尤其有用，其中玉米的不育性可通过在适宜的发育时间施用草甘膦诱导。在另一个非限制性实例中，重组DNA构建体包含用于抑制玉米根虫基因的基因抑制元件和转录为RNA的DNA，所述DNA包含：(a)至少一个可由成熟miRNA识别的外源miRNA识别位点，所述成熟miRNA在植物的生殖组织中特异性表达；和(b)编码epsps-CP4的信使RNA，其中成熟miRNA特异性抑制epsps-CP4在生殖组织中的表达，其中转基因植物的不育性可通过向植物施用草甘膦诱导。这样的构建体对提供具有玉米根虫抗性和一般的草甘膦耐受性的玉米应尤其有用，其中玉米的不育性可通过在适宜的发育时间施用草甘膦诱导。
[00133]T-DNA边界：T-DNA边界指限定土壤杆菌T-DNA(肿瘤DNA)的起始和末端并通过土壤杆菌介导的转化以顺式作用于T-DNA向植物基因组的转移的DNA序列或DNA区域(参见例如Hooykaas和Schilperoort(1992)Plant Mol.Biol.，19：15-38)。多个实施方案包括无T-DNA边界、具有单个T-DNA边界或一个以上T-DNA边界的重组DNA构建体。例如，在其中重组DNA构建体包含其中嵌入基因抑制元件的内含子的实施方案中，内含子优选位于T-DNA边界对之间，所述T-DNA边界对可为左和右T-DNA边界组、两个左T-DNA边界组和两个右T-DNA边界组。在另一个实施方案中，重组DNA构建体包含单个T-DNA边界、嵌入内含子的基因抑制元件和至少一个基因表达元件。
[00134]终止子：许多实施方案，尤其是其中重组DNA构建体设计用于转录为信使RNA的实施方案，包含启动子元件和功能性终止子元件这二者，该功能性终止子元件包含功能性聚腺苷酸化信号和聚腺苷酸化位点，使得由重组DNA构建体转录的RNA可被聚腺苷酸化和加工，用于转运到胞质中。
[00135]在标题“包含微RNA识别位点的重组DNA构建体”之下描述的一般性实施方案中，可存在或不存在功能性终止子元件。在其中不存在功能性终止子元件的实施方案中，功能性聚腺苷酸化信号和功能性聚腺苷酸化位点中的至少一个不存在。在其它实施方案中，3’非翻译区不存在。在这些情况下，重组DNA构建体被转录为非聚腺苷酸化的RNA，优选未被转运到胞质中。
[00136]间隔DNA：间隔DNA区段实际上可包含任何DNA(例如但不限于编码目标基因的可翻译的DNA序列、编码标记或报告基因的可翻译的DNA序列；来源于内含子的可转录的DNA，其在转录时可由产生的转录RNA中被切割下来；编码RNA的可转录DNA序列，其形成例如环或茎的结构或能够结合特定配体的适体；可剪接的DNA，例如内含子和自剪接核酶；所编码序列通过核酸杂交、扩增或测序检测的可转录DNA；和这些的组合。间隔DNA可被发现例如邻接基因表达元件、位于部分基因抑制元件之间或位于不同的基因抑制元件之间。在某些实施方案中，间隔DNA自身是靶基因的有义或反义序列。在某些优选的实施方案中，由间隔DNA(例如靶基因或适体的大环反义序列)转录的RNA采取赋予转录物需要的特征的次级结构或三维构象，所述特征例如为增加的稳定性、增加的体内半衰期或者细胞或组织特异性。
制备和使用重组DNA构建体
[00137]可考虑例如期望的表达类型和在其中要转录构建体的植物中的使用便利性，通过任何适于预期用途的方法制备本发明的重组DNA构建体。制备和使用DNA构建体和载体的通用方法在本领域众所周知，详述于例如手册和实验室指引，包括Sambrook和Russell，“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”(第3版)，Cold Spring HarborLaboratory Press，NY，2001。对构建转化用的DNA构建体和载体有用的技术的实例公开于美国专利申请公布号2004/0115642 A1。DNA构建体还可以使用GATEWAYTM克隆技术(可得自Invitrogen LifeTechnologies，Carlsbad，CA)构建，该技术使用来自噬菌体λ载体构建的Integrase/att系统的位点特异性重组酶LR克隆反应，而不是限制性内切核酸酶和连接酶。LR克隆反应公开于美国专利5,888,732和6,277,608以及美国专利申请公布号2001/283529、2001/282319和2002/0007051。GATEWAYTM克隆技术操作说明书也由Invitrogen提供，其提供了用于将任何需要的DNA常规克隆入含可操作的植物表达元件的载体中的简明指引。另一个替代的载体制造方法使用如Aslandis等(1990)Nucleic Acids Res.，18：6069-6074和Rashtchian等(1992)Biochem.，206：91-97公开的不依靠连接的克隆，其中将具有单链5’和3’末端的DNA片段连接入目标载体中，然后目标载体可在体内扩增。
[00138]在某些实施方案中，重组DNA构建体的DNA序列包括已针对其中要表达重组DNA构建体的植物进行密码子优化的序列。例如，要在植物中表达的重组DNA构建体可通过本领域已知的方法使其全部或部分序列(例如第一个基因抑制元件或基因表达元件)对在植物中表达进行密码子优化。参见例如美国专利5,500,365关于植物密码子优化的描述；另参见De Amicis和Marchetti(2000)Nucleic AcidRes..28：3339-3346。
转基因植物细胞和转基因植物
[00139]本发明的另外方面提供在其基因组中具有本发明提供的任一种重组DNA构建体的转基因植物细胞。还提供含本发明的转基因植物细胞的转基因植物。本发明的转基因植物包括任何发育期的植物，并包括由本文要求保护的转基因植物细胞制备的再生植物，或再生植物的子代植物(其可为近交或杂种子代植物)，或此转基因植物的种子。还提供并要求保护的是在其基因组中具有本发明提供的任一种重组DNA构建体的转基因种子。
[00140]一个实施方案包括在其基因组中具有转录为RNA的重组DNA构建体的转基因植物，所述重组DNA构建体包含：(a)至少一个可由成熟miRNA识别的外源miRNA识别位点，所述成熟miRNA在植物(即由转基因植物细胞制备的植物)的生殖组织中特异性表达；和(b)编码赋予除草剂耐受性的蛋白的信使RNA；其中成熟miRNA特异性抑制所述蛋白在生殖组织中的表达，其中由转基因植物细胞制备的转基因植物的不育性可通过向植物施用除草剂诱导。
[00141]转基因植物细胞可为分离的植物细胞(例如个体植物细胞或在人工培养基当中或之上生长的细胞)，或者可为在未分化组织中的植物细胞(例如愈伤组织或任何植物细胞聚集体)。转基因植物细胞可为在至少一种分化组织中的植物细胞，所述分化组织选自叶(例如叶柄和叶片)、根、茎(例如块茎、根茎、匍匐茎、鳞茎和球茎)、柄(例如木质部、韧皮部)、木质、种子、果实(例如坚果、谷物、肉质果)和花(例如雄蕊、花丝、花粉囊、花粉、心皮、雌蕊、子房、胚珠)。
[00142]本发明的转基因植物细胞或转基因植物可为任何适宜的目标植物细胞或植物。瞬时转化的和稳定转化的植物细胞均包含在本发明中。特别优选稳定转化的转基因植物。在许多优选的实施方案中，转基因植物是由其可收获种子的能育转基因植物，本发明还要求保护这些转基因植物的转基因种子，其中所述种子优选还包含本发明的重组构建体。
制备和使用转基因细胞和转基因植物
[00143]在重组DNA构建体用于生产本发明的转基因植物细胞、转基因植物或转基因种子时，转化可包括任一种众所周知并已证实的方法和组合物。适用于植物转化的方法实际上包括可将DNA导入细胞中的任何方法，例如通过直接递送DNA(例如通过PEG介导的原生质体转化、电穿孔、与碳化硅纤维一起搅拌和加速包被DNA的颗粒)、通过土壤杆菌介导的转化、通过病毒或其它载体等。一个优选的植物转化方法是例如在美国专利5,015,580(大豆)、5,550,318(玉米)、5,538,880(玉米)、6,153,812(小麦)、6,160,208(玉米)、6,288,312(水稻)和6,399,861(玉米)和6,403,865(玉米)中描述的微粒轰击。
[00144]植物转化的另一个优选方法是土壤杆菌介导的转化。在本发明的一个优选实施方案中，本发明的转基因植物细胞利用含二元Ti质粒系统的土壤杆菌通过转化获得，其中土壤杆菌携带第一种Ti质粒和第二种嵌合质粒，该嵌合质粒含野生型Ti质粒的至少一个T-DNA边界、在转化的植物细胞中有功能并与本发明的基因抑制构建体有效连接的启动子。参见例如在美国专利5,159,135中描述的二元系统。另参见De Framond(1983)Biotechnology，1：262-269；和Hoekema等，(1983)Nature，303：179。在此二元系统中，含一个或多个T-DNA边界的较小质粒可便利地构建并在适宜的替代宿主如大肠杆菌中操作，然后转移入土壤杆菌中。
[00145]用于土壤杆菌介导的植物(尤其是作物)转化的详细程序包括例如在美国专利5,004,863、5,159,135和5,518,908(棉花)；5,416,011、5,569,834、5,824,877和6,384,301(大豆)；5,591,616(玉米)；5,981,840(玉米)；5,463,174(芸苔)中公开的程序。已对许多植物物种报告了类似的方法，既有双子叶植物，也有单子叶植物，其中尤其包括花生(Cheng等(1996)Plant Cell Rep.，15：653)；芦笋(Bytebier等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，84：5345)；大麦(Wan和Lemaux(1994)Plant Physiol.，104：37)；水稻(Toriyama等(1988)Bio/Technology，6：10；Zhang等(1988)Plant Cell Rep.，7：379；小麦(Vasil等(1992)Bio/Technology，10：667；Becker等(1994)Plant J.，5：299)、苜蓿(Masoud等(1996)Transgen.Res.，5：313)；和番茄(Sun等(2006)Plant CellPhysiol.，47：426-431)。另参见美国专利申请公布号2003/0167537 A1关于转化的拟南芥植物的载体、转化方法和生产的描述，其中转录因子通过CaMV35S启动子组成型表达。转基因植物细胞和转基因植物还可以通过用其它载体转化获得，例如但不限于病毒载体(例如烟草蚀纹马铃薯Y病毒(TEV)、大麦条斑花叶病毒(BSMV)和在Edwardson和Christie，“The Potyvirus Group：Monograph No.16，1991，Agric.Exp.Station，Univ.of Florida”中提及的病毒)、质粒、粘粒、YAC(酵母人工染色体)、BAC(细菌人工染色体)或在使用适宜的转化方案时的任何其它适宜的克隆载体，所述适宜的转化方案例如为细菌感染(例如采用如上所述的土壤杆菌)、二元细菌人工染色体构建体、直接递送DNA(例如经PEG介导的转化、干燥/抑制介导的DNA摄取、电穿孔、与碳化硅纤维一起搅拌和微粒轰击)。对本领域技术人员应当显而易见的是，可使用和改变多种转化方法，用于由众多目标植物物种生产稳定的转基因植物。
[00146]提供含稳定整合的重组DNA的转基因植物细胞和转基因植物的转化方法优选在介质上的组织培养物中和受控的环境中实施。“介质”指用于体外(即在失活的活体生物外部)培养细胞的众多营养混合物。受体细胞靶包括但不限于分生组织细胞、愈伤组织、不成熟胚或部分胚，以及配子细胞，例如小孢子、花粉、精细胞和卵细胞。设想将由其可再生能育植株的任何细胞作为可用于实施本发明的受体细胞。愈伤组织可由多种组织源发端，包括但不限于不成熟胚或部分胚、实生顶端分生组织、小孢子等。能够作为愈伤组织增殖的那些细胞可用作遗传转化的受体细胞。用于制备本发明的转基因植物的实际转化方法和材料(例如多种介质和受体靶细胞、不成熟胚的转化以及随后的能育转基因植物的再生)公开于例如美国专利6,194,636和6,232,526以及美国专利申请公布号2004/0216189。
[00147]在一般的转化实践中，DNA在任一种转化试验中都被导入到仅小百分率的靶细胞中。一般使用标记基因来提供用于鉴别那些细胞的有效系统，所述细胞通过接受转基因DNA构建体并将其整合入它们的基因组中而被稳定转化。优选的标记基因提供了赋予对选择剂(例如抗生素或除草剂)抗性的选择标记。植物细胞可对抗其的任何抗生素或除草剂都可以是有用的选择剂。潜在转化的细胞与选择剂接触。在存活细胞群中的将是其中赋予抗性的基因一般被整合和以足以允许细胞存活的水平表达的细胞。可测试细胞，以进一步证实重组DNA的稳定整合。常用的选择标记基因包括赋予抗生素(例如卡那霉素或巴龙霉素(nptII)、潮霉素B(aphIV)和庆大霉素(aac3和aacC4))抗性或除草剂(例如草铵膦(bar或pat)和草甘膦(EPSPS))抗性的那些基因。有用的选择标记基因和选择剂的实例描述于美国专利5,550,318、5,633,435、5,780,708和6,118,047。还可以使用可筛选的标记或报告体，例如提供目测鉴别转化体的能力的标记。有用的可筛选标记的非限制性实例包括例如所表达蛋白通过作用于发色底物(例如β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)(uidA)或萤光素酶(luc))产生可检测的颜色或自身可检测(例如绿色荧光蛋白(GFP)(gfp)或免疫原性分子)的基因。本领域技术人员将认识到，许多其它有用的标记或报告体是可用的。
[00148]通过在本发明的转基因植物中转录重组构建体获得的靶基因表达(或目标基因的同时表达)所产生的改变可通过任何适合的方法检测或测量，所述适合的方法包括蛋白检测方法(例如蛋白质印迹、ELISA和其它免疫化学方法)、测量酶活性或核酸检测方法(例如DNA印迹、RNA印迹、PCR、RT-PCR、荧光原位杂交)。这样的方法是本领域一般技术人员周知的，以众多可获得的手册为证；参见例如JosephSambrook和David W.Russell，“Molecular Cloning：A LaboratoryManual”(第3版)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY，2001；Frederick M.Ausubel等(编辑)“Short Protocols in Molecular Biology”(第5版)，John Wiley and Sons，2002；John M.Walker(编辑)“ProteinProtocols Handbook”(第2版)，Humana Press，2002；和Leandro 
Figure A200680046237D0071144750QIETU
(编辑)“Transgenic Plants：Methods and Protocols”，Humana Press，2004。
[00149]用于检测或测量通过在本发明的转基因植物中转录重组DNA获得的靶基因表达(或目标基因的同时表达)所产生的改变的其它适宜方法包括检测相对于其中不转录重组DNA的转基因植物为其中要转录重组DNA的转基因植物中的靶基因表达(或目标基因的同时表达)的直接或代理指示的任何其它性状，例如毛重或显微形态性状、生长速率、产量、繁殖或募集速率、对害虫或病原体的抗性或对生物或非生物胁迫(例如水分亏缺胁迫、盐胁迫、营养胁迫、热或冷胁迫)的抗性。这些方法可使用表型性状的直接检测或代理测定(例如在植物中，这些测定包括植物部分测定，例如叶或根测定，以测定非生物胁迫的耐受性)。
[00150]本发明的重组DNA构建体例如可通过表达或抑制其它基因与其它重组DNA堆叠，用于赋予其它性状(例如就转化植物而言为包括除草剂抗性、害虫抗性、发芽耐冷性、水分亏缺耐受性等的性状)。用于协同降低和增加基因表达的构建体公开于美国专利申请公布号2004/0126845 A1。
[00151]可收获转基因育性植物的种子并用于培育在其基因组中包含重组DNA构建体的本发明转基因植物的子代，包括杂种代。因此，除了用重组DNA构建体直接转化植物之外，本发明的转基因植物可通过使具有重组DNA的第一种植物与没有该构建体的第二种植物杂交制备。例如，可将重组DNA导入经历转化以产生转基因植物的植物系中，该植物系可与第二种植物系杂交，以将重组DNA渐渗入获得的子代中。具有一个重组DNA(实现靶基因表达的改变)的本发明的转基因植物可与具有其它重组DNA的植物系杂交，所述其它重组DNA赋予一种或多种额外性状(例如但不限于除草剂抗性、害虫或疾病抗性、环境逆境抗性、改变的营养物含量和产量改善)，以产生具有赋予期望的靶序列表达行为和额外性状这二者的重组DNA的子代植物。
[00152]通常，在这种用于组合性状的育种中，表现出额外性状的转基因植物是雄性系，携带基本性状的转基因植物是雌性系。此杂交的子代分离，使得一些植株将携带两个亲代性状的DNA，一些将携带一个亲代性状的DNA；这些植株可利用与亲代重组DNA相关的标记来鉴别。携带两个亲代性状的DNA的子代植株可与雌性亲代系多次回交，例如通常6-8代，以产生除其它转基因亲代系的重组DNA之外与一个原始转基因亲代系具有大致相同的基因型的子代植物。
[00153]本发明的又一方面为由本发明的转基因种子培育的转基因植物。本发明涉及直接由含重组DNA的转基因种子培育的转基因植物以及植物子代，包括近交或杂种植物系，其通过使直接由转基因种子培育的转基因植物与不是由相同转基因种子培育的第二种植物杂交获得。
[00154]杂交可包括例如以下步骤：
(a)第一种亲代植物(例如非转基因的或转基因的)和按照本发明为转基因的第二种亲代植物的植物种子；
(b)将第一种和第二种亲代植物的种子培育成开花植物；
(c)用第二种亲代的花粉传粉第一种亲代的花；和
(d)收获带有已受精的花的亲代植物上产生的种子。
