UA126801C2 - Конструкція рекомбінантної днк для спільної супресії генів ендогенної оксидази - Google Patents

Конструкція рекомбінантної днк для спільної супресії генів ендогенної оксидази Download PDF

Info

Publication number
UA126801C2
UA126801C2 UAA201902529A UAA201902529A UA126801C2 UA 126801 C2 UA126801 C2 UA 126801C2 UA A201902529 A UAA201902529 A UA A201902529A UA A201902529 A UAA201902529 A UA A201902529A UA 126801 C2 UA126801 C2 UA 126801C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
oxidase
plant
sequence
gene
promoter
Prior art date
Application number
UAA201902529A
Other languages
English (en)
Inventor
Едвардс М. Аллен
Эдвардс М. Аллен
Джаянанд Бодду
Чарльз Р. Дітріх
Чарльз Р. Дитрих
Александр Голдсміт
Александр Голдсмит
Мія Хауелл
Мия Хауелл
Кевін Р. Косола
Кевин Р. Косола
Сівалінганна Манджунатх
Сивалинганна Манджунатх
Аніл Нілам
Анил Нилам
Лінда Рімаркуіс
Линда Римаркуис
Томас Л. Слевінскі
Томас Л. Слевински
Тіамагондлу В. Венкатеш
Тиамагондлу В. Венкатеш
Хуай Ван
Original Assignee
Монсанто Текнолоджі Ллс
Монсанто Текнолоджи Ллс
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Монсанто Текнолоджі Ллс, Монсанто Текнолоджи Ллс filed Critical Монсанто Текнолоджі Ллс
Publication of UA126801C2 publication Critical patent/UA126801C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8273—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for drought, cold, salt resistance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/46—Gramineae or Poaceae, e.g. ryegrass, rice, wheat or maize
    • A01H6/4684—Zea mays [maize]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C12N15/8223—Vegetative tissue-specific promoters
    • C12N15/8225—Leaf-specific, e.g. including petioles, stomata
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8291—Hormone-influenced development
    • C12N15/8297—Gibberellins; GA3
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Ecology (AREA)
  • Forests & Forestry (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

