KR20230164771A - 지베렐린 대사의 조작을 통한 단간 식물의 수확가능한 수확량을 증가시키기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

지베렐린 대사의 조작을 통한 단간 식물의 수확가능한 수확량을 증가시키기 위한 방법 및 조성물 Download PDF

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에드워드 엠. 앨런
제야난드 보두
찰스 알. 디에트리치
알렉산더 골드슈미스
미야 하우웰
케빈 알. 코솔라
시밸링가나 만주나스
아닐 닐람
린다 뤼마르퀴스
토마스 엘. 슬레윈스키
야마곤들루 브이. 벤카테쉬
후웨이 왕
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몬산토 테크놀로지 엘엘씨
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Abstract

본 개시내용은 옥수수 또는 다른 곡물 식물에서 지베렐린 (GA) 함량의 변경을 위한 조성물 및 방법을 제공한다. GA20 또는 GA3 옥시다제 유전자의 특정 하위유형의 억제, 돌연변이유발 및/또는 편집을 통해 지베렐린 생합성에 관련된 유전자의 발현 변경 방법 및 조성물이 또한 제공된다. 억제 요소를 갖는 변형된 식물 세포 및 식물 또는 GA 옥시다제 유전자의 발현 또는 활성을 감소시키는 돌연변이는 감소된 지베렐린 수준 및 향상된 특징, 예컨대 감소된 식물 높이 및 증가된 도복 저항성을 포함하지만, 오프-유형 없이 추가로 제공된다.

Description

지베렐린 대사의 조작을 통한 단간 식물의 수확가능한 수확량을 증가시키기 위한 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR SHORT STATURE PLANTS THROUGH MANIPULATION OF GIBBERELLIN METABOLISM TO INCREASE HARVESTABLE YIELD}
관련 출원에 대한 교차 참조
본원은 2016년 8월 17일 출원된 미국 가출원 번호 62/376,298, 2017년 1월 4일 출원된 미국 가출원 번호 62/442,377, 그리고 2017년 5월 5일 출원된 미국 가출원 번호 62/502,313에 우선권을 주장한다. 각각의 이들 미국 가출원은 그 전체가 본 명세서에서 참고로 편입된다.
서열목록의 편입
(MS-Windows®에서 측정된) 293,398 바이트이고 2017년 8월 17일 창작된 "P34494WO00_SEQ.txt" 명칭의 파일에 함유된 서열목록은 이와 함께 전자적으로 제출되고 그 전체가 참고로 편입된다.
배경
분야
본 개시내용은, 옥수수를 포함하는 곡물 식물 또는 외떡잎식물에서, 특성, 예컨대 도복 저항성 및 증가된 수확량 개선용 조성물 및 방법에 관한 것이다.
관련 기술
지베렐린 (지베렐린산 또는 GAs)는 수많은 주요 식물 성장 및 발달성 과정을 조절하는 식물 호르몬이다. 반왜성 밀, 쌀 및 수수 식물 품종에서 GA 수준의 조작은 20th 세기 동안 이들 곡물 수확물에서 증가된 수확량 및 감소된 도복으로 이어졌고, 이것은 녹색 혁명의 주범이었다. 그러나, 다른 곡물 수확물, 예컨대 옥수수에서 성공적인 수확량 이득은 GA 경로의 조작을 통해 실현되지 않고 있다. 사실상, GA 경로 유전자에서 일부 돌연변이는 수확량과 양립불가능한 옥수수에서 다양한 오프-유형과 관련되어 왔고, 이것은 연구자가 GA 경로의 조작을 통해 반왜성, 고수율 옥수수 품종의 발견을 못하게 하고 있다.
증가된 수확량 및/또는 도복에 대한 저항을 갖는, 외떡잎식물 또는 곡물 농작물, 예컨대 옥수수의 개발에 대한 필요성이 당업계에서 계속된다.
요약
제1 양태에서, 본 개시내용은 비-코딩 RNA 분자를 인코딩하는 전사가능한 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 작제물을 제공하고, 여기서 상기 비-코딩 RNA 분자는 외떡잎식물 또는 곡물 식물 또는 식물 세포에서 내인성 GA 옥시다제 단백질을 인코딩하는 mRNA 분자의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인 서열을 포함하고, 상기 내인성 GA 옥시다제 단백질은 서열번호: 9, 12, 15, 30 또는 33에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고, 여기서 상기 전사가능한 DNA 서열은 식물-발현성 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
제2 양태에서, 본 개시내용은 비-코딩 RNA 분자를 인코딩하는 전사가능한 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 작제물을 제공하고, 여기서 상기 비-코딩 RNA 분자는 외떡잎식물 또는 곡물 식물 또는 식물 세포에서 내인성 GA20 옥시다제 단백질을 인코딩하는 mRNA 분자의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인 서열을 포함하고, 상기 내인성 GA20 옥시다제 단백질은 서열번호: 9에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고, 여기서 상기 전사가능한 DNA 서열은 식물-발현성 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
제3 양태에서, 본 개시내용은 비-코딩 RNA 분자를 인코딩하는 전사가능한 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 작제물을 제공하고, 여기서 상기 비-코딩 RNA 분자는 외떡잎식물 또는 곡물 식물 또는 식물 세포에서 내인성 GA20 옥시다제 단백질을 인코딩하는 mRNA 분자의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인 서열을 포함하고, 상기 내인성 GA20 옥시다제 단백질은 서열번호: 15에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고, 여기서 상기 전사가능한 DNA 서열은 식물-발현성 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
제4 양태에서, 본 개시내용은 비-코딩 RNA 분자를 인코딩하는 전사가능한 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 작제물을 제공하고, 여기서 상기 비-코딩 RNA 분자는 외떡잎식물 또는 곡물 식물 또는 식물 세포에서 내인성 GA3 옥시다제 단백질을 인코딩하는 mRNA 분자의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인 서열을 포함하고, 상기 내인성 GA3 옥시다제 단백질은 서열번호: 30 또는 33에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고, 여기서 상기 전사가능한 DNA 서열은 식물-발현성 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
제5 양태에서, 본 개시내용은 비-코딩 RNA 분자를 인코딩하는 전사가능한 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 작제물을 제공하고, 여기서 상기 비-코딩 RNA 분자는 외떡잎식물 또는 곡물 식물 또는 식물 세포에서 내인성 GA20 옥시다제 단백질을 인코딩하는 mRNA 분자의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인 서열을 포함하고, 상기 내인성 GA20 옥시다제 단백질은 서열번호: 12에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고, 여기서 상기 전사가능한 DNA 서열은 식물-발현성 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
제6 양태에서, 본 개시내용은 비-코딩 RNA 분자를 인코딩하는 전사가능한 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 작제물을 제공하고, 여기서 상기 비-코딩 RNA 분자는 외떡잎식물 또는 곡물 식물 또는 식물 세포에서 내인성 단백질을 인코딩하는 mRNA 분자의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인 서열을 포함하고, 상기 내인성 단백질은 서열번호: 86, 90, 94, 97, 101, 104, 108, 112, 116, 118, 121, 125, 129, 133, 또는 136에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고, 여기서 상기 전사가능한 DNA 서열은 식물-발현성 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 추가 양태에서, 본 개시내용은 본 명세서에서 개시된 재조합 DNA 작제물을 포함하는 형질전환 벡터를 또한 제공한다. 추가 양태에서, 본 개시내용은 여기에서 개시된 재조합 DNA 작제물을 포함하는 이식유전자성 외떡잎식물 또는 곡물 식물, 식물 일부 또는 식물 세포를 또한 제공한다. 일 양태에서, 이식유전자성 옥수수 식물, 식물 일부 또는 식물 세포가 제공된다. 또 다른 양태에서, 하기 단계를 포함하는, 이식유전자성 곡물 식물의 생산 방법이 제공된다: (a) 외식편의 적어도 하나의 세포를 본 명세서에서 개시된 재조합 DNA 작제물로 형질전환시키는 단계, 및 (b) 형질전환된 외식편으로부터 이식유전자성 곡물 식물을 재생 또는 발생시키는 단계. 또 다른 양태에서, 곡물 식물은 아그로박테리움 매개된 형질전환 또는 입자 폭격을 통해 형질전환된다.
제7 양태에서, 본 개시내용은 하기 단계를 포함하는 옥수수 또는 곡물 식물의 줄기 또는 자루에서 적어도 하나의 활성 GA 분자의 수준의 저하 방법을 제공한다: 이식유전자성 곡물 또는 옥수수 식물의 하나 이상의 조직에서 재조합 DNA 작제물로 하나 이상의 GA3 옥시다제 또는 GA20 옥시다제 유전자를 억제시키는 단계.
제8 양태에서, 본 개시내용은 재조합 DNA 작제물을 포함하는 이식유전자성 옥수수 또는 곡물 식물을 제공하고, 여기서 상기 재조합 DNA 작제물은 억제를 위하여 적어도 하나의 내인성 GA20 또는 GA3 옥시다제 유전자를 표적화하는 비-코딩 RNA 분자를 인코딩하는 전사가능한 DNA 서열을 포함하고, 상기 전사가능한 DNA 서열은 식물-발현성 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 여기서 상기 이식유전자성 외떡잎식물 또는 곡물 식물은 야생형 대조군 식물에 비하여 더 짧은 식물 높이를 갖는다.
제9 양태에서, 본 개시내용은 돌연변이유발 기술에 의해 도입된 내인성 GA 옥시다제 유전자에서 또는 근처에서 돌연변이를 포함하는 곡물 식물을 제공하고, 여기서 상기 내인성 GA 옥시다제 유전자의 발현 수준은 곡물 식물에서 감소 또는 제거되고, 여기서 상기 곡물 식물은 야생형 대조군 식물에 비하여 더 짧은 식물 높이를 갖는다.
제10 양태에서, 본 개시내용은 내인성 GA 옥시다제 유전자의 유전자좌에서 또는 근처에서 표적화된 게놈 편집 기술을 통해 도입된 게놈 편집을 포함하는 옥수수 또는 곡물 식물을 제공하고, 여기서 상기 내인성 GA 옥시다제 유전자의 발현 수준은 대조군 식물에 비하여 감소 또는 제거되고, 여기서 상기 편집된 곡물 식물은 대조군 식물에 비하여 더 짧은 식물 높이를 갖는다.
제11 양태에서, 본 개시내용은 가이드 RNA를 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 상기 가이드 RNA는 곡물 식물의 내인성 GA 옥시다제 유전자의 유전자 좌위에서 또는 근처에서 표적 DNA 서열의 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 또는 적어도 25 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 또는 상보적인 가이드 서열을 포함한다. 일 양태에서, 조성물은 RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 추가로 포함한다.
제12 양태에서, 본 개시내용은 비-코딩 가이드 RNA 분자를 인코딩하는 전사가능한 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 작제물을 제공하고, 여기서 상기 가이드 RNA 분자는 옥수수 또는 곡물 식물의 내인성 GA 옥시다제 유전자의 유전자 좌위에서 또는 근처에서 표적 DNA 서열의 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 또는 적어도 25 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 상보적인 가이드 서열을 포함한다.
제13 양태에서, 본 개시내용은 적어도 하나의 상동성 서열을 포함하는 재조합 DNA 공여체 템플레이트를 제공하고, 여기서 상기 적어도 하나의 상동성 서열은 표적 DNA 서열의 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 500, 적어도 1000, 적어도 2500, 또는 적어도 5000 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 상보적이고, 여기서 상기 표적 DNA 서열은 옥수수 또는 곡물 식물의 내인성 GA 옥시다제 유전자의 유전자 좌위에서 또는 근처에서 유전자 서열이다.
제14 양태에서, 본 개시내용은 제1 상동성 아암 및 제2 상동성 아암을 포함하는 2개의 상동성 아암을 포함하는 재조합 DNA 공여체 템플레이트를 제공하고, 여기서 상기 제1 상동성 아암은 제1 측접하는 DNA 서열의 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 500, 적어도 1000, 적어도 2500, 또는 적어도 5000 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 상보적인 서열을 포함하고, 여기서 상기 제2 상동성 아암은 제2 측접하는 DNA 서열의 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 500, 적어도 1000, 적어도 2500, 또는 적어도 5000 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 상보적인 서열을 포함하고, 그리고 여기서 상기 제1 측접하는 DNA 서열 및 상기 제2 측접하는 DNA 서열은 옥수수 또는 곡물 식물의 내인성 GA 옥시다제 유전자의 유전자 좌위에서 또는 근처에서 유전자 서열이다. 일 양태에서, 여기에서 개시된 재조합 DNA 공여체 템플레이트를 포함하는 DNA 분자 또는 벡터가 추가로 제공된다. 또 다른 양태에서, 여기에서 개시된 재조합 DNA 공여체 템플레이트를 포함하는 박테리아 또는 숙주세포가 추가로 제공된다. 또 다른 양태에서, 여기에서 개시된 재조합 DNA 작제물을 포함하는 옥수수 또는 곡물 식물, 식물 일부 또는 식물 세포가 추가로 제공된다.
제15 양태에서, 본 개시내용은 옥수수 또는 곡물 식물의 내인성 GA 옥시다제 유전자의 유전자 좌위에서 또는 근처에서 표적 부위에 결합하고 상기 표적 부위에서 이중-가닥 절단 또는 닉을 야기시키는 조작된 부위-특이적 뉴클레아제를 제공한다.
제16 양태에서, 본 개시내용은 부위-특이적 뉴클레아제를 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 재조합 DNA 작제물을 제공하고, 여기서 상기 부위-특이적 뉴클레아제는 외떡잎식물 또는 곡물 식물의 내인성 GA 옥시다제 유전자의 유전자 좌위에서 또는 근처에서 표적 부위에 결합하고 상기 표적 부위에서 이중-가닥 절단 또는 닉을 야기시킨다.
제17 양태에서, 본 개시내용은, 하기 단계를 포함하는, 이식유전자성 옥수수 또는 곡물 식물의 생산 방법을 제공한다: (a) 외식편의 적어도 하나의 세포를 여기에서 개시된 재조합 DNA 공여체 템플레이트로 형질전환시키는 단계, 및 (b) 상기 형질전환된 외식편으로부터 상기 이식유전자성 옥수수 또는 곡물 식물을 재생 또는 발생시키는 단계, 여기서 상기 이식유전자성 옥수수 또는 곡물 식물은 재조합 DNA 공여체 템플레이트의 삽입 서열을 포함함.
제18 양태에서, 본 개시내용은, 하기 단계를 포함하는, 내인성 GA 옥시다제 유전자에서 또는 근처에서 게놈 편집을 갖는 옥수수 또는 곡물 식물의 생산 방법을 제공한다: (a) 부위-특이적 뉴클레아제 또는 상기 부위-특이적 뉴클레아제를 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 재조합 DNA 분자를 상기 옥수수 또는 곡물 식물의 외식편의 적어도 하나의 세포에 도입하는 단계, 여기서 상기 부위-특이적 뉴클레아제는 내인성 GA 옥시다제 유전자의 유전자 좌위에서 또는 근처에서 표적 부위에 결합하고 상기 표적 부위에서 이중-가닥 절단 또는 닉을 야기시킴, 및 (b) 상기 편집된 외떡잎식물 또는 곡물 식물의 내인성 GA 옥시다제 유전자에서 또는 근처에서 게놈 편집을 포함하는 적어도 하나의 외식편 세포로부터 편집된 옥수수 또는 곡물 식물을 재생 또는 발생시키는 단계.
제19 양태에서, 본 개시내용은 2000 mm 미만, 1950 mm 미만, 1900 mm 미만, 1850 mm 미만, 1800 mm 미만, 1750 mm 미만, 1700 mm 미만, 1650 mm 미만, 1600 mm 미만, 1550 mm 미만, 1500 mm 미만, 1450 mm 미만, 1400 mm 미만, 1350 mm 미만, 1300 mm 미만, 1250 mm 미만, 1200 mm 미만, 1150 mm 미만, 1100 mm 미만, 1050 mm 미만, 또는 1000 mm 미만의 식물 높이, 그리고 (i) 18 mm 초과, 18.5 mm 초과, 19 mm 초과, 19.5 mm 초과, 20 mm 초과, 20.5 mm 초과, 21 mm 초과, 21.5 mm 초과, 또는 22 mm 초과의 평균 줄기 또는 자루 직경, (ii) 야생형 대조군 식물에 비하여 향상된 도복 저항성, 또는 (iii) 야생형 대조군 식물에 비하여 향상된 가뭄 내성 중 하나 이상을 갖는 변형된 옥수수 식물을 제공한다.
제20 양태에서, 본 개시내용은 야생형 대조군 식물에 비하여 감소된 식물 높이, 그리고 (i) 야생형 대조군 식물에 비하여 증가된 줄기 또는 자루 직경, (ii) 야생형 대조군 식물에 비하여 향상된 도복 저항성, 또는 (iii) 야생형 대조군 식물에 비하여 향상된 가뭄 내성을 갖는 변형된 곡물 식물을 제공한다.
도 1은 근친교배 대조군 식물에 비교하여 8 형질전환 사건을 거쳐 GA20 옥시다제 억제 작제물을 발현시키는 옥수수 근친교배 식물의 감소된 식물 높이를 도시하고;
도 2A는 하이브리드 대조군 식물에 비교하여 GA20 옥시다제 억제 작제물을 발현시키는 하이브리드 옥수수 식물의 평균적으로 감소된 식물 높이를 도시하고;
도 2B는 감소된 식물 높이를 갖는 GA20 옥시다제 억제 작제물 (우측)을 발현시키는 하이브리드 옥수수 식물 옆에서 야생형 하이브리드 대조군 식물 (좌측)의 이미지를 도시하고;
도 3A는 하이브리드 대조군 식물에 비교하여 GA20 옥시다제 억제 작제물을 발현시키는 하이브리드 옥수수 식물의 평균적으로 증가된 줄기 직경을 도시하고;
도 3B는 증가된 줄기 직경을 갖는 GA20 옥시다제 억제 작제물 (우측)을 발현시키는 하이브리드 옥수수 식물의 자루의 단면 옆에서 야생형 하이브리드 대조군 식물 (좌측)의 자루의 단면의 이미지를 도시하고;
도 4는 하이브리드 대조군 식물에 비교하여 GA20 옥시다제 억제 작제물을 발현시키는 하이브리드 옥수수 식물의 평균적으로 증가된 생 이삭 중량을 도시하고;
도 5는 하이브리드 대조군 식물에서 더 큰 도복을 야기하였던 바람 사건에 반응하여 야생형 하이브리드 대조군 식물에 비교하여 2개의 야외 시험에서 GA20 옥시다제 억제 작제물을 발현시키는 하이브리드 옥수수 식물의 평균적으로 증가된 생 이삭 중량을 도시하고;
도 6은 하이브리드 대조군 식물에 비교하여 GA20 옥시다제 억제 작제물을 발현시키는 하이브리드 옥수수 식물의 증가된 수확 지수를 도시하고;
도 7은 하이브리드 대조군 식물에 비교하여 GA20 옥시다제 억제 작제물을 발현시키는 하이브리드 옥수수 식물의 평균 곡물 수확량 추정치에서 증가를 도시하고;
도 8은 하이브리드 대조군 식물에 비교하여 GA20 옥시다제 억제 작제물을 발현시키는 하이브리드 옥수수 식물의 평균적으로 증가된 다작성 스코어를 도시하고;
도 9는 이식유전자성 옥수수 식물과 대조군 사이 R1 초과까지 발달성 시기 V11 동안 경시적으로 식물 높이에서 변화를 도시하고;
도 10은 이식유전자성 옥수수 식물과 대조군 사이 R5 시기에서 잎 조직내 물 수준 및 기공 유통성의 적응증으로서 안정한 산소 동위원소 비 (δ18O)의 측정치를 비교하는 그래프를 도시하고;
도 11은 그 깊이에서 뿌리의 존재를 나타내는 물 수준에서 변화를 검출하는 상이한 토양 깊이에서 센서를 사용하는 양쪽 SAP 및 HD 조건에서 이식유전자성 및 대조군 식물 사이 R2 초과까지 발달성 단계 V10 동안 뿌리 전선 속도를 비교하는 그래프를 도시하고;
도 12A는 온실에서 정상 및 가뭄 조건 하에서 이식유전자성 옥수수 식물과 대조군 사이 아침 및 오후 동안 기공 유통성에서의 차이를 도시하고;
도 12B는 온실에서 정상 및 가뭄 조건 하에서 이식유전자성 옥수수 식물과 대조군 사이 아침 및 오후 동안 광합성에서의 차이를 도시하고;
도 13A는 이식유전자성 옥수수 식물 대 대조군의, 벌크 줄기 조직, 또는 분리된 관속 및 비-관속 줄기 조직내 miRNA 발현 수준에서의 차이를 도시하고; 그리고
도 13B는 이식유전자성 옥수수 식물 대 대조군의, 벌크 줄기 조직, 또는 분리된 관속 및 비-관속 줄기 조직내 GA20 옥시다제_3 및 GA20 옥시다제_5 mRNA 전사체 발현 수준에서의 차이를 도시한다.