[00155]经常需要将重组DNA渐渗入到原种中，例如通过回交，以将特别需要的性状由一个来源转移至没有该性状的近交植物或其它植物。这可例如通过优良近交系(“A”)(回交亲本)与供体近交系(“B”)(非回交亲本)首先杂交实现，所述供体近交系携带适宜的所述性状的基因，例如按照本发明制备的构建体。首先在获得的子代中选择该杂交子代的要由非回交亲本“B”转移的目标性状，然后将选定的子代与优良的回交亲本“A”回交。在5代或更多代具有选择的目标性状的回交之后，子代对控制要转移的特征的基因座是半合子，但对大部分或几乎全部的其它基因而言象优良亲代一样。最后的回交代应自交，以产生对要转移的基因为纯系的子代，即一个或多个转化事件。
[00156]通过一系列育种操作，选定的DNA构建体可由一个系移至完全不同的系中，不需要进一步的重组操作。人们因此可生产对一个或多个DNA构建体为纯种的近交系植物。通过杂交不同的近交植物，人们可生产大量的具有不同DNA构建体组合的不同杂种。以此方式可生产具有经常与杂种相关的需要的农学特性(“杂种优势”)以及一个或多个DNA构建体赋予的需要特征的植物。
[00157]遗传标记可用于帮助将本发明的一个或多个DNA构建体由一种遗传背景渐渗入到另一种中。帮助选择的标记相对于常规育种提供的优势在于，其可用于避免由表型改变引起的错误。此外，遗传标记可提供有关特定杂交的个体子代中的原种种质的相对程度的数据。例如，当具有需要性状的植物(要不然其具有非农学需要的遗传背景)与原种亲代杂交时，遗传标记可用于选择不仅具有目标性状而且具有相对大比例的需要种质的子代。以此方式，使将一种或多种性状渐渗入到特定遗传背景中所需要的代数最小。在本发明的转基因植物的育种中帮助选择的标记的有效性以及有用的分子标记的类型(例如但不限于SSR和SNP)论述于PCT申请公布号WO 02/062129和美国专利申请公布号2002/0133852、2003/0049612和2003/0005491。
[00158]在本发明的某些转基因植物细胞和转基因植物中，可能需要同时表达(或抑制)目标基因，同时还调节靶基因的表达。因此，在某些实施方案中，转基因植物包含重组DNA，该重组DNA还包含用于表达至少一种目标基因的基因表达(或抑制)元件，靶基因表达的调节优选用转基因植物中至少一种目标基因的同时表达(或抑制)实现。
[00159]因此，如本文所述，本发明的转基因植物细胞或转基因植物可通过使用本领域已知的或目前公开的任何适宜的、瞬时或稳定的、整合或非整合的转化方法获得。重组DNA构建体可在任何植物细胞或组织中或在任何发育阶段的全株中转录。转基因植物可来源于任何单子叶或双子叶植物，例如但不限于商业或农业用途的植物，例如作物(尤其是用于人类食物或动物饲料的作物)、产木或产浆的树、蔬菜植物、结果植物和观赏植物。目标植物的非限制性实例包括谷类作物(例如小麦、燕麦、大麦、玉米、黑麦、黑小麦、水稻、黍、高粱、昆诺阿藜、苋和荞麦)；草料作物(例如饲草和草料双子叶植物，包括苜蓿、野豌豆、三叶草等)；油籽作物(例如棉花、红花、向日葵、大豆、油菜、油菜籽、亚麻、花生和油椰子)；树类坚果(例如胡桃、腰果、榛果、美洲山核桃、扁桃等)；甘蔗、椰子、海枣、橄榄、甜菜、茶和咖啡；产木或产浆树；蔬菜作物，例如豆类(例如菜豆、豌豆、小扁豆、苜蓿、花生)、莴苣、芦笋、朝鲜蓟、旱芹、胡萝卜、萝卜、芸苔属植物(例如甘蓝、羽衣甘蓝、芥菜和其它叶状芸苔、椰菜、花椰菜、芽甘蓝、芜箐、球茎甘蓝)、食用葫芦科植物(例如黄瓜、甜瓜、西葫芦、笋瓜)、食用葱属植物(例如洋葱、大蒜、韭菜、葱、细香葱)、食用茄科成员(例如番茄、茄子、马铃薯、胡椒、灯笼果)和食用藜科成员(例如甜菜、牛皮菜、菠菜、昆诺阿藜、苋)；结果作物，例如苹果、梨、柑橘类水果(例如橙子、酸橙、柠檬、柚子等)、核果(例如杏、桃、李子、油桃)、香蕉、菠萝、葡萄、猕猴桃、番木瓜、鳄梨和浆果；以及观赏植物，包括开花观赏植物、观赏树木和灌木、观赏地被植物和观赏草类。优选的双子叶植物包括但不限于油菜、棉花、马铃薯、昆诺阿藜、苋、荞麦、红花、大豆、糖甜菜和向日葵，更优选大豆、油菜和棉花。优选的单子叶植物包括但不限于小麦、燕麦、大麦、玉米、黑麦、黑小麦、水稻、观赏草类和饲草、高粱、黍和甘蔗，更优选玉米、小麦和水稻。
[00160]植物转化中的最终目标是生产可用于人的植物。在这方面，本发明的转基因植物实际上可用于被认为对种植者或消费者有价值的任何用途。例如，人们可能希望收获转基因植物自身，或者收获用于种植目的的转基因植物的转基因种子，或者可由转基因植物或其种子获得产品，例如油、淀粉、乙醇或其它发酵产物、动物饲料或人类食品、药物以及各种工业产品。例如，玉米被广泛用于食品和饲料工业以及工业用途。玉米用途的其它论述可见于例如美国专利号6,194,636、6,207,879、6,232,526、6,426,446、6,429,357、6,433,252、6,437,217和6,583,338以及PCT公布号WO 95/06128和WO02/057471。因此，本发明还提供由本发明的转基因植物细胞、植物或种子生产的商品产品，包括但不限于收获的叶、根、枝、块茎、茎、果实、种子或其它植物部分、粗粉、油、提取物、发酵或消化产物、碾碎的或完整的植物粒或种子，或者任何食品或非食品产品，包括由本发明的转基因植物细胞、植物或种子生产的这些商品产品。在本文涉及的一种或多种商品或商品产品中的本发明重组DNA构建体的一种或多种核酸序列的检测实际上是商品或商品产品包含或来源于本发明的转基因植物细胞、植物或种子的证据。
[00161]在优选的实施方案中，在其基因组中具有本发明的重组DNA构建的转基因植物相对于没有该重组DNA构建体的植物具有至少一种额外的改变性状，所述性状选自以下性状：
(a)改善的非生物逆境耐受性；
(b)改善的生物逆境耐受性；
(c)改变的初级代谢物组成；
(d)改变的次级代谢物组成；
(e)改变的痕量元素、类胡罗卜素或维生素组成；
(f)改善的产量；
(g)改善的使用氮或其它营养的能力；
(h)改变的农艺性状；
(i)改变的生长或繁殖特征；和
(j)改善的收获、储存或加工品质。
[00162]在特别优选的实施方案中，转基因植物的特征在于：改善的非生物逆境耐受性(例如水分亏缺或干旱、热、冷、非最佳营养或盐水平、非最佳光照水平的耐受性)或生物逆境耐受性(例如拥挤、植化相克或受伤)；改变的初级代谢物(例如脂肪酸、油类化合物、氨基酸、蛋白质、糖或碳水化合物)组成；改变的次级代谢物(例如生物碱、萜类化合物、聚酮化合物、非核糖体肽和混合的生物合成源的次级代谢物)组成；改变的痕量元素(例如铁、锌)、类胡萝卜素(例如β-胡罗卜素、番茄红素、黄体素、玉米黄质或其它类胡萝卜素和叶黄素)或维生素(例如生育酚)组成；改善的产量(例如在非逆境条件下改善的产量或在生物或非生物逆境下改善的产量)；改善的使用氮或其它营养的能力；改变的农艺性状(例如延迟成熟；延迟衰老；早熟或晚熟；改善的耐荫性；改善的根或茎倒伏抗性；改善的茎“green snap”抗性；改变的光周期响应)；改变的生长或繁殖特征(例如有意矮化；例如可用于改善的杂交程序的有意雄性不育；改善的营养生长速率；改善的萌发；改善的雄性或雌性育性)；改善的收获、储存或加工品质(例如储存期间改善的耐虫性、改善的抗破坏性、改善的消费者吸引力)；或任何这些性状的组合。
[00163]在一个优选实施方案中，转基因种子或转基因植物生产的种子具有改变的初级代谢物(例如脂肪酸、油类化合物、氨基酸、蛋白质、糖或碳水化合物)组成；改变的次级代谢物(例如生物碱、萜类化合物、聚酮化合物、非核糖体肽和混合的生物合成源的次级代谢物)组成；改变的痕量元素(例如铁、锌)、类胡萝卜素(例如β-胡罗卜素、番茄红素、黄体素、玉米黄质或其它类胡萝卜素和叶黄素)或维生素(例如生育酚)组成；改善的收获、储存或加工品质，或这些的组合。例如，可能需要改变作物(例如油菜、棉花、红花、大豆、糖甜菜、向日葵、小麦、玉米或水稻)种子的氨基酸(例如赖氨酸、甲硫氨酸、色氨酸或总蛋白)、油类化合物(例如脂肪酸组合物或总油类化合物)、碳水化合物(例如单糖或淀粉)、痕量元素、类胡萝卜素或维生素含量，优选组合改善的种子收获、储存或加工品质，因此提供用于动物饲料或人类食物的改善的种子。在另一种情况下，可能需要改变转基因植物或转基因植物种子的天然组分的水平，例如降低具有低水平赖氨酸、甲硫氨酸或色氨酸的蛋白的水平，或增加需要的氨基酸或脂肪酸的水平，或降低变应原性蛋白或糖蛋白(例如花生变应原，包括arahl，小麦变应原，包括麸朊和麦谷蛋白，大豆变应原，包括P34变应原、球朊、大豆球蛋白和伴大豆球蛋白)或毒性代谢物(例如木薯中的生氰糖苷、茄科成员中的茄属生物碱)的水平。
实施例
实施例1
[00164]该实施例阐述了用于抑制至少一种靶基因的重组DNA构建体的非限制性实例；这些构建体在被设计成包含miRNA识别位点时允许在特定组织中表达基因抑制元件。
[00165]图1A图示了用于抑制至少一种靶基因的本发明重组DNA构建体的非限制性实例。这些构建体包含至少一个用于抑制至少一个第一种靶基因的第一种基因抑制元件(“GSE”或“GSE1”)，其中第一种基因抑制元件被嵌入到位于非蛋白编码DNA的一侧或两侧的内含子中。这些构建体使用内含子(在许多实施方案中，优选来源于5’非翻译区的内含子或增强表达的内含子)传递基因抑制元件，无需存在任何编码蛋白的外显子(编码序列)。构建体可任选地包含至少一个用于抑制至少一个第二种靶基因的第二种基因抑制元件(“GSE2”)，至少一个用于表达至少一个目标基因(其可为编码序列或非编码序列，或这二者)的基因表达元件(“GEE”)，或这二者。在包含任选的基因表达元件的实施方案中，基因表达元件可位于内含子外部(例如邻接内含子)。在某些实施方案中，包含第一种基因抑制元件的内含子处于终止子的3’。
[00166]为更清晰地区分本发明的重组DNA构建体(包含至少一个嵌入在非蛋白编码DNA的一侧或两侧的单个内含子中的基因抑制元件)和现有技术，图1B图示了现有技术的重组DNA构建体的实例。这些构建体可包含邻接位于蛋白编码序列侧翼的内含子定位或者位于两个分散的内含子之间(其中基因抑制元件没有嵌入在两个分散的内含子的任一个当中)的基因抑制元件，或者可包含含有嵌入在内含子当中的基因抑制元件的基因表达元件，所述内含子位于多个外显子(例如包含蛋白编码序列的外显子)侧翼。
[00167]图2图示了可用于本发明的重组DNA构建体的基因抑制元件和可转录的外源DNA的多个非限制性实例。在以单链画出之处(图2A-2E)，这些实例以5’-3’(左至右)转录方向常规显示；箭头表示反义序列(箭头的头指向左侧)或有义序列(箭头的头指向右侧)。这些基因抑制元件和可转录的外源DNA可包括：包含至少一个反义DNA区段的DNA，所述反义DNA区段对至少一个第一种靶基因的至少一个区段是反义的，或者包含多个拷贝的至少一个反义DNA区段的DNA，所述反义DNA区段对至少一个第一种靶基因的至少一个区段是反义的(图2A)；包含至少一个有义DNA区段的DNA，所述有义DNA区段为至少一个第一种靶基因的至少一个区段，或包含多个拷贝的至少一个有义DNA区段的DNA，所述有义DNA区段为至少一个第一种靶基因的至少一个区段(图2B)；转录为RNA的DNA，所述RNA通过形成双链RNA用于抑制至少一个第一种靶基因，所述DNA包含至少一个反义DNA区段和至少一个有义DNA区段，所述反义DNA区段对至少一个第一种靶基因的至少一个区段是反义的，所述有义DNA区段为至少一个第一种靶基因的至少一个区段(图2C)；转录为RNA的DNA，所述RNA通过形成单个双链RNA用于抑制至少一个第一种靶基因，所述DNA包含多个连续的反义DNA区段和多个连续的有义DNA区段，所述反义DNA区段对至少一个第一种靶基因的至少一个区段是反义的，所述有义DNA区段为至少一个第一种靶基因的至少一个区段(图2D)；转录为RNA的DNA，所述RNA通过形成多个双链RNA用于抑制至少一个第一种靶基因，所述DNA包含多个反义DNA区段和多个有义DNA区段，所述反义DNA区段对至少一个第一种靶基因的至少一个区段是反义的，所述有义DNA区段为至少一个第一种靶基因的至少一个区段，其中所述多个反义DNA区段和多个有义DNA区段以一系列反向重复序列排列(图2E)；以及包含来源于miRNA的核苷酸的DNA，或包含siRNA的核苷酸的DNA(图2F)。
[00168]图2F图示了可由基因抑制元件的实施方案转录的双链RNA和可用于本发明的重组DNA构建体的可转录外源DNA的多个非限制性排列。当形成此双链RNA时，其可抑制一种或多种靶基因，并可以形成单个双链RNA或多个双链RNA，或单个双链RNA“茎”或多个“茎”。当形成多个双链RNA“茎”时，它们可为“锤头”或“三叶草”排列。在某些实施方案中，双链茎可形成“假结体”排列(例如在一个双链茎的间隔物或环RNA形成第二个双链茎的部分的情况下)；参见例如在Staple和Butcher(2005)PLoS Biol.，3(6)：e213中的假结体结构的描绘。间隔DNA(位于dsRNA区之间或邻接dsRNA区)是任选的，但通常被包含在内，其一般含有不对应于靶基因的DNA(尽管在某些实施方案中其可以包含靶基因的有义或反义DNA)。间隔DNA可以包含转录为单链RNA或至少部分双链RNA(例如为“相吻茎-环”排列)的序列，或转录为采取次级结构或三维构象(例如靶基因或适体的反义序列的大环)的RNA的序列，所述次级结构或三维构象赋予转录物额外的需要特征，例如增加的稳定性、增加的体内半衰期或细胞或者组织特异性。
实施例2
[00169]该实施例描述了一种通过测定miRNA表达模式测定潜在有用的miRNA识别位点的非限制性方法。给定miRNA表达的空间或时间分布的信息例如可用于设计要以空间或时间特异性方式表达的重组构建体。该实施例公开了在玉米中的成熟miRNA表达模式，并提供针对这些miRNA的识别位点的序列，所述miRNA适于包含在于玉米和其它植物中有用的重组DNA构建体中。
[00170]总RNA使用Trizol(Invitrogen，Carlsbad，CA)由LH244玉米植物分离。使用7个发育阶段，包括来自萌发秧苗的根和枝分生组织、幼年(V1-V2)和成年叶(V7-V8)、柄节间、脱落前的穗和不成熟(约1”)穗。如Allen等(2004)Nat.Genet.，36：1282-1290所述将5μg总RNA在17％ PAGE-尿素上解析。印迹用对小RNA序列为反义的并使用Optikinase(USB)用γ32P-ATP末端标记的DNA寡核苷酸探测。使用的探针以及它们的相应序列在表1给出。
表1
 
SEQ ID NO. 序列 miRNA
1 GTGCTCACTCTCTTCTGTCA miR156、miR157
2 TAGAGCTCCCTTCAATCCAAA miR159
3 TGGCATCCAGGGAGCCAGGCA miR160
4 CTGGATGCAGAGGTTTATCGA miR162
5 TGCACGTGCCCTGCTTCTCCA miR164
6 GGGGAATGAAGCCTGGTCCGA miR166
7 TAGATCATGCTGGCAGCTTCA miR167
8 TTCCCGACCTGCACCAAGCGA miR168
9 TCGGCAAGTCATCCTTGGCTG miR169
10 GATATTGGCGCGGCTCAATCA miR171
11 CTGCAGCATCATCAAGATTCT miR172
12 GGCGCTATCCCTCCTGAGCTT miR390
13 GATCAATGCGATCCCTTTGGA miR393
14 TGGGGTCCTTACAAGGTCAAGA TAS35’D7(+)
15 GGAGGTGGACAGAATGCCAA miR394
16 GAGTTCCCCCAAACACTTCAC miR395
17 CATCAACGCTGCGCTCAATGA miR397
18 CGGGGGCGACCTGAGAACACA miR398
19 AGCCAGGGAAGAGGCAGTGCA miR408
[00171]结果示于图3。一个探针(SEQ ID NO.1)与两个家族(miR156和miR157)的成熟miRNA杂交。个体成熟miRNA以不同水平在特定细胞或组织中表达。例如，Zm-miR390在根和成熟叶中不表达或仅以低水平表达。
实施例3
[00172]该非限制性实施例描述了本发明的重组DNA构建体，其可用于在多细胞真核生物的特定细胞或来源于多细胞真核生物的特定细胞(例如植物细胞或动物细胞)中抑制靶RNA表达，以及它们的使用方法。构建体包含与转录为RNA的DNA有效连接的启动子，所述DNA包含可由成熟miRNA识别的至少一个外源miRNA识别位点，所述成熟miRNA在多细胞真核生物的特定细胞中表达，以及在特定细胞中被抑制的靶RNA，其中所述靶RNA在非特定细胞的多细胞真核生物的细胞中表达。
[00173]业已鉴别出几乎在所有植物细胞中表达的强组成型启动子(例如CaMC 35S、OsAct)，但强空间特异性(细胞或组织特异性)和时间特异性启动子还没有被充分表征。为了在没有强细胞或组织特异性启动子的情况下将靶RNA或转基因表达限于特定细胞或组织类型，可能需要在选定的细胞或组织中抑制处于组成型启动子控制之下的转录物的表达。本发明提供使用内源miRNA的识别序列抑制组成型表达的靶RNA在特定细胞中表达的方法。
[00174]本发明的方法允许空间或时间特异性地转录后控制靶RNA的表达，其中转录由非特异性(例如组成型)启动子驱动。本发明的方法例如允许通过组成型启动子或在期望的细胞或组织类型之外具有表达的启动子转录的基因受限表达。受限的表达可为空间或时间受限的，例如限于特定的组织或细胞类型或模式(file)，或限于特定的发育、繁殖、生长或季节阶段。在miRNA于特定条件(例如在生物逆境下，例如拥挤、植化相克作用或害虫或病原体侵扰，或非生物逆境下，例如热或冷胁迫、干旱胁迫、营养胁迫、重金属或盐胁迫)下表达时，对应的miRNA识别位点可用于条件化特异性抑制，即抑制处于特定条件下的靶RNA。
[00175]例如，Zm-miR 162在玉米根中表达差(参见实施例2和图3)，因此，设计表达构建体以包含邻接组成型表达的靶RNA或在组成型表达的靶RNA中的外源miRNA162识别位点可将靶RNA转录物累积限制在除了根以外的所有玉米植物细胞中。在其中表达给定的成熟miRNA的细胞中需要受限的表达的情况下，该方法对多细胞真核生物(植物和动物)中的所有基因表达应用都有用。