(57) Реферат:
Винахід стосується композицій та способів зміни вмісту гібереліну (СА) в кукурудзі або інших зернових рослинах. Пропонуються також способи та композиції для зміни експресії генів, пов'язаних з біосинтезом гібереліну, шляхом супресії, мутагенезу та/або редагування певних підтипів генів оксидази (зА20О або САЗ. Крім того, пропонуються модифіковані рослинні клітини та рослини, які мають елемент супресії або мутацію, що знижують експресію або активність гена оксидази СА, які додатково містять знижені рівні гібереліну та поліпшені характеристики, такі як зменшена висота рослини та підвищена стійкість до вилягання, але без відхилень.
Х І
Х ши х ' ЕЕ
Во
Фо ня ше Ж НН Не кН НН ще ШК
ЖОВ ння ту ї м и м жк и ХО ЖК жк пи
З З Я Я Е « з В ДЕ
Наеамер Події
ФМ 1
ПЕРЕХРЕСНЕ ПОСИЛАННЯ НА СПОРІДНЕНІ ЗАЯВКИ
ГП) Ця заявка заявляє пріоритет попередньої заявки на патент США Мо 62/376298, поданої 17 серпня 2016 року, попередньої заявки на патент США Мо 62/442377, поданої 4 січня 2017 року, та попередньої заявки на патент США Мо 62/502313, поданої 5 травня 2017 року. Кожна з цих попередніх заявок на патент США повністю включена в цей документ за допомогою посилання.
ВКЛЮЧЕННЯ ПЕРЕЛІКУ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
І2) Перелік послідовностей, що міститься у файлі з ім'ям ""34494Уу000 5ЕОЖЕ, розмір якого становить 293398 байт (виміряно в МЗ-УЛЛМООМУЗФ)) і який був створений 17 серпня 2017 року, поданий в електронному вигляді та повністю включений в цей документ за допомогою посилання.
РІВЕНЬ ТЕХНІКИ
ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ
ІЗІЇ Цей опис відноситься до композицій та способів поліпшення ознак, таких як стійкість до вилягання та підвищений урожай, у однодольних або злакових рослин, включаючи кукурудзу.
ПОПЕРЕДНІЙ РІВЕНЬ ТЕХНІКИ
І4Ї Гібереліни (гіберелінові кислоти або СА ((сА-діррегеїїс асіа)) є гормонами рослин, які регулюють ряд основних процесів росту та розвитку рослин. Маніпулювання рівнями СА в напівкарликових сортах пшениці, рису та сорго призвело до збільшення врожайності й скорочення вилягання посівів цих злакових культур протягом 20го століття, що значною мірою призвело до Зеленої революції. Проте, успішне збільшення врожайності в інших злакових культурах, таких як кукурудза, не було досягнуто за допомогою маніпулювання шляхами СА.
Справді, деякі мутації в генах шляху СрА були пов'язані з різними нетиповими сортами кукурудзи, які несумісні з врожайністю, що привело дослідників до пошуку напівкарликових, високоврожайних сортів кукурудзи за допомогою маніпулювання шляхом СА.
ІБЇ У цій галузі техніки як і раніше існує потреба в розробці однодольних або злакових культур, таких як кукурудза, з підвищеною врожайністю та/або стійкістю до вилягання.
СУТНІСТЬ ВИНАХОДУ
ІБЇ У першому аспекті цього опису запропонована конструкція рекомбінантної ДНК, що містить послідовність ДНК, що транскрибується, що кодує некодуючу молекулу РНК, при цьому зазначена некодуюча молекула РНК містить послідовність яка є, щонайменше на 80 965, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 956, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 965, щонайменше на 97 95, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або на 100 95 комплементарною щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам молекули мРНК, що кодує ендогенний білок оксидази ЗА в однодольній або злаковій рослині або клітині рослини, при цьому ендогенний білок оксидази СА є, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 96, щонайменше на 97 956, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або на 100 95 ідентичним 5ЕО ІЮ МО: 9, 12, 15, 30 або 33, і при цьому послідовність ДНК, що транскрибується, функціонально пов'язана з промотором придатним для експресії в рослині.
Ї/Ї У другому аспекті цього опису запропонована конструкція рекомбінантної ДНК, що містить послідовність ДНК, що транскрибується, що кодує некодуючу молекулу РНК, при цьому некодуюча молекула РНК містить послідовність, яка є, щонайменше на 90 95, щонайменше на 9595, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 9565, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або на 100 95 комплементарною щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам молекули мРНК, що кодує ендогенний білок
БО оксидази (ЗА20 в однодольній або злаковій рослині або клітині рослини, ендогенний білок оксидази (ЗА20 є, щонайменше на 8095, щонайменше на 8595, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 96, щонайменше на 98 965, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або на 100 95 ідентичним 5ЕО ІЮ МО: 9, і при цьому послідовність ДНК, що транскрибується, функціонально пов'язана з промотором придатним для експресії в рослині.
ІЇВЇ У третьому аспекті цього опису запропонована конструкція рекомбінантної ДНК, що містить послідовність ДНК, що транскрибується, що кодує некодуючу молекулу РНК, при цьому некодуюча молекула РНК містить послідовність, яка є, щонайменше на 90 95, щонайменше на 9595, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 9565, щонайменше на 98 95, щонайменше на бо 99 95, щонайменше на 99,5 95 або на 100 95 комплементарною щонайменше 15, щонайменше
16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам молекули мРНК, що кодує ендогенний білок оксидази ЗА20О0 в однодольній або злаковій рослині або клітині рослини, при цьому вказаний ендогенний білок оксидази зА20 є, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 956, щонайменше на 98 965, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або на 100 95 ідентичним 5ЕО ІЮ МО: 15, і при цьому послідовність ДНК, що транскрибується, функціонально пов'язана з промотором придатним для експресії в рослині.
ІЗ|Ї У четвертому аспекті цього опису запропонована конструкція рекомбінантної ДНК, що містить послідовність ДНК, що транскрибується, яка кодує некодуючу молекулу РНК, при цьому некодуюча молекула РНК містить послідовність, яка є, щонайменше на 90 95, щонайменше на 9595, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 9565, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або на 100 95 комплементарною щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам молекули мРНК, що кодує ендогенний білок оксидази БАЗ в однодольній або злаковій рослині або клітині рослини, ендогенний білок оксидази СЗАЗ є, щонайменше на 8095, щонайменше на 8595, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 96, щонайменше на 98 965, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або на 100 95 ідентичним 5ЕО ІО МО: 30 або 33, і при цьому послідовність ДНК, що транскрибується, функціонально пов'язана з промотором придатним для експресії в рослині.
МОЇ У п'ятому аспекті цього опису запропонована конструкція рекомбінантної ДНК, що містить послідовність ДНК, що транскрибується, що кодує некодуючу молекулу РНК, при цьому некодуюча молекула РНК містить послідовність, яка є, щонайменше на 90 95, щонайменше на 9595, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 9565, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або на 100 95 комплементарною щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21,
Зо щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам молекули мРНК, що кодує ендогенний білок оксидази (ЗА20 в однодольній або злаковій рослині або клітині рослини, ендогенний білок оксидази (ЗА20 є, щонайменше на 8095, щонайменше на 8595, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 96, щонайменше на 98 965, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або на 100 95 ідентичним ЗЕО ІЮО МО: 12, і при цьому послідовність ДНК, що транскрибується, функціонально пов'язана з промотором придатним для експресії в рослині.
М) У шостому аспекті цього опису запропонована конструкція рекомбінантної ДНК, що містить послідовність ДНК, що транскрибується, що кодує некодуючу молекулу РНК, при цьому некодуюча молекула РНК містить послідовність, яка є, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85956, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 96, щонайменше на 9895, щонайменше на 9995, щонайменше на 99,5 95 або на 100 95 комплементарною щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам молекули мРНК, що кодує ендогенний білок в однодольній або злаковій рослині або клітині рослини, при цьому ендогенний білок є, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85956, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 96, щонайменше на 9895, щонайменше на 9995, щонайменше на 99,5 95 або на 100 95 ідентичним ЗЕО ІЮ МО: 86, 90, 94, 97, 101, 104, 108, 112, 116, 118, 121, 125, 129, 133 або 136, і при цьому послідовність ДНК, що транскрибується, функціонально пов'язана з промотором придатним для експресії в рослині. У додатковому аспекті цього опису також запропонований вектор для трансформації, що містить конструкцію рекомбінантної ДНК, яка описана в цьому документі. У додатковому аспекті цього опису також запропонована трансгенна однодольна або злакова рослина, частина рослини або клітина рослини, що містить конструкцію рекомбінантної
ДНК, описану в цьому документі. В одному аспекті надається трансгенна рослина кукурудзи, частина рослини або клітина рослини. В іншому аспекті запропонований спосіб отримання трансгенної злакової рослини, що включає: (а) трансформацію щонайменше однієї клітини експлантата за допомогою конструкції рекомбінантної ДНК, описаної в цьому документі, та (Б) 60 регенерацію або розвиток трансгенної злакової рослини з трансформованого експлантата. В іншому аспекті злакова рослина трансформується за допомогою трансформації, опосередкованої Адгобасіегішт або бомбардуванням частинками. 21 У сьомому аспекті цього опису запропонований спосіб зниження рівня щонайменше однієї активної молекули СА в стеблі кукурудзяної або зернової рослини, що включає: супресію одного або більше генів оксидази САЗ або оксидази ЗА20 рекомбінантною конструкцією ДНК в одній або більше тканинах трансгенної зернової або кукурудзяної рослини. (13) У восьмому аспекті цього опису запропонована трансгенна кукурудзяна або зернова рослина, що містить конструкцію рекомбінантної ДНК, при цьому конструкція рекомбінантної
ДНК містить послідовність ДНК, що транскрибується, що кодує некодуючу молекулу РНК, яка націлена щонайменше на один ендогенний ген оксидази СА20 або БАЗ для супресії, при цьому послідовність ДНК, що транскрибується, функціонально пов'язана з промотором придатним для експресії в рослині, і при цьому трансгенна однодольна або зернова рослина має меншу висоту рослини в порівнянні з контрольною рослиною дикого типу. 14) У дев'ятому аспекті цього опису запропонована зернова рослина, що містить мутацію в ендогенному гені оксидази СА або біля нього, введену методом мутагенезу, при цьому рівень експресії ендогенного гена оксидази ЗА знижується або відсутній в зерновій рослині, і при цьому зернова рослина має меншу висоту в порівнянні з контрольною рослиною дикого типу. 15) У десятому аспекті цього опису запропонована кукурудзяна або зернова рослина, що містять геномне редагування, введене за допомогою цільового методу редагування геному в локус ендогенного гену оксидази СА або біля нього, при цьому рівень експресії ендогенного гена оксидази СА знижений або відсутній в порівнянні з контрольною рослиною, і при цьому редагована зернова рослина має меншу висоту в порівнянні з контрольною рослиною.
П16Ї В одинадцятому аспекті цього опису запропонована композиція, яка містить направляючу РНК, при цьому направляюча РНК містить направляючу послідовність, яка є, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 96, щонайменше на 98 965, щонайменше на 9995 або на 10095 ідентичною або комплементарною щонайменше 10, щонайменше 11, щонайменше 12, щонайменше 13, щонайменше 14, щонайменше 15, щонайменше 16, по щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24 або щонайменше 25 послідовним нуклеотидам цільової послідовності ДНК в геномному локусі ендогенного гена оксидази СА зернової рослини або біля нього. В одному аспекті композиція додатково містить ендонуклеазу, що направляється РНК.
І17| У дванадцятому аспекті цього опису запропонована конструкція рекомбінантної ДНК, що містить послідовність ДНК, що транскрибується, що кодує некодуючу молекулу направляючої
РНК, при цьому молекула направляючої РНК містить направляючу послідовність, яка є, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 96, щонайменше на 98 965, щонайменше на 9995 або на 10095 комплементарною щонайменше 10, щонайменше 11, щонайменше 12, щонайменше 13, щонайменше 14, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24 або щонайменше 25 послідовним нуклеотидам цільової послідовності ДНК в геномному локусі ендогенного гена оксидази СА кукурудзяної або зернової рослини або біля нього. 18) У тринадцятому аспекті цього опису запропонована донорна матриця рекомбінантної
ДНК, що містить, щонайменше, одну гомологічну послідовність, при цьому щонайменше одна гомологічна послідовність є, щонайменше на 70 9565, щонайменше на 75 95, щонайменше на 80 96, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 9695, щонайменше на 9795, щонайменше на 99595 або на 10095 комплементарною, щонайменше 20, щонайменше 25, щонайменше 30, щонайменше 35, щонайменше 40, щонайменше 45, щонайменше 50, щонайменше 60, щонайменше 70, щонайменше 80, щонайменше 90, щонайменше 100, щонайменше 150, щонайменше 200, щонайменше 250, по щонайменше 500, щонайменше 1000, щонайменше 2500 або щонайменше 5000 послідовним нуклеотидам послідовності цільової ДНК, при цьому послідовність цільової ДНК є геномною послідовністю в геномному локусі ендогенного гена оксидази ЗА кукурудзяної або зернової рослини або біля нього. 19) У чотирнадцятому аспекті цього опису запропонована донорна матриця рекомбінантної
ДНК містить два гомологічних плеча, включаючи перше гомологічне плече і друге гомологічне плече, при цьому перше гомологічне плече містить послідовність, яка є, щонайменше на 70 95, щонайменше на 7595, щонайменше на 80 956, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 95, щонайменше на 99 95 або бо на 100 96 комплементарною, щонайменше 20, щонайменше 25, щонайменше 30, щонайменше
35, щонайменше 40, щонайменше 45, щонайменше 50, щонайменше 60, щонайменше 70, щонайменше 80, щонайменше 90, щонайменше 100, щонайменше 150, щонайменше 200, щонайменше 250, щонайменше 500, щонайменше 1000, щонайменше 2500 або щонайменше 5000 послідовним нуклеотидам першої фланкуючої послідовності ДНК, при цьому друге гомологічне плече містить послідовність, яка є, щонайменше на 70 956, щонайменше на 75 95, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 965, щонайменше на 9695, щонайменше на 9795, щонайменше на 9995 або на 10095 комплементарною, щонайменше 20, щонайменше 25, щонайменше 30, щонайменше 35, щонайменше 40, щонайменше 45, щонайменше 50, щонайменше 60, щонайменше 70, щонайменше 80, щонайменше 90, щонайменше 100, щонайменше 150, щонайменше 200, щонайменше 250, щонайменше 500, щонайменше 1000, щонайменше 2500 або щонайменше 5000 послідовним нуклеотидам другої фланкуючої послідовності ДНК, і при цьому перша фланкуюча послідовність ДНК і друга фланкуюча послідовність ДНК є геномними послідовностями у геномному локусі ендогенного гена оксидази СА кукурудзяної або зернової рослини або біля нього. В одному аспекті додатково надана молекула ДНК або вектор, що містить донорну матрицю рекомбінантної ДНК, описану в цьому документі. В іншому аспекті додатково надана бактеріальна клітина або клітина-господар, що містить донорну матрицю рекомбінантної ДНК, описану в цьому документі. В іншому аспекті додатково надана кукурудзяна або зернова рослина, частина рослини або клітина рослини, що містить конструкцію рекомбінантної ДНК, описану в цьому документі.
І20| У п'ятнадцятому аспекті цей опис відноситься до сконструйованої сайт-специфічної нуклеази, яка зв'язується з цільовим сайтом в або поруч з геномним локусом ендогенного гена оксидази (ЗА кукурудзяної або зернової рослини та викликає дволанцюговий або одноланцюговий розрив в цільовому сайті. (21) В шістнадцятому аспекті цей опис відноситься до конструкції рекомбінантної ДНК, що містить трансген, що кодує сайт-специфічну нуклеазу, при цьому сайт-специфічна нуклеаза зв'язується з цільовим сайтом у геномному локусі ендогенного гена оксидази СА однодольної або зернової рослини, або біля нього і викликає дволанцюговий або одноланцюговий розрив в цільовому сайті.
Зо (22| У сімнадцятому аспекті цей опис відноситься до способу отримання трансгенної кукурудзяної або зернової рослини, що включає: (а) трансформацію щонайменше однієї клітини експлантата за допомогою донорної матриці рекомбінантної ДНК, описаної в цьому документі, та (6) регенерацію або розвиток трансгенної кукурудзяної або зернової рослини з трансформованого експлантата, при цьому трансгенна кукурудзяна або зернова рослина містить послідовність вставки донорної матриці рекомбінантної ДНК. (23) У вісімнадцятому аспекті цей опис відноситься до способу отримання кукурудзяної або зернової рослини, що має геномне редагування в гені ендогенної оксидази СА або біля нього, що включає: (а) введення щонайменше в одну клітину експлантата кукурудзяної або зернової рослини сайт-специфічну нуклеазу або молекулу рекомбінантної ДНК, що містить трансген, що кодує сайт-специфічну нуклеазу, при цьому сайт-специфічна нуклеаза зв'язується з цільовим сайтом в геномному локусі ендогенного гена оксидази (СА або біля нього і спричиняє дволанцюговий або одноланцюговий розрив в цільовому сайті та (Б) регенерацію або розвиток редагованої кукурудзяної або зернової рослини щонайменше з однієї клітини експлантата, що містить геномне редагування в гені ендогенної оксидази ЗА або біля нього редагованої однодольної або зернової рослини. (24) У дев'ятнадцятому аспекті цей опис відноситься до модифікованої рослини кукурудзи, яка має висоту рослини менше 2000 мм, менше 1950 мм, менше 1900 мм, менше 1850 мм, менше 1800 мм, менше 1750 мм, менше 1700 мм, менше 1650 мм, менше 1600 мм, менше 1550 мм, менше 1500 мм, менше 1450 мм, менше 1400 мм, менше 1350 мм, менше 1300 мм, менше 1250 мм, менше 1200 мм, менше 1150 мм, менше 1100 мм, менше 1050 мм або менше 1000 мм і один або більше з (ї) середнього діаметра стебла понад 18 мм, понад 18,5 мм, понад 19 мм, понад 19,5 мм, понад 20 мм, понад 20,5 мм, понад 21 мм, понад 21,5 мм або понад 22 мм, (ії) поліпшення стійкості до вилягання в порівнянні з контрольною рослиною дикого типу, або (її) підвищення стійкості до посухи в порівнянні з контрольною рослиною дикого типу. (25) У двадцятому аспекті цей опис відноситься до модифікованої зернової рослини, що має зменшену висоту рослини в порівнянні з контрольною рослиною дикого типу, та (ї) збільшеному діаметру стебла в порівнянні з контрольною рослиною дикого типу, (ії) поліпшеної стійкості до вилягання в порівнянні з контрольною рослиною дикого типу, або (ії) поліпшеної стійкості до посухи в порівнянні з контрольною рослиною дикого типу. 60 КОРОТКИЙ ОПИС ГРАФІЧНИХ МАТЕРІАЛІВ
(26) На Фіг. 1 проілюстрована зменшена висота рослин у інбредних рослин кукурудзи, що експресують конструкцію супресії оксидази СА20, через вісім подій трансформації в порівнянні з інбредними контрольними рослинами; (27| На Фіг. 2А проілюстрована зменшена висота рослин в середньому по гібридним рослинам кукурудзи, що експресують конструкцію супресії оксидази СЗА20, в порівнянні з гіоридними контрольними рослинами; (28) На Фіг. 28 проілюстровано зображення гібридної контрольної рослини дикого типу (ліворуч) поруч з гібридною рослиною кукурудзи, що експресує конструкцію супресії оксидази
СА20 (праворуч), що мають зменшену висоту рослини; (29) На Фіг. ЗА проілюстрований збільшений діаметр стебла рослин в середньому по гібридним рослинам кукурудзи, що експресують конструкцію супресії оксидази СА20, в порівнянні з гібридними контрольними рослинами;
ЇЗОЇ На Фіг. ЗВ проілюстровано зображення поперечного перетину стебла гібридної контрольної рослини дикого типу (ліворуч) поруч з поперечним перетином стебла гібридної рослини кукурудзи, що експресує конструкцію супресії оксидази ЗА20 (праворуч), що має збільшений діаметр стебла;
ІЗТІ На Фіг. 4 проілюстрована збільшена сира вага початку в середньому по гібридним рослинам кукурудзи, що експресують конструкцію супресії оксидази ЗА20, в порівнянні з гіоридними контрольними рослинами;
ІЗ2ІЇ На Фіг. 5 проілюстрована збільшена сира вага початку в середньому по гібридним рослинам кукурудзи, що експресують конструкцію супресії оксидази ЗА20, у двох польових випробуваннях в порівнянні з гібридними контрольними рослинами дикого типу у відповідь на випадок сильного вітру, який викликав більше вилягання у гібридних контрольних рослин;
ІЗ3Ї На Фіг. 6 проілюстрований збільшений індекс збору гібридних рослин кукурудзи, що експресують конструкцію супресії оксидази СЗА20, в порівнянні з гібридними контрольними рослинами;
ЇЗ4Ї На Фіг. 7 проілюстровано збільшення середньої оцінки врожайності зерна гібридних рослин кукурудзи, що експресують конструкцію супресії оксидази СА20, в порівнянні з гіоридними контрольними рослинами;
Зо ІЗ5Ї На Фіг. 8 проілюстрований збільшений показник плодючості в середньому по гібридним рослинам кукурудзи, що експресують конструкцію супресії оксидази СЗА20, в порівнянні з гіоридними контрольними рослинами;
ІЗ6Ї На Фіг. 9 проілюстровано зміну висоти рослин з плином часу на стадіях розвитку М11 до
КІ між трансгенними рослинами кукурудзи і контролем;
ІЗ7Ї На Фіг. 10 проілюстрований графік, що порівнює вимірювання співвідношень стабільних ізотопів кисню (0180) як показника провідності устя та рівня води в тканини листя на стадії К5 між трансгенними рослинами кукурудзи і контролем;
ІЗ8І На Фіг. 11 проілюстрований графік, що порівнює швидкість росту кореня під час стадій розвитку М10 та до К2 між трансгенними і контрольними рослинами як в умовах 5АР, так ів умовах НО із застосуванням датчиків на різних глибинах грунту, які виявляють зміни в рівнях води, що вказують на наявність коренів на цій глибині;
ІЗ9Ї На Фіг. 12А проілюстровані відмінності в провідності устя вранці та вдень між трансгенними рослинами кукурудзи та контролем за нормальних умов та умов посухи в теплиці;
І4ОЇ На Фіг. 128 проілюстровані відмінності у фотосинтезі вранці та вдень між трансгенними рослинами кукурудзи та контролем в нормальних умовах і в умовах посухи в теплиці;
І41| На Фіг. 13А проілюстровані відмінності в рівнях експресії мікроРНК в загальній стебловій тканині або в окремих судинних та несудинних тканинах стебла трансгенних рослин кукурудзи в порівнянні з контролем; а також
І421 На Фіг. 13В проілюстровані відмінності в рівнях експресії транскрипта мРНК оксидази З
СА20 та оксидази 5 СБА20 у загальній стебловій тканини або в окремих судинних і несудинних тканинах стебла трансгенних рослин кукурудзи в порівнянні з контролем.
ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС СУТНОСТІ ВИНАХОДУ
Визначення
І43|Ї Для полегшення розуміння опису, кілька термінів та скорочень, що застосовуються в цьому документі, визначені нижче наступним чином:
І44)| Термін "та/або" в разі застосування в списку з двох або більше предметів означає, що будь-який з перерахованих предметів може застосовуватися сам по собі або в поєднанні з будь- яким одним або більше перерахованими предметами. Наприклад, вираз "А та/або В" призначено для позначення одного або обох з А та В, тобто одного А, одного В або А та В в 60 комбінації. Вираз "А, В та/або С" призначено для позначення одного А, одного В, одного С, А та
В в комбінації, А та С в комбінації, В та С в комбінації або А, В та С в комбінації.
Ї45| Застосовуваний в цьому документі термін "близько" призначений для визначення числових значень, які він змінює, та позначає таке значення як змінну в межах похибки. Коли конкретна межа похибки, такої як стандартне відхилення від середнього значення, не вказана, слід розуміти, що термін "близько" означає той діапазон, який буде включати вказане значення та діапазон, який буде включати округлення в більшу або меншу сторону до цієї цифри з урахуванням значущих цифр.
І46Ї Термін "зернова рослина" в контексті цього опису відноситься до однодольної (топосої) культурної рослини, яка відноситься до сімейства злакових Роасеаеє або Сгатіпеае та яку зазвичай збирають з метою отримання її насіння, включаючи, наприклад, пшеницю, кукурудзу, рис, просо, ячмінь, сорго, овес та жито.
І47| Застосовуваний в цьому документі термін "відсоток ідентичності" щодо двох або більше нуклеотидних або білкових послідовностей розраховується шляхом (ї) порівняння двох оптимально вирівняних послідовностей (нуклеотиду або білка) у вікні порівняння, (ії) визначення кількості положень, у яких ідентична основа нуклеїнової кислоти (для нуклеотидних послідовностей) або амінокислотний залишок (для білків) зустрічається в обох послідовностях, з метою отримання числа співпадаючих положень, (ії) поділ кількості співпадаючих положень на загальну кількість положень у вікні порівняння, а потім (м) множення цього коефіцієнта на 100 95, щоб отримати відсоток ідентичності. З метою розрахунку "відсотка ідентичності" між послідовностями ДНК та РНК урацил (І) послідовності РНК вважається ідентичним тиміну (Т) послідовності ДНК. Якщо вікно порівняння визначено як область вирівнювання між двома або більше послідовностями (тобто, виключаючи нуклеотиди на 5 та 3 кінцях вирівняних полінуклеотидних послідовностей або амінокислот на М-кінці та С-кінці вирівняних послідовностей білка, які не є ідентичними для порівнюваних послідовностей), тоді "відсоток ідентичності" також може згадуватися як "відсоток ідентичності вирівнювання". Якщо "відсоток ідентичності" обчислюється по відношенню до еталонної послідовності без вказівки конкретного вікна порівняння, то відсоток ідентичності визначається шляхом ділення числа співпадаючих положень в області вирівнювання на загальну довжину еталонної послідовності. Відповідно, для цілей цього опису, коли дві послідовності (запитувана і предметна) оптимально вирівняні (з
Зо урахуванням пробілів в їх вирівнюванні), "відсоток ідентичності" для запитуваної послідовності дорівнює кількості ідентичних положень між двома послідовностями поділеній на загальну кількість положень у запитуваної послідовності по всій її довжині (або у вікні порівняння), яка потім множиться на 100 95.
Ї48| Визнано, що положення залишків білків, які не є ідентичними, часто відрізняються консервативними амінокислотними замінами, де амінокислотні залишки замінені іншими амінокислотними залишками з аналогічним розміром і хімічними властивостями (наприклад, зарядом, гідрофобністю, полярністю та тому подібним), а, отже, не можуть змінити функціональні властивості молекули. Коли послідовності відрізняються консервативними замінами, відсоток подібності послідовностей може бути відкоректований в бік збільшення, щоб скорегувати консервативну природу неідентичних заміни (замін). Вважається, що послідовності, які відрізняються такими консервативними замінами, мають "подібність послідовностей" або "схожість". Таким чином, "відсоток подібності", як застосовується в цьому документі щодо двох або більше білкових послідовностей, розраховується шляхом (Її) порівняння двох оптимально вирівняних білкових послідовностей у вікні порівняння, (ії) визначення кількості положень, в яких один і той же або подібний амінокислотний залишок зустрічається в обох послідовностях, з метою отримання числа співпадаючих положень, (ії) ділення кількості співпадаючих положень на загальну кількість положень у вікні порівняння (або загальну довжину еталонного або запитуваного білка якщо вікно порівняння не вказано), а потім (їм) множення цього коефіцієнта на 10095, з метою отримання відсотка схожості. Консервативні амінокислотні заміни білків відомі в цій галузі техніки.
Ї49| Для оптимального вирівнювання послідовностей з метою обчислення їх відсотка ідентичності або подібності в цій галузі техніки відомі різні попарні або множинні алгоритми та програми вирівнювання послідовностей, такі як СіиеїамуУ або Вабіс І оса! АІїдпітепі Зеагсп ТооФ (ВГ АБ5ТФ)) і тому подібні, які можуть застосовуватися для порівняння ідентичності або подібності послідовностей між двома або більше нуклеотидними, або білковими послідовностями. Не дивлячись на те, що в цій галузі техніки відомі інші способи вирівнювання та порівняння, вирівнювання між двома послідовностями (включаючи діапазони відсотка ідентичності, описані вище) може бути таким, як визначено алгоритмом Сіивіаму або ВІ А5ТФ, див., наприклад,
Спеппа К. та співавт., "Мийіріє зедоепсе аїідптепі у/йп (Ше Сіиеаї зегівє5 ої ргодгатв, " Мисівїс 60 Асід5 Небвеагтсп 31: 3497-3500 (2003); Тпотрзоп 9УО та співавт., "СіиеїаіІ! МУ: Ітргоміпу Ше вепзйймну ої ргодгез5іме тийіріє зедоепсе аїіїдптепі Ійгоцди зедиепсе меїднпііпа, розйіоп-5ресіїїс дар репайез апа умеїдні таїйгх споїісе, " Мисівїс Асід5 Незеагсй 22: 4673-4680 (1994 рік); та Гажіп
МА та співавт., "СіиеїтаІ УМ апа Сіивіа! Х мегвіоп 2.0," Віоіптогітайіс5 23: 2947-48 (2007 рік); та
АЙйбспиї, ЗЕ, сіб, МУ., МіПег, М/., Муег5, ЕМ 5 Гіртап, 0 (1990 рік) "Вабхіс Іосаї аїїдптепі зеагсп 1001." у). Мої. Віої. 215: 403-410 (1990 рік), весь зміст та опис яких включено в цей документ за допомогою посилання.
І5ОЇ В цьому документі термін "відсоток комплементарності", застосовується по відношенню до двох нуклеотидних послідовностей, є аналогічним концепції процентної ідентичності, але відноситься до відсотку нуклеотидів у запитуваної послідовності, яка оптимально парується основами або гібридизується з нуклеотидами предметної послідовності, коли запитувані та предметні послідовності розташовані лінійно та оптимально спарюються основами без вторинних структур, що складуються, таких як петлі, стебла або шпильки. Такий відсоток комплементарності може бути між двома ланцюгами ДНК, двома ланцюгами РНК або ланцюгом
ДНК та ланцюгом РНК. "Відсоток комплементарності" розраховується шляхом (ї) оптимального спарювання основ або гібридизації двох нуклеотидних послідовностей в лінійному та повністю витягнутому положенні (тобто, без фолдінгу або вторинних структур) через вікно порівняння, (ії) визначення кількості положень цієї пари основ між двома послідовностями у вікні порівняння, з метою отримання кількості комплементарних положень, (ії) ділення кількості комплементарних положень на загальну кількість положень у вікні порівняння та (ім) множення цього коефіцієнта на 100 95, з метою отримання процентної комплементарності двох послідовностей. Оптимальне спарювання основ двох послідовностей може бути визначено на основі відомих спарювань нуклеотидних основ, таких як 5-С, А-Т та А-У, за допомогою водневих зв'язків. Якщо "відсоток комплементарності" обчислюється по відношенню до еталонної послідовності без вказівки конкретного вікна порівняння, то відсоток ідентичності визначається шляхом ділення числа додаткових положень між двома лінійними послідовностями по загальній довжині еталонної послідовності. Таким чином, для цілей цього опису, коли дві послідовності (запитувана та предметна) є оптимально спарені основами (з урахуванням розбіжностей або не спарених основами нуклеотидів, але без фолдінгу або вторинних структур), "відсоток комплементарності" для запитуваної послідовності дорівнює кількості спарених основами положень між двома послідовностями, поділеній на загальну кількість положень у запитуваній послідовності по всій її довжині (або на кількість положень у запитуваній послідовності у вікні порівняння), яка потім множиться на 100 95.
ІЗ51Ї Термін "функціонально пов'язаний" відноситься до функціонального зв'язку між промотором або іншим регуляторним елементом та асоційованою послідовністю ДНК, що транскрибується, або кодуючою послідовністю гена (або трансгена), так що промотор, тощо, діє чи функціонує, з метою ініціювати, сприяти, впливати, викликати та/або стимулювати транскрипцію та експресію асоційованої послідовності ДНК, що транскрибується, або кодуючої послідовності, щонайменше, в певних клітинах, тканинах, стадії(ях) розвитку та/або стані(ах).
ІЗ521Ї Термін "промотор, що експресується в рослині" відноситься до промотора, який може ініціювати, сприяти, впливати, викликати та/або стимулювати транскрипцію та експресію асоційованої з ним послідовності ДНК, що транскрибується, кодуючої послідовності або гена в рослинній клітині або тканині.
ІЇ5З3| Термін "гетерологічний" по відношенню до промотора або іншої регуляторної послідовності по відношенню до асоційованої полінуклеотидної послідовності (наприклад, послідовності ДНК, що транскрибується, або кодуючої послідовності, або гена) є промотором або регуляторною послідовністю, яка функціонально не пов'язана з такою асоційованою полінуклеотидною послідовністю в природі - наприклад, промотор або регуляторна послідовність мають різне походження в порівнянні з асоційованою полінуклеотидною послідовністю, талабо промотор або регуляторна послідовність невідомі у природі у видів рослин, які повинні бути трансформовані промотором або регуляторною послідовністю.
І54|Ї Термін "рекомбінантний" відносно полінуклеотидної (ДНК або РНК) молекули, білку, конструкції, вектору та такого іншого, відноситься до полінуклеотидної або білкової молекули або послідовності, штучної та такої, що зазвичай не зустрічається в природі, та/або присутнім в контексті в якому вони зазвичай не зустрічаються в природі, включаючи молекулу полінуклеотиду (ДНК або РНК), білок, конструкцію тощо, включаючи комбінацію двох або більше послідовностей полінуклеотиду або білка, які не зустрічаються в природі разом, таким же чином без втручання людини, що й полінуклеотидна молекула, білок, конструкція тощо, що включають в себе щонайменше дві полінуклеотидні або білкові послідовності, які функціонально пов'язані, але гетерологічні стосовно один до одного. Наприклад, термін "рекомбінантний" може 60 відноситися до будь-якої комбінації двох або більше послідовностей ДНК або білка в одній і тій же молекулі (наприклад, плазміді, конструкції, векторі, хромосомі, білку та таке інше), де така комбінація є штучною і зазвичай не зустрічається в природі. Як застосовується в цьому визначенні, фраза "зазвичай не зустрічається в природі" означає "не зустрічається в природі без втручання людини". Рекомбінантна полінуклеотидна або білкова молекула, конструкція тощо, може містити полінуклеотидну або білкову послідовність(ості), яка (ї) відокремлена від іншої полінуклеотидної або білкової послідовності(тей), які існують в природі поруч один з одним, та/або (ії) є суміжною (або примикає до) з іншими полінуклеотидними або білковими послідовностями, які не перебувають у природній близькості один від одного. Така рекомбінантна полінуклеотидна молекула, білок, конструкція тощо, також може стосуватися полінуклеотидної або білкової молекули, або послідовності, яка була генетично сконструйована та/або сконструйована поза клітиною. Наприклад, рекомбінантна молекула ДНК може містити будь-яку сконструйовану або штучну плазміду, вектор тощо, та може включати лінійну або кільцеву молекулу ДНК. Такі плазміди, вектори тощо, можуть містити різні підтримуючі елементи, включаючи прокаріотичну точку початку реплікації та селектуючий маркер, а також один або більше трансгенів або експресійних касет, можливо, на додаток до селектуючого маркерного гену рослини та тому подібному.
І55) В цьому документі термін "виділений" стосується, щонайменше, часткового відділення молекули від інших молекул, в основному пов'язаних з нею в її природному стані. В одному варіанті реалізації винаходу термін "виділений" стосується молекули ДНК, яка відокремлена від нуклеїнових кислот, що зазвичай фланкують молекулу ДНК в її природному стані. Наприклад, молекула ДНК, що кодує білок, який природним чином присутній в бактерії, була б виділеної молекулою ДНК, якби вона не перебувала в ДНК бактерії, у якій природним чином знаходиться молекула ДНК, що кодує білок. Таким чином, молекула ДНК, злита або функціонально пов'язана з однією або більше іншою молекулою(ами) ДНК, з якими вона не може бути пов'язана в природі, наприклад, в результаті рекомбінантної ДНК або методів трансформації рослин, вважається виділеною в цьому документі. Такі молекули вважаються виділеними, навіть якщо вони інтегровані в хромосому клітини-господаря або присутні в розчині нуклеїнової кислоти з іншими молекулами ДНК.
І56) В цьому документі термін "кодуюча область" стосується частини полінуклеотиду, який
Зо кодує функціональну одиницю або молекулу (наприклад, без обмеження, мРНК, білок або некодуючу послідовність або молекулу РНК).
ІБ7| В цьому документі термін "модифікований" в контексті рослини, насіння рослини, частини рослини, клітини рослини та/або геному рослини стосується рослини, насіння рослини, частини рослини, клітини рослини та/або геному рослини, що містить сконструйовану зміну у рівні експресії та/лабо кодуючої послідовності одного або більше гена(ів) оксидази СА по відношенню до дикого типу або контрольної рослини, насіння рослини, частини рослини, клітини рослини та/або геному рослини, наприклад, через (А) трансгенну подію, що включає конструкцію, що супресує, або послідовність ДНК, що транскрибується, що кодує некодуючу
РНК, яка націлена на один або більше генів оксидази ЗАЗ та/або СА20 для супресії, або (В) подію редагування генома або мутацію, яка впливає (наприклад, зменшуючи або усуваючи) на рівень експресії або активності одного або більше ендогенних генів оксидази САЗ та/або СА20.
Більш того, термін "модифікований" може додатково стосуватися рослини, насіння рослини, частини рослини, клітини рослини та/або геному рослини, що має одну або більше мутацій, що впливають на експресію одного або більше ендогенних генів оксидази СА, таких як один або більше ендогенних генів оксидази (САЗ та/або СА20, введених за допомогою хімічного мутагенезу, вставки або виключення транспозону, або будь-якого іншого відомого методу мутагенезу, або введених за допомогою редагування генома. Тому, для ясності, модифікована рослина, насіння рослини, частина рослини, клітина рослини та/або геном рослини включає мутовану, редаговану та/або трансгенну рослину, насіння рослини, частину рослини, клітину рослини та/або геном рослини, що мають модифікований рівень експресії, профіль експресії та/або послідовність, що кодує один або більше генів оксидази ЗА по відношенню до дикого типу або контрольної рослини, насіння рослини, частини рослини, клітини рослини та/або геному рослини. Модифіковані рослини або насіння можуть містити різні молекулярні зміни, які впливають на експресію гена(ів) оксидази СА, таких як ген(и) оксидази САЗ та/або СА20, включаючи генетичні та/або епігенетичні модифікації. Модифіковані рослини, частини рослин, насіння тощо, можуть бути піддані мутагенезу, редагування генома або сайт-спрямованої інтеграції (наприклад, без обмеження, за допомогою способів, які застосовують сайт-специфічні нуклеази), генетичної трансформації (наприклад, без обмеження, за допомогою способів трансформації Адгорасіегйішт або бомбардування мікрочастинками) або їх комбінації. Такі бо "модифіковані" рослини, насіння рослин, частини рослин та клітини рослин включають рослини,
насіння рослин, частини рослин та клітини рослин, які є нащадками або отримані з "модифікованих" рослин, насіння рослин, частин рослин та клітин рослин, які зберігають молекулярну зміну (наприклад, зміну рівня експресії та/або активності) одного або більше генів оксидази ЗА. Модифіковані насіння, представлені в цьому документі, можуть дати початок модифікованій рослині, представленій в цьому документі. Модифікована рослина, насіння рослини, частина рослини, клітина рослини або геном рослини, представлені в цьому документі, можуть містити конструкцію рекомбінантної ДНК або вектор, або геном, як зазначено в цьому документі. "Модифікований продукт рослинного походження" може бути будь-яким продуктом, виготовленим з модифікованої рослини, частини рослини, клітини рослини або хромосоми рослини, представлених в цьому документі, або будь-якої їх частини або компонента. 58) Як застосовується в цьому документі, термін "контрольна рослина" (або аналогічно "контрольні" насіння рослини, частина рослини, клітина рослини та/або геном рослини) стосується рослини (або насіння рослини, частини рослини, клітини рослини та/або геному рослини) що застосовується для порівняння з модифікованою рослиною (або модифікованим насінням рослини, частиною рослини, клітиною рослини та/або геномом рослини) та має такий самий або подібний генетичний фон (наприклад, однакові батьківські лінії, гібридне схрещування, інбредна лінія, тестери, тощо) що й модифікована рослину (або насіння рослини, частина рослини, клітина рослини та/або геном рослини), за винятком події(ій) трансгенного та/або геномного редагування, які зачіпають один або більше генів оксидази СА. Наприклад, контрольна рослина може бути інбредною лінією, яка є такою ж інбредною лінією, що застосовується для виготовлення модифікованої рослини, або контрольна рослина може бути продуктом того ж гібридного схрещування інбредних батьківських ліній, що й модифікована рослина, за винятком відсутності в контрольній рослині будь-якої трансгенної події(ій) або події(ій) редагування генома, що зачіпає один або більше генів оксидази СА. З метою порівняння з модифікованою рослиною, насінням рослини, частиною рослини, клітиною рослини та/або геномом рослини, "рослина дикого типу "(або аналогічним чином насіння рослини "дикого типу", частина рослини "дикого типу", клітина рослини "дикого типу" та/або геном рослини "дикого типу") стосується нетрансгенної та геномно-нередагованої контрольної
Зо рослини, насіння рослини, частини рослини, клітини рослини та/або геному рослини. В цьому документі термін "контрольна" рослина, насіння рослини, частина рослини, клітина рослини та/лабо геном рослини може також бути рослиною, насінням рослини, частиною рослини, клітиною рослини та/або геномом рослини, що мають схожий (але не однаковий або ідентичний) генетичний фон з модифікованим рослиною, насінням рослини, частиною рослини, клітиною рослини та/або геномом рослини, якщо він вважається досить подібним для порівняння характеристик або ознак, що підлягають аналізу.
ІБ9У|Ї В цьому документі термін "цільовий сайт" для редагування генома стосується розташування полінуклеотидної послідовності в геномі рослини, яка зв'язується та розщеплюється сайт-специфічною нуклеазою, що вводить дволанцюговий розрив (або одноланцюговий розрив) в остов нуклеїнової кислоти полінуклеотидної послідовності та/або в її комплементарний ланцюг ДНК. Цільовий сайт може містити щонайменше 10, щонайменше 11, щонайменше 12, щонайменше 13, щонайменше 14, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26, щонайменше 27, щонайменше 29 або щонайменше 30 послідовних нуклеотидів. "Цільовий сайт" для РНК-спрямованої нуклеази може містити послідовність або комплементарного ланцюга молекули дволанцюгової нуклеїнової кислоти (ДНК), або хромосоми в цільовому сайті.
Сайт-специфічна нуклеаза може зв'язуватися з цільовим сайтом, наприклад, через некодуючу направляючу РНК (наприклад, без обмеження, СКІЗРЕ РНК (сгтРНК) або одиночну направляючу
РНК (59РНК), як описано далі нижче). Некодуюча направляюча РНК, представлена в цьому документі, може бути комплементарною цільовому сайту (наприклад, комплементарною або ланцюгу дволанцюгової молекули нуклеїнової кислоти, або хромосомі в цільовому сайті).
Зрозуміло, що для некодуючої направляючої РНК може не вимагатися досконала ідентичність або комплементарність для зв'язування або гібридизації з цільовим сайтом. Наприклад, може допускатися щонайменше 1, щонайменше 2, щонайменше 3, щонайменше 4, щонайменше 5, щонайменше б, щонайменше 7 або щонайменше 8 помилкових спарювань (або більше) між цільовим сайтом та некодуючою РНК. Термін "цільової сайт" також стосується розташування полінуклеотидної послідовності в геномі рослини, яка пов'язана та розщеплюється іншою сайт- специфічною нуклеазою, яка не може направлятися некодуючою молекулою РНК, такою як бо мегануклеаза, нуклеаза з цинковими пальцями (2ЕМ) або ефекторна нуклеаза, подібна активаторам транскрипції (ТАГЕМ), для введення дволанцюгового розриву (або одноланцюгового розриву) в полінуклеотидну послідовність та/або її комплементарний ланцюг
ДНК. В цьому документі термін "цільова область" або "націлена область" стосується полінуклеотидної послідовності або області, яка фланкована двома або більше цільовими сайтами. Без обмеження, в деяких варіантах реалізації винаходу цільова область може бути піддана мутації, делеції, вставці або інверсії. В цьому документі термін "фланковані" якщо застосовується для опису цільової області полінуклеотидної послідовності або молекули, стосується двох або більше цільових сайтів полінуклеотидної послідовності або молекули, що оточує цільову область, з одним цільовим сайтом на кожній стороні цільової області. Крім редагування генома, термін "цільовий сайт" може також застосовуватися в контексті супресії гена для позначення частини молекули мРНК (наприклад, "сайту розпізнавання"), яка комплементарна щонайменше частині некодуючої молекули РНК (наприклад, мікроРНК, мігнкК тощо), що кодується конструкцією супресії.
ІЄОЇ В цьому документі термін "донорна молекула", "донорна матриця" або "молекула донорної матриці" (спільно йменовані "донорна матриця"), які можуть бути рекомбінантною донорною матрицею ДНК, визначається як молекула нуклеїнової кислоти, що має матрицю нуклеїнової кислоти або послідовність вставки для сайт-спрямованої, спрямованої вставки або рекомбінації в геном рослинної клітини за допомогою репарації одноланцюгового розриву або дволанцюгового розриву ДНК в геномі рослинної клітини. Наприклад, "донорна матриця" може застосовуватися для сайт-спрямованої інтеграції трансгену або конструкції супресії, або як матриця для введення мутації, такої як вставка, делеція тощо, в цільовий сайт в межах генома рослини. Запропонований в цьому документі метод редагування цільового генома може включати застосування однієї або більше, двох або більше, трьох або більше, чотирьох або більше, або п'яти або більше донорних молекул або матриць. "Донорська матриця" може бути одноланцюговою або дволанцюговою молекулою ДНК або РНК, або плазмідою. "Інсерційна послідовність" донорної матриці є послідовністю, що призначена для цільової інерції в геном рослинної клітини, яка може мати будь-яку відповідну довжину. Наприклад, інсерційна послідовність донорної матриці може становити від 2 до 50000, від 2 до 10000, від 2 до 5000, від 2 до 1000, від 2 до 500, від 2 до 250, від 2 до 100, від 2 до 50, від 2 до 30, від 15 до 50, від 15 до 100, від 15 до 500, від 15 до 1000, від 15 до 5000, від 18 до 30, від 18 до 26, від 20 до 26, від 20 до 50, від 20 до 100, від 20 до 250, від 20 до 500, від 20 до 1000, від 20 до 5000, від 20 до 10000, від 50 до 250, від 50 до 500, від 50 до 1000, від 50 до 5000, від 50 до 10000, від 100 до 250, від 100 до 500, від 100 до 1000, від 100 до 5000, від 100 до 10000, від 250 до 500, від 250 до 1000, від 250 до 5000 а бо від 250 до 10000 нуклеотидів або пар основ в довжину. Донорна матриця також може мати щонайменше одну гомологічну послідовність або гомологічне плече, таке як два плеча гомології, для спрямовування інтеграції послідовності мутації або вставки в цільовий сайт в геномі рослини за допомогою гомологічної рекомбінації, при цьому гомологічна послідовність або гомологічне плече (ї) ідентичні або комплементарні, або мають відсоток ідентичності або відсоток комплементарності послідовності в цільовому сайті або біля нього в геномі рослини. У разі, якщо донорна матриця містить гомологічне плече (ї) та послідовність вставки, гомологічне плече (ї) буде фланковане або оточувати послідовність вставки донорної матриці.
ІЄТ| Інсерційна послідовність донорної матриці може містити один або більше генів, або послідовностей, кожна з яких кодує транскрибовану некодуючу послідовність РНК або мРНК та/або транслювану послідовність білка. Послідовність, що транскрибується або ген донорної матриці може кодувати білок або некодуючу молекулу РНК. Інсерційна послідовність донорної матриці може містити полінуклеотидну послідовність, яка не містить функціональний ген або повну послідовність гена (наприклад, донорна матриця може просто містити регуляторні послідовності, такі як послідовність промотора, або тільки частину гена або кодуючої послідовності) або може не містити будь-які ідентифіковані елементи експресії гена або будь- яку активно транскрибуючу послідовність гена. Крім того, донорна матриця може бути лінійною або кільцевою та може бути одноланцюговою або дволанцюговою. Донорна матриця може доставлятися в клітину у вигляді "голої" нуклеїнової кислоти (наприклад, за допомогою бомбардування мікрочастинками), у вигляді комплексу з одним або більше агентами доставки (наприклад, ліпосомами, білками, полоксамерами, Т-ланцюгом, інкапсульованою з білками і тому подібним) або міститися в бактеріальному або вірусному носії для доставки, такому як, наприклад, Адгобасієгішт Іштеїасіеєп5 або гемінівірус, відповідно. Інсерційна послідовність донорної матриці, представлена в цьому документі, може містити транскрибуючу послідовність
ДНК, яка може бути транскрибована в молекулу РНК, що може бути некодуючою та може або не бо може бути функціонально пов'язана з промотором та/або іншою регуляторною послідовністю.
І621 Відповідно до деяких варіантів реалізації винаходу донорна матриця може не містити інсерційну послідовність, а замість цього містити одну або більше гомологічних послідовностей, яка(ї) включають одну або більше мутацій, таких як вставка, делеція, заміна тощо, стосовно геномної послідовності на цільовому сайті в геномі рослини, наприклад, в або близько гена оксидази ЗАЗ або оксидази ЗА2О0 в геномі рослини. В альтернативному варіанті, донорна матриця може містити інсерційну послідовність, яка не містить кодуючої або транскрибуючої послідовності ДНК, при цьому інсерційна послідовність застосовується для введення однієї або більше мутацій в цільовий сайт в геномі рослини, наприклад, в або близько гена оксидази САЗ або оксидази СА20 в геномі рослини.
І63З| Донорна матриця, представлена в цьому документі, може містити щонайменше один, щонайменше два, щонайменше три, щонайменше чотири, щонайменше п'ять, щонайменше шість, щонайменше сім, щонайменше вісім, щонайменше дев'ять або щонайменше десять генів або транскрибуючих послідовностей ДНК. В альтернативному варіанті, донорна матриця може не містити генів. Без обмеження, послідовність гена або транскрибуючих ДНК донорної матриці може включати, наприклад, ген стійкості до інсектициду, ген стійкості до гербіцидів, ген ефективності використання азоту, ген ефективності використання води, ген, що забезпечує харчову цінність, ДНК-зв'язуючий ген, селектуючий маркерний ген, РНКі або супресуючу конструкцію, ген ферменту сайт-специфічної модифікації генома, одиночну направляючу РНК системи СКІЗРЕ/Сав59, касету експресії на основі гемінівіруса або векторну систему експресії на основі вірусу рослин. Відповідно до інших варіантів реалізації винаходу інсерційна послідовність донорної матриці може містити транскрибуючу послідовність ДНК, що кодує некодуючу молекулу РНК, яка може націлюватися на ген оксидази СА, такий як ген оксидази ЗАЗ або оксидази СА2О, з метою супресії. Донорна матриця може містити промотор, такий як тканиноспецифічний або тканинобажаний промотор, конститутивний промотор або індуцибельний промотор. Донорна матриця може містити лідерну послідовність, енхансер, промотор, сайт ініціації транскрипції, 5'-НТО, один або більше екзонів, один або більше інтронів, сайт термінації транскрипції область або послідовність, 3-НТО, та/або сигнал поліаденілювання. Лідерна послідовність, енхансер/(або промотор можуть бути функціонально пов'язані з послідовністю гена або ДНК, що транскрибується, що кодує некодуючу РНК, котра
Зо спрямовує РНК, мРНК та/або білок.
І64) В цьому документі термін "судинний промотор" стосується промотора, що експресується в рослині, який керує, викликає або ініціює експресію послідовності ДНК, що транскрибується або трансгена, функціонально пов'язаного з таким промотором, в одній або більше судинній тканині(ах) рослини, навіть якщо промотор також експресується в іншій несудинній клітині(ах) або тканині(ах) рослини. Така судинна тканина(и) може містити одну або більше клітину(и) або тканину(и) флоеми, судинної паренхіми та/або обкладки судинно-волокнистих пучків рослини. "Судинний промотор" відрізняється від конститутивного промотора тим, що він має регульований та відносно більш обмежений профіль експресії, який включає одну або більше судинну тканину(и) рослини. Судинний промотор включає як судинно-специфічні промотори, так і судинно-бажані промотори.
І65) В цьому документі термін "листовий промотор" стосується промотора, що експресується в рослині, який керує, викликає або ініціює експресію послідовності ДНК, що транскрибується або трансгена, функціонально пов'язаного з таким промотором, в одній або більше листовій тканині(ах) рослини, навіть якщо промотор також експресується в інший не листовій клітині(ах) або тканині(ах) рослини. Листовий промотор включає як специфічні для листя промотори, так і бажані для листа промотори. "Листовий промотор" відрізняється від судинного промотора тим, що він експресується переважно або виключно в тканині(ах) листя рослини в порівнянні з іншими тканинами рослини, тоді як судинний промотор експресується переважно в судинній тканині(ах), включаючи судинну тканину(и) поза листям, таку як судинна тканина(и) стебла або стебла та листя рослини.
Опис
ІБ6) Більшість зернових, які виробляють зерно, таких як пшениця, рис і сорго, продукують як чоловічі, так і жіночі структури в межах кожної окремої квіточки волоті (тобто, вони мають єдину репродуктивну структуру). Проте, зернові чи кукурудза унікальні серед злакових культур, оскільки вони утворюють окремі чоловічі (султан) та жіночі (початок) суцвіття. Кукурудза створює повністю сексуально диморфні репродуктивні структури шляхом вибіркового аборту чоловічих органів (пиляків) в суцвіттях початку і жіночих органів (сім'язачатка) в суцвіттях султана на ранніх стадіях розвитку. Точно регульований синтез та передача сигналу гібереліну має вирішальне значення для регуляції процесу вибіркового аборту, причому жіночий бо репродуктивний початок найбільш чутливий до порушень в шляху СА. Дійсно, фенотип "пиляк початку" є найбільш поширеним репродуктивним фенотипом у мутантів СА кукурудзи.
ІБ7| На відміну від кукурудзи, мутації в шляхах синтезу або сигнального шляху гібереліну, які привели до "зеленої революції" по відношенню до пшениці, рису та сорго, зробили незначний вплив на їх репродуктивну структуру, оскільки ці види сільськогосподарських культур не піддаються процесу вибіркового аборту зерна, що несе волоть під час розвитку та, таким чином, не чутливі до порушень в рівнях СА. Ті ж мутації не застосовувалися на кукурудзі, тому що порушення синтезу та сигнального шляху ЗА неодноразово призводило до драматичних спотворень та маскулінізації початку ("пиляк початку") та стерильності (порушення розвитку пиляка та мікроспор) в султані, на додачу до екстремальної карликовості в деяких випадках.
Див., наприклад, СНеп, У. та співавт., "Те Маіїге ОМ'АВЕЇТ Епсодез а Сірбегеїїп 3-Охідазе апа І5 риаї І осаїїгед ю Ше Мисієи5 апа Суювзої, " Ріапі Рпузіоіоду 166: 2028-2039 (2014 рік). Ці мутантні фенотип СА (нетипові) в кукурудзі привели до значного скорочення продукції зерна та зниження врожайності. Додатково, утворення пиляків в початку збільшує ймовірність грибкових інфекцій або інфекцій, викликаних комахами, що знижує якість зерна, виробленого на таких мутантних початках. Передова селекція для розробки напівкарликових ліній кукурудзи не увінчалася успіхом, а репродуктивні відхилення (в тому числі екстремальні карликові) мутантів ЗА було важко подолати. Таким чином, ті ж самі мутації в шляху СА, які призвели до "зеленої революції" в інших зернових, ще не були успішними в кукурудзі.
І68)Ї Незважаючи на ці попередні труднощі в досягненні кращих врожаїв зерна в кукурудзі за допомогою маніпулювання шляхом СА, автори цього винаходу виявили спосіб маніпулювання рівнями ЗА в рослинах кукурудзи таким чином, щоб зменшити загальну висоту рослини та довжину міжвузля стебла та збільшити стійкість до вилягання, але не викликати репродуктивних відхилень, раніше пов'язаних з мутаціями в шляху ЗА кукурудзи. Додаткові дані вказують на те, що ці невисокого зросту або напівкарликові рослини кукурудзи можуть також мати одну або більше додаткових ознак, включаючи збільшений діаметр стебла, зменшений злам стебла, більш глибоке коріння, збільшену площу листя, більш ранню зімкнутість полога, більш високу провідність устя, нижчу висоту початку, підвищений вміст вологи в листі, підвищення стійкості до посухи, підвищення ефективності використання азоту, підвищення ефективності використання води, зниження вмісту антоціанів та площі листя в нормальних умовах або стресових умовах, викликаних обмеженою кількістю азоту або води, збільшення маси початку, збільшення кількості зерна, збільшення маси зерна, збільшення врожайності та/або збільшений індекс збору.
І69|Ї Не обмежуючись будь-якої теорією, передбачається, що неповна супресія гена(ів) оксидази СА20 або САЗ та/або націлювання на підмножину одного або більше генів оксидази
СА може бути ефективним в досягненні невисокого зросту, напівкарликового фенотипу з підвищеною стійкістю до вилягання, але без репродуктивних відхилень в початку. Додатково пропонується, не обмежуючись теорією, що обмеження супресії гена(ів) оксидази СА20 та/або
САЗ деякими тканинами, що активно продукують СА, такими як судинні та/або листові тканини рослини, може бути достатнім для отримання рослини невисокого зросту з підвищеною стійкістю до вилягання, але без значних дефектів в репродуктивних тканинах. Експресія елемента супресії оксидази СА20 або САЗ тканиноспецифічним або тканинобажаним способом може бути достатньою та ефективної для отримання рослин з низькорослим фенотипом, при цьому уникаючи потенційних дефектів в репродуктивних тканинах, які раніше спостерігалися у мутантів СА в кукурудзі (наприклад, уникаючи або обмежуючи супресії гена(ів) оксидази ЗА20 в таких репродуктивних тканинах). Наприклад, ген(и) оксидази БЗА2О0 та/або БАЗ може бути націлений на супресію із застосуванням судинного промотора, такого як промотор паличкоподібного вірусу рису тунгро (КТВМ-тгісе шподго расіцогт міги5), який керує експресією в судинних тканинах рослин. Як підтверджується в наведених нижче Прикладах, профіль експресії промотора КТВМ є активним в судинних тканинах рослин кукурудзи в порівнянні з несудинними тканинами, що є достатнім для отримання напівкарликового фенотипу у рослин кукурудзи, коли він функціонально пов'язаний з елементом супресії, націленим на гени) оксидази ЗА20 та САЗ. Зниження рівнів активної СА в тканині(ах) кукурудзи або зернових рослин, що виробляють активну СА, може зменшити висоту рослини та підвищити стійкість до вилягання, і можна запобігти відхилення в цих рослинах, якщо рівні активної СА теж зазнають значного впливу або зниження в репродуктивних тканинах, таких як жіночий статевий орган, що розвивається, або початок рослини. Якщо рівні активної СА можуть бути знижені в стеблі або міжвузлі(ях) кукурудзи або зернових рослин без істотного впливу на рівні ЗА в репродуктивних тканинах (наприклад, жіночих або чоловічих репродуктивних органах або суцвіттях), тоді кукурудза або зернові рослини, що мають зменшену висоту рослини та підвищену стійкість до 60 вилягання, можуть бути створені без дефектів в репродуктивних тканинах рослини.
(70 Таким чином, в цьому документі представлені конструкції рекомбінантної ДНК та трансгенні рослини, що містять елемент або послідовність супресії оксидази ЗА20 або сдЗ функціонально пов'язані з промотором придатним для експресії в рослині, який може бути тканиноспецифічним або тканинобажаним промотором. Такий тканиноспецифічний або тканинобажаний промотор може керувати експресією асоційованого з ним елемента або послідовності супресії оксидази СА, в одній або більше тканині(ах) рослини, що активно продукують СА, для супресії або зниження рівня активних (СА, які продукуються в цій тканині(ах). Такий тканиноспецифічний або тканинобажаний промотор може керувати експресією, асоційованої з ним конструкції супресії оксидази СА, або трансгена під час однієї або більше стадії(стадій) вегетативного розвитку. Такий тканиноспецифічний або тканинобажаний промотор також може мати невелику експресію або відсутність експресії в одній або більше клітині(ах) або тканині(ах) жіночого статевого органу, що розвивається, або початку рослини з метою уникнення можливості виникнення відхилень в цих репродуктивних тканинах. Відповідно до деяких варіантів реалізації винаходу тканиноспецифічний або тканинобажаний промотор є судинним промотором, таким як промотор ЕТВУ. Послідовність промотора КТВМ представлена в цьому документі як БЕО ІО МО: 65, а усічена версія промотора
ЕТВМ додатково представлена в цьому документі як ЗЕО ІЮ МО: 66.
Ї/11| Активні або біоактивні гіберелінові кислоти (тобто, "активні гібереліни" або "активні ЗА") відомі в цій галузі техніки для цього виду рослин, на відміну від неактивних ЗА. Наприклад, активні СА в кукурудзі та вищих рослинах включають таке: ЗАТ, БАЗ, СА4 та сА7. Таким чином, "тканина, що виробляє активну ЗА" є рослинною тканиною, яка продукує одну або більше активних сА.
І7/21 Крім супресії генів оксидази СА20 в тканинах рослини, які продукують активну ОА, за допомогою промотора судинної тканини, було несподівано виявлено, що супресія одних й тих же генів оксидази СА20 за допомогою різних конститутивних промоторів також може викликати фенотип низького, напівкарликового зросту у кукурудзи, але без будь-яких видимих дефектів в початку. З огляду на те, що раніше було показано, що мутації в шляху СА викликають дефекти в репродуктивних тканинах, було несподівано, що конститутивна супресія оксидази БА20 не викликала подібних репродуктивних фенотипів в початку. Таким чином, додатково
Зо пропонується, що супресія одного або більше генів оксидази ЗА20 могла бути здійснена із застосуванням конститутивного промотора для створення низькорослої, стійкої до вилягання кукурудзи або зернової рослини без будь-яких істотних або спостережуваних репродуктивних відхилень в рослині. Інші несподівані спостереження були зроблені, коли та ж сама конструкція супресії оксидази СА20 була експресована в стеблі, листках або репродуктивних тканинах. Як описано додатково нижче, спрямована супресія тих же генів оксидази СА20 в тканинах стебла або початку рослин кукурудзи не приводила до фенотипу невисокого, напівкарликового зросту.
Крім того, націлена експресія конструкції супресії оксидази СА20 безпосередньо в репродуктивних тканинах початку, що розвивається рослин кукурудзи за допомогою промотора жіночої репродуктивної тканини (початку) не викликала будь-яких значних або спостережуваних відхилень в початку. Проте, експресія тієї ж конструкції супресії оксидази БА20 в листових тканинах була достатньою для того, щоб викликати фенотип помірного невисокого зросту без істотних або спостережуваних репродуктивних відхилень в рослині.
Ї73| Не обмежуючись будь-якої теорією, пропонується, що низькорослі, напівкарликові фенотипи в кукурудзі та інших злакових рослинах можуть бути результатом достатнього рівня експресії конструкції, що супресує, націленої на певний ген(и) оксидази СА в тканині(ах), яка продукує активну ЗА рослини. Щонайменше, для спрямованої супресії певних генів оксидази
СА20 в кукурудзі, обмеження профілю експресії з метою уникнення репродуктивних тканин початку може бути необов'язковим для уникнення репродуктивних відхилень у не зовсім розвиненому початку. Проте, експресія конструкції супресії оксидази ЗА20 на низьких рівнях
БО та/"або в обмеженій кількості рослинних тканин може бути недостатньою для того, щоб викликати значну низькорослість, напівкарликовий фенотип. Беручи до уваги, що спостережуваний напівкарликовий фенотип зі спрямованою супресією оксидази СА20 є результатом вкорочення міжвузля стебла рослини, є несподіваним, що супресія генів оксидази
СА20 щонайменше в деяких тканинах стебла була недостатньою, щоб викликати скорочення міжвузля та зменшену висоту рослини. Не обмежуючись будь-якої теорією, передбачається, що супресія певного гена(ів) оксидази СА в тканині(ах) та/або клітині(ах) рослини, де виробляються активні СА, і не обов'язково в тканині(ах) стебла або міжвузля, може бути достатньою для отримання напівкарликових рослин, навіть незважаючи на те, що ознака низькорослості обумовлена вкороченням міжвузля стебла. З огляду на те, що СА можуть мігрувати через бо судинну систему рослини, передбачається, що маніпулювання генами оксидази СА в рослинній тканині(ах), де виробляються активні СА, може привести до низькорослої, напівкарликової рослини, навіть якщо це може бути в значній мірі досягнуто шляхом супресії рівня активних ОА, що продукуються не в тканинах стебла (тобто далеко від місця дії в стеблі, де знижене подовження міжвузля призводить до напівкарликового фенотипу). Справді, було виявлено, що супресія певних генів оксидази СА20 в листових тканинах викликає помірний напівкарликовий фенотип у рослин кукурудзи. З огляду на, що експресія конструкції супресії оксидази СА20 з декількома різними "стебловими" промоторами не давала напівкарликового фенотипу у кукурудзи, слід зазначити, що експресія тієї ж самої конструкції супресії оксидази СА20 за допомогою судинного промотора була ефективною при послідовному створенні напівкарликового фенотипу з високим ступенем прояву гена через події та зародкову плазму.
Цей напівкарликовий фенотип також спостерігався при експресії тієї ж конструкції супресії оксидази СА20 із застосуванням інших судинних промоторів.
І741 Відповідно до варіантів реалізації цього винаходу запропоновані модифіковані зернові або кукурудзяні рослини, які мають, щонайменше, одну корисну агрономічну ознаку і, щонайменше, один жіночий репродуктивний орган або початок, які практично або повністю не містять дефектів. Корисна агрономічна ознака може включати, наприклад, коротшу висоту рослини, коротшу довжину міжвузля в одному або більше міжвузлі(ях), більший (товстіший) діаметр стебла, підвищену стійкість до вилягання, підвищену стійкість до посухи, підвищену ефективність використання азоту, підвищену ефективність використання води, більш глибоке коріння, більшу площу листка, більш ранню зімкнутість пологу та/"або збільшену врожайність.
Дефекти можуть включати чоловічу (султан або пиляк) стерильність, зменшену кількість насіння та/або наявність однієї або більше маскулінізованих або чоловічих (або подібних чоловічим) репродуктивних структур в жіночому органі або початку (наприклад, в пиляку початка) рослини.
В цьому документі представлено модифікована зернова або кукурудзяна рослина, в якій відсутні значні дефекти в репродуктивних тканинах рослини. Така модифікована зернова або кукурудзяна рослина може мати жіночий репродуктивний орган або початок, які здаються нормальними в порівнянні з контрольною рослиною або рослиною дикого типу. Дійсно, пропонуються модифіковані зернові або кукурудзяні рослини, які містять, щонайменше, один репродуктивний орган або початок, який не має або не проявляє, або по суті або повністю позбавлений відхилень, включаючи чоловічу стерильність, знижене число зерен, та/або маскулінізовану структурули) в одному або більше жіночих органах або початках. В цьому документі жіночий орган або початок рослини, такої як кукурудза, є "по суті вільним" від чоловічих репродуктивних структур, якщо чоловічі репродуктивні структури відсутні або майже відсутні в жіночому органі або початку рослини на підставі візуального огляду жіночого органу або початку на більш пізніх репродуктивних стадіях. Жіночий орган або початок рослини, такої як кукурудза, є "повністю вільним" від зрілих чоловічих репродуктивних структур, якщо чоловічі репродуктивні структури відсутні або не спостерігаються, або не є такими, що спостерігаються в жіночому органі або початку рослини, такої як рослина кукурудзи, шляхом візуального огляду жіночого органу або початку на більш пізніх репродуктивних стадіях. Жіночий орган або початок рослини, такої як кукурудза, без істотних відхилень і по суті вільної від чоловічих репродуктивних структур в початку, може мати кількість зерен на жіночий орган або початок рослини, яка становить щонайменше 9095, щонайменше 9595, щонайменше 96 95, щонайменше 97 9565, щонайменше 98 95, щонайменше 99,5 95, щонайменше 99,6 95, щонайменше 99,7 956, щонайменше 99,8 95 або щонайменше 99,9 95 від кількості зерен на жіночий орган або початок дикого типу або контрольної рослини. Аналогічним чином, жіночий орган або початок рослини, такої як кукурудза, без істотних відхилень і по суті вільної від чоловічих репродуктивних структур в початку, може мати середню масу зерен на жіночий орган або початок рослини, яка становить щонайменше 90 956, щонайменше 95 95, щонайменше 96 95, щонайменше 97 9565, щонайменше 98 95, щонайменше 99,5 95, щонайменше 99,6 95, щонайменше 99,7 96, щонайменше 99,8 965 або щонайменше 99,9 95 від середньої маси зерен на жіночий орган або початок дикого типу або контрольної рослини. Жіночий орган або початок рослини, такої як кукурудза, який повністю вільний від зрілих чоловічих репродуктивних структур, може мати кількість зерен на жіночий орган або початок рослини, яка приблизно така ж, що й у дикого типу або контрольної рослини. Іншими словами, репродуктивний розвиток жіночого органу або початку рослини може бути нормальним або практично нормальним. Однак кількість зерен на жіночий орган або початок може залежати від інших факторів, які впливають на використання ресурсів та розвиток рослини. Дійсно, кількість зерен на жіночий орган або початок рослини та/або маса зерен на жіночий орган або початок рослини може бути приблизно такою ж або більшою, ніж у дикого типу або контрольної рослини. бо 75) Гормон рослин гіберелін грає важливу роль в ряді процесів розвитку рослин, включаючи проростання, елонгацію клітин, цвітіння, ембріогенез та розвиток насіння. Певні біосинтетичні ферменти (наприклад, оксидаза СА20 та оксидаза САЗ) й катаболічні ферменти (наприклад, оксидаза БА2) у шляху СА мають вирішальне значення для впливу на рівні активної СА в тканинах рослин. Таким чином, на додаток до супресії деяких генів оксидази ЗА20, додатково пропонується, що супресія гена оксидази СЗАЗ конститутивним, тканиноспецифічним або тканинобажаним чином може також продукувати рослини кукурудзи, що мають низькорослий фенотип та підвищену стійкість до вилягання, з можливою підвищеною врожайністю, але без дефектів в початку. Таким чином, відповідно до деяких варіантів реалізації винаходу надані конструкції та трансгени, що містять елемент або послідовність супресії оксидази сАЗ, функціонально пов'язані з конститутивним або тканиноспецифічним, або тканинобажаним промотором, таким як судинний або листовий промотор. Відповідно до деяких варіантів реалізації винаходу тканиноспецифічний або тканинобажаний промотор є судинним промотором, таким як опромотор ЕТВМ. Проте, інші типи тканиноспецифічних або тканинобажаних промоторів можуть потенційно застосовуватися для супресії оксидази САЗ в тканинах, які продукують активні (ЗА кукурудзи або зернових рослин для отримання напівкарликового фенотипу без значних дефектів.
Ї76Ї Будь-який відомий в цій галузі техніки спосіб супресії цільового гена можна застосовувати для супресії гена(ів) оксидази ЗА відповідно до варіантів реалізації цього винаходу, включаючи експресію антисмислових РНК, дволанцюгових РНК (длРНК) або інвертованих повторів послідовностей РНК, або за допомогою косупресії або РНК інтерференції (РНКІ) за допомогою експресії малих інтерферуючих РНК (міРНК), коротких шпилькових РНК (КШРНК), транс-активних міРНК (та-міРНК) або мікро РНК (мікроРНК). Крім того, з метою сайленсінга гена можуть застосовуватися смислові та/"або антисмислові молекули РНК, які націлені на кодуючі та/або некодуючі геномні послідовності або області в межах або поблизу гена оксидази СА. Відповідно, будь-який з цих способів може бути застосований для цільової супресії ендогенного гена(ів) оксидази ЗА2О або оксидази БАЗ тканиноспецифічним або тканинобажаним способом. Див., наприклад, публікації патентних заявок США Мо 2009/0070898, 2011/0296555 та 2011/0035839, зміст та опис яких включено в цей документ за допомогою посилання.
Зо І/7| В цьому документі термін "супресія" відноситься до зниження, зменшення або усунення рівня експресії мРНК та/або білка, кодованого цільовим геном в рослині, клітині рослини або тканині рослини на одній або більше стадії(ях) розвитку рослин, в порівнянні з рівнем експресії такої цільової мРНК та/або білка в контрольній рослині, клітині або тканині, або рослині, клітині або тканині дикого типу на тій же стадії(ях) розвитку рослини. Відповідно до деяких варіантів реалізації винаходу представлена модифікована або трансгенна рослина, що має рівень експресії гена оксидази (СА2О0, який знижується щонайменше в одній тканині рослини щонайменше на 595, щонайменше на 1095, щонайменше на 20956, щонайменше на 25 95 щонайменше на 30 95, щонайменше на 40 956, щонайменше на 50 95, щонайменше на 60 965, щонайменше на 70 95, щонайменше на 75 95, щонайменше на 80 95, щонайменше на 90 95 або 100 95 в порівнянні з контрольною рослиною. Відповідно до деяких варіантів реалізації винаходу представлена модифікована або трансгенна рослина, що має рівень експресії гена оксидази
САЗ, який знижується щонайменше в одній тканині рослини щонайменше на 5 956, щонайменше на 10 95, щонайменше на 20 95, щонайменше на 25 95 щонайменше на 30 95, щонайменше на 40 96, щонайменше на 50 95, щонайменше на 60 95, щонайменше на 70 95, щонайменше на 75595, щонайменше на 8095, щонайменше на 9095 або 10095 в порівнянні з контрольною рослиною. Відповідно до деяких варіантів реалізації винаходу представлена модифікована або трансгенна рослина, що має рівень експресії гена оксидази СА20, який знижується щонайменше в одній тканині рослини на 5 Фо - 20 95, 5 905 - 2590, 5 о - ЗО о, 5 о - 40 Фо, 5 90 -
Ув, 5 У - 6О Ов, 5 У - 70 90, 5 Ую - 75 905, 5 95 - 80 Фо, 5 90 - 90 У, 5 Чо - 100 Фо, 75 95 - 100 95, 50 9о 50 - 10095, 50 95 - 9096, 50 95 - 75595, 25905 - 75 90, ЗО бо - 80 95 або 10 95 - 75 95 в порівнянні з контрольною рослиною. Відповідно до деяких варіантів реалізації винаходу представлена модифікована або трансгенна рослина, що має рівень експресії гена оксидази САЗ, який знижується щонайменше в одній тканині рослини на 5 95 - 20 95, 5 ою - 25 9Ую, 5 Чо - ЗО Фо, 5 95 -
АО ув, 5 95 - 50 95, 5 90 - 60 95, 5 95 - 7095, 5 Чо - 75 в, 5 Чо - 80 У, 5 Чо - 90 У, 5 Зо - 100 Фо, 75 9 - 100 96, 50 95 - 100 96, 50 Зо - 90 95, 50 96 - 75 96, 2595 - 75905, ЗО Зо - 80 90 або 10 95 - 7595 в порівнянні з контрольною рослиною. Відповідно до цих варіантів реалізації винаходу щонайменше одна тканина модифікованої або трансгенної рослини, що має знижений рівень експресії гена(ів) оксидази ЗА20 та/або оксидази БАЗ, включає одну або більше рослинну тканину(и), яка продукує активну (СА, таку як судинну та/або листову тканину(и) рослини, бо протягом однієї або більше вегетативної стадії(стадій) розвитку.
ІЇ/8) У деяких варіантах реалізації винаходу супресія ендогенного гена оксидази СА20 або гена оксидази БАЗ є тканиноспецифічною (наприклад, тільки в листовій та/або судинній тканині). Супресія гена оксидази (ЗА2О може бути конститутивною та/або специфічною або кращою для судинної або листової тканини. В інших варіантах реалізації винаходу супресія гена оксидази СА20 або гена оксидази САЗ є конститутивною, а не тканиноспецифічною. Відповідно до деяких варіантів реалізації винаходу експресія ендогенного гена оксидази СА20 та/або гена оксидази ЗАЗ знижується в одному або більше типах тканин (наприклад, в листовій та/або судинній тканині(ах)) модифікованої або трансгенної рослини в порівнянні з такою ж тканиною(тканинами) контрольної рослини.
І79| Відповідно до варіантів реалізації цього винаходу представлена молекула, конструкція або вектор рекомбінантної ДНК, що включають елемент супресії, націлений на ген(и) оксидази
С;А2О0 або ооксидази ЗАЗ, який функціонально пов'язаний з конститутивним або тканиноспецифічним, або тканинобажаним промотором придатним для експресії в рослині.
Елемент супресії може містити послідовність ДНК, що транскрибується, довжиною щонайменше 19 нуклеотидів, наприклад, довжиною від близько 19 нуклеотидів до близько 27 нуклеотидів або 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 або 27 нуклеотидів довжиною, при цьому послідовність ДНК, що транскрибується, відповідає, щонайменше, частині цільового гена оксидази ЗА, що підлягає супресії, та/"або комплементарній їй послідовності ДНК. Елемент супресії може становити 19-30, 19-50, 19-100, 19-200, 19-300, 19-500, 19-1000, 19-1500, 19-2000, 19-3000, 19-4000 або 19-5000 нуклеотидів в довжину. Елемент пригнічення може мати довжину, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22 або щонайменше 23 нуклеотиду або більше (наприклад, щонайменше 25, щонайменше 30, щонайменше 50, щонайменше 100, щонайменше 200, щонайменше 300, щонайменше 500, щонайменше 1000, щонайменше 1500, щонайменше 2000, щонайменше 3000, щонайменше 4000 або щонайменше 5000 нуклеотидів в довжину).
Залежно від довжини та послідовності елемента супресії може допускатися одне або більше неспівпадінь послідовностей або некомплементарних основ без втрати супресії, наприклад, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 або більше неспівпадінь, якщо некодуюча молекула РНК, що кодується елементом супресії, все ще здатна в достатній мірі гібридизуватися та зв'язуватися з цільовою молекулою мРНК гена(ів) оксидази (ЗА2О або оксидази САЗ. Дійсно, навіть більш короткі елементи супресії РНКІі в діапазоні від близько 19 нуклеотидів до близько 27 нуклеотидів в довжину можуть мати одне або більше неспівпадінь або некомплементарних основ, але все ж бути ефективними в супресії цільового гена оксидази (СА. Відповідно, смислова або антисмислова послідовність елемента супресії може бути, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 96, щонайменше на 9895, щонайменше на 9995, щонайменше на 99,5 95 або на 100 95 ідентичною відповідній послідовності щонайменше сегмента або частини цільового гена оксидази СА або його комплементарній послідовності, відповідно.
ІВО| Елемент супресії або послідовність ДНК, що транскрибується, за цим винаходом для цільової супресії гена(ів) оксидази ЗА можуть включати одне або більше з наступного: (а) послідовність ДНК, яка включає, щонайменше, одну антисмислову послідовність ДНК, яка є антисмисловою або комплементарною, щонайменше, одному сегменту або частині цільового гена оксидази СА; (Б) послідовність ДНК, яка включає безліч копій щонайменше однієї антисмислової послідовності ДНК, яка є антисмисловою або комплементарною щонайменше одному сегменту або частині цільового гена оксидази СА; (с) послідовність ДНК, яка включає, щонайменше, одну смислову послідовність ДНК, яка включає, щонайменше, один сегмент або частину цільового гена оксидази СА; (4) послідовність ДНК, яка включає безліч копій щонайменше однієї смислової послідовності ДНК, кожна з яких містить щонайменше один сегмент або частину цільового гена оксидази СА; (є) послідовність ДНК, яка включає інвертований повтор сегмента або частини цільового гена оксидази СА та/або транскрибується в РНК для супресії цільового гена оксидази СА шляхом утворення дволанцюгової РНК, при цьому РНК, що транскрибується, включає щонайменше одну антисмислову послідовність ДНК, яка є антисмисловою або комплементарною щонайменше до одного сегмента або частини цільового гена оксидази СА і щонайменше до однієї смислової послідовності ДНК, яка містить щонайменше один сегмент або частину цільового гена оксидази БА; (Її) послідовність ДНК, яка транскрибується в РНК з метою супресії цільового гена оксидази СА шляхом утворення однієї дволанцюгової РНК та включає безліч послідовних послідовностей антисмислової ДНК, кожна з яких є антисмисловою або комплементарною щонайменше до одного сегменту або частини цільового гена оксидази СА, та безліч послідовних смислових послідовностей ДНК, кожна з яких містить щонайменше один сегмент або частину цільового гена оксидази А; (9) послідовність бо ДНК, яка транскрибується в РНК з метою супресії цільового гена оксидази БА шляхом утворення безлічі подвійних ланцюгів РНК та включає безліч послідовностей антисмислової
ДНК, кожна з яких є антисмисловою або комплементарною щонайменше одному сегменту або частині цільового гена СА, та безліч послідовностей смислової ДНК, кожна з яких містить, щонайменше, один сегмент або частину цільового гена оксидази СА, при цьому безліч антисмислових сегментів ДНК та безліч смислових сегментів ДНК розташовані у вигляді серії інвертованих повторів; (й) послідовність ДНК, яка включає нуклеотиди, отримані з мікроРНК, переважно рослинної мікроРНК; (ї) послідовність ДНК, яка включає попередник мікроРНК, який кодує штучну мікроРНК, комплементарну щонайменше одному сегменту або частині цільового гена оксидази ОА; (Ї) послідовність ДНК, яка включає нуклеотиди міРНК; (К) послідовність ДНК, яка транскрибується в РНК-аптамер, здатний зв'язуватися з лігандом; а також (І) послідовність
ДНК, яка транскрибується в РНК-аптамер, здатний зв'язувати з лігандом, та ДНК, яка транскрибується в регуляторну РНК, здатну регулювати експресію цільового гена оксидази сА, при цьому регуляція цільового гена оксидази СА залежить від конформації регуляторної РНК, а на конформацію регуляторної РНК алостерично впливає стан зв'язування РНК-аптамера лігандом. Будь-який з цих елементів супресії гена, що транскрибується в одноланцюгову або дволанцюгову РНК, може бути призначений для супресії більш ніж одного цільового гена оксидази СА, в залежності від кількості та послідовності елементак(ів) супресії.
ІВ1|Ї Множинні смислові та/або антисмислові елементи супресії для більш ніж однієї цілі оксидази ЗА можуть бути розташовані послідовно в тандемі або розташовані у вигляді тандемних сегментів або повторів, таких як тандемно-інвертовані повтори, які також можуть перериватися однією або більше спейсерною послідовністю(ями), а послідовність кожного елемента супресії може бути націлена на один або більше генів оксидази СА. Крім того, смислова або антисмислова послідовність елемента супресії може не повністю збігатися або бути не повністю комплементарною цільовій послідовності гена оксидази СА, в залежності від послідовності та довжини елемента супресії. Навіть більш короткі елементи супресії РНКІ від близько 19 нуклеотидів до близько 27 нуклеотидів в довжину можуть мати одне або більше неспівпадінь або некомплементарних основ, але все ж бути ефективними в супресії цільового гена оксидази СА. Відповідно, смислова або антисмислова послідовність елемента супресії може бути, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 9595, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 9565, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 965, щонайменше на 99,5 95 або на 100 95 ідентичною відповідній послідовності щонайменше сегмента або частини цільового гена оксидази ЗА або його комплементарній послідовності, відповідно. 821 Для супресії антисмислової послідовністю, послідовність ДНК, що транскрибується, або елемент супресії містить послідовність, яка є антисмисловою або комплементарною щонайменше частині або сегменту цільового гена оксидази СА. Елемент супресії може містити безліч антисмислових послідовностей, які є комплементарними одній або більше частинам або сегментам цільового гена(ів) оксидази СА, або безліч копій антисмислової послідовності, яка комплементарна цільовому гену оксидази ЗА. Антисмислова послідовність елемента супресії може бути, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 9595, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 9565, щонайменше на 98 95, щонайменше на 9995, щонайменше на 99,595 або на 10095 ідентичною послідовності ДНК, яка є комплементарною до, щонайменше, сегменту або частини цільового гена оксидази СА. Іншими словами, послідовність антисмислового елемента супресії може бути, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 956, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 965, щонайменше на 97 95, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або на 100 95 комплементарною цільовому гену оксидази сА.
ЇЗ3| Для супресії гена(ів) оксидази (А із застосуванням інвертованого повтору або транскрибованої ддРНК, послідовність ДНК, що транскрибується, або елемент супресії можуть містити смислову послідовність, яка містить сегмент або частину цільового гена оксидази СА, та антисмислову послідовність, яка є комплементарною сегменту або частині цільового гена оксидази ЗА, при цьому смислові та антисмислові послідовності ДНК розташовані в тандемі.
Смислові та/або антисмислові послідовності, відповідно, можуть бути менш ніж на 100 95 ідентичними або комплементарними сегменту, або частині цільового гена оксидази СА, як описано вище. Смислові та антисмислові послідовності можуть бути розділені спейсерною послідовністю, так що молекула РНК, що транскрибується з елемента супресії, утворює структуру "стебла", петлі або "петлі-на-стеблі" між смисловою та антисмисловою послідовностями. Замість цього елемент супресії може містити безліч смислових та антисмислових послідовностей, які розташовані в тандемі, який також може бути розділений 60 однією або більше спейсерними послідовностями. Такі елементи супресії, що містять безліч смислових та антисмислових послідовностей, можуть бути розташовані у вигляді послідовності смислових послідовностей, за якими слідує послідовність антисмислових послідовностей, або у вигляді послідовності тандемно розташованих смислових та антисмислових послідовностей. В альтернативному варіанті, одна або більше смислових послідовностей ДНК можуть бути експресовані окремо з однієї або більше антисмисловими послідовностями (тобто, одна або більше смислових послідовностей ДНК можуть бути експресована з першої послідовності ДНК, що транскрибується, та одна або більше антисмислових послідовностей ДНК можуть бути експресовані з другої послідовності ДНК, що транскрибується, при цьому перша та друга послідовності ДНК, що транскрибується, експресуються у вигляді окремих транскриптів).
ІЗ4| Для супресії гена(ів) оксидази СА із застосуванням мікроРНК послідовність ДНК, що транскрибується або елемент супресії можуть містити послідовність ДНК, отриману з послідовності мікроРНК, що є природною для вірусу або еукаріота, такого як тварина або рослина, або модифікованої або отриманої від такої природної послідовності мікроРНК. Такі природні або отримані природним чином послідовності мікроРНК можуть утворювати структуру "самогібридизації" та служити каркасом для попередника мікроРНК (пре-мікроРНК), і можуть відповідати стебловій області нативної послідовності попередника мікроРНК, такій як природна (або отримана природним чином) первинна-мікроРНК (перв-мікроР НК) або послідовність пре- мікроРНК. Однак, на додаток до цих природних або отриманих природним чином каркасів або передпроцесованим послідовностям мікроРНК, сконструйовані або синтетичні мікроРНК за цим варіантом реалізації винаходу додатково містять послідовність, що відповідає сегменту або частині цільового гена(ів) оксидази СА. Таким чином, на додаток до передпроцесованим або каркасним послідовностям мікроРНК, елемент супресії може додатково містити смислову та/або антисмислову послідовність, яка відповідає сегменту або частині цільового гена оксидази А, та/або послідовність, яка є комплементарною їй, не дивлячись на те, що може допускатися одна або більше неспівпадінь послідовності.
ІЗ5|Ї Сконструйовані мікроРНК корисні для супресії цільового гена з підвищеною специфічністю. Див., наприклад, Рагі7оно і співавт., Зепе5 Оем. 18: 2237-2242 (2004 рію), та публікації патентних заявок США Мо 2004/0053411, 2004/0268441, 2005/0144669 та 2005/0037988, зміст та опис яких включені в цей документ за допомогою посилання. мікроРНК є
Зо РНК, що не кодують білок. Коли молекула попередника мікроРНК розщеплюється, утворюється зріла мікроРНК, довжина якої зазвичай становить від близько 19 до близько 25 нуклеотидів (зазвичай у рослин довжина становить від близько 20 до близько 24 нуклеотидів), наприклад, 19, 20, 21, 22, 23, 24 або 25 нуклеотидів в довжину та має послідовність, що відповідає гену, націленому на супресію, та/або його комплементу. Зріла мікроРНК гібридизується з цільовими транскриптами мРНК та направляє зв'язування комплексу білків з цільовими транскриптами, які можуть функціонувати для інгібування трансляції та/або призводити до деградації транскрипта, таким чином, негативно регулюючи або супресуючи експресію цільового гена. Попередники мікроРНК також корисні в рослинах для направлення поетапного продукування міРнНК, транс- активних міРНК (та-міРНК), в процесі, який вимагає РНК-залежної РНК-полімерази з метою супресії цільового гена. Див., наприклад, Аїйеп та співавт., СеїІ 121:207-221 (2005 рік), Маиспегеї зЗсіепсе ЗТКЕ, 2005:ре43 (2005 рік) та Мозпікама і співавт., зепез Оем., 19:2164-2175 (2005 рію, зміст та опис яких включені в цей документ за допомогою посилання.
ІЗ6Ї мікроРНК рослин регулюють свої цільові гени шляхом розпізнавання та зв'язування з комплементарною або майже ідеально комплементарною послідовністю (сайтом впізнавання мікроРНК) в цільовому транскрипті мРНК з подальшим розщепленням транскрипта ферментами
РНКази І, такими як АКСОМАИШТЕТ1. У рослин певні помилкові спарювання між цим сайтом розпізнавання мікроРНК та відповідною зрілою мікроРНК, як правило, не допускаються, особливо помилкові спарювання нуклеотидів в положеннях 10 та 11 зрілої мікроРНК.
Положення в зрілій мікроРНК наведені в напрямку від 5'до 3'. Досконала комплементарність між цим сайтом розпізнавання мікроРНК та відповідною зрілою мікроРНК зазвичай є необхідною в положеннях 10 та 11 зрілої мікроРНК. Див., наприклад, Егапсо-2огтійа та співавт., (2007 рік)
Маїшге Сепеїїсв, 39:1033-1037; та Ахіеї!| і співавт., (2006 рік) СеїїЇ, 127:565-577.
І87| Багато генів мікроРНК (гени МІК) були ідентифіковані та оприлюднені в базі даних (СтікВазе", що доступна в мережі за адресою птісготпа.запдег.ас.ик/зедиепсе; також див.,
Сиінййвб-допез та співавт., (2003 рік) Мисівїс Асіа5 Нев., 31:439-441). Повідомлялося, що гени МІК зустрічаються в міжгенних областях, як окремо, так і в кластерах в геномі, але також можуть повністю або частково розташовуватися в інтронах інших генів (як кодуючих білок, так і не кодуючих білок). Для огляду біогенезу мікроРНК, див., Кіт (2005 рік) Майшге Кем. Мої. СеїІ. Віо!., 6:376-385. Транскрипція генів МІК може, щонайменше, в деяких випадках, перебувати під бо промоторних контролем власного промотора гена МІК. Первинний транскрипт, званий "перв-
мікроР НК", може бути досить великим (кілька тисяч пар основ) та може бути поліцистронним, містити одну або більше пре-мікроРНК (структури "самогібридизації", що містять розташування "петлі-на-стеблі"? що процесує до зрілої мікроРНК) а також звичайний 5 "кеп' та поліаденільований хвіст мРНК. Див., наприклад, Фіг. 1 в Кіт (2005 рік) Маїшге Кем. Мої. СеїІ.
Віо!., 6:376-385.
ІВ8) Трансгенна експресія мікроРНК (будь то така послідовність, що зустрічається в природі або штучна послідовність) може бути застосована для регуляції експресії цільового гена або генів мікроРНК. Сайти розпізнавання мікроРНК були підтверджені у всіх областях мРНК, включаючи 5'-сетрансльовану область, область що кодує, інтронну область та 3- нетрансльовану область, що вказує на те, що положення цілі мікроРНК або ділянка розпізнавання щодо кодуючої послідовності можуть не обов'язково впливати на супресію (див., наприклад, Чдопе5-АНоадез апа Вагіє! (2004)). Мої. СеїІ, 14:787-799, Апоадез та співавт., (2002)
СеїІ, 110: 513-520, Айеп та співавт., (2004) Маї. Сепеї., 36:1282-1290, З,ипКаг апа 7Ни (2004 рік)
Ріапі Сеїї, 16:2001-2019). мікроРНК є важливими регуляторними елементами у еукаріот, а трансгенна супресія за допомогою мікроРНК є корисним інструментом для маніпулювання біологічними шляхами та відповідями. Опис нативних мікроРНК, їх попередників, ділянок розпізнавання та промоторів приведено в публікації заявки на патент США Мо 2006/0200878, зміст та опис якої включено в цей документ за допомогою посилання.
ЇЇ Створення штучної послідовності мікроРНК може бути досягнуто шляхом заміни нуклеотидів в стебловий області попередника мікроРНК послідовністю, що комплементарна передбачуваній цілі, як продемонстровано, наприклад, 7епд та співавт., (2002 рік) Мої. Сеї, 9:1327-1333. Відповідно до багатьох варіантів реалізації винаходу, ціллю може бути послідовність гена оксидази БА20О або гена оксидази ЗАЗ. Один приклад, що не обмежує, загального способу визначення нуклеотидних змін в нативній послідовності мікроРНК для отримання сконструйованого попередника мікроРНК для цілі, що представляє інтерес включає наступні етапи: (а) вибір унікальної цільової послідовності з щонайменше 18 нуклеотидів, специфічних до цільового гену, наприклад, із застосуванням інструментів вирівнювання послідовності, таких як ВГА5Т (див., наприклад, Ай5спи! та співавт., (1990 рік) У. Мої. Віої., 215:403-410; АІбспиі та співавт., (1997 рік) Мисієвїс Асіа5 Кев5., 25:3389-3402); послідовності КДНК
Зо та/або геномної ДНК можуть застосовуватися для ідентифікації ортологів цільового транскрипта та будь-яких потенційних збігів зі сторонніми генами, що дозволяє уникнути ненавмисного сайленсінгу або супресії нецільових послідовностей; (Б) аналіз цільового гена на наявність небажаних послідовностей (наприклад, збігів з послідовностями з нецільових видів) та оцінка кожної потенційної цільової послідовності на вміст С, оцінку Рейнольдса (див. Кеупоїд5 а співавт., (2004 рік) Маїшйге Віоїесппої., 22: 326-330), та функціональну асиметрію, що характеризується негативною різницею у вільній енергії (ДдОо") (див., Кпмогома та співавт., (2003 рік) СеїІ, 115:209-216). Переважно, можуть бути обрані цільові послідовності (наприклад, 19-мери), які мають усі або більшість із зазначених нижче характеристик: (1) оцінка Рейнольдса » 4, (2) вміст С від близько 40 95 до близько 60 95, (3) негативну ДЛО, (4) кінцевий аденозин, (5) відсутність 4 чи більше одних і тих же нуклеотидів, що йдуть підряд; (б) місце розташування близько 3'-кінця цільового гена; (7) мінімальні відмінності від транскрипта попередника мікроРНК. В одному аспекті некодуюча молекула РНК, що застосовується в цьому документі для супресії цільового гена (наприклад, гена оксидази ЗА20 або САЗ), призначена для того, щоб мати цільову послідовність, що демонструє одну або більше, дві або більше, три або більше, чотири або більше, або п'ять або більше з вищевказаних характеристик. Положення на кожному третьому нуклеотиді елемента супресії можуть впливати на ефективність РНКІ; наприклад, алгоритм "вієхріогег" загальнодоступний за адресою гпа-спет.и- їоКкуо.ас.|р/зіехріогег.піт (див., Кай апа ЗилиКкі (2007 рік) Мисівіс Асій5 Кев., 10.1093/паг/дкі1120); (с) Визначення зворотного комплементу обраної цільової послідовності (наприклад, 19-мер) для застосування при отриманні модифікованої зрілої міРНК. Щодо послідовності 19-мера, додатковий нуклеотид в положенні 20 може збігатися з обраною ціллю або послідовністю розпізнавання, а нуклеотид в положенні 21 може бути або неспареним, щоб запобіти поширенню сайленсінгу на цільовому транскрипті або спареним з цільовою послідовністю, щоб сприяти поширенню сайленсінгу на цільовому транскрипті; та (а)
Трансформація штучної мікроРНК в рослину.
І2ОЇ Відповідно до варіантів реалізації цього винаходу запропонована молекула, конструкція або вектор рекомбінантної ДНК, що включають послідовність ДНК, що транскрибується, або елемент супресії що кодує молекулу мікроРНК або попередника мікроРНК, для цільової супресії гена(ів) оксидази СА. Така послідовність ДНК, що транскрибується, та елемент супресії 60 можуть містити послідовність довжиною щонайменше 19 нуклеотидів, яка відповідає одному або більше гену(ам) оксидази СА, та/або послідовність, комплементарну одному або більше гену(ам) оксидази (ЗА, хоча можуть допускатися один або більше невідповідностей послідовності або неспарених нуклеотидів.
І91| Ген(и) оксидази СА також може бути супресований із застосуванням однієї або більше малих інтерферуючих РНК (міРНК). Шлях міРНК включає непослідовне розщеплення довшого дволанцюгового інтермедіату РНК ("РНК-дуплекса") на малі інтерферуючі РНК (міРНК). Розмір або довжина міРНК варіюється від близько 19 до близько 25 нуклеотидів або пар основ, але загальні класи міРНК включають ті, які містять 21 або 24 пари основ. Таким чином, послідовність ДНК, що транскрибується, або елемент супресії можуть кодувати молекулу РНК довжиною, щонайменше, від близько 19 до близько 25 нуклеотидів (або більше), наприклад, щонайменше, 19, 20, 21, 22, 23, 24 або 25 нуклеотидів в довжину. Таким чином, для супресії міРНК забезпечується рекомбінантна молекула, конструкція або вектор ДНК, що включають послідовність ДНК, що транскрибується, і елемент супресії, що кодує молекулу міРНК для цільової супресії гена(ів) оксидази СА. Така послідовність ДНК, що транскрибується, та елемент супресії можуть мати довжину щонайменше 19 нуклеотидів і мати послідовність, що відповідає одному або більше гену(ам) оксидази СА, та/або послідовність, комплементарну одному або більше гену(ам) оксидази саА.
І92) Ген(и) оксидази СА також може бути супресований із застосуванням однієї або більше транс-активних малих інтерферуючих РНК (та-міРНК). В шляху та-міРНК, мікроРНК слугують для направлення поетапного процесингу первинних транскриптів міРНК в процесі, який вимагає
РНК-залежної РНК-полімерази для отримання дволанцюгового попередника РНК. та-міРНК визначаються відсутністю вторинної структури, цільового сайту мікроРНК, який ініціює продукцію дволанцюгової РНК, потребою в ОСІ 4 та РНК-залежній РНК-полімерази (КОР), а також продукуванням безлічі ідеально послідовних малих РНК, довжиною -- 21 нуклеотид, з ідеально підібраними дуплексами з 2-нуклеотидними 3'-"липкими" кінцями (див., АйПеп та співавт., (2005 рік) СеїІ, 121:207-221). Розмір або довжина та-міРНК варіюється від близько 20 до близько 22 нуклеотидів або пар основ, але зазвичай це 21 пара основ. Таким чином, послідовність ДНК, що транскрибується, або елемент супресії за цим винаходом можуть кодувати молекулу РНК довжиною, щонайменше, від близько 20 до близько 22 нуклеотидів, наприклад, довжиною 20, 21 або 22 нуклеотиди. Таким чином, для супресії та-міРНК забезпечується рекомбінантна молекула, конструкція або вектор ДНК, що включають послідовність ДНК, що транскрибується, або елемент супресії, що кодує молекулу та-міРНК для цільової супресії гена(ів) оксидази СА. Така послідовність ДНК, що транскрибується, та елемент супресії можуть мати довжину щонайменше 20 нуклеотидів і мати послідовність, що відповідає одному або більше гену(ам) оксидази СА, та/або послідовність, комплементарну одному або більше гену(ам) оксидази СА. Щодо способів конструювання відповідних каркасів та-міРНК, див., наприклад, патент США Мо 9,309,512, який включений в цей опис за допомогою посилання у всій своїй повноті.
І923| Відповідно до варіантів реалізації цього винаходу пропонується рекомбінантна молекула, вектор або конструкція ДНК, що включають послідовність ДНК, транскрибується, кодуючу некодуючу молекулу РНК, яка зв'язується або гібридизується з цільової мРНК в клітині рослини, при цьому молекула цільової мРНК кодує ген оксидази СА20 або САЗ, та при цьому послідовність ДНК, що транскрибується, функціонально пов'язана з конститутивним або тканиноспецифічним, або тканинобажаним промотором. На додаток до націлювання на зрілу послідовність МРНК, некодуюча молекула РНК може замість цього націлюватися на інтронну послідовність гена оксидази СА або транскрипту мРНК, або на послідовність МРНК оксидази
СА, що перекриває кодуючу та некодуючу послідовності. Відповідно до інших варіантів реалізації винаходу пропонується рекомбінантна молекула, вектор або конструкція ДНК, що включають послідовність ДНК, що транскрибується, яка кодує некодуючу молекулу РНК (попередник), яка розщеплюється або процесується в зрілу некодуючу молекулу РНК, яка зв'язується або гібридизується з цільової мРНК в клітині рослини, при цьому молекула цільової
МРНАК кодує білок оксидази (СА20О або сСАЗ, та при цьому послідовність ДНК, що транскрибується, функціонально пов'язана з конститутивним або тканиноспецифічним, або тканинобажаним промотором. Для цілей цього винаходу "некодуюча молекула РНК" є молекулою РНК, яка не кодує білок. Приклади, що не обмежують, некодуючої молекули РНК включають мікро РНК (мікроРНК), попередника мікроРНК, малу інтерферуючу РНК (міРНК), попередника міРНК, малу РНК (довжиною 18-26 нуклеотидів) та попередника, що кодують те ж саме, гетерохроматичну міРНК (гх-міР НК), що взаємодіє з Рім/ії РНК (ріРНК), дволанцюгову РНК, що утворює шпильки (дцРНК, що утворює шпильки), транс-активну міРНК (та-міРНК), бо антисмислову міРНК, що зустрічається в природі, (паї-міРНК - паїшгайу оссигтіпуд апіізепвзе
5ікМА) СКІЗРК РНК (сгРНК), трейсер (Ігасег-транс-актгивуючу СКІЗРК) РНК (ГасгтРНК), направляючу РНК (нНРНК) і одиночну направляючу РНК (онРНК - зіпдієе-дпіде АМА).
І94| Відповідно до варіантів реалізації цього винаходу відповідні тканиноспецифічні або тканинобажані промотори для експресії елемента супресії оксидази 5А20 або БАЗ можуть включати ті промотори, які керують або викликають експресію пов'язаного з ним елемента або послідовності супресії, щонайменше, в судинній та/або листовій тканині кукурудзи або зернових рослин, або, можливо, в іншій тканини в разі оксидази САЗ. Експресія елемента або конструкції супресії оксидази ЗА, за допомогою тканиноспецифічного або тканинобажаного промотора також може відбуватися в інших тканинах зернових або кукурудзяних рослин за межами судинних і листових тканин, але рівні активної (ЗА в тканинах, що розвиваються, репродуктивних тканинах рослини (особливо в жіночому репродуктивному органі або початку) переважно не піддаються значному зменшенню або впливу (в порівнянні з диким типом або контрольними рослинами), так що розвиток жіночого органу або початку може відбуватися нормально в трансгенній рослині без будь-яких відхилень у початку та втрати потенційної врожайності.
І95| Будь-які судинні промотори, відомі в цій галузі технікию, можуть потенційно застосовуватися в якості тканиноспецифічного або тканинобажаного промотора. Приклади судинних промоторів включають промотор КТВМ (див., наприклад, 5ЕО ІЮ МО: 65), відомий промотор гена сахарозосинтази, такий як промотор кукурудзяної сахарозосинтази-1 (5и51 або
ЗП1) (див., наприклад, 5ЕО ІЮ МО: 67), промотор паралога гена кукурудзи 51, промотор сахарозосинтази (551) ячменю, промотор рисової сахарозосинтази-1 (К551) (див., наприклад,
ЗЕО ІО МО: 68) або промотор рисової сахарозосинтази-2 (2552) (див., наприклад, 5ЕО ІЮ МО: 69), відомий промотор гена транспортера сахарози, такий як промотор транспортера рисової сахарози (5!ИТ1) (див., наприклад, ЗЕО ІЮО МО: 70), або різні відомі вірусні промотори, такі як промотор плямистого вірусу жовтої коммеліни (СОУММ-Соттвеїїпа уеПйом/ тоне міги5), промотор великого міжгенного регіону (ГІВ-Іагде іпсгегдепіс гедіоп) гемінівіруса карликової пшениці (М/ОМ- м/пеаї амжагї детіпімігиє), промотор білка оболонки (СР - соаї ргоїеїп) гемінівіруса смуги кукурудзи (М5М-таїіе 5ітєаК детіпіміги5) або жовта смуга 1 (у51-уеПом/ зійре 1) - подібний промотор рису або О5У512 (5ЕО ІО МО: 71), та будь-яку ділянку функціональної послідовності
Зо або усічення будь-якого з вищевказаних промоторів з подібним профілем експресії, такий як усічений промотор ЕТВМ (див., наприклад, ЗЕО ІЮ МО: 66).
І6Ї Будь-які листові промотори, відомі в цій галузі техніки, можуть потенційно застосовуватися в якості тканиноспецифічного або тканинобажаного промотора. Приклади листових промоторів включають промотор піруватфосфатдикінази кукурудзи або промотор
РРОК (ругимаїге рпозрпаге аїКіпазе) (див., наприклад, 5Е0О ІЮ МО: 72), промотор фруктозо-1,6- бісфосфат альдолази кукурудзи або ЕДА (див., наприклад, ЗЕО ІЮО МО: 73) та рисовий промотор
Мадн-содаї (див., наприклад, ЗЕО ІЮО МО: 74) і будь-яку частину функціональної послідовності або усічення будь-якого з вищевказаних промоторів з подібним профілем експресії. Інші приклади листових промоторів генів однодольних рослин включають промотор рибулозофосфаткарбоксилази (Рубіско) або малої субодиниці Рубіско (ЕВС5-ВиВізСО зтаїїЇ зирипі), промотор гена, який зв'язує хлорофіл а/ь білка, промотор фосфоенолпіруваткарбоксилази (ФЕП-карбоксилази) та промотор гена Муб, і будь-яку частину функціональної послідовності або усічення будь-якого з цих промоторів з подібним профілем експресії.
І97| Будь-які інші судинні та/або листові промотори, відомі в цій галузі техніки, також можуть бути застосовані, включаючи промоторні послідовності з родинних генів (наприклад, послідовності промоторів сахарозосинтази, транспортера сахарози та вірусних генів) одного й того ж або різних видів рослин або вірусів, які мають подібний профіль експресії. Крім того, представлені промоторні послідовності з високим ступенем гомології до будь-якого з перерахованого вище. Наприклад, судинний промотор може містити послідовність ДНК, яка є, щонайменше, на 70 956, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 956, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 96, щонайменше на 98 965, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або 100 95 ідентичною одній або більше з ЗЕО ІЮ
МО: 65, 66, 67, 68, 69, 70 та 71, будь-якій частині функціональної послідовності або її усіканню, та/або будь-яку послідовність, комплементарну будь-якій з вищевказаних послідовностей; листовий промотор може містити, наприклад, послідовність ДНК, яка є, щонайменше, на 70 95, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 956, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, по щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 956, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 965, щонайменше на 99,5 95 або 100 95 ідентичною одній або більше з ЗЕО ІО МО: 72, 73 і 74, будь- 60 якій частині функціональної послідовності або її вкороченню, та/або будь-якій послідовності,
комплементарній будь-якій з вищевказаних послідовностей; та конститутивний промотор може містити послідовність ДНК, яка є, щонайменше, на 70 95, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85956, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 96, щонайменше на 98595, щонайменше на 9995, щонайменше на 99,595 або 100 95 ідентичною одній або більше з з ЗЕО ІЮ МО: 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82 та 83, будь-якій частині функціональної послідовності або усічення, та/або будь-якій послідовності, комплементарній будь-якій з вищевказаних послідовностей. Приклади судинних та/або листових промоторів можуть додатково включати інші відомі, сконструйовані та/або ідентифіковані згодом промоторні послідовності, які, як показано, мають профіль експресії в судинній та/або листовій тканині(ах) зернової або кукурудзяної рослини. Крім того, будь-який відомий або ідентифікований згодом конститутивний промотор також може бути застосований для експресії елемента супресії оксидази ЗА2О або САЗ. Загальні приклади конститутивних промоторів наведені нижче.
І98|Ї Як відомо в цій галузі техніки, термін "промотор" може, як правило, стосуватися послідовності ДНК, яка містить сайт зв'язування РНК-полімерази, сайт ініціації транскрипції та/або ТАТА-бокс та сприяє або стимулює транскрипцію й експресію асоційованої полінуклеотидної послідовності, що транскрибується, та/або гена (або трансгена). Промотор може бути синтетичним або штучним та/або сконструйованим, зміненим або отриманим з відомої або такої, що зустрічається в природі послідовності промотора. Промотор може бути химерним промотором, що містить комбінацію двох або більше гетерологічних послідовностей.
Таким чином, промотор за цим винаходом може включати варіанти послідовностей промотору, які подібні за складом, але не ідентичні іншим промоторним послідовностям, відомим або представленим в цьому документі. Промотор може бути класифікований відповідно до багатьох критеріїв, що стосуються характеру профілю експресії, асоційованої кодуючої послідовності або послідовності, що транскрибується, або гена (включаючи трансген), функціонально пов'язаних з промотором, таким як конститутивний, специфічний до стадії розвитку, тканиноспецифічний, індуцибельний тощо. Промотори, які керують експресією у всіх або майже у всіх тканинах рослини, називають "конститутивними" промоторами. Однак рівень експресії з "конститутивним промотором" не обов'язково є однаковим для різних типів тканин та клітин. Промотори, які
Зо керують експресією в певні періоди або стадії розвитку, називаються "промоторами, специфічними до стадії розвитку". Промотори, які керують посиленою експресією в певних тканинах рослини в порівнянні з іншими рослинними тканинами, називають промоторами, "посиленими в певній тканині" або "тканинобажаними промоторами". Таким чином, "тканинобажаний" промотор викликає відносно вищу чи домінуючу, або переважаючу експресію в конкретній тканині(ах) рослини, але з нижчими рівнями експресії в іншій тканині(ах) рослини.
Промотори, які експресуються в певній тканині(ах) рослини, практично не експресуючись в інших тканинах рослини, називають ""-каниноспецифічними" промоторами. Тканиноспецифічний або тканинобажаний промотор також може бути визначений відносно специфічної або бажаної тканини(тканин), у якій він керує експресією асоційованої послідовності ДНК, що транскрибується або елемента супресії. Наприклад, промотор, який викликає специфічну експресію в судинних тканинах, може згадуватися як "судинно-специфічний промотор", тоді як промотор, який викликає переважну або домінуючу експресію в судинних тканинах, може згадуватися як "судинно-бажаний промотор". Аналогічно, промотор, який викликає специфічну експресію в тканинах листя, може згадуватися як "промотор, специфічний до листової тканини", тоді як промотор, який викликає переважну або домінуючу експресію в тканинах листя, може згадуватися як "промотор, бажаний до листової тканини". "Індуцибельний" промотор є промотором, який ініціює транскрипцію у відповідь на стимул навколишнього середовища, такий як холод, посуха чи світло, або інші стимули, такі як поранення або хімічний вплив. Промотор також може бути класифікований за своїм походженням, наприклад, гетерологічний, гомологічний, химерний, синтетичний тощо. "Гетерологічний" промотор є промоторною послідовністю, що має інше походження в порівнянні з асоційованої з ним послідовністю, що транскрибується, що кодує послідовність або ген(або трансгени), та/або не зустрічається в природі у видів рослин, що підлягають трансформації, як визначено вище.
І29| Деякі з оксидаз ЗА в зернових рослинах складаються з сімейства родинних генів оксидази СА. Наприклад, кукурудза має сімейство з щонайменше дев'яти генів оксидази СА20, які включають оксидазу 1 СА20, оксидазу 2 СА20, оксидазу З (СА20, оксидазу 4 СА20, оксидазу 5 ЗА20, оксидазу 6 ЗА20, оксидазу 7 СА20, оксидазу 8 СА20 та оксидазу 9 СА20.
Однак в кукурудзі є тільки дві оксидази САЗ: оксидаза 1 БАЗ та оксидаза 2 БАЗ. Послідовності
ЗЕО ІЮ МО ДНК та білка для кожного з цих генів оксидази ЗА20 представлені в Таблиці 1, а 60 послідовності ЗЕО ІЮ МО ДНК та білка для кожного з цих генів оксидази ЗАЗ представлені в
Таблиці 2.
Таблиця 1
Послідовності ДНК та білка за ідентифікатором послідовності для генів оксидази СА20 в кукурудзі
Таблиця 2
Послідовності ДНК та білка за ідентифікатором послідовності для генів оксидази САЗ в кукурудзі
П00| Послідовність геномної ДНК оксидази З СЗА20 представлена в 5ЕО ІЮ МО: 34, а послідовність геномної ДНК оксидази 5 (ЗА2О представлена в 5ЕБЕО ІЮ МО: 35. Для гена оксидази З ЗА20, 5ЕО ІЮ МО: 34 надає 3000 нуклеотидів вище від 5'-НТО оксидази З СА20; нуклеотиди 3001-3096 відповідають 5-НТО; нуклеотиди 3097-3665 відповідають першому екзону; нуклеотиди 3666-3775 відповідають першому інтрону; нуклеотиди 3776-4097 відповідають другому екзону; нуклеотиди 4098-5314 відповідають другому інтрону; нуклеотиди 5315-5584 відповідають третьому екзону; та нуклеотиди 5585-5800 відповідають 3-НТО. 5ЕО ІЮ
МО: 34 також забезпечує 3000 нуклеотидів нижче від кінця 3'-НТО (нуклеотиди 5801-8800). Для гена оксидази 5 ЗА20, ЗЕО ІЮ МО: 35 забезпечує 3000 нуклеотидів вище від стартового кодону оксидази 5 СЗА20 (нуклеотиди 1-3000); нуклеотиди 3001-3791 відповідають першому екзону; нуклеотиди 3792-3906 відповідають першому інтрону; нуклеотиди 3907-4475 відповідають другому екзону; нуклеотиди 4476-5197 відповідають другому інтрону; нуклеотиди 5198-5473 відповідають третьому екзону; та нуклеотиди 5474-5859 відповідають 3-НТО. 5ЕБО ІЮ МО: 35 також забезпечує 3000 нуклеотидів нижче від кінця 3-НТО (нуклеотиди 5860-8859). 101) Послідовність геномної ДНК оксидази 1 ЗАЗ представлена в 5ЕБО ІО МО: 36, а послідовність геномної ДНК оксидази 2 СЗАЗ представлена в 5БО ІЮ МО: 37. Для гена оксидази 1 ЗАЗ, нуклеотиди 1-29 з 5ЕО ІЮ МО: 36 відповідають 5'-НТО; нуклеотиди 30-514 з
ЗЕО ІО МО: 36 відповідають першому екзону; нуклеотиди 515-879 з 5ЕО ІЮ МО: 36 відповідають першому інтрону; нуклеотиди 880-1038 з 5БО ІЮ МО: 36 відповідають другому екзону; нуклеотиди 1039-1158 з 5ЕО ІО МО: 36 відповідають другому інтрону; нуклеотиди 1159-1663 з
ЗЕБЕО ІЮ МО: 36 відповідають третьому екзону; та нуклеотиди 1664-1788 з 5ЕБО ІЮ МО: 36 відповідають 3'-НТО. Для гена оксидази 2 БАЗ, нуклеотиди 1-38 з БЕО ІЮО МО: 37 відповідають 5-НТО; нуклеотиди 39-532 з 5ЕО ІО МО: 37 відповідають першому екзону; нуклеотиди 533-692 з
ЗБЕО ІЮ МО: 37 відповідають першому інтрону; нуклеотиди 693-851 з 5БО ІЮ МО: 37 відповідають другому екзону; нуклеотиди 852-982 з 5ЕБЕО ІЮ МО: 37 відповідають другому
Зо інтрону; нуклеотиди 983-1445 з 5ЕО ІО МО: 37 відповідають третьому екзону; та нуклеотиди 1446-1698 з БЕО ІО МО: 37 відповідають 3'-НТО. 1021 На додаток до фенотипічних спостережень з націлюванням на ген(и) оксидази З ЗА20 та/або оксидази 5 СА20, або ген(и) оксидази 1 БАЗ та/або оксидази 2 САЗ, з метою супресії, також спостерігається напівкарликовий фенотип з супресією гена оксидази 4 сА20.
Послідовність геномної ДНК оксидази 4 ЗА20 представлена в 5ЕО І МО: 38. Для гена оксидази 4 СА, 5ЕО ІО МО: 38 надає нуклеотиди 1-1416 вище від 5-НТО; нуклеотиди 1417-
1543 з БЕО ІЮ МО: 38 відповідають 5'-НТО; нуклеотиди 1544-1995 з 5ЕО ІО МО: 38 відповідають першому екзону; нуклеотиди 1996-2083 з 5БЕО ІО МО: 38 відповідають першому інтрону; нуклеотиди 2084-2411 з 5БЕО ІО МО: 38 відповідають другому екзону; нуклеотиди 2412-2516 з
ЗБЕО ІЮ МО: 38 відповідають другому інтрону; нуклеотиди 2517-2852 з 5БО ІЮО МО: 38 відповідають третьому екзону; нуклеотиди 2853-3066 з 5ЕО ІЮО МО: 38 відповідають 3-НТО; та нуклеотиди 3067-4465 з БЕО ІЮ МО: 38 відповідають геномній послідовності нижче від 3'-НТО. 1103) Відповідно до варіантів реалізації цього винаходу запропонована молекула, вектор або конструкція рекомбінантної ДНК, що містять послідовність ДНК, що транскрибується, яка кодує некодуючу молекулу РНК, при цьому некодуюча молекула РНК містить послідовність, яка є, щонайменше, на 80 96, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 965, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 956, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 965, щонайменше на 99,595 або 10095 комплементарною, щонайменше, сегменту або частині молекули мРНК (ї) що експресуються з ендогенного гена оксидази СА та/або (ії) що кодують ендогенний білок оксидази СА в рослині, при цьому послідовність ДНК, що транскрибується, функціонально пов'язана з промотором придатним для експресії в рослині, і при цьому рослина є зерновою або кукурудзяною рослиною. 1104) Відповідно до деяких варіантів реалізації винаходу, некодуюча молекула РНК націлена на ген(и) оксидази СА20, такий як ген(и) оксидази З СА20 та/або оксидази 5 СА20, з метою супресії, та містить послідовність, яка є, щонайменше, на 8095, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 965, щонайменше на 9895, щонайменше на 9995, щонайменше на 99,595 або 10095 комплементарною, щонайменше, 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам з однієї або більше з 5ЗЕО ІЮО МО: 7, 8, 13 та 14. Відповідно до деяких варіантів реалізації винаходу, некодуюча молекула РНК є, щонайменше, на 80 95, щонайменше на 85 965, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 965, щонайменше на 9895, щонайменше на 99595, щонайменше на 99,595 або 10095 комплементарною, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам молекули мРНК, що кодує ендогенний білок оксидази ЗА20 в рослині, який є, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 965, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 956, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 965, щонайменше на 99,5 95 або 100 95 ідентичним одній або більше з 5ЕО ІЮ МО: 9 та 15.
Відповідно до додаткових варіантів реалізації винаходу, некодуюча молекула РНК може містити послідовність, яка є, щонайменше на 8095, щонайменше на 8595, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 96, щонайменше на 98 965, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або 100 95 комплементарною, щонайменше, 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам молекули мРНК, що кодує ендогенний білок оксидази (ЗА20 в рослині, який є, щонайменше, на 80 95, щонайменше на 85956, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 965, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або 100 95 подібним одній або більше з 5ЕО ІО МО: 9 та 15. На додаток до націлювання на зрілу послідовність МРНК (включаючи одну або обидві з нетрансльованих або екзонних послідовностей), некодуюча молекула РНК може додатково націлюватися на інтронні послідовності гена або транскрипта оксидази СА20.
МО5| Відповідно до деяких варіантів реалізації винаходу, некодуюча молекула РНК націлена, з метою супресії, на ген(и) оксидази САЗ, та містить послідовність, яка є, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 965, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 956, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 965, щонайменше на 99,595 або 10095 комплементарною, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам з однієї або більше з 5ЕО ІЮО МО: 28, 29, 31 та 32.
Відповідно до інших варіантів реалізації винаходу, некодуюча молекула РНК є, щонайменше на 80 96, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 60 96 96, щонайменше на 97 956, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 95, щонайменше на
99,5 95 або 10095 комплементарною, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам молекули мРНК, що кодує ендогенний білок оксидази САЗ в рослині, який є, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 9565, щонайменше на 90 95, щонайменше на 9595, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 9565, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 965, щонайменше на 99,5 95 або 100 95 ідентичним одному або обом з 5ЕО ІО МО: 30 та 33.
Відповідно до додаткових варіантів реалізації винаходу, некодуюча молекула РНК може містити послідовність, яка є, щонайменше на 8095, щонайменше на 8595, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 96, щонайменше на 98 965, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або 100 95 комплементарною, щонайменше, 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам молекули мРНК, що кодує ендогенний білок оксидази САЗ в рослині, який є, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 965, щонайменше на 98 95, щонайменше на 9995, щонайменше на 99,5 95 або 100 95 подібним одному або обом з 5ЕО ІЮ МО: 30 та 33. На додаток до націлювання на зрілу послідовність
МРНК (включаючи одну або обидві з нетрансльованих або екзонних послідовностей), некодуюча молекула РНК може додатково націлюватися на інтронні послідовності гена або транскрипта оксидази сАЗ. 106) Відповідно до деяких варіантів реалізації винаходу, некодуюча молекула РНК націлена, з метою супресії, на ген оксидази 4 (А20, та містить послідовність, яка є, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 965, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 956, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 965, щонайменше на 99,5 95 або 10095 комплементарною, щонайменше, 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам з однієї або обох з 5БЕО ІЮ МО: 10 та 11. Відповідно
Зо до інших варіантів реалізації винаходу, некодуюча молекула РНК є, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 956, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 965, щонайменше на 97 95, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або 100 95 комплементарною, щонайменше, 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам молекули мРНК, що кодує ендогенний білок оксидази ЗА20 в рослині, який є, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 965, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 956, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 965, щонайменше на 99,595 або 10095 ідентичним ЗЕО ІЮ МО: 12. Відповідно до додаткових варіантів реалізації винаходу, некодуюча молекула РНК може містити послідовність, яка є, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 965, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 956, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 965, щонайменше на 99,5 95 або 10095 комплементарною, щонайменше, 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам молекули мРНК, що кодує ендогенний білок оксидази СА20 в рослині, який є, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 96, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 965, щонайменше на 98 965, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або 100 95 подібним ЗЕО ІЮ МО: 12. На додаток до націлювання на зрілу послідовність мРНК (включаючи одну або обидві з нетрансльованих або екзонних послідовностей), некодуюча молекула РНК може додатково націлюватися на інтронні послідовності гена або транскрипта оксидази СА20. 11071) Відповідно до багатьох варіантів реалізації винаходу, некодуюча молекула РНК, яка кодується послідовністю ДНК, що транскрибується, молекули, вектора або конструкції рекомбінантної ДНК, може бути попередником мікроРНК або міРНК, який процесує або розщеплюється в рослинній клітині з утворенням зрілої мікроРНК або міРНК, яка націлюється на ген оксидази СА20 або оксидази сАЗ. 108) Відповідно до варіантів реалізації цього винаходу рівні ЗА можуть бути знижені в стеблі зернової або кукурудзяної рослини шляхом націлювання лише на обмежену підгрупу бо генів в сімействі оксидази (ЗА з метою супресії Не обмежуючись будь-якої теорією,
пропонується, що націлювання на обмежене число генів у сімействі оксидаз ЗА з метою супресії може привести до низькорослого фенотипу і стійкості до вилягання в трансгенних рослинах, але без відхилень в репродуктивних або початкових тканинах рослини через диференціальну експресію серед генів оксидаз СА, достатньої компенсації для супресії гена(ів) оксидази СА іншим геном(ами) оксидази СА в цих репродуктивних тканинах та/або неповної супресії цільового гена(ів) оксидази СА. Таким чином, шляхом обмеження експресії або супресії гена(ів) оксидази ЗА за допомогою тканиноспецифічного або тканинобажаного промотора можна уникнути не тільки відхилень, пропонується, що обмежена підмножина генів оксидази СА (наприклад, обмежена кількість генів оксидази ЗА20) може бути направлена на супресію, так що інші гени оксидаз СА в межах того ж сімейства генів (наприклад, інші гени оксидази СА20) можуть компенсувати втрату експресії гена(ів) супресованої оксидази СА в цих тканинах.
Неповна супресія цільового гена(ів) оксидази СА також може забезпечити достатній рівень експресії цільового гена(ів) оксидази СА в одній або більше тканинах, щоб уникнути відхилень або небажаних ознак в рослині, які можуть негативно вплинути на врожайність, таких як репродуктивні відхилення або надмірне скорочення висоти рослин. На відміну від мутацій повної втрати функції в гені, супресія може зберегти часткову активність цільового гена.
Оскільки різні гени оксидази СА20 мають різні профілі експресії в рослинах, націлювання на обмежену підмножину генів оксидази ЗА2О0 з метою супресії може дозволити модифікувати певні ознаки, уникаючи при цьому відхилень, раніше пов'язаних з мутантами СА в зернових рослинах. Іншими словами, ознаки росту, розвитку і репродуктивні ознаки або відхилення, раніше пов'язані з мутантами СА в кукурудзі та інших зернових культурах, можуть бути розділені шляхом націлювання лише на обмежену кількість або підмножину (тобто один або більше, але не всіх) генів оксидази ЗА20 або САЗ та/або неповної супресії цільового гена оксидази СА. За допомогою трансгенного націлювання на підмножину одного або більше ендогенних генів оксидази ЗАЗ або (ЗА20 з метою супресії в рослині, можна застосовувати більш первазивний профіль експресії (наприклад, з конститутивним промотором) для отримання напівкарликових рослин без значних репродуктивних відхилень та/або інших небажаних ознак в рослині, навіть з експресією трансгенної конструкції в репродуктивній тканині(ах). Справді, в цьому документі представлені елементи та конструкції супресії, які
Зо вибірково націлені на гени оксидази 3 СЗА2О0 та/або оксидази 5 СА20 (ідентифіковані в наведеній вище Таблиці 1) з метою супресії, які можуть бути функціонально пов'язані з судинним, листовим та/або конститутивним промотором. 109) З конструкцією супресії, яка націлена лише на обмежену підмножину генів оксидази
СА20, таких як ген(и) оксидази З СЗА20, оксидази 4 ЗА20 та/або оксидази 5 СА20, або яка націлена на ген(и) оксидази оксидази 1 (ЗАЗ та/або оксидази 2 БАЗ, обмеження профілю експресії елемента супресії може бути менш важливим для досягнення нормального репродуктивного розвитку зернових або кукурудзяних рослин та запобігання відхилень в жіночому органі або початку через компенсації тощо, від інших генів оксидази СА20 та/або САЗ.
Таким чином, експресія конструкції та елемента супресії, селективно або переважно націлених, наприклад, на ген(и) оксидази З СА20 та/або оксидази 5 БА20, ген оксидази 4 бА20 та/або ген оксидази 1 САЗ, та/або оксидази 2 БАЗ в кукурудзі, або на аналогічні гени та гомологи в інших рослинах зернових, може бути викликаний різними типами промоторів, що експресуються в рослинах, включаючи конститутивні та тканиноспецифічні або тканинобажані промотори, такі як судинний або листовий промотор, які можуть включати, наприклад, промотор КТВУ, наведений вище (наприклад, промотор, що містить послідовність ЕТВМ (5ЕБО ІЮ МО: 65) або усічену послідовність ЕТВМ (ЗЕО ІЮ МО: 66)), та будь-які інші промотори, які керують експресією в тканинах, що охоплюють велику частину або всю судинну та/або листову тканину(и) рослини.
Будь-який відомий або згодом ідентифікований конститутивний промотор з досить високим рівнем експресії також може бути застосований для експресії конструкції супресії, націленої на підмножину генів оксидази ЗА20 та/або САЗ в кукурудзі, зокрема на ген(и) оксидази З СА20 та/або оксидази 5 СА20, ген оксидази 4 СА20 та/або ген(и) оксидази 1 САЗ та/або оксидази 2
САЗ, або подібні гени та гомологи в інших зернових рослинах.
П10|Ї Приклади конститутивних промоторів, які можуть бути застосовані в однодольних рослинах, таких як зернові або кукурудзяні рослини, включають, наприклад, різні промотори гену актину, такі як промотор Актину 1 рису (див., наприклад, Патент США Мо 5,641,876; див., також ЗЕО ІЮ МО: 75 або 5ЕО ІО МО: 76) та промотор Актину 2 рису (див., наприклад, Патент
США Мо 6,429,357; див., також, наприклад, ЗЕО ІЮО МО: 77 або 5ЕО ІЮ МО: 78), промотор Самм 355 або 195 (див., наприклад, Патент США Мо 5,352,605; див., також, наприклад, ЗЕО ІО МО: 79 для Самм 355), промотор убіквітину кукурудзи (див., наприклад, Патент США Мо 5,510,474), 60 поліубіквітиновий промотор Соїх Іасгута-|орі (див., наприклад, 5ЕО ІЮ МО: 80), промотор рису або кукурудзи Со52 (див., наприклад, Раїег та співавт., Те Ріапі дошгпаї, 2(6):837-44 1992 рік; див., також, наприклад, ЗЕО ІО МО: 81 для рисового промотора Со52), промотор ЕММ 355 (див., наприклад, Патент США Мо 6,372,211), подвійний покращений промотор СММУ (див., наприклад,
Патент США Мо 5,322,938), промотор МММУ (див., наприклад, Патент США Мо 6,420,547; див., також, наприклад, ЗЕО ІЮ МО: 82), промотор РСІ ЗМ (див., наприклад, Патент США Мо 5,850,019; див., також, наприклад, 5Е0О ІЮ МО: 83), промотор Ети (див., наприклад, ГГ аві та співавт., Тпеог. Аррі. Сепеї. 81:581 (1991 рік); та Мсеїгоу і співавт., Мої. Сеп. Сепеї. 231:150 (1991 рік)), тубуліновий промотор кукурудзи, рису або інших видів, промотор нопалінсинтази (по5), промотор ооктопінсинтази (005), промотор маннопінсинтази (таб) або промотор алкогольдегідрогенази рослини (наприклад, Ай! кукурудзи), будь-які інші промотори, включаючи вірусні промотори, відомі або ідентифіковані в цій галузі техніки для забезпечення конститутивної експресії в зерновій або кукурудзяній рослині, будь-які інші конститутивні промотори, відомі в цій галузі техніки, які можна застосовувати в однодольних або зернових рослинах, і будь-яку частину функціональної послідовності або усічення будь-якого з вищевказаних промоторів.
І111)| Достатній рівень експресії послідовності ДНК, що транскрибується, кодуючої некодуючу молекулу РНК, націлену на ген оксидази СА з метою супресії, може бути необхідний для отримання низькорослого, напівкарликового фенотипу, який є стійким до вилягання, оскільки більш низькі рівні експресії можуть бути недостатніми для зниження рівнів активної СА в рослині в достатній мірі, щоб спричинити істотний фенотип. Таким чином, можуть бути кращими тканиноспецифічні та тканинобажані промотори, які керують тощо, помірним або сильним рівнем експресії їх асоційованої послідовності ДНК, що транскрибується, в тканині(ах), яка продукує активну ЗА рослини. Крім того, такі тканиноспецифічні та тканинобажані (промотори) повинні стимулювати тощо, експресію асоційованої з ними послідовності ДНК, що транскрибується, протягом однієї або більше вегетативної стадії(стадій) розвитку рослин, коли рослина росте та/(або подовжується, включаючи одну або більше з наступної вегетативної стадії(стадій): МЕ, М1, М2, М3, М4, М5, Мб, 7, М8, М9, М10, М11, М12, М13, М14, Мп, МТ, наприклад, експресія щонайменше протягом М3-М12, М4-М12, М5-М12, М6-М12, М7-М12, М8-М12, М3-М14, М5-
М14, М6-М14, М7-М14, М8-М14, М9-М14, М10-М14, тощо, або протягом будь-якого іншого діапазону вегетативних стадій, коли відбувається ріст та/або подовження рослини. 1121) Відповідно до багатьох варіантів реалізації винаходу, промотор, що експресується рослиною, може переважно стимулювати експресію конститутивно або, щонайменше, в частині судинної та/або листової тканини рослини. Різні промотори, що керують експресією елемента супресії, націленого на ендогенний гени) оксидази З (ЗА20 та/або оксидази 5 СА20, ген оксидази 4 СА20, ген(и) оксидази 1 БАЗ та/або оксидази 2 БАЗ в кукурудзі, або подібні гени та гомологи в інших зернових рослинах, можуть бути ефективними для зменшення висоти рослини та підвищення стійкості до вилягання в різній мірі залежно від їх конкретного профілю та сили експресії в рослині. Однак деякі тканиноспецифічні та тканинобажані промотори, що керують експресією елемента супресії оксидази ЗА20 або САЗ в рослині, можуть не призводити до фенотипу значно низького зросту або стійкості до вилягання через просторово-часовий профіль експресії промотора під час розвитку рослини, та/або кількість або сила експресії промотора є занадто низькими або слабкими. Додатково, деякі конструкції супресії можуть тільки зменшувати та не усувати експресію цільового гена(ів) оксидази СА20 або САЗ при експресії в рослині і, таким чином, в залежності від профілю та сили експресії цього промотора, профіль та рівень експресії конструкції супресії оксидази СА20 або САЗ з таким промотором можуть бути недостатніми для отримання спостережуваного фенотипу висоти рослин та стійкості до вилягання рослин. 113) Відповідно до цих варіантів реалізації винаходу пропонується рекомбінантна молекула, вектор або конструкція ДНК, для супресії одного або більше ендогенного гена(ів) оксидази СА20 або САЗ в рослині, що містять послідовність ДНК, придатну для транскрипції, яка кодує некодуючу молекулу РНК, при цьому некодуюча молекула РНК містить послідовність, яка є, щонайменше, на 80 96, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 956, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 965, щонайменше на 99,595 або 10095 комплементарною, щонайменше, сегменту або частині молекули МРНК, що експресуються з ендогенного гена оксидази ЗА та кодуючі ендогенний білок оксидази СА в рослині, при цьому послідовність ДНК, що транскрибується, функціонально пов'язана з промотором придатним для експресії в рослині, і при цьому рослина є зерновою або кукурудзяною рослиною. Як сказано вище, крім націлювання на зрілу послідовність мРНК, некодуюча молекула РНК може додатково націлюватися на інтронну 60 послідовність(послідовності) гена або транскрипта оксидази (СА. Відповідно до багатьох варіантів реалізації винаходу, некодуюча молекула РНК може націлюватися, для супресії, на ген оксидази З СА20, та містити послідовність, яка є, щонайменше, на 80 956, щонайменше на 85956, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 96, щонайменше на 98595, щонайменше на 9995, щонайменше на 99,595 або 100 95 комплементарною щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам з 5ЕО ІЮ МО: 7 або 5ЕО ІЮ МО: 8. Відповідно до деяких варіантів реалізації винаходу некодуюча молекула РНК, націлена на ген оксидази З СА20 для супресії, може бути комплементарною, щонайменше 319 послідовним нуклеотидам, але не більше ніж 27 послідовним нуклеотидам, наприклад, комплементарною 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 або 27 послідовним нуклеотидам з 5ЕО ІЮ МО: 7 або 5ЕО ІЮ МО: 8. Відповідно до деяких варіантів реалізації винаходу, некодуюча молекула РНК може націлюватися на ген оксидази БА20 для супресії і містити послідовність, яка є, щонайменше на 8095, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 965, щонайменше на 9895, щонайменше на 99595, щонайменше на 99,595 або 10095 комплементарною, щонайменше, 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам молекули мРНК, що кодує ендогенний білок оксидази ЗА20 в рослині, який є, щонайменше, на 80 96, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 965, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 956, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 965, щонайменше на 99,5 95 або 100 95 ідентичним 5ЕО ІЮ МО: 9. Відповідно до додаткових варіантів реалізації винаходу, некодуюча молекула РНК може містити послідовність, яка є, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 96, щонайменше на 97 956, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або 100 95 комплементарною, щонайменше, 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам молекули мРНК, що кодує ендогенний білок оксидази СА20, який є, щонайменше, на 80 96, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 965, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 956, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 965, щонайменше на 99,5 95 або 100 95 подібним ЗЕО ІЮ МО: 9. (114 Як згадано вище, некодуюча молекула РНК може націлюватися на інтронну послідовність гена оксидази СА замість або на додаток до екзону, 5-НТО або 3-НТО гена оксидази СА. Таким чином, некодуюча молекула РНК націлена, для супресії, на ген оксидази З
СА2О, може містити послідовність, яка є, щонайменше на 8095, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 965, щонайменше на 9895, щонайменше на 99595, щонайменше на 99,595 або 10095 комплементарною, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам з 5ЕО ІЮ МО: 34 та/або нуклеотидам 3666-3775 або 4098-5314 з 5ЕО ІЮ МО: 34.
Важливо відзначити, що представлені в цьому документі послідовності для гена оксидази З
СА2О можуть варіюватися в залежності від різноманітності рослин кукурудзи, ліній та зародкових плазм через поліморфізми та/або наявність різних алелей гена. Додатково, ген оксидази З СА20 може бути експресований у вигляді альтернативно сплайсованих ізоформ, які можуть призводити до різних мРНК, кДНК та кодуючих послідовностей, що можуть впливати на конструкцію конструкції супресії та некодуючої молекули РНК. Таким чином, некодуюча молекула РНК націлена, для супресії, на ген оксидази З БЗА20, може бути більш широко визначена як та, що містить послідовність, яка є, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 9095, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 965, щонайменше на 9895, щонайменше на 99595, щонайменше на 99,595 або 10095 комплементарною, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам з 5ЕО ІЮО МО: 34. 115) Відповідно до варіантів реалізації цього винаходу запропонована молекула, вектор або конструкція рекомбінантної ДНК для супресії ендогенного гена оксидази 5 СА20 в рослині, що бо містить послідовність ДНК, придатну для транскрипції, яка кодує некодуючу молекулу РНК, при цьому некодуюча молекула РНК, націлена на ген оксидази 5 СА20 для супресії, містить послідовність, яка є, щонайменше на 8095, щонайменше на 8595, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 96, щонайменше на 98 965, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або 100 95 комплементарною, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам з 5ЕО ІЮО МО: 13 або 5ЕО ІЮ
МО: 14. Відповідно до деяких варіантів реалізації винаходу некодуюча молекула РНК, націлена на ген оксидази 5 СА20 для супресії може бути комплементарною, щонайменше 19 послідовним нуклеотидам, але не більше ніж 27 послідовним нуклеотидам, наприклад, комплементарною 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 або 27 послідовним нуклеотидам з 5ЕО ІЮ МО: 13 або 5ЕО ІЮ МО: 14. Відповідно до деяких варіантів реалізації винаходу, некодуюча молекула
РНК може націлюватися на ген оксидази зЗА20 для супресії та містити послідовність, яка є, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 965, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 956, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 965, щонайменше на 99,595 або 10095 комплементарною, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам молекули мРНК, що кодує ендогенний білок оксидази СА20 в рослині, який є, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 96, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 965, щонайменше на 98 965, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або 100 95 ідентичним 5ЕО ІЮО МО: 15.
Відповідно до додаткових варіантів реалізації винаходу, некодуюча молекула РНК може містити послідовність, яка є, щонайменше на 8095, щонайменше на 8595, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 96, щонайменше на 98 965, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або 100 95 комплементарною, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам молекули мРНК, що кодує ендогенний білок оксидази (ЗА2О, який є, щонайменше на 8095, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 965, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або 100 95 подібним 5ЗЕО
ІО МО: 15. 116) Як згадано вище, некодуюча молекула РНК може націлюватися на інтронну послідовність гена оксидази ЗА замість або на додаток до екзонної або нетрансльованої області зрілої МРНК гена оксидази СА. Таким чином, некодуюча молекула РНК націлена, для супресії, на ген оксидази 5 СБА20, може містити послідовність, яка є, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 956, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 965, щонайменше на 97 95, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або 100 95 комплементарною, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам з 5ЕО ІЮ МО: 35 та/або нуклеотидам 3792-3906 або 4476-5197 з 5ЕО ІЮ МО: 35.
Представлені в цьому документі послідовності для оксидази 5 БА20 можуть варіюватися в залежності від різноманітності рослин кукурудзи, ліній та зародкових плазм через поліморфізми та/або наявність різних алелей гена. Додатково, ген оксидази 5 ЗА20 може бути експресований у вигляді альтернативно сплайсованих ізоформ, які можуть призводити до різних мРНК, кДНК та кодуючих послідовностей, що можуть впливати на конструкцію конструкції супресії та некодуючої молекули РНК. Таким чином, некодуюча молекула РНК націлена, для супресії, на ген оксидази З СА20, може бути визначена більш широко як така, що містить послідовність, яка є, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 956, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 965, щонайменше на 99,595 або 10095 комплементарною, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам з 5ЕО ІЮ МО: 35. 1171) Відповідно до додаткових варіантів реалізації винаходу, пропонується рекомбінантна молекула, вектор або конструкція рекомбінантної ДНК для спільної супресії ендогенних генів оксидази З (ЗА20 та оксидази 5 СА20 в рослині, що містить послідовність ДНК, придатну для бо транскрипції, яка кодує некодуючу молекулу РНК, при цьому некодуюча молекула РНК націлена на гени оксидази З СЗА20 та оксидази 5 СА20, для супресії, містить послідовність, яка є (Її) щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 965, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 956, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 965, щонайменше на 99,595 або 10095 комплементарною, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам з ЗЕО І МО: 7 та/(або 5ЕО ІЮО МО: 8, та (ії) щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 965, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 956, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 965, щонайменше на 99,595 або 10095 комплементарною, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам з 5ЕО ІЮ МО: 13 та/або 5ЕО ІЮ МО: 14. Відповідно до деяких з цих варіантів реалізації винаходу, некодуюча молекула РНК, спільно націлена на гени оксидази 3 (СЗА20 та оксидази 5 (СА20 для супресії може бути комплементарною щонайменше 19 послідовним нуклеотидам, але не більше ніж 27 послідовним нуклеотидам, наприклад, комплементарною 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 або 27 послідовним нуклеотидам з (ї)
ЗЕО ІО МО: 7 (та/або 5ЕО ІО МО: 8) та (ії) 5ЕО ІЮО МО: 13 (та/або 5ЕО ІЮ МО: 14). Відповідно до багатьох варіантів реалізації винаходу, некодуюча молекула РНК, спільно націлена на гени оксидази З СБА20 та оксидази 5 БА20 для супресії, містить послідовність, яка є (її щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 96, щонайменше на 97 956, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або 10095 комплементарною, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам молекули мРНК, що кодує ендогенний білок оксидази СА20 в рослині, який є, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 9565, щонайменше на 90 95, щонайменше на 9595, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 9565, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 965, щонайменше на 99,5 95 або 100 95 ідентичним 5ЕО ІО МО: 9, та (ії) щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 956, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 965, щонайменше на 97 95, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або 100 95 комплементарною, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам молекули мРНК, що кодує ендогенний білок оксидази ЗА20 в рослині, який є, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 965, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 956, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 965, щонайменше на 99,5 95 або 100 95 ідентичним ЗЕО ІЮ МО: 15. Як згадано вище, некодуюча молекула РНК може націлюватися на інтронну послідовність гена оксидази СА. Таким чином, некодуюча молекула РНК може націлюватися на інтронну послідовність(послідовності) одного або обох гена(ів) оксидази З СА20 та/або оксидази 5 СА20, як зазначено вище. 118) Відповідно до конкретних варіантів реалізації винаходу, некодуюча молекула РНК, яка кодується послідовністю ДНК, що транскрибується, містить (ї) послідовність, яка є, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 956, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або 100 95 комплементарною ЗЕО ІЮО МО: 39, 41, 43 або 45, та/або (і) послідовність або елемент супресії, кодуючі некодуючу молекулу РНК, що містить послідовність, яка є, щонайменше на 9595, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 965, щонайменше на 98 9565, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або 100 95 ідентичною
ЗЕО ІЮ МО: 40, 42, 44 або 46. Відповідно до деяких варіантів реалізації винаходу, некодуюча молекула РНК, яка кодується послідовністю ДНК, що транскрибується, може містити послідовність з одним або більше помилковими спарюваннями, наприклад, 1, 2, 3, 4, 5 або більше комплементарних помилкових спарювань, відносно послідовності цільового сайту або сайту впізнавання цільової мРНК гена оксидази СА20, такої як послідовність, що майже комплементарна 5ЕО ІЮО МО: 40, але з одним або більше комплементарними помилковими спарюваннями відносно 5ЕО ІЮ МО: 40. Відповідно до конкретного варіанту реалізації винаходу, некодуюча молекула РНК, що кодується послідовністю ДНК, що транскрибується, містить послідовність, яка на 100 95 ідентична 5ЕО ІЮО МО: 40, яка на 100 95 комплементарна цільовій послідовності в КДНК та кодуючим послідовностях оксидази З ЗА20 (тобто, 5ЕО ІЮ МО: 7 та 8, відповідно) та/або відповідній послідовності мРНК, що кодується ендогенним геном оксидази З 60 СА20. Однак послідовність некодуючої молекули РНК, що кодується послідовністю ДНК, що
Зо транскрибується, яка на 100 95 ідентична 5ЕО ІЮО МО: 40, 42, 44 або 46, може бути не повністю комплементарною цільовій послідовності в КДНК та кодуючим послідовностям гена оксидази 5
СА20 (тобто, 5ЕО ІЮ МО: 13 їі 14, відповідно) та/або відповідній послідовності мРНК, що кодується ендогенним геном оксидази 5 СА20. Наприклад, найбільший комплементарний збіг між некодуючою молекулою РНК або послідовністю мікроРНК в 5ЕО ІЮ МО: 40 та кДНК, і кодуючими послідовностями гена ооксидази 5 (ЗА20 може включати одне помилкове спарювання в першому положенні ЗЕО ІЮ МО: 39 (тобто, "С" в першому положенні 5ЕО ІЮО МО: 39 замінюється на "с"; тобто, ЗТССАТСАТОСОСТОСААСТА). Однак некодуюча молекула РНК або послідовність мікроРНК в ЗЕО ІЮ МО: 40 можуть як і раніше зв'язуватися та гібридизуватися з МРНК, що кодується ендогенним геном оксидази 5 БЗА20, незважаючи на цю невелику розбіжність. 119| Відповідно до варіантів реалізації цього винаходу пропонується рекомбінантна молекула, вектор або конструкція ДНК, для супресії одного або більше ендогенного генаців) оксидази ЗАЗ в рослині, що містять послідовність ДНК, придатну для транскрипції, яка кодує некодуючу молекулу РНК, при цьому некодуюча молекула РНК містить послідовність, яка є, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 965, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 956, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 965, щонайменше на 99,595 або 10095 комплементарною, щонайменше, сегменту або частині молекули МРНК, що експресуються з ендогенного гена оксидази ЗАЗ та кодуючі ендогенний білок оксидази САЗ в рослині, при цьому послідовність ДНК, що транскрибується, функціонально пов'язана з промотором придатним для експресії в рослині, і при цьому рослина є зерновою або кукурудзяною рослиною. Крім націлювання на зрілу послідовність мРНК, некодуюча молекула РНК може додатково націлюватися на інтронні послідовності гена або транскрипта оксидази сАЗ. 1120) Відповідно до деяких варіантів реалізації винаходу, некодуюча молекула РНК може націлюватися, для супресії, на ген оксидази 1 САЗ, та містити послідовність, яка є, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 965, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 956, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 965, щонайменше на 99,595 або 10095 комплементарною, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам з ЗЕО ІО МО: 28 або 5ЕО ІЮО МО: 29. Відповідно до деяких варіантів реалізації винаходу некодуюча молекула РНК, націлена на ген оксидази САЗ для супресії, може бути комплементарною, щонайменше 19 послідовним нуклеотидам, але не більше ніж 27 послідовним нуклеотидам, наприклад, комплементарною 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 або 27 послідовним нуклеотидам з 5ЕО ІЮ МО: 28 або 5ЕО ІО МО: 29. Відповідно до деяких варіантів реалізації винаходу, некодуюча молекула РНК націлюється на ген оксидази САЗ для супресії та містить послідовність, яка є, щонайменше на 8095, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 965, щонайменше на 9895, щонайменше на 99595, щонайменше на 99,595 або 10095 комплементарною, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам молекули мРНК, що кодує ендогенний білок оксидази ЗАЗ в рослині, який є, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 965, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 956, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 965, щонайменше на 99,595 або 10095 ідентичним ЗЕО ІЮ МО: 30. Відповідно до додаткових варіантів реалізації винаходу, некодуюча молекула РНК може містити послідовність, яка є, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 965, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 956, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 965, щонайменше на 99,595 або 10095 комплементарною, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам молекули мРНК, що кодує ендогенний білок оксидази ЗАЗ, який є, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 95, щонайменше на 98 965, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або 100 95 подібним ЗЕО ІЮ МО: 30. (121| Як згадано вище, некодуюча молекула РНК може націлюватися на інтронну послідовність гена оксидази ЗАЗ замість або на додаток до екзону, 5'-НТО або 3-НТО гена 60 оксидази СА. Таким чином, некодуюча молекула РНК націлена, для супресії, на ген оксидази 1
САЗ, може містити послідовність, яка є, щонайменше на 8095, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 965, щонайменше на 9895, щонайменше на 99595, щонайменше на 99,595 або 10095 комплементарною, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам з 5ЕО ІЮ МО: 36 та/або нуклеотидам 515-879 або 1039-1158 з 5ЕО ІЮ МО: 36.
Представлені в цьому документі послідовності для оксидази 1 ЗАЗ можуть варіюватися в залежності від різноманітності рослин кукурудзи, ліній та зародкових плазм через поліморфізми та/або наявність різних алелей гена. Додатково, ген оксидази 1 ЗАЗ може бути експресований у вигляді альтернативно сплайсованих ізоформ, які можуть призводити до різних мРНК, кДНК та кодуючих послідовностей, що можуть впливати на конструкцію конструкції супресії та некодуючої молекули РНК. Таким чином, некодуюча молекула РНК націлена, для супресії, на ген оксидази 1 САЗ, може бути визначена більш широко як така, що містить послідовність, яка є, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 956, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 965, щонайменше на 99,595 або 10095 комплементарною, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам з 5ЕО ІЮ МО: 36. 11221 Відповідно до деяких варіантів реалізації винаходу, некодуюча молекула РНК може націлюватися, для супресії, на ген оксидази 2 САЗ, та містити послідовність, яка є, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 965, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 956, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 965, щонайменше на 99,595 або 10095 комплементарною, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам з 5ЕО ІЮ МО: 31 або 5ЕО ІЮ МО: 32. Відповідно до деяких варіантів реалізації винаходу некодуюча молекула РНК, націлена на ген оксидази САЗ для супресії, може бути комплементарною, щонайменше 19 послідовним нуклеотидам, але не більше ніж 27 послідовним нуклеотидам, наприклад, комплементарною 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 або 27 послідовним нуклеотидам з 5ЕО ІЮ МО: 31 або ЗЕО ІО МО: 32. Відповідно до деяких варіантів реалізації винаходу, некодуюча молекула РНК націлюється на ген оксидази САЗ для супресії та містить послідовність, яка є, щонайменше на 8095, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 965, щонайменше на 9895, щонайменше на 99595, щонайменше на 99,595 або 10095 комплементарною, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам мРНК, що кодує ендогенний білок оксидази БАЗ в рослині, який є, щонайменше на 80 96, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 96, щонайменше на 97 956, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або 100 95 ідентичним 5ЕО ІЮО МО: 33. Відповідно до додаткових варіантів реалізації винаходу, некодуюча молекула РНК може містити послідовність, яка є, щонайменше на 80 965, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 956, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 965, щонайменше на 97 95, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або 100 95 комплементарною, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам молекули мРНК, що кодує ендогенний білок оксидази САЗ, який є, щонайменше на 80 96, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 96, щонайменше на 97 956, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або 100 95 подібним 5ЕО ІЮО МО: 33. 123| Як згадано вище, некодуюча молекула РНК може націлюватися на інтронну послідовність гена оксидази ЗАЗ замість або на додаток до екзону, 5'-НТО або 3-НТО гена оксидази ЗАЗ. Таким чином, некодуюча молекула РНК націлена, для супресії, на ген оксидази 2 САЗ, може містити послідовність, яка є, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85956, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 96, щонайменше на 98595, щонайменше на 9995, щонайменше на 99,595 або 100 95 60 комплементарною, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18,
щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам з ЗЕО ІЮО МО: 37 та/або нуклеотидам 533-692 або 852-982 з 5БО ІЮ МО: 37.
Представлені в цьому документі послідовності для оксидази 2 ЗАЗ можуть варіюватися в залежності від різноманітності рослин кукурудзи, ліній та зародкових плазм через поліморфізми та/або наявність різних алелей гена. Додатково, ген оксидази 2 ЗАЗ може бути експресований у вигляді альтернативно сплайсованих ізоформ, які можуть призводити до різних мРНК, кДНК та кодуючих послідовностей, що можуть впливати на конструкцію конструкції супресії та некодуючої молекули РНК. Таким чином, некодуюча молекула РНК націлена, для супресії, на ген оксидази 2 САЗ, може бути визначена більш широко як така, що містить послідовність, яка є, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 956, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 965, щонайменше на 99,595 або 10095 комплементарною, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам з 5ЕО ІЮ МО: 37. 11241 Відповідно до конкретних варіантів реалізації винаходу, некодуюча молекула РНК, яка кодується послідовністю ДНК, що транскрибується, для націлювання на ген оксидази сСАЗ, містить (ї) послідовність, яка є, щонайменше на 95 9565, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 96, щонайменше на 98595, щонайменше на 9995, щонайменше на 99,595 або 100 95 комплементарною 5ЕО ІЮ МО: 57 або 59, та/або (ії) послідовність або елемент супресії, кодуючі некодуючу молекулу РНК, що містить послідовність, яка є, щонайменше на 95 9565, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 9565, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або 100 95 ідентичною 5ЕО ІЮО МО: 58 або 60. Відповідно до деяких варіантів реалізації винаходу, некодуюча молекула РНК, яка кодується послідовністю ДНК, що транскрибується, може містити послідовність з одним або більше помилковими спарюваннями, наприклад, 1, 2, 3, 4, 5 або більше комплементарних помилкових спарювань, відносно послідовності цільового сайту або сайту впізнавання цільової МРНК гена оксидази САЗ, такої як послідовність, що майже комплементарна 5ЕО ІЮ МО: 57 або 59, але з одним або більше комплементарними
Зо помилковими спарюваннями відносно ЗЕО І МО: 57 або 59. Відповідно до конкретного варіанту реалізації винаходу, некодуюча молекула РНК, кодуюча послідовністю ДНК, що транскрибується, містить послідовність, яка на 100 95 ідентична ЗЕО ІЮ МО 5ЕО ІО МО: 58 або 60, яка на 100 95 комплементарна цільовій послідовності в КДНК та кодуючим послідовностям гена оксидази 1 САЗ або оксидази 2 САЗ в кукурудзі (тобто, зБЕО ІЮ МО: 28, 29, 31 та/або 32) та/або відповідній послідовності МРНК, що кодується ендогенним геном оксидази 1 САЗ або оксидази 2 БАЗ. 1125) Відповідно до деяких варіантів реалізації винаходу, некодуюча молекула РНК може націлюватися, для супресії, на ген оксидази 4 (СА20, та містити послідовність, яка є, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 965, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 956, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 965, щонайменше на 99,595 або 10095 комплементарною, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам з 5ЕО ІЮ МО: 10 або 5ЕО ІЮО МО: 11. Відповідно до деяких варіантів реалізації винаходу некодуюча молекула РНК, націлена на ген оксидази 4
СА20 для супресії, може бути комплементарною, щонайменше 19 послідовним нуклеотидам, але не більше ніж 27 послідовним нуклеотидам, наприклад, комплементарною 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 або 27 послідовним нуклеотидам з 5ЕО ІЮО МО: 10 або 5ЕО ІЮ МО: 11. Відповідно до деяких варіантів реалізації винаходу, некодуюча молекула РНК націлюється на ген оксидази
СА20 для супресії та містить послідовність, яка є, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 965, щонайменше на 9895, щонайменше на 99595, щонайменше на 99,595 або 10095 комплементарною, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам молекули мРНК, що кодує ендогенний білок оксидази ЗА20 в рослині, який є, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 965, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 956, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,595 або 10095 ідентичним ЗЕО ІЮ МО: 12. Відповідно до додаткових 60 варіантів реалізації винаходу, некодуюча молекула РНК може містити послідовність, яка є,
щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 965, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 956, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 965, щонайменше на 99,595 або 10095 комплементарною, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам молекули мРНК, що кодує ендогенний білок оксидази (ЗА20, який є, щонайменше на 80 96, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 96, щонайменше на 98 965, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або 100 95 подібним ЗЕО ІЮ МО: 12. 126| Як згадано вище, некодуюча молекула РНК може націлюватися на інтронну послідовність гена оксидази СА20 замість або на додаток до екзону, 5-НТО або 3-НТО гена оксидази (ЗА20. Таким чином, некодуюча молекула РНК націлена, для супресії, на ген оксидази 4 (ЗА20, може містити послідовність, яка є, щонайменше на 80 9565, щонайменше на 85956, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 96, щонайменше на 98595, щонайменше на 9995, щонайменше на 99,595 або 100 95 комплементарною, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам з 5ЕО ІЮ МО: 38 та/або нуклеотидам 1996-2083 або 2412-2516 з 5ЕО ІЮ МО: 38.
Представлені в цьому документі послідовності для оксидази 4 СБА20 можуть варіюватися в залежності від різноманітності рослин кукурудзи, ліній та зародкових плазм через поліморфізми та/або наявність різних алелів гена. Додатково, ген оксидази 4 БА20 може бути експресований у вигляді альтернативно сплайсованих ізоформ, які можуть призводити до різних мРНК, кДНК та кодуючих послідовностей, що можуть впливати на конструкцію конструкції супресії та некодуючої молекули РНК. Таким чином, некодуюча молекула РНК націлена, для супресії, на ген оксидази 4 БА20, може бути визначена більш широко як така, що містить послідовність, яка є, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 956, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 965, щонайменше на 99,595 або 10095 комплементарною, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам з 5ЕО ІЮ МО: 38. 1271 Відповідно до конкретних варіантів реалізації винаходу, некодуюча молекула РНК, яка кодується послідовністю ДНК, що транскрибується, для націлювання на ген оксидази 4 СА20, містить (ї) послідовність, яка є, щонайменше на 95 9565, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 96, щонайменше на 98595, щонайменше на 9995, щонайменше на 99,595 або 100 95 комплементарною ЗЕО ІО МО: 61, та/або (ії) послідовність або елемент супресії, кодуючі некодуючу молекулу РНК, що містить послідовність, яка є, щонайменше на 95 9565, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 9565, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або 10095 ідентичною 5ЕО І МО: 62. Відповідно до деяких варіантів реалізації винаходу, некодуюча молекула РНК, яка кодується послідовністю ДНК, що транскрибується, може містити послідовність з одним або більше помилковими спарюваннями, наприклад, 1, 2, 3, 4, 5 або більше комплементарних помилкових спарювань, відносно послідовності цільового сайту або сайту впізнавання цільової МРНК гена оксидази СА20, такої як послідовність, що майже комплементарна 5ЕО І МО: 61, але з одним або більше комплементарними помилковими спарюваннями відносно ЗЕ ІЮ МО: 61. Відповідно до конкретного варіанту реалізації винаходу, некодуюча молекула РНК, яка кодується послідовністю ДНК, що транскрибується, містить послідовність, яка на 100 95 ідентична 5ЕО ІЮ МО: 62, яка на 100 95 комплементарна цільовій послідовності в КДНК та кодуючим послідовностях оксидази 4 БА20 в
БО кукурудзі (тобто, ЗЕО ІЮ МО: 10 або 11), та/або відповідній послідовності мРНК, що кодується ендогенним геном оксидази 4 СА20.
І128)| Відповідно до варіантів реалізації цього винаходу запропонована конструкція рекомбінантної ДНК, що містить послідовність ДНК, придатну для транскрипції, яка кодує некодуючу молекулу РНК, націлену на ендогенний ген(и) оксидази З СА20 та/або ген(и) оксидази 5 (ЗА20 для супресії при цьому послідовність ДНК, що транскрибується, є функціонально пов'язаною з конститутивним, тканиноспецифічним або тканинобажаним промотором, і при цьому послідовність ДНК, що транскрибується, викликає зниження або зменшення рівня експресії ендогенного гена(ів) оксидази З ЗА20 та/або оксидази 5 БА20 в одній або більше тканині(ах) рослини, трансформованої послідовністю ДНК, що бо транскрибується. Така некодуюча молекула РНК, що кодується послідовністю ДНК, що транскрибується, може містити послідовність, яка є () щонайменше на 80 95, щонайменше на 85956, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 96, щонайменше на 98595, щонайменше на 9995, щонайменше на 99,595 або 100 95 комплементарною, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам молекули мРНК, що кодує ендогенний білок оксидази СА20 в рослині, який є, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 965, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 956, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 965, щонайменше на 99,5 95 або 100 95 ідентичним ЗЕО ІЮ МО: 9, та/або (ії) щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 956, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 965, щонайменше на 97 95, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або 100 95 комплементарною, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам молекули мРНК, що кодує ендогенний білок оксидази ЗА20 в рослині, який є, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 965, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 956, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 965, щонайменше на 99,5 95 або 100 95 ідентичним ЗЕО ІЮ МО: 15.
