CN104969853B - 转基因玉米事件mon87427和相对发育尺度 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了转基因玉米事件MON 87427和源自事件MON 87427的植物、植物细胞、种子、植物部分和商业产品。本发明也提供了对于转基因玉米事件MON 87427特异的核苷酸和包含转基因玉米事件MON 87427特异的核苷酸的植物、植物细胞、种子、植物部分和商业产品。本发明也提供了涉及转基因玉米事件MON 87427并涉及

Description

转基因玉米事件MON87427和相对发育尺度
本申请是申请日为2010年11月16日、申请号为201080053218.3、发明名称为“转基因玉米事件MON 87427和相对发育尺度”的发明专利申请的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求享有于2009年11月23日提交的美国临时申请号61/263，526(该申请的全部通过引用方式结合在本文中)和2009年11月23日提交的美国临时申请号61/263，530(该申请的全部通过引用方式结合在本文中)的优先权。
序列表的引入
序列表包含在名为“56887-0001_序列.文本”的文件中，其大小为19.6千字节(在Microsoft中测定的大小)，于2010年11月12日生成，通过电子提交方式递交，其全部通过引用方式结合在本文中。
技术领域
本申请涉及植物育种、研究和农业领域。更具体地，它涉及转基因玉米事件MON87427和与转基因玉米事件MON 87427相关的核酸分子、植物、植物部分、种子、细胞或农业产品。它还涉及玉米穗(maize tassel)发育的预测、其在植物育种、研究和农业中的应用以及由此产生的玉米杂种种子。
背景技术
具有新的期望的特征的农作物可用于植物育种、研究和农业目 的。可用生物技术的方法生产这种农作物。然而，商业适用的转基因事件的产生和筛选可需要广泛研究、分析和表征大量的个体植物转化事件以挑选具有既有所需特征又有使之适用于商业和农业目的必需的最佳表型和农业特征的事件。这种筛选事件的方法常常需要多年、在多地及多种条件下进行许多事件的温室及田间试验，以便收集大量的农学、表型和分子数据。然后得到的数据和观察结果必须由数个团队的科学家和农学家带着挑选商业适用事件的目的进行分析。本发明提供了在玉米中产生新的期望特征的商业适用的事件。
玉米繁殖性成熟度的准确测定也可用于植物育种、研究和农业目的，如在玉米杂种种子生产中。本领域常用于预测和估计玉米生长和发育期的工具包括如V-期(其根据植物特征)和生长度单位(Growing Degree Units，其根据生长度天数)等度量。然而，这两种工具所产生的穗发育期的估算值，随玉米基因型而差异很大。因此依赖这些测试方法可产生错过其中生长期是重要因素的处理方案中的最有效时间的风险。本发明提供了基于协调不同基因型的穗发育的相对发育尺度(relative development scale)，可用于监控和预测不同基因型的玉米中的穗发育。
发明内容
本发明提供了一种重组DNA分子，包括包含选自SEQ ID NO：1-8的核苷酸序列的核酸分子。本发明也提供了一种重组DNA分子，其中所述重组DNA分子通过将插入的异源的核酸分子和玉米植物、植物细胞或种子的基因组DNA结合而形成。本发明也提供了源自转基因玉米事件MON 87427的重组DNA分子，一种代表性种子以保藏号PTA-7899保藏于美国典型培养物保藏中心()。本发明也提供了一种重组DNA分子，其中所述重组DNA分子是用于诊断源自转基因玉米事件MON 87427的DNA存在的扩增子。本发明也提供了一种重组DNA分子，其中所述重组DNA分子是在源自转基因玉米事件MON 87427的玉米植物、植物细胞、种子、后代植物、 植物部分或商业产品中。
本发明也提供一种DNA分子，包含具有SEQ ID NO：10的足够长度的连续核苷酸的核苷酸序列的核酸分子作为DNA探针，该DNA探针在严格杂交条件下与包含选自SEQ ID NO：1-10的核苷酸序列的DNA分子杂交，并且在严格杂交条件下不与不含选自SEQ ID NO：1-10的核苷酸序列的DNA分子杂交。
本发明也提供了DNA分子对，由第一DNA分子以及不同于第一DNA分子的第二DNA分子组成，其中所述第一DNA分子和第二DNA分子各自包含具有SEQ ID NO：10的足够长度的连续核苷酸的核苷酸序列的核酸分子作为DNA引物，当与来自事件MON 87427的DNA在扩增反应中共同使用时，该DNA引物产生用于诊断样品中玉米事件MON 87427的扩增子。
本发明也提供了一种检测样品中源自MON 87427的DNA分子存在的方法，通过将样品与DNA探针接触、使样品和DNA探针处于严格杂交条件下以及检测样品中DNA探针与DNA分子的杂交，其中DNA探针与DNA分子的杂交表明样品中源自转基因玉米事件MON 87427的DNA分子的存在。
本发明也提供了一种检测样品中源自转基因玉米事件MON87427的DNA分子存在的方法，通过将样品与DNA分子对接触、进行足以产生包含选自SEQ ID NO：1-10的序列的DNA扩增子的扩增反应以及检测反应中DNA扩增子的存在，其中反应中DNA扩增子的存在表明样品中源自MON 87427的DNA分子的存在。
本发明也提供了一种DNA检测试剂盒，包括至少一种包含SEQ ID NO：10的足够长度的连续核苷酸的核苷酸序列作为特异性地检测源自转基因玉米事件MON 87427的DNA的存在的DNA引物或探针，其中所述DNA的检测用于诊断样品中转基因玉米事件MON 87427的存在。
本发明提供了包含具有选自SEQ ID NO：1-10的核苷酸序列的核酸分子的重组玉米植物、种子、细胞或其植物部分。本发明也提 供了对草甘膦除草剂处理组织选择性耐受的重组玉米植物、种子、细胞或植物部分。本发明也提供了当在DNA扩增方法中试验时，其基因组产生包含选自SEQ ID NO：1-10的DNA分子的扩增子的重组玉米植物、种子、细胞或植物部分。
本发明也提供了玉米植物或种子，其中玉米植物或种子源自转基因玉米事件MON87427。本发明也提供了玉米植物或种子，其中玉米植物或种子是具有至少一个源自转基因玉米事件MON 87427的亲本的杂种。
本发明也提供了一种无生命植物材料，包含选自SEQ ID NO：1-10的重组DNA分子。
本发明也提供了一种包含具有选自SEQ ID NO：1-10的核苷酸序列的核酸分子的微生物。本发明也提供了作为植物细胞的微生物。
本发明也提供了由转基因玉米事件MON 87427产生并包含具有选自SEQ ID NO：1-10的核苷酸序列的核酸分子的商业产品，其中在源自商业产品的样品中检测到该核苷酸序列可确定该商业产品是由转基因玉米事件MON 87427所产生。本发明也提供了选自完整或加工的种子、动物饲料、油、膳食、面粉、薄片、糠、生物质和燃料产品的商业产品。本发明也提供了通过获得包含转基因玉米事件MON 87427的玉米植物或其部分而产生商业产品以及由玉米植物或其部分产生商业产品的方法。
本发明也提供了一种在田间控制杂草的方法，通过在田间种植MON 87427且在田间应用有效剂量的能够在不伤害转基因玉米事件MON 87427植物的情况下控制杂草的草甘膦除草剂。本发明也提供了一种在田间控制杂草的方法，其中所述有效剂量的草甘膦除草剂是每英亩约0.1磅至约4磅。
本发明提供了产生耐受草甘膦除草剂应用的玉米植物的方法，其通过将包含具有选自SEQ ID NO：1-10的核苷酸序列的核酸分子的转基因玉米事件MON 87427与第二种玉米植物进行有性杂交从而产生种子、收集由杂交产生的种子、使种子生长以产生多个后代植物、以草甘膦处理后代植物并筛选对草甘膦耐受的后代植物。本发明也提供了产生耐受草甘膦除草剂应用的玉米植物的方法，其通过将包含具有选自SEQ ID NO：1-10的核苷酸序列的核酸分子的转基因玉米事件MON 87427自交从而产生种子、收集由自交产生的种子、使种子生长以产生多个后代植物、以草甘膦处理后代植物并筛选对草甘膦耐受的后代植物。
本发明也提供了产生玉米杂种种子的方法，其通过在区域内种植转基因玉米事件MON 87427、使源自种子的玉米植物生长、在花粉形成前用有效剂量的草甘膦除草剂处理植物而在不伤害植物的情况下使植物雄性不育、用来自第二种亲本植物的花粉使植物受精以及收获植物产生的种子，其中种子是通过转基因玉米事件MON 87427与第二种亲本植物的杂交产生的玉米杂种种子。本发明也提供了产生玉米杂种种子的方法，其中所述有效剂量的草甘膦除草剂是每英亩约0.1磅至约4磅。本发明也提供了产生玉米杂种种子的方法，进一步包括在区域内种植第二种亲本植物以及使源自第二种亲本植物的玉米种子生长。本发明也提供了产生玉米杂种种子的方法，其中第二种亲本植物对草甘膦耐受。
本发明也提供了通过选择相对发育尺度(Relative Development Scale)上的范围而预测玉米穗发育的时机的方法，其中该范围表明向所期望的穗发育期的成熟。本发明也提供了预测玉米穗发育的时机的方法，其中期望的穗发育期是对于玉米的生殖杂交、穗不育化、去雄和/或进行发育调节处理的最佳穗发育期。本发明也提供了预测玉米穗发育的时机的方法，其中用于构建相对发育尺度的特定花生长期是在约50％玉米植物群体花粉散落时，其中范围为相对发育尺度上的约0.62至约0.75。本发明也提供了预测玉米穗发育的时机的方法，进一步包括在期望的穗发育期对玉米植物实施发育调节处理。
本发明也提供了产生玉米杂种种子的方法，其通过在区域内种植第一种亲本植物的玉米种子、使源自玉米种子的第一种亲本植物生长、通过选择相对发育尺度上显示向期望的穗发育期的成熟的范 围而确定第一种亲本植物穗发育的时机、通过穗发育时机的确定及时地对第一种亲本植物实施发育调节处理从而阻止第一种亲本植物的自花授粉、对第一种亲本植物实施发育调节处理、用来自第二种亲本植物的花粉使第一种亲本植物受精以及收获第一种亲本植物产生的种子，其中种子是通过第一种亲本植物与第二种亲本植物的杂交产生的玉米杂种种子。本发明也提供了用本方法产生的玉米杂种种子。本发明也提供了产生玉米杂种种子的方法，其中发育调节处理是草甘膦，第一种亲本植物是组织选择性草甘膦耐受的。本发明也提供了产生玉米杂种种子的方法，其中第一种亲本植物是转基因玉米事件MON 87427植物。本发明也提供了产生玉米杂种种子的方法，其中第二种亲本植物对草甘膦耐受。
通过下面的详细描述，本发明的上述和其它方面将变得更加明显。
本发明涉及但不限于以下各项：
第1项.一种重组DNA分子，包括包含选自SEQ ID NO：1-8的核苷酸序列的核酸分子。
第2项.第1项的重组DNA分子，其中所述重组DNA分子通过将插入的异源核酸分子与玉米植物、植物细胞或种子的基因组DNA连接而形成。
第3项.第1项的重组DNA分子，其中所述DNA分子来自转基因玉米事件MON 87427，其代表性样品被保藏为ATCC PTA-7899。
第4项.第3项的重组DNA分子，其中所述DNA分子是用于诊断来自转基因玉米事件MON 87427的DNA存在的扩增子。
第5项.第1项的重组DNA分子，其中所述重组DNA分子存在于来自转基因玉米事件MON 87427的玉米植物、植物细胞、种子、后代植物、植物部分或商业产品中，所述转基因玉米事件的代表性样品已被保藏为ATCC PTA-7899。
第6项.一种DNA分子，包含具有SEQ ID NO：10的足够长度连续核苷酸的核苷酸序列的核酸分子作为DNA探针，该DNA探针 在严格杂交条件下与包含选自SEQ ID NO：1-10的核苷酸序列的DNA分子杂交并且在严格杂交条件下不与不含选自SEQ ID NO：1-10的核苷酸序列的DNA分子杂交。
第7项.DNA分子对，由第一DNA分子以及不同于第一DNA分子的第二DNA分子组成，其中所述第一DNA分子和第二DNA分子各自包含具有SEQ ID NO：10的足够长度的连续核苷酸的核苷酸序列的核酸分子作为DNA引物，当与来自事件MON 87427的DNA在扩增反应中共同使用时，该DNA引物产生用于诊断样品中转基因玉米事件MON 87427DNA的扩增子。
第8项.一种检测样品中来自MON 87427的DNA分子的存在的方法，所述方法包括：
a.将样品与权利要求6的DNA探针接触；
b.使所述样品和所述DNA探针经受严格杂交条件；以及
c.检测所述样品中所述DNA探针与DNA分子的杂交，其中所述DNA探针与DNA分子的杂交显示了所述样品中来自转基因玉米事件MON 87427的DNA分子的存在。
第9项.一种检测样品中来自转基因玉米事件MON 87427的DNA分子的存在的方法，所述方法包括：
a.将样品与权利要求7的DNA分子对接触；
b.进行扩增反应，其足以产生包含选自SEQ ID NO：1-10的序列的DNA扩增子；和
c.检测所述反应中所述DNA扩增子的存在，其中所述DNA扩增子在所述反应中的存在显示了所述样品中来自MON 87427的DNA分子的存在。