[00176]在包括植物在内的多细胞真核生物中，微RNA(miRNA)通过可为空间或时间特异性的转录后切割机制调节内源基因。本发明提供一些方法，借助这些方法将miRNA识别位点加入组成型表达的转基因可用于将转基因的表达限于没有互补成熟miRNA的细胞或远离那些在空间或时间上(包括条件化地)表达互补成熟miRNA的细胞的细胞。这些miRNA识别位点在导入转基因植物细胞或来源于这些细胞的转基因植物的新转录物中的操作对改变新转基因的表达模式有用。
[00177]在替代方法中，现有的(天然或内源)miRNA识别位点被突变(例如通过化学诱变)，足以减少或阻止切割(参见Mallory等(2004)Curr.Biol.，14：1035-1046)。以此方式，具有期望的作用(例如增加叶或种子大小)的靶RNA序列可以比存在天然或内源miRNA识别位点时高的水平表达。一个实施方案是用工程化的同源物置换天然基因，其中天然miRNA已被突变乃至去除，也就是说对给定miRNA的切割不敏感。
[00178]所述方法的一个实施方案是将至少一个外源miRNA识别位点(通常21个核苷酸序列)导入靶RNA的5′或3’非翻译区或靶RNA当中。在靶RNA包含编码序列的情况下，至少一个外源miRNA识别位点可被导入到靶RNA的编码区中。这导致在表达对应成熟miRNA的组织或细胞类型中的靶RNA表达降低。通过在靶RNA转录物中包含对应于成熟miRNA的识别位点，有可能调节靶RNA的表达，以至于甚至在组成型启动子控制之下靶RNA也仅在选定的细胞或组织中或在选定的时间段中表达。这使得可以既用强组成型启动子获得高表达水平，又使此表达有空间或时间限制。
[00179]可使用任何miRNA识别位点，优选其中已确定对应的成熟miRNA的表达适于需要的靶RNA表达或抑制的情况。已知众多的miRNA识别序列。参见例如Jones-Rhoades和Bartel(2004).Mol.Cell，14：787-799，Rhoades等(2002)Cell， 110：513-520，Allen等(2004)Nat.Genet.，36：1282-1290)。还参见ASRP在线数据库(Gustafson等(2005)Nucleic Acids Res.，33：D6379-D640)。可用于本发明的构建体和方法的miRNA识别位点的非限制性实例包括在表2中提供的那些，表2给出了所示miRNA家族的识别位点序列，并指示了在“所有植物”(即低级植物、单子叶植物和双子叶植物)、单子叶植物和/或双子叶植物之间的分布。鉴定出miRNA的植物物种和使用的缩写为：拟南芥(Arabidopsis thaliana)(At)、大豆(Glycine max)(Gm)、陆地棉(Gossypiumhirsutum)(Gh)、大麦(Hordeum vulgare)(Hv)、番茄(Lycopersicumesculentum)(Le)、百脉根日本变种(Lotus corniculatus var.japonicus)(与“Lotus japonicus”同义)(Lj)、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)(Mt)、Mesembryanthemum crystallinum(Mc)、水稻(Oryza sativa)(Os)、珍珠粟(Pennisetum glaucum)(Pg)、菜豆(Phaseolus vulgaris)(Pv)、欧洲山杨(Populus tremula)(Pt)、甘蔗(Saccharum officinarum)(So)、高粱(Sorghumbicolor)(Sb)、可可(Theobroma cacao)(Tc)、小麦(Triticum aestivum)(Ta)、葡萄(Vitis vinifera)(Vv)和玉米(Zea mays)(Zm)。
表2
Figure A200680046237D00831
Figure A200680046237D00841
Figure A200680046237D00851
Figure A200680046237D00861
Figure A200680046237D00881
Figure A200680046237D00891
[00180]因此，预期表达重组DNA构建体的转基因植物应相对于在其它组织中的表达在根和成熟叶中显示出靶RNA表达的抑制，所述重组DNA构建体在组成型启动子(例如35S启动子)控制之下转录为含Zm-miR390识别位点和靶RNA的RNA。
[00181]在另一个实例中，Zm-miR172以高水平在柄中表达，在其它组织中不表达或仅以低水平表达。预期表达构建体的转基因植物应在非柄(其中靶RNA的表达应受到抑制)的组织中以较高水平表达靶RNA，所述构建体在强组成型启动子(例如CaMV 35S启动子)控制之下转录为含Zm-miR172识别位点和靶RNA的RNA。
[00182]为阐述本发明的构建体和方法控制目标基因表达的应用，使用报告基因作为目标基因自身，或作为目标基因的替代。例如，在需要于玉米柄和不成熟穗组织中表达报告基因(例如绿色荧光蛋白，GFP)时，miR156靶位点包含在GFP表达盒中，并在处于CaMV 35S启动子控制之下的稳定转基因玉米植株中表达。在其它组织(例如根、叶和穗)中，GFP表达被抑制。抑制表型可限于被抑制组织中非常特定的细胞类型，邻近表达成熟miR156的那些细胞的邻近细胞显示出GFP表达或表达梯度。
[00183]在另一个实施例中，使用强组成型启动子驱动苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)杀虫蛋白或蛋白片段(“Bt”)的表达，其中在花粉中特异性表达的miRNA的识别位点包含在构建体中，在除了花粉以外的植物组织中产生强Bt表达。
[00184]所述方法的一个特定的非限制性实例是将在根中不表达(或仅以低水平表达)的至少一个miRNA的识别位点纳入重组DNA构建体中，该重组DNA构建体包含其表达仅在根中需要的靶RNA。强组成型启动子(例如增强的35S)仍可使用，但靶RNA的表达现在限于不表达对应的成熟miRNA的细胞。该方法的具体实例是在重组DNA构建体中包含玉米miRNA162、玉米miRNA164或玉米miRNA390识别位点(或其任何组合)，用于例如在包含表达盒e35S/Bt/hsp17的构建体中表达作为靶RNA的苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白或蛋白片段(“Bt”，参见例如在美国专利号6,953,835和2005年8月31日申请的美国临时专利申请号60/713,111中公开的苏云金芽孢杆菌杀虫序列及其使用方法)。这些miRNA(例如miRNA162、miRNA164或miRNA390)基本上不在玉米根中表达，但在大部分其它组织中表达。在表达盒中包含这些识别位点中的一个或多个降低了非根的大部分组织中的转录物表达，但在根中保持了高水平的Bt靶RNA表达，例如是控制诸如玉米根虫的害虫所需要的。在类似的实施方案中，不同miRNA识别位点的组合包含在构建体中，以便在一个或多个特定组织中实现需要的表达模式。
[00185]包含外源miRNA识别位点的可转录DNA序列的非限制性具体实例示于图4和图5。图4图示了靶向叶绿体TIC809，其具有位于3’非翻译区(SEQ ID NO.176)的miRNA162识别位点(以粗体文本表示)。图5图示了非靶向的TIC809，其具有位于3’非翻译区(SEQID NO.177)的miRNA164识别位点(以粗体文本表示)。
实施例4
[00186]该实施例描述了具有组织特异性表达的作物MIR基因的鉴别和miR基因启动子的鉴别。更具体地说，该实施例描述了作为鉴别雌性生殖组织(胚乳)中特异性表达的miRNA的非限制性方法的转录谱，以及具有胚乳特异性表达的玉米miR167启动子序列的鉴别。对应于该miRNA的识别位点例如可用于制备具有符合本发明的可诱导雌性不育的转基因植物。
[00187]已发现MIR167基因家族(SEQ ID NO.178)成员占由发育中的玉米胚乳克隆的小RNA群的约1/4。为确定所观察到的强胚乳表达是否由单个MIR167基因家族成员引起，通过RT-PCR分析几个MIR167基因。在公共的miRNA注册处(‘miRBase”，可于microRNA.sanger.ac.uk/sequences在线获得)发现9个玉米MIR167茎-环序列，以miR167a-miR167i列出。使用首链cDNA合成的基因特异性引物对玉米miR167序列中的几个进行组织特异性RT-PCR，接着用基因特异性引物对进行PCR。胚乳的miR167g表达强且是组织特异性的(授粉后15、20天)。
[00188]为确定miR167g是否在胚乳中丰富表达，准备玉米(LH59)的RNA印迹。印迹用末端标记的成熟miR167 22聚体LNA探针探测(图6A)，剥离，并用约400bp的miR167g基因特异性探针再探测(图6B)。观察到的强胚乳信号表明，miR167g主要引起胚乳增强的表达。玉米组织的转录谱证实了RNA印迹结果(图6C)；对应于miR167g的转录物在胚乳组织中丰富且特异性地表达。
[00189]可公开得自GenBank并具有登录号DR827873.1(GI：71446823)的804个碱基对的cDNA序列(注释为“ZM_BFb0071I20.r ZM_BFb Zea mays cDNA 5′，mRNA序列”)在此引入作为参考。该序列包含对应于成熟miR167g的区段(SEQ ID NO.178)。使用公共序列对专利性玉米基因组序列进行生物信息分析。包含玉米近交系B73的序列的4.75kb基因组聚类被鉴别为包含预测的miR167a和miR167g的基因序列。两个MIR167基因之间的486个碱基对区被鉴别为与表达序列标签(EST)序列具有同源性。在两个(miR167a和miR167g)预测转录物的上游序列中鉴定到了启动子基序。预测的miR167a和miR167g转录物之间的1682个碱基对的区域(SEQID NO.179)以及EST和预测的miR167g转录物之间的674个碱基对的较小区域(SEQ ID NO.180)被鉴别为miR167g启动子序列。这些序列的部分(例如SEQ ID NO.179或SEQ ID NO.180的至少约50个、约100个、约150个、约200个、约250或约300个核苷酸，或者与SEQ ID NO.179或SEQ ID NO.180的区段具有至少85％、至少90％或至少95％的同一性的至少约50个、约100个、约150个和约200个连续核苷酸的片段)也可用作启动子；它们的启动子作用可通过本领域众所周知的方法证实(例如驱动萤光素酶或绿色荧光蛋白之类的报告基因的表达)。该基因组聚类的注释图，包括miR167a和miR167g基因以及成熟miRNA和启动子元件(例如TATA盒)的定位，示于图7。注释图还显示了植物生长激素响应因子(ARF)基序或具有序列TGTCTC(SEQ ID NO.181)的植物生长激素响应元件的位置，该位置表明植物生长激素可调节miR167g的表达。成熟miR167miRNA与ARF6和ARF8(其编码活化的ARF)互补，已被提出调节植物生长激素稳态；参见例如Rhoades等(2002)Cell，110：513-520，Bartel和Bartel(2003)Plant Physiol.，132：709-717，Ulmasov等(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96：5844-5849，和Mallory等(2005)Plant Cell，17：1360-1375。
[00190]除了由玉米近交系B73鉴定的miR167g启动子序列(SEQID NO.179和SEQ ID NO.180)之外，由玉米近交系LH244扩增两个另外的miR167g启动子序列(SEQ ID NO.182和SEQ ID NO.183)。SEQ ID NO.182和SEQ ID NO.183的3′末端通过miR167g的5′RACE(cDNA末端的快速扩增，Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)经试验确定。768个碱基对序列(SEQ ID NO.182)的5′末端对应于可由GenBank公开获得并具有登录号CF035345.1(GI：32930533)的481个碱基对的cDNA序列(注释为“QCG17c03.yg QCG玉米cDNA克隆QCG17c03，mRNA序列”)的末端。407个碱基对序列(SEQ ID NO.183)的5′末端对应于可由GenBank公开获得并具有登录号DN214085.1(GI：60347112)的746个碱基对的cDNA序列(注释为“MEST991_A06.T7-1 UGA-ZmSAM-XZ2玉米cDNA，mRNA序列”)的末端。
[00191]本文描述的miR167g启动子序列、miR167g基因、成熟miR167g微RNA和miR167g识别位点(其实例包含在以下的表6中)具有多种用途，如在本文公开内容中的它处所述。具体地说，miR167g启动子可用作胚乳特异性启动子，并可用于例如置换玉米B32启动子。在另一种用途中，miR167g序列或成熟miR167g(或其前体)被工程化，以抑制靶基因，尤其是抑制将为胚乳特异性的情况。miR167g识别位点可用于例如其中基因要在非胚乳的组织中表达的基因表达构建体，尤其可用于制备具有符合本发明的可诱导雌性不育的转基因植物。
实施例5
[00192]当前用于miRNA鉴别的标准一直强调种间miRNA的系统发生保守性，因此已在植物中表征了几个非保守的或种特异性的miRNA。该实施例描述了用于鉴别miRNA的非限制性方法、它们的组织表达谱、它们对应的识别位点和靶的实例。
[00193]由从大豆叶构建的大小分级的cDNA文库中鉴别出5个新的非保守miRNA和对应的MIR序列。用于miRNA鉴别的标准包括：(1)克隆的21个核苷酸的小RNA，以及为较低丰度的可能的miRNA*(对应于miRNA的链)，(2)保留完全处于短的不完全回折结构中的miRNA/miRNA*双链体，(3)miRNA由RNA PolII非蛋白编码转录物衍生，和(4)在编码基因中存在互补靶位点；参见Ambros等(2003)RNA，9：277-279。
[00194]由包含衔接物的原始序列切下小RNA，测定它们的链。过滤该序列组，以去除为病毒tRNA、rRNA、叶绿体和线粒体RNA的小RNA序列和转基因，产生一组过滤的381,633个推定miRNA序列。将没有来源于以上来源和不与已知miRNA同源的小RNA作图至参比大豆cDNA序列。对于具有低蛋白编码内容物的作图的cDNA序列，含推定miRNA的约250个核苷酸的cDNA序列片段使用RNAFolder折叠。检验回折结构，以核查小RNA是否位于茎中，以及具有较低丰度的广泛(但不完全)互补的小RNA是否位于茎的对侧。小RNA的潜在靶基于由Jones-Rhoades和Bartel(2004)Mol.Cell，14：787-799，和Zhang(2005)Nucleic Acids Res.，33：W701-704修改的规则预测。表3列出了由大豆叶组织克隆的5个新的非保守的miRNA，以及每个对应的miRNA*和前体pri-miRNA；丰度(“abund”)以在总共381,633个序列中出现的序列次数给出。
表3
Figure A200680046237D00941
[00195]对于每个新的大豆miRNA，miRNA前体序列的回折结构都通过算法(“RNAFolder”，基于RNAfold，其在www.tbi.univie.ac.at/～ivo/RNA/RNAfold.html可公开获得)预测，并在可得到时获得miRNA前体转录谱，如表4所列出的。针对其中两种miRNA(SEQ ID NO.184和SEQ ID NO.187)，鉴别出在大豆中的预测靶(识别位点)的实例以及所鉴别的它们的表达模式。
表4
 
miRNASEQ IDNO.    miRNA前体  miRNA前体回折      miRNA前体转录谱       预测的玉米靶(识别位点)序列    预测的靶表达谱    
184 186 参见图8A 参见图8B 多酚氧化酶(SEQ IDNO.200)     参见图8C    
187 189 参见图9A -- 多酚氧化酶(SEQ IDNO.201)     参见图9B    
190 192 参见图10 -- -- --
193 195 参见图11 -- -- --
196 198，199   参见图12A 参见图12B    -- --
[00196]另外，由内部(“MRTC”)大豆数据库鉴别出每个新的大豆miRNA的靶(识别位点)序列，列于表5。每个识别位点和对应的成熟miRNA序列之间的错配核苷酸数在1-6个错配之间，其可包括空位或“遗漏的”核苷酸。例如，空位存在于SEQ ID NO.220、SEQ ID NO.221、SEQ ID NO.223、SEQ ID NO.224和SEQ ID NO.225的每一个中的核苷酸7和8之间。
表5
Figure A200680046237D00951
Figure A200680046237D00971
Figure A200680046237D00981
Figure A200680046237D00991
实施例6
[00197]该实施例描述了用于鉴别miRNA的非限制性方法，所述miRNA用于制备具有本发明方法可用的可诱导不育的转基因植物。更具体地说，通过评价转录谱(TxP)数据鉴别在期望的组织(即雄性或雌性生殖组织)中具有表达模式的miRNA。
[00198]用于鉴别在期望的组织(即雄性或雌性生殖组织)中具有表达模式的miRNA的一个通用方法包括以下步骤：
(a)提供初始miR序列，其包含茎-环区，例如来自‘miRBase数据库(可在microRNA.sanger.ac.uk/sequences在线获得)的公开可获得的miR序列；