정의
본 개시내용의 이해를 촉진하기 위해, 본 명세서에서 사용된 바와 같이 몇 개의 용어들 및 약어들은 아래와 같이 정의된다:
2 이상 항목의 목록에서 사용될 때 용어 "및/또는"은 열거된 항목의 임의의 하나가 열거된 항목 중 임의의 하나 이상과 조합으로 또는 그것만으로 이용될 수 있다는 것을 의미한다. 예를 들어, 표현 "A 및/또는 B"는 A 및 B의 둘 중 하나 또는 모두 - 즉, A 단독, B 단독, 또는 조합으로 A 및 B를 의미하도록 의도된다. 표현 "A, B 및/또는 C"는 A 단독, B 단독, C 단독, 조합으로 A 및 B, 조합으로 A 및 C, 조합으로 B 및 C, 조합으로 또는 A, B, 및 C를 의미하도록 의도된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "약"은, 그와 같은 값을 변수로서 오차 한계 내에서 나타내는, 변경하는 수치를 수식하도록 의도된다. 특정 오차 한계, 예컨대 평균 값에 대한 표준 편차가 인용되지 않는 경우, 용어 "약"은 인용된 값을 포괄할 그 범위 그리고, 유의미한 숫자를 고려하여, 그 숫자를 반올림 또는 반내림함으로써 포함될 범위를 의미하는 것으로 이해될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "곡물 식물"은 볏과 식물의 포아세아애 또는 그라미네아애 과에 있는 그리고, 예를 들어, 밀, 옥수수, 쌀, 기장, 보리, 수수, 귀리 및 호밀을 포함하는, 그것의 종자로 전형적으로 수확되는 외떡잎 (외떡잎식물) 농작물을 지칭한다.
2 이상 뉴클레오타이드 또는 단백질 서열에 관련하여 본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어들 "퍼센트 동일성" 또는 "퍼센트 동일한"은 (i) 비교의 창으로 2개의 최적으로 정렬된 서열 (뉴클레오타이드 또는 단백질) 비교, (ii) (뉴클레오타이드 서열용) 동일한 핵산 염기 또는 (단백질용) 아미노산 잔기가 양쪽 서열에서 발생하여 매칭된 위치의 수를 산출하는 위치의 수 결정, (iii) 비교의 창에서 위치의 총 수로 매칭된 위치의 수 나눗셈, 그리고 그 다음 (iv) 이 몫을 100% 곱셈함으로써 계산되어 퍼센트 동일성을 산출한다. DNA 및 RNA 서열 사이 "퍼센트 동일성" 계산의 목적을 위하여, RNA 서열의 우라실 (U)는 DNA 서열의 티민 (T)와 동일하게 간주된다. 비교의 창이 2 이상 서열 사이 정렬의 영역으로서 정의되면 (즉, 정렬된 폴리뉴클레오타이드 서열의 5' 및 3' 말단에서 뉴클레오타이드, 또는 비교된 서열 사이 동일하지 않은, 정렬된 단백질 서열의 N-말단 및 C-말단에서 아미노산을 배제하면), "퍼센트 동일성"은 또한 "퍼센트 정렬 동일성"으로서 지칭될 수 있다. "퍼센트 동일성"이 명시되고 있는 특정 비교 창 없이 참조 서열에 관련하여 계산되고 있다면, 퍼센트 동일성은 참조 서열의 총 길이로 정렬의 영역에 걸쳐 매칭된 위치의 수를 나눗셈함으로써 결정된다. 따라서, 본 개시내용의 목적을 위하여, 2개의 서열 (쿼리 및 대상)이 (그것의 정렬에서 갭을 허용하는) 최적으로 정렬되는 경우, 쿼리 서열에 대한 "퍼센트 동일성"은 그것의 길이 (또는 비교 창)으로 쿼리 서열에서 위치의 총 수로 나눗셈된, 이것이 그 다음 100% 곱셈되는 2개 서열 사이 동일한 위치의 수와 동일하다.
아미노산 잔기가 유사한 크기 및 화학적 특성 (예를 들어, 전하, 소수성, 극성, 등)을 가진 다른 아미노산 잔기로 치환되는 경우, 동일하지 않은 단백질의 잔기 위치가 종종 보존적 아미노산 치환만큼 상이하고, 따라서 분자의 기능적 특성을 변화시킬 수 없다는 것이 인식된다. 서열이 보존적 치환에서 상이한 경우, 퍼센트 서열 유사성은 비-동일한 치환(들)의 보존적 성질에 대하여 교정하기 위해 상향 조정될 수 있다. 그와 같은 보존적 치환만큼 상이한 서열은 "서열 유사성" 또는 "유사성"을 갖는다고 한다. 따라서, 2 이상 단백질 서열에 관련하여 본 명세서에서 사용된 바와 같이 "퍼센트 유사성" 또는 "퍼센트 유사한"은 (i) 비교의 창으로 2개의 최적으로 정렬된 단백질 서열 비교, (ii) 동일 또는 유사한 아미노산 잔기가 양쪽 서열에서 발생하여 매칭된 위치를 산출하는 위치의 수 결정, (iii) 비교의 창에서 위치의 총 수 (또는 비교의 창이 명시되지 않은 경우 참조 또는 쿼리 단백질의 총 길이)로 매칭된 위치의 수 나눗셈, 그리고 그 다음 (iv) 이 몫을 100% 곱셈함으로써 계산되어 퍼센트 유사성을 산출한다. 단백질에 대한 보존적 아미노산 치환은 당해 기술에 공지되어 있다.
그것의 퍼센트 동일성 또는 유사성을 계산하기 위해 서열의 최적의 정렬을 위하여, 다양한 쌍으로 또는 다중 서열 정렬 알고리즘 및 프로그램은, 2 이상 뉴클레오타이드 또는 단백질 서열 사이 서열 동일성 또는 유사성을 비교하기 위해 사용될 수 있는, 당해 기술, 예컨대 ClustalW, 또는 Basic Local Alignment Search Tool® (BLAST®), 등에 공지되어 있다. 다른 정렬 및 비교 방법이 당해 기술에 공지되어 있어도, (상기 기재된 퍼센트 동일성 범위를 포함하는) 2개의 서열 사이 정렬은 하기에 의해 결정된 바와 같을 수 있다: ClustalW 또는 BLAST® 알고리즘, 참고, 예를 들어, Chenna R. 등, "Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs", Nucleic Acids Research 31: 3497-3500 (2003); Thompson JD 등, "Clustal W: Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice", Nucleic Acids Research 22: 4673-4680 (1994); and Larkin MA 등, "Clustal W and Clustal X version 2.0", Bioinformatics 23: 2947-48 (2007); and Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, D.J. (1990) "Basic local alignment search tool", J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990), 이의 전체 내용 및 개시내용은 본 명세서에 참고로 편입됨.
2개의 뉴클레오타이드 서열에 관련하여 본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어들 "퍼센트 상보성" 또는 "퍼센트 상보적"은 퍼센트 동일성의 개념과 유사하지만 쿼리 및 대상 서열이 2차 폴딩 구조, 예컨대 루프, 줄기 또는 헤어핀 없이 선형으로 배열되고 최적으로 염기짝짓기되는 경우 대상 서열의 뉴클레오타이드로 최적으로 염기짝짓기 또는 하이브리드화하는 쿼리 서열의 뉴클레오타이드의 백분율을 지칭한다. 그와 같은 퍼센트 상보성은 2개의 DNA 가닥, 2개의 RNA 가닥, 또는 DNA 가닥 및 RNA 가닥 사이일 수 있다. "퍼센트 상보성"은 (i) 비교의 창으로 선형 및 완전하게 연장된 배열에서 (즉, 폴딩 또는 2차 구조 없이) 2개의 뉴클레오타이드 서열 최적으로 염기짝짓기 또는 하이브리드화, (ii) 상보적 위치의 수를 산출하기 위해 비교의 창으로 2개의 서열 사이 염기짝짓기하는 위치의 수 결정, (iii) 비교의 창에서 위치의 총 수로 상보적 위치의 수 나눗셈, 그리고 (iv) 이 몫을 100% 곱셈함으로써 계산되어 2개 서열의 퍼센트 상보성을 산출한다. 2개 서열의 최적의 염기 짝짓기는, 수소 결합을 통해, 뉴클레오타이드 염기의 공지된 짝짓기, 예컨대 G-C, A-T, 및 A-U에 기반하여 결정될 수 있다. "퍼센트 상보성"이 특정 비교 창의 특정 없이 참조 서열에 관련하여 계산되고 있다면, 퍼센트 동일성은 참조 서열의 총 길이로 2개 선형적 순서 사이 상보적 위치의 수를 나눗셈함으로써 결정된다. 따라서, 본 개시내용의 목적을 위하여, 2개 서열 (쿼리 및 대상)이 (폴딩 또는 2차 구조 없이 미스매치 또는 비-염기짝짓기된 뉴클레오타이드를 허용하는) 최적으로 염기짝짓기되는 경우, 쿼리 서열에 대한 "퍼센트 상보성"은 그것의 길이로 쿼리 서열에서 위치의 총 수로 (또는 비교 창으로 쿼리 서열에서 위치의 수로) 나눗셈된, 이것이 그 다음 100% 곱셈되는 2개의 서열 사이 염기짝짓기된 위치의 수와 동일하다.
용어 "작동가능하게 연결된"은, 프로모터, 등이 적어도 특정 세포(들), 조직(들), 발달성 시기(들), 및/또는 조건(들)에서 관련된 전사가능한 DNA 서열 또는 코딩 서열의 전사 및 발현을 개시, 보조, 영향, 야기, 및/또는 촉진시키기 위해 작동 또는 기능하도록, 유전자 (또는 이식유전자)의 코딩 서열 또는 관련된 전사가능한 DNA 서열과 프로모터 또는 다른 조절 인자 사이 기능적 연결을 지칭한다.
용어 "식물-발현성 프로모터"는 식물 세포 또는 조직에서 그것의 관련된 전사가능한 DNA 서열, 코딩 서열 또는 유전자의 전사 및 발현을 개시, 보조, 영향, 야기, 및/또는 촉진시킬 수 있는 프로모터를 지칭한다.
관련된 폴리뉴클레오타이드 서열 (예를 들어, 전사가능한 DNA 서열 또는 코딩 서열 또는 유전자)에 관하여 프로모터 또는 다른 조절 서열에 관련하여 용어 "이종성"은 자연에서 그와 같은 관련된 폴리뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결되지 않는 프로모터 또는 조절 서열이다 - 예를 들어, 프로모터 또는 조절 서열은 관련된 폴리뉴클레오타이드 서열에 비하여 상이한 기원을 갖고/갖거나 프로모터 또는 조절 서열은 프로모터 또는 조절 서열로 형질전환되도록 식물 종에서 자연 발생이 아니다.
폴리뉴클레오타이드 (DNA 또는 RNA) 분자, 단백질, 작제물, 벡터, 등에 관련하여 용어 "재조합"은, 인간 개입 없이 함께 동일한 방식으로 자연적으로 발생하지 않을 2 이상의 조합 폴리뉴클레오타이드 또는 단백질 서열, 예컨대 서로에 대해서 이종성이지만 작동가능하게 연결되는 적어도 2종의 폴리뉴클레오타이드 또는 단백질 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드 분자, 단백질, 작제물, 등을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드 (DNA 또는 RNA) 분자, 단백질, 작제물, 등을 포함하여, 인공적이고 자연에서 정상적으로 발견되지 않는, 및/또는 자연에서 정상적으로 발견되지 않는 상황에서 존재하는 폴리뉴클레오타이드 또는 단백질 분자 또는 서열을 지칭한다. 예를 들어, 용어 "재조합"은 그와 같은 조합이 인공적이고 자연에서 정상적으로 발견되지 않는 동일한 분자내 2 이상 DNA 또는 단백질 서열의 임의의 조합 (예를 들어, 플라스미드, 작제물, 벡터, 염색체, 단백질, 등)을 지칭할 수 있다. 이 정의에서 사용된 바와 같이, 어구 "자연에서 정상적으로 발견되지 않는"은 인간 도입 없이 자연에서 발견되지 않는 것을 의미한다. 재조합 폴리뉴클레오타이드 또는 단백질 분자, 작제물, 등은 (i) 자연에서 서로에 대해서 근접하여 실재하는 다른 폴리뉴클레오타이드 또는 단백질 서열(들)로부터 분리되는, 및/또는 (ii) 서로 근접하여 자연적이지 않은 다른 폴리뉴클레오타이드 또는 단백질 서열(들)에 인접한 (또는 상기와 인접한) 폴리뉴클레오타이드 또는 단백질 서열(들)을 포함할 수 있다. 그와 같은 재조합 폴리뉴클레오타이드 분자, 단백질, 작제물, 등은 또한 유전자적으로 조작되고/되거나 세포의 외부에서 작제된 폴리뉴클레오타이드 또는 단백질 분자 또는 서열을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 재조합 DNA 분자는 임의의 조작된 또는 인공 플라스미드, 벡터, 등을 포함할 수 있고, 선형 또는 원형 DNA 분자를 포함할 수 있다. 그와 같은 플라스미드, 벡터, 등은 아마 식물 선택가능한 마커 유전자, 등에 더하여 복제 및 선택가능한 마커의 원핵 기원, 뿐만 아니라 하나 이상의 이식유전자 또는 발현 카세트를 포함하는 다양한 유지 요소를 함유할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "단리된"은 그것의 천연 상태에서 그와 전형적으로 관련된 다른 분자로부터 한 분자를 적어도 부분적으로 분리시키는 것을 지칭한다. 일 구현예에서, 용어 "단리된"은 그것의 천연 상태에서 DNA 분자를 정상적으로 측접하는 핵산으로부터 분리되는 DNA 분자를 지칭한다. 예를 들어, 박테리움에서 자연적으로 존재하는 단백질을 인코딩하는 DNA 분자는 단백질을 인코딩하는 DNA 분자가 자연적으로 발견되는 것으로부터 박테리움의 DNA 내에 없으면 단리된 DNA 분자일 것이다. 따라서, 예를 들어 재조합 DNA 또는 식물 형질전환 기술의 결과로서, 자연에서 관련되지 않은 것과 하나 이상의 다른 DNA 분자(들)에 작동가능하게 연결된 또는 상기에 융합된 DNA 분자는 본 명세서에서 단리된 것으로 간주된다. 그와 같은 분자는 숙주세포의 염색체 속에 통합하였던 또는 다른 DNA 분자를 가진 핵산 용액에서 존재하는 경우 심지어 단리된 것으로 간주된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "인코딩 영역" 또는 "코딩 영역"은 작용 단위 또는 분자 (예를 들어, 제한 없이, mRNA, 단백질, 또는 비-코딩 RNA 서열 또는 분자)를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 한 부분을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 식물, 식물 종자, 식물 일부, 식물 세포, 및/또는 식물 게놈의 맥락에서 "변형된"은, 예컨대 (A) 억제를 위하여 하나 이상의 GA3 및/또는 GA20 옥시다제 유전자를 표적화하는 비-코딩 RNA를 인코딩하는 전사가능한 DNA 서열 또는 억제 작제물을 포함하는 이식유전자성 사건, 또는 (B) 하나 이상의 내인성 GA3 및/또는 GA20 옥시다제 유전자의 발현 수준 또는 활성에 영향을 미치는 (예를 들어, 상기를 감소 또는 제거하는) 돌연변이 또는 게놈 편집 사건을 통해, 야생형 또는 대조군 식물, 식물 종자, 식물 일부, 식물 세포, 및/또는 식물 게놈에 비하여 하나 이상의 GA 옥시다제 유전자(들)의 발현 수준 및/또는 코딩 서열에서 조작된 변화를 포함하는 식물, 식물 종자, 식물 일부, 식물 세포, 및/또는 식물 게놈을 지칭한다. 사실상, 용어 "변형된"은, 화학적 돌연변이유발, 트랜스포존 삽입 또는 절개, 또는 임의의 다른 공지된 돌연변이유발 기술을 통해 도입된, 또는 게놈 편집을 통해 도입된, 하나 이상의 내인성 GA 옥시다제 유전자, 예컨대 하나 이상의 내인성 GA3 및/또는 GA20 옥시다제 유전자의 발현에 영향을 미치는 하나 이상의 돌연변이를 갖는 식물, 식물 종자, 식물 일부, 식물 세포, 및/또는 식물 게놈을 추가로 지칭할 수 있다. 명백하게 하기 위해, 따라서, 변형된 식물, 식물 종자, 식물 일부, 식물 세포, 및/또는 식물 게놈은 야생형 또는 대조군 식물, 식물 종자, 식물 일부, 식물 세포, 및/또는 식물 게놈에 비하여 하나 이상의 GA 옥시다제 유전자(들)의 변형된 발현 수준, 발현 패턴, 및/또는 코딩 서열을 갖는 돌연변이된, 편집된 및/또는 이식유전자성 식물, 식물 종자, 식물 일부, 식물 세포, 및/또는 식물 게놈을 포함한다. 변형된 식물 또는 종자는, 유전적 및/또는 후생유전자 변형을 포함하여, GA 옥시다제 유전자(들), 예컨대 GA3 및/또는 GA20 옥시다제 유전자(들)의 발현에 영향을 미치는 다양한 분자 변화를 함유할 수 있다. 변형된 식물, 식물 일부, 종자, 등은 돌연변이유발, 게놈 편집 또는 부위 지향적 통합 (예를 들어, 제한 없이, 부위-특이적 뉴클레아제를 사용하는 방법을 통해), 유전적 형질전환 (예를 들어, 제한 없이, 아그로박테리움 형질전환 또는 미세투사물 폭격의 방법을 통해), 또는 이들의 조합을 거치게 될 수 있다. 그와 같은 "변형된" 식물, 식물 종자, 식물 일부, 및 식물 세포는 하나 이상의 GA 옥시다제 유전자에 분자 변화 (예를 들어, 발현 수준 및/또는 활성에서의 변화)를 보유하는 "변형된" 식물, 식물 종자, 식물 일부, 및 식물 세포로부터 자손이거나 유래되는 식물, 식물 종자, 식물 일부, 및 식물 세포를 포함한다. 본 명세서에서 제공된 변형된 종자는 본 명세서에서 제공된 변형된 식물을 생기게 할 수 있다. 본 명세서에서 제공된 변형된 식물, 식물 종자, 식물 일부, 식물 세포, 또는 식물 게놈은 본 명세서에서 제공된 바와 같은 재조합 DNA 작제물 또는 벡터 또는 게놈 편집을 포함할 수 있다. "변형된 식물 생산물"은 본 명세서에서 제공된 변형된 식물, 식물 일부, 식물 세포, 또는 식물 염색체, 또는 이의 임의의 부분 또는 성분으로 제조된 임의의 생성물일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "대조군 식물" (또는 마찬가지로 "대조군" 식물 종자, 식물 일부, 식물 세포 및/또는 식물 게놈)은, 하나 이상의 GA 옥시다제 유전자에 영향을 미치는 이식유전자성 및/또는 게놈 편집 사건(들)을 제외하고, 변형된 식물 (또는 식물 종자, 식물 일부, 식물 세포 및/또는 식물 게놈)과 동일 또는 유사한 유전적 배경 (예를 들어, 동일 친계, 하이브리드 교배, 자식 계통, 테스터, 등)을 갖는 그리고 변형된 식물 (또는 변형된 식물 종자, 식물 일부, 식물 세포 및/또는 식물 게놈)에 비교를 위하여 사용되는 식물 (또는 식물 종자, 식물 일부, 식물 세포 및/또는 식물 게놈)을 지칭한다. 예를 들어, 대조군 식물은 변형된 식물을 만들기 위해 사용된 자식 계통과 동일한 자식 계통일 수 있거나, 또는 대조군 식물은, 하나 이상의 GA 옥시다제 유전자에 영향을 미치는 임의의 이식유전자성 또는 게놈 편집 사건(들)의 대조군 식물에서 부재를 제외하고, 변형된 식물과 동일한 근친교배 친계의 하이브리드 교배의 생산물일 수 있다. 변형된 식물, 식물 종자, 식물 일부, 식물 세포 및/또는 식물 게놈에 비교의 목적을 위하여, "야생형 식물" (또는 마찬가지로 "야생형" 식물 종자, 식물 일부, 식물 세포 및/또는 식물 게놈)은 비-이식유전자성 및 비-게놈 편집된 대조군 식물, 식물 종자, 식물 일부, 식물 세포 및/또는 식물 게놈을 지칭한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "대조군" 식물, 식물 종자, 식물 일부, 식물 세포 및/또는 식물 게놈은 또한, 분석될 특징 또는 특성의 비교를 위하여 충분히 유사한 것으로 간주되면, 변형된 식물, 식물 종자, 식물 일부, 식물 세포 및/또는 식물 게놈과 유사한 (동일 또는 동일성이 아닌) 유전적 배경을 갖는 식물, 식물 종자, 식물 일부, 식물 세포 및/또는 식물 게놈일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 게놈 편집용 "표적 부위"는 폴리뉴클레오타이드 서열 및/또는 그것의 상보적 DNA 가닥의 핵산 백본에 이중가닥 절단 (또는 단일가닥 닉)을 도입하는 부위-특이적 뉴클레아제에 의해 결합 및 절단되는 식물 게놈 이내 폴리뉴클레오타이드 서열의 위치를 지칭한다. 표적 부위는 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 적어도 27, 적어도 29, 또는 적어도 30 연속적인 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. RNA-유도된 뉴클레아제용 "표적 부위"는 표적 부위에서 이중-가닥 핵산 (DNA) 분자 또는 염색체의 어느 한쪽 상보적 가닥의 서열을 포함할 수 있다. 부위-특이적 뉴클레아제는 표적 부위에, 예컨대 비-코딩 가이드 RNA (예를 들어, 제한 없이, 아래 추가로 기재된 바와 같이 CRISPR RNA (crRNA) 또는 단일-가이드 RNA (sgRNA))를 통해 결합할 수 있다. 본 명세서에서 제공된 비-코딩 가이드 RNA는 표적 부위에 상보적 (예를 들어, 표적 부위에서 이중-가닥 핵산 분자 또는 염색체의 어느 한쪽 가닥에 상보적)일 수 있다. 완벽한 동일성 또는 상보성이 표적 부위에 결합 또는 하이브리드화하기 위해 비-코딩 가이드 RNA에 요구되지 않을 수 있다는 것이 인정될 것이다. 예를 들어, 표적 부위와 비-코딩 RNA 사이 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 또는 적어도 8 미스매치 (이상)은 용인될 수 있다. "표적 부위"는 또한, 폴리뉴클레오타이드 서열 및/또는 그것의 상보적 DNA 가닥에 이중가닥 절단 (또는 단일가닥 닉)을 도입하기 위해, 비-코딩 RNA 분자, 예컨대 메가뉴클레아제, 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 또는 전사 활성제-유사 효과기 뉴클레아제 (TALEN)에 의해 유도되지 않을 수 있는 또 다른 부위-특이적 뉴클레아제에 의해 결합 및 절단되는 식물 게놈 이내 폴리뉴클레오타이드 서열의 위치를 지칭한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "표적 영역" 또는 "표적화된 영역"은 2 이상 표적 부위에 의해 측접되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 영역을 지칭한다. 제한 없이, 일부 구현예에서 표적 영역은 돌연변이, 결실, 삽입 또는 역전을 거치게 될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 분자의 표적 영역을 기재하는데 사용될 때 "측접된"은, 표적 영역의 각 면에서 하나의 표적 부위로, 표적 영역을 둘러싸는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 분자의 2 이상 표적 부위를 지칭한다. 게놈 편집과 별개로, 용어 "표적 부위"는 또한 억제 작제물에 의해 인코딩된 비-코딩 RNA 분자 (예를 들어, miRNA, siRNA, 등)의 적어도 일부분에 상보적인 mRNA 분자의 일부분 (예를 들어, "인식 부위")를 지칭하기 위해 유전자 억제의 맥락에서 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 재조합 DNA 공여체 템플레이트일 수 있는, "공여체 분자", "공여체 템플레이트" 또는 "공여체 템플레이트 분자" (집합적으로 "공여체 템플레이트")는 식물 세포의 게놈에서 닉 또는 이중-가닥 DNA 중단의 복구를 통해 식물 세포의 게놈에 부위 지향적, 표적화된 삽입 또는 재조합용 핵산 템플레이트 또는 삽입 서열을 갖는 핵산 분자로서 정의된다. 예를 들어, "공여체 템플레이트"는, 식물의 게놈 이내 표적 부위에 돌연변이, 예컨대 삽입, 결실, 등을 도입하기 위해 템플레이트로서 또는, 이식유전자 또는 억제 작제물의 부위 지향적 통합을 위하여 사용될 수 있다. 본 명세서에서 제공된 표적화된 게놈 편집 기술은 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 또는 5 이상 공여체 분자 또는 템플레이트의 사용을 포함할 수 있다. "공여체 템플레이트"는 단일가닥 또는 이중-가닥 DNA 또는 RNA 분자 또는 플라스미드일 수 있다. 공여체 템플레이트의 "삽입 서열"은, 임의의 적합한 길이일 수 있는, 식물 세포의 게놈 속에 표적화된 삽입을 위하여 설계된 서열이다. 예를 들어, 공여체 템플레이트의 삽입 서열은 2 내지 50,000, 2 내지 10,000, 2 내지 5000, 2 내지 1000, 2 내지 500, 2 내지 250, 2 내지 100, 2 내지 50, 2 내지 30, 15 내지 50, 15 내지 100, 15 내지 500, 15 내지 1000, 15 내지 5000, 18 내지 30, 18 내지 26, 20 내지 26, 20 내지 50, 20 내지 100, 20 내지 250, 20 내지 500, 20 내지 1000, 20 내지 5000, 20 내지 10,000, 50 내지 250, 50 내지 500, 50 내지 1000, 50 내지 5000, 50 내지 10,000, 100 내지 250, 100 내지 500, 100 내지 1000, 100 내지 5000, 100 내지 10,000, 250 내지 500, 250 내지 1000, 250 내지 5000, 또는 250 내지 10,000 뉴클레오타이드 또는 염기쌍 길이일 수 있다. 공여체 템플레이트는 또한, 상동성 재조합을 통해 식물의 게놈 이내 표적 부위 속에 돌연변이 또는 삽입 서열의 통합을 유도하기 위해, 적어도 하나의 상동성 서열 또는 상동성 아암, 예컨대 2개의 상동성 아암을 가질 수 있고, 여기서 상기 상동성 서열 또는 상동성 아암(들)은 동일 또는 상보적이거나, 또는 식물의 게놈 이내 표적 부위에서 또는 근처에서 서열에 퍼센트 동일성 또는 퍼센트 상보성을 갖는다. 공여체 템플레이트가 상동성 아암(들) 및 삽입 서열을 포함하는 경우, 상동성 아암(들)은 공여체 템플레이트의 삽입 서열을 측접할 것이거나 둘러쌀 것이다.