第10项.一种DNA检测试剂盒，包括至少一种包含SEQ ID NO：10的足够长度的连续核苷酸的核苷酸序列作为特异性地检测来自转基因玉米事件MON 87427的DNA存在的DNA引物或探针，其中所述DNA的检测用于诊断样品中转基因玉米事件MON 87427的存在。
第11项.包含具有选自SEQ ID NO：1-10的核苷酸序列的核酸分子的重组玉米植物、种子、细胞或其植物部分。
第12项.第11项的重组玉米植物、种子、细胞或其植物部分，其中所述植物、种子、细胞或其植物部分对草甘膦除草剂处理具有组织选择性耐受性。
第13项.第11项的重组玉米植物、种子、细胞或其植物部分，当在DNA扩增方法中试验时，其基因组产生包含选自SEQ ID NO：1-10的DNA分子的扩增子。
第14项.一种玉米植物或种子，其中所述玉米植物或种子来自转基因玉米事件MON87427，其代表性样品已被保藏为ATCC保藏号No.PTA-7899。
第15项.第14项的玉米植物或种子，其中所述玉米植物或种子是具有至少一个来自转基因玉米事件MON 87427的亲本的杂种。
第16项.一种无生命植物材料，包含选自SEQ ID NO：1-10的重组DNA分子。
第17项.一种包含具有选自SEQ ID NO：1-10的核苷酸序列的核酸分子的微生物。
第18项.第17项的微生物，其中所述微生物是植物细胞。
第19项.由转基因玉米事件MON 87427产生并包含具有选自SEQ ID NO：1-10的核苷酸序列的核酸分子的商业产品，其中在源自所述商业产品的样品中检测到所述核苷酸序列可确定所述商业产品由转基因玉米事件MON 87427所产生。
第20项.第19项的商业产品，其中所述商业产品选自完整或加工的种子、动物饲料、油、膳食、面粉、薄片、糠、生物质和燃料产品。
第21项.产生第19项的商业产品的方法，所述方法包括：
a.获取包含转基因玉米事件MON 87427的玉米植物或其部分；以及
b.从玉米植物或其部分产生玉米商业产品。
第22项.一种在田间控制杂草的方法，包括在田间种植MON 87427植物，以及在所述田间应用有效剂量的能够在不伤害所述转基因玉米事件MON 87427植物的情况下控制杂草的草甘膦除草剂。
第23项.第22项的方法，其中所述有效剂量的草甘膦除草剂是每英亩约0.1磅至约4磅。
第24项.一种产生耐受草甘膦除草剂应用的玉米植物的方法，包括：
a.将包含具有选自SEQ ID NO：1-10的核苷酸序列的核酸分子的转基因玉米事件MON 87427植物与第二种玉米植物进行有性杂交，然后产生种子；
b.收集杂交产生的所述种子；
c.使所述种子生长以产生多个后代植物；
d.以草甘膦处理所述后代植物；以及
e.筛选对草甘膦耐受的后代植物。
第25项.一种产生耐受草甘膦除草剂应用的玉米植物的方法，包括：
a.将包含具有选自SEQ ID NO：1-10的核苷酸序列的核酸分子的转基因玉米事件MON 87427植物自交，然后产生种子；
b.收集所述自交产生的所述种子；
c.使所述种子生长以产生多个后代植物；
d.以草甘膦处理所述后代植物；以及
e.筛选对草甘膦耐受的后代植物。
第26项.一种产生玉米杂种种子的方法，包括：
a.在区域内种植转基因玉米事件MON 87427种子；
b.使源自所述种子的玉米植物生长；
c.在花粉形成前以有效剂量的草甘膦除草剂处理所述植物以便在不伤害所述植物的情况下使所述植物雄性不育；
d.用来自第二种亲本植物的花粉使所述植物授粉；以及
e.收获源自所述植物的种子，其中所述种子是通过转基因玉米事件MON 87427植物与第二种亲本植物杂交而产生的玉米杂种种子。
第27项.第26项的方法，其中所述有效剂量的草甘膦除草剂是每英亩约0.1磅至约4磅。
第28项.第26项的方法，进一步包括在所述区域内种植第二种亲本植物并使源自所述第二种亲本植物的玉米植物生长。
第29项.第28项的方法，其中所述第二种亲本植物是草甘膦耐受的。
第30项.预测玉米穗发育的时机的方法，包括选择相对发育尺度的范围，其中所述范围表明向所期望穗发育期的成熟。
第31项.第30项的方法，其中所述期望的穗发育期是对于玉米植物的生殖杂交、穗不育化、去雄或实施发育调节处理的最佳穗发育期。
第32项.第30项的方法，其中用于构建所述相对发育尺度的特定花发育期是在约50％玉米植物群体花粉散落时，其中所述范围为所述相对发育尺度上的约0.62至约0.75。
第33项.第30项的方法，进一步包括在所述期望的穗发育期对玉米植物实施发育调节处理。
第34项.一种产生玉米杂种种子的方法，包括：
a.在区域内种植第一种亲本植物的玉米种子；
b.使源自所述玉米种子的所述第一种亲本植物生长；
c.通过选择相对发育尺度上表明向所期望穗发育期成熟的范围来确定所述第一种亲本植物的穗发育的时机；
d.用所述穗发育时机的确定值来及时地对所述第一种亲本植物实施发育调节处理，进而防止所述第一种亲本植物的自花授粉；
e.对所述第一种亲本植物实施所述发育调节处理；
f.用来自第二种亲本植物的花粉使所述第一种亲本植物授粉；以及
g.收获源自所述第一种亲本植物的种子，其中所述种子是通过所述第一种亲本植物与第二种亲本植物杂交而产生的玉米杂种种子。
第35项.用第34项的方法产生的玉米杂种种子。
第36项.第34项的方法，其中所述发育调节处理是草甘膦，所述第一种亲本植物是组织选择性草甘膦耐受的。
第37项.第36项的方法，其中所述第一种亲本植物是转基因玉米事件MON 87427植物。
第38项.第37项的方法，其中所述第二种亲本植物是草甘膦耐受的。
附图简要说明
图1说明了转基因玉米事件MON 87427的构造，在图中，[A1]、[A2]和[A3]分别对应于横跨在转基因插入序列的5’末端侧翼的玉米基因组DNA和转基因插入DNA的5’部分的SEQID NO：1、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5的相对位置；[B1]、[B2]和[B3]分别对应于横跨在转基因插入序列的3’末端侧翼的玉米基因组DNA和转基因插入DNA的3’部分的SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6的相对位置；[C]对应于包括在转基因插入序列的5’末端侧翼的玉米基因组DNA和转基因插入序列的5’末端部分的SEQ ID NO：7的相对位置；[D]对应于包括在转基因插入序列的3’末端侧翼的玉米基因组DNA和转基因插入序列的3’末端部分的SEQ ID NO：8的相对位置；[E]对应于SEQ ID NO：9和转基因插入序列中各个元件的相对位置；以及[F]代表表示为SEQ ID NO：10并包含SEQ ID NO：1-9的MON 87427的连续序列。
图2显示了当与玉米事件NK603杂交并用草甘膦以每次喷洒每英亩2.25磅的速度每季喷洒两次时，MON 87427杂种的种子产量。
图3显示了在构建相对发育尺度中所用的穗发育期。大概尺寸用方括号表示。在该图中，Vg是营养阶段(vegetative stage)的分 生组织；T0是营养阶段向生殖阶段的转换期；T1是可见的生殖生长点(0.9mm)；T2是可见的侧枝原基(lateral branch primordiavisible)(1.8mm)；T3是可见的小穗原基(spikelet primordia)(4.1mm)；T4是中心轴和侧轴延伸(12.9mm)；T5是花药分化的开始(41.0mm)；T6是花粉分化的开始(175mm)以及T7是花药伸出和花粉散落(285.0mm)。
图4表示了处于两个生长期(V8和V10)3个玉米基因型之间的穗大小的差异。
图5显示了到达T5-期的GDU需要值与到达P50％的GDU需要值之间的相关性，更具体地显示了利用到达T5和到达P50％的GDU需要值之间的相关性获得的回归线。每个点代表在平均各位置点的不同的近交株。
图6显示了相对发育尺度如何揭示通过发生在相对发育尺度上0.62和0.75处的花药挤出风险(anther extrusion risk(AE风险(％)))测定的化学试剂产生玉米穗不育的效率的最佳窗口的例子，其中达到了到达P50的总的GDU需要值的62％–75％，其中AE风险在近交系和成熟组中降到最低。每个数据点代表1个图或两行总共32株植物的平均值。N＝620
图7显示了T-期与GDU(A)和相对发育尺度(B)的函数。每条回归线代表不同的近交株。
图8表示MON 87427和CMS区域(block)在不同吐丝(silking)期(x轴)测定的花药挤出风险的百分比(y轴)。
图9显示了以杂交系统(RHS)通过MON 87427和CMS系统在95％显著性水平产生的杂种种子的种子遗传纯度和种子特征纯度。图表上黑线分别代表种子遗传纯度和种子特征纯度的所需质量标准。
序列简要说明
SEQ ID NO：1是代表玉米基因组DNA与整合的转基因表达盒 之间的5’连接区的20个核苷酸的序列。
SEQ ID NO：2是代表玉米基因组DNA与整合的转基因表达盒之间的3’连接区的20个核苷酸的序列。
SEQ ID NO：3是代表玉米基因组DNA与整合的转基因表达盒之间的5’连接区的60个核苷酸的序列。
SEQ ID NO：4是代表玉米基因组DNA与整合的转基因表达盒之间的3’连接区的60个核苷酸的序列。
SEQ ID NO：5是代表玉米基因组DNA与整合的转基因表达盒之间的5’连接区的100个核苷酸的序列。
SEQ ID NO：6是代表玉米基因组DNA与整合的转基因表达盒之间的3’连接区的100个核苷酸的序列。
SEQ ID NO：7是位于MON 87427的插入DNA侧翼、直到并包括转基因DNA插入的5’序列。
SEQ ID NO：8是位于MON 87427的插入DNA侧翼、直到并包括转基因DNA插入的3’序列。
SEQ ID NO：9是完全整合入玉米基因组DNA并包含表达盒DNA的序列。
SEQ ID NO：10是代表位于MON 87427的插入DNA侧翼的5’序列(SEQ ID NO：7)、完全整合入玉米基因组DNA并包含表达盒的序列(SEQ ID NO：9)和位于MON 87427的插入DNA侧翼的3’序列(SEQ ID NO：8)的叠连群的核苷酸序列，包括SEQ ID NO：1-6。
SEQ ID NO：11是用于鉴定MON 87427的转基因特异性测试事件引物-1SQ20052。由(PE Applied Biosystems，Foster City，CA)测试(使用引物SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12的组合)产生的PCR扩增子对于事件MON87427的存在是阳性结果。
SEQ ID NO：12是用于鉴定MON 87427的转基因特异性测试事件引物-1SQ20053。
SEQ ID NO：13是用于鉴定MON 87427的转基因特异性测试事 件6-FAM探针PB10016。该探针是6-FAMTM-标记的合成寡核苷酸。 测试中，在扩增反应(使用引物SEQ ID NO：11-12结合使用6FAMTM-标记的探针)中释放出荧光信号用于诊断事件MON87427的存在。
SEQ ID NO：14是转基因特异性测试内部对照引物-1SQ1241。
SEQ ID NO：15是转基因特异性测试内部对照引物-1SQ1242。
SEQ ID NO：16是转基因特异性测试内部对照VIC探针PB0084。
SEQ ID NO：17是用于鉴定MON 87427的事件特异性测试事件引物-1SQ12763。由(PE Applied Biosystems，Foster City，CA)测试(使用引物SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18的组合)产生的PCR扩增子对于事件MON87427的存在是阳性结果。
SEQ ID NO：18是用于鉴定MON 87427的事件特异性测试事件引物-1SQ12886。
SEQ ID NO：19是用于鉴定MON 87427的转基因特异性测试事件6-FAM探针PB4352。
发明详述
提供下面的定义和方法以更好地定义本发明并指导本领域普通技术人员实施本发明。除非另有说明，可以根据相关领域的普通技术人员的常规用法来理解术语。
本文所用的术语“玉米”是指“玉米”或玉米(Zea mays)，且包括可与玉米育种的所有植物品种，包括野生玉米种以及那些属于允许种之间育种的玉蜀黍属(Zea)的植物。
“草甘膦”是指N-(磷酰基甲基)甘氨酸，是一种5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)抑制剂除草剂。草甘膦通过抑制EPSPS而干扰芳香氨基酸的合成。草甘膦作为除草剂(Monsanto Company，St.Louis，Missouri)可商业获得。