(b)应用序列分析算法，例如本领域众所周知的BLAST(参见Altschul等(1990)J.Mol.Biol.，215：403-410)，以鉴别同源或相同的序列(例如来自用玉米完整基因组DNA制作的微阵列探针组上的专利序列)；和
(c)分析步骤(b)中鉴别的同源探针组序列的转录谱，并鉴别在期望的组织(即雄性或雌性生殖组织)中具有表达模式的miRNA。
[00199]优选地，加入第4步：
(d)对于被发现具有期望的转录谱的同源探针组序列，通过比对初始miR序列的茎-环序列和探针组序列证实miRNA基因的鉴别，或者对于潜在的新的miRNA，确定预测被折叠为miRNA的茎-环结构特征的序列。还优选使用任选的步骤，其中包含对非探针组序列数据集的额外序列数据集的一个或多个BLAST比较(在以上的步骤(b)之前)，使得可以进一步鉴别落在预测的miR基因回折区之外的探针；通过它们没有miRNA特征如正确的回折结构来鉴别假阳性并去除，所述假阳性例如缘于包含不正确剪接的DNA大片段(contig)的额外序列数据集中的匹配。
[00200]将以上方法应用于玉米的专利转录谱数据。图13和14图示了探针组序列的转录谱，其被鉴别为包含即在雌性生殖组织(图13)或在雄性生殖组织(图14)中具有需要的表达模式的miRNA基因。几个miRNA基因和它们对应的识别位点的实例被鉴别为对制备具有可诱导不育性的转基因植物有用(表6)。miR166家族的2个成员miR166b和miR166d共有相同的成熟miRNA序列和对应的识别位点，但显示出不同的表达模式，miR166b仅在胚中表达，而miR166d在胚珠、胚、穗丝和根中表达；因此对制备可诱导的雌性不育植物而言，应优选miR166b。可用于制备可诱导的雌性不育植物的miRNA的一个特别优选的实施方案为玉米胚乳特异性miR167g(SEQ ID NO.307)，其在3’末端上有或没有额外的G；在3’末端上有额外的G的实施方案为以GG为末端的22聚体，并具有对应的识别位点，该识别位点在核苷酸加入到优选错配(即不是C)的5’末端的情况下优选也为22聚体。除了这些和相似的miRNA以及它们的对应识别位点用于制备和使用可诱导不育的转基因植物的有用性之外，这些成熟miRNA的启动子也可用于驱动期望在生殖组织中特异性表达的转基因的表达，例如miR167g启动子可用于驱动胚乳特异性表达。
表6
Figure A200680046237D01011
Figure A200680046237D01021
Figure A200680046237D01031
Figure A200680046237D01041
实施例7
[00201]这是重组DNA构建体制备方法的非限制性实例，所述重组DNA构建体可用于制备可诱导不育的转基因植物，转录为RNA，所述重组DNA构建体包含：(a)至少一个可由成熟miRNA识别的外源miRNA识别位点，所述成熟miRNA在植物的生殖组织中特异性表达；和(b)编码赋予除草剂耐受性的蛋白的信使RNA；其中成熟miRNA在生殖组织中特异性抑制该蛋白的表达，其中转基因植物的不育性通过向植物施用除草剂诱导。在此阐述了设计用于此重组DNA构建体的miRNA识别位点的方法的非限制性实例，其中所述植物为玉米，赋予除草剂耐受性的蛋白为5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶；类似方法可用于其它植物和其它蛋白。
[00202]该方法包括以下步骤：
(a)选择至少18个核苷酸的独特靶序列，其对编码5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的信使RNA是特异性的。一种方法是使用BLAST检索(例如玉米cDNA和基因组DNA数据库这二者的BLAST检索)，以鉴别EPSPS直系同源物和对不相关基因的任何潜在匹配，由此避免无意的非靶序列沉默。
(b)分析信使RNA的不需要的序列(例如匹配非靶物种、尤其是动物的序列)，记录每个潜在19聚体区段的GC含量、Reynolds记分(参见Reynolds等(2004)Nature Biotechnol.，22：326-330)，并通过自由能(“ΔΔG”)的负差表征功能不对称(参见Khvorova等(2003)Cell，115：209-216)。优选地，选择具有全部或大部分以下特征的19聚体：(1)Reynolds记分>4，(2)GC含量在约40％至约60％之间，(3)负ΔΔG，(4)末端腺嘌呤，(5)没有4个或更多个相同核苷酸的连续排列；(6)邻近靶基因的3’末端定位。优选地，选择多个(3个或以上)19聚体进行测试。
(c)测定用于制备合成的21聚体miRNA的选定19聚体的反向互补物；在20位的附加核苷酸优选与选定的靶序列匹配，优选选择在21位的核苷酸为不配对的，以防止传递性。
(d)例如在瞬时烟草本塞姆氏(Nicotiana benthamiana)测定中测试合成的miRNA的miRNA表达和靶抑制。
(e)将最有效的miRNA克隆入构建体中，用于玉米的稳定转化(参见在“制备和使用重组DNA构建体”和“制备和使用转基因植物细胞和转基因植物”之下的章节)。
实施例8
[00203]该实施例描述了制备可诱导不育的转基因植物以及它们在生产杂种种子中的应用。更具体地说，该实施例描述了由可诱导的雄性不育的转基因玉米亲代植物和可诱导的雌性不育的转基因玉米亲代植物生产杂种玉米种子，其中不育性通过向亲代植物应用除草剂草甘膦诱导。
[00204]重组DNA构建体被设计成转录为(a)可由成熟miRNA识别的外源miRNA识别位点，所述成熟miRNA在植物的生殖组织中特异性表达；和(b)编码赋予除草剂(草甘膦)耐受性的蛋白(5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶)的信使RNA；其中成熟miRNA特异性抑制生殖组织中的蛋白的表达，其中转基因植物的不育性可通过向植物施用除草剂诱导。每个重组DNA构建体都包含转录为编码根癌土壤杆菌菌株CP4(“EPSPS-CP4”)的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶的信使RNA的序列：ATGCTTCACGGTGCAAGCAGCCGTCCAGCAACTGCTCGTAAGTCCTCTGGTCTTTCTGGAACCGTCCGTATTCCAGGTGACAAGTCTATCTCCCACAGGTCCTTCATGTTTGGAGGTCTCGCTAGCGGTGAAACTCGTATCACCGGTCTTTTGGAAGGTGAAGATGTTATCAACACTGGTAAGGCTATGCAAGCTATGGGTGCCAGAATCCGTAAGGAAGGTGATACTTGGATCATTGATGGTGTTGGTAACGGTGGACTCCTTGCTCCTGAGGCTCCTCTCGATTTCGGTAACGCTGCAACTGGTTGCCGTTTGACTATGGGTCTTGTTGGTGTTTACGATTTCGATAGCACTTTCATTGGTGACGCTTCTCTCACTAAGCGTCCAATGGGTCGTGTGTTGAACCCACTTCGCGAAATGGGTGTGCAGGTGAAGTCTGAAGACGGTGATCGTCTTCCAGTTACCTTGCGTGGACCAAAGACTCCAACGCCAATCACCTACAGGGTACCTATGGCTTCCGCTCAAGTGAAGTCCGCTGTTCTGCTTGCTGGTCTCAACACCCCAGGTATCACCACTGTTATCGAGCCAATCATGACTCGTGACCACACTGAAAAGATGCTTCAAGGTTTTGGTGCTAACCTTACCGTTGAGACTGATGCTGACGGTGTGCGTACCATCCGTCTTGAAGGTCGTGGTAAGCTCACCGGTCAAGTGATTGATGTTCCAGGTGATCCATCCTCTACTGCTTTCCCATTGGTTGCTGCCTTGCTTGTTCCAGGTTCCGACGTCACCATCCTTAACGTTTTGATGAACCCAACCCGTACTGGTCTCATCTTGACTCTGCAGGAAATGGGTGCCGACATCGAAGTGATCAACCCACGTCTTGCTGGTGGAGAAGACGTGGCTGACTTGCGTGTTCGTTCTTCTACTTTGAAGGGTGTTACTGTTCCAGAAGACCGTGCTCCTTCTATGATCGACGAGTATCCAATTCTCGCTGTTGCAGCTGCATTCGCTGAAGGTGCTACCGTTATGAACGGTTTGGAAGAACTCCGTGTTAAGGAAAGCGACCGTCTTTCTGCTGTCGCAAACGGTCTCAAGCTCAACGGTGTTGATTGCGATGAAGGTGAGACTTCTCTCGTCGTGCGTGGTCGTCCTGACGGTAAGGGTCTCGGTAACGCTTCTGGAGCAGCTGTCGCTACCCACCTCGATCACCGTATCGCTATGAGCTTCCTCGTTATGGGTCTCGTTTCTGAAAACCCTGTTACTGTTGATGATGCTACTATGATCGCTACTAGCTTCCCAGAGTTCATGGATTTGATGGCTGGTCTTGGAGCTAAGATCGAACTCTCCGACACTAAGGCTGCTTGA(SEQ ID NO.344)。为便于克隆，每个重组DNA构建体还包含位于信使RNA和终止子之间的3’非翻译区(3’UTR)间隔序列TgagctcAAGAATTCGAGCTCGGTACCggatccTCTAGCTAG(SEQ IDNO.345，SacI和BamHI限制位点由小写字母表示)，其允许在SacI和BamHI限制位点之间插入miRNA识别位点。
[00205]用于可诱导的雄性不育的重组DNA构建体包含序列TgagctcAAGAATTCGAAGACAATGCGATCCCUUUGGAGCTCGGTACCggatccTCTAGCTAG(SEQ ID NO.346，SacI和BamHI限制位点由小写字母指示)，其包含合成的miRNA识别位点(由下划线文本指示)，设计用于被miR393识别，miR393在花粉中高度表达(参见实施例6)，是相对小的miRNA家族的成员(降低了相同miRNA家族的其它成员在非花粉的组织中抑制EPSPS-CP4的可能性)。
[00206]用于可诱导的雌性不育的重组DNA构建体包含序列TgagctcAAGAATTCGATCCGCTTTCTCTCTTCTGTCAGCTCGGTACCggatccTCTAGCTAG(SEQ ID NO.347，SacI和BamHI限制位点由小写字母指示)，其包含合成的miRNA识别位点(由下划线文本指示)，设计用于被miR156j识别，miR156j在胚珠和早期籽粒中高度表达(参见实施例6)。该miRNA识别位点在14位包含独特的碱基，其可以优先与靶序列配对，以改善miR156j识别的特异性。与miRNA的3’末端配对被减少(相对于内源靶)，改善了miR156j识别的特异性。这降低了miR156家族的其它成员在非胚珠和早期籽粒的组织中抑制EPSPS-CP4的可能性。
[00207]两个重组DNA构建体(用于可诱导的雄性不育和可诱导的雌性不育)中的每一个都独立地被转化入玉米，如在“制备和使用转基因植物细胞和转基因植物”之下所述。简而言之，针对每个重组DNA构建体制备用于植物转化的载体，如在“制备和使用重组DNA构建体”之下所述，并使用土壤杆菌介导的转化和草甘膦选择用于转化玉米植物组织。每个转基因插入事件的转基因植物都培育至成熟，子代种子通过常规自交或杂交生产(如在“制备和使用转基因植物细胞和转基因植物”之下所述)。子代种子任选地包含赋予额外性状(例如就转化植物而言，性状包括除草剂抗性、抗虫性、发芽耐冷性、水分亏缺耐受性等)的其它重组DNA。由这些子代种子选择可培育成第一种亲代植物(在其基因组中包含用于可诱导的雄性不育的重组DNA构建体)的转基因种子和可培育成第二种亲代植物(在其基因组中包含用于可诱导的雌性不育的重组DNA构建体)的转基因种子。
[00208]在大田中进行混合种植，具有用于可诱导的雄性不育的构建体的转基因玉米种子对具有用于可诱导的雄性不育的构建体的转基因种子的比率为约1:4至约1:10。使转基因玉米种子发芽，由此提供具有可诱导的雄性不育的第一种亲代植物(即需要授粉的亲代植物)和具有可诱导的雌性不育的第二种亲代植物(即授粉亲代植物)。在适宜的植物发育阶段，通过喷雾向第一种和第二种亲代植物施用有效诱导第一种亲代植物的雄性不育和第二种亲代植物的雌性不育的量的除草剂草甘膦。由大田收集的种子为由第一种亲代植物的胚珠生产的杂种种子，所述胚珠由第二种亲代植物的花粉授粉。
[00209]本文公开并要求保护的所有材料和方法都可以按照以上公开内容的说明获得和使用，无需过度不当试验。尽管已依据优选实施方案和说明性实施例描述了本发明的材料和方法，但对本领域技术人员显而易见的是，在不偏离本发明的概念、精神和范围的情况下，可对本文描述的材料和方法实施改变。所有这些对本领域技术人员显而易见的类似置换和修改都被认为属于由随附权利要求书限定的本发明的精神、范围和概念。
序列表
<110>Allen，Edwards
     Gilbertson，Larry A
     Houmard，Nancy M.
     Huang，Shihshieh
     Ivashuta，Sergey I.
     Roberts，James K.
<120>生产杂种种子的方法
<130>38-21(54232)C
<150>60/726,106
<151>2005-10-13
<150>60/836,246
<151>2006-08-07
<160>347
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>1
Figure A200680046237D01091
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>2
Figure A200680046237D01092
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>3
Figure A200680046237D01101
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>4
Figure A200680046237D01102
<210>5
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>5
Figure A200680046237D01103
<210>6
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>合成构建体
<400>6
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<210>7
<211>21
<212>DNA
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<400>7
Figure A200680046237D01111
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<211>21
<212>DNA
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<220>
<223>合成构建体
<400>8
<210>9
<211>21
<212>DNA
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<220>
<223>合成构建体
<400>9
Figure A200680046237D01113
<210>10
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>10
Figure A200680046237D01114
<210>11
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>11
Figure A200680046237D01115
<210>12
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>12
Figure A200680046237D01121
<210>13
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>13
Figure A200680046237D01122
<210>14
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>14
Figure A200680046237D01123
<210>15
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>15
Figure A200680046237D01124
<210>16
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>16
Figure A200680046237D01131
<210>17
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>17
Figure A200680046237D01132
<210>18
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>18
Figure A200680046237D01133
<210>19
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>19