공여체 템플레이트의 삽입 서열은 각각이 전사된 비-코딩 RNA 또는 mRNA 서열 및/또는 번역된 단백질 서열을 인코딩하는 하나 이상의 유전자 또는 서열을 포함할 수 있다. 공여체 템플레이트의 전사된 서열 또는 유전자는 단백질 또는 비-코딩 RNA 분자를 인코딩할 수 있다. 공여체 템플레이트의 삽입 서열은 기능적 유전자 또는 전체 유전자 서열을 포함하지 않는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있거나 (예를 들어, 공여체 템플레이트는 간단히 조절 서열, 예컨대 프로모터 서열, 또는 단지 유전자 또는 코딩 서열의 일부분을 포함할 수 있거나), 또는 임의의 확인가능한 유전자 발현 요소 또는 임의의 활동적으로 전사된 유전자 서열을 함유하지 않을 수 있다. 또한, 공여체 템플레이트는 선형 또는 원형일 수 있고, 단일가닥 또는 이중-가닥일 수 있다. 공여체 템플레이트는 (예를 들어, 입자 폭격을 통해) 네이키드 핵산으로서, 하나 이상의 전달 제제를 가진 복합체 (예를 들어, 단백질, 등으로 캡슐화된 리포좀, 단백질, 폴록사머, T-가닥)으로서 전달될 수 있거나, 또는 박테리아 또는 바이러스성 전달 비히클, 예컨대, 예를 들어, 아그로박테리움 투메파시엔스 또는 제미니바이러스, 각각에서 함유될 수 있다. 본 명세서에서 제공된 공여체 템플레이트의 삽입 서열은, 비-코딩될 수 있고 프로모터 및/또는 다른 조절 서열에 작동가능하게 연결될 수 있거나 아닐 수 있는, RNA 분자 속에 전사될 수 있는 전사가능한 DNA 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에 따르면, 공여체 템플레이트는 삽입 서열을 포함할 수 없고, 대신에, 식물의 게놈 이내 표적 부위에서, 예컨대 식물의 게놈 이내 GA3 옥시다제 또는 GA20 옥시다제 유전자에서 또는 근처에서 유전자 서열에 비하여, 하나 이상의 돌연변이, 예컨대 삽입, 결실, 치환, 등을 포함하는 하나 이상의 상동성 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 공여체 템플레이트는 코딩 또는 전사가능한 DNA 서열을 포함하지 않는 삽입 서열을 포함할 수 있고, 여기서 상기 삽입 서열은 식물의 게놈 이내 표적 부위 속에, 예컨대 식물의 게놈 이내 GA3 옥시다제 또는 GA20 옥시다제 유전자에서 또는 근처에서 하나 이상의 돌연변이를 도입하는데 사용된다.
본 명세서에서 제공된 공여체 템플레이트는 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 또는 적어도 10 유전자 또는 전사가능한 DNA 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 공여체 템플레이트는 유전자를 포함하지 않을 수 있다. 제한 없이, 공여체 템플레이트의 유전자 또는 전사가능한 DNA 서열은, 예를 들어, 살충 저항 유전자, 제초제 내성 유전자, 질소 사용 효율 유전자, 물 사용 효율 유전자, 영양 품질 유전자, DNA 결합 유전자, 선택가능한 마커 유전자, RNAi 또는 억제 작제물, 부위-특이적 게놈 변형 효소 유전자, CRISPR/Cas9 시스템의 단일 가이드 RNA, 제미니바이러스-기반 발현 카셋트, 또는 식물 바이러스성 발현 벡터 시스템을 포함할 수 있다. 다른 구현예에 따르면, 공여체 템플레이트의 삽입 서열은, 억제를 위하여, GA 옥시다제 유전자, 예컨대 GA3 옥시다제 또는 GA20 옥시다제 유전자를 표적화할 수 있는, 비-코딩 RNA 분자를 인코딩하는 전사가능한 DNA 서열을 포함할 수 있다. 공여체 템플레이트는 프로모터, 예컨대 조직-특이적 또는 조직-바람직한 프로모터, 항시성 프로모터, 또는 유도성 프로모터를 포함할 수 있다. 공여체 템플레이트는 리더, 증진제, 프로모터, 전사 개시 부위, 5'-UTR, 하나 이상의 엑손(들), 하나 이상의 인트론(들), 전사 말단 부위, 영역 또는 서열, 3'-UTR, 및/또는 폴리아데닐화 신호를 포함할 수 있다. 리더, 증진제, 및/또는 프로모터는 비-코딩 RNA, 가이드 RNA, mRNA 및/또는 단백질을 인코딩하는 유전자 또는 전사가능한 DNA 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "관속 프로모터"는, 상기 프로모터가 다른 비-관속 식물 세포(들) 또는 조직(들)에서 또한 발현될지라도, 식물의 하나 이상의 관속 조직(들)에서 그와 같은 프로모터에 작동가능하게 연결된 전사가능한 DNA 서열 또는 이식유전자의 발현을 구동, 야기 또는 개시하는 식물-발현성 프로모터를 지칭한다. 그와 같은 관속 조직(들)은 식물의 체관부, 관속 실질, 및/또는 다발 외피 세포(들) 또는 조직(들) 중 하나 이상을 포함할 수 있다. "관속 프로모터"는 식물의 하나 이상의 관속 조직(들)을 포함하는 발현의 조절된 및 상대적으로 더욱 제한된 패턴을 갖는다는 점에서 항시성 프로모터와 구별된다. 관속 프로모터는 양쪽 관속-특이적 프로모터 및 관속-바람직한 프로모터를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "잎 프로모터"는, 상기 프로모터가 다른 비-잎 식물 세포(들) 또는 조직(들)에서 또한 발현될지라도, 식물의 하나 이상의 잎 조직(들)에서 그와 같은 프로모터에 작동가능하게 연결된 전사가능한 DNA 서열 또는 이식유전자의 발현을 구동, 야기 또는 개시하는 식물-발현성 프로모터를 지칭한다. 잎 프로모터는 양쪽 잎-특이적 프로모터 및 잎-바람직한 프로모터를 포함한다. "잎 프로모터"는 다른 식물 조직에 비하여 식물의 잎 조직(들)에서 더욱 우세하게 또는 독점적으로 발현된다는 점에서 관속 프로모터와 구별되고, 반면에 관속 프로모터는 잎 외부의 관속 조직(들), 예컨대 식물의, 줄기의, 또는 줄기 및 잎의 관속 조직(들)을 더욱 일반적으로 포함하여 관속 조직(들)에서 발현된다.
설명
대부분의 곡물 생산 볏과식물, 예컨대 밀, 쌀 및 수수는 원추꽃차례의 각각의 잔꽃 이내 양쪽 웅성 및 자성 구조를 생산한다 (즉, 이들은 단일 생식 구조를 갖는다). 그러나, 옥수수 또는 메이즈는 별개의 웅성 (술) 및 자성 (이삭) 꽃차례를 형성한다는 점에서 곡물-생산 볏과식물 중에서 특유이다. 옥수수는 발생의 초기 단계 이내 솔의 잔꽃에서 자성 기관 (밑씨) 및, 이삭의 잔꽃에서 웅성 기관 (꽃밥)의 선택적 낙태에 의해 완전히 성적으로 동종이형의 생식 구조를 생산한다. 정확하게 조절된 지베렐린 합성 및 신호전달은, GA 경로에서 파괴에 가장 감수성인 웅성 생식 이삭으로, 이러한 선택적 낙태 과정의 조절에 중요하다. 사실상, "꽃밥 이삭" 표현형은 GA 옥수수 돌연변이체에서 가장 흔한 생식 표현형이다.
옥수수와 대조적으로, 밀, 쌀 및 수수에서 "녹색 혁명"으로 이어졌던 지베렐린 합성 또는 신호전달 경로에서 돌연변이는 이들 작물 종이 발생 동안 곡물 보유 원추꽃차례의 선택적 낙태 과정을 거치지 않기 때문에 그것의 생식 구조에서 거의 영향이 없었고, 따라서 GA 수준에 파괴에 비감수성이다. 동일한 돌연변이는 GA 합성 및 신호전달 경로의 파괴가, 일부 경우에 극단적인 왜화에 더하여, 솔에서의 멸균 (파괴된 꽃밥 및 소포자 발생) 및 이삭 ("꽃밥 이삭")의 극적인 뒤틀림 및 웅성화로 반복적으로 이어졌기 때문에 옥수수에서 이용되지 않고 있다. 참고, 예를 들어, Chen, Y. 등, "The Maize DWARF1 Encodes a Gibberellin 3-Oxidase and Is Dual Localized to the Nucleus and Cytosol", Plant Physiology 166: 2028-2039 (2014). 옥수수에서 이들 GA 돌연변이체 표현형 (오프-유형)은 알맹이 생산에서 상당한 감소 및 수확량에서 감소로 이어졌다. 게다가, 이삭 이내 꽃밥의 생산은 진균 또는 곤충 감염의 가능성을 증가시키고, 이는 돌연변이체 이삭에서 생산되는 곡물의 품질을 감소시킨다. 옥수수의 반왜성 계통을 개발하기 위한 정방향 교배는 성공적이지 않았고, GA 돌연변이체의 생식 오프-유형 (뿐만 아니라 극단적인 왜화)는 극복하기 위해 도전해 왔다. 따라서, 다른 볏과식물에서 녹색 혁명으로 이어졌던 GA 경로에서 동일한 돌연변이는 옥수수에서 아직 성공하지 못했다.
GA 경로의 조작을 통해 옥수수에서 더 높은 곡물 수확량 달성에서 이들 이전의 어려움에도 불구하고, 본 발명자들은 전체적인 식물 높이 및 줄기 마디간 길이를 감소시키고 도복에 대한 저항을 증가시키지만, 옥수수에서 GA 경로의 돌연변이와 이전에 관련된 생식 오프-유형을 야기시키지 않는 방식으로 옥수수 식물에서 GA 수준을 조작하는 방식을 알아내었다. 추가 증거는 이들 단간 또는 반왜성 옥수수 식물이 또한, 증가된 줄기 직경, 감소된 녹색 스냅, 더 깊은 뿌리, 증가된 잎 면적, 더 이른 캐노피 폐쇄, 더 높은 기공 유통성, 더 낮은 이삭 높이, 증가된 잎 수분 함량, 향상된 가뭄 내성, 증가된 질소 사용 효율, 증가된 물 사용 효율, 정상 또는 질소 또는 물 제한 스트레스 상태 하에서 잎내 감소된 안토시아닌 함량 및 면적, 증가된 이삭 중량, 증가된 알맹이 수, 증가된 알맹이 중량, 증가된 수확량, 및/또는 증가된 수확 지수를 포함하여, 하나 이상의 추가의 특성을 가질 수 있다는 것을 나타낸다.
이론에 의한 구속됨 없이, GA20 또는 GA3 옥시다제 유전자(들)의 불완전한 억제 및/또는 하나 이상의 GA 옥시다제 유전자(들)의 서브셋의 표적화가, 이삭에서 생식 오프-유형 없이, 도복에 대한 증가된 저항과 단간, 반왜성 표현형 달성에 효과적일 수 있다는 것이 제안된다. 이론에 의한 제한됨 없이, 식물의 특정 활성 GA-생산 조직, 예컨대 관속 및/또는 잎 조직에 GA20 및/또는 GA3 옥시다제 유전자(들)의 억제 제한이, 생식 조직에서 상당한 오프-유형 없이, 증가된 도복 저항성으로 단-신장 식물을 생산하기에 충분할 수 있다는 것이 추가로 제안된다. 조직-특이적 또는 조직-바람직한 방식으로 GA20 또는 GA3 옥시다제 억제 요소의 발현은, (예를 들어, 생식 조직에서 GA20 옥시다제 유전자(들)의 억제 회피 또는 제한에 의해) 옥수수에서 GA 돌연변이체와 이전에 관측된 생식 조직에서 잠재적인 오프-유형을 회피하면서, 단간 표현형을 가진 식물 생산에서 충분하고 효과적일 수 있다. 예를 들어, GA20 및/또는 GA3 옥시다제 유전자(들)은, 식물의 관속 조직에서 발현을 구동시키는, 관속 프로모터, 예컨대 쌀 퉁그로 바실리폼 바이러스 (RTBV) 프로모터를 사용하는 억제에 대하여 표적화될 수 있다. 아래 실시예에서 지지된 바와 같이, RTBV 프로모터의 발현 패턴은 GA20 및 GA3 옥시다제 유전자(들)을 표적화하는 억제 요소에 작동가능하게 연결된 경우 옥수수 식물에서 반왜성 표현형을 생산하기에 충분한, 비-관속 조직에 비하여 옥수수 식물의 관속 조직에서 강화된다. 활성 GAs를 생산하는 옥수수 또는 곡물 식물의 조직(들)에서 활성 GA 수준의 저하는 식물 높이를 감소시킬 수 있고 도복 저항성을 증가시킬 수 있고, 오프-유형은 활성 GA 수준이 식물의 생식 조직, 예컨대 발달하는 자성 장기 또는 이삭에서 또한 상당히 영향을 받지 않거나 저하되지 않는 식물에서 회피될 수 있다. 활성 GA 수준이 생식 조직 (예를 들어, 자성 또는 웅성 생식 기관 또는 꽃차례)에서 GA 수준에 상당히 영향 없이 옥수수 또는 곡물 식물의 자루, 줄기, 또는 마디간(들)에서 감소될 수 있다면, 감소된 식물 높이 및 증가된 도복 저항성을 갖는 옥수수 또는 곡물 식물은 식물의 생식 조직에서 오프-유형 없이 창출될 수 있다.
따라서, 조직-특이적 또는 조직-바람직한 프로모터일 수 있는, 식물 발현성 프로모터에 작동가능하게 연결된 GA20 또는 GA3 옥시다제 억제 요소 또는 서열을 포함하는 재조합 DNA 작제물 및 이식유전자성 식물은 본 명세서에서 제공된다. 그와 같은 조직-특이적 또는 조직-바람직한 프로모터는 그 조직(들)에서 생산된 활성 GAs의 수준을 억제 또는 감소시키기 위해 식물의 하나 이상의 활성 GA-생산 조직(들)에서 그것의 관련된 GA 옥시다제 억제 요소 또는 서열의 발현을 구동시킬 수 있다. 그와 같은 조직-특이적 또는 조직-바람직한 프로모터는 발달의 하나 이상의 영양 단계(들) 동안 그것의 관련된 GA 옥시다제 억제 작제물 또는 이식유전자의 발현을 구동시킬 수 있다. 그와 같은 조직-특이적 또는 조직-바람직한 프로모터는 또한 그 생식 조직에서 오프-유형의 가능성을 회피하기 위해 식물의 자성 장기 또는 이삭 발달의 하나 이상의 세포(들) 또는 조직(들)에서 발현을 거의 갖지 않을 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 조직-특이적 또는 조직-바람직한 프로모터는 관속 프로모터, 예컨대 RTBV 프로모터이다. RTBV 프로모터의 서열은 서열번호: 65로서 본 명세서에서 제공되고, RTBV 프로모터의 절단된 버전은 서열번호: 66으로서 본 명세서에서 추가로 제공된다.