本发明提供了玉米转基因事件MON 87427(此处也被称为MON87427)。此处所用的术语“事件”是指通过将转基因核酸分子插入植 物基因组的行为(即通过植物转化的动作而产生转基因植物)而生成的产物。因此，“事件”通过以下人类行为而产生：(i)在实验室中以包括感兴趣的转基因的核酸分子转化植物细胞，即将核酸构建体或分子插入植物细胞基因组中，(ii)再生由核酸分子插入植物基因组而导致的转基因植物种群，和(iii)筛选特征为核酸分子插入植物基因组特定位置的特定植物。因此，事件可被代表连续的DNA分子的至少一部分的核酸序列独特并特异地描述，该DNA分子由核酸分子插入植物基因组中特定位置而在事件中产生，并包括一部分连接于插入的DNA分子并在其侧翼的植物自身的基因组DNA和插入的核酸分子。事件是重组的，由人类行为产生的，不存在于非转基因植物中。
因此术语“事件”是指包括插入植物基因组中特定位置的核酸分子的原始转化植物(“转化株”)。术语“事件”也指由包括插入植物基因组中特定位置的核酸分子的转化株传代的所有后代。因此这种后代是转基因的并包含事件。可通过包括自花授粉、与包含相同或不同转基因的另一种植物杂交和/或非转基因植物、如来自不同种的植物杂交而产生后代。甚至在许多代之后，在被称为MON 87427后代植物的任何植物中，来自原始转化的插入DNA和侧翼DNA仍将存在并可轻易地辨认。
术语“事件”也指在原始转化株中生成的连续DNA分子(包括插入DNA和与插入DNA的任一侧紧紧相邻的侧翼玉米基因组DNA)和包含该核酸序列的任何DNA分子。通过将转基因核酸分子插入植物基因组的行为，即通过转化的行为生成连续DNA分子，其对于特定事件是特异且独特的。因此，插入DNA在与周围玉米植物基因组DNA相关的玉米事件MON 87427中的排列对于MON 87427是特异且独特的。该DNA分子也是事件MON 87427的玉米染色体的主要部分，这在植物中是稳定的，可被任何后代继承。
转基因玉米事件MON 87427植物表现了商业可接受的组织选择性草甘膦耐受性。在MON 87427中，玉米营养组织和玉米雌性生殖组织是 草甘膦耐受的，但是对于玉米花粉发育关键的关键雄性生殖组织对草甘膦不耐受。因此，草甘膦处理的MON 87427植物在杂种种子的生产中可作为雌性亲本。
本文所用的术语“重组”是指通常不能在自然界中发现并且通过人为干预、即人类手工产生的非天然的DNA和/或蛋白和/或生物体。这种人类干预可产生DNA分子和/或植物或种子。此处所用的“重组DNA分子”是包括并不自然地共同存在而且是人类干预的结果的DNA分子的组合的DNA分子，即由至少两种彼此异源的DNA分子组成的DNA分子，和/或人工合成并具有衍生自自然中通常存在的核苷酸序列的核苷酸序列的DNA分子，和/或包括人工加入宿主细胞的基因组DNA和侧翼的宿主基因组的相关DNA的DNA分子。重组DNA分子的一个例子是包含至少一条选自SEQ ID NO：1-10的序列的DNA分子。此处所用的“重组植物”是在自然接种不存在，是人类干扰的结果并且包含并入其基因组中的转基因和/或异源DNA分子的植物。作为这种基因组改变的结果，重组植物与相关的野生型植物明显不同。重组植物的一个例子是转基因玉米事件MON 87427植物。
此处所用的术语“转基因”是指人为干预导致的人工并入生物体基因组的核酸分子。这种转基因对于宿主可以是异源的。术语“转基因”是指包含转基因，例如“转基因植物”是指包含转基因、即人为干预导致的人工并入生物体基因组的植物。此处所用的术语“异源的”是指通常在自然界中不存在的第一分子结合自然界中的第二分子。例如，分子可来自第一物种并插入第二物种的基因组中。因此该分子是异源分子，即对于生物体是异源的，被人工并入生物体的基因组中。
此处所用的术语“嵌合的”是指通过将第一DNA分子与第二DNA分子融合而产生的单一DNA分子，其中无论第一DNA分子还是第二DNA分子通常都不会以这种结构(即彼此融合)存在。因此，嵌合DNA分子是一种新的、在自然中通常不存在的DNA分子。嵌合DNA分子的一个例子是包含至少一条选自SEQ ID NO：1-10的序列的DNA分子。
本发明提供了DNA分子及其对应的核苷酸序列。此处所用的术语“DNA”、“DNA分子”、“核酸分子”是指基因组或合成来源的双链DNA分子，即脱氧核糖核苷酸碱基的聚合物或核苷酸分子，从5’端(上游)至3’端(下游)阅读。此处所用的术语“DNA序列”、“核苷酸序列”是指DNA分子的核苷酸序列。此处所用的命名法是美国联邦法规§1.822的第37条所要求的，记述在WIPO标准ST.25(1998)附录2的表1和3。按照惯例和此处所用的本发明的核苷酸序列、如SEQ ID NO：1-10提供的那些及其片段，仅提供了两条互补核苷酸序列链中的一条链，但暗示，互补链(即互补链的序列，在本领域中也称为反向互补序列)也在本发明的范围之内且清楚地落在要求保护的客体范围之内。因此，此处所用的关于SEQ ID NO：1-10及其片段包括并指的是互补链的序列及其片段。
此处所用的术语“片段”是指完整部分中的不完整的更小片段的部分。例如，SEQID NO：10的片段包括SEQ ID NO：10的完整序列的至少约10个核苷酸、至少约20个核苷酸或至少约50个核苷酸的序列。
对应于插入的转基因DNA和插入的转基因DNA任一末端侧翼的玉米基因组DNA实质片段的完整核苷酸序列的核苷酸序列此处作为SEQ ID NO：10提供。其一个分段是作为SEQID NO：9提供的插入的转基因DNA(此处也被称为转基因插入序列或插入的DNA)。通过磷酸二酯键与插入的转基因DNA的5’末端物理连接、因此在其侧翼并包含10个核苷酸的转基因插入DNA的玉米基因组DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。通过磷酸二酯键与插入的转基因DNA的3’末端物理连接、因此在其侧翼并包含10个核苷酸的转基因插入DNA的玉米基因组DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。
MON 87427进一步包含被称为接头的两个区段。“接头”是插入的转基因DNA的一个末端插入并连接至基因组DNA的地方。接头横跨、即延伸通过插入的转基因DNA的一部分和相邻侧翼基因组DNA，其包含这两个作为一个连续分子的连接点。一个接头在插入的基因组DNA的5’末端，一个在插入的基因组DNA的3’末端，在 此处分别被称为5’接头和3’接头。“接头序列”或“接头区段”是指接头的DNA序列和/或相应的DNA分子。本领域技术人员可以用SEQ ID NO：10设计MON 87427的接头序列。MON 87427的接头序列的例子作为SEQ ID NO：1-6提供。SEQ ID NO：1是横跨玉米基因组DNA和基因组插入DNA的5’末端间接头的20个核苷酸的序列；SEQ ID NO：3是横跨玉米基因组DNA和基因组插入DNA的5’末端间接头的60个核苷酸的序列；SEQ ID NO：5是横跨玉米基因组DNA和基因组插入DNA的5’末端间接头的100个核苷酸的序列。SEQ ID NO：2是横跨玉米基因组DNA和插入的DNA的3’末端间接头的20个核苷酸的序列；SEQ ID NO：4是横跨玉米基因组DNA和插入的DNA的3’末端间接头的60个核苷酸的序列；SEQ ID NO：6是横跨玉米基因组DNA和插入的DNA的3’末端间接头的100个核苷酸的序列。图1说明了从5’至3’排列的SEQ ID NO：1-10的物理排列。包括SEQ ID NO：1-6的源自转基因MON 87427的任何DNA片段都在本发明的范围之内。本发明因此提供了包含SEQ IDNO：1-6中所述的核苷酸序列的至少一个的DNA分子。
事件MON 87427的接头序列作为转基因玉米事件MON 87427植物、种子或细胞的基因组的部分而存在。在来自玉米植物、种子或植物部分的样品中鉴定SEQ ID NO：1-6中的一个或多个可确定DNA从MON 87427中获得，且用于诊断来自事件MON 87427的DNA样品的存在。
本发明提供了可用作用于诊断样品中来自玉米植物事件MON 87427的DNA的存在的引物或探针的示例性DNA分子。这种引物或探针对于目标核酸序列是特异的，可用于通过此处所述的本发明的方法鉴定MON 87427核酸序列。
“引物”是被设计用于涉及热扩增的退火或杂交方法中的核酸分子。在热扩增、如聚合酶链式反应(PCR)中可使用一对引物和模板DNA、如玉米基因组DNA样品以产生扩增子，其中由这种反应产生的扩增子具有对应于位于引物和模板杂交的两个位点之间的模 板DNA的序列的DNA序列。此处所用的“扩增子”是用扩增技术合成的DNA。本发明的扩增子具有包含SEQ ID NO：1-10或其片段的一个或多个的序列。通常设计引物来与互补的目标DNA链杂交以在引物和目标DNA链之间形成杂交链，以目标DNA链为模板，引物的存在是聚合酶起始引物延伸(即将额外的核苷酸聚合加入延伸的核苷酸分子)的识别点。本发明所用的引物对是指使用两条结合双链核苷酸片段的相反链的两条引物，其目的在于在针对引物对的每一条结合的位点之间线性扩增核苷酸片段。引物序列的例子作为SEQ ID NO：11-12、SEQ IDNO：14-15和SEQ ID NO：17-18提供。引物对SEQ ID NO：14-15和引物对SEQ ID NO：17-18各自具有第一DNA分子以及第二DNA分子(不同于第一DNA分子)，其中二种分子各自都是长度足以作为DNA引物的连续核苷酸，当与来自MON 87427的模板DNA在DNA扩增反应中共同使用时，可以产生用于诊断样品中源自MON 87427的DNA存在的扩增子。
“探针”是用于退火或杂交方法中的与目标核酸的链互补的核酸分子。本发明的探针不仅包括脱氧核糖核酸或核糖核酸，而且包括特异性地结合靶DNA序列的聚酰胺和其它探针材料，并且这种结合可用于诊断、识别、确定或验证具体样品中靶DNA序列的存在。探针可结合于常规可检测的标记或报告分子，例如放射性同位素、配体、化学发光试剂或酶。可用作检测MON 87427的探针的序列的例子是SEQ ID NO：1-2、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：19。
设计和使用引物和探针的方法是本领域熟知的，例如在Joseph Sambrook，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Third Edition，Cold Spring HarborLaboratory Press(2001)和Current Protocols in Molecular Biology，Wiley-Blackwell中描述。包含SEQ ID NO：1-10的片段并可用作检测MON 87427的引物和探针的DNA分子可以被本领域技术人员容易地设计用作杂交检测方法、例如Southern印迹方法中的探针。
因此，此处所示的DNA分子及对应的核苷酸序列可用于例如鉴定MON 87427，筛选包含MON 87427的植物品种或杂种，检测样品中来自转基因MON 87427的DNA的存在以及监测样品存在和/或缺乏MON 87427或来自MON 87427的植物部分。
本发明提供了玉米植物、后代、种子、植物细胞、植物部分以及商业产品。这些植物、后代、种子、植物细胞、植物部分和商业产品包含可检测量的本发明的核苷酸，即，如具有至少如SEQ ID NO：1-10所示的一个序列的核酸分子。本发明的植物、后代、种子、植物细胞和植物部分也包含一种或多种额外转基因。这种转基因可以是编码蛋白或RNA分子的任何核苷酸序列，该蛋白或RNA分子赋予期望的特性，包括但不限于增强的昆虫抗性、增强的水利用效率、增强的产量性能、增强的抗旱性、增强的种子质量、改进的营养质量和/或增强的除草剂耐受性，其中该期望的特性是相对于缺乏该额外转基因的玉米植物而测定的。
本发明提供了源自转基因玉米植物事件87427的玉米植物、后代、种子、植物细胞、植物部分以及叶子。为了实现本发明，MON 87427的种子的代表性样品已经根据布达佩斯条约进行了保藏。选择接受该保藏的保藏中心是美国典型培养物保藏中心(ATCC)，其地址为10801University Boulevard，Manassas，Virginia USA，邮编20110。该ATCC保藏中心将登录号No.PTA-7899分配给该事件MON 87427的种子。
本发明提供了含有具有其基因组中存在的SEQ ID NO：1-10的DNA分子的微生物。这种微生物的一个例子是转基因植物细胞。微生物，如本发明的植物细胞，可用于许多工业应用，包括但不限于：(i)用作科学探究或工业研究的研究工具；(ii)在培养中用于产生内源的或重组的可用于随后的科学研究或用作工业产品的碳水化合物、脂质、核酸或蛋白产品或小分子；以及(iii)可与植物组织培养技术一起使用以产生随后可用于农业研究或生产的转基因植物或植物组织培养物。微生物如转基因植物细胞的生产和使用应用微生物技术和人类干预以产生人造的独特的微生物。在该过程中，重组DNA被插入植物细胞基因组以产生与天然存在的植物细胞分离且独特的转基因植物细胞。然后该转基因植物细胞可以用现代微生物技术像细菌和酵母细胞一样培养，可以未分化的单细胞状态存在。新的植物细胞的转基因组成和表型是由异源DNA整合进细胞基因组而产生的技术效果。本发明的另一方面是使用本发明的微生物的方法。本发明的使用微生物如转基因植物细胞的方法包括(i)通过将重组DNA整合进细胞基因组，然后用该细胞衍生具有同样异源DNA的额外细胞的方法；(ii)用现代微生物技术培养包含重组DNA的细胞的方法；(iii)产生并纯化内源或重组的来自培养细胞的碳水化合物、脂质、核酸或蛋白产品的方法；以及(iv)使用现代植物组织培养技术和转基因植物细胞以产生转基因植物或转基因植物组织培养物的方法。