<210>20
<211>20
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>20
Figure A200680046237D01141
<210>21
<211>20
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>21
Figure A200680046237D01142
<210>22
<211>20
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>22
Figure A200680046237D01143
<210>23
<211>20
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>23
Figure A200680046237D01144
<210>24
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>24
Figure A200680046237D01145
<210>25
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>25
Figure A200680046237D01146
<210>26
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>26
<210>27
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>27
<210>28
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>28
Figure A200680046237D01153
<210>29
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>29
Figure A200680046237D01154
<210>30
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>30
Figure A200680046237D01155
<210>31
<211>21
<212>RNA
<213>菜豆
<400>31
Figure A200680046237D01161
<210>32
<211>21
<212>RNA
<213>葡萄
<400>32
Figure A200680046237D01162
<210>33
<211>21
<212>RNA
<213>大麦
<400>33
Figure A200680046237D01163
<210>34
<211>21
<212>RNA
<213>水稻
<400>34
Figure A200680046237D01164
<210>35
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>35
Figure A200680046237D01165
<210>36
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>36
<210>37
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>37
Figure A200680046237D01171
<210>38
<211>21
<212>RNA
<213>水稻
<400>38
Figure A200680046237D01172
<210>39
<211>21
<212>RNA
<213>百脉根日本变种
<400>39
Figure A200680046237D01173
<210>40
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>40
Figure A200680046237D01174
<210>41
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>41
Figure A200680046237D01175
<210>42
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>42
Figure A200680046237D01181
<210>43
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>43
Figure A200680046237D01182
<210>44
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>44
Figure A200680046237D01183
<210>45
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>45
Figure A200680046237D01184
<210>46
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>46
<210>47
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>47
Figure A200680046237D01186
<210>48
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>48
Figure A200680046237D01191
<210>49
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>49
Figure A200680046237D01192
<210>50
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>50
Figure A200680046237D01193
<210>51
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>51
Figure A200680046237D01194
<210>52
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>52
Figure A200680046237D01195
<210>53
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>53
Figure A200680046237D01201
<210>54
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>54
Figure A200680046237D01202
<210>55
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>55
Figure A200680046237D01203
<210>56
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>56
Figure A200680046237D01204
<210>57
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>57
Figure A200680046237D01205
<210>58
<211>22
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>58
Figure A200680046237D01206
<210>59
<211>22
<212>RNA
<213>欧洲山杨
<400>59
Figure A200680046237D01211
<210>60
<211>22
<212>RNA
<213>水稻
<400>60
Figure A200680046237D01212
<210>61
<211>23
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>61
Figure A200680046237D01213
<210>62
<211>23
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>62
Figure A200680046237D01214
<210>63
<211>23
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>63
Figure A200680046237D01215
<210>64
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>64
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<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>65
Figure A200680046237D01222
<210>66
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>66
Figure A200680046237D01223
<210>67
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>67
<210>68
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>68
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<211>21
<212>RNA
<213>水稻
<400>69
Figure A200680046237D01226
<210>70
<211>21
<212>RNA
<213>蒺藜苜蓿
<400>70
Figure A200680046237D01231
<210>71
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>71
Figure A200680046237D01232
<210>72
<211>21
<212>RNA
<213>番茄
<400>72
Figure A200680046237D01233
<210>73
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>73
Figure A200680046237D01234
<210>74
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>74
Figure A200680046237D01235
<210>75
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>75
Figure A200680046237D01241
<210>76
<211>21
<212>RNA
<213>欧洲山杨
<400>76
<210>77
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>77
Figure A200680046237D01243
<210>78
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>78
Figure A200680046237D01244
<210>79
<211>21
<212>RNA
<213>水稻
<400>79
Figure A200680046237D01245
<210>80
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>80
Figure A200680046237D01246
<210>81
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>81
Figure A200680046237D01251
<210>82
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>82
Figure A200680046237D01252
<210>83
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>83
<210>84
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>84
Figure A200680046237D01254
<210>85
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>85
Figure A200680046237D01255
<210>86
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>86
Figure A200680046237D01261
<210>87
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>87
Figure A200680046237D01262
<210>88
<211>21
<212>RNA
<213>玉米
<400>88
Figure A200680046237D01263
<210>89
<211>21
<212>RNA
<213>葡萄
<400>89
Figure A200680046237D01264
<210>90
<211>21
<212>RNA
<213>水稻
<400>90
Figure A200680046237D01265
<210>91
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>91
Figure A200680046237D01266
<210>92
<211>21
<212>RNA
<213>陆地棉
<400>92
Figure A200680046237D01271
<210>93
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>93
Figure A200680046237D01272
<210>94
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>94
<210>95
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>95
Figure A200680046237D01274
<210>96
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>96
Figure A200680046237D01275
<210>97
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>97
<210>98
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>98
Figure A200680046237D01282
<210>99
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>99
Figure A200680046237D01283
<210>100
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>100
Figure A200680046237D01284
<210>101
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>101
Figure A200680046237D01285
<210>102
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>102
Figure A200680046237D01286
<210>103
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>103
Figure A200680046237D01291
<210>104
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>104
Figure A200680046237D01292
<210>105
<211>21
<212>RNA
<213>水稻
<400>105
Figure A200680046237D01293
<210>106
<211>21
<212>RNA
<213>水稻
<400>106
Figure A200680046237D01294
<210>107
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>107
Figure A200680046237D01295
<210>108
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>108
<210>109
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>109
Figure A200680046237D01302
<210>110
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>110