І129| Відповідно до варіантів реалізації цього винаходу запропонована конструкція рекомбінантної ДНК, що містить послідовність ДНК, придатну для транскрипції, яка кодує некодуючу молекулу РНК, націлену на ендогенний ген(и) оксидази 1 САЗ та/або ген(и) оксидази 2 (САЗ для супресії при цьому послідовність ДНК, що транскрибується, є функціонально пов'язаною з конститутивним, тканиноспецифічним або тканинобажаним промотором, і при цьому послідовність ДНК, що транскрибується, викликає зниження або зменшення рівня експресії ендогенного гена(ів) оксидази 1 САЗ та/або оксидази 2 БАЗ в одній або більше тканині(ах) рослини, трансформованої послідовністю ДНК, що транскрибується.
Така некодуюча молекула РНК, що кодується послідовністю ДНК, що транскрибується, може містити послідовність, яка є () щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 96, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 965, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або 100 95 комплементарною, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам молекули мРНК, що кодує ендогенний білок оксидази САЗ в рослині, який є, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 965, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або 100 95 ідентичним
ЗЕО ІЮО МО: 30, та/або (ії) щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 96, щонайменше на 98 965, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або 100 95 комплементарною, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам молекули мРНК, що кодує ендогенний білок оксидази САЗ в рослині, який є, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 965, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або 100 95 ідентичним
ЗЕО ІО МО: 33.
ЗОЇ Відповідно до варіантів реалізації цього винаходу запропонована конструкція рекомбінантної ДНК, що містить послідовність ДНК, придатну для транскрипції, яка кодує некодуючу молекулу РНК, націлену на ендогенний ген СА40 оксидази 4 для супресії, при цьому послідовність ДНК, що транскрибується, є функціонально пов'язаною з конститутивним, тканиноспецифічним або тканинобажаним промотором, і при цьому послідовність ДНК, що транскрибується, викликає зниження або зменшення рівня експресії ендогенного гена оксидази 4 СА20 в одній або більше тканині(ах) рослини, трансформованої послідовністю ДНК, що транскрибується. Така некодуюча молекула РНК, що кодується послідовністю ДНК, що транскрибується, може містити послідовність, яка є () щонайменше на 80 95, щонайменше на 85956, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 96, щонайменше на 98595, щонайменше на 9995, щонайменше на 99,595 або 100 95 комплементарною, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, 60 щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23,
щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам молекули мРНК, що кодує ендогенний білок оксидази ЗА20 в рослині, який є, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 965, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 956, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 965, щонайменше на 99,5 95 або 100 95 ідентичним ЗЕО ІЮ МО: 12. 131) Відповідно до багатьох варіантів реалізації винаходу пропонується модифікована або трансгенна рослина, яка трансформується рекомбінантною конструкцією ДНК, що містить послідовність ДНК, придатну для транскрипції, яка кодує некодуючу молекулу РНК, націлену на ендогенний ген(и) оксидази З (зА20 та/або оксидази 5 СА20О для супресії, та/або має ендогенний ген оксидази З СЗА20 та/або оксидази 5 СА20, відредагований за допомогою цільових методів редагування генома, як запропоновано в цьому документі, при цьому послідовність ДНК, що транскрибується, функціонально пов'язана з конститутивним промотором або тканиноспецифічним, або тканинобажаним промотором, таким як судинний промотор або листовий промотор, і при цьому рівень експресії ендогенного гена(ів) оксидази З
СА20 та/або оксидази 5 СА20 усувається, зменшується або знижується в одній або більше рослинній тканині(ах), такій як одна або більше судинна та/або листова тканина(и) модифікованої або трансгенної рослини, щонайменше на 595, щонайменше на 10 95, щонайменше на 20 95, щонайменше на 25 95, щонайменше на 30 95, щонайменше на 40 95, щонайменше на 50 95, щонайменше на 60 956, щонайменше на 70 95, щонайменше на 75 965, щонайменше на 8095, щонайменше на 9095 або 10095 в порівнянні з диким типом або контрольною рослиною. Відповідно до багатьох варіантів реалізації винаходу пропонується модифікована або трансгенна рослина, яка трансформується рекомбінантною конструкцією
ДНК, що містить послідовність ДНК, придатну для транскрипції, яка кодує некодуючу молекулу
РНК, націлену на ендогенний ген(и) оксидази 3 ЗА20 та/або оксидази 5 СА20 для супресії, та/або має ендогенний ген оксидази 3 ЗА20 та/або оксидази 5 СА20, відредагований за допомогою цільових методів редагування генома для зниження або усунення рівня його експресії та/або активності, при цьому послідовність ДНК, що транскрибується, функціонально пов'язана з конститутивним промотором або тканиноспецифічним, або тканинобажаним промотором, таким як судинний промотор або листовий промотор, і при цьому рівень однієї або
Зо більше активних СА, таких як САТ, САЗ, СА4 та/або СА7, зменшується або знижується в одній або більше рослинній тканині(ах), таких як одна або більше судинна та/або листова тканина(и) або одна або більше стеблова та/або міжвузлова тканина(и), модифікованої або трансгенної рослини, щонайменше на 5 95, щонайменше на 10 9565, щонайменше на 20 95, щонайменше на 25595, щонайменше на 30 96, щонайменше на 40 95, щонайменше на 50 95, щонайменше на 60 96, щонайменше на 70 95, щонайменше на 75 95, щонайменше на 80 95, щонайменше на 90 95 або 100 95 в порівнянні з диким типом або контрольною рослиною. 11321 Відповідно до багатьох варіантів реалізації винаходу пропонується модифікована або трансгенна рослина, яка трансформується рекомбінантною конструкцією ДНК, що містить послідовність ДНК, придатну для транскрипції, яка кодує некодуючу молекулу РНК, націлену на ендогенний ген(и) оксидази 1 САЗ та/або оксидази 2 БАЗ для супресії, та/або має ендогенний ген оксидази 1 ЗАЗ або оксидази 2 САЗ, відредагований за допомогою цільових методів редагування генома, як запропоновано в цьому документі, при цьому послідовність ДНК, що транскрибується, функціонально пов'язана з конститутивним промотором або тканиноспецифічним, або тканинобажаним промотором, таким як судинний промотор або листовий промотор, і при цьому рівень експресії ендогенного гена(ів) оксидази 1 САЗ та/або оксидази 2 ЗАЗ усувається, зменшується або знижується в одній або більше рослинній тканині(ах), такій як одна або більше судинна та/або листова тканина(и) модифікованої або трансгенної рослини, щонайменше на 595, щонайменше на 1095, щонайменше на 20 95, щонайменше на 2595, щонайменше на 30 956, щонайменше на 40 95, щонайменше на 50 95, щонайменше на 60 95, щонайменше на 70 95, щонайменше на 7595, щонайменше на 80 965, щонайменше на 9095 або 10095 в порівнянні з диким типом або контрольною рослиною.
Відповідно до багатьох варіантів реалізації винаходу пропонується модифікована або трансгенна рослина, яка трансформується рекомбінантною конструкцією ДНК, що містить послідовність ДНК, придатну для транскрипції, яка кодує некодуючу молекулу РНК, націлену на ендогенний ген(и) оксидази 1 САЗ та/або оксидази 2 БАЗ для супресії, та/або має ендогенний ген оксидази 1 САЗ та/або оксидази 2 САЗ, відредагований за допомогою цільових методів редагування генома для зниження або усунення рівня його експресії та/або активності, при цьому послідовність ДНК, що транскрибується, функціонально пов'язана з конститутивним промотором або тканиноспецифічним, або тканинобажаним промотором, таким як судинний бо промотор або листовий промотор, і при цьому рівень однієї або більше активних СА, таких як
САТ, БАЗ, СА4 та/або (ЗА7, зменшується або знижується в одній або більше рослинній тканині(ах), таких як одна або більше судинна та/або листова тканина(и) або одна або більше стеблова та/або міжвузлова тканина(и), модифікованої або трансгенної рослини, щонайменше на 595, щонайменше на 10 95, щонайменше на 20 95, щонайменше на 25 95, щонайменше на 30 96, щонайменше на 40 95, щонайменше на 50 95, щонайменше на 60 95, щонайменше на 7095, щонайменше на 7595, щонайменше на 8095, щонайменше на 9095 або 10095 в порівнянні з диким типом або контрольною рослиною. 1133) Відповідно до багатьох варіантів реалізації винаходу пропонується модифікована або трансгенна рослина, яка трансформується рекомбінантною конструкцією ДНК, що містить послідовність ДНК, придатну для транскрипції, яка кодує некодуючу молекулу РНК, націлену на ендогенний ген оксидази 4 СА20 для супресії, талабо має ендогенний ген оксидази 4 СА20, відредагований за допомогою цільових методів редагування генома, як запропоновано в цьому документі, при цьому послідовність ДНК, що транскрибується, функціонально пов'язана з конститутивним промотором або тканиноспецифічним, або тканинобажаним промотором, таким як судинний промотор або листовий промотор, і при цьому рівень експресії ендогенного генак(ів) оксидази 4 СЗА20 усувається, зменшується або знижується в одній або більше рослинній тканині(ах), такій як одна або більше судинна та/або листова тканина(и) модифікованої або трансгенної рослини, щонайменше на 595, щонайменше на 1095, щонайменше на 20 95, щонайменше на 2595, щонайменше на 30 956, щонайменше на 40 95, щонайменше на 50 95, щонайменше на 60 95, щонайменше на 70 95, щонайменше на 7595, щонайменше на 80 965, щонайменше на 9095 або 10095 в порівнянні з диким типом або контрольною рослиною.
Відповідно до багатьох варіантів реалізації винаходу пропонується модифікована або трансгенна рослина, яка трансформується рекомбінантною конструкцією ДНК, що містить послідовність ДНК, придатну для транскрипції, яка кодує некодуючу молекулу РНК, націлену на ендогенний ген(и) оксидази 4 СА20 для супресії, та/або має ендогенний ген оксидази 4 СА20, відредагований за допомогою цільових методів редагування генома для зниження або усунення рівня його експресії та/або активності, при цьому послідовність ДНК, що транскрибується, функціонально пов'язана з конститутивним промотором або тканиноспецифічним, або тканинобажаним промотором, таким як судинний промотор або листовий промотор, і при цьому
Зо рівень однієї або більше активних СА, таких як САТ, БАЗ, СА4 та/або СА7, зменшується або знижується в одній або більше рослинній тканині(ах), таких як одна або більше судинна та/або листова тканина(и) або одна або більше стеблова та/або міжвузлова тканина(и), модифікованої або трансгенної рослини, щонайменше на 5 95, щонайменше на 10 95, щонайменше на 20 95, щонайменше на 2595, щонайменше на 30 956, щонайменше на 40 95, щонайменше на 50 95, щонайменше на 60 95, щонайменше на 70 956, щонайменше на 7595, щонайменше на 80 965, щонайменше на 90 95 або 100 95 в порівнянні з диким типом або контрольною рослиною. 1134) Відповідно до багатьох варіантів реалізації винаходу пропонується модифікована або трансгенна рослина, яка трансформована рекомбінантною конструкцією ДНК, що містить послідовність ДНК, придатну для транскрипції, яка кодує некодуючу молекулу РНК, націлену на ендогенний ген(и) оксидази З ЗА20, оксидази 4 СА20 та/або оксидази 5 СА20 для супресії, трансформована конструкцією рекомбінантної ДНК, що містить послідовність ДНК, придатну для транскрипції, яка кодує некодуючу молекулу РНК, націлену на ендогенний ген(и) оксидази 1
САЗ, оксидази 2 САЗ для супресії, та/"або має ендогенний ген оксидази 3 СА20, оксидази 4
СА20 або оксидази 5 СА20, відредагований за допомогою цільових методів редагування геному, для зниження або усунення рівня його експресії та/або активності, як представлено в цьому документі, при цьому послідовність ДНК, що транскрибується, функціонально пов'язана з конститутивним промотором або тканиноспецифічним, або тканинобажаним промотором, таким як судинний промотор або листовий промотор, і при цьому модифікована або трансгенна рослина має одну або більше з наступних ознак: напівкарликовість або зменшену висоту, або зріст рослини, зменшену довжину міжвузля стебла, підвищену стійкість до вилягання та/або збільшений діаметр стебла. Така модифікована або трансгенна рослина може не мати будь- яких значних репродуктивних відхилень. Модифікована або трансгенна рослина може мати один або більше з таких додаткових ознак: зменшений злам стебла, більш глибоке коріння, збільшену площу листя, більш ранню зімкнутість полога, більш високу провідність устя, нижчу висоту початку, підвищений вміст вологи в листі, підвищення стійкості до посухи, підвищення ефективності використання азоту, підвищення ефективності використання води, зниження вмісту антоціанів та площі антоціанів в листі у нормальних умовах або стресових умовах, викликаних обмеженою кількістю азоту або води, збільшення маси початку, збільшення кількості зерна, збільшення маси зерна, збільшення врожайності та/або збільшений індекс збору. бо Відповідно до багатьох з цих варіантів реалізації винаходу рівень експресії та/або активності ендогенного гена(ів) оксидази З (ЗА20, оксидази 4 СА20О та/або оксидази 5 СА20 або ендогенного гена(ів) оксидази 1 БАЗ та/або оксидази 2 САЗ, може бути усунутий, зменшений або знижений в одній або більше рослинній тканині(ах), такій як одна або більше судинна та/або листова тканина(и), модифікованої або трансгенної рослини, щонайменше на 5 9565, щонайменше на 10 95, щонайменше на 20 95, щонайменше на 25 95, щонайменше на 30 95, щонайменше на 40 96, щонайменше на 50 95, щонайменше на 60 95, щонайменше на 70 95, щонайменше на 7595, щонайменше на 80 95, щонайменше на 90 95 або 100 95 у порівнянні з диким типом або контрольною рослиною, та/або рівень однієї або більше активних СА, таких як САТ, САЗ, СА4 та/або СА7, зменшується або знижується в одній або більше рослинній тканині(ах), таких як одна або більше стеблова, міжвузлова, судинна та/або листова тканина(и), або одна або більше стеблова та/або міжвузлова тканина(и), модифікованої або трансгенної рослини, щонайменше на 595, щонайменше на 1095, щонайменше на 2095, щонайменше на 25 95, щонайменше на 30 95, щонайменше на 40 95, щонайменше на 50 95, щонайменше на 60 965, щонайменше на 70 95, щонайменше на 75 95, щонайменше на 80 95, щонайменше на 90 95 або 100 95 в порівнянні з диким типом або контрольною рослиною. 135) Відповідно до багатьох варіантів реалізації винаходу, що описані в наведених вище абзацах, некодуюча молекула РНК, яка кодується послідовністю ДНК, що транскрибується, молекули, вектора або конструкції рекомбінантної ДНК, може бути попередником мікроРНК або міРНК, який згодом може бути процесований або розщеплений в рослинній клітині з утворенням зрілої мікроРНК або міРНК. (136) Молекула, конструкція або вектор рекомбінантної ДНК за цим винаходом може містити послідовність ДНК, придатну для транскрипції, яка кодує некодуючу молекулу РНК, яка націлена на ендогенний ген оксидази СА для супресії, при цьому послідовність ДНК, що транскрибується, функціонально пов'язана з промотором придатним для експресії в рослині, таким як конститутивний або судинний та/або листовий промотор. Для цілей цього винаходу, некодуюча молекула РНК, яка кодується послідовністю ДНК, що транскрибується, яка націлена на ендогенний ген оксидази СА для супресії, може включати зрілу некодуючу молекулу РНК, яка націлена на ендогенний ген оксидази СА для супресії, та/"або молекулу-попередник РНК, яка може процесуватися в рослинній клітині в зрілу некодуючу молекулу РНК, таку як мікроРНК або міРНК, яка націлена на ендогенний ген оксидази СА для супресії. На додаток до пов'язаного з нею промотора послідовність ДНК, що транскрибується, кодуюча некодуючу молекулу РНК для супресії ендогенного гена оксидази СА, також може бути функціонально пов'язана з одним або більше додатковими регуляторними елементами, такими як енхансер(и), лідер, сайт ініціації транскрипції (Т55-ігапвсгіріп їаг 5йе), лінкер, 5 ії 3 нетрансльована область(ї) (НТО), інтрон(и), сигнал поліаденілювання, область термінації або стоп-кодон тощо, які є підходящими, необхідними або бажаними для посилення, регулювання або забезпечення можливості експресії послідовності ДНК, що транскрибується, в клітині рослини. Такий додатковий регуляторний елемент(и) може бути необов'язковим та/або застосовуватися для посилення або оптимізації експресії послідовності трансгена або ДНК, що транскрибується. Як зазначено в цьому документі, "енхансер" відрізняється від "промотора" тим, що енхансер зазвичай не має сайту ініціації транскрипції, ТАТА-боксу або еквівалентної послідовності і, отже, його недостатньо для запуску транскрипції. В цьому документі термін "лідер" може бути визначений, як правило, як послідовність ДНК 5-НТО гена (або трансгена) між сайтом ініціації транскрипції (Т55) ії 5'-кінцем послідовності ДНК, що транскрибується, або сайтом ініціації кодуючої білок послідовності трансгена.
І137| Відповідно до додаткових варіантів реалізації винаходу запропоновані способи трансформації рослинної клітини, тканини або експлантата молекулою, або конструкцією рекомбінантної ДНК, що містить послідовність ДНК, що транскрибується, або трансген, функціонально пов'язаний з промотором придатним для експресії в рослині, для отримання трансгенної рослини. Послідовність ДНК, що транскрибується, може кодувати некодуючу молекулу РНК, яка націлена на ген(и) оксидази СА для супресії, або попередника РНК, який процесує у зрілу молекулу РНК, таку як мікроРНК або міРНК, яка націлена на один або більше ген(ів) оксидази СА для супресії. У цій галузі техніки відомі численні способи трансформації хромосом або пластид в рослинній клітині за допомогою молекули або конструкції рекомбінантної ДНК, які можна застосовувати у відповідності з варіантами реалізації способу за цим винаходом для отримання трансгенної рослинної клітини і рослини. Будь-який відповідний спосіб або метод трансформації рослинної клітини, відомий в цій галузі техніки, може бути застосований відповідно до цих способів. Ефективні способи трансформації рослин включають бактеріально-опосередковану трансформацію, таку як трансформація, опосередкована 60 Адгобасієегічт або ЕПігобішт, та трансформація, опосередкована бомбардуванням частинками або бомбардуванням мікрочастинками. У цій галузі техніки відомо безліч способів трансформації експлантатів вектором для трансформації за допомогою бактеріально- опосередкованої трансформації або бомбардування мікрочастинками, або частинками і подальшого культивування, і тому подібного, цих експлантатів для регенерації або розвитку трансгенних рослин. У цій галузі техніки також відомі інші способи трансформації рослин, такі як мікроіїн'єкція, електропорація, вакуумна інфільтрація, тиск, сонікація, перемішування карбіднокремнієвого волокна, ПЕГ-опосередкована трансформація тощо. 138) Способи трансформації рослинних клітин і експлантатів добре відомі фахівцям в цій галузі техніки. Способи трансформації рослинних клітин шляхом бомбардування мікрочастинками з частинками, покритими рекомбінантною ДНК, представлені, наприклад, в патентах США Мо 5,550,318; 5,538,880 6,160,208; 6,399,861; та 6,153,812, а опосередкована
Адгорасієгішт трансформація описана, наприклад, в патентах США Мо 5,159,135; 5,824,877; 5,591,616; 6,384,301; 5,750,871; 5,463,174; та 5,188,958, всі з яких включені в цей документ за допомогою посилання. Додаткові способи трансформації рослин можна знайти, наприклад, в
Сотрепаїшт ої Тгапздепіс Стор Ріапі5 (2009 рік) Віаскугеїї Рибіїзпіпуд. Будь-який відповідний спосіб трансформації рослини, відомий або розроблений в цій галузі техніки, може бути застосований для трансформації рослинної клітини або експлантата за допомогою будь-якої з молекул нуклеїнової кислоти, конструкцій або векторів, представлених в цьому документі. 1139) Трансгенні рослини, отримані способами трансформації, можуть бути химерними або нехимерними для події трансформації в залежності від застосовуваних способів та експлантатів. Додатково запропоновані способи експресії некодуючої молекули РНК, яка націлена на ендогенний ген оксидази СА для супресії в одній або більше рослинних клітинах або тканинах під контролем промотора, що експресується в рослині, такого як конститутивний, тканиноспецифічний, тканинобажаний, судинний та/або листовий промотор, як представлено в цьому документі. Такі способи можуть бути застосовані для створення трансгенних рослин зернових або кукурудзи, що мають нижчий зріст, напівкарликовість, зменшену довжину міжвузля, збільшений діаметр стебла та/або поліпшену стійкість до вилягання. Такі трансгенні зернові або кукурудзяні рослини можуть також мати інші ознаки, які можуть бути корисними для врожайності, наприклад, зменшений злам стебла, глибше коріння, збільшену площу листя,
Зо більш ранню зімкнутість пологу, підвищення стійкості до посухи, підвищення ефективності використання азоту, підвищення ефективності використання води, більш високу провідність устя, нижчу висоту початку, підвищений вміст вологи в листі, зниження вмісту антоціанів та/або площі антоціанів в листі за нормальних умов або стресових умов, викликаних обмеженою кількістю азоту або води, збільшення маси початку, збільшення кількості зерна, збільшення маси зерна, збільшення врожайності та/або збільшений індекс збору у порівнянні з диким типом або контрольною рослиною. В цьому документі термін "індекс збору" відноситься до маси зібраного зерна, поділеній на загальну масу надземної біомаси рослини на збиральній площі.
І140| Трансгенні рослини, які експресують трансгенну або некодуючу молекулу РНК оксидази СА, що націлена на ендогенний ген оксидази СА для супресії, можуть мати більш ранню зімкнутість пологу (наприклад, приблизно на один день більш ранню або на 12-48 годин, на 12-36 годин, на 18-36 годин або на близько 24 години більш ранню зімкнутість пологу), ніж рослина дикого типу або контрольна рослина. Хоча трансгенні рослини, які експресують трансгенну або некодуючу молекулу РНК оксидази СА, яка націлена на ендогенний ген оксидази СА для супресії, можуть мати нижчу висоту початку, ніж рослина дикого типу або контрольна рослина, висота початку зазвичай може бути щонайменше 45 сантиметрів над землею. Трансгенні рослини, які експресують некодуючу молекулу РНК, яка націлена на ендогенний ген оксидази СА для супресії, можуть мати більшу біомасу та/або площу листя на одній або більше пізніх вегетативних стадіях (наприклад, У8-М12), ніж рослина дикого типу або контрольна рослина. Трансгенні рослини, які експресують трансгенну або некодуючу молекулу
РНК оксидази СА, яка націлена на ендогенний ген оксидази ЗА для супресії, можуть мати глибше коріння на пізніших вегетативних стадіях при вирощуванні в полі, ніж рослина дикого типу або контрольна рослина, що може бути пов'язано з підвищеною швидкістю росту кореня.
Ці трансгенні рослини можуть досягати глибини 90 см під землею раніше (наприклад, на 10-25 днів раніше, на 15-25 днів раніше або на близько 20 днів раніше), ніж рослина дикого типу або контрольна рослина, що може відбуватися в результаті вегетативного та репродуктивного переходу рослини (наприклад, на М16/К1 через близько 50 днів після посадки, на відміну від через близько 70 днів після посадки для контрольних рослин). 1411) Клітина(и) реципієнта або цілі експлантату або клітинні цілі для трансформації включають, але без обмежень, клітину насіння, клітину плоду, клітину листа, сім'ядольну бо клітину, клітину гіпокотиля, клітину меристеми, клітину ембріона, клітину ендосперму, кореневу клітину, клітину проростка, стовбурову клітину, клітину стручка, клітину квітки, клітину суцвіття, клітину стебла, клітину квітконіжки, клітину маточки, клітину стигми, клітину рецептакулу, клітину пелюстки, клітину чашолистка, пилкову клітину, клітину пиляку, клітину тичинкової нитки, клітину зав'язі, клітину сім'язачатку, клітину перикарпу, клітину флоеми, клітину бруньки, клітину калусу, хплоропласт, клітину устя, клітину трихоми, клітину кореневого волоску, клітину коренеплоду або клітину судинної тканини, насіння, ембріон, меристему, сім'ядоль, гіпокотиль, ендосперм, корінь, пагін, стебло, вузол, калус, клітинну суспензію, протопласт, квітку, лист, пилок, пиляк, зав'язь, сім'язачаток, перикарп, бруньку та/або судинну тканину або будь-яку трансформовану частину будь-якого з перерахованого вище. Для трансформації рослин будь-які цільові клітини, тканина(и), експлантат(и) тощо, які можуть бути застосовані для отримання вектора з метою трансформації рекомбінантної ДНК або молекули за цим винаходом, можуть в сукупності називатися "експлантат" для трансформації. Переважно така, що трансформується або трансформована клітина, або тканина експлантату може бути додатково розвинута або регенерована в рослину. Будь-яка клітина або експлантат, з яких можна вирощувати або регенерувати родючу рослину, розглядається в якості корисної клітини-реципієнта або експлантату для практичного застосування цього опису (тобто, в якості цільового експлантату для трансформації). Калус може бути ініційований або створений з різних тканинних джерел, включаючи, але без обмеження, ембріони або частини ембріонів, неембріональні тканини насіння, апікальні меристеми проростків, мікроспори тощо. Будь-які клітини, які здатні проліферувати як калус, можуть служити клітинами-реципієнтами для трансформації. Способи трансформації та матеріали для отримання трансгенних рослин (наприклад, різні середовища і реципієнтні цільові клітини або експлантати та способи трансформації й подальша регенерація в трансгенні рослини) відомі в цій галузі техніки. 1142) Трансформація цільового рослинного матеріалу або експлантату може бути здійснена в культурі тканини на живильному середовищі, наприклад, суміші поживних речовин, які дозволяють клітинам рости іп мійго або клітинній культурі. Як відомо в цій галузі техніки, трансформовані експлантати, клітини або тканини можуть бути піддані додатковим етапам культивування, таким як індукція калусу, відбір, регенерація тощо. Трансформація також може здійснюватися без створення або застосування тканини калусу. Трансформовані клітини, тканини або експлантати, що містять вставку або подію рекомбінантної послідовності ДНК, можна вирощувати, розвивати або регенерувати в трансгенні рослини в культурі, пробірках або грунті відповідно до способів, відомих в цій галузі техніки. Трансгенні рослини можуть бути потім схрещені з собою або іншими рослинами для отримання трансгенного насіння та нащадків.
Трансгенна рослина також може бути отримана шляхом схрещування першої рослини, що містить послідовність рекомбінантної ДНК або події трансформації, з другою рослиною, в якій відсутня вставка. Наприклад, конструкція або послідовність рекомбінантної ДНК може бути введена в першу лінію рослин, яка піддається трансформації, яка потім може бути схрещена з другою лінією рослин з метою інтрогресії конструкції або послідовності рекомбінантної ДНК в другу лінію рослин. Нащадки цих схрещувань можуть бути потім зворотно схрещені в більш бажану лінію безліч разів, наприклад, через 6-8 поколінь або зворотних схрещувань, щоб отримати потомства рослини з по суті тим же генотипом, що й у вихідній батьківській лінії, але для введення конструкції або послідовності рекомбінантної ДНК.
І143)| Представлена в цьому документі трансгенна або відредагована рослина, частина рослини, клітина або експлантат можуть належати до елітного сорту або елітної лінії. Елітний сорт або елітна лінія стосується сорту, отриманого в результаті селекції та відбору для забезпечення чудових агрономічних характеристик. Представлена в цьому документі трансгенна або відредагована рослина, клітина або експлантат може бути гібридною рослиною, клітиною або експлантатом. Як мається на увазі в цьому документі "гібрид" створюється шляхом схрещування двох рослин з різних сортів, ліній, інбредів або видів, таким чином, що нащадки містять генетичний матеріал від кожного з батьків. Фахівці в цій галузі визнають, що можуть бути отримані гібриди більш високого порядку. Наприклад, перший гібрид може бути отриманий шляхом схрещування сорту А з сортом В, щоб створити гібрид А х В, а другий гібрид може бути отриманий шляхом схрещування сорту С з сортом 0, щоб створити гібрид С х 0.
Перший та другий гібриди можуть бути далі схрещені для створення гібрида вищого порядку (А х В) х (С х 0), що містить генетичну інформацію від усіх чотирьох батьківських сортів.
І144| Відповідно до варіантів реалізації цього винаходу пропонується модифікована рослина, що містить елемент супресії оксидази СА, який націлений на два або більше генів оксидази СА для супресії, або комбінацію двох або більше елементів супресії оксидази СА та/або редагування гена(ів). Конструкція або вектор рекомбінантної ДНК може містити одну бо касету або елемент супресії що містить послідовність ДНК, що транскрибується,
сконструйовану або вибрану для кодування некодуючої молекули РНК, яка є комплементарної розпізнаванню мРНК або цільовій послідовності двох або більше генів оксидази СА, включаючи щонайменше перший ген оксидази СА та другий ген оксидази СА, тобто, мРНК цільових генів оксидази СА мають ідентичну або майже ідентичну (або подібну) послідовність, таким чином, що один елемент супресії та кодована некодуюча молекула РНК можуть націлюватися на кожен з цільових генів оксидази (ЗА для супресії. Наприклад, експресійна касета та конструкція супресії представлені в цьому документі, включають послідовність ДНК, що транскрибується, яка кодує одну некодуючу молекулу РНК, яка націлена на гени оксидази З ЗА20 та оксидази 5
СА20 для супресії. 11451 Відповідно до інших варіантів реалізації винаходу конструкція рекомбінантної ДНК або вектора можуть містити два або більше елементів супресії або послідовності, які можуть бути об'єднані разом в конструкції або векторі або в тандемі в одній експресійній касеті, або окремо в двох або більше експресійних касетах. Конструкція або вектор рекомбінантної ДНК може містити одну експресійну касету або елемент супресії, що містять послідовність ДНК, що транскрибується, яка кодує некодуючу молекулу РНК, що містить дві або більше цільові послідовності, розташовані в тандемі, включаючи, щонайменше, першу цільову послідовність та другу цільову послідовність, при цьому перша цільова послідовність є комплементарною розпізнаванню мРНК або цільовому сайту першого гена оксидази СА, а друга цільова послідовність комплементарна розпізнаванню мРНК або цільовому сайту другого гена оксидази
СА, та при цьому послідовність ДНК, що транскрибується, є функціонально пов'язаною з промотором придатним для експресії в рослині. Промотор, що експресується в рослині може бути конститутивним промотором або тканиноспецифічним або тканинобажаним промотором, як представлено в цьому документі. Некодуюча молекула РНК може бути експресована у вигляді пре-мікроРНК, яка процесується в дві або більш зрілі мікроРНК, включаючи, щонайменше, першу зрілу мікроРНК та другу мікроРНК, при цьому перша мікроРНК містить цільову послідовність, яка комплементарна розпізнаванню мРНК або цільовому сайту першого гена оксидази СА, а друга мікроРНК містить цільову послідовність, яка комплементарна розпізнаванню мРНК або цільовому сайту другого гена оксидази сА. 1146) Відповідно до інших варіантів реалізації винаходу конструкція рекомбінантної ДНК або
Зо вектор можуть містити дві або більше експресійні касети, включаючи першу експресійну касету та другу експресійну касету, при цьому перша експресійна касета містить першу послідовність
ДНК, що транскрибується, функціонально пов'язану з першим промотором придатним для експресії в рослині, а друга експресійна касета містить другу послідовність ДНК, що транскрибується, функціонально пов'язану з другим промотором придатним для експресії в рослині, при цьому перша послідовність ДНК, що транскрибується, кодує першу некодуючу молекулу РНК, яка містить цільову послідовність, яка комплементарна розпізнаванню мРНК або цільовому сайту першого гена оксидази СА, а друга послідовність ДНК, що транскрибується, кодує другу некодуючу молекулу РНК, яка містить цільову послідовність, що комплементарна розпізнаванню мРНК або цільовому сайту другого гена оксидази ЗА. Кожен з першого та другого промоторів, що експресуються в рослині, може бути конститутивним промотором або тканиноспецифічним, або тканинобажаним промотором, як передбачено в цьому документі, і перший та другий промотори, що експресуються в рослині можуть бути однаковими або різними промоторами.
І147| Відповідно до інших варіантів реалізації винаходу два або більше елементів супресії або конструкції, націлені на ген(и) оксидази СА та/або редагування гена оксидази СА, можуть бути об'єднані в модифікованій рослині шляхом схрещування двох або більше рослин разом в одному або більше поколіннях для отримання модифікованої рослини, що має бажану комбінацію елемента(ів) супресії та/або редагування генів. Відповідно до цих варіантів реалізації винаходу перша модифікована рослина, що містить елемент або конструкцію супресії, націлені на ген(и) оксидази ЗА (або редагування гена оксидази СА), може бути схрещена з другою модифікованою рослиною, що містить елемент або конструкцію супресії, націлену на ген(и) оксидази ЗА (або редагування гена оксидази СА), так що може бути отримана модифікована рослина нащадків, що містить перший елемент або конструкцію супресії та другий елемент або конструкцію супресії, елемент або конструкцію супресії та редагування гена оксидази СА, або редагування першого гена оксидази СА та редагування другого гена оксидази СА. В альтернативному варіанті, модифіковану рослину, що містить два або більше елементів або конструкцій супресії, націлених на ген(и) оксидази СА та/або редагування гена(ів) оксидази ЗА, може бути здійснене за допомогою (ї) котрансформації першого елемента або конструкції супресії і другого елемента або конструкції супресії (кожен з бо яких націлений на ген оксидази СА для супресії), (ії) трансформації модифікованої рослини другим елементом або конструкцією супресії, при цьому модифікована рослина вже містить перший елемент або конструкцію супресії, (ії) трансформації модифікованої рослини за допомогою елемента або конструкції супресії, при цьому модифікована рослина вже містить відредагований ген оксидази 5А, (ім) трансформації модифікованої рослини конструкцією(ями) для внесення однієї або більше змін в ген(и) оксидази СА, при цьому модифікована рослина вже містить елемент або конструкцію супресії або (м) трансформації за допомогою конструкції(ій) для внесення двох або більше змін в ген(и) оксидази сА.
І148)| Відповідно до варіантів реалізації цього винаходу запропоновані модифіковані рослини, що містять дві або більше конструкцій, націлених на ген(и) оксидази СА для супресії, включаючи першу конструкцію рекомбінантної ДНК та другу конструкцію рекомбінантної ДНК, при цьому перша конструкція рекомбінантної ДНК містить першу послідовність ДНК, придатну для транскрипції, яка кодує першу некодуючу молекулу РНК, яка є комплементарною розпізнаванню мРНК або цільовій послідовності першого гена оксидази СА, та друга конструкція рекомбінантної ДНК містить другу послідовність ДНК, придатну для транскрипції, яка кодує другу молекулу некодуючої РНК, яка є комплементарною розпізнаванню мРНК або цільовій послідовності другого гена оксидази СА. Перша та друга конструкції рекомбінантної ДНК можуть бути поміщені в один вектор та трансформовані в рослину як одна подія трансформації або представлені в окремих векторах або конструкціях, які можуть бути трансформовані у вигляді окремих подій трансформації. Відповідно до цих варіантів реалізації винаходу перший ген оксидази (СА може бути геном оксидази З СА20, оксидази 5 (А20, оксидази 4 СА20, оксидази 1 САЗ або оксидази 2 САЗ, перша некодуюча молекула РНК є комплементарною послідовності розпізнавання або цільовій послідовності мРНК, що експресуються з такого гена оксидази СА, а другий ген оксидази СА може бути геном оксидази З БА20, оксидази 5 БА20, оксидази 4 (СА20, оксидази 1 САЗ або оксидази 2 САЗ. Відповідно до деяких варіантів реалізації винаходу, перший та другий гени оксидази СА можуть бути однаковими або різними генами оксидази СА. В альтернативному варіанті, другий ген оксидази СА може бути іншим геном оксидази СА, таким як ген оксидази 1 (СЗА20, оксидази 2 СЗА20, оксидази 6 СА20, оксидази 7 СБА20, оксидази 8 ЗА20 або оксидази 9 СА20, а друга некодуюча молекула РНК є комплементарною до послідовності розпізнавання або цільової послідовності мРНК, що
Зо експресуються з такого гена оксидази сА.
І149| Відповідно до варіантів реалізації цього винаходу запропоновані модифіковані рослини, що містять конструкцію рекомбінантної ДНК, націлену на гени оксидази СА для супресії, що включає послідовність ДНК, придатну для транскрипції, яка кодує некодуючу молекулу РНК, яка містить дві або більше послідовностей, що націлюються, розташованих в тандемі, включаючи, щонайменше, першу послідовність, що націлюється, яка комплементарна послідовності розпізнавання мРНК або цільовій послідовності першого гена оксидази СА, та другу послідовність, що націлюється, яка комплементарна послідовності розпізнавання мРНК або цільовій послідовності другого гена оксидази ЗА. Некодуюча молекула РНК може бути експресована у вигляді пре-мікроРНК, яка процесує в дві або більш зрілі мікроРНК, включаючи, щонайменше, першу зрілу мікроРНК та другу мікроРНК, при цьому перша мікроРНК містить першу послідовність, що націлюється, яка комплементарна розпізнаванню мРНК або цільовому сайту першого гена оксидази СА, а друга мікроРНК містить другу послідовність, що націлюється, яка комплементарна розпізнаванню мРНК або цільовому сайту другого гена оксидази СА. Відповідно до цих варіантів реалізації винаходу перший ген оксидази СА може бути геном оксидази 3 (СЗА20, оксидази 5 СЗА20, оксидази 4 СА20, оксидази 1 САЗ або оксидази 2 САЗ, перша некодуюча молекула РНК є комплементарною послідовності розпізнавання або цільовій послідовності мРНК, що експресуються з такого гена оксидази СА, а другий ген оксидази ЗА може бути геном оксидази З ЗА20, оксидази 5 СА20, оксидази 4
СА20, оксидази 1 САЗ або оксидази 2 БАЗ. Відповідно до деяких варіантів реалізації винаходу, перший та другий гени оксидази СА можуть бути однаковими або різними генами оксидази сА.
В альтернативному варіанті, другий ген оксидази ЗА може бути іншим геном оксидази сА, таким як ген оксидази 1 СА20, оксидази 2 СА20, оксидази б (СА20, оксидази 7 СА20, оксидази 8 БА20 або оксидази 9 СА20, а друга некодуюча молекула РНК є комплементарною до послідовності розпізнавання або цільової послідовності МРНК, що експресуються з такого гена оксидази СА. 50) В описаних вище сценаріях розташування та незалежно від того, чи об'єднані цільові послідовності в тандем в одній послідовності ДНК, що транскрибується, (або в експресійній касеті) або в окремих послідовностях ДНК, що транскрибуються, (або експресійних касетах), другий ген оксидази ЗА може бути геном оксидази СА, відмінним від гена оксидази З СБА20, 60 оксидази 5 ЗА20, оксидази 4 БА20, оксидази 1 САЗ або гена оксидази 2 САЗ, такого як ген оксидази 1 СА20, оксидази 2 ЗА20, оксидази 6 ЗА20, оксидази 7 СА20, оксидази 8 ЗА20 або оксидази 9 БА20. Відповідно до цих варіантів реалізації винаходу друга послідовність, що націлює, кодує молекули РНК може бути, щонайменше на 8095, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 956, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 965, щонайменше на 9895, щонайменше на 99595, щонайменше на 99,595 або 10095 комплементарною, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам з будь-якого одного або більше з БЕО ІЮ МО: 1, 2, 4, 5, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, та/або 26. Згідно з деякими варіантами реалізації винаходу друга послідовність, що націлює, некодуючої молекули РНК може бути комплементарною, щонайменше 19 послідовним нуклеотидам, але не більше 27 послідовним нуклеотидам, наприклад, комплементарна 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 або 27 послідовним нуклеотидам з будь-якого одного або більше з 5ЕО 10
МО: 1, 2, 4, 5, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25 та/або 26. Відповідно до деяких варіантів реалізації винаходу, друга послідовність, що націлює, некодуючої молекули РНК є, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 956, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 965, щонайменше на 97 95, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або 100 95 комплементарною, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам молекули мРНК, що кодує ендогенний білок оксидази СА в рослині, який є, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 965, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 956, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 965, щонайменше на 99,5 95 або 100 95 ідентичним будь-якій одній або більше з БЕО ІЮ МО: 3, 6, 18, 21, 24 та/або 27. Відповідно до додаткових варіантів реалізації винаходу, друга послідовність, що націлює, некодуючої молекули РНК може містити послідовність, яка є, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 956, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 965, щонайменше на 97 95, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або 100 95 комплементарною, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам молекули мРНК, що кодує ендогенний білок оксидази СА, який є, щонайменше на 80 96, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 96, щонайменше на 97 956, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або 100 95 подібним одній або більше з 5ЕО ІЮ МО: 3, 6, 18, 21, 24 та/або 27. 151) Молекула або конструкція рекомбінантної ДНК за цим винаходом може містити або бути включена у вектор для трансформації ДНК з метою застосування в трансформації цільової клітини рослини, тканини або експлантата. Такий вектор для трансформації може зазвичай містити послідовності або елементи, необхідні або корисні для ефективної трансформації, на додаток до щонайменше однієї послідовності трансгена, експресійної касети та/або ДНК, що транскрибується, що кодує ген оксидази СА або некодуючу молекулу РНК, націлену на ендогенний ген оксидази СА для супресії. Для Адгобасіегішт-опосередкованої, КПі2обіа- опосередкованої або іншої бактеріально-опосередкованої трансформації вектор для трансформації може містити ділянку або область сконструйованої транспортної ДНК (або Т-
ДНК), що мають дві граничні послідовності, ліву межу (І В-Іей рогаег) та праву межу (КВ-гідні рогаеєг), що фланкують щонайменше послідовність ДНК, що транскрибується, або трансген, так що вставка Т-ДНК в геном рослини створює подію трансформації для послідовності ДНК, що транскрибується, трансгена або експресійної касети. Таким чином, послідовність ДНК, що транскрибується, трансген або експресійна касета, кодуюча некодуючу молекулу РНК, націлену на ендогенний ген оксидази СА для супресії, може бути розташована між лівою та правою межами Т-ДНК, можливо, разом з додатковим трансгеном(ами) або експресійною касетою(ами), такими як трансген маркера, що селектується рослиною, та/або інший ген(и) агрономічного інтересу, який може надавати рослині ознаку або фенотип агрономічного інтересу. Відповідно до альтернативних варіантів реалізації винаходу послідовність ДНК, що транскрибується, трансген або експресійна касета, кодуюча некодуючу молекулу РНК, націлену на ендогенний ген оксидази СА для супресії, та трансген маркера, що селектується рослиною, (або інший ген агрономічного інтересу) можуть бути присутніми в окремих сегментах Т-ДНК на одній і тій же або іншій молекулі(ах) рекомбінантної ДНК, наприклад, для котрансформації. Вектор або конструкція для трансформації може додатково містити прокаріотичні підтримуючі елементи, які 60 можуть бути розташовані в векторі поза областю(ами) Т-ДНК.
І152| Трансген маркера, що селектується рослиною, у векторі або конструкції для трансформації за цим винаходом може бути застосований для допомоги в селекції трансформованих клітин або тканини внаслідок присутності селекційного агента, такого як антибіотик або гербіцид, при цьому трансгени маркера, що селектується рослиною, забезпечує толерантність або стійкість до селективного агенту. Таким чином, агент, що селектується, може впливати або сприяти виживанню, розвитку, росту, проліферації тощо, трансформованих клітин, що експресують трансген маркера, який селектується рослиною, наприклад, для збільшення частки трансформованих клітин або тканин в рослині КО. Зазвичай гени маркера, що селектується рослиною, включають, наприклад, гени, що забезпечують толерантність або стійкість до антибіотиків, таких як канаміцин та паромоміцин (прін), гігроміцин В (ар ІМ), стрептоміцин або спектиноміцин (аадА) та гентаміцин (аас3 і аасс4) або ті, які забезпечують толерантність або стійкість до гербіцидів, таким як глюфосинат (баг або ра), дикамба (ОМО) та гліфосат (агоА або ЕРБР5). Можна також застосовувати гени скринінгу рослин, які забезпечують можливість візуального скринінгу трансформантів, такі як люціфераза або зелений флуоресцентний білок (ЗФБ), або ген, що експресуює бета-глюкуронідазу або ген (5И5) цідА, для якого відомі різні хромогенні субстрати. У деяких варіантах реалізації винаходу вектор або полінуклеотид, представлений в цьому документі, містить щонайменше один маркерний ген, що селектується, вибраний з групи, що складається з прінІ, арії М, аадА, аасз, аасС4, раг, раї ОМО, ЕРБР5, агА, ЗФБ та 505. Трансформація рослин може також проводитися без селекції під час одного або більше етапів, або стадій культивування, розвитку або регенерації трансформованих експлантатів, тканин, рослин та/або частин рослини. 153) Відповідно до цих варіантів реалізації винаходу способи трансформації рослинної клітини, тканини або експлантату за допомогою молекули або конструкції рекомбінантної ДНК можуть додатково включати сайт-спрямовану або цільову інтеграцію. Відповідно до цих способів частина молекули донорної матриці рекомбінантної ДНК (тобто, послідовності вставки) може бути вставлена або інтегрована в бажаному сайті або локусі в геномі рослини.
Послідовність вставки донорної матриці може містити трансген або конструкцію, таку як послідовність трансгена або ДНК, придатну для транскрипції, яка кодує некодуючу молекулу
РНК, яка націлена на ендогенний ген оксидази СА для супресії. Донорська матриця також може
Зо мати один або два плеча гомології, що фланкують послідовність вставки, щоб сприяти цільовій події вставки за допомогою гомологічної рекомбінації та/або репарації, що спрямовується гомологією. Кожне гомологічне плече може бути, щонайменше на 70 95, щонайменше на 75 95, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 965, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 95, щонайменше на 99 95 або 100 95 ідентичним або комплементарним щонайменше 20, щонайменше 25, щонайменше 30, щонайменше 35, щонайменше 40, щонайменше 45, щонайменше 50, щонайменше 60, щонайменше 70, щонайменше 80, щонайменше 90, щонайменше 100, щонайменше 150, щонайменше 200, щонайменше 250, щонайменше 500, щонайменше 1000, щонайменше 2500 або щонайменше 5000 послідовним нуклеотидам послідовності цільової ДНК в геномі однодольної або зернової рослини. Таким чином, молекула рекомбінантної ДНК за цим винаходом може містити донорну матрицю для сайт-спрямованої або націленої інтеграції трансгена або конструкції, такої як послідовність трансгена або ДНК, що транскрибується, кодуючої некодуючу молекулу РНК, яка націлена на ендогенний ген оксидази СА для супресії в геномі рослини. 154) Будь- який сайт або локус в геномі рослини можуть потенційно бути обрані для сайт- спрямованої інтеграції послідовності трансгена, конструкції або ДНК, що транскрибується, представленої в цьому документі. Для сайт-спрямованої інтеграції спочатку можна зробити дволанцюговий розрив (ДЛР) або одноланцюговий розрив в обраному геномному локусі за допомогою сайт-специфічної нуклеази, такої як, наприклад, нуклеаза з цинковими пальцями, сконструйована або нативна мегануклеаза, ТАЇЕ-ендонуклеаза або направлена РНК ендонуклеаза (наприклад, Са59 або Ср). Для сайт-спрямованої інтеграції може бути застосований будь-який спосіб, відомий в цій галузі техніки. У присутності молекули донорної матриці з послідовністю вставки, ДЛР або одноланцюговий розрив може потім бути відновлений за допомогою гомологічної рекомбінації між гомологічним плечем(ами) донорної матриці та геномом рослини або за допомогою негомологічного з'єднання кінців (НГЗК), що призводить до сайт-спрямованої інтеграції послідовності вставки в геном рослини для створення події цільової вставки в сайт ДЛР або одноланцюгового розриву. Таким чином, може бути досягнута сайт- специфічна вставка або інтеграція трансгена, конструкції або послідовності.
П155| Введення ДЛР або одноланцюгового розриву також може бути застосоване для введення цільових мутацій в геном рослини. Відповідно до цього підходу мутації, такі як делеції, 60 вставки, інверсії та/(або заміни, можуть бути введені в цільовий сайт за допомогою недосконалого відновлення ДЛР або одноланцюгового розриву з метою викликати нокаут або нокдаун гена оксидази (ЗА. Такі мутації можуть бути отримані шляхом недосконалого відновлення цільового локусу навіть без застосування молекули донорної матриці. "Нокаут" гена оксидази СА може бути досягнутий шляхом індукції ДЛР або одноланцюгового розриву в ендогенному локусі гена оксидази СА або біля нього, що призводить до відсутності експресії білка оксидази СА або експресії нефункціонального білка, тоді як "нокдаун" гена оксидази СА може бути досягнутий аналогічним чином шляхом індукції ДЛР або одноланцюгового розриву в ендогенному локусі гена оксидази СА або біля нього, який недосконало відновлюється в сайті, що не впливає на послідовність, кодуючу ген оксидази ЗА таким чином, щоб виключити функцію кодованого білка оксидази ЗА. Наприклад, сайт ДЛР або одноланцюгового розриву всередині ендогенного локусу може знаходитися вище або 5'-області гена оксидази БА (наприклад, послідовності промотора та/або енхансера), з метою впливу або зменшення його рівня експресії. Подібним чином, такі цільові нокаут або нокдаун мутації гена оксидази СА можуть створюватися за допомогою молекули донорної матриці для направлення конкретної або бажаної мутації в цільовий сайт або біля нього, за допомогою репарації ДЛР або одноланцюгового розриву. Молекула донорної матриці може містити гомологічну послідовність з послідовністю вставки або без неї і містити одну або більше мутацій, таких як одна або більше делецій, вставок, інверсій та/або замін, щодо цільової геномної послідовності в сайті ДЛР або одноланцюгового розриву або біля нього. Наприклад, цільові нокаут мутації гена оксидази СА можуть бути досягнуті шляхом видалення або інвертування щонайменше частини гена або шляхом введення зсуву рамки зчитування або передчасного стоп-коду в послідовність, що кодує гена. Видалення частини гена оксидази СА також може бути здійснено шляхом створення
ДЛР або одноланцюгового розриву в двох цільових сайтах що призводить до делеції проміжної цільової області, що фланкована цільовими сайтами.
І156|Ї Сайт-специфічна нуклеаза, представлена в цьому документі, може бути обрана з групи, що складається з нуклеази з цинковими пальцями (2ЕМ), мегануклеази, РНК-спрямованої ендонуклеази, ТАЇЕ-ендонуклеази (ТАЇГЕМ), рекомбінази, транспозази або будь-якої їх комбінації. Див., наприклад, Кпапаадаїйе К., та співавт., "Зепоте еайіпод ог їагдеїей ітргометепі іп ріапів, ", Ріапі Віоїесппо! Нер 10:327-343 (2016 рік); та Са) Т., ії співавт., "ЛЕМ, ТАГЕМ апа
СВІЗРА/Са5-базед теїподв їог депоте епдіпеегіпд", Ттепав Віоїесппої. 31(7):397-405 (2013), зміст та опис яких включені в цей документ за допомогою посилання. Рекомбіназа може бути сериновою рекомбіназою, приєднаною до мотиву розпізнавання ДНК, тирозиновою рекомбіназою, приєднаною до мотиву розпізнавання ДНК або іншим ферментом рекомбінази, відомим в цій галузі техніки. Рекомбіназа або транспозаза може бути ДНК-транспозазою або рекомбіназою, приєднаною до ДНК-зв'язуючого домену. Тирозинова рекомбіназа, приєднана до мотиву розпізнавання ДНК, може бути обрана з групи, що складається з рекомбінази Стге, рекомбінази Бір та рекомбінази Тпр1і. Відповідно до деяких варіантів реалізації винаходу рекомбіназа Стге або рекомбіназа Сіп, представлені в цьому документі, пов'язані з ДНК- зв'язуючим доменом цинкового пальця. В іншому варіанті реалізації винаходу серинова рекомбіназа, приєднана до мотиву розпізнавання ДНК, що представлений в цьому документі, обрана з групи, що складається з інтегрази РПЇСЗ1, інтегрази КА та інтегрази ТР-901. В іншому варіанті реалізації винаходу транспозаза ДНК, приєднана до ДНК-зв'язуючого домену, що представлений в цьому документі, обрана з групи, що складається з ТА Е-ріддуВас та ТАГЕ-
Маг.
І157| Відповідно до варіантів реалізації цього опису направлена РНК ендонуклеаза може бути обрана з групи, що складається з Сав51, Са518В, Са52, Сав53, Са54, Сав55, Са56, Са57, Саз8,
Са59 (також відомих як С5п1 та С5х12), Сав510, Сзу1, Сзу2, СзуЗ, Све1, Све2, С5с1, С562, Свза5,
Свп2, Свте2, Сет3, Сет4, Сето, б5тб, Ст, СтиЗ, Стг4, Сто, Стб, Се5р1, С5р2, С5603,
Свх17, С5х14, С5х10, Сех16, Свзах, С5х3, Сех1, Сех15, С5И, Сеї2, СвіЗ3, Сеї4, Сри, СавхХ, Саву, їх гомологів або модифікованих версій, Агдопаше (необмежені приклади білків Агдопаше, включають ТПпегпти5 (егторпйи5 Агдопашіе (ТАдо), Ругососсивз Тигіовив Агдопаціє (РІАдо),
Маїгопобасіегішт дгедогуїі Агдопаціє (МоАдо)) та їх гомологів або модифікованих версій.
Відповідно до деяких варіантів реалізації винаходу направлена РНК ендонуклеаза може бути ферментом Са59 або Ср.
І158)| В одному аспекті сайт-специфічна нуклеаза, що представлена в цьому документі, обрана з групи, що складається з нуклеази з цинковими пальцями, мегануклеази, РНК- спрямованої нуклеази, нуклеази ТАГЕ, рекомбінази, транспозази або будь-якої їх комбінації. В іншому аспекті сайт-специфічна нуклеаза, представлена в цьому документі, обрана з групи, що складається з Са59 або Ср. В іншому аспекті сайт-специфічна нуклеаза, що представлена в 60 цьому документі, обрана з групи, що складається з Сав51, Са518В, Са52, Са53, Са54, Са55, Савб,
Саз7, Са58, Са59, Саб510, Сву!, Сву2, С5уЗ3, Свзе1, С5е2, С5с1, С5с2, Сзаб5, С5п2, бвт2, Свт,
Ста, Сеть, С5тб, Ст, Стг3, Стг4, Сто, Стиб, С5р1, Сб5р2, С553, С5х17, С5х14, Сех10,
С5х16, Сбхах, Сех3, Сех1, Сех15, С5П, С5і2, С513, С5М4, Ср, Саб5Х, Саву їх гомолога або їх модифікованої версії. В іншому аспекті представлена в цьому документі направлена РНК нуклеаза обрана з групи, що складається з Са59 або Ср. В іншому аспекті представлена в цьому документі направлена РНК нуклеаза обрана з групи, що складається з Са51, Сав18,
Саз2, Са53, Са54, Са55, Сазб, Саз7, Савз8, Са5з9, Саб510, Сву!, Свуг, СвуЗ, Свеї!, Свег2, С5с1,
Сзвс2, Сва5, Свп2, бет2, б5т3, Сет, Сет, Сетб, Ст, СтЗ, Сті4, Ст, Стгб, С5Б1, Св5р2,
С5р3, Сех17, Сех14, Сбех10, Сех16, Свах, Сех3, Сех!, Сех15, СП, Сеї2, Сві3, С5і4, Сри, Савх,
Саб5у їх гомолога або їх модифікованої версії. В іншому аспекті спосіб та/або композиція, представлена в цьому документі, містить, щонайменше одну, щонайменше дві, щонайменше три, щонайменше чотири, щонайменше п'ять, щонайменше шість, щонайменше сім, щонайменше вісім, щонайменше дев'ять або щонайменше десять сайт-специфічних нуклеаз. У ще одному аспекті спосіб та/або композиція, представлена в цьому документі, містить, щонайменше одну, щонайменше дві, щонайменше три, щонайменше чотири, щонайменше п'ять, щонайменше шість, щонайменше сім, щонайменше вісім, щонайменше дев'ять або щонайменше десять полінуклеотидів, що кодують щонайменше одну, щонайменше дві, щонайменше три, щонайменше чотири, щонайменше п'ять, щонайменше шість, щонайменше сім, щонайменше вісім, щонайменше дев'ять або щонайменше десять сайт-специфічних нуклеаз. 1159) Для РНК-спрямованих ендонуклеаз додатково представлена молекула направляючої
РНК (нРНК), яка спрямовує ендонуклеази в цільовий сайт в геномі рослини за допомогою спарювання основ або гібридизації щоб викликати ДЛР або одноланцюговий розрив в цільовому сайті або біля нього. НРНК може бути трансформована або введена в рослинну клітину або тканину (можливо, разом з нуклеазами або кодуючою нуклеазу молекулою, конструкцією або вектором ДНК) у вигляді молекули НРНК або у вигляді молекули, конструкції або вектора рекомбінантної ДНК, що містить послідовність ДНК, що транскрибується, кодуючою направляючу РНК функціонально пов'язану з промотором придатним для експресії в рослині. Як відомо в цій галузі техніки, "направляюча РНК" може включати, наприклад, СКІЗРК РНК
Зо (сТРНК), одноланцюгову направляючу РНК (59РНК) або будь-яку іншу молекулу РНК, яка може направляти або спрямовувати ендонуклеази до конкретного цільового сайту в геномі. "Одноланцюгова направляюча РНК" (або "5б9дРНК") є молекулою РНК, яка містить сгРНК, ковалентно пов'язану з їгастРНК лінкерною послідовністю, яка може бути експресована у вигляді одного транскрипту або молекули РНК. Направляюча РНК містить послідовність, що направляє або націлює, яка ідентична або комплементарна цільовому сайту в геномі рослини, наприклад, в гені оксидази СА або біля нього. Мотив, що прилягає до протоспейсеру (РАМ- ргоюзрасег-адіасепі тої) може бути присутнім в геномі, безпосередньо таким, що прилягає та розташованим вище 5'-кінця послідовності геномного цільового сайту, послідовності, що комплементарно націлює, направляючої РНК, тобто, безпосередньо нижче (3) до смислового (т ланцюга геномного цільового сайту (по відношенню до цільової послідовності направляючої
РНК), як відомо в цій галузі техніки. Див., наприклад, УМи, Х. та співавт., "Тагдеї зресійсну ої Те
СВІЗ5РА-Сав59 зузіет, " Оцапі Віої. 2(2):59-70 (2014 рік), зміст та опис яких включено в цей документ за допомогою посилання. Геномна послідовність РАМ на смисловому (Ж) ланцюгу, прилеглої до цільового сайту (по відношенню до послідовності направляючої РНК, що націлює), може містити 5'-М(С0-3. Проте, відповідна послідовність направляючої РНК (тобто, безпосередньо нижче (3) до послідовності направляючої РНК, що націлює), як правило, може бути не комплементарною геномній послідовності РАМ. Направляюча РНК зазвичай може бути некодуючою молекулою РНК, яка не кодує білок. Направляюча послідовність направляючої РНК може мати довжину щонайменше 10 нуклеотидів, наприклад, 12-40 нуклеотидів, 12-30 нуклеотидів, 12-20 нуклеотидів, 12-35 нуклеотидів, 12-30 нуклеотидів, 15-30 нуклеотидів, 17-30 нуклеотидів або 17-25 нуклеотидів, або близько 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 або більше нуклеотидів в довжину. Направляюча послідовність може бути, щонайменше на 95 965, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 95, щонайменше на 99 95 або 100 95 ідентичною або комплементарною, щонайменше 10, щонайменше 11, щонайменше 12, щонайменше 13, щонайменше 14, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25 або більше послідовним нуклеотидам послідовності ДНК в геномному цільовому сайті. 160) Для редагування геному в гені оксидази З СА20 або біля нього за допомогою РНК- бо спрямованої ендонуклеази можна застосовувати направляючу РНК, яка містить направляючу послідовність, яка є, щонайменше на 9095, щонайменше на 9595, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 965, щонайменше на 99 95 або 100 95 ідентичною або комплементарною, щонайменше 10, щонайменше 11, щонайменше 12, щонайменше 13, щонайменше 14, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25 або більше послідовним нуклеотидам з 5ЕО ІЮ МО: 34 або послідовності, комплементарної їй (наприклад, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 або більше послідовним нуклеотидам з 5ЕО ІЮ МО: 34 або послідовності, комплементарної їй). Для редагування геному в гені оксидази 5 (зЗА20 або біля нього за допомогою РНК-спрямованої ендонуклеази можна застосовувати направляючу РНК, яка містить направляючу послідовність, яка є, щонайменше на 90 956, щонайменше на 95 956, щонайменше на 96 96, щонайменше на 97 96, щонайменше на 99 95 або 100 95 ідентичною або комплементарною, щонайменше 10, щонайменше 11, щонайменше 12, щонайменше 13, щонайменше 14, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25 або більше послідовним нуклеотидам з 5ЕО ІЮ МО: 35 або послідовності, комплементарної їй (наприклад, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 або більше послідовним нуклеотидам з ЗЕО ІЮ МО: 35 або послідовності, комплементарної їй). В цьому документі термін "послідовний" по відношенню до полінуклеотидної або білкової послідовності означає відсутність делецій або пробілів в послідовності.
І161)| Для мутацій нокдауну (і, можливо, нокауту) за допомогою редагування геному, направлена РНК ендонуклеаза може бути націлена на послідовність, розташовану вище або нижче, таку як послідовність промотора та/або енхансера, або інтрон, послідовність 5'НТО та/або З'НТО гена оксидази 3 СЗА20 або оксидази 5 СА20, для мутації однієї або більше промоторних та/або регуляторних послідовностей гена та впливати на рівень його експресії або знижувати його. Для нокдауну (ї, можливо, нокауту) гена оксидази З СА20 в кукурудзі може бути застосована направляюча РНК, яка містить направляючу послідовність, яка є, щонайменше на 90 96, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 95, щонайменше на 99 95 або 100 95 ідентичною або комплементарною, щонайменше 10, щонайменше 11, щонайменше 12, щонайменше 13, щонайменше 14, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25 або більше послідовним нуклеотидам в діапазоні нуклеотидних послідовностей 1-3096 з 5ЕО ІЮО МО: 34, діапазоні нуклеотидних послідовностей 3666-3775 з БЕО ІЮ МО: 34, діапазоні нуклеотидних послідовностей 4098-5314 з
ЗБЕО ІЮ МО: 34, діапазоні нуклеотидних послідовностей 5585-5800 з 5БО ІЮ МО: 34 або діапазоні нуклеотидних послідовностей 5801-8800 з 5БО ІЮО МО: 34, або послідовності, комплементарної їм (наприклад, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 або більше послідовним нуклеотидам в діапазоні нуклеотидних послідовностей 1-3096, 3666-3775, 4098-5314, 5585-5800, 5801-8800, або 5585-8800 з 5БО ІЮО МО: 34, або послідовності, комплементарної їм).
І162| Для нокдауну (і, можливо, нокауту) гена оксидази 5 ЗА20 в кукурудзі може бути застосована направляюча РНК, яка містить направляючу послідовність, яка є, щонайменше на 90 96, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 95, щонайменше на 99 95 або 100 95 ідентичною або комплементарною, щонайменше 10, щонайменше 11, щонайменше 12, щонайменше 13, щонайменше 14, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25 або більше послідовним нуклеотидам в діапазоні нуклеотидних послідовностей 1-3000 з 5ЕО ІЮО МО: 35, діапазоні нуклеотидних послідовностей 1-3000 з 5ЕО ІО МО: 35, діапазоні нуклеотидних послідовностей 3792-3906 з
БО ЗБЕО ІЮ МО: 35, діапазоні нуклеотидних послідовностей 4476-5197 з 5БО ІЮ МО: 35 або діапазоні нуклеотидних послідовностей 5860-8859 з 5БО ІЮО МО: 35, або послідовності, комплементарної їм (наприклад, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 або більше послідовним нуклеотидам в діапазоні нуклеотидних послідовностей 1-3000, 3792-3906, 4476-5197 або 5860-8859 з 5ЕО ІЮ МО: 35, або послідовності, комплементарної їм). 1163) Для мутацій нокдауну (ї, можливо, нокауту) шляхом редагування геному, направлена
РНК ендонуклеаза може бути націлена на кодуючу та/або інтронну послідовність гену оксидази З СА або оксидази 5 СА20, щоб потенційно усунути експресію та/або активність функціонального білка оксидази ЗА з гена. Однак в деяких випадках може бути досягнутий нокаут експресії гена оксидази СА шляхом націлювання на послідовність (і) гена вище та/або 60 5НТО або на інші послідовності в геномному локусі гена або біля нього. Таким чином, нокаут експресії гена оксидази СА може бути досягнутий шляхом націлювання на геномну послідовність в сайті або локусі, або біля нього, цільового гена оксидази З СА20 або оксидази 5 СЗА20, вище або нижче послідовності, такої як послідовність промотора та/або енхансера або послідовність інтрона, 5НТО та/або З'НТО гена оксидази З СА20 або оксидази 5 СА20, як описано вище для нокдауну гену оксидази З БЗА20 або оксидази 5 СБА20. (164) Для нокауту (ії, можливо, нокдауну) гена оксидази З ЗА20 в кукурудзі може бути застосована направляюча РНК, яка містить направляючу послідовність, яка є, щонайменше на 90 96, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 95, щонайменше на 99 95 або 100 95 ідентичною або комплементарною, щонайменше 10, щонайменше 11, щонайменше 12, щонайменше 13, щонайменше 14, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25 або більше послідовним нуклеотидам в діапазоні нуклеотидних послідовностей 3097-5584 з 5ЕБО ІО МО: 34, діапазоні нуклеотидних послідовностей 3097-3665 з БЕО ІЮ МО: 34, діапазоні нуклеотидних послідовностей 3776-4097 з
ЗБЕО ІЮ МО: 34, діапазоні нуклеотидних послідовностей 5315-5584 з 5БО ІЮ МО: 34, або послідовності, комплементарної їм (наприклад, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 або більше послідовним нуклеотидам в діапазоні нуклеотидних послідовностей 3097 - 5584, 3097-3665, 3097-3775, 3665-4097, 3776-4097, 3776-5314, 4098-5584 або 5315-5584 з 5ЕО
ІО МО: 34, або послідовності, комплементарної їм).
І165| Для нокауту (і, можливо, нокдауну) гена оксидази 5 ЗА20 в кукурудзі може бути застосована направляюча РНК, яка містить направляючу послідовність, яка є, щонайменше на 90 96, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 95, щонайменше на 99 95 або 100 95 ідентичною або комплементарною, щонайменше 10, щонайменше 11, щонайменше 12, щонайменше 13, щонайменше 14, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25 або більше послідовним нуклеотидам в діапазоні нуклеотидних послідовностей 3001-5473 з 5ЕО ІО МО: 35, діапазоні нуклеотидних послідовностей 3001-3791 з БЕО ІЮ МО: 35, діапазоні нуклеотидних послідовностей 3907-4475 з
ЗБЕО ІЮ МО: 35, діапазоні нуклеотидних послідовностей 5198-5473 з 5БО ІЮ МО: 35, або послідовності, комплементарної їм (наприклад, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 або більше послідовним нуклеотидам в діапазоні нуклеотидних послідовностей 3001 - 5473, 3001-3791, 3001-3906, 3792-4475, 3907-4475, 3907-5197, 4476-5473 або 5198-5473 з 5ЕО
ІО МО: 35, або послідовності, комплементарної їм). 1166) Відповідно до деяких варіантів реалізації винаходу запропонована направляюча РНК для націлювання на ендогенний ген оксидази З СБА20 та/або оксидази 5 СА20, що містить направляючу послідовність, яка є, щонайменше на 90 9565, щонайменше на 95 9565, щонайменше на 96595, щонайменше на 9795, щонайменше на 9995 або 10095 ідентичною або комплементарною, щонайменше 10, щонайменше 11, щонайменше 12, щонайменше 13, щонайменше 14, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21 або більше послідовним нуклеотидам з будь-якого одного або більше з ЗЕО ІЮ МО: 138-167.
І167| Для редагування геному в гені оксидази 4 СА20 або біля нього за допомогою РНК- спрямованої ендонуклеази можна застосовувати направляючу РНК, яка містить направляючу послідовність, яка є, щонайменше на 9095, щонайменше на 9595, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 965, щонайменше на 99 95 або 100 95 ідентичною або комплементарною, щонайменше 10, щонайменше 11, щонайменше 12, щонайменше 13, щонайменше 14, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25 або більше послідовним нуклеотидам з 5ЕО ІЮ МО: 38 або послідовності, комплементарної їй (наприклад, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 або більше послідовним нуклеотидам з ЗЕО ІЮ МО: 38 або послідовності, комплементарної їй). (168) Для мутацій нокдауну (і, можливо, нокауту) шляхом редагування геному, направлена
РНК ендонуклеаза може бути націлена на кодуючу та/або інтронну послідовність гену оксидази 4 СА20, щоб потенційно усунути експресію та/або активність функціонального білка оксидази 4 (ЗА20 з гена. Для гена оксидази 4 (СА20 в кукурудзі може бути застосована направляюча РНК, яка містить направляючу послідовність, яка є, щонайменше на 90 965, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 95, щонайменше на 99 95 або 100 95 ідентичною або комплементарною, щонайменше 10, щонайменше 11, щонайменше 12, щонайменше 13, щонайменше 14, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, 60 щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22,
щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25 або більше послідовним нуклеотидам в діапазоні нуклеотидних послідовностей 1544-2852 з 5ЕБО ІО МО: 38, діапазоні нуклеотидних послідовностей 1544-1995 з БЕО ІЮ МО: 38, діапазоні нуклеотидних послідовностей 2084-2411 з
ЗБЕО ІЮ МО: 38, діапазоні нуклеотидних послідовностей 2517-2852 з 5БО ІЮ МО: 38, або послідовності, комплементарної їм (наприклад, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 або більше послідовним нуклеотидам в діапазоні нуклеотидних послідовностей 1544- 2852, 1544-1995, 1544-2083, 1996-2411, 2084-2411, 2084-2516, 2412-2852 або 2517-2852 з ЗЕО
ІО МО: 38, або послідовності, комплементарної їм).
І169)| Для мутацій нокдауну (і, можливо, нокауту) за допомогою редагування геному, направлена РНК ендонуклеаза може бути націлена на послідовність, розташовану вище або нижче, таку як послідовність промотора та/або енхансера, або інтрон, послідовність 5'НТО та/або З'НТО гена оксидази 4 СА20, для мутації однієї або більше промоторних та/або регуляторних послідовностей гена та впливати на рівень його експресії або знижувати його. Для гена оксидази 3 СЗА20 в кукурудзі може бути застосована направляюча РНК, яка містить направляючу послідовність, яка є, щонайменше на 90 9565, щонайменше на 95 9565, щонайменше на 96595, щонайменше на 9795, щонайменше на 9995 або 10095 ідентичною або комплементарною, щонайменше 10, щонайменше 11, щонайменше 12, щонайменше 13, щонайменше 14, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25 або більше послідовним нуклеотидам в діапазоні нуклеотидних послідовностей 1-1416 з БЕО ІЮО МО: 38, діапазоні нуклеотидних послідовностей 1417-1543 з 5ЕО ІЮО МО: 38, діапазоні нуклеотидних послідовностей 1996-2083 з БЕО ІЮО МО: 38, діапазоні нуклеотидних послідовностей 2412-2516 з 5ЕО ІО МО: 38, діапазоні нуклеотидних послідовностей 2853-3066 з 5ЕО ІЮО МО: 38 або діапазоні нуклеотидних послідовностей 3067- 4465 з БЕО ІЮО МО: 38, або послідовності, комплементарної їм (наприклад, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 або більше послідовним нуклеотидам в діапазоні нуклеотидних послідовностей 1-1416, 1417-1543, 1-1543, 1996-2083, 2412-2516, 2853-3066, 3067-4465 або 2853-4465 з 5ЕО ІЮ МО: 38, або послідовності, комплементарної їм). (170) На додаток до направляючої послідовності направляюча РНК може додатково містити
Зо одну або більше іншу структурну або каркасну послідовність(послідовності), які можуть зв'язуватися або взаємодіяти з РНК-спрямованою ендонуклеазою. Такі каркасні або структурні послідовності можуть додатково взаємодіяти з іншими молекулами РНК (наприклад, ігастРНК).
У цій галузі техніки відомі способи та методи конструювання конструкцій, що націлюються, та направляючих РНК для редагування геному і сайт-спрямованої інтеграції в цільовому сайті в геномі рослини із застосуванням РНК-спрямованої ендонуклеази. (171) Відповідно до деяких варіантів реалізації винаходу запропоновані конструкції та вектори рекомбінантної ДНК, що містять полінуклеотидну послідовність, що кодує сайт- специфічну нуклеазу, таку як нуклеаза з цинковими пальцями (2ЕМ), мегануклеаза, направлена
РНК ендонуклеаза, ТА Е-ендонуклеаза (ТА ЕМ) рекомбіназа або транспозаза, при цьому кодуюча послідовність функціонально пов'язана з промотором придатним для експресії в рослині. Для РНК-спрямованих ендонуклеаз, додатково запропоновані конструкції та вектори рекомбінантної ДНК, що містять полінуклеотидну послідовність, що кодує направляючу РНК, при цьому направляюча РНК містить направляючу послідовність достатньої довжини, що має процентну ідентичність або комплементарність до цільового сайту в геномі рослини, наприклад, в цільовому гені оксидази СА або біля нього. Відповідно до деяких варіантів реалізації винаходу полінуклеотидна послідовність конструкції та вектора рекомбінантної ДНК, яка кодує сайт- специфічну нуклеазу або направляючу РНК, може бути функціонально пов'язана з промотором придатним для експресії в рослині, таким як індуцибельний промотор, конститутивний промотор, тканиноспецифічний промотор тощо.
І172| Відповідно до деяких варіантів реалізації винаходу, конструкція або вектор рекомбінантної ДНК можуть містити першу полінуклеотидну послідовність, що кодує сайт- специфічну нуклеазу, та другу полінуклеотидну послідовність, що кодує направляючу РНК, які можуть бути введені в клітину рослини разом з допомогою методів трансформації рослини. В альтернативному варіанті можуть бути надані дві конструкції або вектори рекомбінантної ДНК, включаючи першу конструкцію або вектор рекомбінантної ДНК та другу конструкцію або вектор рекомбінантної ДНК, які можуть бути введені в клітину рослини разом або послідовно за допомогою методів трансформації рослин, при цьому перша конструкція або вектор рекомбінантної ДНК містить полінуклеотидну послідовність, що кодує сайт-специфічну нуклеазу, а друга конструкція або вектор рекомбінантної ДНК містить полінуклеотидну послідовність, що бо кодує направляючу РНК. Відповідно до деяких варіантів реалізації винаходу конструкція або вектор рекомбінантної ДНК, що містить полінуклеотидну послідовність, кодуючу сайт- специфічну нуклеазу, може бути введена за допомогою методів трансформації рослин в клітину рослини, яка вже містить (або трансформована нею) конструкцію або вектор рекомбінантної
ДНК, що містить полінуклеотидну послідовність, що кодує направляючу РНК. В альтернативному варіанті, конструкція або вектор рекомбінантної ДНК, що містить полінуклеотидну послідовність, що кодує направляючу РНК, може бути введена за допомогою методів трансформації рослини в клітину рослини, яка вже містить (або трансформована нею) конструкцію або вектор рекомбінантної ДНК, що містить полінуклеотидну послідовність, що кодує сайт-специфічну нуклеазу. Відповідно до ще одного додаткового варіанту реалізації винаходу перша рослина, що містить (або трансформована) конструкцію або вектор рекомбінантної ДНК, що містить полінуклеотидну послідовність, кодуючу сайт-специфічну нуклеазу, може бути схрещена з другою рослиною, що містить (або трансформована) конструкцію або вектор рекомбінантної ДНК, що містить полінуклеотидну послідовність, що кодує направляючу РНК. Такі конструкції або вектори рекомбінантної ДНК можуть бути тимчасово трансформовані в клітину рослини або стабільно трансформовані, або інтегровані в геном клітини рослини. (173) В одному аспекті вектори, що містять полінуклеотиди, що кодують сайт-специфічну нуклеазу, та, необов'язково, одну або більше, дві або більше, три або більше, або чотири або більше нРНК надаються рослинній клітині за допомогою способів трансформації, відомих в цій галузі техніки (наприклад, без обмежень, бомбардуванням частинками, ПЕГ-опосередкованою трансфекцією протопласту або Адгобасіегішт-опосередкованою трансформацією). В одному аспекті вектори, що містять полінуклеотиди, кодуючі нуклеазу Са59, та, необов'язково, одну або більше, дві або більше, три або більше, або чотири або більше нРНК надаються рослинній клітині за допомогою способів трансформації, відомих в цій галузі техніки (наприклад, без обмежень, бомбардуванням частинками, ПЕГ-опосередкованою трансфекцією протопласту або
Адгорасіегійт-опосередкованою трансформацією). В іншому аспекті вектори, що містять полінуклеотиди, кодуючі СрИ, та, необов'язково, одну або більше, дві або більше, три або більше, або чотири або більше сгРНК надаються клітині за допомогою способів трансформації, відомих в цій галузі техніки (наприклад, без обмежень, вірусною трансфекцією,
Зо бомбардуванням частинками, ПЕГ-опосередкованою трансфекцією протопласту або
Адгорасіегійт-опосередкованою трансформацією). 174) Деякі сайт-специфічні нуклеази, такі як рекомбінази, нуклеази з цинковими пальцями (27ЕМ), мегануклеази та ТАГЕМ, не є РНК-спрямованими і замість цього покладаються на свою білкову структуру для визначення свого цільового сайту для того, щоб викликати ДЛР або одноланцюговий розрив, або вони злиті, пов'язані або приєднані до ДНК-зв'язуючого білкового домену або мотиву. Структура білка сайт-специфічної нуклеази (або злитого/приєднаного/пов'язаного ДНК-зв'язуючого домену) може націлювати сайт-специфічну нуклеазу на цільовий сайт. Відповідно до багатьох з цих варіантів реалізації винаходу, не-РНК- спрямовані сайт-специфічні нуклеази, такі як рекомбінази, нуклеази з цинковими пальцями (2ЕМ), мегануклеази та ТАГЕМ, можуть бути спроектовані, сконструйовані та виготовлені відповідно до відомих способів для націлювання й зв'язування з цільовим сайтом в геномному локусі ендогенного гена оксидази СА кукурудзи або зернової рослини або біля нього, такого як ген оксидази 3 (ЗА20 або ген оксидази 5 СЗА20 в кукурудзі, з метою створення ДЛР або одноланцюгового розриву в такому геномному локусі для нокауту або нокдауну експресії гена оксидази СА шляхом відновлення ДЛР або одноланцюгового розриву. Наприклад, сконструйована сайт-специфічна нуклеаза, така як рекомбіназа, нуклеаза з цинковими пальцями (2ЕМ), мегануклеаза або ТАГЕМ, може бути сконструйована для націлювання та зв'язування з (ї) цільовим сайтом в геномі рослини, що відповідає послідовності з «ЕО ІЮ МО: 34 або його комплементарній послідовності, з метою створення ДЛР або одноланцюгового розриву в геномному локусі гена оксидази З СА20, (ії) цільовим сайтом в геномі рослини, що відповідає послідовності з зФЕО ІЮ МО: 35 або його комплементарній послідовності, з метою створення ДЛР або одноланцюгового розриву в геномному локусі гена оксидази 5 СА20, або (ії) цільовим сайтом в геномі рослини, що відповідає послідовності з 5ЕО ІЮ МО: 38 або його комплементарній послідовності, з метою створення ДЛР або одноланцюгового розриву в геномному локусі гена оксидази 4 СБА20, що може потім привести до створення мутації або вставки послідовності в сайт ДЛР або одноланцюгового розриву через механізми клітинної репарації, які можуть направлятися донорною молекулою або матрицею. (175) В одному аспекті описана в цьому документі методика цільового редагування генома може включати застосування рекомбінази. У деяких варіантах реалізації винаходу тирозинова 60 рекомбіназа, приєднана, тощо, до мотиву або домену розпізнавання ДНК, може бути обрана з групи, що складається з рекомбінази Сте, рекомбінази Бір та рекомбінази Тпр1. В одному аспекті Сте-рекомбіназа або Сіп-рекомбіназа, представлені в цьому документі, можуть бути пов'язані з ДНК-зв'язуючим доменом з цинковими пальцями. Система сайт-спрямованої рекомбінації РІір--ЕТ може походити з 2-мікронної плазміди пекарських дріжджів Засспаготусе5 сегемізіае. У цій системі рекомбіназа Бір (фліпаза) може рекомбінувати послідовності між цільовими сайтами розпізнавання фліпазою (ЕКТ-Пірразе гесодпіоп їагдеї). ЕНТ-сайти містять 34 нуклеотиди. Бір може зв'язуватися з "плечима" сайтів ЕКТ (одне плече знаходиться в зворотній орієнтації) та розщеплювати сайт ЕКТ з будь-якого кінця проміжної послідовності нуклеїнової кислоти. Після розщеплення Бір може рекомбінувати послідовності нуклеїнових кислот між двома сайтами ЕКТ. Сте-Іох є системою сайт-спрямованої рекомбінації, що отримана з бактеріофага РІ11, яка аналогічна системі рекомбінації РІір-ЕВТ. Сте- ох можна застосовувати для інвертування послідовності нуклеїнової кислоти, видалення послідовності нуклеїнової кислоти або транслокації послідовності нуклеїнової кислоти. У цій системі рекомбіназа Сте може рекомбінувати пару послідовностей нуклеїнової кислоти ох. І ох-сайти містять 34 нуклеотиди, причому перший та останній 13 нуклеотиди (плечі) є паліндромними. Під час рекомбінації білок
Стге рекомбінази зв'язується з двома сайтами ох на різних нуклеїнових кислотах та розщеплюється в сайтах Іох. Розщеплені нуклеїнові кислоти сплайсуються разом (реципрокно транслокуються) та рекомбінація завершується. В іншому аспекті наданий в цьому документі сайт Іох є сайтом ІохР, Іох 2272, ІохМ, ох 511, Іох 5171, Іох71, Іохбб, М2, М3, М7 або М11. 176) 2ЕМ є синтетичними білками, що складаються з сконструйованого ДНК-зв'язуючого домену цинкового пальця, злитого з доменом розщеплення (або напівдоменом розщеплення), який може бути отриманий з ендонуклеази рестрикції (наприклад, РОКІ). ДНК-зв'язуючий домен може бути канонічним (С2Н2) або неканонічним (наприклад, СЗН або С4). ДНК-зв'язуючий домен може містити один або більше цинкових пальців (наприклад, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або більше цинкових пальців) в залежності від цільового сайту. Кілька цинкових пальців в ДНК- зв'язуючому домені можуть бути розділені лінксерною послідовністю(ями). 2ЕМ можуть бути сконструйовані для розщеплення практично будь-якої ділянки дволанцюгової ДНК шляхом модифікації ДНК-зв'язуючого домену цинкового пальця. 2ЕМ утворюють димери з мономерів, що складаються з неспецифічного домену розщеплення ДНК (наприклад, отриманого з
Зо нуклеази ЕоКІ), злитого з ДНК-зв'язуючим доменом, що містить набір цинкових пальців, сконструйованих для зв'язування послідовності ДНК цільового сайту. ДНК-зв'язуючий домен
ЕМ зазвичай може складатися з 3-4 (або більше) цинкових пальців. Амінокислоти в положеннях -1, 2, «3 і 46 по відношенню до початку а-спіралі цинкового пальця, які сприяють сайт-специфічному зв'язуванню з цільовим сайтом, можуть бути змінені та налаштовані для відповідності конкретній цільовій послідовності. Інші амінокислоти можуть утворювати основний консенсусний каркас для генерації 2ЕМ з різною специфічністю послідовності. Способи та правила конструювання 2ЕМ для націлювання і зв'язування з конкретними цільовими послідовностями відомі в цій галузі техніки. Див., наприклад, заявки на патент США Мо 2005/0064474, 2009/0117617 та 2012/0142062, зміст і опис яких включені в цей документ за допомогою посилання. Для нуклеазного домену БоКкІ може знадобитися димеризація для розщеплення ДНК, і тому необхідні два 2ЕМ з їх С-кінцевими областями для зв'язування протилежних ланцюгів ДНК сайту розщеплення (розділених 5-7 п.о.). Мономер 2ЕМ може розрізати цільовий сайт, якщо два 7Е-зв'язуючих сайти є паліндромними. Застосовуваний в цьому документі 2ЕМ є широким та включає мономерний 2ЕМ, який може розщеплювати дволанцюгову ДНК без допомоги іншого 2ЕМ. Термін 2ЕМ може також застосовуватися для позначення одного або обох членів пари 2ЕМ, які сконструйовані для спільної роботи з розщеплення ДНК в одному й тому ж сайті.
І177| Не обмежуючись будь-якої наукової теорії, оскільки специфічність ДНК-зв'язуючих доменів цинкового пальця може бути змінена з застосуванням одного з різних способів, теоретично можуть бути створені індивідуальні ЕМ для націлювання практично на будь-яку цільову послідовність (наприклад, на ген оксидази (ЗА або біля нього в геномі рослини).
Загальнодоступні способи конструювання доменів з цинковими пальцями включають Сопіехі- дерепадепі Аззетбіу (СобА), Оіїдотегіледй Роо! Епдіпеегіпд (ОРЕМ) або Моашіаг Аззетбіу. В одному аспекті спосіб та/або композиція, надані в цьому документі, включають одну або більше, дві або більше, три або більше, чотири або більше, або п'ять або більше 2ЕМ. В іншому аспекті
ЕМ, представлений в цьому документі, здатний генерувати цільовий ДЛР або одноланцюговий розрив. В одному аспекті вектори, що містять полінуклеотиди, що кодують один або більше, два або більше, три або більше, або чотири або більше, або п'ять або більше 7ЕМ надаються клітині за допомогою способів трансформації, відомих в цій галузі техніки (наприклад, без обмежень, бо вірусною трасфекцією, бомбардуванням частинками, ПЕГ-опосередкованою трансфекцією протопласту або Адгорасієгічт-опосередкованою трансформацією). 2ЕМ можуть бути введені у вигляді білків 2ЕМ, у вигляді полінуклеотидів, що кодують білки ЕМ, та/або у вигляді комбінацій білків та полінуклеотидів, кодуючих білок.
І178| Мегануклеази, які зазвичай ідентифікуються у мікробів, такі як сімейство хоумінг- ендонуклеаз ГАСГІЮАЮОС, є унікальними ферментами з високою активністю та довгими послідовностями розпізнавання (» 14 п.о.), що призводить до сайт-специфічного розщеплення цільової ДНК. Сконструйовані версії мегануклеаз, що зустрічаються в природі, зазвичай мають подовжені послідовності розпізнавання ДНК (наприклад, від 14 до 40 п.о.). Відповідно до деяких варіантів реалізації винаходу, мегануклеаза може містити каркасний або основний фермент, вибраний з групи, що складається з І-Стеї, І-Сеці, І-Мв5ої, І-5сеї, І-Апії ї І-ЮОтої. Конструювання мегануклеаз може бути більш складним, ніж 2ЕМ та ТАГЕМ, тому що функції розпізнавання й розщеплення ДНК мегануклеазами тісно пов'язані в одному домені. Спеціалізовані способи мутагенезу та скринінгу високої продуктивності були застосовані для створення нових варіантів мегануклеази, які розпізнають унікальні послідовності й мають поліпшену нуклеазну активність.
Таким чином, мегануклеаза може бути обрана або сконструйована для зв'язування з геномною цільовою послідовністю в рослині, наприклад, в геномному локусі гена оксидази СА або біля нього. В одному аспекті спосіб та/або композиція, надані в цьому документі, включають одну або більше, дві або більше, три або більше, чотири або більше, або п'ять або більше мегануклеаз. В іншому аспекті мегануклеаза, представлена в цьому документі, здатна генерувати цільовий ДЛР. В одному аспекті вектори, що містять полінуклеотиди, що кодують одну або більше, дві або більше, три або більше, або чотири або більше, або п'ять або більше мегануклеаз надаються клітині за допомогою способів трансформації, відомих в цій галузі техніки (наприклад, без обмежень, вірусною трасфекцією, бомбардуванням частинками, ПЕГ- опосередкованою трансфекцією протопласту або Адгорасіегіит-опосередкованою трансформацією).
І179| ТАСГЕМ є штучними ферментами рестрикції, що отримані шляхом злиття ДНК- зв'язуючого домену ефектора, подібного активаторам транскрипції (ТАГЕ) з нуклеазним доменом (наприклад, РОКІ). Коли кожен член пари ТАГЕМ зв'язується з сайтами ДНК, що фланкують цільовий сайт, мономери РОКІ димеризуються та викликають розрив дволанцюгової
Зо ДНК в цільовому сайті. Крім домену розщеплення БоКІ дикого типу, варіанти домену розщеплення РОКІ з мутаціями були розроблені для поліпшення специфічності розщеплення та активності розщеплення. Домен ЕБоКкІ функціонує як димер, потребуючи двох конструкцій з унікальними ДНК-зв'язуючими доменами для сайтів в цільовому геномі з правильною орієнтацією та відстанню. Як кількість амінокислотних залишків між ДНК-зв'язуючим доменом
ТАСГЕМ та доменом розщеплення БоК!І так і кількість основ між двома окремими сайтами зв'язування ТАГ ЕМ є параметрами для досягнення високих рівнів активності. 180 ТАГЕМ є штучними ферментами рестрикції що отримані шляхом злиття ДНК- зв'язуючого домену ефектора, подібного активаторам транскрипції (ТАГЕ) з нуклеазним доменом. У деяких аспектах нуклеаза обрана з групи, що складається з РуціЇ, МиїН, Темі, ЕоКІ,
АМІ, МІМІ, БИ, БааІ, 515І, СіеСОмЕ, Сіо051 та Рері071. Коли кожен член пари ТАГЕМ зв'язується з сайтами ДНК, що фланкують цільовий сайт, мономери ЕоКІ димеризуються та викликають розрив дволанцюгової ДНК в цільовому сайті. Термін ТАГЕМ, що застосовується в цьому документі, є широким за значенням та включає мономерний ТАГЕМ, який може розщеплювати дволанцюгову ДНК без допомоги іншого ТАГЕМ. Термін ТАГЕМ також відноситься до одного або обох членів пари ТАГ ЕМ, які працюють разом для розщеплення ДНК в одному й тому ж сайті. 1811 Ефектори, подібні активаторам транскрипції (ТА Е-ігапзстгірійоп асіїмайог-їКе енесіог), можуть бути сконструйовані так, щоб зв'язувати практично будь-яку послідовність ДНК, наприклад, у геномному локусі гена оксидази СА в рослині або біля нього. ТАЇЕ має центральний ДНК-зв'язуючий домен, що складається з 13-28 повторних мономерів 33-34 амінокислот. Амінокислоти кожного мономера висококонсервативні, за винятком гіперваріабельних амінокислотних залишків в положеннях 12 та 13. Дві варіабельні амінокислоти називаються повторюваними варіабельними дизалишками (КУО-гереаї-хапабіе дігехідце). Амінокислотні пари МІ, МО, НО та ММ КМО переважно розпізнають аденін, тимін, цитозин та гуанін/аденін відповідно, а модуляція КМО може розпізнавати послідовні основи
ДНК. Цей простий зв'язок між амінокислотною послідовністю та розпізнаванням ДНК дозволив створити специфічні ДНК-зв'язуючі домени шляхом вибору комбінації повторюваних сегментів, що містять відповідні ЕМО. 11821 Крім домену розщеплення ЕБоКІ дикого типу, варіанти домену розщеплення РОКІ з бо мутаціями були розроблені для поліпшення специфічності розщеплення та активності розщеплення. Домен ЕРоКкІ функціонує як димер, потребуючи двох конструкцій з унікальними
ДНК-зв'язуючими доменами для сайтів в цільовому геномі з правильною орієнтацією та відстанню. Як кількість амінокислотних залишків між ДНК-зв'язуючим доменом ТАЇЕМ та доменом розщеплення ЕоКіІ так і кількість основ між двома окремими сайтами зв'язування
ТАГЕМ є параметрами для досягнення високих рівнів активності. Домени розщеплення Рмції,
Ми і Темі сіеауаде є корисними альтернативами варіантів РОКІ і РОКІ для застосування з ТАЇ Е.
Рмучі! функціонує як високоспецифічний домен розщеплення, коли з'єднаний з ТАГЕ (див., Хапк та співавт., 2013 рік. РГо5 Опе. 8:е82539). МиШїН здатний вводити специфічні для ланцюга одноланцюгові розриви в ДНК (див., сабрзаїййоОм/ та співавт., 2013 рік. Мисієїс Асіаб5 Кезеагспй. 41:е83). Темі вводить дволанцюгові розриви в ДНК в цільових сайтах (див., Вешигаєїєу та співавт., 2013 рік. Маїшге Соттипісайопв5. 4:1762). (183) Взаємозв'язок між амінокислотною послідовністю та розпізнаванням ДНК зв'язуючого домену ТАГЕ дозволяє конструювати білки. Програмні забезпечення, такі як ОМА Умогк5, можуть застосовуватися для розробки конструкцій ТАГЕ. Інші способи конструювання конструкцій ТАГЕ відомі фахівцям в цій галузі техніки. Див., ОоуЇе та співавт., Мисівеіс Асід5 Кезеагсп (2012 рік) 40:М/117-122; Септак та співавт., Мисіеіс Асій5 Кезеагсп (2011 рік). 39:е82; і аїв- пі.сас.согпеїІ.еди/ароці. В одному аспекті спосіб та/або композиція, надані в цьому документі, включають один або більше, два або більше, три або більше, чотири або більше, або п'ять або більше ТАГЕМ. В іншому аспекті ТАГ ЕМ, представлений в цьому документі, здатний генерувати цільовий ДЛР. В одному аспекті вектори, що містять полінуклеотиди, що кодують один або більше, два або більше, три або більше, або чотири або більше, або п'ять або більше ТАГЕМ надаються клітині за допомогою способів трансформації, відомих в цій галузі техніки (наприклад, без обмежень, вірусною трансфекцією, бомбардуванням частинками, ПЕГ- опосередкованою трансфекцією протопласту або Адгорасіегіит-опосередкованою трансформацією). Див., наприклад, заявки на патент США Мо 2011/0145940, 2011/0301073 та 2013/0117869, зміст й опис яких включені в цей документ за допомогою посилання. 184) В цьому документі термін "цільовий метод редагування генома" стосується будь-якого способу, протоколу або методу, які дозволяють здійснювати точне та/або цільове редагування певного місця розташування в геномі рослини (тобто, редагування в значній мірі або повністю
Зо не випадковим чином) із застосуванням сайт-специфічної нуклеази, такої як мегануклеаза, нуклеаза з цинковими пальцями (2ЕМ), направлена РНК ендонуклеаза (наприклад, система
СКІБРЕ/Са59), ендонуклеаза ТАГЕ (ТАГЕМ), рекомбіназа або транспозаза. В цьому документі термін "редагування" або "редагування геному" стосується створення цільової мутації, делеції, інверсії або заміни щонайменше 1, щонайменше 2, щонайменше 3, щонайменше 4, щонайменше 5, щонайменше 6, щонайменше 7, щонайменше 8, щонайменше 9, щонайменше 10, щонайменше 15, щонайменше 20, щонайменше 25, щонайменше 30, щонайменше 35, щонайменше 40, щонайменше 45, щонайменше 50, щонайменше 75, щонайменше 100, щонайменше 250, щонайменше 500, щонайменше 1000, щонайменше 2500, щонайменше 5000, щонайменше 10000 або щонайменше 25000 нуклеотидів послідовності нуклеїнової кислоти ендогенного геному рослини. В цьому документі термін "редагування" або "редагування геному" також охоплює цільову вставку або сайт-спрямовану інтеграцію щонайменше 1, щонайменше 2, щонайменше 3, щонайменше 4, щонайменше 5, щонайменше 6, щонайменше 7, щонайменше 8, щонайменше 9, щонайменше 10, щонайменше 15, щонайменше 20, щонайменше 25, щонайменше 30, щонайменше 35, щонайменше 40, щонайменше 45, щонайменше 50, щонайменше 75, щонайменше 100, щонайменше 250, щонайменше 500, щонайменше 750, щонайменше 1000, щонайменше 1500, щонайменше 2000, щонайменше 2500, щонайменше 3000, щонайменше 4000, щонайменше 5000, щонайменше 10000 або щонайменше 25000 нуклеотидів в ендогенному геномі рослини. "Редагування" або "геномне редагування" в однині відноситься до однієї такої цільової мутації, делеції, інверсії, заміни або вставки, тоді як
БО "редагування" або "геномні редагування" відноситься до двох або більше цільової мутації(мутацій), делеції(делецій), інверсії(інверсій), заміни(замін) та/або вставки(вставок), причому кожне "редагування" вводиться за допомогою цільового методу редагування генома. 185| З огляду на те, що супресія генів оксидази 3 (А20, оксидази 4 СА20 та/або оксидази 5 СА20 в кукурудзі призводить до утворення рослин з меншою висотою та довжиною міжвузля на додаток до інших корисних ознаках, передбачається, що експресія одного або більше з цих генів може бути зменшена або усунена шляхом геномного редагування одного або більше цього гену(ів) з метою забезпечення подібних корисних ознак для рослин кукурудзи.
Додатково, з огляду на те, що конститутивна експресія конструкцій супресії, націлених на ці гени оксидази СА20, продукує рослини кукурудзи, що володіють корисними ознаками низького зросту 60 без відхилень у початку, та що експресія безпосередньо в репродуктивних тканинах початку також не призводить до появи репродуктивних відхилень, передбачається, що один або більше з цих генних локусів можуть бути відредаговані з метою нокдауну або нокауту їх експресії для отримання подібних ефектів у рослин кукурудзи. Підходи редагування цільових генів можуть бути застосовані для модифікації послідовності промотора та/або регуляторної області(ей) одного або більше генів оксидази З СБА20, оксидази 4 СА20 та/або оксидази 5 СА20 з метою нокдауну або нокауту експресії цього гена(ів), наприклад, за допомогою цільових делецій, вставок, мутацій або інших змін послідовності. Дійсно, промотор та/або регуляторна область) або послідовність(послідовності), або 5-НТО, З'НТО, та/або інтронна послідовність(послідовності) одного або більше генів оксидази З СА20, оксидази 4 БА20 та/або оксидази 5 (ЗА20 можуть бути в значній мірі видалені або мутовані. В альтернативному варіанті, все або частина кодуючої (екзон), 5'-НТО, З'НТО та/або інтронної послідовності(ей) одного або більше генів оксидази З СЗА20, оксидази 4 ЗА20 та/або оксидази 5 СА20 можуть бути редаговані, видалені, мутовані або іншим чином модифіковані для нокдауну або нокауту експресії, або активності цього генай(ів). Такі цільові модифікації в локусах генів оксидази З
СА20 оксидази 4 БА20 та/або оксидази 5 СБА20 можуть бути досягнуті із застосуванням будь- якої зручної технології редагування геному, відомої в цій галузі техніки, наприклад, шляхом відновлення дволанцюгового розриву (ДЛР) або одноланцюгового розриву, введеного сайт- специфічною нуклеазою, такою як, наприклад, нуклеаза з цинковими пальцями, сконструйована або нативна мегануклеаза, ТА Е-ендонуклеаза або направлена РНК ендонуклеаза (наприклад,
Са59 або Ср). Таке відновлення ДЛР або одноланцюгового розриву може привести до спонтанних або стохастичним делецій, додавань, мутацій та тому подібного, в цільовому сайті, де був введений ДЛР або одноланцюговий розрив, або репарація сайту може включати застосування молекули донорної матриці з метою направити або викликати бажану або специфічну делецію, додавання, мутацію тощо, в цільовому сайті. (186) Як зазначено в цьому документі, рослина, трансформована молекулою рекомбінантної
ДНК або вектором для трансформації, що містять трансген, кодуючий послідовність ДНК, придатну для транскрипції, яка кодує некодуючу молекулу РНК, яка націлена на ендогенний ген оксидази СА для супресії, може включати різні однодольні рослини або зернові рослини, такі як кукурудза та інші однодольні або зернові рослини, які мають окремі чоловічі та жіночі квітки
Зо (аналогічно кукурудзі) і, таким чином, можуть бути сприйнятливі до відхилень в жіночих репродуктивних органах, структурах або тканинах з мутаціями в шляху СА. 187) Ці композиції та способи можуть бути додатково застосовні до інших зернових рослин, які виграли б від зменшеної висоти рослини та/або підвищеної стійкості до вилягання. Такі рослини можуть бути трансформовані молекулами або конструкціями рекомбінантної ДНК для супресії одного або більше ендогенних генів оксидази СА20 та/або САЗ в рослині відповідно до способів та підходів, представлених в цьому документі, з метою отримання зернової рослини, яка може бути коротша та/або стійкою до вилягання. Дійсно, зернова рослина, що ектопічно експресує послідовність ДНК, придатну для транскрипції, яка кодує некодуючу молекулу РНК, яка націлена на ендогенний ген оксидази СА для супресії, може мати безліч корисних ознак, таких як нижчий зріст або висоту рослини, коротшу довжину міжвузля, збільшений діаметр стебла, поліпшену стійкість до вилягання, на додаток до інших поліпшених ознак, пов'язаних з врожайністю та/або стійкістю до посухи, як передбачено в цьому документі, стосовно рослини дикого типу або контрольної рослини, що не має послідовності трансгену або ДНК, що транскрибується. Як описано додатково нижче, рослини зернових культур, які вже були модифіковані з метою збільшення врожайності та стійкості до вилягання за допомогою мутацій в шляху СА, такі як пшениця, рис, просо, ячмінь та сорго, можуть замість цього трансформуватися молекулою або конструкцією рекомбінантної ДНК як передбачено в цьому документі. На відміну від багатьох мутацій шляху СА в цих культурах, які можуть бути рецесивними, трансгенні конструкції, які експресують елемент супресії, націлений на ендогенний біосинтетичний ген оксидази СА в цих культурах, можуть бути домінантними, навіть якщо вони гемізиготні або присутні в рослині у вигляді єдиної копії. Таким чином, рослини, які можуть бути трансформовані молекулою рекомбінантної ДНК або конструкцією, що експресує конструкцію супресії, можуть потенційно включати різні однодольні або зернові культури.
Наявність домінантного трансгенного локусу, що викликає напівкарликовий, стійкий до вилягання фенотип може бути бажаним та кращим у порівнянні з рецесивним мутантним алелем для того ж фенотипу через переваги в селекції та інтеграції ознак. 1188) Відповідно до варіантів реалізації цього винаходу додатково пропонується, щоб гени оксидази СА в інших рослинах зернових, що мають найбільшу ідентичність/подібність послідовностей з генами оксидази З (ЗА20, оксидази 4 СЗА20, оксидази 5 СА20, оксидази 1 бо САЗ та/або оксидази 2 БАЗ в кукурудзі, які як показано цьому документі, викликають фенотип короткого зросту, напівкарликовість та інші корисні ознаки при супресії за допомогою конструкції рекомбінантної ДНК для супресії, також можуть бути цілями для супресії з метою отримання трансгенних рослин зернових, які мають подібні фенотипи напівкарликовості та/або стійкості до вилягання. У Таблиці З представлено список генів оксидази СА з інших зернових рослин (сорго - зогупит бісоїог; рис - Огула займа; просо італійське - 5еїагіа Маїїса; пшениця - Тийсит аевіїмит; та ячмінь - Ногдецт миЇдаге), що мають високий ступінь ідентичності послідовності 3 одним з генів оксидази СА в кукурудзі, який при супресії призводить до низькорослого, напівкарликового фенотипу.
Таблиця З
Гомологи генів оксидази СА кукурудзи з інших рослин зернових культур
Назва гена Вид зернової Гомолог в (ЗЕО о (вЕО о (БО о Геномний культури кукурудзі МО МО МО (ЗЕО ІЮ МО) апАгО
САго Зоглит Ох 3З/аАгО | ва 85 87 оксидаза 2 рісоїог Ох 5
САгО пА2гО Зеїагіа
Ох 5 апАгО оксидаза 2 заїма
Ох 5 ці апАгО аСАгОо Тийсит Ох З/бАгО 97 оксидаза-02 аевзімит
Ох 5
Ногдеит СіАго диоксигеназа Ге2О00 Ох З/йАг20 100 101 мУцЇдаге Ох 5 флавонолсинтаза/флаванон | Зеїата и З-гідроксилазоподібна паса сАго ох 4 106 107 108 109 нарінгенін, 2-оксоглутарат 3-| Огуга диоксигеназа вайуа сСАгО ОХ 4 110 111 112 113 аевімит мУцїдаге
САЗ
САЗ-бета- ЗогпИт Ох /бАЗ | 4490) 420 | 124 122 диоксигеназа 2-2 рісоЇог
Ох 2 . САЗ сАЗ-бета- Зеїагіа ркдема
САЗ
САЗ бета- Огуга Ох Л/БАЗ | 427. | 128 | 129 130 диоксигеназа 2-3 займа
Ох 2
САЗ
САЗ-бета- Ногіеит Ох біз | 4310 | 132 | 133 гідроксилаза мУцЇдаге
Ох 2 ці САЗ бАЗох- ТИбсит Ох о/бідЗ | 434 | 435 | 136 137 рг2 білок аевіїмит
Ох 2
І189| Відповідно до іншого аспекту цього винаходу, молекула, вектор або конструкція рекомбінантної ДНК надана для супресії ендогенного гена оксидази СА (або оксидаза-подібного
СА) у зерновій рослині, причому молекула, вектор або конструкція рекомбінантної ДНК, містять послідовність ДНК, придатну для транскрипції, яка кодує некодуючу молекулу РНК, при цьому некодуюча молекула РНК містить послідовність, яка є (ї) щонайменше на 80 95, щонайменше на 85956, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 96, щонайменше на 98595, щонайменше на 9995, щонайменше на 99,595 або 100 95 комплементарною, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам будь-якого одного або більше з ЗЕО ІЮ МО: 84, 85, 87, 88, 89, 91, 92, 93, 95, 96, 98, 99, 100, 102, 103, 105, 106, 107, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 119, 120, 122, 123, 124, 126, 127, 128, 130, 131, 132, 134, 135 та/або 137, та/або (ії) щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 965, щонайменше на 9895, щонайменше на 99595, щонайменше на 99,595 або 10095 комплементарною, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам молекули мРНК, що кодує білок в зерновій рослині, який є, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 956, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 965, щонайменше на 97 95, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або 100 95 ідентичним будь-якій одній або більше з БЕО ІЮО МО: 86, 90, 94, 97, 101, 104, 108, 112, 116, 118, 121, 125, 129, 133 та/або 136. Аналогічно, некодуюча молекула РНК може націлюватися на ендогенний ген оксидази СА (або оксидаза-подібного СА) у зерновій рослині, що має процентну ідентичність з геном(ами) оксидази СА, який, як показано, впливає на висоту рослини кукурудзи. Таким чином, додатково надається некодуюча молекула РНК, що містить послідовність, яка є, щонайменше на 8095, щонайменше на 8595, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 96, щонайменше на 98 965, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або 100 95 комплементарною, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам молекули мРНК, що кодує ендогенний білок у зерновій рослині, який є, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 965, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або 100 95 ідентичним будь-якій одній чи більше з 5ЕО ІЮ МО: 9, 12, 15, 30 та/або 33. Як згадано вище, що некодуюча молекула РНК може націлюватися на послідовність екзона, інтрона та/або НТО гена оксидази
СА (або оксидаза-подібного СА). 190) Крім того, надані способи введення або трансформації в рослину, зерно, частину рослини або клітину рослини будь-якої з вищезазначених конструкцій, векторів або конструкцій відповідно до будь-яких із способів, описаних в цьому документі, які можуть бути сконструйовані будь-яким підходящим способом, описаним в цьому документі, включаючи різні укладки або спільні розташування, що націлюються, а також модифіковані зернові рослини, частини рослин, тканини рослин і клітини рослин, отримані таким чином та/або такі, що містять будь-яку таку молекулу, вектор або конструкцію рекомбінантної ДНК. Оскільки некодуюча молекула РНК, що експресується з вищевказаних конструкцій, буде сконструйована для націлювання на ендогенний ген оксидази СА, рослина зерна, трансформована такими молекулами, векторами або конструкціями рекомбінантної ДНК, має переважно відповідати виду походження для цільової послідовності або близькоспорідненим видам, штамам, зародковим плазмам, лініям тощо. Наприклад, конструкція супресії комплементарна 5ЕБО ІО МО: 84, повинна застосовуватися для трансформації рослини сорго, такої як рослина Зогопйит бісоЇог або, можливо, споріднених видів сорго, штамів тощо, які, як очікується, будуть мати
БО близькоспоріднену або подібну послідовність гена оксидази СА (або оксидаза-подібного СА).
І191| Геномні послідовності для кожного із зазначених вище генів з рослин зернових додатково представлені в Таблиці 3, і можуть бути застосовані для націлювання цих генів для редагування генома відповідно до будь-яких відомих методів. Будь-яка сайт-специфічна нуклеаза та спосіб можуть бути застосовані, як описано в цьому документі, для створення ДЛР або одноланцюгового розриву для гена в геномному локусі або біля нього, який може бути репарований неідеально або за допомогою опосередкованої матрицею рекомбінації з метою створення мутацій тощо, в гені або біля нього. Відповідні нуклеази можуть бути обрані з групи, що складається з нуклеази с цинковими пальцями (2ЕМ), мегануклеази, РНК-спрямованої ендонуклеази, ТАЇЕ-ендонуклеази (ТАЇГЕМ), рекомбінази, транспозази або будь-якої їх 60 комбінації. Для РНК-спрямованої ендонуклеази може бути застосована конструкція або вектор рекомбінантної ДНК, що містять направляючу РНК, для направлення нуклеази в цільовий сайт.
Відповідно, направляюча РНК для редагування гена оксидази СА (або оксидаза-подібного СА) у зерновій культурі може містити направляючу послідовність, яка є, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 95, щонайменше на 99 95 або 100 95 ідентичною або комплементарною, щонайменше 10, щонайменше 11, щонайменше 12, щонайменше 13, щонайменше 14, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25 або більше послідовним нуклеотидам будь- якого одного або більше з ЗЕО ІО МО: 84, 85, 87, 88, 89, 91, 92, 93, 95, 96, 98, 99, 100, 102, 103, 105, 106, 107, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 119, 120, 122, 123, 124, 126, 127, 128, 130, 131, 132, 134, 135 та/або 137. Для сайт-специфічних нуклеаз, які не є РНК-спрямованими, таких як нуклеаза з цинковими пальцями (ЕМ), мегануклеаза, ТАЇ Е-ендонуклеаза (ТАГ ЕМ), рекомбіназа та/або транспозаза, специфічність геномної цілі для редагування визначається структурою білка, зокрема, його ДНК-зв'язуючим доменом. Такі сайт-специфічні нуклеази можуть бути обрані, розроблені або сконструйовані так, щоб зв'язувати та розрізати бажаний цільовий сайт в будь-якому з вищевказаних генів ЗА оксидази (або оксидаза-подібного СА) в геномі зернової рослини. Подібно трансформації за допомогою конструкції супресії, зернова рослина, трансформована певною направляючою РНК або молекулою, вектором або конструкцією рекомбінантної ДНК, що кодують направляючу РНК, переважно має бути видом, в якому існує цільова геномна послідовність або близькоспорідненим видом, штамом, зародковою плазмою, лінією тощо, так що направляюча РНК здатна розпізнавати та зв'язуватися з потрібним цільовим сайтом розрізання. 1192) Додатково надані способи введення або трансформації в зерновій рослині, частині рослини або клітині рослини будь-якої направляючої РНК, описаної вище, або будь-якої конструкції, вектора або конструкції, кодуючої таку направляючу РНК, можливо, на додаток до
РНК-спрямованої нуклеази, відповідно до будь-якого з описаних в цьому документі способів, а також модифікованим рослинам зернових, частин рослин, тканин рослин та клітинам рослин, отриманим таким чином та/або таким, що містять будь-яку таку молекулу, вектор або конструкцію рекомбінантної ДНК та/або відредагований ген оксидази СА (або оксидаза- подібного (ЗА). Модифіковані рослини зернових, що мають відредагований ген оксидази СА (або оксидаза-подібного СА) та/або елемент супресії, націлений на ген оксидази СА (або оксидаза-подібного СА), можуть мати одну або більше корисних ознак, представлених в цьому документі, таких як більш нижча висота рослини, коротша довжина міжвузля, збільшений діаметр стебла, поліпшена стійкість до вилягання та/або стійкість до посухи в порівнянні з рослиною дикого типу або контрольною рослиною, які не мають будь-якого такого елемента редагування або супресії. На додаток до редагування геному мутації в гені оксидази СА (або оксидаза-подібного (ЗА) можуть бути введені за допомогою інших методів мутагенезу, як описано в цьому документі. 193| Відповідно до іншого аспекту цього винаходу надається трансгенна рослинаци), рослинна клітина(и), насіння та частина(и) рослини, що містить подію трансформації або вставку в геном, щонайменше, однієї його рослинної клітини, при цьому подія трансформації або вставка містить послідовність, конструкцію або експресійну касету рекомбінантної ДНК, що містить послідовність ДНК, придатну для транскрипції, яка кодує некодуючу молекулу РНК, яка націлена на ендогенний ген оксидази СА з метою супресії, при цьому послідовність ДНК, що транскрибується, функціонально пов'язана з промотором придатним для експресії в рослині, таким як конститутивний, судинний та/або листовий промотор. Така трансгенна рослина може бути отримана будь-яким підходящим способом трансформації, як зазначено вище, для отримання трансгенної рослини КО, яка потім може бути самозапилена або схрещена з іншими рослинами, щоб виробляти насіння КІ та наступні покоління потомства і насіння за допомогою додаткових схрещувань тощо. Варіанти реалізації цього опису додатково включають рослинну клітину, тканину, експлантат, частину рослини тощо, що містить одну або більше трансгенних клітин, що мають подію трансформації або геномну вставку рекомбінантної ДНК або полінуклеотидної послідовності, що містить послідовність ДНК, придатну для транскрипції, яка кодує некодуючу молекулу РНК, яка націлена на ендогенний ген оксидази СА з метою супресії.
І194| Трансгенні рослини, клітини рослин, насіння та частини рослин за цим винаходом можуть бути гомозиготними або гемізиготними для трансгенної події або вставки послідовності
ДНК, що транскрибується, з метою супресії гена оксидази СА в геномі, щонайменше, однієї його рослинної клітини, або подію цільового редагування геному, рослини, клітини рослини, насіння та частини рослини відповідно до цих варіантів реалізації винаходу можуть містити будь-яку бо кількість копій такої трансгенної події(й), вставки(ок) та/або редагування(редагувань). Дозу або кількість експресії трансгенної або такої, що транскрибується послідовності ДНК можна змінювати по її зиготності та/або кількості копій, що може впливати на рівень або ступінь фенотипічних змін в трансгенній рослині тощо. Як зазначено вище, трансгенні рослини, представлені в цьому документі, можуть включати різні однодольні або зернові рослини та навіть сільськогосподарські рослини, такі як пшениця, рис і сорго, які вже мають підвищений врожай та/або стійкість до вилягання внаслідок попередніх селекційних зусиль та мутацій шляху
СА в цих рослинах. Переваги застосування трансгенної або такої, що транскрибується послідовності ДНК для експресії елемента супресії, націленого на ген біосинтетичної оксидази
СА, включають не тільки здатність обмежувати експресію тканиноспецифічним або тканинобажаним чином, але також і потенційне домінування (наприклад, домінантно-негативні ефекти) одиночної або гемізиготної копії послідовності ДНК, що транскрибується, що призводить до корисних ознак або фенотипів низькорослості, напівкарликовості у сільськогосподарських рослин. Таким чином, молекули або конструкції рекомбінантної ДНК за цим винаходом можуть бути застосовані для створення корисних ознак у безлічі однодольних або зернових рослин без відхилень із застосуванням тільки однієї копії трансгенної події, вставки або конструкції. На відміну від раніше описаних мутацій або алелів в шляху СА, які є рецесивними та вимагають, щоб рослини були гомозиготними по мутантному алелю, рослини, трансформовані СА-модифікуючими трансгенами та конструкціями супресії з цього винаходу, можуть покращувати ознаки, врожайність та зусилля по селекції, полегшуючи виробництво гібридних зернових рослин, оскільки їм потрібна тільки одиночна або гемізиготна копія трансгенної конструкції або конструкції, що супресує. 195) Відповідно до деяких варіантів реалізації винаходу трансгенна або модифікована зернова або кукурудзяна рослина, що містить трансген гена оксидази СА або послідовність
ДНК, що транскрибується, для супресії ендогенного гена оксидази СА або геномно редагованого гена оксидази СА, може бути додатково охарактеризована як така, що має одну або більше корисних ознак, таких як нижчий зріст або висота напівкарликової рослини, зменшена довжина міжвузля, збільшений діаметр стебла, поліпшена стійкість до вилягання, зменшений злам стебла, більш глибоке коріння, збільшена площа листя, більш рання зімкнутість полога, підвищений вміст води в листі та/або більш висока провідність устя в умовах
Зо обмеження води, зниження вмісту та/або площі антоціанів в листі за нормальних або стресових умов, що обмежують азот або воду, поліпшені ознаки, пов'язані з врожайністю, включаючи більший жіночий репродуктивний орган або початок, збільшення маси початку, індексу збору врожаю, врожайності, збільшення коли кількості зерна та/або збільшення маси зерна, по відношенню до рослини дикого типу або контрольної рослини. Така трансгенна зернова або кукурудзяна рослина може додатково мати підвищену стійкість до стресу, таку як підвищена стійкість до посухи, підвищене використання азоту та/або стійкість до посадки з високою щільністю. 196)| Для цілей цього опису термін "рослина" включає експлантат, частину рослини, розсаду, проросток або цілу рослину на будь-якій стадії регенерації або розвитку. В цьому документі термін "трансгенна рослина" стосується рослини, геном якого був змінений в результаті інтеграції або вставки молекули, конструкції або послідовності рекомбінантної ДНК.
Трансгенна рослина включає рослину КО розвинену або регенеровану з першопочатково трансформованої рослинної клітини(клітин), а також нащадки трансгенних рослин в більш пізніх поколіннях або схрещування з трансгенною рослиною КО. В цьому документі термін "частина рослини" може стосуватися будь-якого органу або незміненої тканини рослини, таких як меристема, орган/структура пагону (наприклад, лист, стебло або вузол), корінь, квітка або квітковий орган/структура (наприклад, верховий лист, чашолистик, пелюстка, тичинка, плодолистик, пиляк та сім'язачаток), насіння (наприклад, ембріон, ендосперм та оболонка насіння), плід (наприклад, зріла зав'язь), паросток або інші тканини рослини (наприклад, судинна тканина, епідерміс, основна паренхіма тощо) або будь-якої їх частини. Частини рослин за цим винаходом можуть бути життєздатними, нежиттєздатними, регенерованими і/або такими, що не регенеруються. "Паростком" може бути будь-яка частина рослини, яка може прорости в цілу рослину. 1971 Відповідно до цим варіантів реалізації винаходу рослинна клітина, трансформована конструкцією або молекулою, що містить послідовність ДНК, що транскрибується, з метою супресії ендогенного гена оксидази СА, або конструкцією, яка застосовується для редагування геному, може включати будь-яку рослинну клітину, яка є компетентною для трансформації, як відомо в цій галузі техніки, що заснована на способі трансформації, такою як меристемна клітина, ембріональна клітина, калусна клітина тощо. В цьому документі "трансгенна рослинна бо клітина" просто стосується будь-якої рослинної клітини, яка трансформована стабільно інтегрованою молекулою, конструкцією або послідовністю рекомбінантної ДНК. Трансгенна рослинна клітина може включати спочатку трансформовану рослинну клітину, трансгенну рослинну клітину регенерованої або розвиненої рослини КО, трансгенну рослинну клітину, що культивована з іншої трансгенної рослинної клітини, або трансгенну рослинну клітину з будь- якої спадкової рослини або нащадка трансформованої рослини КО, включаючи клітину(и) насіння рослини або ембріона, або культивовану рослинну клітину, клітину калусу тощо.
М198| Варіанти реалізації цього опису додатково включають способи створення або отримання трансгенних або модифікованих рослин, такі як трансформація, редагування генома, схрещування тощо, при цьому спосіб включає введення молекули, конструкції або послідовності рекомбінантної ДНК, що містить трансген оксидази (А або послідовність ДНК, що транскрибується, для супресії ендогенного гена оксидази СА в клітині рослини або редагування геномного локусу ендогенного гена оксидази СА, а потім регенерацію або розвиток трансгенної або модифікованої рослини з трансформованої або редагованої рослинної клітини, що може бути виконано під тиском відбору на користь трансгенної події. Такі способи можуть включати трансформацію клітини рослини молекулою, конструкцією або послідовністю рекомбінантної
ДНК, що містить послідовність ДНК, що транскрибується, для супресії ендогенного гена оксидази СА та відбір рослини, що має один або більше змінених фенотипів або ознак, таких як один або більше з таких ознак на одній або більш стадіях розвитку: нижчий зріст або висота напівкарликової рослини, зменшена довжина міжвузля в одному або більше міжвузлі(ях), збільшений діаметр стебла, покращена стійкість до вилягання, зменшений злам стебла, глибше коріння, збільшена площа листя, більш рання зімкнутість полога, підвищений вміст води в листі та/або більш висока провідність устя в умовах обмеження води, зниження вмісту та/або площі антоціанів в листі в нормальних або стресових умовах, що обмежують азот або воду, покращені ознаки, пов'язані з врожайністю, включаючи більший жіночий репродуктивний орган або початок, збільшення маси початку, індексу збору врожаю, врожайності, збільшення кількості зерна та/або збільшення маси зерна, підвищена стійкість до стресу, така як підвищена стійкість до посухи, підвищене використання азоту та/або підвищена стійкість до посадки з високою щільністю в порівнянні з рослиною дикого типу або контрольною рослиною. 1199) Відповідно до іншого аспекту цього винаходу запропоновані способи для посадки
Зо модифікованої або трансгенної рослини(рослин), представлених в цьому документі, з нормальною/стандартною або високою щільністю посадки в полі. Відповідно до деяких варіантів реалізації винаходу врожай культурної рослини на гектар (або на площу землі) може бути збільшений шляхом посадки модифікованої або трансгенної рослини(рослин) за цим винаходом з більш високою щільністю посадки в полі. Як описано в цьому документі, модифіковані або трансгенні рослини, які експресують послідовність ДНК, придатну для транскрипції, яка кодує некодуючу молекулу РНК, націлену на ендогенний ген оксидази СА з метою супресії, або мають редагований ген оксидази СА, можуть мати зменшену висоту рослини, більш коротке міжвузля, збільшений діаметр стебла та/або підвищену стійкість до вилягання. Передбачається, що модифіковані або трансгенні рослини можуть переносити умови посадки з високою щільністю, оскільки збільшення діаметра стебла може протистояти виляганню, а коротша висота рослини може забезпечувати підвищену проникність світла для нижнього листя в умовах посадки з високою щільністю. Таким чином, модифіковані або трансгенні рослини, представлені в цьому документі, можуть бути посаджені з більш високою щільністю з метою збільшення врожайності з гектара (або площі землі) в полі. Для просапних культур більш висока щільність посадки може бути досягнута шляхом висадки більшої кількості насіння/рослин на довжину ряду та/або шляхом зменшення відстані між рядами.
І200| Відповідно до деяких варіантів реалізації винаходу модифікована або трансгенна рослина може бути посаджена з щільністю в полі (кількість рослин на площу землі/поля), яка є, щонайменше на 5 то, 10 то, 15 то, 20 то, 25 то, 50 Зо, 75 9о, 100 то, 125 то, 150 то, 175 то, 200 то, 225595 або 25095 вище, ніж нормальна щільність посадки для цієї сільськогосподарської рослини відповідно до стандартної агрономічної практики. Модифікована або трансгенна рослина може бути посаджена з щільністю посадки в полі щонайменше 93 480 рослин на гектар, щонайменше 98 400 рослин на гектар, щонайменше 103 320 рослин на гектар, щонайменше 108 240 рослин на гектар, щонайменше 110 700 рослин на гектар, щонайменше 113 160 рослин на гектар, щонайменше 118 080 рослин на гектар, щонайменше 123 000 рослин на гектар, щонайменше 127 920 рослин на гектар, щонайменше 132 840 рослин на гектар або щонайменше 137 760 рослин на гектар. Наприклад, рослини кукурудзи можуть бути посаджені з більш високою щільністю посадки, наприклад, в діапазоні від близько 93 480 рослин на гектар до близько 147 600 рослин на гектар або від близько 98 400 рослин на гектар до близько 142 60 680 рослин на гектар, або від близько 103 320 рослин на гектар до близько 142 680 рослин на гектар, або від близько 98 400 рослин на гектар до близько 110 700 рослин на гектар, або від близько 110 700 рослин на гектар до близько 123 000 рослин на гектар, або від близько 123 000 рослин на гектар до близько 142 680 рослин на гектар, або від близько 127 920 рослин на гектар до близько 137 760 рослин на гектар, або близько 93 480 рослин на гектар, близько 103 320 рослин на гектар, близько 113 160 рослин на гектар або близько 118 080 рослин на гектар, близько 123 000 рослин на гектар або близько 127 920 рослин на гектар, або близько 132 840 рослин на гектар, на відміну від стандартного діапазону щільності посадки, наприклад, від близько 44 280 рослин на гектар до близько 93 480 рослин на гектар.
І201| Відповідно до варіантів реалізації цього опису пропонується модифікована рослина(и) кукурудзи, які включають (ї) висоту рослини менш ніж 2000 мм, менш ніж 1950 мм, менш ніж 1900 мм, менш ніж 1850 мм, менш ніж 1800 мм, менш ніж 1750 мм, менш ніж 1700 мм, менш ніж 1650 мм, менш ніж 1600 мм, менш ніж 1550 мм, менш ніж 1500 мм, менш ніж 1450 мм, менш ніж 1400 мм, менш ніж 1350 мм, менш ніж 1300 мм, менш ніж 1250 мм, менш ніж 1200 мм, менш ніж 1150 мм, менш ніж 1100 мм, менш ніж 1050 мм або менше ніж 1000 мм та/або (ії) середній діаметр стебла щонайменше 18 мм, щонайменше 18,5 мм, щонайменше 19 мм, щонайменше 19,5 мм, щонайменше 20 мм, щонайменше 20,5 мм, щонайменше 21 мм, щонайменше 21,5 мм та щонайменше 22 мм. Іншими словами, пропонується модифікована рослина(и) кукурудзи, які мають висоту рослин менш ніж 2000 мм, менш ніж 1950 мм, менш ніж 1900 мм, менш ніж 1850 мм, менш ніж 1800 мм, менш ніж 1750 мм, менш ніж 1700 мм, менш ніж 1650 мм, менш ніж 1600 мм, менш ніж 1550 мм, менш ніж 1500 мм, менш ніж 1450 мм, менш ніж 1400 мм, менш ніж 1350 мм, менш ніж 1300 мм, менш ніж 1250 мм, менш ніж 1200 мм, менш ніж 1150 мм, менш ніж 1100 мм, менш ніж 1050 мм або менше ніж 1000 мм та/або середній діаметр стебла більше 18 мм, більше 18,5 мм, більше 19 мм, більше 19,5 мм, більше 20 мм, більш 20,5 мм, більше 21 мм, більше 21,5 мм або більше 22 мм. Будь-яка така ознака або діапазон висоти рослини, виражається в міліметрах (мм), може бути перетворена в іншу одиницю виміру на основі відомих перетворень (наприклад, один дюйм дорівнює 2,54 см або 25,4 міліметра, а міліметри (мм), сантиметри (см) та метри (м) відрізняються тільки на одну або більше ступенів від десяти).
Таким чином, будь-яке вимірювання, представлене в цьому документі, додатково описано в термінах будь-яких інших порівнянних одиниць вимірювання відповідно до відомих та
Зо встановлених перетворень. Однак точна висота рослини та/або діаметр стебла модифікованої рослини кукурудзи можуть залежати від навколишнього середовища та генетичного фону.
Таким чином, зміна висоти рослини та/або діаметра стебла модифікованої рослини кукурудзи замість цього може бути описана в термінах мінімальної різниці або процентної зміни відносно контрольної рослини. Модифікована рослина кукурудзи може додатково містити, щонайменше, один початок, який по суті не містить чоловічих репродуктивних тканин або структур, або інших відхилень. (2021 Відповідно до варіантів реалізації цього винаходу запропоновані модифіковані рослини кукурудзи, які мають висоту рослини на пізніх вегетативних та та/або репродуктивних стадіях розвитку (наприклад, на стадії КЗ) від 1000 мм до 1800 мм, від 1000 мм до 1700 мм, від 1050 до 1700 мм, від 1100 до 1700 мм, від 1150 до 1700 мм, від 1200 до 1700 мм, від 1250 до 1700 мм, від 1300 до 1700 мм, від 1350 до 1700 мм, від 1400 мм до 1700 мм, від 1450 мм до 1700 мм, від 1000 мм до 1500 мм, від 1050 мм до 1500 мм, від 1100 мм до 1500 мм, від 1150 мм до 1500 мм, від 1200 мм до 1500 мм, від 1250 мм до 1500 мм, від 1300 до 1500 мм, від 1350 до 1500 мм, від 1400 до 1500 мм, від 1450 до 1500 мм, від 1000 до 1600 мм, від 1100 до 1600 мм, від 1200 мм до 1600 мм, від 1300 до 1600 мм, від 1350 до 1600 мм, від 1400 до 1600 мм, від 1450 мм до 1600 мм, від 1000 мм до 2000 мм, від 1200 мм до 2000 мм, від 1200 мм до 1800 мм, від 1300 мм до 1700 мм, від 1400 мм до 1700 мм, від 1400 мм до 1600 мм, від 1400 мм до 1700 мм, від 1400 до 1800 мм, від 1400 до 1900 мм, від 1400 до 2000 мм або від 1200 до 2500 мм, та/або середній діаметр стебла від 17,5 до 22 мм, від 18 мм до 22 мм, від 18,5 до 22 мм, від 19 до 22 мм, від 19,5 до 22 мм, від 20 до 22 мм, від 20,5 до 22 мм, від 21 до 22 мм, від 21,5 до 22 мм, від 17,5 до 21 мм, від 17,5 до 20 мм, від 17,5 до 19 мм, від 17,5 до 18 мм, від 18 до 21 мм, від 18 до 20 мм або від 18 мм до 19 мм. Модифікована рослина кукурудзи може по суті не містити відхилень, таких як чоловічі репродуктивні тканини або структури в одному або більше початках модифікованої рослини кукурудзи. (203) Відповідно до варіантів реалізації цього винаходу представлені модифіковані рослини кукурудзи, які мають (ї) висоту рослини, яка є, щонайменше на 5 96, щонайменше на 10 95, щонайменше на 15 95, щонайменше на 20 95, щонайменше на 25 95, щонайменше на 30 95, щонайменше на 3595, щонайменше на 40 956, щонайменше на 45 95, щонайменше на 50 95, щонайменше на 55 95, щонайменше на 60 95, щонайменше на 65 95, щонайменше на 70 95 або бо щонайменше на 75 95 менше, ніж висота рослини дикого типу або контрольної рослини та/або бо
(ії) діаметр стебла, який є, щонайменше на 5 95, щонайменше на 10 95, щонайменше на 15 95, щонайменше на 20 95, щонайменше на 25 95, щонайменше на 30 95, щонайменше на 35 965, щонайменше на 40 95, щонайменше на 45 95, щонайменше на 50 95, щонайменше на 55 95, щонайменше на 60 95, щонайменше на 65 956, щонайменше на 70 95, щонайменше на 75 965, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95 або щонайменше на 100 95 більше діаметра стебла рослини дикого типу або контрольної рослини.
Відповідно до варіантів реалізації цього винаходу модифікована рослина кукурудзи може мати зменшену висоту рослини, яка є не більше ніж на 20 95, 25 95, 30 Ус, 35 95, 40 9, 45 95, 50 Об, 5595 або 60 95 коротшою, ніж висота рослини дикого типу або контрольної рослини, та/або діаметр стебла, який є менш ніж (або не більше ніж) на 10 95, 15 95, 20 95, 25 95, З0 9Уо, 35 Об, 40 У, 45 90, 50 9, 55 90, 60 95, 65 Зо, 70 9, 75 У, 80 95, 85 У, 90 У, 95 95 або 100 95 більшим, ніж діаметр стебла рослини дикого типу або контрольної рослини. Наприклад, модифікована рослину може мати (ї) висоту рослини, яка є щонайменше на 10 95, щонайменше на 15 95 або щонайменше на 20 95 менше або коротше (тобто коротше більш ніж або рівно на 10 95, 15 95 або 20 95), але не більше ніж на 50 95 коротше, ніж у рослини дикого типу або контрольної рослини, та/або (ії) діаметр стебла, який є, щонайменше на 5 95, щонайменше на 10 95 або щонайменше на 15 95 більше, але не більше ніж на 30 95, 35 95 або 40 95 більше, ніж у рослини дикого типу або контрольної рослини. За визначенням, фрази "цонайменше на 20 95 коротше" та "коротше більш ніж або рівно на 20 95" виключають, наприклад, на 10 95 коротше. Аналогічно, за визначенням, фраза "не більше ніж на 50 95 коротше" виключає на 60 95 коротше; фраза "щонайменше на 5 95 більше" виключає на 2 95 більше; та фраза "не більше ніж на 30 95 більше" виключає на 40 95 більше. (204) Відповідно до варіантів реалізації цього винаходу представлені модифіковані рослини кукурудзи, які мають висоту від 5 95 до 75 95, від 595 до 50 95, від 10 95 до 70 905, від 10 95 до 65 95, від 10 95 до 60 Об, від 10 95 до 55 9б, від 10 95 до 50 905, від 10 95 до 45 Об, від 10 95 до 40 95, від 10 95 до 35 95, від 10 95 до 30 95, від 10 95 до 25 95, від 10 95 до 20 9б, від 10 95 до 15 95, від 10 95 до 10 9б, від 10 95 до 75 Об, від 25 95 до 75 90, від 10 95 до 50 95, від 20 95 до 50 Об, від 25 95 до 50 95, від 30 95 до 75 95, від 30 95 до 50 95, від 25 95 до 50 95, від 15 95 до 50 905, від 20 95 до 50 95, від 25 95 до 45 95 або від 30 95 до 45 95, або від 30 до 45 95 менше ніж висота рослини
Зо дикого типу або контрольної рослини та/або діаметр стебла від 5 95 до 100 95, від 5 95 до 95 95, від 5 95 до 90 9рб, від 5 95 до 85 905, від 5 95 до 80 905, від 5 95 до 75 905, від 5 95 до 70 9бв, від 5 95 до 65 95, від 5 95 до 60 Об, від 5 90 до 55 90, від 5 95 до 50 905, від 5 95 до 45 90, від 5 95 до 40 95, від
Б 95 до 35 9в, від 5 95 до 30 95, від 5 90 до 25 90, від 5 95 до 20 90, від 5 95 до 15 95, від 5 90 до 10 95, від 10 95 до 100 95, від 10 95 до 75 90, від 10 95 до 50 95, від 10 95 до 40 95, від 10 95 до
ЗО 9о, від 10 95 до 20 905, від 25 95 до 75 905, від 25 95 до 50 95, від 50 95 до 75 90, від 8 95 до 20 95 або від 8 95 до 15 95 більше ніж діаметр стебла рослини дикого типу або контрольної рослини.
І205) Відповідно до варіантів реалізації цього винаходу представлені модифіковані рослини кукурудзи, які містять середню довжину міжвузля (або довжину міжвузля мінус-2 та/або довжину міжвузля мінус-4 щодо положення початку), яка є, щонайменше на 5 95, щонайменше на 10 95, щонайменше на 15 95, щонайменше на 20 95, щонайменше на 25 95, щонайменше на 30 95, щонайменше на 3595, щонайменше на 40 956, щонайменше на 45 95, щонайменше на 50 95, щонайменше на 55 95, щонайменше на 60 95, щонайменше на 65 95, щонайменше на 70 95 або щонайменше на 75 95 меншою від тієї ж або середньої довжини міжвузля рослини дикого типу або контрольної рослини. "Мінус-2 міжвузля" рослини кукурудзи відноситься до другого міжвузля під початком рослини, а "мінус-4 міжвузля" рослини кукурудзи відноситься до четвертого міжвузля нижче початку рослини. Відповідно до багатьох варіантів реалізації винаходу пропонуються модифіковані рослини кукурудзи, які мають середню довжину міжвузля (або довжину мінус-2 міжвузля та/або мінус-4 довжину міжвузля відносно положення початку), яка на від 5 95 до 75 90, від 5 95 до 50 905, від 10 95 до 70 9б, від 10 9о до 65 95, від 10 95 до 60 95, від 10 95 до 55 90, від 10 95 до 50 905, від 10 905 до 45 9б, від 10 95 до 40 95, від 10 95 до 35 Об, від 10 95 до 30 9б, від 10 95 до 25 Об, від 10 95 до 20 905, від 10 95 до 15 95, від 10 95 до 10 Об, від 10 95 до 75 95, від 25 95 до 75 95, від 10 95 до 50 95, від 20 95 до 50 95, від 25 95 до 50 95, від 30 95 до 75 90, від 30 95 до 50 95, від 25 95 до 50 Об, від 15 95 до 50 95, від 20 95 до 50 905, від 25 95 до 45 95 або від 30 95 до 45 95 менша, ніж однакова або середня довжина міжвузля рослини дикого типу або контрольної рослини.
І206) Відповідно до варіантів реалізації цього винаходу представлені модифіковані рослини кукурудзи, які мають масу початку (індивідуально або в середньому), яка є, щонайменше на 5 96, щонайменше на 10 95, щонайменше на 15 95, щонайменше на 20 95, щонайменше на 25 95, щонайменше на 30 95, щонайменше на 35 956, щонайменше на 40 95, щонайменше на 45 965, 60 щонайменше на 50 95, щонайменше на 55 956, щонайменше на 60 956, щонайменше на 65 965,
щонайменше на 7095, щонайменше на 75 95, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 965, щонайменше на 90 95, щонайменше на 9595 або щонайменше на 100 95 більшою, ніж маса початку рослини дикого типу або контрольної рослини. Модифікована рослина кукурудзи, представлена в цьому документі, може містити масу початку, яка на від 5 95 до 100 905, від 5 95 до 95 905, від 5 95 до 90 9б, від 5 9о до 85 9б, від 5 95 до 80 905, від 5 95 до 75 9, від 5 95 до 70 9бо, від
Б 95 до 65 9б, від 5 95 до 60 95, від 5 9о до 55 90, від 5 95 до 50 90, від 5 95 до 45 95, від 5 90 до 40 9о, від 5 90 до 35 905, від 5 95 до 30 905, від 5 95 до 25 90, від 5 95 до 20 Об, від 5 95 до 15 95, від
Б 965 до 10 9б, від 10 95 до 100 9б, від 10 95 до 75 Фо, від 10 95 до 50 905, від 25 95 до 75 90, від 25 95 до 50 95 або від 50 95 до 75 95 більша, ніж маса початку рослини дикого типу або контрольної рослини.
І207| Відповідно до варіантів реалізації цього винаходу пропонуються модифіковані рослини кукурудзи або зернові рослини, які мають індекс збору, щонайменше 0,57, щонайменше 0,58, щонайменше 0,59, щонайменше 0,60, щонайменше 0,61, щонайменше 0,62, щонайменше 0,63, щонайменше 0,64 або щонайменше 0,65 (або вище). Модифікована рослина кукурудзи може мати індекс збору від 0,57 до 0,65, від 0,57 до 0,64, від 0,57 до 0,63, від 0,57 до 0,62, від 0,57 до 0,61, від 0,57 до 0,60, від 0,57 до 0,59, від 0,57 до 0,58, від 0,58 до 0,65, від 0,59 до 0,65 або від 0,60 до 0,65. Модифікована рослина кукурудзи може мати індекс збору, який є, щонайменше на 195, щонайменше на 2 956, щонайменше на З 965, щонайменше на 4 95, щонайменше на 5 965, щонайменше на б 906, щонайменше на 790, щонайменше на 890 щонайменше на 9 95, щонайменше на 10 95, щонайменше на 11 9565, щонайменше на 12 95, щонайменше на 13 95, щонайменше на 14 95, щонайменше на 15 95, щонайменше на 20 95, щонайменше на 25 965, щонайменше на 30 95, щонайменше на 35 95, щонайменше на 40 95, щонайменше на 45 95 або щонайменше на 50 95 більше, ніж індекс збору рослини дикого типу або контрольної рослини.
Модифіковані рослини кукурудзи можуть мати індекс збору, який на від 1 95 до 45 95, від 1 95 до 40 9о, від 1 9о до 35 90, від 1 95 до 30 905, від 1 95 до 25 905, від 1 95 до 20 Об, від 1 95 до 15 95, від 1 95 до 14 9б, від 1 95 до 13 Об, від 1 95 до 12 905, від 1 95 до 11 905, від 1 95 до 10 Об, від 1 95 до 9 965, від 1 95 до 8 95, від 1 95 до 7 905, від 1 95 до 6 9б, від 1 95 до 5 95, від 1 95 до 4 905, від 1 95 до З 95, від 195 до 2 95, від 5 95 до 15 905, від 5 95 до 20 95, від 5 95 до 30 95 або від 5 95 до 40 95 більше, ніж індекс збору рослини дикого типу або контрольної рослини.
Зо (2081) Відповідно до варіантів реалізації цього винаходу запропоновані модифіковані рослини кукурудзи або зернові рослини, які мають врожайність, підвищену щонайменше на 0,0627 тон на гектар, щонайменше на 0,1254 тон на гектар, щонайменше на 0,1881 тон на гектар, щонайменше на 0,2508 тон на гектар, щонайменше на 0,3135 тон на гектар, щонайменше на 0,3762 тон на гектар, щонайменше на 0,4389 тон на гектар, щонайменше на 0,5016 тон на гектар, щонайменше на 0,5643 тон на гектар або щонайменше на 0,627 тон на гектар відносно рослини дикого типу або контрольної рослини. Модифіковані рослини кукурудзи можуть мати збільшення врожайності від 0,0627 до 0,627, від 0,0627 до 0,5016, від 0,1254 до 0,5016, від 0,1254 до 0,3762, від 0,1254 до 0,3135, від 0,15675 до 0,28215 або від 0,1881 до 0,2508 тон на гектар. Модифікована рослину кукурудзи може мати врожайність, підвищену щонайменше на 195, щонайменше на 2 956, щонайменше на З 965, щонайменше на 4 95, щонайменше на 5 965, щонайменше на 695, щонайменше на 795, щонайменше на 8595, щонайменше на 9 95, щонайменше на 10 95, щонайменше на 11 9565, щонайменше на 12 95, щонайменше на 13 95, щонайменше на 14 95, щонайменше на 15 95, щонайменше на 20 95 або щонайменше на 25 95, ніж врожайність рослини дикого типу або контрольної рослини. Модифікована кукурудза може мати врожайність більшу на від 1 95 до 25 95, від 1 95 до 20 95, від 1 95 до 15 90, від 1 95 до 14 95, від 1 95 до 13 95, від 1 95 до 12 905, від 1 95 до 11 95, від 1 95 до 10 95, від 1 95 до 9 95, від 1 95 до 8 9б, від 1 95 до 7 905, від 1 95 до 6 9б, від 1 95 до 5 Об, від 1 95 до 4 90, від 1 95 до З 9бо, від 1 95 до 2 90, від 5 95 до 15 90, від 5 95 до 20 Об, від 5 95 до 25 90, від 2 95 до 10 905, від 2 95 до 9 9б, від 2 95 до 8 95, від 2.95 до 7 95, від 295 до 6 905, від 2 95 до 5 95 або від 2 95 до 4 95, ніж врожайність рослини дикого типу або контрольної рослини.
І209| Відповідно до варіантів реалізації цього винаходу запропонована модифікована зернова або кукурудзяна рослина, яка має частоту вилягання, що є, щонайменше на 5 95, щонайменше на 10 95, щонайменше на 15 95, щонайменше на 20 95, щонайменше на 25 965, щонайменше на 30 95, щонайменше на 35 956, щонайменше на 40 95, щонайменше на 45 965, щонайменше на 50 95, щонайменше на 55 956, щонайменше на 60 956, щонайменше на 65 965, щонайменше на 7095, щонайменше на 75 95, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 965, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95 або на 100 95 менше або нижче, ніж у рослини дикого типу або контрольної рослини. Модифіковані зернові або кукурудзяні рослини можуть мати частоту вилягання від 5 95 до 100 905, від 5 95 до 95 9б, від 5 95 до 90 905, від 5 95 до 85 905, від 60 Б 95 до 80 Об, від 5 95 до 75 95, від 5 9о до 70 90, від 5 95 до 65 90, від 5 95 до 60 9б, від 5 90 до
55 95, від 5 95 до 50 Об, від 5 95 до 45 90, від 5 95 до 40 905, від 5 95 до 35 90, від 5 905 до ЗО 95, від 965 до 25 9б, від 5 905 до 20 Об, від 5 95 до 15 905, від 5 95 до 10 Ов, від 10 95 до 100 9бо, від 10 95 до 75 90, від 10 95 до 50 Об, від 10 95 до 40 9б, від 10 95 до 30 905, від 10 95 до 20 Об, від 25 95 до 75 95, від 2595 до 50 95 або від 50 95 до 7595 менше або нижче, ніж у рослини дикого типу або 5 контрольної рослини. Крім того, представлені популяції зернових або кукурудзяних рослин, що володіють підвищеною стійкістю до вилягання та зниженою частотою вилягання. Запропоновані популяції модифікованих зернових або кукурудзяних рослин, що мають частоту вилягання, яка є, щонайменше на 5 95, щонайменше на 10 95, щонайменше на 15 95, щонайменше на 20 95, щонайменше на 2595, щонайменше на 30 956, щонайменше на 35 95, щонайменше на 40 95, щонайменше на 45 95, щонайменше на 50 956, щонайменше на 55 95, щонайменше на 60 965, щонайменше на 6595, щонайменше на 70 956, щонайменше на 7595, щонайменше на 80 965, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95 або на 100 95 менше або нижче, ніж у популяції рослин дикого типу або контрольних рослин. Популяція модифікованих рослин кукурудзи може мати частоту вилягання від 5 95 до 100 95, від 5 95 до 95 95, від 5 95 до 90 95, від 5 95 до 85 Об, від 5 95 до 80 9б, від 5 95 до 75 905, від 5 95 до 70 9о, від 5 905 до 65 905, від
Б 95 до 60 Об, від 5 95 до 55 95, від 5 9о до 50 9о, від 5 95 до 45 90, від 5 95 до 40 9б, від 5 95 до
З5 90, від 5 9о до 30 90, від 5 95 до 25 905, від 5 95 до 20 905, від 5 95 до 15 9б, від 5 95 до 10 95, від 10 95 до 100 95, від 10 95 до 75 95, від 10 95 до 50 95, від 10 95 до 40 95, від 10 95 до 30 95, від 10 95 до 20 95, від 2595 до 75 905, від 2595 до 50 95 або від 50 95 до 7595 менше або нижче, ніж у популяції рослин дикого типу або контрольних рослин, що може бути виражено як середнє значення для певного числа рослин або посівної площі рівної щільності. (210) Відповідно до варіантів реалізації цього винаходу пропонуються модифіковані рослини кукурудзи, що мають значно зменшену або знижену висоту рослини (наприклад, 2000 мм або менше) та значно збільшений діаметр стебла (наприклад, 18 мм або більше) в порівнянні з рослиною дикого типу або контрольною рослиною. Відповідно до цих варіантів реалізації винаходу зменшення або зниження висоти рослини та збільшення діаметра стебла можуть знаходитися в межах будь-якого з діапазонів висоти, діаметра або відсотка, зазначених в цьому документі. Такі модифіковані рослини кукурудзи, що мають зменшену висоту рослини та збільшений діаметр стебла по відношенню до рослини дикого типу або контрольної рослини,
Зо можуть бути трансформовані послідовністю ДНК, що транскрибується, кодуючою некодуючу молекулу РНК, яка націлена щонайменше на один ген оксидази СА20 та/або щонайменше один ген оксидази (ЗАЗ з метою супресії. Модифіковані рослини кукурудзи, що мають значно зменшену висоту рослини та/або значно збільшений діаметр стебла в порівнянні з рослиною дикого типу або контрольною рослиною, можуть додатково мати щонайменше один початок, який по суті не містить чоловічих репродуктивних тканин або структур та/або інших відхилень.
Модифіковані рослини кукурудзи, що мають значно зменшену висоту рослини та/або збільшений діаметр стебла по відношенню до рослини дикого типу або контрольної рослини, можуть мати знижену активність одного або більше гена(ів) оксидази СА20 та/або оксидази САЗ в одній або більше тканині(ах) рослини, такій як одна або більше судинна та/або листова тканина(и) рослини, по відношенню до однієї й тієї ж тканини(тканин) рослини дикого типу або контрольної рослини. Відповідно до багатьох варіантів реалізації винаходу модифіковані рослини кукурудзи можуть містити, щонайменше, одну полінуклеотидну або таку, що транскрибується послідовність ДНК, кодуючу некодуючу молекулу РНК, функціонально пов'язану з промотором, який може бути конститутивним, тканиноспецифічним, тканинобажаним промотором, при цьому некодуюча молекула РНК спрямована, щонайменше, на один ген(и) оксидази СА20 та/або оксидази САЗ з метою супресії, як передбачено в цьому документі. Некодуюча молекула РНК може бути мікроРНК або міРНК або молекулою- попередником мікроРНК або міРНК. Відповідно до деяких варіантів реалізації винаходу модифіковані рослини кукурудзи, що мають значно зменшену висоту рослини та/або збільшений діаметр стебла відносно рослини дикого типу або контрольної рослини, можуть додатково мати підвищений індекс збору та/або підвищену стійкість до вилягання в порівнянні з рослиною дикого типу або контрольною рослиною. (211| Модифіковані рослини кукурудзи або зернові рослини, що мають значно зменшену висоту рослини та/або значно збільшений діаметр стебла в порівнянні з рослиною дикого типу або контрольною рослиною, можуть містити мутацію (наприклад, вставку, делецію, заміну тощо) в гені оксидази СА, введену за допомогою технології редагування генів або іншої техніки мутагенезу, при цьому експресія гену оксидази СА знижена або усунена в одній або більше тканинах модифікованої рослини. Такі модифіковані рослини кукурудзи, що мають зменшену висоту рослини та/або збільшений діаметр стебла стосовно рослини дикого типу або бо контрольної рослини, можуть додатково мати підвищений індекс збору та/або підвищену стійкість до вилягання стосовно рослини дикого типу або контрольної рослини. Такі модифіковані рослини кукурудзи можуть бути практично вільні від відхилень, таких як чоловічі репродуктивні тканини або структури та/або інших відхилень в, щонайменше, одному початку модифікованих рослин. Методи мутагенезу рослини (за виключенням редагування геному) можуть включати хімічний мутагенез (тобто, обробку хімічним мутагеном, таким як азид, гідроксиламін, азотиста кислота, акридин, аналог нуклеотидної основи або алкілуючий агент - наприклад, ЕМ5 (етилметансульфонат), ММИО (М-метил-М-нітрозосечовина) тощо), фізичний мутагенез (наприклад, гамма-промені, рентгенівське випромінювання, ультрафіолетове випромінювання, йонний пучок, інші форми випромінювання тощо) та інсерційний мутагенез (наприклад, транспозон або вставка Т-ДНК). Рослини або різні частини рослини, тканини рослини або клітини рослини можуть піддаватися мутагенезу. Оброблені рослини можуть бути відтворені для збору насіння або отримання нащадків рослини, а оброблені частини рослини, тканини рослини або клітини рослини можуть розвиватися або регенеруватися в рослини або інші тканини рослини. Мутації, отримані за допомогою методів хімічного або фізичного мутагенезу, можуть включати мутації зсуву рамки зчитування, міссенс- або нонсенс-мутації, що призводять до втрати функції або експресії цільового гена, такого як ген оксидази САЗ або сА2О. (212) Один спосіб мутагенезу гена називається "ТІ ГІМО"(для націлювання на індуковані локальні ураження в геномах), при якому мутації створюються в рослинній клітині або тканині, переважно в насінні, репродуктивній тканині або зародковій лінії рослини, наприклад, застосовуючи мутаген, такий як обробка ЕМ5. Отримані рослини вирощують та самозапилюють, а нащадків застосовують для отримання зразків ДНК. ПЛР-ампліфікація та секвенування послідовності нуклеїнової кислоти гена оксидази СА можуть бути застосовані для визначення того, чи має мутована рослина мутацію в гені оксидази СА. Рослини, які мають мутації в гені оксидази СА, можуть потім бути перевірені на наявність зміненої ознаки, такої як зменшена висота рослини. В альтернативному варіанті, піддані мутагенезу рослини можуть бути перевірені на змінену ознаку, таку як зменшена висота рослини, а потім ПЛР -ампліфікація та секвенування послідовності нуклеїнової кислоти гена оксидази СА можуть бути застосовані для визначення того, чи має рослина зі зміненою ознакою також мутацію в гені оксидази сА.
Див., наприклад, Соїрегі та співавт., 2001 рік, Ріапі Рпузіо! 126:480-484; та МссСаїїшт і співавт., 2000 рік, Маїшге Віобтесппоїоду 18:455-457. ТІ. ІМО може застосовуватися для ідентифікації мутацій, які змінюють експресію гена або активність білків, що кодуються геном, які можуть застосовуватися для введення та відбору цільової мутації в гені оксидази СА рослини кукурудзи або зернової рослини. (2131 Кукурудзяні або зернові рослини, які були піддані мутагенезу або обробці з метою редагування генома, можуть бути піддані скринінгу та відібрані на основі спостережуваного фенотипу (наприклад, будь-якого фенотипу, описаного в цьому документі, такого як коротша висота рослини, збільшений діаметр стебла, тощо), або застосування селекційного агента з маркером селекції (наприклад, гербіцидом тощо), маркером скринінгу або молекулярним методом (наприклад, більш низькі рівні СА, більш низькі рівні транскрипту або оксидази А, наявність трансгена або послідовності, що транскрибується, тощо). Такі методи скринінгу та/або відбору можуть бути застосовані для ідентифікації та відбору рослин, що мають мутацію в гені оксидази СА, яка призводить до бажаного фенотипу рослин. (214) Відповідно до варіантів реалізації цього опису пропонується популяція модифікованих рослин кукурудзи або зернових рослин, при цьому популяція модифікованих рослин кукурудзи або зернових рослин має середню висоту рослини, яка є значно меншою, та/або середній діаметр стебла, який є значно більшим, ніж популяція рослин дикого типу або контрольних рослин. Популяція модифікованих рослин кукурудзи або злакових рослин може мати загальний родовід з однією модифікованою рослиною кукурудзи або зернових рослин та/або мати одну спільну вставку, подію або редагування конструкції для супресії трансгенної оксидази СА.
Модифіковані рослини кукурудзи в популяції модифікованих рослин кукурудзи, як правило, можуть містити, щонайменше, один початок, який по суті не містить чоловічих репродуктивних тканин або структур та/або інших відхилень. Популяція модифікованих рослин кукурудзи або зернових рослин може мати підвищену стійкість до вилягання в середньому або на число рослин або польових площ, ніж популяція рослин дикого типу або контрольних рослин.
Популяція модифікованих рослин кукурудзи або зернових рослин може мати частоту вилягання, яка є, щонайменше на 5 95, щонайменше на 10 95, щонайменше на 20 95, щонайменше на 30 95, щонайменше на 40 95, щонайменше на 50 956, щонайменше на 60 956, щонайменше на 70 95, щонайменше на 80 95, щонайменше на 90 95 або на 100 95 менше (або нижче), ніж у популяції бо контрольних рослин кукурудзи або зернових. Популяція модифікованих рослин кукурудзи може мати індекс збору щонайменше 0,57 або більше. (215) Відповідно до варіантів реалізації цього винаходу пропонуються модифіковані рослини кукурудзи або зернових, що мають знижений вміст гібереліну (в активній формі), щонайменше, в тканині(ах) стебла та міжвузля, таких як тканина(и) стебла, міжвузля, листа та/або судинна тканина(и), в порівнянні з тією ж тканиною(ами) рослин дикого типу або контрольних рослин.
Відповідно до багатьох варіантів реалізації винаходу пропонуються модифіковані рослини кукурудзи або зернові рослини, що мають значно зменшену висоту рослини та/або значно збільшений діаметр стебла в порівнянні з рослинами дикого типу або контрольними рослинами, при цьому модифіковані кукурудзяні або зернові рослини додатково мають значно знижений або знижений рівень(рівні) активних гіберелінів або активних СА (наприклад, одного або більше 3 САТ, БАЗ, СА4 та/або СА?) в одній або більше тканині(ах) стебла, міжвузля, листа та/або судинній тканині(ах) відносно однієї й тієї ж тканини(тканин) рослин дикого типу або контрольних рослин. Наприклад, рівень однієї або більше активних СА в тканині(ах) стебла, міжвузля, листа та/або судинної тканини(тканин) модифікованої кукурудзяної або зернової рослини може бути, щонайменше на 595, щонайменше на 1095, щонайменше на 15 95, щонайменше на 20 95, щонайменше на 25 95, щонайменше на 30 95, щонайменше на 35 965, щонайменше на 40 95, щонайменше на 45 95, щонайменше на 50 95, щонайменше на 55 95, щонайменше на 60 95, щонайменше на 65 956, щонайменше на 70 95, щонайменше на 75 965, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95 або щонайменше на 100 95 менше або нижче, ніж в тієї ж тканини(ах) рослини дикого типу або контрольної рослини. (216) Відповідно до деяких варіантів реалізації винаходу модифікована кукурудзяна або зернова рослина може містити рівень(рівні) активного гібереліну (СА) (наприклад, один або більше з САТ, БАЗ, СА4 та/або СА?) в одній або більше тканині(ах) стебла, міжвузля, листа та/або судинній тканині(ах), який на від 5 95 до 50 95, від 10 95 до 100 95, від 20 95 до 100 95, від
ЗО 95 до 100 95, від 40 95 до 100 95, від 50 95 до 100 95, від 60 95 до 100 95, від 70 95 до 100 95, від 80 95 до 100 95, від 80 95 до 90 95, від 10 95 до 90 95, від 10 95 до 80 95, від 10 95 до 70 95, від 10 95 до 60 95, від 10 95 до 50 95, від 10 95 до 40 95, від 10 95 до 30 95, від 10 95 до 20 95, від 50 95 до 100 95, від 20 95 до 90 95, від 20 95 до 80 905, від 20 95 до 70 95, від 2095 до 60 95, від 20 95 до 50 95, від 20 95 до 40 Об, від 20 95 до 40 9б, від 20 95 до 30 95, від ЗО 95 до 90 Ов, від 30 905 до 80 95, від 30 95 до 70 95, від 30 95 до 60 95, від 30 95 до 50 95, від 30 95 до 40 95, від 40 95 до 90 95 від 40 90 до 80 905, від 40 95 до 70 Ов, від 40 905 до 60 905, від 40 95 до 50 905, від 50 95 до 90 905, від 50 95 до 80 95, від 50 95 до 70 95, від 50 95 до 60 95, від 60 95 до 90 95, від 60 95 до 80 905, від 60 95 до 70 95, від 70 95 до 90 95 або від 70 95 до 80 95 менше або (або нижче), ніж в тієї ж тканини(ах) рослини кукурудзи дикого типу або контрольної рослини. Модифікована кукурудзяна або зернова рослина, що має знижений рівень(рівні) активного гібереліну (ЗА) в одній або більше тканині(ах) стебла, міжвузля, листа та/або судинній тканині(ах), може також по суті не містити відхилень, таких як чоловічі репродуктивні тканини або структури та/або інші відхилення щонайменше в одному початку модифікованої рослини кукурудзи. (217| Відповідно до варіантів реалізації цього винаходу пропонуються модифіковані кукурудзяні або зернові рослини, що мають значно знижений або усунений рівень експресії одного або більше транскриптай(ів) та/або білка(ів) гена оксидази САЗ та/або СА20 в одній або більше тканині(ах), таких як одна або більше тканина(и) стебла, міжвузля, листа та/або судинна тканина(и) модифікованих рослин, в порівнянні з тією ж тканиною(ами) рослин дикого типу або контрольних рослин. Відповідно до багатьох варіантів реалізації винаходу пропонується модифікована кукурудзяна або зернова рослина, що містить значно зменшену висоту рослини та/або значно збільшений діаметр стебла в порівнянні з рослинами дикого типу або контрольними рослинами, при цьому модифікована кукурудзяна або зернова рослина має значно знижений або усунений рівень експресії одного або більше транскрипта(ів) та/або
БО білка(ів) гена оксидази СА20 та/або оксидази САЗ в одній або більше тканиніс(ах), такій як одна або більше тканина(и) стебла, міжвузля, листа та/або судинна тканина(и) модифікованої рослини, в порівнянні з тією ж тканиною(ами) рослин дикого типу або контрольних рослин.
Наприклад, модифікована кукурудзяна або зернова рослина має значно знижений або усунений рівень експресії транскрипта(ів) та / або білка(ів) гена оксидази З СА20 та/або оксидази 5
СА20, та/або значно знижений або усунений рівень експресії одного або більше транскрипта(ів) та/або білка(ів) гена оксидази 1 БАЗ та/або оксидази 2 САЗ в одній або більше тканині(ах) стебла, міжвузля, листа та/або судинній тканині(ах) модифікованої рослини, в порівнянні з тією ж тканиною(ами) рослин дикого типу або контрольних рослин. Наприклад, рівень одного або більше транскрипта(ів) та/або білка(ів) гена оксидази САЗ та/або оксидази СА20 або одного або 60 більше транскриптакйів) та / або білка(ів) гена оксидази СА (або оксидаза-подібного СА) в одній або більше тканині(ах) стебла, міжвузля, листа та/або судинній тканині(ах) модифікованої рослини кукурудзи може бути, щонайменше на 5 9565, щонайменше на 10 95, щонайменше на 1595, щонайменше на 20 95, щонайменше на 25 95, щонайменше на 30 95, щонайменше на 3596, щонайменше на 40 95, щонайменше на 45 95, щонайменше на 50 95, щонайменше на 5595, щонайменше на 60 956, щонайменше на 65 95, щонайменше на 70 95, щонайменше на 75 9о, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95 або щонайменше на 100 95 менше або нижче, ніж в тієї ж тканини(ах) рослини дикого типу або контрольної кукурудзяної або зернової рослини. (218) Відповідно до деяких варіантів реалізації винаходу модифікована кукурудзяна або зернова рослина може містити рівень(рівні) одного або більше транскрипта(ів) та/або білка(ів) гена оксидази ЗАЗ та/або одного або більше транскрипта(ів) та/або білка(ів) гена оксидази
СА20 (або оксидаза-подібного ЗА) в одній або більше тканині(ах) стебла, міжвузля, листа та/або судинній тканині(ах), який на від 5 95 до 50 95, від 10 95 до 100 95, від 20 95 до 100 95, від
ЗО 95 до 100 95, від 40 95 до 100 95, від 50 95 до 100 95, від 60 95 до 100 95, від 70 95 до 100 95, від 80 95 до 100 90, від 80 95 до 90 90, від 10 9о до 90 905, від 10 Фо до 80 90, від 10 9о до 70 905, від 10 95 до 60 95, від 10 95 до 50 95, від 10 95 до 40 95, від 10 95 до 30 95, від 10 95 до 20 95, від 50 95 до 100 95, від 20 95 до 90 95, від 20 95 до 80 905, від 20 95 до 70 95, від 2095 до 60 95, від 20 95 до 50 95, від 20 95 до 40 Об, від 20 95 до 40 95, від 20 95 до 30 95, від ЗО 95 до 90 Ов, від 30 905 до 80 95, від 30 95 до 70 95, від 30 95 до 60 95, від 30 95 до 50 95, від 30 95 до 40 95, від 40 95 до 90 95 від 40 90 до 80 905, від 40 95 до 70 Ов, від 40 905 до 60 905, від 40 95 до 50 905, від 50 95 до 90 905, від 50 95 до 80 95, від 50 95 до 70 90, від 50 95 до 60 905, від 60 9о до 90 905, від 60 95 до 80 9б, від 60 905 до 70 95, від 70 95 до 90 95 або від 70 95 до 80 95 менше або нижче, ніж в тієї ж тканини(ах) рослини дикого типу або контрольної кукурудзяної або зернової рослини. Модифікована кукурудзяна або зернова рослина, що має знижений або усунений рівень експресії щонайменше одного гена(ів) оксидази (ЗА20 та/або оксидази ЗАЗ в одній або більше тканині(ах), може також по суті не містити відхилень, таких як чоловічі репродуктивні тканини або структури та/або інші відхилення щонайменше в одному початку модифікованої рослини кукурудзи.
І219| Відповідно до деяких варіантів реалізації винаходу пропонуються способи, що включають зниження або усунення експресії щонайменше одного гена оксидази СА20 та/або щонайменше одного гена оксидази ЗАЗ в зерновій рослині, наприклад в одній або більше тканині стебла, міжвузля, судинній та/або листовій тканині зернової рослини, при цьому експресія щонайменше одного гена оксидази (СЗА20 та/або щонайменше одного генайів) оксидази ЗАЗ істотно не змінюється або змінюється щонайменше в одній репродуктивної тканині рослини, та/або при цьому рівень(рівні) однієї або більше активних СА істотно не змінений або змінений щонайменше в одній репродуктивній тканині рослини в порівнянні з рослиною дикого типу або контрольною рослиною. Відповідно до багатьох варіантів реалізації винаходу рівень(рівні) експресії щонайменше одного гена оксидази ЗА20 або оксидази САЗ знижується або усувається щонайменше в одній тканині модифікованої рослини за допомогою конструкції рекомбінантної ДНК, що містить послідовність ДНК, придатну для транскрипції, яка кодує елемент супресії гена оксидази СА20 або оксидази САЗ, таку як щонайменше одна зріла мікроРНК або попередник мікроРНК, який процесує в зрілу мікроРНК, при цьому мікроРНК здатна знижувати або супресувати рівень експресії щонайменше одного гена оксидази ЗА20 або оксидази ЗАЗ, і при цьому послідовність ДНК, що транскрибується, функціонально пов'язана з конститутивним, тканиноспецифічним або тканинобажаним промотором. (229| Пропонуються способи та методи для скринінгу та/або ідентифікації клітин або рослин тощо, на предмет наявності цільових змін або трансгенів та відбору клітин або рослин, що містять цільові зміни або трансгени, які можуть грунтуватися на одному або більше фенотипах, або ознаках, або на наявності або відсутності молекулярного маркера або полінуклеотидної або білкової послідовності в клітинах або рослинах. Нуклеїнові кислоти можуть бути виділені та виявлені із застосуванням методів, відомих в цій галузі техніки. Наприклад, нуклеїнові кислоти можуть бути виділені та виявлені із застосуванням, без обмеження, технології рекомбінантних нуклеїнових кислот та/або полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Загальні методи ПЛР описані, наприклад, в РОК Ргітег: А І арогаогу Мапиаї, Оіепепрасі 5 Омекзіег, Ред., Соїй Зргіпд Нагбог
І арогагогу Ргев55, 1995 рік. Методи рекомбінантних нуклеїнових кислот включають, наприклад, розщеплення ендонуклеазою рестрикції та лігування, які можуть бути застосовані для виділення нуклеїнової кислоти. Виділені нуклеїнові кислоти також можуть бути хімічно синтезовані або у вигляді однієї молекули нуклеїнової кислоти, або у вигляді ряду олігонуклеотидів. Поліпептиди можуть бути очищені з природних джерел (наприклад, біологічного зразка) відомими способами, такими як йоннообмінна ДЕАЕ |(диетиламіноетил), гельфільтраційна хроматографія та бо хроматографія на гідроксиапатиті. Поліпептид також може бути очищений, наприклад, шляхом експресії нуклеїнової кислоти в експресійному векторі. Крім того, очищений поліпептид може бути отриманий хімічним синтезом. Ступінь чистоти поліпептиду може бути виміряна із застосуванням будь-якого відповідного способу, наприклад, колонкової хроматографії, електрофорезу в поліакриламідному гелі або аналізу за допомогою ВЕРХ. Будь-який спосіб, відомий в цій галузі техніки, може застосовуватися для скринінгу та/або ідентифікації клітин, рослин тощо, що мають трансген або редагування геному в своєму геномі, спосіб може бути заснований на будь-якій зручній формі візуального спостереження, відбору, молекулярного методу тощо. (221| У деяких варіантах реалізації винаходу пропонуються способи виявлення рекомбінантних нуклеїнових кислот та/або поліпептидів в клітинах рослин. Наприклад, нуклеїнові кислоти можуть бути виявлені із застосуванням гібридизаційних зондів або шляхом виробництва ампліконів із застосуванням ПЛР з праймерами, як відомо в цій галузі техніки.
Гібридизація між нуклеїновими кислотами обговорюється в ЗатбгооК та співавт. (1989 рік,
Моїесшіаг Сіопіпд: А І абогаїту Мапиаї, 2-ге вид., Соїй Зргіпд Нагбог І абогаїогу Рге55, Соїа
Зргіпд Нагрог, штат Нью-Йорк). Поліпептиди можуть бути виявлені із застосуванням антитіл.
Методи виявлення поліпептидів із застосуванням антитіл включають твердофазні імуноферментні аналізи (ЕГІ5А), вестерн-блот, імунопреципітацію, імунофлуоресценцію тощо.
Антитіло, представлене в цьому документі, може бути поліклональним антитілом або моноклональним антитілом. Антитіло, що володіє специфічною афінністю зв'язування з поліпептидом, представленим в цьому документі, може бути отримане із застосуванням способів, відомих в цій галузі техніки. Антитіло або гібридизаційний зонд можуть бути прикріплені до твердої основи, такої як пробірка, планшет або лунка, із застосуванням способів, відомих в цій галузі техніки. (222| Виявлення (наприклад, продукту ампліфікації, комплексу гібридизації, поліпептиду) може бути здійснено із застосуванням міток, що детектуються, які можуть бути приєднані або зв'язані з гібридизаційним зондом або антитілом. Термін "мітка" призначений для застосування як прямих міток, так і непрямих міток. Мітки, що детектуються, включають ферменти, простетичні групи, флуоресцентні матеріали, люмінесцентні матеріали, біолюмінесцентні матеріали та радіоактивні матеріали.
Зо (2231 Скринінг та відбір модифікованих, редагованих або трансгенних рослин або клітин рослин можуть проводитися за допомогою будь-яких методологій, відомих фахівцям в галузі молекулярної біології. Приклади методик скринінгу та відбору включають, але без обмежень,
Саузерн-аналіз, ПЛР-ампліфікацію для виявлення полінуклеотиду, нозерн-блот, захист від
РНКази, добудову праймера, ЗТ-ПЦР-ампліфікацію для виявлення РНК-транскриптів, секвенування по Сенгеру, технології секвенування наступного покоління (наприклад, Шиптіпаєф),
РасВіоФ, оп ТоггепітМ тощо), ферментні аналізи для визначення ферментативної або рибозимної активності поліпептидів та полінуклеотидів, а також гель-електрофорез білків, вестерн-блот, імунопреципітацію та імуноферментний аналіз для виявлення поліпептидів. Інші методи, такі як гібридизація іп 5йи, фарбування ферментів і імунофарбування, також можуть бути застосовані для виявлення присутності або експресії поліпептидів та/або полінуклеотидів.
Способи виконання всіх згаданих методів відомі в цій галузі техніки.
ВАРІАНТИ РЕАЛІЗАЦІЇ ВИНАХОДУ