활성 또는 생물활성 지베렐린산 (즉, "활성 지베렐린" 또는 "활성 GAs)는, 불활성 GAs와 구별되는 바와 같이, 주어진 식물 종에 대하여 당해 기술에 공지되어 있다. 예를 들어, 옥수수 및 고등 식물에서 활성 GAs는 하기를 포함한다: GA1, GA3, GA4, 및 GA7. 따라서, "활성 GA-생산 조직"은 하나 이상의 활성 GAs를 생산하는 식물 조직이다.
관속 조직 프로모터로 식물의 활성 GA-생산 조직에서 GA20 옥시다제 유전자의 억제에 더하여, 다양한 항시성 프로모터로 동일한 GA20 옥시다제 유전자의 억제가, 이삭에서 임의의 가시적인 오프-유형 없이, 옥수수에서 짧은, 반왜성 신장 표현형을 또한 야기시킬 수 있다는 것이 놀랍게도 밝혀졌다. GA 경로에서 돌연변이가 생식 조직에서 오프-유형을 야기시키는 것으로 이전에 밝혀진 것을 감안하면, GA20 옥시다제의 구성적 억제가 이삭에서 유사한 생식 표현형을 야기시키지 않았다는 것은 놀라웠다. 따라서, 하나 이상의 GA20 옥시다제 유전자의 억제가 식물에서 임의의 상당한 또는 관측가능한 생식 오프-유형 없이 단간, 도복-저항성 옥수수 또는 곡물 식물을 창출하기 위해 항시성 프로모터를 사용하여 수행될 수 있다는 것이 추가로 제안된다. 다른 놀라운 관찰은 동일한 GA20 옥시다제 억제 작제물이 줄기, 잎 또는 생식 조직에서 발현되었던 경우 이루어졌다. 아래 추가로 기재된 바와 같이, 옥수수 식물의 줄기 또는 이삭 조직에서 동일한 GA20 옥시다제 유전자의 표적화된 억제는 단간, 반왜성 표현형을 야기시키지 않았다. 또한, 자성 생식 조직 (이삭) 프로모터로 옥수수 식물의 발달하는 이삭의 생식 조직에서 직접적으로 GA20 옥시다제 억제 작제물의 지향된 발현은 이삭에서 임의의 상당한 또는 관측가능한 오프-유형을 야기시키지 않았다. 그러나, 잎 조직에서 동일한 GA20 옥시다제 억제 작제물의 발현은 식물에서 상당한 또는 관측가능한 생식 오프-유형 없이 중간 정도 단간 표현형을 야기시키는데 충분하였다.
이론에 의한 제한됨 없이, 옥수수 및 다른 곡물 식물에서 단간, 반왜성 표현형이 식물의활성 GA-생산 조직(들)에서 특정 GA 옥시다제 유전자(들)을 표적화하는 억제 작제물의 충분한 발현 수준에서 비롯할 수 있다는 것이 제안된다. 적어도 옥수수에서 특정 GA20 옥시다제 유전자의 표적화된 억제를 위하여, 생식 이삭 조직을 회피하기 위한 발현의 패턴 제한은 발달하는 이삭에서 생식 오프-유형을 회피하기 위해 필요하지 않을 수 있다. 그러나, 저 수준에서, 및/또는 제한된 수의 식물 조직에서 GA20 옥시다제 억제 작제물의 발현은 상당한 단간, 반왜성 표현형을 야기시키는데 불충분할 수 있다. 표적화된 GA20 옥시다제 억제를 가진 관측된 반왜성 표현형이 식물의 줄기 마디간 단축의 결과인 것을 감안하면, 적어도 일부 줄기 조직에서 GA20 옥시다제 유전자의 억제가 마디간의 단축 및 감소된 식물 높이를 야기시키는데 충분하지 않았던 것은 놀랍다. 이론에 의한 구속됨 없이, 활성 GAs가 생산되는 식물의 조직(들) 및/또는 세포(들)에서, 그리고 반드시는 아니지만 줄기 또는 마디간 조직(들)에서 특정 GA 옥시다제 유전자(들)의 억제가, 단간 특성이 줄기 마디간의 단축에 기인하지 않을지라도, 반왜성 식물을 생산하는데 충분할 수 있다는 것이 제안된다. GAs가 식물의 맥관구조를 통해 이동할 수 있다는 점을 감안하면, 활성 GAs가 생산되는 식물 조직(들)에서 GA 옥시다제 유전자 조작이, 비-줄기 조직에서 (즉, 감소된 마디간 연신이 반왜성 표현형을 유발시키는 줄기에서 작용 부위에서 떨어져서) 생산된 활성 GAs의 수준 억제에 의해 이것이 크게 달성될 수 있을지라도, 단간, 반왜성 식물을 초래할 수 있다는 것이 제안된다. 사실상, 잎 조직에서 특정 GA20 옥시다제 유전자의 억제는 옥수수 식물에서 중간 정도 반왜성 표현형을 야기시킨다고 밝혀졌다. 몇 개의 상이한 "줄기" 프로모터로 GA20 옥시다제 억제 작제물의 발현이 옥수수에서 반왜성 표현형을 생산하지 못했다는 것을 감안하면, 관속 프로모터로 동일한 GA20 옥시다제 억제 작제물의 발현이 사건 및 생식질을 거쳐 고도의 침투로 반왜성 표현형의 일관된 생산에서 효과적이었다는 것이 주목할 만하다. 이 반왜성 표현형은 다른 관속 프로모터를 사용하여 동일한 GA20 옥시다제 억제 작제물의 발현으로 또한 관측되었다.
본 개시내용의 구현예에 따르면, 오프-유형이 실질적으로 또는 완전히 없는 적어도 하나의 자성 생식 기관 또는 이삭 그리고 적어도 하나의 유익한 작물학적 특성을 갖는 변형된 곡물 또는 옥수수 식물은 제공된다. 유익한 작물학적 특성은, 예를 들어, 더 짧은 식물 높이, 하나 이상의 마디간(들)에서 더 짧은 마디간 길이, 더 큰 (더 두꺼운) 줄기 또는 자루 직경, 증가된 도복 저항성, 향상된 가뭄 내성, 증가된 질소 사용 효율, 증가된 물 사용 효율, 더 깊은 뿌리, 더 큰 잎 면적, 더 이른 캐노피 폐쇄, 및/또는 증가된 수확가능한 수확량을 포함할 수 있다. 오프-유형은 웅성 (술 또는 꽃밥) 멸균, 감소된 알맹이 또는 종자 수, 및/또는 식물의 자성 장기 또는 이삭 (예를 들어, 꽃밥 귀)에서 하나 이상의 웅성화된 또는 웅성 (또는 웅성-유사) 생식 구조의 존재를 포함할 수 있다. 식물의 생식 조직에서 상당한 오프-유형이 부족한 변형된 곡물 또는 옥수수 식물이 본 명세서에서 제공된다. 그와 같은 변형된 곡물 또는 옥수수 식물은 대조군 또는 야생형 식물에 비하여 정상으로 보이는 자성 생식 기관 또는 이삭을 가질 수 있다. 사실상, 하나 이상의 자성 기관 또는 이삭에서 웅성 멸균, 감소된 알맹이 또는 종자 수, 및/또는 웅성화된 구조(들)을 포함하는 오프-유형을 갖지 않거나 나타내지 않거나, 또는 상기가 실질적으로 또는 완전히 없는 적어도 하나의 생식 기관 또는 이삭을 포함하는 변형된 곡물 또는 옥수수 식물이 제공된다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 식물, 예컨대 옥수수의 자성 장기 또는 이삭은 웅성 생식 구조가 후기 생식 단계에서 자성 장기 또는 이삭의 육안 검사에 기반하여 식물의 자성 장기 또는 이삭에서 부재이거나 거의 부재이면 웅성 생식 구조가 "실질적으로 없다". 식물, 예컨대 옥수수의 자성 장기 또는 이삭은 웅성 생식 구조가, 후기 생식 단계에서 자성 장기 또는 이삭의 육안 검사에 의해, 식물, 예컨대 옥수수 식물의 자성 장기 또는 이삭에서 부재이거나 관측되지 않았거나 관측가능하지 않았다면 성숙한 웅성 생식 구조가 "완전히 없다". 이삭에서 웅성 생식 구조가 실질적으로 없는 그리고 상당한 오프-유형 없이, 식물, 예컨대 옥수수의 자성 장기 또는 이삭은 야생형 또는 대조군 식물의 자성 장기 또는 이삭당 알맹이 또는 종자의 수의 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.6%, 적어도 99.7%, 적어도 99.8%, 또는 적어도 99.9%인 식물의 자성 장기 또는 이삭당 수많은 알맹이 또는 종자를 가질 수 있다. 마찬가지로, 이삭에서 웅성 생식 구조가 실질적으로 없는 그리고 상당한 오프-유형 없이, 식물, 예컨대 옥수수의 자성 장기 또는 이삭은 야생형 또는 대조군 식물의 자성 장기 또는 이삭당 평균 알맹이 또는 종자 중량의 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.6%, 적어도 99.7%, 적어도 99.8%, 또는 적어도 99.9%인 식물의 자성 장기 또는 이삭당 평균 알맹이 또는 종자 중량을 가질 수 있다. 성숙한 웅성 생식 구조가 완전히 없는 식물, 예컨대 옥수수의 자성 장기 또는 이삭은 야생형 또는 대조군 식물과 약 동일한 식물의 자성 장기 또는 이삭당 수많은 알맹이 또는 종자를 가질 수 있다. 환언하면, 식물의 자성 장기 또는 이삭의 생식 발달은 정상 또는 실질적으로 정상일 수 있다. 그러나, 자성 장기 또는 이삭당 종자 또는 알맹이의 수는 식물의 자원 이용 및 발달에 영향을 미치는 다른 인자에 의존할 수 있다. 사실상, 식물의 자성 장기 또는 이삭당 알맹이 또는 종자의 수, 및/또는 식물의 자성 장기 또는 이삭당 알맹이 또는 종자 중량은 야생형 또는 대조군 식물과 약 동일할 수 있거나 그 초과일 수 있다.
식물 호르몬 지베렐린은 발아, 세포 연신, 개화, 배아발생 및 종자 발달을 포함하는 수많은 식물 발달성 과정에서 중요한 역할을 한다. GA 경로에서 특정 생합성 효소 (예를 들어, GA20 옥시다제 및 GA3 옥시다제) 및 이화작용 효소 (예를 들어, GA2 옥시다제)는 식물 조직에서 활성 GA 수준 영향화에 중요하다. 따라서, 특정 GA20 옥시다제 유전자의 억제에 더하여, 구성적 또는 조직-특이적 또는 조직-바람직한 방식으로 GA3 옥시다제 유전자의 억제가 또한, 이삭에서 오프-유형 없이, 가능한 증가된 수확량으로, 단간 표현형 및 증가된 도복 저항성을 갖는 옥수수 식물을 생산할 수 있다는 것이 추가로 제안된다. 따라서, 일부 구현예에 따르면, 구성적 또는 조직-특이적 또는 조직-바람직한 프로모터, 예컨대 관속 또는 잎 프로모터에 작동가능하게 연결된 GA3 옥시다제 억제 요소 또는 서열을 포함하는 작제물 및 이식유전자가 제공된다. 일부 구현예에 따르면, 조직-특이적 또는 조직-바람직한 프로모터는 관속 프로모터, 예컨대 RTBV 프로모터이다. 그러나, 조직-특이적 또는 조직 바람직한 프로모터의 다른 유형은 상당한 오프-유형 없이 반왜성 표현형을 생산하기 위해 옥수수 또는 곡물 식물의 활성 GA-생산 조직에서 GA3 옥시다제 억제를 위하여 잠재적으로 사용될 수 있다.
당해 분야에 공지된 표적 유전자의 임의의 억제 방법은 안티센스 RNAs, 이중가닥 RNAs (dsRNAs) 또는 역전된 반복 RNA 서열의 발현을 포함하는, 또는 작은 간섭하는 RNAs (siRNAs), 짧은 헤어핀 RNAs (shRNAs), 트랜스-작용 siRNAs (ta-siRNAs), 또는 마이크로 RNAs (miRNAs)의 발현을 통한 공-억제 또는 RNA 간섭 (RNAi)를 통해 본 발명의 구현예에 따라 GA 옥시다제 유전자(들)을 억제시키는데 사용될 수 있다. 게다가, 유전자의 침묵화를 야기시키기 위해 GA 옥시다제 유전자 이내 또는 근처에서 코딩 및/또는 비-코딩 유전자 서열 또는 영역을 표적화하는 센스 및/또는 안티센스 RNA 분자가 사용될 수 있다. 따라서, 임의의 이들 방법은 조직-특이적 또는 조직-바람직한 방식으로 내인성 GA20 옥시다제 또는 GA3 옥시다제 유전자(들)의 표적화된 억제에 사용될 수 있다. 참고, 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2009/0070898, 2011/0296555, 및 2011/0035839, 이의 내용 및 개시내용은 본 명세서에 참고로 편입됨.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "억제"는, 식물 발생의 동일한 단계(들)에 야생형 또는 대조군 식물, 세포 또는 조직에서 그와 같은 표적 mRNA 및/또는 단백질의 발현 수준과 비교된 경우, 식물 발생의 하나 이상의 단계(들)에 식물, 식물 세포 또는 식물 조직에서 표적 유전자에 의해 인코딩된 mRNA 및/또는 단백질의 발현 수준의 저하, 감소 또는 제거를 지칭한다. 일부 구현예에 따르면, 대조군 식물과 비교된 경우, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100% 만큼 적어도 하나의 식물 조직에서 감소되는 GA20 옥시다제 유전자 발현 수준을 갖는 변형된 또는 이식유전자성 식물이 제공된다. 일부 구현예에 따르면, 대조군 식물과 비교된 경우, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100% 만큼 적어도 하나의 식물 조직에서 감소되는 GA3 옥시다제 유전자 발현 수준을 갖는 변형된 또는 이식유전자성 식물이 제공된다. 일부 구현예에 따르면, 대조군 식물과 비교된 경우, 5%-20%, 5%-25%, 5%-30%, 5%-40%, 5%-50%, 5%-60%, 5%-70%, 5%-75%, 5%-80%, 5%-90%, 5%-100%, 75%-100%, 50%-100%, 50%-90%, 50%-75%, 25%-75%, 30%-80%, 또는 10%-75% 만큼 적어도 하나의 식물 조직에서 감소되는 GA20 옥시다제 유전자 발현 수준을 갖는 변형된 또는 이식유전자성 식물이 제공된다. 일부 구현예에 따르면, 대조군 식물과 비교된 경우, 5%-20%, 5%-25%, 5%-30%, 5%-40%, 5%-50%, 5%-60%, 5%-70%, 5%-75%, 5%-80%, 5%-90%, 5%-100%, 75%-100%, 50%-100%, 50%-90%, 50%-75%, 25%-75%, 30%-80%, 또는 10%-75% 만큼 적어도 하나의 식물 조직에서 감소되는 GA3 옥시다제 유전자 발현 수준을 갖는 변형된 또는 이식유전자성 식물이 제공된다. 이들 구현예에 따르면, GA20 옥시다제 및/또는 GA3 옥시다제 유전자(들)의 감소된 발현 수준을 갖는 변형된 또는 이식유전자성 식물의 적어도 하나의 조직은, 발생의 하나 이상의 영양 단계(들) 동안, 식물의 하나 이상의 활성 GA 생산 조직(들), 예컨대 식물의 관속 및/또는 잎 조직(들)을 포함한다.
일부 구현예에서, 내인성 GA20 옥시다제 유전자 또는 GA3 옥시다제 유전자의 억제는 (예를 들어, 잎 및/또는 관속 조직에서만) 조직-특이적이다. GA20 옥시다제 유전자의 억제는 구성적 및/또는 관속 또는 잎 조직 특이적 또는 바람직할 수 있다. 다른 구현예에서, GA20 옥시다제 유전자 또는 GA3 옥시다제 유전자의 억제는 구성적이고 조직-특이적이지 않다. 일부 구현예에 따르면, 내인성 GA20 옥시다제 유전자 및/또는 GA3 옥시다제 유전자의 발현은 대조군 식물의 동일한 조직(들)과 비교된 경우 변형된 또는 이식유전자성 식물의 하나 이상의 조직 유형에서 (예를 들어, 잎 및/또는 관속 조직(들)에서) 감소된다.
본 개시내용의 구현예에 따르면, 식물-발현성 구성적 또는 조직-특이적 또는 조직-바람직한 프로모터에 작동가능하게 연결되는 GA20 옥시다제 또는 GA3 옥시다제 유전자(들)을 표적화하는 억제 요소를 포함하는 재조합 DNA 분자, 작제물 또는 벡터가 제공된다. 억제 요소는 적어도 19 뉴클레오타이드, 예컨대 약 19 뉴클레오타이드 내지 약 27 뉴클레오타이드, 또는 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 27 뉴클레오타이드의 전사가능한 DNA 서열을 포함할 수 있고, 여기서 상기 전사가능한 DNA 서열은 억제되어야 하는 상기 표적 GA 옥시다제 유전자의 적어도 일부분에, 및/또는 거기에 상보적인 DNA 서열에 상응한다. 억제 요소는 19-30, 19-50, 19-100, 19-200, 19-300, 19-500, 19-1000, 19-1500, 19-2000, 19-3000, 19-4000, 또는 19-5000 개의 뉴클레오타이드일 수 있다. 억제 요소는 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 또는 적어도 23 뉴클레오타이드 또는 그 초과 길이 (예를 들어, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 50, 적어도 100, 적어도 200, 적어도 300, 적어도 500, 적어도 1000, 적어도 1500, 적어도 2000, 적어도 3000, 적어도 4000, 또는 적어도 5000 뉴클레오타이드)일 수 있다. 억제 요소의 길이 및 서열에 따라, 하나 이상의 서열 미스매치 또는 비-상보적 염기, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 그 초과 미스매치는 억제 요소에 의해 인코딩된 비-코딩 RNA 분자가 GA20 옥시다제 또는 GA3 옥시다제 유전자(들)의 상기 표적 mRNA 분자에 여전히 결합 및 충분히 하이브리드화할 수 있다면 억제의 손실 없이 용인될 수 있다. 사실상, 약 19 뉴클레오타이드 내지 약 27 뉴클레오타이드 범위의 심지어 더 짧은 RNAi 억제 요소는 하나 이상의 미스매치 또는 비-상보적 염기를 가질 수 있지만, 표적 GA 옥시다제 유전자 억제에서 여전히 효과적일 수 있다. 따라서, 센스 또는 안티-센스 억제 요소 서열은 표적화된 GA 옥시다제 유전자의 적어도 한 분절 또는 부분의 상응하는 서열, 또는 그것의 상보적 서열, 각각에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100% 동일할 수 있다.
GA 옥시다제 유전자(들)의 표적화된 억제를 위하여 본 발명의 억제 요소 또는 전사가능한 DNA 서열은 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다: (a) 표적화된 GA 옥시다제 유전자의 적어도 하나의 분절 또는 부분에 안티-센스 또는 상보적인 적어도 하나의 안티-센스 DNA 서열을 포함하는 DNA 서열; (b) 표적화된 GA 옥시다제 유전자의 적어도 하나의 분절 또는 부분에 안티-센스 또는 상보적인 적어도 하나의 안티-센스 DNA 서열의 다중 카피를 포함하는 DNA 서열; (c) 표적화된 GA 옥시다제 유전자의 적어도 하나의 분절 또는 부분을 포함하는 적어도 하나의 센스 DNA 서열을 포함하는 DNA 서열; (d) 표적화된 GA 옥시다제 유전자의 적어도 하나의 분절 또는 부분을 각각 포함하는 적어도 하나의 센스 DNA 서열의 다중 카피를 포함하는 DNA 서열; (e) 이중-가닥 RNA 형성에 의해 표적화된 GA 옥시다제 유전자 억제를 위하여 RNA 속에 전사하고/하거나 표적화된 GA 옥시다제 유전자의 한 분절 또는 부분의 역전된 반복부를 포함하는 DNA 서열, 여기서 상기 전사된 RNA는 표적화된 GA 옥시다제 유전자의 적어도 하나의 분절 또는 부분을 포함하는 적어도 하나의 센스 DNA 서열 및 표적화된 GA 옥시다제 유전자의 적어도 하나의 분절 또는 부분에 안티-센스 또는 상보적인 적어도 하나의 안티-센스 DNA 서열을 포함함; (f) 단일 이중-가닥 RNA 형성에 의해 표적화된 GA 옥시다제 유전자 억제를 위하여 RNA 속에 전사되는 그리고 표적화된 GA 옥시다제 유전자의 적어도 하나의 분절 또는 부분을 각각 포함하는 다중 연속 센스 DNA 서열 및 표적화된 GA 옥시다제 유전자의 적어도 하나의 분절 또는 부분에 각각 안티-센스 또는 상보적인 다중 연속 안티-센스 DNA 서열을 포함하는 DNA 서열; (g) RNA의 다중 이중 가닥 형성에 의해 표적화된 GA 옥시다제 유전자 억제를 위하여 RNA 속에 전사되는 그리고 표적화된 GA 옥시다제 유전자의 적어도 하나의 분절 또는 부분에 각각 안티-센스 또는 상보적인 다중 안티-센스 DNA 서열 및 표적화된 GA 옥시다제 유전자의 적어도 하나의 분절 또는 부분을 각각 포함하는 다중 센스 DNA 서열을 포함하는 DNA 서열, 여기서 상기 다중 안티-센스 DNA 분절 및 다중 센스 DNA 분절은 일련의 역전된 반복부로 배열됨; (h) miRNA, 바람직하게는 식물 miRNA로부터 유래된 뉴클레오타이드를 포함하는 DNA 서열; (i) 표적화된 GA 옥시다제 유전자의 적어도 하나의 분절 또는 부분에 상보적인 인공 miRNA를 인코딩하는 miRNA 전구체를 포함하는 DNA 서열; (j) siRNA의 뉴클레오타이드를 포함하는 DNA 서열; (k) 리간드에 결합할 수 있는 RNA 압타머 속에 전사되는 DNA 서열; 및 (l) 표적화된 GA 옥시다제 유전자의 발현을 조절할 수 있는 조절 RNA 속에 전사하는 DNA 및 리간드에 결합할 수 있는 RNA 압타머 속에 전사되는 DNA 서열, 여기서 상기 표적화된 GA 옥시다제 유전자의 조절은 조절 RNA의 형태에 의존적이고, 조절 RNA의 형태는 리간드에 의해 RNA 압타머의 결합 상태에 의해 다른자리입체적으로 영향받음. 단일가닥 또는 이중-가닥 RNA에 의해 전사되는 간에, 임의의 이들 유전자 억제 요소는, 억제 요소(들)의 수 및 서열에 의존하여, 1 초과 GA 옥시다제 표적 유전자를 억제시키도록 설계될 수 있다.