Figure A200680046237D01303
<210>111
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>111
<210>112
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>112
Figure A200680046237D01305
<210>113
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>113
Figure A200680046237D01306
<210>114
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>114
Figure A200680046237D01311
<210>115
<211>22
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>115
Figure A200680046237D01312
<210>116
<211>22
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>116
Figure A200680046237D01313
<210>117
<211>22
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>117
Figure A200680046237D01314
<210>118
<211>22
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>118
<210>119
<211>22
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>119
Figure A200680046237D01321
<210>120
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>120
Figure A200680046237D01322
<210>121
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>121
Figure A200680046237D01323
<210>122
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>122
Figure A200680046237D01324
<210>123
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>123
Figure A200680046237D01325
<210>124
<211>22
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>124
Figure A200680046237D01326
<210>125
<211>22
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>125
Figure A200680046237D01331
<210>126
<211>22
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>126
<210>127
<211>22
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>127
Figure A200680046237D01333
<210>128
<211>22
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>128
Figure A200680046237D01334
<210>129
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>129
Figure A200680046237D01335
<210>130
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>130
<210>131
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>131
<210>132
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>132
Figure A200680046237D01343
<210>133
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>133
Figure A200680046237D01344
<210>134
<211>21
<212>RNA
<213>水稻
<400>134
Figure A200680046237D01345
<210>135
<211>21
<212>RNA
<213>水稻
<400>135
Figure A200680046237D01346
<210>136
<211>21
<212>RNA
<213>水稻
<400>136
Figure A200680046237D01351
<210>137
<211>21
<212>RNA
<213>水稻
<400>137
Figure A200680046237D01352
<210>138
<211>21
<212>RNA
<213>欧洲山杨
<400>138
Figure A200680046237D01353
<210>139
<211>21
<212>RNA
<213>蒺藜苜蓿
<400>139
Figure A200680046237D01354
<210>140
<211>21
<212>RNA
<213>小麦
<400>140
<210>141
<211>21
<212>RNA
<213>小麦
<400>141
Figure A200680046237D01361
<210>142
<211>21
<212>RNA
<213>小麦
<400>142
Figure A200680046237D01362
<210>143
<211>22
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>143
Figure A200680046237D01363
<210>144
<211>22
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>144
<210>145
<211>22
<212>RNA
<213>高粱
<400>145
Figure A200680046237D01365
<210>146
<211>22
<212>RNA
<213>甘蔗
<400>146
Figure A200680046237D01366
<210>147
<211>22
<212>RNA
<213>玉米
<400>147
Figure A200680046237D01371
<210>148
<211>22
<212>RNA
<213>水稻
<400>148
<210>149
<211>22
<212>RNA
<213>珍珠粟
<400>149
Figure A200680046237D01373
<210>150
<211>22
<212>RNA
<213>葡萄
<400>150
Figure A200680046237D01374
<210>151
<211>22
<212>RNA
<213>可可
<400>151
Figure A200680046237D01375
<210>152
<211>22
<212>RNA
<213>番茄
<400>152
Figure A200680046237D01381
<210>153
<211>22
<212>RNA
<213>玉米
<400>153
Figure A200680046237D01382
<210>154
<211>22
<212>RNA
<213>欧洲山杨
<400>154
Figure A200680046237D01383
<210>155
<211>22
<212>RNA
<213>水稻
<400>155
Figure A200680046237D01384
<210>156
<211>22
<212>RNA
<213>小麦
<400>156
Figure A200680046237D01385
<210>157
<211>22
<212>RNA
<213>大麦
<400>157
<210>158
<211>22
<212>RNA
<213>欧洲山杨
<400>158
Figure A200680046237D01391
<210>159
<211>22
<212>RNA
<213>Mesembryanthemum crystallinum
<400>159
Figure A200680046237D01392
<210>160
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>160
Figure A200680046237D01393
<210>161
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>161
Figure A200680046237D01394
<210>162
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>162
Figure A200680046237D01395
<210>163
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>163
Figure A200680046237D01401
<210>164
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>164
Figure A200680046237D01402
<210>165
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>165
<210>166
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>166
Figure A200680046237D01404
<210>167
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>167
Figure A200680046237D01405
<210>168
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>168
Figure A200680046237D01406
<210>169
<211>21
<212>RNA
<213>水稻
<400>169
Figure A200680046237D01411
<210>170
<211>21
<212>RNA
<213>水稻
<400>170
Figure A200680046237D01412
<210>171
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>171
<210>172
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>172
Figure A200680046237D01414
<210>173
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>173
Figure A200680046237D01415
<210>174
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>174
Figure A200680046237D01421
<210>175
<211>21
<212>RNA
<213>拟南芥
<400>175
<210>176
<211>1242
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>176
Figure A200680046237D01423
<210>177
<211>956
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>177
Figure A200680046237D01432
<210>178
<211>22
<212>DNA
<213>玉米
<400>178
Figure A200680046237D01441
<210>179
<211>1683
<212>DNA
<213>玉米
<400>179
<210>180
<211>674
<212>DNA
<213>玉米
<400>180
<210>181
<211>6
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>181
Figure A200680046237D01461
<210>182
<211>768
<212>DNA
<213>玉米
<400>182
Figure A200680046237D01462
<210>183
<211>407
<212>DNA
<213>玉米
<400>183
Figure A200680046237D01463
Figure A200680046237D01471
<210>184
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>184
Figure A200680046237D01472
<210>185
<211>20
<212>RNA
<213>大豆
<400>185
Figure A200680046237D01473
<210>186
<211>762
<212>DNA
<213>大豆
<400>186
Figure A200680046237D01474
Figure A200680046237D01481
<210>187
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>187
Figure A200680046237D01482
<210>188
<211>19
<212>RNA
<213>大豆
<400>188
Figure A200680046237D01483
<210>189
<211>346
<212>DNA
<213>大豆
<220>
<221>不确定
<222>(1)..(346)
<223>所有n位点不确定
<400>189
Figure A200680046237D01484
<210>190
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>190
Figure A200680046237D01491
<210>191
<211>20
<212>RNA
<213>大豆
<400>191
<210>192
<211>434
<212>RNA
<213>大豆
<400>192
Figure A200680046237D01493
<210>193
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>193
Figure A200680046237D01494
<210>194
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>194
<210>195
<211>439
<212>DNA
<213>大豆
<400>195
Figure A200680046237D01502
<210>196
<211>22
<212>RNA
<213>大豆
<400>196
Figure A200680046237D01503
<210>197
<211>20
<212>RNA
<213>大豆
<400>197
Figure A200680046237D01504
<210>198
<211>495
<212>DNA
<213>大豆
<400>198
Figure A200680046237D01511
<210>199
<211>825
<212>DNA
<213>大豆
<400>199
Figure A200680046237D01512
Figure A200680046237D01521
<210>200
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>200
Figure A200680046237D01522
<210>201
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>201
<210>202
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>202
<210>203
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>203
Figure A200680046237D01525
<210>204
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>204
Figure A200680046237D01526
<210>205
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>205