(224)| У наступних абзацах перерахована підмножина ілюстративних варіантів реалізації винаходу. (225| Варіант реалізації винаходу 1. Конструкція рекомбінантної ДНК, що містить послідовність ДНК, придатну для транскрипції, яка кодує некодуючу молекулу РНК, при цьому некодуюча молекула РНК містить послідовність, яка є, щонайменше на 90 95, щонайменше на 9595, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 9565, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або на 100 95 комплементарною щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам молекули мРНК, що кодує ендогенний білок оксидази ЗА20 у зерновій рослині або клітині рослини, ендогенний білок оксидази СА20 є, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 965, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 956, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 965, щонайменше на 99,5 95 або на 100 95 ідентичним 5ЕО ІЮО МО: 9, і при цьому послідовність ДНК, що транскрибується, функціонально зв'язана з промотором придатним для експресії в рослині. (226) Варіант реалізації винаходу 2. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 1, яка відрізняється тим, що некодуюча молекула РНК містить послідовність, яка є, 60 щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 965,
щонайменше на 9895, щонайменше на 9995, щонайменше на 99,595 або на 10095 комплементарною щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам з ЗЕО ІЮ МО: 7 або 5ЕО ІО МО: 8. (227| Варіант реалізації винаходу 3. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 1, яка відрізняється тим, що некодуюча молекула РНК містить послідовність, яка є, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 965, щонайменше на 9895, щонайменше на 9995, щонайменше на 99,595 або на 10095 комплементарною щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам молекули мРНК, що кодує ендогенний білок оксидази ЗА20 в однодольній або зерновій рослині або рослинній клітині, причому ендогенний білок оксидази СА20 є, щонайменше на 8095, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 965, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 956, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 965, щонайменше на 99,5 95 або на 100 95 ідентичним ЗЕО ІО МО: 15. (2281) Варіант реалізації винаходу 4. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 3, яка відрізняється тим, що некодуюча молекула РНК містить послідовність, яка є, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 965, щонайменше на 9895, щонайменше на 99595, щонайменше на 99,595 або на 10095 комплементарною щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам молекули з 5ЕО ІЮО МО: 13 або 5ЕО ІО МО: 14. (229) Варіант реалізації винаходу 5. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 1, яка відрізняється тим, що промотор, який експресується в рослині, є судинним промотором. (230 Варіант реалізації винаходу 6. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації
Зо винаходу 5, яка відрізняється тим, що судинний промотор містить один з наступних: промотор сахарозосинтази, промотор транспортера сахарози, промотор 5А1, промотор плямистого вірусу жовтої коммеліни (СОУММ-Соттеїїйпа уеїЇЇОом/ тоШе міги5), промотор великого міжгенного регіону (ГІА-Іагде іпіегдепіс гедіоп) гемінівіруса карликової пшениці (М/ОМ-мпеаї амжагї детіпімігив), промотор білка оболонки (СР - соаї ргоїеіп) гемівіруса смуги кукурудзи (М5М-таїіе вігеак детіпіміги5), жовта смуга 1 (У51-уєІом 5ігіре 1) - подібний промотор рису або жовта смуга 2 промотор рису (05751 2). (2311 Варіант реалізації винаходу 7. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 5, яка відрізняється тим, що судинний промотор містить послідовність ДНК, яка є, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 965, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 956, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 965, щонайменше на 99,5 95 або на 100 95 ідентичною одній або більше з 5БЕО ІЮ МО: 67, 5ЗЕО ІЮ МО: 68, 5ЕО ІЮ МО: 69, 5ЕО ІЮ МО: 70 або 5ЕО ІО МО: 71, або її функціональній частині. (2321) Варіант реалізації винаходу 8. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 1, яка відрізняється тим, що промотор, який експресується в рослині, є промотором втТВУ. (233) Варіант реалізації винаходу 9. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 8, яка відрізняється тим, що промотор, який експресується в рослині, містить послідовність ДНК, яка є, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 965, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 96, щонайменше на 98 965,
БО щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або на 100 95 ідентичною одній або більше з БЕО
ІО МО: 65 або 5ЕО ІО МО: 66, або її функціональній частині.
І234| Варіант реалізації винаходу 10. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 1, яка відрізняється тим, що промотор, який експресується в рослині, є листовим промотором.
І235| Варіант реалізації винаходу 11. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 10, яка відрізняється тим, що листовий промотор включає один з наступного: промотор Рубіско (КиВізхСО), промотор РРОК, промотор РЕВА, промотор Мадр-
Сюодаї, промотор гена білка, який зв'язує хлорофіл а/ь, промотор фосфоенолпіруваткарбоксилази (ФЕП-карбоксилази) або промотор гена Муб. бо (236| Варіант реалізації винаходу 12. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 10, яка відрізняється тим, що листовий промотор, містить послідовність
ДНК, яка є, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 9595, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 9565, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або на 100 95 ідентичною одній або більше з 5БЕО ІЮ МО: 72, 5ЕО
ІО МО: 73 або 5ЕО ІО МО: 74, або її функціональній частині.
І237| Варіант реалізації винаходу 13. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 1, яка відрізняється тим, що промотор, який експресується в рослині, є конститутивним промотором. (238| Варіант реалізації винаходу 14. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 13, яка відрізняється тим, що конститутивний промотор, вибраний з групи, що складається з: промотора актину, промотора 355 або 195 Саму, рослинного промотора убіквітину, рослинного промотора бо52, промотора ЕММ, промотора СМУ, промотора МММУ, промотора РСІ 5М, промотора Ети, промотора тубуліну, промотора нопалінсинтази, промотора октопінсинтази, промотора маннопінсинтази або алкогольдегідрогенази кукурудзи, або їх функціональної частини.
І239| Варіант реалізації винаходу 15. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 13, яка відрізняється тим, що конститутивний промотор містить послідовність ДНК, яка є, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 965, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 96, щонайменше на 98 965, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або на 100 95 ідентичною одній або більше з БЕО
ІО МО: 75, БЕО ІО МО: 76, 5ЕО І МО: 77, ЗЕО ОО МО: 78, 5ЕО ІЮ МО: 79, 5ЕО ІЮ МО: 80, 5ЕО
ІО МО: 81, ЗЕО ІЮ МО: 82 або ЗЕО ІО МО: 83, або її функціональній частині. (240| Варіант реалізації винаходу 16. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 1, яка відрізняється тим, що некодуюча молекула РНК, яка кодується послідовністю ДНК, що транскрибується, є попередником мікроРНК або міРНК, який процесується або розщепляється в рослинній клітині з утворенням зрілої мікроРНК або мігРНК. (241) Варіант реалізації винаходу 17. Вектор для трансформації, що містить конструкцію рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 1. (242) Варіант реалізації винаходу 18. Трансгенна зернова рослина, частина рослини або
Зо клітина рослини, що містить конструкцію рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 1. (243) Варіант реалізації винаходу 19. Трансгенна зернова рослина за варіантом реалізації винаходу 18, яка відрізняється тим, що трансгенна рослина має одну або більше з наступних ознак відносно контрольної рослини: коротшу висоту рослини, збільшений діаметр стебла, поліпшену стійкість до вилягання, глибше коріння, збільшену площу листа, більш ранню зімкнутість полога, більш високу провідність устя, нижчу висоту початку, підвищений вміст вологи в листі, підвищення стійкості до посухи, підвищення ефективності використання азоту, зниження вмісту антоціанів та площі антоціанів в листі за нормальних умов або стресових умов, викликаних обмеженою кількістю азоту або води, збільшення маси початку, збільшення індексу збору, збільшення врожаю, збільшення кількості зерна, збільшення маси зерна та/або збільшення плодючості. (244) Варіант реалізації винаходу 20. Трансгенна зернова рослина за варіантом реалізації винаходу 18, яка відрізняється тим, що трансгенна рослина має коротшу висоту рослини та/або поліпшену стійкість до вилягання. (245) Варіант реалізації винаходу 21. Трансгенна зернова рослина за варіантом реалізації винаходу 18, яка відрізняється тим, що висота трансгенної рослини є, щонайменше на 10 95, щонайменше на 20 95, щонайменше на 25 95, щонайменше на 30 95, щонайменше на 35 95 або щонайменше на 40 95 нижчою ніж у контрольної рослини дикого типу. (246) Варіант реалізації винаходу 22. Трансгенна зернова рослина за варіантом реалізації винаходу 18, яка відрізняється тим, що діаметр стебла трансгенної рослини на одному або більше міжвузлях стебла є, щонайменше на 5 95, щонайменше на 10 95, щонайменше на 15 95, щонайменше на 20 95, щонайменше на 25 95, щонайменше на 30 95, щонайменше на 35 95 або щонайменше на 4095 більшим, ніж діаметр стебла на одному або більше міжвузлях контрольної рослини дикого типу.
І(2А7| Варіант реалізації винаходу 23. Трансгенна зернова рослина за будь-яким з варіантів реалізації винаходу 18, яка відрізняється тим, що трансгенна зернова рослина є рослиною кукурудзи, і при цьому діаметр стебла трансгенної рослини кукурудзи на одному або більше з першого, другого, третього та/або четвертого міжвузля, розташованого нижче початку, є, щонайменше на 595, щонайменше на 10 95, щонайменше на 1595, щонайменше на 20 95, бо щонайменше на 25 95, щонайменше на 30 95, щонайменше на 35 95 або щонайменше на 40 95 більшим, ніж у того ж міжвузля контрольної рослини дикого типу. (248) Варіант реалізації винаходу 24. Трансгенна зернова рослина за варіантом реалізації винаходу 18, яка відрізняється тим, що рівень однієї або більше активних ЗА в щонайменше одній тканині міжвузля стебла трансгенної рослини нижче, ніж в тієї ж тканини міжвузля контрольної рослини дикого типу.
І249| Варіант реалізації винаходу 25. Трансгенна зернова рослина за варіантом реалізації винаходу 18, яка відрізняється тим, що рівень однієї або більше активної СА в щонайменше одній тканині міжвузля стебла трансгенної рослини є, щонайменше на 5 95, щонайменше на 1095, щонайменше на 15 95, щонайменше на 20 95, щонайменше на 25 95, щонайменше на 30 96, щонайменше на 35 95 або щонайменше на 40 95 нижчим, ніж у тієї ж тканини міжвузля контрольної рослини дикого типу. (250) Варіант реалізації винаходу 26. Трансгенна кукурудзяна рослина, частина рослини або клітина рослини, що містить конструкцію рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 1. (2511 Варіант реалізації винаходу 27. Спосіб отримання трансгенної зернової рослини, що включає: (а) трансформацію щонайменше однієї клітини експлантата конструкцією рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 1 та (Б) регенерацію або розвиток трансгенної зернової рослини з трансформованого експлантата. (252) Варіант реалізації винаходу 28. Спосіб за варіантом реалізації винаходу 25, який відрізняється тим, що зернова рослина трансформується за допомогою опосередкованої
Адгобасієегішт трансформації або бомбардування частинками. (253| Варіант реалізації винаходу 29. Конструкція рекомбінантної ДНК, що містить послідовність ДНК, придатну для транскрипції, яка кодує некодуючу молекулу РНК, при цьому некодуюча молекула РНК містить послідовність, яка є, щонайменше на 90 95, щонайменше на 9595, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 9565, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 965, щонайменше на 99,5 95 або 100 95 комплементарною, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам молекули мРНК, що кодує ендогенний білок
Зо оксидази ЗА2О в однодольній або зерновій рослині або клітині рослини, ендогенний білок оксидази (ЗА20 є, щонайменше на 8095, щонайменше на 8595, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 96, щонайменше на 98 965, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або 100 95 ідентичним ЗЕО ІЮ МО: 15, і при цьому послідовність ДНК, що транскрибується, функціонально пов'язана з промотором придатним для експресії в рослині. (254| Варіант реалізації винаходу 30. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 29, яка відрізняється тим, що некодуюча молекула РНК містить послідовність, яка є, щонайменше на 9095, щонайменше на 9595, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 95, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або 100 95 комплементарною, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам з ЗЕО ІЮО МО: 13 або 5ЕО ІЮО МО: 14.
І255| Варіант реалізації винаходу 31. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 29, яка відрізняється тим, що промотор, який експресується в рослині, є судинним промотором. (256| Варіант реалізації винаходу 32. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 31, яка відрізняється тим, що судинний промотор містить один з наступних: промотор сахарозосинтази, промотор транспортера сахарози, промотор 51, промотор плямистого вірусу жовтої коммеліни (СОУММ-Соттеїїйпа уеїПоу/ тоШе міги5), промотор великого міжгенного регіону (ГІК-Іагде іпіегдепіс гедіоп) гемінівіруса карликової пшениці (М/ЮМ-мпеаї амжмаг детіпіміги5), промотор білка оболонки (СР - соаї ргоївїп) гемівіруса смуги кукурудзи (МБМ- таїіе 5зтєакК детіпіміги5), жовта смуга 1 (у51-уе ом війре 1) - подібний промотор рису або жовта смуга 2 промотор рису (О57У751 2). (257| Варіант реалізації винаходу 33. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 31, яка відрізняється тим, що судинний промотор містить послідовність
ДНК, яка є, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 9595, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 9565, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 965, щонайменше на 99,5 95 або на 100 95 ідентичною одній або більше з ЗЕО ІЮ МО: 67, 5ЕО 60 ІО МО: 68, 5ЕО ІЮ МО: 69, 5ЕО ІО МО: 70 або 5ЕО ІЮО МО: 71, або її функціональній частині.
(258| Варіант реалізації винаходу 34. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 29, яка відрізняється тим, що промотор, який експресується в рослині, є промотором КТВУ.
І259| Варіант реалізації винаходу 35. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 34, яка відрізняється тим, що промотор, який експресується в рослині, містить послідовність ДНК, яка є, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 96, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 965, щонайменше на 98 965, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або на 100 95 ідентичною одній або більше з ЗЕО ІЮ МО: 65 або 5ЕО ІО МО: 66, або її функціональній частині. (260О| Варіант реалізації винаходу 36. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 29, яка відрізняється тим, що промотор, який експресується в рослині, є листовим промотором. (261| Варіант реалізації винаходу 37. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 36, яка відрізняється тим, що листовий промотор включає один з наступного: промотор Рубіско, промотор РРОК, промотор ЕВБА, промотор Мадп-Содаї, промотор гена білка, який зв'язує хлорофіл а/Ю, промотор фосфоенолпіруваткарбоксилази (ФЕП- карбоксилази) або промотор гена Муб. (262| Варіант реалізації винаходу 38. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу Зб, яка відрізняється тим, що листовий промотор, містить послідовність
ДНК, яка є, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 9595, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 9565, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або на 100 95 ідентичною одній або більше з БЕО ІЮ МО: 72, 5ЕО
ІО МО: 73 або 5ЕО ІО МО: 74, або її функціональній частині.
І263| Варіант реалізації винаходу 39. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 29, яка відрізняється тим, що промотор, який експресується в рослині, є конститутивним промотором. (264| Варіант реалізації винаходу 40. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 39, яка відрізняється тим, що конститутивний промотор, вибраний з групи, що складається з: промотора актину, промотора 355 або 195 Саму, рослинного промотора
Зо убіквітину, рослинного промотора бо52, промотора ЕММ, промотора СММУ, промотора ММУ, промотора РСІ 5М, промотора Ети, промотора тубуліну, промотора нопалінсинтази, промотора октопінсинтази, промотора маннопінсинтази або алкогольдегідрогенази кукурудзи, або їх функціональної частини.
І265| Варіант реалізації винаходу 41. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 39, яка відрізняється тим, що конститутивний промотор містить послідовність ДНК, яка є, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 965, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 96, щонайменше на 98 965, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або на 100 95 ідентичною одній або більше з БЕО
ІО МО: 75, БЕО ІО МО: 76, 5ЕБЕО І МО: 77, ЗЕО ІО МО: 78, 5ЕО ІО МО: 79, 5ЕО І МО: 80, 5ЕО
ІО МО: 81, ЗЕО ІЮ МО: 82 або ЗЕО ІО МО: 83, або її функціональній частині. (266| Варіант реалізації винаходу 42. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 29, яка відрізняється тим, що некодуюча молекула РНК, яка кодується послідовністю ДНК, що транскрибується, є попередником мікроРНК або міРНК, який процесується або розщепляється в рослинній клітині з утворенням зрілої мікроРНК або мігРНК. (267| Варіант реалізації винаходу 43. Вектор для трансформації, що містить конструкцію рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 29. (268) Варіант реалізації винаходу 44. Трансгенна зернова рослина, частина рослини або клітина рослини, що містить конструкцію рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 23. (269) Варіант реалізації винаходу 45. Трансгенна зернова рослина за варіантом реалізації винаходу 44, яка відрізняється тим, що трансгенна рослина має одну або більше з наступних ознак відносно контрольної рослини: коротшу висоту рослини, збільшений діаметр стебла, поліпшену стійкість до вилягання, глибше коріння, збільшену площу листа, більш ранню зімкнутість полога, більш високу провідність устя, нижчу висоту початку, підвищений вміст вологи в листі, підвищення стійкості до посухи, підвищення ефективності використання азоту, зниження вмісту антоціанів та площі антоціанів в листі за нормальних умов або стресових умов, викликаних обмеженою кількістю азоту або води, збільшення маси початку, збільшення індексу збору, збільшення врожаю, збільшення кількості зерна, збільшення маси зерна та/або збільшення плодючості. бо (270) Варіант реалізації винаходу 46. Трансгенна зернова рослина за варіантом реалізації винаходу 44, яка відрізняється тим, що трансгенна рослина має коротшу висоту рослини та/або поліпшену стійкість до вилягання. (271) Варіант реалізації винаходу 47. Трансгенна зернова рослина за варіантом реалізації винаходу 44, яка відрізняється тим, що висота трансгенної рослини є, щонайменше на 10 95, щонайменше на 20 95, щонайменше на 25 95, щонайменше на 30 95, щонайменше на 35 95 або щонайменше на 40 95 нижчою ніж у контрольної рослини дикого типу. (2721) Варіант реалізації винаходу 48. Трансгенна зернова рослина за варіантом реалізації винаходу 44, яка відрізняється тим, що діаметр стебла трансгенної рослини в одному або більше міжвузлях стебла є, щонайменше на 5 95, щонайменше на 10 95, щонайменше на 15 95, щонайменше на 20 95, щонайменше на 25 95, щонайменше на 30 95, щонайменше на 35 95 або щонайменше на 40 95 більшим, ніж діаметр стебла в одному або більше міжвузлях контрольної рослини дикого типу. (273) Варіант реалізації винаходу 49. Трансгенна зернова рослина за будь-яким з варіантів реалізації винаходу 44, яка відрізняється тим, що трансгенна зернова рослина є рослиною кукурудзи, і при цьому діаметр стебла трансгенної рослини кукурудзи в одному або більше з першого, другого, третього та/або четвертого міжвузля, розташованого нижче початку, є, щонайменше на 595, щонайменше на 10 95, щонайменше на 1595, щонайменше на 20 95, щонайменше на 25 95, щонайменше на 30 95, щонайменше на 35 95 або щонайменше на 40 95 більшим, ніж у того ж міжвузля контрольної рослини дикого типу. (274) Варіант реалізації винаходу 50. Трансгенна зернова рослина за варіантом реалізації винаходу 44, яка відрізняється тим, що рівень однієї або більше активних СА в щонайменше одній тканині міжвузля стебла трансгенної рослини нижче, ніж в тієї ж тканини міжвузля контрольної рослини дикого типу. (275) Варіант реалізації винаходу 51. Трансгенна зернова рослина за варіантом реалізації винаходу 44, яка відрізняється тим, що рівень однієї або більше активної СА в щонайменше одній тканині міжвузля стебла трансгенної рослини є, щонайменше на 5 95, щонайменше на 1095, щонайменше на 15 95, щонайменше на 20 95, щонайменше на 25 95, щонайменше на 96, щонайменше на 35 95 або щонайменше на 40 95 нижчим, ніж у тієї ж тканини міжвузля контрольної рослини дикого типу.
Зо (276) Варіант реалізації винаходу 52. Трансгенна кукурудзяна рослина, частина рослини або клітина рослини, що містить конструкцію рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 23. (277| Варіант реалізації винаходу 53. Спосіб отримання трансгенної зернової рослини, що включає: (а) трансформацію щонайменше однієї клітини експлантата конструкцією рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 29, та (Б) регенерацію або розвиток трансгенної зернової рослини з трансформованого експлантата. (278) Варіант реалізації винаходу 54. Спосіб за варіантом реалізації винаходу 29, який відрізняється тим, що зернова рослина трансформується за допомогою опосередкованої
Адгобасіегічшт трансформації або бомбардування частинками. (279| Варіант реалізації винаходу 55. Конструкція рекомбінантної ДНК, що містить послідовність ДНК, придатну для транскрипції, яка кодує некодуючу молекулу РНК, при цьому некодуюча молекула РНК містить послідовність, яка є, щонайменше на 90 95, щонайменше на 9595, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 9565, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 965, щонайменше на 99,5 95 або на 100 95 комплементарною, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам молекули мРНК, що кодує ендогенний білок оксидази БАЗ в однодольній або зерновій рослині або клітині рослини, ендогенний білок оксидази СЗАЗ є, щонайменше на 8095, щонайменше на 8595, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 96, щонайменше на 98 965, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або 100 95 ідентичним ЗЕО ІО МО: 30 або 33, їі при цьому послідовність ДНК, що транскрибується, функціонально пов'язана з промотором придатним для експресії в рослині. (280| Варіант реалізації винаходу 56. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 55, яка відрізняється тим, що некодуюча молекула РНК містить послідовність, яка є, щонайменше на 9095, щонайменше на 9595, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 95, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або на 100 95 комплементарною, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, бо щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам з ЗЕО ІЮО МО: 28, 29, 31 або 32.
І281| Варіант реалізації винаходу 57. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 55, яка відрізняється тим, що промотор, який експресується в рослині, є судинним промотором. (282| Варіант реалізації винаходу 58. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 57, яка відрізняється тим, що судинний промотор містить один з наступних: промотор сахарозосинтази, промотор транспортера сахарози, промотор 51, промотор плямистого вірусу жовтої коммеліни (СОУММУ-Соттеїїпа уеПйом/ тоШе міги5), промотор великого міжгенного регіону (ГІК-Іагде іпіегдепіс гедіоп) гемінівіруса карликової пшениці (М/ЮМ-мпеаї дугагї детіпіміги5), промотор білка оболонки (СР - соаї ргоївіп) гемівіруса смуги кукурудзи (МБ5М- таїе 5ігеак детіпіміги5), жовта смуга 1 (у51-уеІом вітре 1) - подібний промотор рису або жовта смуга 2 промотор рису (О57У751 2). (283| Варіант реалізації винаходу 59. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 57, яка відрізняється тим, що судинний промотор містить послідовність
ДНК, яка є, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 9595, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 9565, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або на 100 95 ідентичною одній або більше з БЕО ІЮ МО: 67, 5ЕО
ІО МО: 68, 5ЕО ІЮО МО: 69, 5ЕО ІО МО: 70 або 5ЕО ІЮО МО: 71, або її функціональній частині.
І284| Варіант реалізації винаходу 60. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 55, яка відрізняється тим, що промотор, який експресується в рослині, є промотором КТВУ. (285| Варіант реалізації винаходу 61. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 60, яка відрізняється тим, що промотор, який експресується в рослині, містить послідовність ДНК, яка є, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 96, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 965, щонайменше на 98 965, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або на 100 95 ідентичною одній або більше з ЗЕО ІЮ МО: 65 або 5ЕО ІЮ МО: 66, або її функціональній частині. (286| Варіант реалізації винаходу 62. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 55, яка відрізняється тим, що промотор, який експресується в рослині, є
Зо листовим промотором. (287| Варіант реалізації винаходу 63. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 62, яка відрізняється тим, що листовий промотор включає один з наступного: промотор Рубіско, промотор РРОК, промотор ЕВА, промотор Мадп-содаї, промотор гена білка, який зв'язує хлорофіл а/Ю, промотор фосфоенолпіруваткарбоксилази (ФЕП- карбоксилази) або промотор гена Муб. (288| Варіант реалізації винаходу 64. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 62, яка відрізняється тим, що листовий промотор, містить послідовність
ДНК, яка є, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 9595, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 9565, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або на 100 95 ідентичною одній або більше з БЕО ІЮ МО: 72, 5ЕО
ІО МО: 73 або 5ЕО ІО МО: 74, або її функціональній частині.
І289| Варіант реалізації винаходу 65. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 55, яка відрізняється тим, що промотор, який експресується в рослині, є конститутивним промотором.
І290| Варіант реалізації винаходу 66. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 65, яка відрізняється тим, що конститутивний промотор, вибраний з групи, що складається з: промотора актину, промотора 355 або 195 Саму, рослинного промотора убіквітину, рослинного промотора 5052, промотора ЕММ, промотора СММ, промотора МММУ, промотора РСІ 5М, промотора Ети, промотора тубуліну, промотора нопалінсинтази, промотора октопінсинтази, промотора маннопінсинтази або алкогольдегідрогенази кукурудзи, або їх функціональної частини.
І291| Варіант реалізації винаходу 67. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 65, яка відрізняється тим, що конститутивний промотор містить послідовність ДНК, яка є, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 965, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 96, щонайменше на 98 965, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або на 100 95 ідентичною одній або більше з БЕО
ІО МО: 75, БЕО ІО МО: 76, 5ЕБЕО І МО: 77, 5ЕО ІО МО: 78, 5ЕО ІО МО: 79, 5ЕО ІО МО: 80, 5ЕО
ІО МО: 81, ЗЕО ІЮ МО: 82 або ЗЕО ІО МО: 83, або її функціональній частині.
І292| Варіант реалізації винаходу 68. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом бо реалізації винаходу 55, яка відрізняється тим, що некодуюча молекула РНК, яка кодується послідовністю ДНК, що транскрибується, є попередником мікроРНК або міРНК, який процесується або розщепляється в рослинній клітині з утворенням зрілої мікроРНК або мігРНК.
І293| Варіант реалізації винаходу 69. Вектор для трансформації, що містить конструкцію рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 55. (294| Варіант реалізації винаходу 70. Трансгенна зернова рослина, частина рослини або клітина рослини, що містить конструкцію рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 55. (295) Варіант реалізації винаходу 71. Трансгенна зернова рослина за варіантом реалізації винаходу 70, яка відрізняється тим, що трансгенна рослина має одну або більше з наступних ознак відносно контрольної рослини: коротшу висоту рослини, збільшений діаметр стебла, поліпшену стійкість до вилягання, глибше коріння, збілошену площу листа, більш ранню зімкнутість полога, більш високу провідність устя, нижчу висоту початку, підвищений вміст вологи в листі, підвищення стійкості до посухи, підвищення ефективності використання азоту, зниження вмісту антоціанів та площі антоціанів в листі за нормальних умов або стресових умов, викликаних обмеженою кількістю азоту або води, збільшення маси початку, збільшення індексу збору, збільшення врожаю, збільшення кількості зерна, збільшення маси зерна та/або збільшення плодючості. (296) Варіант реалізації винаходу 72. Трансгенна зернова рослина за варіантом реалізації винаходу 70, яка відрізняється тим, що трансгенна рослина має коротшу висоту рослини та/або поліпшену стійкість до вилягання.
І297| Варіант реалізації винаходу 73. Трансгенна зернова рослина за варіантом реалізації винаходу 70, яка відрізняється тим, що висота трансгенної рослини є, щонайменше на 10 95, щонайменше на 20 95, щонайменше на 25 95, щонайменше на 30 95, щонайменше на 35 95 або щонайменше на 40 95 нижчою ніж у контрольної рослини дикого типу. (298) Варіант реалізації винаходу 74. Трансгенна зернова рослина за варіантом реалізації винаходу 70, яка відрізняється тим, що діаметр стебла трансгенної рослини в одному або більше міжвузлях стебла є, щонайменше на 5 95, щонайменше на 10 95, щонайменше на 15 95, щонайменше на 20 95, щонайменше на 25 95, щонайменше на 30 95, щонайменше на 35 95 або щонайменше на 40 95 більшим, ніж діаметр стебла в одному або більше міжвузлях контрольної
Зо рослини дикого типу.
І299| Варіант реалізації винаходу 75. Трансгенна зернова рослина за будь-яким з варіантів реалізації винаходу 70, яка відрізняється тим, що трансгенна зернова рослина є рослиною кукурудзи, і при цьому діаметр стебла трансгенної рослини кукурудзи в одному або більше з першого, другого, третього та/або четвертого міжвузля, розташованого нижче початку, є, 35 щонайменше на 595, щонайменше на 10 95, щонайменше на 1595, щонайменше на 20 95, щонайменше на 25 95, щонайменше на 30 95, щонайменше на 35 95 або щонайменше на 40 95 більшим, ніж у того ж міжвузля контрольної рослини дикого типу.
ІЗО0Ї Варіант реалізації винаходу 76. Трансгенна зернова рослина за варіантом реалізації винаходу 70, яка відрізняється тим, що рівень однієї або більше активних СА в щонайменше 40 одній тканині міжвузля стебла трансгенної рослини нижче, ніж в тієї ж тканини міжвузля контрольної рослини дикого типу.
ІЗО1Ї) Варіант реалізації винаходу 77. Трансгенна зернова рослина за варіантом реалізації винаходу 70, яка відрізняється тим, що рівень однієї або більше активної СА в щонайменше одній тканині міжвузля стебла трансгенної рослини є, щонайменше на 5 95, щонайменше на 45 1095, щонайменше на 15 95, щонайменше на 20 95, щонайменше на 25 95, щонайменше на 96, щонайменше на 35 95 або щонайменше на 40 95 нижчим, ніж у тієї ж тканини міжвузля контрольної рослини дикого типу.
ІЗО2І) Варіант реалізації винаходу 78. Трансгенна кукурудзяна рослина, частина рослини або клітина рослини, що містить конструкцію рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 55.
ІЗОЗІЇ Варіант реалізації винаходу 79. Спосіб отримання трансгенної зернової рослини, що включає: (а) трансформацію щонайменше однієї клітини експлантата конструкцією рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 55, та (Б) регенерацію або розвиток трансгенної зернової рослини з трансформованого експлантата.
ІЗО4| Варіант реалізації винаходу 80. Спосіб за варіантом реалізації винаходу 79, який відрізняється тим, що зернова рослина трансформується за допомогою опосередкованої
Адгобасієегішт трансформації або бомбардування частинками.
ЇЗО5| Варіант реалізації винаходу 81. Конструкція рекомбінантної ДНК, що містить послідовність ДНК, придатну для транскрипції, яка кодує некодуючу молекулу РНК, при цьому 60 некодуюча молекула РНК містить послідовність, яка є, щонайменше на 90 95, щонайменше на
9595, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 9565, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 965, щонайменше на 99,5 95 або на 100 95 комплементарною, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам молекули мРНК, що кодує ендогенний білок оксидази ЗА2О в однодольній або зерновій рослині або клітині рослини, ендогенний білок оксидази СЗА2О0 є, щонайменше на 8095, щонайменше, на 8595, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 96, щонайменше на 98 965, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або на 100 95 ідентичним ЗЕО ІЮО МО: 12, їі при цьому послідовність ДНК, що транскрибується, функціонально пов'язана з промотором придатним для експресії в рослині.
ЇЗО6Ї Варіант реалізації винаходу 82. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 81, яка відрізняється тим, що некодуюча молекула РНК містить послідовність, яка є, щонайменше на 9095, щонайменше на 9595, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 95, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або на 100 95 комплементарною, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам з ЗЕО ІЮО МО: 10 або 11.
ЇЗО7| Варіант реалізації винаходу 83. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 81, яка відрізняється тим, що промотор, який експресується в рослині, є судинним промотором.
ІЗО8| Варіант реалізації винаходу 84. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 83, яка відрізняється тим, що судинний промотор містить один з наступних: промотор сахарозосинтази, промотор транспортера сахарози, промотор 51, промотор плямистого вірусу жовтої коммеліни (СОУММ-Соттеїїпа уеПом/ тоШе міги5), промотор великого міжгенного регіону (ГІК-Іагде іпіегдепіс гедіоп) гемінівіруса карликової пшениці (М/ЮМ-мпеаї амжмаг детіпіміги5), промотор білка оболонки (СР - соаї ргоївїп) гемівіруса смуги кукурудзи (МБМ- таїе 5ігеак детіпіміги5), жовта смуга 1 (у51-уеІом війре 1) - подібний промотор рису або жовта
Зо смуга 2 промотор рису (05751 2).
ЇЗО9|Ї Варіант реалізації винаходу 85. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 83, яка відрізняється тим, що судинний промотор містить послідовність
ДНК, яка є, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 9595, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 9565, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або на 100 95 ідентичною одній або більше з БЕО ІЮ МО: 67, 5ЕО
ІО МО: 68, 5ЕО ІЮ МО: 69, 5ЕО ІО МО: 70 або 5ЕО ІЮО МО: 71, або її функціональній частині.
ЇЗ1ОЇ Варіант реалізації винаходу 86. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 81, яка відрізняється тим, що промотор, який експресується в рослині, є промотором КТВУ.
ЇЗ11| Варіант реалізації винаходу 87. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 86, яка відрізняється тим, що промотор, який експресується в рослині, містить послідовність ДНК, яка є, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 96, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 9565, щонайменше на 97 965, щонайменше на 98 965, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або на 100 95 ідентичною одній або більше з ЗЕО ІЮ МО: 65 або 5ЕО ІЮ МО: 66, або її функціональній частині.
ЇЗ12| Варіант реалізації винаходу 88. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 81, яка відрізняється тим, що промотор, який експресується в рослині, є листовим промотором.
ЇЗ13| Варіант реалізації винаходу 89. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 88, яка відрізняється тим, що листовий промотор включає один з наступного: промотор Рубіско, промотор РРОК, промотор ЕВА, промотор Мадп-содаї, промотор гена білка, який зв'язує хлорофіл а/Ю, промотор фосфоенолпіруваткарбоксилази (ФЕП- карбоксилази) або промотор гена Муб.
ЇЗ14| Варіант реалізації винаходу 90. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 88, яка відрізняється тим, що листовий промотор, містить послідовність
ДНК, яка є, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 9595, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 9565, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або на 100 95 ідентичною одній або більше з БЕО ІЮ МО: 72, 5ЕО
ІО МО: 73 або 5ЕО ІО МО: 74, або її функціональній частині. бо ЇЗ15| Варіант реалізації винаходу 91. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 81, яка відрізняється тим, що промотор, який експресується в рослині, є конститутивним промотором.
ЇЗ16Ї Варіант реалізації винаходу 92. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 91, яка відрізняється тим, що конститутивний промотор, вибраний з групи, що складається з: промотора актину, промотора 355 або 195 Саму, рослинного промотора убіквітину, рослинного промотора бо52, промотора ЕММ, промотора СММ, промотора МММ, промотора РСІ 5М, промотора Ети, промотора тубуліну, промотора нопалінсинтази, промотора октопінсинтази, промотора маннопінсинтази або алкогольдегідрогенази кукурудзи, або їх функціональної частини.
ЇЗ17| Варіант реалізації винаходу 93. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 91, яка відрізняється тим, що конститутивний промотор містить послідовність ДНК, яка є, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 965, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 96, щонайменше на 98 965, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або на 100 95 ідентичною одній або більше з БЕО
ІО МО: 75, БЕО ІО МО: 76, 5ЕБЕО І МО: 77, 5ЕО ІО МО: 78, 5ЕО ІО МО: 79, 5ЕО ІО МО: 80, 5ЕО
ІО МО: 81, ЗЕО ІЮ МО: 82 або ЗЕО ІО МО: 83, або її функціональній частині.
ЇЗ18| Варіант реалізації винаходу 94. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 81, яка відрізняється тим, що некодуюча молекула РНК, яка кодується послідовністю ДНК, що транскрибується, є попередником мікроРНК або міРНК, який процесується або розщепляється в рослинній клітині з утворенням зрілої мікроРНК або мігРНК.
ІЗ19| Варіант реалізації винаходу 95. Вектор для трансформації, що містить конструкцію рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 81.
ІЗ20) Варіант реалізації винаходу 96. Трансгенна зернова рослина, частина рослини або клітина рослини, що містить конструкцію рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 81.
ІЗ21| Варіант реалізації винаходу 97. Трансгенна зернова рослина за варіантом реалізації винаходу 96, яка відрізняється тим, що трансгенна рослина має одну або більше з наступних ознак відносно контрольної рослини: коротшу висоту рослини, збільшений діаметр стебла, поліпшену стійкість до вилягання, глибше коріння, збільшену площу листа, більш ранню
Зо зімкнутість полога, більш високу провідність устя, нижчу висоту початку, підвищений вміст вологи в листі, підвищення стійкості до посухи, підвищення ефективності використання азоту, зниження вмісту антоціанів та площі антоціанів в листі за нормальних умов або стресових умов, викликаних обмеженою кількістю азоту або води, збільшення маси початку, збільшення індексу збору, збільшення врожаю, збільшення кількості зерна, збільшення маси зерна та/або збільшення плодючості.
ІЗ221| Варіант реалізації винаходу 98. Трансгенна зернова рослина за варіантом реалізації винаходу 96, яка відрізняється тим, що трансгенна рослина має коротшу висоту рослини та/або поліпшену стійкість до вилягання.
ІЗ23| Варіант реалізації винаходу 99. Трансгенна зернова рослина за варіантом реалізації винаходу 96, яка відрізняється тим, що висота трансгенної рослини є, щонайменше на 10 95, щонайменше на 20 95, щонайменше на 25 95, щонайменше на 30 95, щонайменше на 35 95 або щонайменше на 40 95 нижчою ніж у контрольної рослини дикого типу.
ІЗ24| Варіант реалізації винаходу 100. Трансгенна зернова рослина за варіантом реалізації винаходу 96, яка відрізняється тим, що діаметр стебла трансгенної рослини в одному або більше міжвузлях стебла є, щонайменше на 5 95, щонайменше на 10 95, щонайменше на 15 95, щонайменше на 20 95, щонайменше на 25 95, щонайменше на 30 95, щонайменше на 35 95 або щонайменше на 40 95 більшим, ніж діаметр стебла в одному або більше міжвузлях контрольної рослини дикого типу.
ІЗ25) Варіант реалізації винаходу 101. Трансгенна зернова рослина за будь-яким з варіантів реалізації винаходу 96, яка відрізняється тим, що трансгенна зернова рослина є рослиною кукурудзи, і при цьому діаметр стебла трансгенної рослини кукурудзи в одному або більше з першого, другого, третього та/або четвертого міжвузля, розташованого нижче початку, є, щонайменше на 595, щонайменше на 10 95, щонайменше на 1595, щонайменше на 20 95, щонайменше на 25 95, щонайменше на 30 95, щонайменше на 35 95 або щонайменше на 40 95 більшим, ніж у того ж міжвузля контрольної рослини дикого типу.
ІЗ26Ї Варіант реалізації винаходу 102. Трансгенна зернова рослина за варіантом реалізації винаходу 96, яка відрізняється тим, що рівень однієї або більше активних СА в щонайменше одній тканині міжвузля стебла трансгенної рослини нижче, ніж в тієї ж тканини міжвузля контрольної рослини дикого типу. бо ІЗ27| Варіант реалізації винаходу 103. Трансгенна зернова рослина за варіантом реалізації винаходу 96, яка відрізняється тим, що рівень однієї або більше активної СА в щонайменше одній тканині міжвузля стебла трансгенної рослини є, щонайменше на 5 95, щонайменше на 1095, щонайменше на 15 95, щонайменше на 20 95, щонайменше на 25 95, щонайменше на 30 96, щонайменше на 35 95 або щонайменше на 40 95 нижчим, ніж у тієї ж тканини міжвузля контрольної рослини дикого типу.
ІЗ28) Варіант реалізації винаходу 104. Трансгенна кукурудзяна рослина, частина рослини або клітина рослини, що містить конструкцію рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 81.
ІЗ29| Варіант реалізації винаходу 105. Спосіб отримання трансгенної зернової рослини, що включає: (а) трансформацію щонайменше однієї клітини експлантата конструкцією рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 81, та (Б) регенерацію або розвиток трансгенної зернової рослини з трансформованого експлантата.
ІЗЗОЇ Варіант реалізації винаходу 106. Спосіб за варіантом реалізації винаходу 105, який відрізняється тим, що зернова рослина трансформується за допомогою опосередкованої
Адгобасієгішт трансформації або бомбардування частинками.
ЇЗ31Ї Варіант реалізації винаходу 107. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 1, 29, 55 або 81, яка відрізняється тим, що некодуюча молекула РНК містить послідовність, яка є, щонайменше на 9095, щонайменше на 9595, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 95, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або на 100 96 комплементарною, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам молекули мРНК, що кодує ендогенний білок оксидази ЗА в однодольній або зерновій рослині або рослинній клітині, причому ендогенний білок оксидази СА є, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 96, щонайменше на 97 956, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або на 100 95 ідентичним одній або більше з 5ЕО ІО МО: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30 та 33.
ЇЗ32| Варіант реалізації винаходу 108. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом
Зо реалізації винаходу 107, яка відрізняється тим, що некодуюча молекула РНК містить послідовність, яка є, щонайменше на 9095, щонайменше на 9595, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 95, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або на 100 95 комплементарною, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам з одного або більше 5ЕО ІЮ МО: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31 та 32.
ЇЗ33| Варіант реалізації винаходу 109. Конструкція рекомбінантної ДНК, що містить послідовність ДНК, придатну для транскрипції, яка кодує некодуючу молекулу РНК, при цьому некодуюча молекула РНК містить послідовність, яка є, щонайменше на 90 95, щонайменше на 9595, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 9565, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або на 100 95 комплементарною, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам молекули мРНК, що кодує ендогенний білок в однодольній або зерновій рослині або клітині рослини, при цьому ендогенний білок є, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 965, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 956, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 965, щонайменше на 99,5 95 або на 100 95 ідентичним 5ЕО ІЮО МО: 86, 90, 94, 97, 101, 104, 108, 112, 116, 118, 121, 125, 129, 133 або 136, і при цьому послідовність ДНК, що транскрибується, функціонально пов'язана з промотором придатним для експресії в рослині.
ЇЗ34| Варіант реалізації винаходу 110. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 109, яка відрізняється тим, що некодуюча молекула РНК містить послідовність, яка є, щонайменше на 9095, щонайменше на 9595, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 95, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або на 100 95 комплементарною, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам з 5ЕО ІО МО: 84, 85, 87, 88, 89, 91, 92, 93, 95, 96, 98, 99, 100, 102, 103, 105, 106, 60 107, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 119, 120, 122, 123, 124, 126, 127, 128, 130, 131, 132, 134, 135 або 137.
ЇЗ35|Ї Варіант реалізації винаходу 111. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 109, яка відрізняється тим, що промотор, який експресується в рослині, є судинним промотором.
ЇЗ36Ї Варіант реалізації винаходу 112. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 109, яка відрізняється тим, що промотор, який експресується в рослині, є промотором КТВУ.
ЇЗ37| Варіант реалізації винаходу 113. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 109, яка відрізняється тим, що промотор, який експресується в рослині, є листовим промотором.
ЇЗ38| Варіант реалізації винаходу 114. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 109, яка відрізняється тим, що промотор, який експресується в рослині, є конститутивним промотором.
ІЗ39| Варіант реалізації винаходу 115. Вектор для трансформації, що містить конструкцію рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 81.
ІЗ40) Варіант реалізації винаходу 116. Трансгенна зернова рослина, частина рослини або клітина рослини, що містить конструкцію рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 109.
ІЗ41| Варіант реалізації винаходу 117. Трансгенна зернова рослина за варіантом реалізації винаходу 116, яка відрізняється тим, що трансгенна рослина має коротшу висоту рослини та/або поліпшену стійкість до вилягання.
ІЗ421 Варіант реалізації винаходу 118. Трансгенна зернова рослина за варіантом реалізації винаходу 116, яка відрізняється тим, що рівень однієї або більше активних СА в щонайменше одній тканині міжвузля стебла трансгенної рослини нижче, ніж в тієї ж тканини міжвузля контрольної рослини дикого типу.
ІЗ43) Варіант реалізації винаходу 119. Спосіб отримання трансгенної зернової рослини, що включає: (а) трансформацію щонайменше однієї клітини експлантата конструкцією рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 116, та (Б) регенерацію або розвиток трансгенної зернової рослини з трансформованого експлантата.
Зо ІЗ44| Варіант реалізації винаходу 120. Спосіб за варіантом реалізації винаходу 119, який відрізняється тим, що зернова рослина трансформується за допомогою опосередкованої
Адгобасієегішт трансформації або бомбардування частинками.
ІЗ45) Варіант реалізації винаходу 121. Спосіб зниження рівня щонайменше однієї активної молекули СА в стеблі кукурудзи або зернової рослини, що включає: супресію одного або більше генів оксидази ЗАЗ або оксидази СА20 рекомбінантною конструкцією ДНК в одній або більше тканинах трансгенної зернової або кукурудзяної рослини.
ЇЗ46| Варіант реалізації винаходу 122. Спосіб за варіантом реалізації винаходу 121, який відрізняється тим, що конструкція рекомбінантної ДНК кодує некодуючу молекулу РНК, яка націлена на один або більше генів оксидази БАЗ або СА20 з метою супресії, при цьому послідовність ДНК, що транскрибується, функціонально пов'язана з промотором придатним для експресії в рослині.
ІЗ47| Варіант реалізації винаходу 123. Спосіб за варіантом реалізації винаходу 122, який відрізняється тим, що промотор, який експресується в рослині, є судинним промотором.
ІЗ48) Варіант реалізації винаходу 124. Спосіб за варіантом реалізації винаходу 122, який відрізняється тим, що промотор, який експресується в рослині, є промотором КТВУ.
ІЗ49| Варіант реалізації винаходу 125. Спосіб за варіантом реалізації винаходу 122, який відрізняється тим, що промотор, який експресується в рослині, є конститутивним промотором.
ЇЗ5ОЇ Варіант реалізації винаходу 126. Спосіб за варіантом реалізації винаходу 122, який відрізняється тим, що промотор, який експресується в рослині, є листовим промотором.
ЇЗ51| Варіант реалізації винаходу 127. Спосіб за варіантом реалізації винаходу 121, який відрізняється тим, що трансгенна рослина кукурудзи або зернова рослина є рослиною кукурудзи.
ІЗ521) Варіант реалізації винаходу 128. Трансгенна рослина кукурудзи або зернова рослина, що містить конструкцію рекомбінантної ДНК, при цьому конструкція рекомбінантної ДНК містить послідовність ДНК, придатну для транскрипції, яка кодує некодуючу молекулу РНК, яка націлена щонайменше на один ендогенний ген оксидази ЗА20 або САЗ з метою супресії, при цьому послідовність ДНК, що транскрибується, функціонально пов'язана з промотором придатним для експресії в рослині, і при цьому трансгенна однодольна рослина або зернова рослина має меншу висоту рослини в порівнянні з контрольною рослиною дикого типу. бо ЇЗ5ЗІЇ Варіант реалізації винаходу 129. Трансгенна кукурудзяна або зернова рослина за варіантом реалізації винаходу 128, яка відрізняється тим, що трансгенна рослина має одну або більше з наступних додаткових ознак відносно контрольної рослини: збільшений діаметр стебла, поліпшену стійкість до вилягання, глибше коріння, збільшену площу листа, більш ранню зімкнутість полога, більш високу провідність устя, нижчу висоту початку, підвищений вміст вологи в листі, підвищення стійкості до посухи, підвищення ефективності використання азоту, зниження вмісту антоціанів та площі антоціанів в листі за нормальних умов або стресових умов, викликаних обмеженою кількістю азоту або води, збільшення маси початку, збільшення індексу збору, збільшення врожаю, збільшення кількості зерна, збільшення маси зерна та збільшення плодючості.
ЇЗ54| Варіант реалізації винаходу 130. Трансгенна кукурудзяна або зернова рослина за варіантом реалізації винаходу 128, яка відрізняється тим, що висота трансгенної рослини є, щонайменше на 10 95, щонайменше на 20 95, щонайменше на 25 95, щонайменше на 30 95, щонайменше на 35 95 або щонайменше на 40 95 нижчою ніж у контрольної рослини.
ЇЗ55) Варіант реалізації винаходу 131. Трансгенна кукурудзяна або зернова рослина за варіантом реалізації винаходу 128, яка відрізняється тим, що діаметр стебла трансгенної рослини в одному або більше міжвузлях стебла є, щонайменше на 5 95, щонайменше на 10 95, щонайменше на 15 95, щонайменше на 20 95, щонайменше на 25 95, щонайменше на 30 95, щонайменше на 35 95 або щонайменше на 40 95 більшим, ніж у контрольної рослини.
ЇЗ56Ї Варіант реалізації винаходу 132. Трансгенна кукурудзяна або зернова рослина за будь-яким з варіантів реалізації винаходу 128, яка відрізняється тим, що рівень однієї або більше активних СА в щонайменше одній тканині міжвузля стебла трансгенної рослини нижче, ніж в тієї ж тканини міжвузля контрольної рослини.
ІЗ57| Варіант реалізації винаходу 133. Трансгенна кукурудзяна або зернова рослина за будь-яким з варіантів реалізації винаходу 128, яка відрізняється тим, що рівень однієї або більше активної (А в щонайменше одній тканині міжвузля стебла трансгенної рослини є, щонайменше на 595, щонайменше на 10 95, щонайменше на 1595, щонайменше на 20 95, щонайменше на 25 95, щонайменше на 30 95, щонайменше на 35 95 або щонайменше на 40 95 нижчим, ніж у тієї ж тканини міжвузля контрольної рослини.
ІЗ58) Варіант реалізації винаходу 134. Трансгенна кукурудзяна або зернова рослина за
Зо будь-яким з варіантів реалізації винаходу 128, що відрізняється тим, що трансгенна рослина не має яких-небудь значних відхилень в щонайменше одному жіночому органі або початку.
ІЗ59| Варіант реалізації винаходу 135. Трансгенна кукурудзяна або зернова рослина за будь-яким з варіантів реалізації винаходу 128, яка відрізняється тим, що трансгенна зернова рослина є рослиною кукурудзи, і при цьому некодуюча молекула РНК націлена на ендогенний ген(и) оксидази З СА20 та/або оксидази 5 СА20 з метою супресії.
ЇЗбОЇ Варіант реалізації винаходу 136. Трансгенна кукурудзяна або зернова рослина за варіантом реалізації винаходу 128, яка відрізняється тим, що промотор, який експресується в рослині є судинним промотором.
ІЗ61| Варіант реалізації винаходу 137. Трансгенна кукурудзяна або зернова рослина за варіантом реалізації винаходу 128, яка відрізняється тим, що промотор, який експресується в рослині є промотором КТВМ.
ІЗ62| Варіант реалізації винаходу 138. Трансгенна кукурудзяна або зернова рослина за варіантом реалізації винаходу 128, яка відрізняється тим, що промотор, який експресується в рослині є конститутивним промотором.
ЇЗЄЗІ| Варіант реалізації винаходу 139. Трансгенна кукурудзяна або зернова рослина за варіантом реалізації винаходу 128, яка відрізняється тим, що промотор, який експресується в рослині є листовим промотором.
ЇЗ64| Варіант реалізації винаходу 140. Трансгенна кукурудзяна або зернова рослина за варіантом реалізації винаходу 128, яка відрізняється тим, що трансгенна рослина має одну або більше з наступних додаткових ознак відносно контрольної рослини: збільшений діаметр стебла, поліпшену стійкість до вилягання, глибше коріння, збільшену площу листа, більш ранню зімкнутість полога, більш високу провідність устя, нижчу висоту початку, підвищений вміст вологи в листі, підвищення стійкості до посухи, підвищення ефективності використання азоту, зниження вмісту антоціанів та площі антоціанів в листі за нормальних умов або стресових умов, викликаних обмеженою кількістю азоту або води, збільшення маси початку, збільшення індексу збору, збільшення врожаю, збільшення кількості зерна, збільшення маси зерна та збільшення плодючості.
ІЗ65)| Варіант реалізації винаходу 141. Зернова рослина, що містить мутацію в ендогенному гені оксидази ЗА або біля нього, введену методом мутагенезу, при цьому рівень експресії бо ендогенного гена оксидази СА знижується або відсутній в зерновій рослині, і при цьому зернова рослина має меншу висоту в порівнянні з контрольною рослиною дикого типу.
ІЗ66) Варіант реалізації винаходу 142. Зернова рослина за варіантом реалізації винаходу 141, яка відрізняється тим, що трансгенна рослина, яка містить мутацію, має одну або більше з наступних додаткових ознак відносно контрольної рослини: збільшений діаметр стебла, поліпшену стійкість до вилягання, глибше коріння, збільшену площу листа, більш ранню зімкнутість полога, більш високу провідність устя, нижчу висоту початку, підвищений вміст вологи в листі, підвищення стійкості до посухи, підвищення ефективності використання азоту, зниження вмісту антоціанів та площі антоціанів в листі за нормальних умов або стресових умов, викликаних обмеженою кількістю азоту або води, збільшення маси початку, збільшення індексу збору, збільшення врожаю, збільшення кількості зерна, збільшення маси зерна та збільшення плодючості.
ІЗ67| Варіант реалізації винаходу 143. Зернова рослина за варіантом реалізації винаходу 141, яка відрізняється тим, що висота зернової рослини є, щонайменше на 10 95, щонайменше на 20 95, щонайменше на 25 95, щонайменше на 30 95, щонайменше на 35 95 або щонайменше на 40 9о нижчою ніж у контрольної рослини.
ІЗ68)| Варіант реалізації винаходу 144. Зернова рослина за варіантом реалізації винаходу 141, яка відрізняється тим, що діаметр стебла злакової рослини в одному або більше міжвузлях стебла є, щонайменше на 5 9565, щонайменше на 10 95, щонайменше на 15 95, щонайменше на 965, щонайменше на 25 95, щонайменше на 30 95, щонайменше на 35 95 або щонайменше на 20 40 95 більшим, ніж у контрольної рослини.
ІЗ69| Варіант реалізації винаходу 145. Зернова рослина за варіантом реалізації винаходу 141, яка відрізняється тим, що рівень однієї або більше активних ЗА в щонайменше одній тканині міжвузля стебла зернової рослини нижче, ніж в тієї ж тканини міжвузля контрольної рослини.
ІЗ70ОЇ Варіант реалізації винаходу 146. Зернова рослина за варіантом реалізації винаходу 141, яка відрізняється тим, що рівень однієї або більше активної СА в щонайменше одній тканині міжвузля стебла зернової рослини є, щонайменше на 595, щонайменше на 10 95, щонайменше на 15 95, щонайменше на 20 95, щонайменше на 25 95, щонайменше на 30 95, щонайменше на 3595 або щонайменше на 4095 нижчим, ніж у тієї ж тканини міжвузля
Зо контрольної рослини.
ІЗ71Ї) Варіант реалізації винаходу 147. Зернова рослина за варіантом реалізації винаходу 141, яка відрізняється тим, що зернова рослина не має яких-небудь істотних відхилень в щонайменше одному жіночому органі або початку.
ІЗ721 Варіант реалізації винаходу 148. Зернова рослина за варіантом реалізації винаходу 141, яка відрізняється тим, що зернова рослина є кукурудзяною рослиною.
ЇЗ7З3| Варіант реалізації винаходу 149. Кукурудзяна або зернова рослина, що містять геномне редагування, введене за допомогою цільового методу редагування геному в локус ендогенного гену оксидази СА або біля нього, при цьому рівень експресії ендогенного гена оксидази ЗА знижений або відсутній в порівнянні з контрольною рослиною, і при цьому редагована зернова рослина має меншу висоту в порівнянні з контрольною рослиною.
ІЗ74| Варіант реалізації винаходу 150. Редагована кукурудзяна або зернова рослина за варіантом реалізації винаходу 149, яка відрізняється тим, що редагована рослина має одну або більше з наступних додаткових ознак відносно контрольної рослини: збільшений діаметр стебла, поліпшену стійкість до вилягання, глибше коріння, збільшену площу листа, більш ранню зімкнутість полога, більш високу провідність устя, нижчу висоту початку, підвищений вміст вологи в листі, підвищення стійкості до посухи, підвищення ефективності використання азоту, зниження вмісту антоціанів та площі антоціанів в листі за нормальних умов або стресових умов, викликаних обмеженою кількістю азоту або води, збільшення маси початку, збільшення індексу збору, збільшення врожаю, збільшення кількості зерна, збільшення маси зерна та збільшення плодючості.
ІЗ75| Варіант реалізації винаходу 151. Редагована кукурудзяна або зернова рослина за варіантом реалізації винаходу 149, яка відрізняється тим, що висота редагованої рослини є, щонайменше на 10 95, щонайменше на 20 95, щонайменше на 25 95, щонайменше на 30 95, щонайменше на 35 95 або щонайменше на 40 95 нижчою ніж у контрольної рослини.
ІЗ76Ї Варіант реалізації винаходу 152. Редагована кукурудзяна або зернова рослина за варіантом реалізації винаходу 149, яка відрізняється тим, що діаметр стебла редагованої рослини в одному або більше міжвузлях стебла є, щонайменше на 5 95, щонайменше на 10 95, щонайменше на 15 95, щонайменше на 20 95, щонайменше на 25 95, щонайменше на 30 95, щонайменше на 35 95 або щонайменше на 40 95 більшим, ніж у контрольної рослини. бо ІЗ77| Варіант реалізації винаходу 153. Редагована зернова рослина за варіантом реалізації винаходу 149, яка відрізняється тим, що рівень однієї або більше активних СА в щонайменше одній тканині міжвузля стебла редагованої рослини нижче, ніж в тієї ж тканини міжвузля контрольної рослини.
ІЗ78)| Варіант реалізації винаходу 154. Редагована кукурудзяна або зернова рослина за варіантом реалізації винаходу 149, яка відрізняється тим, що рівень однієї або більше активної
СА в щонайменше одній тканині міжвузля стебла редагованої рослини є, щонайменше на 5 95, щонайменше на 10 95, щонайменше на 15 95, щонайменше на 20 95, щонайменше на 25 965, щонайменше на 30 9565, щонайменше на 35 95 або щонайменше на 40 95 нижчим, ніж у тієї ж тканини міжвузля контрольної рослини.
ІЗ79| Варіант реалізації винаходу 155. Редагована кукурудзяна або зернова рослина за варіантом реалізації винаходу 149, яка відрізняється тим, що редагована рослина не має яких- небудь істотних відхилень в щонайменше одному жіночому органі або початку.
ІЇЗ8ОЇ Варіант реалізації винаходу 156. Редагована кукурудзяна або зернова рослина за варіантом реалізації винаходу 149, яка відрізняється тим, що геномні редагування вводять із застосуванням мегануклеази, нуклеази с цинковими пальцями (2ЕМ), РНК-спрямованої ендонуклеази, ТАЇ Е-ендонуклеази (ТАГЕМ), рекомбінази або транспозази.
ІЗ81| Варіант реалізації винаходу 157. Редагована кукурудзяна або зернова рослина за варіантом реалізації винаходу 149, яка відрізняється тим, що геномне редагування включає заміну, делецію, вставку або інверсію одного або більше нуклеотидів відносно послідовності ендогенного гена оксидази СА в контрольній рослині.
ІЗ821 Варіант реалізації винаходу 158. Композиція, що містить направляючу РНК, при цьому направляюча РНК містить направляючу послідовність, яка є, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 95, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 95 або на 100 95 ідентичною або комплементарною щонайменше 10, щонайменше 11, щонайменше 12, щонайменше 13, щонайменше 14, щонайменше 15, щонайменше 16, по щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24 або щонайменше 25 послідовним нуклеотидам цільової послідовності ДНК в геномному локусі ендогенного гена оксидази СА зернової рослини або біля нього.
Зо ІЗ83|Ї Варіант реалізації винаходу 159. Композиція за варіантом реалізації винаходу 158, яка відрізняється тим, що молекула направляючої РНК містить направляючу послідовність, яка є, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 96, щонайменше на 98 965, щонайменше на 99595 або на 10095 ідентичною або комплементарною щонайменше 10, щонайменше 11, щонайменше 12, щонайменше 13, щонайменше 14, щонайменше 15, щонайменше 16, по щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24 або щонайменше 25 послідовним нуклеотидам з ЗЕО ІЮ МО: 34, 35 або 38 або послідовності, комплементарної їм.
ІЗ84| Варіант реалізації винаходу 160. Композиція за варіантом реалізації винаходу 158, яка відрізняється тим, що молекула направляючої РНК містить направляючу послідовність, яка є, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 95, щонайменше на 99 95 або на 100 95 ідентичною або комплементарною щонайменше 10, щонайменше 11, щонайменше 12, щонайменше 13, щонайменше 14, щонайменше 15, щонайменше 16, по щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24 або щонайменше 25 послідовним нуклеотидам з ЗЕО ІЮ МО: 87, 91, 95, 98, 105, 109, 113, 117, 122, 126, 130 або 137 або послідовності, комплементарної їм.
ІЗ85І| Варіант реалізації винаходу 161. Композиція за варіантом реалізації винаходу 158, яка додатково включає ендонуклеазу, що спрямовується РНК.
ІЗ86) Варіант реалізації винаходу 162. Композиція за варіантом реалізації винаходу 161, яка відрізняється тим, що направлена РНК ендонуклеаза в присутності молекули направляючої РНК викликає дволанцюговий розрив або одноланцюговий розрив в цільовій послідовності ДНК або біля нього в геномі зернової рослини.
ІЗ87| Варіант реалізації винаходу 163. Композиція за варіантом реалізації винаходу 161, яка відрізняється тим, що направлена РНК ендонуклеаза обрана з групи, що складається з Сав1,
Сав18, Саз2, Са53, Са54, Са55, Са5б, Савз7, Сав58, Са59, Са510, Сву!, Сву2г, СвуЗ3, Св5е1, Свег,
С5с1, Свс2, бзаб5, Свп1, С5п2, бвте, Сет3, С5т4, Сет, б5тб, Ст, СтіЗ3, Стг4, Ст, Стиб,
С5р1, С5р2, С563, С5х17, С5х14, Сех10, Сех16, Свах, Сех3, Сех1, С5х12, Сех15, С5И, Се,
С513, С514, СрИ, СавзхХ, Сазу, Агдопаціе та будь-яких їх гомологів або модифікованих версій, що мають активність РНК-спрямованої ендонуклеази.
ІЗ88) Варіант реалізації винаходу 164. Композиція за варіантом реалізації винаходу 158, що 60 додатково включає донорну матрицю рекомбінантної ДНК, яка містить, щонайменше, одну гомологічну послідовність або гомологічне плече, при цьому, щонайменше, одна гомологічна послідовність або гомологічне плече є, щонайменше на 7095, щонайменше на 75 95, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 965, щонайменше на 9695, щонайменше на 9795, щонайменше на 9995 або на 10095 комплементарною, щонайменше 20, щонайменше 25, щонайменше 30, щонайменше 35, щонайменше 40, щонайменше 45, щонайменше 50, щонайменше 60, щонайменше 70, щонайменше 80, щонайменше 90, щонайменше 100, щонайменше 150, щонайменше 200, щонайменше 250, щонайменше 500, щонайменше 1000, щонайменше 2500 або щонайменше 5000 послідовним нуклеотидам послідовності цільової ДНК, при цьому послідовність цільової
ДНК є геномною послідовністю в геномному локусі ендогенного гена оксидази СА кукурудзи або зернової рослини або біля нього.
ЇЗ89| Варіант реалізації винаходу 165. Конструкція рекомбінантної ДНК, що містить послідовність ДНК, придатну для транскрипції, яка кодує некодуючу молекулу направляючої
РНК, при цьому молекула направляючої РНК містить направляючу послідовність, яка є, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 95, щонайменше на 99 95 або на 100 95 комплементарною щонайменше 10, щонайменше 11, щонайменше 12, щонайменше 13, щонайменше 14, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24 або щонайменше 25 послідовним нуклеотидам цільової послідовності ДНК в геномному локусі ендогенного гена оксидази СА кукурудзи або зернової рослини або близько нього.
ЇЗ9ОЇ Варіант реалізації винаходу 166. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 165, яка відрізняється тим, що направляюча РНК містить направляючу послідовність, яка є, щонайменше на 9595, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 965, щонайменше на 9995 або на 10095 комплементарною щонайменше 10, щонайменше 11, щонайменше 12, щонайменше 13, щонайменше 14, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24 або щонайменше 25 послідовним нуклеотидам з ЗЕО ІЮО МО: 34, 35 або 38 або послідовності, комплементарної їм.
Зо ЇЗО1| Варіант реалізації винаходу 167. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 165, яка відрізняється тим, що молекула направляючої РНК містить направляючу послідовність, яка є, щонайменше на 95 9565, щонайменше на 96 965, щонайменше на 97 95, щонайменше на 99 95 або на 100 95 комплементарною щонайменше 10, щонайменше 11, щонайменше 12, щонайменше 13, щонайменше 14, щонайменше 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24 або щонайменше 25 послідовним нуклеотидам з ЗЕО ІЮ МО: 87, 91, 95, 98, 105, 109, 113, 117, 122, 126, 130 або 137 або послідовності, комплементарної їм.
ЇІЗ92| Варіант реалізації винаходу 168. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 165, яка відрізняється тим, що послідовність ДНК, яка транскрибується, функціонально пов'язана з промотором придатним для експресії в рослині.
ЇЗ93| Варіант реалізації винаходу 169. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 165, яка відрізняється тим, що молекула направляючої РНК є СКІ5БРЕ РНК (сТРНК) або одноланцюговою направляючою РНК (онНРНК).
ЇІЗ94| Варіант реалізації винаходу 170. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 165, яка відрізняється тим, що направляюча РНК містить послідовність, що комплементарна послідовності мотиву, прилеглого до протоспейсеру (РАМ), яка присутня в геномі зернової рослини, безпосередньо прилеглу до послідовності цільової ДНК в геномному локусі ендогенного гена оксидази СА або біля нього.
ЇЗ9О5| Варіант реалізації винаходу 171. Конструкція рекомбінантної ДНК за будь-яким варіантом реалізації винаходу 165, яка відрізняється тим, що послідовність РАМ містить канонічну послідовність 5'-МОС-3".
ЇЗ96|Ї Варіант реалізації винаходу 172. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 165, яка відрізняється тим, що ген ендогенної оксидази СА кодує білок, який є, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 956, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 965, щонайменше на 99,5 95 або 100 95 ідентичним ЗЕО ІЮ МО: 9, 12 або 15.
ЇЗ97| Варіант реалізації винаходу 173. Молекула ДНК, що містить конструкцію рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 165. бо ІЗ98)Ї Варіант реалізації винаходу 174. Вектор для трансформації, що містить конструкцію рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 165.
ІЗ99| Варіант реалізації винаходу 175. Бактеріальна клітина, яка містить конструкцію рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 165.
І400)| Варіант реалізації винаходу 176. Кукурудзяна або зернова рослина, частина рослини або клітина рослини, що містить конструкцію рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 165.
І401| Варіант реалізації винаходу 177. Композиція, що містить конструкцію рекомбінантної
ДНК за варіантом реалізації винаходу 165.
І4021| Варіант реалізації винаходу 178. Композиція за варіантом реалізації винаходу 177, яка додатково включає ендонуклеазу, що спрямовується РНК.
І403| Варіант реалізації винаходу 179. Композиція за варіантом реалізації винаходу 177, яка відрізняється тим, що направлена РНК ендонуклеаза обрана з групи, що складається з Сав51,
Сав18, Саз2, Са53, Са54, Са55, Са5б, Савз7, Сав58, Са59, Са510, Сву!, Сву2г, СвуЗ3, Св5е1, Свег,
Сзе1, С5с2, Сзаб5, С5п2, бет2, б5т3, Сет, Сто, Сетб, Ст, СтЗ3, Стг4, Стг5, Стгб, Се5р1,
Сб5р2, С5р3, Сех17, С5х14, С5х10, С5х16, Свах, Сех3, С5х1, Сех15, С5И, Сві2, Св5іІ3, С514, Ср,
Агдопаціе та їх гомологів або модифікованих версій, що мають активність РНК-спрямованої ендонуклеази.
І404| Варіант реалізації винаходу 180. Композиція за варіантом реалізації винаходу 177, яка додатково включає другу конструкцію рекомбінантної ДНК, що містить другу послідовність ДНК, придатну для транскрипції, яка кодує ендонуклеазу, який спрямовується РНК.
І40О5) Варіант реалізації винаходу 181. Композиція за варіантом реалізації винаходу 177, що включає молекулу ДНК або вектор, що містять конструкцію рекомбінантної ДНК та другу конструкцію рекомбінантної ДНК.
І406) Варіант реалізації винаходу 182. Композиція за варіантом реалізації винаходу 177, що включає першу молекулу ДНК або вектор та другу молекулу ДНК або вектор, при цьому перша молекула або вектор ДНК містить конструкцію рекомбінантної ДНК, що кодує молекулу направляючої РНК, а друга молекула або вектор ДНК містить другу конструкцію рекомбінантної
ДНК, що кодує ендонуклеазу, яка спрямовується РНК.
І407| Варіант реалізації винаходу 183. Композиція за варіантом реалізації винаходу 177, що додатково включає донорну матрицю рекомбінантної ДНК, яка містить, щонайменше, одну гомологічну послідовність або гомологічне плече, при цьому, щонайменше, одна гомологічна послідовність або гомологічне плече є, щонайменше на 7095, щонайменше на 75 95, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 965, щонайменше на 9695, щонайменше на 9795, щонайменше на 9995 або на 10095 комплементарною, щонайменше 20, щонайменше 25, щонайменше 30, щонайменше 35, щонайменше 40, щонайменше 45, щонайменше 50, щонайменше 60, щонайменше 70, щонайменше 80, щонайменше 90, щонайменше 100, щонайменше 150, щонайменше 200, щонайменше 250, щонайменше 500, щонайменше 1000, щонайменше 2500 або щонайменше 5000 послідовним нуклеотидам послідовності цільової ДНК, при цьому послідовність цільової
ДНК є геномною послідовністю в геномному локусі ендогенного гена оксидази СА кукурудзи або зернової рослини або біля нього.
І408) Варіант реалізації винаходу 184. Донорна матриця рекомбінантної ДНК, що містить, щонайменше, одну гомологічну послідовність, при цьому щонайменше одна гомологічна послідовність є, щонайменше на 7095, щонайменше на 7595, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 956, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 965, щонайменше на 97 95, щонайменше на 99 95 або на 100 95 комплементарною, щонайменше 20, щонайменше 25, щонайменше 30, щонайменше 35, щонайменше 40, щонайменше 45, щонайменше 50, щонайменше 60, щонайменше 70, щонайменше 80, щонайменше 90, щонайменше 100, щонайменше 150, щонайменше 200, щонайменше 250, щонайменше 500, щонайменше 1000, щонайменше 2500 або щонайменше 5000 послідовним нуклеотидам послідовності цільової ДНК, при цьому послідовність цільової ДНК є геномною послідовністю в геномному локусі ендогенного гена оксидази СА кукурудзи або зернової рослини або біля нього.
І409| Варіант реалізації винаходу 185. Донорна матриця рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 184, яка відрізняється тим, що, щонайменше, одна гомологічна послідовність містить, щонайменше, одну мутацію відносно комплементарного ланцюга послідовності цільової ДНК в геномному локусі ендогенного гена оксидази СА або біля нього.
І410) Варіант реалізації винаходу 186. Донорна матриця рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 185, яка відрізняється тим, що, щонайменше, одна мутація включає заміну, делецію, вставку або інверсію одного або більше нуклеотидів відносно комплементарного бо ланцюга послідовності цільової ДНК.
І411) Варіант реалізації винаходу 187. Донорна матриця рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 184, яка відрізняється тим, що щонайменше одна гомологічна послідовність є, щонайменше на 70 95, щонайменше на 75 95, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 965, щонайменше на 99595 або на 10095 ідентичною або комплементарною, щонайменше 20, щонайменше 25, щонайменше 30, щонайменше 35, щонайменше 40, щонайменше 45, щонайменше 50, щонайменше 60, щонайменше 70, щонайменше 80, щонайменше 90, щонайменше 100, щонайменше 150, щонайменше 200, щонайменше 250, щонайменше 500, щонайменше 1000, щонайменше 2500 або щонайменше 5000 послідовним нуклеотидам 5ЕО ІЮ
МО: 34, 35 або 38, або послідовності, комплементарної їм.
І4121) Варіант реалізації винаходу 188. Донорна матриця рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 184, яка відрізняється тим, що щонайменше одна гомологічна послідовність є, щонайменше на 70 96, щонайменше на 75 95, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 956, щонайменше на 97 965, щонайменше на 99595 або на 10095 ідентичною або комплементарною, щонайменше 20, щонайменше 25, щонайменше 30, щонайменше 35, щонайменше 40, щонайменше 45, щонайменше 50, щонайменше 60, щонайменше 70, щонайменше 80, щонайменше 90, щонайменше 100, щонайменше 150, щонайменше 200, щонайменше 250, щонайменше 500, щонайменше 1000, щонайменше 2500 або щонайменше 5000 послідовним нуклеотидам 5ЕО 10
МО: 87, 91, 95, 98, 105, 109, 113, 117, 122, 126, 130 або 137, або послідовності, комплементарної їм.
І413) Варіант реалізації винаходу 189. Донорна матриця рекомбінантної ДНК містить два гомологічних плеча, включаючи перше гомологічне плече та друге гомологічне плече, при цьому перше гомологічне плече містить послідовність, яка є, щонайменше на 70 95, щонайменше на 7595, щонайменше на 80 956, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 95, щонайменше на 99 95 або на 100 95 комплементарною, щонайменше 20, щонайменше 25, щонайменше 30, щонайменше 35, щонайменше 40, щонайменше 45, щонайменше 50, щонайменше 60, щонайменше 70, щонайменше 80, щонайменше 90, щонайменше 100, щонайменше 150, щонайменше 200,
Зо щонайменше 250, щонайменше 500, щонайменше 1000, щонайменше 2500 або щонайменше 5000 послідовним нуклеотидам першої фланкуючої послідовності ДНК, при цьому друге гомологічне плече містить послідовність, яка є, щонайменше на 70 956, щонайменше на 75 95, щонайменше на 8095, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 965, щонайменше на 9695, щонайменше на 9795, щонайменше на 9995 або на 10095 комплементарною, щонайменше 20, щонайменше 25, щонайменше 30, щонайменше 35, щонайменше 40, щонайменше 45, щонайменше 50, щонайменше 60, щонайменше 70, щонайменше 80, щонайменше 90, щонайменше 100, щонайменше 150, щонайменше 200, щонайменше 250, щонайменше 500, щонайменше 1000, щонайменше 2500 або щонайменше 5000 послідовним нуклеотидам другої фланкуючої послідовності ДНК, і при цьому перша фланкуюча послідовність ДНК та друга фланкуюча послідовність ДНК є геномними послідовностями в геномному локусі ендогенного гена оксидази СА кукурудзяної або зернової рослини або біля нього.
І414) Варіант реалізації винаходу 190. Донорна матриця рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 189, що додатково містить послідовність вставки, розташовану між першим гомологічним плечем та другим гомологічним плечем.
І415) Варіант реалізації винаходу 191. Донорна матриця рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 189, яка відрізняється тим, що послідовність вставки містить, щонайменше 1, щонайменше 2, щонайменше 3, щонайменше 4, щонайменше 5, щонайменше 6, щонайменше 7, щонайменше 8, щонайменше 9, щонайменше 10, щонайменше 20, щонайменше 30, щонайменше 40, щонайменше 50, щонайменше 60, щонайменше 70, щонайменше 80, щонайменше 90, щонайменше 100, щонайменше 200, щонайменше 300, щонайменше 400, щонайменше 500, щонайменше 750, щонайменше 1000, щонайменше 2500 або щонайменше 5000 нуклеотидів.
І416) Варіант реалізації винаходу 192. Донорна матриця рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 189, яка відрізняється тим, що кожне гомологічне плече є, щонайменше на 70956, щонайменше на 75 956, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 96, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 95, щонайменше на 99 95 або на 10095 ідентичним або комплементарним, щонайменше 20, щонайменше 25, щонайменше 30, щонайменше 35, щонайменше 40, щонайменше 45, щонайменше 50, 60 щонайменше 60, щонайменше 70, щонайменше 80, щонайменше 90, щонайменше 100,
щонайменше 150, щонайменше 200, щонайменше 250, щонайменше 500, щонайменше 1000, щонайменше 2500 або щонайменше 5000 послідовним нуклеотидам із 5БЕО ІЮ МО: 34, 35 або 38, або послідовності, комплементарної їм.
І417| Варіант реалізації винаходу 193. Донорна матриця рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 189, яка відрізняється тим, що кожне гомологічне плече є, щонайменше на 70956, щонайменше на 75 956, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 96, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 95, щонайменше на 99 95 або на 10095 ідентичним або комплементарним, щонайменше 20, щонайменше 25, щонайменше 30, щонайменше 35, щонайменше 40, щонайменше 45, щонайменше 50, щонайменше 60, щонайменше 70, щонайменше 80, щонайменше 90, щонайменше 100, щонайменше 150, щонайменше 200, щонайменше 250, щонайменше 500, щонайменше 1000, щонайменше 2500 або щонайменше 5000 послідовним нуклеотидам з 5ЕО ІЮО МО: 87, 91, 95, 98, 105, 109, 113, 117, 122, 126, 130 або 137, або послідовності, комплементарної їм.
І418) Варіант реалізації винаходу 194. Донорна матриця рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 189, яка відрізняється тим, що один або більше нуклеотидів, присутніх в геномі однодольної або зернової рослини між першою фланкуючою послідовністю ДНК та другою фланкуючою послідовністю ДНК, відсутні в молекулі донорної матриці рекомбінантної
ДНК між першим гомологічним плечем та другим гомологічним плечем.
І419| Варіант реалізації винаходу 195. Донорна матриця рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 194, яка відрізняється тим, що, щонайменше 1, щонайменше 2, щонайменше 3, щонайменше 4, щонайменше 5, щонайменше 6, щонайменше 7, щонайменше 8, щонайменше 9, щонайменше 10, щонайменше 20, щонайменше 30, щонайменше 40, щонайменше 50, щонайменше 60, щонайменше 70, щонайменше 80, щонайменше 90, щонайменше 100, щонайменше 200, щонайменше 300, щонайменше 400, щонайменше 500, щонайменше 750, щонайменше 1000, щонайменше 2500 або щонайменше 5000 нуклеотидів, присутніх в геномі однодольної або зернової рослини між першою та другою фланкуючими послідовностями ДНК, відсутні в молекулі донорної матриці рекомбінантної ДНК між першим та другим гомологічними плечима.
І420| Варіант реалізації винаходу 196. Молекула або вектор ДНК, що містять донорну
Зо матрицю рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 189.
Ї421| Варіант реалізації винаходу 197. Бактеріальна клітина або клітина-господар, що містить донорну матрицю рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 189.
І4221) Варіант реалізації винаходу 198. Кукурудзяна або зернова рослина, частина рослини або клітина рослини, що містить конструкцію рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 189.
І423| Варіант реалізації винаходу 199. Сконструйована сайт-специфічна нуклеаза, яка зв'язується з цільовим сайтом в геномному локусі ендогенного гена оксидази ЗА кукурудзяної або зернової рослини, або поруч з ним та викликає дволанцюговий або одноланцюговий розрив в цільовому сайті.
І424| Варіант реалізації винаходу 200. Сконструйована сайт-специфічна нуклеаза за варіантом реалізації винаходу 199, яка відрізняється тим, що сайт-специфічна нуклеаза є мегануклеазою або хоумінг-ендонуклеазою.
І425| Варіант реалізації винаходу 201. Сконструйована сайт-специфічна нуклеаза за варіантом реалізації винаходу 200, яка відрізняється тим, що сконструйована мегануклеаза або хоумінг-ендонуклеаза включає фермент остову або основний фермент, вибраний з групи, що складається з І-Стеї, І-Сеці, І-М5ої, І-5сеї, І-Апії та І-ЮОтої.
І426| Варіант реалізації винаходу 202. Сконструйована сайт-специфічна нуклеаза за варіантом реалізації винаходу 199, яка відрізняється тим, що сайт-специфічна нуклеаза є нуклеазою з цинковими пальцями (2ЕМ), що містить ДНК-зв'язуючий домен та домен розщеплення.
І427| Варіант реалізації винаходу 203. Сконструйована нуклеаза з цинковими пальцями по варіанту реалізації винаходу 202, яка відрізняється тим, що домен розщеплення є доменом нуклеази ЕокКІ.
І428| Варіант реалізації винаходу 204. Сконструйована сайт-специфічна нуклеаза за варіантом реалізації винаходу 199, яка відрізняється тим, що сайт-специфічна нуклеаза є ефекторною нуклеазою, яка подібна активаторам транскрипції (ТАГЕМ), що містить ДНК- зв'язуючий домен та домен розщеплення.
І429| Варіант реалізації винаходу 205. Сконструйований ТАГЕМ за варіантом реалізації винаходу 204, який відрізняється тим, що домен розщеплення вибраний з групи, що 60 складається з нуклеазного домену РмиїЇ, нуклеазного домену МиїН, нуклеазного домену Темі,
нуклеазного домену ЕоОКІ, нуклеазного домену АМ/!, нуклеазного домену МІУ, нуклеазного домену 5БІЇ, нуклеазного домену зааї, нуклеазного домену 5ї5І, нуклеазного домену СіерОкКЕ, нуклеазного домену Сіо051 та нуклеазного домену Реріб71.
І430| Варіант реалізації винаходу 206. Сконструйована сайт-специфічна нуклеаза за варіантом реалізації винаходу 199, яка відрізняється тим, що цільовий сайт, зв'язаний сайт- специфічною нуклеазою, є, щонайменше на 80 9о, щонайменше на 85 96, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 95, щонайменше на 99 95 або на 100 95 ідентичним або комплементарним, щонайменше 20, щонайменше 25, щонайменше 30, щонайменше 35, щонайменше 40, щонайменше 45, щонайменше 50, щонайменше 60, щонайменше 70, щонайменше 80, щонайменше 90, щонайменше 100, щонайменше 150, щонайменше 200, щонайменше 250, щонайменше 500, щонайменше 1000, щонайменше 2500 або щонайменше 5000 послідовним нуклеотидам з ЗЕО ІЮ МО: 34, 35 або 38, або послідовності, комплементарної їм.
І431| Варіант реалізації винаходу 207. Сконструйована сайт-специфічна нуклеаза за варіантом реалізації винаходу 199, яка відрізняється тим, що цільовий сайт, зв'язаний сайт- специфічною нуклеазою, є, щонайменше на 80 9о, щонайменше на 85 96, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 95, щонайменше на 99 95 або на 100 95 ідентичним або комплементарним, щонайменше 20, щонайменше 25, щонайменше 30, щонайменше 35, щонайменше 40, щонайменше 45, щонайменше 50, щонайменше 60, щонайменше 70, щонайменше 80, щонайменше 90, щонайменше 100, щонайменше 150, щонайменше 200, щонайменше 250, щонайменше 500, щонайменше 1000, щонайменше 2500 або щонайменше 5000 послідовним нуклеотидам з 5ЕО ІЮО МО: 87, 91, 95, 98, 105, 109, 113, 117, 122, 126, 130 або 137, або послідовності, комплементарної їм.
І4321 Варіант реалізації винаходу 208. Конструкція рекомбінантної ДНК, що містить трансген, який кодує сайт-специфічну нуклеазу, при цьому сайт-специфічна нуклеаза зв'язується з цільовим сайтом у геномному локусі ендогенного гена оксидази СА однодольної або зернової рослини, або біля нього і викликає дволанцюговий або одноланцюговий розрив в цільовому сайті.
І433| Варіант реалізації винаходу 209. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом
Зо реалізації винаходу 208, яка відрізняється тим, що трансген функціонально зв'язаний з промотором придатним для експресії в рослині.
І434| Варіант реалізації винаходу 210. Конструкція рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 208, яка відрізняється тим, що сайт-специфічна нуклеаза є мегануклеазою або хоумінггеендонуклеазою, нуклеазою з цинковими пальцями або ефекторною нуклеазою, подібною активаторам транскрипції (ТАГ ЕМ).
І435) Варіант реалізації винаходу 211. Молекула або вектор ДНК, що містить конструкцію рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 208.
І436| Варіант реалізації винаходу 212. Бактеріальна клітина або клітина-господар, що містить конструкцію рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 208.
І437| Варіант реалізації винаходу 213. Кукурудзяна або зернова рослина, частина рослини або клітина рослини, що містить конструкцію рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 208.
І438) Варіант реалізації винаходу 214. Донорна матриця рекомбінантної ДНК, що містить щонайменше одне гомологічне плече та послідовність вставки, при цьому щонайменше одне гомологічне плече є, щонайменше на 7095, щонайменше на 7595, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 956, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 965, щонайменше на 97 95, щонайменше на 99 95 або на 100 95 комплементарним, щонайменше 20, щонайменше 25, щонайменше 30, щонайменше 35, щонайменше 40, щонайменше 45, щонайменше 50, щонайменше 60, щонайменше 70, щонайменше 80, щонайменше 90, щонайменше 100, щонайменше 150, щонайменше 200, щонайменше 250, щонайменше 500, щонайменше 1000, щонайменше 2500 або щонайменше 5000 послідовним нуклеотидам послідовності геномної ДНК кукурудзяної або зернової рослини, і при цьому послідовність вставки містить конструкцію рекомбінантної ДНК, що містить послідовність ДНК, придатну для транскрипції, яка кодує некодуючу молекулу РНК, при цьому некодуюча молекула РНК націлена, з метою супресії, на один або більше ендогенних генів оксидази БА20 або САЗ в однодольній або зерновій рослині або в рослинній клітині, і при цьому послідовність ДНК, що транскрибується, функціонально зв'язана з промотором придатним для експресії в рослині.
І439| Варіант реалізації винаходу 215. Донорна матриця рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 214, яка відрізняється тим, що щонайменше одне гомологічне плече містить 60 два гомологічних плеча, включаючи перше гомологічне плече і друге гомологічне плече, при цьому перше гомологічне плече містить послідовність, яка є, щонайменше на 70 95, щонайменше на 7595, щонайменше на 80 956, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 95, щонайменше на 99 95 або на 100 95 комплементарною, щонайменше 20, щонайменше 25, щонайменше 30, щонайменше 35, щонайменше 40, щонайменше 45, щонайменше 50, щонайменше 60, щонайменше 70, щонайменше 80, щонайменше 90, щонайменше 100, щонайменше 150, щонайменше 200, щонайменше 250, щонайменше 500, щонайменше 1000, щонайменше 2500 або щонайменше 5000 послідовним нуклеотидам першої фланкуючої послідовності ДНК, а друге гомологічне плече містить послідовність, яка є, щонайменше на 70 96, щонайменше на 75 95, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 9695, щонайменше на 9795, щонайменше на 99595 або на 10095 комплементарною, щонайменше 20, щонайменше 25, щонайменше 30, щонайменше 35, щонайменше 40, щонайменше 45, щонайменше 50, щонайменше 60, щонайменше 70, щонайменше 80, щонайменше 90, щонайменше 100, щонайменше 150, щонайменше 200, щонайменше 250, щонайменше 500, щонайменше 1000, щонайменше 2500 або щонайменше 5000 послідовним нуклеотидам другої фланкуючої послідовності ДНК, при цьому перша фланкуюча послідовність
ДНК та друга фланкуюча послідовність ДНК є геномними послідовностями в одному й тому ж геномному локусі однодольної або зернової рослини або біля нього, і при цьому послідовність вставки розташована між першим гомологічним плечем та другим гомологічним плечем та містить конструкцію рекомбінантної ДНК, що містить послідовність ДНК, придатну для транскрипції, яка кодує некодуючу молекулу РНК.
І440) Варіант реалізації винаходу 216. Донорна матриця рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 215, яка відрізняється тим, що послідовність ДНК, яка транскрибується, функціонально пов'язана з промотором придатним для експресії в рослині.
І4411| Варіант реалізації винаходу 217. Донорна матриця рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 215, яка відрізняється тим, що некодуюча молекула РНК містить послідовність, яка є, щонайменше на 9095, щонайменше на 9595, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 95, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або 100 95 комплементарною, щонайменше, 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам молекули мРНК, що кодує білок оксидази ЗА, який є, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 956, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 965, щонайменше на 97 95, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або 100 95 ідентичним 5ЕО ІО МО: 9, 12, 15, 30 або 33.
І4421) Варіант реалізації винаходу 218. Донорна матриця рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 215, яка відрізняється тим, що некодуюча молекула РНК містить послідовність, яка є, щонайменше на 9095, щонайменше на 9595, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 95, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або 100 95 комплементарною, щонайменше, 15, щонайменше 16, щонайменше 17, щонайменше 18, щонайменше 19, щонайменше 20, щонайменше 21, щонайменше 22, щонайменше 23, щонайменше 24, щонайменше 25, щонайменше 26 або щонайменше 27 послідовним нуклеотидам молекули мРНК, що кодує білок оксидази ЗА, який є, щонайменше на 80 95, щонайменше на 8595, щонайменше на 90 956, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 965, щонайменше на 97 95, щонайменше на 98 95, щонайменше на 99 95, щонайменше на 99,5 95 або 100 95 ідентичним ЗЕО ІЮ МО: 86, 90, 94, 97, 101, 104, 108, 112, 116, 118, 121, 125, 129, 133 або 136.
Ї443| Варіант реалізації винаходу 219. Композиція, що містить донорну матрицю рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 214.
І444| Варіант реалізації винаходу 220. Бактеріальна клітина або клітина-господар, що містить донорну матрицю рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 214.
Ї445)| Варіант реалізації винаходу 221. Трансгенна кукурудзяна або зернова рослина, частина рослини або клітина рослини, що містять послідовність вставки донорної матриці рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 214.
І446| Варіант реалізації винаходу 222. Трансгенна кукурудзяна або зернова рослина за варіантом реалізації винаходу 214, яка відрізняється тим, що трансгенна рослина має одну або більше з наступних ознак відносно контрольної рослини: коротшу висоту рослини, збільшений діаметр стебла, поліпшену стійкість до вилягання, глибше коріння, збільшену площу листа, більш ранню зімкнутість полога, більш високу провідність устя, нижчу висоту початку, 60 підвищений вміст вологи в листі, підвищення стійкості до посухи, підвищення ефективності використання азоту, зниження вмісту антоціанів та площі антоціанів в листі за нормальних умов або стресових умов, викликаних обмеженою кількістю азоту або води, збільшення маси початку, збільшення індексу збору, збільшення врожаю, збільшення кількості зерна, збільшення маси зерна та/або збільшення плодючості.
І447| Варіант реалізації винаходу 223. Трансгенна кукурудзяна або зернова рослина за варіантом реалізації винаходу 222, яка відрізняється тим, що трансгенна рослина має коротшу висоту рослини та/або поліпшену стійкість до вилягання.
І448)| Варіант реалізації винаходу 224. Трансгенна кукурудзяна або зернова рослина за варіантом реалізації винаходу 222, яка відрізняється тим, що висота трансгенної рослини є, щонайменше на 10 95, щонайменше на 20 95, щонайменше на 25 95, щонайменше на 30 95, щонайменше на 35 95 або щонайменше на 40 95 нижчою ніж у контрольної рослини.
І449| Варіант реалізації винаходу 225. Трансгенна кукурудзяна або зернова рослина за варіантом реалізації винаходу 222, яка відрізняється тим, що рівень однієї або більше активних
СА в щонайменше одній тканині міжвузля стебла трансгенної рослини нижче, ніж в тієї ж тканини міжвузля контрольної рослини.
І450) Варіант реалізації винаходу 226. Спосіб отримання трансгенної кукурудзи або зернової рослини, що включає: (а) трансформацію щонайменше однієї клітини експлантата за допомогою зазначеної донорної матриці рекомбінантної ДНК за варіантом реалізації винаходу 215, та (5) регенерацію або розвиток трансгенної кукурудзи або зернової рослини з трансформованого експлантата, при цьому трансгенна кукурудзяна або зернова рослина містить послідовність вставки донорної матриці рекомбінантної ДНК.
І451| Варіант реалізації винаходу 227. Спосіб за варіантом реалізації винаходу 226, який відрізняється тим, що однодольна або зернова рослина трансформується за допомогою опосередкованої Адгобасіегішт трансформації або бомбардування частинками.
І4521| Варіант реалізації винаходу 228. Спосіб отримання кукурудзяної або зернової рослини, що має геномне редагування в ендогенному гені оксидази СА або біля нього, що включає: (а) введення щонайменше в одну клітину експлантата кукурудзяної або зернової рослини сайт- специфічну нуклеазу або молекулу рекомбінантної ДНК, що містить трансген, що кодує сайт- специфічну нуклеазу, при цьому сайт-специфічна нуклеаза зв'язується з цільовим сайтом в
Зо геномному локусі ендогенного гена оксидази СА або біля нього та спричиняє дволанцюговий або одноланцюговий розрив в цільовому сайті та (Б) регенерацію або розвиток редагованої кукурудзяної або зернової рослини щонайменше з однієї клітини експлантата, що містить геномне редагування в ендогенному гені оксидази (А або біля нього відредагованої кукурудзяної або зернової рослини.
І453| Варіант реалізації винаходу 229. Спосіб за варіантом реалізації винаходу 228, який відрізняється тим, що етап введення (а) додатково містить введення донорної матриці ДНК, що містить, щонайменше, одну гомологічну послідовність або гомологічне плече, при цьому, щонайменше, одна гомологічна послідовність або гомологічне плече є, щонайменше на 70 95, щонайменше на 7595, щонайменше на 80 956, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 95, щонайменше на 99 95 або на 100 95 комплементарною, щонайменше 20, щонайменше 25, щонайменше 30, щонайменше 35, щонайменше 40, щонайменше 45, щонайменше 50, щонайменше 60, щонайменше 70, щонайменше 80, щонайменше 90, щонайменше 100, щонайменше 150, щонайменше 200, щонайменше 250, щонайменше 500, щонайменше 1000, щонайменше 2500 або щонайменше 5000 послідовним нуклеотидам послідовності цільової ДНК, при цьому послідовність цільової
ДНК є геномною послідовністю в геномному локусі ендогенного гена оксидази СА кукурудзяної або зернової рослини або біля нього.
І454)| Варіант реалізації винаходу 230. Спосіб за варіантом реалізації винаходу 228, який додатково включає: (с) відбір редагованої кукурудзяної або зернової рослини.
І455)| Варіант реалізації винаходу 231. Спосіб за варіантом реалізації винаходу 230, який відрізняється тим, що етап відбору (с) включає встановлення, чи був редагований локус ендогенного гена оксидази СА із застосуванням молекулярного аналізу.
І456) Варіант реалізації винаходу 232. Спосіб за варіантом реалізації винаходу 230, який відрізняється тим, що етап відбору (с) включає встановлення, чи був редагований локус ендогенного гена оксидази СА шляхом спостереження фенотипу рослини.
І457| Варіант реалізації винаходу 233. Спосіб за варіантом реалізації винаходу 231, який відрізняється тим, що фенотип рослини є зменшенням висоти рослини відносно контрольної рослини.
І458) Варіант реалізації винаходу 234. Спосіб за варіантом реалізації винаходу 228, який бо відрізняється тим, що етап введення (а) створює щонайменше одну мутацію в геномному локусі ендогенного гена оксидази СА або біля нього, і при цьому мутація включає заміну, делецію, вставку або інверсію одного, або більше нуклеотидів відносно послідовності геномної ДНК контрольної рослини.
І459| Варіант реалізації винаходу 235. Модифікована рослина кукурудзи, яка має висоту рослини менш ніж 2000 мм, менш ніж 1950 мм, менш ніж 1900 мм, менш ніж 1850 мм, менш ніж 1800 мм, менш ніж 1750 мм, менш ніж 1700 мм, менш ніж 1650 мм, менш ніж 1600 мм, менш ніж 1550 мм, менш ніж 1500 мм, менш ніж 1450 мм, менш ніж 1400 мм, менш ніж 1350 мм, менш ніж 1300 мм, менш ніж 1250 мм, менш ніж 1200 мм, менш ніж 1150 мм, менш ніж 1100 мм, менш ніж 1050 мм або менш ніж 1000 мм та або (ї) середній діаметр стебла понад 18 мм, понад 18,5 мм, понад 19 мм, понад 19,5 мм, понад 20 мм, понад 20,5 мм, понад 21 мм, понад 21,5 мм або понад 22 мм, (ії) поліпшення стійкості до вилягання в порівнянні з контрольною рослиною дикого типу, або (ії) підвищення стійкості до посухи в порівнянні з контрольною рослиною дикого типу.
І460)| Варіант реалізації винаходу 236. Модифікована кукурудзяна рослина за варіантом реалізації винаходу 235, яка відрізняється тим, що кукурудзяна рослина має одну або більше з наступних ознак відносно контрольної рослини дикого типу: коротшу висоту рослини, збільшений діаметр стебла, поліпшену стійкість до вилягання, глибше коріння, збільшену площу листа, більш ранню зімкнутість полога, більш високу провідність устя, нижчу висоту початку, підвищений вміст вологи в листі, підвищення стійкості до посухи, підвищення ефективності використання азоту, зниження вмісту антоціанів та площі антоціанів в листі за нормальних умов або стресових умов, викликаних обмеженою кількістю азоту або води, збільшення маси початку, збільшення індексу збору, збільшення врожаю, збільшення кількості зерна, збільшення маси зерна та/або збільшення плодючості.
І461| Варіант реалізації винаходу 237. Модифікована кукурудзяна рослина за варіантом реалізації винаходу 235, яка відрізняється тим, що рівень однієї або більше активних СА в щонайменше одній тканині міжвузля стебла кукурудзяної рослини нижче, ніж в тієї ж тканини міжвузля контрольної рослини дикого типу.
І4621| Варіант реалізації винаходу 238. Модифікована зернова рослина, що має зменшену висоту рослини в порівнянні з контрольною рослиною дикого типу, та (ї) збільшений діаметр стебла в порівнянні з контрольною рослиною дикого типу, (ії) поліпшену стійкість до вилягання в
Зо порівнянні з контрольною рослиною дикого типу, або (ії) поліпшену стійкість до посухи в порівнянні з контрольною рослиною дикого типу.
І463| Варіант реалізації винаходу 239. Модифікована зернова рослина за варіантом реалізації винаходу 238, яка відрізняється тим, що рівень однієї або більше активних СА в стеблі зернової рослини нижче, ніж в контрольній рослині дикого типу.
ПРИКЛАДИ
Приклад 1. Зменшення висоти рослин у інбредних ліній кукурудзи через події трансформації по елементу супресії оксидази СА20.
Ї464| Лінія інбредних рослин кукурудзи була трансформована за допомогою опосередкованої Адгобасіегічт трансформації вектором трансформації, який має експресійну конструкцію, що включає послідовність ДНК, що транскрибується, з послідовністю (ЗЕО ІЮ МО: 39), що кодує послідовність, що націлює, (ЗЕО ІЮ МО: 40) мікроРНК під контролем промотора паличкоподібного вірусу рису тунгро (ЕТВМ) (ЗЕО ІЮ МО: 65), який, як відомо, викликає експресію в судинних тканинах рослин. МікроРНК, яка кодується цією конструкцією, містить послідовність РНК, націлену на гени оксидази З (СЗА20 та оксидази 5 СБА20 в рослинах кукурудзи з метою супресії. За допомогою цієї конструкції було проведено кілька подій трансформації, та ці трансформанти були протестовані в теплиці, щоб визначити, чи не зменшилась у них висота рослин в порівнянні з нетрансгенними контрольними рослинами дикого типу. Як проілюстровано на Фіг. 1, значне зменшення висоти рослин регулярно спостерігалося у трансгенних рослин, які експресують конструкцію супресії, через кілька подій трансформації (див. 1-8 події) в порівнянні з контрольними рослинами дикого типу (ДТ). Висота рослин для кожної з подій трансформації була розрахована як середнє значення для приблизно 10 рослин для кожної події та порівняна з середньою висотою контрольних рослин.
Середньоквадратичні помилки, представлені у вигляді планок похибок на Фіг. 1, були розраховані для кожної події та контрольних рослин. Більш того, розвиток початку у кожного з цих трансформантів був нормальним.
І465)| Як видно з результатів цього експерименту, середня висота рослин у рослин, які експресують мікроРНК, націлену на супресію генів оксидази З ЗА2О0 та оксидази 5 СА20, послідовно знижувалася протягом декількох подій до 3595 в порівнянні з контрольними рослинами. Ці дані підтверджують висновок про те, що ефекти, які спостерігаються з цією бо конструкцією супресії, не обумовлені вставкою конструкції в будь-який один локус в геномі рослини.
І466) Ці дані додатково вказують на те, що експресія цієї конструкції для супресії оксидази
СА20О0 при використанні судинного промотора КТВМ ефективна для створення цих фенотипів висоти рослин. Крім того, ранні дані на рослинах кукурудзи КО, які конститутивно експресують ту ж конструкцію супресії оксидази СА20 під контролем різних конститутивних промоторів, також дають низькорослі рослини (див. Приклад 15 нижче). Таким чином, експресія конструкції супресії, націленої на оксидазу ЗА20, може бути ефективною для зменшення висоти рослини та забезпечення інших корисних ознак, пов'язаних з врожайністю та таких, що перешкоджають виляганню, описаних в цьому документі, з огляду на те, що різні профілі експресії, включаючи судинну та конститутивну експресію, забезпечують подібні фенотипи висоти рослин без видимих відхилень початків.
Приклад 2. Зменшена висота рослин у гібридних рослин кукурудзи, що експресують елемент супресії оксидази СА20.
І467| Гібридні рослини кукурудзи, що мають конструкцію супресії оксидази СА20, описану в
Прикладі 1, також показали зменшену висоту рослин в порівнянні з контрольними рослинами дикого типу при вирощуванні в польових умовах. Обчислювали середню висоту рослини трансгенних гібридних рослин кукурудзи, що експресують елемент супресії оксидази СА20, на 10 мікроділянках та порівнювали з середньою висотою рослини контрольних гібридних рослин кукурудзи дикого типу (нетрансгенних) на 32 мікроділянках. Кожна мікроділянка для трансгенного та нетрансгенного контролю включала приблизно б рослин, хоча фактична кількість рослин на ділянку могла варіюватися в залежності від кількості рослин, які проростають та розвиваються в рослини, що мають початки. Як проілюстровано на Фіг. 2А, значне зменшення середньої висоти рослин спостерігалося у трансгенних гібридних рослин, які експресують конструкцію супресії (гібрид 5ОР-СА20ох), в порівнянні з гібридними рослинами кукурудзи дикого типу (контроль). Середньоквадратичні помилки, представлені у вигляді планок похибок на Фіг. 2А, були розраховані для трансгенних гібридів та контрольних рослин.
Зображення гібридної контрольної рослини (ліворуч) поруч з трансгенною гібридною рослиною, що експресує елемент супресії оксидази СА20 (праворуч), додатково наведено на Фіг. 28.
І468) В цьому експерименті середня висота вирощених в полі гібридних рослин кукурудзи,
Зо що експресують мікроРНК, націлених на гени оксидази З СА2О та оксидази 5 СА20, зменшилася близько на 40 95 в порівнянні з контрольними гібридними рослинами дикого типу.
Ці дані свідчать, що фенотип висоти рослин присутній у гібридних рослин кукурудзи додатково до інбредних ліній. Проте, загальна біомаса в цьому експерименті виявилася нейтральною у напівкарликових рослин кукурудзи в порівнянні з контролями.
Приклад 3. Збільшений діаметр стебла у гібридних рослин кукурудзи, що експресують елемент супресії оксидази СА20.
І469| Гібридні рослини кукурудзи, що мають конструкцію супресії оксидази СА20, описану в
Прикладі 1, також продемонстрували збільшений діаметр стебла в порівнянні з контрольними рослинами дикого типу при вирощуванні в польових умовах. Діаметр стебла вимірювали на другому міжвузлі нижче первинного початку. Розраховували середній діаметр стебла трансгенних гібридних рослин кукурудзи, що експресують елемент супресії оксидази ГК2О, на 8 мікроділянках та порівнювали з середнім діаметром стебла контрольних гібридних рослин кукурудзи дикого типу (нетрансгенних) на 8 мікроділянках. Кожна мікроділянка включала близько б рослин. Як проілюстровано на фіг. ЗА, значне збільшення середнього діаметра стебла спостерігалося у трансгенних гібридних рослин, які експресують конструкцію супресії (гібрид БОР-СА20ох), в порівнянні з гібридними рослинами кукурудзи дикого типу (контроль).
Середньоквадратичні помилки, представлені у вигляді планок похибок на Фіг. ЗА, були розраховані для трансгенних гібридів та контрольних рослин. Зображення поперечного зрізу стебла гібридної контрольної рослини (контроль; зліва) наведено поруч з поперечним зрізом стебла трансгенної гібридної рослини, що експресує елемент супресії оксидази СА20 (ЗОР СА20ох; праворуч), далі зображено на Фіг. ЗВ.
І470| В цьому експерименті середній діаметр стебла вирощених в полі гібридних рослин кукурудзи, що експресують мікроРНК, які націлені на гени оксидази З (ЗА20 та оксидази 5
СА20, збільшився приблизно на 1395 в порівнянні з контрольними гібридними рослинами дикого типу. Ці дані показують, що гібридні рослини кукурудзи, які експресують мікроРнНК оксидази ЗА20О0, можуть мати більш товсті стебла на додаток до фенотипу зі зменшеною висотою рослин.
Приклад 4. Гібридні рослини кукурудзи, які експресують елемент супресії оксидази ЗА20, мали збільшену сиру вагу початку. бо І4711|Ї Гібридні рослини кукурудзи, що містять конструкцію супресії оксидази СА20, описану в
Прикладі 1, також продемонстрували збільшену сиру вагу початку в порівнянні з контрольними рослинами дикого типу при вирощуванні в польових умовах. Розраховували середню вагу сирого початку на ділянку трансгенних гібридних рослин кукурудзи, що експресують елемент супресії оксидази СА20, на 24 мікроділянках та порівнювали із середньою вагою сирого початку гібридних контрольних рослин кукурудзи (нетрансгенних) на 8 мікроділянках. Знову ж, кожна мікроділянка включала близько 6 рослин. Як зображено на фіг. 4, збільшення середньої ваги сирого початку на ділянку спостерігалося у трансгенних гібридних рослин, які експресують конструкцію супресії (гібрид 5ИОР-СА20ох), в порівнянні з гібридними рослинами кукурудзи дикого типу (контроль), та розвиток початку і зерна був нормальним. Стандартні відхилення для цього експерименту, представлені у вигляді планок похибок на Фіг. 4, були розраховані для трансгенних гібридів та контрольних рослин. Як проілюстровано на Фіг. 5, аналогічні результати були отримані на іншому сайті для польових випробувань, який також зазнав пошкодження від вітру.
І472) В цьому експерименті середня вага сирого початку вирощених в полі гібридних рослин кукурудзи, що експресують мікроРНК, націлені на гени оксидази З БА20 та оксидази 5 СА20, був збільшений в порівнянні з контрольними гібридними рослинами дикого типу, що вказує на те, що ці трансгенні рослини можуть додатково мати покращені ознаки, пов'язані з врожайністю.
Проте, ці результати засновані на даних спостережень без великомасштабного статистичного порівняння з контролями, та показники врожайності слід розглядати в умовах вирощування на великих полях.
Приклад 5. Гібридні рослини кукурудзи, які експресують елемент супресії оксидази ЗА20, демонстрували підвищену стійкість до вилягання.
Ї473| У місці проведення польових випробувань пошкодження вітром гібридних рослин кукурудзи перед цвітінням показало підвищену стійкість до вилягання рослин, які експресують конструкцію супресії оксидази СЗА20, описану в Прикладі 1, в порівнянні з контрольними гібридними рослинами дикого типу. У той час як гібридні контрольні рослини дикого типу (нетрансгенні) були візуально покладеними у відповідь на сильний вітровий вплив, трансгенні гібридні рослини кукурудзи, які експресують елемент супресії оксидази СА20, на сусідньому полі, показали стійкість до вилягання. Щоб оцінити ефекти стійкості до вилягання гібридними
Зо рослинами кукурудзи, що експресують конструкцію супресії оксидази СА20, середня вага сирих початків на ділянку у трансгенних гібридних рослин кукурудзи, які супресують оксидазу СА20, в двох місцях польових випробувань, схильних до вилягання, порівнювали із середньою вагою сирих початків гібридних контрольних рослин дикого типу. Дані, зібрані в цих двох дослідженнях, показали, що гібридні контрольні рослини мали знижену середню вагу сирого початку приблизно на 57 95 та 81 95, відповідно для двох досліджень, у порівнянні з гібридними рослинами, що експресують конструкцію супресії оксидази СА20.
І474| Візуальне спостереження того, що гібридні трансгенні рослини кукурудзи, що експресують оксидазу (зЗА20, мали підвищену стійкість до вилягання в порівнянні з нетрансгенними контрольними рослинами, поряд зі збільшенням середньої ваги сирого початку в цих випробуваннях з трансгенними рослинами, які супресують оксидазу СА20, показують, що підвищена стійкість до вилягання може пояснювати збільшення середньої ваги сирого початку.
Таким чином, підвищена стійкість до вилягання рослин, які супресують оксидазу ЗА20, може додатково збільшити потенціал врожайності/стабільність цих трансгенних рослин кукурудзи завдяки протистоянню ефектів вилягання під час суворих погодних явищ.
Приклад 6. Гібридні рослини кукурудзи, які експресують елемент супресії оксидази СА20, показали збільшення індексу врожайності.
І475) Гібридні рослини кукурудзи, що містять конструкцію супресії оксидази СА20, описану в
Прикладі 1, додатково продемонстрували збільшення індексу врожайності в порівнянні з контрольними рослинами дикого типу при вирощуванні в польових умовах. Індекс врожайності трансгенних гібридних рослин кукурудзи, що експресують елемент супресії оксидази БА20, визначали для рослин, вирощених на 8 мікроділянках, і порівнювали з нетрансгенними гібридними контрольними рослинами кукурудзи. Кожна мікроділянка включала близько 6 рослин. Як проілюстровано на Фіг. 6, значне збільшення індексу врожайності спостерігалося у трансгенних гібридних рослин, які експресують конструкцію супресії (гібрид 5БОР-СА20ох), в порівнянні з гібридними рослинами кукурудзи дикого типу (контроль). Середньоквадратичні помилки, представлені у вигляді планок похибок на Фіг. 6, були розраховані для трансгенних гібридів та контрольних рослин.
І476| В цьому експерименті індекс врожайності вирощених в полі гібридних рослин кукурудзи, що експресують мікроРНК, які націлені на гени оксидази З (ЗА20 та оксидази 5 бо СА20, збільшився приблизно на 1195 в порівнянні з контрольними гібридними рослинами дикого типу. Дане збільшення індексу врожайності було додатково пов'язано зі зменшенням ваги соломи в порівнянні з контрольними рослинами дикого типу, проте у трансгенних рослин не спостерігалося відмінностей в загальній сухій вазі біомаси.
Приклад 7. Гібридні рослини кукурудзи, які експресують елемент супресії оксидази ЗА20, показали збільшення середньої оцінки врожайності зерна.
І477| Середня оцінка врожайності зерна для гібридних рослин кукурудзи, що експресують елемент супресії оксидази СА20 (ідентифікований у Прикладі 1), була розрахована для 16 мікроділянок на поле (з приблизно б рослинами на ділянку). Розрахована середня оцінка врожайності зерна для цих трансгенних гібридних рослин кукурудзи, які супресують оксидазу
СА20, збільшилася приблизно на 15 95 в порівнянні з контрольними гібридними рослинами кукурудзи (Фіг. 7). Оцінка врожайності зерна є показником, який представляє загальну оцінку очікуваної врожайності, засновану на показниках ознак початку. Оцінка врожайності зерна отримана з початків, зібраних вручну на невеликих ділянках, а одиницями виміру є кг/га (замість буш/акр). Оцінка врожайності зерна (кг/га) розраховується за формулою (кількість зерна на одиницю площі (зерен/м2) Х вагу одного зерна (мг) х 15,5 95 / 100).
Приклад 8. Гібридні рослини кукурудзи, які експресують елемент супресії оксидази ЗА20, мали збільшення середнього показника плодючості.
І478| Гібридні рослини кукурудзи, які експресують елемент супресії оксидази СА20 (ідентифікований у Прикладі 1), також показали в експерименті на мікроділянці, що вони мають підвищену плодовитість та вторинні початки в порівнянні з нетрансгенними гібридними контрольними рослинами. Оцінка плодючості була визначена по 10 мікроділянках трансгенних гібридних рослин кукурудзи в полі (приблизно 6 рослин на ділянку). Як проілюстровано на фіг. 8, середній показник плодючості трансгенних гібридних рослин кукурудзи, які супресують оксидазу
СА20, становив 3, тоді як середній показник плодючості контрольних рослин становив 1. Для визначення оцінки плодючості рослини аналізували на розвиток вторинних початків на стадії розвитку КІ. Рослини оцінювали за такою шкалою: 1 - утворення невеликого вторинного початку або його відсутність; 2 - викидання маточкових стовпчиків видно на вторинному початку; З - розвинений вторинний початок виникав з листової піхви початку; та 4 - гарний розвиток вторинного початку, подібного первинному початку. Збір врожаю в кінці сезону також
Зо показав, що принаймні деякі вторинні початки були продуктивними з нормально розвиненими зернами.
Приклад 9. Широкі дослідження врожайності та ознак на полі з гібридними рослинами кукурудзи, трансформованими конструкцією супресії оксидази СА20.
І479| Конструкція супресії оксидази (А20, описана в Прикладі 1, була трансформована в комерційну жіночу інбредну лінію кукурудзи, та був створений ряд подій трансформації.
Трансформовані рослини вирощували та самозапилювали для накопичення достатньої кількості насіння, а потім схрещували з різними комерційними чоловічими інбредними лініями кукурудзи для отримання гібридних рослин кукурудзи. Кожна окрема чоловіча інбредна лінія, що застосовується для отримання чоловічого-жіночого гібрида, називається тестером. Потім гібридні рослини кукурудзи з різними тестерами вирощували на великих полях в польових умовах відповідно до стандартної агрономічної практики (ЗАР-5їапдата адгопотіс ргасіїсе).
Щільність посадки для 5АР становила 83 640 рослин на гектар з інтервалом 76 сантиметрів.
Ї480| Для польових випробувань, чотири різних події трансформації, що експресують конструкцію супресії оксидази ЗА20, були схрещені з двома різними лініями комерційного тестера. Потім гібридні рослини кукурудзи були протестовані в 16 географічних точках в 6 штатах США на Середньому Заході. Врожай трансгенних гібридних рослин кукурудзи в цих місцях розраховували та порівнювали з урожаєм нетрансгенних гібридних контрольних рослин кукурудзи. В Таблиці 4 представлена різниця врожайності в тонах/гектар між трансгенними гібридними рослинами кукурудзи для кожної події в порівнянні з нетрансгенним контролем.
Негативне число вказує на зниження врожаю. Відмінності по врожайності зі статистичним значенням р менше 0,2 вказані в Таблиці 4 жирним шрифтом та курсивом. Цей запис також застосовується для вказівки статистичної значущості для решти таблиць в цих прикладах, якщо не вказано інше. Як показано в Таблиці 4 під заголовком 5АР, значне збільшення врожайності спостерігалося у трансгенних гібридних рослин кукурудзи, що експресують конструкцію супресії (трансгенні рослини) в умовах БАР, відносно гібридних рослин кукурудзи дикого типу (Контроль). Значне збільшення врожайності спостерігалося по 4 трансгенним подіям та 2 контрольним лініям.
Ї481| Порівнянне велике дослідження врожайності було проведено в умовах високої щільності (НО), з 103 320 рослин на гектар та відстанню між рядами 76 сантиметрів, і в бо порівнянні зі стандартною агрономічної практикою (5АР). Відмінності в врожайності в умовах НО представлені в Таблиці 4 під заголовком НО. Змішані результати були отримані в цих умовах високої щільності з урожаєм, що варіюється в залежності від подій та тестерів. Проте, збільшення врожаю спостерігалося для двох подій з одним з двох тестерів, та залишається можливість для більш високого врожаю через більшу кількість зародкової плазми в різних умовах високої щільності.
Таблиця 4
Різниця у великій врожайності між трансгенними рослинами та контролем при 5АР та НО
Подія3 | 23 | 18 | 2 5 ющ | 76 | 9 | 07
І482| Випробування ознак також проводилися в полях з метою вимірювання ряду ознак розвитку та репродуктивних ознак. Ці випробування проводилися з нормальною щільністю (ЗАР), як описано вище, та в умовах посадки надвисокої щільності (НО) 132 840 рослин на гектар з відстанню між рядами 50 сантиметрів. Випробування проводилися на гібридних рослинах кукурудзи з 7 подіями трансформації та З тестерами, і дані для кожного тестера були об'єднані за 7 подіями.
І483) Таблиця 5 підсумовує результати випробувань ознак на гібридних рослинах кукурудзи.
Виміром є або різниця у відсотках, або різниця в днях або кількості листя між трансгенними рослинами та контролем. Де це доречно, стадія розвитку, така як КЗ тощо, на якій було виконано вимір, вказана в дужках під стовпцем "Назва Ознаки". Скидання пилку вимірюється з точки зору кількості днів від проростання до 50 95 рослин, що скидають пилок. Появу викидання маточкових стовпчиків вимірюють за кількістю днів від проростання до 50 95 рослин, викидають маточкові стовпчики. Інтервал між скиданням пилку та викиданням маточкових стовпчиків є результатом вимірювання кількості днів від 50 9о рослин, що скидають пилок до викидання маточкових стовпчиків. Сила стебла є мірою сили, при якій сегмент стебла ламається в поперечному напрямку із застосуванням спеціального інструменту для ламання стебла. Індекс площі листя (ГАЇ-Ієаї агеа іпаех) є безрозмірною величиною, що характеризує протяжність полога рослини, яка визначається як площа одностороннього зеленого листа на одиницю площі поверхні землі в межах простору широколистяного полога.
Таблиця 5
Відмінності в ознаках між трансгенними та контрольними рослинами в ЗАР та НО нннІ"?н"внИисшшШИННиНшННИшІ 76 см ЗАР 50 см ОНО
Вимір | НазваОзнаки (Гестер-1| Тестер-2 |Тестер-3|Тестер-1|Тестер-2| Тестер-3
Висота рослини (КЗ) 96 Різниці нижче 1,82 метрів
Висота початку (3)
Висота початку вище тд о |тТАК ТАКО ТАКО ТАКО |ТАК сантиметрів нннІ"?н"внИисшшШИННиНшННИшІ 76 см ЗАР 50 см ОНО
Вимір | НазваОзнаки (| Гестер-1| Тестер-2 |Тестер-3|Тестер-1|Тестер-2| Тестер-3
Довжина міжвузля . . . . . (початок мінус 2) (23) 342 34,7 34 449 36,4 42,3
Довжина міжвузля . . . . . (початок мінус 4) (23) 542 49,4 54,9 60,1 55,7 59,4
Діаметр стебла (2 вузли нижче початку) 44 5,6 4,5 37,7 43,1 35,5
ВЗ
. . Діаметр стебла (4 о
Різниці вузли нижче початку) 3,9 -1,6 1 16,3 15,6 16,5
ВЗ
Міцність стебла 2-го вузла нижче початку 10,2 0,1 0,7 501 115 ІН/Д
Во
Міцність стебла 4-го вузла нижче початку -13,6 -22,3 -11,5 13,3 78,4 |Н/Д
Во ни я я Я ПНЯ ПОЛЯ ПО ПОХ
Інтервал між скиданням пилку та викиданням -0,88 -1 -0,5 -0,33 -0,07 маточкових стовпчиків
Поява викидання маточкових 0,63 -0,25 -0,38 -0,26 -1,03 стовпчиків ни я я Я ПНЯ ПОЛЯ КОХ ПОХ
Зелений лист Ме (В4)
Зелений лист Ме (5)
Число Зелений лист Ме (105 | 04 | 03 | ли | 09 днів після К5)
Зелений лист Ме (14 да | 04 | 02 | 07. | 03 | 03 днів після К5) нин я Я ПНЯ ПНЯ ПОЛЯ ПОЛ ПОЛ
Фо Різниці Індекс о с
Індекс площі листя 23 БА 3,6 202 19 157
Мм12
Ї484| Як показано в Таблиці 5, у трансгенних рослин в порівнянні з контролем спостерігалося значне зменшення висоти рослини, висоти початку та довжини міжвузля. 5 Трансгенні рослини постійно демонструють висоту рослин нижче 1,82 метра та висоту початків вище 45 сантиметрів, що дозволяє збирати врожай без внесення змін до обладнання. В цьому експерименті спостерігалося збільшення діаметра стебла, особливо в умовах з більш високою щільністю посадки.
І485) Таблиця 6 підсумовує результати випробування ознак початку для гібридної кукурудзи.
Випробування проводилися на гібридних рослинах кукурудзи з 7 подіями трансформації та З тестерами, і дані для кожного тестера були об'єднані за 7 подіями. Вимірювання є різницею у відсотках дельти між трансгенними рослинами та контролем. Де це доречно, стадія розвитку, така як КЗ тощо, на якій було виконано вимір, вказана в дужках під стовпцем "Назва Ознаки".
Площа початку є середнім розміром початку на графіку з точки зору площі з двомірного зображення, отриманого при візуалізації початку, включаючи зерна та вільний простір. Діаметр початку є середнім розміром діаметра початку, виміряним як максимальна "широка" вісь початку по його найширшому перетині. Довжина початку є середнім розміром довжини початку, виміряним від кінчика початку по прямій лінії до основи вузла початку. Кінчик початку моїй рсї є середнім розміром відсотка площі вільного простору у верхній 3095 області початку, з двомірного зображення, отриманого при візуалізації початку, включаючи зерна та вільний простір. Вільний простір початку є середнім розміром відсотка площі вільного простору на початку, з двомірного зображення, виміряного при візуалізації початку, включаючи зерна та вільний простір. Оцінка врожайності зерна визначена в Прикладі 7. Зерна на одиницю площі вимірюються як середнє значення числа зерен на одиницю площі поля. Початки збирали з заданої довжини ряду, зазвичай одного метра, та обмолочували і об'єднували для підрахунку зерен, а потім кількість перераховували в загальну кількість зерен на одиницю площі поля. Вагу одного зерна вимірювали як середнє значення ваги на зерно. Це розраховувалося як співвідношення (маса зразка зерна відрегульована до 15,5 95 вологості)/кількість зразка зерна).
Зерна на початок є середнім значенням кількості зерен на початок. Це розраховувалося як (загальна вага зерна/одинична вага зерна"загальна кількість початків), де загальна вага зерна та загальна кількість початків вимірюються за зразками початку на площі від 0,19 до 10 квадратних метрів.
Таблиця 6
Відмінності в ознаках початку між трансгенними та контрольними рослинами, під БАР та НО 11111111 7бомЗАР. | | 777 5бсмОНО ГГ о НазваОзнаки /Тестер-1 |Тестер-2 |Тестер-3| |Тестер-1 | Тестер-2 | Тестер-3
Областьпочатку(Вб)(см) | 55 | 116 | 48 || 149 | 169. | 88
Діаметрпочатку(Вб)(мм) | -22 | 007 | 25 || 7 | 13 | 18
Довжина початку(Вб)(см) | 7,3 | 125 | 74 || 154 | 143 | М пси зи м и вв нт простір рсї (Кб) (90) питне зале 5 | зв
Пенн те ле) зе, оте) вв (Кб) (кг/га)
Зерна на одиницю площі вуса и | ве 67 пе | яв пон в зе ов | зви ве) во (кількість)
Вагаодного зерна(Вб)(мо | 18 | 51 | 771 || -05 | лез | -75
І486) Як показано в Таблиці 6, спостерігалося значне збільшення площі початку та довжини початку в цих експериментах для трансгенних рослин в порівнянні з контролем. Також було помітно зменшення діаметра початку. В цьому експерименті оцінка врожайності зерна була в основному нейтральною між трансгенними рослинами та контролем.
І487| Додаткові дані були зібрані в польових умовах зі стандартною щільністю за 8 подій, що схрещені з одним тестером, що свідчить про зменшення висоти рослини, висоти початку та довжини міжвузля, а також збільшення діаметра стебла та індексу збору в порівнянні з контролем (дані не показані). Висоту рослин вимірювали від землі до самого верхнього листа з язичком на стадії КЗ. Висота початку вимірювалася від землі до вузла початку на стадії КЗ.
Діаметр стебла вимірювали в середині 2-го вузла стебла нижче початку, якщо не вказано інше.
Ці дані продемонстрували високу пенетрантність ознак висоти рослин та стебла за подіями, хоча збільшення плодючості (або кількості вторинних початків) не було значним або вираженим в цих дослідженнях.
І488| В окремому експерименті зростання висоти рослини вимірювали від стадії М11 до стадії КІ! і далі. На Фіг. 9 проілюстровані відмінності у висоті рослин між трансгенними рослинами та контролем за цей період часу. На фігурі намальовані пунктирні лінії для висоти 152 см та 183 см для довідки.
Приклад 10. Трансгенні рослини виявляли поліпшені ознаки в стресових умовах, викликаних нестачею азоту та води в умовах контрольованого середовища.
І489) Цей приклад ілюструє посилену реакцію на стрес, викликаний нестачею води та азоту у трансгенних рослин кукурудзи, що мають конструкцію супресії оксидази БА20, описану в
Прикладі 1, в порівнянні з контролем в автоматизованій теплиці (АТ) або в полі, як зазначено.
Пристрій та способи автоматичного фенотипічного аналізу рослин в АТ описані, наприклад, в публікації патенту США Мо 2011/0135161, яка включена в цей документ за допомогою посилання у всій своїй повноті.
І490) В умовах АТ рослини кукурудзи тестували в п'яти різних умовах, включаючи відсутність стресу, стресові умови слабкого та помірного дефіциту азоту і помірного дефіциту води.
Рослини кукурудзи вирощували в особливих стресових умовах, наведених в Таблиці 7.
Таблиця 7
Опис п'яти умов зростання в АТ
Відсутністьстресу.ї/ 77771111 5096 | 8ММсСсСсСшС.уД
Воднийдефіцит мякий 17777777 4096 77777777 8ММ1ССсСшС
Воднийдефіцитпомірний | 35967777 8ММ1ССсСшС
Дефіцитазоту м'який 17777771 5096 | бмММССсСшщС.уД
І491| Дефіцит води визначаються як питомий об'ємний вміст води (ОВВ), який нижче, ніж
ОВВ рослини, яка не піддається стресу. Наприклад, рослину, не схильну до стресу можна підтримувати при 50 95 ОВВ, а ОВВ для аналізу дефіциту води можна визначити між 35 95 та 40 95 ОВВ. Дані були зібрані із застосуванням візуалізації у видимому світлі та гіперспектральної візуалізації, а також безпосереднього вимірювання маси горщика і кількості води та поживних речовин, які щодня вносяться до окремих рослин. Дефіцит азоту визначається (частково) як питома концентрація азоту в мМ, яка нижче концентрації азоту в рослині, що не піддається стресу. Наприклад, рослина, не схильна до стресу може підтримуватися при 8 мМ азоту, тоді як концентрація азоту, що застосовується в аналізі дефіциту азоту, може підтримуватися в концентрації від 4 до 6 мМ.
І492| Для перевірки було виміряно до десяти параметрів. Вимірювання на основі візуалізації у видимому світлі: висота рослини, біомаса та площа полога. Висота рослини (Ріпін) відноситься до відстані від вершини горщика до найвищої точки рослини, отриманої з бокового зображення (мм). Біомаса (Вітав55) визначається як розрахункова сира вага пагонів (г) рослини, отримана із зображень, що отримані з різних кутів. Площа полога (Спор) визначається як площа листа, якщо дивитися зверху вниз (мм2). Оцінка та площа антоціана, оцінка та концентрація хлорофілу та оцінка вмісту води були виміряні за допомогою гіперспектральної візуалізації.
Оцінка антоціанів (Апі5) є оцінкою антоціанів в листовому полозі, яка отримана з гіперспектральної візуалізації зверху вниз. Область антоціанів (АпіА) є оцінкою антоціанів у стеблі, яка отримана з гіперспектральної візуалізації при погляді збоку. Оцінка хлорофілу (Сігр5) та концентрація хлорофілу (СігрС) є вимірами хлорофілу в листовому полозі, які
Зо отримані з гіперспектральної візуалізації зверху вниз, де оцінка хлорофілу вимірюється у відносних одиницях, а концентрація хлорофілу вимірюється в одиницях частин на мільйон (чнм). Вміст води в листі (РІГ/ЛІСО є виміром води в листовому полозі, який отриманий з гіперспектральної візуалізації зверху вниз. Коефіцієнт корисного використання води (УМОЕ-У/аїег
Ов5е Ейісіепсу) визначається з грамів рослинної біомаси на літр доданої води. Внесена вода (МЛгАр) є прямим вимірюванням води, доданої в горщик (горщик без отвору) в ході експерименту. Ці фізіологічні експерименти були організовані таким чином, щоб тестовані трансгенні рослини порівнювалися з контролем. Трансгенні рослини з двома подіями трансформації вимірювали в порівнянні з контролем. Всі дані представлені у процентній відмінності дельти трансгенної рослини по відношенню до контролю. Точка вимірювання зі статистичними р-значенням « 0,1 показана жирним курсивом. Інші точки вимірювань мають р- значення » 0,1.
І493) В Таблиці 8 наведені результати випробування ознак в АТ, виміряних через 21 день після посадки на вегетативній стадії, тоді як в Таблиці 9 наведені результати випробувань ознак в АТ, виміряних через 55 днів після посадки на репродуктивній стадії, у трансгенних рослин, що мають одну з двох подій конструкції супресії оксидази СА20, яка описана в Прикладі 1, відносно контрольних рослин.
Таблиця 8
Трансгенні рослини проти контрольних рослин в теплиці в нормальних та стресових умовах, через 21 день після посадки
Назва. ІВідсут| Дефіцит азоту Відсут| Дефіцит азоту стрес Р Р стрес Р Р рослини
Біомаса) -0,06 | -8,9 | 5,61 |-748| 847 полога
Вміст вологи ві 18,6 23 16,3 55 10,1 30,9 15,5 55,9 21,4 листі
Площа антоці- | -38,9 | -28,9. | -35,4 -А1 -55,5 -42,3 -39,7 -35,4 -46 -26 анів
Оцінка антоці- |-10,21 | -14,5 -2,9 129,5 2,4 78,1 4,5 3,3 119,6 -2,5 анів
Концен- траця | 12 | об | 004 |-584| 327 8056 | -203 ) -346в | -414| 2,05 хлоро- філу
Таблиця 9
Трансгенні рослини проти контрольних рослин в теплиці в нормальних та стресових умовах, через 55 днів після посадки 1111 подіяї СС
Відсут- | Дефіцит азоту Відсут- | Дефіцит азоту
Назва ність |Дедкий) Помір- | Дегкий | Помір- ність Легкий) Помір- |Дегкий Помірний
Ознаки| стресу ний ний стресу ний р
Висота рос- -1,9 Й 1Н/Д ІН/Д -40,7 | -25,4 -3,3 . ІН/Д Н/Д -41,93 | -29,6 лини початку
Шені ее ва лат, 60 ее ля вв соломи
Індекс
Внесе- ск» з (ня ндо|лее| зи
І494) Як показано в Таблиці 8, у порівнянні з контролем трансгенні рослини виявляли деякі поліпшені ознаки, пов'язані зі стресостійкістю, та зберігали інші позитивні ознаки в умовах стресу. Висота рослин значно зменшилася у всіх обробках та не була порушена стресовим станом. Площа біомаси та пологу була нейтральною в умовах відсутності стресу, але збільшилася у більш важких стресових умовах. Вміст вологи в листі значно збільшився в умовах відсутності стресу та стресових умовах, що вказує на те, що трансгенні рослини утримують більше води в тканинах листя. Площа антоціанів значно зменшилася в умовах відсутності стресу та стресових умовах, що вказує на відсутність дефіциту азоту у трансгенних рослин.
Ї495| Як показано в Таблиці 9, у порівнянні з контролем, у трансгенних рослин спостерігалося значне зменшення в ознаках внесеної води, УМШЕ, біомаси та маси стебла, що вказує на те, що у трансгенних рослин була покращена ефективність використання води, причому рослинам з більш низькою біомасою потрібно менше води. Індекс збору значно зріс в умовах відсутності стресу та стресових умовах.
Приклад 11. Трансгенні рослини виявляли підвищену стійкість до посухи, провідність устя та швидкість росту кореня на репродуктивних стадіях як за стандартної, так і за високої щільності посадки в полі.
І496)| Прямі спостереження були зроблені по зменшенню скручування листя в трансгенних рослинах кукурудзи, що мають конструкцію супресії оксидази ЗА20 з Прикладу 1, в умовах посухи в польових умовах в порівнянні з контрольними рослинами. Скручування листя кукурудзи відбувається, коли потенціал води в листі падає нижче порогу приблизно -1,1 МПа.
Провідність устя також зменшується при водному стресі. Стабільні співвідношення ізотопів кисню (0180) застосовувалися в якості показника провідності устя, які обернено пропорційні провідності устя. Значне зниження 6180, та таким чином, значне збільшення провідності устя трансгенних рослин в порівнянні з контролем спостерігалося у зразках листя початку, зібраних на стадії К5 (див., Фіг. 10). Дані були взяті з трансгенних рослин за дві події трансформації та усереднені по 10 тестерам з 2 повтореннями на тестер. Збільшення 5180 в листі контрольних рослин вказує на те, що провідність устя була нижче для контролю. У поєднанні зі зменшенням скручування листя, яке спостерігається в польових умовах, значне збільшення провідності устя в листі трансгенних рослин в результаті випробувань на врожайність в 15 з 16 польових розташувань вказує на поліпшення стану вологи в листі під час пізнього вегетаційного росту трансгенних рослин.
І497| Ефективне поглинання води корінням є важливим фактором росту рослин. Щоб виміряти прогрес у розвитку глибини вкорінення, ємнісні датчики вологості грунту ЗепіекФф 5ОГО були встановлені на стадії М4 в ряді між рослинами в одному польовому місцезнаходженні. Вологість грунту щогодини вимірювали ємнісними датчиками на глибинах 10, 20,30, 50, 70, 90, 120 та 150 см від рівня землі. Глибина фронту вкорінення визначалася наявністю добових структур при виснаженні вологи в грунті, зафіксованих датчиками. Коренева активність вже була присутня на глибині 10, 20 та 30 см під час установки на стадії МА. Ми виявили першу появу виснаження вологи в грунті на глибинах 50, 70 та 90 см. Грунт на глибині 120 та 150 см був насичений протягом всього періоду вегетації. Хоча ріст коренів, можливо,
З5 досяг цих глибин, ми не змогли виявити активність коренів на цих глибинах для цього експерименту через неможливість виявити виснаження вологи в грунті в насиченій зоні. На Фіг. 11 проілюстровано час (дні після посадки) для фронтального кореня рослини, необхідний для досягнення різних глибин на осі У. Лінії з кружками призначені для рослин з кроком міжрядь 76 сантиметрів та густотою посадки 83 640 рослин на гектар, а лінії з квадратами - для рослин з кроком міжрядь 50 сантиметрів та густотою посадки 135 300 рослин на гектар. Стадії рості показані на осі Х.
І498| Як проілюстровано на Фіг. 11, ріст кореня в цьому експерименті був схожим між трансгенними та контрольними рослинами аж до М12, причому коріння досягали глибини 50 та 70 см через близько 30 та 36 днів після посадки, відповідно. Однак коріння трансгенних рослин досягли глибини 90 см в К1 або раніше (тобто, через близько 50 днів після посадки), або на близько 20 днів раніше, ніж коріння контрольних рослин. Трансгенні рослини виявляли підвищену швидкість фронту вкорінення після стадії М11/Л/12, що може призвести до посилення запобігання посухи в критичний період розвитку рослини під час цвітіння. Це збільшення швидкості фронту вкорінення може дозволити трансгенним рослинам використовувати більш глибокі запаси грунтової води протягом критичного періоду на стадії К1, що дозволяє уникнути, зменшити або мінімізувати вплив посухи на цвітіння та запилення. Покращене запилення в умовах посухи може поліпшити набір зерен та потенціал врожайності. 499) Щоб доповнити наведений вище польовий експеримент з датчиками вологості, швидкість кореневого фронту для трансгенних рослин кукурудзи, що мають конструкцію супресії оксидази ЗА20 з Прикладу 1 (п-10), була виміряна в експерименті з кореневим ящиком та порівняна з контрольними рослинами дикого типу (п-9). Кореневі ящики з плексигласу (1,5 метра у висоту та п'ятнадцять на двадцять сантиметрів в поперечному перерізі; товщина стінок 125 сантиметра) були заповнені сумішшю Ж 10 польовий грунт/вермикуліт/перліт (співвідношення 1:1:1) та застосовувалися для візуалізації коренів кожної рослини. бо Максимальна глибина вкорінення в кожному ящику вимірювалася через рівні проміжки часу після посадки (приблизно кожні два дні). В цьому експерименті середня глибина фронтового кореня трансгенних рослин була послідовно більшою або глибшою, ніж у контрольних рослин
ДТ, починаючи з близько 21-го дня після посадки (тобто, приблизно на стадії М4) та продовжуючи, щонайменше, до 34 дня після посадки, коли вимірювання були зупинені (дані не показані). Це спостереження в кореневих ящиках з контрольованим середовищем узгоджується зі збільшеною глибиною коренів, що спостерігається за допомогою датчиків вологості в польових умовах, та показує, що глибші корені можуть виникати на більш ранніх стадіях розвитку, хоча відмінності в глибині коріння не були виявлені в польовому експерименті до закінчення стадії М11/Л/12.
ІЇБОО|Ї Хоча ознаки кореня, виміряні в експериментах з контрольованим середовищем, описаних в Прикладі 14 нижче, як правило, не показують істотної різниці в глибині кореня (або показують тільки мінімальну різницю), експеримент з вермикулітом в Прикладі 14 проводився на стадії М3 до того, як відмінність в глибині кореня спостерігалася в експерименті з кореневим ящиком в цьому Прикладі 11 (тобто, починаючи зі стадії М4), і хоча експеримент з агеропонним апаратом в Прикладі 14 проводився на стадії М5, аеропонічна система не має будь-якої взаємодії рослини з грунтом (на відміну від експерименту з вермикулітом), яка може вплинути на нормальний (або більш природний) ріст та розвиток коренів.
Приклад 12. Трансгенні рослини мають більш високу провідність устя в нормальних умовах та в умовах посухи й підтримують більш високу здатність фотосинтезу в умовах стресу від посухи.
ІЇБО1| У теплиці також вимірювали рівні провідності устя та фотосинтезу в листі за нормальних умов та умов посухи. Для цього експерименту трансгенні рослини з конструкцією супресії оксидази ЗА20 з Прикладу 1 та контрольні рослини дикого типу піддавали хорошому поливу (1500 мл води в день) або впливу обмеженої кількості води/хронічної посухи (1000 мл води в день). Двадцять (20) повторень контрольних рослин дикого типу та десять (10) повторень на подію (всього дві події) для конструкції супресії оксидази ЗА20 піддавали хорошому поливу, і сто сорок (140) повторень контрольних рослин дикого типу та сімдесят (70) повторень на подію (всього дві події) для конструкції супресії оксидази ЗА20 піддавали дії обмеженої кількості води/хронічної посухи. Прикордонні рослини відповідної висоти (гібриди для
Зо рослин ДТ та інбреди для трансгенних рослин) були розміщені по периметру експериментальних рослин в теплиці для нормалізації ефектів затінення. Добові вимірювання провідності устя та фотосинтезу проводилися вранці та вдень за допомогою пристрою ГІ-СОКФ на стадії М12 відповідно до інструкцій виробника. Як проілюстровано на фіг. 12А, було встановлено, що провідність устя була постійно вище для трансгенних рослин як в умовах гарного поливу, так і в умовах посухи в обидва моменти часу дня. Також спостерігалося, що у трансгенних рослин було менше скручування листя в умовах посухи. Як додатково проілюстровано на Фіг. 128, вища швидкість фотосинтезу також спостерігалася у відповідь на умови посухи, яка істотно не реагувала на збільшення сонячного світла в другій половині дня, на відміну від контрольних рослин, які показали зниження швидкості фотосинтезу вдень, особливо в умовах посухи.
ІБО2| Ці результати (в поєднанні з окремими польовими спостереженнями вище) демонструють, що трансгенні рослини з конструкцією супресії оксидази СЗА20 не тільки мали вищий газообмін та фотосинтез в листі, але підтримували вищий газообмін та фотосинтез в листі у відповідь на умови обмеження води/хронічної посухи. Додатково було відзначено, що у трансгенних рослин температура листя була нижче, ніж у контрольних рослин (дані не показані). Таким чином, передбачено, що трансгенні рослини, які експресують конструкцію супресії оксидази ЗА20, можуть мати більшу стійкість до посухи та здатність підтримувати фотосинтез в умовах обмеження води в порівнянні з контролями. Не обмежуючись теорією, додатково пропонується, що глибше коріння, що спостерігаються для трансгенних рослин з конструкцією супресії оксидази СА20 (особливо на пізніх вегетативних та ранніх репродуктивних стадіях), може сприяти стійкості до посухи цих трансгенних рослин.
Приклад 13. Трансгенні рослини проявляли репродуктивні ознаки, які можна порівняти з контрольними в тепличних умовах.
ІБОЗ| Трансгенні рослини кукурудзи, що мають конструкцію супресії оксидази СА20, описану в Прикладі 1, а також контрольні рослини вирощували в горщиках в теплиці до репродуктивної стадії КІ, а репродуктивні ознаки вимірювали на стадіях М8 та КІ. Дані були взяті для трансгенних рослин двох подій трансформації (Таблиця 10). Дані представлені або з точки зору різниці в кількості днів, або у вигляді процентної різниці для трансгенних рослин в порівнянні з контролем дикого типу, причому істотні зміни виділені жирним шрифтом. Назви ознак визначені бо в Прикладах 9 та 10 вище. Конкретні спостереження за ознаками та класами ознак цвітіння,
незрілого початку, зрілого початку та султана підсумовані в таблиці. В цілому, репродуктивний розвиток у трансгенних рослин був майже еквівалентний контрольним рослинам з невеликими або незначними змінами.
Таблиця 10
Тепличні репродуктивні ознаки трансгенних рослин проти контролю -17,60 96
Розвиток -8- - :
Кількість верхівок о о Незначне збільшення числа листя (НІ) 2 96 1,10 96 листа 0,3
Дні до 50 95 викидання маточкових -0,4 дня -0,5 дня стовпчиків та 50 95 Трохи уповільнений час скидання
Цвітіння (1) скидання пилку пилку з нормальним часом
Днів до 50 95 110 9; 110 у викидання маточкових стовпчиків; скидання пилку бо 579 більш низьке АБІ
Днів до 50 95 видимої китиці 0,40 95 -0,10 Фо ниток рильця
Діаметр незрілого . о . о початку біля основи 28,50 76 22,50 б
Незрілий незрілого початку . . - Повільний старт розвитку початку початок (8) | Довжина незрілого о о -42 90 -31 96 початк
Незрілі насіння/ряд о о
Уздовж 38,70 96 29,70 о
Насіння/Ряд о о
Поздовжньо 16 0,40 76
Номер ряду насіння| 2,20 95
Зрілий Загальна кількість 110 9; -0,50 9, Правильний розвиток зрілого початок (Б1) | квіточок бо 75079 |початку
Кількість міжвузлів стрижня початку -3,60 Фо 0,10 95 кукурудзи султана
Кількість гілок первинного бічного | -10,40 95 -9,10 Фо султана -- - Султан, що правильно
Султан (К1) Кількість плок розвинувся, але з більш коротким вторинного бічного -17,60 95 -13,70 95 с першим міжвузлям султана осі квіточки
Довжина міжвузля . о . о першого султана 34,10 96 32,70 о
Приклад 14. Кореневі ознаки трансгенних та контрольних рослин в тепличних умовах.
І504| Трансгенні рослини, які мають конструкцію супресії оксидази СА20, описану в Прикладі 1, та контрольні рослини вирощували в теплиці на середовищі з вермикулітом до стадії МЗ або в аеропонному апараті до стадії М5. Рослини були вилучені, а коріння промиті для безпосереднього або оптичного вимірювання кореневих ознак. Трансгенні рослини з 4 подіями трансформації були протестовані в порівнянні з контролем. Результати вимірювань підсумовані в Таблицях 11 та 12 для рослин, вирощених на вермикулітовому середовищі, або в аеропонному апараті для зростання, відповідно. Кількість точок розгалуження кореня вимірює кількість кінцевих точок розгалуження кореня рослини за допомогою візуалізації кореня рослини. Зображення кореневої системи було представлено у вигляді ескізу для вимірювання довжини кореня. Було отримано до 40 зображень під різними кутами навколо вертикальної осі кореня, та вимірювання були усереднені по зображеннях. Загальна довжина кореня вимірює сукупну довжину коренів рослини, так якщо б всі коріння були поставлені в ряд, шляхом візуалізації кореневої системи рослини. Зображення кореневої системи було представлено у вигляді ескізу для вимірювання довжини кореня. Було отримано до 40 зображень під різними кутами навколо вертикальної осі кореня, та вимірювання були усереднені по зображеннях. Дані в Таблицях 11 та 12 представлені в процентній відмінності дельти трансгенних рослин в порівнянні з контролем зі значними змінами, представленими жирним шрифтом.
Таблиця 11
Ознаки тепличних коренів трансгенних рослин в порівнянні з контролем на УЗ, в середовищі з вермикулітом 11111111 | Подія! | Подія2 | ПодіяЗ | Подія | /-:(И (КБ "Середнійдіаметркореня | -122 | -9,3 | -38 | 598
Клнееннн | 65 6 розгалуження кореня
Сухамасакореняї//-/-:/ | 1 | 56 | 7 | 5
Площаповерхнікореня | 22 | -б2 | -6 ББЖ щ0 (Загальнадовжинакореня| 10 | -9 | З | 14
Висотарослини.ї | 1557 | 744 | 23 | 773 | 77777711
Сухамасапагонуїд | 36 | 2 | 45 | -77
Співвідношення пагону до рю 5 я |в | я
Таблиця 12
Ознаки тепличних коренів трансгенних рослин в порівнянні з контролем на М5, в аеропонному апараті 11111111 | Подія! | Подія? | ПодіяЗ3 | Подія4
ІЇБО5| Як показано в Таблицях 11 та 12, у трансгенних рослин спостерігалося значне зменшення висоти рослин на стадіях УЗ та М5, але в цих експериментах між трансгенними та контрольними рослинами спостерігалися тільки незначні зміни в загальній структурі коренів.
Приклад 15. Фенотипічні спостереження трансгенних рослин з альтернативними промоторами.
ІБО6|Ї У Прикладах 1-14 трансгенні рослини містили елемент супресії оксидази СБА20, функціонально пов'язаний з промотором КТВУ. Рослини кукурудзи також трансформували тим же елементом супресії, функціонально зв'язаним з різними іншими промоторами, щоб перевірити, як різні профілі експресії елемента супресії оксидази ЗА20 можуть впливати на висоту рослини та інші фенотипи.
ІБО7| Трансгенні рослини (рослини КО), регенеровані з експлантатів, трансформованих конструкціями, функціонально зв'язаними з різними промоторами, спостерігали на стадії зростання К5 в теплиці, а початки спостерігали після того, як їх знімали для просушування. Різні протестовані промотори вказані в Таблиці 13. Спостереження проводилися для рослин з множинними подіями трансформації для кожної конструкції, що містить різні промотори в порівнянні з контрольними рослинами тієї ж лінії схрещування без конструкції супресії оксидази
СА20. Результати цих спостережень підсумовані у Таблиці 13 по подіям трансформації для кожної конструкції.
Таблиця 13
Узагальнені результати спостережень КО трансгенних рослин з конструкцією супресії мікроРНК для оксидази СА20 під контролем різних промоторів
Назва промотора Профіль експресії Дані спостережень рослин КО
Промотор КТВМ Судинно посилений короткі; без відхилень . еякі короткі (змінні); без
Промотор е355 САММ конститутивний д Р ( ) відхилень поліубіквітиновий промотор . деякі короткі (змінні); без . с. конститутивний .
Соіїх Іастута-|обі відхилень . деякі короткі (змінні); без промотор актину рису конститутивний . відхилень . деякі короткі (змінні); без промотор рису 5052 конститутивний . відхилень
Енхансер -промотор КТВМ )|конститутивний короткі; без відхилень конститутивний Короткі . . . середньо-короткі; без промотор РРОК кукурудзи посилений в листі, високий еред роткі; відхилень . . ся деякі короткі (змінні); без промотор ЕВА кукурудзи посилений в листі, середній . відхилень . . . середньо-короткі; без промотор Мадайп-Содаї рису посилений в листі, низький еред роткі; відхилень . еякі короткі (змінні); без промотор рису Сур2 Судинно посилений д Р ( ) відхилень
Судинно посилений короткі; без відхилень - нормальної висоти;
У2 Судинно посилений рме ' без відхилень - нормальної висоти;
УЗ Судинно посилений рме ' без відхилень - . - нормальної висоти; промотор МММ.ЕСТ посилений в стеблі, високий рме ' без відхилень - . г. нормальної висоти; 51 посилений в стеблі, середній . без відхилень - . ще нормальної висоти; 52 посилений в стеблі, середній . без відхилень - . ще нормальної висоти; 53 посилений в стеблі, середній . без відхилень . посилений в корені, високий середньо-короткі; промотор ЗЕТІЇ. НГ рені, ред роткі,
Судинно посилений без відхилень - . - нормальної висоти; промотор Ксс3 рису посилений в корені, низький : без відхилень - - нормальної висоти;
Промотор Ехрбо рису посилений в початку, високий : без відхилень - - нормальної висоти; промотор Нга кукурудзи посилений в початку, низький : без відхилень
ІБО8| Як показано в Таблиці 13, в порівнянні з контролями, трансгенні рослини КО з конструкцією супресії оксидази (ЗА2О не демонструвати будь-яких істотних відхилень при спостереженні за всіма протестованими промоторами. Навіть експресія безпосередньо в репродуктивних тканинах початку не викликала помітних відхилень. Висота рослин була явно зменшена не тільки для конструкції промотора КТВМ (в попередніх Прикладах), але також і у трансгенних рослин, що мають однакову конструкцію супресії оксидази ЗА20, функціонально зв'язану з різними конститутивним промоторами, листовими промоторами на різних рівнях експресії деякими судинними промоторами та кореневим промотором з високим рівнем експресії. Був протестований сконструйований промотор з конститувною експресією (СТІ), зв'язаний з конструкцією супресії оксидази ЗА20, і також було виявлено, що він викликає фенотип короткого росту. Аналогічно, було виявлено, що, щонайменше, один сконструйований промотор з судинною експресією (М1), пов'язаний з конструкцією для супресії оксидази СА20, викликає фенотип короткого росу на додаток до судинного промотора Сура2 рису, хоча рослини з двома іншими сконструйованими судинними промоторами (М2, М3) та трьома сконструйованими промоторами стебла (51, 52, 53) не мали зменшеної висоти рослини. Однак зміна послідовності термінатора транскрипції для конструкції супресії оксидази СА20 під контролем промотора ЕТВМ не змінила фенотип короткого росту (не показано в Таблиці 11).
Застосовуваний в цьому документі термін "середньо-короткий" відноситься до помірного зменшення висоти рослини (відносно зменшення висоти рослини, що спостерігається з промотором КТВМ), а спостереження "деякі короткі" означає, що були деякі відмінності в ступені зменшення висоти рослини.
ІБО9| Ці результати показують, що експресія елемента супресії оксидази сА20 конститутивним промоторами незмінно приводила до фенотипу короткого росту, хоча з цими конститутивним промоторами спостерігалася деяка мінливість в фенотипах висоти рослин.
Аналогічним чином, комбінація промотора КТВМ з енхансерним елементом для перетворення профілю експресії з судинного в конститутивний як і раніше викликає фенотип короткого росту (що вказує на достатність промотора КТВМ). Кілька судинних промоторів, включаючи промотор
КТВМ, продукували фенотип з коротким ростом, але пара інших сконструйованих судинних промоторів не продукувала фенотип з коротким ростом, що може бути пов'язано з більш низьким рівнем експресії з цими промоторами. Жоден з промоторів стебла не продукував фенотип короткого росту, що вказувало на те, що експресії конструкції супресії СА20 в стеблі було недостатньо для отримання цього фенотипу. Дивно, але експресія конструкції супресії
СА20 в листі постійно призводила до фенотипів короткого росту з різними рівнями експресії, хоча результати були певною мірою варіабельними. Ці дані вказують на те, що виробництво активних СА в тканині листя сприяє росту рослин і, в підсумку, висоті рослин, навіть якщо такий вертикальний ріст відбувається в стеблі рослини. Експресія конструкції супресії оксидази СА20 з різними кореневими промоторами, як правило, не давала фенотипу короткого росту, хоча
Зо один кореневий промотор дійсно продукував помірний фенотип, що може бути пов'язано з додатковою експресією в надземних рослинних тканинах. 510) Потім рослини КО самозапилювалися та отримані насіння вирощували в розсаднику для отримання гомозиготних інбредних нащадків рослин (рослини К1). Спостереження за нащадками трансгенних рослин КІ з деякими промоторних конструкціями (щонайменше, 4 події трансформації на конструкцію) проводили на стадії розвитку КІ! в порівнянні з контрольними рослинами тієї ж лінії схрещування без конструкції супресії оксидази СА20. Як і рослини КО, було виявлено, що рослини нащадків К1, що експресують конструкцію супресії оксидази СА20 з кожним з промоторів ЕТВМ, САММ е355 та поліубіквітиновим промотором Соїх Іасгута-|обі мають низькорослий, напівкарликовий фенотип, без будь-яких істотних відхилень.
Приклад 16. Фенотипічні спостереження трансгенних рослин кукурудзи з конструкціями, націленими на різні гени оксидази сА.
І511| Наведені вище Приклади демонструють, що конструкція, яка експресує мікроРНК, націлена на гени оксидази З ЗА20 та оксидази 5 БА20 для супресії, і функціонально пов'язана з судинним, конститутивним та/або листовим промотором придатним для експресії в рослині, може бути застосована для створення низькорослої, напівкарликової кукурудзяної рослини.
Щоб перевірити, як націлювання на різні гени оксидази СА20 або САЗ, або різні частини генів оксидази З СА20 та/або оксидази 5 СА20 для супресії, може вплинути на висоту рослини, було створено кілька конструкцій і трансформовано в рослини кукурудзи. Конструкції також були створені з тією ж послідовністю, що націлює, що й в наведених вище Прикладах, але з іншою послідовністю остова мікроРНК (дві з мікроРНК кукурудзи, одна з мікроРНК сої та одна з мікроРНК бавовни - конструкція в наведених вище Прикладах застосовувала рисову послідовність остова мікроРНК). В Таблиці 14 наведено список цих додаткових конструкцій супресії, а також спостереження за трансгенними рослинами КО в теплиці, що містять ці конструкції (в порівнянні з контрольними рослинами дикого типу). Конструкції, націлені на (і) оксідазу 1 СА20/оксідазу 2 (ЗА20, (ії) оксідазу З СА2гО/оксідазу 9 СА20, (її) оксідазу 7
СА2гО/оксідазу 8 СБА20 та (ім) оксідазу З ЗА20/оксідазу 5 СА20 (з різними остовами мікроРНК), кожна з яких кодується мікроРНК з одною послідовністю націлювання, комплементарною обом цільовим генам, в той час як набори (ї) окремих послідовностей, націлених на оксідазу З ЗА20 та оксідазу 5 СА20, (ії) окремих послідовностей, націлених на оксідазу 4 СА20 та оксідазу 6 бо СА20, та (іїї) окремих послідовностей, націлених на оксідазу 4 та оксідазу 7/8 СБА20, кожна експресувалася у вигляді однієї пре-мікроРНК з двома послідовностями націлювання, розташованими в тандемі, які розщеплюються та розділяються на дві зрілі мікроРНК. В Таблиці 14 представлена послідовність, націлена на мікроРНК, та послідовність КДНК, комплементарна послідовності, націленої на мікроРНК. Для конструкції оксідаза 1 сА20/оксидази 2 БА20 зірочка С) вказує на те, що довжина вирівнювання між послідовністю націлювання мікроРНК та ціллю мРНК або сайтом впізнавання була коротшою (17 проти 20 нуклеотидів) для оксидази 1
СА20, ніж для оксидази 2 СА20. Аналогічно для конструкції оксидази З (зЗА20/оксидази 9 БА20 зірочка () вказує на те, що довжина вирівнювання між послідовністю націлювання мікроРНК та ціллю мРНК або сайтом впізнавання була коротшою (17 проти 20 нуклеотидів) для оксидази 9
СА20, ніж для оксидази З ЗА20. Для кожної з конструкцій, перерахованих в Таблиці 14, значних відхилень не спостерігалося, за винятком спостережень, представлених в таблиці.
Таблиця 14
Узагальнені результати спостережень КО трансгенних рослин кукурудзи з конструкціями супресії мікроРНК, націленими на різні гени оксидази СА
МРНК Цільова Цільова
Цільовий ген(и) Цільова послідовність послідовність Спостереження (Конструкція/Промотор) область КДНК (ЗЕО ІС) мікроРНкК
МО ЗЕО І МО
Оксидаза 1 БА20 та 1: екзон"
Оксидаза 2 БА20 2. екзон 47 48 Всі події - високі (ДТ) (промотор КТВМ) "
Оксидаза З БА20 та 3: екзон
Оксидаза 9 БА2О 9. екзон" 49 50 Всі події - високі (ДТ) (промотор КТВМ) "
Оксидаза 7 БА20 та
Оксидаза 8 БА20 екзон 51 52 Всі події - високі (ДТ) (промотор КТВМ)
Оксидаза З БА20 Події трохи коротше (Окремий; промотор КТВМ |НТО 53 54 (- 15 сантиметрів проти та 355) Дт)
Оксидаза 5 БА20 (Окремий; промотор КТВМ |НТО 55 56 Всі події - високі (ДТ) та 355)
Оксидаза 5 БА20 , Всі події - коротше (Окремий; тандемний набір)
Оксидаза З СА20 та
Оксидаза 5 БА20 , Всі події/конструкції - (Різні остова мікроРНК) 3/5: екзони 39 40 коротше (промотор КТВМ)
Всі події - високі (ДТ)
Оксидаза 1 САЗ нто 57 58 (спостерігалося тільки З (промотор КТВМ) події)
Оксидаза 1 БАЗ Деякі події - коротше (промотор КТВМ) (темніше зелене листя) (промоторСАММ е355)
Оксидаза 4 ЗА2О та Деякі події -
Окремий; тандемний набір Й 2
Оксидаза 4 СА20 та : події
КТК тн соч (Окремий; тандемний набір) ' о
І512| Спостереження, узагальнені в Таблиці 14, показують, що націлювання на деякі інші гени оксидази (ЗА2О0 не призводило до низькорослого, напівкарликового фенотипу. Жодна з конструкцій, націлених на (ї) родинні гени оксидази 1 БА20 та оксидази 2 СА20, (ії) споріднені гени оксидази З БА20 та оксидази 9 БА20, (ії) споріднені гени оксидази 7 ЗА20 та оксидази 8
СА20 або (ім) тільки ген оксидази 9 ЗА20О не призводила до низькорослого, напівкарликового фенотипу, що спостерігався у рослин КО. Навпаки, ті конструкції, які кодують одну мікроРНК, спільно націлену на гени оксидази З ЗА20 та оксидази 5 СА20 в трансгенних рослинах КО та
КІ, дійсно давали низькорослий, напівкарликовий фенотип, навіть якщо застосовувалася інша послідовність термінації транскрипції або різні остова мікроРНК (всього з 5 протестованих послідовностей остова мікроРНК). Крім того, націлювання на різні послідовності генів оксидази З СЗА20 та оксидази 5 СБЗА2О все ще призводить до отримання напівкарликових рослин. Цікаво, що конструкції супресії, які були сконструйовані для націлювання на кожен з генів оксидази З (ЗА2О0 та ооксидази 5 СЗА20 окремо, не опродукували низькорослий, напівкарликовий фенотип, на відміну від конструкцій, спільно націлених на гени оксидази З
СА20 та оксидази 5 БА20, хоча конструкція, окремо націлена на ген оксидази З СА20, дійсно викликала невелике зменшення висоти рослини. Проте, трансгенні рослини, що мають тандемний векторний набір конструкцій супресії, окремо націлених на гени оксидази З 5А20 та оксидази 5 (СА20, дійсно продукували низькорослий, напівкарликовий фенотип, подібно конструкціям, що кодують одну мікроРНК, спільно націлену на гени оксидази 3 СА20 та оксидази 5 (ЗА20. Ці дані показують, що низькорослий, напівкарликовий фенотип спостерігається з конструкціями, націленими як на гени оксидази З СА20, так і на гени оксидази 5 СА20, але повний напівкарликовий фенотип не спостерігається при націлювання на гени оксидази 3 БА20 та оксидази 5 СЗА20 окремо для супресії (тільки невелике зменшення висоти при націлюванні на оксідазу З (ЗА20 та відсутність фенотипу висоти рослини при націлювання на оксідазу 5 СА20). Крім того, як описано, фенотип висоти рослини не спостерігався при націлювання на ген(и) оксидази 1 БА20, оксидази 2 БА20, оксидази б БА20, оксидази 7 БА20, оксидази 8 СА20 та/або оксидази 9 БА20. 513) Крім генів оксидази З СБА20 та оксидази 5 СА20, спостерігалося помірне зменшення висоти рослин в трансгенних рослинах КО з конструкцією супресії, що включає дві цільові послідовності в тандемі, комплементарному спільній цілі: () гени оксидази 4 СА20 та оксидази 6 СА20 або (ії) гени оксидази 4 СБА20, оксидази 7 БА20 та оксидази 8 СА20 - одна з двох цільових послідовностей спрямована як на гени оксидази 7 СА20, так і на гени оксидази 8
СА2О0. З огляду на, що окрема конструкція, яка націлена на гени оксидази 7 СА20 та оксидази 8 СА20, не продукувала фенотип висоти рослини, а конструкція супресії, націлена на гени оксидази 4 СА20 та ген оксидази 6 СА20, продукувала фенотип висоти рослини, який був схожий з конструкцією супресії націленої на гени оксидази 4 СА20, оксидази 7 СА20 та оксидази 8 СА20, передбачається, що націлювання на ген оксидази 4 СА20 в значній мірі (якщо не повністю) відповідає за фенотип висоти рослин, що спостерігається у цих трансгенних рослин. Крім того, трансгенні рослини кукурудзи з конструкціями, націленими на гени оксидази 1 ЗАЗ або оксидази 2 БАЗ, також продемонстрували зниження висоти рослини, хоча в цьому фенотипі була деяка мінливість в залежності від конститутивного промотора. Таким чином, на додаток до генів оксидази 3 (ЗА20 та оксидази 5 СА20, гени оксидази 4 СА20, оксидази 1 САЗ та оксидази 2 САЗ також можуть бути ціллю для супресії з метою отримання низькорослих, напівкарликових рослин.
Приклад 17. Фенотипічні спостереження рослин кукурудзи, що мають редагований ген оксидази З БА20 або оксидази 5 сАг0.
І514| На додаток до вищезазначених конструкцій супресії в ендогенних генах оксидази З
СА20О та оксидази 5 (СЗА2О в рослинах кукурудзи були створені кілька мутацій шляхом редагування генома для перевірки фенотипічного ефекту нокауту кожного з цих генів. Для кожного з генів оксидази З (СЗА20 та оксидази 5 СА20 була створена серія з десяти одноланцюгових направляючих РНК (з9РНК), кодуючих конструкції, що націлюють, які націлені на різні позиції уздовж геномної послідовності для кожного гена. Була створена додаткова серія з десяти 5ОРНК, кожна з яких націлена на обидва гена оксидази 3 СА20 та оксидази 5 СА20 в однакових або різних положеннях уздовж геномної послідовності для кожного гена. Цільові зміни в геномі були зроблені шляхом доставки 59РНК разом з експресією білка Са59 експлантатам кукурудзи, щоб викликати появу ДЛР або одноланцюгового розрива в геномному цільовому сайті для НРНК або біля нього, який потім може бути неправильно репарований з метою введення мутації в цільовому сайті або біля нього. Присутність мутації була згодом підтверджена за допомогою аналізу ПДРФ (поліморфізму довжин рестрикційних фрагментів) та/або секвенуванням рослин. У наведеній нижче Таблиці 15 представлений список бо протестованих конструкцій направляючих РНК (нРНК), які можуть бути застосовані для редагування геному одного або обох гена(ів) оксидази З СЗА20 та оксидази 5 СА20 за допомогою РНК-спрямованої ендонуклеази. Ці конструкції направляючих РНК, як правило, призначені для націлювання на кодуючі послідовності генів оксидази З ЗА20 та оксидази 5
СА20, але деякі з комбінованих цільових конструкцій можуть замість цього націлюватися на послідовність НТО одного з двох генів. Ці НРНК можуть бути застосовані з відповідною ендонуклеазою для отримання дволанцюгового розриву (ДЛР) або одноланцюгового розриву в геномі в геномному цільовому сайті, або біля нього, відповідною нРНК, який може бути недосконало репарований, з метою створення мутації (наприклад, вставки, делеції, заміни тощо). Трансгенні рослини, які були гомозиготними по редагованому гену оксидази З БА20 або гомозиготними по редагованому гену оксидази 5 БА20, були отримані з декількох конструкцій (див., жирний текст). Події також генерувалися з конструкцій, призначених для редагування обох генів. Для конструкцій, спільно націлених на гени оксидази З (ЗА20 та оксидази 5 СА20, координати кодуючої послідовності (СО5) наведені стосовно одного з двох генів, зазначених в дужках. Таблиця 15 далі показує, які конструкції здійснили події редагування генів, чи були ці події гомозиготними або гетерозиготними в рослинах КО, а числа х в дужках вказують можливу зміну послідовності з мутацією (наприклад, 41 означає вставку 1 нуклеотиду тощо, та більші або більш складні індели позначені як "дел." або "вставка"). Для комбінованого націлювання на оксідазу З ЗА20 та оксідазу 5 ЗА20 ідентичність мутованого гена також вказана в дужках.
Відповідно до результатів для конструкцій супресії, трансгенні рослини, гомозиготні по редагованому гену оксидази 3 (СЗА20 або оксидази 5 СА20, не мали низькорослого, напівкарликового фенотипу, а мали нормальну висоту рослини відносно контрольних рослин (див., конструкції оксидази 3-0 ЗА20 та оксидази 3-05 СА20, а також конструкції оксидази 5-В
СА20 та оксидази 5-5 БА20 в Таблиці 15), що вказує на те, що нокаут тільки одного з цих генів недостатній для отримання напівкарликового фенотипу.