本发明的植物将事件DNA(包括转基因插入序列)传至后代。此处所用的“后代”包括包含源自祖先植物的事件DNA和/或具有至少如SEQ ID NO：1-10所示序列中一条序列的核酸分子的任何植物、种子、植物细胞和/或再生植物部分。植物、后代和种子对于该基因而言可以是纯合的或杂合的。后代可由MON 87427植物产生的种子和/或与MON 87427植物的花粉受精的植物产生的种子生长而成。本发明的植物可通过自花授粉或异花授粉产生和/或被用于自花授粉或异花授粉方法中。因此，在一种实施方式中，MON 87427植物可以被不同的玉米植物异花授粉而产生杂种后代。可用于MON 87427玉米植物的育种方法是本领域已知的。
本发明提供了源自MON 87427的植物部分。此处所用的“植物部分”是指由源自MON87427植物的材料组成的植物的任何部分。植物部分包括但不限于：花粉、胚珠、荚、花、根或茎组织、纤维和叶。植物部分可以是活的、非存活的、可再生的和/或不可再生的。
本发明提供了由转基因玉米事件MON 87427产生并包含具有选自SEQ ID NO：1-10的核苷酸序列的核酸分子的商业产品。此处所 用的“商业产品”是指由源自MON 87427植物、种子、植物细胞或植物部分的材料组成的任何组合物或产品。商业产品可以是活的或非存活的。非存活的商业产品包括但不限于非存活的种子和谷粒；加工的种子、种子部分和植物部分；脱水的植物组织、冷冻的植物组织和加工的植物组织；被加工用于陆地的和/或水生动物消耗的动物饲料的种子和植物部分，油、膳食、面粉、薄片、糠、纤维、牛奶、奶酪、纸、奶油、酒和其它任何供人类消耗的食物；以及生物质和燃料产品。活的商业产品包括但不限于种子和植物细胞。因此转基因玉米事件MON 87427可用于生产通常是由玉米获得的任何商业产品。源自MON 87427的商业产品可包含可检测量的对应于MON87427的特异且独特的DNA，可特异性地包含可检测量的具有至少一条如SEQ ID NO：1-10所提供的序列的核酸分子。在源自、构成为、组成为或包含玉米植物、玉米种子、玉米植物细胞或玉米植物部分的商业产品的样品中检测一种或多种这些序列可决定和测定在这种商业样品中源自玉米事件MON87427的生物材料的存在，这种核酸分子的检测可用于确定商业产品的含量和/或来源。可使用核酸分子的任何标准检测方法，包括此处公开的检测方法。
因此本发明的植物、后代、种子、植物细胞、植物部分和商业产品可用于例如出于农业目的为了产生MON 87427种子和/或植物部分而使植物生长，出于植物育种和研究目的而产生MON 87427的后代，出于工业和研究应用而使用微生物技术和销售给消费者。
本发明提供了用草甘膦除草剂和MON 87427控制杂草的方法。提供了在田间控制杂草的方法，包括将MON 87427变种或杂种植物种植于田间，为了不伤害MON 87427植物的同时控制田间杂草而将除草有效剂量的草甘膦应用于田间。这种草甘膦除草剂的应用可在萌芽前，即在MON 87427种子种植后且MON 87427植物萌芽前的任何时间，或萌芽后，即在MON 87427植物萌芽后的任何时间。田间使用的用于控制杂草的除草有效剂量的草甘膦的范围为一个生长季节每英亩约0.1磅至每英亩4磅草甘膦。草甘膦的多种应用可用于， 在一个生长季节中，两种应用(如种植前应用和萌芽后应用或萌芽前应用和萌芽后应用)或三种应用(如种植前应用、萌芽前应用和萌芽后应用)。
提供了产生除草剂耐受的转基因玉米事件MON 87427植物的方法。这些方法产生的后代可以是变种或杂种植物；可由MON 87427植物产生的种子和/或与用MON 87427植物的花粉受精的植物产生的种子生长而成；可对于该转基因而言可以是纯合的或杂合的。后代可随之为自花授粉或异花授粉的。
可通过将包含具有至少一种选自SEQ ID NO：1-10的序列的核酸分子的MON 87427植物与另一种玉米植物进行有性杂交、然后产生种子、随后收集并生长为后代植物而产生耐受草甘膦除草剂应用的玉米植物。然后用草甘膦除草剂处理这些后代并可筛选出对草甘膦除草剂耐受的后代。另外，可以用诊断方法分析这些后代植物以筛选包含MON 87427 DNA的后代植物。
在实施本发明的方法时，可通过人类干预而完成或帮助一种植物与另一种植物有性杂交的步骤，即异花授粉，例如：通过手工收集一种植物的花粉并将该花粉与第二种植物的花柱或柱头接触，然后任选地阻止受精植物的进一步受精；通过人手和/或行为去除(例如通过去雄)、破坏(例如通过应用化学试剂)或覆盖植物的雄蕊或花药以便防止自然的自花传粉以及为了受精而发生异花传粉；通过人为将传粉昆虫放置到“定向授粉”的位置(例如，通过在果园或田间设置蜂房或通过将植物和传粉昆虫关闭在一起)；通过人为开放或去除花的部分以允许外来花粉在花柱或柱头上的放置或接触(例如，在天然具有阻碍或防止异花授粉的花的玉米中，使其在没有人为干预的情况下成为天然的强制自花传粉种)；通过特定区域的植物的选择性替换(例如故意将植物种植于传粉邻近区)；和/或应用化学物质以沉淀开花或阻止(花粉的柱头)的感受能力。
在实施本发明的方法时，可通过人类干预而完成或帮助玉米植物通过自花受精而有性受精的步骤，即自交，例如：通过手工收集 植物的花粉并将该花粉与相同植物的花柱或柱头接触，然后任选地阻止受精植物的进一步受精；通过人手和/或行为去除(例如通过去雄)、破坏(例如通过应用化学试剂)或覆盖植物的雄蕊或花药以便防止自然的自花传粉以及为了受精而发生手工的自花传粉；通过人为将传粉昆虫放置到“定向授粉”的位置(例如，通过将植物和传粉昆虫单独关闭)；通过人为操作植物的生殖部分以允许或增强自花传粉；通过植物的选择性放置(例如故意将其它植物远离传粉邻近区种植)；和/或通过应用化学物质以沉淀开花或阻止(花粉的柱头)的感受能力。
本发明提供了可用于玉米杂种种子生产中的植物和方法。
玉米植物具有分开的雄性和雌性开花部分。穗是植物的雄性结构，耳穗(earshoot)是植物的雌性开花结构。玉米的花期(flowering stage)涉及花粉散落(pollenshed)和吐丝(silking)。玉米花粉可与相同植物(自花授粉)或不同植物(异花授粉)受精。如果在花粉散落前植物的雄性结构没有被去除，那么玉米植物在某种程度上将自花授粉。对于杂种种子的生产，第一种玉米植物的雌性结构与第二种玉米植物的花粉进行异花授粉。因此，有效的杂种种子生产需要不允许使植物自花授粉的植物的自身花粉。此处提供的增加玉米杂种种子生产的方法包括将包含MON 87427的种子或植物与一种或多种其它的玉米植物生长在一个区域。然后在花粉形成之前用草甘膦处理事件MON 87427植物，因此使事件MON 87427植物雄性不育，不能自花授粉。然后用此处所述的任何方法用来自其它玉米植物的花粉使事件MON 87427植物授粉。其它玉米植物可对草甘膦耐受的或不耐受的。然后从事件MON 87427植物收获玉米种子，其中从处理的MON 87427植物收获的种子比从未处理的事件MON87427植物或从相同条件下其它玉米植物收获的玉米种子具有更高产量的玉米杂种种子(即更高百分比的收获的杂种种子或更高的杂种种子纯度)。从相同条件下未处理的事件MON 87427植物收获的玉米种子具有更高百分比的非杂种种子(即通过自花授粉产生的杂 种种子)以及更低产量的玉米杂种种子。
本发明的植物和方法也可与本领域已知方法一起用于玉米育种目的，本领域已知方法如美国专利号7，314，970(其全部通过引用方式结合在本文中)和美国专利号20090165166(其全部通过引用方式结合在本文中)中描述的方法。
这些方法所涵盖的以及用这些方法产生的植物、后代和种子与其它玉米植物不同。例如，本发明的MON 87427植物、后代和种子是转基因且重组的，因此由人类干预产生，包含可检测量的具有至少一条如SEQ ID NO：1-10所示的序列的核酸分子。
因此本发明的方法可用于例如出于农业或研究目的为了产生MON 87427种子和/或植物部分而使植物生长时控制田间杂草，出于植物育种或研究目的而筛选MON 87427的后代，以及产生MON 87427的后代植物和种子。
可以评价本发明的植物、后代、种子、植物细胞、植物部分和商业产品的DNA组成、基因表达和/或蛋白表达。这种评价方法可通过使用标准方法如PCR、northern印迹、southern分析、western印迹、免疫沉淀和ELISA或通过使用此处提供的检测方法和/或检测试剂盒而进行。
提供了检测样品中对MON 87427特异的物质的存在的方法。可通过任何本领域采用的核酸检测方法如聚合酶链反应(PCR)或DNA杂交而使用本发明的探针和引物检测本发明的核酸分子的存在。提供的一种方法包括通过将DNA样品与能从事件MON 87427DNA中产生扩增子的引物对接触、进行扩增反应并因此产生包含至少一条如SEQ ID NO：1-10所示的序列的DNA扩增子、然后检测扩增子分子的存在或缺失以及任选地在扩增子的序列中验证包含至少一条如SEQ ID NO：1-10所示的序列的存在。这种扩增子的检测可以确定和/或诊断样品中MON 87427特异DNA以及MON 87427生物材料的存在。提供的另一种方法包括将DNA样品与DNA探针接触、使探针和DNA样品经受严格的杂交条件，然后检测探针和目标DNA 样品间的杂交。杂交的检测可诊断DNA样品中MON 87427特异性DNA的存在。可以通过本领域已知的任何方法完成核酸扩增、核酸杂交和DNA测序。用于实施本发明的一个示例性技术是(PE Applied Biosystems，Foster City，CA)。
可以通过使用源自本发明提供的序列的引物扩增来自所述事件的这种序列，接着对扩增子或克隆的DNA进行标准DNA测序，来验证(如果必要，校正)来自MON 87427(典型种子样品已经作为ATCC PTA-7899保藏)的异源DNA插入序列、连接序列或侧翼序列。
提供了DNA检测试剂盒。可以使用此处公开的组合物和方法以及DNA检测领域公知的方法开发这种试剂盒的变型。DNA检测试剂盒可用于鉴定样品中的MON 87427DNA，且可以应用于培育含有MON 87427DNA的玉米植物的方法。这种试剂盒可包含与SEQ ID NO：1-10或其片段相似或互补的DNA引物或探针。
因此，本发明的试剂盒和检测方法可用于例如鉴定MON 87427，筛选包含MON87427的植物品种或杂种，检测样品中来自转基因MON 87427的DNA的存在以及监测样品存在和/或缺乏MON 87427或来自MON 87427的植物部分。
本发明提供了可用于监控和/或确定玉米中生殖发育的相对发育尺度。通过提供表述相对于开花期的穗发育期的时间尺度，这种新的相对发育尺度解决了玉米品种和近交系间的生长和生殖成熟差异。相对发育尺度减小了观察到的基因型间的穗发育和穗生长的差别。图3显示了在各个成熟期中的穗发育。
通常根据营养事件(通常称为V期)的期尺度来确定玉米的发育。这些期根据其中可见叶颈的最上部叶来定义这些期。VE对应于萌芽期，V1对应于第一叶，V2对应于第二叶，V3对应于第三叶，V(n)对应于第n叶。当穗的最后分枝可见但在吐丝出现之前，VT发生。当对田间的玉米分期时，仅仅当田间50％或更多的植物在该期或超过该期时，方才定义每一个特定的V-期。然而，使用这种营养 度量来确定生殖成熟度可由如下事实所复杂化：所有基因型间营养生长不必与生殖发育相关联。此外，不是所有的近交系分化出相同数量的叶子，田间巡查结果并不总是与它们的评估值相一致，最早分化的叶子在季中相当早期便开始衰老，所以如果叶子在早期不进行正确的标记，后面正确地鉴定V-期会变得很困难。
另一种预测和估计玉米生长和发育期的常用工具是生长度单位(GDU)。在玉米生长和发育中的一个因素是热。通常在一个单一时间点测热，其被表示为温度，但它也可以在一个时间期间测量，被表示为热单位。这些热单位通常被称为GDU。GDU可被定义为经受某种限制的平均每日温度和选定的基础温度之间的差别。使用下列公式计算GDU：
生长度单位＝{(H+L)/2}–B