Figure A200680046237D01531
<210>206
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>206
Figure A200680046237D01532
<210>207
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>207
Figure A200680046237D01533
<210>208
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>208
Figure A200680046237D01534
<210>209
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>209
Figure A200680046237D01535
<210>210
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>210
Figure A200680046237D01541
<210>211
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>211
Figure A200680046237D01542
<210>212
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>212
Figure A200680046237D01543
<210>213
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>213
Figure A200680046237D01544
<210>214
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>214
Figure A200680046237D01545
<210>215
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>215
Figure A200680046237D01546
<210>216
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>216
Figure A200680046237D01551
<210>217
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>217
Figure A200680046237D01552
<210>218
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>218
Figure A200680046237D01553
<210>219
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>219
<210>220
<211>20
<212>RNA
<213>大豆
<400>220
Figure A200680046237D01555
<210>221
<211>20
<212>RNA
<213>大豆
<400>221
<210>222
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>222
Figure A200680046237D01562
<210>223
<211>20
<212>RNA
<213>大豆
<400>223
Figure A200680046237D01563
<210>224
<211>20
<212>RNA
<213>大豆
<400>224
Figure A200680046237D01564
<210>225
<211>20
<212>RNA
<213>大豆
<400>225
Figure A200680046237D01565
<210>226
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>226
Figure A200680046237D01566
<210>227
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>227
Figure A200680046237D01571
<210>228
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>228
<210>229
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>229
Figure A200680046237D01573
<210>230
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>230
Figure A200680046237D01574
<210>231
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>231
Figure A200680046237D01575
<210>232
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>232
Figure A200680046237D01581
<210>233
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>233
Figure A200680046237D01582
<210>234
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>234
Figure A200680046237D01583
<210>235
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>235
<210>236
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>236
<210>237
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>237
<210>238
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>238
Figure A200680046237D01591
<210>239
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>239
Figure A200680046237D01592
<210>240
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>240
Figure A200680046237D01593
<210>241
<21i>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>241
Figure A200680046237D01594
<210>242
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>242
Figure A200680046237D01595
<210>243
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>243
<210>244
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>244
Figure A200680046237D01602
<210>245
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>245
Figure A200680046237D01603
<210>246
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>246
Figure A200680046237D01604
<210>247
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>247
Figure A200680046237D01605
<210>248
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>248
Figure A200680046237D01606
<210>249
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>249
Figure A200680046237D01611
<210>250
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>250
Figure A200680046237D01612
<210>251
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>251
Figure A200680046237D01613
<210>252
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>252
<210>253
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>253
<210>254
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>254
Figure A200680046237D01621
<210>255
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>255
Figure A200680046237D01622
<210>256
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>256
Figure A200680046237D01623
<210>257
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>257
Figure A200680046237D01624
<210>258
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>258
Figure A200680046237D01625
<210>259
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>259
<210>260
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>260
Figure A200680046237D01631
<210>261
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>261
Figure A200680046237D01632
<210>262
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>262
Figure A200680046237D01633
<210>263
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>263
Figure A200680046237D01634
<210>264
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>264
Figure A200680046237D01635
<210>265
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>265
Figure A200680046237D01641
<210>266
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>266
<210>267
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>267
Figure A200680046237D01643
<210>268
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>268
Figure A200680046237D01644
<210>269
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>269
Figure A200680046237D01645
<210>270
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>270
Figure A200680046237D01646
<210>271
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>271
Figure A200680046237D01651
<210>272
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>272
Figure A200680046237D01652
<210>273
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>273
Figure A200680046237D01653
<210>274
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>274
<210>275
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>275
Figure A200680046237D01655
<210>276
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>276
Figure A200680046237D01661
<210>277
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>277
Figure A200680046237D01662
<210>278
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>278
Figure A200680046237D01663
<210>279
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>279
Figure A200680046237D01664
<210>280
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>280
Figure A200680046237D01665
<210>281
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>281
Figure A200680046237D01666
<210>282
<211>21
<212>RNA
<213>大豆
<400>282
Figure A200680046237D01671
<210>283
<211>22
<212>RNA
<213>大豆
<400>283
<210>284
<211>22
<212>RNA
<213>大豆
<400>284
Figure A200680046237D01673
<210>285
<211>22
<212>RNA
<213>大豆
<400>285
Figure A200680046237D01674
<210>286
<211>22
<212>RNA
<213>大豆
<400>286
Figure A200680046237D01675
<210>287
<211>22
<212>RNA
<213>大豆
<400>287
<210>288
<211>22
<212>RNA
<213>大豆
<400>288
Figure A200680046237D01682
<210>289
<211>20
<212>RNA
<213>大豆
<400>289
Figure A200680046237D01683
<210>290
<211>22
<212>RNA
<213>大豆
<400>290
Figure A200680046237D01684
<210>291
<211>22
<212>RNA
<213>大豆
<400>291
Figure A200680046237D01685
<210>292
<211>22
<212>RNA
<213>大豆
<400>292
Figure A200680046237D01686
<210>293
<211>22
<212>RNA
<213>大豆
<400>293
Figure A200680046237D01691
<210>294
<211>22
<212>RNA
<213>大豆
<400>294
Figure A200680046237D01692
<210>295
<211>22
<212>RNA
<213>大豆
<400>295
Figure A200680046237D01693
<210>296
<211>22
<212>RNA
<213>大豆
<400>296
<210>297
<211>21
<212>RNA
<213>玉米
<400>297
<210>298
<211>20