Таблиця 15
Направляючі РНК (нНРНК) націлені на гени оксидази З БА20 та оксидази 5 БА20 з метою редагування
Послідовність
Генна ціль нНРНК націлювання нРНК (ЗЕО Координати СОЗ Створені події
Ію МО гена
Оксидаза З-АСА2О | -/-//О 138171 552-572 | -:К/ -
Оксидаза З3-ВСА2О | -: 139.17 879-899... | .ь.4/- 7
Оксидаза 3-ССА2О | 00140717 147-167 | 77777777 -1 1. гомозиготний (-1)
Оксидаза 3-0 пА2О 141 526-546 2. гетерозиготний (-1) 3. біааллельний (-2, 1
Оксидаза З-ЕСА2О | -:(/ 142.1 446466 | (З - ж 2ЗКК
Оксидаза З-ЕСБА2О | 0014317 го2ием | 1-1 1. гомозиготний (41)
Оксидаза 3-4; С2А20 144 548-568 2. гетерозиготний (-1) 3. біааллельний (1, -1
Оксидаза З-НСША2О | 00145111 547-567 | 77777771
Оксидаза ЗЛ3СА2О | 01467777 17743463 | 7777-71
Оксидаза 3 СА2О | 0014711 548-Б67 | 7777-1111 ния няня нн Інн 1. гомозиготний (-1)
Оксидаза 5-В СА2О 149 99-119 з тетерознтотний (1. 7 4. гетерозиготний (-3, -1
Оксидаза 5-ССА2О | -/-///150 17 369-389. | -:К::г - г:
Оксидаза 5-0 А2О | 77015117 48680
Оксидаза 5-ЕСА2О | -/о152 1356-3762) | щК - 5 4 7 45и
Послідовність
Генна ціль нНРНК націлювання нРНК (ЗЕО Координати СОЗ Створені події
Ію МО гена . . 1. гомозиготний (-1)
Оксидаза 5-4; СА2О 154 770-790 2. гомозиготний (-1
Оксидаза 5-Н СА2О 10-30 т
Оксидаза 5-І СА2О 2в228а 111
Оксидаза 5-) СА2О 768-788. | ::; 0-5 ДщДщ нини 290...310 289...309 270...290 49...69 265...285 .
Оксидаза 3/5-Е СА2О Ох 5 САгО 1. гетерозиготний (Ох5, 1) 1. гетеро (ОХх3, 4-1, -1) . 419...439 гетеро (ОХ5, 41, дел.)
Оксидаза. 3/5-Е САго 163 (Ох ЗСА2О) | 2. гетеро (ОХ3, 41, дел.) гетеро (ОХ5, 41, вставка) 110...130 634...654 98...118 517...537
Приклад 18. Конструкція супресії, націлена на гени оксидази З БА20 та оксидази 5 БА20, знижує рівні транскриптів оксидази СА20 та рівні активної СА в рослині.
І515| Щоб визначити, як рівні транскрипту оксидази СА20 були зачеплені в трансгенних рослинах за допомогою конструкції супресії, націленої на гени оксидази З ЗА20 та оксидази 5
СА20, цілі тканини з різних частин трансгенних рослин, вирощених у теплиці, були взяті на різних вегетативних стадіях (М3, М8 та М14), а рівні транскриптів МРНК для кожного з генів оксидази СА20 аналізували із застосуванням аналізу ТадмМмапФ). Для цих експериментів сумарну
РНК екстрагували з застосуванням набору для екстракції РНК від 7уто КезеагсйпТМ та обробляли ДНКазою ТигбоТМ для зменшення забруднення геномної ДНК. Потім РНК піддавали зворотній транскрипції з метою отримання дволанцюгової кДНК. Кількісну ПЛР зі зворотною транскрипцією проводили із застосуванням геноспецифічних праймерів та мічених РАМ зондів
ТадмМмапе в Віо-КайФ СЕХО9б Кеаї Тіте Зубіет. Метрики контролю якості розраховувалися із застосуванням тканиноспецифічних стандартів для визначення ефективності кПЛР та сумарної
РНК, яка не зазнала зворотної транскрипції для обліку залишкового забруднення геномної ДНК.
Різниця між граничними значеннями циклу для генів, що представляють інтерес проти нормалізуюючих генів визначала відносну кількість кожного транскрипта гена в кожній тканині.
Ця відносна величина була розрахована із застосуванням одного (185) або середнього геометричного двох (185 та ЕІ Е1А) нормалізуюючих генів.
І516) В цьому експерименті рівень транскрипта оксидази З СА20 був знижений у більшості вегетативних тканин на цих стадіях, включаючи тканину листя та стебел в УЗ, тканину міжвузля в У8 та тканину листя та міжвузля в М14, хоча рівень транскрипта оксидази З БА20 в корені МУЗ та листі М8 виявився незмінним (дані не показані). Крім того, рівень транскрипта оксидази 5
СА2О для цього експерименту в цілому залишався незмінним в тестованих вегетативних тканинах (дані не показані), хоча рівень експресії транскрипта оксидази 5 СА20 був відносно низьким в цих тканинах. Ні оксідаза З СА20, ні оксідаза 5 СЗА20 не були значно знижені в зразках тканин кореня трансгенних рослин. Рівень транскриптів кожного з інших генів оксидази
СА20 (тобто, підтипи 1, 2, 4 та 6-9), як правило, не змінювався або збільшувався в деяких тканинах трансгенних рослин.
І517| Аналогічний експеримент був проведений з репродуктивними тканинами трансгенних рослин, які експресують ту ж саму конструкцію супресії. Цілісні тканини з різних частин трансгенних рослин, вирощених у теплиці, відбирали на різних репродуктивних стадіях (К1 та
КЗ), а рівні транскриптів мРНК для кожного з генів оксидази СА20 аналізували із застосуванням аналізу ТадМап?т). В цьому експерименті рівні транскриптів оксидази З ЗА20 та оксидази 5
СА20 були в основному незмінними в К1 листя, початків, султанів та міжвузля і в КЗ листя та міжвузля в порівнянні з контролями (дані не представлені). Результати для інших генів оксидази
СА20 були в основному змішаними або нейтральними (дані не показані).
І518) Ці дані показують, що рівень транскриптів оксидази З СБА20 в трансгенних рослинах кукурудзи під час вегетативних стадій, як правило, знижений в цьому експерименті, але, мабуть, практично не змінювався у порівнянні з контрольними тканинами рослин на більш пізніх репродуктивних стадіях. Хоча явного зниження рівня транскриптів гена оксидази 5 СБА20 в цих трансгенних рослинних тканинах зазвичай не спостерігалося, рівень експресії цього гена був відносно низьким. Таким чином, зміни в рівні його експресії, можливо, було важко виявити за допомогою цього способу. Крім того, конструкція супресії, мабуть, специфічна для цільових генів оксидази СА20, оскільки в цьому експерименті не спостерігалося послідовного зниження рівня експресії ні для одного з інших генів оксидази А20.
І519| В окремому експерименті рівні експресії оксидази ЗА20 були визначені в тканинах стебла трансгенних рослин, які експресують конструкцію супресії з попередніх Прикладів (націлену на гени оксидази З БА20 та оксидази 5 СА20 для супресії під контролем промотора
ЕТВМ), в порівнянні з контролем дикого типу. Зразки тканин відбирали зі стебел М3-Мб, та частини цих стебел додатково розсікали для відділення судинних і несудинних тканин з метою визначення рівнів диференціальної експресії серед цих тканин. Рівні експресії транскрипта визначали із застосуванням методу РНК-секвенування (КМА-5е4) для кількісного порівняння між тканинами трансгенної рослини та рослини дикого типу. Дані, представлені на Фіг. 13А отримані з трансгенних рослин, що мають одну з двох подій, і контрольних рослин дикого типу, що мають одну з двох зародкових плазм, причому кожен стовпець на Фіг. 13А, представляє одну з двох трансгенних подій або зародкових плазм, відповідно. Для цих експериментів окремі
Зо судинні пучки відокремлювали від решти тканини стебла зразків і піддавали окремому аналізу.
Як проілюстровано на Фіг. 13А, мікроРНК, яка експресується конструкцією супресії, була виявлена в загальній стебловій тканині рослини ("загальна", тобто, без поділу судинної та несудинної тканини), а також у відокремленій судинній ("Судин") та несудинній ("Несудин") тканинах із загального зразка стебла. Однак рівень експресії мікроРНК був значно вище в судинній, ніж в несудинній тканині, що вказує на судинний профіль експресії промотора КТВУ. 520) Загальні зразки стебла та відокремлені судинні та несудинні зразки також аналізували в аналогічному експерименті КМА-5ед для вимірювання та порівняння рівнів транскриптів гена оксидази З ЗА20 та оксидази 5 СА20 в трансгенних рослинах у порівнянні з контрольними рослинами дикого типу (разом з іншими генами оксидази СА20), хоча для кожного типу тканини показаний тільки один зразок дикого типу. Для цих експериментів тканину стебла з контрольних або трансгенних рослин (дві події) розрізали на окремі судинні пучки і несудинні тканини, як описано вище. Загальна 5РНК і мРНК були секвеновані для кожного зразка, та дані були проаналізовані та порівняні із застосуванням аналізу головних компонентів. 521) Як проілюстровано на Фіг. 13В, рівні транскрипту гена оксидази З СА20 були значно знижені в загальній стовбуровій тканині (Загальна) та в окремих судинних тканинах стебла (Судин) трансгенних рослин (ТР) в порівнянні з контролями дикого типу (ДТ), але залишалися незмінними у відокремленій несудинній (Несудин) тканині. Однак рівні транскриптів гена оксидази 5 СА20 були значно знижені в загальній тканині стебла (Загальна), але відносно не змінилися у відокремлених судинних (Судин) і несудинних (Несудин) тканинах трансгенних рослин, хоча спостерігалася тенденція до зниження для транскрипта оксидази 5 СА20 в зразках судинної (Судин) тканини з трансгенних рослин. Рівень експресії гена оксидази 5 СА20 був низьким, особливо в несудинних тканинах. Всі інші гени оксидази (зЗА2О0 не показали значного зниження рівнів транскриптів в аналізованих тканинах трансгенних рослин, хоча пара генів оксидази (зЗА20 показала невелику тенденцію до підвищення рівня їх експресії. Ці дані додатково демонструють, що рівні експресії генів оксидази З СЗА20 та оксидази 5 СА20 знижуються різною мірою в одній або більше тканинах трансгенних рослин, що мають конструкцію супресії відносно контролів. Дійсно, вища експресія мікроРНК та сильніша супресія ендогенного гена оксидази З ЗА20 в судинних тканинах узгоджується з судинним профілем експресії промотора КТВМУ та, можливо, більш високі рівні експресії гена оксидази 3 СА20 в бо судинних проти несудинних тканин рослин дикого типу. Аналогічний профіль спостерігається також для гена оксидази 5 СА20, хоча і не настільки виражений, як у оксидази З БА20 між судинними і несудинними тканинами.
І522| Низькорослий, напівкарликовий фенотип, що спостерігається з супресією оксидази
СА2О в трансгенних рослинах, ймовірно, опосередкований зниженням рівня активних ОА, присутніх в тканинах стебла або міжвузля та/або в тканинах рослин, які продукують активні СА.
Щоб визначити рівні активних СА (особливо С1, (33 та (4) відносно інших неактивних форм гормону, рівні ЗА вимірювали в різних зразках тканини, взятих у контрольних рослин трансгенного та дикого типу на різних стадіях розвитку. Для цих експериментів свіжозаморожені зразки для кожної тканини подрібнювали та розподіляли в 96-лункові скляні пробірки разом з внутрішніми стандартами. Зразки екстрагували із застосуванням розчинника метанол:вода:оцтова кислота (80:19:11 об./06.) два рази на добу протягом 4 годин при 4" с.
Розчинник випарювали з екстракту майже до сухості, застосовуючи багатоканальний 5РЕ з азотом. Зразки додатково очищали із застосуванням картриджа 5РЕ. Після очищення зразки обробляли із застосуванням стандартного способу РХ-МС/МС з мас-спектр вимірювальними приладами ЗбПітадлитеФ МехегаФ ОРІ С та 5СІЕХФ Шіріє дай 5500. Хроматограми були проаналізовані та визначені кількісно з застосуванням внутрішніх стандартів.
І523| Два набори експериментів були виконані зі зразками, взятими з різних тканин вегетативної стадії рослини. Як показано в Таблиці 16 для одного експерименту в теплиці, знижені рівні активних ЗА (ЗА1, ЗАЗ та БА4) спостерігалися в різних тканинах трансгенних рослин на різних вегетативних стадіях. Дані в Таблиці 16 представлено у вигляді числа трансгенних рослин, що мають значну зміну кількості кожного гормону СА для даної тканини ( у" - вгору або збільшений; "Ю" 5 вниз або зменшений; "М" - нейтральний або без змін і "ТТ" - загальна кількість рослин). СА, які демонстрували, щонайменше, часткове зменшення в зразках тканини, виділені жирним шрифтом. Активна САТ була знижена в тканинах листя та міжвузля на стадії М8 та в тканини міжвузля на стадії М14, а активна СА4 була зменшена в стеблі УЗ та міжвузлі М8 та М14. Однак активна САЗ була помітно зменшена в цьому експерименті. Інші неактивні форми СА були змінені в різних тканинах трансгенних рослин, як показано в Таблиці 16. В цілому, СА, які знаходяться нижче генів оксидази СА20 в шляху гіберелінової кислоти (наприклад, ЗАЗ, БА20 та сАЗ4), мають тенденцію до зниження, тоді як СА, які знаходяться вище генів оксидази ЗА20, мають тенденцію до підвищення (наприклад, СА12 та АБЗ), що може бути пов'язано з більш низькою активністю генів оксидази СА, що викликають накопичення попередників ЗА вище. Ці дані узгоджуються з супресією активності оксидази
СА20 в цих тканинах і більш низьким рівнем активних гормонів СА в стеблі та листі трансгенних рослин.
І524| В окремому експерименті аналогічні вимірювання гормонів (ЗА були взяті з різних тканин рослин під час вегетативних стадій розвитку. Як показано в Таблиці 17 для експерименту із застосуванням тканин, узятих у рослин в теплиці та полі, знижені рівні однієї або більше активних СА (СА, БАЗ та сА4) спостерігалися в листі та міжвузлі трансгенних рослин на стадіях МЗ3 та М8. Зразки листя на стадії М8 для цього експерименту були взяті у рослин в полі, на відміну від інших зразків, узятих у рослин в теплиці. Дані в Таблиці 17 відображаються аналогічно тому, як описано в Таблиці 16. Інші неактивні форми СА були змінені в різних тканинах трансгенних рослин, як показано в Таблиці 17. Подібно спостереженнями, викладеним вище, СА, які знаходяться нижче генів оксидази ЗА20 в шляху гіберелінової кислоти (наприклад, БАЗУ, (зЗА20 та сАЗ4), мають тенденцію до зниження, тоді як
СА, які знаходяться вище генів оксидази БА20, мають тенденцію до підвищення (наприклад,
СА12 та сАБ5БЗ). Ці дані знову узгоджуються з супресією активності оксидази ЗА20 в цих тканинах і більш низьким рівнем активних гормонів СА в стеблі та листі трансгенних рослин.
Таблиця 16
Зміна рівня гормонів СА в тканинах трансгенних рослин кукурудзи, що експресують конструкцію супресії оксидази СА20 в теплиці
ТОМ ТОМ 1 1 ТОМ ом/ет | арт о омет |омет| 2рет о 2ет| гот т
САТ ТВ орует о) ом/ет | 2о?т| мет | ЗИМ) омето | 2м/т лет лет
САгО 2п/2т | 2мет омет |орет| 2рет о гоет| 00 2мт сАЗА 22 | 20/2Т 2/2 | 2/2 20/27 2/2 20/27 2/2
САБЗ оцет | 2й/2т ) ом/т | 2и?т | мето | от | ТОЛМ ротом лет 2
Таблиця 17
Зміна рівня гормонів СА в тканинах трансгенних рослин кукурудзи, що експресують конструкцію супресії оксидази СА20 в теплиці (Т) або полі
Лист (т) Корінь (Т) Міжвузля (Т) Лист (Поле) зр/1М/4Т 2рлцлМмдт зр/1М/4Т 70/1М/8Т зр МАТ АМ/АТ зр МАТ 7рлМ/ВтТ 4М/4Т 4М/4Т 40/4Т 80/8Т 4М/4Т 4М/4Т 4М/4Т 4М/4Т 4р/ат АМАТ 4р/ат БШ/ЗМ/8Т вАТа тОл Мвт аА2гО 40р/4Т 10/3М/4Т 40р/4Т 80/8Т сАЗА 10/3М/4Т 40р/4Т 40р/4Т 40/4М/87Т сАБЗ 40 АТ 20/2мМА4тТ 10/3М/4Т 80/8Т
І525| Супресія генів оксидази оксидази З ЗА20 та оксидази 5 СА20 в трансгенних рослинах кукурудзи знижує рівні цільових транскриптів оксидази СА в різних тканинах, включаючи стебло, міжвузля, судинні тканини та листя, і супресія цих генів оксидази (ЗА20О також додатково пов'язана зі зниженням рівнів активних СА в тканинах трансгенної рослини, включаючи стебло та міжвузля, які є місцем впливу на ріст рослин на вегетативних стадіях і, в кінцевому рахунку, на висоту рослин на більш пізніх вегетативних та репродуктивних стадіях. Аналогічно спостереженнями, що рівні транскрипту оксидази БА20 в тканинах репродуктивної стадії в основному не змінюються або змішуються, рівні гормонів СА, включаючи активні СА, також в основному не змінюються або змішуються в тканинах репродуктивної стадії (дані не показані).
І526| Після докладного викладу цього опису буде очевидно, що можливі модифікації, варіанти та еквівалентні варіанти реалізації винаходу без відхилення від суті та обсягу цього опису, як описано в цьому документі та в формулі винаходу, що додається. Крім того, слід розуміти, що всі приклади в цьому описі представлені в якості прикладів, що не обмежують.
ПЕБЕНІК ПОСЛІДОВНО СТЕИ гр луках и Мекки Ти «А моОраФаасєє екв аУ л
Вк Перацдусгіт М
АфієМт, ПОЯВИ М.
Бе ч Зах хустки сні, Звусмпати тес гів В
ІМ. МУХИ ОО Їх.
А іще хі ЩА і сімені хі жде гів у стос. БІШВХВИЦеХ «г хі Стік
Милюї місц
Мпомеі, Мука жи злу в йсимопАЩ, СЕП г,
ЧИ ді мак. мл А кт ху те ши ОТ.
ЗАВЖІПЕКЛІ КВ о хау кум стуку скейті ТЕ севкЕдттат, Туман У.
УК жахи д щої
Мапс , Боба кл пу тА ммс имтя пл ЗБІЙ п уКАХНІМУЄТ хіших СПОСОБИ ТА КОМІКУХ; зва ІМ зЗбІлЛвшЕННЯ ВРОЖАЙНОСТІ мости мтиеи ум ТЗ МиХМм полу М МАТИ кизьЕОвОсних БОСлЛяН пНяХоОМ МАВТПУЛЯВІ
МЕТАВСЛЕММУ ГІВЕРЕНХНІВ аа тУва Яд агитМ же 0 раза МОо я шт ІМ, що еще ах ша по, а я тя ЛІ дит
ВАХ шим А 7 цд чий дтугайло УЮ
ХаЛМЕМ ДЕК клю хх ВЕ тера
Ед мим т гл я «ЛРУ ДЕ Бех, М «ї15їз ЗВіз-йВЕ хАХІЙ КОМА А «ішчух 157
ТЕЛЕ Мо ск Ух ї ях що х
СРО Ватт їв вероїя 3,5 м гул 4
М УМ сх тс ік М МІХ кл шіуттх «кіш ДИК тру че шк
УА сша ух оч « си 4 перемички МА Вон сову х ер нок жк уту коп гоху тур іхстеизив о іч ву в КО павочасвих сви сеавв часи зуосвсвкеа зе песо й
Мер кіст Седрик ди сдепМочдити др КитИ ии Уг вуКх 3
МТС ж паче хаос спапатааия апое ХлЗзшБа сиг шу че їж форт лу зорових фі сте офриеох до скети тит ре ие дути Мито еф евро че топспахІмрати фрукт сяК що пис яї поишапка лаш шодо Уус попу ю УЖ ук олзучухтвии в Уолт чут ху і УжУ ІІТ УсМиИжУЄ тки ис хотів Зал пЕжкшжшечннІі. збапзаафе сХсрианмн пре мее песто саму ко М ин в и и ВН НН и в м свати свис зпосїсви сбасЕтути Фосишешлот сесдосю реж Ое о ин НК НК НИ піч щедрі их сп пізспалоес споушешекиУкх Фоми пт х й УНК Тесозсхвхсе що
Мети Ви ге ев их рик ких у фи ки усі пусмиини гул уже уфи уро в ли ТУ спясзсасацкІ свт сосзозочавя чеспссалосе пове ззаанетая КМ стук сивиною узд из ин ис ужови оку можете жом и уже Ж ик ие уми ки у ке псочезосшесе сатодасокс бестпзповсот ссщопоааях пастою своа челспаєтя зни чн пжитогует ку и КМ ния ких ши в НН «ах
СУКНЯ МІХ сади Ех Мпа Спи схо схе че
Ед ие утоми ож фуда зумовив фиих ЯЗ Б озугмфутьщі суди еру шип сват созсотоа зво бсасесеис пшкпсшеи авось и піку ик иа и у рифи п ми ее озевим в ту ся мем ожо уми живі В пи ух щи пере ртома слона вок КО Ве Фрошиксвлиневи шому У син с миру ки руту Мо Коморуе в мито Коко Перу ззй ссазосіти сода чач влас нУЄ поса сна щаслива Б зач В жі Кору ню в тріо стежех ур Моз тай вишсаваслА сабо сети асенив сесонаехє поса шессоцасто що уетіги ужив ж цих жут Код нав век луг имя усві стек гео пох зсзпззацзх зіесзаасше сесоцсвехо ачасдазч сскчсспесе зазобпако ЯЗ
Кг м ереУф ит сип тету Е сі фі трее Мі ВК пиття Жозе жу 25 г ацасцсвало сазаасопа посадам поста садопсешис босими раа кт кове ужив их у Як ки он и ни НН В НК пд ошеасммив СВАТИ ИХ ВИКЛ смола рому миМм паста ЕАЯ сити ТИХ В фури ивиуи пи уж тири фтдутУтВ Ми фугу тов ИрИм п Ким ЗІ шШивичим ий печами совок щита ча дм сек рр дже (у ме ирив тр ди иику ЧК рови З Ес Крут ЕЕ пив чайпкппасии ЧИМ: посасосеса сечо с сви иМмМІ лі аУнниу их п Ку и ви из уко Ми сжлуйх щи юн и нн сечу дути хі спите лдокеч савтзиищоас сдавозсшкиса перли тхо сзвасаачсас басозвпеассх іч пек их и соуси іх ки о Ка НН и в о М в ЕК КК ОН зл жсшхиатио снрмироці засзероснУць було ко час попі сОогУх Адм М грутікер р удар с матуємититіи п ВІТ КК ут щі сид пеи г тк закис чоавсеацшеч дисадоссоє савани учас Дос Адм дтреиу В дит фр к оч Муки Вік о са (ск вт чай зачсквоссих зЗовипиксасз зач иояс кос цастух спаслакчвУуЗ сах км суд ее жири Ух джу в и ім пориву ти ху ук мочок учи рих зум щрузсатавч ззочсизаа чис осссса ас тсксаз свосалквзс зво 155 а о НН в НН и в НН чий завиасипктох човазаваоа хвата кцкх асо аз аа чи злу Фож ом ху ту докохежуюк ою ХОМ оМомфрек мих се КІ ОМ усу х тай ззвзасавзоссст заватквазса зазсадлкка зплаззиесл споавічами сакипаоуа КО р ІН і НН вовною суп тк В Во хі опо я ок хх зочдазсваве «ис сисОуоовасва асп ова сиза аиБає зиеачивидах АБУ дома міт ом од хом хв ацщиюку о джен ю ие су мож по яд о пуитихх хол ту заставка завхазсвач сват вЗестокаїсвк завокааєхва осв уєх Ушо суху зує ц Ві Мох що Кох тром ею хх гри в іо хво діжу зкй закажасеах садив каза тассавотеє зам нвнавІ чечеасекк екон їв ки НН вв в В в НН НА и і НН зах кЕЕчексеях чес с щлтсссКіЗ факто шеассестаняЯх своих ТО - ас х ІА сти ик «у о МАКИ хх кл я я а «Ех ТІ1ї5 ех три ких ОА мл с бик хи жа ло жжВ МАУ м Рух се
КІ « док уже нки іти ин ни и в НК пох зкщЩдочсета сооосвоа хшисшин стоп Чшш шити схе МАХ
Ер сстваса есе сдацев пак вому скосу Ви буд ин 125 шиЕшесошевая спиш сМнусв чКесасим сичесоаснх зчаацилеа сис ско Кк іме щи м тури б ери пу Ки Ж юки ие спуухтнучие утекти ЗУ песо Сон псссзисавсе стссоспин аоспосапоча попи 455
ЗИ суфіксами КОМ р из и ух ож сири У МК І ії
ВІ ци Чптпеяс ста Вмх шили пла сша ом «км шсчасасеа сучас соска сгає ебозасщую ШЕ ОА Фест Ка мол вх льки РІ нік пови тов Же Ки речи КИ вик зка часввосяаФи поимройєр ссивитнаці пох ашипокну ик кся ша и рухи учиу В ур ек их УК сту дих зсхож мамі ж УМ сиг ж Кам еттук ом сухе міх Я засос спосте смМіскцсянимь срашеєсчсеях «шле ма селом ЗАМ лег цимух ик м дет мо су щит ихУк Вих тут и дО Ім М що сс гр ще и чаславосив зсзнчсиве фас пп сстастх ПЕЧІ Ввова соня зи
Уж пустив ее и тиж ЖК охоти ему мит Уд Можу вит уки хуя ди
Чичсатоецочс залиша пси шими сода пе лам о НН а повели г ур Кр пухир ик у и М днокик ук аа пси сих їх вічка є їх золи фмеТочиа пис чких щу моя вк ки ух вен нн в А АН и МНН уко мил ковими г пЕссккесаза чізасочаскс свісвисощи сосвавоссвеї зсссчуслля поза сех сх - везе мо ми Кому дити пи Мееу и В жири ху Й жии В дя му ам В уж у І ІУ ЛЕ озЗІмеасаяс кош и чошоасахУю щи Олек шк пакиИвзЗиу ти М піт в дужі них тет ту жи пуер у Кк гер утри и у и гу о тасипзвозопа дчизчасесса зпещкксчас дессоосалос спосо скоса БУ сих утмуриитус тую помер ВУ сек гу уд рухи иуиУ ук си зви ча шоста ссскЗа часова К суксавовс зЗспасасих МшакодеЗик списом Вяц ери ів руси ів етері суку ди стиск Кр віх Зп ч«вокасвича зиКчЧинессв о ссзпчсствс Збоавовоеси паса ле «сис жо сш сКссє пз шасеа зЗзапозасава Фокса созмосваста печерах БУ нн ни НН НВ хдзм пІіпеакм БК кХУ ша Ух тез мера ШК ще МНК У ОКУ дрих джу у т що ех щи сур муж у ту ре ою ік у и Кок юку ау их дит ДЮ Ех зппсвстяса зессззасах чазоасскс сесоктос посвассчаех стазпаскшац; МК и и НН хіт Ах Тл апивчстаниЯ шасешивимх пити чази авт їх «їй «ші ВІН нев чу ку КА яку том ли літх хх М ше пашЕ ал Я
МОЮ З духу Ж бах В А ж шля вм бат бр їбжту Жилі хни лу Вів мія
Ме УВА Бей іа Але МЕ Ах Ехз Бжзе Бо ем Уві ре дар ів Атїа ї 5 15 15 ї З МЕ А
Жтро Там Моск Мія тв лює йця Ті бу МА мів па тб секує Ву Мід ку їх цех 5 М ем дах Аз гі Ехо піб о Сбівп гне Те жк вовка ів яд « Б ло 5 ЗК хау ім бом бу Мичу бах дих Хуст СА 135 35 Тихі що їещ А уки тома вир оз лях кщІ тах РжО Аж ЗжЕ бай хм ша ме Ома Ух ЕКО мех
Як р тю Бах жо ах г их М х З що бі. дк домі ча нн зАШ ВЕ мжм жах МУ В ска лів окв ТВі У АХ Я Зах ЗА АХ ВЕУ а а яа а 5 о блуй Ме То Пі іє Ша бе т туї зле стр: 3 ху том маше їз Сув Азв Бей Ні Б) ББе ЕБе бів Чаї Уші Зі Мід сів ті Авю я ет, "ка па шх я ТА жо лох ке Ж хі АТ Моя ЖКя г буку ки Ми М іхуз ЖК - г г. дк Кз дав йза зем ТвжЖ Аза пів Аза ків вка Су Меї вБроАів Бе бе Тлх
ВУ 5 ЗЕ жо Жим Жду бу м Тем й щен і ім кт мм Пі ім ве о мес КІВ БВ ЕКО АБО МУ жа ХО Ма сів АК АХ само м зе яко хх «хх 1 3 хм х55 хх тка 3 сни ВІ. Сб о бдк Ва ім й» Ще Мих УЗ йому Ж бум фу
Сув омлу ХУХ Бай Зеж ЗХ Же ОКпХ САУ Дж ЕЛЕ Аза дах СУ Ба БК з УА ух
КАТЕ дп ке
Чт шеую Ж овха йхаж Міюі Жук дек ЖИМ бок кам еф ох х фу дух СХ хх хх щей БІВ ЖЕ веж Кур ЗЕ ук Бх да БоввоншЮ Ар озАУ МВ їв ЗЕ ч« кй
Ач М ММ тов ша Тими бах її 3УВї оз ж сидує них ха Жах Ти Там хх 1 зу: ЗаЖК ув зво Уві У ві Аа цех т Уж БИФ ВА А Був емо) у пи ча тей за ЗА вяБен АяЯУ М Му
Шо ак о жчну щи рі Мі шо сх 31 А ву рах де сту шоу у МЕ кі ТУух ДЕ нів Кіш щі пів ві жтУх о, у плям ж ЖЕ дех ша МУ
ЕВ я г ке А ех
Фо: с Ту и Ж ох Толя Жид (1 жа Том дише Ку жк 1 я те ха сх т али піз ут їду даю бака 15 баці Мох 1 Зк ох ст Фі ев о тизер сля вк Ахз мем Зшх вед о сУХМ це Мей пів уз фе зу зуб ек дев шу
Ел їх іп я 185 ів 2 їх от ж МІ У що сх. я хх г г ж ех Моє п ха: чтві (1у хз Аха Ні Бе да ва Бе пе сів Бфу Ап дю ек їз «ее суткгх ие
ДАЛЕЕ Ю М
Ма Дон Ж Ж бик о рук би дж їЗмд жо зер ю о ху аг том
Же Ак до зем дез Тек жук Ра БЕ с ув іп ба то ТУ АВЕвОХАЮ Лящ бук зах сх ту «М па А т яю сф ст м и ж пек й жу фею ух Хо ще миє Жим Ми жу щі вх ЗУ БКОо Мія Су зи сх ТВ бех ів) ТвЕ Хіе бео Віз бів
У при з3ж зай
ОМ ян «ах 545 хо ке ж лу их хоч сл Мр, вих хо Щлсу ОК их т км: У мо фу
Авр овЗо УВІ БЕУ Біу Бей Бій Хі Бе дю лів вів ТВ ем Аз Тхо
ЕЕ сухо Ух
Зх ЗМ ВУ
Ще Ха тт х йо м шт Том я з ТІ КС «т 1 5 ж ТУ хв Ки
Ахш Беж Ті дДкЕз КЕхО Ах хо Сі бів спе Узі Уві йвпап іїїв Бі Ах
БК зак гу
Же хо М тру Зніа Ме хто ую щш Т тро беж чно Мр бу тм Ці ех
ТВжх о впе Ме діа сем ек зва ща ха тТУух жу зе дує дев нь джу
ТЕ ЕД І шУТ ОК ЩІ
Ал а їм ху ух ЕВ Ах й дет моху Тх її Шах см Бах: хів уві Уві вва о Зех Ак Уа Вів Ако Ак дах ем Аа ЕБе Хібде Їм)
ЗО 835 ММ
Туш фати ла Мощі ауд бла кт нм тв Ха тях т уко сук хх хиті щі) М ;; ток г їв душ шк фу Тло тем: Оці вк у Жхс В ме АшЮ ЗУ жа Ма ОАКО КІ Хо ГЛУВ ХМ МБО УВА Аа тд зах че ху
ІЗ єю КЕ ваш ху хо оон Мих Мт Ах сок мя ДК пе є блмує Вк ву т хх ток вер Аїа ДХат гхо Ахп вті Же КК Ал пе о тлх кв ок жуВх бе Бей їх 38 її
А хе, бом КУ Що хе жк поаих Ки оску. моху би су окт їх Хо джхю» Ве Ших МекК Хка Ніз ТУХ деа ек Авр о Мах Бе ормих Мей бів Ав хай зав 1858 пЛльм Зо зве тіж и дошку Мт Ср Фусжує Аз Тис шух Ух Ук МХ 151 томі З гум:
Клео Бех жа уже зем) мах клх жах бОеЖ 2 ау МАМ Мав й УМ ме и т І чех
Ач зу Бу зло пул а
ЕХ В ут Ж
АД АТХ я ее пу ки ДНК «813» йЕа пауз «ніх 4 скиту до о и п и В Нв КН и НК тк сазчазвсчава вставок щУсоспасКх запас соствосзствис вааосахсОу пи вовогтточимі М оті сти тречернн ті Вияв в піти по меру пуд асЕксочссаст спас зош ссшиІг спо никКі салон васала Ва пром и в и В и НН зх засво сос тп сайко пизОпочосососа ссізчлапсе ааппосипас пода оа що три й щи инутуицю и Жири и ки ше их чечизу тиви их сф пи юс іиких хи зацааасстє сесссосас пісваоскої зсдаоктісої ссоососзот Чеосксовою че и Нв НН фата нрх и щит их До чими зУмлт части с Чіа чаетецосвсо чес сса зач аах паса ЗО
Чом си пшИпбвВаМмМмВІх сенат «Ел дис зи и в НН и НН дл кшчасванІса ср сссво форт сна ав сел Вел кое щ-їМ сна А НК пут еф чити гу учи я их дня кури ах у у, пп пшаазсеикк сталеву пиІлпсоповов аолеатпасиох Ффксшеоаасть корис зе5сг раритети Божі іуєтит І из ту ВО цу вим уу що Ж фу В гг устих фути ах зисесвочуас поапосоУсас щопусчнех вс озсав суЕсоссоас дае ячи хі Кум ту кувати жерти ср мк им от и тки ах зсепасзвипчи зчацакчтає сеззадчевек зоспапосчах пасе со чеплолааап о
МІЖ хитрих стери и сирих Ким ем их гг в ризи ру т и их Ки
КІнМсзсчаає Чопа са зЗичшпощє пава сслоИ спопасиоче Це ктх Зак поріріжс етери сс куту стру ою ес сзуитожу сф Жж хурми стихи мате втіх тт зччЧчЧлцсва псссоцесакоч сосен с записи чес щичн стоки и а І соастдассас зешисоодсаєс соуздассова соБсастоас Чебасіосвзо садисуаоя ТВ ше НА В В жд сжрцсзвосї долото зосопозе) оосозоаст саочоїзооу соосодюеоу хай мету и К скутери горіхи ВІТ рр Фе од ит апа зиск есе снаки Фщоссае я перо дим лапа са МН ами тоне уифилу чути ит и гг (цу и хрипи ит уфулт у дну о ужих Ззди закзассгзса сессуооп дбовссзусц аФсодеокоссю соуси зсевЕК во 285 тд их Ж еру ие ІК зви живих их см и ху о се опти
КРИЗА ТИНУ сит ФЛ прешефтм шжропат фаху фас асиах ММ пох ус у шифру ев Кожух уки р фу Ки стрів кими ту цит 15 «узиччшноу сечо чкм піс нрвнМмиО сезочнеМ спазм зас плечкх пе У смов пови о сних си вк. ферум КІ о тіки ви пуф оче чіпи зчвацивх сим иоео плач леасслв почжвисетек ше очя пола еа 11945 пра у чн и В и В А и и іп цисесчсув пев сазан очка саА ПОП юЮВиХ СА ТИЄВ. зам км пух в хе мити хх ців м ох КО сжоезІЗитіужстууимхі сті кит кох ци ззЗзца чолсеазчсвчоч печсвЗотам сеамцьеваМ сус шинек зоачатосву сопе ЯКУ саазгдадт папи з стхмасхвиагав завизазиви сзвемайсоци писав с та спаазиаащмхЕ семи лис инскма сера «фах пвисешиЕВас дк схуд пух т СКК джу ул фору тстучих дотики ме во похо дох віче стек суті ох «пек сеча повчпикавес бух сас віспа пеассаассаьо сззкаавва МТУ гурти ІК сви МІХ Ж КК уже гео КВК Я сухо М ж ро жири іх зай сциЧчеасазло пост сасвнл пасе свичсакач свои ааА чив 135 дела Ей виру що ДИВ Б росу рр пі у гуму уче сом ож хоп поссеаспичкоавз пазвсчсцихеа аск ЗК еасахз сова соезегаааих ЗМО покути пед ви зи чпзчавия зитапех ХА «ід 5 и рих тот же Ком АЛ ку тує «ій ДЕЕ
Кая чек ххх «А» жа ЯМКУ хи ц «ках и в НН А НА НН З зла ичи сечо» х зКораласс из скоа Ззислицааше Чавес ж пи рові сті тут гуру в т де и їй чем соки с спзаззаечко чсшосодио пчхвееказа запас з щоб ітик болів тугі суто Кут зт ирутІ те: Ме уки де ту и іх чий
АХ шо МД жи ММ с МОМ Мт АК, Пп А на с п я Я мя АЩшУ родео еу их порту и ТК учи сте ті иохих діру тур со ее аг засічки воша «ши Ех ша ее оре сс и пе ув ух Ус хім у Когут ВОК ох усустиви фіз еуужох кій глухо мох їли стксцесчаас ссиасииКм соус о дока ХОПпОеИКЧИ писав ЧО се і НН В НН НН вч пас саи чес асвеча Фопазчавостсас зас зшлив чо пИФсОиКи зви пед думати Кути жу ук дові фев их уж киев Ще уже очи ща дк паскасички пепиЗзгалав аа по весЕ кино «ее пишеєицоя слона ай шен и ит ку мод ри их сф аа шик их се В І Их КК сег ут сустуєв ща щоизутим пику иружужеу хо пещичичстоЯ спала цоека лксшекоаа песо випа пиву жи соді вищі ХІІ гових рик цотіжет ЩІ духо Ж ІТ уро 0 УкІвоз ик Фо зазвісаиасто вспозавивашиа сша из сОщранМмУуєЄ асо Ччасзц ПО се мери ес ие грифи ие ужив жор жи Я и юю уник уже утекти тих шиті схпчшоапоеавс спомини. снвимМеУн чив поета запали --що дині сви у жи фо лу дити ФК див ув ию ори ит пив ще рих щі ки ке жим ог щи кшспкспасо счапилавсса иа отсци сопоцовас сплеск шила З пи в В НК НЯ тек пчксичийли часа єс кишки аку єс Коустчсвис аазасаВоЗ поса НВ и и в В НН НН А че мирі псцса Софа песо че иа сссосеуменя шеочКеоку ги
Теж звук т лу ож сечу ду пи Уряди си їие ую тут щити т Кукул пт пісзаетато зочасасокЕ сзсстЗотепо вапоцпаАє чеце зЗксапассв сш чив так зеироужитху фути Ки свчузоткти сет ори еуре и урВ ииК В Б фу пед ри чиуихики пт. пасассчезчо Каасозоасзоа сазсіссопе созбосцсовеп сої Есвіссх сазвссвасов о схшиасеЗс слати спосо списа вза зап ох усу ев М свити ОО мохи жов тв мих щу зго що ж укових проя чоти
Фени с места салони опачоопеос зУсссдстса давосасиех їм тужити (ХК вити Увивирини и дручир в скит р и зам ср ниМ; сучас сАХУ ласо ко фета поса сошки км і. пух схе щирих СІВ Ух м 332 тами попе каз ша дах че - вій в 11 зе
ЖАКА СУМУ сту ут жу: ки? ЛИ
Тк ему але
ХІІ БОЛЙ ша пух аг Е кам» хо мит й ря у вла ал о мал Ма й діл і Мі тем сек дує ШОУ
Мет вів із пів Ат Ма ал Бе Ат має ма жк 1 с АХ ошОО 4 х хх ле х х у Ах тт. міш ли му ли ім Звоа дв пе уккй туго ках Кри. дян А А сту пл нів сі Бщ Аін пів ве о Маі Т БОЖУ вкодбів ців АХ ша Кк
За ж зи
М и «КМ хх Го т кх хг Зх щі ло Я т хіх йо з г жи ж їз Бі сі чаї щЗів спів Уві Бі ів БЕ Ха ті Ав Бе бі БІ 35 КУ У о: НЕ о
Шк босу щу я Що ТО хи щої Тех кі: мих Тл: ху т ТЗ ж У хочу а
Бе за ха Аа Ба У хаА ва ЕКО АХУ зЗау тА БА Ос З ек шли г Ж поту п ЗУ БО доку ща шо км дк фо 2 ах я ру джут іш 1 МА и щи хі хо тм
Ещфї6 міш с УВА Ва Об ка дл ЕМ Буш о мішж Уа ау ск ух ЛИ
За ТЕХ, В м Б я М
У сту кт бу дя їмо пл Машею й Жах ту х З що Тихі Же тах че ви ЗАМ ва АЖ МХхО Сук су даю ол о Се Ху Ада ба вже тує ще 85 ц5
З хм М хх со Ту біг й їх т йо уж М и 1 о і ре ху
Заа дво уз бів Ака Азіа ів АКЗ Аха Ніз бу Си дви Ні БУ Ту щХ їх НЕ мМ Ах 1 хід жчухм о Моуу СМ спі ає (73 хи й кож що Я ші ббтуш стаз б ощия дич мує То Чл аа Зах щбех Купе осла ХжуУу БЕЩ це Вів Суб сСуз Бей бо ЖЖЮ БУВ БАд
Тк БО зе
ЗУ ММ 12 к «тори Жора Ж ю Шу Мк їх ТУ жо сті: ди Ус пн очи 1 хх
Ж без же пе дк МУВ КЛ АВ ху мА їхА У ТпХ ваз ов Ай ХА 48 «жк чих
Уже М Ач ду их тт, но жх хг. дог я тою ри їх. оси Тв Ам я вжи шт «231 коляд Ши до хх тує Р й ху хоч тім Ми її
ЗА АЖ УМХ ГУ ма З ав ота ми ші у ша аже о ХеЖ ше МЛ о мАХх а УуУу ха ік ци чої 145 ї152 їп5 МО
ТУуМи зу би їм спо ок ймеч и Му Чую г бан В х би жу ем ЖвА КУМ МЕ. їш ЖЖ Ж ОВ хів Ме ТлАх М ка їеч Але Бе АЖЮ
ЕВ 17 Тк
Я Ах Ах хім му Ух ку моху А хї лот тури Жиахіх ша йому ТАТ М до тя сах ЩЕ щів Уві їні Бізе йза Вій Му ші Бе Бар оАкЯ сів Вів їм
ВЖК і5У го почи и ук ДМА тку ТТ. й хи гук тіки І ЖАХ Мащено Доичим Жоацоух Мощшуує ЗЇ ше бр
ВгФф ші Бе вве піз бпіу Бі вою Бек ві Мех Аа без дна Нік ОтТух
З ху к, сом зи
АХ Ми ва ота лох За озхе; ї ж їїх Ж оте. зижух бодуха ТУ хх йо ж при ох Дю и птах Ах Ух дис піз Бхо На бева т вжодемо і у жшпхосму кжо БХжх ду 18 зх ву че АХ КАМ що пак МУ Мои Ж ока бра тує Толя Як ше шт т Тк ку й у ух
Ав вро ТнХ ех без ТБжЖ дес це НУ бів АБ Ав осві сі пі Бе тре за ак зай ща шу ФО чо ле Мао ща Міг я Ок ну жо хг мм дж жи ши ож хіх ав оУВА Ах вів оку Зі са шхЗ Хв ХО пів У ВКОЯ ЕТО АК АК
Ак «ех тк зи С зу
КОЗУ у ОО
ХХ ожх 5 ХХ Уж У ок. ті їі хг Тсзах су сх їх Ж З Со Ж хх св ччя пескух ар одів Кпе: Уа: ха вжшЖп дж Зім ВВЮ ОїБКоОКЗЕ оміа вів Б5ецо СК АТ їх у МОХ ту
ШУ ЖУК хи 1 ка кі ша у - ох с яке х ' 155 ою Ма хи ЧНІ чук м. Фе меня У хх піс вкла ща Офхк о бух у сх т пі м хі ві ха вь їх м хх же ха Бі1а ТБ бах ув оав пз Ох вав жа ВА ЯТЬ ХМК ХОМ Ух зх зах -дх п ши шо сах щу аа сКокхх я. Тони ІМ т ору хе Хе їх ен ок Ху соя т сх су -ї т У ух у з пл жук; с де их поет У Ї поУусмо х? т ех бе вч Зех беа Аза їцпе ЕБе бе ба гбЕз Кхо Пец зр дк Уві
Ва В Зп
ХК Жити Му Ману Ії Що зо стих Я окіух 0 ж їх; йому ЇХ ж сті ех чВвМ кщ жЖхОп хто у йАшаО ОК ЖИ їхАХЬ їх А пла АПУ МК Еж о ХУ КИ зак зх трат, ЗУ
УВУ що їх зда се Хо ТЕ Їх Ж хе ТЗ піде йон пз (в уг Тольг. Ель. ся і ко ха АВ ВК Бко АдвоБле ТВ Тв оАкч лій Бпе БГза За Бе же 355 т38 з: ах ЗМ М. - - у: яхкга и - -о ту : - я - їх 2 пог Ту, ях ож ке Же лох де Мід щі пу Ми й ії Щ0УМт5 в й зап ому ів 7 УЖ АХ ж ше зви дів су ТУ Меї пер олЛів спе Уді ех ха ик НК 448 ди жщЗ
Я зи. ті ОТ ХЕ х Уха Ак Ху їх ах» яку яю ЛЮ Мт ть тах ж хв оз да слу зу й обкл Нав ово у у бю сам Зі пі Аа 355 Яке ЗЕ «аВЕМ уВи
Са теле
Ек ЕАМТЗАХХ ера кат ха ших зе па У хо рух ч «І» Ї судив чу В Іти у ух же АКА вм рю КУМ реф риє гу ее жу п ча ми: воші ша СК КІМ споссвасодах сфеусваса ис вок штоО у туз ТИ и тд у и из хост їжею ши утри уміти ут е хви У І семи иа плуг зесвдиадео свседчстваста сопсвкхоптато скоса приасиОитсл пилосос ММ секти ДК КК Кор г фоечиитуу тя Мі гака Іо Е ати перев ери з се 1 шисееашех паспсвиаво дошок т щпоиеадиекИВ тус луска А суху Тими Ки Вусики УК Ух УТ КУЄ УМ т пррхузи тиху вх дека жу кожух от жу пл зош Сем ска оссоза адессавЗа соспчлецеснх КтшиКєИ ги сурасуваов исесоуєсєто асокоутою сапуефетоця поасфесютх спо куа їх очок сзапнусаис поп сосассцоає сзсоцослаа зсоссци Ао пакадсеподає зсвсзуаоко босБоподиа зодосим поса асося зо оочи я чЧчицисчепс зЗуашуцошео ащсоцесеик ооо зсекооюам задеи ЗО писок «сшторосацевос зер асо озон зо есвче ЧИ ковадло плопзасвоа астми уєтик Бозолепюхив смрапіосюо Фасон ви кечисзола седвостсалс дусатепкио папа двимо кову зиск. ко зпоечачата столова асплвачезає счиспогаас спасе сеоотуацо ТО сват саставчсяо чщшихасоасс доспаЗикоке счуваацесаи с«щихссвих тя пасуасзоусва совсталеся созшеосна пчсосзвноЗз сапакеізачс зоччовосо а всмешассст пасшзсчсхч асивішских раза счипасонО серии ЗВ кочФеопасц сне ссспиоссоо спол сосна весвареюсі зво чсдвосвсшеє сзкачоЗоКо сссаазосоЗас зФусасвавзЗач сен нМм спека ходо скзваскзчисй зосезаазськ свахочакоу сосок еке Чопа двазайочис їі1пко бТуакоасис посади зсппечсоцс пол токо Ззаасеслт соазпешаосю 15 кесабуснстк саботаж свосбасочед ссоазсасю свозсозаас посссовешо іжхоо зивищчасисес совно позою м сисшесорив саван зрази її
Кос остазо сосасасзша чсспоасссво зсзУуссвеса зе Крус їз заощссесщо зе опекес споатісокаУ всовосстас буссвсівок вста їі ацвкізчсава зажсовсвтвЕ асвівтацеє абсо сса віза ове аби 1445 расчасосаЗ сахсотжес куща В спаєдастау сезаєссєех ссеасцчаев ії змриасатит сайтах ас і «тів З «їі» ЛІ «вій ДНК «13 без пауз «900» 5 ашоааосрссеа Фосшчаосшов зосаекосео сс свУ сеесирошат шефа шкмих Іо пештускачов «зизосвазшус соаочссся зчссвасавау сорсуетя ЗІ сосУ їх клсзччаЗс соавааково зовзесаїсс скоїчассЯо чодавоенуєє горах Ко
Фо уФ тику ких Тит стр міхи мулом муУжК их сус живу и ес гуимию МУМІУТХД ИИКУЖ ЗД паси спец власних сотка хо созочшац сосок пса «и сфімсжетирКУМИ Три ІЖ ТУ ур Веи ТЕЖ іурусоукив КК ЕКО ЕК жи фуру В М ЗІ жде шив ссо Ззпсдезацеья чо оччиоь Фолс ско тох ЛІ с рі Мо фот пчифе и ВУ мет кі ом КК сутки ть пох іжи сегкевр их зе сазехокеє пчпазочаск паси шесрио сопе сис ЕМ частки спитали с цих стазц сацпчаапоихУ Зоасешиех почався ж М фоузачкустіву в рем сор овеири ту строки КБ гри сх укр кет ми с ще ря ай ктисзнаьасвз славі чхв послеавлича пебсгрофртсло опти шатах Кс
Є п ум ут ай ууУМдуУстцо зе уєіумІи|Ути хитрих фею туф то по у цит ирих, цит шЕчистицша чо осСасие машини промити шк Ка їм зшсисплахс вача сетошв зисвапуао садово с зу ЕВоМО пууадаца є бю мли сту 0 уж су ум вул с ому ак УК ач ух гум ау тугу мно щі зачозазеиЕ пчисточасзаж свізавзися ската писати зааЧсосе тУЖхМ и и В В НК КК пл бали запсбелкксцв човен хемпахла о папи асхв соло ТИ тези ую спе ухуХ МИ щи Ме Можу жу сторо ии ми Кк еи и сити кл ка ссимрм сосиски сп оІЄНІЮ щук МЕ Іа нос Црптори а сих ТЕ кн р На В В са виссестпоос звоатасчасик саЗосзщас епос срочно ІЧ посе ж угК ох ерирувиитуу бідою ж тки вх ді стіл ия дих и ВИ пуху сих пла тосту Ммр спсовазоас сестапсоат звпестннку зиск сво зиску шУМ дод ее дод щі сірих дуєти іх ту Мов ту теги дек ху евики скюшОгу заст азсЗзавчацео сорока чере ач оа писав Б
Жосчтрух. ет кн из дю у ги их ируию йК що и уч тех и Зв
Ме х пасти КСО ИсссКо сосна ето щи їае жим ОСС АН суду учить пу М стих рою у и кути фі жи кі в тм. зурінахтю ву суч щи хх песо азот ст сассечо сдеоцпаликсва засл о човин КУ п і нн в и но Но НН зла
Машка сні ес рик є психо ше ше си шо А юУ кн и А Я зок
ШЕ Мисик ов їаА сід В а Мх ї кт зак
ФА МА Зшто когрлотує пом сій» БІК ж ств ж
КАБ иа ЗУ ом Уу їх самими З
Мет Ар одів ех БЕ ЗЛ вхо Буш йеб ВхО Ге3 Ах ві Би тТвх Бк
Єсум У ск тоже їх й Ге «о болуєк дахж пу М ик У ре іх Ам
Шах їїв вв») Баш лів НУ шк зв Ах із ло Дів пів Вів Ап и 25 30 чі хх У с су Фо: пу : У кі яз «Мі х Ві хх ух фс х о дачу дам ім фе Ху СК лих леву 14 у аз піс Ді Уві Бае вар ша ек ВКФ ос ЕХ у КАЖЕ їхщц т дії 8 х,
ЗО жи ЕК
Уж ках їх М жук Щжх 4 м тт: ХЕ хх я Дози ож кт п сб Ох ще ТО
СО КІНЬ щЖжМ Я КО Ехо Біз С бій вій с йтОа тис Жах лів Аїда Зі
БО ЗЕ «й т т їх ун Ук хіх Мосул М лк дж Ж шу пом бл Хочу Мк Їх
Бек вій Уві хз хаї ха що УВА шаЖ УВА зей ЗК ЗБ оБЕМ вЕЖЮОБАХ ех г -к ях та ТВ ЩО лу і гі кт дея від щі ті тіж чиї віх в'яз дід б віз ту за щі цес йхЗ йхЯ Аз вв Бі Зі ЗНМ дів А:АВ Вів зу дав І вх
МЕ за з її: ати гх- хх г з 1-1 Уж Ж Моє пт т ФМоднує хх щі Ж ту Ж ків бі Бе пе зів Уві Сув біу Ні бу Уві Авр о вла Ак с їх уу яке «ек «чи ща ах Іо
Кох хт. її тах мує їх хо бху ж Тіз дю йому Ходує їх ХХ ту Щі г) Аїів дів ЗедобЗнв пі Ві мех дз вле Ве о дЕЧ Кео СЕЗ ем мА жк Ул ом
Ба ие АХ пт бум пів хх ій Де и Ов би ро сви Ша ше щі ну бку
КА У миХ ФлокА ЖвА ЖММ ха Ж КА жах Мои А ТЗ жом хіх ги кох хх
ТА БУЛО вжи вій ку ВК З р пі т їі ще пу Жх ту ну сх х ї58 1 В сек хв йон від ХВ т ЛюЮНах В Же їду Тім Ву жим сб (а и тех віз нів Вів Азр о джха ле діа хат бе ії вхо бро Бу сі тп так км ук та ха Ак Ах хви
ХогУух Сх Їх - т їхХЕ їКо. Кк уст п а ож їх і ци Уч ха -х т, тд бук ВБо пла Ве : х сг КІЗ у 15 Зк дуг хі г: їні Му зем спек свв осіу рРпе наз джросу х із вія Вів вко У УВІ хні Дей ткх 1чий жи
АТО о Її
Тека ШЕ пом (ік ую Тома лу м . мах (ТІ. зе софта мк ик
ТтУЖ ЕБа СтТвЕ Ав Тпр ов Бту ОЗ дв вка бій ВЕБ УВІ Оу Ак уд иа тах тхх
Е ЗКУ Ах стаж МИ м доету Птаха 2713 2313: мук Том 73:35 тахіу Мах 7 дат фрукт мих
ТУХ АВ ОА УЖХ СУ щАМ АВ МвВИ Му сіб їжнхІ ех ем жпЕ тів Мек
ЕН ти зпиа
МИХ а МІ
Ту тем тех т тім й ож ут хкщо 1 у а ун М чт їх
АД ХИМО ди ма інв бах Мем оїхму Мам їз пи озіе ХУХ ХЕ ЗМ ха аа Зіщ шли
Ух Ки их М дугу ше. лк М ОНИ я Ті С фо баку яке жи ТК Єр ою їху
Ява: ВК ОІВ Азвощаех Ахо Зах фі1і8 Меб дгз о суз ват ПУХ Хух Ето Ко
ОХ ОТ студ бум кА ях «ТІЙ и тт бен щен ТТ т іх Ж разу маю сті: ух Мід сб Ку фе сСуг го Уі ВХ біз дх ФО ЖлХ ше су КлХх о су Кб опв Су паю ККУ
А ат цк
З У шУй хх тих вія тах жна і шої боту; і йду йадух зд пубіу ТУР стол Ля са
ВХ Аза їні ТУ фіз бе бу ши ва 48 ювшоувІ сі шу ший шій Уві тд Як що т зи туру Тем йо ем хм зт (усе їжа 6 киА іо Мих С вва УМА лю о сОМу хх їщ ох проц туш Уа Ага БЕЗ ді ше щі У із мах зу: тт зу щи «ЕМ м хв ж Ам лах 2 босу шШшкте бек о Мох 313 23 пом 7 1 кг тих тва ле Аж зи БУХ Ар Ж Впе Межх Аіз Без дех вчи пу йхд ту жи тах запи дво и їх гокхши Ка і хх Тим Я один во ха хх ж Ми Му БІЛ «13 Ждан
Муш йек СУБ Її іа вт іа хв УВА йзз Аж Ак пал озій Аа САМ
ВУ зчІй У же
МКУ же зр: зи
Фа ох СЕ пе оз ен їх Хв ож пляжу Ж МУ ОІД у Му
Бех Бей Аза леж сле рев Су КБжЖОо еп ви ви дуб Уа УМ ЗЕ ОжКО ттУц ззй УМц
ЛЗ ЗЕ ал дані що Хм ОТ МІ. Мк Жоком Хо ау и ою ЖІ. В жи щи хе
ЕХО дав ОЗшх вав вза БК дХхч ОА ОБУ Х КЗ ШЕ ЕТ ІБК ОТХБ Ом Оле зай Зах. зх
КИ ЖК УК пом т схід о ее Ух ах пу ри Б ФІ ом лим божих Щорлва йауує СЮ о жа фу Та мою Ме Ахо Бе Тих бій дк ні Тук йхо дів Джев о ЖижЖ Яке ТВх се жде рат -к в
Ох У УКХ хотух ул охо хх страх боку бе бом ен. щук ї33 бу Мі Ви ха Ам фе варобів Ве тах БЖ ТЕюросжм ес Кі піч ХО Вів лій Віа Лі ККЗ тищ тв шує ЖБІ жк
ТУ
Усуї та кім 1 яка а
А ЖАКА ХЕ деку лице «вії днЖ
СОЯ текло лох жо ТЕ МКУ сем Ох жк ще оз ці ежевв их сови ивии в пу и ожажемує Урядові пух о иріу І завасБпапшко вахо;акраес сіло Мних пачисшсшО сосочка зиск -и вжи дит ідо кивок ди у пд ери ситу за шкі овисх засвизсасе дчаповилевоа посевпаси сасазииаца че Ко оф их кризи вер умо рих м имя не Ко ик шини р ре кю Є КИ Ек и пирив еииииих З т авсгтсеосвиЗ Фалло асиста сптасацасла Фест своем засасмносо іо сорочок очи о щоки дикі ин сдуія ужлу ие тдже ЖК крови г мив ласасо застосо ме сової поскпкошжм Алое Кс лес кВ є. мч по кни я иа Ся сжохті ти му у о ол КО не НК еф и ск уже лим саван поши шли хмуре рам ОВ І сеЕсЕКсвЕс пт дІХеКМмиЦцеЄс спивЗщолВоОс піЗцшцеосщ поши ЗК список Чон пошили спиш пи попки лю зпачЧселач пси оЧоче осо аа ЗсЗІваччи чих снаа сувавишацих мМ ери жереха ож йти их т раджу ту отих сюжети ТУ ої бл зеацостаппс пзпвсгазу азптсоччазчев свосавзаас зпощшниннасх ззаду чи
МЕ етик и их себорея пити уд и тези и «хурми Ко АТ часову с їз спо ЗО СУ йо русин чим нХютя к пли ей и помає суди утихух ЕВ ІВ у ихух ужив ие гзоціхеевоум іх хУФфУХІВ КК Ім шОЛЕ жчІтседаїзас затепвосскио апавтсбасо зо саца задано миски Ж зазазсстасз пазвоедокау спсттсавасх зсспеазисхя ар сцея зестоваоєх ска зЗдтцечлераст п їопрутдетих сп мий відо сш дура щи Кісти Фр где у за зЗадемах се шепіт иах Зреямишаак «У ККшАК КУКА ие ун ни у и и и чи шати оши пото счаценх почали сс ооо вим У пости аасс зісопщоасс здавозасщі сррениви с: зесозеесоє зоре св. х4о сизсЧчайкоз зсасчесв посоочоаоос сзасисахке ахсесевасо сочзузвоеоє вошй свіссаоцівз шчзчлзчадой пвасасоог катода спас дво о вав зовідесста сибскгсват ссдоусчалих визссвкЗзчє пЗачисача Зевс іп тзвасавцца саасшсчосе вочеасувово сотасвасткУ здаопосдаскто сксацевоса їп8о зпзлазвуеавсва савсоїсвач ависосаасу пздвзаасве тсвааскооч «вики вата НЕ зпаческсте побпзостав созостоуєскау сзотаззаїс сакзпсаоя ссоахзсуо їі їховозайїтся зЗапсасчоспа коїсзКозос ацсготан свозасваваає завсласеєе їх5О шічсекз паззсасоуча свпчов'сс Фаовичсвви пасе соцвОоа пепловиех ТЛ схе сшихно ЗчааЕзасаш соку шЕстоистя пап часа 132 ч«едааксаз: зпзЗзсаіаФф шопавссасв пссзчскос асан сс оц Вячо ск.астоестче хаспоска ВАТ «вій і «вії» 1115 кій ДНК
АТІАХ бев шауай «ШІ зЕЧечиоо саше ова сс с пооасвоцесс бозвосам село о М зсечитстасот вазсовоссоу сесспстУїокс аїссщчасскої зоешостото схоче їх зривисчези асо сосна З сза Чесава ем ї55 зичу каст зосвспчечо Чезоссазао вссслізосх подо оцав ча 23 чик сзпсбочмен звзапооччааа спочоствае зправа ис що стопу саси аспечссвцуе фоасвссваз заспсчаои аехзсавуча зокочсвечає їа зкочЧечссзУ попазссчео фосусоззсеа вості всих Стах КУ засвауїдас «осад востачеоко азурачашчоас сзпааача сс зво зечЧипвааде сепосчехое щптдокеанх сбавссннММм: сдавуостреає оперою ща звоссзчастжх звосчастсх савззассах звсЗаєсскіста песо шеаокакеоє Ва поскуссеце дФессуиеє чусоексоас ча созос асовалавсох сечо о атсспашлесех ессвзозФфаси слктаача пса засн сщки сивая Ще косо сслом озон зешопесено пісессвІсе всезкоІЗосва поетсатесаЗ 78 дкзсзчазаос почаачсапс доп сассичичє Зеаасксоосасо еп ство є ЩІ межи окон проткнути ск ето омі Кер етще зп чив Ескк вас мннаа ссовосзусаЕ дЧаЕхчаае ЗЕзовоцас почезаева МУ сего тих І ДІВ ді думи ди удо Коти оюпує МВ олуєтио (хох ог лу Еш ши атшооа списа всо воску асаа стаз Ии мтс сосзоауавуаа БО п уч гі ж В й их сту тк тю ун Живи пт М й из в жфи их жи им ки рик кі тт пери осхих падала лона а цпЕспвцахл ск е каз азпзеодчачи Ким
Іф ит тух В хіх дув уюх Мати труу дути Мити тки кв же МН хист ецхл спаси сабо сово ассувоновВв хицесеклии зи юки жири дмуУєМ КІТ ІВ УМ кри куки ог сек хо лік ту ЗІ ЖЕК Оса К С с ч АХ «ві 1 тк Ех З «шах віх
Ля тевце ків» БАК шк ту С д ху хО лев ша УТ «аг з «Мох 4
Ми: ті 1: фам СВУ Мав о дж сін й мед ві те що хх сх Мік
Ме зЗіу пі ре ТВх Мек Ар біАв Аза ВНа Уві Бій йза вхо пів Мі ї 7 о МО
Ще и Жак ит Хлхо ху ну тт М я зх Ул ун Хм хе вже Ко пуд жит АФ ХВ ДВК жаб ОВаВ ОО КАХ ЗМУ А вус їм бі йди тех 5345 зх
ОМ и в дує іму ет Жищмії ЩІ кл шквал: є лм хм МК хо ж ех длох Ви лацоех КхОЗ фен) дів хв ще іш ші АХа та Зв Віва бе Аза АТА зе ха зи
НА я» л
У х хі їх ох : - ши там Ма ли и хі и по са ; з а іє ей дим бух іх йог Мі» зл г хх
ІБАМОЧВА ЖАЄ СК За поаеВ уж озАВ хім жпе Ма ЩІ сю їх у
МНН ж а яЕ МІ ке т 10 и Ж ую ВХ тож Мхієує дб Кт х Ху ЩІ таб їн ик Кожух
Нізв 5 У жа вка аа пам То Уві йіз Аху Аза ол міц Аза сів дх й а тв ХА ж хід на Їх щі лох шк хх пла ха бл Щі» щі МЕ дух мем дах
Мав БА Вл Аза о бем би від щшіб йха БУ Аза ліва Мі дЕхщ о дЕЗ дп
ЗИ ЗЕ тк морю т. Ух жоко хг Мтахає чим Ту у ст А чим їх сммлу чут
АВ ХА БЖ ем Ам АЖ ОО ЖУК АЮ ЛК с па ХЛ Бут АВТ ОУщІ я я вж за тт тогрх хх
Во АХ Кк о Ха Тут Тижи р (58 смутує ау Жозу Ех та М усе их їх Ук дис Між зга ав ХХ ому ка ВА УЖХ Бр ОН Ж Ехо Ак Мо Вже Бо Бо
ТЗ КО 125 пну; 1 Мі щі зд Щутсю ж кшх УЖ Ж Т:х М ьУ почую Микч
ВЕБ Але лів ТВі їв зов о йплУу ЗАЙ бен УМ БВ о АБр ОА Ту Су попе зд я отек з г
АХ ПО АЖ бу оєуу я ШІ м ТЗ хк рек, паю МТ хх пон пла сл и Ох жов я пав Аж о Мем о жхе бі КОе дв п Аз зей позцч щі ТУК Ах бух Ва за: що дк дош 145 50 Ії КБ ше о ойУуУся ФУ іх Хдлу Ж я міх бушо тогук То п; ж іш щі хто бах Тв
Мет о Зіз Шібв іїмі їв рі бЗуужх їм де пів ей бів Ві Ах шах Бех 155 тА ЕТ жо хх зов хх дути З . пе бот ХА --ї жо Уфі Хол ту рю ру вук їжи Ак Ехо Аза ойха ей МІУ щі Бпе Бе о СУ Авроїхой ТВЕОТАХ
Уют чу зх же ЗХ НН
Мал: КЕ фан бе пд міш з Ж Ух ттхг чи сем и хх Та іх ипеокІбФ Ст МЕМ дви мів ї УК БЕ КЕсб СУ Ки Кк ЕКО вв зем лад «и ях стук я КН Ка
М КО Ма те ях лю Мах шо ті ли до юю бі мам ру Хм ху
МО за Уві Бу АБш Мі ст взвод зЗАУу а БЕ ЯТК ал Бе о Кух
ОБЖ а хад
І ФО «АЛОМ сії 5. Ми їх її й хі ут вжи хек йщу. ТТ х (ху їх 4 В ази вх Ух соку іУу ши АБ ЯМ дис ва дж с АВК АВ ЖАВ й ша 5 24
Як: М «Ох я
М т Ще м Женя дю 32 Сх ог. лдв сю ДЕ ж п Хм хащі ТТ Іх
ЖОВ ахч сві Аж Ву Уді БкоО 4 ВЕоЗшЖ жвБ о хІВ дБКОАБХ ж Х слу зак зчпйз лк ах З ЕХ ми З кару ті ші а й т Ди я З хе Щи як Ге, ча їх їх важки ем да АХ ВЕ ВИ жа АЖ ЗАу гм ЖК У ВА Ку хх ВЕ ц зв зх ла
ОМ МІ «3
Ух ря Ту Й пото жи тах Мі шо У т да Туга Тож А Щі ще тиці
АЖ ша ау под о о ВАВ ів бе о їев фей й Бко Бу Аарвоїем п ТИ ІА р а «ЛУ хх пе т щх Щі й вх чих о бл єм їх, пі іх кг: бу Мід йхз ліз бум бу піз ББЖ лі жі Дів лі пла бі ЗАУ Ахо ех дів «ух жах зах
Ка ва Іо их жк У» дя джу т ди Чжоу КУ гу хе Те хх т Щі шо ж М пів Уві Ах Аж іп ів зем літ Ах пе фев Сів бі Биз Фів сл
Ся т Ток ХХ я КЛ В ж Хоч «тки дк сш 35 ом ЩО СУєг: зійп ові сова Біб 01 дів сів джаз су Баш Ну шезЕ вав во діа ЦЕ зх за 15
ЛЕ ЛЕ ФО Т кої та Уха ут уки Хуст ж оусту Кат бум фі й ск АТ я дя т ух шщіп оз ОА Мх БУ КО Ах Бо тах отТлІ Аа вк дій лу З МОЛ ух 4 зак Зп
Ж вч и хі сті ві шо ишул У що Ж дк я Зх саги сн ку Жах
Алв їМе іа Ми ет ЗшжЖ сек Адо» мех сл Ні Аха Мей жах мех та хід й пе дів Бах хе ска г с дх, їх
М їх
«ії 135 «АЖ дЕХ «23» Жев ау «ах 1 зкоувдаисло Зспосскис аввкчоюосси спосо сеанс зх свацев щ- авскоссскче декслосіше Касвевувсс «сссасоосоос судвовасте сосепевЕво Зх китЧсзасеоо санаксесаї зво сзсаЗ Зазсзасвво асо зипсоказоах ід зсозшовцсоз подолозазов сзезосоивсш поСапоцасто ссвпофевй сепосеУко ай сисрісцоф стесссвсвоо сещососаво Краси сст поза сва зчаставцусо то зво че ссвосаазає свесусаох зесоцчасе суозссуая Фоссававо І чкспусчосе Босозкоачис Фсвопаасзаа дис поси ссио зсааосзау СО чи сзасЗа баЗзасж а сок цоут Феасзцозасо ЧиЗОозшеУци посох «щи чЧезпцедчевоа сади зозпцодвоЯ свочаЗиоше посвочеаоо с мАасе За чтІзчовсзпаа спосо цеста соатсосчсхо спасе оса почате шЕ соч о І пісоссчалв адек спочив ссозрчслвлой спрммщшчциа песпчацє йо с«вочпшсоасс засіла сазчпемос соч шосту єх сомуєіАсиИ ТО засопочсаоо сапхссіч соби кодаг свокесохоЗа позсстскса сова мох тво пазчссавтта часа ка ссецаФаас ссзвазада сгозазоалпацзих чісоомиоя Що зезактачс сис фасок чевоавазокчс зещадовишв сода що пісзавччаса чипаусссаї сасцевасас застеасевсш скеосузосс пфрачеосуа ЗЕв каенсщсв зола очесе зсвесчклпас сесасцасочи кеоасоесюЕ ссоооацао ТО таспицесоя осот пс ево сучас посФсопЕосму косою 12 пипсостасан ссаповасаї сіподасакх Кісвтіоас саскочавонр ново 145 застншкос аосзспоша чЧолазасов спро сх поси скл Аа пшЕченххас поза пе соч са пісок поши чсщи і-х5О ссспоасксов поса чсаеце скоса ицих Бисасцнм ФаевиваАасйоВ сиспчатниос ЗУ
У асо З чина З ОА песзочскЗоа впоссекса созсиодст бессасаЗос пацесоваас зсуви Іво список аФфомнмнецЧе попа коссскиссшос осо сопсоосвопо 1440 щшчсавосмре: свофасвоФфи пес мрнхо споипсшлипс плода плода Очст Не всоссевосех касзобаста зас асвлаї псавчадчсви аїгвкакмакає вевтасавлас БВ зивкиштиса ївіатеввЕ аїазаачава засаапсечо кеашсткі ек ї8ЖО яких ж и Вуду у дом лим тяжко потіхи бод гучну м текоц гу я щі штвсааслииї поаєтлсах вет патто силам гипавшатох справах Аа: . пи ливу шо : . ча соусу дити дв гук кю ВХ киев сала дз 7 пусте Зав есшеу ссстосиовор секс тсх падвалевхк фаз АТ са ля їй
М Ко
Ем ту квїх 1135 ек Ту тіж
БО ЧИЖ ск а, хіх туш
Ха жа Ух є ча
Ці МВ зкчадпічощих цссссосілс авзпчкоосту вопслецІних пакт Коли тих БУ гзеУКаніи секне у опе луєчих меми сир пев ку и рих ту лу и АН засос сохсспостФеЕ пзасазвавасс сосаєссосс содасваосх сесецпеає ак дач ми у сок Я сер им пови тв діжу кож куми дув ж ккоасачстопо свист спав чавсчасвазо весло зесбунах А пам а а а и А и зах зими вих пиши пзацеєе сфе сллямЯ осока псласисює ск скнуки КМ мах а мусу смт Ки Умов ж Берк сим а мм ладсвми чип шкаф допо апелхИ пежслпосаши аЄхчзасакис слЧассасав Засл АВІКЄ ММ нн унч В В Н Ел зашемикне ссвпсадоое сиром чик одало оплот зиисавла их хо че контр уро гетри Си ов п ди штшлімнІссаЕ ХПП пово зО паси спосо паче чо
З Яіжгх по ах тут Жуки хітів М сну фізжоз усу ІК се І су сп Ім й жшишдееаство Мао асоу со ешає ес евом фивиаНє ІС КУ хх резерви Керхер сему ми т маже г жо пуер УЮ гу суток дит ща зЗиспасоои всем Фозпсчасе своих босвовсшиЗ сепасаеоцє ан скожтут ит свои чи ввиии що путем терту юю я ун ифи ци М рію щЩтлнх жом сзпорааУя песик щита шле СОКУ змо и еези і рьх п пи одіруневири еу Вт у і інет ии фс чуууи в фе шо пЕсжолочаща Фроецхи ша дили Усю самка сеча ря вич мннео зсесчссе сазвчссмхмМ: пччазозада схе слопипадияо їх
А а НН АН в А В А ци чЧасцоцсстюмо секс коє песо тету дивом Кам Си ке СБ звчссвасУш сзФеачешия «са хосівссаста бота Фоми ше жо ічетевив жор фо у совок ери СЯ КК и ви киев ун уче в ж ом апа аз че халат шезаиссчаЗс Чис пон ае є її 5 тити Хо и А І поч сх кесозОчласе сопел песто аасечсшевом сис поч що ке и В в В в В І чл спаси а посжпичОшиИ ЗОозпозиЦех ие Молшеик секс ям сей ствер стр сур ст ем тирі сут Кіт евию т сечею фіг М ем ті вик звочсачея зчссооуасоє Чехочоаас даси зсософсосо осо ММ тегу три и Веди схигужс иа фу щури ферит омитуяю є уч щи тлда ччасороссат ссесставсв сопло есе ККУ ша шару иах КАЖУ пиві Кт п НН в НН НИ и НН АННИ 12
Мр оксс всстзпцсчах пливу со ок часах зош зе хви чи ааихм соч са си ї З Бо шт І НИ о АЖ ка и ВА В хатУп
ОЛЕНІ АЦК МИНЕ ШИК КІ СУП КМЯ ІМ РОВІ ЛКК ке тиф ери ик де рами уз иужух учи м и Мечі поети дети ур кутики, яхту шерласмнисоО мрисмесвє сощфсцИс лес доста Попик ВОК уче КіІж и ди тал типи я ка й я ш ке АХ Е сеї АБХ ту зи
ЖОМХ БИК мл і са «оп «А» ва шВУуХ гати «Кк аби КЕ дя люту Щука ож то г--т й сте ша хх У у терни иа кю тома
МЕї ака БЕоО ВЕЖУ ба Бо бко За Узі БКО дах їги Би Бак МЖит дм) : З 18 358 ї З ще Ми
Ж Ток Ку зд м бу мк Хоч Жар фік їй чу дез Має беж ТМ я
Зеє беч бези Хі зв Бех фев Бех вже бо Уві ТЕХ лавотнЕ БЕ Хе ки В за фо Хінчну йкі СеУм о ке дж оо став хм А Фу Ж Фо Тохл Мих її вжи опа ав озЗилохи КЕО дав шЖХх зем ом Ми ма ВАВ ме она Ха жк зх хе
У я Щї духу сх «у дам їх жу лох сту кн дешемо У вках о ри бик их ож вах Біл Бім ВКФ пів пів хо віз Уві Бу дже беж Хек Хек ех ех пох ук М
Во Бк БО хх їли Ще М з му ке Ся дужі Й Ох Фа бін жо хи Шюито босу вій груз йжЗ Вів Аїв тТВж Зеї Мет дз о дія дек о Бхо Вів Ко Еко цен п -кй кт й
Б ке То в тоди Токта: ще З що Хан МІЯ Тем ше бечуя и Фа Тмії ТУжчу Що хи аж мі Зх Щ ЖІ БхЗ жиах гл ЗЕ со Вшх ТІ Бк м МА Ла А сх г тп -к ра аз 5
ШУ Зо ЗО т йди одіж. З 5 У: в То уд т кг У лах ли діа ві шах мжв ар ого Аза Азе Вів дів лів ех Бу Вів бі Аза Аза УЗА Не 325 зе 15 і Мп Во
Хек тв йо Мк о ит сл т ду й ж лк Фк тю же фу ше ви ВеЗ Ак ліц вхо Ж лам КЕ вав Кит Кк Ве дено оту пох хд їх ц ХЕ 15 хх «ЧУ МАС пте йти Жде ще Хе чає та А Ті їв й. АКА ких Мів о слі шіц Біз іа да Ко Зв Беж Аіа Аз Біл їв) бій УВА Вхз Мак осві іа І ї4п дош у лях дКУЛО т фону й та их й ко віт томі Дт лк В
Ав оМвІ чу Уві Без АжУ Али БіУ Вр ок АЛЬ сСіУу пап лк Зх під
Бош ІТ ке Зк їх Во іп 155 хі він ік ові із дів дід мх з стмк ціа філ роз шва ім дз зай ай ша УВА пав пав лав ув Ай АЛЬО МІВ су Еге гБлФ сало ха ХМ іх іт 115 тхх т є мя шо їх ск зу щі жі ух ух хх му мм я У ши бак хх
МЕ АЖ МА АЮ св 4 Ва вів ів А заУ АК лад АїЗз ле ЯКЕ їх
З цк Ох
Аз вах МЛК
У Саму у ТМ ях фр там; жом їх г ти и ЖуУчм МІ чу іа цех ЗВО Клео гла вищ меш яЖІ ШО мав ос муж са АХ мав ому їз В их їз5 МО «МЕ зок ЕКО Фін зу р с пух ст 3; сф СУ сук Щі ця й ші Жук
Вхп Маї Бо хі БЕ ОУваА фшех бу Тех Зк йек о йха нів Аїв вв ОдЕц хів 15 а кА КН яхта
Зв: Ж лож жа фе Жуких биту Хлор ії Му тжмла Шик б Фа; бу Мак тка» віз Від Був їшиа ШЖхО Єхт су5 МА ЖлХх дже мех Бпе б Хух хх ях прю «хх дм
ДО шах «Ах ее хх тт Щлв щлу лоен ууя хх хів З їх теж Шк хх (15 НУ ТМ
Азрвосоту діва віа кс бко в) Уві чаї Ав обеє Кпе са) сі Тлх Бе ул пт ТЕ: «ал жЯУ ке
ТУ ле та що тс У люту да 2 жу (ЖК тку тт Доит сблзаз тт У
Чі біп одав газ бів бжО Мет пі тТхвр УВА бух бод ве тує сок ик ких «т я хОЖЮ, сдІМ
ТЗ ух СУА Ж кт соч х я т я ник е о ик й Сочи Ж Ж ох КОХ ов. СбшУ зх з Тл ТІ г У Вч т ї х ся тоді мл іх каз МУ поч Мах їх ув'ааАв ве пФ зем Ап ДАК Мвк осів цеч їена Зі дец щех тар т аз що 231 томи дж Фа; ріж ран рію УТ ЇЗНІУ Зно» (іх й кує вчи слу ЖЕ жа В АХ У КУХ КУ О пшжобАа с клпе Кпе о Сабо АХ ряоекк смт ета В КН рве я ЗО жах бах т шо Мн туги феї мо бюл Тане бе б пр: їх їни За лк Зах ле Ме йкЧ бу Зап о ТтТух ТУХ Бу ТЕО СУБ Вк СЮ вхо БІВ я лм еп «ув
Оу хи АН: и
Же п там міх ак іх фки Мао сну хх Жокох ке ді Тур ть ті
ХІІ ОКпХ ОІВ МУ Аля БАаЖж ЕКО мл СУБ й ОКО АК ОКА мМ Олика зх та 35
Ук У У тТазум Те т у ж Ж хуй ах ки Ух туя ую де жо ХУ кю пк: лен ем оліа зе Аве Мщі їхАМм о їхіУ Мем ха ді її уУді де осха м їх аЛлі з хо бужяє уде ик Жуєих У дохо иа Ж г я дн ДЕ тре ох ті вла їко АхЗ Вус Уві Аха Бе і Кко Бім 5ів Мет Узі ї1іе Ажши Т1іе ЗІ пк в буді зюш
ОХ 3 шо хжшже ком Мас йиує й хо т З йо г ме доки Сем Лози ду у хом Та і
Кз хх оКБе Меп о йій пев дех дж (4 х вет ЖУК му Бех Суд лит Між за ТЕ, ща аж Ка ях ох же ОЧІ Ж. ї оси Сян Тож ке Кк пу жук Що соки Жах то дк: ТУТ: жо с 7 Т Мах й У Ху у ТУТ г У З сх СХ: о з ххх І жи Аза Уаї УВА ви Бій ОзКч їх дів у Бк Сх иа 35 ББа вва де аа защ дит
Ії 325 53 УНІ тлхіх й Мене оч М хо Аг жч хм 1 будяк Ма ж мо сжа пЕшОо жо а и ав лю Уві УМХ вхл ка ККО дія щаЖ вла дід ди че я и ЗАВ ЗА сожи му Дону йони Мі ви тм Мур СТІ биту о свсухх Її т»хі щШуук о м МЕ Бр
Бжз Ожкч Ася тує ВКро дз шо жлш длаКО БЖ лав сУуюж от Мет Ах Ба КЕКх їв аск ак
М хи у хктокя Асі М що сус шкі чи Ка м боту СТВ бух да щоб щих Их СОМ ду саеповКча ЗАВ ою й ш вій бе жи о ЖУКМм п о мтО й Зк Блю жплЕ ХК
ІЗ аа 155 тбужх Ж их Мік іо йву 33 Мі вів їх от фШачч фут; тлім Же їко бай Бех НіЗз у БЕЗ Аза Біб 5із діа Біа БжО йхОо лу сккх 459 258 зо «ій» 15
Як, тло «шві РФ5І1О сек пшу «ЕІ ДЯ хе ке меру подих, ся «ААУ 15 суттю гир іхивих М Кок пити пи пу В гриви В дити шт завзчУуалече пчвссчсани состава зЗсесакоспочз пока пасе пу нн оч а нн я суп «засос пес ичис чЧУувипчшецо амнимМиви шо чат оса ММ кет сор вро Кожну стві ді ду тхір ср зай пев ФВ сип НЕК МУЄ МУК як чис Меса їі55 се НК В НН НН узи их рим у и их уж ож т У и тт дпавичсхаис рим Чеплесдим врословаста спол сли «ЗИ гсдсспЗсос псопеатстос чЧесзтзадсо гизасвлсис спас с попе ЗгУлй ка чи зоосасиш поч тезах са сече пече У сири кит у ит и В су ж ни и и тиж вжрлди фжІЗсз ту Ко ЧУ посчсстхш повпчсеки ппопслиау целжЕосКсла чи о чшвас свист БУ пруттжетктутиМ хр уст ервим пк о щити суху ри УК ух Кука дО аишипче У ПІ КНх ПІ Ко ПМ сирим се ил: ОК КЕ М мес ее ре фугу дир утреуєтусі вою сумо ут е уж фрі Я п счсразаас са щцо тапкхас со ЗзвИичасши худа Ех пани у КІНО В чих Бе
Хотин слі субтитрів му з оспВвипинииаКо кот хлмеасимю смс еасЯя шко иастх чесвімМбасує сапхІМнушМИ дЗисцииаКиИ ПпЖК кеВ КУ ритм я В Кору У зв вчити си В Вже у годжі у Ви пух штишкхсчасвца ЧІ сшЕЧсше сах сива поашоксавя зеадавсспасаз БО вики ми В меди ур хов ре Мих му слі Же мису ре м пф ке ши сзссквссоа сазцпоазс созсзвзися соасехазиох зезсасзасоу виска шк еру Міфи ОТУТ у и дух ут. пурузті ех оду сорти и тихих сих луг еВ кит мМ ую г ТЕ щшиспочассх зпаласочайс басеболвацяа вачслесетІчл позапсажф спалив: ї-
ОЧІ Зло еф дути уми ут рив серии их В щирим узи вл сто ппхсаайшкк сопссохосо вБососчлчало бос скасезосеє содорроев Ж
УЖ у о пуху ий и В уми думу ки ох віжки туц пут у и ут и ви и или У ат пжтластсссва сщдомлошаскх зве кевз плеса пуп ша ках йо хости щиті гі М жу и зубі уВ УІКИИ ери сухим ую пити вису т фо хімік Іху пл щммиМмисом пожеж: ло сввис попасти посасосвес восвасвепи МО
Кн В В НН НИ здо чсопрвисеих семи засво пс впсасооач сфе сло чт и нн и НК НН НН НН лоЕкТету паайвттсчав сопечадчечс виз осеУка сш ск лідсжсокщс вассВ о ВХ бливо с спошнмивас шесчесвесн воазасаоссо допо алвс зазавоася шо кн в в НН в р В НН НО т пчїасопасаз Чозскасзис зво свое воси здовссвоЗзаФ са тику ХЕ дурити еВ уч І цію що уж мчіжук що суд вка КВ пугтоуєчитут умі ех тоудкщ рес зЗесскачс ме виВвимМ заКшавсчв Кама к шик кож ди ому они у су я я сх мує щи СМ уж яз удав ож у нах и ву їх ж М ОО Ту важки сІс сахцасакта зЗззайзасаста сЕзІзсІваху ше ВиЕ Свостинна 15 еабсзача сеочсмрвросаук дова нсосЕкК сезсобссвнка свосабна зас ка МЕМ пес сдрстоии пох опол пустот схо и сг я м. дач у мохи ую і фичиА МА ІІ звцизайнса ввзсдавцзай зЗІіжнозвазасак бдамвровалка сезИжщЕкЕиЕ сзафоавнлау АДМ селу св хору мот Кофти ви фоскеке ве кі Во оч охВВо своу ще хіхоетит зу моги и у чий ззаззапо стікає бзосіз-іаїв касова асви згвакавсочє зво ІЧ деки ку падав скажімо діфвизизарт дисци ті, З д звсиазЕетих ча зала сп де ПН ОВК Кт Коха ЯК кЗМми х гу кедесвсвак ІБК ех У «ЕК аж ія
ЖД дих Ах шт тих
Кк МИХ куту» тс им «еф йо пирув «Я ГУ зпачеопчачи зсшжхитакс шаоччссчеО пасе сич ерин пиво пе ситі у щі сти ужив ик стики ий Ук щу и пути у живи ум ух уже ім уж В я ли «ИМЯ ЕЕ ЕМ ЧИ Ще ЗНЯЛИ «МІК х їх сао сутки жритот учив уки уже кт тужити ЖорУтут им ери Кия ри ие зи зпапссепашсв схинасич свпоссчсвчеи зон соло савсочо пишосспоКо їщше и кі Р, Фоліо юн ситу І ДОК викрив и сежких суди у и ще я су часточки списати шавссл асзасвоЧчосе соссзчсовое доски «У фури и КУ В КИ усе имк уми утиск р НК б
ЧчипЧчсМичес поч сота шиис сКопавасасла чес ацк свт ве сли м соку мисі сувою уи по жи КК уки ферму вчи тм КУ за залили чававчасесо пика снпоашои вшир сави своЗсзачзла папках КО дп сриничятю пвх си сходив духи ота вини духи Ко За звестІлосае все сстссч секта скох саблссел апа ооо ЕМ мечук ес дити сит Утім ІВ ЗУ я петуЕссавос сооосставкЕї свазоаздасс асачевосу зосгчсвачла зпсссаЗааЗ аю се сктужтуки В уд ехо и Кози фе уитужі мит усу иту в гум; сут УеК ожлреричиМ ті вом їж «ай пісузЗсв фр зтасзк сеспасстиз Зацачссооа зпоосадазозс заасевоа ВТО о Но Нв і ОН дат азвпчавсоче коша чесна с вичок св екю: ес ви тр кіхутуметрух ск Міли ти уки хмизу ІМ м ху т ет рити ох ЩІ зачин счаци фбозосеввв побесичеасо сапвосувис сизаслиио псассвисся зим руд фут и др ре сторо ук чо ри ут ву гу ув в я туда ства злоаст спас ссвес синростпеа писок ссасми сссФцслацйтер заклик ІК азвіди ша сич сбесивкстваєс вка ачсоцасши чума ТЕ зЗащевиа ц пед щи птаха іа пив тгваю пил А
МІУ інилих ром р м шо ую Зп ИЗД МИ М пЕВоляї сх фе тки фе асстни піч сІБеМизу пері паро цх ст шЕХКНОІКЖНжЄ косо ЕЧчУєс жор саамони пеошицСссм пс вас о МО з опи но кана юн холу ув щи етно ЯМ. дих ТІ ашицениииє смс Чталецлаве дпа павича зосвазиесеяв се вая І по чи и КН и я ско врохсвіиещо г тал ма зезата зссуЗцаоса ФЧизисаска стопа Бовуеасеа КВХУ джу лк ях
АКА Мо хлійх БЕНЕ хЕІ13М шее яву «ЗО 8 хх: що аю дя жі бує шана мя м ху мів лм Тк от Хкщшмач МЛ жа
Ме Ада сла ка Мед бе ех ТМ» ліз Мадї вія Ааш о жвХ Бей БЕ Баш я к а Ак х З Її МА
Шк бик ко а додеино Шжучу Іх Фен 1 ду Шен их Кошик М гл я ди
Беж ТК Уві йхл БУВ біз Бех хай вка Бхо Акор їшиа Ада А Ул Уа, ш и Бе ви сло ді два їі Шбхи їх ша вх сімї 25» Мк їжуу й АкчУ пі
ТпХ оса пав АКТ Зі Ехо ті Заї А ще Геацоспіє МОЖ БО) Ар о Ввх ч 1 У
ВУ 4 45 со ця А пі Мі сі те ко С доти йо ем Мі по їі зма Ши ака ах уУі Вів бів Уві ші Ви дів Сх Ак ше НІВ біб гла КпеЕ
З 55 и піт в сла ден ца о йла її міш хз хіх Ту шві та дл та дув їхік ВА ЗА КЗпП Ома ву хз ПІВ ЗЛА ЛАЯ МВ Уа ма мап УЗА МИ еж чт че пи ж БЮ їх ре кл Ах Ух: ба тю Му М Фсятажо Ток. М Тк и М п в не ЕН іа Міа БіУ хз бі Ра бБе Ажщ бе ко Ехо піз Бій БУ ВІЗ Буд
Ех п Тк, ху тк с Хе То важ хо ож Ж тт Туя т - ЩІ ж лож їТк їжа ЖУК Ще т Ази о йзо КжО Аіз мул УА Тіз дЕЗ гу девх ТВ дет ВВЕ їх їх А. Ки сх з тай гук, ту
У м А ух ту прин Ж ск Ве гої іш пу МХонажо нує ах т сх Щи Жука зав 'Ууаї пса Був Зіщ пе УА пів й ТІ АжЗУ Ав БУХ ін Аа Бе чек ух тв 115 КО ккра по бліх М хх (же ЖК ах кош ря жо Хе я зи са дж Хо Що
ЗАЖ Оу ма хо ша Ба ОЗ г -е ви Его дае бур ка беви Ам) бут золю подо я ор 158 135 І їжу дух МУ бю МУ бум Мао т юю Мая бра утіх Тек ах Щи ях тегОУ Ав їОЕЛЕ ду ОО КлХ мех (1 У ха їшЖЕ СУ Буш са УМ дЕЗ осщО
ЗАВ щу 1 хх іш
Зп Ал Ах АЖ
Техіх 21, ЖИ пгт Тем ук здо віх Я ми мя Же ву (3 Там Ж
І юамУу кмФ Ол Ме Її Ук Аза ав зле ех км ох деео За ле А з шх «ке «суп ї55 А Р с «г : леї Кк - ве шої - 2 кут 3: с ст і зу сблу Мих о бага 1: хі Тохус ік лат вм тім Кім «о Му ЩЕ
Зі шах Тух мех Б У Баш Дав 'іжц Ба ФбАм сів бами ши Яка МевІ дів чату тих 12
Іо 155 їз
Здаю а: сах фен ух АХ уко тах беж УТ т сх сф ск 1 хх 5 хі ючи КОЖ ГУ Еш Ки СУ жо ща КЕ (А Ц ЗаВа УМХ КжХ бхАЮ МО лгук лох ща і-У ЕМ КА
Хе щі мі ми Ап ух ва мл тах М 71 Там ХМ дохо т-ва мА АЖ АВ ОЖХО АВ АВ жа ХА ДАЖЕ ХИМО ЗМ ж ЗМ я МУ
Хр т, ул ши ех М ху їх Ід їх том: 25. и хіх 34 од их их схе ли кох хи ши а МвмА АФ МИ сіб сві їеи Віз бів пі У ші тих шо А ХВ т ксхух од ех
Ж шо 49
Фе ми их хе Ви ж ошя У ум Ми ла Ті йежу ТУ м Ух: 1 ваша Бк Вио хуУ Мао вай важ АЖ АЮ КО їхуЧ ВЩ шжАВОНХ юОд 2 У К. ком А
МОУ тм на я жом жали Мова ТУ у т ву трагає нуюю ту гц ту пі ет йіМ щі ла
Влала їм Бе АВ ЩІ Уу міт жУухХ БжЖщш ЗзБЖ ха їКв омпавожя вів УВА Ух «ди з зх
ЧИМ км 23 ох уд я нт УА М дит зи их джу лов да ко З куу йти бе пт
Мао» Зак ВЕ жи із Ак о Мех ех Ма вія Мет Еве Пеюбю суд вже ле лоза тет хх, ке КТ ли я хит Віхола лет же лк бут Ал о мжтр о бо Тел на Ук п жк муж
Авт ож УВА УВІ їх 53 Бк Вів АХОЯ був Бей ма дп сів йо тд
Фе Ж Я бен Доичт у Маки Мою тую щухо Зк Міжває ау А гахш фрує
Еко Аіяз Уві тТух ях Аз тех ТВс тує дар о Буд Тек ТУХ Зі був БВе за Зв 15 ях ти о коти Моме ри й тк ст Ух тям Стою ГЛ Ж іх йомх Мк жопа НЕ АВ дО аз пав овБІій оп СУ мим мам МО Кг ОЗ КЕ их З ЗАЗ
ЖЕ 15
ЕМ ЗУ.
КсУі педе
Бек Дах нта «Жука сегвх ех ха А ши вух хг Кл «апр ІЗ и ик паворкаво сшвоуайаВНо Кеш їх шик У Ех х ик ще ссср везсасозас асзавачени давсазсоеюзчв сао сагеспсасх АК хазсзашнюсо дозаслпосаз сасзосасезо ссссзсвІч поза сКсс со созау 1388 сАшОИОнка матЕшеакаш ско света ше кокК кеша ких М зх пет ужив и е Фе уник ит и я утри Я ву жи лу и и ик ее є ли зосдасчачис завзссчазча опсасат сесізеазвис даспстченцсоя спосте що гугти тур РІЖКИ им ижи СХ ТУТ ЮК туру ЮИ пут КВ кл ут У ери Ку ух отут 1 паста сочац пепсин засл спека сфе Ес БІ суті сторож суки чи стрів іє могут Кф сри В аа зчавссодесес пчосчееосв соми Чопа зас Кох пс Зах с крови пироги Кия пед ща сті сзпассто сбесцасзатоа псавоєзсоп садосчссвас Ффесаавося симво І совки дути духу и Ед сифони Вих о ев ів у я дгриууеи З пчткИичисИсу зсашпосчатв ассощексиМа пече що поши За рити уро фуру жиди п ту ут пу иви я тру бич иежи г дО чЧсІпсастсаво дФісцчасуссх гебасцосх ссбсчасуєцч споспсваса спосо ацчає ХХ и НН ше ув пух ифужім их ту жо и хи ия ли живих ЛІ з2чхсвзазцсо песбисцлиза йззУшенича села кишле ЗК МІ ит ДО те міо ху укр пости Ж зи дитя ит сту тик и КК Мети туту
Чопа зичекаооста запаси спиш спуски вита КЗ. сової доц ді очИКИх (ВСУ ІВ суне вин вих ур тічіиио дг дивт тех пазсвозсас засхвсвсоз зопзчазвиЗшЕ зЗОищекосхеси час кчсаца шевця УЮ сувичічер в іх коди екв Мпа Бади сли дл смід З
Ессе стсавелене СлиЗзпошь пз схе сш че п В За прати ил уч у я жил и ж и фр тт и у чи сем емтимжум ужІМи: ЖІ ув Вору поимиеВ із д щ К І сша зиспвиапиоВ гаесоутав сечо сис кіеоааасях ям песо сала Че заачсввсу паси асиртуаови вхо ша зкастесципв сепасоопсує ФфосвксКсна сзссвОае сЕЧчсоосц ксавіракиів Аа
УСІ мух хо пи ет фугу іч сМУжтеви ІМ и утримує де щік ХЕ Зх Буд са пслало Чесне сао пчсна кає сс ча звичаях КМ дек - скол ге ле же г. вож ше г - с я ау сущоц и і щоВІя г хо мир що УНК уко УК двері Іде прищ ср киев 14; стасзсівиам папа Тло т Фрикнлваттх щемить пре КЕ ач га дор х г м М г є. ЗІ Ту спас сахоа почесно зи сеоаУ сжкопсвайсоо зго зпасаю Саму ши сот к стих хо туть бетгу куди фу ким дихав Клуб хо при щодо хіх шоассазисах ізоссесаис супчик са сстсасасав сстахтасссва авусшалеая кеМ ахкзгслайаза вт закви сачтипавстає зкічзеіпаав сессвкасмр ах зпакках «ІМ фе м КВКоК іно щі обох В мі ух Вих, а Фе иаий і я мі ик фл жи вт ик ну У жлюгх ктІиаазкиов кеш стссзаб скаче «ско ававв завис кати асп : Фосудуєт
Вс МАТ ері хх
БІ ЬОи Ом
ТУЯ, де к чо М клішз ЛЕК ет "У ш ммих дах ЖЖ Ж УВ «ях Ко акзисасвицй поса сазисшнвІ зп и печити Фаза мі т и х З З ї З - ТУ т 3 я чи З зи хи М рем ки нестир ут ж ттииї жене М и и ек и НН серии я их лм ссоешикчиич смола чер ТЕЛ похмуру ся шорт М пучок у ам хтувисуц о ФУ цар УМ гуси рив МУ усе дути сити и т сиза ски Коди чдаак паче Зло отчи сс щайих писодаАсчає БО жі оЗ ци фучевИих 0 гу кове о М па ех ул ку. храми и. щоку пий итум ух р ака хе У зосзаадеві: деаасзсств суссарсвос ззбадецасо зсчісосссто сапоссдчаєо ї4 сити М сту між сфе ж ую поси уки жених и уми у уж пуфи мя зай зваскоицисек дсп еве сірих ссье «фаски боносвосча пес ЗМУ жимі ухумитих уче ем ижу (Іри ие му тхЖ ИЙ с ль пе вузу ву КО шпЕхшчивинчт пом епос Віспа ша ших КМ
ПОМІЖ сруз ких см и гуми и ин т- УкльсхиВ М кум их и утри тех ха са зазакчсвоо асо тлахтошо колес ршщос сома спис ох а жк вк НН и НН и НО Но о НО а Ноя ази палпчЧацсст сФтоссавчя дез сеоинс са ксуЧивВ свое плачевно аю «поачалтаст мошекссЕс сус сшечоа аосссавизоч Вс споеи «шко ку М тек іттуц в ого туУє пресу ки сзеро ев в гру іо жуи позу мури ді Кури В шен псслсвксчваа всозачонкя спла окио часове ворот пощаао 5 чЕцессЗпоал зссослоцесоо зоб ссие бпсошоваасв безе аах сус оУ щей корисна Фромм шал оо ситі сраку Кеел ЗеМИсЗІ Кто Тк ори лу и вищо ази ВИ г и и и Он НО НН и тр щшрІД УКВ БИК ик посвестлмр посада списа сОлиЧи 1
ЕЕ ж и іч ев ву ех ужив «мет хів к й іи ж сцоцув дих тир до их да чес вони ма после баслеацаеак Спаса паси о ие г шоп с сво ва чле шал ит септика Фея ШІ
ЛЕ СУ хх ши кА «1 2585
КЕ АХ «Ж пику хх пи хист ММК хм жи ау хм Ту зх «ях ФМ мх ло г Хі жк Мт о Жошгу Хе а нь сь я На ти сеї міш с їі БЕП ОА ЗВ ОХ Бона вл ва МАВ БІ шах МЕ п - х 4: чц ї 5 ще КБ порту іі ик Ві вжи Тому дж дід та сто ші Ат тую А їхура ЗКо біз 5іч ек дів Ахо Бео йо дів бів ПСуз біз ва зи бі Су ВПа м 5 за чи Кк 0 дугу ЩА лює міх Ні піс раї Вей бах дії бал бі; ДІ пом Тех хз Уа жи са МОВ БА ЖвА КХОЗ шеЖх УА вжи вжи ВА АВ Ме дув пу пп А
ТХ Зк У лих 57: її ех я ЖотУч Щи Ходосу Тех хе х У сту я ЖЖ Мт Хо
Аа АІВ Уві Вкоа Віа КЕ пе АЗК олЛиВО ХО влвовжр ій БУВ АТО АхЗ кд шк ще зи пе Б ох КУ Хі їх Же ву тт: М о хи лихо 1 Мч ж дж їх пе
Ук МАО УА дж п саю блФех БМУу хх хх вл Ку жах БЖ СКМХ «ц вх тех, й
БОКУ ЇХ ще ше жк Жкулчну Ж ока Му 3 ул ох іх т хи Том томи дах. ХО Мі сю «КК х їУк є ту в»ап кжоО Меи Ул ОошлЮ Вів Бле с ж аа іх БЗШчЮ ОБВвлаВа Ваш ща г хлХ хх пий ЗЕ хх да ую тка бак по тлу с-м ще я сах беж ек ьЬ усю дае Уві Аве одіа пе Сув ВІВ Пес Бей дар бів БО ко два їії8е Ахао зви 5 тт
ТО 1 З пе Ам У ож ихю трак Ж ОА фол шу дФЧ ах Мем ль см хім их ліш тик щі Бу Вха КфЕ Зха сем бує мет наша Бер Мал де Уві ух зл За ск
АТХ ач МЖТЕ хімії хх уж мл хм ВА шик Ше Жмі 025 Там АХ с ую лк мя бу
З да АХ хі мер жк сок ЗшЖ М шаф АВ ща см о хМО МІВ ЛЕ зх су ц чай 135 і3Б 140 «а: ін йду Вуту буту їтбмуа їв Ж те ті: ау Вр; офі ав спе вне Він вар Тхо вхо сСуз сів Бе Ажа їі Аза АкКу ТУхК дав Тух ТЕ ча5 хе їх зва
Ме. А М КСЗІ НЕ
Що бі сть хан є кх шенк ТМ їзх Ху щі Чвкж ЩІЯ єк сМЖВ МУ и Ті
ЕВ жКМ У Бкочах сі Ж ше мя щу У ії Бі таж Мі ТБ й Бовах о озУу
ЗО ТІ тк
Та Ту ПММ щої шує 15 Їх ух ук аху ЩО хи тк ії ТЛ: ЗУ кл зем о ХлЖ н АмшеО пХв жів яйЖЕ о шаш СУМ же су сА ШО ЛИВО ЖК Ода
ЩЕ З ЗУ
АК ММК От лома ка ше Го ММ 23 «з їх Мох лик Ж 1 Аме хх ЩА хі їй Аве кб о піш Ще о щЬУ Піо КБе УДО БЖ Уа Аве Хе УМ Ва А їи5 пд у
Фуко Ух Хот тп «жа й жк сш хв тру су бу Іум ах Тк; ет пе Її; хаі ВЕ ТіФ їх «УВА паішЖ Кл Ба ККро мах М су ща; й яд ка ве Во пох Жогіми ща жит у Гог Мк Мних щої Може а Ач ХЕ рен 5 Шен
Ажя Бембі Зап Уда був піз Дт УЗ: ВІ Ку до вій кЗ УЗА БЖ
УТ ТІ А І дя НИ же мання
Же Жак жа Ж І до дю ШЕ том тах дл шу Клуд Ук зва Жив щ
Жхзу фа Беж їз ІВ Мах Жив ЇМ» їй вів ко щук З поае За Уві тих зи зЗиц
Ка ко кІОЯ
Фі к З до їхнуху під й жнив до хх ГУ шарі Док Мом ту тих сехг Ху пах що ту з ще 5 ШЕ др лох хх тим ївк дів Ехо діва Алла вце Маії дво Аза АВ нів БкО со пхо тТух муз м кишй що
Р С: ТЕГ,
Ие «З КУ хід бмесо веи лан ет уУ ух Мо ж йоумчо їси Дожчу Удвхух Ши Сг М ТІЛ гу хх Жпшл ОМА ОКУХ БЖ МН АтЖ КІ ам МБО мХхЗ зам оОоЗеК БК ша мА кл; Зам з меш ють ди міш й сх млі Кі таці ді тії МД хіх Мт чі АІа шпімМ ів 5їва Бе діва де Ме Аза АТ
Зах «уже шо МО рт КУ «ЕМ й пути ад
А М Мах «Вів дик шию а сту хм гчки
КЕ ви пух яд лю 00
СА шо пер КоУ туМтудичх подачу тезу пит ве М сперму дор ги еВ уж и чле сопла осха снмисзос акзисасео пецеспецс пи -щи лі У У шстасхазавче сісзахчсса сна совоаас заЗзосзасцее ажсопнастои повзе Тк зви виш ися боззасссве свлисаззоеза зало семи мх їди им киМ ввеєжшиЗеу послом свопи ща лк ПМК АХ ке ит ФВ у ду хаус ДУТИ ОО УСІЗІЗИАВІК ІЗ иВИВИ ФУТ ЖИЄ их ФІ ТИ ВУТТЄ ДУХ УТ пал шеоетподссвасг стозолпавссв сСсесаачиаа сома сим поса ке суму систе Можу схе Кк сміху уми ж мусу сом жщтохіІУЄВ МИ Ух Мити м уеук В У ЗІ запаху Кекс племен сх ІМуЄто ситі ОСТІ жи сержеуг дур сут дотуи ВО их крик ен и за шик амимц ЦАМТаОКІ сс засос ше соч атсв посол чали А я оте си асан смайли запо вес спалив Я шюешссччов астучавеєт сс ше висот шал маи КЗ песо ахц сошасс спос чести смикає кури Веу ах сист аацу секс ссоосаспос дипчелос почав посох КО еру гриву Іво вуйко ит прог ур бути сумо кг дих
Іди исхиОу ав ло спвталписалО Чала спсатоє шви праву шо сервери серии т Криті р мери ери о го шви сасциА МІРІ джут к УМХ ОНИ реОоХетх еозм а Ох гміни Куц и ту и ери их жу еру ом мов мем мо ФУ жом ему тугі ПІ 5Х аачевзоиКеше Кссаоачаасое посасочссвоа Ббслоасасо зсзачсвое кЕвиасщину тк затасайссау чдебестесчр соупасазвох сасверчасе сосисок сасоокет: ЕВ сгвочазочасз азезсчвоу сзуусоссова засл вою соцосуисоу переве тай змозадатх ссср осбсптссско чбсайсвіне ово своє за ; ; ; зЕз зоасавсчеча засо ссасва сусчазасас сортах чсубоуєис «ака совеое я звЕпбтсасатсоя ссаещикеах фокучичесєс азозаслеаст зочсоаасат сла зо
Кіз оава сзсзсскассс зсзсозас зацікав аспеасовсцча стасоОчао іс пкссааскоє ссвосузса зсозсусвозчо заоч сосазаїеазс доасзсавсоє Зо сесасуевс здкасавоцося ббаактасая шитсосоовс ЗвабасдеяЕ асвломе ї- кіст гацоешчсхех врівавасУх чкоустіаза авзатазста соч 1558 зкчсцзакка стасцсоичис сзагсавсаа вассктзчпав састтасвоу спопаскоєа ЕЕ: тавссстачевя сзополачо ссасустачзе аасвзацаєсє сучадозусс завазедас уза квсадевссв пФівоацезавс бестсоваасва сестра сома оку зочкракоКе їч3о
Мисмесасе зечовтсахє адепяасояа уч тяааз врссцасвео доп 1556 ктів 5 «Щі» зо «кій» ДНЕ «вай» шва веух «Оп» 25 зечосазаза бсссзакчваЕ совок одеес скошссонеї субєкта ства ое що педескчєсшеа лес рмра осо оує пусто бузосееса софсоєсосо їдО депо сися кодледзасви двефртецоссх подочеол песеоувсс попоувецянх 1 поствеайспос зосзасзссеай спосо оси зИидУсерсєтм сало ж авссощевек деозущоскЕ соус кс засоседесу сасесаспоща сзбсвсуке 0
Бістосусчс зосіспасзе зссусссовав Ззксзасоувуа ссчіосаваас сіасусвопау ЗО звпасдевох состав Ооя ослецсспосо зупдочавостат возссадекї ро окоцє яХю стчЧовочуазе зссочкіосе здессзосся суссаоцессо дФозвксвавояо пдхасавокає За всоусаодеца сао соосодозе садасссяса созпасссооу стсообевсо о чссаскссазру аоуведаЗка сусзачесоас ососзазоасує сзодавесосцю сзссочечає що ссссепесоз подвоссоЕ сопеочасряс сксскодісв воасстеза сзепозове в речо езсе асзоулаччоє ссасвзечя ааосасерач сасаасосче спон ТЗ зсзсосассу стайсостак дікссещсУ пефопсавча зощассозе зачофееоя тва г змі вже Ме пік сет уттстИІВ жмюуж ж пити ФК В ик івх и що суди Іов МИ цпаФфасастяЗ попав поаесоюцих сеуливсавзчи ше сввика баян ЗчУ сптрдонаєкІМУ ЦІМОТІурОсВО СО с бедолипачй сосну патини зп спирту Би пвОо седсашоє семи чи ФАК ями . з аа ЗИ єкт я
Ж я ел ЕМ есе чкя х ис як ІП кт МК ек су сти ск
Ех ЕМ БЖ
Х
«з я
Ме: Мах 1 Є М ху Ж Во Жоух дожи тс: М мо ух ху а Мі дене вет ділі Ті Ехо бві їла ах БО меид о виИмМу меш Ммлад жау дУ Ох ККО т Кк 38 ях к- -х У. о-я. с Яку би ут ті х п Вб ху І банош су их ї5 де ії дае кг ті ки аа : зищо 01533 Мк З ІІ гм рве
Аве о ели ах Вів вгкч и ака АзЗв вів с У М УК їн бу Се вве зЗйи туї люту км Я КЗ
Можею ку ту Мал сті ВТ Фа Ам тю Ка сту жор о З Ха к: ахЗ щі тв Зм Ні ЗіУу Ві КО дій пі їм) їм дід йо Ма БУВ хх ах ех - мох хх ще о 5 1 з хг уч що пах ща бота Же бу щу: піх уУлемо Ко щомуж
Аів віз У вх Ів пев о вде йшов о їмщ їж вЕродвОо дія Ббуз йхя БЕ кол це ша
М «Я ту щж ах вому хг Ха кни ТУ ху іх т би спужю ІМ АТ я нн НКУ ох айв Аїа бах чаї їі ЕКЗ о сІУ йех бі ТУух а АІіА ВкоО Ку Бхо ів кож «бу чк т
Б То ТТ БИ до В тах: Мк ФРІ їз бух 1» бю: дн зи та дл С Фен кох
Зв вхо їв Тух БІ Аїа ВБеосіу без дво вв о Аза Аза віа ко Ха вв за 25 бах ві хх хів Вс бчм іш ким тем: дам й до ду ту бро ту хг кт
За-щиа їв за оміа Вле СсСуУув Бі для без ази о дід ЕІ Був ЗУ Уві дКш і5 15 пу ко хі гоже яю лу т и - ге ях паю зі чих
ІЗ Кох хім глищ 5 г щі ТІЛ х дек шле Мк хи тях А їх пім жВих ові шЖВ Ол К ОО УУХ лм УМ МУх Мб ків З: Зв Уа Ка УВА АХ 31 з 155
Мо їі сх хв В у т юю 05 юку зд бін бум о Хот Фе Тату: Товузт ОК ія хв вий У ша ме віз ТтпХ Бех Ту Ці У зшжм шу МЕ мам ше ОлЛІВ 4 я Ук чай ло ї55 Я
Федя КИ хі ша бух Жуки сб Лі ту ре тій шу помя тут ше їм .
Зах не Ай АВ о ТЕв БКо Су бів Рбе Аа 118 Аза оЗка ТУух йвпотмх ххх лк чи м ях їх Мя їво сія ра і Же я Ми жид ту я ку тк сн УК мм мех слух їж сій бай ТьУ Уеі у ех Бек Зі УВУ ли Уа Ні ТБ ве» Зах
Уж дже ще Е хе за хр
АТЗ Мо АОТЬ оЬЯ туУїаї садку ічнє хг тім тю ла Ас пу йти о ру її лоша Кт: шіе КМ Бей ТЕЖ ах ев шал ера вач шив УВА щі МОХ МЕМ ха хм Ки, жо ше Й ее Ин но ни о А В НН НК тажх о у ж я тві йевй до жо Вів віз Біт бів Рне УЗі Кк Уві АвроБхе Мак ка ще А зт
АТО ки М тп Слух Шешо Т.М ча вх тла ху х ск» Фі ие ДІ Сх бр УУ Же зім зЗекх Кпе сво Уа. Ап Хі ау КЗо МАО ОСМКУ СХ ВЕ АіаА ТЕ ХМ ОХК вв три Еш Ула шов ше хх Я з пахи тоди 4 г ї У с чех бою І чно уч У НІ діжки хущ
Бі вка ве Бі два Уві вуз НВ ВК УВУ Ако Сув Ууах Ака Вко бі ке туту -хк чай я и «55 ве
Туя ніж тло Мк тк АЛ я ку ХК Жодтю о Жощитя йЗ Фу Вол ду» оку жу хз дЕш 1 Бех їі Віа Ме Бе без їз Азія вко БУ Аза Азв да
АК зт з кое ге кХИТЬ з-ї хо Ж дим 1 З Чон хм Ох б ря Мі шо ну Мних щу Міугу чво шах АкВ бю» За Вів ша ві Зв ІВ бі Бі Ко лу АХ ОТУХ зо я вте тоаїки тю З ро Ву пу Му Ма Хе тм ож Хом о чн ее Еко ББпе Аво Ту дзр АЮ Ту АХЗ АХ їсма бу ва пеб тик ожіу ак Зах за я кА шлю
Ух ле КЗ я 134 хз дю уХ бач Ми віх Ах спі Ак що Ух їх Атїа їв Ата Зоу Мех віа АКА ву ду «ик «Ам жу ші 1534 штук, гіч
М Вк
ТЛО. ст сл е «вай бна пазу лук «з: суха сення вигинів сивих смт их Криві КВК ша ваше цеяй БичЧоНиІН У - сСшала че в кеша пси пп. екечса еще та те зсибикстав совсмахвта сясбсзесаб сайаоїзсава зва вкЕвЗсовеакУ ВО уекому фу цу о дощ ців сви уюуєм возів ох Вод КВ цу доц ох ут и ціх кову. заа списках завивка с ден ксавска хаКАХУеЦКУ ЗаЧОКЮВ АКТУ ЗМУ зх чшпоаснс паатлочслає соглчасироа чесаавноос запллосвств ассщеасхва. «ЧУ суч хом руч ужитих их прибих ситу т й пкт жу ких зріє ел чсвасросез воззасчасуа зуасазоссоАє дама ааспстита Фест М ухгхев и ке ори ви жди тив (дев Кадр ки ка зп зак па ваша чис вто папетов щи пох фу З чи пр чо ал касаксосос ссзодссода ссаоввссзоаа бсостоцесо бокс с сукодеВсс зи хукручу ту У жи С дожив уз иких фам в с ходу КАВИ хурми ру ія он НН не з зассеиа и пече спо шишка шешАОТОЦИМ Ся порве ша зи річки ф и фікуси их Ку очок ее учи хи оче во дай зспассчсас возссвочеє осбФасосства баесодеавик всзчесокетє Вова очта ай вижссаноачає подана спиазчпачс часу сири переко М зазищнижцие сзоссдвогу звису сає зе апотасеччс пос о свсизсвоса зссбосзашов полеаацовху есеї песо солевну ТЕК пшосчоссщии «дос ссзив зосеаико сс сим осоки 7 апринисиеч спас а супсасзося зусевіхл сао а зшкеанаа ай псчоусир рес пашіссисвиЯ есе чеш Касова чо оя ВО мресясоча есзЕзчасласх заплоуааЗстоє Хаспочоасах щоссоевасс коаеосвко ЗБ стіпозЗсхахчо собезсасс сопвоїавоЗе спос ссЗзкестлов спаси тпза зпазшасзсесв за ксвозсв офис базсїсасса керсосссах ссср чато їоно
Ес сдисв ВоцІбудсца созсскаоат їсте саов Всзочезаа сеадечсуа ії158 стос с брови чаз стссзсло лосини пече зокосдаюецє ТЕО сно зопзазсає содоснвеа сспзачфиіза сззасавода засос ао їв сопозЗосє асахзоасас савссссост звосссостоз сссвосооЗо висох і5е шфесавскчвиа ами ле п«сваисавзоз вассезсско о пасів ою колВкос ве їзВ ззозоствзоса засво: сзвівзеом «свзааовза вассаазшиух коса іч зкІсозсозао сзаазаосаве ссзчайкко сиксвзамтамх пеакоассвих свеКаєкаса іпов
Мбаводекад сови кса зсспсвисає асвасоица зи зоссш чеше 1555 заспоащшічу акечЕзекос сісссцсвоса зайстнівсш безоптасво век РЕЇА «Ж «Вії 1512 «вій» ДЕЖ «21їх Же пух «епох 5 здам сЕЗсудецис заинчавксо Зкспасокчоа ссавочссста зесзовоєаа СЕН чеззсадоеу садскопссав зааавоав пасвнвнато апоацивача зочмескао 129 зчзасхзствоч спокаагова зфзоуавоч сассічхсв асяпоИичеви алея ІЖ2 зосовсзоУ «спосо всс сосчиоссово «соя босесаеиК сосок ти Я
Зсзоассастиса зе наВжи свящ ссоисе Збсщвосаами Сер саке ЗО сзсесвЗоИса сеоосшаео ЗЗссВвіЧекос часзсосаеУк зросту сечехксхк ка «ази а висасончщи соосФацозає зизацочця завис сарізасат ЕН счсесЕссжт вес зопссоачсза чис довоя бок сеа соончКевоу во меми ж ут оуиУ пУахиеу дети Ж и мети г отим кож ри ти В у и стуку и щи птоз чсзоеМ астма етан Опов Зою СУКИ 5 рн и НН В В А Ко п шжсваци бопостпесвв дес емнКі депо сиреоаскоюцєми сист АВ ме екю меси хи жи их іі щу и ухуху петжуутиМ сжІхе ВІЗИТИ мк Куди у І черпав св соч й х спасає чле есе спра чкСоАСОСЬУ ХМ пн анна а НН и ВА зисалтачаню спос л диссжкОччх весен сп с Пп ФЕМ а зам : - . п . сеомох уУежкмІєу ую вик угод гу дир ФУ ач зе у щур рр юю их у о и ТК шток сич сшив свхчасаао здрочавоска воску ше ТК ей іти У ихик их уки сміху му узи сухі которое У Мі иуиВ ВО им виє уд у ку а сапсвсаох сололасасс соски иЗ дала оаикивІМее пф 35 но дих м ері ІК в і жде п Т и гоже с мя щі песто азпчоссолоса зпристахнивс паФошИсИиУХ псом кс ПЗВ Ом учити ук и ія си кригу Віру пу В духу Б ка и сет их ТУ тпоччасов козу соссаз ссІісосзас сасссвовоча хстамева суч зем р и НН НИ В ТА та звозисостє хасаслосспох сппвлЗгбоваи уесасщиЗал соподиаси зчсеоти АМАМ ; с . пк я кмдхе ща сумок бот «пах дк уся ее пи и НН в В пат косвсозасе бос ча попашкеакк зедестоеиоо сини поема МО пи нн и в Ви ЧИ А чай чисеашивчсти сопла сахозчасвосс засто а петесош сСпасобкнов Ам дерти ІІ У Же усу скаже рудих ств ово ків хо ут іа кішию ЮК ев онуки лих келиха Вис реа жнив часи КВУ ВО мюОсше перуки А«ШУ ху що тео З практ исх ас я «іо пи кк: «Ккаї ЯМІ слух хх ту «ші Бл ет. «уко ша хе йщев мдУуЗ «НЕ 87 хх жу тож кі хіх Вік бух МА Аа ло щі дат їди Аж кл.
Меї вес ба Щі Мія Аз БЕ Меї Вів 16 Маї дв щое і іа Ап дів 1 х 15 185 й юю кока 1 і хіх: ві. та щі ту хіт тах їх удух іі, шу Сх піп ої Бій зів Зі ів дав діва вів вав їж пув ввио МАЮ су хх зЗщ зл шк кг НК мах я: тт, и хх со Фо су му жк т ж МІ окт У Ус я кіз сти; бів БІБ ОбфЧа беж Хто тУукК да ТУуюК С У Вів їядо Мем о Був Ку ї5 ЧИ 45 мя дж ва Коха дм ву ж сте Тр мм док бах ну ж долую птах чаї А З нів Цижбй меж Адже о пех У уж АФ УВК АК ЯМА КІ АЮ ах ч ГУК їй Ще шт
ВИ ка их
МЕ ру Се щ Мет їх сте А совух Ух Хе слідує мкм лю а Ей Бе діа ше ат де вже У Зах во віз УВА щех ек де ди "згх тре дл
Ко КУ т Ж по Фо лу ТЗ же МА Уа то се хх т хв умі А пк чі від БА ШЕХ жів АХЦ УВА су ме КО жах УВА Авт оте іа і У кох зх тю жо З шо
Тк Мк Ха Ук у її пооху хі й А їм реє Ж жух: 0 жи Зк АБ ОТГгХо УЗ зуп А ла май жах де пів хи МБО зв Ома ут зи зх чи дМх МАМ
Зоо кн и Уреу їх МК Ук вл но АТ Я шк її а зу ЕКО гріх ів с ув яса хи ТУ пі т ЕІ БВ Бал ода У ЗКУ нів сп ж Ел зу 115 МО яжеК чи х 12КБУЗХ ую ТА кг ду Ту Тука ЗУ Можна віхи ЗМ а
Яек йвв Уві Вех Зі Бі Мем їз Аве Мві ів Бі Акца вва Бве 5
Зх з ЗАЙ ло ККЗ Мах тем Ми Ти пів ті Мох МІ хто ік Абу бух Де хау щі ут Кі ча му ОХ ми лів са Б ЗА ОМ ПАБ оОМЕл оЖХ вів Би тах мушлі тд цій я Зх 145 і ДЯ ви
Усі хек Ск Хижак ух ЖІ щоху ті ох ххх б Ще ДА т то же КК АУЖ ах п мех гл вай ЗА овАа мує а пюроялв Ух зи їх Сл кк; дк дам: Бе» БУЄ Тло то что уткж МІ ях Киї Ту в ЩІ: т си АКА ЛЕК ОХ Ве іх ї; УЗ АН М 15 Ж мом що ще о БАВ олк У щА ій ак: «ти іч5 5 Ви
Ж окіх ТУ, хз Му ки й ТУ м жа М пох ух Ко Ха хм муж хІХ У пул теку й: тт й т їх Не я іх ж щі ВІ вх
Мей БЕ ТУЮ ТЕрБ о ВЕЗ Бій щіп Бус із яв цем АРКУ ав Уві 8із ТВХ
У пе ВА туту д.
НА «ВО 25 оучи аж М о ту ує ЩО У о Ж шу мом АФ їх пл мон з ати Ах вка тТук іа тпх Ав ех БУ Ал бу ЖБе мех ПТ) Уві Мет 53м АЇа 538 І за о ау о М
ЩО том і УЗ шо хіх зх т бач пі й Ха» 35 та, «ж ут ій бен хів Аіз бе лу Ті во Тву Аіа Зі щі Ущі еза бБіУ БІ ту ц альхш Зх сут ду ми ше ох там й і Шар фі тлу ох же Фа ую ІА кашу У ку ж Ох іа Аіа іа Зеж йве Хакс нів ме мес Ту Узі Бех а о кух жкхо лав зах сусут кот,
Тула ЇХУутех Хі Із Ж МУ Км 1 Мих їх ух Жан ЩІ шо Сук ж бхвж
Сув Бо сів БЖ Зім Без ТБ о бео щІі1Уу Мек о РБжо Бех Ні пек Азюеотух жяН ве зла
Зх фіг ФМ сію міх ДЯ ба і хау Мі шо Мало йліу ска тим і а
ЗУ їево ба твх ске Узі цей сій дев нів во сів зі Бем о Б3ібй Зв3 я зи тва
КЕ ММ че
Момає лях Маує ТМ У т Ж Уа сп Ми хе Шут. Хо Уже гам жук мили
Мат ні де їжа АХ ТХв Бе охиХх хе В ЖЖ дав ж ОА ОК ОК Ве чай мещо птн ас Ех виз їв РАВА джу хм гу мож кул т их іх ки Ураую шум Мох в пою Мах
УФ Мах дБИ УВІ щі Авройлв ба ЗАМ Жке Жук ек лап осСуу ОКУ ТУЄ зУрц т лк зам
М до ЗАЗ ша тор КЕ тя ста Б дон сту мік ду ве ут см му їх дк тех зуй Бе діа бев ІВ ха Уа Ні Увал вва ех ТВ Ах Бго ке діє
Ух а за
УЖ ЗМ ЗИ дош мо до хмко ДУро 131 мо жиє Ж гозі жу МУ х га дж из ті кр шу; ше Чаї Аз о жекЕ Ба нів Бах БеМмобхе йде ФА йо Уа бе БАХ Еко
Заг ха зап ї4а 345 Зк тру ех 0 ферм жи бу Можу я ді іх лм й дуг бу сМхую Ме
Кіз Втоа піц іє Уві вза ВЗ Бі» вів хі да КІ Ак ха Тух Мах 315 35 Її щока ти Д БУ М УМерих фл Хі М х «г - Хо и Жири Ах Мов тю
Зав п а кЕпе вій Зп жЖІЖФ СВБ АВ КМХ ЗЖМ сУ а зак да АВЕ са а М Зо тоже в би мує КУ х ке Чім сою и о Тк Тк ше Що щі лі з жи им за опувВ их й бен Зі йевх ха ау мм КиМУ йіз із Віа ЕК зах и БУ хе;
У зай МІ І йпем опиз гай жи щу ОБО
ТУ п пох «Ах я ша зад
КЕ КК ЗА ях п хи АЕЕ хх їх «лій йна ау «3005 ЗЕ фежечен рути лю ие В диких Канн дя УТ Кути я фе ма и Ме вив у В дих Ко мтспсеасхтвиа шосасиаці за исово висо перо касво ше й с ж Кий п ж нуту Би ий ун ут В жу буквиці чи Ву Є їх -исЕсескх сш пшшие сс плИиш сю ема зосаиек ЗМ
Хом кіІж в ми димок Оу я но Ком муж махи мк фу уж кю ге Ком ох Фожом кути у зх
ХхазкасЕчсх Зоссаплочес сах ссрс піч Фасовка ис АЮ сифон оря і хо угор и роя В умо о КО гурту ер кт дует рих зд соска сччииа всраассивах ссосвзаоссчен чес зиссвоаси сао аю туаідю умти дкну лу их но пу хе жу КУ ситах фу кри ух тьми ножу их зЗптасшсксма ам сши уста ско пес ех У УК зМи уми м ехиж и Мах ситу ий ери Ух хіх су чим скік ху мух ев чуми схов и де
ОК пихи аа искму Ущ Та шкі шоп к ші З стирух утім Ж хори Можете хо схов ктоуутрими су ісрииих иир их и рих м й сасоеікоасест зро засс копососоє Фувоссоцог ссоусоаосо сапсазспо иа криву тиви КВ гових джеми КИЕВ и то ок кто зи диссоосцсоо спасе жк ах собомнсовше сов косе шу пи у ровів уві ту пит діти со и жи греч Іов снеки пух чай шопшщшрос соня чес сстос своесатшсл пис слизова дО те філе В іч фретреи се вих КМ Ого щі фу етичні яки ех Бр спи ша х ин щепи є СЕН Є їх зе Чопик щи ше Оп У повин в ту ДОВІВ уж ІІ т жу их у СМуктуУєЄхеиюмтим и. зу иА жах дви шк шт ст дати аМЯе дупло паса пхдоподеОо попе аю
КИТ епшк Вами «Ми чи сезичаснек восашосгтєх зви аве їх
УжІ хе ух м мі оух ф тифу Ми О гу чсуТуеВиМ п ге ож жовиви ЖК вм ми У зач спалено соч поса опи зиих ЗК ЩО аж п ож Ук А и я Ім мІмИ м ви уже чи паху вита ем ху ами Ам жим рописапоссамр алича спооссоепза зосдвоасоа «нава шк ди ї грат при Вид вх. тА усу З Я т КЕ сут ириХТ Боже ут ЕВ чим часчасцпасс чоивзоесакНнс вес часта сАкрУууаХи су ццицекх Ух чіпоччос абсцодсвесва пезасссоче сиБсоюптсвко КоОсозпасао вазах 5 пципсчачеу селен фото ФфузистЗича зала сет захо чассзссктш зкочесаасо сФопопаст: стЕпсовиЗзкс спосо Ффосракієхв заз сецзсакчеас сазосозшеса сочочазсоя пдчасепсуво дазвЕскооо сопопсівое 11435 пиксзцосс спсдисусасз ссеваочеаче зосслоссце Чесно спосо со їж дФоессммхоосх свосцсоосю псесекчзсс сувзтесвя щчаочесоесчся здав осх ве пазстсталожох зосксодизо бМозачасЗих счосепофсе спасе вописавоща 1535 завозу с зопасоЧиоя сосзгсазсла зосезсвоста зок ски сзівпоса ва чо зесузосос зва скчеє зсідасзато зе сасвех асзоззовУуа еасмаская 3445 завів зве зсааав дсвасссоа спис оааВ соус овио дВвоссеВКе 155 блочні о асасака оче зсзсвоочсшос осли спасе зок телех і чеках псовпославас саеешспЗисо содселсосм сором суч ЇВ чив асааЄ КзапіечівЗ базальна свзозозаавй зссве аз сова 1585 адвифасю лозлопааса аозвезааска вопавзакся зпспасдас аспапсотоаа іт пса Как авкс бсбадисах птасачавас снемосиче сссессавї ісп смак аскс чіспосасвь асозвгслкта чекав осах павастаашои зоаваЕогсх ій акЕ іі ке йо «шії1» 1148 «ії МиК «діл» ее дує
Х
«КН» З вкзаспчавчо соуссосвост паасвавоваає ссдозсвос сачаствоса пасе ви «чив ссз апомроасаю сових сопсозвозасли алсосхуох дос: ї58 шозосюацос позасоссЯЕ сс засссмино ссосоцолссо засос оЯ ІВ косзщеносзо суродов соосслосова савізоадао сезсбилЕОсх сепоуюосеех тав ласка зоцдасосчо сососзсасоя зеузвосода педосасиви чес я псоуцосчвов всвазчакце сускмцує Фадоссаив воосееоосу стосу Іо зхескскві посбоскоск сеіссваазкос зи заоксся Фу ивасви шок ЯК чишхвсоююи: Чоечсшчасих сива: сша сссвавоо зоУчсзвооза пивсВвокачо 85 типчак кзасзааоза декосвовай песалшоасося сспопесцоа свазовасо З пачскеаптсс гсасоцчечес зп: часззиасае стацечесту сзацчикна ВУ паж ла км и Ух ситу. ок у и ри лу жваві у их ву, ик Мер у в рим ери вини ге А сідла ходч ссзвавгчах чассоаоснис асоцеассеса воски ецутини вки пон нн в НН и І ні НА тах часссоалсочи чезсчсеао спекла сесассовсх серп селех милує Тех оре ргхе о Битечюттур КК Ерсе ви Ве утуед сеенху пеуву су БК ч7Ей асісачазюес козодесосс чсізосадекс ЕпоОсдеоОНсою посту зач о с рун КН НН пр зер рем с ет миорртия заз зцечЧссзсссму бесодешечс сис осочос засчкоиден аспек сосося себя а авесаслецух песапеацсе чозпсалоеце зсспеакезчеяа дспситаоуасих спзиачиВта я зортзсКейес абпсоссооу ссоссосся сасчсовази чере спро ее ВЕ вичссуессв чссоачссос сасчвосою сис: Фпсацка піцу 1123 сапсадлвеаса петтпасовс сип пос Есдада чив севми пцрисомиНоЄ пит тпРспаДспвентр соусаспсає сш чпочписализ сСощеоусеи дрон пам тихих руху пусччотту ці уту. ноу тир ут оферти щу дугу і Я крови Зх щшипчассцо зочасоаоча спайс з исас вусацсеа чхає Ач фев ки в хм у ах ще пахаз ЗАЖЕ дит ж пох
КО АКА Кк мн, Зх «11 ЛЯХ ккіжА БИК вели ххх ях «ША паа цу
І зи «Ва» у дм тю фу. Ву: бах сх Мох Ток ут Куих Чер Ж ост Ам пк
Мех шко ТИХ руб Бех Нія їі дви вия Ав вхо вп бмХ Ме аз О лов 1 5 19 15 фею З я ку т му ж Ра; бук міх тужити пуф Том: й ху
ЕН А їв дів ак с ах й Уа: ЕХО ма мах паз са АХ ОжКИ А т Мам пах 28 Ко ж хх ї Шкитея а и сну їх лу Ткусиу т лу тех брмку у ти ТА зво Ні Ехо» УЩі Уві Анрі піч Аза Бхо біт Без АЮ ів Уві ро сжожх кт що
І г 35
Ех бал ща ох т: ВОЗ худ ж Зв остее; тої бек 1 51 щ 1: таї Уві Авв бен шіу Віз вія баб Бус діЗз Ржо дів Вр Аіа Аз Віа ск -к -х 5 си дв хе шли т. иа - Чому й Іхкута ох Ж ин іх щі ча вія Ах із Азв бів ба Кв оз Віа Же гей Бе отїнт Зі БВ
А чй тре аг ща г і ЗО пл хх ан ду п. х сх тож ої дою, же ж жі М они С що х пі Маї хо дів дв Бей Бей дів дка хаї щів зв Ах бзе пів вк й зо Зх й Моя. ШТ бфовую дати ох Хом хо Жов ще їх бує х хх ог А хе,
Меї бе бі їжю БІБ; йіз дар ав Буд беї доп віз Уві Бк бпіу Ехо їн 55 її гхтхх жме КЛ до ум с ук тру М сао Бут бує ТІ те За би. Йеі йих
МАУ зи біз су бу КЕ ЗА БЖК КХО БІЛ о Зе ОшЕ ЗЕ Еш БІіМЕ де
ТЕ ч НАНУ їх
НІ АкТУ Мах тки сах Му бум дю УЛ ли Мк Сижує во імк ху Зм аж о ах йому
Му ув МЕ ОТЕ МоаЖ ХМ Оу УЧ АХ ЕБе йдевху РБуз дів йпеї їм слух З з Ох тай 138 дах х 43
Мсру А шу уч т х Мусмо Ж ву їТовулт Му ХУжеу Ж гм Щука нує бух бруду ів вав зец пт ви Ми жХО КхОЗ дув піз ЗА ле ЗЕ ХУ ЖИпХ о БеХ так 1347 Вп 1ка
А Мах ЩоКія Ах
ТК: їх дах хг як ТЗ лк Зої Зж4сї ТІм Мі ж Му г Ж тему МІХ виг СУ Бар о Майї Меї піз пів пе бло тв пла ше ЗК ВА ММВи мА зиц хе хи ї5Е ВН ТУ
Зх Ж Хоми Жохіх ТА Том: Мах 8 дум; Міую Ух до Хм тя; їм пи йшу ТМ
Ва чу мем) Бей см зей ве мем Ме Ал ше оку фе яп ЗУБ М 4 зх зіак ко АТХ уми
Те а нь я НЕ ЧИ КЗ хх пи хто т ща су теж Ма ск са Аз ет вів Уа бів діа Зі дЕ ЧОМ АВ із пів твІ Меї те тк туп чек їа5 ОО ЛО
Ди ее ся 4 вч Ху у Фбхіж и Поичиж тЯ Щек Ток Щит Ту хх щи
АтТа ТтТВаг Мат іш бву дзпотх Ге т Х Бк Бх шок кКОо АТБ КХхО вх Ак, хай дл зу
ША й «М
Ж доста сх ха гі хі міш ЖнНЕк цу йорж щі Ви Зва ть Шви. Ми
Мав зем му мащВ Аж жхя МАЖ ОВ АВ бек шу КУрж КІИВ ОХ Бжовва а т ск тк Б «Я шу Що ЕТЬ шк
ОКО ла Міхно тім їй те Фо жЖавує ПУТ тТовхух вух ще Мак щи Ту Мои
Мекосів йех їхми Май пт м у ик біб без ББо Ах шпоНашВ вл кис мех зай чий зак «З Ве КАЛІ
ТУ жу ся ХЕ. 3 Ох їЕУ Жити То ж щ Кожна ЇУї 2 хіх Те 12531 1257 До ха
Зкщ Ттхв Уві дів Уві ЕКЗ діа Хі Бк Бі ді Ба Уві Уві Дай Уві ка Зк «та
ШК хо. Куй. шо ж кю жо Мк іх хіх ХХ сг ж с Ки Поу Ск Щі єс: У Ух мо їхА| МБО МЕМ ТЕ Нів та без ЗлАх Ажи пам АФ Бе біє йох бві т ЖХ рек зок кльх каз КО «я
Мою ому ТЕ ж ххх Хосе Можна 2. Уж. що фо ГЛ «ав, у БК Тл хх ж нь вч вій ха Заї ВВЕ дич йо зи ве овжиМ ке сш Ю веи о шАУ ук -ай чт хи з У Зо
ТУрег бот у ухун щи хе мі окт мух бужум Мсчиу о можн М хм
Ех Тихі іх те тк пе Я п с ШЕ» ку г се 2713
Бе їз сі У хо БжОо вЖОо база Лі Шта 83 йав вхо іш Аж п оба че чи пак шо те ХК, ух 3 Х, МВ
Кх ю аа У їжа їх їм (трах й щу рвм Мі тик т і ду ми та бік 3
УВА ВЕ гхо сі Ажу Для Бк вів ЖУК Ах ів Ма бах ТЕЖ о БКко зів и ЗМ ЗІ су Мам ст 3; А ря т тт ВОЮ о жур бі ум тат кош ВУ тм кУх ех злу Ха: АЕЛ ОВ БУВ діа ВП тВвЕ тих зЗіУ із Беж Аза Бей
150 за У таж АК їли щу ті хіх діти дів дк 7 щі) ле ли ве ТТ дя мУв омеї Увх дів ай вій пі да Біа йзр БемВ Вар оавр Зв ому АЮ зр дю лиш тя ця касу єди п дже хж хан ик сю хів вів ві зві Ні Бій Бів іб жав БО Уві а3 Зеж ЗЕ пк б Зам
ЗК іо яю «іх З ятужа тах ках мот ТУ ре б пк я, че
ЖОМУ кж Ну хх же У
Е смоианВМ Щ ф ом фон я, кум ж очи у В Ух Я серии ут М УКВ си вихо тку ує дих ща часокоссвЕ сзацтакс птах ступросслвоаа ЧЕсоКрохьав дпошсфриниу Би пуск НЯ хе МК АК и КиМУ м ми МИХ, кл МВ ко ня МК А КК АКТИ Як пи лита й М Ми ух ва: Ах дХ Ех су чис Ж Бе де в пу жк З ІЗ тах ХО с хе «с : в док дкосчруву сем рт р еити слеутту ми мех тт гово пору мреричиию три иях 14й тсестосааки позу пдожфрІсчмт: содазастеоя спа оси заоч ааку Ви дик хи иу і и уж турку и фу офи и ур мож гу ти сит т «дух ще Кі по зусастосчс затЗзчалосо зогоадепусоа вот оЗешсес часа аоас асист ЛО уче жири и ру ие и вер усева ківі (живих Ми овК У СО мі ин. зиа пакчустоочв спав псзисовено чЧессшоасеза зок чик МО с В и стиму тури зка печмлЕссччсся сечо счапвачо спек спа ес и фермер сни тю гріти ря ирчтввии учити Вр дод сусксовто: сссуцетссї песавоуєсє боодоозооо соуосоочча звососвсуо Іо крани учи в и ВН шт чезвсстаеа сеча соппоЧчоас спосо паазсстата бо сеааце я сеЕ ВАН ММ сере демЕрКИ дихає иа лим ІБ УВа ЗК В От, ЯКА
ЗчиавсеишкК сич вом НУЄ хмі сис меси ях чесасцасья себто сустасутоаз сдозосажчов счуасаяваа відає о ЕеНи
Кетасочсаоч длепесесчає спосо сВ мови соо шолевосеас чок е тю сшасличасиа часа ня зачати ачасссчиво спопмчаалуац пависсвассх «М кчкчЕссосв зсспозацсе дисеассаеН засос та СасоаЗжспо зале гевиосх ІМ уче кам мк грози сф тв Ву все строфи Ух ит зах списа нлає Зсадцазцюєсс злоссво сполох псчесчсоо шоссе аю метки НИ фр хрустку кидав из вух ет их пі паца дчоспричс ссср с сеанс ФфипоесЧай са Іова ших
Фу тещу піхви ує вих доро тте и ів пихи уусут слу ЖІМмчйЕ водутих суши руси и п ссксавсчав сус сподеашесока кесваомеиум «с ї шросазеак соач«аицу ше часа кс сок кис сесслувх свечзвоюа Фото с Мах сш Ки и и шукати ки у живи ія ки дети Си г ситу т-у ужити метил ик ми зл пчссУсЕст Чек сстаочч зосчавичосо кекс с Коха п очка щи татам зовсзаФфае осо чсвичоа діЗзачисачсе хороучачаиа спеки їла зач вмеасзя сівачаасва пушок ссдесахшви севаоюоа виб ини ВаМу зежуУкічииу км кох сущим уи кити фото осли Ек чспдзла списана зай алисзавеит згавастсаз вазвспадхкою краде се бсччлнНнв плошуасавиаа Мем вл ки моя ев т у п хек лив кім ру Ох зу се о ни Зх стае Іза шМХ таептсх чат та че ззаМхшких хви тзазаа Ж саке у В в здсх с ук доб мок од ж кю хуя лу вро УМ ому му жо оф М вух их 3 ог зсокоУзсакас котазваказчас авхзеаовис бвеваасвиая зичу есасих або вас і 555 вості вдмг кава иак вка взаскниванвоз айккгзаввча шків чмах хи хсКпаесвамоУ иа вуІчшмумиц екс пу ох МКК шу соль окя Ох «шах ла шт чі
ЕК М.А «вій» ДНЕ «АЖ хва шву шує: УЗ их ХЕ сф діти сере оф р ом ритм й и ик сею тв е фрими в Баутічерури йо у у чо дя чкцивУсичк сзксщссчс воассксчаняа сстасассу шко похо. Ох ек глфт нив ввю кис ифу оті ужити св милу ми мууч куки митр м сег ме М их зегу сисФфацостс сосна Чесставовса пиподчезсосс сирими сеайа сера їм сежту котики снами и окериих сити аж В МИ ве п ареуви руе и и пет бори 5 пити подиЗзпшки сій тлЗзпза випа ХІМ ОрТИ КІ СМ хо
Є оХ их Кф У КК ужив пох уки их дугу ожтуті са Во жук жи их пл пасЧчичасєе св олаос шепсассоса сс с че иКоє соте це М
Ріки ий ки ихучуткх ти сгхтте рі Иик диву др пешхо ща гуми шу ву сти ЕК шасшькую шок пОЖЕИМеИЧИМКМ рима Як Ж парша СКК Сх КУ зму
Ше чи удІжи Ви темі: ач жи туєт У іо (пре иуучеии у ту із иМиех вих пф уки сяг сеппКонско січаизачс спсошеосаа сасосшсиссм воушацииєн ха Ввисо БО пан и В НІЧНА ДОЗІ патцесазчи сеспесекчче воессосаеес посавеаЧекоеа сикччеисща каси ЕМ фони уча жиму уко. а а и УгУ ЦІМ ІУЖІВМК Ву ехуфу ут уЙиУЮ В М уже уж Ум уч пи у дя вкпсцочиса ссвопЧссоу спав; песо фаски песо цх зао пасоксосос опо соаесчЕ песо лави сбвозасацвно вЗзабзаче пакт щи в кумі ву лугом умах ум умами М и удо УСІХ УЗоВ ВВ зриви ус ут СУ зччскзсим засос казка дечеох зр сксасео ис лопслалогох шо и нн в НК и ни А ду печене чувоесевоа совопасскут воесеоаств сосвсстеве деку БИ п и пожовкле мису ре чааспсззапи зоечписакожа ппеоаасот пасзосзжоє са щекаишах падала ТМ здо ум ую, ет тут ут мими ту ЖЖ У тиВ ІЖ и рими з и ув УІЖИ г ох и тк имчук сві ЗІ зкчсазапнис ссричссечО вес песню пса зи цаих МО
СЕ уз еухіжтвехих МУ сузсрихІхохуВ схо Куди М суку ж умер пи жом уми м (бе ет (що п
ЧЕ чи соло си зп пасеоис вкзчуте посечесио опари ТО поможи ра соч тини Ом іжих шихиюух фур соя ж узи ких пою путем У В тусхІх засицзшти ссср єси кзсссасшшеп спспеисКниа Чисто певна шАМУ
Досжти ууочии м ому фру чек ото мі тв су птоих Міо пору ут пи ес Ії ее ообсг ссо чипвач чвзоспциашам пече шипи ЕІ сф греч ртрничиниє греблю ух же еф ужучирив сту куди гі дике годую оте Др тла стастовссті зпавпоаазує са тсопце есе заспачалса сзсоцааото 12028 лугу отри ВК М ож ирузиИ ретрИ т увести вет о ри руєтЯ рус усуКіуоке зпий чзайсзсваох сосхусочусає зулсозсУто шесссспеянма сумедсечих усе ах МУ попе вс позстстю стлуьам сусла жен пив доц хх ,5 цавацлазцаас заз дцаве Ффопстииас воша АВА лк їх сюту же АМА У
Моя НЕ
МА ЧЕ юр ет зд кажи 0 вжЖеа ВУХ
С ль кос да ж ти Ж со у ху Хуг ВЗА ун М ки щу я й ох у
Же тії ЩшкКк о бе пех йде Зв Ді ек ТВ Бу Аза Бій даа сах са Ух і В: 10 тк і З хе Кя том хи В ше ех аю ди АЛ 1. пл кк ХУ го їх ке міш І ц їжа Уді БВ Ан бе БАЖ жЗшХ гай ска шоу МВА КХЕ ММА Є БВ пай сл 75 зп
ККУ ж Зо бтбуту Тюеім Щоб Мало й гу: баки їжу біз а Ом до Аз щі деху ке її Ех сі хі ВЕй о іАМОбМКЕ го БК о Уді са ЗзжшжЕ падяЯ мах мк »МЮ
За СЕ 5 «та ЕХ їх Ху кА деку Ми слу ке Вл ба ие й хх леву хх чаї Уві роз Уаї У«і дви: Мек обі УВІ) лів Суд Кто АВроАія ТВХх Аха й «ке щи
ЛІ ХУ М
З що тах Зк Ку МІ до вто дощу 3 вух: іх ЗА МОУ З Тк Зхц їАха іа мен йів йхз віз Ака АБ ощіч ТЕв оса тал Бвпе іа Бей УЗА Ку сх чУг «Ж ХЕ до Б ТЕ Ви
Урі 21 хх ме му ФЛ дж вх Дос ХХ ТТ «з їдл: тім ма В
ЗІ їх УА ЕКО МАХ бів Уві ма вий ВЖК МЛАЙ са ЖОВ АХМЛ ЯМ їхАВ
Б З тму
Место ої Ва Маї тен Вр Аза б дже їв ді ка ВІ пл джу дет жа Беацд ле Хаї ем Кз із Жхо АвзоО був із вВкз Аза пів дич Ак зи че ік їс5о МКУ ло ока С хх Ух жи ЗБ оо жи С у бю є о тк Фе Тож с Хх У НЯ
Жх» Бі біз ба ЖБЕ Віа тбвкЕ са ТУЮ ФУ Бжо БІЄ ко лим Аля о Бец
РЕ хи 755
Я АХ М Мк ок пеки бл к о болуш Ж: ха Ммух Шк Ту тА му ую хат іх А вкч кВт лех МУ лев мех Уже о ЗеЕ зів БІ ЖЖ жвВх Бле БК вх іа зх зх уд 1 зе КО І бор хат Хе лю т Мою оку ЗАЛ мех, у Моз ах (ти щих Му
МклжЖ жа АКТ А ше Бе дл КА ЖЖ ХЕ ККОо вве ОБУ Оу БК БЖ ях 150 155 і тм Жука Щі Мах бинт ху ша Мав Мі лі ні й жу МЛ» Жим де кУЖ Мей дж ЕВ СВ да Уа мет Зав окц ої УЖ ОАЕ Ах ра ях тА с їБ55 Мт ТУ
КО г дет тт пк ТЖотууї То суєї До ье зр Бах Му СУ я їду ТУ ху б дів Бен) бі БУ АкчЧ ої бе Ав ії Без о бле ес Віа рей пам ЇМ тт зо зм їх ї85 іч зе о Жлах у мл ах пок сим тлі кх ГАЗ му я Му шк ж жі тку їВи зе Уві дів» Бе Дів дБ жі щі тТпЕ б) Ажш АК ДАВ Ах їв юка ку су Ми М ун У зі їла УУжи ІЛ пут Ті дже
ЯКО КК Ол Ваз СУМУ Мат Мі вро Її ї: шЖМ Су ги ММ хвощ Ах З чех бю У ех шу Ол ше
-х ті лах т тая Влоу ще МУ м ож хи В " а век тд Ті
Аіз їі пі їв о тву дід Ні ТК двродеК б3іу ЕВ Ї11є ТБих деп їІв езиї тп КЕ, «ат жк ло ка а
Ми жі ув М їв й із тах й Я нє Бахі) Щжту муж 2 таки Лк
Меї бій бет Ехо Мві Бхо Біу пев бій ім ізо вх Аа бі Еко АЮ заз 250 ху ес ел ЮЛ тиху свя АТ хо ут , сію еу МІ тка ТЗ и Мао тих дха ТІВ УжА Ух Уа ко Аз Бк РО біу Вія без Хі Ма Ме плед
БО шк кои
Ук Є хо ох к кл Тшує бі зоб ях док: бро пк Ст їж тт іч йщрв ої Вле бЗіа заУ Меви ВХ йзЗВв о спЕу ЛУукщо Бе ВЕ ФОшях КЗ Ма за зви 285 ко шву 2 їни ох 3-5 лу с. Щожесх (15 йон 23344 я іх беж ХЕ Є ки ків дкч віз та) Уаї йдех Аса Бій Ак ліз йхо Бі» Бек Уді Еко отТук
Уж МУ У ОС туту шли «ТИ Б чу. чо сш ку юну джу Ух Му пило чи жо З ще То. п Фут МІ де Бец сив Ех ха сбав Ав оБеї ТИХ Уа ААВ Ко пев вла зе А «Уц а п 335 тла
За З 315 о
Ж охух Жбоашаг фаил г ж зе ідо м між ду хх б тку стем Ме пні їм Бк сік дк пу дів УА Вб Аж Аза УЗ ТВЕ Тжв БгО іх чек дя як
У В 5
Жббехуу ЖЖ КУ т тю ЩО я щі шо тлмх т- зкіку булу ух йог тки Ва ти тУук Меї 5 за Був Ні Був УВ3і РВБе сту ТВХ бвБоВіа Кз Вів па їй 5 5 тт лиж У Мои лу ст тх хг Можу іа т Ж м З х п, дух Мхл пів омеї їн спо о їша біз алі дози ам ва см сл зіу її АКЗ лав
Зк х Зк зак
КУ ЗБ Зах жо пом рух дів Тих ТВ жа «10» 38 зх ад юн о Коул ту тка, гу «вій» ЛИНЕ
ОТ. тд Ух Ух «хії Жез шахЕ «ІН» ща ск ду М Кк жи й пиві Кі кіочсуУу т єс пек и ти я о КО гаваавкс зіслсстякзЗа воша плаїа ссабславтта СпзасешУуєе пса БО ов В Я ув дик фраки зе кіх В еКрд дваи Кдлеу юр уж в кухуц в зи
ОК Іх зисв вико в ї тчсщчавче захи пассзавси аск квв КК А іч. ж Ку Во пет пут хоюууз укусі що ВОВИХ В ти КО ух оу ви фот у й пекти з птиавЕспкста сор ахтае сусоосаусе азот схпозапеоє копав їх ок че печу нн во ев ех «око юю М ду М іч М о су п Мови мк зах пвтавшсассс сочистевав астетсассске ктсавсІїїа кссссЗассв вавзеахоає 4 хіти т ти ФК а пдв му ху тки яю оку є вух водощ у ях уж утчиа тв ли запчЗквану есте їв пеастие спр бсвесбУ каесизрсихи поеспачснав З вксаавикуї тесспгеазс вавачваВке ВАШУ пт здавпвсях ваввасазса шк ацасадсссх вазсадохную ФбоЗочоазес касстатока сзассвикода Касова ко пісессезсла бавзнаїсазса зе зссзсеалуви Факс евка зач За зкхівоспиє Козсвиказса сок сососеа стсоїаилас аасеЕсшікс зі авсоца зо сІкачасаа спроссвіаква зтвстазава зов оско звостоазсе ссбовасеЕх БиО зсбавккаккс ЗозкУсЕкаї скхкізукоае пбсозсвавих свакссукасє зазспаввлоаа ВО зааїтассвів посЕпоскіВвЕ ассвайекжс базова сЕсЗКсхааа СвЕКсосаще ЗЕ «ссзававка сзакіскизаї пставочо свусзабоваа хозазоссеУ сеї Ти птсайчеківз пІзкааазай авкаввавиТе апаязкатсцав асвотасвасе иа о сасзтавнак вЕбстхакав васвзссвхЕк сказ лака заКаЕсещОВ поси зав ктавзстатв засво стоа вигайзааїб снаспадвах боса жликох косого Зо чсектсвтстадч стесазкаюк сахттазвка пуоссктдсв заседтачви вхсакосекЕ Ого зсавсатксеї сстабвооа спосзопзеайк сФіакстдчспчс сказав разова іх атанавиа пікс тЕваєс спас остїа авакксзвават вазах зими 1145 засссЗзКаз зіакаказас секасвевсо зсшхвитаїсс воснівакау сехасаекав і830 сваЕкачЕХ ачзсстасатї зосзасасссч азапчевсчаа КЕКСпОоКсса Зсвавачаае їж зкасзкаева Мачикек сікласазеав «лизчавахха вавкївави: зоуокахаку іже ака сабсвосвкКсй «лавсан ЄсаасвоКеє пабзасвайаи аваопалва 1155 звітззанавци: астагласаа квосвссеасв как азсва оЗзОсаїЕвиаї ІаавеайТ 1445 мразаклтав косасаавскк азкУкевксе Зевс свазаїасце свист ов їжа И. ктастіссаа зпасавакщї зак ставох саЕдассчеї счусзектвасх свдвааавия 13 зездазчасас завис ах зазааавНнІЕ Зло я тікав с ваш їі їхсасбезах заавевацьс баезаасвойе сазвсосекії паза зо сх чо заз ксїви бовоссевоВ спо ї Часвсазаос воскаїсспоса затв ї749 пичссвосах сессзатакс асцпаділкає зокре спосо ла своєї 18 штпастаках списана сзовстазау ївагаскста зар цусза вози 15 кати жЕк стае нтссвс стпасзівзаств саке ЗЕсссеацои зпасеоикав ЗЕ пвавссасезус зствівзнасза КСВ сєс свсешхеВКтсІ сеассівацвв зосазаеие їз штзсовизчаза завхкаувиа сосвус вч МіФесоевин зазчсвхава злакова ха сізваассат сагізчахасс сттаскуссса вазоваазаіа каазчзсккаса зЗавзазтзчаак. з хзваїсссаека зсаавевавї зтадектава бховасових вав ка свт х ЕІ пассваїзЗав зсаскіїсса Соазптавках зесссвакУє сесукавох зосвекиеЕх во зЕвсавтии зесезавовеє паща сСстсзаазазеа спзчавктяЄ зксстеЕкчЄ КИ завуссааска сзвазазаои запаска свпісеквайт прес ксЯа адшкасуєцє ІЧ захетвек звик аво бозаефекатя ссотазвоася паФфовзаавза Фоввиаееко та05 хзчаавачат зеавсвуссЕ аївззиіваа зепавзайа хавжкацахх пак «455 запала окасазвт взосчсковаєс чес ссхва пазвтасии дфсозтвецЗа ЖЕК зпагдапсата кс кцсаха ЧЕ тосекс паобазскаїх завієзчатав гпесоувкакує шо засасвовсос зпшазЗкіче асо задо асан засіпЕех ЯМ чкцвзосві:з звабаскад Зхачваси ашстацазах БосазУнках сОзеоЗкум ЕТО випадав сич чсезвазазас оавчсвикосі ваеасеКсув асо шо кЕхлодазвз асхттлавасто пастка к сзизайвахзяа апасбовалає капа ІВ садааєстеааїв зазсасахке атидасцчсс класс чесоссотвсцЧ песо ВО ззосаїович спсспвовраа сасчашоу соепсеосоки печера сс о еЗя0 чсзУКасмло б ллосоча зсгсопзеекє сестер вснваамеююмі солоне їіпо зчасвУскс сеузсеасасх сфе сче зшазосксасє че сказ васзпсавуя З зЗпсаскскш свосвосазчев зсзсасвооєс звосзссовкод суслі зассосайеи 155 звссстссисо пепевосайс поссадевих завоссоссосов пІЗдосзатіав сазапочас ЗІ зсдпоасзчсІв зсвзоазоснс аз чекоа васпеоломес пово свва сао їжа чсезиБсскН дзоспсвода запо созасеконе спосте зозашоаптсоо іо жізчкоччаси сразсзбосх зозсвачас сФфастсаоне пси ося сосок зЗКо плацізчссЗ стискує пзочсвоча пес косвоа) СоїЗзосзИоса спо зах чес писасоЗссчо Зоо пссацєаУє Кштхосоих дес Ук 34 чвоазачеивис зопсссзчея своє влочеряни засесасоая осчодовош 4548 пассзаптсЗ сзсссазох соосіппцаай заззоссепиї ссекоЯеи славсчало Зо зп чесчодлосс сечо сФаскасеис весозщивосо оч посьала пса а ЯЕеО чіпа лаза тазазазвцай пвопоссссо аахротвиакх саксзайсвчх висазчизцах їтхО
Чопссосшмвс оорнррсох Зазбпааса спсчассоат заавоцсах чес ов ут кчесвссеува човоссзсопасг дасасвеаху ааскорсуси часа зво коу зва аптек цачиои дао сосотекасї восузаає пттсннвюає соц ксв ЗЕ : , лав осілі павзсіасво ссзосщасе спроапаесеьь дизсассту сороасеу за
; , ; вила «авсасечеза ссссасаася ставссахов боспасвоце савсжооци зрос со кссіпзклав сзасзащоо см иМмицис зоословесх весвоакз зсвисавеса зо Е бсачсзасас опкКов ра «іх З яв тая «ві ДНК хіх йех пауз «апох 35 «схе зксівакатх спіссеаквЕ свзгеУкки зрсзавоКеї звів во часта чає псазктаваа стямасмих: ссбзсіавод каска Хара їз чвазесеккс засдівсксїх КебзтщЩсск аакобеюя сузсовсссв зда аЗ із зКавссосвіїЗ аїскстававсс зіаасектаав тата созиа босмвиакс пЕпЕсее ох таз сессвквсах завкопаАсєви соти кчса зеКохктавх саке сСевопсасЕе Ба тсеатасссв чех Коазвассвеоч спіл зкаївасеса сізазааівх 58 «авсісссваа сиісанийає зе еаскаса абевеснашо мали весло ЗИ зосвастаєсков зедивкощаз ів коКа содлавиеч зразках век ка заззавізза педастетай ссазасовеос азкастезЗа сзпазававах задчашакте ха завакававк зЕцсазаааа сві уса Заескосважк вбанссвнаа вічка ОО зап сзхасаї вгвізисв гівзедавех ЕІ КкЖЕ Ккосзеіаа свавстакав «еВ чзайвсвсттхк «вотасоку сосвоатав сосачсвов: абваозфосеє вевісекоКЕ ТВ кЧпмівеВек дасте ска ссекчещи слазваєсо)а птавсаївазЗу весни ТЕ чЧиечиссенех песевкооай позвосзавЗч вопсдлахвзиа хзлазхалав сасвкхеедиЗ 48 ївисттакох бгавстосма чсвеласви щвиккавита Сузасеаасв казка зо кчаїззкссо ашрийсзоа взосвзеаїтав паззсассово сазан плеавашеоюа я шрилахзаав спаде поесахо пескдіскта пазачоизиіазча базаавстлахЗ абавклатте КО задбсасвосх Баксосвоко ведассттах збосаавуюх авзеасзваї свашссЗвах 1555 тезмассв'во зп зсваноа вомопово знайти засн кос вх Вк 159 зсгвткасіч свосазівус ззасптсзза сазсзкзавЕ сатеазестох ааасстеао 1250 аввастзчаче са чісчевив сасвіспих вутавчах ссатаптееи Затіваєште 13ка звксавааиЕх емсзккаїтии коескоФфетка тека ата псодововсови ваша 1325 зваззїщакс азгоучасктоя вапаззастя саакбкцастов зобом кавеее буси 13 сагхдівкае сового ао базове заваз валова зелавеово спототавно А таке тасєвоє згадокастЕ осФзКївазх чоуачптузова зомасасоваа зе іо сесдзачисас сзосилета сазазссвв задала ссовссявасс зсзасавасЕ і5Ка зипгтувгому саузасазаєс авоиашсннра спасававбсва папок саозо бив ТБ з«вкспесаває зве кітас сбазопасвЕ два сввса местасчекди БебввасазЗ 15 хектсайвсочак стсгсптаткас Свіст лажу Каб аастх апоцчавнсаах пЕштеаВЕша Ії ск свсссах завис Фопасванау Зучасаассв света с свои кад МЕ часозсвавс сакссслозвее вусатааоча чок ЕсавкЕ зозкцшкча соссоваатав іБО пвквесво ззепсеашепа Флісавслє звеасвзаасха чпиваскичо пекти а ВБЕ чизалазсно псавлкбало сбсввисекхах скзавстусайп соавЕссвце зсвзавосоІвУух ізо ксавкзЕїзу сдазаваскаа сосвахставї стацсесвас сзкваозава завивка 05 циежсвиеає гоззсазаос свксссаає кктззсавае всквассвах севоавеааих іп бповтазаах Кттвзисахк абластсвЕ соссавставт собвасхос апа оКЕка А косим сІзтааккаст сзасвостав чзчасасззат заЕданнки скавасосасх ЕМ чактазссаз гук тавата зівсісснох падвосаове савсгсеае секс віоуа ДИКО вксптавацова зазавочиск аасассзаз сзгсплоцх саїгеоаїеа Сссаззвасох чи кссвківо сізазацчвкик шисаепакео пбазасаза оз пзчвівах вико НИ сбаоаасхзасх посопзасава статок абзаакатах зе лоа Саспеазопака яко тзваекасака кесасвоемив пеасвоссвехс чи аеаз зкаввасеео збе ва Ви звасузстаав сплеск оза ссассвосах бечакавос сосеасвизес спопвкавЕкає Іва суаадвиссх сасїзааїсве ссоставхза сехахкоачес стсзевайкс закзааваке ОО васкаскнио зпаесосзеасва дазвитацека вгвевичкав зссвасскв аск акзи я схе омевос чавосаввак заксззасів соти масває вЗкееачх зааддекао ат ззвхІцссакжав вавтккКдва созавачізаФ сексу кааїтв заавккоасвзи асо «ВХ казвзакавск азававезає ксжовззаазвЕ асазксаваес досі вщиасо зсавазваае яаЕО -зквасзкаст сувсззасвкх зоваебвхек восбузавах вес осчои СКК 2 стави асп сасаас цеадцесосствЕ запа соцє ппсасицчє пузчесписх В зпзааосицо песбслсіхс заесзикеоо Шосекасосвих скосу Беца ІПхЕ зашкссста ссосессток басадлайастт сесасосчхо суда: сзопошаєно ЗР скоса скеУ сво ксах Ззцзкодсза Зазочаплаач Зассаєечх попе алаще ЗІ засзапацев чецссавуся сосазесеака оссзагозасо совосес сопе Яка сЕшжетсочощ боросовогис садроссвос вЕбочасскос ссзсокоЗсва зувоначесо За завис: совасавоце спомин зЗбомісцвос спосо зоссвадато Узеп песочсспотве Коста чозчслазау почоЗосЕ сссозавооо позосхоцах жа жапссчакзу сачаснав счестосос арен зофоцаох зп оцшее зано псзуооссвЗа бопсочиЗес пичссуосасз сасцУужчеоює сросезакака осплоапласало 3580 жмласцеоч сс уачеч село пасучочссв чових сич оо БО стелпоссвзовз азопчсооас соуси с сепипчовоося сасссаечев саспавасосу ЗЕ песчЧосовис зона савхшксско кчлазотаса споді секЕ оче ЗО звезшооссд сла остк соукочоезЗаст пасток Чизосспоса пово ЕХ чадесселиза упали кави Ззгазкзаацва Фізсзсоосс хаос сопла 540 чено зазксзаас ссззуазвозасо басокасссс соссоспбсх сабусаако запо казчсваціча зощівосазв зсув рового аве задескаїнЗс Опасовков ІБК зЗззЗссониЗ засос поеоочзаа дез сстосс касовстода ака опо зпаасвосссд кссвисах: пдопосваскв салони саооссазаох сцпаоеоах зач зсехоидчевост осо зозвесссзс Фр саосс зпсжкссее зо восчасох з140 пчаалоачослкоз зпапоасхог спас ов Зечпосастює Фкоссарюия колосу ат свктзлЕсасст весвісзспч вовссексво Засвасцваа сзавеомно сосках ЕКО песо чЯ сипсесі ще ссівиша Басова вчусескосвах пока ЕТ
Есоссваайс совЗссавео сзааоов Зоя вся зозобеасвх запо 350 свіжі азсва зтвсвкахстах заоч асол ковзає засзцацвов бзочмесо аа котла сопе сиасопзсваз асо сЗсцосчси Кекс и тУквишсоцеоау сосоозоссво чоочкеслои пос вм паза озсоц всвачаазае ло пчассесчазоз чахссоесач сучівусаву їбсеската Зк сзасо пдв СУ чІчпазващс стос Фдзочлеви счаочожавс зОзосзнЗЗа зво чо казус с совет мх севктосвва сек Зсазвосабст ап о т сстсзаастекс зпасщекксас фриз косяв схмавіслУои сопмКивВивс пом оя кош кессдчасіо зх ссч ссусстласо ЗзЕЕсбси сбсошЕшКсхВ сао ФЕМ сксковасоко ссоззазазва ставзсвавкс двовзезивосох вседексСева бабавсакак 4зЕа псацсзсавоа ахеонсбецаст шіссвеоссса саводосався випила свопи зво хпювсосоаея зисссовосе сззоСсвзой пдеватчиОї саззааасквав завпиаавви ЗИ задопоцсвноз авзавсвІірає ппастикек асаоамевсяс сезаажвклеє повна сх. 20 спадсанссавс зазазссата сосаїахста задоавсвава сіосскУквак ісетосека ЗА с«шкпчіащнка чис васвовчско веозбдоспацчо пса е моно Зло зсашпіалкх сопдаслзсаз зсапасеки сзпізшисе пачЧоВІс зоссувас ЗНО сстлпастоасас зпаліпочес васасшстпса зоспозилах поп осали чіпи павига Іа сами зслоссшеццс остова чоти о поса ваи их з щчсеаіска звасвузчсвас воза сткІЇ зчіакстіаве зовссттчевоЗ сазана ЗЕ зп ссат стсззоайчс авсазаззсва гоасазасайо зсозсУмака спа овау ЗНО зхавапзсчисв авастпУукой сасівасеви світла пост тоскоавВ зсув УУО садку бовасосоро зозсосласта чоазасахвнс сззааавиага зазтавкє вав завіз савоца авіасвуасти ссоскссава сттточасайс Ввчасласоси позі леааВу Ул чксасзвошЕкх схо вач состава сесасастсви собу цевса кЗИсавасаа ІБ зесаслерсод пеадзепасва дезпошооатс ачізнастоа аслочсовалоа висо Бо осади сусп цена аазасозесв пОсавсветш савиаюсв Б пктсзацзача але свова хплсвсїкс собоксоввої зЕскісапка дсезваиааав пай захчсакцсе пизапізаве сЕхосзавсов авкаїзскої завсктао Езопа вох ЧО кассхоїсвЕ заз ків скозвосано масокоесвоч сода сає кача ках Би циачсуцеах стізагмовВвос взаасвтйеаз пльйвтлааів авовічлиса воза акЕчся ік звазвзисани звоссзсостт сасзЗасазс сстсвхсє зіЧчалатос бсвликоаца віч тсазчссвасте сссатсостаї ссзсасвсав сво совсв висотоккисх за ох ви ахссптшескса завспксовЕ Ед сгссасовоесв соавостоза звспшаксвах БОЮ посада чІспестсай ЯосшЕслІвнзв; ссаталстст зассатЕкпло вості БіІБИ
Кк зазчеспа соаазосеа СЗзсзоаозса сзехповає ЗжівоаЕсоп бозозвабоива чо зачаспчочк авалосгавоса паспаввсаЕ Ессе свкІ звзаатакас коесЕстевпав пе чаавпучизас свпоассзазс зпсасохесв певісвових ссгкоусасва стасзожфрокя я питссзочао сЕтстсвВса Фезватвккоа сосен побувкажаю ср тахиа Ва зсЕкоченка зошевкосвї зусккицохз зосеоскос восасвкоача сти савв Ево пазасавоцз стміалавоча сасзацссв савзпіаЕЯс сСвцеавтвай вка ТЕ зпвасаапї песатациао звЕтЕслав севасцвеває сеессотове бсвізавца То зпіхчассск сгсаїасимасй забез сва їаєкссовох саке ззабекекки а щи але Косхатасвв свваззцчза вазкаседаах ещокава: вевоаацосєВ ЗО кзпесслата кризова асакславйтЕкх тзасаколЧах чеосстабтла вахочоаваЗе вчи тасзкавтак сік сїаоде сассісевех їасрізаоаас вай кое зиБе зад
Чекозаста сесзекосе: сус овсв ааїсаваів бевоссасос зо овЕчов то тасесвоссс косахсзалаєа коза ачав Чепісоаах пссвсза свасзазавесе ТО ксасгтсацпех ваопчсчбасас зас онасде ву каслпопа визсовкосо зав сксаве та акстссстоача зап казк дазсадозяє пчусазассво зставалівас сассачачио ТЕО бззсавннж сосазнксств чсвавалоевк досасвосава своє свусаасяая Тихо зЕтстачсссх ахазсавие затавасоаа зплацозс зкезаваса зессвуєвЗи ТУ атсвавсстїєт засзезссаа оора ТЯ «кій» ЗЕ «зії Кт В «віх» НЕ хЕІЯ» же вмруз -апую З ввіссизчс осо иааштх Фо осивоє сзссуапосх песопиасшеос авоспефваох І посостаєсст засос ссз зозпсасодєс спот птоосвооеє песосаасо 120 щсасоавеса сосезосоа зврозезас счссоцасес савсжя спри 1859 впстсаеачсдче счспраассвоа чЧезссоеоичих песня є «ас цссоцо зссшсо «4 засад песто вмуцесвоВ зо сосоче пчасетоУко зозоЗсчох МН взачапшстччви соепоасивичя юрис сощослайса сазиашасщох зосшчеоя з пуссслпесда сестосуда баспчсосвос сусссовисов сток субаваозиа зай каса Ффроаснм сксссвосод жюжжсостооа соубодапоєс сосавззсисх. аЕ часпосавичих сич взосое Касвосазви сепУузеасж коса ккасик спесІЗтча ща;
цосевовейи зсочассосоч аосасвссае зодсзасссв спспівовка соЄсасат ВІ скешсесосЕх сцени ло зими льс соосзоссая сакацвиі) своесзсска що своаоабасвух зосесаксваєс зспозшчаве дезосзсаео зопосечезсся зак заася ТЕ
Егабннико човугсозсє спксіваово спосо боозазчово ссебаорУо т соки зс кзсхазоибув сота с сизузозале зувакжаскя мопс Кай посбезеесро бозслсхзїа спеасквоста бозетахзЗЕ запо ає дова щю свацстазасв способ оз споесавусє зсбоцачет ссппісбау спосо з5у с«встссгасчасч сазпосачса ссзмочаоаос сааспсзаауя азс осувов соувичавиечо 02 И пессвицшвк сіІсаасеВаК ЗОЗ влаєакх Своя сво шов асоу іш сис зач касви Фовсесвзоа саадсдасвв заавзоставоч сеча 1155 часзвосзчасу ваосастовах зссосозтую соесодассоя сзчсвоюо Сирота є хо срвцсвоиаш часа сскосаосто соКопзичовоа апесо сс 1255 щшесспьсссує свсзлоссо асозчсазУ зе со осоЗя пошко їі ирхлсвасти дочки х ссововОтої свосаВ пчехксстаов почав ска 138 спенозссчис чбіпзасосочи зесєстовасаз чассссооско зЗУствеекех Коееросоо зап щшепочсаєсоскт важ ое сускчствеза пшоно собу посох і5ОО пшешечссвхс асепауюоку вчусвсасщЗа сакссовай зезшоскіса ссвоссоздоне іо «кксодсвссст вадвкчча косою соло сісппасуавося зом і528 таспчсозЕс севтстазсади адовзостзає соаестасся пафссчдтвс сазксузх ЕВ заасохзасас соасзЗасовї псзсаєаєас зкодасазває созссозаута зх азстоа МТВ ссусвавецх аасосовок зсоуаваєссь чсасеєстта саосУко Та кЕі1005 У «В» ЗВ «вісз НЕ «13» Жед мах «ав 7 сщжзссозвиа здкссеіснав чсоссзасовно вцесзвозаї зчсатесоало ссзесассви БІ шпсксшаожсе (січе соч ноксоя КежЕоаох «зате пІхКее Кох їде сшззаасвса сао ацосв зо ссавоо воакасссчкс супами чис ІяВ зони зас чес вижеача ссорисизЗа пасопапЗ зозчееаше з зернини заа «ач зи ЕЗс оз ссцИссвВ педспкелло созоаачиЗу ЗО
КО ц пе СУК зп опу ащиазасви З У. ИН п кс опо тпм х ва и КА прое пря пат содвеааста сю Степ Ерах Зх чем му саше перРІ пат хх ІМК СНОМ пишу чем одер вх поживи ик сер пос уилуя ФМ Коди дитя ВО тут иутих речи т В ки т я свои коое саазивсако Стас стаи ВшБашнІЬх стопи сис и пре и в НИ НН хай запзиакІа сопсшисая поста сои чин ШІ мо Сх Іо п їх ЕК За замсзема тя коди сво Ееайї сгососс дні прес сстта паса, шли пеазЗтасоа тувочеаее пити кпХ цисти: чепчик час т Ж: си евксех поеми жамеасти шим ІЕИЕ ІМЕНІ Хл вия ЗМО ЛИТВІ пе кісті см Іо ВО лужку уже ктих учею пет ція жк а ки пулу У птчЧастчиВК дин КшмапсаЄ осно збо асахча сЗзчашчачоВ счахвУуаи МЕЖ акад х пише псасно попе сцаш полоса лини побив Же свічу Вих виру схову ут пули я ит У и о шо пила посади ЧдалеспафМмеі аварахисиУс зпапшставе попали ЗО шасссчасис спасає псавояааслтоав асбакссааис ве ше на Щщрошк КК Хвиие МУ дупи у ту тичуєеккі у и ув ик овучаук мух суму ау ую й их божу Між сих фу ук и у ую дО азмкихацзрств соссассстакс пшхчзовсалалх сксозчаско хшеліщеносе МобаКЕцаєх 5 сети суєти Кожух (ик іт й тити додруттомииих Уеет В нижчу; (ту прив "ци зсевзочсакза сзачезоссмс аописФссмрі звосоао сеслассто лето ЕЕ
З узклирау иі т Бех дич ВІ біз дІєтуєтиитух ЇЗМИф М тхІЗИИтІХсВ МТ вує ща ри пк зсасооччавкс юс асоссокшеса Сосазазоссе песщос сечова ие фокус тєіитІхи лист рит с усІиФиє Бо еВ ср дитяти жуих уже ІиТ ту Іі Ж тим 1чА4х сні чаш соч КусСсоЧкм щини спека зо «ие и чрееи ухЕУ ЖИВ отиту; сх охоте Урок тупик ВК ре злий спек оздеза псбокеосва чзспсссвстеаа вецЗФасцчсе псозпаасиси ахсосе ххщО поичаокавЗз ссзвоавшосос нас сх шЕШИКИКОМ почали Ак праху аж оре ринви фритюрі Кі ков хи ий КУТА Му Кути ти МКУ МУХИ ки ХА ЛИХІ МАХ Ам уки щих у я своих кри етері що сур дуг У тт жу из из уурчуиг зи шпУуфчвихиих пис воасає апное са вчбсСеахвачех счгсслочац пак тк тихим сутв дум су и м сце ту Ім МИ еКК с м дічиж рих ке ду и чай шхМІсСЕрЧ аа Фе ликм печшхоА ев воспКазаов семи Мая слина цтешо єешпрлважхео Маша теїввеасхвз Мазвеацчавктс пера АжВУ призов вової примх еВ ми ув с Базель в дя Зак тує цит вд ец ци зиск чавал ва сесв зсзсеадаза пів зісшм СаваакВе іо плекав вади даті ви ВКМ Аацв ви ее ав нев дова ду ЕМ зчсавикаїс говзртдаза вастІвихаа Кокваасвав савсахавпаМ сеавзвасиха яп сук ців рих се в овІчиь сф сухо ВЖИВ сум М гук м тка хви есах песехска зепзчавсовах ззкіазвзачтав Кави ззамазках їЕКО заакилавиа Кепка Мих «іп» 48 «231х аПпо5 ис «цу хи АХ коту Зло мих тод МО гм ожидУув с ли, хх
КК хх селі зі Е іщук еВ вм супи ду дою гу Комо іхо3 г іже юю жо у кеди ще
КК КА так шк ЧеспеоУкежв сацехазаев Уч шал едасоктец Епос и шсісвзочла пшезІвааїср ваіваесдвастсз азссосоцкя паска совок сако 129 таспоттвк декізезас акне соком зоб тта пашжксуаак |В чсесазвосссво всостЧтазк коса Вежа кааєх севцесимхо сопе сосасе ша шостсїао зве сата базвївісач дпдзоузазиасо зЗейавохнавх зав тоаа З чсазчисачач зпасезказе двазчзачссс шстхгазссач зимує чаво сесвасвокя з кадчівоакикх базтастспа кохзавосяох сішдзосасова сзачасовако звіасщитакх о сКіскасопія зобспочіва зозкассопеас сзкадшЕооск кабвасасев зшскакакав Я пасзатасцць бактсчвакиЕ ктаїзаеасви засос дзаааволаза зоссазаава Ва зведсовіааав позвосас пес ваВаО соло оваде сазвсусва сассшКцКх Ок сттЕнасиспа звоспаачвВ Сер сссаХ севаахокоса васвоссавек аа ия БИ веаїзквзасєси: авактвізасв стаз аїви вачпзіваазоас свавічасва зва ююв ТЕ кс:вавевказ КівЗзисвКх зЕсавсвааї взссоваєсшев дово сза ЗксВачас ТВО часно сепеапасісю стиск сввоісвива5 сеча баси а засавБктств астевчпстаї зіавиаск счасчбавесс сзазсеваваеч пеалеоУо ЗВО хвахасвога засн к сахкозаїса посвіцеєсах сапукаїасху азни шк ссвааачикс боспацавУю: коспосеавак севКЕшКкКУ поспзазаасв севававаеса щі їіЧпхо кокспаасВо мІісоссосваа зодоспоссаз сет свкя шоосбЕВаьа стсашксаЕ МО слсесссавса загозочау ЕЕ годоадеї боссовуааас вадскокка Зх 1145 сечспуспвоеа азефжфасєкава ек асслтес аспептавкавх крахом МЕ ак те ВО склу водаАц СсвиКовКо жоадфастисх Фази ос свавосасвосе зчспашаеКку 1и5У чсвіЕрасоває сеаавсааєс савачиткк Босетесяає бокс: запаси її чссвоцосст дпсссоаопцаш зазсзстазвс яадасавичеї пепстеаааа сосбвисевоу їз спсвиснна сотвзассабфса сеававстосс зов аву швостсаков сезштосоКою 1455 ч«ацососНс су сасєсза сосвативаст Зп Чес повуссавце сасосаеКе КН весесадлих свосвсонв позвчасчсоа чаша дис сосна х ІБ жівссас кпосшкзсан сепосувапа соки совах псесвішеюиа Фет Кв пшвнВсОпиК сосен обо осісЕ зчапечесВцс босодецосю поча ощих 1535 зиссмМхаз чізачсосозс стала сода шилом: сауцссво їла:
ост. поря к- ле зе З дм песоессцлв зчазасіная сдеоусуслас завад сосадч сус ких песо 18 часову зафнхоз бусвосадане сао осдчетосодах асеведацеє іч51 ззассасвос аззласутоаа поаосвсіцодава зівоазеикас засос х срочно ЗЕ цпосуосссосз зсвоассаоу созасацеча чссозсас здагазсваЗ пусосовада їв кпівссдачс КксвзЗзЗгове зазаттавох акаївтшЕ коозвісаха окестекеа ща хаззвкЕсаазз зазкссзезач сов сциаса савЗосссзу сазаавЗчс ходова ва зсзсзаваце часулафтг стзчспнеса засос зчикзацицсс сода десеав з180 «пскзассс соавоссазсея сасачестсу созапасов засовостхс ассосоаекоца КТ зоссаскасис сосок асося звосстсодганос бос оче сЗозазсс савани вл чизапавост пассзісоскоа свосапосвс) зсув чессзвовиї соч ша пидЧвосчеца мес зов соссспзикяе Зтсзсвкс азот 450 зпстсасштсоз чухавсчс сассттсаУша асоцадисза зсчсвочЗ сакаовсои ЯКО зак ахна зсбесксааа пос сЗц сезон ача слозЧааова сзеасачианай БО зачвпосзсао» зпосассоч пис ссазс боса ачч ззаапеккске «вес ає га
Ум хезвов соезсзассса сессвузао зазосуаіач заг роаскчУх задозадаво дели часссцесса зубасзаесас сеасеавіс зесавосмосх бсвеасасову двазавосвою ато засбссавав востсвавощ сочасдавеасаси сзаземнине вепосзацва задом віти «корспкади палЕЗсствої ппобапчассп зпллсахЕао своє позиви «а зопвичЧсасаї пкочсоцосЗ соскоцо о зааасваатв зіпазеамрз спот 855 заливка абззасаса вказав база песик жов шчай зчвасавсафша сссакчКцу оцет пас усвво аваееивала фа ииєв Защо часа со податися сис ий пипсвиссишЄ зпеспцчаввио запо Зп зочссеасесЕ сзвиасвалеста забав стзсв сбашессежах вико теза ЗО споцесомуко ставопчатоя бофосесача астеооласте фзасзссвацє садааеава з засво дазуесоасзса зочавцнвів пссзсссовач засо очасе савцаЗа Зло пе пив ку еви ухгу ц ох су піч сущохУгх р и Я дою сю ач зазаим сич а КудозЗасааа возцчазваєоз заазеовиава взуазазачав ЗБОККУх ЗаММ чічазсавсва ФапІзака пес сеека спрозаніда кола ву блоавсїавВоє Зао засссзкдчаа сив с зкесавкстви зе сзиК ОсКЗакш сззаккиаа Зах чезсацавчасх засос зозаадзгча зона сз сао сс ззисчвосо їао зчачсвахцава завсзадоеУ счзувомов зсзаосавос заз часова 35455
: : ; : дити десф А у ту лин з пути чо пами ово ес сх Кк трі хв хе тал пасаж есе ча Фома сука ха оз зах Ми : ; ск з ит нижчу вірі сб бпазгапвасай зассевзадпав пкаїайвлЕ КлзЗзоагЗа в сади поапспазвиоя чз3зчзоччичаУх пазвтапзсла заспссзелав касах совок зво пк космос оди со ліву КО сере узруУ тю що Ум сикхасспоав ост ассщЕ дозасуваке сСтзаїааза сзУуаЗкаста зазна Ж сш в им ах ок ук мив див суще коди ста тр Ку ли пЕцслеоткЕа соч ватсваКаїе засвасЕЕко чтапісвасх сзаевЕоВКе ІБ згзадісаввия сват мміІацнеа паза ззай Завазаисвзв сосвазаї адехзЗаесизЗах зай асаззосчави ссавскдаце ау зцпап палав сссмтсваза авиЗашоас зи пет опо ово мук лук жк фот с в жк ву сущим и я ж учити ув мих ап зпеаакзлат зсазвксчатЕк асЕксотавоа пика ККоИс дела списи І пір ис ВЕ мом й і фр В Ку пу уявив увів м ом КЕ о іт чаш ацазчосиви ахзоччасакоа ссккухКсова сли Квошихс «ск сввекоа зесасвкача ших сезаессаст каапазпляви БапассвааЗ гад тваяса зи ЕдІваа дІсвиВеВе З шихти сдеш жа сис сСацастачанУу кчаАсЗоачОМ ЗК Ве иа км щи додому ко ув ж жди вк ск печу А ко змічту о Ц в ую лах азвізциниаса заасекащек пвазпстие щувсовоогав ппеашоссв ас зач ев и а НИ запа слава свся пасе ЗМУ «т1йз За «йІї-х 2 ел ті кшіш? ДИК мосютр туя «мі зі т Тижея пие чих «Біде йБучна пПоОФшп лавою «Ех «чаї» слігзимкнестид суптнМмстії п плакали СУПІ «еіз УУ сере ему ку трива хх шіссвісаєя печера в 2 «тА» я
ТК м 3
ЕАУВО є А детдор ту: єхдж ак ких шт уч Фірзпхжгуі м Кук ихчео урихче ко гру
А о мипУучна шт ДиВнЬУюе ках дей лю УВК жа гм УМ Ух явки та З ОлЛЬКОВУКЛЕХЖУБИМ СУБ п «ка ап ікру ти ди мухи т 3
ТММ КМХ ПИЛИ «А я Тх а хе АМУ р «щі ІЗ «В10х ДЕК т ПіжуУтіхіІЇ хо бзбохемї ек их кА шШуУина ПОрлілопвнаств лих
Ходи МИХ
СТЕ ую гудгі худне смучУві я жи лашо»вукнавсатив суди саьх «аз 43 асзирочсчя зов абай 12
Кі Ка дсх - Ам,
у т
КІМ о кА «ай НИ. «кій Шуміва послідовність» «КшІУх ха» Зпігонухивотим пупреєсхх «ах хз «ише а прукцуритаечим чек віз чт я Мк
МипачИцисе шосшсюМ ох «І ах «ії» 18 пекти пи жа Ал т а на каси Щщтечна Послідеши сті» гу хек КС ту чн зедувшуи Я часах ин уклатми ук М «паз я сі керу уки у 1 пасиви Фа КТ ик ух хх
ММ» а «жі жї ел УВІ кшАш Бик хуя сини усєіох бич зі ри й ие ве штучна меси КЕ соту
ЕМ
ТУ скат писмтк пу М суму Х ходи опАарсниклІени Упр «пох 44 я пичвичучшсв спи х кА оно з 5
ОК З
«ре іч ня хх «ЛУ ІАТАТУ ту ше глжму ЖІ укла М уче, «Ії щЕуУчва Послідевністьв о у кшеиХ
Ки ще й чжхкєх гук мус: Уют схе ой «ий ШИБКУ КлІСОтТИиК суп ни :: кап 85 иа У о маеашеаскя Ма
Ку Ду Еш
ЕМ чЕ
МОУ ми зх
КОКО кА і зе
Ж ДОКХ НЕ ух Те зу тич инвя кла т єм ка щтучнв поОпшлідавнсть «с»
КА ла, лог ах ем ФУ; уки «и М свпуд ние ХиИд ЗІКА
МІ хо
Мк чих пе Кв. ажфанчцаше зи амониАЕ кі ща ду чле Ж «вв ІВ
А т
ХДАК ХУ ета Ціпзеіустх тече зем уче кА Штучна ПООчДОБНииТе «ках пр . . . г «кеВ слі ХенуУукавВовиЗ супваес жо тут ду «00 47 ребру духи ик фу уй КЗ
ШивроревиК Мосс їз «рійх «в яку ща «КАМ «М «іш БЕК «ії» штУчиз ПослідоОвнусть «их оче жу хи: зу ка окчві го дхехачричоце і Х вк опхиснуклевтид Сук х «ях «5 ізо дет ри ід Ж оазчазвазчав зпсзанолас в «Х т у Ух хо З сті 18 кА ОХ. я ух учуФ «іш дик тю я Фоштукткіту ПтТутіоюі щу і т ск шЕУчМа САДОВА чткшмг тру по тут ет и послух ж оЗлІроМукинтотид пУпЕІННУХ У «ЯМ о ; : хх туз жор сі я ех т їх хаті Зах меа ше ХУ
ФЕН ЩІ
«ФМ що «еВ хі ек гахіу «шінМм БНЕ тв діннзутусх СТИ щої три ві ек, «ій Віхучна ПОследОевнашю»е
Уа
Ам У шати мет ик тиву и педа ких сшпУшпиУклесотид супи «аз щі темі дич сів -л хи ВОЛО ПОКИ кА т тем ж ках п ккіїм ІЗ шт ту яр чиї дик
Я 0 Мід жидо ІЗ пе се «З До штучна осла доВнЕУуТь «ЕЗ0Х
Ух уть0 суті роми чи я хек слдакзвнеилетокид пуп х АХ ей лю щі ками лА
. ча ти відо хіІх ви мб ди дих їх чик амац тиви аскк З шт п вул шо «ті 5 «віхи пі ет, холІх кеїшк ВИК ке штучна посади вналУуюе «йивах сх ст опір ут слі х «ил с-лІКовукничоУутиц спас ях шо какщухх ЖИ з цавомиснакст пах чЯ в а квВи 5 киїїз ІЗ люту пу ж М ДК
Ту тич и 4 ку УмКіЇ ет хм 0 щУУМмЕа ЗІЗ ДЕВІВН ЕТ»
УЛ ук ут взиї содою им чумі Її ході пу БанеКЛИМККим шу МІ. код що
Ка З фер оо кхт хт цтво ц «у качасасм ах 3 ши» Оу жк Б
ЖАКА «А пов тд «кас их ертухи 0 Мо кумою Геї пса З чі жи шву чи іс віндова сь «ам «ТЕХ у гмхмохомсритт юю усу У хек олпаковикашжоУхим муки ж по «ях 55 мити самця ка
МАН ка «Ам я «Мт ІЗ тм, ЧУ кА У НЕ тло примлуцої ізн мож их кА жвжуУузнв ниппдаванаткх
СУТ хх зах поні ик ик с урни у
Еш Я ЛЕК сМУКНЕККРВИА СУТ 3 дух, що чашмМм о Отму фест ці под Кік в СН
Зав аимжа ВСУ. А ех ЛУ и Фо «ВІ ак сту уч кій І сх те «Ек вих
Кк пи до Гуті У ре, к штучаа зле дивнктте стуткті
КиМУ «ий пальму кишуи муч
СЯ; саму китУхий ПСЖ
«ап 55 --
ЗиЗвавсчади сао с в а У хх Ми М жук х
ХА А дк кхмУ пи зх я тк». З на ши шу чнеа ТОД УЮ
КЕ
«Ей соні коамухлдетинвид пуп дл г «кл що пн и т позазчзаосх вза каста М ех ЩЕ ккачи п лаки ді сш БИК
Ол, МПігехозлмом о ТТахіх м 3 У іх кві дж плоть ж
УКХ, «м і у ху ви ВЕ січки ХХ «ЕК» ЗдіБовуклаттид супро
ТУ ду. г «Я» е схе візи ек протоку ки й ТЕ апшилашва ЗОНИ г ях ск ук «Ах ОТ
А зтоху кА М рик тими
ДМК мА
Кт, Уббумехх і Кб мом ем,
Еш ДІТЮчЧНЯ ПОСЛА ДСВНУТЬ «КОД туту, м 5 дума тт уеамеучики
Хо слаКБомУуклесемя пух Хх тт Фк. кашизх ща пасаж фа їх «ві0з во тяж хо я «А
Ки хе кіш ге ла феозегія біси т я мух сім «о 3 ОХ штучна нсоспІідоОоВвнаоик га кВ
Ж М шлЬСИНУКІлЕУТИВМ СУПИ щу я кашу пю шичассисляа иа я «ім Б «ля хх
АЖ А
«ях цих ех Фе уУтА кг ро о «ші» Шкучна Порхолідоввністьв
ТЕ ж
АЖ и ск кту туя ск уки пи имени утво хі я 0 ЛА МОщукиУсиц ШУ Х
АТ, шл
КМ А
- ог, ; «ха уесх юр еи ву кУК КЕовомх їх
КІН НИ В похила 4 лій КЗ еф хх «вії» хх туту гумі «ек ВЕ не. Зо сттго Фіто ши и Кч же» щтучзна послідов Ммухе лих
Ам кл 00 суді докт укоюдо соки
Ми сплішжпнуклеоти д пп «а Бо й - : . а чинили: пиві мтвЗ з чада Ми почував о А
У що? «шва іх о «ії Ка су х сі че дик ок ех. Кеті : ех пд пиепі лим іст
СІ штечна іншлІдсннИикь «ТИХ
Ми ху ре НУ хи ВЛПУпПОоБУКлЛааЖМИ СУДДЕЮ «ший» 5 жан и НН ча зоасзаиайи пазом І ш З гр 545 же ще «С тку
Ж шко тру жу жк КиИХ тая Хв ек лили І за их тп ух сх тик пою і ет
ОК штучна поси «УДК ти ткт ух устя пу ще Ол уКонуКДЕНУКИД СУП Х «ях а ткігрл лети ноти тя тод т павзааалочоча подесачпе а і
Од ох кА вежу лу, тишу
Же ах «213 Палюзководібний вірує рису тУунгоро а хо УК,
Кеши У нолпватицих плакали акації ди втомі діаг дц аку и чУушкахвича ЗЗсашеашика вовк схавеч аеУсскичашиа зливи чав сука о часта вав акє псссвиччикх пів ствазвсв авсзайЙскКс вееаоючеци А ух ків паче пав ик чим мох уж ечуя пута у ту и Ки пожов ем що уих В обоечт и ех хх шоста заця зе асовіаицУх звашаУєсшхйА зі ада бос ополАІВЕ МК пгсоатпакзстшиЕ шоссе ваа пово сьозсозаеа соус сце Вера ка - Б
З оди ері хо уди о ков ою т ря піцу щ хво куму варю ві в озвсінт в у зла вазсасвчах педпавссввос сезгашакст ппевицаесєв тес запи КО подолав дних пра оком те ом ви уж их зо жетон дух ж І пвисдипави зсоовкзсчаз сссвикваллє ша ваенюм сошки Кашу їх жи долу грец уро сут фл кс опіжитовку онко о сп ит В ще ци орд їй зчиччаваакат зессвесгаа Заплава чалнвч апр скеа саешеКива Вина х ЗМ : . ; : хх сфа же щук о ук дез ут БІ мет сти ув дез в пами Ма Б аг визісвзеазчи сасксваазаззчаоа сапосахлч спади садчв зсзезчатшза заспосавках їжу усе іже ди поту м п хек тих Вик дів вв В ал питасвисо звбсвзозкасдвзв часа че спасає дала КУЄ Ка Ух зак
КівкЕсааваех срастсіїтаваа базова овоа базапавица сеовзсчявзЗзака сафадецх пиМ зсашииосвос асп вив ашеациша мешкати Фолс жала пе п ин и НН и з зчизсасваї пессазічеа сссскчааск соачзевхата возуачочссв чедлеачкекя ТІ ху за
ЕІ ща Б «Зір» де є АЙ ш--ех туру, то, «Ех Ех кля тр «кит их шлю Т1тоз усві п Ех лм ух аж дю Ум тих шим папичкиподісвим вірус мисте тувгиох кацих як пою ув уж я пове пові их (ур МІ п М ми Мих жи ім Уж Мои их ро зипавтосаву Фсвазааджавю свати ах аа косув РА пола сли паші а фериту ую с ди рик Вот ці КЕ довів им КК ух ск тазпстовашах шви ченка ско вадча ша гавез встсвВч шо ВИ пости ньекс сзіатасвнлайа поаасасиво шву За МОЗ ство З
КМ в: яка хр кА ко шир ту «зх свій» ДЕК мл ах. бохо Мих
М ема нику чтаиЗ 5
УС усе В М Яів Можу со Во хижак хі межи и шм ом Ко І мом дик жк щогл писпсазласєв тасзпсава з теп пай ох чле А х чеспаве псих ЕВ ши
Році дом щи вх ВІ дики вади жов кох ле ох стснчавазас хкасвиїчакс «Узипсакавт явушавецчеУ ЗЕ пешеаавах їшх п. уй хуей ую фею сви лу м ми В туй фоуме Й ро уЖ м кермі ом ух жом их кожи ит ЗУ пасвоиссенви сткссаєнчсл косинка ака СЕспаФавасх повин. ТО : : тах зді гуєидіх едокіие ЖМетрдетомоих Ущігититіх міжкрея сет дор за пвасаличат сксвисеиі бли пса себя засвосташис пови те ЗМ ен и и НН НК ди твчсвазскдєе засисасоузри сеча вова сеческссоа Кавзагавтв сама Ми еуУ фол т зору жук св мих о мо охоп уємом о смт жу ім сих ук тео кіт КМ Е ща тавучахаззаа поши зспашх зовзаадавеа СЗЗ Кн ЗК опеваспеаца за заваді скакхх ї5ю пока аа на и о НН А я дл зсайзисслеа зокоасслесе пуасвисслем вас беасшковми ХапичКоМо ЗМ дроти (рев Ми М ОО Мо вс КІТ Беру вх рез ви 588 ачлпсиксвозоа впосоєапе хокзвстсвс ака нчч хзоачасесв зЗоасвисшсЕ У про а ні и у и ал послав босих зЗсаазвизАХ Збоассааака асп дотик УЗ жор мох уки ех ІМК пемзою єм ом о кбомом В ше мея ту) щи вим убу щи их КУ «вка асткса сосаавсштах зсвзилсвзе Чвзесазеек вас гова пика жилу ско між мим мяких сухих трете моз МІХ ль Кум ЖОВ хв щОщІ чкасизпачаз васвеиаслой асасвЗсава сгрююпасавно азалавайскиа тс авасаа ши
З - КУ і : і У Е: х тцазавова пад ісскобо рІбтаасьа абЕкстицва вемнМЕЕкоВ Орос оесВ тий пссцапково овоча ест аетексат зобозасалв асзоссвоца асевадсвке ТЕО ззсичаоптау паатоетах се стяє вотшемкма щинасечех задатися ле тазу ссвзоа скссавксах Коші повув пасе ксдкаи бавасвіваа вип еавоаах ЗЕ зсасзаствсву; чле аІставосаос зас састайх Ск асізза ваза ЗО капати касизисомІх чспсащсви ззаштсоах ваавкисооа За їх засвиссвЕс ЕВКсвзаЦцЧфа зсасвсоаави ака своей ХОСЕ їі вЕ-хвкчссвау есе зазачх зсвїазкаса зізанааУсоу состава О созсавиоще 1145 хсвнавтхваєтв псстсчсасва аасаавхзма заесстосайа оставсо чав Тата тазавссо: давасєзося звоєазссвх бузшчОачс ззачазкоея їочзсеавКор 1559 зипссикоах чеки чЧацо сша пасли псасс песшавосекос сплави о 1350 їлстоешоІссо пас тсвао ЗсокхЗзсасех сузвассзав зелозацсезо запокссац їз сассзчачаз васктувавсу звався гозЗаисвек сСовсвізааа зокдеЗа іа 1449 спакскхааав совваасимво сспожасаваса сасваасила апЕпосвапе влоачилККх МО свачеободча сесатоесеоз асустасосо зедяаавоса зсідсазлов аопаваассаво їі здлавсотавс ссокЗзлвазасз сопзазадава сзласадасвоу звзсавзвотх севаааавваав НЕО соазсесанао сс Бакия сви паче воски асиЗ зчазачазвзоаа всваснааюа ЕВ сваспдаазачеа сабасвзачаз ссбпейссзах пеасховзайс весела йо аспоавіаек АТЯВ шсузечавц свопи сх вісівинкай абсиспасззЗОа зузносзвас взвавайапах 1508 чиисннрмас сабзуозачазо дгазазасо порода чо зосозавечасо созосстеоса МЕЖ завачетсопу заасссаевл сезцосдчазиа спогашеа сосозосе пеашилате а ї5ЗІо паззвзоесастоа човен зніс лоо спла Ччевоис свт иМн пазасбозидчая і158Е зилазкавов саззсозазу ВІО «спи БЕ «ЖЕ о ЕМО «інх ДНЕ «г1ух сОкухв заііча «аск Ей «ваза та сессовоачах зізсвавича сегвивКаїс забазазаздаа завів аївад БО зкжазмикух вавхкхсзат вавтасетосв кЕхзатахос сваржахсцосв запо свеее Во пикжстІсса спаадсїчоє стілавсеае аазкатис дувстщесео свноссовенов НЕ зсззвассезо сивсееечаю екю кни пасвІраше Фоєссксва сет Зо заЗзцовасти зсаппоазчазчат авоватсоос сгосстоасша пезвааєсва кЕдсвВаЧеюа о зшісасвиса васабі гавалоалоюа бохо дозаїдавах созаВеоКоа БО тксбаззисея бусвсксски азЗасаксшЕ саааввокюасс цесаскитсивує или маствй о тазосісвоаз забсзолова Мідівстсви сзебовкосїл зкзаозосвов ацчсасеюто з тссзозерУ авссвосссо спосавзвиаянє азіцповаєе аззекассвУ допадвкска а хтпаасксачи совсзнеааак сссвисазце засо аєс ес пасстях Солицосеваа ВО свазлазвио сасівопеде сесії заваза звсосвевиа затиски сегтпачахо зву загтівзавви Кеоеуттову зкізславної зізакисїз абовуктавЕ спосо ах ТЕО звзакаєсс счасвексова алича моста псвАх Фавст ав ТО песо ставай сибсвскайло асаасаалсв спкчсВисе Зо Кх що зсбвасеткзЗиа сосзоасЕс а: азассзсазка сзівазгатав зсСавсасося свіпсасеса Зп звістазсвс Каствзцісса сяйво ваасоасатх кчовЕаеее ашивепакео За засазтаста чаплі оса засос песен спис овав ТВО ЕКИХ, івак азассачааас бпавзадвава адпозассвив зеасдвк є збссвасосв чоаввкавце 19 ставі спсих зссадаксїв зсаатстсова саззвсававцаї сссахтвкпая салі совє ї155 сзазвизаза свсечіввсв сскдчавсусха човзесовов аассзаєсваа вхславккх її0о хІдеавксає каазкЕсатиа спвассоаЗ пзасвсзся псзазоксвЕ Сезауцоо шк зоеапасенн: очок зобслискове зсечдлапо сала шосе со їЗАе дфи:азчоріссх ссовтсеасно поскосбеЄше степ савзоскаки боєезсавоюа 1385 ассвоссвиоса хсадатасат ссовалазоссва бпзацвсзаї пасісоиззча задаззадас 13458 козазссаєв «ассосазсо авадастивич сстсвцЧасва авсвстовзазн вазах Шин сбозоашесь: стсавсвадев абосацаазе задуму чедадастає баса 15855 завсксаст ззазосакас зеавзссава сзаівсая часового пахова ївБло запаски сФохзачааос звччавзстот чезЗаасонн човазчсаа венах ала БВ атскцпазач дпаавспайєс заайзозано свезчаЕоста зов косо їТяО кіжсодсвстс азессаслосв своих па пасосцаачсх аалпстасфовоа свщнаацої М а - щої. м г. я ча и - же 4 зоютю їн твоя ля Од - НК чзазочазца дир севпоипссиєс фест иоие осебеєосте почачевста із5о поассласати пак зопаєти дпа екко Кгсолдлсаїс савзоастадое забава їз «сЕЗесаслуцч сзовахксва їтавзвисиеа сспожазама ца фарба адев їЗаО хоадзачаєта вкзссвелай под чех БЕ ча що «кфй» ДНК «війз бЗтуУужха вати та «м Ка щік аво заваасацавв зчтаввавозв чесвсбахиа сі осхвса Ук івае 5 цпсазаєсУсх зссптоцсас СевостшОса коавсвачи чососвезав спесаааиає їди ссзвпадасс спачихосбто сасечосавс созсстевзоасє соаспеицчавйт часу 155 зсастозачсит схоче сузає засос коава засос сиза рисах ха вуівсвухссав зЗзазпкеазак базаевзвсх зукахссктоао Міс ов собаках аве Зо стаілслоскоазок сакічшсавав кЕкасстоава свасссзава вакатеоскся зазозазса 355 зиекевесжхх Зссевческст аксдаазцусях соуваоссесос авпцоваскоч саесосеоча й чеовлеєсммЕ хсссоета аствовзсочв аказалеізах ессувасаза садвассавх и зеїкасцекте касессоесо сбасцозскав аскаєчекеа сзЗсвосесос всакаваосх з панки коша Екк звіесосвово ех касти бвакосазве всзваставяє ОО аахзвисспза сап'сахокиз сапу савааи ссзазасвеаа зебзсказач ба висаЗ ва «ктаскасаз зсассвспсає созазаскаав зазасзсовса асссіяша стада ТО чтзвсасвет авсасукках се ровасве ств кЗаст каазваскавй осавовеєВ тва
Ччовсівазвстс зІболвадвасе севзавизатх аапуІзцнсвоче спозазваца Песах ах хетабечасча поссмозсста зззаамнниио паассвасоо аск заезв сапу ЗО жбоевсасспноа зо соасооя аозстоєлза зесовоскяз сосоцоацсе «бувоковах з55 посвозааст зозааовазу зсезосаса девастасвоиса ссяазавосао КозссКцоде їБхЕ зеводазвкачь засиваствас свесаскеав пескосавца сиве скоя вовопдаавеє Мано «агопскавак саасвсехаве аасхвісвслаос авзацивикУ зЗвацатгсвеав зсакавасеав 1Б55 звасвастає птосвисезса сзастізааи сабскхасзах совосеазєв даасосаачу їж «теза сісва авабазаксзв сссіпеакива свзхасесцва секс зеазваа 1258 ззвоаасоате Куда ссазає заоч зе афкв етквисасхя вовка їзкО чщасвиассю: авессскоєвз аазЕтатавт Фр тх сенатеассю БКСассека 1385 дих до мВ ск коти Ківі при ніж в дуг здам «сс ствусотв пассоктакви состайвтсоо вкусив иа КК 45 лу свищ В дру жи пев ве ливі мг Ки и Жозе в окр су гіч Ки хх зчсазчайккз зчаепасапае задавати засавкчайаци ссозчавЕвкх зпчаахОосщє хо зачсизуцчач зосвоеслазо взасос Я К ІМК КВ Мора ДАМО МИ суду моло мо се фони оф цохохо зд вдвох щур мету вутих їх ща зазассизиаа ВПО І зчксяаая вазаавассю СКК сс юкиахл ЗО сим патіо В ик сви дисвидагв ад дике зчЕЗВа пеетстлзосао сайпсааавиа сплав вусами ях їд чшсхзза зизамя Ка Ме доти впало саскасмаст сплеск л помодпосдо здЕЕОеаи Ваг
З чащаяк дама часами содсаНЕих Фокс ЧК и ЧО мовити вана аа Кріт вад вала саден зчзапстаагчетх 12Ва швисеваха зввазгавачих касова вазу свесаЗЗло фасувасе АН свт міжн охо охоту Вивих у УКВ жук щатія КОВО учити Ж ФО Козак ин пу оцту ти зиадевадаавс пазвзвичісляа зпазамокНч пе тцссти ЗЕ КссКсл ааастсоцай АБ сттрстсаса птаавсисаєх Казала й слзадвиссий сек ахек пази под
ЕММА СІТОК ФОМИ ОІВ ІА НМ М Ме КАККЕЧЕКЕЮ КЛАЦККХВМУ МВФ
Чо лелусти хо лм хаті лссзлсав заазислти савздое єди 15 зпаавациаехє ааслоссаицяа своем еств зайвигащкс свзчлинкоа матчах АС - х гелеве хи баг зппааазаає пославидах КИ дії» пл
А Ти «ММ ОН «312 пнЕ
М І ЄЗУТХХ
КЕ УтижІМІВ ФІЖ В З
А КУ из АХА
Да Я чаш їм
Коужтустирустуєтити се иемтуи ци споеиц хуик гдз Кур му пргхемцІж дугу пз кИидизчуанос записаним засво алешастох схо шоуаи асани ииє и сезцвзадчов аассзапич адуавохч Чешпсосов паса сек а ММ ем жи мов умів их петтту моху суаревичуту МК ух Кир Кіри усу хв тил айв ччзеис попав фс вач ефе фаду АБ о и НН я ки в НН и НК Я ч «часа лир: ЗЕ заз саззадвосх зааалатбтв апп «УМ мот ди аствиА лУдВВиВоа салдтштв слиз сний палала дЕ зп чесстачоаци счвзачадавча зво саща салат веа леза оаааа чт х. З зок ох свиті фра су щутуних рег кода ож оц фоифремфй г дизу и Уа В УК дю сус дич ди АТ звигаджчча зфсевоешея сова шзЗоссствссваз сао всвостацти ЛК поанаа ч Н Н Ч за зпалсссапи Фасовка иесдзчмє Фаза сазоє ссеасвзаов КлЗвееаа СУ акрів мочок ме сти М зе иріх ви КІ аіи ож М Ос мо ці у Кг азвзптичазЗикви З пе З і що хоВисна аа аа Є Кер ша У а сей в мови Іо хім пеУВ В Ку між (ху фер ом ох й хочу В т кот дж плчакжасеко алпочоавасх зок осчсв заз ажекиа вказа ач чек лаако 545 чн нн и НН и НН ся усу ців вок Мо дк мух шо пеО їпеї хо уки У Іва ЧЕ х Арх Т пу їх чиї Зло ЕХ Вщх здевЕвайик де сп жоуткм допо вит доти мВ пкт дві мл х дж зачхкішачаї зосїазвоаза завзашавса закосаз зісадастив сло славкя пк мч дулю нє пижма я зи и ка ох пес кт Ж ми еф т дек у тлу зчавикУуєсх бах ахвові лих СК. їв КХхЗІах З зашити Зах ттхвника ТЯ: сю и их ов схо те ще фев ую жов одежу туя. щі сук ит я Фе ди ему гін ех и і У. б зшоссалина екс хк Чакксавхка асбеїавсичав ХКЕтсапросеа ЦИ ВшАУКЕ ТИ печі ні НН ЧИ п я соках вини кру сирих шт зкидазесвух бос исстеа ставав тУйа Кюсквисаше айва позах о пеки ек ці оком Ів ую ххх им у ут Вод коук нах ух Му Кк зп шжкЕсакіхса вхіасвівшще виз озчасв аассасацхо сасово писк ЗО ме и нн и НН В и НН НН гедою вою кА ЗИ ща еп ло вза сата кокоса сзчоасавтаскавх аклєасловЕ пемовимпа я зх пк дуєх цім цім біди Бджоли ол тА АВ цтва хи поствагасв зсолзозвовац бл соваяу касок алав садове піз їв дор ткож х охоп ек ди цкщй си в еІд в думу тд кишки зей жука стаа садзаввеате ссзасаасвВ ссхшевІза зЗзчавгасза ваеапохива хе жо лов рр удо оцю ую ти сер ми Же ВТР Ж КОМ серии их Кер их ин сте ут лай пса снахх вві лашися сорти тм о ш їц скрапкт середа псує Ка КО нм щих смів сади сли с схзазаба позавівцІд хз чис мх паси чксви свище хчаК ке часеУв сс аЗвмх пора АК его У цоцО В моху сус ох кожи Кох в доц их сет ков ефект опр оц В одіж чо зсвзавахсеа зЗсаазисайшие паслеачсове зобов сЗтсвкасав Сова їещи адресу Мом ечувме седиечуВ вагх Куродд вчи дб дев р кри 137 закикикас баси пасиок сах коесваецено ашивсапК Кл їз мож К уд су ков кб Ес уг В ср свт ще тт закиспазват побозвизчех бозаЗасзаа шЕасупосв песен сио сиЗочша в МАМИ сему ми луги хви дв б ох ВО МІХ ВІВ ходом мичии хо цу их 8
Що а достат сек кзаїо сзуавсвдазза вавзавзвоУза збавівсво уЯах пак еквикаикии роти й гас Дт дтайтуєичх рей діа зай запаствккеЕ сизаєіссач юс зисахце пасеаозави дхастасціє сша їмо оре су М я й сю ком ких скік ми тужити фу сту екс моху ЖОВ мохом Кл
МКУ, дах писали чи е и хе ка ПК За Ха ке КЛ вх що Мои гу хх пеки зем ж ему кВ ххх І уд важ ЗУ песициснач сдецайастаа сх аак пс ак сх са за асравзпое гів вм чн и НА НН де цу Оуй пк озеіі є в дод дуг ЕВ таксвивзесо пазвасвосх вовча засакзлахв баса сват зим спрею ст ції ес ца су юки даже Кр щм мглщкувщк Іа акстачісоач виз чис бавитися Кап кожних вставав БІО сир ук гдз Іза тка суддею ЩІ у е 1дли са аскававачахє Зсасвшичшє сома кщасах Чака ко «кА ОКХ Ом ків Жуки служив куму ох дови Ук одежі хх цу тих зву ЕК МИ ЖЕ свпакелссое пасма сава пдсзвеаакехо пичавиеа Ввшсеамкио вВІЦОМеІКІМ АТО кому тис одомомеУ св оу жук т ці мо тоами ж Іс х ус щік ув цих хх и уч Зм
ПЕКІНІ АС сс НВАХ оті наше сооея шишок пасив Ак стік вдіяти МК М у Мф Мюслі диУКю учи водо тім горі кі ше зЗзИий чзачавазлос века ЕсВЕ шко чапвохилах Сбсдвесссаче вопрос іх пет же вх лІЙй «аванси пове паза шхММмо
С - ккаАМх ТУ «піт ЗвпаБ
ХА КАМИ ть ху тек
Маю 0 АТМ
КЛ фл тТнуекдо шов дк
Со чек пах
ОЙ я, т
МК г жк уже терези сви В ри Ко евиуикит, шив ІМ ФК пуф мм ух ух сис пгтгуУє й ОТ пехласчо пасчшсаоша плен ак АХ МКК ИНА М пове КЕН Фе «терФ Іс Ву копічені вх киває дико КІВ ва вий мал ВУВКІ ху пчаслаапчачи бзипедиЗа вламбвхтаФф зпшаххлахо МИшх пчЧчувиаш а еКртетаАх. АХ -к Сфочрив гвоцОоно г ин ух фу у ух дж фени Ки ж мок довж вихов. Тим п Чехазе копала УвЕдИТ ТИКИ ПИ Ех с Мамо Ж т пев Ще я мим у памгуємь піки В фам СВ пе щоку у фотку межи ях о похох пу ми МН: седан сзи вазон свсзсх спабахвивое пшспклзавх хвата звів киа «ЧУ ситах оіх ВОІВ МКК ххх са азаилестий піс вІпаААк ям ше ябщшороу є долу щонухту ці и супи о ех ке поковок мо жк цк Ман пи зазІ Фа чвавил пкіавииу І цаахзсчавс саиоовазХас За еКе То
Іди засасе паза сесветвахс азс ста уаво чолов зе пасопоюфиоЯ Сезозсвчас спадавучиЕ сек евацї кастаковаї бавзсеовсоу «БО зЕцсисозсоя часопис сапосзвссаУ завада саасв ексковасися звеаденвчах ЧИ злості ссчеа Звибоассако совсскевас засіках звсКгчессва абсвадапоц во тосаззчанво заховане скссспочай Заспзтдлам; ахакаовоцча кедах ЗБ заачччеся косвізаскз ства асіоєс саке захо викона ТЕО цосбоісваав: аззаакЕтаї пк гишВ ззапавсова ваті вовка 7 аІлакависх чо овсвки сезон а вза говвоавеи хвааавове Я цеЕкстЕсх ілі наосва зчівесоївоУ совет сс аоцвоас волоса Зп кичсізсова засаслоса соссуховаве аасксстехоч авкссзеаєу сеаставахо зу ссовсгаазсай злазвосвісьа авккссалакх сви осазає пссзассвих Ева ОКИ АЕС тссатаєстлх совок есе тастк сЕстеЕоЕКЕ схосасстахе тавбокееоео 15 шко ах лоти соті сстЕї спро СтеКЕсЕКеК соссоА 1148 чтсоссоазссв ЗоссаинУ сппсзкоосе асссЕлЕоє Ззоссосасдес чоЗетеооцЕ їжи чочикоовво севесвео сосзасосЗзо зевозивса сзсастевосу ачивочаио ТЕ вгспчасзаах зов сасеат спосо зосКтвзцемво ашастевач зво 1588 зкзвишитми ссашетшкшов аайхоиуетои своешоеткщо Заст фол Мо чисувазаве смхжшазвасх спажкасхУні сеиМнавзвс азачсосяа аа ОЧКсее 1458 зіварічав ваївсмжов еассзавачи аваавезова кового авоашисою МО й : : : яких чктсссстхмх азіселЕсао хлевастс стос смог ос хастлоскез і550
Верхи зидасштноа сиди си фу пут вар вода та маму МК УК ЕК й МАМ КАЄ Ме Кк КО МКК Тихе КК Ки хо чисвассссва зосбслсцосео ссокосксева босі тастога Зссосзосеи пев сиоваву ївО зісподу на споесорощи сасазцосомс асипсктм зоспелдтчесих зош я іт55 ципксомоас соцечискак десассвичу восасцоав суда вовосецєх ЕЯо щасизсзавза соспочслосах ссосесоссава асоцоєкскоєх соссзалищису сша ї855 закишсосачсс Зк: алезсдвоааш задвацеачов чаавгацаик кксстВЕцоя їЗио завлзиватет заааваиЕес ЗЕ сокамствеає засос Кс я їз ззассзайає сопедеювота я п хр «КАХ ТЕ «ері уд кА ие зх пек «ші дих я ло сект ма жом БІДУ «ЯМ та тюки В густу ог В уриеуию сгусфулах В гц оту км сви ішух ЖІ див о смт ЩО песасцзаслоа кута осї засос возва баздазвчатє скла кх свктченикЕ зи кр и худ судоми фр в в ха муч ВУ КИ дичних иа уд дивани хтЕЕх сЕсККУуваЩе сахсогзасвЕ асокстожосо вікабасовах садок васевсвсєку ТЕ доп в М фу щощ о су мод уж дня и ко фе грунт уж сх мм ох мом йо моцоужуєЄ Моє М вуж у «кх «аткжкслаа вес икЕсЕс сспсКстасшкх зпзстязвла висссваєтову пок КККутх МО аджику поді вп Божик о цк щи пк ВВ дм звзичсниа пами кацат авпасухзвава птавокадк давача засо акааах «щи дуги и проду ю тує па подив дит ча авиекаеиа суки пт свист слеса зав свка ас ЕнавтапоОосв зеахакитетв сатопвавнх КА док о вдову коп ря оф ра М о ді ве жири днк їй заскзаасие зи піазкає спаззвзееКс ешЕксчанвнкакЕ векотакос Ббозваааєеа ЗЕ
Фо можут и ЩО (Ауді но фо моду п и НН НН ас зІвехетає соствзвошанс сЕвостоваа зсожоЗроав ах ишаа сопе ам пса км ки жа можу М ді Мозок Води дич діт пев щі частівки я вето спосо Слссасози хЗайациасах ачвваажия ж пе НН НН и В НА В чай ттлачкс Зоспоичсака сосслеіапосса сосках асавооссвас сша зЗЯс ин НН В ТІ ствазаззоотл заз ави чо с асиахвоссв стсталоспсав чапооссавоє КО п кап чпапсзнайии Фреска поадестн чеоксасивак спос зазчи пада ше
Кефір гг дити Мотрі вові мечі Мезим КЕ вив і за
ЧК ока цоисвляачое спомин сива тевосацюии пиши іх че чОше азисемета спочплимшас а сазана вегавие со КО ТО щОо ТМ век ти вача. ЩЕ ск ве су
ОлОАХЕМ КА «Вії» 1185 «Ві» нцЕ
КЕ Я ЖМКУ ет ах вОекави т айитщвнтгої пспосаїващ птн датам кеіпадайсвкс пвспиВвевх ка зику чес зеа шен вечкеуЄ шах сивина М ПО
Коси о св вд оці о вним ВІ Коцуоу шві щуку кКиу ик Иие сві ззавсвуих сова пжекпоскеви МазкваакиКш псзаавокка пеВЕКеесх Вк гоп дов ут вуж ху Вуж учи г уч см ск цих мом еу ж сим Фу орвизи и тим вве зд
ШИК шт поши хоаслІзасв звело: запи нНЕ о А АЮ
Фо Мир все де фе у пучки село диктує в жі зх як ІК ох тд ид и ур тих "ах живичсІ у се гтпиовоа ар чізза апеаасвиса зажфакопасх часи чи и НН НН и НН и НН НН злу хтвазосале пахаичессс вес х зчсазсгсоса звуасвикКа соосцРаче о пвх зіву во дур кокон не воесуй КІВ дохо лужок хі лаг пшкицх паса пиасазтскх вузмавокио ска вкаоав У їУ хзавассшаЗ вузах ТК туге и жо ви ту лух пут пЕсдикив ах йо чеМ грим ово пл зсавазасем чис птахтвсцлав згсЗзпсави свист зЗзсасваоах км прий куски сода і Кору и скул о УЖ вх кер в ака чзакспросавцу сасчсавхкоалеа васозлацекс бич альчо почав сшю шко З кв В НН В и «ду
СІ ачккаац псваичсаФс Валяння со ссда чвостзвозча запаси --
засслнавоха посесаосташ дбала сх поема сдесетавоо плавав ім іс уєчику жу гК лев рою о сьо они рифу М жири новим тКмтх Кун гргу т чай чис ив гвавпсаавае азвешовІхньУ мОссеаоесє «садова шо васкя зе захис пат люто ях ил яд и щи дя ту ик утри вк чі Кер моих я ТЕТ зом Іца МИ зпизайссевна щастю сфе сортах сто Ка сера не івгх тус мі вину сук уж утіх честі дин В Ку Жчюетюц гий тий спешсоасвоа апипоасезса ззошоипвака соус с зсисеко Хапеаою МО застуд педа кІн аплоидпиася госпицтсмдЕх світ свиси ства Зап спе Чен: вочоаиая ЧоисечИслх «вав сова ни «екв ху ст щити СВІЖИМ ІЗІВиск іх спуУтУуЙ СЕ хо Ух часа жо кому адл алі тика ах сеео зала сщие жов аектя спасе пасфіцуатАт ОК ев імя ск ці у евихии демо щи Ус дове ог ВУ ЮК ту то ЧЕ аа час шепзаствачес сопе тав лає зсвзу всовчавдаззаа випа шо фот сті пови се курми дет дев семеро в пиву пі лавснкх пасззчаткоа Факт сс вачсснвасчов зорово «св каия ОКО кн ни о ни м се под ди готи ол щ Мт дитин іч У хоч квсоисс всстсавасств зчапассвас сіимослксв сзвастсатах сспеохеаКоюо че
У язки сх ур гуру сти КІ рев Фо Між мом ж що уже тих тай «ЗЕ осасо сахоачссвас сви тоєх пежнвинжлю сосках своасца іо дома и кі кві ци за викла м пока х Ки
ЩО а «вів ЗЛУ шо пі чаї ДУЄ ее Ша сти спон хх ех Еш ша ках 4 є дик вока заз акти мк кхдкак сил ча ки сх вкх пи да свое ста зоасвксава ета зІта догазазиади зага хтслсаа пахви щу дес х сут мох У докір в ик діода КО заявлених с кв код їз чизааавзаа аоаазвУтав піших раскслоав сазвкашиаеве соКосисткас сука кю дов ул и юук еитМ мижи важити чі теж ом бі м сети их ух уки М заавсстІс паз алев сптаврослап паїспаївчца асо сдктенІйе мя їі стелу ут жор тот В ро (ох рих с Карр М ик ВК заз чшсивстеао лу в Чиста За ж є сесааса псих писати Ме ЗМ ет АТІКА мч их Корок уми хору нує ОК мк пре зай чийого аспиччаоею ше сисрх кас мИпшцм сти еко ХХ ж пи ту тиву жит луйтивузучік их фут ви у пу и шк тки уки ниж ку НІКИ УЙ зЗщц касетах совшссеос шоком ше ТКА шик Ах КУ шу їчю сша овла шолстасйяосчов'сзаскУлеся взивсоваааа воски АЖ екол чаю фо ому ЄВ В хх зала щеим сиве кагуд ше Кг путех дим ДОК Ом дит ух ОЯХ ск ізсовз авосвавноист сосок азая в їссавіхку аспктдакитта зЕтасуєац УМ пік дог зливи вок кахидх сист муч о тд 548 заскассазах звззачаксї авЗкивзиай Зевса оче вевисолавВе КН серб рам Бош роо смоли сло сем пасив кала
МррШУ ри поси мр уко ФУ ср оско ІМ мвиа аа МУ стер ох (Ту и сему ІКОН че сек жуки к и Е г чести чис Є сера сасв сс но часи хаос су проте и жу ву гфтми щих пом й моги сушки Кури ж и ик изу и В тла зашити слслессакт споосчастовосоа смт сс БИ ихова сс Бк якби фо фу и ОЕМ Км дах ом и в ку уж ому юс гук жати те чолов спиш КЕКВ асп теико Сихів таса папа М срожозууруіх стр Угри тт т ие УК М уп проміж мч ні Кі овоцоВ заг пзисчезпис сосен чпасвссзсає взаасалоола васлазечаЄ посввечхка кю павсжесіке сссчвусста зкссзуасно: зазввааісо ссср соуо зсссосакує що сзихтчкчка стос ицовУу зло цеваавзсзаств ас ссккаа пек за чеастаєстя сствізкзев пбваетавсає збсабопаотв зеасавносста сававстває іо хасувуататл паклстсвзко безос ишЕ сис дохезсовоя сомровеча Ме свеспсвеасх зеавваиаккх стадо скали лажи МАшивосксосВ діва сааих 1145 звацававихт шстковасзтва сеасЗісфасс акзчсваовецче зворот бохо кхую ї30О чек котв пісоВкЕчка сісасвекоЗ Каскссавзих доасзсачсаєс завис ТБ зпотттачає спесавзксск Факс пхба зЗаавссчв спзваасвих «сссабадаоя РЕ тщаевоатапо Чопесазвоші зсавссзасу заскнтіззза звасазаоад зайвий ІБ звипзсоважс зпазізсаза авзвсаахчас саававкасац сваха сцени щяао
Чсзавусувся азвачазаала паза ассіоюо сосок Оосс бас асава ТМ
Басеазаашив посзачкчопсос сво оса ке 155 си» От саїх яЧІ «іш дНЕ «233» бжуха закута «ащоВ ту
Іпчазассас сао: звувзаздазалч опо оаЗ ссавзасава авсзеаажонча 5 чассозссосза Совааазкоув Фазсоессвяк свеазаеках хаїдназува захи їй з'ємавецчшкя дсмсоевазся звасскесюе Ктлокайнта Ева кі КЕ 185 тик згса пшипслапаєту бсвикКшзК вичавки сесевзачке ахкепиКке кю почазазсасви ахоикезнЕх пазах жкзазекоще тс задіяна КН засо вх зазваесаїи: сппвзоваав сссврасзоМ авЕкіаасчї вас скщах 52 зазчзеїакеи ахссвацсза асостсвова сцазсвагав савчцактазвза вЕвиОеоє зи сгосЗссаствоа сусевазаа кесопістза базааасзааа зпасаВвеаст чзфалеіснава о сзистводавй засвзвсосох авазїссіа вадцоссаавац басптабсосво звивин ВЕ зазчсссазсс сзаопсосвасое сазсссватс сасстсосввчєо свачссаєсея засвоює БО хапасвоссю ососовотатцеяа сопе Косослатєє тупо пев вай О аавазазазоа авцчаавазавв зузвааазавз вевзасавЗос зпачаксс сно ТЕО подчавасто фаду зов фас Ффессксеоке сусла тво їзазвосчесес севосзссве сао басвка соссеоссско сшсусссвасо собсоаалхо Я х 4 х. А кг «Кх кю ЗВ корт туге «пі РАХ хх те шале АЙ слиз гри в шо окт хви МЕЖ пакЕки «Во» 76 пед ект ий им фо их дуть хутори Се пре дер кіз и ож мому пиво і» со
ШехнивсЗ сСосеїахзиї кзЗазвецаза чЧоимКннатеач сссгвваках зас а Вч задасивсск зва авокУу азазозссво гійазчазчахЗ дівтавнцивза звевассзнЕа їжО пе оп омовомуте Ка дви ис су дур ковка ОК р дл как дов фуд хх аЕкнааачиМкоа зсссвзадчея завів шх сЕссвств Какао х датах ік годи я Фо г р звати упо ко кочі м «ку жук ж сь дожіии хи о сю жУ тідсоочІвс ссЕЗаївео паст Еекака гузесісеуи вБтавеЕвта сісосаа 248 фетр лу у ри веди к ую е шен ее яка щеик мим кет вад два ця сзззазкзсов касета бакт сазчссоцс сссзвассеЯ сс ко сзаасвсача щі зму т дн юю «ков ув ою хід щлУхі сич цу уж ків ж цк е них Ех зачати ока савасавласви скІМавзваай воссевіеКИс павипуцасе ване 5 ух судо Ук ус екери у лю г ж ик лу фор хуя Уж моли Ко полю йо у ди ки лу їавзвагвкеа Їзвиіссазцася застосо псьасизна зреадакиав Фавст ки кими ку скеехІ Кчи в сх Се аю фо р хх лу окопу м лм ІК моих ум лі щі пессекИисая човна с кІшстао сааззлавна сасвасска пзоосваеаєх ве тую щачсу хоч крик коки ховгк мив ох путі ту фрі чв фое виихщоя тай зЕткасвзай зпдалоссьа аациіссиваа Зоссвазао ставока пп зчи зссбдониов лав міс деХнллидя ЗМ сЕнхгсую зов мІНнї дав пшХ Її Кл чесне аеискаанисв ВС еКмиа собосажквиа зисаасичше чекає шу годе іму декор Ви БК гуде Ер у ТАКО свт а в ще ак павиасии шосе КО ца х «ЗЕ «опи чсм пам пе Кос авиставанина сот суми і скит вх хз мок міо мом ртуті пічих Ковчи їх хек ур ТУ ааззалаиза: ацейдазаайа плазаачача вавесашеесла касет се е та зу КВ еп сх рим У сажі нор он и а пев зу м т тут, папа «спазм сао сало схе скоса 5 подиху ок ту вичизиюи ом фо рі ще титани ичит живи шифру зити и думи мотив їх зеасстмних піс миайека саше м КИ Бщемс сесисвасиос попивчанвцока че тезу уєи ор смути и в умо увутих Же еї І груерИИИЮ сч иууу зп ше Саша МКУ КНЕУ ХЛІ КИ КК ОН сп У сим чи пкт тт нки ке ук ІМ Дуо ер и мя и КВ и МО мекв в ТУ
СЕМ саме чу взвосвзспссови семи боки сс сто ПУ Тх Зв поЯ Я утиийк ву и пуф их в и ужту ми ку уми про и в кв тр, пуфики т ук прожитий ств дн Золя кр сяечу миро осщшає стсколосьї зЗгазуккез зоадизеаспади свого ко п премії чи са вежі У тиву ВО дм виру фр ик він Ж учи Качур тв зх чсесивчассоо ппсссспоЗа сузасчак сосотику ЗК госпо Мт ікси уже учити офі у еру су тещу Ви ут ЖК сугігту у зх поса паза сосоудаичоа часа сс посуха АЗИ пох сті ке долу фут двух мя дроту ри моги єм дих меж зах ср авапавсхктози сеахпстазвзаєс веззчасизца зп ай воза маса 120 кре ху жу соком ко МО фо ухи р ик КУ ме лу и дозувати ія лит загс тзтахЕ ската ссзскоаста сіло лсанис боззасчечс кача їкБи ; : : : ; ; ; ; : що з тд вки к вка ВЕК ацет пика цикиВ мекв диву кике аа тс с кара лово закссавасє соссасаше чес х ак ем ідо «стеарат плода пен вснуми прис м Ендо ев 1352 есе кеуакоУ чичасавакоа сектори сажа кечсаЗОас ках ЩІ АЗше сте т чожауть аВптепшсаЯазЗцта та ее
«ВМх ті «Іво та У
Уся хм «км ФІДАУ шу й хе рід кт ака сх уха віха г ке кам тео ух читу пед вивих рек цу щи ую вро чт ще дики акт ща засос звсслссвочс скзовссает кепки ссеесапекх вечх КК ще фору МО ве м жсзсх ци СМ й отити фот вує утіх их цу сУж ий приріст у ді Ки ту атаки сиеє сиг ваавчше Кескзечии блоки сеш поскачессва стано ак че ік
Фо у имя пи жук у у ОО сус тс мох рижики жк хх п моду суєту пп зикКазсаваслиЕ асом ас их ласаавивх поза вкчсве свувасаана зво нмех Ам сит кутю оо Кт оо вжи оре м си вк пдв ру сс т часом поставав Капесмик са щЕхО СА Кл лих чЧавикахича ям хучсзлсівс звс«аввсва ззаваеаиев хзсгасасво сетЕссвоса вових а как т ом хво Ат гомо жм Квас ож коти см ов К ДО Бе зим кістках Чвакеазааа кпк чао вас зоаи пшзаасеаиеХ есе аю - сект . «кції уп мату нею Ох вечору дО зчкзазгкате базбазссіва абсастатсавас стшосЕкиакв сестро вузол КО пед дон по пресу ин іму му в усу що се В очи ск Мних втіх щоку жо оц, Еш сешкІвсптасти зп ше Фокс сахв здсачшоацх пис ЗЛИМ МІ док похо холу ох уче дія дим кв ін колу ю оком з еункв доро гою хе Ат задаззаастис длапопасезИи зковишсис бавзиачива авкчаханав пеВИишавКх Бе кеди зад г хв УЮ Жфлемчию со кох в Моз вве КК дог тт сівзаеваайа савадазаасх Сезон а зак авКах колоса часа ШУ хи щоку ж Вико дже и ми преж м кю уж с Ким но М КВ в оехии яв ших задаазиачаце зчазвлеска спол запи олеа виЗопасевай БТ ХХ 5 і. ит уж чек фі ух мих и о Ух свопуттитетіМ доме иу их фр оизилу Я їз г що дет ух ою ух ут ТЕТУ
Мр риМмЕли (сс иваа вай асо пек оспахкоє ап тки фот кс яю У жа ПАМ З ЯКЕ я тру «ІІ хх я срх та «Щі» 145 «тим ДИКЕ ех гірких Фподет ха ка шив шщЕХка
Ту о
ЖОВ 1
Жов оц их жк жов В ЙО ОК мор а в мо ужує смію орМ вих св що Можу рен ДОВ К их у ДІ їейзааацеяч ставав тху папи спав КІ ко вВичсвишиаа ЗХ ОМИО 5е ож фури жим жожа им ин йо УА М у В Вони пороки яті ун в уєють я уч хи муч ах Рг корі сосиски се виавааВихил пас ссва шатах о вас як сеча жодош о АФ рв рних ст чий «чсспссЕзаах посла сла А «шах «паї» ВІ т, тлу хАЖХ КУТ ВАТУ
БТ вхрУс мсУзалЕи пвАтвиХ жЖапустх сен 78 спи уч чивлу и ву лускою вок х дехто жо езитукт х пет живи ЛУК Муз и рю ог шелак апоастюиа зсеваво;ччоа ашаптоссшая онко ак моВКтУ пе
УЖ рю ди и бум ім же ов гр Ум У ох ФУ ія м о МоЖІЖ м оці фути у дуети. Я ї3 «ствассвесот пипвоипиви ши авакя почзазааах аа Фе ло знедолені стелях соттитуцін М зд сакезкіщсо атззадзаай ппссакосзек чЧаззаслиит сина счі сУучетосава зим и крутих рев саме ІЖ за хг пеки сирій вед аг чпавеспавсссст пасссвсва часами Заавзизавоа зоре свао сапки А сира вих соми мокрих дж ми ду Ж орки р дви сфлу иа луу моижуУм УЖ утри их хо квт пт зазосзазчзсозЗз акттчас аа ос ссочат ЗУвопазехто звосозвачоае часвиссома Я питан фу ми у ролу такой р кети діви вих ів и до мж футболу ур Іти те зм вав сосса дабсшсовикоа сстадекаси вБобосзсЕис болечавчає зо овзаад зву г зер хуиниУ и вуж щі ие ик вики гущу піти кі Вод и НК чвари постасаваєа совисаскас Чагаавозчав зепйссавстоє сзааЧашее М посочсодасеа чепчбслюса еасмізасм ссвоссвоза здав ах чзаваазшлав ЗМ п'я тих, Я кит у паж ки ий и в зрив ди срср у но й и й ВО хм ну и ик В зуоврии в т и ЩО: завсечсссай спсастолсекс адечстанвика часте соко асо єсас поалсдеа о уж ту узи люд люющ отих ца и в ет и ол и нате у шу лу цу о пуитох пуд ок ек ія ШИХ
Чала звемо ха сескбс)повза Засспуресх стахтзівало валове ую го Я хг че дат пахова «а Ак и хх пк жд У «міх ві «їй хи тА КВ Х
Тим ол іп з и и зх А ЗИ КАЛ УТА ТММ Я, «ях БЕ зчсдлпзостош гаїтаксипв слав саван ЕЕ апзсвога й теж ву у й Тх висадватее траскексияє дети єаИ спайвтшсчшис скаче ЗИСК ХА тв кою охо дощове сутки серії скине дуби КЕЙ фев Вр ян чапсасанст пазазаеава всоссвосах сеасссашо фс сорок ова їх зчашкчавах сзісассвака косвосасао сасчУсаивох азс Кехе сову слоя ії тевзоапспилзиссл засипає скоса песЕЗимати тзапастш пис ск
Зчзвочувн зсалплоевзое саке стежка сарана кока У три озтте зиму июОтм мо іжсвк скиту ую мух смужку щі жи уко лм чЕсоассво безос поапевсочк сщсемииН шесоркаоаю оре КО роко пдв км Мекка х слу ее ДВ ВК чт Кі зи кассосслаз аашестоско сссбізазсав садисасвлтя сваашевее зо акксов ЗО тм ву хо паж жо и ду фо Ежена вк улозМіжутих Міхов око о пу угор о с хе звиазааоглпта опа штшаке чи скора сова шкох впав сто а ке ко оучиіи фетр етно БК опи ми зичу хна види а -Еказеци сонпствозява сссзаестаєс вссаасезчс чезсзачоза апоовссвоє зви пре сежооутуУ сети отиті ди уедуєитуємУ діт ГУ Ди духу Ии В кри оф жуки ур А
Чисазвцесва севазсасовач савоасиассста засос апшосс мачо пичч ха. За мебссадсо безстезсва аскетодосс бос обов вос асспсивосе «а рута КО че ре уфуєтчя г осхсоере Вк іт цукр ей верх жи ду ке піз ша:
ЗО КК сова котлом пері лиик Фени ста Пе КО ща збагсосозай зпедепцпеус пізуацовоЯ спссоспосі сксвоаспос асвЗавссой 12 тоди ри В о мив колу тири рр оитиа и; СТИК М ниж и уходу ходу ютик ДМ ик зику "КЕ саксоаоскся супсаседеє зпсзосчасооя Чоакшсскес сеоасоашто шоссе осНЕ м шиспссшши счсшлсочссак шйасвавиае сепсис валки пошасве а; «ІМ ві «ТІ» 847 миска па
Жди ДК их ки іж щогмі зхх «ак ха пайок
«або» В звіссзавава ЧІвтстлоас пре ххснс есувасіве савкасазозч азвоч их щ азззіаіваав стазвеска касзичаас зЗєстчзасзас: возвайсесую задавав 1хО тес сассия шесуацт в ввЕспососв в засада впхпесхезса пива ютеух Її тикхсектладе васгквадфевь дааеаствеа гово гошо ставав саквсвоКх «чо хека гоа азів папа во созгазкеч себевааии бос хчавва МН зазазасскк состацссЗав сесвзавоуочх ававзачазвх вис иМх зевааваавах ї155 зцеааслеавсв паскскоузас часова заасегчаво аовозаєивк вивела їди азс зса соч ввнах сасвоцісвеІ свавачасва шоКівососсв Коста яко каска сїва ссозаатасай сксасклаш тезах аксєтиккс засво еою ай зацетассіа сосасвсаєЕ бЕЗЕпесеаї Зк сче зчазецсаєм спксаакВсв що сс содасха збоазсвоаеи козака ссв «кози свебвезсї зуФивчсва вк вкпсазаттс аа лоа споиаксвомна ассвисстке асвесвюоса взевсапеааз Ж закхтавсхсов сепаавкацев сова зпвейєдпагию зе ьк береже та звазазагвна савхизеє сочсососс сеспсеатико сезкахкоцче смеоасвоов о зсвасзпаче запи чсспас влавсвасоє зсазваедвахс аа вас зач зо кавуб сс садом в возив Ес пІодя папа па
АПК МУК ІМУ ТИХІ М т ки хе хж Межа мО МАМУ ХУкуМеМ МХА ТИ МУ «а я «а1ім ТІ «тій» ДЕЕ «кі3з Каиудквовірус моваіки МіхвБі1ї «ЧИ» ВЕ кочазасса даавааакске сабсзавовав сазгесаззї аволаскває заакЕЧастя Бо зпамснитат сло клзах ваза зайвим свав звовзавахс авЕблахоуєстах їхО заст ичи сдппшассето зщосакечі а Завсвссае Хтсоассасов Засатсавиев Мн ссксвсе соіхоаззни аввоазіаахва секзеацак авнщзоза зпсасевека а звасасиннви очі свазви сопажавзвзий Засрив сафепасека знав Зо чпрчвалпсс бпосстссасї задвавакка заливки сіМММвкОаЧЄ спосо сю 35 аскзастсай садова сазочасше оавейхзастає зацпоасаао зовано Ей «савзаахкЕ сектаївзсоав зпавозсава бозааапзва здавала с падасоавя З пизчавіосза вабсзвзавазес Завеаслтавеа бика сБшссрасих есе коєаах За
: : : : ; хх комоди іх домів коди дет щи ем тиккте пхати В дл звасвспі вх асзіскдзек ввксазсстоас Св ЕКаХ ета ачсовеакаВу ВУ уже пунаю я в тим ж ут вт мів вик хх йо СКК НН кіз цу водо дод кит ша зізвзистукай шо шах пек павзвов Тв - ака ЗК Ки пак зак акі асаниішанії зії авсасв Зсахксссак вазвосазис пкнассееКаи Ж зх «І ТА «зі й 33 «ЕМВ ша шу х «що
ЕН Я Зх п пу хром 0 ВМЗХх ноу те, ач НН век и зони мя дике кА и лауслимовивух шлсогажичетвоМм пішки врахисв є Дт пох «ОК» шо при туи тешик ОВо м ам ро я м и ни НН Фк Ії «етаспачапак копав ФшвичешхІ совок ес хХ Самих БУ ше хі хо их ці ча сід до ді Бору о уки м гуд я пі хх записав авзвсеславах залів пеаавспсавахтв атлцнММм зво «М сек копит зга мої ох хат цілих із ри дещо хг стласопислтах пасцеавнакай белавуосу зичаасстьо поз окс вааасивкмх ІВ тех м КМ ох ком фі иміхту Мк кт по Жуков кожи сему іжж у хутрі За птн ататє сиза еко айиЕ бмосасиваа хаос ЯвсшишоВЕ км пхизуму юки Мох дом мВ по яву м у офсет ес щи щомогю у єх моих шу ше лшс сах зааУуаа и МХ М касової сао слоа ч заданих о свккічаост восаскжлвиа «деиствавза азвсчазноеї зсаакекех ОКХ каміх я «Ек вах корти МУ сткш ДЕК ек демо з ек ду «и 0 БИК ТМІх ХМ «4005 Ва тт Же ри я Моця трів р кеВ ж у до сасксссавса сгписаїцч псолодеачавос Фрмеадаце вс айтито сови ви встав спсжащнсва планети спа олає саопипессв певне 12 ся хлів соми цмеє шия уко ЕІ КА ЕК ОрІКАШ Ки ХХ