1 초과 GA 옥시다제 표적에 대한 다중 센스 및/또는 안티-센스 억제 요소는 연속으로 나란히 배열될 수 있거나, 또는 하나 이상의 스페이서 서열(들)에 의해 또한 차단될 수 있는, 탠덤 분절 또는 반복부, 예컨대 탠덤 역전된 반복부로 배열될 수 있고, 각각의 억제 요소의 서열은 하나 이상의 GA 옥시다제 유전자(들)을 표적화할 수 있다. 게다가, 억제 요소의 센스 또는 안티-센스 서열은, 억제 요소의 서열 및 길이에 의존하여, 표적화된 GA 옥시다제 유전자 서열에 상보적 또는 완벽하게 매칭될 수 없다. 약 19 뉴클레오타이드 내지 약 27 뉴클레오타이드의 심지어 더 짧은 RNAi 억제 요소는 하나 이상의 미스매치 또는 비-상보적 염기를 가질 수 있지만, 상기 표적 GA 옥시다제 유전자 억제에 여전히 효과적일 수 있다. 따라서, 센스 또는 안티-센스 억제 요소 서열은 표적화된 GA 옥시다제 유전자의 적어도 한 분절 또는 부분의 상응하는 서열, 또는 그것의 상보적 서열, 각각에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100% 동일할 수 있다.
안티-센스 억제를 위하여, 전사가능한 DNA 서열 또는 억제 요소는 표적화된 GA 옥시다제 유전자의 적어도 일부분 또는 분절에 안티-센스 또는 상보적인 서열을 포함한다. 상기 억제 요소는 표적화된 GA 옥시다제 유전자(들)의 하나 이상의 부분 또는 분절에 상보적인 다중 안티-센스 서열, 또는 표적화된 GA 옥시다제 유전자에 상보적인 안티-센스 서열의 다중 카피를 포함할 수 있다. 안티-센스 억제 요소 서열은 표적화된 GA 옥시다제 유전자의 적어도 한 분절 또는 부분에 상보적인 DNA 서열에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100% 동일할 수 있다. 환언하면, 안티-센스 억제 요소 서열은 표적화된 GA 옥시다제 유전자에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100% 상보적일 수 있다.
역전된 반복부 또는 전사된 dsRNA를 사용하는 GA 옥시다제 유전자(들)의 억제를 위하여, 전사가능한 DNA 서열 또는 억제 요소는 표적화된 GA 옥시다제 유전자의 한 분절 또는 부분에 상보적인 안티-센스 서열 및 표적화된 GA 옥시다제 유전자의 한 분절 또는 부분을 포함하는 센스 서열을 포함할 수 있고, 여기서 상기 센스 및 안티-센스 DNA 서열은 나란히 배열된다. 센스 및/또는 안티-센스 서열은, 각각, 상기에 기재된 바와 같이 표적화된 GA 옥시다제 유전자의 한 분절 또는 부분에 100% 미만 동일할 수 있거나 상보적일 수 있다. 센스 및 안티-센스 서열은 스페이서 서열에 의해 분리될 수 있고, 이로써 억제 요소로부터 전사된 RNA 분자는 센스 및 안티-센스 서열 사이 줄기, 루프 또는 줄기-루프 구조를 형성한다. 억제 요소는 대신에, 하나 이상의 스페이서 서열에 의해 또한 분리될 수 있는, 나란히 배열되는 다중 센스 및 안티-센스 서열을 포함할 수 있다. 다중 센스 및 안티-센스 서열을 포함하는 그와 같은 억제 요소는 일련의 센스 서열 이어서 일련의 안티-센스 서열로서, 또는 일련의 나란히 배열된 센스 및 안티-센스 서열로서 배열될 수 있다. 대안적으로, 하나 이상의 센스 DNA 서열은 하나 이상의 안티-센스 서열로부터 별도로 발현될 수 있다 (즉, 하나 이상의 센스 DNA 서열은 제1 전사가능한 DNA 서열로부터 발현될 수 있고, 하나 이상의 안티-센스 DNA 서열은 제2 전사가능한 DNA 서열로부터 발현될 수 있고, 여기서 상기 제1 및 제2 전사가능한 DNA 서열은 별개의 전사체로서 발현된다).
마이크로RNA (miRNA)를 사용하는 GA 옥시다제 유전자(들)의 억제를 위하여, 전사가능한 DNA 서열 또는 억제 요소는 바이러스 또는 진핵생물, 예컨대 동물 또는 식물에 고유한 miRNA 서열로부터 유래된, 또는 그와 같은 고유 miRNA 서열로부터 변형된 또는 유래된 DNA 서열을 포함할 수 있다. 그와 같은 고유 또는 고유-유래된 miRNA 서열은 폴드 백 구조를 형성할 수 있고 전구체 miRNA (pre-miRNA)용 스캐폴드로서 제공할 수 있고, 고유 miRNA 전구체 서열의, 예컨대 고유 (또는 고유-유래된) 1차-miRNA (pri-miRNA) 또는 pre-miRNA 서열로부터 줄기 영역에 상응할 수 있다. 그러나, 이들 고유 또는 고유-유래된 miRNA 스캐폴드 또는 사전가공된 서열에 더하여, 본 구현예의 조작된 또는 합성 miRNAs는 표적화된 GA 옥시다제 유전자(들)의 한 분절 또는 부분에 상응하는 서열을 추가로 포함한다. 따라서, 사전-가공된 또는 스캐폴드 miRNA 서열에 더하여, 하나 이상의 서열 미스매치가 용인될 수 있어도, 억제 요소는 표적화된 GA 옥시다제 유전자의 한 분절 또는 부분에 상응하는 센스 및/또는 안티-센스 서열, 및/또는 거기에 상보적인 서열을 추가로 포함할 수 있다.
조작된 miRNAs는 증가된 특이성으로 표적화된 유전자 억제에 유용하다. 참고, 예를 들어, Parizotto 등, Genes Dev. 18:2237-2242 (2004), 및 미국 특허 출원 공개 번호 2004/0053411, 2004/0268441, 2005/0144669, 및 2005/0037988, 이의 내용 및 개시내용은 본 명세서에 참고로 편입됨. miRNAs는 비-단백질 코딩 RNAs이다. miRNA 전구체 분자가 절단되는 경우, 전형적으로 약 19 내지 약 25 뉴클레오타이드 (통상적으로 식물에서 약 20 내지 약 24 뉴클레오타이드), 예컨대 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 뉴클레오타이드인, 그리고 억제를 위하여 표적화된 유전자 및/또는 그것의 보체에 상응하는 서열을 갖는 성숙한 miRNA가 형성된다. 성숙한 miRNA는 mRNA 전사체를 표적화하기 위해 하이브리드화하고 표적 전사체에 단백질의 복합체의 결합을 가이드하여, 이는 전사체의 번역을 개시 및/또는 열화를 초래하는 기능을 할 수 있고, 따라서 표적화된 유전자의 발현을 부정적으로 조절 또는 억제시킨다. miRNA 전구체는, 표적 유전자의 억제를 야기시키기 위해 RNA-의존적 RNA 중합효소를 필요로 하는 과정에서, siRNAs, 트랜스-작용 siRNAs (ta-siRNAs)의 동상 생산 유도용 식물에서 또한 유용하다. 참고, 예를 들어, Allen 등, Cell 121:207-221 (2005), Vaucheret Science STKE, 2005:pe43 (2005), 및 Yoshikawa 등. Genes Dev., 19:2164-2175 (2005), 이의 내용 및 개시내용은 본 명세서에 참고로 편입됨.
식물 miRNAs는 표적 mRNA 전사체에서 상보적 또는 거의-완벽하게 상보적 서열 (miRNA 인식 부위)에 결합 및 인식, 이어서 RNase III 효소, 예컨대 ARGONAUTE1에 의한 전사체의 절단에 의해 그것의 표적 유전자를 조절한다. 식물에서, 주어진 miRNA 인식 부위와 상응하는 성숙한 miRNA 사이 특정 미스매치는 전형적으로 용인되지 않은, 특히 성숙한 miRNA의 위치 10 및 11에서 불인치된 뉴클레오타이드이다. 성숙한 miRNA 이내 위치는 5'에서 3' 방향으로 주어진다. 주어진 miRNA 인식 부위와 상응하는 성숙한 miRNA 사이 완벽한 상보성은 성숙한 miRNA의 위치 10 및 11에서 일반적으로 요구된다. 참고, 예를 들어, Franco-Zorrilla 등. (2007) Nature Genetics, 39:1033-1037; 및 Axtell 등. (2006) Cell, 127:565-577.
많은 마이크로RNA 유전자 (MIR 유전자)는 확인되고 데이터베이스 ("miRBase", microrna.sanger.ac.uk/sequences에서 온라인으로 이용가능; 또한 참고 Griffiths-Jones 등. (2003) Nucleic Acids Res., 31:439-441)에서 공공연하게 이용가능하게 되었다. MIR 유전자는 모두 단리된 유전자간 영역에서, 그리고 게놈내 클러스터에서 발생한다고 보고되어 왔지만, 또한 다른 유전자의 인트론 (양쪽 단백질-코딩 및 비-단백질-코딩) 이내 전적으로 또는 부분적으로 위치할 수 있다. miRNA 생합성의 검토를 위하여, 참고 Kim (2005) Nature Rev. Mol. Cell. Biol., 6:376-385. MIR 유전자의 전사는, 적어도 일부 경우에, MIR 유전자의 자체 프로모터의 선전용 대조군 하일 수 있다. 일차 전사체, 일명 "pri-miRNA"는 상당히 클 (수 킬로베이스)일 수 있고, 하나 이상의 pre-miRNAs (성숙한 miRNA에 가공되는 줄기-루프 배열을 함유하는 폴드-백 구조) 뿐만 아니라 mRNA의 일반 5' "캡" 및 폴리아데닐화된 꼬리를 함유하는, 다시트론성일 수 있다. 참고, 예를 들어, Kim (2005) Nature Rev. Mol. Cell. Biol., 6:376-385에서 도 1.
(자연 발생 서열 또는 인공 서열이든) miRNAs의 이식유전자성 발현은 miRNA의 표적 유전자 또는 유전자들의 발현을 조절하는데 이용될 수 있다. miRNAs의 인식 부위는, 5' 미번역된 영역, 코딩 영역, 인트론 영역, 및 3' 미번역된 영역을 포함하는, mRNA의 모든 영역에서 입증되어 왔고, 코딩 서열에 비하여 miRNA 표적 또는 인식 부위의 위치가 억제에 반드시 영향을 미칠 수 있는 것이 아님을 나타낸다 (참고, 예를 들어, Jones-Rhoades and Bartel (2004). Mol. Cell, 14:787-799, Rhoades 등. (2002) Cell, 110:513-520, Allen 등. (2004) Nat. Genet., 36:1282-1290, Sunkar and Zhu (2004) Plant Cell, 16:2001-2019). miRNAs는 진핵생물에서 중요한 조절 인자이고, miRNAs로 이식유전자성 억제는 생물학적 경로 및 반응 조작에 유용한 도구이다. 고유 miRNAs, 그것의 전구체, 인식 부위, 및 프로모터의 설명은 미국 특허 출원 공개 번호 2006/0200878에서 제공되고, 이의 내용 및 개시내용은 본 명세서에 참고로 편입된다.
인공 miRNA 서열 설계는, 예를 들어, Zeng 등. (2002) Mol. Cell, 9:1327-1333에 의해 실증된 바와 같이, 의도된 표적에 상보적인 서열로 miRNA 전구체의 줄기 영역에서 뉴클레오타이드 치환에 의해 달성될 수 있다. 많은 구현예에 따르면, 상기 표적은 GA20 옥시다제 유전자 또는 GA3 옥시다제 유전자의 서열일 수 있다. 관심의 표적을 위하여 조작된 miRNA 전구체를 생산하기 위해 고유 miRNA 서열에서 뉴클레오타이드 변화 결정을 위한 일반적인 방법의 하나의 비-제한적인 예는 하기 단계를 포함한다: (a) 예를 들어, 서열 정렬 도구 예컨대 BLAST (참고, 예를 들어, Altschul 등. (1990) J. Mol. Biol., 215:403-410; Altschul 등. (1997) Nucleic Acids Res., 25:3389-3402) 사용에 의해, 표적 유전자에 특이적인 적어도 18 뉴클레오타이드의 특유의 표적 서열을 선택하는 단계; cDNA 및/또는 게놈 DNA 서열은 관련없는 유전자에 임의의 잠재적인 매치 및 표적 전사체 오쏘로그를 확인하는데 사용할 수 있어서, 그렇게 함으로써 비-표적 서열의 비의도적인 침묵화 또는 억제를 회피함; (b) 바람직하지 않은 서열에 대하여 표적 유전자 (예를 들어, 비-표적 종으로부터 서열에 대한 매치), 그리고 GC 함량에 대하여 스코어 각각의 잠재 표적 서열, 레이놀즈 스코어 (참고 Reynolds 등. (2004) Nature Biotechnol., 22:326-330), 및 자유 에너지에서 음성 차이 ("△△G")를 특징으로 하는 기능적 비대칭 (참고 Khvorova 등. (2003) Cell, 115:209-216)을 분석하는 단계. 바람직하게는, 모든 또는 대부분의 하기 특징을 갖는 표적 서열 (예를 들어, 19-mers)는 선택될 수 있다: (1) 레이놀즈 스코어 > 4, (2) GC 함량 약 40% 내지 약 60%, (3) 음성 △△G, (4) 말단 아데노신, (5) 동일한 뉴클레오타이드의 4 이상의 연속적인 실행의 부족; (6) 표적 유전자의 3' 말단 근처에서 위치; (7) miRNA 전구체 전사체로부터 최소 차이. 일 양태에서, 표적 유전자 (예를 들어, GA20 또는 GA3 옥시다제 유전자)를 억제시키기 위해 본 명세서에서 사용된 비-코딩 RNA 분자는 전술한 특징의 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 또는 5 이상을 나타내는 표적 서열을 갖도록 설계된다. 억제 요소의 모든 제3 뉴클레오타이드에서 위치는 RNAi 효능 영향에서 중요할 수 있고; 예를 들어, 알고리즘, "siExplorer"는 rna.chem.t.u-tokyo.ac.jp/siexplorer.htm에서 공공연하게 이용가능하다 (참고 Katoh and Suzuki (2007) Nucleic Acids Res., 10.1093/nar/gkl1120); (c) 변형된 성숙한 miRNA 제조에서 사용하기 위해 선택된 표적 서열 (예를 들어, 19-mer)의 역 보체를 결정하는 단계. 19-mer 서열에 비하여, 위치 20에서 추가의 뉴클레오타이드는 선택된 표적 또는 인식 서열에 매칭될 수 있고, 위치 21에서 뉴클레오타이드는 표적 전사체에서 침묵화의 확산을 방지하기 위해 짝짓기되지 않도록 또는 표적 전사체에서 침묵화의 확산을 촉진시키기 위해 표적 서열에 짝짓기되도록 선택될 수 있음; 그리고 (d) 인공 miRNA를 식물에 형질전환시키는 단계.
본 개시내용의 구현예에 따르면, GA 옥시다제 유전자(들)의 표적화된 억제를 위하여 miRNA 또는 전구체 miRNA 분자를 인코딩하는 전사가능한 DNA 서열 또는 억제 요소를 포함하는 재조합 DNA 분자, 작제물 또는 벡터가 제공된다. 하나 이상의 서열 미스매치 또는 비-염기짝짓기된 뉴클레오타이드가 용인될 수 있어도, 그와 같은 전사가능한 DNA 서열 및 억제 요소는 하나 이상의 GA 옥시다제 유전자(들)에 상응하는 적어도 19 뉴클레오타이드의 서열 및/또는 하나 이상의 GA 옥시다제 유전자(들)에 상보적인 서열을 포함할 수 있다.
GA 옥시다제 유전자(들)은 또한하나 이상의 작은 간섭하는 RNAs (siRNAs)를 사용하여 억제될 수 있다. siRNA 경로는 더 긴 이중-가닥 RNA 중간체 ("RNA 듀플렉스")의 작은 간섭하는 RNAs (siRNAs)로의 비-위상화된 절단을 포함한다. siRNAs의 크기 또는 길이는 약 19 내지 약 25 뉴클레오타이드 또는 염기쌍 범위이지만, siRNAs의 흔한 부류는 21 또는 24 염기쌍을 함유하는 것을 포함한다. 따라서, 전사가능한 DNA 서열 또는 억제 요소는 적어도 약 19 내지 약 25 뉴클레오타이드 (또는 초과) 길이, 예컨대 적어도 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 뉴클레오타이드인 RNA 분자를 인코딩할 수 있다. siRNA 억제를 위하여, GA 옥시다제 유전자(들)의 표적화된 억제용 siRNA 분자를 인코딩하는 전사가능한 DNA 서열 및 억제 요소를 포함하는 재조합 DNA 분자, 작제물 또는 벡터가 따라서 제공된다. 그와 같은 전사가능한 DNA 서열 및 억제 요소는 적어도 19 뉴클레오타이드일 수 있고 하나 이상의 GA 옥시다제 유전자(들)에 상응하는 서열, 및/또는 하나 이상의 GA 옥시다제 유전자(들)에 상보적인 서열을 가질 수 있다.
GA 옥시다제 유전자(들)은 또한 하나 이상의 트랜스-작용 작은 간섭하는 RNAs (ta-siRNAs)를 사용하여 억제될 수 있다. ta-siRNA 경로에서, miRNAs는 이중-가닥 RNA 전구체의 생산용 RNA-의존적 RNA 중합효소를 필요로 하는 과정에서 siRNA 일차 전사체의 동상 프로세싱을 안내하는 역할을 한다. ta-siRNAs는 이중-가닥 RNA의 생산, DCL4 및 RNA-의존적 RNA 중합효소 (RDR6)의 요건, 및 2-뉴클레오타이드 3' 돌출부로 완벽하게 매칭된 듀플렉스를 가진 다중 완벽하게 위상화된 ~21-nt 작은 RNAs의 생산을 개시하는 2차 구조, miRNA 표적 부위의 부족에 의해 정의된다 (참고 Allen 등. (2005) Cell, 121:207-221). ta-siRNAs의 크기 또는 길이는 약 20 내지 약 22 뉴클레오타이드 또는 염기쌍 범위이지만, 대부분 통상적으로 21 염기쌍이다. 따라서, 본 발명의 전사가능한 DNA 서열 또는 억제 요소는 적어도 약 20 내지 약 22 뉴클레오타이드, 예컨대 20, 21, 또는 22 뉴클레오타이드인 RNA 분자를 인코딩할 수 있다. ta-siRNA 억제를 위하여, GA 옥시다제 유전자(들)의 표적화된 억제용 ta-siRNA 분자를 인코딩하는 전사가능한 DNA 서열 또는 억제 요소를 포함하는 재조합 DNA 분자, 작제물 또는 벡터가 따라서 제공된다. 그와 같은 전사가능한 DNA 서열 및 억제 요소는 적어도 20 뉴클레오타이드일 수 있고 하나 이상의 GA 옥시다제 유전자(들)에 상응하는 서열 및/또는 하나 이상의 GA 옥시다제 유전자(들)에 상보적인 서열을 가질 수 있다. 적합한 ta-siRNA 스캐폴드의 작제 방법에 대하여, 참고, 예를 들어, 전체적으로 본 명세서에 참고로 편입되는, 미국 특허 번호 9,309,512.