其中H是每日高温(但不高于86°F)，L是每日低温(但不低于50°F)，B是50°F的基础值。因为当温度高于86°F或低于50°F时玉米生长很慢，因此在公式中所用的每日高温和低温设定了限值。每日温度的较低截止值也防止了负数值的计算。因此，如果每日高温超过86°F，那么在GDU公式中所用的每日高温将被设定在86°F。相反，如果每日低温低于50°F，那么在GDU公式中所用的每日低温将被设定在50°F。如果每日高温不超过50°F，那么该天就不记录GDU。玉米植物一天可累积的最高GDU为36，最低为0。通过每日GDU的值相对于特定时间量的总和来鉴定玉米植物的成熟指数。大多数玉米种子生产者使用的时间期间是从种植点到生理成熟或谷粒几乎完全充实的点。在美国的大部分州，大部分地理地区都保留了累积GDU，可以从USDA Crop Reporting Service或State Extension Services获取。此外，在美国专利号6,967,656中描述了获取特定位置GDU信息的仪器，该专利的全部通过引用方式结合在本文中。就V-期而言，GDU测定值相对于穗发育期在基因型间差异很大，不是可靠的穗发育的预测指标。
此处所述的“相对发育尺度”被定义为通过将给定穗发育期的 GDU除以到达花粉散落的特定期所需的GDU而产生的尺度。然后用每种基因型或近交品种的此信息构建回归线。可以用此处所述的方法构建相对发育尺度，它是基于达到特定玉米花发育期相对于到达给定穗发育期必需的GDU需要值之间的关系。同样，相对发育尺度可用于各种基因型和近交品种间的玉米中预测穗发育，可在植物育种和农业方法中被用作V-期和GDU的替代方案。
此处所用的“花发育期”根据植物群体花粉散落的程度而定义，被称为P-期。花发育期被表示为Px，其中P代表“花粉”，“x”表示在群体中花粉散落的植物的百分比。本发明的相对发育尺度基于通过将给定穗发育期的GDU除以到达花粉散落的特定期所需的GDU而衍生的回归。这可以如下表示：
相对发育尺度＝(到达Tn的GDU/到Px的GDU)
其中“到达Tn的GDU”是到达特定穗发育期所需的GDU(生长度单位)的值，其中n范围为0-7，其中“到Px的GDU”是到达特定花发育期或P-期所需的GDU的值，其中n范围为0-100(其一个例子就是被定义为田间50％植物开始花粉散落的P50)。
回归关系可基于任何穗发育期和花发育期或P-期的GDU需要值之间的关联关系。这种关联关系通过将到达特定穗发育期所需的GDU除以到达特定花发育期或P-期所需的GDU而表示。在本发明的一种实施方式中，用于回归关系的花发育期或P-期是P50，其中玉米植物群体的50％花粉散落。在另一种实施方式中，用于计算回归关系的花发育期或P-期可以从约1％至100％，包括约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98和99％。用于回归的穗发育期可以是T0和T7之间，如T0、 T1、T2、T3、T4、T5、T6、和T7。无论被挑选用于生成回归关系的是穗发育期和花发育期，相对发育尺度基于通过绘制到达花粉散落的特定期所需的GDU相对于到达给定穗发育期的GDU数值的关系而获得。图5显示了这个方面。此处所用的术语“确定”是指测定、评估、评价、估计、监测和/或预测的行为。例如，此处所用的“确定穗发育”包括测定穗发育的目前期、监测穗发育的进展、和/或预测穗发育未来期的发生。
因此，本发明提供了产生相对发育尺度的方法，包括测定玉米植物群体成熟到达特定穗发育期所需的生长度单位；测定所述玉米植物群体成熟到达特定花发育期所需的生长度单位；以及通过将所述玉米植物群体成熟到达所述特定穗发育期所需的生长度单位除以所述测定的所述玉米植物群体成熟到达所述特定花发育期所需的生长度单位而生成回归线。测定步骤可对于至少两个群体的玉米植物进行重复。测定步骤可对于多个穗发育期和/或多个花发育期进行重复。特定花发育期可以是约50％玉米植物群体发生花粉散落。
本发明也提供了确定对于穗发育相关的处理方案的相对生长尺度上的最佳范围，因此允许使用者确定其中发育期是重要因素的处理方案的最佳时机。它的一个例子是在玉米杂种种子的生产中在多样的亲本基因型间应用单一通用化学试剂处理方案达到导致玉米穗不育的最佳效果，而不论基因型或成熟组。
此处所述的术语“杂种种子”是通过两种植物的异种授粉而产生的种子。由杂种种子生长而成的植物可改进了农业特征，如更好的产量、更佳的均一性和/或抗病性。杂种种子并不繁殖纯种，即通过杂种植物(由杂种种子生长而成的植物)自花授粉而产生的种子不能可靠地产生相同杂种植物中的下一代植物。因此，用于种植新的杂种种子必须由亲本植物系产生。由于大部分农作物植物既有雄性又有雌性器官，杂种种子仅仅可通过防止雌性亲本的自花授粉并允许或帮助与所需花粉的授粉而产生。有许多防止雌性亲本自花授粉的方法，一种防止自花授粉的方法是在花粉散落前将花粉产生器官 机械摘除。商品化的玉米(maize，Zea mays)杂种种子生产通常涉及通常在隔离的田地中的分开的行或块中种植所需的雄性和雌性亲本系、处理雌性亲本植物以防止花粉散落、确保雌性仅仅被指定的雄性亲本授粉以及仅仅从雌性亲本收获杂种种子。杂种种子可以是单杂交(例如，两种近交系之间的第一代杂交)、修饰的单杂交(例如，两种近交系之间的第一代杂交，通过使用关系紧密的杂交而使其中一种或另一种被稍稍修饰)、双杂交(例如，两种单杂交之间的杂交的第一代)、三系杂交(例如，单杂交和近交系之间的杂交的第一代)、顶交(例如，近交系和开放传粉的品种之间的杂交的第一代或单杂交和开放传粉的品种之间的杂交的第一代)或开放传粉的品种(例如，被选为标准、可显示变化但具有品种能与其它品种区别的特征的植物群体)的结果。
在杂种种子生产中，可在雌性亲本植物中阻止花粉生产和/或散落以帮助雌性仅仅被指定的雄性亲本授粉并因此产生杂种种子。这种阻止措施可通过本领域技术人员已知的任何方法或方式实现，包括但不限于手工或人手去雄、机械去雄、使用授粉控制的遗传方法和/或使用化学试剂。这些方法中的任意方法可以是结合或单独使用的。去雄可以手工或用手进行，通常通过从玉米植物人工去除穗、通常通过拉掉穗而进行。机械或机器去雄通常采用被称为“切割机”的去雄机器，其穿过成行的玉米移动并切除植物的顶端部分。然后几天后“牵拉”机器穿过玉米行移动并通过将穗抓在两个高速移动的滚筒之间而将植物的穗拉掉。本发明方法的实施中可用的机械去雄器包括安装在高清除机(high clearancemachine)上的那些。剪切机可以是用于剪切或撕碎玉米植物包括穗的顶部的在从水平到垂直的不同平面上操作且高度可调的旋转叶片或刀片。牵拉机可以是两个高度可调且以相反方向滚动的小轮或滚筒，抓住穗和上面的叶子，以手部去雄操作相当的方式将它们往上拉。牵拉机和切割机可以分开或一起和/或与其它去雄方法结合使用。去雄的时间窗口对于玉米杂种种子生产中的期间管理最为关键和困难。在本领域中，也使用 化学试剂和/或遗传方法来防止活的花粉形成或花粉散落。
本发明提供了通过选择相对发育尺度上的范围而确定穗发育的时机的方法，其中该选择的范围表明向所期望穗发育期的成熟。期望的穗发育期为T0至T7期，例如T5期。特别感兴趣的穗发育期是生殖杂交的最佳穗发育期、穗不育或去雄的最佳穗发育期、和/或对玉米植物实施发育调节处理的最佳期。在构建和使用相对发育尺度中，用于构建相对发育尺度的特定花发育期可以是约50％玉米植物群体发生花粉散落。本发明方法使用的方法可用的相对发育尺度的示例性范围是相对发育尺度上的约0.62至约0.75。
测定穗发育的时机对于涉及植物发育特异性的实践的计划和/或标准化的农业方法是有用的。其例子包括：需要化学试剂的及时应用的方法，如在具有差异较大的成熟度的近交系间应用除草剂、杀真菌剂、肥料和/或生长调节剂；需要监测、预测和/或调节穗发育的方法，如监测雄性近交系的早期穗发育，其可导致减少的花粉散落，以及需要提供合适的处理以影响穗发育；需要及时地应用激素和/或生长调节剂以修正不平衡和/或产生期望的农业结果的方法；和/或需要在所述期望的穗发育期将发育调节处理施加于玉米植物的任何方法。本发明可用于计划和/或研究工作的领域中，如预测去雄或植物发育相关的工作需求；预测穗发育相关的需求；确定压力如何影响穗发育；和/或用于在通过预测穗发育期所确定的特定发育期强加压力而筛选和评价特征和/或近交系或杂种。
本发明提供了用于通过相对发育尺度确定何时发育调节处理最有效的方法。此处所用的术语“发育调节处理”是指应用至少一种影响植物发育的物理处理和/或化学试剂。植物的发育包括但不限于花发育、根部发育、叶子发育、茎发育、穗发育、生殖发育、配子发育、花粉发育、种子发育和/或任何其它部分的发育。调节处理可导致发育被终止、迟缓、阻止、延迟或增强。发育调节处理可以是物理处理，如去雄、喷射(作为延迟成熟的方式使用火把烧烤雄性植物的顶部)和/或研磨、摩擦、刮擦、划伤、切割、穿孔、超声处理、 分离、破坏、去除、压碎、修剪和/或覆盖任何植物部分。发育调节处理可以是化学试剂，如天然化合物或合成化合物。可用作发育调节处理的化学试剂包括植物生长调节剂、植物生长调节剂抑制剂、植物激素、植物激素抑制剂、植物生长刺激剂、植物生长阻滞剂、杀真菌剂、杀虫剂、除草剂、生长素、抗生长素、细胞分裂素、脱叶素、乙烯抑制剂、乙烯释放剂、赤霉素、形态素和杀配子剂。用于本发明方法中的示例性物理处理是去雄和/或灼烧。用于本发明方法中的示例性化学试剂是除草剂草甘膦。可在任何期将发育调节处理应用于玉米植物，例如当穗生长期对应于相对发育尺度上的0.62至0.75的范围(其包括T5穗发育期)时。提供的用相对发育尺度鉴定应用穗发育调节处理的最有效的期间的能力是本发明的一个方面。许多穗发育调节处理，包括能够防止花粉发育或防止花粉散落的化学试剂，是本领域已知的，可用于本发明方法的实施中。
本发明可用于通过使用本发明的方法产生杂种种子。本发明提供了用于第一种亲本玉米植物与第二种亲本玉米植物杂交的方法，其中应用发育调节处理可以抑制第一种亲本玉米植物的花粉产生。本发明的方法可用于确定应用发育调节处理的是最有效的发育期和/或时机。本发明尤其可用于美国专利号6,762,344和美国专利申请公开号No.2009/0165166中提供的方法中。在一种实施方式中，本发明是用本发明的方法产生的杂种种子，包括由杂种种子生长而成的植物和植物部分以及由此产生的商业产品。
本发明提供了使用用于杂种种子生产的转基因玉米事件MON87427植物，其中草甘膦被用作MON 87427植物中的穗发育调节处理以防止花粉形成。这基于通过及时应用草甘膦而防止含MON87427的雌性亲本系花粉散落进而防止自花授粉发生的能力。如果相对于穗形成太早应用草甘膦，雄性生殖体对于完整效果的处理可能是发育不足的。如果相对于穗形成太晚应用，花药挤出可能已经正在进行，草甘膦处理不能够防止花粉发育。因此，相对于穗发育应用草甘膦的时机对于保证最佳效率以及因此的产生的杂种种子的最 高纯度是重要的。在一种实施方式中，可通过使用相对发育尺度确定MON 87427植物的穗发育的时机并选择显示向期望穗发育期的成熟度的相对发育尺度上的范围而鉴定用于该方法的草甘膦应用的最佳时机。然后可用这种穗发育时机的确定值鉴定将草甘膦作为发育调节处理应用于MON 87427植物、进而防止自花授粉并增加杂种种子生产的时机。本发明的方法揭示了，对于将草甘膦应用于MON 87427植物以防止花粉形成而言，相对发育尺度上的0.62至0.75的范围或T5的穗发育是最佳范围。因此，在杂交系统中，对于任何给定成熟度组的任何给定亲本雌性系，通过该亲本雌性系到达P50所需的GDU乘以该范围内的任何值而预测最佳时间。当该计算的结果等于该生长季的GDU时，就获得了草甘膦应用的最佳时间。也可用其它花粉散落基准或其它T-尺度基准来产生相对发育尺度，也不会偏离本发明的范围。
本发明的另一方面提供了可用于确定其中生殖杂交最佳的穗发育期的方法。与基因型间的发育差异妨碍单独地基于V-期或GDU的可靠地预测最佳调节处理的方式相似，异花授粉的时机也可通过相对发育尺度而受益。用相对发育尺度的简单研究揭示了在该尺度的特定范围内异花授粉是最佳的。再次，通过知道给定基因型到达P50所需的GDU，在不依赖于不可靠的营养基准或不进行费时的穗发育的物理评价的情况下，可查明何时到达该范围。通常用于不同特征和农作物的育种方法的描述可见下列书本参考书之一(Allard，“Principles of Plant Breeding，”John Wiley&Sons，NY，U.of CA，Davis，CA，50-98，1960；Simmonds，“Principles of crop improvement，”Longman，Inc.，NY，369-399，1979；Sneep和Hendriksen，“Plant breeding perspectives，”Wageningen(ed)，Center forAgricultural Publishing and Documentation，1979；Fehr，In：Soybeans：Improvement，Production and Uses，2nd Edition，Manograph.，16：249，1987；Fehr，“Principles ofvariety development，”Theory and Technique，(Vol 1)和Crop Species Soybean(Vol2)，Iowa State Univ.，Macmillian Pub.Co.，NY，360-376，1987)。