Вип МОМ КОХ птиоа Я У шасюк ШК їх щи ФФомацчеа Ва МЕМ ст гжуч в ррінич аю кт Баг Ус интуут ех у сут тити ситим их рює стер хай саше дівоча сезсочсеао сеаеассатисю Яососеет специ кяй піни лу у жи фу ужити ик фосфату пф куки жо шжизии В гу гущу три и ух г писала сосок сис м со о спзчсаЗо апвочзос МіО сбщиктсмьа хичспвисляЄ «сс рило песпцичч чисто се прита г ит ох жа В ою ию й х рижики во и уми Ж ужив г Можете и й чес вола саспескес пада пчерсапсасми ми рминВІ сира пи пи жуєюих жу фот су жи Й ужив уверх и и и їщл спосФтскчоВ пспосвус ап есЕОош що в ДІМ Х ЦИМИ сли Б прачфа ад питаю у шир ск ожив ик пи чужа ки у Кекс и и порож ук ик х тай чести срмрІаснаВЕОЯ ПІКІВ пес пчссроа сти ваное Керн Я апелотсотсІйи цавипнапдосс стоком песто соска Бе сошоц МИ висот ай алао сито си ов шана кжшпуюи зи ї ї г с 5 є ще я ТО ОГх форту усоутчком му твивітУь муки дер в сих и ДК МКК луги щи секс иа сис восоаЗи сис сотии Ваза КЕкИиа попав списи ЗУ запаска сиві заволаткат сере пай осцаитІ сири игра лап занос счалазавБо звізавикЯє спУуссачизак свиечеасхм схо Но цеспзаздеси ззазсасадо касівосоазая аЯзКкссссаа зпасазосто сошавовкеє ЩО чезсвасів сівсссвосЯ спсстацат собаче чес левом зосссасе я йодчасесово поз кавос вІсстескає заовстеаса соєву зве З скзаувозцеза шо осст Чо ЧоссоЯ оперує овЕдолеео есе зво чоасинтсвщи зола сесоксоя засозпссук взозвУч сокатасояс дозах іпао асосзвцсозеса одЧазлнопе сопе осо еНбо осссозеосшач пато ФфІвоя 10 їтзсозоассзос сосен постарше Фчасапташоис час свсо сао со сх 1145 ксабдсусие сасапсядеуєс савстассяся соуси сстз сапчсвовВс ЗоскеоВени їж шткчуєсЕомс позовна Фпосашесс зоачадусозе печене асосшецєннад БІО шрапеціачие Фумоавазсоя завоює еазвоосоко сокіІосу зар оснх іо желе гсео ссовицпеюмь спосо ше коцсоє совно: Зпспчасвио її зчасобасоц чесоспме опе поовах жо КЗшспоепсах сесопеа бат ія касзсочастз зососкасотенє сестаствої Фастов стіасптвасЯ всжвооцсяав іщк ззатастестає зсаІкаскЕ їспакавсава ваїзеасвавУу саме Фпос сесозгерно АБО сілежстхтоу спосте савстчсуко сеФфаїсспсає Естабесоох тсводасов ваги кичасзеассє збссвзаїєаке собасаха іа ій КЗ «Ії па «вій» дик «мій ЗежоМив Місті кап» ЕЕ зкчесЗгсссх садчавзозаса взечссвосв свассксокоас сів свасвУ свое во авдодпазсяй ссдзодоосах евозоссазо воссочос спос есик сетесомиМо МО сесайпкосста іссовоапах спассосове зсгссаско зезацейезче засос і85 засос сзсдавосссва давсссопосо ссассссео оасосасвса зазОаошсе чо «кстдвссстосф сичсузачеє дова осо чрочсаася кача зсеаУо 305 завссштенсоу пепсфоуся спосо саше пачеое сопсесаеас зводевоч Бо хЕслюссвсоЯ спос очаез псацоскорас песо сичя пеоспесоссс часопис кВ спасти бохлосдшасе ппсдпцатс Фасад епос ся спосо 85 встсоасюшесоо зчкасасцає; сбФфізсасаес паса сзсбаачиЕ ссссмазваи 45 зазассостчє песопоченк псасипвичає демо серии поасевомі пий да и жи их и п це ваевІчикцдауручь ще фе бомхсчмвгрдія сук димі щи вссичсвис СОУ ся аа кпсспочщев «Качан шко пса ТИМ мита удіуУ хитка суду чу відки пд етику піти Е ср ІЗ ад ззоасзиачІ зчшЕчрсЗОок сдвсаваосесч пече кс зашагек ек БА стерти мух стече жи хів осо БІВ У пав щи дя зай при. пе овщах ке ерероюнеии ІК Кущ хро и УМ шо їди У дети и ки Уж Ву пж чужих узи ВІВ жиих сажу ми ж іжеиих ки у ери пат посзсоссалос пудавчассазча почЧовизссо расова с сесастца пі аєиу пах мем оирхеУу це нт рик рису м усу тую В тити сісчужтх птуя хи КІ КІВ сет стро ЕК ст піаккномох схили хичсеичИх ЗУчекощаи тех евия срок о пихи и уже уже их и 0 діжу т ем же пі пизжукг ох ж ж Ід УЄтуУМ МН шсерлжлискаимл слот аФлалсвк деталивасв сшсраиуВе «а на ЖЖиХ непу снпадсв песни папки пассдемні бер озвасся пізсвпивку ЗА пичссспааср часа чрапаа печемо пасцвинеКР оса чвасва ІЧ са кКу МАЮ ; ; щи ша ; «шо суржик ми ферми ВОМ НО ер хи (Укази хе м ити пуу ери Кожух туге тки С сини Жак ЕКек ссЕпесчслюс спофашиасх зов Кесте ще ко ММ пору уУчет о ис ивуну Ку ивдих КфіІкцучейв им серии ох рем В милу их 1л4п зиасапсхова сасесчизоуа певисоодас ббовосооЗ ссцасостове чочесооВс Ааю му жому ху усу сесію міх У ахеу ми умію изухумау аю гу ав и иху ух пт павчсФосне всхосЧуссча сепспонпасл пбоцеаснне сивим зиск «ОО у нн в ЕН НЯ яка чассеапцкос мачсксидоЗ чем сопи сис ивосх З іякча
ЛЮТ ку, ФО
ЖД З т дя «Ії БУ коки оту «кіт КЛК ех Фк вера іх «ЕІ МЕ ХІма шРК ОХ
МТУ зд
ЗМ МК мак Ух нн УТ ук у мм ША у ку юн Ку ха зи ож дюни дм о М же
Мас шах Зек шо тай вк АВ б ВХ вів їм Бк збе Жух пеЖЕ ЙДИ 1 х їй 1Е
А З 5 Ах сук о бух бок ДІ с мм» ой й Мі В стік Мих блаух йо За б Шк пек бек ех мів їх з вкл віз діа Аїд бек Ме й г Алла цех ще ЕКО "зт сук зх
М Б їх
М учи й кам т овзк Ж Тс ху У ЖЖ ТМ, ще Тюхин Фах фу блю жк
Міа Ехо Ехо Сер їмо Гео дхз бів бле дих хо Хех вхо йех ба вже
З 3 й ву лий Я
Й КЕ Я ож Фан хі кі ЗУ Ух тн іа вх іа М Му де ТМ б в аа Ко пі вза від Зо ву вав Мая ад Зах ЕТЖ ВОЮ АКО ХО лк ду шх ке о ВУ ЯН пл, їх ту то ті тки ре Тіни їУМет Таб П'зекж Жекх А хи ля У до є зав 'кжЖО Був ха КВ БА КЖО Кмит п ЗУБ О еЖО МмажЖ сх БА мав пх вх та та ви
Ме і: МУ хе ет Між Маки то Мою Ух т шумі ЖУжуЮ ку ден АЛ З цу щі їз іх ги хлх сх БьщЩ в ЗАМ СЕМ жа ЖВА КЕ УА УК пн о звХ вах Жх щу щі з ее же ШО ох ето йеу Мі цу й вл ті т Жету йом вл дк Ж хо гії дл мВ Аа два бах Бер оАка вія щі пев вхо Аж Аа вва дів сАв Ух чом з тк зх ме КМУ МАМ
Зв мк хх сок чних молі ММох ба їі ад сук сіл Між сх во ож ок ОЕшЖ МАЙ ОЮВИ МАВ о У БХХА глФ оїАМ жЗВА шо АЮ ЕМ ОХ
Уч В ки зх
ММ іш їж
Іх-у ау зу Мо тиху й ма но ух хх іх ВТ дж тот. ДУ ТУе чаї Ази Вів Аза Хом іУу Ак ліз йів Бей ВзроБіу Ада лек Адев о Бе з А ТУ дай
О.О хх Ми шим яхт ЄЖизіх фжхх бах Міг джу Тлумх пїх; м М до уч Ще 0 ок: М
ЖОВ оахи мезо бю Бе йів бжю мя АФ Ах впав пику с УМ КО зу за5 Іо 155 ї5О
Ум хвщ бах і Чек тних пох й Мі Ві хи ву Бе й ше ох зп УВК ЖЕ БУ УК Ж пшех дів ьо ВІВ АЮ ЗХ БЕК Дів Беж Кк Ук чех З Ук чи 15:55 ло го т, У Як Тухуь, Її дю ТІЛ 34 Км тов ІА мг жу ХК Мох, йо Сх М ЩІ х ка шив АЖ ЗУ мам ЯЛЖ МБО же КРБ слу ках МУ Ве жа ла МАВ. щи ме ха
Кк ДЖ КЛИМ дуг Тк хі ЗІ хі Мова бажахм фМіхтх СО фж Тлохе сиі боузя 47 ТІ ТеК Ххжах (ЗБ х ех Кто ах а ві мВ ЗУ г ОКАХ ху их мим о сАДЮ ХА МИМО КУЄ? «ги Б их
У І 205 рух бу Мур ря оку ЛЕ сх т хи бу тат зо Му о Такщо Щука зів ВІЗ МЕЖ пу Аж УВІ т Ук ші акЗ Тукх Су сх БУ В'ае мую о зад як Б ше кА ЕН тазу ох У ах бу лі Вдих ту жо Жора ЗТ ха дух У Уха і ух
ЕМ ек зиМм Ул дв Б сам вБжшМ мем оїАЦ ХМ ЛХ М АКМу хв М їкАМ ук мот дитух зах вки шлО 5 зяп фонд Із ж км о Жук о Му і ФМ їх 15 йо би бик Ж Мо ду
Акщ іх Тек ТУЮ Аху бів ББя Біне БА Ар о жежЖ Ахо Жах Ха мех ОЖхе зах хуй З кош «М хх тк ж «ух. дл с ж Щи у их г Ж ах Жду У ух буожсвя з Ж і я а МЛ ех п ле еко го акт Ву ма ка їі. хг Ла хо хо Ту та СИМ пужх Ваз Жук ТУК Рхо вхо Суз Бжо бід ВЕ б хо ТЕХ іа ЗУ ЖЕ
Защи зт7ще НИ ек хе СУ
Ток х Хе МА шт х Ва Фо, пи З Ж То; еф же я жом бл ТУ є Хо зу га Бій СОУ ВВ ЕКО Упе Ві Баб ТтВвх дів еч о бшщ о сап дз Ко х о лют, тк зи
ОХ яю ХУ «и лю их у то спр ЇЖА Ух щі фуд 1: МУР ії МЖіяенку дет бін хз 1 Уже чі с у ваАУу цем оса да жменя ЗВ ОошАУ за ЕМ Ов КО Ух Ах зй зав Зп
М С ВНУ
Бела буті із лов Мав са ті ам ти і дет се ших Мах Мі
Екс о хвх мУхО ма вав мах Ул АФ КВХ АФ зу ШКО УЛ БТ ТЕХ вав
ЗУ еуч «у хо ща я, Шо та чи о Ж окт «ех жк дм Ма Щи я хз хх М ух
Шеч ех АЗзп осі дз ТУх бух Же ж був во НІВ ле Іа хз) Уві ви тут ху чук щ, 1 ту 3 АХ ех нг поь Ох й Уже їх ок я Ух г. УК: То Стук: Жлжтах, Мох, Ох хз Щів щи Вже ях ПІАХО бах АТ зе ЮКмз їЗміх ма шко дк п тів ха спав оБМи АжЗ Ахлй пах ем йіа Же пз Бей оСуВ КО пхщ БО ке ди дит 1:83 345 Е сек донос кр дих ши до ху А мам дних и Ха суху
Аве» Ака УВх УА Вк Ехо РІЗ лів Зех Бек зі тТвжЖ вхо Ах ба тТух зУцщ р т мк «Ху З
У ж хо Чек т кук А один М охафа ху Мжеху КИ Члюяе УТ жи Уч лу ху я хо хропе Тйх беробіа АВК од Ме Ах Бу бля Зій вхч бів о тух деку пк зад
ТИ т5 ЗУ ж - пі мо доти ще пат КОХ вх ще нору Тех дує бЖаюю іш
Акоа вія дз Твх вто ТВ би Ав оАЛяЯ КВе ТБхХ Ак ЖЕробжна хеж Яїш хх той хх, па
ЗХ я Ж мо пік рек ав хе дід пів щіз хі ді Хід фут що тіу їхАЖ ХХ УВА ЖК БВ хьеПО шо ЗАЙ їхАВ БАФ Ж СУ лу 305 о ххх шої «віце КЗ сл зап «ях АЛМВОЮ тру ти
МЖК МмлХ шо сут че ар -вух «ТКА ХЛ ОХ «пох ВЗ соц учив Ки оку ер я чи туба ери мкс мох да шкасссасаиа бос осесачя копссовазаас чесвачаоеос ооо скоса. ви хе сі міт ІІІ Й мих полісу у УК еии злим зиск лаз ачев чис пише т спе ших їм
Фор ит у вими гу ихи ди ще них о се орди хи ув хе тиву ду т, З сИпшасои шоп шосе ОВО пошко УХА А ее и вн в, ВИ В В В тод списа шосх похо сект Ккочцоаалеяс ссаавцасшлс допо стаскс піп сюе «ще зсзводазас застосо асс ксзасслоза вчсса сс даспусачося З . - : - : ри пет путем КРІМ к их Ві; Іі івоиуи гер и р и ери оре В изочсва бзаосчаствес зпочзасас зчсЗосоЯсиЗо зпЗзсасацчцесо пен ує ваз іх ртиви чин тирі и вия соку В гу усу путремчтвиистЕ стружку Уж вир иохуеми шлІ чизпчассса соспшЕпсв сачзаса ПОЗОВУ ЗУ шк «І птВрпслозпе сини аск полоши спе спос айо папорІосо ВО р в в В и НВ НН «г пчсчишку спричи с поні сце саподнисця скла ода шум зопалу пезтзавЗас сСозппстипо ик ссволта соечеошшн сапки ши вечер в Вищі дич учету дисц тт сг Кот щи ал юшки шо ВИС вах ро САУ пе зппчакікат вЕсІвосаи секофлшнес оз лапскта че кашеск свое Не жо ут у и жоден іжує цк у совок ц призи Ехив ух хо ти "пий ахвІіхнт поч Фома вбахцчеатя бвхесахова Віхи КИм фах Іо
ДІЛІ УКХ тс еМмигужуУкМ и ж одусхучов ою ми уко Вмо сх Ку тк мВ гм тв ж ах зпизсалеаска паші свині золи чазав зчакопавоа ве сич ау скуфіу ем В сус Уж ЖІ Мих Мі мати ви жим ІК Ж их ери й щи ох ке ух ух у В у дл пзувисасзаа спос ечуУа ссузчосова ча посаопо песо сах павук х шМ ге сдуг оформ е с соку дути сс фр кущ щі «ау свзазтчакач сс ссакс ВЕК зесастассо чссщКщиоя що жу тритівкзгаиУв іти спофезимЕууикию су Кам и Ж систе фуд Ми пет Віри за чЧкмоЗссам соч чеєсм спаси се есе сс УМ звизосаасчя постава соц поезацтоц поссоууптєєр смлукосхає фа5О
ЧчидосакаоЕ свксевосвяіх позсуасасок сова сває спот ие ца кокос чоспечсОка зва сЕ сасексцююз БУС Феофан Мао каз засех вассззасоц аскзсацеає деастасзтай ппазвксата свусаусеве ій «сблдсазсаєк зсзчбасніа ссоуасшсавк завоаасатяо чекисзавеосо вишок ве ЮЗЕУ чаипочицитах звопсувсажес ствсвивуас зоспаокоеча чес касаца спас їж сІстсасахтос зивоВмчре подпссазЯас спаси зосуспоачав чесезсцася 1435 звсаззавояс чоло гео ичек Феозафашес апа позу іх зозсзахгася січе аізоа СкнБласхя ацФооасих ссср чисоцапосх іл екссачусцс Фопсоссьу чрсассесок сок козі весотю фе іл шщчпчепеака спосо сноч списує вУк суши сви стека поза ичесх і1585 седстсспасч птодсоцосо бапосааскєс сессопеода поиФфооою содою іо залпачсазва вч асвсва славу азвсбізузвеє спрсзаащах асо іо зчішЧстих зсессксавс схЗссвочш Чоп ссЕщІх шоелоспеоЄ Ісав іо щекссисис зЗечасссооуас асзочосасс сесвссзоача стосу щомисе іл пассоказчта чсзачсвесе зсашекиле досерайпвнос ака кКоЯ асо іо зслтастат пайвссссЕкс бочевсзауа басусавали вслсвоазлчє пободаас од птачЗсвсвал апскаоссса зссшсзшзч зУукдавососея пеуезецаЗо поеоаече го чості ох ссвсоассореє зер буси часао ссбсюатса поєд юво тії59 чисоасовронт сассодоавих бсаософа сеасопоа сесексвасяю воша ка дя псечечцсесоувос зссочсесе педасзюосек своссмкцея сисбиссасту чекає па задсссвоачад сао списав осов феод є чайпесоужес звалася ІЯ чазачиазвц пода ексск соосозаасс сусосчиоя чбсссшиво пу яп зді чоащецс ммзснмач саше сач асзксацсс осла осески сс а котсайюисіш асо соесо сапасаоссозс абсо те солоних випасеиока ше «хЕвокщчссає бпсдавсватЕ за сесвна сосааавака сеБаєвнаса петехкекакє «2588 акаїзснаї аоізачцсвачза пузсссоюсІ завосекв ссбучЕ ЕК поса савох У че еЕзЗаек шссаскосва ссвекевиЯ звосвеаЗя ЗиБІсавосв ехо то аиасксонсх саасосхавск зссосзае аствасачаи сзфасокае созекваввсх тка зчазшсавсче понорвімнхр пусоножиоєс зоцессаста доза Фсовосчсоу Ваши забави еок чозеосусва пезаЗкмИЄ пешпвтсесше бкссатсато веду Же закчскчсще саазачкиєс вазечЕстес йзоамйоесслай сама зозкопавВлих жає сама с посспаззисее савзасеик созоечоссов звали сессаса Кия НН зптвоптссо возисвек песо пори сохх че веоа озочіпоає зо тасвососса сосбосиноава ачвеатмсат своадсекова зпасбксзаса зеЕБспаскаа Зх поствиаскв спеатсавсаа ЗЕ сасаписак спа бевксса поса В зі шила атавкочаєя сбазатвісу зосссксвх ссзвузавох зосвсеа оса чо тезЕшІчЕ сусла све зчовонам аззатсача хачВкссво взасос ЗО акжлачавкк бен оаосвои зе азс заз бісвовсвиц з зссевсху пеоедовоссвок боса: зага зоскаововав згайсевавосх ссзсевасех ЖИЖО пеацуоаговко сбесавзцпуав всоссолосвКссе сві чвансяи сао ав сомиа Зако спааззавза зааасоузсай маавазеаси БіастосвавЕ БЕпасссосвя сабо Я е«хжлосавоссв бос опаою сшкасепико кроахсео ссопрозаксс зда кс ІБК «всзказколз віаасвкшса чсасоствос всстуввсока зує иаЗза зач ос ЗБ щи сзсозецу аасвасвоЯУ соазсзаовс вацпсевацеову созбвЗаюте часова КЕ «взсозасесоя сасвзосауех свезасвовус звис звбозасааза безе та зосзЕсстузо аззсоспаеза ацечосства гсуаасвоаа саезосачо асо ссаоа зва паста сазасокх зпаозассява Саасззаст; сзнаввсза акне о їксекасааке зспасизааац чок чссиЄ бозцивисев сейцеатиах весело Іа чола атлесослав пи вопсоаЇ сс тзвоа пипескЕсв зсвизеатаЗ зо сксасукоасо поса ксЯвча ссосощпегс посасабова сс своваВос сзаддеващо чив: кишок зес сссла ав зісовпєсаов сохесовоя сазапасіко депакуси КЕ зі посвтерсезк бас осе золи зиссто ббасзабсовз осо песо час капучзеснаст сссоузочава ассскаиов ВІ асаксо зоазасавио вавовесваа М ЯКБИ же ум ою ув пу ФС та сил дю Аа тах нки жи о с о КО АКА водо втичь си, засл сиву зУЄ ох хачс2асстхах завоесонов зу хсеі савичзацсіви звазвцєвпоаса запахи таки
УукЗсасасщх савзозавив супставамс веаезиеилв аависасЕат вависеюютх Яляо кучзскоаавоК пвесасекка са сов асекссавих Висаєнечов ас асиВ ЯЗ чзаспсзаказча збавзкзбсав васала касазассюва сосЗзсзвост попа чваках що зкччоссцич счсваавНн сасзечеіст спачсСвавоава схававчак осласовоюи КО зіва тавсвака ссоаавасазас свозстоопса затззвочаЧче зош Фа сева чел пчесасаака сжсвеаосс сви косе косея рожоеютав еко зни стазсцасєтий засповекаді злавасастоа кита зопаааессв здавав асва 748 кс осап соавсотоааваа чваззазозв задзалстає Єсваетеваи: випро ч8по заксічснках хасшикитах заоч сеассвцеко зстазевах вчетаюв|ивя ак жакоаасскае впіпассзнав вазївзовазав вававависа соасссаачаа зссзадевай 132 зраессевиєе «совок о сзоасвсаочс Кебовіосєс пе асаК сива за сезубсавих сссасмесаї ксозсесвасча СЕбасікаса ЗоссЕКНте азеопацавх Мо зЕстоссссп едакттісах созсоазцчосЕ сесзІасдаес сезаоссича зага едаєх І позававчца зп стсва досто кча ссвавескек засос апосіссевею ЗІ што пе восФчсеЧ счїзсвабаса ни соваа ззгасакцко кчсзиассав УЖЕ зачаті х звусаваачеа звізда с стоЗзоссзевВх шоваадтася Кс огсав ЗЕ зпзнасавваай ссвівссаао стпсассклс втсасовчвх кЕФеетстаса ах асикх АИ состав село ссве есвааах пеосвокоац кс аеаса савосакаосс 305 засїжавсі авсикасово: свекор зуасовесеко свасасакУє зона пики ачЕчсчасамих сосоаззеазча Мівзечашасї вташцикабл збазвайтва аволеваниких ВО ктпсезокескс зевсаствса попі асваатсев Кос тсКояа сусвкшиаау аво ззвзгївзосшх стчараспка чаї акста згасикташво бовЕчавскт сеча ВЕДИ ес свома зкозиаснвих Капеаваєзих ва ивосв васахашатх бари УМ пев ва зво сачо позови ос повсоспта визааеосае поса чооа ЗівБИ прокалиаї зчасвгасає ссопсвззаах пдзеабвивсво ззскксзата спекзасвека ЗВ ассзасаєсн: зазасосеаса сепогтасоче ззвяссваас свачсечеєтз седваа асо ЗЛО зишссзааїс проазвсвіссх ссззавцсїї Стос гавоя завчушаасВа воссазавседа 3540 зівассвсса зужсававносв адсчосеова ккссовосааз аусвоюсово севаавозаю ЩО їсвазкажківа спаосвакІс сасззсазах сеавгазакса зачдчавоов Коса БО зазчастазвасс кісзевеес савцзпуаоси пеусацесвале зсввсзаахо всзссвавомй БІ счеехасьазо дев лавач сьшккоозузе певуюаєвус Базовою зав юкли ІЗ ск стаакзю зввассокаєх сСзазсооай псів искке содазсвава завезти Бач пезсвісттї зісзазосав; Сллпосослаа при щцуєвас сосСасавосх всевтанчав 383 кчасчсчасе сет дссос свслсоватах садусатоо єсбесавеов казктевакс БІ зоасаїсвх:час заазосазих сезабаваиае сзацчессава Фабасаастне фрази Кл БЯжАИ сазкисасзача сацзсантава се остов: азвосавпяє впоазчаєзача сіавванава пав ччазазттпї асосабсазча восбаннвеї даазасасає зво стає пазаадиоскКо ач шзкслоазч кесекаосавасва визавстизМх сксацоавах «жахів опа ас ВН зхавсвзвіх зара таа асоззосзчавь сеавссвоссов сЕсосвавай посзацасво 55 зичачсссвв зуссначаЗза Застваиаї Зечачсу Чассонезахз асоетасєнка в'шо слжастоаат весвсосвака базепсайоя сзосакиоте плалюЕЧацл совоеоопиви яжННО зчзазвсзавь знросвсокі звбазсговзз сссовасоотя асан Сни сжоасох по зиствуца зазазсаскоа січ асввїа зоспаскевав чсассатавя зобдоутавива вні чІззасаззац злих ціва зссзеаозаоа актових зала завали зей забовсесхквз сосок птизассастхс «ахочата созкаслоско столова То азсзачасаа зтазузазек соксацса висо тв соаахзтісах дасте вох ТОНЕ жк сзавис шосте засва ссЕЕоса зЗесаазаона Яка сутдеоцаае ло зеЕцикасув сасвУкемам зола зоизсаиве споозеадви Се аОеВИх ТЕО клзасукосє шхсшсвоошх боаззисекзУ восстопиії повз авх зако рх зав акесзеастос стсачааЗше стзаскочас сопаебсовуца веївсскеч содазеув ТЕО чЧесвстоавоос ктсоскосак БОС ссеас ЗКТсКсЩІти Фбскчасав пекошееосКу Не задишка лтов зоскокваде бссиносекор висасмимісх стежки ово тя зксвєссешко мово птов скісвксвасо КОбокішкОс совсмашко соспсшксеасе То вкшекесикк злочин логи ссктєх кЗабекксосвВ поспочсвЕ саввоасако ТУ весмироссся пот оксебоа созасашЕкс сечесесов іст сазце пото ссою ТЕ шЕксссаез авикіссоме ссаооме абсеосвкаЕка беру поча со То часа свикУ КпЩОомвееае сппсавашек стомат сне сухе ссуюа а тт ччУссоосзаае бтовсвнну паска стесасствсх застає софаоврах тво шпсссадезї засасежфмв всозоазаове сабсивоосу содзоссеато зувпшсеао та зазаззссвсз зсосчкчак пожсзовива сувосташес Фесувчавсо зосоцеачо ТядО чзеопасскес псозшспсс свзавсассає беФіопоао совасеаїшев сова о тя звссттоаса стайоватех псзповзаств сопе аос ззпаастогс залаваакся пад саспсшЕшаи Есе Зосбвсачес поечеспозсато сзаззсавво ствозваваяа Іо зсеківзаїсу стдсосасве ажзисаазай зокоаспалиа задеовсайано зЗекзпашака аа «теаассаис засполавала засос ЄФбосезевт сегеазосвех Кущ оа ВІжО
Зиасовсвши засос ос свусасвецза всасучавав зсасодвока зп Ивх хо зімнривавс зпідзавацаз паскзостане ОЗ Кеавассее бек илецве Влад шсшттосзсйз пзавпсеяасо свист восазв печазастО сипсазпоскоа зоспсавзавсй Вас посестізаєс васзоссзаВк босВвіссвса заззазвааав ззасззівас зазставсосса АБО висо ос сзпбацогау сбвцоевсс уипсодазазв соуввоссаои ро ЗБ посадіасвлсх заззакщчкас ввоазчазасвай ааспсаасвоа свавсчочаї соасчаоЗ ЗУ
Чен явух асом зфапеисасооч вас зкоззесеоо зсозецааксе ВЕ счЧазазчааиа сзвачзайнн пзачасцоах сесії соч окоВа ссвоспоусаєе УМ пцеазсехсчко чсезибасваа засо аочуа соплосзоноса пиЗзсаЗіча зас диаоою Вл звис птезкзочко казали ча вза чапоадлпатц згоди ВАХ засвовссата субааскаїа сво каєка зем сезвитаі здавав оке шяВх зауссзвззавс сс а зе Фаза Склесек кажана зай чевеКЕсксс засос зеззазцваа хе своє кка вепафатовоу Зоо заазазетатих звис зобов беЕКасекчс спчізосава баса сова Зоо зпиасааавсов висавчаткос асбспсшецчаї красавикоав асізеасває св ах віха техксатікаст вагттаакохї ксакзчвуях чославачаї зпсспамаєшвх вдаадвомих зів чазавсьси: пазоппсвіхуа засовасоае асавасусико загбтодеацеа: бак счацо за3о звазазтазсх зичссачивкх сеазкчсовиаш шктсвичщоВ пОеФфежтсива паВипММеИа ЗО кові свва знавця стопи: аза ваозесласио солацчнювола зе З зхажиктсях залоз ствза сп соваахасї сасзцачазї сзвтаозеш оссаашксавх вах їсЕкессккВ скесіказах ацаседчіраїх вксзісааазв «аввкссевки зЕазчесваое ЗяВИ
ЗзЕсзаасв «зизававскх зкекзцечав сЕзгеазаває васавказоає спаде За звсесчасса саке зсовсчакас засос з сова свои со Я ВЕБИ ти восссвах щесоспссвои одеса сесазсносв деосоиочх саше ЗУ зсокчссчКкс засос Фоссісекя ссвзозосссе зедвассуоа спина яТКО ссзззазсза сао озта стоссстовЕ сщосчоайас асо о втік ощо што пессуза: сесуавочеко сіра сЄлоча псує Зтадкооє боку уа 2840 «ввксссзиє сппасслезоає позссаздо фас заос севствакох Сапа Зоо сісакоачасо припої пзетазичех оссЕссссва свесФавеоєс засос зи звочссЗща ссуаіваеско спосо ФкпзастОаео Зососстеах зле ЕСоєох іо чапвипичсхис жопа чал Зодивссава сиву списа зтеа ах Мо Е зпедвепсеЕ звпсзвиМсЕки «пси певна Чаучачосиоо била 15148 піжочккзза здчаассвіч Застоозсвос вапавківиав збаакаатах балок ха кі сзасї с сазосптазша зЕпсоВваЧої зссосаоскве завасаспвач состав То 55 сткпицете Чтеасакастасє асукассзто сечссизУУх ставкавтих сазпссаавває що стчисеухо вохазїсавст звісаччсо фосассічКЕ пусбсцвочав сеповауках ТОК шппсцнвкхаше пссазсасвча Збасалио засвасвеік восабулево сикоМмоов. ічяяО чоезттасгеса соді созасвз асозссакас се секосвач собу іво бкосссвюока ВО зегайкттскс піповістсоса хкодавтсеств сФавсестахко: зкалавсеае взабзиачах їп58В зазавзасазв сова кствоя свасхівчх падватсшой апзочавеиє шктав кв ІБ част ссз зваповуссе затсзссвса щиваасповсв Баївимайт асваЗагеває ТЕО кабдияттвасє завис зу Еткс паапаачиха супавшикак плекав. іп7450 чдкЕвсесхзава звсссокосся зсавушеспкос засбвкчстти зо зчасвас пава 19803 пттасткелаа ссосздаастажу сесхсасест саостасосков кеш нигва чеше ча соакосвзоїх чбсисспак зпоепсписло сіла сазвс зззодазчавиа засасиНих по О «апа сочаосисас адавссаквоа зспашвиксоя ФфссмрвраБаО охо іо чу ких и Ме зу ни пс ги прп ті их и ин Фо житт ву гомо ум ку я ул птчависаеста КовзчсваКи сичешиенОощтЕ ЧЕН ККецИи хліві ЗаеКепеуа ААМЯМ павОоксцечє песо савочасЗає ззозакса чес лакоа сезаВа ско її зсФижКемр: слу сактце зазор зза зоздавсзоа зЗаввоссвха шезоушеиху їБо педаєсзисає чспироасас зеолевосса Косово заоч М: сб 11880 ссптсдочИ зецтесамів зессхоззвах скозЗзЗисгао сіссажфевес вззпавесао 112 зптасквпсво бостзазо собі соза сававазаот зе коає зеабвузесме 115945
КзЗектастла сававивЕох їасевісцоа зибатеівв ФсокУуєщаво всзкосакаа Міо засасктвайу чіасастазайа спвазвізаев ссасвовУх касі вЕаає печсуваеаху ї1455 звІстеккай песто пліва сасзаїтвих вкгсазвхІйса зекааАваФЕа 15850 ахаїгвістя їаггтїодова азвовавата застає аоетадуєса всутлазєве но четоцвиссх засизукеси бозоасццоц сапссслозсав воссеооасю зва КЕН азсасассяї зозсооцяда зустодссвк позсостосоу дсзаваааєс зсауволавну ТКта зкосвзсаик сової сзоас зосізвосуІв зіпзсошекс дескоа Еко зоба пвию 1150 свзаавтитеЕ савзвактсоть саксоасвика вексссбова сзвасаєаєо садеасевай МАХ тасззаєззае аозеаасаек зассзиасвае пссзепезеа вето та сажа 1150 ззасссазск зускксаєвеї сазваїсветаї гідфосзавка сваазшзазав Костів а Бум цисзавнств зав восв спадзаповточа пово сасих беспоассвак сип іо сгезччссасох сацазозвксва звізда носі: зссоБсоаач секавецох засос иє 1ябБо пракетстав сувасадвоч ссеауссовУу себеуауєчЬ адегчаакося вбачав зх сскзаасзцо содавуєсує едфісевацоц ссстотрвеї касосуувево сеоеаруасю їі зспевксовс зФовсоуосі зозбодаває ссовасезако фозууєскив азфаооваов 018240 зукесоаксас всвхзчазая соска ка звсриреаве асскассвої азпадвивай Не закасівсяз садооваакс слазасіКсу свсайствав ссзазустзтв забковтух Как е падтлествла спозлалаавалш сболлепкивл аск Заа даси тащіт доц зЖчАВ сачідесале ссзааодаааа поток окіс соску соват азсстссвае ВЕсссКОцо лем зсезвоосве адепти кя тест застосо адіцчаавацє спот Мжчяо чізоаєякх ство кбзосзаакаї бвїсоваєта газастввасх ззазеставах дао зчессусасес ззаксовосв зЗоихавзисаї збазксавЕи ЖЕО сатин Мао звис свкя саблпюцесвос зазастсзаї збодасназла зт сгцваава ссссткоЧх іхето ссзадезс: За асовавсзат зсоседчекєз звссдассяо пдосакофато Фотвасєтас 18 своазусово: сациссіЯцах здасбвацах сосзовсвЯс сааукбсавося висока ка Тато ззссккасаз зесуЗззозоз асосаскзаз засаекозаз зудоЗозазо сазоазсааас Била їказоззваеху зкчусЕкУуєс своп вкЗзКувиасав посоЗбоав Коб цуєло МК кощвсд т «БІ Ве «віз іти «ВІ1йх дНЕ «ІЗ» ждесвхів фБеаісе «час0» ВВ косксзхчує пссовашевс адсвадассс азцосштссе сасзусадев чозсочесва щі чийпосзцоє дезисасиса Єдине сомччизоея сосок Кесоююуия їх
Фоми вос зоб чашпскеє сСодепессва спетчасапч псосбтоооса состав ї8а
Ми реочс Зсзак сСозаосопеа зе азосе падатсссуа сао а кощеє ех попу лим щфІлвцоссоавасєс даспоавстопус пошепки Ффасподезсеай сосок сауна З каз о сізсозсазеч пепасосчово сжреасоч спосо баса пух ік пцоччеЗсще подасоасаво чик всОса почне сасууечосо чеосцевосе хо счсзсЗсзиа дзопсізаах спошесачиза сом іссци бЕцсаосєла сова теа 8 воижбсзепсщи паса засос кх соофпапасвох ваосссдиво поса ха саоціссваст сосен зоаззсзасисе сессеу Кесовеуасло спе мрє ЩО спосо псісцашовВок содспочсвс соспччасай засос сан вк зас тассеа ваза счио зоазацасглаа сосок с сепвсдассяа сопе ТО заазставоцс сорвреесснр вчсасоччосгеа ствссцочат осо ссцаза апа У саїзпзЕчсЗ бспссоасовох зсссосочео шссоаоалнося соєва поле я посзсасттс паесспосасов сопотчассас ссшсстсоса; засоата см поз осоа ОО ччакисьош: здвочасиасе Чис сочшсмооое сосочки одеса шк саїйшуасдас асо псвоаоа скосу косва сусла с вва попало Ап чахззсзанс пачсцвиаооя чис попав и поспосищченоо спе ВЕ песзчитоапе сопло спадзоцсє сао а зизшсосспс зосїасосаза 1145 сЕтсассса зостався бос тслтас Здсазесвс бассциенихщ авасшоусн ІБ што пса свист свсе сачшосочис своудасочоеЗо свое Не іл шщшрозсвестє асопачЧикхач сопзсзпчоави созассавЗс соесоІвдасяча сосок 135 ккпсдссчес осо Чоезсчшша Мои лосасо кусуосоалое пови мач 1585
ЧЕлзоспаєси спкхчассоас поузрпсссцсо сосок зе хротаое чеше аа гцсеоосаїа созааЕслоЗї Фдоечосовсая сссвоссоо совствасУх зовівківсва КОКО амсвоасакаї ахасахачса ставвтасаса вапсзазсцо сечасокси ЕКО 15 пттчекижхли сопапсасвнх сптспезовУкс часоакяза сзваснинкх пБвсФианеса іо макездвічся спсвтцчави посачавіоиє почавсочаса адепти зросли ТЕО сзтЧоскосх зЗаспосазсх чизчосяаа пас ахоаз Ччопсавазаа зпішЕвеКо 1745 пк тд, соти МІ мих УФ УВУ М их Зиму ти В КІ сим М тал тати ссия часах сосалаваптс пови с часова МІХ «Вій» до сх уся та кіхх Ам тю те
АКА АКТУ ум ту пали скат мо «різ йегзжтів їМазїїсА ейМми пе
Ор ке З ; ; 5 ка сі чи кими ЩО УЖ щи а ня хати и (живи и сер ии су зиМи и зи: падімнишеяа звів Сбоссесаха чола шапсавае У сем с Бдлюіяа осиуоееМеМи Фригниатли вих БІВ спол ссудих за щити паста ци МАЕ МЕМУЮЛМУПСИЙ СОН Мт ММ посавочзиаекоЯ мискою Якшо час пози сука ки 553 тку рому живи уче муж ки умі хи супах юр СКУ и и жи нику В ж их ма за писсчсстцасс спас стач стопу ичо паче совадв Кешиоиеє пЕхпЧЕОМ хе їх. поету оио3 и ду ехЕзвит ит СМ Ки Сема ММ зма ие мит муз дими хи топи мис еп оом сФфиаптп зими У Ж О туру ж ут сту св окіст лу зе уритеи «хакери (УТ тиви ХХІ х ев Ви вагу стає чозеоча ссзчсослачя стече сит струс са дао І тес тити ут тв спри В вок Жид ТРЕКУ С м си СІ диполя смс миаии шипа спичшапсаких печити счечвлесмі ЗАМ сефсутттеіміжемиви фуд ето В рух Козу ит и тири тртв о то Ве хви Б пошли сцену Пежо се иак Ос поецта спа ТК У пути тую Моз у у іІхут ту сл кВ и осетер (Уж ЕХ Ж Ку хичи ки
Читомо сплю ее сире роєм сова сирТишсниоаа порох М ох хм мм Ку сх оч очи МО моху М ви Об уж ом ох Мих пУтзеугтУюТХ ит В ку і ММЗ шмат шов ФАСОНОМ ММК иХмх ФЕМ сх кими ВМО сеоузтх руту Ус ей зичу чуже тех узи реву гі щі жбтз рев уггі и ша
Фе ака їке ФІ соди ло шмо рою сх соцаоса задо тт - призу ЗМІ ща сфсхуф тує щ о ст и цу дути покриві можу ух т МІХ (МИ ки жи що зЗзЗиа
МВ Зчх Ка А У Ко МЕ аз Кж Ук З СМАК КИ ВХ ся в чех І «у со ія еф ржди и ем пк щевх МмЖжлЛІ М ні т пд га бли МУК ЛІЗІ бю ак ММ ву лиже мітку мМад мому Кфеу юю сюемО МКУ мм МА МАТ Ж штрих пеки ач Вр еки сем КИ ІВ пи
ЗзищиІцКЦО ВУЗИ асо пош ХК КОМИ ро ие ОЦЕ БОКОМ ти пед ри едикт феК руки мі Ух МИТ фуд ех. зЗзпи сайицчсесю шипшина паплма сх сумні ас ЗІ ЛО ЦКМ ЧИНА МУ ше фігу фут щиху Пол стру тут и уииин рр ги ур у И сових зе хбсакситпясто сало сенисамаиух сс лсихтят слюмрисахЧиє селах в : : : . м ; . . си я гугтит ут ий хуй ие туї узи лу иерою Іри ин соус терти пла пипоичщичзеУх кшахУчкИеик ща песен сухе Жири «слепеиси У
УЖ аж цк Фк УК густу ую и Ки В уки М тих их уз рух окт рути зи
Чітчаасшвис сдасеума спи ес уких са сочч шу ше ср ит ру ую чужу Ми Ух ни Умови м гм жу ТУ ЦИХ УСІХ ИМ сети ом у еМи уж ух ти чисте стосу после зас сосни шосЧаВоКК Ач про нн В НН зва
ВОМУ ЗВИК БЕММмМІ Фк кнум МУрОКИМУПКих фрукти ме хх чи чи а не чеки пам их уки сиву их В. пот жи ОО сриитую о ери Ж ту пасосссоя сао сипле всдос ступив вочсочпоее пост ото ко . р сук ее гу ге зт
ПИТ х. З кю ях щи чеЕАМ ям «її З тру ту пла шк пе мк их кс док іі сц «В Кетеагав зві щ ки ТТ «Ех що доз ві ду ім й ик ик УМА Ву Ві до ті бухт. т щу щу» щту
Миї Узі бах пів йіз Бів Зій піц Рруз Ваа 12; бгОо Ні баках щех її : й хх; ї Х 19 ке «хі А ох їх й жи Ж 53 х мл во и ту Ми ху Вл шо Док бач ів і1у их о скАй Мт КО ЛАВ ОО АХ вла Бех ві мес взводів ВХ же ла ак
Ех х з ам ІЛ С
Ух жу хом її шу дк КУ ТШет сію їм шию їх Му стосу фе КІ па жо їм Я ша АКОТ да вх Кв Ку жех дО ФА ВНІ А Ма ОпеХ
Таро бе й пет піт 1 тщ ВВ лах так ді В хіх в'я йоу
Му Бгто Аж Ася Віз Дів Вів ів Аів піт уз діа Віа Аза бів мех
М УЗ хг хХЕсуї сю; Ме тим Ще бек є бу блю жи Му жи ки У м жжу «ЧА жЖРЖ о дВЕ ОО АЖ Епос ОММ ка ну ЗАШ ХО ва БЖжО лФб о хНх ХХ
Гоже та ТЕ КМ
БО г ТО ЗУ
Ки ії жу ххх М ую Же щи СЖХузи п хі ля хх о дух
ЕКО НІВ ви лдзЗзюшодлаз КО КО вла ОБЖ МАЙ маш «са ЛАМИ сх ЕХО ха т ТЕ п о у уд Мщі йшли гаї у а гм) дет дм їла диму дує Мі щ ті ах Ум ух зай о ожщ Оз а3 А ВА ХО ВІ АВ су кро йАВ о жаУ ожив у ай тт зле м А ЗАОАХХ «т іа ща діа тА пащі іх Ву Вт чу дід жк ші Міс пил п: зх ойів ів іа стій Уч Бі Хі Аіз Су дів Те»Е нів пі Бпе бла ча їй чУц
МАТ 3 МАТ ху зв лико й ЩІ у ід жу х 1 хів дя хі пло їкдї чх Пі іх хе щі є хх Амду тих) : т діа хіх от їАТ ЖВо Ку о шауУ ЛАВ о 1 Ше ЕН дід Аво ів Аза АЖ Ж яка ма дО
У «з: кт
ТЗ Ал 142 хе і хх Сов пкт би ЇУМо шо бал шу бом хіх т тс ік дух
ЕЕ іх вад же АЗИ Жпе шле ев о земні) демо йАдЗ алЛІ Зух сам Ооиа зац жд з зди
МЗЕш Ам ах зо шк Фо ов, сил Хо У КЕ ре їг-к-Уї со ся СТ коли а ша кл Аж я ді : рБет піє Ву сеї г туф при Ті ще 3 і й вів Ака Аз За БЖ пі ЖХВХ Уві бек ЗХ У жшжЕ ЖЖ ше ві Бі вад з ку яти зх
З о 11 з а дих М жав о жу фі тую жу ях Мох У лу оду лю у Ти
А ля Кит вух зЗзЕЕ мух Мем гЕО ЖХЮ мВ А ОМлХ ї-воЖнии МО МКУ «пх ке з тут пд т їз
Зх Аа У
ПШвсз МІ Меу Мт х лм Ві сива дм М 1 їх думу Св З Асху й сг тве пла вар о олу па аа ЗЕ ЕЕ УВА УА УДло ВЖК АД ХК Ома ХК те сет па
М «ки ке тек оба і чів ще нич іа ші 13 дови Деу сх Ту; у мк
ТАЖ ОТО сх Ж Іов рум схщц Аїа Уві ЩІ Ж яхт ді ух ошах Ах Ух ії та За кАМ ОБ ко ож ка хх Му ж ок й тумбу Тимі Жину 1 дю я: туз: Ті) М, птш Ач Бай мех Му лах мим жБМ МЕМ АТХ ХА Мел під Бем о цеав о БА чзУсУц пах ех т жк «о «ТОВТІ КО що жав жо Ст н УЖ ху тА ОТ. ові СТ дю сію я ща В же сю пі жк їбела ШшШЖхХ Бе З У Жак сам Вже хау шЖЖ БУХ вро Кума Кл ЗА АЮ
ЗА ТЕО ЛЕ А хі М ши
Жди ух ому Хв Мох Мега ую кує Сами ЩїХмиї ЇУм ех їЗзєемо бе 1 ку зе ВвКщч веж да ме я СВ ож ОА ЖЕК АшЖЖК КУ жо юЮУВ жо КМ КК щи Зак а
У хо я ТМ от, фону ТМ ост одвуї (ЗЛ: Ві м лох ких 1іфї ж сх йно Можу в З отут СИ
Мам Оу АлЖ о МиЯ ваш АХ су жи НЕЗ Су АвБ БЖ ТБ йіа їз ТтлЕ шу ся а чо у. І Ж и ук, Мах сгхже 3253 я и Хоч т: хг бони хм хз й та лях бе Би де в пожхвВА ші ЗКУ мі Б УЖДУ їжа МВІі АвБопау зай пртук, зп кВ ТКУ що ст бек Дим о пк ді дм фрм ові фії ів меж хе що м те де їх дж спа Зах АХ що яхт Уа их ша АХ Мей ма ї Тхе два ТІ че ий зх пут 8 а хх КН
ХУ яке А З«М пі. вашу СвК хх МІ: их Міг писк й кї Фу смс тла ох й Хе зі вв хви оОшж ВУХ Ав з сх Дай сш БО АК Буш лак КСВ Ше ей дов з
ЗК зл Я
Мп ях Кт «и хи ких Ми мат страх іх докт дам ние тм: У З
Кіз та 5іа Уч Уві дво Ів Ат бів бів Аг о ВЕл бек беви дів Ба хг ах їх ее мл КИ
ШУ о БТощхіу їх УК р 13 шу Ауя ха сах фс Шу Жде Ол бою
Жпе о Беа Сжа жо йкО пім їв о йхУ тва зві ха Бжоз Вже іа вк ожАє чне ща дк я Зах вл хіх УТ тт ту ли ту В и Може УМікю фе Дух те нує М ух М же ваш УВА Оу са ей о пшсе Вот АЕщ ху ЕХ ЛЯ тв оУйХ КВ ові АБО ча В зи
ЗАМ ОБОХ и ткач Ме ум Ваш Жве би оду МІ срате оо Мі х ат мук фету со тах
За Мех йо БвБе тах пів Ащоа МІіЗ у шк ОБЖ Ух зви о ТтБу Ах Ол ве
КУ й їх Зп
Що А: З. такі бьк о Кв отже їм буку ЩЦрм ситу пи хх г - М Що Же вав віа пе ТЕ Ахо Ту Бош ех МАВ ОС ж ЕКа вл ІН ар ІВ ж пз дІд дл мч 315 АХ
Міаул З и ТУ: МІ Х дну х
Уві Аія Вка діа Аіа ек ТВЕ їз же нету пз «шо пу кА хУвип
КАК ОК ММИТ
«Ек дик
У Зх о чн ож шехаків зві
«ау ВІ ксссасоцис бпоспавсає засвзааФфм: аФскосбдосї свозжствоаса зосссзосай ще
Шсподсвтєс позуісаєвся спрасуєсюд босурессво ссбобоєєме ссотосуєесє шо чпаскссзвае вктцаслосвоо сс шсве Зпосздалех пошаолосо поса їв пассупсо обі Боаоствс Фсопираусос заопзсоосоу боссаккЕсу чо пецессдовє даєсоводоо опосзапево астуотоаво ссоцасуєоо сосоозкаоа шо хусачпоукт скоса свас поцавссом Зп сосен песвонкоое що састасасоє зозпасовасу вотісткосв зоб усооу сасодсоєаст пезссовесї Зо зусосопрот посуха чаоо зеоосаукуа окт ес слесусто «озасаа ев чо оеовнросо сор пеассоєакс суукасеою воофеовсю сеофрнмихеуєх 549 поочессаас обома воучачаспосе сссосетсфур бокс децосеЯки т
Честрсозкс дкоФфаскасї бФоссодовс сссоофурво дасстозрадо серп єв во зжакіази (вамрвасіїч посасаоаїіа сакосасвкоя зону сухе ТЕХ завсссвисте псакрововс веасокоє аферу аксверауєя сб Те атшвачалии спомин Факс ссср кчапесаш чо 355 зссалтасто фіаско сві соаззасезс соскссвіся засо сва сиасотзосо зво стспичсссча вросасеез сасзстввс асуаултесте авоспрецассю сасеоикв зо зжкатссвсос сзоаофтахов сосок схе адчкох козаком зувскоасе іо песоевсоцеи ссдсеоссеу сошсесучсе абовасаєсс дФодаєвсяке сзтошевосу МН ссдесосква бопашеоктВ КЗЕсООБсВК асосоєтосо обечеооча зсавозаава шо почссмровоє пебоастесее плесо ех лосовая состава зисаасоо ве зацастпсва сабзсвсзоо сасеовсцво зежсвоссво сасоукоаувсї збопскора Не зсзвсопасоо ваасзсдйиасо сус сово нс ссозаспссо стасвевее ІЗ поЧезастко бауостесра почессоосо зішесбатос сщриерєеєкк сопсоФфана 189 адЕтсоттоац соспасізсаза заззалосва сосок сснлачайо зо иви 145 есе сах есе зочехО сзсуцсоосх зате ех 1505 чари чсапод псом зч сао паси зЗочез посли стопи 1565 шві зщкпссвосе собак сзоавасааи Знирвисвооч зоспасвцноа нн сеацусачку зистаасскИ сктошоювхи бсовепусовов ам ов Кесесвеех 695 побасаеоесо зФфМмнсосо катозустоо аакасавоса паска зкооаевкевх зт тчхововеоо сотих очссоо сом ою вок пссшеоша со вохст ТЕЦ тими стен КеМмоде ст ПслІ сх Зх ет МОЖУ з Кі ще Вис В я ЖЖ таиссакщеєш шероиханни песо хе ра кору Ним КУ ксшісксашУ сексом соц стипа сподопаши поазчЯКио сих Мах пор чн и НН НН и и НН НН Я їз чвозазчасе поту азвасах «сзсчзшшк хат пед иух чо -Е ї1зЗко факт ох Фо подо В су посі вкітуці фе цтво сер всхтуюих з-ай зхтакзІахаї жиладивах Ішли ще ах Ж ши кохвиах пе а ЗИ с МИТІ КИ иа жо х р У пчижюию м у уж в Км и Юм котрі сер упустити ху пох суть секс сесеасака белтссднаиос зиск сексі! оптова жи усу ич Кеиюи спомурор Кік пет ит прочитав 751 Ії чтапстасаста созвсспиБвое кози сосен сечо Кос. що спебчЕзссои саслачноес попала сссоисувІМ: ВОІВ специ ца лих пекти СІМ НАНясмХ пос «Мои імени КПК М рифи; утри М офечтутиверВиЕ Віночки У иКи фКещвуу дери ур екв пешссезсси папосоЯавих ссезоткзчучхУ совссисвим спекопасчс вивихи ка ши М педфомрисмас салом кових сасавосдопе тисдлосася осла УМ ен ин В и НК В І НН сит пччасасцека чЧспУусдасч пачок ссвс сптазпссвасвя зчлоасозаксе ззоФоавусох «У зесзеасози подисосехх ссзослтвче запаси є зсозочЕхо пак шс ки р сусло утхи в стю Сфожожехии тими Керр и вик имимя о скл придсссвоая сіпчсоуноч засо осша Копоссаисчое зипсчиМь зоссоссвх оком чн и В и В ИН вий «кс Срмозссооп сососвизчес ласо доссасоцоо ве дооЄ ШОУ пн в В В НИ зах зикеасечсвс вівкасавзо вутвсахвниає вожозосахв Фаїзраїзат сваосшузнокх ЧИ нн нн НН НК НН стол что осли КК Еох коту часа чав ца Божа іМи домів Кок ис Кік кла йлмик АКМ УМ содудд вк очи щутих ее взір хитання тзаасшиот птастізаахих салзвасшецч авось шу зазчесссовече спотискишоя сто жчиня сччсазсїо чешсосвавия сс ЕН т зер ка В НА НН задт сивашоєави пехзисасса сосочстссзча коса пакс зчазвисосо здвиспчикоа штам я я ит зайди зи: шашок «УМХ «Зап» а «Ей ак «п їв
У те жд ЗІЗ кл Рчечре що ді хх сука За а пн в НН я шїх х пила ших че часеакмним паями шов шк ПИВО М пі сутооричю дуд дує ув Кеди що Учити о с двічі юв ліру Річі имя 2 есФссекннУких йипсасВфосЕ МО иоВ описово сао спешпшвоссха я пчУсставосасе счшпасасова спасшвосссв кад пспакас «соки зас кедис АТО ч«споччсиче поса сечс состава іце сФавоснзох пад ма Чапека «ЗМ фу юри ти и НК тачки У меч Я ит Вир я Кров зи часа чшстчав плас аури стоич печсиосгаав сен акя ступи аа І зосчМцниНН сполох З,исависо зим ФО ФЕН ї Пе Зх соту тири М пизди РИ М КІ драхв тими суді ДОТИ аа шифр ко сроссктцхрах режексуОс хе єтиме ше ех пасує Ах М земств сетер на смол ож емУ семи дип пит заоч ша ННЯ ВЕ ІМК ОКХ Фр ча То сраки ди софт я дорих кв У схуд мин ми можем ую сви уж милих и хай
ОЛЦ пк ХОМ КИЕ МЕ ХО ЦЕН ВХКИ МНИХ п сумо із ом хе Жук у домуку дію Мои В Вир МОГИ син тиви ик КІ слива ЗсеслсвнУут вадиачаси сш шелат шоКшиуапуаи ск КИ захво уж мужі мих су ж уж Ми и ери тм м іти схо мм Мом ужтот и ДЕ степах попоцастове боса са шоста сови сочсс спагеті со пре уж вит с доуєую піти дет УМВІ ДІ фетюлуєи іх сур их щу их дози до мим и їх
КРОКИ пев е їх ПО шашок ВІ п ЕЯя ЗУ Ка ЗшУщчахш ВЗА их ТМ тщдпвенсти»аа погода Ко папи васивсвлила ті рео садових тва часа шипа папера шпака ще ме сеслацпа га ер уки ж жу у луг що У дфачнитних ву о фу и ВИ Ж си их ним ж и и юних дм павахшшаеоє фФопеайтлее хесносновт фам Ффиесок песик За оте ор ія тів три и ви Кк иоу ІОВ ИК Др ее А я ца
Фе Ко Вп мули шпон Мою бли ссза зиск т казну РОН прегувнуюи сфд и Жовті уии Кодиии рнгирри вних ОБ чи ух пд зпсчистсах сочзелочслаа сЗзЗсосюсся бсачоссшк сооопясУс вза ка ша асани пам піти демони гади мули пам вшчаєЄншиуслв спаси стаку дес асо осачоука сиза кИ пес алачх ЕМ мА А НК НН чївЕй чаю заа псачеачозо паса косах сЕсспУукцює серця шко пн В и В В М я тай зла сири подач слозоичса пилку ЩО ОА КК З сфере ТО шари дви да дари суду ди тре ЛА шити сашщижще еко вочсвоссчме алича саше хИ век замки м ни в и тЗай шттиксвсзомх соуси пози се сова и са ЛІНІ Фисли вх Мі терту рих ст нн Мч лази сашнИивмахитч аксона зЗспааитчадзе се шсаваса Часи опи ї5Зши км дичини узи ик діри ее пери г ре ци хх лм
МІВ сАнВ сухо ша вата чу Яся ша кН пасиви що слави ЖИ пав па пет спін асви авіа тв ЗАТ шик села шк оч шжиМаАк мох Ка А іт ци пе плели причежт еук уж уже аж сви В хви КО кв єв слуль ж ощіУ М МУ МК
УюизЗапаниеа а ща звосскзтоалак соч схаоччс осипи пгах сасувааава КО зум лу з у ж поки муж фу уки року я Фо я піхву ль Як ню у у ке од що В че дш завгаїзексш запо чзеасапае БтасБитатів зсссаввіка ав ае АЗЕВй
ПИВ. За шу -рх кА п ша МІВ ик ли
ЧК ЕМ ноу у склеміхх й хи бкА ХУ пу звлАчА «ща» паї де оувиТ уєтже хи дру греч им ді су ВІ щи зу рих и Ки дух ії акпЧсдоапом вовни ссове спспвосвивУ сепсалиаас сСаспоусссвх зчаасиссато шо м НА В я поч ска щури І осях фа оуи ппсзцпоачс ЗзсзЗсоачея дпзастещшах злуки ЖИ кацекстссичя вЗзпсвВуІпсожо Зізассвас засос песо чес сНааз шк пк дищкувУ ги тви Коди у ето Стор ет сиве В гео пот; сичевосчУх сс оечя седан ссср са сєва засос «ГИ екв М с ; сет Кк яихух п турнх и и в В о А я г
ШОН Пе МНЕ Я МАКИ ТУ МЕ че ХВ змо пон и НИ так саспяЧсбспоЗ аопосо З чини чок ЧчицресииНя ШЕ тих зи рани у НН А А Я дл шиплссдиссд ссоствоачазпоа сезони сЗустессссиа свое савани М ви ни Не НН А НА о НН ОН пд звиасчсстовоч споечЧасоечинк соссісіІваз сс оча сан ої спаси М ет сер итур фу Катя стримано де БЕК медсестер ап
Ззешичипних пече к шосе шими афюих кеша ше зах застосо сзвіползах заз ївосачл вадпевосоалсй зазачаїзав завіс НО
Чкшаакравсв кофти чав оспсовас смисл ачсшвицска шву Зак
Ум роз утіту пиві вом ких Ко У ово сухих сук ери три што чсвоасашисс ззсбсакои: поса апосчсивио списаних ГК чазчссавое геслозезаУа ссозсвосзсх зпасососеоу сосисок спос С ни в и ВИН Ви НН І НА хай засиеаслосе печі свв чес дасчасзвах Коко е сс тях в ни и В зл поесчасасвВ кад саїсва свисодишчає вссх пса сш соуцаа попка МУ зазвчссицос спсасвзиаує Фчоисовас свЗзолчочм чес саке У ноя е я є ям дк. м. м. е ЗДУ доки ф тр стихух сег упо в счиі ІТВиЕкри сотовИ м ритути Ер ке хг
КТК кома си хви шось маю пе тия се подив ив пи опои судеив пЕІикІо мури дир «пт свссассосоту звотловсзКо зассласс висот сову юоя своем ВО ин в в НН зах
АМКУ КСО Соки кшицо хе сх цискеИм СОВИ Ма У п НН хх ичаеУсхаЗсле чарами зчИихачина АТЕ секту спра «шій з яхюрум СВУ «СЕ «МУ «іш ЛЕ тут перекіс до «кі» шЕУва Васі Уй «ай 54 мак чаї від плм Мах жу уж кі ка іє Бей Мі щ па я Фчю ру; ШкУйл
Мах Уві Щі Бай Нів Бус ТВ БЕ» Бо Бій Бхо піз біп об БФ КЕ і З 18 т5 ке фостухо дно ро КУ ух ся дж му 34 Кк суши Ж я мА що
Мас вер БЖ ТБ ліз піУу Жежх біу ї118 віз діа Ко діз віз дія Аїя 28 З ЗО її їх Део їки дрвх Ммще Мт: фу Тло Ту бачу Отут: фра о фйдюї сх
Уві СУ Ер їжи Ага Ме Біб Ехо Му її жо Біш ко ББе Удлоі Тр
БІ 45 бе й плед МІ йрвх о щує дія пом ба ла сла бом йпдту МА ТК;
КІ май схіУ В йпла лЕКЧ Ехо мів дех дав ов їхАМ хви АЮ сих МЕ хх тк - 5 5 ко зал ша йти УТ» лащоР о туї доку бу бок дах КІ т ВУХ. їди тві хаї й ча у Уч зво ВХ АЗроУ Ав ОКХ зЗінп біу іга ха зо Не ж ху вія діа ді пік нії тя вія дів ге Аля бик іа тім шиє Бі
ЩО вищ ха й аж УВА вів Влв ді МУЖА АК пос ЖОКАК ЕцеЕ «т ща щи що зи аз
М в У пл Зі дю ст Му гі: ва дл під і тні іх кт вла Мі дл жаль ЖаВ швЕХ ОаАйпОоОМмуш шу Ж хі вир ощаАВ вав ве о Ллая ОАЕ Я вліво ока ЕМ я іт 3 т5К пк и З АК с КУ Сх 1 Фо Ту хе не я є що атм, тож х. 5 жа Х ку йо Тож взршіуУу Аза Хек ой Виез вив дже БЕ и жо їв АтТв о ЗМух йко пахЗ так «ж чек
АХ Б Як вх де фо хі ми Тк еко КУ З їх» бик Жв ко бек Ж мае щі віз Аж Аг Ма вхо пі ап оУва хх о сзаУ ХУ Бх бек вів мл Віа за чл за и АЖ кю хоч оди ти п шу Тож ТМ Мет ж сожек й х ЗММух св окуяя и МА хг ад о АкКа Ба вів ВЕ му цем КІ ТЕО МУ Зі твж би де БА Бі М 85 чкйа т тт іх 158 155 ІБ пу шлам жах Же Щі щі щі тки Ті ХА жі трете Ши Соуу Сихк
Ве НІВ аз лиц вів вій пів пло жхЗА ВА пав в УшЕ ппе ек мех ся зт ух 155 іт АКТУ
Му тА Ух шк, АВ ох Ж їх МУ Я г Тож «я х сф рошео Ж «ак, Здати
Ух КИ їх дея ЖУК Му Му о: ємо Мк чл хх тт ОТ
Мк ем ожіУ БЕ зоб гле вів Хо Меї бі Зк УВІ Тух біпобУ тує 1цх ж суд їКкЕ хх МО їм їі тах меру Банє 1535 сміх ю Хо тр От хх там г шу сам зх Ех МУ фа мем хтК о) пХх Ах Ме осі дм бммх ТД хц тт т»гув
М «пи 05 те Кі с СУ Те. год ьХ вт к ооо ж гі ха Мт кос зак, рин: Кл Че, сх Кз хх ту 2 Ф тив й ; Вк Ото хи Ж б ее В Не Ж
Меви Шех пев сі Уаї іш Бу ЗАУ ТуК Тук Ха Б5іш бів Бе вів йо п лора зп
ТАМ «Ух «хім
Ду Фон сову і ХХ» йод, ех ех но ос важ ож Пе. оту. Жорж и ох. ня уко бек о бик ті Мих мимо емо тек бом ск бПеку бив о їбЖкеУа бл ду еЖ ЗК мя т МмЖжЕ ВК МУ ВЖА ху ДЖ КК гу СВ БЖ Був у я вх гу ТК ТЕ дней жоещи А «ВАХ тт жона. ММ боки У шо кю думи БЖ кю у Мних ж я жо МИ ах зай оо мнЕ мем мі Ж БІ БхОЗ БіЗ сх АЖ КК ЖЕ Ва Бех УБЕ зи тих ЗдЕ
КЗ МИ ПИТ ух: Уже. мкл «В хо жк ех ної т й в зв ху с т ре Км пи» слух де дих пд тю хобму Млі Ма жом ві жду іх
Ті Пеєз бец сій зер» веюв Майї бі піч Беб о біт УЗІ їец ті бле шу
Зо ек суку ши «КИЙ «М ші бе йку Вуз Мах бу бе А о ка іо із МеВ уві їі вл тіж зіз ЖК Ах Бхо чаї бек Бе Уві Ехо Бі Аза Мей чаї Бі Авто тат дл КН ся пот хх ув ле фаху Мун мох я У щи Фоцеиз твує у хи дует кни Ток Кн и че зЗАУу АВЕЮ ЩпПХ глс вк Вів Беж ЗеК АвМмл сах лхп ух БУХ ЗБЕ ОСУВ лов сут зах че
ЗО га5 М хг х ох ех чол ую оди болю й. Мем Му що тоди т що тва ків дхй Вів Уа Зеаї ни Вів Ахп дж бів вка вхо мех ем лі Кпе сек т та ху хг
ІВ ЗЕ ЗІЗ ЗИ
- « ог у пером у дух ке їх В ще кт Бк Зут долу дія
Креофеи Суй БЕо Вс сім ВЕ оОАХЧ УВО УА Дкш БЖ ЕФ Бут ОЕМ ска
Зк по зак
ЗЕ дя м жо що Ук пу их Іложю стпаує ня Мк Мр я т ол аж бле: МехЕ ООйєту ів тки Русз щів Ніз о тТУх БК Аве пе ТВЕ ТЕ мій Ав ма РИЗЕ ОВО
ОД хац пет чю Уч ЯМ
ТікМуку Урни Ж У М ж дусовю ббхгжо Щоки Гн Мосс МИМО М жим ВМ т ух й шу ВІ хх ду пів тТвт Щі дк п МЖх ЖЕЧ вав БО Бк Ах ч айпх зем лю пає гпФ
Зах З5 о
Му мамо нм Вот ЛЮ Оу тя яд я ж М З в ху у до ІЗ ках дк бук о зеч Мі схо ХО АВ пів Б да вів ва ул ВУ хай сук з прю я ах 5
ІА вті пі В Ше «ва 3 вх ва ЕК
ВЕБ
«210» 95 рум ЗІдД мокко Ди АК хХ «вах ДЕ ку Жах хи
АКА ших хі ев За пожити, уже ж иужеии вх ут веи дищо ху кох си кексу жави у тУ Ви В у дих Уч пс спсвллапа високе саизвосесво сесашисасв совок спе саанки щу оте пути ад кити МІ Мом их финутитнаду тих уз ооМ сжефж жур єриих ерІЖІ МІХ поза ши МАІ ВІН тєЯ КОН ПАЛЬ БАЛІВ БУК УВНА КІ ше ее КК шериочаисаня сф сиосвя сичшсииеша Берта йшли сташтедешо поз АшО
ШКО КУ хх аа Мелашки Фа палав ХО хе У ке породив слів ее еВІ а. смак из Мерідудає мтс зва спожи ссвя суцооасост віри е сема песо спе 305 : сих дим меуКІіути тугі КД Вережт и ку ЕЕ пе ІН З зай асаичапичи пили ичве чЧповосщн вові кн сосні шо чощевеиц КУ зичу херес и лутижевлути живи жо Мо ук ю муж ух кю жи ажуюУиу и ху им я ал саше шпонок серии афупчестоега дшоевсхрухс павохушинкмх КМ их ефуттху миру! ких млин ши пу и Кот ШЕУ утри кедр БЖ сачсличсшо сІспсаас пос носи ссоле сопхсееии песо жо чЧчепсчсцичсш поза исслон сФшсвосаКч посилає сещецесново фе М пакту их пи МІух моду жив имя УК КУМ их КИ ум У
Кишлссссаа писок иЗгов сша асик шлЕссеКиоВ поса поса вує ефе у мо ооо дих Офис рем в в ачіжени р дари Кк шепссленї посизассес сесктоссвІюа сосок л сбвикілео ссвагаецяе шю хоаж в мо оугоим сх оту туда дат суч сехоз ко жк хх хода оМоми що Види тег «асиавсьмимхе всІпочсиали всех зиах тсвласесаа завосзаветих зе жо вишсолалантв ' паски пааеко ввели соснові алое шана Кг взсхисчазекоув кеспоцеаекс каві УКУ ес Фчалачеасає раза ше утіх туг М (Хомик Мом к сущим рук ма м ме мае пи иту В тиву зай зоседлазчназавк чав сосшекчасзв сао ас показ оо виссечс ж
: тат ст им ти екон фот ді суді ин кіс жд вис сет пл хоазавасовло соесхвиво а щех кто пола ства кросу пла шо он ду учи можу ифрутУ Сир поту иїщО пжи М о ЖЖ уиз ред ОК р дв Б вита а капи ща оку ша т шшжштнао щИичИоаецсИат куски Ох сестру им с Уют де жу Кам сут и сут г чесну ша сер сттай сосен о снеки ку ку ках
Соуси оууєкких угутх куки жити спустити слу у уд зпшй ах ОЇ че Ко. м КЕ КАК Кит Км ти рез ША Щи КРАКОВІ КАТІ КИ КОТИК КАМ сера пах ех засто косе аво спавсечиа і1т45 ми ет у с кожух ко, умію мох ру візи ек сук : хх гео іед их ум о НН пд йазипдазаика пад за зарита ПТМ СКП сНЕитр ох а с зви звізааззева закирих Я дже дібров пев про супе Кора ВОК жу Ір кхМ Ел ацисЧчапчИчм песто ко айзцчсшнчай лена латеасх коралі ик Ко ки хо друці доц Іще ит ри Вени пава рути движка ї533 звзвісасвавс застава сас сосисок сувою ЗЕ Ко бе чзсЗссКтаса М є Фокс уж до с мих си довж дама жи Ме цихе щи п гії кг з ков роко хх ха тІсзакталув чіпа чхзвоа зпслевоисІе пісесаеави аж ВИК З УХи ран и НН НН су у цого лууч ех лади кпайвициіх ККсовВЦсКеЕ япіспаквиие агпзчааваає краспохеасяи бовкеайвио їз зак еамемии завела заці ммиве Ззваукемвецк пами цих до дах Фо Кл «хавактачистх сзисеастиия заказ Е асзсехкуах азеасякова ета Зх до оцих Кіаує цевих сук дод вжи що ше аувавьих шсуцоцов ум оц чий зчазвкашви звик с сзКавзвоиве зссвваачио зх тасбвавра сваха Зо гів вк пед фтмчувиі о зт сп ВО Бони Кожух зд заачівакка зсазозасек «сссостувосж зачавие Кох сосиски сова Ма жук ох УМ ИМ О хозек уже еВ умру ух Я меж ум ми мив их вок о яко ск ик 1 ахлиадас пиши ЗошУ зпаапочслЗзоа алзспсосвас вочосвочети засацоск ї5БМО
Ів тину ги у доц рати доц уд ри КН я хр жити сопе кнешкио вас рах шипи СЕ почи пла я Ка з іа фури лк щу тв що посікти озимих щи буфриуи ху усу моді запи зічасвачосв вашому давати всосасивасх провсасавУ свое каВ зам
Уж о ух гумки меж Кв у У муч ох зум ко о ризи ек я щі ие шли ча воссеОосахии «засл ипаа песто Зосзааі їіщщо нт х о седуюков и в о НН Кочур ю ув це АТ шптсазакааскк сассаєбссзУ ахасваастох чекав чкзаивикх спеапатваєямх ІІ з жопу фФодиц вві ох ков хо ВК ом ох дозор режі в дв -аай твезасвока зпопаїхшниива вацазадная авиІгвоузнта зесаццисс зигслопахє Аж дощ кот ето ко ке скор ві це ця зЗипд зсспизстаиае состав ча спипчавикста ха птисвк сствзачесиал зи а ММ кччаазчачов сад тав свизоасзадч впав сає Форекс сл пгро кА ша Кишкц ВНАУ чаша и саше шнек нм Зоо лАМУ
Ффоіжеуечучу і вол жив учинив фенолу сьти КО о тору в тету вміти кру умі ки уж тугу далее дата КК осо зо дахкх часу зезовиЗцив о тимусу Міхов ву я теми отих митті тую ми ук гу ехМаеух пуд зачин сома соа щи свлесаих Фон сИци аслиииак пгт Жито КТК п НИ и НИ В ЧИ заз сшзсцсаич впошевисох ач шихссрио спочив Зх коса тами хжрру ик Боже вими пф рію УК Мом ЕК т Міжорртия Вокек уже зад песчвосеате подо лвос пепсину сок чес мрос сопе ЗИ пу Кук ик Божа стртиВ гУопомі тт ррери схемі роми а я та щи а Кк шт ІК к- ою їх сс заоч сха слати я педа «я нн и ни и НК НН НН я хх в, пості «своп по оавсозаве чамзасФовзУ чав и БЕК кх М зпзачоувзвийи зт озаасх чеку сао скех солена часа ЗНО
: Оу и НН ВХ зай мазстчсвна дпа пааспеацеєе село поро тмно достоту чаю пери спЗспиа запвсечая дес нврн спо;ЗсиоаЧк поча чав ММ яті ит В то ферит пий Кжетлдлдм или лим С
Мука Кути У Ху КІ МО ТІНІ ТАКИХ ЩО А МОмет уку міх. ую То Ю иртихе ТюК КУ хи патагоютс асист зопобмотс пепсслисо содоппасмиє солоною зу етап соуст суще печиво чЧищетеамстьи мщлеаємІю сумує чаАми «хм грозу ти ин міо риіх к пКерар охтк и з мине с ка дове дьиюдо сум що ку иих зави звичсвоачЗси зоапсоасевоа сода осо зесцовасув аасзоавасав зва ЗМ пр КК ферит суті вм тиху ро Ко ВІК ер сети зва ати нии пласта сидсоабові стаемойно по влас пис жи р в НА НН фени Ж оо тк пла
БЮержиаК щи чеше ми о шжшиУуя ТІК с ШИМКО ХМК ї та КНУ між вті го Ве зов гг зу кі ік о фК КиЦ ви пре Ку КН ствпаскоестав паска адчвассвайа песик зо зчя їх Я ча ЗО пекла х задатки Журден чада мпеккавема ек агкгувх зів чтахкасутззаа взаааовиваяй попасти числа хі штІзита піс. УНОЧІ умру чи злий кума ча ЗО За
Я ГУх пд тям М ОМ слі їв 11 «ій БЕНЕ мл ран хочу ве «ші ткЕКісов вже оцн хасох НЕ зизчастноств пом чсвво шашосслЕЗсИ если поли косиво Как чашосе є
Кіото а і НН В АН НЯ че
МУшуулссмихе маси пейлеаью запа чачи Вас ЧАК ЕВ
З З ЯМ Ка ту ем З - узи уужту вих см и кими сф уч гри 2-60 р ме рити Мур МО мир ию реим Уже лип ачи почи сш пове х щини смолі пости ОУ НІ дуету ще уУз Мо ужуєеигух В си В ух т и УТ и ум ую у КіІчу т між охоту тус ух ащ ашисІмивК зЗУсцоасиви чес засухи перси боомрацє М о НА НАХ прозі ии КО мм, саги ик за соус посоповсує зусусвууа дсоусунех дооссвоосе суфувистьс зда су ут тлу цуєтутиеми ме схо М ужив Ки ум еЗужужІ Кри В сУТУ МО пес лт ут у и и 3 паччотосу ччсвосчстоа щовсвоче бочок сечова сепсис ша пк жк метчик пит о дих столи В грифу дику фл пн чн НИ НН хай кеапочлиасе салона спосо асезо столика вис исо земна а пики ючих ур вуду Ух уУ ке рух гру тери ун Кт вав идти ай шпЕшоссс осокою печує «ит пранні сепсис чо зцеассоскодш ЗЗссозиастеа счвозссват зочалаеях зоммнррашеа спе цоаа Ва 2 шо» І З ЗА З З з Є ТЕЛК х тд пове п в НН В НЯ гий асизасевсс сирих чат часи стізсезаачш позови часом чек стригти Мо межею сю Козині 0 паче чих п педоічтчвгх ку іс к де к ці тума шах ФосточчазеЕ шк хччах чия хх парта о шаАВОосА СЕУ зд утри Я у Км итує су утрІи т УЄУТВ сіру жирком их мі в Мужик пух Ж Ую их бли чових плааисовз чезсапаико поса чх схов личса шоста ее я я жи я З З Дол ЗМ З ТУ М тишу дою и ху УМ ух ех УК мах ему еЖІ В Уж хи Фо а ую й ги ект у им КІ ши
УКВ своих чшацеа пастир чаша сли сдапсаиКУ а пф иа жк уд им ВЖК де плачу А у Уж и иа пкт візу е ти и пе в иа Ту ч«щшросиит мист сума яксахсяася косо всваи сао ВК стакан с дооможох й жому и утУ іі и, ск чучериижтн ММ Ко ін свое вия Кл жзЕзЗІсззаси зчсзаичства ази свсисчсоано хоч пависо вича Ви столи саше шеБорс пуста сечею щростреюи МО крил | туту фею ик ну ю см учити он комаху чих УК жду Ко жу усу їй зчессла сли серолсмненх шипами є С часи ве сах Ме: вЕ й АЮ тампони вик дптзсллстмд сенсчєсисви стела сніни бив сслЗ Ір опих АЖ дик их ча а їх шир ВИК НУ КК ВККСУ хр ек Кука ж фот лист перерви т ух зала
Су о ЧІ К сира ра Кох ВА «пі» 7 ах з кві жа шетруху прут
Мк А Бл
Дона С кате, тії оз жхучти жах СТЕ тмт НУК ЦИ ках БІ
Же дик ТвУ прю пий Міда сяє ку Та Ті їм Пі Ше ЕН бі пух шеї йвВроЇжвВх пек грубо мьеа їбмих БО ма би Бей осі Куб КО іа Ехо з 5 Ух З ії й о Млю
Убдще У йому ек ря хіх віта тод вт лу хх му тей їі ті их
ЗеЖ ї11і8 АБ бхО Ббпе біз Віз Суз йій діа ЯМ Аза обу зу бу Ух
ПГУ люту й
ОМ дл ла
З ол жі Ох хх стра шу я Може Мт Тл Ши ок т шко Від хів вів ах вів УЩа АХ БЕОе Ззши дІб АК со ож зу АФ ОЕКО ВАВ и Я тт» дру її 3 б ХУ що т па ха й же дккух фу тує я хе ху шко Ве Уві Тв вхо Ні Аітва и тбзі Ах Біб ТтАх Тв дід ба оп шо кк ко а У ви ке Ух униз др во ік. ті Я тоді жит ж с; шу Ж ; х1 5 ЗУ Ї її хх іх 1 хз -щ К ск Миюк їжи ліва Уві Ехо Уві Уві) ж Боям зазу а3 МБО вуоО ав су ДЖЕК дав кц тк ср, пе го ТУ ВЕ хі тю тах й дум їх ху іх тім дл кі хіх іх тбмх Мід вбив жому мам ЗК лдЕФ Аді Уві ліз сп ува пів Алі ВІВ С че пав хх це и» т Тк пл, уко ой ЩО М ЗзЕтХ дам й М я тих жо маш о саіУ КТих шІУВб їхАТЬ ж аж Ба пав озБзіУ Ма Ми р о йі и а тий пе тп
Вк А Ах 7 си я Ки Жук йо 1 ха Кз башт пен Ук т: бах т гоже їж р їх ух ; НИ з щі се хх У КОХ сот кі Тем
Аху йіз діа ей Авр ос3уУ діа бек бі Ве рве АФ оре Ех МеВ діа я хх, тм «-ц
АК хм її го то Те у ох Ще Же ех їекуч СТУ ММ ок їж дю Мах ММ пі вж шій; КхЗ Аа вх Мк ек коса ТМмк їваА ех Оу еЖ ХВ Е 139 135 159
Хек ВІ х мік лін Мк щу МВА для ее би ім: Шум су тає і КЕ сшжжЖ о ВАй пат ода МВ Ам лк ска ОБЖ ОХ ми ЖІ ХО Зух сїхАХ ОАЕ чац жу як ах
У дм Ак КУМ бля Жук фуку тю їх у УЖ З А г хе джу І Ж котки дух АЮ хв ї-а Шеж ВбБе піу Бін Нія дни5 йха ХТа стіуУу Аза Вів Бко ба) Уві Уві
Ек г ТЕ ха умо МУ ко им сту ТК Щі Жов Атщух сим ті Ту Му ЇЛ блю уутих
Ав оте ЖБаЖ ТВ Бех о тТлх оз БА ехо др о КУухХ Зм ОВО мех жо МУ опо 7 Зк ащх ї5-: МО Ме чі бу ПІ у УТ аж та Тік чив Му хакі 021 їх Мах Хо оку ті ах ЖУК АЙ ЗА уж ши маш Дж Фе ву Ам мим МмаК ша ВЕУ АК з «ух г тату їз МО У жом пою Фон пл ЗУ Ту: Муха жена діл Ух дк М ках 2 хх Мк Мід
Мих ша Бещшщ їжа й мекв сек Ай соку УА А СжВ пк ЗА ТУух УЖЕ "хг 11 селу мк «АХ М
Ха 13. виш й Щі шк ух у Фе то фе Дах сті Дому стік тях піч ЗАМ Ейпе Бе міа Ав Бек сожшю же дію Бех опи сжа Ази ЛУК Тух хи зл их ск ді ФОМИ дю ОМ. уд Жах бах Дюк п Же сп гу. ана Уж тод У за НИ ую гля їхню І шу бтдхег жо ЕКО Су Ж ЗА кКтб о ха Уют тб БеМмР зу СУК К ї Ж ЕЖО Важ Сех як сук т яп я ше я ч Узжеуу Смак А тезі см Ж ше тиж Кох Її м Ат Дт ХК гулі фе т
Ар Вже ЖЖ Бій цем Тв лає дм фев бо ар ОоАВО оЗаї пі ту Те зди дк ти «ою ку У тої хм Жодтх (хУу шу М Мах кї ким їм 133 ом зум іх муси тих зам ОМА ле Уві КАЖЕ Ух вв о укр о АКОЯ Ехо УВІ дж ВжОо ах вхо ші путре -й чек я зи УЖ гм кох ках я З хх Є у и пає щу Мі Фк. дв лот сЕкує Мошух КИТ Аг вив Мет УВА їі ЖЗВ Тіз бі БевБ'тТВЕе Ве МеКх біз Це) Бек дад о Біх
З ТЖЕ За зам Тік току Кока бли Логує пре же о Ем То духа о фужию о может ОТ а авта тТУЕш СУш жеЖ су Беж Біля йха ів КЕ УА вна йх Ах би М 15 ТТ 5 ЗО
Хкур ой аж хол АЛ ну бе їм бах о бе бе тля дк ку ха ха
АХ АХ АХ зФжбцоскАД ЕпЕ Баг пев С М Ж ЛЕ АЛЬ АЕ ЛЯ ва ма. в зе пк
ЗБ ЗИ 55
Ямтщ Ву Вуз бут щі бщіиі кт Щи Шут; Мур ок му жо обау фе ть
ЗкщОКхс жЖхОЗ тхи вМУу Зек вЕщф о ХО Ах виз Ух БЕ АЮ ОО Ве твх ж: зац тай ав 345 ЗЕ
Ме ее Хі бод бю Щи Ми бю жу дих Мо юю хх жопа тр вій дев о бам Ме о Яжо пе отТвх біп ов Мі ТУЖ Ак дів АЮ Те
Я лагу кох
ХУ У У бить бі дет Мі Вік тік са жу фі бе бек еко буму ох бує хи Упх зей вже ві Ве ЩТБЕ ба БЕБ Кл беж Беж Бех дек мех пах ж тв тм зла І : ж І ш ще і 4 хх Ах ав амп Ам АХ Уха зе тя
«їх 55 «су а деко «са М суч твк, лиж «ій ДЕ «дід ткісшмим валі сх За
КОМИ я па утік сих тимус єхИисих Котюк ХВ ду зе луй у жов усу уник Жуки ща посвічуас сепсадассос сспецфовесав стсакоссопа чес со шеЗОпеВоВе Ба пра сеухути піти ших тихих схе що ср дісдкуруих УК моли в их фев гук уче их о зесоассасту. одесі спис злсчлоач писати скщснвасео сшеаиКенУки шк : ; ще . зх пед иф сиуя муих дерт футів фо соми ий фев ох сор их тим даси шиих слишсзавочсшах по лиелчхкєс Чис сазисзисай печах Ам ха сфофо ів сили ву сив ІОВ пр ф іі хи три ер Вр "аг часасоасва сбасощюве сосок оессто зола цеса а Же сим кр ЗО ; . : чий они нн В В и АН пд
ІК шу За ПСО ВАЛНЮ ІОК ХВ АХХ ІАЕЯЕКНО ЕУЗ ЧЕ АКА ФМ г зустрі му Укус м КІ песик тх (оси усе ужгород сх ЗК х. лечить хи пор похо с пе шар шахи х Зиаца нс хх
Я зроучу ую рі нот княже КЕ ВА ст житі ох ру оті твір ззл посччедичс ссасЗзпиасвО чеоспосвов ЗиЧшсОоЧ все сова я о НК НН У іх уро дузі М моих ом ММ я ЗА шов пасочавоа сосачсою по оимМио осо шов зи и в В На я кат спссосуоє дооітсссоую засво даогсасаєоа Фозєдовевс совосоВкке хай греч отр щоки Ку со С ох пев ік Кому дроти пору дере дат зипсспвайт вопоссолва зопадаАпеоИ хе лоеиХ песвощапосп спини ши греч тітку Кожух до им іт пив чув дію се туту т тя кА ичсисликаш педа стхв сохсасовоастх вспсосече спочлпасасаа упав КО -е тоіафхих спуску Вимити сеежхи дити Вчити титри и си тавсувкакосо вмисосисхое звосспшиееао зтосаловооя замша цеси споспивиииа АЮ
УК ож Ми ож ст ДУ уче ужив жи ож иВлют Ух сиву ух иа ух ких хім уж пен шпик оте пес сс сессастеяка пУКюспосвкка чоло х апа ТК ; - ; ши : хай прК дос А тив пи Вр положим пт б іс Кри судо В оз и поле тсм ди хг жувичстазпа погас р ген жО чимро влас х У зах Чалп аасиупнааи щи пн нн рн В В ВН пртжгу чЧчетзсвояу пп асаця впли ь чавлетоавтя фадетевияєс созцрашек М спехщаІнтт и ту сгагкру мату ожину баси Балду шт ко ун зд зач асот фашекьаю ефе ча песто те кессвксая ятки х о У сексу цу ж лут м кажи тут жстех мух ко ик муху Жир ориУх сири зт завис свиах солена пдониманиєе «евиссеим ис еццанакх пшочфаАцики АМАЮ : дп
Гефест еит сверичіиіикО ериревуєя сефо ех рек ек В ов запа чпибоннрсаснр папссплсвех Фчоаспосаєс есери тснани або кянУкОє вишок шо
Ежен ких Ми щит УВсв (У Кути ВЖК укрити Мои ри 1148 паче чосІ пелет ни косо чя шкОтеиеиХе ис сшК Со мо їв оч опа Я ди ий дих оси си дю сира ов фе рию кр м фоф кину м АК ую у зЗзаУу стахччсстаєс звасассоссс ясвиссосак фбчоааичсх мокеЕиксав пає їла : : ; : : ; - : слу мити ку сих милу ун поле долу хіт иче вію ВЕ Кім жо в ду Ст
Ха КазЗи Бл счаззЗиа пиаФимамихх «МИТІ ЖІ Мис ХАТКИ ї Ат са и и НН вв НК У КН 1378 шисФеашочеажи засос поза песик пісне свв сало Адкю доти УА віче І ЮК ВО уд івиия Вихе до дичщовІх схоче и і ай ати ж шив имаиа пвх ї шати спсСтавсчацщ поши кия А
УК дих у у усихии Км уйних жа ик ВВ Фоми пече фо оках ік уєвик і о у муутжи 153485 пмивикитаїт свасозивацев щити тпспазаоалай Клас лука і5359 що же умо би оду в вкупі ну мес х оо ово хм узи ЗАЛИ ксщшасвессо сова ашЕкЕ скссЕвчх зусвоголавз боса кКалт лзаслок Мами о жо уро лк жо сук дик тому вихо під Де дт и дя НЕ ззивилешЕ бсескасизай Хот Юлсех Кхесвинйисах атестата век 158О сур В Ед дою рих Фо фо мит вон су ія модою им ик в кт зЕЛлА шанси стабаслтє есзвішЕс акзкоссвкх заавсаскссе пУуставкисЕ їі рони чн НН и НІ в НН те зівспцабсса вопрос ссасесоаво сте кКавстеко ксссатвот аоцтстова 155 що ат я гро пес Іж пи ге М ВВЕ ве кМіІдІз цих міді емитвуе НК вапна вто стих завити па пес о тах СОКУ ХЕ М
Де м феи в Кий но уз й и ужуи ких лу ви пулу кр с нн в НН селу 1зйаий «пит косе сввисаахас оче иа липа леАИ Келих є ЗАКО по моху що жи щу г дохо Кох Е Мою ес у У и тут усе ою фу жди че зчзавктайсак шдсопвчоазехаз сала чесасвзавосх аКосошКМ пис х ах захи мол хх моке мому их мо уж М ем уча фи т ж мими пф ги І хоче Вир ча нн асах пазкмисзрає свзисаалоа кис ствосеатовх соте ММ си в оч сих св ом М учету о можу істоти о луг хв Мих фи ро гео жи р сиру зи дсткцсекоис аавбцслецчее молозива азс зоБссвацаш кофе і1зво морфо І іо среди кі АК щічках. се ск кв тут пестпзоІдлаз паскптадсаст воза шара хто екс ка дип а МИ
ШО : м . за пт ср одесити відки ств ви поту ЛВ у офдгви У огртх зІвоччЧоки акссахли бука тсІвЕс сотослиссв заоч часте МО сова стаз вчисайаесваа чоахоипазва звзасвЗЗза попзоавасчаш пово иа «А
Утриско свиту мо ом ух іх муч еиуМ мохи муки між и ЖК ділу ху См
МИТО п ПО щяЯ их КИ гЕ чх Зах асощ шо о коляски ж М пити туди їхге Каси чи кі зи пасиви пот 8 ВІ ууЕ лит ср с прочи сЯо сис ср хК пасмо чає «ЛЮ чишстотосоа бІосож позавкитено зесчешипса сзоасвацш зошит як степи нцсх войпласзевза бодопзлпоае баБопозсте аасевЗ кава сова КК тими вУмшавеУвчяа спос пера Чесовчокаа сивою Емо
Ктсоинеан аспраан сопависасво бочка хиФфесоплас пошив яву теру ЖІВ зи КК уми их рису отиті г уж и В ск пи узи и щі дощу или У черстакикниК павко пише шк Кам еу КУ скла ци ше чок ше я шим туги фу их гук у ухихих ау ихуфусеже ва суку с дит УТ оту умі фору татами вух зу: чепсчкиссх потоку шес сапозсаиКе попе сасочко поси КИТ ких ссщихвслази систе спозвссзсави ФіІзасовсзіа вика сасвЕакщчЕе Ва ву туту НОМ вн ж ню ен нн А НИК зх цикчсвиКке посіла а зиск ах пло ВоВ сода ас вача ее ми рес уж пум іа ркюатм о же мг мо умі уже міх мучив у ух фот кзуик Зпдиа «свое весла соло свзасле»акчс песо Коса кош речи му АН зп ик ит их пи ее пуфи луйм і ти муки и СЕ зичикасваз азс зоспоцек зап лаалоиция состав засос «М х и з, Бо че М З сі а їх че Кг т5 ша ла МО ос ія пику и соту си ФК ІІ ди туф суті Муфти пи учу тихих Ки жири и Ж зЗпосіссЕоо сода оссоос зосацевсо спо сеопосесо дес сааоа ши ее о НК я аю мое сет еУохоуи бцІувеУцх из ов им схе, Зп кписсдЗочм бассезчаеи севипсшаци Базстесеси пошко екс и сонати ти Утворити у ри Ж сек еую в дО мк кермо шал перо асо інших сивий шк песо перс по зим спесосачийи попе сінцих бек свас сагувиасЗвВ гепитосаєа зпай пшссисезоаам ЗсшчшеКоах сис песЗззесав Секс ям сїті1М з348 тА КЗМ сю пиК
ЗК Ак дих склу» дідусі ніохте ті еблухнв весь БОКИ УМА
«аа» 55 часонвацс вхвбазеВЕ сосок ссосзпоумн асокаеєсуна МЕСКФЕВо КО зстазтчдлєсв зспсвосває ассзастссо пссасоанес ссзсЕБоЧчао Сосхоаске Ма зписвсапУу сусп зтУао паля соуала чападизаоа зкоессвазоа перо 55 кетоз о «асадаваста аабсосоцех соЗзЕксВтсх зпеосовозЕ суасвоцетя Іо почала соц ФоаоЗмни яру стуєов кофе себто дО зсскопсовЗа сапппссаое посадова зспоассавоа сао соао сала зо титщсапиточа ссздппасцоа сппсзвососс дпушицесши авшоаесоюи молота зи чппчасикех шосчасксцес поспзосваис азс посесезахо осо я чисзааозиши ваза цс ссеасасечаи сус сочесу совацоихос сздвачаВо Я зиишишкссе ковша ссвожессас ЧаВо сз Че зазосашкІах яп чисуксстайи аск ксвосвс счсшсоскЧчас часоасвсса спсовасслезяу радше паєає 85 «ваза Ззодацоасоаи човни содчихоазчсое бавсдааати полин ТО зпсспсрнве зола севсововаа Зесеісосо сопувовусво спо коу то зх свзазх азокеасипаео ппапсосодач спожамнв сосна живо ша коасювоссе сазозосас сессЕцсоа садфааосзвося арка ста чоссосаа а «соч ис селом сссавчосс зоавосесх запзаасЗКо ЗИ зпедзсассх оз пбсозазодос соузтасвоца зотасстоств ссустсочео їск зкчсассв взазазчачез сс песівстісс ссЗзосссицоо зп ивосомх іо чЕзассоЗос сзесашоККо чо ссУ дозор ссбасммнЗ се сасикци МІ зосдчазсказ бусопесоспеас посааєзосво Бассосиусех воспссосоаєвас зсссоасоасе іо місЧчедем ооивасих Фспоседевас бсопассс осссавзсося апа і-5БИ таєФкзчискоЕ Чака сах стале сазс бах ес павоссаскОЕ зп иє и щисдмиса Коссак зале азс бавсгавата зЕчеквсах ККшсТавсо 1383 чеписакскнои васосповаи базвасакаєЄ загавккнас побввоасасзх асцпикавкех МЕМ «хщччсчавкх жук осаКахЄ сивпави чавпааклта своє ї48Е «шій г сжвів ЕХО квішШх дн віх Ножобеци зів
ЗОН оду тю м и бе жим и нот сутки т пуф ир ти п Ох секти у и ЖК оту ше її зЕспсптплаьса мила посайзалти авзисашка сазан век І фото до жов юн Віце синя уро ри пев ди икокох зх аилоападчекстЇ сезЗосфащилє шен МИСУ ОХ пс Ва о муси Мк пон чн НН НК ня заг зцопзалпзаса посавоЗаасше спсеєашиек систе Фгозатавє копеюєких АхеЮ
Моз м их спи ув ес миох дхІзИожихквгтт у Мітки Кеди ри ЕК За й сесзишеаоє солена моб сошки чаєии Машею ше Я пЕгссдидй і песня Мово мрМ стат посилено сосНИиоі Ве чи
ЯК щеасасц ККУ ЕН КК пЧУюКк сродртучьа сеча ФУ ям г. 2 З пику З г їх у є. жк ї- я тю кі иу (у ТД печиво тет піти с МК Ки схе уми узи вМиЕ гддииетуи ЩІ зпесслацоасає опочлозссиа попе свочзассЯ засо шко же су рев ух тв тю ее ро сороки мок ср М ун сх Ким рі ге дл почата сшалосухамьа сс силачслю папи кукси села хе рн я сек третини серии ть щи р ак шапка зошсааксше залог мана сист спасе ассно Змі пи и Н «ду чкжмнитчоса засУуюисихм чел шескшивсша боса КВ сука ву ери ух их у моху щі сходи сміху Бім В ЖЕ УЙТИх У М БІЖИ ШТ ж кочг сповосасант спвесивсс піни: овоч с ОК Не зтавокісзичх восовзцочса за касиво ззвоасаепзо аччспапода паса У ей уз й з А о ван яри М и суки Ки вити У Комахи тую спсзосишвива боцпасие соц жсепО шу ро а уанНй Пл тао ТМ и НН НК ЗЕ
Кожна зо оселекос саксахозоа кУусвасіанйи зосоБосчахм сосок ги пес изожу ве ому ди пуер ку сиза ж кити КО ЗИМ ІТ М іх плюіг заставити хоча Ии чола Чис мІки по сгеаих «шву пек
Е гетри ож міки фу АХ еру ІК Кри еже и ЕФ У М рик ру є иих лен жшасзосаалоа ласо че оди Фа сгхах ФУупІрасІсх сви пшепскрросня пс пдрифетету кою др ие Орів лу ит урифИия туди Вч Іти Кри фу режі ащи ззІиацминю вас саЕ авазоатсечино зпесаплоМаша пе океатх стали смх ЗК ь МТ и учи хх о кмимтм рела ті У В я - фол Кусдии иуиуи в учи ук гук туту; уз миску псує уии у УЛ Іеу К усежии Олю звичку шипи почсш сс мКо швом зап скиту МЕМ
МАМИ спра оси ФМ Кок яр тмсих ами утри ув метеорит (оку ери тку Вих т Кору ту перу ую у зач писдсочзитех зсслаасеЕ сазссдозея паза сабак забссасдовЗ чаша КМЗ потр сич увИ ре сити ж Ко суті чи Тор К В др зи
МІ пе шАККІВКХИХ ПОасІОКЄо еп шомиламо порадимо пет мрикимх ККУ дуги тус ому суд ур се зов лки засос асо 3 ди
ИОШ хх й жк Ме М
ТУ хх кА ших нку те
Б Оса соки шлА «Р» Комецт Узі мили 3 ечуми ОХ я їх ог Уго сс їм. хз шо щі Зодчих хх пас ду пої хг ес Уа ДЕ вояка ннк ах ЕМпе УВУ сі Ал лють і У зва Ахв пів Уві т чи тк : 5 її і5 пу тім шуй в пок двуї бд ул Тім Мі щ Фу фену Муш тд
Сех бів БІО віз МБО ослів УВА дав о Мж шах Кщ МмаВвоЗВА КЕ ЄЮ пе Ууду м зх хи хм КУ, М ет ймм лу іх же За нє. бек сліз ТлУук Щ хіх бух їй тд жа ак Авроліз Вхвп АВ То вв одЧех Бук АВ дій Би Бер ЖЗі зви пок дл Ак
Ух ки За дл Хі Мих вк ТК же тлу СЛ м їх їх хіх фу Зо Тіз бле ух ку дат ої Щлю МЕ п чіт жа ож кА БжЖО поч юЖха вне тів ТЕ КЕ за пе ЩО ро чо кауху Ху нс ню баню бух тих хх та т йш У щІ бух 12 у
КІіБ Аза БЕВВ Аза дЕд Ве: Хек дех їі їсецрозім їжи аа евА БІ да як пит ек п
Ма ТЕ ТО Ве «га ща тлом тки ЗУ МІУ щу; Він бу бі ла гу М Ах уст АТ а Аж М: лу Віза лів ОМ МІЖ Бех лів вв БУ Ме Лі вх пів и ЗЕ лі Ул пе від їх Щи Сех Зі Сб Мао хх дз ВІ Ті хв зів Аїз біб Уві Мів бій вія кя дій Хек мів бу ве бів щів Уві ї щих чи чай
ВЕ БИ 116 ямоно вх міш дк - т ковші хи ку я тя тую т ваш Мін Іі Ма хТто же 1 тині Щі сих а Міші и хМпЖ АЖ п ошжАу ах Аз пока вів не вав А АВ хі Пе Аж Бохкнх т15 33п ту
КУ ММ 1 В
ЧЕ ши і Фешеує ОЩднНях рр уст Її суха Ще гожт ЩО. ЧУЄ 7 «и У Ху хх дів дів ж Коти Ве вх ч маец жхо їж Аа жгХ У У шоп АК ІЗ АТО
Хокит фак їм стру СТИК у АСВ бл тр: тек Ул до пох ді Ах ЩІ; ди ку
Ах Бех рхе бу ТЕ Мак БУ піч Тук Аів Бех діа Нів Аза вав Ахо : 45, зу зак ки
КЗ ли ЯТЬ яю т А О ол озжу Тут Мет сбяух Хом Її по їм Кк бу: бу Ех Том тле да мав му їв: БЖ ТЖхЮ муж АЧХ вВжоіжшм: Жак паж Тіз НІіЗ БЕК чик зе ше 155 МТК МТ щи хащі Щі 3 лам Ул що тн ЩО «біт Ук 14 - сх хх А У
Мів Уві Міш хіз Хв о Сбві бі Лів Кс вів Хе Хеж Ні Сі Узі) Дав зав тр хх ши М Апш
Мб Кан нн. ке І їз їх Ж ох те Ми Міша и хх
ЖЕ вне То Зах діа би зЗІіУу Авв ой; ЕБе Меб Між їжи пі пає У
Зо студ Зх
М МИ ши
МуУхкж ме лож УЛ Трою хжи тк 221 хх Мох сих т Жх 2 Що Ми Ж хх ЯК т сх й 5 тик вав оба Тух Су Зіч віа МК ів аб із Зах їез АіВ Іі Мет ох суч щ ще
КА Ф.М хо ле щі їм лі ца ду ба (їі м бом Піх дає (ах будо бур ожив А кю - і ва МО аю УВА шшжх їа Бу ве шу ХО зЕк бух тек БЕФЧООВЮ
За З в зд
Фах йо З СЯ
ІМіе: ШК и: УЗ ха ГУ х о бдру бижа СТМ дню дою ти су суми піка фр Аж
ЕМеЕ Бре АіЗз вве бі Бех зЗежЖ 138 Меї зкЕЗ Суз ав тТух тТУкК Еко ва
Кк ЗА сх ц
ОКО ЗО «М
Мом о Ви Мі їх Щату Дячя Моє боді ПІ ЧУ 3 кг фену ї3я що їн дух Лука був Бко біб Бо Азв АЖ тах Без щі ТП оБіу БЕ Вів Суз дя вка тег ки зу
ЛИ ХК о
Се Ж Жихі ж Ті тост Товух Мк ще хо (т313: 33 бдту сл» Тоагм 1
Же Аза їмба ЖлХх Ді ме Ме зів меЮр о ску па УВА АВ СКУ БЕР ат ми чит «в кю ЕЕ КУ ле «ці тс Ів бе піч ів пе дк йду ща бечу жк їм т хе ТІ чвА шви Уа вай ЗМУ АЙ ОХКЕ ИЧ дах А ВК ЖЕО МО ХХ СУ хи за га5 Зц
Ж дл хи ххх хи хх 1 як Мам лю ЩІ х УК Вл Том є дом ТЛ єю Джем псевд Маї Уві Аве зів сту ВЖЮОКлЛЕІ ВВЕ МЕЖ АІВ Бей омах Ана БА Ах 05 1 15 хе я . о шар іме Тая Ці йду вія хащі Ха Ж хо бут ут удо М В;
Тух Був Беж сув без Нав о Аху дів і Уггі БіБ Ах Бім Бу БІ ДК 125 339 235
Можу У охо ахую ЩО я ак Ма осі ЛО хо хх уж г ХхХажі щріх лаї их ах ех ва вай ХтЖоОок їмшчи цес дія БЕ дж бід век Оовча ХА Ума ВЕ зах як тек
ЗИ 45 Іо й Ми їм йдж о ЗзкеА іа ба іх ут жу Уві єю Фет о йше Ск прук ше КХо гил о ОеХ МІ а КтО ді Ж АХ ль УФК шо АБЗ ОКВвВОУпЕ шк пре ро
ІБ Іо ЗО те ДО тя боту ЗД шт віт Ка ів й ЩА чу дме ів ау ді же овійв зам демо МмеКковлоа пе остАХх бій тА ТУ Ах бів Ба Вів чек зиере ех ї7и ТЕ ІА
І Не. ЯК зи Еко Ж ших Від ню щі слух Я тоді щахіч бана Жим им зи ум хо тах пев Ав Віа Беж віз Се Тк це) Бе бе Бко Хек суд ВО хх тут кет погук їх КЕ ІВЕ я вт свв жу йіМ Дів хі с "Чбюре Хм
ЇвВвжЖ отТавЕ Жхо» пів о Аів 0б3мл 5 МУ АК Ох Х
Уде зах кор 4 ор «я Юма ес зал ке Ак я тля
ОК дик як жо зріс «шій дока Бісскох гл зву и Аме ум нн и в в в На і У В В КУ та поси ватсз спадна поКевокетт сбсвіметво свастоасспоивт спос пи епі риснуиу тече Мечі не НА зрже порожиту я хост вососєтазсвас зошвусоесея спасе сессавезлчал селах совно щей ще м: г і м. . рн не Ж: сх » г. і - ех с як г ж сет ЕиИ Ужуи фтор готи суди Мк еви що Вир г ру их я І сивисаличИ смислами сла ца сроалі вксскавсв пара иеи З
НЕ тІКіивіх спрУдечещдиию стро етеуир Ух гм со соту сту г диу К Аг чиста: фесесссраРа пап пччи соч аи Фен лаків чи нн чн мисі сур К ре Кір муру очи зав сзисчлзачс педазЗисора плече пекли паста спо ХУ и ин і в В В зах педа чеспесозосош пасавличещя Чехи село вЗоспавачме Ба
ПУДІЗІ НЯ вису ее спе єю Вивих хат вих діт р и аиочсапоО ач сви сво зосках зач аци сала ува ху саіслодвас спав уц посієцеасток сусососасос Забпссасешс сусива сек «55 мрадлосчасх поспвзосося схссаззай сади садках «шов ца зцеччсзса Застава соузсениах заз кодексу: Соц що чагсзоссцоя азостуаас сдасосссла ссзуседевг ФІОгесостета зузасезуає БЕ пеоЗаслаїл поцсхчаали асо ассшЕсс впоссосоеаши ссспазсскце сипскошазУк Зап зІауссзсас звозасзсчя засос дас сакоссакас садазсдаво ЄП зва зфасатссову сфувостосх сосувсеусуа сфФосущсова соусах спаоувесоь 48 чУссуаазисч слова сов аспзиссшиоа ссксзкосвиа чі Зцваава вечасвоцаа ФІН поадвссюєо дао соску сао двовуивек ссвовессхв зво скпрсває соодсвачех васзвоссасзУє заадеозчеі чада спас 19288 сдасосчесс зоптасоася сссасетовЗ додсовсте кксовусасся птівецавовь чої саастстсвац вадстоадєу зозававсв Бовувсфом свкусснафа ецасостсяє 3145 ши стаї апаваснчсВ спастися пчсливсВце засув увеаа писсеасеЧчНа ТЕО чсзассзастх зкоєескіса Зесссвеотву ато сезскешачезк Євзвасавах зІКо їзасазвтщчсо соасоскахах Фмосакасо сзузЗзсвавае азвайскева себадпатч ка їз «вкчсїсеаа заввазаася сечо зач сем евсзаквася зас Іва чечшипасчек всссєвнах кокаввосува пес Кс заз «дав ОЗ «кллїім ЗВ «12 ДНК «Вії» дока Бісвіох «каімих АВ зкчадсчадєс ссвосасоза деподеской засл сезезеаосся босссавцшся ка зспутсвосо змревооу) сассесчото аксзасетої сфостевсво спроба ї2о «ссоавсдоцеч сочсастеа сочсаостоео зобу ен сини ївЕ засно Таз оцач ссассвочея БШссзосовой сопцочопцом посох 40 чепсаоєоу сцбссттсоде Фекопосуося овосолочааоо ссодосесуєо овочазеоа зва зпозуаастичс созцаЄвста сузаассолво сасесоваца зочпбсовоцсла сода хо ша пксдастсх ооо сезвхспстинмо сховала л сс ав позик о я чксххсавзце асавзасшчих пмпадчивису поза скиса ззЗзаоцозчех зчачазЗКає ва чкзуцсасизча сачащлацесЕ чім ісвзаш стзссзстадче бчаєсоасиоо Чаопскооавна уза се суціеіхитио дугових Кирилу тре Кв я пром нн и пл псізаваалоз досади волА са автвіллеоо спвсакксвх сопассчаве Я се дитини нд туту орд подих Мох тр утво уту ув судимі у тих ях, пасевискив сао топос Зесчокцсчай срср сващсвиоции де сутуревттсти рих мк ру о сиди МУК іі Мор и дреитув я било чсацчсолпла птуашшокоа ссзазасаява фіз ноас суч вппава чадо ких ТМ постпасостоя чсзчсиФпча зкчошичсаш За ооп спо ацчеє кс ТМ додат чит пово свт дтп труси сек ц діви ваг засфісцея зсссоЗЕсся саке звеасазожео зопзчазечс засос ж форм ажен ик ри ж гу их екс уювих с фичитив пииих о ди ж хв смс гу мив пл «мм ланзча зпссззсва зоззвашис исасзиККе все ва шоежосеняио ан иеаквитнахт Е аа чих зачин ея чека Але пептиІчоЯаи Че и нн р в В зи писовсиешпих зач чавек собсваснис апа ув пове Бипай аа дЛМ скуті Кіті сід Км ци промах тя ди ж ужив жодуея чуУчпалааст Би оп почи КтазЗзач ва О жи пелЕ соня ІМТ я ту тА хеш МУ Мих еліт Зак кет ОА
Мч тепле «пів БНЕ «йійх Жохалов Бісвіск «ва» їм мем іо іо їз лдую мав сім щ Ат ке хв її дп титул Мік
Ме обі щшіу Бе) тТВвх мес зі пі йо Бе уза бів із ко біцп Міз 1 З їо 15 дове берегу Таз Шут бук злу жву ли щі ки 31 тт - їлУуТ Жліх дж
Аа вто пуБ Еко ТВх ді Тахо бі іа Тк біУ її Пец зві Ті Ашо т 2 3
У сміх Йо ус Ха ке АВ Сол е о вкту Тіт да іа дія дів а: вхо, від їв чех Буе їн ТЕ Ві Хек Азов о Твх ас дів вій дів Зі Аве дів 38 що 5
Ум а від су я іх іх Вл зу дня й ит сук Юре згд ев іа біз бій маї сі із із пек Ах Адвотер пу Біне впе За)
Ба У ко ха ХК 2415 хм тт: Ма ех АТ см ми ха Шен щі си їх «а ха їАш МАВ Ох УА ОБЖ БА Їх У ве отві вів Вхз Віа ть дій
ЩО ох Мк Жіуж ЩО Ух їх ВХ тах їх же Кох лах ум хх хх хх ло вав осів БжУ ві пе ЕВе дів рев хо дав З вх зу ла вав Ума зх ай хи
Бо У фехх окт си Мета САТ А й: бут Тіах хи сю ІТ: о 22153 і м юю ака Ах) швах пав ойаа пай о ккОа пе су тТУух ХЕ СУМ шов мл КАХ зда зга ка
В АЖУ хх тех у йо о Щкчу Де; Же бо Міс: бі б Мбеує їм ХА бум йж Дах їжв й Уві джу аю жкж ПУБ АВ Уві ЇМ давоМмечч хаз Еко Аха вар «жк я; з
ХО ї158 їх ге т спа бує Від іш в ил ар ста У тає їх жЖмю буси де ха Ра вжшжОо гро від дій І Ага м обу Уч щей ва шип оз» Аж «ах з кк а
Али У М
Чжоу. Фжчж (3 й тТоамі: Жак: (ли Бр йти 23 й Тана (11: 1 лях уз ТЕв БЕ бій Авробеца Жхо щі БВе Хку ба Аза ев сів ба тТух ск кт Кк: ж
ЕК 15 55 ік я хі ша сао ут: Зх жу жи Жах «ук У У, т Ти В ща щі МІВ МиМИ ОМ ХУ їй об шах В Ве зи Я ШММ Шаах мм ХА щі
Еш з аск пяоу іх ке; во Жде б7Тодаї Тло Жсуж кт ту Вл Деу бок 3115 як бек Му база Дух
Аж леж и бу Мем Ахо БЕЗ бер Аа ба Ні БІ1Уу ББе ре пуз АЮ іа сх 138 ім фа блимає би Ті й тїемз ле ім бує ку у т ик Шу шій жву ЖК Бе Ті Ак мети яп Ваз тю Кто КО бує Виіо йех БЖО ччуц туту яки чУуц гі МТ
ММ «МУ хм
Жде їі Віа тан і я о ет дов їн же арок віщо тему тв ав оз) ва шжм ші Жак ау АК Яжха Її, ув «Ви вій шЗьУ АМаА Ме ВЕ луг -к еру гу
Са А В
КІВ я хх те З двугі Умлут УТ ту ж Фет КВ см т ох Хоч деку - божу Во мк ті цем ук щіп о Азр бла Уа су Сі Мем дз УВА Ах ду ка ех хеуц я а Ай хОАК КИ «З КЗ
Стхао Длуку т ку п с ля тих ЗУ ди 5 вою ки ти М дет й цех вве пі 5іУу бім бі БІ Тко о Заї ко Узі дДкч Бко УВІ БЕЗ зів ча дожоя «дж
У І ие сСогоу зчш Ру удач х а зу С Тодуєї їжи хащі сх пк шо
Беж ре УА їіш Аза Хі Зі Ази Бей Уаб в УЗА ЖЕЮ ЩежЖ зв Ахр их «ик Ба
КО ПИ 7 - тутує Ж би у 5 Щі ух хх по а ой и М - пл ук сої Важ - ін Щі Вк; тезу са й Же ДІ ї- бл
Ах Фоми вай ж Аів Б) Ні ак ха ії бве Уаї Ана ех Дія ДЕ ГІ 4 ие -ай зак ку хх кл фран бочку м МІУ о бу у Сх біду оз ех че хіх бок о Жчуу пк о Ме хх
Вжа Бе дек Мет Ро Тух Бе бре Авй бжо ліз дек Тух ТАХ Мей Удї чи гпейх сту що ТО ЗК
С «у т 7 и, Жах. ЩЕ бу Хода Й ок ух и гоже - Ка Тясчен ум її ок Ід ж х тих мМ лах З їх йду ху : - Пе
Ма ово таді бай пай ме ві Зх АжЖео вже оваер вх Рхз ом ТУуК Дю
За зії ЗІБ 355 й омо тру иряк Му и ж Уму: Ве: Мік ббуюх о щи чо« с деки Же м ба
Азв ТУЮ 5ЗеЖ Бжсв ошіу щі Рпе ББе хшкЕ ТВ Ат Бе дей Щек дз вне кохк зт з
ЗК ЖЕ лх тухег боже ХУ У Му лит паї о т с т Теу хх Ох 35 тих тим Том сх му із їхрі Беж ай ім ввий діє (Мп отІіє Дія Нія Бе пу Був 7 й за ах т ту з У ЗУ їм Лі Ж ее вх мМ У ма ха
Ж
«ие Т05 «ії і1453 ки ДИК «і» боконма БішеісЕ «НН 105 сш иассв смрасссоея сессвское ссвосаеза Фон потових І вопасачсевав зодакодчсов баса свосвковуво салєскмехр о босвоцтию 15 слпвіпасоос сссаазиста сосзїочесаа зесатувУузче висеєогеся ода оео Іо зесесисамо чена пичасаипччє сосзуизово «оса сиза хаЗ «сим сопопзокалоа чес запас сади справу е ще печі счещо Чон очеча попали: злим ицм: смрюасчо вас зво ч«ЧесесассІ Зала тасу созецесзчов соцакасїво пазечааис дозссваова ЕК сщшиспадеацек коичавиня пеккочаАло сіно заслпичосє счссадиваю В кас ссаво зчесзачнкоя сСмМбозетав савеотосюо саоассичо поз Я чепасозалх пеайайпикатсли бЕкхспахсвах вЕКссасовх піавкеадчтшк засвесавку ККУ чавсктЕутх Стаса аач зсзепоачеао засл зисзакоцая ес Б товазскочух зЗзачссзайс узссузавоасе сазаззссзво дссооасооу сеіпозваех 72
Зак свацоча поздузоичасе ссезсссоЗс срраассаств спеосисасло ссоувпеспів то муці с зачаваоч сезоесзазу визсчоооас зсопаассао суши вссачо їж зсгоапатичча садок ас чісочалзе поспішав седицаси мину зап ксенон зоссухосся заз оу бовксваасює сосок зов зви зпчаднсаасца своссвсзач зпсооаю: зссзопчочиєс дапоавиких зір 105о щит ає осли еттю соми: спрадстастас сахисошаЗ ссезапчовоя ЕЕ заспізаоча соезизасдао созсосваак вочасзосів сачакоао записи ї155 чкасзоачиаа сваслазтсчає стсззлавозс ссачоозіа паагстакисях зишнросае ії това остоЗссЕс зоссвовіаа зсазсазек вскесеако овоча Та5О чИизсзацес вуса пссопросумир соте свіє сечею зифсльсеже 1325 спало ас асваатсвай вавлеснсоса стали я боса чфозеалася її зкізаасво засцеЗоесм сбсвсзавзо азвзасятсалча кчсзвЗанаєи посох я виаасвичаї серхзасакс прита зсззассваз абозавлЕца спе тиико із-за
«вій» ІЩЕ кгіїз БАЗ «Жійз ДЯК «ВІЙ дпесежєав зі53їса «4апй»х ЗБ ассесиасвяие сатвсслоаса ссссвксото мостах ввисачиснс ХесКоачеае ще з«ксасвачоо зсвовесеис звосовзсова зососоевос зболосасоЯ чес ко 15 стасзаасиаво босу сзкас водиососхоа цовотевосс ааошелавеє Хоми ах ї8О сесчапЗпсаи сс ес воесессюсс в сасков Часу дис осцх 248 засесцчспуес попере соспазаснВ спос соби оюшо зе а І злих адоа саооаЗежс сопезсемас соецрново допеслоЗаоа посади ЕН цес очсо скоса чезз взсозсвавачи песо атавчеаоо сш чо поедчкчсїао завасозоноє зосвсоезадлав сзссазчазеає сочаазоча усе ссяе за пис миує очи освас спосивсащек сФфорихаєс зпоечачаво сасосоаача зав пзачечссс зевсвостао сдчпавкос вчатиочеко чаваачтаса саовачсах ЕН зтчазвзалоко ово свача паесоачащик зако лсссЯ Звоссавест коза соКов БУ пзчассщмх нео сІюа зсоассвоас паси стаїо «бо савсс випас ТЕ штпосссвао спсоваобсу соби шпоинт соцссласат заФавезссш сао тай пеїбсскстає сацуесчаєв ммвминнї сшеаспесопоа спосо есо шмрчапу 5 закссасакс весен ссоизссших сзієвксавс допо алт сади лсем ай скла ачовзво зво шовея ецазсосоза ривок зсзасавесо софта аа ваччкомсї вцусосовск сскбсваеют засос асоврча и вассужкоцча іт чЧаззесзза ззоочвозчапоу астосцсосссож пкасозоост сасавое чив Ек З садсвссвао ааозаствуста вебісзалаа спла папаалатсє зам 1140 скжесваузжу вушко стаз свовеочаввау зівссасаку совок сх 1-0 часспачасча своє поассоаплес водссивоац свя св заставки її788 счччекскІ цавссчечак пизасоова показах аї візка ва звуках її хшІч ач мето чсозаачслаа звіт о ХесаЕккда Чак Кх ї385 чпоасвзосвхо зазосвастаис сви ес оалтис двисакоча посадових їі450 часно вспажтачіа кскзезчаова зрази баса кх їі
«ВМО ми
З зак
МАЮ АБЗ лю уУце такт ик
КУ о ни и сЕзаи джкхак)В ВхвІИВ са ДИ по огрйш ие Км ит м тех. ам емо моих ту во фу и Кирилу у хи щи
ВЕК МАКИХх Келих папа шу КИ пасм посчавОочита сОесшаЗУх ве суттих фокусу иимуУє пули их из дб ух иих М х спуі уст и МО схо Кі ери их ее вс соВІмМр вис швЕспстохл щшосоМтсшИиМ сОсовсЕоаст оцих АкИ сежст строю тих Фуко и Я ЖІ) пес сед ев идІІ і Тоуз и У я зл часом соло шатах песо се маш ах ЇВ
Фет вомеверуквю сттроиКЕ Ко очоутиіх доферВ ражЕ ИИд ал
ЦО КК хе Чи пох пимрчи зим У ши Чишки СУМ пути ую уд и Фуко вх тету Еф єжухулуУ жил кв Пуск жи гже вилку Ж заззссчсвис ско серолелотон деп асицче ааЦссеєк попу М: сеокіжкуєті ти усе учету в у году мух ІУпунувочщіє серпи кт У Буки еалчисаваи сист Ка соми ос сффазичасвиси вва ще дк х : . сх тждустуУЧ В УМ Моизую ие В жир утри руд уєур ВИ дз иевуе учи т вВодорткии Мих УЗ еф их кл В шзичицЕнош ЗИ Коше зок се ма кеша сухе БУ ри г я. ню ум ик тс г Є пи Ф пд, кою и их в ж си я. се АОЩЕ секс плиті суки іі В мМ тА ФК хв ах чо спа вазасазня зиссцааво соуси сла цадаи випа ТЗ колу ик сут ті угуУгтУ ди бик чих іх пог их сих міх Кору тити сухими г Й кзсахсзсвааз сслахзчзавца дощової заздакатст засічаслос сопло кИ З пулу іжтуєтиви сек от вия отут и Я их уві ще ДР ВО виру их ЩІ засссшавччс сізасвоаме зсасччиккс беіпавнен зоеБссессех сабо Ве пови це же уми суми ЖК Керр суди ах шт пасксизомвло сопосссунос ззосминас сопоосслеісс Зо спвоисо писав пах н 5 су иа с я - . - сами с г. пеки м боях
Утеоуитит ух Коди ин о Ми туди птосеу иеровихт ТОК дек тки зл припораноцває удо ск сти пчЙьас цеси оо шичанк шлаком г по у их пк ок сту ою Узі мі о У зують хи Комі М МО зп дик тич дО постоешооо влипоешюю спос смхк спос диких Ж опе би теку их Коси усі В стем ці сх щитовУкю Моз ихіхІіЗевиий ФІ киудІузав ит ІК дих ат чашсистамос азотну свасовсазча пвпчадаоцосс саше шиацу шко плеча дама но ефе оуожЕрии фор сх спору сід апа ззпшезчоаисв ачазаачаки ствола каска демптоЧченимр саке МО
Іти Фк мусу ти тусу Удод схе вт рих кими щити хи В дити ую пу чЧкшнриемині приулацос ЗЗошвиссовоа дчапоасюеми сопоФфевома сиссевогах КОХ ; : - . : . 4 жах ни ни НА КК В НН А зп
Марусю ОК ОКА ЯНИ ОН хи Вв о адчазЗОсеоЗа само алаею Ма прі сумкою иа жу усу ху тує ххх мухи уже у зх авкссузкИш песвЕпикства фарами Зх Ух шлю зх жи з
Ж їх Ок сяії» З тихі з гг
КИМ БЕ тка - : чо оже шле ух джемів рих хе дебвхїа ка КьОвВ код совуи «аск ОВ
Ме о (2 «хх їх .ЗуУєсх Маоху Міарк йомач 115 ФШемк бах її тт щі бул ії А дк
МК А ча у ЄДю щжех КРУ ЗБЮоОБЗоАМ ЛЕЖ І ща Ом лю жКО ам ОЗБЕХ 1 щ їв 1Е ї ме КУ М
Може; дУктю оглтхо їу ре ації Се ке 331 уд срімо гіч ло а Тахії Же жу хоч Ех ду ржО ТВ Узі дп ій йів ТНх су БК БЕ я с1є Ар су т 7
КМ в Км сх мк п - яхти хто вх кох
Ж х я пе тот и 11 г 4 3 іх мух й и щі іа щі Аж
Ме; дек БЕжо Пе тйх зі піз БІіУу бу слу взЗюК дов вьа вів Уві АхК за 48 : те че з Вії ому Досі Дал суху сту Юм ка 1 - ж М КОН щі з щоїМау уе Аж ж щі БЕ ца
Зі гєз діз дів Бій Маї Зіу йза Аз бек хз Аве отжв 1у Бе вве ек шк я щі Зх о с. : гоакя хг х. х пла вве пал о вла дит щі ск г щі сбві піс мл: а ЩІіЗз Єві та дій ті так оУді бів да дід тв х
Уа УВІ Уві пІішЖ НУз бі УдіІ ККОб ВА сх ТпК шал бів АЖО А Тх ях пот зх зв їх п 2 ще
О-О пі піс дк дів ВКе пе дів би Бе Ре 01 Ак ув Мів діва
Зі віз Бій Ах чл йпеоХиВоаАВв Оеш КЕФб ле Ач вАКО хУВ мМах ка т ви п З а за ж с одео дее піч дів Зір бкБ їдма Щі осшеу феок шій Жадт Мі Ні тва ша БЕ шк АХ АФ сх БУС сама бу яУУ Жук ах Ж шАЄ ІОВ 7 пу У зх зал їпЕ 10
М БНО сво 2-х ся т пох ду бе Мам у ж но учи Локк твуЕ уз Бем Уді ких Бк оїЖкв о Бу 1 бі Сбех дер ої Мді бо ПІ
Іпх вуз дал о Уйі ЖЕ ВЕБ ОЗЖЮ ому дай ха Ух вже вам охаА ОККО ху зх за 5
А МУ Ії - я що ж их ек. З «5, М го йог това о я Жуж я ї- Віз у іа диму; і 1: 5 ді ие слі пі бен пів ко Хо Ті бів Ма Кі бБЮ Іі Ів бві31 бак пе и - з ду тк ххх їх ах АУУш А жу : сх 7 хх - г м -л, й ох Чек Ши 1 бю їжи же Пі ше Дт і А тем: па ів дп зу КЕ Бокс АХ во мии ожхО шау ле о лУКщ Ам кА МЕМ о ща м т какая «ж док хом хщ їжа іа ях Ам І ет м. Зіт бів Мет ші сій Їхю; Кля Бо їз Ті їоиа ій їжи ТЇїю
КУхохнах хм М тМетУ іїкАШ ВАМ АТО Мо УТ мух АМФ БИ їхАХ ЛИХ ЖЕ 7 «хх тк зт
ЗК Аг АХ я пижмо с ох - т біо тс дж Тана дезу Шо Аді: ВМхт їн Мі пі Бе ча їж хі Ахо Бех пен Ава їж Аж Вко ва» озАхе бо НіЗ о0фУу Бе о Бле Буд ї т 1Кц «п їх їх їди
А ях х ге ж жа фі б'ю ваше Жах й М4 о Жіево їж фо їй о Зах
ЗвросаАт Тих ТБ» Бве їіб Аж ме вад Між ТУуК Жхус Ех Су Бо БФ т т ми ж зх Зп ле
АМІХ дм яшАКО й « : - . я ех щі ж щі
Те Док ї- діа без іє Зді пі» дез Чіз Боб йди діа бі Вів Ї2и
Тжо Ажрвобец Діва без зі Уві сі» Ас Ніз Був др обі бо бів Се ри пк злу
ЖІ АЙ ПАМ
: ге - : її о щу ау т ких Минув у ку перу Я вах ау; хек 3 ж Жах даті Мало щі пл Та МХщу Чи А ув АІЗ злпх ЗА ЗжЖМ Кк Зал ВО ЗВИйИ УЛ смау су зи пр оха АКЕЧ АІВ Ах и ха її а ти - я 2-0 ту « соч їй ни вхачо ем о дЗкеу тЛІх бу Деу сті зе еп Чаї до Жаі їчв Вт Майї ко би Шок Бке їі зах вав ому сжюЮ АЖ ех сикК мА МУЗ ТЕЖ ХУ БЕЖ УК ЛЕК Же ЗАВ
Ах КУ її п ї Е у кюТУ их доню жим
З м и". ть т де я Мал; дтку в; Кі Мет хх тує Зах Деу шт Аве бли ТЛ їв Ада» Мал Би два оїжч Гі пів Уві Те вишах оша мак мкЧч уко кю ух хх іх
М с «ІВ тд А кажи Мо Мох дж хи хр дику сум Ко Ти ія Мк Мк б вах дів Зі біз Ах Мах ТКУ Уі дей бер Вів Бдуз бли вх ЖБе щеХх
Ти М пк дО я МІУ жом туф старш Му й Же мої Мод гля є СТУ Ме ху бі бю іх
Мт ха тТУух БМ БЕ дЗо ЕХ ВІВ Ж ОО ЖЖХ кі МВ осСбву щоб ІЗ Зах как щи зем й ЗУ зво кеуіу же тія Мі їй ща сг Щ а хх шій ЖУеиу Ху ов смтєюю шо бах ж бак їх А хи МО ВИ УщЩИ ОО ІхАЬ УХА: Хе ї: МЕ Мт тла ул ЖЕК Аїш 7 у х вит
Зк туї т чт Е лету
ЗКУ Я Іі їЕЙ сум ху Хм Зі У І бар сим М ня Тожуд буде бо Мод Ух Теза Тосхі Її сусх
ЕК щу дз вав оОБлде ех беру дк мя Ази ех ди Бе ої я ЗЕ Ми хх й хащ п ах У пок р у: дж Ж пін ту ща мі би тан те йо заї ді У ЩІ
Зех маі іч дао Їіїв Бі лів діа Міз Счзе дув Ах пех Уді дід Аїа хо з48 зав «ж ш ДЧ шт зад
Ех МИМО «валки ДНЕ ху смужку двці их «ії Бестахі БЕЛЛ ИВ че «гу «ЗОд» 155 восссавласа спос села стиск вас ори зЗсавли пл
КИМІКИНИЄ Я СХКОСЛИХІМа хром рик Вест теку а
Мові евро и ви СУ сх дере Кто их фури ер дуг в суд ра сткпасваис зсвпавалЕсс своловЗпаа адзсаЕфаскес аоспрсвЕцЗЯ пес КУ одіж ію ів В сти дере г п НН чЕщй чсакодахсе сушили воазсссссоца сдапассоогтест заФфсотивстсєУ бони лофаяає ше шоу кз вив пухку см аа ци вдихи (ЖК Ко уетехитекихю Уч лу рифи лю гу сакзчоасаво сецебовксо зсссовксоо зпксастазс щоки очах Б стуки ою тує іься строю цвіту жу ІТК УФО зр СЖІих і Мити и М ГУК В ет тт зуссусууво фоускчоося собача сусоосеоо сезуасков зок осесех зпо
ПКУ ке жна НІ КорЦоКх сс куми оо Ек ее фі ни у ж пече ин фрези тк лиж вуж дж те деки сирим ги ур сг щік сосвоис спосо зіисчозаашо пелети виачасиоеа соках ак по чо аа вч я дп пи овивах ца пчизпайс впсозостстайдлшаа сепсоа Кофта похо шаши У
Улу й чити иту ТУЄТУТ ЕХ ТІ тут В М суєти ду ют вити ЖЕ дити и Кер сзгу дор код шко ск ї пет схптиа аа спростив пис айек КУ са нав а еуцоціжфтукіутиті тс у щури см жим Едді ди Кф де леви їхай спвачезчссс зЗвазассочс свопи сая ЗКоаваковас сезосзставхВк Саух мо м жук мкм фуга Кт суд іх деки Куди це ЩЕ дане вав сче соссасов СІК ОввоажЕ ВІКУ х СкаКаККхх зах пу чннн чн и ливу моду фуга уч мВ п и нн НЯ татка зесавезчвко сова ай СК ха ДЗК ссвачцвви Кок спашвис ХК КЕІхяВКУ сш ї рем их дж миємо тм ШО жерців мим соток хом ух ух М взазчлахсвцаа хан басплодвЕв кцасизичав педа КМЄС БЕ ліф фуд о смітт вро мом и тумоуУЄВ КІ учи вд фон, кових ах пет спахлиь своозавчВО писав бдваврошоуєс хвзвасеев се Босеи ши 2 оцодох ль Ки упо ОКО и чере суто ж оерижівия гоіж фе і хажіточтоя Му зп чххзаавстиІ вссолоузеале схопив азИиа пасмам ач паби: залив Зо зазпогава бпоавоуакас козвостовх «сшоссодавом сшоеанисоя ес За зекосзссвх поликсавоч висадавочс береш со стсаассим вихосгшоонпу мВ пвоесповдесме паски зла сози сацосалаа зесолсзчаая шалтпаскву Кто сзсїлтастево двочасЗзксв чо аекоза сдеосесоє списа вої поза 1143 спчцсзбсаа) осссдтоссоо веЕкестЕсак сагсававсзсс Фчсазесеке основ ох Б звзсввасазаа дсесхастсв пелоплайаксо фЕкснки пптавкосот акІлапоавах ВЕЖ кжаїакстеов сасзгвсоає совувектЕу сао айсааоовса зотеасоувчая іа шкчиччазокх пз ставстс сваео ккшсссааи свои її сеаасоочщоо часкаспвосв Коуза часа сезон осо здали 1459 чЧесссчарає часпфооссвсвй викоафутева скжектоадо аскаозазаа зоаочсавоку 15 спавзавадния арпчошОадав «сасюосчови сфоасаккіс вас сало іо пчабвсасво зізззадлайсс свсабоскоаа соло ащць апопсчасави поча 1555 зЗксссслезах бсвззачавскоа затв авеста поса є чо евВеЄ сеча как і55О шщшаснеасихки зсасахакаї козлазашжува свое а Коко СІзвипсдиза мя ацісзацаск Єсоскостаса клсслЗзаахЕ Іза азпсаїсзато зас. іо тсерассл мецсхєсдатс ачелпастуа доалпссозоссх стзвидласва зпукласега яко «сдаззайкцх свущкахаєа арх шт КЕ си ІВ «ках ПУТ «їй дик ка» бхута зажіха «кан 115 чачссаспвасо свсасасвса сесвотзикІз сесзсзазвос сдавсасЕкч зсктасвосх. во «спассвоса зисваслкчакс чвосзкодас щосскетосв кодам: ЧО їх шесозчачо апочссосай зоасессочес Зссзачунвоя зобчазосок чес і3о писЕстссУ ксоттсЗссочцос спчсдахос засос заз ч3засус зостечооЧк и чачзссчза запедачест зсааскоащУао СссбсзкаЯ зеасчсста судово ню зеичспасчсо; более зпосчувацуЗ стадо часяк стул НОМ зима ДЕ стола солоЗпетоц пази сита очам: чшицашини ам зпсайацеаасп ксаздачастоя звасоаазся гкозвосеср Бсспостасса пасти з понуро у цап псшисоавасза спосте сзатаичас сота сб зсазсавапко запоепапуає дрО у ужиті рв ЕК Із о і ті сусиекі Жов щоА У мує ту пвев р ур В их дл пичсесинрвх псвЗозалас «віз чтазчач свозусочат поча ав часом У ри в НН А пз дрижиж М дм вх шу їжі (жаху ери се пу ж ери у шо зачскчен велося сазоаацзоскєс си о сбпилшецени вових ваи ве руля ку жеих сту ща ія у в з уиту Кредо пре ен печити их кл кисазичасо ясними бос шахссцо сСесаЗсшАК «шок лО посоецасве яЖо пасли Жести силоси пасом паском пеки лиа Мч ас соус симіссоеа Заст Сесихвасєтчс поса инеа 5 кн и в, ВВ В НН м пай часзасзиу чоло песпопессоас сазесоміІвишт почала км аю уж и дув их поки штуєцю суку ух ут щи Вік Кеди пу Кт тт песен шсс золоті сазосавочес зцоеавиаксв сосок чвлсаакочае шу пусте Ім ттитіхте виткі х терито серия, гер щит геть Ж гуму ти пи взоакасзеов чсепосоашев сствнуєтасто дпезчавсчкух вспазозачавиа зоре М м НК В і и В НК за соки нсшно ссолассощяє папепеасвос аїр созовтх сво ача ша сно СаО сх джу щи рови ою ов цехи сук Кай тою пед вит и ль тп пасааледео сазосацаа саассосстас вас авткескоев Ф сао 105 дасзсвасе спадлпаапе задечеспацч авопілсвапв ксасисакк: сапидзвдпав чав ажпхнванеєх Збавсечии сдавеманач асо ста саше ша аи М Ач ївасєче ЩЕ УКВ МОНАКО кесачовава ЕК свавіч веде су їх; сасвасокеВ МАУ взсшоетшо чзссвкчазьк авбзахаксє зозасяассах «сага свзаксеву дїкМ
Е ск ифууухвию жоеюр и ушичих сів у ож ко пуб и тя ко НК ча атстоЕчаскос оба сазана акчроаовУ згаззечало зав На кот в ртуті дв ув КО опсзгуц цу ХХ оси фу ці КОЮ ау ф ик сх ча каско енсу виставок кеасазвовеа свзічспапас спасвзасясси пуща КОСУ ст ТІ ул ТУ кА АМІОУ «яп
Ку ЗАЇМЕ
Ух, уж ох ФО их
БО АЯ якКула шАхча «Яяпо 11 зпчачочсесс бшкосвецаа пиаещиокою зби сезацевосоя пів Уєх Бо с межею ик о мор рази ие вия жнив ж тиж жиру ув у ги три сис палпссеичи св песо ЗЕсИЗИСИКК ше ЖІ ХО СІ як засчсася созасзцас чевозищокс ден яц кожен вас таве АЗИ фуіху Ексмо фирма о сер ую мито Фото сети регу у а копа соч зодповзочах Фмросслиза вопсошує зошит жо цедпсусеоз совок сорофсиоєта ссашацсюа Фаесоче про жи уч и и НН з зачосзасде слвозчуува севсзсвкс ЗеЧиасвока зоавсчесвса зувиБ аа Що чарки виссстскауюачх срофссечвет ихросоюхт смассвим пз Е ІК а пЧоасулосксое піс асва павук зчаспаєстосх озезакосачз сочапосваа З нехитрим сиди уки ф В оо мови фетр ик тує ие сир що Вуз тим «и тата зожаваселЕ чцаачаска Фо свас Бшчсстротх паб спитає Ж пфритуу, итічітх фути ии миру ся при и кт цичіжщу ьо Ід ких жі вишу ше чи Каша шсисе шихти есе ств воша щАСИВИИКХК БО хни тисяа висоти кепсичекеа мусом коЧКино зас Ба
Арон су кути СК жита жу ум вити ушу жому туемітсх добути утеих у суду Ме пасззвоацвоз сошосчсист смс хаопзоцеасе аслЕсасчя шелак Не яку при ижик ОО укжхуч пути вити срака ай й приручити шефи уривку ду т вух щи пупсчиах ям ВМиниа зсшицчове ФП ЕМ Хе Ск АНХ М пол сту учити сук кох нин рату ом кут щ жи схе росу гия и ОР У и зай заслали позах иса зпзЕчеаналс папи адяех воша Фацлот ом мх ша : : ; ; : : : - пий ре ируфучезии кс поч спаде и ке Ве ЕВ фугу пл зіва чаов зпчізчачав човен прове сссе ксобесксва сстхоцоНо в пд и од щи ие т жу сІв ее гг ефе схучи схуд им сит Вивих пюшо песвосаш о ассие ї. оц чис сотнею Вр есКх КУМ х У пах своя що оо стуку и Юди дих дру ифіх су ох че ди іх вщо сх ими пі чл їх шистасаакЕ чола аакк суксачоаоис вопавсчайеа туя плтбптавз завВапсшиаи МІЖ жу КІВ типа часви сиве сви зве кг до У форачвас пса чив ОА УМ 27 та
КАХ хх штук голу «ій» БлЕ
ОМ ж туюмсущо шт а хх Ух в'аиакІа не зом «чай 115 мах га, ху Ж ок Шеги Міую дк поле ві тбінігз 25 71 Мія бум пів МЛ а мех см шу ПМ ОЗНЕ Мен ода щомлє їз вве У«І Бір Аівз Бк бі НІВ 1 ї НЕ їх
АХ З Що ал же ки Тупий щ 235 1у доух слу ті пану ці тіг дхух вх вхо Гуз хів Бех Уді діа хіс в) да юю ос-ау ЗАВ КО ЗшК сашо АЛЕ
ЗВ хх КІ дл КУ ям
Жду Сбжум дих Там Тих Що хі 11 дае ті: ух її ще хи и Вл
Зецш ЗЕ ХО ми Би мів КА УМ су НЕО Ах ш дів МЕ Божу УА ОЗЖІЕ сх Ку мк
КУ я «5 1 ХХ длі Мій фу г Зк туз ли дет іа пом дао дош у іш ОК а ія їи Ав бій щі Уві щі У ХО мав юах Ка АБО ТЕ ол у гле Бпв
КВ За ВО ку жк тв т: -і тої Кх я ко тки 1 хх х чаї Уві Хваі Ажа Мівз ці Уді Ро дія пів дів УВІ Аіа ха АТа лід їх з пп
М». м С Є пір; т пі дту ж нах Же хх Темі рей бе йти ку Мк Міда 51: зав ДІВ дів вжи ТІ ВБе ББе Аве два Бус Ів Бім оку дхч лів Зі її ПИ ШХ чиї хл. жом баню я г ке Фати жу и бак ох пШиру хто х
УЗА Вів дк хек бу ів із го Ме фі Тує ТК вів Зах Бі іш тйх ау «чи 1218 335 На
ТЕЗУ рова Могзх. сти ун б'є трос жк кох Ха Кв. Тих, У. З ск ючи
Квт Ву: дві бтзі Вх5 Ав» о жбХв обу пій Се ЕБе ба Бей Маз вк Ах тк «лк «ах
ММ їй 15 жу рх Яку щу дім фуж у сім су йороа лта кг Ло ку Жук їхАХЬ ЗІ ЖЖ ЖЕК СХ жо КиХх о ІМ вав УВА Бай Ммшг Ах кВ Би М ах чЗУх хх тат жо ака Аж щі й ме гемо т Усю ДМете Дечу: Тези Южкх бле бічна боках 1: Від Мак сте дв о Аво пув ТЕО БО АБр оз фев Бий Бу КРБ Ат Бій дія Ме -хЖц «ку -кх тм 145 153 155 Ж пі ой ноту піс дій дій щі лім щі їжа Дід ба лу блеми іс під
Бай ої ТУ малу БУМ ох Ущь ЗАМ МАМ вим й кБИж Му МИ АВ оОшБА зак у гу Ук
МЕ КК 5
Удміх і чех Хокг бемк о Бах 7 Там щокою Маму М аж тує. (5 м 57 ху ЖЕНИХ інв ММ кА см лек зн) шмаАу ожи вже КЕОб пар оахчЧ меО аа Ха пе 18 їх 15
МЕ АХ А
Фрі тео дат дет ім би о твт пух Зх бі Хв м Мі шо стТзюю їУжч ТУ
Бе Му АВ Ав оБів Так ТВ пе зів Ах Бей Ав о Нів Тукх БЕ вже зу лк гу зд шовку ша м шо ут бик м тел щі т (юю ді і дет Мія теся ду Мід -уш жЖКсп лжи гХт вже о Зещ овая зим оїшху А мау вЖЯ пл Му Вр опа 73 Ки г їх КОМ ша М полю В тк я дж ощчух мух и духу дос ж гу тля Ж ху хв щої
ААУ ав ШО МЕ Уха ВЗшЦ МУХ ЗАКО ЄММО АВК УВА СКУ Фуш мем се УА - жк зх рт г хх Аа о з шк ТУ Я а що як ЩМу дав йамиуу ІЛ 3 3 пк 1 нн МУ Ак и ХМ Ух МІУ
Аз Ага вжЖщч беж дер оші жі ТЕБ УВІ ІЗ УМ Вч го УА ЖхО нав 245 ШЕ я «ек й сів Та щем ра ті дише ті тів пів МА пев ее ще шт я ЕЕ їла зів мап ха жу АБ Ода дАж ІВ Уа ТІВ Бех АБО АВ яп ташВ же
У ФО І
Фбокаж бук о бл при Ві сти ціх мяч зн ді хів жи ск сії Хм (4
УК АУЖ АХ ШК мав оси Ома БЕ Ж БА ЗА АВ ОУВА І ВУЖ АХА
ТУ ШЕ хх
КЗ де и щокою ОК Сезк о ТЗ: Ме Біне МБ: ва де Зк дл іі щі тк мМ ле
УЖ ОК Ва шЖкеж їі: Ех БАЗ вве Ба» дав Бкпо ій 3 У Мі Тих Же Ух Її сюди зх пт
КУ З Ме
Бач ж то пе міхи хи А сум х їж: Ток Ум в Мои х сі шж Тивіх ФР ОХ ща У Хм гу За кт АТ дви сту км -АВ Кс ом ЗОМ М Кк М пи Аве ща шжх КК Віа АК Ух АХ зх м зУк пт а 1 Ід ко пу бах кн беж ях Ж ІМ І Жах УЮ и Хкк В Ха йти вк ку Жук вві ТЕ зу бім Ба Ева себ ТБ АхЗ БУ Аз ех Ваш оЕБе че зх зп их ЗО З
Хужах о Ж оудхю Ж я Вс ЖК КА Же ди сту тт не ни НН Я
НУ лу ЗМ МК ЖАХ йхв Уві бій з3е вх пів о Бпе ДІЛ ПАЛ ЖМ зам ик -к ж зах ОХ ї1и ск ях . ска 15 кв склу
Жид Хлухя штуку тане «и дик иль пеки дея їхали до діа ек МЕЖ ВО
«ат» 15 зазссасвоп свозсасвсва свсапоєско сасвосатяє февсвсекек деовсваюки 5 пієшесасся зсіасвовкс дассасодууєс ауростєкосся срортовоух збоку іхо чсссессовшс вссососсаа зош сссасо песпадасло асаценіссе зпктахттрає 185 скакесодог пескофеєєо соодахо зесопофа Феубдувсоо дексу т заччезочея печечачессо зво сЕссссаєтоу сзчерееов сус з чстчааисвя посусцозю Зосают саесвтях бохо оса ко пами нкому осукодедсс зезозаоросу псусотасою Фубвоєавєоо десофамемк: я зссазавасу созззоасся зазоузазато Єбрдфаєстод бсссосзсоа пасоссоєо 459 ссммхнасва соопсстсцюєх бас осв сезоїпессо зоазсвацея поссзаофає то скЧесзаЧчеї Ксвасксвац бсассаєсакс дассЗакищЕ ссбзкекако севосакова БК птсадіссва соксвісцав бобковосеа дузаштевай доедовасає дфусзавеі 5. ставочащих зФусчоссват стесеопчаде бдФакозсосвп Фаросткоуче скчафасскя У здопсосстсса ЕдосЕксївс авзцаєсоаює вдассвисої саїсодаєскс авссзекех ТО чкоссвуоюх дадссосоаєс сбоцостису зотісооску соговафуво фетреедо о ссвепрекуєт соассвнр засакопосо досссавоц пепсодсота госоасуе зу зчидчаскдс сосоводссс змов бсіїтевосак сеавсуєсєцоо засзтеввсх яко зпчтасеико спібжкоадо «оскасвив спеаїівасав ЗБЕсЖсТтт авсвавеЕвЕ їз пчцзсатваа сзтасезсаз бцазачався астчтасовї авобочкУва коса Мова савосстсвш везссстеєв зчсвасасоок аскфеєссоза запропо суїдаувеося тля тато «ксипасноиоєо хпасвідчахл жиккжлколе сдипавсссав зсаавлекеа РІсФе зацеачвЕс: авізоаєкаа зву еасккасвка сСазавебетисї зсозовасяє їжа зокастктстсоа бозавозово дсодесерав зекзаврсова кобра вакоссливста вто сіжайазкта касФдозтава сок ловока свое ка сєеусбаєав аква евох Ма сізснвасса: завозусвккх зпрезукосдносв авоссоєсвах восзвазстад ссаятаваєв вне їабазсгасв болтів чеока абичеєвота есязосксхВв Бога сткоЇ сила МН хховстаааа авасовастау косо уко своазсакоача щдочасолоу ррераюрх ее цодозасасст зукащеа заасекофаш засув ежосзашжомо шоп юютИ зіва ватися фосасассеє есе сспрчатннве сеокувасюра пувоувокоу о зцосазчакаси аслостасаеа сезонрооав кіс псадев ссводавова свосааскоо кт
Дощач о пут и ім пив сексі пір и дуети их стюров тд М Мол до и Ех папа ззцавпит зпЧенвв сопосашвнк асисакикяешв аа сша цих АЖ фут пр усу ях пох оуг дк еомочоуц іх У сих вих Іуди тлу й ОК о ту М ит ща зацаксатц Єсвотазаеу тгсвовиви Чат пвассвияка Зопеко «ЧЕ МОУ - оку чн НК НН в и Не во НО кам З ту песвзимева пазвизишшЗМ щшахеацдиеавках пабамсоєнасме пока У ЛЬ ЕХ МІ ЖИМ тлу кт борт стеу й ха ВЕ ситах в вгдохуд Банах ие ду 155Цй свліспсоссчо сспасузкавх зозвсасУк воЗавастаичОх ть лецака шести о чи фо фу сту х кож до Фони діву еВ ЗкрЕ Ки свЕрту ктавсиКохЗ сова чва ка сзоаасзаслта самок щука ших: лк гу -х4 «Ми Аз г РАХ «Еш ОА алу Усе чек их клю рені ін ол пом оз кгс стае жЕжкУшиОе ФеВИМУМИ я тугу: 174 шаМи хи випус и оди СУж у А етику тк дусі вуз до ДМ Мох ВО спастваш совсзеасасеа сопЗсевоз сасаоссяи аовечесчала Вл БУ
Вова Бик зб их му их жи би уУтИ туту Вр Ухокдехи ев кт «со сши сСлосувиса кобсоеасвкс зссааччУсх чових вх пеувссвовоє МЕ ки нн и ви І и КО зап ксщдозсаца соспсисчваса ссусасосчва чстаавасу спизасасНас печиво ЗУ тб х Угри БІ соті иУВ і сті уууІхеи фуд щи фіг ди хе пи. М ше стцесс кисле соихии сфщаиошич пасе икОо сних ЕцЧаО суч їжи їх й межі суєту сосу цик Буд ожіІХСУт ферит Ки ожив о сиг усв Ми В стихи КУН тазу к чайна ЗИЧВЗИКИ В сптщшича ІК ка пошта спо ЗЕ речі піч, Сотні рих гі КІ щі Вт хіти КК урвечия и ринки у тодту чесати торс зесшаноацЧчим смачно Кл пити ссср пво шк о ни т в НА їз трава соч ичспеа чопзвсаано вечсисота зиск ща ку хіт дворі Мо довиІї гуцтудІ рр форми Керр тиху сритф хе гтевк 2вп щссвасао повчччвеко Завачиамиц Ме аІпИи ХІН чих хм прі Керр сим ких Ім тром пере утро тя ери гри сам
ПТК НІ Коша кита троса цпашття деп ца папок ТО ща сваеац аачшхикоза ецдвасасзай зеежсоеижа взоащаВсеоо хоча по кож вІУЦО Жозе ЗЕМ Е сугииетя джу туф оже их и м й зи ай поши соц сювам сові оЯ ев сани Ж СкїКсввуЗ ше заоссвиассм стос агсви псом сеанси що садок тт еп Исм псом Ффехофуаиакх леми рано шапИисееисх ТМ ри п А а а а НН а а і а и и а и а п п а о тв шипа соеи шоссе саз смс поицсопеасеав пюешепКатив Чала БЕЕЯУ резус и міх В ЖИ сур сх ди СІІК сиек Жив ух щі К В рветтх ай зчсщечиха зош ссозоч пло зорпзадиая списи ЗИпеКеосих за падати гидота дув судді дк дог то австсточтаст пт сзак спосласчіш Зпссазч захво сивиза сапУусасочх МО зіжсезечч ти водо сіті хв ді ему Ех КімЕ ет чУКИ В зай зщиезичавас воно чох пуск о своя КОКО Чех ше сксочасишс зазЗзпзасас свіча пекли виз сосен АмАМ
З ам я - У ОХ т Зх КУ я У З З У Е дтучтвит Кит учи ижтуими о ик ой вовк ож вим рми дея Квіт обрив я З руш солазосвачк всоашооссов савптс восени ксв чсваслсачува чЧавизвесаво ХУ
Тіт уьмівиху Соус Ж ори хви ЖІ ВІВ серии сек ии В вх зла юискмрнмаМ сесиМмузсмеа зЗзассукіІмовмо ахлНмалам спшпфаацея пуімрасму є ААУ «кави чав сет освечавеь пок Коко песо Кс ще ке Кадупоскася Ку дик ові ри ред уж я Мам ві коки рат ол щв о судеув дю вчити чт кдд Я Ету вспищсваоиов лі Ммех почав яеЗ патзввап ва ЖУК К МКМ дашки забави тала видала татко смс кад еще щ за
Вих МИКОЛІ АЛАХІ ХО М млехІ Мою Бо. ЩО ху и юхікутьмо ША кю Му МОЮ МОДЕМ лях спо» аск ев пом ги Важ уеміх ее ву лу смиує т луки Жим зазсчвацаМе полі актавл чашеуохиУунИи люта ззиадетах це КК АХ про аа чо В и А и займ зваисвахп ул їву за ав У ЕЕЖНТУ М, тавасох шезЗч апа за ; : : хм посуточно с цВ У Кох су дісіоІХ Уфі ІВ ди зп зсвазсеадло хоп стчава силах ай цехах пси пачнин асхавахи М прохчия сус вемея судив пвх дрів кри гів в щит іх Вр сидр гуехич К ки звичок саке кових поісввочак педа шатро зве пок фол юих улуєа моти сечі ди що ур тич ви егукатр ев авт х ча аасштсвиис «в;тазчикстч почавцосела чо етука спхчеавксУ спав мим дому ку живі свв суки дев тури стуку у ди зва звоссксавсце пси Кози якесь Кссовкохеко сво ЗО ск ода фо в ов шоу пує су йвіх поету дм бота м ххх у лу селу усу В 1З4ай
МУтадпце всадхацоки зп спасе Зскшхвовах гадазосеска їі кит яра
ОК, ші тя ее МК М них Хо кА АНА; пер хх тлу шт дик мирт чн се кн гі
Ми ЕММА МАМ ОУН ши ЕХ щоку туєхиіихсхох Мік ото СУ кууиУМ хе милі УК мМ и ІЗ І усе І точчсппоаш сесостасшаа сизим збо кис ссишасвися швомавачи и
Дора хи иМю притч еуи УК уж учити о хуй ву иких чу тури чо авапосклосОя вони саотеспоо вптосдчаситх сошопесап сорта КМ т. диф туерижити Мотиви пек хи пф ху орини; гя евоу и оче ти ух ій зазапссоато сСИимеес ср оозао чЗбпччтаоу спасе слона ї185 нефртужф труд ожру Коужутриитоуфтии УУтуК чім роті оіу В гук гтуж оті ічевеУ руд к тек виг рн ша х ПО лука УКХ па КК КЕ па чи а нн НЕ НК А ай пихи КхУ КІМ Ос селам вельми парус стану ха хи уюум і виру ух пк ож тупих сту вве АНИУМ цоУбу цім В Уч сжЕжуУ між гзтзрох духу ДИВ ою іх т пилчееоУузши ази нназис Чат Фастов сему єЄоцеа сну тк ЗК печу и іх меру рив пори иЖо я стржсекетут о В В сор орех оц В ку да чтапстоописс сосшетадиє поиск поса спавосчасоза чок за пити жит а Іжа г вити се птн засід за ОБ чина сша ММК У хи мими ААМІКТИІ ше тету ту їУТІ одщУс КочжІУєВИЮ О сУ ді М ии Кг уткоже и В ки дути сУЄут ІК ЦИ ци штсешакццаи хшже М шашку федри єа иа сеча зач шва ам : ; : ; : : мч бритви КОМ В ема мм глави ха мювие дам оч типа аспссдчл кеВ НУк шиком сетакелУух хтуахесаи: зависати е УНН учтел ит и их же у их пуф гуму учи и муки ую т Миру Ух ву у ІХІЖІ пуфи Кл
ЖИ УЮ УНІВ МКК ОО ФОНІ «ЕК «хх сксхвосале ботассвзапй сопайотспиє спос х бсописаста сессавопоХ зм шишок слиаквуса пас Фо спін псих їм прод Кат ур ую утвір СКК им соди фон ве Мовою лу Я су ви тай звЗспоазачст зодчих пчисссазас боссовичксв псавочосов совсакевеє Ме кеожотеу корту подіум гумору всту схо т туту ер ке ут ж суку ах чаша повасслвиве ас а азс я в ЯКУ ЖК чо ажуіхрацас косою м севиосшккг есе ІВ сере фас ше
Кт пива ікрі хи дану геуте хіх В ом сзсУєМми Води гі уєутики яку що кеша сах сазан Фокс спи ЗО х ОБУ скоуоф син овівоо в ереио спичив ким пев пипівпадва мств ІЙ песисотосв спав «Чала ск З рука мор кмуня ва сі Мт ча їх Т.М
ЩО о уд гуму В тк уче и Ве код пе; диеспатинив есе есе Ху: м тІх їх ад ДОК «КЕТіх За «ій» БИК т меімхузх усу сі Я ух. щи ух ТКА смм веаБаУцх духу чі «ЯН МІ ле Ж ж не щ че С Ток МЛ ЗУ сх. І хм т хіх га УЗ ук ря
Мек Біт біт Бей їж Мет даю Біб ів Бе Маз пів діа Бхо ца хх 1 х й «щ 4 х А еВ
Кан Чую Толя М Ж мч хі» хі т ки жи їх: зи Ж жит кп ожпК ооув ва ав сце; мів дже пів Аха бу А ОгЕТЬ жа п
Ку -х ЗА а КУ Зх
То ке фею Там Ж ло лу хм тку М ги Ту: Ж Хі бі іх веш ое-жЕ ЕХО СюЗвОо мав мив о саАшЖ АЮ ув уд са мам АВ ву шу по
Ух 2 ої
Б З п хто ста хр іх ко їж лу т щу ее хх ФІ» фЗту зд щі їх лав ом сах нау Ах с із пес ха АдрвоТе ВосАЖ Х Зе Ббе Узі Угі хаі1
В що шо
У У БУ хм Ме Мч: (гу те В трах син їх З д шк Ку ток Хля У хз ту
Зха ків піт Уві Кто Віа ів ТЕ заз) ія хо дів ем Бій АВ сів у а тре га пе Еш КОХ М хх МІ хо Му бро ло тки их М Мк дою їн в м хі ту жит
ЗЕч ма пе о жхпшео вав їжа ст вів ЇМ) БЕч Бу від лій ха »ЕЗ дХЗ вх Зо 25 ші (т І У Ук жому іх Мікула (АЛ ат ук а МІ Ми тихих З Ф
БМ о їАМ МАВ Вів ж Пец о Му сх УЖ х МО їКАЦ ММ ХМ МАВ ОСА КУ ха зп іа тій
АМУ МУ Маю «33 же ем пікуу бах ут ха шва хе Зі лу ба бу гі їету зх ві Ах даю бкро же іш Ма БЕ Ар о Бео Уві жо Ви хів БЖ БЖ як з А и
КА ЕЕ Я 5 хек ки віх Ві (туї кла Хх ме кі Жов Мих фугу Кі хм ЧЖогкмо Муч ко шко дів вдів УщІ Ал ДЮ ОХ ж змжкй Мет ме СІ Ла МУ КЕ дук ЗЕ - ї3а 135 шо їх 1 у дош Її вух Уже фа (Ме що ах Вояж 243 34 сх ста т ук
Ж сАЩ ВІ МмеО КХшоБаУ ВВЕ о АХлООсН відо МеуУ АБ ЖАВ Ух ЇБАМ ОО МЖВ чих тат 155 жк
Кльш ми Кеш. АЮ хо Ме ут 0 бі пк бно тях Тощіі Тома (04 тд; 1 Віа що Марго дав Мет ста Ач леа Аза БНе о Бов пев сеча БА еВ їі Аза БО ше з кв «ся сяк
ОКХ І 32 ик СК хо Тоеукі й мем їм Ж ла жхм Том Я ко Їж тра мах Муз Боєто щох таж кі
ПЕ КАМ ЕМ хх шо жк во хз їв Кіз сСіУ БЕ ВВЕ му ав пох Ве зд 5 НЕ хе А жу
Халк о Хі ТМ Ті жов Що зу тая бю, усна и Фо Мова боту бл лпх ок АФ мЕЩТ аимо БаЙй Ол КУ КО Же Су ж жо ОЗжх Кб мжЖе Ом з зи т тзУгУуц
В чї жо Ж жхї хи їТщ М юю у ми Ві ХХ ок ЩкюА ВІ Тл В Хіхух ниє Ж су тм
АізЗ лим 5 ж А ВАК У Ах па МУЗ Зв ЛАД їхаЮ ВІВ МЕНА СХ АЖ ОВО тут тк лю «А «А хі то. г че тих духих У сх жо ті М т ех дові док: Пехко ще тА
ТУ Міб зва вав Ма бБіу Бі жо даю обві вх ка йке Хек ев о БМУ а ій як, зап ей ям ХМ кож м піштжу ХХІ йУгь МВ уки зе тю жхеки шу Сум сбпблеу ві ті Ми хх
МО СЮЕ УХА ВІ ОХ і вжз БЖ Уді УкКе ЗИ оз БУХ У Ві Кі дво ві жа зай су
ТКУ «ОМ і ХМ мо де ХХ її 453 сб Му ди дае Му гу. (дл ця ЗМ в птах зі тр лав дав Кат Уа КЖже Зах вва Бр оОаХч Ух жом Се Мая Ач за зах зи шлю кА М
ЗЕ оду ХО Кн хх Ха ум ЗР Ж гм бом Жук КМ у. Мо уч МУ нів Ажу Ук беж чі два дек Бів Буз СМ Акоч ЕЗе дек мес Ко тує за запа «й к шо ЕХ «М МО «ба: Шрі 5 ХУ гу бу Мох М мік тла: мл: тех Ж 022151 Фу Ми
Кче ЖБе Ар огяа Зі Зес дев віз Ме сов сао бе Бей а ках вх. тету "У. запи
З ХМ їі сщо ше к Ме т: и мч Щі щі бак Ху Щодо т Му Фе (ху Ат уж ак ща за АХ жо віз БЕШЩш ХлуУЖ пав вав КУуХ ми З КЮросьу ЗБ зи пт зах зе
З ЩО ЗУ 38
Зізсу ЛУ Же Ума й тики дж бітум йшту Зі лечо сла діт В' що Хр с
Впе Бпзе хе ТЕ йхо Му Аво Бех Аха рве Ак бує Беб діа УЮ бі кн 5 ЗУ 125 а ші Ті їх ях би ко Том й Дону Шк два Уві піл Ті Зія Нік Вже АХ ч му аж КС
За 45
ШОЕ 7 ее Ми М: сухо, чл
МАЛА АТЗ жу «це
Бо дих «вій» тЕхІВіста левріч са тутю зач тю 1
ММ Ж кидком тлу сту ців мдф пк дит вх дв вчив ех З косастсаачи ссапвавасвса сосцепеачо сабсчссало «свочедвов аск ацека З сет сви тМ бурового би тури тр (Мб ем вугри ори ух зв тсЕЧатсеюмр отв сда Коссцдасавко засос писескссах засос 17 мок омуж У уУги - се фути с веж ех л рееж шк и хх у Еш пса Уха слсепледаист лова клав ми ОМ: Луць сурма жу ММУ а и в в ви В и о ай чеше стала спесищвосвс часа шесдавичкх пики ки ; : ; : : ет
МК и в В НН я па зацамирвов пес сос схо нча Кс сомле перо скрума ге У
. их мак у и туф тжуиВИ Жовті кури С УУ Ж турі фе суді ХЕТУ
Фу ащЦатя спфрпчсиас посонаЗичем ПАСИ ЩЕ ХАН ух ЗМУ пуття сосен в свідома прцтелоксня иа Фа а поччавзасша ссукоасфуву Фавсуже позову красиве ресор Ах сиг шик о керу ж пе мтусо у Кузик иую тож дме уюИх тилу еру щі авал»свзачдазИиза соиаОУаестоя аа хм лоша прє СКК в пед ери т тус молі м Кіно ІТК фев ил шими; Сопссавосг снах саси пбобеасьаале адпицпежсесзак пасе вче х м м Мои м 3 - г с. я. с я пи гія юс дачі о дермі гот В Боже вра вв рих ж Кон кт да: засл сноало чсчиксаїоз асісейссев ХКсжапсцЧаси сопзвслачаа саше ксахеа МУ жали ма кава иа Мото алвни Мій и вкзчсиаавита Зк кКіртх, хв ово туцоа мисом кожи срок мі уюю Кор КМ МУКИ КУ ТІМ ге міг цк жук ги г див су дих сих и ІІ ІМК гір дити КІ о т ин а пуд ївсоззлаваец спчасспсчажчав сел ваацеиоя Бах дужок ючиви ут ИфУкІУтК и тус Уж пеки Ю Мт вих хутро ОМ ун су дофиуи М. аймиасичм шифувишичеа «(асо спас цит кескатеами тшУ зрання ач В у жи соти ди Мощі шуфи ан ми жур иих жу ща ДК ужив их ям завалити УА ем МЕМ ї ФЕМ САРИ СМУ ХО ПОЕТ са Ж греч чуму а он в НН НО Ін из совзсЗзеаІвис зерсозт ст хосапоасоаУк сеовссалавс двоцісачс ше ее пав пихи пехпо;віІМНУц ВІЦІ пІцих СРО ВМ рих сера з 5 М шишки шифри ккал ач м шани екю мох ха дю УК ОО если В уевий кА му иу В ом уж щі жу у дих жиму их зплЗиа посбайзксах сазвочссис часа чик чиви свзопзасхвиОЯ свіча аЧеУ Аио пр в в В НН НА вивч їз плірацевсаа Чис сс авсходчозспа зозчайпзалох стспадспос хаскі коя їЗ5О три уитуиз ую и: с діжі щоках рути суті тт Мч ув КеУ І пустити лак зссссочааи сао асстаацотих балада вза попоаазичає падати 3180 гл вве хату що гуни до вк схожу ва кед пи це дня пуд ск р ун С глек пк спе гц КЕН дв жу ви печива Зла спспачЧахакоя сусскасаас сСцоачоусаастЕ Бо овивс свозаванеєс запас кесв КшМми пудів МЕ Іі «ЕТ стату ау дома тва зай тазик с пули «Фоми севсАшЕКУ Фея Кока 1 при ни НК и В и зи зоачавопкасто втцавсшсвх Засл сок шсилая катка Зола КМ под одвеКих сне пе ЗМоуд ку Фази фитин а ж вицЕ т жай течсасврспсол посипте зпизахсавтвї зб'ааатваци асксссевоен свзазашива а 55 може вом мох мих паї мжІт УМІВ У пут тує вв ою коми Мои льки туди пад хлайлтяо волхви За ошхвайхчиУ поеми була я зчзкавитоакяахХ зва мвакч воштесисея МІтбосвеаалтеа вписати поч пеплах Аа ттвацицІних пгзчзвчайцаа лиса паси айв послвозассти їсзипапвива Еш ших Кіа ЧШС соц бичка поділом сцен Я да сзи т Ки дощу су ді зе доіжстузимх Код вдих де ти
УМА тим МАТИМЕ ХІМІК у УМА ХЕ ВІКІ Пю І ХАТУ ОККО, «взвича звак МУК МИ КМ тримача лють о хе ву УВІ ик Мих им и звижаа це В уч пух ви пхиЖ ИК о сижижу ев я сх ЕВ гУ зпсспсозсаах оссззааасспах сага стотов замов сс оз вазеооя послів аїе АБ5оУ шу щує можу ж ситу дет МВ им. прий моивизую их меду ху жи усу ту дубу ЦО М я житло ВХ Ол иУю ВЕСНИ сш же ЧЕ ВЕК КЕ Оу пн и -8апй кс Каши Укр слв сопе ас скмюка Хаос иац пада АшМмО дика ав падиисвося леазечисзав сзавокцсли сосзчрсава чо» ЕЕКе КМ
Хан вк ий Ам ла ту ти о ХХ Мах р "вал
КА ХЕ шк тун пИиш
Ко их
ТМ у НА стук сум кі
ТОЙ У зисшить лора ка «Фщае БІК бах Ж хи Тк Жим Му ХИТ я ти ХУ мл ьо Те Ст я щит мах БА ІА ве дж ВНІС слу Моя ЖУт УА ХМ ВЛА БжлО БшАМ МАВ і 5 10 їУ
Макро по Хомю Ух Спа їм: Аля йх За шт ім Ті. Бут її» блю йу хо тах бух Вжхо ТНК їси дів зо Аза Ав опію ї1є Кхе Зві ЗБ Ар жа ту "рт дою ок «ли тоуг Єлуюк о Уюжу Тизмі5 лу й сії шк 3 Кз іх Са дм їх їх Бі зеє,М ШВх хо це Аза Віа сСіу АБв о ші дн бі» Уві АБ оАіа Бе ха з хх щ
Лях чи З 5
Ки . хлжї пох жу У г п хо Доих о що при Ж З «хна ШК: 1715 хх
Ай за жах ау АКЗ вав Зх вх ЕВ окХю ау КгІпб о тя Уда в УФ «У хЕ п
З ЩЕ шт, ще ПІ А - за 21 сен т ех с з ч х 3 х як я т их 45 у1 2 їд днх та т били Му м хе М ТМ ще КУ те ха Ні іш УА Бко Ав о Ба ТВ Увь бів Ак дів без бів іа сік
ЩЕ а ІВ що
Мок ха ка Зм й чиї Ши; пла ща ем Кох щі А уУу хх мух
Ак Аїа Ве оБла діа би Ко діа ші Ак Ту У ол кі Х Ах Ах жк нх ще кшх я хх,
Бе У Ж
Зх г хі хіх Ше сх ях схжях Чекуує Ту мокко Ту бо іх сх кує от лю ша оАВ ВІ ХО їххВ. чу БУХ КУХ со со о ща Ніз ТВХ та ДЕК дай зле ті ие Ак КА ста щи важ Мем тлі їх: а й Вк їМніх г фін Мах Її ТЕ ТУєг тва вВІФ ДАЕ св о» Зам УщЕ же хв лова КО МЕ о БаМм У Же з ІН 35
Маля Ах Ма ж Мега лм у хх ду: і лі ТУ м ММА Мом до тт Хр сп кхсб групова вій ха лад АВ о шаМ а Св аа Епшж сх гм ву КЕр мк ід див
АК ХХХ Мао жену Й Тем Ух же ХМ, поч ху А я тн А ю му міка М М току
Ж ха АБ зт КЕ оиУ Ге От УА Ук пе ЄАдИй бІ Ух важ Бук -хЕ дк Ук тя
ЛУ АТ 1 НУ
М ЗУ Ас хе їв Мак пі мл Тех Ах рем таж Там Кохії Кіз Бані Же Кох щу йіз Ме Бім зі бен дія ЕЕ ЖЕК ОВО ІМ дО ДЕ В ЖІ СХ
Зак ж ле
МО ВУ ККУ їшхе їх їі Ж жит йоду домі Тоді М М л ду бах Тл А лух Шла чу вжи ЗззаУ ей отжбих хо ВЗ ОАЕ а АЗИ Лу Кл Кле Був ВаБ опа ФА тив тах т су те це її
УМ Аа АЖ
Тер стуюк о во тії Жук Тоді щем 11 Зако бу ту фут т А їпЖ жвЕ Сп: хів да Вед ди Нав о бУЖ Бко БуЗ ух БЕЗ йежх Бк Аз їх А БЕ
ТЖостз: ло т м та Сх Хе т бод В ггух Ві: Гоше ДО тошшу: ббкех тлу
Мем вів їенп зі УВА бМшЖ Аж нів ууш Зв оАза сту Аіта без ТБЕ УВУ в пек яті
АЮ кА мае тод. сут и оду ук зи хх п пет ба бул Мік й Суху йо
Бе) тТух Бій вер дво Уаї Бі ому їм Авр о Узі Вуд Кіз кох Ар; ток туру з тат
Ка о 35 т уд й іх й її фест хх м й їі дугу Дт Шива бін їх тах му
ЗА ав тхв охао АЖ УВІ ВІ КІС Уа бх сощю лшЕЕ ЯМ УВА МАВ Олю зда м зи га дж чих п ля т чн зга сутки йно Ме Мох сф и сск пі х
Уугі пі Аз оті Тзе ска» Мді Жкрохпт Авт Але жа ТУх ЗМ Хек дід ка зд ла лю «ЖУШ кю по;х ші Аміж 2 пеук щу ве бу Ду хе 51 тт бБбх бак ух іму пів Ні йкч Уві бек та) дав ех Ав Бу Зіч Яхо ББе ех Мет ВК за с т
У «ТО жене сли У Зах Моя Зуи сжх бо Ж Щлідо мак гі пл бий їм (ії т
Тух Ева Бе Авп Бхо піу бек Аз Аза Меж Узі бі вхо ій Бім б3м за тт; же
КІ «ЦЗ З шує т УХ бу ща Ста м Хом хі кум тлхум кг ла тю Машу у ЄЮ вв уві) бах аз оба Ак ко »ів Ах ТК Азов одів ЗУх ВЕ дХхОб сію ї05 ЗО 2у5 Б
Ще ск; -х тую хг Фо я с Що пог ху по Хол щу тот Ток Ж БУ я під кКле кт ек ВХ вЕО Був ДВБ оОшжх ел Кпж му СБ цем ле Ущ 330 зав ліз дош и 1 ж вія З УМО щоку бе Та Мі шо то за о АЧИ УФК са фа І пла к)воАХЯ Му МЕЧ ОБАаВ ех та зах 4 745 са» 18 тк хх, ти «іі МИ «ШІ Ех сю ту Мис Ммлую М у оку кА СЕН пАсоАюК дп 5 ут «аОих щуЗ яю ох ЕК ощоиий пу еююмиз що уж І и ж ух и зойк ух Киів ох, сток ее ЗІ звсзавтіки возсоагеюз спиш осбаслвосКтл песацеееих сови у шроти то о мох мису тля с я он. т - зок ами ти р ди ти не а яти и дю их пики суді дома фур вовещ о св Ки улех В ху ія НУ асшвппаточ сваччииоа ла сих асак їх Ікс шипами писк хе поживи о руси во в спори пу их ож де ув ох ин ре дою щи писсезска свое зовцсосае зсводеавоЗ сова с зассщовие 155 трете іх с Кк дім окозелу лу Козу жге у КК ритм ик поз уу ух их м зай зциспочзазати пахв пев ахзсхвосая поФфєсса бек щи см ЗО они нано в но а о НН НН і їй пипоесечвис проза свІ сво озсЗх посол пул частасешуо У
Кора Жили гук у тростину; ти жити дурити ие зи коадсслосооє голесоалосв сессукозса засоцозасз саседодоєс азс ЖЕД серии и пф ух литих пери иком юка стю их ивутиия ве ких сени у и 0 уча мих з шт а ФК сенуюатицу щуки ЕЛЕН ших Ера чи гриму ТУ СТУ МІУ Ж Хе е их сор Кто ПЕТ, гурту ака очко ст спсовоасвавя дипзспича смуга счоа алое спосо ве ЗО ї я г поем, ся З А м дю ж м с Фесюк с г. ном ко у сс ут оркестр ер. пірнув Втр Се ре С севиКопоЗс пичксазадчаз ссопаос асспахсса соусах заасташаа ех абгдодаслиха спосо сосен сс Кусоцстаса десслсшссопи свкптсвевою Я ктсквовсоста вусасестко чЧсусапова свсасоккої спобочюсав оФесоосуєе що часзосїссзпа застсгоосс хзазуссюо пасуєсевие соусу супах ти
Чаздавссос асвацсовнвас фмросеско додовсайоо пухкавєт зевосеоеєсу тя зЗсчесзччух ссасофасвая дез ооує осо еха сбзлачеоовоа захоуссао вч вжоведасоу совсевицев сосопаєозе саоссосоУк доза деуєспоєоуєчу зов спец тв пезоссвоо сет сепсис х Єсукотечоа зач зБа ссфостче вастоктоєд совсусссоу звссочео сабо засовтаєся ІЗжВ шик спчесвас ще подо ки СбЕопсаствисшс сопесплиаасо пошив іп зусФсаквос зсстасусєтах сосавасооо пасстосфуаєв Фуалтаєеток застає тАяе
ФОКС ЦКУ МОвНХ севожфеецює себе звузчесуєтс зозсуеоє М зосспесоаєсак ассцечсоче сзечкзоатсо Чезкасахоч опр сопоєаа фас ї2Би зосатоеоез сасоеосаст севчахоцєс чисстоечево содосовоуєс ссср 1329 шпсксодакцакоу вести Боцочссочос восувассеш кокоса дос Ке іно чістсассЗу впсозахода кеосословко Закочаовс пвувкУака асусакав 45 зсісвЕсцаї Ффазсадасз заствабсва досавсссо)в васбазєзея човіческує Кн деки чих ще кчошиВ оселі вичок Е печиво оЗсеекІро Мо сесаассвоо сдесоесрчааї кЗасз'батав закадавова спазововеє запас і5559 зала сефзесуаво асуесовкув зоуаввноун асфскоєвот сао ко Мово схкпадческа Фикбасвоса пис чвІ поеми скоса асся зі Уч паткоаазсеча сахталіпуа косцувикевох застає сосоувемає падівиаму і385 саке кУЄ песасовуфо фоваетовут сваспевасо Кафосввуюєт совомюооа 155о часкочсова кпасвочесх зсвооссзпах сстчевоч КОС Бствоо Фуко Уа зшавазозваз авезсцанка свізисзово боза«сооакс вва унЕз слюч вну ук я Ба «1 170 «па пИиК «Кі» Закоївна міссїск «ах Ле й засо пзрозеасех соспласоесЯя баствокіля ЗОЗ сова соОоЗу БУ
; шу прин нн в НН АОАНИ СВО: чими шпат шиацу сах ем їх код ПЧ Як ние ссад аФапечеос шкода У сша ссвеаєца поса КУ сітки М чи В ее Іти міне ж мк или кЖ их Між х тиж у Ку зму и тери Ж чтапчича ме посаВвеакели соуси пес иу очи шику М ; лок он пр итр сіли сидів баки зп павоссоасчсст сопосччацех поеболрочсоо зсзЗачиаос здазінМме пасе З пе фо жити сви у ик М Мои живи ух ухут и пф жю миитх умі и В и УК
ФІ Ма у висо сосок сосок Фа У ках БІО фути и ух ит Во и уки ХК ук у г у жити тхеретлує у пе м р ОХ постав слЕссІлеІ скоса бла ЧЕ попала са И З тушкувати сіни фам жири «хи их и В зх прии м уж сих ит учет мити их и шпон шосопосе соусом стул І СслаИта ПАХ ХЙ ами умі сиву ет свому жи схежхі сх хто пудів с Восжо Ж жесту В шик гуси и и гу КА вашим ко вес е «ФК КісихиІ За Зпиа чи чими чих ЯКО мовою ужив ВЕ сих сах уже ем я етики сЗиреє ти чтиво ВЕ
ШЕФ Ба Касвсашцес чпооостнос всмрасти вому КЛЕМ ГО кн В НВ НА В На їди чтаздпсачвоаза кози зачвос заслали зЗпсвисовасс бозасшеиа пише пе
УЖЕ (и узи Учити и щит прозі ситет о ее рови М мі чо иа сссте пис х сс саВЕс сеивовВоса асо ЧК и тх НО ен НН НН ННЯ Зап ие осаца зп осс зоодохошац сосок етаос аозстстисНИа сер ік призів рричттху ущК дрехозучувся стреси тав из ЕК ІЕу рр у у м ве у йи х шов ту чсетакустзя сзаассщаа соски чксаввичоща частих спасе я зно нон в о НН ст
ВІіМТаНеНеУЄИ (ІБК щити спос ха ееи «самка Мицх
ЕК і в и и НН і НН зди ах ше Зима Кл НИК ИМОКМу хол еснвли виш меОк поса и сво ни а о НН НН Но и ЕМ
ТЕМАМИ ОТ КАКОМІІННХ оКлКлА КА КІ У иКнх ФІ КО КВК мем фосгочизата завис иастс паслоецоючея ссочсщиа взасзиае сш шт чЧоесасиепо соушочеасии сдаосоамв ос скосдисих попав а Ко хх яю вх ди у ти маже ЩОКИ пу ху думати их тя и те чину ол сиди Ач
ЄсЕІійв 121
Я хх Са
ДК КОЖ кс х ту хи шИк тиру Іон М Ж уж жоже ек посох ма Білвісєх каси я й йем ви» бут бух Мясг Баму Мі ц х Жуки До Утема ІКОх Хо: Ук ех. ож
Мек Ехо Їли Куоа йеЕ МІіЗ Бем віз Ана обжеа угор УОКІНЕ ВИ М ДІ т а к «т те у у у :; 4 ве Е Ай 1 Аза дме до жд йхт йіц тв щі хід ау п гм) Мас ке ів Аа Ак Ахч Уві хо щію ТК Міз Вів Хв о бко пзіу бео) Мі Але - ка 3 ща а ба щі Я ймах 1 іх ВІ ди лу нн ди й хи о кн хід ні: вт Ма УК АБ БОКУ АЛ із ка щі у Ки ою вх еВ яКЕ У є
Ух 42 45
Фа тонам: ВЗ мк щі шах 1 буки ми КТ полою хіт ХІН ве КА Ти в МО МА А ІКАО КК МАМ МЕ МУ ЧЕ «сх А
ТВі дев їжи Вів БІ Віз Аза вро Бій Бкз йха вів вів Мах ві дів щи 5 ЯН хх 75 лою я віх й та їм ех ті М Шрек о те тамі Ті 1 щі Уві АЙ КК діва дів ща бів те ОБУ Аж За рев Бе Тл іу ох «т ек ал во Те Га ше сі о ЖУжау 4 жу йо ін щу: їм: Ва бе ли ші хе ву Та вх
Мів ШлуУ Узі Бо ВБЕз йіш бе їв ів вх Макопім зв Ах тла під
Х : З й зо 5
Ук Жах ЗК: ВМ там ук ЩІ мк дує тло МеіУг о бе ДІ хх Доу лях їпк Мет пе ВІВ ей жо 5лха Ар ойзрв о мУв мех АсУ бух ха дк ла
У ктук зт
Аме М 4 де 3 ми до й Ту тку (Тушку им ех Хр буру ко щуку й.
ЖЖ зу ва ви оку ОКУ ЖУК їх: У УЖ ко) ЕХ її ву ву бін це уча ях тк 175 ла У кох,
Ам М я
Фа би пек Ме обр бе 8353 сю сх Ся МУ Се бут Бі х щем тд веж ПУж МуУує МЕЖ жХМ шЖК шлв о бБаУ УЖ их Ве ше хз Ву АЖ Бе 17 обр, Мах
ХОМ ОХ Ах
Му Щі Деу ХХ кх Мк Ж дує бує ббжжя жк Там ЩО стї3: деку В бі ОКУ зх лів вяй вей о ве вух Бест оїїІЮ КО ОБ мів ОзАУ дЕБ дО ДУХ їВЕ ік чад «шк тий їх 135 ІБУ їБИ шиком ШУВУ КІ у т та жук г тк Тр дош де ЩІ є лиж п ма СА ж еко Ве бо зб Уві Меї ЗР пі Бе Вів зв НіЗ Ша т Ві т вх КпЕеБ сСуз дз Уві Ме сУщ БОЛЮ Є пе Ні му ЗВ ниву. ХУКш о кА МКМ
Ех ум тсвц ке ІК МІ и Хол. ладі тв Тим Її ту Жиких Хо кухх «ст Ах там лах ту: прохо
Ай о Ммпш му АЙВИ НМ ма но КВ ММ Мат ді б Уу МаВиопХ вжшю тва їв зав
ММ ММЗ АМ хі фр ТЕМ г ту лі у Кн У ду око вхо А у я у їй пд бай мах й уж аз гій дів ба во АЖч ЗХ Ада со тих меш зав гг тик в
М лем п тару З пає Ми Як тки ом еку лиу дум щЩомуж сх у фа дя ж
ТвАх дів їлх Ме: Вк меч дб хо Тук шо дж СУ КО Ак Бо ХО
Б ттЕ За ше ШАХ ши че тю Жах 0 зе жаху пл хі бак о Мт мою 213 пах ки бУюкою. йетх ваг о йіЗ їм біу ма Хі іа Ві Тк Азов ех й бе Бе Тек КБ ук хм зр, сао хі ОКО кох КОЖ
Ех Зх г и с с Ж 175 Же. кт ї т КО у Хо ж ТЕ: х па їх: Кочеч жі -.
Х Где за шк п тв. ж у ТБ У тиМмІ Беж Ах М:ІВ Мі КЕ єт
Ж ма са ОВК де УВА шЕЖО БкЖ БЕМОЗАМ МЕЧ о КВ Ах із ДАІ ОВК "Км, Зах ци «У шим рве шу керолхммх хІц фо ча дж й дещо міч ха здо двух п 12АО дя вар ваха їх Уві Ав Уа) Ко дів МА овБкхсо щі дів ЕКе Маї УВА АВ зд зе НУ «ОМ ОМ шІМ чт ще кт тах Обі НЯ а ті Ти рве йду Міс вве роз Мі ба ств
ТВі ші Яви Бей Бпе Ніз Ті8 рей тп бзв біУ йхя Ре Нів бек ові «тк зу бук
ІВ «МИ ях змію бі Мих М аж хг ок пли ДУ х в Дата Аокач Хо Му и ІТ хх
Тут Кі Ах Лів жа Ма Ви Ах ца мав оашЕ в дає люву вшМм ос то «ц т;
Же п па "За ШУ Темі ТТ х Ук сід Мк жом Зх теж ЛЮТА М ШК Ії гуту дечУ Сі
ТУ ЕЛЕ Бе сх Ж ко КжО ОВАЛ аА му Ума сема БЕФ МИ ма мВ зе ЗЕ 315 ЗХ ха ух дека буку 033 Му щу ду у пу дев Ж моїм яю Ммум ам хід щі по Фр у У ВХ Ку Аа УЖ АКУ Зіз сві ТИХ МЕ Еко 325 335 з пі Манує Му обі їі бич тлу Тс Ж ва бі ль Тв й) в'я шу Мі спів Тук Веб Зі Уві Аха Бу Був Аіа Ббе ть тТаг пі АХа Бех Аїд зи пах, Зх їаЗ жу У їм Тлемо Мох де ді Ж оечя КТ Б тях хх Мі» щі 1 Мак Тих МУ в пи хмув хау Уа Зі ММ вл пав пав МА ма люка о ФМЗІК ХиМИ Ав її
Зеуєт зай з 7 Зх зал йше Вп Віа Міс Від бле дід кі щі сті фу дал ах ціх між іх
ВЕ овнЮ ва ма від сАУ дів Алла Дав зум о гхс Уа УВА БЕЖ АТ А за з7х зву ях ша ТУ
Тахо їжу 155 Сех жниух
ВЕНА Ж же УК М за шт ту долу
АД Кая ся жі
Ж 7 хх ЛА тлу пак хх Ме ек Тім фун и хх
ЕХ зем пусвізх хг лу сла хи «ах Ка ток долу щини пезехучух ую Й у пе о сек жи ролу Мои фло ужи ЕК ІК ів Коти «й сатвавовоисх возссахча литих Спиасдилес хпоачсеесх плов нАХ то вич и НН НН ВН НА я зтьлу зоисанкачез сазоппссска звисати зи оповала слекошилео Ки полиКОос їки пику оце ІК поси соте же о Ве и важ аж лутих утоми ах. г секобстенеу стола зовоасНнс всестивсчеста петапечазе папи Мам псспешсамсо ши кам лних дити ом Кік поса сок охНІдИ зЗАа поса вис сКаКавкниху Ясла би сив у пес ам пос мИМо аю ние нн в НН НН НАВ пе м их шт пс пами АкЖОЗИ пали оса сКІх ЧИезпНІхИ Фр они З ЯК КХХ ЗЕ паті ргерерожттся Кіборг ик ВЕЖ гурти Пи ртфУ соти ов гкод кри я зе ач ноУще кшовсоаАния соки паса ссср вази дм спспишцовя Ілони спосо сі Ввсди леми си ау аа
Іс меш зосотц пп заєс песен схоче сли Ам ; яко трЕж віт у тів р Хор Вих В ач тів оту ето ЖИ сухе есте 4 зсичичличсся сов свакч зозсзочкее пс амци са сопе сацея З ; : . : : : зх и в в НВ В ВК чай «х МКУ ціх поичесопасчаЗ слати с Зесахцакесн сцслецююаи щура ютиі 548 хіти форумі ужежевиМ Боком Мир ве живими КМ КУ од и дич, ажбшицЧенеІ списом кос: сомів Фе пе іо
Я их Ж ші га дчтимлдичт ние Ялина тоди кох тенета ших Я - -шпКшінма вка чому чацче кзЗосасшЕпО ІН ЧКнна ОКА хо здвогесооої зосіскоцює Каезусстас Засзасовов созосстоко сокасдецоває То псодесцасся сфпасосуиса свзсассзхас ссвовсасяк Фодсоашесозх фосмкавеює їЖо саатацсїус фбезсквсоє бсвссвіваа БесовОсск соосвуЗсовх абовіавку о сасаїасвоу бастфсвоЗ: азсезозЕЗбс асзсдоаодо асцовопдсвсо васосовтаде оо ссцаєзооах асвесаєоса годасукаєс дбсвосоєсх вазошосвсос всзсаєосаа яке чевсасоссе зпасскКІк зво лсса скчасізозча Збатзстаде Бавкаасика Та7о стбуксвос сосоасоттоє ктваствсає сазсасаївх стствовуєх зхосовсода 1985 пзачісосає зазчсасабас зсассмс пава ставок боосгсевстоцє їз декорі: вового: зоуюсоує серповувосю падеочадув бепросовово їв цакоассоасс засос беааскцоов осока сезчасеснх зопосарссе ії54 ззвсзаво: поФсвсвсле асицюем прловестЕс підевасяса илксщопое ї52о зчаЧчоклева смобстлоєсє зелена се похропоосста сусвесюруї ВЕ соссксочсо досвасауу Фозаостоє ссасвтсттс зебваесувос дактсовсну Мчо так асасове озосочисЗ сСовессула соссозатаца ЗіаЕссход повесикеех ЗУ спачасочева созоасяоса запо счос доза нья пошесчееоо бопассцено Со псесдеціас сусуєєстесе смкфтоссде бтасвкеюєє февсоюваце апесектсао 15то «сасочцсцкя сосусастов вові сомсоюос оссцросеєто сотої ето поуасзвишас ФоиззчеовУ зофермоо совассеаис зеосебевоє восовокеує утво сеепксватат ссозакодакто дес еза гсдалестов ковкчабовх зсвтавалах 1825 сту сочасзу азсвоаасваа стааксавас авсссковнав сівіпзасас «лоз ооо Бо сксфінекко сокосфовош сеуссвусаа фебксеєкос Фета Касоскою 1329 свасстастс кессзорайіз візаві бацчаззахох аатувзнатсзае Замов ІяКО зчовадавоца заасдаеоає песузсоао авзедувовс пебсусводв Фосмекокх чо птжфестади коволесво сежпенчнрез ок чсасх спсзваксоач ккодеочЕка тів9 зІпасетасєх сгазкоцчакс зактадсква СсЕоватео сузактавта абасевеосв С корму сахсеочЕ аазаздоеццев аСусасосма досеівчєю вусаассац тео ссоотсзаса віааоБссв асостдахосї атастаоу беестіс бохо вац кино зйпвзаечавзна запувастава потоозгтаско авсксвисча зУхі «пф» 123 ех, холу
А Вот «Ей ДдНЕ «і52 вегахів їх «ой» 155 зЕвастнсса зцессгааа: бівсевтсоад впоббостту БЕтсвткєєз вк шокаско га члізазсатуса зізиасащеї Зола СВІ сІЗе поБодатсцх сей ї28 чиацссаваму сайщопосімалч сспеслосох секс аюво кода стех запасетова 186 завссстоми есе Е теобслпокас спаси чез ссзпавасли асусетаоо заг чисто дассасоюст куфозчасза саосчсао ссуатоссс согасуєсох Зав чесззсчаа засстасзусо «зов с сесозсоцчів поссцсуа спол Ед сФазпсадіоа заозфсуктсс сохісасооцт сеасодое посфеееє кескожсуео ЕЕ саксозадчає осзсвисуєох ппакосксоє зесуосодєес дессасавоа суочсвосє 489 чепсцччасох бос асоуеї зорвротасчя стсосезися зБешлссаеЕ Єеоюскеве я зидевкщсоо сосочок всасосклоко Фесошескою сксочесОс зосепочсаз ща зсссорес вацдопсозасз восасезсяв оадєктсти" чвочковкчу вазащктосв «ка стаззслазвїсч сазсоссокся ссувсадчосї сспоуаногу песссоачоа сопсосоуе зЕВ сассофтаз сабоссорсу ссубсоноос Фувуставох аготасовуча созсдассюв 189 засовідсяс стсвааскозк зсссцазота ссодовссод сдооуюуєто супе ковх заг касопсасвси захи посі сасохе суки ай вус соулучзиаа зав чекостосоу сасуцосоєа зсофуєнну засос доскутоЗу поосвкоє зЕв сессзаснахс зопасскої ссбзоабсех сасдавозоє сособосаєв зсув ахов Вал севспеєсстаис потсевсодву зсенхсодпасся сдакатоциих запевокл би зва пінесасесс чатах соеоссосзоша спіши ио сопопмічу спосо тів чис соа: восцідасстр енасасганч споапососгад ваше сшасеЯУУо 1258 списи тс «запам пездссосас сжссчсспвЕс Замок ам шааси ззко зуссчсонсс поса екувог засос просо тсвов стае клпвес ї3ао зтазасасаца суабозатас сюовоссоза зоаассетаво сегаасаве сабссВсссх 1380 песцсзсвіЗ садечочсвад ср сксе певостуткс ФфазаоскшсеиЕ умер тав цазвкстіва азс тазесх севізавуе саваластоей звозазвсЗо ззачувааая 15955 звис захис сг ч пефимо ссовзелоаяи сшчЕпеЕве 152д спаєзаєссак сасссоспає) зваазстваєс саастааеу свв фусаве кю 1529
Кк моху шви муку шию пихи скажу есу сю Ми ЖК о щоохлуєчек ОО ФУ в ую их ЖАЖШ хзскаазоцсї авассавсссва ссвоапстоаяе савтзахаоот ссптабвавнисе депо Мо ; дсжам кекмое вив Муєв м ков ик судич охо спо в М мех рому Іди тс живи зва авааваах чевакчщех часесчшчсу асани хо ах ик у и прим й ку ую мих у ми В жують си Вт уки ІжІ Ми ад стІчпесвиоьа зах оваки Фоми деле дача Окчосча Зоо свикч шшаюе А «пійз АЙх я чи
ЖЖ КА су ту, пиж «іш ДАН
КЕ яешиюожмї Коша дод кА Ах Земахи вели нях. чл «ЯК» п : ; я
В ітухичиіуттиих стр и ря ху оцрфи учених м ех іі р ДУ рити Уч грВіерегх й
Ввізпсчасос скиди вссте севоаесвоз сескавимох вобессео сало п. пуд ву фут УК сих уки у ок у скит муж ква ух пф миру даму уУє В гук шити ув угя зт зЗичслашх пехвичмит спинних раса ссвис спаржева Кох ХУ мими аж ВКеА М ужимитус уки муч см двом Ж Ім мих тиф еЖи их тубус тех ииі чий
НІЧ моло Ферми режі ксомх схе счшк МО жири ит отже ииит у урУ Кури уж есрВІ ут Му Уежухаі ичи му і мя ЕХ чим мниц лапа посспгасово сома личко папи и ; : ежтнух Сет тя сту ЕКО перу В я зигу щІпссспицчоа возспшамиманс Фчопочесв аавосслосл папи х сцивиКшли М грузи то Килими ЗУ и у тужити сутезургтутитщуМИ п Код уту од ут ем т уецигя ЩЕ зесстацесзчаса аспазечЧесно сучас сс рннн пссосацеса сис БИ тими ку ми мо фо их з цдожІх и кути Між ам ужив ІА М МІ МО УМ січі у еВ Ух лег посасиссок спосо сах ФУ ИН БИ АКА опи: ФМ КИХ ча кож чан р и оч Не у и зва кишок шИи ЧІ им ІНН ЛА КЕ пропо еХеитс МАЯ КІ НК ЗУ зач варю я жи ги я. жави в ук ж феод ик их пирію те уві жи іі ву ах кчозавсча поза авче сопсвеюао бос млуссевиао скл ка си спи сстив спИищисссвча зипсассощи песлоаоачеи ше сосоя роя а сперму цісмуи видовими содовим пис дди граб поет дя А аштзкоетастя апеасивиоас сини своих шукаю фо ани УшУ а нн НН и В в м ан т птІМусстесе ле см коФферих озон сосен тЕну омекстксиени кою омтєт Ка хм ж Жити и пев уж ки уже щирими Химия хх сук Ім сил шин оиЯ хом чск позу кю спОепсилІмемє стане сах Те жи их и жу МК дж ек ам и сна ори У им их ик ши ви Ам Ж се ож дим ит у чат спездесчезс сивих соебсутсавс чсслочшааос кеиБсасва пила йо туби узи В учих дю див их пут кет же учеК дю цуттих усу ит сири те ов вух ТАТ зассоапсс вовка воша чзКспазпве аа сехпоа возив жи
Уж іму ци ти умо уи схо ериисмуіии жУииМа узи Кі уУ пут ВИМК ізіхиВ ФІ ТЕГ щ5ай
ШК шошомцчІ чола ЗисАЗОЧКТ пасок чив не печери Фор дир (ЖЕ Мат и мав пос МІ О та песо сири сан ФП спдс спаси си ее А МАМ сг Мітки ур су тити т вух Мости М ги ли зззайоцссх сапки спешосс посвачаєл сосочки сплив дМТюМ сет ти сур Вир сІіжІх диву ффихуУ тиху КІ пу уі ТЕ УМІВ ап
Кр описки сесаАисмМІ ФО висАдшеск куки КОЮ фотка ху лаку
МКУ Ка п й 455
ЕАМВ ОО КшО ярі хх
УА МА ах «Вл» БИК их ух Фо х хх и чі 0 дамо илЛя ПАХ «і а хавимх «й 2 Фора То льох їТмум о Мая до лу Тк лу ки Мом беж Хот слу Мом
Мей ВО Таж ко дек Ніз пед Бе АВвпоБкЗ ев о Ттух Впе дер о вбне: Акхц х чт Ах з їх рі ї5 М ч з золи ме Са бруєия гуму 4 ля мує ху их ке х осмук ів 5Бів Мід о йкчЯ УвУ КхЗ ім Щек НУ Аха хв КІ ші Бе Аве Ар го ВУ 3 шко бач хі я йду 3 тлу тлу й Ве Мі сек ой бл вд А ів жи аа ХА АЮ ЇХ жЖ ам КМ Бл їхАШ ОВК шко АЗо вл ОМ
ТУ Б ся ях 5 ж
Фа їх» да Му т щи й ут мя ху бі. їх Ві Щі А Ах дум ххх
МУ ОУВА УВА МАЮ ІіхВМ ОКО ЇМО ЖЕО зАЄ ів Вів віз чаї ВІ АХ шк
ЗУ ЩО хх уче В М мити ту сумму (їх А Фе їду Гах Чихх (тлу Хі хх СУХУ 4ів ХУ Віз із ба Бал Ктюв ОА хів ББшж ії би Тйх Фбфіу Вів (І У рчнвя ТЕХ т ЩО
МУ КС ТІ Що зді обкл Ах г га тім Ди доку лід сії мк де їд дід ото мх
Уа жКо діл пі без іо дів вт Уаі Зм Аз охо чЗаі ів Суз Ме ях зо че
Шіхз й ххх ХУ І КО ов єт Там АХЛжКО М жом ск дет тк ух Тл ля
ЕЖат КІВ ІН БО суд АЙ СМ му Мет Ах Вів Ма де Фо ю ЕК у х гі ту чт щи З ЯН
Ху що судо п ю М щі Хе й Мжм їішщо Має йо Зв. ба Жде то ма Аа жа ау МуХх ому ЩЕ ЖК яКЕ да МЕ ох Км Же пшеЖ Мун пк па ре кококх кт Мет.
Гі Кеш о Ми Між ТТ Пр лу тп Пд Жах бери Фищук поли свосучи пу Ме ТЕ ошех СА су шк п Не Бек КЕ ів йех б. ВЕ оку їла чл т; у МИ ї5О ж ух, ня в т лк т пох м Ж ож я "Ма До, Му си Ов У ре їжи Ак Я зу тм рого ув ї. а оку ми АБ Її УЖЕ х в'юеяшх з 145 1хо 155 150 жк бою дк дк: Уж іу і НК мл тки іх ж Моз 1. Хі Ж ст вже УВІ Ме піп хі пе Ків БУуЗ За МеХ АКп о діз сво вів Бар хх т УлЕх,
М КК КО дого хм Комі Ї31Із Хахм ЖИчох Ж ші дум М Во тує (Лю Хохух ую лі г п
АХ АНОДІ Сай З» БІВ МО АК Ла ме са у зам ОСКлХ іх у іхАМ мал че ах хх ши їх Я я АТО ке хі іє жі щі щі дл лк дум У Хі: Мміллу мл сам тк стме хіх та щі т АВ УВА СХ АК ХА дк АК ла шаУ бах тах мес тм дів тлу За тах
А «Мк ХО
Зх Уце хх : бфожему бачу бик фут дока їахмщ (ж щоку Уй ну док пу ох
Вих Ммек нів Бев Ат ЖЕв ук Бко вхо ств БхЗ вже о БкОо Ака Ахо МІВ 218 З дао
Тл: пою татід То Віз МА в піка шу Шок тії вх то 3 ном ЖЕ пе)» обі Бша Її біз Кіз Тих АЮ З піу яп Кле Жах ЕБе У8І ад
ЕЕ ХЛ ЖЕ а
Ум дае т щі лів ем г» ходи м таня Шви ж пі Хіам омх А жа зап оВеш ЗО УВІ хз о шнУу пев озІіВБ ОБ ке дл мл о огУу Ко Бе ОАЕ тк пу у ях ХО ю ОХ бум ОК ЗЕез СЕ, хз я Ми тен уж що ХХІ хіх хи Мих яті хх заз ів ува гжО вав УВА КЕ зАЖ Вів БсаФ жах шА ВІМЬ УВО Оу ех М пт
УТІХ «ЕХ Кк лежу Ж зії Урі Зі Тра Та Есе щу; 143 0бувуя иа А до ЯК бчку Мк ве Ге ББе Ніз бів бец Ск дв БІ Ахо Бе нів Бех Уві ТУух НІ ектрх, З Уж ях си ши дум Від а хі де Жокож ху. Ханах долі бом Ж пух Жах стр жк ху
І ВА УВА ЗА ВЛ ВКФ ВЕЮ са ЗБ ОТКЧ сваволя МмА Зі АЖ пе
Тахо я тки Ши ки ха Вії о ІТАЛ ДК х Хм Тез Мк ТАТ злет сту ки Ж пс шиє Ка пав олад зу Уа па КК мо дич жав Уа УМ
Іп5 1 Ки за
Швея Мох тнє ще А и шум ВО я ХмМик о йлею КЗ п ЦИ см М Фі. ТХХ дя ж ж
ЕХО Ки хау жи ка КО Віа ЗУ ОАЕ із Мало те шок сл ГУК жи и че
ЗВ а Зх - пк хв тик т нь и о Фін ре Умані я сур ОТ Зиват фолущ
Меї Зі Уві вхо Буз Бу Бій Кт ТипжЖж ТБ Зі ій бек ха ем БУВ км ча зийщ ло 345 ЗО сих г АТ хіх Алла вів лм Вл мк Фа й хау бу ще ре ех Ма дів дій діа З ІВ ВІЗ ТКУ зна зе АЗИ де щі пк Ах В вд ту Зш В
МО Ж ЗК й А Що ЩО щої 1. г. УХ к Ще их дк 1-х хі хм Ки шо Фе. хо хів йіва Біва вій УА МівоЗІаа Ехо Бо Уйі хі УВІ Бек же пу шк щує то яхту а п ее чех
КМ ка ок жх хх «ші ЧЕ кл ях «щу дО КЛ я Зх пакдрвімв ії ка ще шах вкКкщ ха ие
Сай ЗА «М ік зику сметана жди гл ко кт Мене гук кір дах І зпсх ПписеАВО УК О тА Шабо сх и пев Уую пи хх ех ее и ТИ т З що
ІС берети смерек ем во жк сумі ее ків мому т
Зевсом згас Езиси Зоисиазко своє пИипопавстя копа МЕМ труси вв; пет В дуги син нути узЕжи ие ори сефутчичУ В пхати У КИ застали шах дз. ЩщК питне шосте нУувор клудашемх сири ї5щий пд Бачу уста тук Кит ччучууІ рути ВЕ Інд мих ОН зай зпзассссше каско цасх опе шенммх пса ицоае сода аеро шо пт М іди ходили Вк фреш иви ФФУ УЄТТІЗеви и; ЗКУ и пери ЗІ часи сааи дапсвсмех судах о свопсщоавоасо ссошоцлосм поафаспцсое ач рмжчсоакх засліосоть зозеччлеЗс «сало осо колосу ХО саавциачиз чФписчешс состсзосая соаочоче сосуюечази кеша о спас спзвоазас сасопкочсеух соч зроду х цеувонаца веселою 5 запо оассу запала ст зосзостасоц сеспосвосю: ВБеКсепін опієтосах и зсзсакчозс сссстасузек воасвкіглює Фолс свое доска УНН пис ссс вас асзасувойа сачиексева паспхочня Косик а ой зтквочоссалосс дисочсвсаст прифоцисов спесскиосцо сзтесвиаУх зизеека ох та ззаїсспеасств сасозсасоцеа боуассоцатиа гчЕссодаос аапсосатас апа сао Ко зивасивасв пал исшмиос база капс асо я СЕК 15 чспкачпайкл восзгзатаза зчачтсспзчс аволапевсх спори тено поси ще писдаслектх ссскоадаче зо спушо зсспасзайо адФорочулоє спис ньо ЗО чапсочазоа ссцаспеачав зассестезос всстассатт ксваскіа тет аєо іп віднос со» Зшечсїако азсзавоЗза ещолісствив зба сеспах запасу КОВО завІкллхачх оссазаасісоа асзсазавозча засовачекх всакччцс Фолс і: зчерлеазчо акеставочя ссспочавснвох сосок ще х соло шац їх засіла бссктсвиоскЕ сзсслесесва епосі чс сиве оса зсув косех і25О сапсдиссосв осока зоуссчовоса поси дело сама ще 13
Часзасиких схУсасвисош батовямро сосепсеса зсшсиепа шок із чксзазвсиссз ассххочасев двпасслаимо чок босом допис 1323 авачечлстс дарссмиунвеа зоохівосс ссофнросю соеєцоств ссср ії «сек часосо взпестакзуу соблозусвас вацосекіса сосассачече сс її задвкзаєсто смнричетос спосуссаце павтосавсЗ асесошвссо зпоссзпеос ІБ чсспчебовосс застосо к сш стсоа додчівчитаВ сечаточсооя чаввоасво іо сеакчсалас спусаплиссяа човастоває севлазсаациу саше хе сососоаеи 1745 пацацетассвоа сипачсЕлос псадсптто сабо зсхацпатоя заваасрнлай 1550 зиЕкиовзвис: пазвісралта созазвонаа засазавас полив орав їв адикчЕеск сосазкклоа сеззссеоЕс ссаваозоФще сетриКаєст коасуасках 158 квстспкзахгмт зазавосгявко спааскеаакя сек аФчовк сощивавБесотЬ балках їз група ссюва спе сезасдасвоя бстасавосо пасе коре аа спосо здадазаазах здавгахзакї Забосцо: засув сови «що візова зосссакчсва зазоактусУв док сашкНх сив зх4к «ій 197 іі КО «ях ДНЕ «ВІЇ йпхУха зве «опи ІЗ виакжсксвкх сидстІвкмі заайпксвІвн вавашавткта сгетаззцаза зеадяктАс.
БЕ зиск соаскачоск собзососваас зазводвасо васчечочЯ се 155 жипедчісатс чсслЕсЯжес! без еосс засплсожа пасековаза чсшопас ІН сехспасктс суцуедеєта сзсесзпечеоосє дова ссфкоеюву сссосаств хЯх прасстеночкоа четвер ери содопеанє сука с сор жо пеки кс сао созсщсех Фпкассвоичс скпудазачк зочусеаоссту 428 путФессстсс ссцсоцаспе сецеочвачаї псдооссдо сдспоссскоЗ опа «в саастастос еще сласска кососісеКи село ссаац сесасоуюоу. сосдацюв 548 сашспвстес «ние стоосст Вособспостів Февоссдеснс сЕсбЯвосса ЗЗоцеонх шййЙ ствасівссках сісткосвкоа асзсовеолча зчапкисвл Фмимерасоо замов Зо БУ савсчадека стчазнеео осаду стос ассуретчасв ерссюесо 72 аоресонертєку засрафоеоув хто Фе совастьху всгесеюаск ковка зо спозачоакцєс сосспаазессв: соч ачоезст зашпексовос содової ЗУ й сосассеко шишсвсваца Зоссточеово чЧувчсасас сиди хУх зерросхуВ зп поту неуоз попу асочи соло зоечаз Часте сУукс зісзвасцкша почашстоЕ За миматистє восавелтев чес сеу сетскескає сежосюФфему соваассоеа ї12хо «спос дкосиЗоксш Зоссасмосех сзсслассо подув ес 1055 чсслисочазц спасе седосспчац сосососвкес зосостеакох субота 11435 зевсатозсо чізозсваче засос сс бхососешов ачакоЗКако 1 сассцастусс зоспосусеа ссезсуававою спасовочс зосаосзсюу сосцалерика тх388 тртватзашси зсвосевита зисашиссота баса стиза а;заававач вве її пауейпсавзе ззааавецав зешказахоєй саовекеще зкесавеєє сосесоеео 1388 зазасвскх фхасусвкує вижоваєасї жусаксоосе декдсвазва ктаозацє 144
2АА зовозапслу збсадебадат сововтаз:: звЕтазесва схзвеіссває гавооатехв т50о зївактавлв сівтсассс звгттєсзсав стуваладав зазсчєвосЕ ваттаахтає ій кчексвззчсї кавесккахс зазесицівЧа азевовеатев заст ова пропав Та вовотатсоох адеадваочаеи ваемаавносся вваажузасвх зсКуєУкУє сб ї58О какасссіо) сбосковаєка вобоєсекоє сті сазуєєеоьс двоє, ї140 віка тайт сетасаввсти абоораттйте сеасококо пасе зсоспасект гав зчствкавасс зрвустозксва вказав сет асват сезадоваО зеаасокзако із50 шдЕцтвсвчс вічІвічах азс сваУ зага цеааст «сов севВУх асачеа щи асплтактипи дк пп «де ХВ кеіїз 3125 «й ДНК «ех дж ка зак ча «о» 128 зідпсувссс соксуєвссї чайпвасосо сістоєттєр асттосовоає дпедаодопу во зкреоуаоя сусвсусаєю досувета десояссвеос собак оя седсреєдвує 125 засос вусчасосотю уссзасетьо фс сешеооаєте зоооафа 150 что суподовосе зоба КібстІскОч соооосасов субпссєу 245 заичесзекчи сзІзоцісоча заацооче осо СоКоФапусх пошу 325 зазазкжичсоа созбсосзсщи сесочосая сосеазсачее садами пезоавокох Зк сосок: сова зп созвоа пса су коБедисЕа соди щО «п кеооафексс досфоекево щеоосгеуюсє десеасеюх ежшкоєкеки шко овеоу ЕЕ зсшзеоащачи хепасвзоча Зеозосзсвзеа созчскаеою зестпстоава чеку Я зола посксаслуз спадчавоачис осочцачисчя апчпосавоау се авкоє ще звочасов сфрчнков: фФсассбвває сезіаоссса Фусромса пссзсуцооа БИ
Ясдеюеиро овочева овФсопзастеш Ффуосоткоов осбочеех ссауаоико тай зкоссвугоає сдовоєує сооксозвоує сссвосуе: засос восовецеку тво чшеаачучек сс отокав сс «косе шосВвов хост сасва ск шюиИ зай сасацовуссх асовосоєоєс собсуєрахєс сусрнссуєє кое ото зеторекає з0о пісопсодаюс сросоеооша соспсчедавя зчоопссзскоє соодвопссде есери зеп пн и и и НН я зга соацпавсасовооч поскапсссще пЧсивзиЧчаи сепоачІвсв сис сеадаВщку АМаМ нан НИ ВН я НЕ уусавсвасси Фора стисет диплавуаея кс сивссов асо ои село УМ зер ирх ж мату іти ееро сіре мук РЕМ и дра, джу
Заасайцас паски сл еикКк ех заесах ка зак «11» 375 стук, чих
АВК Не ес їЬизсхх ук А ех «АЙ МКУ шЕ БАХА кап я
ОКХ г
Яру їх і їни тою 1 Лтодзу; БТолуо фу Шуст Тому схем УЯбіх дома Кк га
Мек КІЗ Ту Бо йдех Мі бе о буж й вка Бе) Су Бра За бе Аа
У Кк г За
ХЕ НУ АХ Км хі Ах кут бут а тУєМ 211344 М щі ХІІ хочу джу фах Хо хх й шу
Зі Аїа йх з ах Уві БжО зЗіч ТЕ Ні Лі тТХхв Би пу б АЮ Ат «м -к чх- «М «у 2 мето би ві ді х Моїх з ук туї (21 тут 01 вх до А вх
ЗА ЕКО УВА УВА ВО ху (МУ ху АЖ їхАУ ска сіб АВ АХ УВА ККУ сук хх г
ЛВ ах 35 чу лі щаух ал ле іа і ю хи Атх іх вт ве пу Мія пуд вх чаї Ух мав УВО СІ ВІ ЗА АЮ ОЛАд пів вів Ах З 'Уах лава АК ща
За 5 ЩО о ля ту ху вх тах тон о жому що тю ко куля лих ша ох
Аїа Біб ЗіБ Ту обі Аа Вб ї-ща бен Уа Зі піз пі Ууді Бко БІВ шк жа зх дл
УКХ Ії с 8
З що томі Тіз ін Дт 14 4715 07335 но т Мо уми їуУму УМ Ми же віз Мец Ме Бех Ах Уві 55 ОМ вк а ВІ ХО Уві Бе» бек ему я чх пе
Кк зо МИ те Ох Же там МІ сю се а Що т ин ТУ є хх ми па их
ВО біщ сш їх мух Мем оду ові Уа. Ж А У ШКО щі У Іо КІЛ СУ зай ЗК зп ж кох КАХ
Тож ху бпату (ху кує Ще оку їж Єбтум лк ев пі беж Жов бо дме ж мА КшЖх БА ЕХ БЕЖО Уже дл дек ек бле гля соех их мем Ме охо хв їх «лук
МА їм я сук ША їх хе пу УК дае Шут ую Си ду їух ах Шиу КТ Жодуєю о Моя их са шкІіУ ух ох їбб Бл Зеж ко дек дек їз ду З ех АБ АК ху «ск 2 ї30 аа їй поучи то Й джу Уламо фдухж ст й досту УМеуа Кл Тим судив хи шко що ак мМ вх ох вУБ лех за ЗОЗ ОЖ УЖ ли диО пев о сх де тож ж 51 тк Ес їі 155 іх іо
Ж 3 1зк 5513 Шу Зк Тож Міли Шоу йон тон Ах -х ло Ж прю Ж мк хе під інв Бое о нів Був бін Меї Аса веч їм зів АвОб пів Бещ о бем ех чи чи
АК ТюЮ М
Хна жі УМІЖ Ж ша Жука У Ткм ЗУ 0334 Мік й. Я Ах У
Ах ої Бе їй АхЧ о Афв лев о сбіУу еф Же зі б БАв УЮ АіФ пу їй їв Я тд у. и У й ж же ла ту домо Мстую ТАН ки й до ему лют 5 - чаї свій Бій ва АКе АхЗ лак обу є із вка Ме оТБх Аза Ттвх УВі ніх ак зх «угух
Ух ка «У то "хх Тег: пулу зр ож Го хк їн і ие бо ТТ ве КУЯ То гу и нжг
Темі бі уч пл фееєту Док зу з ча пох ї туз: я Тих їв вав о тх шОТУХ жо ЛУК ж ЕЕ ЕХО зай га ва БЕ іа бем оса у мя зім З: тка
МЕ «ж лі «и тії. А щі що тв дам тм Мі шкА шт ву йВіе лат Удує ру Шут пу
ТІ ді: Кіз ота ВВ ОО ху ха шкЕ ТВІ ВК о Єві Їдах бій Мвт о бку ув Зал ЗА за кий М и «ми ша жк ти тн и ти З Деу око пох ку це кр ж МАО Я жа БЖ аку ЗК ЗА дО Кп ЕІ УКЛ АВ КК ОКО Кт їх Ул лк й о зх їжу лісу ик Вл ли АТ лхвУх г лу дня хід Зх ох Хм У
Уа БЕЖО Ві М Ара сію Лів БМлй У Ждаї бий хві с У АВК їм) Бл ай Зде Ул «ХМ си «М
А го їду Тк Аза и щі ну фам ех ЗІ пу чо ще пол. х; хх
НЕЗ ї16 ез тТвх Аза БіУу Ажш о Еце Ні дек узі ТуУхХ Нів джш Віа Маї тик "зп суп я Б еВ зів Хол дп ка Мат вим М Хв ог (3 бу ю фах Тощміз Ж дер ах дек Акоа дв оАхо Аа хо Уді ЗБЕ Бембі Тук Бпе ва Оу ВЕЖ турок ко тив ях та
Ши бич ЩІ І си Ах б тТеу й щі Мі мА Ху Ж її:
Ем ож БжЖюЮ БМ жа о хвх впав ок Озеиа гу сом пів ха Ехо дів мі У
ЯТЬ Зо Ка КУ
Мох ее Щи Зх жу. Що Щоки хе "у жде ЩА єОж у лухлоту. їх. пої хг
Ахщ лу г вав о КУЖ КУ АВ МА Я пит можшХУ ОА ЖУХ МЕ пає УА
Ффоміж тях облі У рих до мому ія іх би М що т товує Мох І ких акц МУ му дІіВ Брпе вав о жлх Блу ХУ ет ВІВ Мем дув мех Уа зе та зац зи 180 345 зви ре М кум кі ж хх. жу Ку 142 0 у ал ху со ми ме лив Ліз 1 віх АТа і х іч ні Хот: Ам са Вів ші вд ож дв пів БЗіа йіа піз йІіЗ жов ОЗ Ні ер ода гі Віз іа вів зц Ех У са
З ще ЗЕ ве хе Ул 21, и
ВМіщ ех Збру 21 л и
Зі йвоз ЗУвІАі пів Ів птй
ТУ як рух сли
КЕ 1 ою схуд «хакі ож
ОТ те ха АХ до ух букет хг ках сжЕУже АКА ря «ти «ап» 17 випасісакі созсївккУї зазазксаїзо даазадахткка сазкаспвовоа вав качх 0 зкпинасоз Боавскодии оку стсвЗає педа ецчея зперичеча псують їх ксидласосжіс злого Есо ссопосазс цеси сесосаеца воесокеко ї55 спін: со ечосза пЗсчоЗ Чув ао зем шосшасца З си ум я иа Се тХи ММ ужити суми Ух кутви жим ху укечи ММ суху меИсеЖтИ Ки В угруути запа сстапссчшс чемно почта слини чеше скани ЗК скине чниК пасппозсозу сосплавно золи печива чими 355 косинсозоз саозщсзееє сопе х Фу феМриНннвІ деЧпооох чи пиши сттує сао а сррачаацає одофасочо соспусесмр охоп я зо позпссвсопочх сопоасссов сопе ме пЕпсхсосзаш спосвсЯБах совка 53 пасопесхес сопссстосо кос птсозцВ щегосЧчаивОус сооссосса Зопесцяа пий повоссвесксо стос ози ататахвсає засво Сов асасеє сакоосасвюв 5 квсксіасопх зувівассзкао сіссзст ах зсзествич Вксчахсіаст зеасватаха ТВ песазкісчастІ здано зі сасФва падав сас чесна са сОска ТЕО винос тос зар ясв спос: пЗсзавачадф) почоиосачалчЕ ср а 4 «ків тчахс зоецчачайоао епосу сфшкасоков века завоухсоси Зоо заспсицечае задпепоссеаце чок сесасоцасеї сззУсьооеЕ сапсееееку Заг пЕіпсаавнис хожуспосенр чсеокосациско после одай пцеспетаси зо 025
ЧілдссоасоЯ Сосни сота зво Уся воски рога саке 108 К зесалощеї кповсефооь сізссвеш зе ьва всоусаасс павссааико МЕ шсодстсозасх вокісссу осмос ЗавишН очисти поса їхщо щшідссоосноя сепочазесст посикаси шви зЗе звссоузаза се сУх ї-5о ностазолаФфе ссокисесео пастою фссколада боже ови сим снмуо їх
Чесзссоссоо зсдазсвова совозосцос Феслссчсс зсчсссасзс агавостаєа То щшасвосвуох зсосїспабсх сасзусзаззе азааазвцяава сазооасач засаваааав 1459 заазвозаслас зазаечакая сасісзичих гвазуоохос ссовозсааа Іза ів чив о сваауимази зескдсапех осад савсчвостяа пава іжЖко чстазасоазз патааєсаеє сгваїкваєта збсскваїсїаз хпоаспеваавта апкзадакка тва сизжЕКсмь хісазЗзаско «азазавзеч соусах кеава саастатто това скав 1558
Екс аксотан сур звааа звозвакссеавов соті ссзазлсв апавпвчавча завиосзваца тп яку звеутусх сті мус ІК у ОО усу В ТВ У тека век и кам щує дич у рих ту аа авчЧазіисчавва спзвзааасоаяе ВАХ КАКУ 5 пласких пово воли АШшМО жк фони сіл ВО ово фгх щодо их Ів дви де ви др дк мук чаш л
Чткчасеваче зосшекаКИпЕ чо ссдава досл венах зов х АБУ жховеставкІ сзгттадзоа вістанесих пасли свист вили г
ФСК ММ У око дику і кий лек мо БОМ ХрК ВУ хую І юку с ВАМ межи дом Мох па хоємоховіи КК о ств КОМ Фут ХІМ ть: тик Ки ж діт годи т. тоди пЕЗлЛІсЗасТа зсбапоаасЕЕ вовка ззовні оха пики паші АМЖОУУ чи и ОО товсту ие коди узи іх о стек (з І Кук тд свита состав мочве зЗазазосвося авасотазастеата псекадпвсает са Му кл т «КАМ АВ ху іти «ЛАВ КІ шу НЕ дюн ТАТ лу дев ут ру «Вій Вера мніцака с Дю, 57 ки А влити брови сао сити попе БЕХ Б встик петввкшсаю скосу свеошииих Мачишичаи КОВИХ ви спос ль уся пет мифеехитг, жим уж о пи фетою уж може вач пре уж т тт зчпсавкосаа зола чеспдачия зекКсецек жк азским аспоЗассева щи
Едвін Ева пахви воза теми ВОпІлЕВснсай плані Каре дух тип
Мі и ми ХА ЕК МК худих ькА іх ке ска ЕЕ МИТ ХеМАТ М КТ як руху иуі жити уко ухт ке оту МУК у нки Уже их Жов иВ и всих сливи иа зай посвзачсаос пизда почав іво айпЗочиНис оце цамнх зессвоссв сах у ви им сити дж «дез оЖ ежевимих вЗифіж ВЗ риІмІМЕ сиу верфі сих уж стихи их бл клан счи педицпсом счоофци ппчаоЗесах чемно палат НО пути ють ие суду ТУ УК У гук ужі муку «ки У УТиМсКх оз аа о Кузик ин фури ем вксоижЕио ста часу иа са оца сани пиши ЗУ рен нн ВК В ЕВ КЕ Я зи аошцоссасцс сопе мрис сеадліселнр спосо посли ата Чопа жк ди НН и НК НИ и Чия да воІчлшепчх песиодовЗз авзаслоичсв подизоомо сито снат Мр осЄ ЗО
Іти су тд вики кун жк ву св ди У тіки щи г м де цип атласи поси Кекс соезавцас зи ло Часу ЗМ
Кк хх узи тхєтви щоці КІ Кути ух гц ту тт деричия три МІвии р щи шко савашмкеие сошки час шипа пісок Зно дритузуреч МВ В рив добрі боихи в ож ід ри фуги г вх ди висту шли Уа о сошасеута сану сус вп хІЖУЗ МІУ В УІХх се УКУЖ В В оси ух кукі ж ги УєУгУЮ сту ИУч Кі ІТ ВВ Ух рими ТІ шинель ЗИиСФеешУС Часів ше ммКІ паче Ос мнекЗ Кий
Мб сузруєруєтия соду зи гуд Всщо фгетрутуті гц ЩО г щамі и КИ живу пути ит тд чшкпогцчачиа са киУєює патасоае стою пис ув 1 зни ча сосаеалсне псосезоює соашоцсов сасозчативи ше ее ни и НН і В НН НН НКИ тус
МКК Зх ПОМ ІНОХЯХ КК ТОВ Х чо Мер ЖІ псечЕ У по прижот роритух око жид сини есте океаном пори и и що сх уже и ср Й ВУ учи у па чЧедецапиши чЧипочстуеч личапипслв Сбоспкочолае спос пише ося ша фоузух хво уз ду ду Між ричит ие ВК ок репу пок ух в прис ту ку и тиж сту ее ПУ ее и дю бути ЧІ каша сли папейникех вовки сту ха вИп хх ОК їм лег У ж Ки хх оту пу ЖОВ ки кл ериху печити их у - КВУ и вих зпвиат асстпчцасвкс зссуслачеас Каси сассовоосса сова чч оптика АЮ ен НН АЧНИК ч-т4В щупа остху «сно со мес Фест су жу Ж КВУ Ка ву АС п НН в ти
ЯКА ДЕД ІТ с о зве Що шою ема дк ми А ОВ «шк тус щі тд пихи ку У и ів и МК див сирних ев Я ш«ицласточощи стос асас пхсстсссчата косого пови ос а дч меми чи хости кі. и кю хфсутем сс кі В дик судові Іо: ко За власну поза дацено пасту врата хво павлалвЗеє лаЗІна За ул пихи цоощі з чавазвиаВвВ хх іл ех їз
ОКО КАя Кн слі зи вича КАХ яру їх «кій дик шк. чн зу: «ЕЕ» Нохоннаа співи «а» доручив ух ГА ди у КУ Ву тету м «Кесиачисом сипати кх ваша сини КЕШ О жк Ие щу ви сестри режи ікси ЕК меси Іф хімію му ти рити ха паачсусисса зчасона си чн ссивн сеосвосЗасї зов си МКУ томі ср СТО оВІ тиж ду сор хи сечу ре у су семхит 31 сораахниМм задали спри доза Осо ВИХ НУ УКХ 35 и в в В В НН о я зав паче сотих сезонна пит ЛШ ЖК ЮИ ши тет жк ет Жуки тет стгриьсерити сте ие дити ин ду В КЗ ти у ТЕТ зп стлпиштнм супорта сохолачатс дочасвос зи осо ец ЗО таеаптувсаима пси песо лсли сзолпасемци смена пиши м спиш хоп Є Зеушнеоти фот дес е щрессецх Ех
Кейт ин фо вух мин іх у аж ик уж крим лив жердини спреди М уч умів в гу дух воотпсшкост косу єстосвВ чілсаспиаЯ софаоцщхх зшвсипілес сопе ио ЗУ реф тчетрруві их ди ресивери З циних ДІ ВВ паину пдв ик зх стічмртосо апссштстоисва пса вва Вінн ос поши х ЗУ тжутІЖ В и І Ю МІЖ У ДИВ Тем зд МИХ Ким у и втки сту ВИМИ Ус тів їх чЧесихааоста спав осса свои ас ше сохв сспасавасє зичу по ша нн ІНН В НК кап сви ФОМІН млі ема сезони пороша срср стви Ме лемки окт и с мини и рив ри и ди ким пику вве де я и тк иа ШК л аж сяволи соло тис бета сопе пише г пе олее ФЕМ Ви подіти КУ ВМО МУ срУ дику с Км УК Веди спр ми Зав чан За ак пос ешими «Фан ХАККсЧВХ мохи М азистлеос поза икоазав зсчзсксим спаепсолсв псом сла пи
Маю мем мкм Усю ши АХ КММи МУ лег ІУ МЕ фев К У тза з ліІТЮЮ уУх ссжежхуитс КМ возуд ІДУ и ИУ ще вп Ччссач дос аха списа сшис ФчипоаскИи хопасвЕсик савоисваВкох Б тив ру п дретуто строгу их кре о умесуєих ев «ик В Кок па пасок ссасв поеовкосасса сочосзиосчес псспзаоссо; всвоапоашло зале хе сети Коди ни ис ржимут ин ух поживу О дупієустужі сеК сіЖоюдО Кре ем и ВК п ку тних зай шашлики соло сщфссовичЕс зем поса чаа ЧСС Кхс шо убужхз дарств у Мом ж диму ситі уУМ ноу тхив Сфоужтвиту ут хи о сус хо ри виу В фату У ду І
ФВ шКрИ КВІН ТВ З сли КУ кових зачич зиску КМУ реч куди сих твутевии и струни ван ви пф тік тує фістули ех уу аа
Ес ксасив спис попав саві «зріз ипеа СЕ соасьа сла Пп МУ Х тідо ій Кути их жи б ух ту є у злий
Ше МІУ МСА ЛАКУ А МАМ ножі в яру «ЖАХ ОД «жи ВДЕ
ТУ Ач н23 З му же
ХА ЯЯ можем типах коду дах «то 3 яса їх АФ ху Мир їх та ак бук В ее 24 у тряіня дя В їх
Ме Рхз тТвх Бо Зеї Ну беУ дек мує АЗо Бо ніш Тужх Внш Аз де 4 Е аг де ї во 19 Ма
Моя ВО Мі хжу. ох ЗКУ де сх зни ЛІ ху З що уч дух Ук ду Кі
Аку ліз ія Зк Ахо Уві Рхо бів Жвх ніш Азія Тк Ро і ем Мія 2 З КІ
М дл поко еною 17 АС ТЯ Влуї 1 кх тк лах що хо ТУ ще рми зх ази о Ніз Ехо Маї УЮ Аз Бі сію бі Ал пу ау пу Ехо Авюио дів
Я У жк їх ДУ о пшя Маю Можу мух ЇУу їх Ди й ка у и у ча Ехо Мав УдІі бию Ме ов Яр Буа Сузв дів Аіа Бій Зі Заї дів
ВИ з О ті Від м ях рат у бів Ж ох То фу ух тах МА УМ кс
Шпей дів Віз Біб аб ТЕ оф йіа ре Без о Бео був о біУ НІ сі Ма жо ча т За ща Ти З ЗИ
ХК усе жо Ж оншя о Бінух ОХ Моз їж т мо КУМ Ук 1 ТЗ «х ие а хе цем аль Бшем вм Ада дО УВА кв одіВв ха Аж Аіф щі У МЕЖ. вл:
Зо ще
МО ол ним Ж сходи и вушну Жжожех Ко ІД Ми почи хи при жу піз Бе; Бо діа бат Бій бук мех Ахо дів Уа ко Ага хо пір Ер ат. а ти
М АХКУ 112
Зжтрє флак г ау Яйяту. т ау бує ек кА Тк Фуумо боуу бич бу Же СТ ями біг знЖ Му каф тТук бішЖ бах ЕЖБ ЕКО зіш 5еЖ мех жлжЖ Бле дек Бе Сея
У її зр: о Кк ля да ку ува 0153 (тд бек ум МІУ сш Тек хо Жожту Базі ще Шедехе Сдосту
Меї ТЕБ Хек За слу ТУух тТвх Без о 3ех Бо АІа Аз о Гво й Беж Аве ї30 ІЩЕ 145 2 ем тх чо Жикк фу тує Зх Трах Я мо му мк лу її шо ІУзахм їм ісв Ак5 Був їм ЖК Ехо тв дів спі наз БбовБ о ХжЕ йха паз бле Суз ах ко тк Я од
Я і52 АхО ЗО й З її; мив щі тя пише м Мих (У Вгх- щоку Ек тя М йо тож
Віз Уві Ммеї Оці бе іє Ак о щію Ве АК ЖМ їв Лія Аз» Був 355 ї7а В
ЗК А КІ точ Тогузя 0730 Ж ощіх ЛУКІЇ Жфодт ЛЕ Моз тоді «ку Ті Миру їх г ти їжв Бей сів ев ВБе Без Уді Аза бецозЗім Бер тТпж Фу У УМ о сЗАТЬ СУХІ і 85 т ії ке хо ху 07153 З т. це тож в щі М тім ву е Міян М рю
Ліва вій УВІ ів дек спів НІВ зуха Гі лій суй Тих Вже ТпУ Аза бо Ж з 3» жИО КЕ
Ме іє їсуй й аж Б Тех бо жу кт: дж їжу Ти Ще Мі : мес Ні пео дб о тхр ТУух жо Бу пухлобко АзЗВв осв Бу Ах Аза Сем хім Ук бат
КАСИ, Ме ш в ох Ж лох ії ри хх Ж до ХУ Мои жу їх ту ДЖ жк до
Бі Пец бі 3іа Кіз ТВк одзо дех бі Ве ББе ТВк Бе Удї їхню Бі по ду Кк Зах ша и ше КТК тні Є шах У рр о чн пл У хг ХУ божі шо лк ди ех з лет веж Бей чаї Екс піу пев сів рев вне дез Мі бр Рко; зв й ткр пах зЗцй зва па БОКИ о дж Тимура 1 М дю їх ЩО о Ек хр У хв ли ке
Чаї їх Майї бхо іа бві Кхз пі Аївз о Меї Уа Заі вва о УВі п3уУ Аве зай зд та хо М кю п ІЗіхше ЇЖУ ху Ж хол Чі; йо мк ук ак Чі хо бує ЗЕ Уран А шо о пев овбе Мав її без ТжЖ Ав плу Ах ВБе Кіз Зех Маї ТУух Він АКщ
Ж ХВО 5 їх ї ху «сти 7 пе 7 щу ос о РН Фан Тр Ек ее. я Се: є.
Аів УвЕ Уві АЗо Аза вав о Бех дер дра сіє Жек Ме су ТУкК Біне їди тей вЖезя ІВ ше шОЖ «НО їт7 ск Шу: й У їх «ау ток ду долю Ти Ток Лк 243 г Тл а цБіу вх ЕХО Ліз Ніз Уві був УВІ діа ко БемоАкЦ Хв Віз їх) Віа ки щи ек де з 315 315 Зх ше тпм ох оз Зо рчув лом Кі х у. сефу птртя тім тах бух щрут ку
Оу Ух ка Віа й ТУК йхч Аа тУавї тву Жтв вхо Зі ТК Мет оку ла зп Я кт ри нн НВ ДО ж не не гу Ух боже щи ЖошУ Ж чи д 5; 1 чві хо пу був діа пе Тжбвж ТП Зі Вів дех ліва їн Бея Мет ві жк зад дах зи КУ 5 хщц жу м ті й ен В ха. Фоліо ха щої То суі ШУєуА ж ВАЛ О тат Фр зів зів Бех ТИХ Ав ою Аз дів дз Ома лим вже ща Мить МК лВ5 зо ЗВ
ЗЕ штук рух 75 й каЩЇОв ІЛЯ ек зад «шіїМ 1554 шт ее «ій» ДЕК кр лухю жі Кіа суд я хх «кій ккхїКісим везе ух щем ек, 4 дно суч вод «ди їнша самка о руту ЗЕД «Ед БУ, (Іо
ЛИП я у. : по ж їх пою я ше МпОош о З, ХХ, МОВО Х лук,
КАХ
ТО чим жо У Ь «их хниЗ сша
Ту іш х Ка
ЖАР іа. Ю.Б
ЗСЖ т, я и - ку, хх «й по Я, шу 5 ОЕМ їх «по» 134 спвсозтазавсй зЗесиекоск вп счех пев ЧохоешеВеи в'пиалечнай и пре укр вили куг ОЙ фе ик жи і рей їн Я перу я ек синивхтщо ж реж ди прееоюжии уфж ях 4зх часи сонну КезпишЕХК базове ку пастка остов. Маю кЧапоцаєсцоес зоспсвсс зпевзочнос сестотоаве сет чес їі чаш лссуца пасе спуссипочає беасавсцаслов сесосУсаЗея ззецевОс дО чепзсоалдчсоа зочессацас чозасзсоа Езчоззасах дебспасссу дисц зпо воезечакчос зе дно сезони зе сссчЧоааас вас що сечова зссвикасУс зво; стО совксодсизо саКчсмн списа пе кпочевадаїх зофеоосака сороссуєеся песто се пасоа соосутоов зви пПежестсмих сепопеюа спевкзоу: сечадаЗока свшсееемих оссщруссво зах зппасоосла посссЗсвва состаососа есте соцлтасецо свипесхтов КЕ тспкчасозса зара ссвое зшзчадчвхс зо огедо своих сезопае Б кттепуєтао сохочшаио воссозочає афрсусос сома восх пещсвоевие Та ксоссовчає сесовоссвис асвешивсс пови стплеашес ссзчасиосоуа та ечсозочсеси: Фірссозатх псоупесалах азбест се сзосихо чолка КИ зосеслушив сезастасв сечо есацспиосча прсзесазакя зочузсско Зо сиукцссчл зУуссвкчусс жфісвасвкс пове севаврссхс всзЗвашацох зво жчсіхссвсво сапскасово поасоуоосчосоа Ссааслоосда садсавокчю засос їв
Фея осезоооуєво зоссасакса зофіпнсио десоаадовУ зовопсіаоов іпво чесевсзсалоцєс сассевософх засакксвалу ззсссеоачїа сао сзсзадавя БІО тсіссвисає суссцуеєксюх зсосовваа бачсзоса сСпєшаєсзао засво оо 12. ссевасевсес сасовосстоо аксксщоку зазор сузссасово сопе їхКо чечзаксазвВК соасанесвих захво сзва свеоавзааєх рода а ков гелі єца 1155 зикозукадсх пашскочадек воосзозацо зазвосзсас почати папок 1359 чекзкЕсесо сваавзпааз паза окос боса кстхмерома фавспетвоє 1445 соч сок сового асусазчсвоч спавсбзаєсьв аглсїгаацаВ зебсавуная Мі зссбазитст вав кава скали асасоаскка пкт ЗипсоВваскох 158 вивеазаеиу зоравнювз авазгзававцає зкоапововво зазвазайайзва авезалааа 1Б5КО зееззвааваз «ввазазава педавзведаа аа 13 «КО» «вії» 115 «кій» ДЕК «кій БкхіМіси зе оцт
«ап» 135 зішссЗасшо саппосвист своасазачзас ссоозсачо Бишшастосоо понос що поечепссло засос чо оссзОа сус аст зоспсечкее почав ї5о часчсечцасоа завчащссчаз сила кам соч ставие спедцсзаеу ЗК 185 зЗачпсачла спихЗдсвас длачазесом пзсзосесє бепиаае пос ач ссФослаче косо соасо сзпоазавосс зочассзозя оса сос зсічооЧоя 450 тстсопезчаале бас очЄ зосзасцчсосо засцасисЗх попе Фетр 35 звтштсатисх Кос стсосаа збзсвозо сссонех асбаессеест поооцдесеає о стсочссооо воспссчназ пого є весоссоссє зсзасеасс пово теє о чсспизаср ааовастеся серрозвчас шеасосаосчи созасавацео осв оу ща жесту мости мМрк сасосчасоаш пес сш час вена во «описова севзідвосчс сапаазкусас екс восоиравмр сере Ба зерно класс сесдпевосвся дашмееиМм: сиижаовово супбостчсво та вписекчече ссуаассчеа ссеизЕссоча сасиососссго асо аЗч даси 7во чЧосчтчем сопосвивах сзпожасакс зоросдаосксх кссавоавсюе своп лис Бе счсскссасв сдичсовоса соусцосчеє змо сзсз зеаомрн засво о ЗО шчетасесов козак сопосапуєс задокочепво сопссаоочеа засто кВ
Фасон мои: сспсостасс сзсозусасУу бресвеЗзажі всасвррсах Фзпааиаая МО шестесвссв ссоФфаопсооко спофоссава Вбзукезсоа свісставка саасзлоює 059 уссадсласа счласчасої звис сксв Ву 13 «Кіз 155 «ВЕ ЕТ «іш ЛЕ «315 ткікісте епічна дати» |З
МЕЖ Бхз ТВ Бко віз Бій рев бЗеї БУ Дер о БІ Ако ТуУх Впе ДЕо БП дта віза йіа Вк Ах ві Рхз біб ТВХ Ні Айе ТкЮ Бк біт бек пів 28 ІЗ | 38 тр Віз Бхз ві Уві дво піу ех сіу Аіа бі Мі Біу РК Ахвовій
У 45 5 спа Бека чі са дазуу Ме о дт дах ВУ бив Міз щі ів віх хі дія
Узі ЕКЗ 83 Уві ви Мет бкч дво окхо Сув Віз Вів Бім Аз УВА АХВ. шо Ох «А ще ек ще бок А щі Код ж я сих прю Кл ФШбфехо Том Ту 043 2, 3 315 Іі їв Дів за аз зо Тв за йіа пе рей сви ба зам Еш ща Уві ди т ст, от хий Но 1 ос їн Хе Ії Ж оша жа їх ен т ра щі тд й ск Мово Ух возі Ззіч жд о їши ліз вка Уві б5Ба дів вів Зі: Ді жіу Мет Бе «Кк п сг
БЖ З ж ож и дк мор Уж МЛ Яку хаосу в хм ФУ жа ни гучно п яз Мох аів іо вхо дів щех Бім мує Мес Аха Алн Уві АхЯ Аж без сі Азо ай тях ям по и То бум оба 01 у бу жк Мих Хек Шаит Т оюю Сік Вр ЗУ а ди ках ех С хв олАХх ЗуУух ему Зех же ЕЕсО дфаш сл пек КВЕе Бве беж У ше 115 1 тах
МАВ Хм Мк
МЕ ОО Ух Фу: С31 С жк сту Тім ЗЕ бос Жкдм т Ж Ж суха Мокія вк мес їгв хе зіз біо тТух Тих гКе Зех БжЕо Аза Бе ЗМеви хо дах вже
Зх хх чай
Ме Ао а
Жохіх Даєхт Хо хв Хо дуууже Тк З лях Мом Хе хх б для Міші чи
Мені БЕ мух Мей тТжрв КкЕф ому АВ Бу Кі Хзо» о Тух ЗкФ Бі Бе сСуУВ чик чт и зп їз 158 15 ї5и хо ла ми: Ох плн: ве Хм Тх; лм ми Кк Ти: пл пе чЧоахи дів УВА мех біз» 5Е) Бра пів Зх ші Ме йхи жів їв) дів йогу
ЗЕ Р Вк
Яка 5 ХХ току З п Ж Меда Бех Чаї йія тлу іл Тих рію іс шли йім гаї
Зам веЖМмосАМ о ЗжИ ЕП Ся тва мів мен ше Бем о упж ау аю суп УВА 41 «вх вх 15 їз щи й хи І Жив М М таза лу ко лах синя Ми о бу хі тре же
Аїта від і Бі ек зі щі Су Сів Аїз бі ЖЖ Ме: ТвВк Аї1зЗ ОТВХ
Музи (5 ех То: ем фе Піза бак. Бу бтуУющю шою Тих сх ту вн МІ о тогуюх
Ве Нівз Їх) вл» ТжвоОфеК го Був Су Ехо Аде руб Буд та Вів Ппео іх -чх ц лук «Ам Ки Ом
Тік тації тіж пі мо У лях з. ТУ ОК У; ХЕ: ЗЕж ок Зіку Ма Хо пі
Зі ей Ті АЗіа ів ТБ Азр цех Зі вне о впе ТБЕЖ Ве Уві їм; 53
ПЕК пл тах зах
МІХ «хх ХОЛ МК
Ти то Хм (215 тожуїх Тем У Хе ця щі бу; ху ух би
ЖЖ Ей МЖВА КІ АЖ мит кА дим гРлжЖ БК Ех шолу КО лаб ми КЕ тд д яд ще 285 ше не їде бріує КК ним А у би їх 5 «хе щу їй М же чаї жах Удо Бжхо Мід Уа КкоО сьУ бажав Меї Уаї Уві й Уві зу зр жк де А
ВО «5 ТО з ші Ши бл ж жаху пк дме хх жо ін мл о ие ЗД бчхк Мі ач
ЗУ жі суп Ка о сяМА Кп ап жу ах пе ща ОшЖ чех ЮЖх пів ОлОсХ лек Ноя У ші «С лм хлеба Вих ум кг ті їМзу бом) Тк тек Км Її їміх кий ха ХА ВАВО АХО Кир о спФХх ЗБ ОЗ да шк дя Ку ХУ ЮТЮМ о ит й а З жу бе Тех І Щі яні Та МЕЖ ря их ж А Може ІТ и ШЬ а
ШіУ ж КксОМ пІАІВ МіБ УщІ М УВО МО ід б» їде АХ по ів овіз пе іа
Аг ше ек ях 305 31 15 З лу сим Ше ЩІ. хі тік воля ВІ ЩЕ ву сечу ку: МІ бю Мав ті шаАу хх Кжо ів З)УХА УЖ АХИЯ Ма Ва КиХх ЗЖМОКБЕФ с Кук о Мшх ому
Б 3 і
ХК Кок У У Ж хх ля ЖИ Че УМ таку ХХ хх Кл токімі гами Мох її тА Ах Буд зу Дій пЇ дВЖ тв пі У ліз ках хІВ ЇМ МЕ вах УВА их ак пр ії 345 У хіх Ущ йду не хе ато ших вів бод Щі шо бруд фах стажі Ж віз б) Бех твх АщО Ав Ар одів В) Ма нів ТБх лев АЮ Без ще
БЕ 5 Ей
Хек лук
ЗК очи зла ух хи хш ми А «АВ ОО КиКа
ТК ух пмх
Зо МК шия, Мих я туп м чи «ші ЖжКІКлими ве мцих
У ГУ, ОТ
ХХ ЩКИХ Вл: ; : ; ; ; : : поч, хе ков дов дже вини ви У ик ие дючлвухуя щире вікі кмин чи их «а паіашвих ми ЧИНИ З петлискси лося Зола ах ХАКІ щи схуд дує че и В Угрин у туру сиву мВ др імя суцохофК етдритии гри т зяоуд плеса мтвеи брошки сах си мало ва щиснюх сера до вому вив о же сфутсьриєттстум сту цу ги ТК ую и с т голих ФТІ ри ух, г вич всиКо сосок ая ссдпашсуцес Бити цосвО Факс часо шому А тадпсавслав ше ках Кеш О шипом ов пами зда кормом шо ШИК фея ЗНЕННя ЯК М сфБіу Кс сири КУ ог пути зай ші пк асиИ сао сопе списи шаною НИ опіум МЕ засл алла перила пхати пет жиму аа ЗА ас зчачампеччаал асп осчвис шерифа оІ па Кут «Кю пери тру ихх ихую итіоіутут ечу к уні тхич М в тяж урии е и гууеву ях
Ма ЧК ОК ск Я за цеси сци ОК с с п ШК Ех суЕЗиф т страж ухух стеки Кути чу сто ту ми зоре Ко рисссяуи сх КУіВ В Ко гіримхевеИ щі зичопнаФш «спла стцся апа имст гасити ои лена ве Зщио
Зір ужиуєти ги мМУу іх щих сужуктусу Вовк сх Мінуси и певен ув и ус д ди
ГАС Уичсачих почи Ех Че во чо ох сшЕлоКше КЕКВ зак дотри еІменМмиІ бак Ж схоесмец ха М Бл ЕД СТІТЮЬО В ще
ФЕМ жуки ЧК юка сис им Вик миаа М вдих семи «іа ие ЕлІ пси серушиа ох вес цра в де дія Ко ночі ну вівця Вес У ее В тату чзсещтвакв сапки селом ес спосо попере зах січ дт ж іщ кі сімох Бачити дев до со Кв веуриту уенвд ль лав всвсзсбозаб зпчЧесвоч| БосазстосУ ассасзсвосЯ сало ец со І щи ско ФК міх Ві; глід мВ су би В В сту фу вер йай спла лир потер пеиачевекиа щипати СО ЕХ иа Затв що пеки чн с ни Нв и і НН НА г пижхасвсавче пасавоківов сочшсцкша Коста сах чсачеце ста ЗОВ хваигсваса апсасавіни песцпимазос сбдошамннмУра копав сс иа шчваиспстивоса задав сСесбасс даесКУкає паро кк сплкеуто шо ву три мер КК МІ Мр и соті стр сте Ех штанини ков песо порекипоие чксзасцесна восазааває дос дехто їМкКМ др ди тут мк ми дю годозуєМ ІВ ри хр КІ ди я соти ду кт у УК щі А: акцассосса паедозовсте сазстчакас зксслзсас саспетссадея фозсвакее ї1пвО т х ех до хе дол оУ Ку гхопжі ув ооо и У ву Мих ру мулу уки хи забакасбавза азсаавиозч севссталопасчасвочо восссавоссаї чпосазадсавацио ІЧ щока Бут сут тиху иу фут духом КВК гм сухо сх мим ху. з1зийй зкутасактикс зссаосзасоо Сізасаєла зап коза пасеадеараох І сн НН НА В и І и НА НКЯ кущ стквае Зах шипа шило зОсевисих село хи о х їОи фауни журі стек ри у с Від гуси руї ром оту ум херес ою ух зд кофе нктсух секс с сок озосия Фо свЗоС пикссаЗсас Запсесцашо Мао стеки сирих ре орЮ в к д почуф даи ох Шо доні и ЮК их ха шати ти дими хиие ФЧХ аце соль шадишицНшх песо КОго ко пулу их ви сх пуфи ко КК п міки дво диких кіно иию йнтт і КА смс сет ут ет, хх кох заахсссивс сао влстивоаоо сстастпасс счшисос ввисосиЗих А жур изуиж у пф учити мирт Ж ди хи рухи ги паж го у кі ую чайптжл чсечасстаслах ассоасиаче салом ун нмеоІ пос ояая чол оссис Али
Фе ліф В рив при В у уноремирих пев уми в рих пи и жу за оастІзассчє соусу асчосепесчу сеовсспезо сип ВлЗича писав У фетру ик (9 жур КОМУ Дені ди учи иту ік У Відом пуф их уж и я ту пса о сзалавачех пеозсжаєсос зсцстсісещо човна дчахо Зп Аж шсасиуасав свою вавосвосчрІ астичислкчахМ мшеслхмЕиащ КЕ ОК шо рути Вих сти КН с Ки пече фото х хкдц кеи зай шосе ссассх сксопассаво стае исУвки сесативиахва ХХ бозаса зоепадеє КЕ я піз ватки домом миру ит до що су Муфти грим ит хи «тая сви пеки зскчаззах стадо астава ЧаОпЦИОЦ АВ «чизсасеЗзся сосцтлсазо ах бссоосЗ сазззазваваа пики ака ар палугу
ММ КЗ і МОм СеЩЕ Ех Се у в МИ АДХВ. КІІМКІ ЖІ ВХ ОО І ХЛМУЄКИХМ ххх Еш сем міом мо Косово вхцяи мех ут шкизвиесзеава свое хи «зЗІй У Ех «Ах Али сла А тиху 3 щ- ко
КТ ІМІХе стали Ж я 1 сухі ІХує мої ТК Ух «ша цеУжни Поопідсвнашее их
Мо Ми «шах злігонукхвотих супееиХ «о» З
МІОМІ КТК АЗ ККУ КК уч жосдхх жо КАХ ДУШ шу тт ща хи се ФІУ ха" БИК я ім ххі1 тур Вт хо «13» пррузна Послідовність
«Я
М х ук імчмлхщніІачи р сут Її хі С схюКсаУНеИМА УТ У сало пл ха камих 153 ве сходити ди НН та плач Ка сви У ту ха
Ех хз ню І хо КОМ М пк п кій» ВВЕ и Ля Тієхеіжівтя біс сети ик «кї53 шщшжтУЧчНа БЗИПЛЛДВМЛЛЕЕ кож хр
КЕ: «У зліхонУкилистив смс
Ми пліаконУклестив СУПІ яд лие тах чаИиши БЮ апа семи МУ
ХОМ сем БМ ях ж уд «Вій 191
С ж ст ах М страх ст аю тик ее тую Ми ук мужі их жк маже чна іа
У ги.
Зх
ШУ 00 суті и моди из КЕ кв» ЗлігонуУклзотимй супрасії «что 14 позчсзооз запо 25 ад чол яд Х о З як в ще мене пох
ІВ КО ел ХІІІ
КЕДИ Х пх ет тидрзхвх ці тіста пал сра ич «и У штучна пп пу «Ех ких лід иклестид сУпресіх «ами д хаплах 1945 сссазосвния воссуояе зв шкпиацчсвиш похо ко ха зх «вій» 145
Зі зи
КАХ М
Ух ск
Как Те
ШОСТЕ, З длчитуса то ЛЗ, лозу я кій ЩШКучна Послідовне
Каже жу люм и «Зх півтони клерваи сей
ША ОльусвукилЕсквА се х «аОФфе 55 ум тух іс здерти тхкі м за пором масони Ом
У хх М ет ит У
Кр зи сії М
Ук пи «ЛИ НЕ ях бімласті3; ик ик о увих, змо У той штучна песблудеанакх «ІЙ
КУ вок Уч Ммлим поетиці «АШІКх СД ОМУКИЛЕАЖНИА ЖУК рричи Ах «що 144 пути етхе и в х а шисслпшччстчи адм азиа М тугу ак «КК яри м пд кА М т жи «ах КВК
СЕ я Поуміхіхи Ттеуйтт уугуєст с УКХ у А зику чна Іль ВмМиХхЕ
Ко шими
ФОТО о он де кеш М сшщІжОВУкЛеВОТиИд сулоаатьх «ЧОП» Щ45
Чий зопсшоветх йо очи Ух «лом ЩБ «вії» 39 «Вій» ВЕЖ
ФО лу Ніехеза м їм мої ев їни
КА щу МИ ОАЕ КУТ
КТК г аж ки Кит с» біоетики сумкматі у
Жим КНУ МО КСІУ КОТА КУА ТУ ЗАВИХУ УМА но Кия т ях «ан лає зу в мія ммоіех а
Ірис лаЗв сит ссух хм со и «Ж КЦеИх ДОЮ ек тт «РАМ В етрау ти «іш» ВКХх кт жим Папі меди ік «ее иенчнв Послідовність кох «323 пуігоцскнаотмт бомиомтії
Ок их МАСКА ЛФК МКУ ХІМВІ МОЮ ях зх
Я х КЛ вистиссяає меча АХ стро че кл лих :а5
ККУ АЗИ ктулоу як «ж м У
От -иЕ «жк РИиК сиру Федів ТІ, : . кет учи КОСА дДОВНисК «ЕІ
СИЛ 0 фр хек кот і. ікру я ському киножец сжпІТЬХ
ОДУ, Кк: «що» 148 лу и и уд у А
ВМО ТИКК ЛЮКИ шо
ХК т ча
КАХ АЛ ТА яри ре «ФІ» дО ух щи ато пТУБАХ ші Мету бух муж й у «іх ЦрручНя ЛИВІ Мить «ТЕХ т ние помади а ут їх вчу ту сиМиЕомукинттийь слюгуми ти ЗА сх З лі
АС АСУ и ее вужчі ух дя ре ати слу А тлі з
КА М АК шк тю «ХХ М ж хкрну їм
КМ ЖЕ те т : : сх Пімчгзма хо Гірхуч ої зе смс «кій Шу ази зими ие кг хом
Ха а плану КЛлЕСТМнВ СУМОМ «ах У - я м - г. и. б
ДІЛУ сег р г г й хм зисхтуатия «смолу У а дх - й шк кю х их ц «кі М кутя см «з ВИК кору тк Мем фрум я «ЕР» шжетчна Послійсиність ще «ЕІух «Пт х Се Мо мс м мих теки олАгомукнатик пелЕМХУХУ
Кг кл ау АУКК сан АБУ У
У г з «щі» 155 вич чт я «КМ жу их УК кін КК
ТЕ Покер т Фо ек ких жкукна цтгплидоавнИгєк
КЗ
Жах «ЛЕТ 0 сірі тим ссттрееия хи плову кнлаквиа сУПпІМНИХ Х хг ух
ІЗ АУКИ ДАЕ тапок чими « нету ху кшІйМ ї5 шля За
АК КМ кн пах ши вх ж пе що ТУЯ ему ге
Ж 0 ЕХО ЗУХВАЛО ше
ЕЛ кю вх : 2 жЕжек МБ АгунжКУИжиМ пУМпИВИЕ хе 155 ззшшцатицстЗ ос атии о я Зх
КАК шу
ДЕК ня Зл ехо ж лю у тут хх. ЕЕ шосту пул илутх о Ттехех ця буді кі «кій ПрурУузна пПо»Олідсантсть яти ва я шЮтК поті хек лу ори ситу іх ки сплЕиКукиетнА СУМ ел Лу щи жи дл роті уро тутутт си пис В і г хи
ФосавесвииМм стерти шМ ее» 155 «13 тв кА М ер зик «кій Бик ти ік унох Стих фгекга ях ж шжтЕчУиВв ІА дДОВВХСТЕ клю тк
ЕМ тю - т жк ку кри Мо схіІ ТУ т ху В загону УВІ
Ат лек карих у гема гетри тету ше асвиХма дпашоачачни «Еш «во» Док ли г ка дО ше щи
Се лк
ТМ поуклхсзх: Хто «Сех, «АХ штучна МОЗ штати ди М
Корея Її ум тм и с скит жукк кеш спаму уУВИД ШУБИ У «Ям ІЖК ри лох паче оц тк шаг «ши «шах 157 «ши хм сли ших вони ЕТ
Зх Мнгздмомо зх уеохла і уже, кЕїйаМ Штучна Поспіудивн шт ет рух. «и «З ле сла то чекузптий пп 15 ки сла нУуКдяо жим сли «фа 157
Ісусу т ох мит. Ех и чис ак щиссецика КУ
Мт з ках хек АТО 217 За
Ей их С дир я ту хи ВКЕ
Ше ТУ, Ухуднк уж гук ох и ин що ТУ чиВ попи ДдоевВа див
Ту у М «М слі рогу се ви суті
ЕК ХМ ЛДОМуМЕМ КИМ су ТУТ ЛА М я кт Ук «ах 115 виЧшщиМмоМми шХ БУЄ С «хіх УЗ ку ум бу «дії ко луку Знати т ем ех «кі х цргУучна ВСЛІД те
Се
ААУ кита ТЕ киці ти клосирих шу і КУ
Ме БАМИ уУ КАК КУ УТ «апВо» 155 нкдрезеуеввуі хі ІМечемаожу их ту «АХ БОС «о п т зи ка ї50 «ії х ТКУ шк туя пе тт КМК лю тя сет, ха Гб ти М га сх, «же шеечна ПослідавнАсть кави?
Ех тей гуми сут со их ТА ПОВНУ МІНИ ЖМД ПУПКА ЛА Х коти яп «щінух 153
А НЯ п стеаздмславис сота ко
Ох З -ЗАКМИ АКА кох х м «ЕІ 25 клі ВНЕ жі тах «ла ПМгідлугує Тит тих 5 оихзух хай ОБУ ІННОВА КХ ких митр усі хід Іти Ух Х ха 0 ШК ОМмув ЛИТВИН МУ КУХ дю тка «ам» Кв я
ФІНАЛ ВВ МИЛИХ Й с гу З
КАСАХ Аж «ії» до «шо» ВНЕ
ЮК і ехєсздігті СЗозузем ях пошу кА жКУМБа МОслДИеНиьстЕ
Уа
ФЕМ
ХК рий пунк сті х
МОДУ шльмопукнлистив СУКИ пою тух ов чи зах дя укж у тт к - сх лю жк сід ту ВУ риф гех их ЗІ скоса всих «о кр лук «их сл НЕ ж й Є У
СУ Ба кЕААМ «о «дій Так ит тестує Ду ум й пуху гу им «Ж шжечма ІТТ «Аг» о лЕтю тю неї им (хе хека я жа ДІ УСКукнехми СЖІЕМІХ
«аро» 163 сосну савоисгсацека во
«Ві Я квіїМ го
«Від» ВЕК
«1» Шеузка Послідуанокеж
«Ве ка» слігомуклеотнд супшеєуї писпссззсти зежисуваюа я
«ла 188
«Кі» КЕ кі Шкузна Послідовність
«ДЦ»
«теї» здіромуклестсни спупресії
«4005 1535 зЗисавосс аозУчашо зо
«аевозх ії185 кЕ1ї15 73
«іш ВНЖ
«ВІ Шеечна Послідовність
«232»
«Ей Знігровухлестид супресії чИсавечаау пінних Ку
«вам ТК киїі» В
«Віз РНЕ
«сії Штучна Послідовність
«еще
-оЛаМ сліконУкНиВОтТИид супиежсії
«НН 157 зиасимссачо паса ви