본 발명의 구현예에 따르면, 식물 세포에서 표적 mRNA에 결합 또는 하이브리드화하는 비-코딩 RNA 분자를 인코딩하는 전사가능한 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자, 벡터 또는 작제물이 제공되고, 여기서 상기 표적 mRNA 분자는 GA20 또는 GA3 옥시다제 유전자를 인코딩하고, 그리고 여기서 상기 전사가능한 DNA 서열은 구성적 또는 조직-특이적 또는 조직-바람직한 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 성숙한 mRNA 서열 표적화에 더하여, 비-코딩 RNA 분자는 대신에 GA 옥시다제 유전자 또는 mRNA 전사체의 인트론 서열, 또는 코딩 및 비-코딩 서열을 중첩하는 GA 옥시다제 mRNA 서열을 표적화할 수 있다. 다른 구현예에 따르면, 식물 세포에서 표적 mRNA에 결합 또는 하이브리드화하는 성숙한 비-코딩 RNA 분자에 절단 또는 가공되는 비-코딩 RNA (전구체) 분자를 인코딩하는 전사가능한 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자, 벡터 또는 작제물이 제공되고, 여기서 상기 표적 mRNA 분자는 GA20 또는 GA3 옥시다제 단백질을 인코딩하고, 그리고 여기서 상기 전사가능한 DNA 서열은 구성적 또는 조직-특이적 또는 조직-바람직한 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 본 개시내용의 목적을 위하여, "비-코딩 RNA 분자"는 단백질을 인코딩하지 않는 RNA 분자이다. 비-코딩 RNA 분자의 비-제한적인 예는 마이크로RNA (miRNA), miRNA 전구체, 작은 간섭하는 RNA (siRNA), siRNA 전구체, 작은 RNA (18-26 nt 길이) 및 동일한 것을 인코딩하는 전구체, 이질염색성 siRNA (hc-siRNA), Piwi-상호작용 RNA (piRNA), 헤어핀 이중 가닥 RNA (헤어핀 dsRNA), 트랜스-작용 siRNA (ta-siRNA), 자연 발생 안티센스 siRNA (nat-siRNA), CRISPR RNA (crRNA), 추적자 RNA (tracrRNA), 가이드 RNA (gRNA), 및 단일-가이드 RNA (sgRNA)를 포함한다.
본 개시내용의 구현예에 따르면, GA20 옥시다제 또는 GA3 옥시다제 억제 요소의 발현을 위하여 적합한 조직-특이적 또는 조직 바람직한 프로모터는 옥수수 또는 곡물 식물의 적어도 관속 및/또는 잎 조직(들)에서, 또는 가능하게는 GA3 옥시다제의 경우에서 다른 조직에서 그것의 관련된 억제 요소 또는 서열의 발현을 구동 또는 야기시키는 그들 프로모터를 포함할 수 있다. 조직-특이적 또는 조직-바람직한 프로모터로 GA 옥시다제 억제 요소 또는 작제물의 발현은 또한 관속 및 잎 조직의 외부 곡물 또는 옥수수 식물의 다른 조직에서 발생할 수 있지만, 식물의 발달하는 생식 조직에서 (특히 자성 생식 기관 또는 이삭에서) 활성 GA 수준은 (야생형 또는 대조군 식물에 비하여) 바람직하게는 상당히 감소되지 않거나 영향을 받지 않아서, 이로써 자성 장기 또는 이삭의 발달은 이삭에서 오프-유형 및 수확량 잠재력에서 손실 없이 이식유전자성 식물에서 정상적으로 진행할 수 있다.
당업계에서 공지된 임의의 관속 프로모터는 조직-특이적 또는 조직-바람직한 프로모터로서 잠재적으로 사용될 수 있다. 관속 프로모터의 예는 RTBV 프로모터 (참고, 예를 들어, 서열번호: 65), 공지된 수크로스 합성효소 유전자 프로모터, 예컨대 옥수수 수크로스 합성효소-1 (Sus1 또는 Sh1) 프로모터 (참고, 예를 들어, 서열번호: 67), 옥수수 Sh1 유전자 상동기관 프로모터, 보리 수크로스 합성효소 프로모터 (Ss1) 프로모터, 쌀 수크로스 합성효소-1 (RSs1) 프로모터 (참고, 예를 들어, 서열번호: 68), 또는 쌀 수크로스 합성효소-2 (RSs2) 프로모터 (참고, 예를 들어, 서열번호: 69), 공지된 수크로스 수송체 유전자 프로모터, 예컨대 쌀 수크로스 수송체 프로모터 (SUT1) (참고, 예를 들어, 서열번호: 70), 또는 다양한 공지된 바이러스성 프로모터, 예컨대 코멜리나 옐로우 반상 바이러스 (CoYMV) 프로모터, 밀 왜소 제미니바이러스 (WDV) 큰 유전자간 영역 (LIR) 프로모터, 메이즈 줄무늬 제미니바이러스 (MSV) 코트 단백질 (CP) 프로모터, 또는 쌀 황색 스트라이프 1 (YS1)-유사 또는 OsYSL2 프로모터 (서열번호: 71), 및 발현의 유사한 패턴으로 임의의 전술한 프로모터, 예컨대 절단된 RTBV 프로모터 (참고, 예를 들어, 서열번호: 66)의 임의의 기능적 서열 부분 또는 절단을 포함한다.
당업계에서 공지된 임의의 잎 프로모터는 조직-특이적 또는 조직-바람직한 프로모터로서 잠재적으로 사용될 수 있다. 잎 프로모터의 예는 옥수수 피루베이트 포스페이트 디키나제 또는 PPDK 프로모터 (참고, 예를 들어, 서열번호: 72), 옥수수 푸룩토스 1,6 비스포스페이트 알돌라아제 또는 FDA 프로모터 (참고, 예를 들어, 서열번호: 73), 및 쌀 Nadh-Gogat 프로모터 (참고, 예를 들어, 서열번호: 74), 그리고 발현의 유사한 패턴으로 임의의 전술한 프로모터의 임의의 기능적 서열 부분 또는 절단을 포함한다. 외떡잎식물 식물 유전자로부터 잎 프로모터의 다른 예는 리불로스 바이포스페이트 카복실라제 (RuBisCO) 또는 RuBisCO 작은 하위단위 (RBCS) 프로모터, 클로로필 a/b 결합 단백질 유전자 프로모터, 포스포에놀피루베이트 카복실라제 (PEPC) 프로모터, 및 Myb 유전자 프로모터, 그리고 발현의 유사한 패턴으로 임의의 이들 프로모터의 임의의 기능적 서열 부분 또는 절단을 포함한다.
당업계에서 공지된 임의의 다른 관속 및/또는 잎 프로모터는 또한, 발현의 유사한 패턴을 갖는 동일 또는 상이한 식물 종 또는 바이러스로부터 관련된 유전자 (예를 들어, 수크로스 합성효소, 수크로스 수송체, 및 바이러스성 유전자 프로모터 서열)에서 프로모터 서열을 포함하여, 사용될 수 있다. 전술한 것 중 임의의 것에 고도의 상동성을 가진 프로모터 서열이 추가로 제공된다. 예를 들어, 관속 프로모터는 서열번호: 65, 66, 67, 68, 69, 70, 및 71 중 하나 이상, 임의의 기능적 서열 부분 또는 이의 절단, 및/또는 임의의 전술한 서열에 상보적인 임의의 서열에 적어도 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100% 동일한 DNA 서열을 포함할 수 있고; 잎 프로모터는, 예를 들어, 서열번호: 72, 73, 및 74 중 하나 이상, 임의의 기능적 서열 부분 또는 이의 절단, 및/또는 임의의 전술한 서열에 상보적인 임의의 서열에 적어도 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100% 동일한 DNA 서열을 포함할 수 있고; 그리고 항시성 프로모터는 서열번호: 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 및 83 중 하나 이상, 임의의 기능적 서열 부분 또는 이의 절단, 및/또는 임의의 전술한 서열에 상보적인 임의의 서열에 적어도 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100% 동일한 DNA 서열을 포함할 수 있다. 관속 및/또는 잎 프로모터의 예는 추가로 곡물 또는 옥수수 식물의 관속 및/또는 잎 조직(들)에서 발현의 패턴을 갖는 것으로 밝혀진 다른 공지된, 조작된 및/또는 나중에-확인된 프로모터 서열을 포함할 수 있다. 게다가, 임의의 공지된 또는 후기-확인된 항시성 프로모터는 또한 GA20 옥시다제 또는 GA3 옥시다제 억제 요소의 발현을 위하여 사용될 수 있다. 항시성 프로모터의 흔한 예는 아래에 제공된다.
당업계에서 이해되는 바와 같이, 용어 "프로모터"는 일반적으로 RNA 중합효소 결합 부위, 전사 개시 부위, 및/또는 TATA 박스를 함유하고 관련된 전사가능한 폴리뉴클레오타이드 서열 및/또는 유전자 (또는 이식유전자)의 전사 및 발현을 보조 또는 촉진시키는 DNA 서열을 지칭할 수 있다. 프로모터는 합성 또는 인공일 수 있고/있거나, 공지된 또는 자연 발생 프로모터 서열로부터 조작, 가변 또는 유래될 수 있다. 프로모터는 2 이상 이종성 서열의 조합을 포함하는 키메라성 프로모터일 수 있다. 본 발명의 프로모터는 따라서, 본 명세서에서 공지된 또는 제공된 다른 프로모터 서열(들)과 동일하지 않은, 조성에서 유사한 프로모터 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 프로모터는 프로모터에 작동가능하게 연결된 (이식유전자를 포함하는) 관련된 코딩 또는 전사가능한 서열 또는 유전자의 발현의 패턴에 관하여 다양한 기준, 예컨대 구성적, 발달성, 조직-특이적, 유도성, 등에 따라 분류될 수 있다. 식물의 모든 또는 거의 모든 조직에서 발현을 구동시키는 프로모터는 "구성적" 프로모터로 지칭된다. 그러나, "항시성 프로모터"로의 발현 수준은 상이한 조직 유형 및 세포를 거쳐 반드시 균일하지 않다. 발달의 특정 기간 또는 단계 동안 발현을 구동시키는 프로모터는 "발달성" 프로모터로 지칭된다. 다른 식물 조직에 비하여 식물의 특정 조직에서 증진된 발현을 구동시키는 프로모터는 "조직-증진된" 또는 "조직-바람직한" 프로모터로 지칭된다. 따라서, "조직-바람직한" 프로모터는, 식물의 다른 조직(들)에서 발현의 더 낮은 수준으로, 식물의 특정 조직(들)에서 상대적으로 더 높은 또는 우선적인 또는 우세한 발현을 야기시킨다. 다른 식물 조직에서 발현이 거의 없는, 식물의 특정 조직(들) 이내 발현시키는 프로모터는 "조직-특이적" 프로모터로 지칭된다. 조직-특이적 또는 조직-바람직한 프로모터는 또한, 그것의 관련된 전사가능한 DNA 서열 또는 억제 요소의 발현을 구동시킨다는 점에서 특정 또는 바람직한 조직(들)의 관점에서 정의될 수 있다. 예를 들어, 관속 조직에서 특정 발현을 야기시키는 프로모터는 "관속-특이적 프로모터"로 지칭될 수 있고, 반면에 관속 조직에서 우선적인 또는 우세한 발현을 야기시키는 프로모터는 "관속-바람직한 프로모터"로 지칭될 수 있다. 마찬가지로, 잎 조직에서 특정 발현을 야기시키는 프로모터는 "잎-특이적 프로모터"로 지칭될 수 있고, 반면에 잎 조직에서 우선적인 또는 우세한 발현을 야기시키는 프로모터는 "잎-바람직한 프로모터"로 지칭될 수 있다. "유도성" 프로모터는 환경 자극 예컨대 냉기, 가뭄 또는 빛, 또는 다른 자극, 예컨대 창상 또는 화학적 응용에 반응하여 전사를 개시하는 프로모터이다. 프로모터는 또한 그것의 기원, 예컨대 이종성, 상동성, 키메라성, 합성, 등의 관점에서 분류될 수 있다. "이종성" 프로모터는 그것의 관련된 전사가능한 서열, 코딩 서열, 또는 유전자 (또는 이식유전자)에 비하여 상이한 기원을 갖는, 및/또는, 상기에서 정의된 바와 같이, 형질전환되어야 하는 식물 종에서 자연 발생이 아닌 프로모터 서열이다.
곡물 식물에서 몇 개의 GA 옥시다제는 관련된 GA 옥시다제 유전자의 계열로 구성된다. 예를 들어, 옥수수는 GA20 옥시다제_1, GA20 옥시다제_2, GA20 옥시다제_3, GA20 옥시다제_4, GA20 옥시다제_5, GA20 옥시다제_6, GA20 옥시다제_7, GA20 옥시다제_8, 및 GA20 옥시다제_9를 포함하는 적어도 9 GA20 옥시다제 유전자의 계열을 갖는다. 그러나, 옥수수에서 단 2개의 GA3 옥시다제, GA3 옥시다제_1 및 GA3 옥시다제_2가 있다. 각각의 이들 GA20 옥시다제 유전자에 대하여 서열번호에 의한 단백질 서열 및 DNA는 표 1에서 제공되고, 각각의 이들 GA3 옥시다제 유전자에 대하여 서열번호에 의한 단백질 서열 및 DNA는 표 2에서 제공된다.
GA20 옥시다제_3의 게놈 DNA 서열은 서열번호: 34에서 제공되고, GA20 옥시다제_5의 게놈 DNA 서열은 서열번호: 35에서 제공된다. GA20 옥시다제_3 유전자에 대하여, 서열번호: 34는 GA20 옥시다제_3 5'-UTR의 업스트림 3000 뉴클레오타이드를 제공하고; 뉴클레오타이드 3001-3096은 5'-UTR에 상응하고; 뉴클레오타이드 3097-3665는 제1 엑손에 상응하고; 뉴클레오타이드 3666-3775는 제1 인트론에 상응하고; 뉴클레오타이드 3776-4097은 제2 엑손에 상응하고; 뉴클레오타이드 4098-5314는 제2 인트론에 상응하고; 뉴클레오타이드 5315-5584는 제3 엑손에 상응하고; 그리고 뉴클레오타이드 5585-5800은 3'-UTR에 상응한다. 서열번호: 34는 또한 3'-UTR의 말단의 다운스트림 3000 뉴클레오타이드 (뉴클레오타이드 5801-8800)을 제공한다. GA20 옥시다제_5 유전자에 대하여, 서열번호: 35는 GA20 옥시다제_5 개시 코돈의 업스트림 3000 뉴클레오타이드 (뉴클레오타이드 1-3000)을 제공하고; 뉴클레오타이드 3001-3791은 제1 엑손에 상응하고; 뉴클레오타이드 3792-3906은 제1 인트론에 상응하고; 뉴클레오타이드 3907-4475는 제2 엑손에 상응하고; 뉴클레오타이드 4476-5197은 제2 인트론에 상응하고; 뉴클레오타이드 5198-5473은 제3 엑손에 상응하고; 그리고 뉴클레오타이드 5474-5859는 3'-UTR에 상응한다. 서열번호: 35는 또한 3'-UTR의 말단의 다운스트림 3000 뉴클레오타이드 (뉴클레오타이드 5860-8859)를 제공한다.
GA3 옥시다제_1의 게놈 DNA 서열은 서열번호: 36에서 제공되고, GA3 옥시다제_2의 게놈 DNA 서열은 서열번호: 37에서 제공된다. GA3 옥시다제_1 유전자에 대하여, 서열번호: 36의 뉴클레오타이드 1-29는 5'-UTR에 상응하고; 서열번호: 36의 뉴클레오타이드 30-514는 제1 엑손에 상응하고; 서열번호: 36의 뉴클레오타이드 515-879는 제1 인트론에 상응하고; 서열번호: 36의 뉴클레오타이드 880-1038은 제2 엑손에 상응하고; 서열번호: 36의 뉴클레오타이드 1039-1158은 제2 인트론에 상응하고; 서열번호: 36의 뉴클레오타이드 1159-1663은 제3 엑손에 상응하고; 그리고 서열번호: 36의 뉴클레오타이드 1664-1788은 3'-UTR에 상응한다. GA3 옥시다제_2 유전자에 대하여, 서열번호: 37의 뉴클레오타이드 1-38은 5-UTR에 상응하고; 서열번호: 37의 뉴클레오타이드 39-532는 제1 엑손에 상응하고; 서열번호: 37의 뉴클레오타이드 533-692는 제1 인트론에 상응하고; 서열번호: 37의 뉴클레오타이드 693-851은 제2 엑손에 상응하고; 서열번호: 37의 뉴클레오타이드 852-982는 제2 인트론에 상응하고; 서열번호: 37의 뉴클레오타이드 983-1445는 제3 엑손에 상응하고; 그리고 서열번호: 37의 뉴클레오타이드 1446-1698은 3'-UTR에 상응한다.
GA20 옥시다제_3 및/또는 GA20 옥시다제_5 유전자(들), 또는 GA3 옥시다제_1 및/또는 GA3 옥시다제_2 유전자(들) 표적화로 표현형 관찰에 더하여, 억제를 위하여, 반왜성 표현형은 GA20 옥시다제_4 유전자의 억제로 또한 관측된다. GA20 옥시다제_4의 게놈 DNA 서열은 서열번호: 38에서 제공된다. GA 옥시다제_4 유전자에 대하여, 서열번호: 38은 5'-UTR의 업스트림 뉴클레오타이드 1-1416을 제공하고; 서열번호: 38의 뉴클레오타이드 1417-1543은 5'-UTR에 상응하고; 서열번호: 38의 뉴클레오타이드 1544-1995는 제1 엑손에 상응하고; 서열번호: 38의 뉴클레오타이드 1996-2083은 제1 인트론에 상응하고; 서열번호: 38의 뉴클레오타이드 2084-2411은 제2 엑손에 상응하고; 서열번호: 38의 뉴클레오타이드 2412-2516은 제2 인트론에 상응하고; 서열번호: 38의 뉴클레오타이드 2517-2852는 제3 엑손에 상응하고; 서열번호: 38의 뉴클레오타이드 2853-3066은 3'-UTR에 상응하고; 그리고 서열번호: 38의 뉴클레오타이드 3067-4465는 3'-UTR의 다운스트림 유전자 서열에 상응한다.
본 개시내용의 구현예에 따르면, 비-코딩 RNA 분자를 인코딩하는 전사가능한 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자, 벡터 또는 작제물이 제공되고, 여기서 상기 비-코딩 RNA 분자는 (i) 내인성 GA 옥시다제 유전자로부터 발현된 및/또는 (ii) 식물에서 내인성 GA 옥시다제 단백질을 인코딩하는 mRNA 분자의 적어도 한 분절 또는 부분에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인 서열을 포함하고, 여기서 상기 전사가능한 DNA 서열은 식물-발현성 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 그리고 여기서 상기 식물은 곡물 또는 옥수수 식물이다.
일부 구현예에 따르면, 비-코딩 RNA 분자는, 억제를 위하여, GA20 옥시다제 유전자(들), 예컨대 GA20 옥시다제_3 및/또는 GA20 옥시다제_5 유전자(들)을 표작화하고 서열번호: 7, 8, 13 및 14 중 하나 이상의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인 서열을 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 비-코딩 RNA 분자는 서열번호: 9 및 15 중 하나 또는 둘 모두에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 식물에서 내인성 GA20 옥시다제 단백질을 인코딩하는 mRNA 분자의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적이다. 추가 구현예에 따르면, 비-코딩 RNA 분자는 서열번호: 9 및 15 중 하나 또는 둘 모두에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 유사한 식물에서 내인성 GA20 옥시다제 단백질을 인코딩하는 mRNA 분자의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인 서열을 포함할 수 있다. (미번역된 또는 엑손 서열의 둘 중 하나 또는 모두를 포함하는) 성숙한 mRNA 서열 표적화에 더하여, 비-코딩 RNA 분자는 추가로 GA20 옥시다제 유전자 또는 전사체의 인트론 서열을 표적화할 수 있다.
일부 구현예에 따르면, 비-코딩 RNA 분자는 억제용 GA3 옥시다제 유전자(들)을 표적화하고 서열번호: 28, 29, 31 및 32 중 하나 이상의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인 서열을 포함한다. 다른 구현예에 따르면, 비-코딩 RNA 분자는 서열번호: 30 및 33 중 하나 또는 둘 모두에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 식물에서 내인성 GA3 옥시다제 단백질을 인코딩하는 mRNA 분자의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적이다. 추가 구현예에 따르면, 비-코딩 RNA 분자는 서열번호: 30 및 33 중 하나 또는 둘 모두에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 유사한 식물에서 내인성 GA3 옥시다제 단백질을 인코딩하는 mRNA 분자의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인 서열을 포함할 수 있다. (미번역된 또는 엑손 서열의 둘 중 하나 또는 모두를 포함하는) 성숙한 mRNA 서열 표적화에 더하여, 비-코딩 RNA 분자는 추가로 GA3 옥시다제 유전자 또는 전사체의 인트론 서열을 표적화할 수 있다.