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>298
Figure A200680046237D01701
<210>299
<211>20
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>299
Figure A200680046237D01702
<210>300
<211>20
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>300
Figure A200680046237D01703
<210>301
<211>20
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>301
Figure A200680046237D01704
<210>302
<211>21
<212>RNA
<213>玉米
<400>302
Figure A200680046237D01711
<210>303
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>303
<210>304
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>304
Figure A200680046237D01713
<210>305
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>305
Figure A200680046237D01714
<210>306
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>306
Figure A200680046237D01715
<210>307
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>307
<210>308
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>308
Figure A200680046237D01722
<210>309
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>309
Figure A200680046237D01723
<210>310
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>310
Figure A200680046237D01724
<210>311
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>311
Figure A200680046237D01731
<210>312
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>312
Figure A200680046237D01732
<210>313
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>313
<210>314
<211>21
<212>RNA
<213>米
<400>314
Figure A200680046237D01734
<210>315
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>315
<210>316
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>316
Figure A200680046237D01742
<210>317
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>317
Figure A200680046237D01743
<210>318
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>318
Figure A200680046237D01744
<210>319
<211>21
<212>RNA
<213>玉米
<400>319
Figure A200680046237D01745
<210>320
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>320
Figure A200680046237D01751
<210>321
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>321
Figure A200680046237D01752
<210>322
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>322
Figure A200680046237D01753
<210>323
<211>20
<212>RNA
<213>玉米
<400>323
Figure A200680046237D01754
<210>324
<211>20
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>324
Figure A200680046237D01761
<210>325
<211>20
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>325
Figure A200680046237D01762
<210>326
<211>20
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>326
Figure A200680046237D01763
<210>327
<211>20
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>327
Figure A200680046237D01764
<210>328
<211>21
<212>RNA
<213>玉米
<400>328
Figure A200680046237D01765
<210>329
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>329
Figure A200680046237D01771
<210>330
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>330
Figure A200680046237D01772
<210>331
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>331
<210>332
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>332
Figure A200680046237D01774
<210>333
<211>22
<212>RNA
<213>玉米
<400>333
Figure A200680046237D01781
<210>334
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>334
Figure A200680046237D01782
<210>335
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>335
Figure A200680046237D01783
<210>336
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>336
Figure A200680046237D01784
<210>337
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>337
<210>338
<211>21
<212>RNA
<213>玉米
<400>338
<210>339
<211>22
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>339
Figure A200680046237D01793
<210>340
<211>22
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>340
<210>341
<211>22
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>341
Figure A200680046237D01795
<210>342
<211>22
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>342
Figure A200680046237D01801
<210>343
<211>22
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>343
Figure A200680046237D01802
<210>344
<211>1368
<212>DNA
<213>根癌土壤杆菌
<400>344
Figure A200680046237D01803
<210>345
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>345
Figure A200680046237D01812
<210>346
<211>63
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>346
<210>347
<211>63
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>347
Figure A200680046237D01821

Claims (20)

1.一种生产非天然杂种种子的方法，所述方法包括：
(a)提供可诱导不育的第一种转基因亲代植物，所述植物在其基因组中包含转录为RNA的重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含：
(i)至少一个可由成熟miRNA识别的外源miRNA识别位点，所述成熟miRNA在所述第一种亲代植物的生殖组织中特异性表达；和
(ii)编码赋予对第一种除草剂耐受性的蛋白的第一种信使RNA；
其中所述成熟miRNA特异性抑制所述蛋白在所述生殖组织中的表达，和
其中所述第一种亲代植物的不育性可通过将所述第一种除草剂施用于所述第一种亲代植物诱导；
和
(b)使所述第一种亲代植物与第二种亲代植物在其中不育性已在所述第一种亲代植物中被诱导的条件下杂交，由此产生非天然杂种种子。
2.权利要求1的方法，其中所述外源miRNA识别位点位于以下的至少一种当中：
(a)所述第一种信使RNA的5’至编码序列的区域；
(b)所述第一种信使RNA的3’至编码序列的区域；和
(c)所述第一种信使RNA。
3.权利要求1的方法，其中所述成熟miRNA是选自在表1、2、3、4、5和6中鉴定的miRNA中的至少一种。
4.权利要求1的方法，其中所述重组DNA构建体还包含选自以下的至少一种元件：
(a)植物启动子；
(b)基因抑制元件；
(c)内含子；
(d)基因表达元件；
(e)转录为能够结合配体的RNA适体的DNA；
(f)转录为能够结合配体的RNA适体的DNA和转录为能够调节靶序列表达的调节RNA的DNA，其特征在于所述调节依赖于所述调节RNA的构象，而所述调节RNA的所述构象受所述RNA适体的结合状态的变构性影响；和
(g)至少一种T-DNA边界。
5.权利要求1的方法，其中第二种亲代植物耐受所述第一种除草剂。
6.权利要求1的方法，其中所述第一种除草剂是内吸收性除草剂。
7.权利要求1的方法，其中所述赋予耐受性的蛋白是选自以下的至少一种蛋白：5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶、来自根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株CP4的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶、草甘膦氧化还原酶、草甘膦乙酰转移酶、草甘膦脱羧酶、pat、bar、麦草畏单加氧酶、2，2-二氯丙酸脱卤素酶、乙酰羟基酸合酶、乙酰乳酸合酶、卤代芳基腈水解酶、修饰的乙酰辅酶A羧化酶、二氢蝶酸合酶、32kDa光系统II多肽、邻氨基苯甲酸合酶、二氢皮考啉二酸合酶、八氢番茄红素去饱和酶、羟苯基丙酮酸双加氧酶、修饰的原卟啉原氧化酶I和芳氧基链烷酸酯双加氧酶。
8.权利要求1的方法，其中：
(a)所述生殖组织是雄性生殖组织，所述第一种亲代植物是可诱导的雄性不育的，所述第二种亲代植物是正常能育的；或
(b)所述生殖组织是雄性生殖组织，所述第一种亲代植物是可诱导的雄性不育的，所述第二种亲代植物是雌性不育的；或
(c)所述生殖组织是雄性生殖组织，所述第一种亲代植物是可诱导的雄性不育的，所述第二种亲代植物是可诱导的雌性不育的；或
(d)所述生殖组织是雌性生殖组织，所述第一种亲代植物是可诱导的雌性不育的，所述第二种亲代植物是正常能育的；或
(e)所述生殖组织是雌性生殖组织，所述第一种亲代植物是可诱导的雌性不育的，所述第二种亲代植物是雄性不育的；或
(f)所述生殖组织是雌性生殖组织，所述第一种亲代植物是可诱导的雌性不育的，所述第二种亲代植物是可诱导的雄性不育的。
9.权利要求1的方法，其中：
(a)所述生殖组织是雄性生殖组织，所述第一种亲代植物是可诱导的雄性不育的，所述第二种亲代植物包括可诱导的雌性不育的第二种转基因亲代植物，所述第二种转基因亲代植物在其基因组中包含转录为RNA的重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含：(i)可由第二种成熟miRNA识别的至少一种外源miRNA识别位点，所述第二种成熟miRNA在所述第二种亲代植物的雌性生殖组织中特异性表达，和(ii)编码赋予对第二种除草剂耐受性的第二种蛋白的第二种信使RNA；其中所述第二种成熟miRNA在所述雌性生殖组织中特异性抑制所述第二种蛋白的表达，其中所述第二种亲代植物的雌性不育可通过将所述第二种除草剂应用于所述第二种亲代植物来诱导；或
(b)所述生殖组织是雌性生殖组织，所述第一种亲代植物是可诱导的雌性不育的，所述第二种亲代植物包括可诱导的雄性不育的第二种转基因亲代植物，所述第二种转基因亲代植物在其基因组中包含转录为RNA的重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含：(i)可由第二种成熟miRNA识别的至少一种外源miRNA识别位点，所述第二种成熟miRNA在所述第二种亲代植物的雄性生殖组织中特异性表达，和(ii)编码赋予对第二种除草剂耐受性的第二种蛋白的第二种信使RNA；其中所述第二种成熟miRNA在所述雄性生殖组织中特异性抑制所述第二种蛋白的表达，其中所述第二种亲代植物的雄性不育可通过将所述第二种除草剂应用于所述第二种亲代植物来诱导。
10.权利要求9的方法，其中所述第一种除草剂和所述第二种除草剂：
(a)是相同的；或者
(b)是不同的。
11.权利要求9的方法，其中所述第一种除草剂和所述第二种除草剂中的至少一种包括内吸收性除草剂。
12.权利要求9的方法，其中所述第一种除草剂和所述第二种除草剂中的至少一种包括选自以下的至少一种除草剂：草甘膦、麦草畏、草铵膦、磺酰脲类、咪唑啉酮、溴苯腈、2，2-二氯丙酸、乙酰乳酸合酶抑制剂、环己二酮、芳氧基苯氧基丙酸酯、磺酰胺除草剂、三嗪除草剂、5-甲基色氨酸、氨基乙基半胱氨酸、哒嗪酮除草剂、环丙基异噁唑除草剂、原卟啉原氧化酶抑制剂和包含芳氧基链烷酸酯部分的除草剂。
13.权利要求9的方法，其中所述第一种和所述第二种信使RNA：
(a)是相同的；或者
(b)是不同的。
14.权利要求1的方法，其中所述非天然杂种种子是玉米种子。
15.非天然杂种种子，所述种子使用包含权利要求3的方法的人类活动生产。
16.可诱导不育的转基因植物，所述转基因植物在其基因组中包含转录为RNA的重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含：
(a)至少一个可由成熟miRNA识别的外源miRNA识别位点，所述成熟miRNA在所述植物的生殖组织中特异性表达；和
(b)编码赋予对除草剂耐受性的蛋白的信使RNA；
其中所述成熟miRNA特异性抑制所述蛋白在所述生殖组织中的表达，
其中所述转基因植物的不育性可通过将所述除草剂施用于所述植物诱导。
17.权利要求16的可诱导不育的转基因植物，其中：
(a)所述生殖组织是雄性生殖组织，所述不育性是雄性不育；或
(b)所述生殖组织是雌性生殖组织，所述不育性是雌性不育。
18.权利要求16的可诱导不育的转基因植物，其中所述生殖组织包括受精胚珠，所述不育性导致受精胚珠不能发育成能育种子。
19.权利要求16的可诱导不育的转基因植物，其中所述植物是通过种子繁殖的作物。
20.权利要求16的可诱导不育的转基因植物，其中所述植物选自玉米、水稻、小麦、燕麦、大麦、黑麦、黑小麦、黍、高粱、昆诺阿藜、苋、荞麦、牧草、草坪草、苜蓿、棉花、红花、向日葵、大豆、油菜、油菜籽、亚麻、花生、菜豆、豌豆、小扁豆、苜蓿、莴苣、芦笋、朝鲜蓟、芹菜、胡萝卜、萝卜、甘蓝、羽衣甘蓝、芥菜、椰菜、花椰菜、芽甘蓝、芜箐、球茎甘蓝、黄瓜、甜瓜、西葫芦、笋瓜、洋葱、大蒜、韭菜、葱、细香葱、番茄、茄子、胡椒、灯笼果、甜菜、牛皮菜、菠菜、观赏植物和林木。
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