Claims (30)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Конструкція рекомбінантної ДНК для спільної супресії генів ендогенної оксидази З СА20 і оксидази 5 (ЗА20, що містить транскрибовану послідовність ДНК, яка кодує некодуючу молекулу РНК, при цьому некодуюча молекула РНК містить націлюючу послідовність, яка: (а) є щонайменше на 80 95 комплементарною щонайменше 19 послідовним нуклеотидам першої молекули мРНК, що кодує перший ендогенний білок оксидази СА в рослині або клітині рослини кукурудзи, при цьому перший ендогенний білок оксидази СА є щонайменше на 80 95 ідентичним ЗЕОІЮО МО: 9, і
(р) є щонайменше на 80 95 комплементарною щонайменше 19 послідовним нуклеотидам другої молекули мРНК, що кодує другий ендогенний білок оксидази СА в рослині або клітині рослини кукурудзи, при цьому другий ендогенний білок оксидази СА є щонайменше на 80 95 ідентичним ЗБОЮ МО: 15; і при цьому вказана транскрибована послідовність ДНК функціонально зв'язана з судинним промотором.
2. Конструкція рекомбінантної ДНК за п. 1, яка відрізняється тим, що націлююча послідовність некодуючої молекули РНК містить послідовність, яка є щонайменше на 90 95 комплементарною щонайменше 19 послідовним нуклеотидам з полінуклеотидної послідовності, вибраної з групи, яка складається з БЕО ІЮ МО: 7, 8, 13 і 14.
3. Конструкція рекомбінантної ДНК за п. 1, яка відрізняється тим, що націлююча послідовність некодуючої молекули РНК містить послідовність, яка є () щонайменше на 90 95 комплементарною щонайменше 19 послідовним нуклеотидам першої молекули мРНК; і/або (ії) щонайменше на 90 96 комплементарною щонайменше 19 послідовним нуклеотидам другої молекули мРНК.
4. Конструкція рекомбінантної ДНК за п. 3, яка відрізняється тим, що націлююча послідовність молекули некодуючої РНК містить послідовність, яка є () щонайменше на 90 95 комплементарною щонайменше 19 послідовним нуклеотидам з 5ЕО ІЮО МО: 7 або 8; і/або (ії) щонайменше на 90 95 комплементарною щонайменше 19 послідовним нуклеотидам з ЗЕО ІЮ МО: 13 або 14.
5. Конструкція рекомбінантної ДНК за п. 1, яка відрізняється тим, що судинний промотор містить один з наступних: промотор сахарозосинтази, промотор транспортера сахарози, промотор ЗА1, промотор плямистого вірусу жовтої коммеліни (СОУММ - Соттвеїйна уєїІом тоНіє міги5), промотор великого міжгенного регіону (ІК - Іагде іпЇегдепіс гедіоп) гемінівірусу карликової пшениці (М/ОМ - мпеаї дулаг детіпіміги5), промотор білка оболонки (СР - соаї ргоївіп) гемівірусу смуги кукурудзи (МОМ - таїе 5ігеак детіпіміги5), рисовий промотор, подібний жовтій смузі 1 (51 - уеіІоху 5ігіре 1) або рисовий промотор жовтої смуги 2 (057751 2).
6. Конструкція рекомбінантної ДНК за п. 1, яка відрізняється тим, що некодуюча молекула РНК, що кодується транскрибованою послідовністю ДНК, являє собою попередника мікроРНК або Зо міРНК, яка процесується або розщеплюється в рослинній клітині з утворенням зрілої мікроРНК або міРНК.
7. Конструкція рекомбінантної ДНК за п. 1, яка відрізняється тим, що націлююча послідовність некодуючої молекули РНК містить послідовність, яка є () щонайменше на 90 95 комплементарною щонайменше 21 послідовному нуклеотиду першої молекули мРНК і/або (ії) щонайменше на 90 96 комплементарною щонайменше 21 послідовному нуклеотиду другої молекули мРНК.
8. Конструкція рекомбінантної ДНК за п. 1, яка відрізняється тим, що націлююча послідовність некодуючої молекули РНК містить послідовність, яка є () на 100 96 комплементарною щонайменше 21 послідовному нуклеотиду першої молекули мРНК іабо на 100 95 комплементарною щонайменше 21 послідовному нуклеотиду другої молекули мРНК.
9. Конструкція рекомбінантної ДНК за п. 1, в якій () перший ендогенний білок оксидази СА20 щонайменше на 95 95 ідентичний ЗЕО ІЮ МО: 9, і/або (ії) другий ендогенний білок оксидази СА20 щонайменше на 95 95 ідентичний ЗЕО ІЮО МО: 15.
10. Конструкція рекомбінантної ДНК за п. 1, яка відрізняється тим, що (ї) перший ендогенний білок оксидази ЗА2О0 є на 100 95 ідентичним ЗЕО ІЮО МО: 9 і/або другий ендогенний білок оксидази СА20 є на 100 95 ідентичним 5ЕО ІЮО МО: 15.
11. Конструкція рекомбінантної ДНК за п. 1, в якій судинний промотор являє собою промотор паличкоподібного вірусу рису тунгро (ЕТВМ).
12. Конструкція рекомбінантної ДНК за п. 11, яка відрізняється тим, що промотор КТВМ містить БО послідовність ДНК, яка щонайменше на 80 95 ідентична одній або декільком з 5ЕО ІЮ МО: 65 або 66 або їхній функціональній частині.
13. Молекула ДНК або вектор, що містить конструкцію рекомбінантної ДНК за будь-яким із пп. 1-
12.
14. Трансгенна рослина, частина рослини або клітина рослини кукурудзи, що містить конструкцію рекомбінантної ДНК за будь-яким із пп. 1-12.
15. Трансгенна рослина кукурудзи за п. 14, яка відрізняється тим, що трансгенна рослина кукурудзи має одну або більше з наступних ознак відносно контрольної рослини: коротшу висоту рослини, збільшений діаметр стебла, поліпшену стійкість до вилягання, зменшений злам стебла, глибше коріння, збільшену площу листка, більш ранню замкнутість полога, більш високу 60 провідність устя, нижчу висоту початка, підвищений вміст вологи в листі, підвищення стійкості до засухи, підвищення ефективності використання азоту, зниження вмісту антоціанів і площі антоціанів у листі в нормальних умовах або стресових умовах, викликаних обмеженою кількістю азоту або води, збільшення маси початка, збільшення індексу збору, збільшення врожаю, збільшення кількості зерна, збільшення маси зерна і/або збільшення плодючості.
16. Трансгенна рослина кукурудзи за п. 14, яка відрізняється тим, що висота трансгенної рослини кукурудзи є щонайменше на 10 95 нижчою, ніж у контрольної рослини дикого типу.
17. Трансгенна рослина кукурудзи за будь-яким із пп. 14 або 16, яка відрізняється тим, що діаметр стебла трансгенної рослини кукурудзи в одному або більше міжвузлях стебла є щонайменше на 5 95 більшим, ніж діаметр стебла в одному або більше міжвузлях контрольної рослини дикого типу.
18. Трансгенна рослина кукурудзи за будь-яким із пп. 14-16, яка відрізняється тим, що діаметр стебла вказаної трансгенної рослини кукурудзи в одному або більше з першого, другого, третього і/або четвертого міжвузля, розташованого нижче початка, є щонайменше на 5 95 більшим, ніж у того ж міжвузля контрольної рослини дикого типу.
19. Трансгенна рослина кукурудзи за будь-яким із пп. 14-16, яка відрізняється тим, що рівень однієї або більше активних ЗА в щонайменше одній тканині міжвузля стебла трансгенної рослини кукурудзи нижчим, ніж в тій же тканині міжвузля контрольної рослини дикого типу.
20. Трансгенна рослина кукурудзи за будь-яким із пп. 14-16, яка відрізняється тим, що рівень однієї або більше активної ЗА в щонайменше одній тканині міжвузля стебла трансгенної рослини кукурудзи є щонайменше на 5 95 нижчим, ніж у тієї ж тканини міжвузля контрольної рослини дикого типу.
21. Трансгенна злакова рослина за будь-яким із пп. 14-16, яка відрізняється тим, що трансгенна рослина кукурудзи не має будь-яких значних відхилень у щонайменше одному жіночому органі або початку.
22. Спосіб отримання трансгенної рослини кукурудзи, який включає: (а) трансформацію щонайменше однієї клітини експлантата конструкцією рекомбінантної ДНК за будь-яким із пп. 1- 12 або молекулою ДНК або вектором за п. 13, ї (5) регенерацію або розвиток трансгенної злакової рослини з трансформованого експлантата, де трансгенна рослина кукурудзи містить конструкцію рекомбінантної ДНК. Зо
23. Спосіб за п. 22, який відрізняється тим, що конструкція рекомбінантної ДНК стабільно інтегрована в геном трансгенної рослини кукурудзи.
24. Спосіб за п. 22 або 23, який відрізняється тим, що щонайменше одна клітина експлантата трансформується за допомогою опосередкованої Адгобрасієлит трансформації або бомбардування частинками.
25. Спосіб за п. 20, в якому щонайменше одна клітина експлантата трансформується шляхом сайт-спрямованої інтеграції конструкції рекомбінантної ДНК у геном щонайменше однієї клітини експлантата.
26. Спосіб за п. 25, в якому сайт-спрямована інтеграція рекомбінантної конструкції ДНК включає використання сайт-специфічної нуклеази.
27. Спосіб за п. 26, в якому сайт-специфічна нуклеаза вибрана з групи, яка складається з нуклеази з цинковими пальцями, сконструйованої мегануклеази, мегануклеази, що зустрічається в природі, ТАГЕ-ендонуклеази і РНК-спрямованої ендонуклеази.
28. Спосіб за п. 25, де сайт-спрямована інтеграція конструкції рекомбінантної ДНК включає використання РНК-спрямованої ендонуклеази і щонайменше однієї направляючої РНК.
29. Спосіб за п. 27 або 28, де РНК-спрямована ендонуклеаза вибрана з групи, яка складається з Саз59 і СриИ.
30. Спосіб за п. 27 або 28, який відрізняється тим, що РНК-спрямована нуклеаза вибрана з групи, яка складається з Са51, Са518В, Саз52, Са53, Са54, Са55, Са5зб, Са57, Са58, Са5з9, Са510, Сзу!ї, Свуг, Сву3, Свеїії, Све2, Овсі, Свс2, Сваб5, Свп2, бете2, Сб5т3, С5т4, бет5, Сетб, Стиї, СтіЗ3, Сті4, Стг5, Стгб, С5рі, Се5р2, С563, Сех17, С5х14, С5х10, Сех16, Свах, С5х3, С5х1, Се5х15, С5П, Се12, С5І3, С514, Сриї, СазХ, Сав5у, їхнього гомолога або їхньої модифікованої версії.
З Її зх не Ми ща совно се до ко є ЖД я В В В В В В ВВ щ : ЩО що Ме що я ло ще ще овен Ж а о нн нн нн нн нн нн ня жа ши шшиши ФО р у рн ну ння щ її жк ЯК Зк не КІ жк КК жк а Фо 2.080000 нн А В нн М АААА-А МЕ А А Я З з 3 З й 5 7 5 ді Номер Події Фіг
В. : | с З І ЕНН Бо ши Є : с 0. Соду Ж : ОО ОХ ЩО ЩДДр нн нн ння п с с о : о о. З протяжних КК секнктеютюют ут кн ек КВК пен Контроль Гори ОР. ЗАгОюх ФІГ 2А
-щ Д.вмьщощЬкю- ОВК ІК ОО о с ооо я з с ІІІ нс
3. п": а с М Й ан с З ОО п Б о. ВХ. с її и т не й ОВУ В ан 1 МО ГБ НН З ТО ХМК нИМ бе Ж
Фіг. 28 я ! я 30 в о пн М : ПО - : ОК У : ОО Дорн ння ння Х і МУ ОМ 55 і М М в : ОО ОМ «зелен НОЯ птннннннннннннюутяттятячуннч ня ВН пежяттятнтнннт Контрот Пбрид 50? бАгОох
Фіг. ЗА Контроль Р йАзОюХ З: ООН ДИН КК М хо В ПИМИИ и ОВК КК и У ПО 5 НН й п. ОВК Я КАК КО ОО а а КЕ ДОКИ Кн З Х с с ши КЕ в п Соя Ка СХ аю ЗО о. ОО В В Ве ово ВВ в п аа 0 НВ с а. ши ОО ВО В ОН КМО : п ПЕНЯ ЕК о коня ОВ ПО КН КВК КВК и
Фіг. ЗВ
Я ї З : ДО ко т УМ ен пуху ку В зв Ди У У У я п я З : о о Бе І ОО ОХ т Кантроях Перид З0РЯЗАТО ох
Фіг. 4 дю в о я Контроль ХЕ ш о В ; щі. 0 ою Є | . Витаання | Вкпробування 2
Фіг. 5 и с лк Мф ння ння ше жнне шшНнНшНи 0/0 НН ОО ї я ДЦ Ж і Б. М Контюль Пбрид ЗИ САгОЮх
Фіг. 6 «з 1 й дн ЕМ і -х 15 ї ОО їй - М М а бор а і о о в я о Я М ШУ с в В ! о о гео й 4 допиднняттялчтянт МОВ, снноюннннюннняхнняя дення ОО... я Кантраль Пбрид ЗИР. сАЗдОох Фіг 7 їх : Ж З ТЕКУ их во я ' о. ЕЕ с Ж ! о. ТОД, ння ння Ж ! М о | о Ве | с с щ 0.5 : ОО З
5. : с о. Контроль 0 Порид ГК 20(1БА201Ох 5ир
Фіг. 8 за В ЗВ й Конгволь во я - Транстенні Рослини о Ж Ше мя 17 КЗ шк обов оа ово к ов ово ов 0 Ух ж - с т М та її щ У м5 В Стадія
Фіг. З
UAA201902529A 2016-08-17 2017-08-17 Конструкція рекомбінантної днк для спільної супресії генів ендогенної оксидази UA126801C2 (uk)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662376298P 2016-08-17 2016-08-17
US201762442377P 2017-01-04 2017-01-04
US201762502313P 2017-05-05 2017-05-05
PCT/US2017/047405 WO2018035354A1 (en) 2016-08-17 2017-08-17 Methods and compositions for short stature plants through manipulation of gibberellin metabolism to increase harvestable yield