일부 구현예에 따르면, 비-코딩 RNA 분자는 억제용 GA20 옥시다제_4 유전자를 표적화하고 서열번호: 10 및 11의 하나 또는 둘 모두의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인 서열을 포함한다. 다른 구현예에 따르면, 비-코딩 RNA 분자는 서열번호: 12의 하나 또는 둘 모두에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 식물에서 내인성 GA20 옥시다제 단백질을 인코딩하는 mRNA 분자의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적이다. 추가 구현예에 따르면, 비-코딩 RNA 분자는 서열번호: 12에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 유사한 식물에서 내인성 GA20 옥시다제 단백질을 인코딩하는 mRNA 분자의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인 서열을 포함할 수 있다. (미번역된 또는 엑손 서열의 둘 중 하나 또는 모두를 포함하는) 성숙한 mRNA 서열에 더하여, 비-코딩 RNA 분자는 추가로 GA20 옥시다제 유전자 또는 전사체의 인트론 서열을 표적화할 수 있다.
많은 구현예에 따르면, 재조합 DNA 분자, 벡터 또는 작제물의 전사가능한 DNA 서열에 의해 인코딩된 비-코딩 RNA 분자는 GA20 옥시다제 또는 GA3 옥시다제 유전자를 표적화하는 성숙한 miRNA 또는 siRNA를 형성하기 위해 식물 세포에서 가공 또는 절단되는 전구체 miRNA 또는 siRNA일 수 있다.
본 발명의 구현예에 따르면, GA 수준은 억제를 위하여 GA 옥시다제 계열 이내 유전자의 제한된 서브셋만을 표적화함으로써 곡물 또는 옥수수 식물의 자루 또는 줄기에서 감소될 수 있다. 이론에 의한 구속됨 없이, 억제를 위하여 GA 옥시다제 계열 이내 제한된 수의 유전자의 표적화가, GA 옥시다제 유전자 중에서 차별적인 발현, 그들 생식 조직에서 다른 GA 옥시다제 유전자(들)에 의한 억제된 GA 옥시다제 유전자(들)에 대한 충분한 보상, 및/또는 표적화된 GA 옥시다제 유전자(들)의 불완전한 억제로 인해 식물의 생식 또는 이삭 조직에서 오프-유형 없이, 이식유전자성 식물에서 단간 표현형 및 도복에 대한 저항을 생산할 수 있다는 것이 제안된다. 따라서, 오프-유형은 조직-특이적 또는 조직 바람직한 프로모터로 GA 옥시다제 유전자(들)의 발현 제한 또는 억제에 의해 회피될 수 있을 뿐만 아니라, 제한된 서브셋의 GA 옥시다제 유전자 (예를 들어, 제한된 수의 GA20 옥시다제 유전자)가 억제를 위하여 표적화될 수 있다는 것이 제안되고, 이로써 동일한 유전자 계열 이내 다른 GA 옥시다제 유전자 (예를 들어, 다른 GA20 옥시다제 유전자)는 그들 조직에서 억제된 GA 옥시다제 유전자(들)의 발현을 손실을 보상할 수 있다. 표적화된 GA 옥시다제 유전자(들)의 불완전한 억제는 또한 곡물 수확량에 부정적으로 영향을 줄 식물에서 오프-유형 또는 바람직하지 않은 특성, 예컨대 생식 오프-유형 또는 식물 높이의 과도한 단축을 회피하기 위해 하나 이상의 조직에서 표적화된 GA 옥시다제 유전자(들)의 충분한 발현 수준을 허용할 수 있다. 유전자에서 완전한 기능소실 돌연변이와 달리, 억제는 표적화된 유전자의 부분적인 활성이 지속하게 할 수 있다. 상이한 GA20 옥시다제 유전자가 식물에서 발현의 상이한 패턴을 갖기 때문에, 억제를 위하여 GA20 옥시다제 유전자의 제한된 서브셋은 곡물 식물에서 GA 돌연변이체와 이전에 관련된 오프-유형을 회피하면서 특정 특성의 변형을 허용할 수 있다. 환언하면, 옥수수 및 다른 곡물 수확물에서 GA 돌연변이체와 이전에 관련된 성장, 발달성 및 생식 특성 또는 오프-유형은 GA20 또는 GA3 옥시다제 유전자의 제한된 수 또는 서브셋만의 (즉, 하나 이상, 그러나 모두는 아님) 표적화에 의해 및/또는 표적화된 GA 옥시다제 유전자의 불완전한 억제에 의해 탈커플링될 수 있다. 식물 이내 억제를 위하여 하나 이상의 내인성 GA3 또는 GA20 옥시다제 유전자의 서브셋을 이식유전자성으로 표적화함으로써, (예를 들어, 항시성 프로모터로) 발현의 더욱 전반적 패턴은 식물에서 상당한 생식 오프-유형 및/또는 다른 바람직하지 않은 특성 없이, 심지어 생식 조직(들)에서 이식유전자성 작제물의 발현으로 반왜성 식물을 생산하는데 사용될 수 있다. 사실상, 관속, 잎 및/또는 항시성 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있는, 억제를 위하여 (상기 표 1에서 확인된) GA20 옥시다제_3 및/또는 GA20 옥시다제_5 유전자를 선택적으로 표적화하는 억제 요소 및 작제물이 본 명세서에서 제공된다.
GA20 옥시다제 유전자의 제한된 서브셋, 예컨대 GA20 옥시다제_3, GA20 옥시다제_4, 및/또는 GA20 옥시다제_5 유전자(들)을 단지 표적화하는, 또는 GA3 옥시다제_1 및/또는 GA3 옥시다제_2 유전자(들)을 표적화하는 억제 작제물로, 억제 요소의 발현의 패턴 제한은 다른 GA20 및/또는 GA3 옥시다제 유전자로부터 보상, 등으로 인해 자성 장기 또는 이삭에서 오프-유형의 회피 및 곡물 또는 옥수수 식물의 정상 생식 발달 수득에 덜 결정적일 수 있다. 따라서, 억제 작제물 및 요소의 발현, 예를 들어, 옥수수에서 GA20 옥시다제_3 및/또는 GA20 옥시다제_5 유전자(들), GA20 옥시다제_4 유전자, 및/또는 GA3 옥시다제_1 및/또는 GA3 옥시다제_2 유전자(들), 또는 다른 곡물 식물에서 유사한 유전자 및 동족체의 선택적으로 또는 우선적으로 표적화는, 예를 들어, 상기 도입된 RTBV 프로모터 (예를 들어, RTBV (서열번호: 65) 또는 절단된 RTBV (서열번호: 66) 서열을 포함하는 프로모터), 및 식물의 많은 또는 모든 관속 및/또는 잎 조직(들)을 포괄하는 조직에서 발현을 구동시키는 임의의 다른 프로모터를 포함할 수 있는, 구성적 및 조직-특이적 또는 조직-바람직한 프로모터, 예컨대 관속 또는 잎 프로모터를 포함하는 다양한 상이한 식물-발현성 프로모터 유형에 의해 유도될 수 있다. 충분히 고수준의 발현을 가진 임의의 공지된 또는 후기-확인된 항시성 프로모터는 또한 옥수수에서 GA20 및/또는 GA3 옥시다제 유전자의 서브셋, 특히 GA20 옥시다제_3 및/또는 GA20 옥시다제_5 유전자(들), GA20 옥시다제_4 유전자, 및/또는 GA3 옥시다제_1 및/또는 GA3 옥시다제_2 유전자(들), 또는 다른 곡물 식물에서 유사한 유전자 및 동족체를 표적화하는 억제 작제물의 발현을 위하여 사용될 수 있다.
외떡잎식물 식물, 예컨대 곡물 또는 옥수수 식물에서 사용될 수 있는 항시성 프로모터의 예는, 예를 들어, 하기를 포함한다: 다양한 액틴 유전자 프로모터, 예컨대 쌀 액틴 1 프로모터 (참고, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,641,876; 또한 하기를 참조한다: 서열번호: 75 또는 서열번호: 76) 및 쌀 액틴 2 프로모터 (참고, 예를 들어, 미국 특허 번호 6,429,357; 또한 하기를 참조한다: 예를 들어, 서열번호: 77 또는 서열번호: 78), CaMV 35S 또는 19S 프로모터 (참고, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,352,605; 또한 하기를 참조한다: 예를 들어, CaMV 35S에 대하여 서열번호: 79), 옥수수 유비퀴틴 프로모터 (참고, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,510,474), 율무 폴리유비퀴틴 프로모터 (참고, 예를 들어, 서열번호: 80), 쌀 또는 옥수수 Gos2 프로모터 (참고, 예를 들어, Pater 등, The Plant Journal, 2(6): 837-44 1992; 또한 하기를 참조한다: 예를 들어, 쌀 Gos2 프로모터에 대하여 서열번호: 81), FMV 35S 프로모터 (참고, 예를 들어, 미국 특허 번호 6,372,211), 이중 증진된 CMV 프로모터 (참고, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,322,938), MMV 프로모터 (참고, 예를 들어, 미국 특허 번호 6,420,547; 또한 하기를 참조한다: 예를 들어, 서열번호: 82), PCLSV 프로모터 (참고, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,850,019; 또한 하기를 참조한다: 예를 들어, 서열번호: 83), Emu 프로모터 (참고, 예를 들어, Last 등, Theor. Appl. Genet. 81:581 (1991); 및 Mcelroy 등, Mol. Gen. Genet. 231:150 (1991)), 옥수수, 쌀 또는 다른 종으로부터 튜불린 프로모터, 노팔라인 합성효소 (nos) 프로모터, 옥토핀 합성효소 (ocs) 프로모터, 만노핀 합성효소 (mas) 프로모터, 또는 식물성 알코올 탈수소효소 (예를 들어, 메이즈 Adh1) 프로모터, 곡물 또는 옥수수 식물에서 구성적 발현을 제공하기 위해 당업계에서 공지된 또는 후기-확인된 바이러스성 프로모터를 포함하는 임의의 다른 프로모터, 외떡잎식물 또는 곡물 식물에서 사용될 수 있는 당업계에서 공지된 임의의 다른 항시성 프로모터, 및 임의의 전술한 프로모터의 임의의 기능적 서열 부분 또는 절단.
억제용 GA 옥시다제 유전자를 표적화하는 비-코딩 RNA 분자를 인코딩하는 전사가능한 DNA 서열의 충분한 발현 수준은, 더 낮은 발현 수준이 상당한 표현형을 야기시키기에 충분한 정도로 식물에서 활성 GA 수준을 저하시키는데 불충분할 수 있기 때문에, 도복을 저항하는 단간, 반왜성 표현형을 생산하는데 필요할 수 있다. 따라서, 식물의 활성 GA-생산 조직(들)에서 그것의 관련된 전사가능한 DNA 서열의 중간 정도 또는 강한 발현 수준 등을 구동시키는 조직-특이적 및 조직-바람직한 프로모터는 바람직할 수 있다. 게다가, 그와 같은 조직-특이적 및 조직-바람직한은 식물이 하기 영양 단계(들): VE, V1, V2, V3, V4, V5, V6, V7, V8, V9, V10, V11, V12, V13, V14, Vn, VT 중 하나 이상을 성장 및/또는 연신하는 경우 식물 발생의 하나 이상의 영양 단계(들) 동안 그것의 관련된 전사가능한 DNA 서열의 발현, 예컨대 적어도 V3-V12, V4-V12, V5-V12, V6-V12, V7-V12, V8-V12, V3-V14, V5-V14, V6-V14, V7-V14, V8-V14, V9-V14, V10-V14, 등 동안, 또는 식물의 성장 및/또는 연신이 발생하는 경우 영양 단계의 임의의 다른 범위 동안 발현을 구동시킬 수 있다.
많은 구현예에 따르면, 식물-발현성 프로모터는 바람직하게는 식물의 관속 및/또는 잎 조직의 적어도 일부분에서 또는 구성적으로 발현을 구동시킬 수 있다. 옥수수에서 내인성 GA20 옥시다제_3 및/또는 GA20 옥시다제_5 유전자(들), GA20 옥시다제_4 유전자, the GA3 옥시다제_1 및/또는 GA3 옥시다제_2 유전자(들), 또는 다른 곡물 식물에서 유사한 유전자 및 동족체를 표적화하는 억제 요소의 발현을 구동시키는 상이한 프로모터는 식물에서 발현의 강도 및 그것의 특정 패턴에 따라 다양한 정도로 도복 저항성 증가 및 식물 높이 감소에서 효과적일 수 있다. 그러나, 식물에서 GA20 또는 GA3 옥시다제 억제 요소의 발현을 구동시키는 일부 조직-특이적 및 조직-바람직한 프로모터는 식물 발생 동안 프로모터의 발현의 공간적-일시적 패턴, 및/또는 너무 낮거나 약한 프로모터의 발현의 양 또는 강도로 인해 상당한 단간 또는 항-도복 표현형을 생산할 수 없다. 게다가, 일부 억제 작제물은 식물에서 발현된 경우 표적화된 GA20 또는 GA3 옥시다제 유전자(들)의 발현을 단지 감소시킬 수 있고 제거할 수 없으며, 따라서 주어진 프로모터로 발현의 패턴 및 강도에 따라, 그와 같은 프로모터로 GA20 또는 GA3 옥시다제 억제 작제물의 패턴 및 발현 수준은 식물에서 관측가능한 식물 높이 및 도복 저항성 표현형을 생산하는데 충분하지 않을 수 있다.
본 구현예에 따르면, 비-코딩 RNA 분자를 인코딩하는 전사가능한 DNA 서열을 포함하는, 식물에서 하나 이상의 내인성 GA20 또는 GA3 옥시다제 유전자(들)의 억제용 재조합 DNA 분자, 벡터 또는 작제물이 제공되고, 여기서 상기 비-코딩 RNA 분자는 식물에서 내인성 GA 옥시다제 단백질을 인코딩하는 그리고 내인성 GA 옥시다제 유전자로부터 발현된 mRNA 분자의 적어도 한 분절 또는 부분에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인 서열을 포함하고, 여기서 상기 전사가능한 DNA 서열은 식물-발현성 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 그리고 여기서 상기 식물은 곡물 또는 옥수수 식물이다. 상기에서 언급된 바와 같이, 성숙한 mRNA 서열 표적화에 더하여, 비-코딩 RNA 분자는 추가로 GA 옥시다제 유전자 또는 전사체의 인트론 서열(들)을 표적화할 수 있다. 많은 구현예에 따르면, 비-코딩 RNA 분자는 억제용 GA20 옥시다제_3 유전자를 표적화할 수 있고 서열번호: 7 또는 서열번호: 8의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 억제용 GA20 옥시다제_3 유전자를 표적화하는 비-코딩 RNA 분자는 서열번호: 7 또는 서열번호: 8의 적어도 19 연속적인 뉴클레오타이드, 그러나 27 이하 연속적인 뉴클레오타이드, 예컨대 상보적 내지 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 27 연속적인 뉴클레오타이드에 상보적일 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 비-코딩 RNA 분자는 억제용 GA20 옥시다제 유전자를 표적화할 수 있고 서열번호: 9에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 식물에서 내인성 GA20 옥시다제 단백질을 인코딩하는 mRNA 분자의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인 서열을 포함할 수 있다. 추가 구현예에 따르면, 비-코딩 RNA 분자는 서열번호: 9에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 유사한 내인성 GA20 옥시다제 단백질을 인코딩하는 mRNA 분자의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인 서열을 포함할 수 있다.
상기에서 언급된 바와 같이, 비-코딩 RNA 분자는 GA 옥시다제 유전자의 인트론 서열을 GA 옥시다제 유전자의 엑손, 5' UTR 또는 3' UTR 대신에, 또는 상기에 더하여 표적화할 수 있다. 따라서, 억제용 GA20 옥시다제_3 유전자를 표적화하는 비-코딩 RNA 분자는 서열번호: 34의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인, 및/또는 서열번호: 34의 뉴클레오타이드 3666-3775 또는 4098-5314의 서열을 포함할 수 있다. GA20 옥시다제_3 유전자에 대하여 본 명세서에서 제공된 서열이 유전자의 상이한 대립유전자의 다형성 및/또는 존재로 인해 옥수수 식물, 계통 및 생식질의 다양성에 걸쳐 다양할 수 있다는 것이 중요하다. 게다가, GA20 옥시다제_3 유전자는 억제 작제물 및 비-코딩 RNA 분자의 설계에 영향을 줄 수 있는 상이한 mRNA, cDNA 및 코딩 서열을 생기게 할 수 있는 대안적으로 스플라이싱된 동형체로서 발현될 수 있다. 따라서, 억제용 GA20 옥시다제_3 유전자를 표적화하는 비-코딩 RNA 분자는 서열번호: 34의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인 서열을 포함하는 것으로서 더욱 광범위하게 정의될 수 있다.
본 개시내용의 구현예에 따르면, 비-코딩 RNA 분자를 인코딩하는 전사가능한 DNA 서열을 포함하는, 식물에서 내인성 GA20 옥시다제_5 유전자의 억제용 재조합 DNA 분자, 벡터 또는 작제물이 제공되고, 여기서 억제용 GA20 옥시다제_5 유전자를 표적화하는 상기 비-코딩 RNA 분자는 서열번호: 13 또는 서열번호: 14의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인 서열을 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 억제용 GA20 옥시다제_5 유전자를 표적화하는 비-코딩 RNA 분자는 서열번호: 13 또는 서열번호: 14의 적어도 19 연속적인 뉴클레오타이드, 그러나 27 이하 연속적인 뉴클레오타이드에 상보적, 예컨대 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 27 연속적인 뉴클레오타이드에 상보적일 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 비-코딩 RNA 분자는 서열번호: 15에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 식물에서 내인성 GA20 옥시다제 단백질을 인코딩하는 mRNA 분자의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인 서열을 포함하는 억제용 GA20 옥시다제 유전자를 표적화할 수 있다. 추가 구현예에 따르면, 비-코딩 RNA 분자는 서열번호: 15에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 유사한 내인성 GA20 옥시다제 단백질을 인코딩하는 mRNA 분자의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인 서열을 포함할 수 있다.
상기에서 언급된 바와 같이, 비-코딩 RNA 분자는 GA 옥시다제 유전자의 인트론 서열을 GA 옥시다제 유전자의 성숙한 mRNA의 엑손 또는 미번역된 영역 대신에, 또는 상기에 더하여 표적화할 수 있다. 따라서, 억제용 GA20 옥시다제_5 유전자를 표적화하는 비-코딩 RNA 분자는 서열번호: 35의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인, 및/또는 서열번호: 35의 뉴클레오타이드 3792-3906 또는 4476-5197의 서열을 포함할 수 있다. GA20 옥시다제_5에 대하여 본 명세서에서 제공된 서열은 유전자의 상이한 대립유전자의 다형성 및/또는 존재로 인해 옥수수 식물, 계통 및 생식질의 다양성에 걸쳐 다양할 수 있다. 게다가, GA20 옥시다제_5 유전자는 억제 작제물 및 비-코딩 RNA 분자의 설계에 영향을 줄 수 있는 상이한 mRNA, cDNA 및 코딩 서열을 생기게 할 수 있는 대안적으로 스플라이싱된 동형체로서 발현될 수 있다. 따라서, 억제용 GA20 옥시다제_3 유전자를 표적화하는 비-코딩 RNA 분자는 서열번호: 35의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인 서열을 포함하는 것으로서 더욱 광범위하게 정의될 수 있다.
추가 구현예에 따르면, 비-코딩 RNA 분자를 인코딩하는 전사가능한 DNA 서열을 포함하는, 식물에서 내인성 GA20 옥시다제_3 및 GA20 옥시다제_5 유전자의 공동 억제용 재조합 DNA 분자, 벡터 또는 작제물이 제공되고, 여기서 억제용 GA20 옥시다제_3 및 GA20 옥시다제_5 유전자를 표적화하는 상기 비-코딩 RNA 분자는 (i) 서열번호: 7 및/또는 서열번호: 8의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인, 그리고 (ii) 서열번호: 13 및/또는 서열번호: 14의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인 서열을 포함한다. 이들 구현예의 일부에 따르면, 억제용 GA20 옥시다제_3 및 GA20 옥시다제_5 유전자를 공동으로 표적화하는 비-코딩 RNA 분자는 (i) 서열번호: 7 (및/또는 서열번호: 8) 및 (ii) 서열번호: 13 (및/또는 서열번호: 14)의 적어도 19 연속적인 뉴클레오타이드, 그러나 27 이하 연속적인 뉴클레오타이드에 상보적, 예컨대 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 27 연속적인 뉴클레오타이드에 상보적일 수 있다. 많은 구현예에 따르면, 억제용 GA20 옥시다제_3 및 GA20 옥시다제_5 유전자를 공동으로 표적화하는 비-코딩 RNA 분자는 (i) 서열번호: 9에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 식물에서 내인성 GA20 옥시다제 단백질을 인코딩하는 mRNA 분자의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인, 그리고 (ii) 서열번호: 15에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 식물에서 내인성 GA20 옥시다제 단백질을 인코딩하는 mRNA 분자의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인 서열을 포함한다. 상기에서 언급된 바와 같이, 비-코딩 RNA 분자는 GA 옥시다제 유전자의 인트론 서열을 표적화할 수 있다. 따라서, 비-코딩 RNA 분자는 상기 확인된 바와 같이 GA20 옥시다제_3 및/또는 GA20 옥시다제_5 유전자(들)의 하나 또는 둘 모두의 인트론 서열(들)을 표적화할 수 있다.