在实施本发明的方法中，一种或两种玉米亲本植物可包括一种或多种期望的农业兴趣的特征。例如，MON 87427亲本玉米植物可用在杂种种子的生产中，用于与第二种亲本玉米植物(其包含至少一种农业兴趣的基因和/或特征)的育种。在该实施方式中，相对发育尺度可被用于监测和/或确定MON 87427亲本玉米植物的生殖发育期，以便在花粉形成前为用草甘膦处理MON 87427亲本玉米植物进而防止自花授粉准确安排时间。可用第二种亲本玉米植物对事件MON 87427植物进行授粉，从事件MON 87427植物收获玉米杂种种子，其中从事件MON 87427植物收获的种子，具有比从未处理或从相同条件下其它玉米植物收获的玉米种子的更高产量的玉米杂种种子(即更高百分比的收获的杂种种子或更高的杂种种子纯度)。
农业兴趣的特征和基因是本领域公知的，包括但不限于，例如除草剂耐受性、雄性不育、增加的产量、昆虫控制、真菌病抗性、病毒抗性、线虫抗性、细菌性疾病抗性、植物生长和发育、淀粉产量、改良的和/或高油产量、改良的脂肪含量、高蛋白产量、水果催熟、增加的动物和/或人类营养、生物聚合物、环境压力、药用肽和分泌肽、改进的加工特性、改进的可消化性、低棉子糖、工业酶产量、改良的口味、固氮作用、杂种种子产量、纤维产量和/或生物染料产量。具有一种或多种期望特性的植物的例子是在美国农业部动植物卫生检验处(APHIS)登记的那些：除草剂耐受性(例如，玉米事件MON 88017、NK603、DAS-68416-4、HCEM485、DP-098140-6、 MIR604、59122、TC-6275、1507系、MON 802、T14和/或T25)、昆虫控制(例如，玉米事件MON 863、MON 809、MON810、MON 89034、MON 88017、MON 802、MIR-162、TC-6275、DBT418、B16、TC-1507、DAS 59122-7、MIR604和/或MON 80100)和/或其它期望特性(例如，玉米事件LY038、MON 87460和/或3272)(这种特性的完整列表的描述可见美国政府网站http：//www.aphis.usda.gov/brs/not_reg.html)。
在实施本发明的方法中，可使用近交系、变种、杂种或任何其它基因型。例如，优良的近交系是优秀农学特性育种和筛选产生的玉米植物系。可以在育种方法中转化和/或使用基因型以包含农学兴趣如草甘膦耐受性的基因，可筛选适合用作杂种种子生产系统中的雌性或雄性亲本的事件。
可用于实施本发明的玉米优良基因型包括但不限于CI9805(美国专利公开号20030093826)；LH321(美国专利公开号20030106086)；HOI002(美国专利公开号20030154524)；HOI001(美国专利公开号20030172416)；5750(美国专利公开号20030177541)；G0502(美国专利公开号20030177543)；G1102(美国专利公开号20030177544)；HX879(美国专利公开号20040068771)；6803(美国专利公开号20040088767)；5020(美国专利公开号20040088768)；G3001(美国专利公开号20040098768)；LH268(美国专利公开号20040111770)；LH311(美国专利公开号20040111771)；LH306(美国专利公开号20040111772)；LH351(美国专利公开号20040111773)；LHE323(美国专利公开号20040111774)；402A(美国专利公开号20040123352)；366C(美国专利公开号20040139491)；NP2315(美国专利公开号20040143866)；PH0GC(美国专利公开号20040194170)；SE8505(美国专利公开号20050015834)；D201(美国专利公开号20050028236)；BE1146BMR(美国专利公开号20050076402)；PHCAM(美国专利公开号20050114944)；PHCK5(美国专利公开号20050114945)；PHC77(美国专利公开号20050114951)；PHCND(美国专利公开号20050114952)；PHCMV(美国专利公开号20050114953)；PHB00(美国专利公开号20050114955)；PHCER(美国专利公开号20050114956)；PHCJP(美国专利公开号20050120437)；PHADA(美国专利公开号20050120439)；PHB8V(美国专利公开号20050120443)；6XN442(美国专利公开号20050125864)；4XP811(美国专利公开号20050125865)；PHCCW(美国专利公开号20050125866)；MN7224(美国专利公开号20050132433)；BE9514(美 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号5，912，420)；91ISI6(美国专利号5，912，421)；MF1113B(美国专利号5，914，452)；PH03D(美国专利号5，917，125)；PHDN7(美国专利号5，917，134)；01DIB2(美国专利号5，920，003)；82DHB1(美国专利号5，922，935)；8M222(美国专利号5，922，936)；PHMJ2(美国专利号5，929，313)；SBB1(美国专利号5，932，787)；86ISI3(美国专利号5，932，788)；ZS01231(美国专利号5，936，144)；87DIA4(美国专利号5，936，145)；79310J2(美国专利号5，936，146)；PH1GC(美国专利号5，936，148)；01DHD10(美国专利号5，939，606)；PH2CB(美国专利号5，939，607)；PH080(美国专利号5，939，608)；PH14T(美国专利号5，942，670)；PH185(美国专利号5，942，671)；PH19V(美国专利号5，948，957)；ZS09247(美国专利号5，952，551)；CRAUGSH2W-89(美国专利号5，952，552)；91DHA1(美国专利号5，962，770)；LH300(美国专利号5，965，798)；91ISI4(美国专利号5，965，799)；79103A1(美国专利号5，969，212)；ASG22(美国专利号5，969，220)；82IUH1(美国专利号5，969，221)；(美国专利号5，969，222)；LH302(美国专利号5，973，238)；LH265(美国专利号5，973，239)；PHFW4(美国专利号5，977，451)；01IBH10(美国专利号5，977，452)；91CSI-1(美国专利号5，977，453)；WKBC5(美国专利号5，977，455)；PH1M7(美国专利号5，977，456)；R327H(美国专利号6，399，860)；FR2108(美国专利号6，407，320)；FR3383(美国专利号6，410，830)；IT302(美国专利号6，414，227)；FR3303(美国专利号6，414，228)；9034(美国专利号6，420，634)；G1500(美国专利号6，420，635)；FR3311(美国专利号6，420，636)；I389972(美国专利号6，420，637)；PH77C(美国专利号6，423，888)；IT201(美国专利号6，426，451)；G3000(美国专利号6，426，453)；94INK1B(美国专利号6，429，363)；PH3HH(美国专利号6，433，259)；6TR512(美国专利号6，433，260)；89AHD12(美国专利号6，433，261)；I889291(美国专利号6，433，262)；2070BT(美国专利号6，437，223)；3323(美国专利号6，437，224)；G1900(美国专利号6，441，279)；16IUL6(美国专利号6，441，280)；7RN401(美国专利号6，444，881)；UBB3(美国专利号6，444，882)；6077(美国专利号6，444，883)；I014738(美国专利号6，444，884)；TDC1(美国专利号6，452，074)；GF6151(美国专利号6，452，075)；7180(美国专利号6，452，076)；WQDS7(美国专利号6，455，764)；X532Y(美国专利号6，459，021)；I465837(美国专利号6，459，022)；1784S(美国专利号6，469，232)；LH176Bt810(美国专利号6，469，233)；6RC172(美国专利号6，469，234)；3327(美国专利号6，469，235)；7SH382(美国专利号6，476，298)；I181664(美国专利号6，476，299)；NP2010(美国专利号6，483，014)；FR3361(美国专利号6，483，015)；1778S(美国专利号6，486，386)；I362697(美国专利号6，492，581)；RPK7250(美国专利号6，506，964)；和6RT321(美国专利号6，911，588)。
此处所述的术语“包括”是指“包括但不限于”。
本文包括下面的实施例来证明本发明的某些优选实施方案的实施例。本领域的技术人员应该理解，下面的实施例中公开的技术代表了本发明人发现在实施本发明中运用良好的技术，因此可以被认为是构成实施本发明的优选方式的实施例。然而，本领域的技术人员根据本公开内容应该理解，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以对公开的具体实施方案进行许多改变，而且仍然获得相同或类似的结果。
具体实施方式
实施例1：玉米的转化及MON 87427事件筛选
通过农杆菌介导的玉米转化方法产生玉米植物MON 87427。将玉米细胞转化并再生成完整的玉米植物，从表现出转基因表达盒的完整性和对草甘膦的耐受性的植物群落中筛选单个植物。从该群落中筛选和鉴定玉米植物事件MON 87427。
利用转化载体pMON58401通过农杆菌介导的玉米未成熟胚胎的转化方法开发转基因草甘膦耐受的玉米植物MON 87427。MON 87427的转基因插入序列和表达盒包含含重复增强子区域(P-e35S)的花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus，CaMV)35S的启动子和前导序列(leader)；可操作地连接至源自玉米热休克蛋白70基因的第一个内含子的DNA前导序列(I-HSP70)；可操作地连接至编码源自拟南芥(Arabidopsis thaliana)EPSPS的shkG基因的N端叶绿体转运肽的DNA分子(Ts-CTP2)；可操作地连接至源自农杆菌属CP4菌株的aroA基因并编码CP4EPSPS蛋白的DNA分子；可操作地连接至源自根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂氨酸合成酶(T-NOS)的3’UTR DNA分子。
可以通过许多方法转化玉米细胞。例如，可以使用下列方法产生包含本发明的植物表达盒的转基因玉米植物。包含植物表达盒的根瘤农杆菌的液体培养从甘油储液或从新鲜划线平板开始，在pH7.0、含50mg/l(每升毫克数)卡那霉素和或50mg/l链霉素或50mg/l奇霉素和25mg/l氯霉素以及200μM乙酰丁香酮(AS)的液体LB培养基中26℃-28℃振摇(约每分钟150转，rpm)生长过夜达到指数生长期。将农杆菌细胞重悬于接种培养基(如美国专利6，573，361的表8中所述的液体CM4C)，调整细胞密度以便当在分光光度计中660nm(即OD660)测定时重悬的细胞的光密度为1。新鲜分离的未成熟的玉米胚胎用农杆菌接种并在23℃暗处共培养2-3天。然后将胚胎转移至补充有500mg/l羧苄青霉素(Sigma-Aldrich，St Louis，MO)和20μM AgNO3的延迟培养基(N61-100-12；如美国专利5，424，412的表1中所述)并在28℃培养4-5天。随后所有的培养都保持在该温度下。
然后将胚胎转移至补充有500mg/l羧苄青霉素和0.5mM草甘膦的第一筛选培养基(N61-0-12；如美国专利5，424，412的表1中所述)。两周后，将存活的组织转移至补充有500mg/l羧苄青霉素和1.0mM草甘膦的第二筛选培养基(N61-0-12)。存活的愈伤组织在1.0mM草 甘膦条件下传代培养，传代培养3次，每次间隔两周。当鉴定草甘膦耐受组织时，组织膨大再生。对于再生，将愈伤组织转移至补充有0.1μM脱落酸(ABA；Sigma-Aldrich，StLouis，MO)的再生培养基(MSOD，如美国专利5，424，412的表1中所述)并培养两周。将再生愈伤组织转移至高蔗糖培养基并培养两周。将小植株转移至在培养屏中的MSOD培养基(无ABA)并培养两周。筛选具有正常表型特征的生根的植物并转移至土壤用于生长及进一步评价。将通过上述转化而产生的R0植物转移到土壤中用于生长，然后自交产生R1种子。通过分析技术(包括TaqMan、PCR分析和除草剂喷洒)的组合筛选植物。