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA126801C2 true UA126801C2 (uk) 2023-02-08

Family

ID=61191268

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201902529A UA126801C2 (uk) 2016-08-17 2017-08-17 Конструкція рекомбінантної днк для спільної супресії генів ендогенної оксидази

Country Status (15)

Country Link
US (5) US10724047B2 (uk)
EP (1) EP3500666A4 (uk)
JP (3) JP2019524147A (uk)
KR (2) KR102607893B1 (uk)
CN (5) CN117604024A (uk)
BR (1) BR112019003114A2 (uk)
CA (1) CA3033373A1 (uk)
CL (3) CL2019000421A1 (uk)
CO (1) CO2019002363A2 (uk)
CR (1) CR20190130A (uk)
MX (9) MX2019001956A (uk)
PH (1) PH12019500341A1 (uk)
UA (1) UA126801C2 (uk)
UY (1) UY37369A (uk)
WO (1) WO2018035354A1 (uk)

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111954463A (zh) 2018-02-15 2020-11-17 孟山都技术公司 用于杂交玉米种子生产的改进方法
WO2019161145A2 (en) 2018-02-15 2019-08-22 Monsanto Technology Llc Improved management of corn through semi-dwarf systems
WO2019161146A1 (en) * 2018-02-15 2019-08-22 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for improving crop yields through trait stacking
MX2020008562A (es) * 2018-02-15 2020-09-25 Monsanto Technology Llc Metodos y composiciones para aumentar el rendimiento cosechable mediante edicion de genes de ga20-oxidasa para generar plantas de poca altura.
US11275941B2 (en) 2018-03-08 2022-03-15 Regents Of The University Of Minnesota Crop models and biometrics
CN109338001B (zh) * 2018-11-01 2021-05-14 浙江省农业科学院 一种鉴定水稻半矮秆基因sd1等位基因的分子标记及矮源基因鉴定方法
WO2020117831A1 (en) * 2018-12-04 2020-06-11 Monsanto Technology Llc Delayed harvest of short stature corn plants
CN110128518A (zh) * 2019-05-06 2019-08-16 中国农业科学院作物科学研究所 利用基因编辑技术创制玉米矮化材料的方法
US20220195450A1 (en) * 2019-05-29 2022-06-23 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for generating dominant short stature alleles using genome editing
WO2020243361A1 (en) * 2019-05-29 2020-12-03 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for generating dominant short stature alleles using genome editing
MX2022000715A (es) * 2019-07-18 2022-02-23 Monsanto Technology Llc Regiones de secuencia intergenica novedosas y usos de estas.
UY38833A (es) * 2019-08-14 2021-02-26 Monsanto Technology Llc Composiciones y métodos para mejorar los rendimientos de cultivos mediante el apilamiento de rasgos
WO2021030539A1 (en) * 2019-08-14 2021-02-18 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for improving crop yields through trait stacking
JP2021061824A (ja) * 2019-10-10 2021-04-22 株式会社カネカ コムギのゲノム編集方法、及びその利用
CN110950942B (zh) * 2019-12-11 2020-12-08 广东省农业科学院蔬菜研究所 与丝瓜蔓长相关的基因及其应用
CN111778265B (zh) * 2020-07-14 2022-06-21 吉林省农业科学院 玉米赤霉素氧化酶的突变基因、突变体、表达载体和应用
CN112062823B (zh) * 2020-09-22 2022-05-17 中国农业大学 Glk7蛋白及其编码基因在植物抗旱中的应用
CN112626113B (zh) * 2020-12-22 2022-06-24 吉林省农业科学院 一种利用基因编辑技术创制玉米矮化材料的方法
CN112899292B (zh) * 2021-02-05 2022-10-25 浙江农林大学 陆地棉株高调控基因GhGA20ox6及其用途
WO2023164456A2 (en) * 2022-02-22 2023-08-31 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for short stature plants through manipulation of gibberellin metabolism to increase harvestable yield

Family Cites Families (77)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5352605A (en) 1983-01-17 1994-10-04 Monsanto Company Chimeric genes for transforming plant cells using viral promoters
US5188958A (en) 1986-05-29 1993-02-23 Calgene, Inc. Transformation and foreign gene expression in brassica species
US5750871A (en) 1986-05-29 1998-05-12 Calgene, Inc. Transformation and foreign gene expression in Brassica species
US5004863B2 (en) 1986-12-03 2000-10-17 Agracetus Genetic engineering of cotton plants and lines
US5322938A (en) 1987-01-13 1994-06-21 Monsanto Company DNA sequence for enhancing the efficiency of transcription
ATE112314T1 (de) 1988-05-17 1994-10-15 Lubrizol Genetics Inc Pflanzliches ubiquitinpromotorsystem.
US5416011A (en) 1988-07-22 1995-05-16 Monsanto Company Method for soybean transformation and regeneration
US5550318A (en) 1990-04-17 1996-08-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US7705215B1 (en) 1990-04-17 2010-04-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US5641876A (en) 1990-01-05 1997-06-24 Cornell Research Foundation, Inc. Rice actin gene and promoter
US5484956A (en) 1990-01-22 1996-01-16 Dekalb Genetics Corporation Fertile transgenic Zea mays plant comprising heterologous DNA encoding Bacillus thuringiensis endotoxin
JP3209744B2 (ja) 1990-01-22 2001-09-17 デカルブ・ジェネティクス・コーポレーション 結実能力のある遺伝子変換コーン
EP0604662B1 (en) 1992-07-07 2008-06-18 Japan Tobacco Inc. Method of transforming monocotyledon
GB9311147D0 (en) 1993-05-28 1993-07-14 Long Ashton Research Station Regulation of plant growth
US5631152A (en) 1994-10-26 1997-05-20 Monsanto Company Rapid and efficient regeneration of transgenic plants
US5850019A (en) 1996-08-06 1998-12-15 University Of Kentucky Research Foundation Promoter (FLt) for the full-length transcript of peanut chlorotic streak caulimovirus (PCLSV) and expression of chimeric genes in plants
US6372211B1 (en) 1997-04-21 2002-04-16 Monsanto Technolgy Llc Methods and compositions for controlling insects
GB9717192D0 (en) 1997-08-13 1997-10-22 Innes John Centre Innov Ltd Genetic control of plant growth and development
US20040121321A1 (en) 1997-11-24 2004-06-24 Brown Sherri M. Nucleic acid molecules and other molecules associated with the gibberellin pathway
US20080034453A1 (en) 1999-05-06 2008-02-07 Nordine Cheikh Annotated Plant Genes
US20060253933A1 (en) 1998-02-10 2006-11-09 Brown Sherri M Nucleic acid molecules and other molecules associated with the gibberellin pathway
ATE303440T1 (de) 1998-06-12 2005-09-15 Rothamsted Res Ltd Enzym
AR032578A1 (es) 1998-08-10 2003-11-19 Monsanto Technology Llc Metodos para controlar los niveles de giberelina
BRPI0007815B1 (pt) 1999-01-14 2016-04-19 Monsanto Technology Llc processo de transformação da soja
US20110214206A1 (en) 1999-05-06 2011-09-01 La Rosa Thomas J Nucleic acid molecules and other molecules associated with plants
US20110185456A1 (en) 1999-05-06 2011-07-28 Nordine Cheikh Annotatd plant genes
US10329575B2 (en) 1999-05-14 2019-06-25 Ceres, Inc. Regulatory sequence for plants
US6429357B1 (en) 1999-05-14 2002-08-06 Dekalb Genetics Corp. Rice actin 2 promoter and intron and methods for use thereof
US6420547B1 (en) 1999-06-03 2002-07-16 University Of Kentucky Research Foundation Use of the full length transcript (FLt) from mirabilis mosaic caulimovirus to express chimeric genes in plants
EP1254958A4 (en) 1999-12-20 2004-06-30 Nat Inst Of Agrobio Sciences GENES FROM RICE ENCODING GIBBERELLIN 3 beta-HYDROXYLASE, AND THEIR USE
JP3829157B2 (ja) * 1999-12-24 2006-10-04 独立行政法人農業生物資源研究所 イネ由来のジベレリン２β水酸化酵素遺伝子およびその利用
WO2002055725A2 (en) 2000-11-14 2002-07-18 Phibro-Tech, Inc., Doing Business As Agtrol International Novel nucleic acids, methods and transformed cells for the modulation of gibberellin production
JP2003000260A (ja) * 2001-06-19 2003-01-07 Honda Motor Co Ltd 植物の半矮性化に関与するｓｄ１遺伝子、並びにその利用
AU2002341541A1 (en) 2001-06-22 2003-03-03 Syngenta Participations Ag Abiotic stress responsive polynucleotides and polypeptides
DK1504126T3 (da) 2002-05-03 2014-06-10 Univ Duke Fremgangsmåde til regulering af genekspression
US6921849B2 (en) 2002-05-23 2005-07-26 Wisconsin Alumni Research Foundation Dwarfism genes and dwarf plants
ATE522130T1 (de) 2002-07-19 2011-09-15 Univ South Carolina Zusammensetzungen und verfahren zur modulation der genexpression in pflanzen
JP3783777B2 (ja) 2002-09-20 2006-06-07 独立行政法人農業生物資源研究所 新たな機能を持つジベレリン２−酸化酵素遺伝子およびその利用
ES2712695T3 (es) 2003-06-02 2019-05-14 Univ Massachusetts Métodos y composiciones para controlar la eficacia de la silenciación del ARN
US20050144669A1 (en) 2003-07-01 2005-06-30 Whitehead Institute For Biomedical Research MicroRNAs in plants
US7888121B2 (en) 2003-08-08 2011-02-15 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
US8207091B2 (en) 2004-03-02 2012-06-26 Stoller Enterprises, Inc. Methods for improving growth and crop productivity of plants by adjusting plant hormone levels, ratios and/or co-factors
GB0421241D0 (en) 2004-09-23 2004-10-27 Rothamsted Res Ltd Transgenic plants
US20060200878A1 (en) 2004-12-21 2006-09-07 Linda Lutfiyya Recombinant DNA constructs and methods for controlling gene expression
JP5109128B2 (ja) 2005-04-14 2012-12-26 国立大学法人名古屋大学 植物の分化・生長を制御する遺伝子、並びにその利用
WO2007126850A2 (en) 2006-03-28 2007-11-08 Syngenta Participations Ag Photoperiodic control of floret differentiation and yield in plants
EP2090662A3 (en) 2006-04-05 2012-10-31 Metanomics GmbH Process for the production of a fine chemical
AU2007252854A1 (en) * 2006-05-23 2007-11-29 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Compositions for silencing the expression of gibberellin 2-oxidase and uses thereof
US8404928B2 (en) 2006-08-31 2013-03-26 Monsanto Technology Llc Phased small RNAs
EP3378953A1 (en) 2006-10-12 2018-09-26 Monsanto Technology LLC Plant micrornas and methods of use thereof
CL2008001832A1 (es) 2007-06-20 2009-03-06 Valent Biosciences Corp Composicion que comprende giberelina 4/7 o acido giberelico y benciladenina en proporcion en peso entre 20:1 a 2:1, y que es util para acelerar la germinacion de plantas; metodo para acelerar la germinacion de plantas o para aumentar el rendimiento del cultivo, empleando dicha composicion.
EP2380988A3 (en) 2007-07-10 2012-04-11 Mosanto Technology LLC Transgenic plants with enhanced agronomic traits
CA2703045C (en) 2007-10-25 2017-02-14 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted integration
US8034992B2 (en) 2008-06-16 2011-10-11 Academia Sinica Gibberellin 2-oxidase genes and uses thereof
US8426677B2 (en) 2008-06-16 2013-04-23 Academia Sinica Method of controlling plant growth and architecture by controlling expression of gibberellin 2-oxidase
ES2563485T3 (es) 2008-07-01 2016-03-15 Monsanto Technology Llc Construcciones de ADN recombinante y procedimientos para modular la expresión de un gen diana
US8586526B2 (en) 2010-05-17 2013-11-19 Sangamo Biosciences, Inc. DNA-binding proteins and uses thereof
CA2771252C (en) 2009-08-31 2019-03-12 Basf Plant Science Company Gmbh Regulatory nucleic acid molecules for enhancing constitutive gene expression in plants
CN106834320B (zh) 2009-12-10 2021-05-25 明尼苏达大学董事会 Tal效应子介导的dna修饰
MX2012007855A (es) 2010-01-06 2013-06-05 Du Pont Identificacion de ritmos diurnos en tejidos fotosinteticos del zea mays y uso en el mejoramiento de plantas de cultivo.
EP4328304A2 (en) 2010-02-08 2024-02-28 Sangamo Therapeutics, Inc. Engineered cleavage half-domains
CA2823367A1 (en) 2010-12-30 2012-07-05 Dow Agrosciences Llc Nucleic acid molecules that target the rho1 small gtp-binding protein and confer resistance to coleopteran pests
CN102174519B (zh) 2011-02-25 2012-11-21 中国农业科学院作物科学研究所 一种矮败水稻培育方法及其所用到的dna
SG10201602651YA (en) 2011-04-05 2016-05-30 Cellectis Method for the generation of compact tale-nucleases and uses thereof
CN110452908A (zh) 2011-04-20 2019-11-15 德福根有限公司 在昆虫害虫中下调基因表达
GB201116129D0 (en) 2011-09-19 2011-11-02 Vib Vzw Methods and means to produce abiotic stress tolerant plants
BR112014013853A2 (pt) 2011-12-09 2020-01-14 Ceres Inc uso de um ácido nucleico isolado, método de obtenção de uma célula vegetal transgênica, método de obtenção de uma planta transgênica, método de produção de uma planta, método de produção de biomassa, método de processamento de biomassa, método de alteração da composição de biomassa, método de modulação de composição de biomassa, método de produção de um produto de forragem
WO2013148201A1 (en) * 2012-03-27 2013-10-03 J.R. Simplot Company Increased tuber set in potato
CA2887143A1 (en) 2012-10-03 2014-04-10 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Genes controlling photoperiod sensitivity in maize and sorghum and uses thereof
TWI595092B (zh) 2012-11-28 2017-08-11 中央研究院 突變型吉貝素２-氧化酶基因及其用途
BR122020005657B1 (pt) 2012-12-26 2022-04-05 Evogene Ltd Método para aumentar a eficiência do uso de nitrogênio, rendimento, taxa de crescimento, biomassa, vigor, rendimento de sementes, capacidade fotossintética e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta, e, construção de ácido nucleico
US20160010109A1 (en) * 2013-03-14 2016-01-14 Pioneer Hi Bred International, Inc Enhanced adaptation of corn
US20160017349A1 (en) * 2013-03-15 2016-01-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize microrna sequences and targets thereof for agronomic traits
KR20150045611A (ko) 2013-10-21 2015-04-29 동아대학교 산학협력단 식물의 지베렐린 메커니즘에 관련된 OsGASD 유전자 및 이의 용도
WO2015168124A1 (en) * 2014-04-28 2015-11-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for controlling plant growth and development
WO2015167956A1 (en) * 2014-04-28 2015-11-05 Dow Agrosciences Llc Haploid maize transformation
US20160050920A1 (en) 2014-08-20 2016-02-25 Valent Biosciences Corporation Methods to improve nodal roots

Also Published As

Publication number Publication date
MX2019001956A (es) 2019-09-04
CN117604023A (zh) 2024-02-27
CN109844107B (zh) 2024-05-28
CN117604022A (zh) 2024-02-27
US11414670B2 (en) 2022-08-16
RU2019105536A (ru) 2020-09-18
MX2022010056A (es) 2022-08-25
JP2019524147A (ja) 2019-09-05
UY37369A (es) 2018-03-23
US20180051295A1 (en) 2018-02-22
CO2019002363A2 (es) 2019-05-31
US20200248199A1 (en) 2020-08-06
JP2022121524A (ja) 2022-08-19
KR20190113740A (ko) 2019-10-08
CA3033373A1 (en) 2018-02-22
MX2022006660A (es) 2022-07-05
US11319550B2 (en) 2022-05-03
CN109844107A (zh) 2019-06-04
MX2022006661A (es) 2022-07-19
MX2022010057A (es) 2022-08-25
US10724047B2 (en) 2020-07-28
MX2022010091A (es) 2022-09-02
EP3500666A1 (en) 2019-06-26
MX2022006657A (es) 2022-07-05
CL2019000421A1 (es) 2019-04-22
US20230110884A1 (en) 2023-04-13
US20200248200A1 (en) 2020-08-06
EP3500666A4 (en) 2020-04-08
CN117604021A (zh) 2024-02-27
CL2022002359A1 (es) 2023-03-31
RU2019105536A3 (uk) 2021-06-25
JP7416862B2 (ja) 2024-01-17
CR20190130A (es) 2019-05-07
PH12019500341A1 (en) 2020-01-20
KR102607893B1 (ko) 2023-12-01
MX2022006659A (es) 2022-07-05
CL2020002242A1 (es) 2021-02-26
CN117604024A (zh) 2024-02-27
BR112019003114A2 (pt) 2019-07-09
KR20230164771A (ko) 2023-12-04
MX2022006658A (es) 2022-07-05
WO2018035354A1 (en) 2018-02-22
US20220364108A1 (en) 2022-11-17
JP2024019715A (ja) 2024-02-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA126801C2 (uk) Конструкція рекомбінантної днк для спільної супресії генів ендогенної оксидази
UA124293C2 (uk) Рослина, яка має біологічну активність гаплоїдного індуктора, і спосіб її застосування
DeYoung et al. The CLAVATA1‐related BAM1, BAM2 and BAM3 receptor kinase‐like proteins are required for meristem function in Arabidopsis
UA119135C2 (uk) Спосіб отримання трансгенної рослини
UA125846C2 (uk) Мутант ahas
UA126472C2 (uk) Композиція та спосіб для зміни цвітіння та архітектури рослин для поліпшення потенційної врожайності
UA121093C2 (uk) Конструкція, яка містить токсиген, що кодує пестицидний білок, і спосіб її застосування для знищення напівтвердокрилих шкідників
Gomariz-Fernández et al. The role of SHI/STY/SRS genes in organ growth and carpel development is conserved in the distant eudicot species Arabidopsis thaliana and Nicotiana benthamiana
UA125478C2 (uk) Трансгенна рослина тютюну
UA126807C2 (uk) Інсектицидний білок і спосіб його застосування
CN111826392B (zh) 水稻基因ljs5-2及其同源基因在控制水稻叶枕发育和叶夹角大小中的应用
CN109628464A (zh) 一种增加大豆产量的方法
Kirbis et al. Transcriptional landscapes of divergent sporophyte development in two mosses, Physcomitrium (Physcomitrella) patens and Funaria hygrometrica
CN107974457A (zh) 果实大小增大的植物
JP2000300098A (ja) Ｃｕｃｕｍｉｓｍｅｌｏ（マスクメロン）種に属する遺伝子導入植物
UA127388C2 (uk) Регуляторний елемент рослини і спосіб його застосування
UA125959C2 (uk) Ген стійкості до хвороб рослин
CN113365494B (zh) 能够发生种子败育型的果实形成的茄子科植物
CN111793635B (zh) 水稻基因ljs5-1在控制水稻叶枕发育和叶夹角大小中的应用
UA126966C2 (uk) Інсектицидний поліпептид, що характеризується поліпшеним спектром активності, та його застосування
Escalant et al. The genetic improvement of Musa using conventional breeding, and modern tools of molecular and cellular biology
AU2020360701A1 (en) Begomovirus resistance related genes
CN111909939B (zh) 水稻基因ljs4-2在控制水稻叶枕发育和叶夹角大小中的应用
CN111909940B (zh) 水稻基因ljs4-1在控制水稻叶枕发育和叶夹角大小中的应用
CN111996196B (zh) 水稻基因ljs1-1及其同源基因在控制水稻叶枕发育和叶夹角大小中的应用