基于显示事件的优势表型和分子特征及其期望的单倍体相关性从45个单独转基因事件中筛选MON 87427事件(Cr 9，60cM)。事件MON 87427的筛选过程以代表45个R0事件的转化的玉米植物开始。这些用草甘膦(在V7期64盎司/英亩)喷洒，然后评价营养耐受性和草甘膦喷洒后的不育性。在初始的45个事件中，当用测试的草甘膦速率和时机喷洒时，35个R0事件表现出营养草甘膦耐受性并且是雄性不育的。然后将这些35个R0事件的植物继续进行进一步的分子分析鉴定。用PCR分析和Southern印迹分析，分子鉴定了35个事件。在分析的35个事件中，挑选了29个事件用于进一步的田间测试。然后在田间效率和产量的田间试验中分析了29个R1事件。此外，进行了额外的分子鉴定，包括基因组和蛋白表达鉴定。分析数据，从广泛的R1植物分析和田间试验结果中挑选了3个重要事件进行R2田间试验。3个重要事件的进一步分析和试验导致了事件MON 87427的筛选。
额外的田间筛选包括在营养4生长期(V4)和营养10生长期(V10)用草甘膦以32盎司/英亩(RoundupMonsanto Co.，St.Louis，MO)处理事件MON 87427。在V4喷洒后对阳性和阴性的植物计数。在V4和V10喷洒后的处理后(DAT)10-14天对处理植物的萎黄病和畸形进行计数。也对V4和V10喷洒的植物进行开花期穗不育率 进行计数。
实施例2：MON 87427 DNA序列的鉴定
通过详细的分子分析方法鉴定插入玉米植物MON 87427基因组的DNA和侧翼基因组序列。这些分析包括：对转基因插入DNA和在转基因插入序列侧翼的基因组DNA测序，测定转基因插入数(在玉米基因组中整合位点数)，测定拷贝数(一个位点中转基因DNA的拷贝数)，分析插入基因盒的完整性，分析在插入序列侧翼的基因组DNA和插入和玉米基因组的单倍体区域的关联。
用PCR技术测定MON 87427中转基因DNA插入的侧翼的序列。从来自标准温室条件下生长的组织的转基因系分离植物基因组DNA。将植物组织与液氮混合并用研钵和研杵研磨成精细粉末。根据厂商的操作步骤用NucleonTM PhytoPureTM基因组DNA提取试剂盒(RPN8511，Amersham，Piscataway，NJ)提取DNA。在最终的沉淀步骤之后，将DNA重悬于0.5mlTE(10mM Tris-HCl pH 8.0，1mM EDTA)中。本领域技术人员可以修改该方法以从玉米的任何组织(包括但不限于种子)中提取DNA。另外，用基于转基因DNA的限制分析选择的限制性内切酶消化一份DNA。经过限制性片段的自连接后，使用由转基因DNA序列设计的引物进行PCR，该引物会扩增由转基因DNA的5’和3’端延伸的序列。通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，并使用QIAGEN凝胶纯化试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化。直接使用标准DNA测序方案对随后的DNA产物测序。延伸至表达盒转基因DNA的右边界(RB)序列的5’侧翼序列如SEQ IDNO：7所示。延伸至表达盒转基因DNA的左边界(LB)序列的3’侧翼序列如SEQ ID NO：8所示。完全整合入玉米基因组DNA并包含表达盒DNA的序列如SEQ ID NO：9所示。
将分离的DNA分子序列与转基因DNA序列进行比较以鉴定侧翼序列和共分离的转基因DNA片段。通过使用基于推导的侧翼序列数据和已知的转基因DNA序列设计的引物进行PCR以确认表达盒的存在。使用由MON87427中的侧翼序列设计的引物，分离对应于转基因DNA 整合到转化系中的同一区域的野生型序列。使用扩增系统(Invitrogen，Carlsbad，CA)进行PCR反应。相对于多个核苷酸和蛋白质数据库分析MON 87427中的侧翼DNA序列和野生型序列LH198。该信息用于检查转基因与植物基因组的关联，并观察插入位点的完整性。
实施例3：用于鉴定样品中MON87427DNA的方法
本实施例描述了可用于鉴定样品中事件MON 87427DNA的方法。使用事件侧翼序列、野生型玉米基因组序列和/或转基因序列来设计用于这种方法中的引物和探针。在测试中可以包括或不包括内部对照引物和探针。
描述了鉴定样品中事件MON 87427(事件特异性测试)和/或事件MON 87427的CP4-EPSPS合成基因(a.k.a.CP4-Zm)(事件特异性测试)的端点热扩增方法。使用事件侧翼序列、野生型玉米基因组序列和转基因序列来设计用于这些测试中的引物和探针(表1)。用于事件特异性测试的DNA引物是引物SQ12763(SEQ ID NO：17)、SQ12886(SEQ IDNO：18)和6-FAMTM标记的探针PB4352(SEQ ID NO：19)。用于事件特异性测试的DNA引物是引物SQ20052(SEQ ID NO：11)、SQ20053(SEQ ID NO：12)和6-FAMTM标记的探针PB10016(SEQ IDNO：13)。6-FAMTM是连接到DNA探针上的Applied Biosystems(Foster City，CA)的荧光染料产品。用于此分析的对照应包括来自包含事件MON 87427DNA的玉米的阳性对照、来自非转基因玉米的阴性对照和不包含模板DNA的阴性对照。
此外，PCR反应的可选的对照包括对玉米基因组中单一拷贝基因特异的内部对照引物和内部对照探针。本领域技术人员知道如何设计对玉米基因组中单一拷贝基因特异的引物。用于转基因特异性测试中作为内部对照的DNA引物是引物SQ1241(SEQ ID NO：14)、SQ1242(SEQ ID NO：15)和VIC TAMRA标记的探针PB0084(SEQ ID NO：16)。对于转基因特异性测试，可使用内部对照引物和探针以及可选的下列步骤5-6。对于事件特异性测试，不使用内部对照。
表1：引物和探针
用于端点方法的条件的例子如下：
步骤1：将18百万欧姆水调节至10μl的最终体积。
步骤2：将5.0μl的2X通用母液混合物(dNTPs、酶、缓冲液)调节至1X最终浓度。
步骤3；将0.5μl事件引物-1(SEQ ID NO：17)和事件引物-2(SEQ ID NO：18)混合物(重悬于18百万欧姆水中至每条引物的浓度为20uM)调节至1.0μM最终浓度(例如在微量离心管中，加入随后物质以获得500μl体积的20uM最终浓度：100μM浓度的事件引物-1(SEQ IDNO：17)100μl；100μM浓度的事件引物-2(SEQ ID NO：18)100μl；300μl的18百万欧姆的水)。
步骤4：将0.2μl事件6-FAMTMMGB Probe(SEQ ID NO：19)(重悬浮于18兆欧的水中至10μM浓度)至0.2μM最终浓度。
步骤5(可选的)：将0.5μl内部对照引物-1和内部对照引物-2的混合物(重悬浮于18兆欧的水中至各引物的浓度为20μM)调节至1.0μM最终浓度。
步骤6(可选的)：将0.2μl内部对照VIC TM探针调节至0.2μM最终浓度(重悬于18兆欧的水中至10μM浓度)。
步骤7：每份样品3.0μl提取的DNA(模板)以及每份包括下列：1.待分析的叶样品；2.阴性对照(非转基因DNA)；3.阴性水对照(无模板)；4.阳性对照MON 87427DNA。
步骤8：热循环条件如下：50℃ 2分钟，1个循环；95℃ 10分钟，1个循环；95℃ 15秒然后64℃ 1分钟，10个循环，-1℃/循环；95℃ 15秒然后54℃ 1分钟，30个循环；最终循环10℃。
优化这些分析方法以用于Applied BiosystemsPCR System 9700(以最高速运行)或MJ Research DNA Engine PTC-225热循环仪。本领域技术人员已知产生鉴定事件MON87427DNA的扩增子的其它方法和仪器。
SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18是一对DNA分子(引物对)的例子，由第一DNA分子以及不同于第一DNA分子的第二DNA分子组成，其中所述第一DNA分子和第二DNA分子各自包含具有足够长度的SEQ ID NO：10的连续核苷酸的核苷酸序列的核酸分子作为DNA引物，当与来自事件MON 87427的DNA在扩增反应中共同使用时，该DNA引物可以产 生可诊断样品中玉米事件MON 87427的扩增子。可在其它基于聚合酶链式反应(PCR)的检测事件的方法中使用这些引物。
实施例4：使用事件MON 87427用于杂种种子生产
下面的实施例描述如何将MON 87427用于玉米育种目的，包括使用美国专利公开号20090165166和/或美国专利公开号7，314，970中描述的方法。
在杂种种子生产中，将包含MON 87427的玉米植物种植于区域中、如开放田间。其它亲本玉米植物可在或不在相同区域中。对于在种子生产期间和在商业田间中的杂草控制，可在如农产品标记指导的营养阶段、以和Roundup玉米事件NK603和MON 88017相同的速率将草甘膦应用于包含MON 87427的玉米植物。对于杂种种子生产，将在穗发育期(接近于V8-V13范围的玉米营养生长期)之前和/或期间开始的两种草甘膦应用方案应用于MON87427植物以产生具有组织选择性草甘膦耐受性的雄性不育表型。在玉米杂种种子生产系统中，在穗发育期应用草甘膦的MON 87427植物将雄性不育，因此可以轻易地被其它花粉供体(雄性)植物所授粉，产生携带组织选择性草甘膦耐受性基因的活的玉米杂种种子。花粉供体植物可在或不在相同区域中。授粉可被本领域已知的任何方式(包括被植物的邻近位置或被手工授粉)所影响。仅仅在穗发育期(接近于V8-V13范围的玉米营养生长期)之前和/或期间开始的时间特异的草甘膦应用方案产生具有组织选择性草甘膦耐受性的雄性不育表型。草甘膦是能通过植物中韧皮部(phloem)容易地转位的系统性除草剂。一旦草甘膦在韧皮部中，它移动到高分生活性区域，沿着通常的途径进行分布。玉米植物中的花粉发育需要约四周完成。早期穗发育期在大约玉米植物生长期V9开始，因此大约在此期和时间应用草甘膦允许草甘膦向雄性生殖组织的最大化转位。在早期营养阶段期间应用草甘膦(与为了控制杂草的现行的 农产品标记规定的应用时机相一致)不会影响MON 87427 的花粉产生，因为敏感的雄性生殖组织在该时间并不活跃地发育。可以用除草剂应用领域已知的方法对草甘膦处理条件进行改变，这些改变也在本发明的范围之内。
当与另一种草甘膦耐受的玉米事件如玉米事件NK603(美国专利号6,825,400)杂交以产生杂种种子时，MON 87427与常规的NK603杂种相比未显示出产量降低(见图2)。用草甘膦以每次2.25lb a.e./英亩两次连续喷洒处理杂交玉米植物的田间以控制杂草，在不同的事件MON 87427杂种和NK603杂种之间没有观察到损伤或雄性不育性的差别。这表明源自事件MON 87427杂交的F1杂种植物对杂草控制所用的草甘膦完全耐受。
实施例5：测定穗发育期
图3中用方括号之间的毫米为单位的大约尺寸表示了穗发育期。在该图中，Vg是营养阶段的分生组织；T0是营养阶段向生殖阶段的转换期；T1是可见的生殖生长点(0.9mm)；T2是可见的侧枝原基(1.8mm)；T3是可见的小穗原基(4.1mm)；T4是中心轴和侧轴延伸(12.9mm)；T5是花药分化的开始(41.0mm)；T6是花粉分化的开始(175mm)以及T7是花药伸出和花粉散落(285.0mm)。通过测定在成熟的不同期的穗而测定给定的植物的穗发育期。用解剖视野下的解剖刀和精细镊，将穗分生组织从发育中的叶子中切出。然后用解剖刀在其基底切出分生组织并通过显微镜观察根据穗发育期(图3中所示)进行评估。
实施例6：相对于穗发育期的营养阶段(V-期)。
本实施例表明当相对于植物营养阶段和植物营养生长测定时，穗干重、穗长度和穗发育期随不同基因型差异很大。
种植了10种基因型：近交系LH198、LH287、O1DKD2、19HGZI、17IDI6and hybridsDKC 44-46、DKC 47-10、DKC 52-40、DKC 58-80、DKC 63-81。挑选杂种来代表表示不同发育模式的遗传学。本研究在 Farmer City(IL)、Kearney(NE)和Williamsburg(IA)进行。用圆锥形播种机种植10种基因型，并变稀为每英亩38，000棵植物的最终规模。播种长度为20英尺，3英尺的小径，共4行，保证所有处理的足够植物并降低了边界效应。收集数据以记录相对于穗发育期的植物营养生长和穗发育的观察值。
在相同的各个营养阶段(V-期)在不同的基因型间观察穗发育的独特差异。例如，在各个V-期，基因型间穗大小差异很明显。在V8期，平均穗长度对于LH198为7mm，对于LH287为40.2mm，对于DKC44-46为47.8mm(图4)。在V8期穗长度尺寸的这个范围在基因型间差别高达7倍。在V10期，这三种基因型的平均穗长度分别为70.1mm、148.2mm和277.3mm(图4)。这导致了基因型间几乎4倍差异的范围。当测定穗干重累积值时，相对于V-期的穗发育的基因型差异也很明显。
在进一步的研究中，用72个近交系来研究范围广泛的成熟度。将这些近交系分成6个成熟组以简化解剖过程(表2)。挑选无特征的近交系以避免在受控田间进行穗穗解剖的复杂性。本实验反映了在四个不同的田间位置Williamsburg(IA)、Waterman(IL)、Farmercity(IL)和Constantine(MI)收集的数据。种植了四行20英尺长的试验田。最终目标群体为每英亩38，000棵植物。在V3期记录最终站立数。将每个试验田的三棵代表性植物的第5和第10片叶子进行标记以追踪V-期；将所有叶子计数，包括胚芽鞘。将每组三棵代表性植物在平均生长发育单位的60％、70％和80％时采样直至开花(被定义为当该组中大约一半的穗花粉散落时，表示为P50)，如前面所述进行穗剪切。
表2
从中间行挑选植物以避免边界植物。在第一次采样时，将相同的生长期的植物进行标记以用于第二次和第三次采样。记录采样时间时每次剪切的时间以及V-期。根据上述相对发育尺度鉴定穗的生长期。继续监控试验田至开花期始终并记录P50的日期。相对于穗发育期，在杂种间营养阶段有差别。例如，在T5的V-期(花药分化的开始)在近交系间范围多于6.5片叶子，为7-14片叶子。这大约是到达此期的10.3片叶子的总平均值的64％。
实施例7：相对于穗和花生长期的平均GDU
本实施例表明达到给定穗发育期或花期所需的平均GDU在基因型间差异很大，因此GDU不是可靠的穗发育的预测者。从上面所述的试验田和近交植物中采集数据。用Onset气象站检测从种植到开花始终的每小时温度，使用该数据根据传统方法(即将每天的最高温度与最低温度平均)计算每天的累积GDU。将源自显示穗发育期的剪切采样的数据相对于GDU要求值作图。通常预计更大叶子数差别的近交系到达特定的穗发育期具有更大的GDU需要值。然而，在上面讨论的到达T5的V-期中观察到的变化不能解释在到达T5的GDU中观察到的所有的变化。这表明，被定义为在连续叶子的延伸之间的时间的出叶间隔(phyllochron)在近交系间有差别。该研究的结果显示到达T5期的GDU在近交系间的范围超过400热或生长度单位；约为总平均值的40％。
观察到近交品种间到达P50和到达给定的穗发育期的GDU需要值之间有强烈的关联。使用源自试验田和近交植物的数据，记录近交系间的到达P50的平均GDU需要值并在给定穗发育期进行比较。到达P50的GDU需要值从最短的成熟度杂种到最长的成熟度杂种的变化为1283至1645单位；稍稍超过360GDU的差别。发现这些差别与近交系中到达T5期的平均GDU需要值的差别相关(图5)。
实施例8：构建相对生长尺度
本实施例显示了构建用于监控和/或预测穗发育的标准化尺度。这种相对发育尺度成功地对近交系间玉米穗发育期进行了标准化。
考虑到上面所述的近交品种间在给定的穗发育期到达P50的GDU需要值间的强烈的关联，开发了相对发育尺度。这通过如下表示相对于到达花粉散落的热量时间的每种基因型的穗发育而计算：
相对发育尺度＝(到达Tn的GDU/到Px的GDU)
使用从上面所述的试验田和近交植物中采集的数据。在给定的穗发育期的GDU值(到达Tn的GDU)除以已知的到达花粉散落的特定期所需的GDU值(到达Px的GDU)，对于某种基因型这种情况下为P50。这与基因型间的穗发育的差别相关。例如，到达T5的GDU需要值在所有近交系间在相对发育尺度上大体一致，范围为到达P50所需的GDU的69-75％。各种基因型相对于穗发育期的GDU需要值的回归线相比于同样这些基因型的用T-尺度标准化的更一致的回归线的差别可以用来评估尺度的标准化程度，而不论成熟度组(图7)。
实施例9：预测生长调节处理的最佳时机
本实施例显示了用相对发育尺度来测定为达到完全的玉米穗不育的化学试剂喷洒方案的最佳时机。在本实施例中，化学试剂是在 杂交系统(RHS)中结合MON87427玉米植物使用的草甘膦除草剂最佳的喷洒时间与实际穗发育期相关，仅仅使用单一有效剂量的实现了完全的玉米穗不育。
挑选32株包含MON 87427事件的近交背景用于研究，将其分成两个成熟度组。将杂种种植为20英尺长的行，3英尺的小径。植物间行距为30英尺。行被种植为四行雌性“测试”植物，随后为两行雄性授粉植物。挑选具有营养生长的对草甘膦雌性组织耐受性但不具有雄性生殖组织耐受性(即组织选择性草甘膦耐受性)的转基因事件用于该研究。雄性授粉者也对草甘膦雄性耐受，而雌性受体植 物当用草甘膦处理时是雄性敏感的。根据近交系的成熟度停止喷洒处理并分为两个亚组。每次临喷洒前，从试验田中挑选三株代表性植物并在田间剪切。记录穗长度、穗发育期、日期和喷洒时的GDU。用高清洗喷洒器将RoundupPowerMAXTM和15加仑/英亩体积的水的喷洒处理(SS1)一次应用于各个处理的各自的成熟组。如图3所示，应用的不育喷洒处理在到达P50所需的GDU的50％-80％的范围(在近交成熟组内平均)，其中WC＝“杂草控制”；Trt 1SS1＝50％到达P50所需的GDU；Trt 2SS1＝57.5％到达P50所需的GDU；Trt 3SS1＝65％到达P50所需的GDU；Trt 4SS1＝72.5％到达P50所需的GDU；Trt 5SS1＝80％到达P50所需的GDU。
表3
在所有喷洒处理后，通过评估花药挤出和相对于吐丝出现的花粉散落进行穗不育性/可育性的评估。当每块试验田在特定生长期时进行这些评估：10％植物进入吐丝期(S10)；50％植物进入吐丝期(S50)；90％植物进入吐丝期(S90)；S90日期后3天(S90+3)；以及S90日期后6天(S90+6)。观察植物的花药挤出(AE)，用花药挤出风险指数(AE风险)测定不育性，该指数是结合该试验田中显示现象强度的花药挤 出的植物的百分比的加权平均数。例如，轻度部分(Light Partial，LP)是10个或更少花药挤出的穗。例如，中度部分(MediumPartial，MP)是>11个花药至25％花药挤出的穗。例如，重度部分(Heavy Partial，HP)是>25％花药挤出的穗。如图6中所示，相对发育尺度揭示了介于0.62-0.75之间的化学试剂产生玉米穗不育性的效率的最佳窗口，其中近交系和成熟组间的AE风险最小。该研究验证了相对发育尺度作为为了实施近交系间杂交系统而提供喷洒推荐方案的工具的效率。这尤其和MON 87427一起使用。
实施例10：具有改进的种子纯度的杂种种子生产方法
用在Kearney，Nebraska；Williamsburg，Iowa；Waterman，Illinois；Farmer City，Illinois；和Constantine，Michigan的24块试验性生产地区域测定杂种种子生产方法以及获得的种子纯度。在每个地点种植四个MON 87427区域和两个细胞质穗不育(cytoplasmictassel sterility，CMS)区域。MON 87427区域由01DKD2MON87427-MON89034雌性x80IDM2MON88017雄性组成，CMS区域由01DKD2NK603B-CMS雌性x 80IDM2MON88017雄性组成。
种植模式为在30英寸行中雌性：雄性为4：1的比例。每个试验区域尺寸为10乘100-150英尺的长块。试验区域在侧边和从头至尾被30英尺(12行)的雄性所环绕。试验区域与其它可能的花粉源至少有200英尺远，彼此有45英尺隔离。该研究在灌溉地和非灌溉地分别种植了40，000和38，000个的群体。雌性和雄性行都在同时种植。通过二者选一地喷射20英尺行长度的区段而使雄性行在V3生长期被喷射以实现萎缩式生长以及延迟雄性植物的花粉散落。将丙烷喷射器安装在拖拉机后面并安装在雄性行之上，大致每隔20英尺在喷射和不喷射之间变换。在种植时使用杀虫剂，用来使由于昆虫压力导致的变化最小化。在授粉后破坏雄性行。所有试验区域在V3期以用于控制杂草的0.75lb a.e./英亩的RoundupPowerMaxTM 喷洒。另外，MON 87427试验区域在种植起的825和975生长度单位(GDU)时以0.75lb a.e./英亩的Roundup PowerMaxTM喷洒两次。喷洒体积保持在恒定的15加仑每英亩(GPA)。
通过从穗出现到吐丝结束后6天(P90+6天)每隔一天监测植物而评估穗不育性。如果发生破损(花粉散落)，进一步将个体植物分类为低度花粉(LP；少于10个花药暴露)、中度花粉(MP；11个花药至25％花药表面区域具有花药挤出)或高度花粉(HP；超过25％花药表面区域具有花药挤出)。然后，如下计算花药挤出风险(AE风险)：
AE风险％＝([(LPx0.25)+(MPx0.5)+(HPx1.0)]/站立数)x 100
在生理成熟和约30-35％的内核水分含量后，根据代表试验区域中所有地块的预定采样方案手工收获每个试验区域100穗混合样品。将样品干燥并称重以调整最终产量。第一组样品用手工处理并送于质量分析(用两分100种子的重复分评估冷发芽和温发芽)。第二组样品送于遗传纯度分析(单核苷酸多态性(SNP)分析)和特性纯度分析(雄性特异性标记的ELISA分析)。第三组样品用于记录种子大小分布。混合收获试验性生产区域，将产量调整至测定每英亩的蒲式耳(bushel)中的湿度为15％。
总的来说，CMS和MON 87427试验区域都超过了玉米穗不育性和种子纯度标准。花药挤出风险远低于甚至在90％雌性群体吐丝后6天的0.5％的所需的性能标准(图8)。MON87427试验区域几乎没有记录到任何破损，但是在CMS试验区域上在吐丝晚期观察到稍高的破损。CMS和MON 87427的雌性和雄性玉米亲本植物都测试了遗传纯度，结果为100％的纯度。MON 87427和CMS亲本植物的高水平玉米穗不育性在这些试验产生的杂种种子中都产生了高水平的遗传纯度和特性纯度(图9)。在MON 87427和CMS的特性纯度间没有统计学显著差异，但是在MON 87427和CMS的遗传纯度间测得了统计学显著差异(p<0.05)。用MON 87427和杂交系统(RHS)产生的杂种种子的遗传纯度水平为98.7％，其显著高于用CMS产生的杂种种子的遗传纯度水平(98.0％)。这导致了相比于CMS系统 亲本植物少了0.2％“自身的”并少了0.5％“其它的”雌性MON 87427亲本植物，表明MON 87427和杂交系统(RHS)可用于改善玉米杂种种子生产中的玉米种子纯度。
以上公开的并且在权利要求书中所述的MON 87427种子的代表性样品已经按照布达佩斯条约的规定在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801University Boulevard，Manassas，VA.20110进行了保藏。该保藏物的ATCC保藏号为PTA-7899，保藏日期为2006年9月26日，微生物名称为玉米(种子)。该保藏物将在该保藏机构保存30年或最后请求后的5年或专利的有效期间，以较长者为准，并且在此期间必要时将进行更换。
上面已经说明并描述了本发明的原理，本领域技术人员应当明白，可以在不背离这种原理的情况下在配置和细节方面对本发明进行修改。我们要求保护在所附的权利要求的精神和范围内的所有修改。

Claims (7)

1.用于实施发育调节处理的预测玉米穗发育的时机的方法，包括选择相对发育尺度的范围，其中所述相对发育尺度通过将到达确定的穗发育期所需的生长度单位(GDU)除以到达确定的花发育期所需的GDU而衍生，其中所述范围表明向穗发育期的成熟；和在所述穗发育期对玉米植物实施发育调节处理。
2.权利要求1的方法，其中所述穗发育期是对于玉米植物的生殖杂交、穗不育化、去雄或实施发育调节处理的穗发育期。
3.权利要求1的方法，其中用于构建所述相对发育尺度的特定花发育期是在约50％玉米植物群体花粉散落时，其中所述范围为所述相对发育尺度上的约0.62至约0.75。
4.一种产生玉米杂种种子的方法，包括：
a.在区域内种植第一种亲本植物的玉米种子；
b.使源自所述玉米种子的所述第一种亲本植物生长；
c.通过选择相对发育尺度上表明向穗发育期成熟的范围来确定所述第一种亲本植物的穗发育的时机，其中所述相对发育尺度通过将到达确定的穗发育期所需的生长度单位(GDU)除以到达确定的花发育期所需的GDU而衍生；
d.用所述穗发育时机的确定值来及时地对所述第一种亲本植物实施发育调节处理，进而防止所述第一种亲本植物的自花授粉；
e.对所述第一种亲本植物实施所述发育调节处理；
f.用来自第二种亲本植物的花粉使所述第一种亲本植物授粉；以及
g.收获源自所述第一种亲本植物的种子，其中所述种子是通过所述第一种亲本植物与第二种亲本植物杂交而产生的玉米杂种种子。
5.权利要求4的方法，其中所述发育调节处理是草甘膦，所述第一种亲本植物是组织选择性草甘膦耐受的。
6.权利要求5的方法，其中所述第一种亲本植物是转基因玉米事件MON 87427植物。
7.权利要求6的方法，其中所述第二种亲本植物是草甘膦耐受的。
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