특정 구현예에 따르면, 전사가능한 DNA 서열에 의해 인코딩된 비-코딩 RNA 분자는 (i) 서열번호: 39, 41, 43 또는 45에 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인 서열, 및/또는 (ii) 서열번호: 40, 42, 44 또는 46에 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 비-코딩 RNA 분자를 인코딩하는 서열 또는 억제 요소를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 전사가능한 DNA 서열에 의해 인코딩된 비-코딩 RNA 분자는, 표적화된 GA20 옥시다제 유전자 mRNA의 표적 또는 인식 부위의 서열에 비하여, 하나 이상의 미스매치, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5 또는 그 초과 상보적 미스매치를 가진 서열, 예컨대 서열번호: 40에 거의 상보적이지만 서열번호: 40에 비하여 하나 이상의 상보적 미스매치를 가진 서열을 포함할 수 있다. 특정 구현예에 따르면, 전사가능한 DNA 서열의 의해 인코딩된 비-코딩 RNA 분자는, GA20 옥시다제_3의 코딩 서열 및 cDNA 이내 표적 서열 (즉, 서열번호: 7 및 8, 각각)에, 및/또는 내인성 GA20 옥시다제_3 유전자에 의해 인코딩된 mRNA의 상응하는 서열에 100% 상보적인, 서열번호: 40에 100% 동일한 서열을 포함한다. 그러나, 서열번호: 40, 42, 44 또는 46에 100% 동일한 전사가능한 DNA 서열에 의해 인코딩된 비-코딩 RNA 분자의 서열은 GA20 옥시다제_5 유전자의 코딩 서열 및 cDNA 이내 표적 서열 (즉, 서열번호: 13 및 14, 각각)에, 및/또는 내인성 GA20 옥시다제_5 유전자에 의해 인코딩된 mRNA의 상응하는 서열에 완벽하게 상보적이지 않을 수 있다. 예를 들어, 서열번호: 40에서 비-코딩 RNA 분자 또는 miRNA 서열과 GA20 옥시다제_5 유전자의 cDNA 및 코딩 서열 사이 가장 가까운 상보적 매치는 서열번호: 39의 제1 위치에서 하나의 미스매치를 포함할 수 있다 (즉, 서열번호: 39의 제1 위치에서 "C"는 "G"로 대체된다, 즉, GTCCATCATGCGGTGCAACTA). 그러나, 서열번호: 40에서 비-코딩 RNA 분자 또는 miRNA 서열은 이 약간의 미스매치에도 불구하고 내인성 GA20 옥시다제_5 유전자에 의해 인코딩된 mRNA에 여전히 결합 및 하이브리드화할 수 있다.
본 개시내용의 구현예에 따르면, 비-코딩 RNA 분자를 인코딩하는 전사가능한 DNA 서열을 포함하는, 식물에서 하나 이상의 내인성 GA3 옥시다제 유전자(들)의 억제용 재조합 DNA 분자, 벡터 또는 작제물이 제공되고, 여기서 상기 비-코딩 RNA 분자는 식물에서 내인성 GA3 옥시다제 단백질을 인코딩하는 그리고 내인성 GA3 옥시다제 유전자로부터 발현된 mRNA 분자의 적어도 한 분절 또는 부분에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인 서열을 포함하고, 여기서 상기 전사가능한 DNA 서열은 식물-발현성 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 그리고 상기 식물은 곡물 또는 옥수수 식물이다. 성숙한 mRNA 서열 표적화에 더하여, 비-코딩 RNA 분자는 추가로 GA3 옥시다제 유전자 또는 전사체의 인트론 서열을 표적화할 수 있다.
일부 구현예에 따르면, 비-코딩 RNA 분자는 억제용 GA3 옥시다제_1 유전자를 표적화할 수 있고 서열번호: 28 또는 서열번호: 29의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 억제용 GA3 옥시다제 유전자를 표적화하는 비-코딩 RNA 분자는 서열번호: 28 또는 서열번호: 29의 적어도 19 연속적인 뉴클레오타이드, 그러나 27 이하 연속적인 뉴클레오타이드에 상보적, 예컨대 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 27 연속적인 뉴클레오타이드에 상보적일 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 억제용 GA3 옥시다제 유전자를 표적화하는 비-코딩 RNA 분자는 서열번호: 30에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 식물에서 내인성 GA3 옥시다제 단백질을 인코딩하는 mRNA 분자의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인 서열을 포함한다. 추가 구현예에 따르면, 비-코딩 RNA 분자는 서열번호: 30에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 유사한 내인성 GA3 옥시다제 단백질을 인코딩하는 mRNA 분자의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인 서열을 포함할 수 있다.
상기에서 언급된 바와 같이, 비-코딩 RNA 분자는 GA3 옥시다제 유전자의 인트론 서열을 GA 옥시다제 유전자의 엑손, 5' UTR 또는 3' UTR 대신에, 또는 상기에 더하여 표적화할 수 있다. 따라서, 억제용 GA3 옥시다제_1 유전자를 표적화하는 비-코딩 RNA 분자는 서열번호: 36의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인, 및/또는 서열번호: 36의 뉴클레오타이드 515-879 또는 1039-1158의 서열을 포함할 수 있다. GA3 옥시다제_1에 대하여 본 명세서에서 제공된 서열은 유전자의 상이한 대립유전자의 다형성 및/또는 존재로 인해 옥수수 식물, 계통 및 생식질의 다양성에 걸쳐 다양할 수 있다. 게다가, GA3 옥시다제_1 유전자는 억제 작제물 및 비-코딩 RNA 분자의 설계에 영향을 줄 수 있는 상이한 mRNA, cDNA 및 코딩 서열을 생기게 할 수 있는 대안적으로 스플라이싱된 동형체로서 발현될 수 있다. 따라서, 억제용 GA3 옥시다제_1 유전자를 표적화하는 비-코딩 RNA 분자는 서열번호: 36의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인 서열을 포함하는 것으로서 더욱 광범위하게 정의될 수 있다.
일부 구현예에 따르면, 비-코딩 RNA 분자는 억제용 GA3 옥시다제_2 유전자를 표적화할 수 있고 서열번호: 31 또는 서열번호: 32의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 억제용 GA3 옥시다제 유전자를 표적화하는 비-코딩 RNA 분자는 서열번호: 31 또는 서열번호: 32의 적어도 19 연속적인 뉴클레오타이드, 그러나 27 이하 연속적인 뉴클레오타이드에 상보적, 예컨대 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 27 연속적인 뉴클레오타이드에 상보적일 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 억제용 GA3 옥시다제 유전자를 표적화하는 비-코딩 RNA 분자는 서열번호: 33에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 식물에서 내인성 GA3 옥시다제 단백질을 인코딩하는 mRNA 분자의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인 서열을 포함한다. 추가 구현예에 따르면, 비-코딩 RNA 분자는 서열번호: 33에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 유사한 내인성 GA3 옥시다제 단백질을 인코딩하는 mRNA 분자의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인 서열을 포함할 수 있다.
상기에서 언급된 바와 같이, 비-코딩 RNA 분자는 GA3 옥시다제 유전자의 인트론 서열을 GA3 옥시다제 유전자의 엑손, 5' UTR 또는 3' UTR 대신에, 또는 상기에 더하여 표적화할 수 있다. 따라서, 억제용 GA3 옥시다제_2 유전자를 표적화하는 비-코딩 RNA 분자는 서열번호: 37의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인, 및/또는 서열번호: 37의 뉴클레오타이드 533-692 또는 852-982의 서열을 포함할 수 있다. GA3 옥시다제_2에 대하여 본 명세서에서 제공된 서열은 유전자의 상이한 대립유전자의 다형성 및/또는 존재로 인해 옥수수 식물, 계통 및 생식질의 다양성에 걸쳐 다양할 수 있다. 게다가, GA3 옥시다제_2 유전자는 억제 작제물 및 비-코딩 RNA 분자의 설계에 영향을 줄 수 있는 상이한 mRNA, cDNA 및 코딩 서열을 생기게 할 수 있는 대안적으로 스플라이싱된 동형체로서 발현될 수 있다. 따라서, 억제용 GA3 옥시다제_2 유전자를 표적화하는 비-코딩 RNA 분자는 서열번호: 37의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인 서열을 포함하는 것으로서 더욱 광범위하게 정의될 수 있다.
특정 구현예에 따르면, GA3 옥시다제 유전자 표적화를 위하여 전사가능한 DNA 서열에 의해 인코딩된 비-코딩 RNA 분자는 (i) 서열번호: 57 또는 59에 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인 서열, 및/또는 (ii) 서열번호: 58 또는 60에 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 비-코딩 RNA 분자를 인코딩하는 서열 또는 억제 요소를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 전사가능한 DNA 서열에 의해 인코딩된 비-코딩 RNA 분자는, 표적화된 GA3 옥시다제 유전자 mRNA의 표적 또는 인식 부위의 서열에 비하여, 하나 이상의 미스매치, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5 또는 그 초과 상보적 미스매치를 가진 서열, 예컨대 서열번호: 57 또는 59에 거의 상보적이지만 서열번호: 57 또는 59에 비하여 하나 이상의 상보적 미스매치를 가진 서열을 포함할 수 있다. 특정 구현예에 따르면, 전사가능한 DNA 서열에 의해 인코딩된 비-코딩 RNA 분자는, 옥수수에서 GA3 옥시다제_1 또는 GA3 옥시다제_2 유전자의 코딩 서열 및 cDNA 이내 표적 서열 (즉, 서열번호: 28, 29, 31 및/또는 32)에, 및/또는 내인성 GA3 옥시다제_1 또는 GA3 옥시다제_2 유전자에 의해 인코딩된 mRNA의 상응하는 서열에 100% 상보적인, 서열번호: 58 또는 60에 100% 동일한 서열을 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 비-코딩 RNA 분자는 억제용 GA20 옥시다제_4 유전자를 표적화할 수 있고 서열번호: 10 또는 서열번호: 11의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 억제용 GA20 옥시다제_4 유전자를 표적화하는 비-코딩 RNA 분자는 서열번호: 10 또는 서열번호: 11의 적어도 19 연속적인 뉴클레오타이드, 그러나 27 이하 연속적인 뉴클레오타이드에 상보적, 예컨대 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 27 연속적인 뉴클레오타이드에 상보적일 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 억제용 GA20 옥시다제 유전자를 표적화하는 비-코딩 RNA 분자는 서열번호: 12에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 식물에서 내인성 GA20 옥시다제 단백질을 인코딩하는 mRNA 분자의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인 서열을 포함한다. 추가 구현예에 따르면, 비-코딩 RNA 분자는 서열번호: 12에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 유사한 내인성 GA20 옥시다제 단백질을 인코딩하는 mRNA 분자의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인 서열을 포함할 수 있다.
상기에서 언급된 바와 같이, 비-코딩 RNA 분자는 GA20 옥시다제 유전자의 인트론 서열을 GA20 옥시다제 유전자의 엑손, 5' UTR 또는 3' UTR 대신에, 또는 상기에 더하여 표적화할 수 있다. 따라서, 억제용 GA20 옥시다제_4 유전자를 표적화하는 비-코딩 RNA 분자는 서열번호: 38의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인, 및/또는 서열번호: 38의 뉴클레오타이드 1996-2083 또는 2412-2516의 서열을 포함할 수 있다. GA20 옥시다제_4에 대하여 본 명세서에서 제공된 서열은 유전자의 상이한 대립유전자의 다형성 및/또는 존재로 인해 옥수수 식물, 계통 및 생식질의 다양성에 걸쳐 다양할 수 있다. 게다가, GA20 옥시다제_4 유전자는 억제 작제물 및 비-코딩 RNA 분자의 설계에 영향을 줄 수 있는 상이한 mRNA, cDNA 및 코딩 서열을 생기게 할 수 있는 대안적으로 스플라이싱된 동형체로서 발현될 수 있다. 따라서, 억제용 GA20 옥시다제_4 유전자를 표적화하는 비-코딩 RNA 분자는 서열번호: 38의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인 서열을 포함하는 것으로서 더욱 광범위하게 정의될 수 있다.
특정 구현예에 따르면, GA20 옥시다제_4 유전자 표적화를 위하여 전사가능한 DNA 서열에 의해 인코딩된 비-코딩 RNA 분자는 (i) 서열번호: 61에 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인 서열, 및/또는 (ii) 서열번호: 62에 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 비-코딩 RNA 분자를 인코딩하는 서열 또는 억제 요소를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 전사가능한 DNA 서열에 의해 인코딩된 비-코딩 RNA 분자는, 표적화된 GA20 옥시다제 유전자 mRNA의 표적 또는 인식 부위의 서열에 비하여, 하나 이상의 미스매치, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5 또는 그 초과 상보적 미스매치를 가진 서열, 예컨대 서열번호: 61에 거의 상보적이지만 서열번호: 61에 비하여 하나 이상의 상보적 미스매치를 가진 서열을 포함할 수 있다. 특정 구현예에 따르면, 전사가능한 DNA 서열에 의해 인코딩된 비-코딩 RNA 분자는, 옥수수에서 GA20 옥시다제_4 유전자의 코딩 서열 및 cDNA 이내 표적 서열 (즉, 서열번호: 10 또는 11)에, 및/또는 내인성 GA20 옥시다제_4 유전자에 의해 인코딩된 mRNA의 상응하는 서열에 100% 상보적인, 서열번호: 62에 100% 동일한 서열을 포함한다.
본 개시내용의 구현예에 따르면, 억제용 내인성 GA20 옥시다제_3 및/또는 GA20 옥시다제_5 유전자(들)을 표적화하는 비-코딩 RNA 분자를 인코딩하는 전사가능한 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 작제물이 제공되고, 여기서 상기 전사가능한 DNA 서열은 구성적, 조직-특이적 또는 조직-바람직한 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 그리고 상기 전사가능한 DNA 서열은 전사가능한 DNA 서열로 형질전환된 식물의 하나 이상의 조직(들)에서 감소 또는 저하되도록 내인성 GA20 옥시다제_3 및/또는 GA20 옥시다제_5 유전자(들)의 발현 수준을 야기시킨다. 전사가능한 DNA 서열에 의해 인코딩된 그와 같은 비-코딩 RNA 분자는 (i) 서열번호: 9에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 식물에서 내인성 GA20 옥시다제 단백질을 인코딩하는 mRNA 분자의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인, 및/또는 (ii) 서열번호: 15에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 식물에서 내인성 GA20 옥시다제 단백질을 인코딩하는 mRNA 분자의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인 서열을 포함할 수 있다.
본 개시내용의 구현예에 따르면, 억제용 내인성 GA3 옥시다제_1 및/또는 GA3 옥시다제_2 유전자(들)을 표적화하는 비-코딩 RNA 분자를 인코딩하는 전사가능한 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 작제물이 제공되고, 여기서 상기 전사가능한 DNA 서열은 구성적, 조직-특이적 또는 조직-바람직한 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 그리고 상기 전사가능한 DNA 서열은 전사가능한 DNA 서열로 형질전환된 식물의 하나 이상의 조직(들)에서 감소 또는 저하되도록 내인성 GA3 옥시다제_1 및/또는 GA3 옥시다제_2 유전자(들)의 발현 수준을 야기시킨다. 전사가능한 DNA 서열에 의해 인코딩된 그와 같은 비-코딩 RNA 분자는 (i) 서열번호: 30에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 식물에서 내인성 GA3 옥시다제 단백질을 인코딩하는 mRNA 분자의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인, 및/또는 (ii) 서열번호: 33에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 식물에서 내인성 GA3 옥시다제 단백질을 인코딩하는 mRNA 분자의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인 서열을 포함할 수 있다.
본 개시내용의 구현예에 따르면, 억제용 내인성 GA20 옥시다제_4 유전자를 표적화하는 비-코딩 RNA 분자를 인코딩하는 전사가능한 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 작제물이 제공되고, 여기서 상기 전사가능한 DNA 서열은 구성적, 조직-특이적 또는 조직-바람직한 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 그리고 상기 전사가능한 DNA 서열은 전사가능한 DNA 서열로 형질전환된 식물의 하나 이상의 조직(들)에서 감소 또는 저하되도록 내인성 GA20 옥시다제_4 유전자의 발현 수준을 야기시킨다. 전사가능한 DNA 서열에 의해 인코딩된 그와 같은 비-코딩 RNA 분자는 (i) 서열번호: 12에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 식물에서 내인성 GA20 옥시다제 단백질을 인코딩하는 mRNA 분자의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인 서열을 포함할 수 있다.
많은 구현예에 따르면, 억제용 내인성 GA20 옥시다제_3 및/또는 GA20 옥시다제_5 유전자(들)을 표적화하는 비-코딩 RNA 분자를 인코딩하는 전사가능한 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 작제물로 형질전환되는, 및/또는 본 명세서에서 제공된 바와 같은, 표적화된 게놈 편집 기술을 통해 편집된 내인성 GA20 옥시다제_3 및/또는 GA20 옥시다제_5 유전자(들)을 갖는 변형된 또는 이식유전자성 식물이 제공되고, 여기서 상기 전사가능한 DNA 서열은 항시성 프로모터 또는 조직-특이적 또는 조직-바람직한 프로모터, 예컨대 관속 프로모터 또는 잎 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 그리고 여기서 내인성 GA20 옥시다제_3 및/또는 GA20 옥시다제_5 유전자(들)의 상기 발현 수준은 야생형 또는 대조군 식물에 비교된 경우 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100% 만큼 변형된 또는 이식유전자성 식물의 하나 이상의 식물 조직(들), 예컨대 하나 이상의 관속 및/또는 잎 조직(들)에서 제거, 감소 또는 저하된다. 많은 구현예에 따르면, 억제용 내인성 GA20 옥시다제_3 및/또는 GA20 옥시다제_5 유전자(들)을 표적화하는 비-코딩 RNA 분자를 인코딩하는 전사가능한 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 작제물로 형질전환되는, 및/또는 그것의 발현 수준 및/또는 활성을 감소 또는 제거하기 위해 표적화된 게놈 편집 기술을 통해 편집된 내인성 GA20 옥시다제_3 및/또는 GA20 옥시다제_5 유전자를 갖는 변형된 또는 이식유전자성 식물이 제공되고, 여기서 상기 전사가능한 DNA 서열은 항시성 프로모터 또는 조직-특이적 또는 조직-바람직한 프로모터, 예컨대 관속 프로모터 또는 잎 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 그리고 여기서 하나 이상의 활성 GAs, 예컨대 GA1, GA3, GA4, 및/또는 GA7의 상기 수준은 야생형 또는 대조군 식물에 비교된 경우 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100% 만큼 변형된 또는 이식유전자성 식물의 하나 이상의 식물 조직(들), 예컨대 하나 이상의 줄기, 마디간, 관속 및/또는 잎 조직(들) 또는 하나 이상의 줄기 및/또는 마디간 조직(들)에서 감소 또는 저하된다.
많은 구현예에 따르면, 억제용 내인성 GA3 옥시다제_1 및/또는 GA3 옥시다제_2 유전자(들)을 표적화하는 비-코딩 RNA 분자를 인코딩하는 전사가능한 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 작제물로 형질전환되는, 및/또는 본 명세서에서 제공된 바와 같은, 표적화된 게놈 편집 기술을 통해 편집된 내인성 GA3 옥시다제_1 또는 GA3 옥시다제_2 유전자를 갖는 변형된 또는 이식유전자성 식물이 제공되고, 여기서 상기 전사가능한 DNA 서열은 항시성 프로모터 또는 조직-특이적 또는 조직-바람직한 프로모터, 예컨대 관속 프로모터 또는 잎 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 그리고 여기서 내인성 GA3 옥시다제_1 및/또는 GA3 옥시다제_2 유전자(들)의 상기 발현 수준은 야생형 또는 대조군 식물에 비교된 경우 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100% 만큼 변형된 또는 이식유전자성 식물의 하나 이상의 식물 조직(들), 예컨대 하나 이상의 관속 및/또는 잎 조직(들)에서 제거, 감소 또는 저하된다. 많은 구현예에 따르면, 억제용 내인성 GA3 옥시다제_1 및/또는 GA3 옥시다제_2 유전자(들)을 표적화하는 비-코딩 RNA 분자를 인코딩하는 전사가능한 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 작제물로 형질전환되는, 및/또는 그것의 발현 수준 및/또는 활성을 감소 또는 제거하기 위해 표적화된 게놈 편집 기술을 통해 편집된 내인성 GA3 옥시다제_1 및/또는 GA3 옥시다제_2 유전자를 갖는 변형된 또는 이식유전자성 식물이 제공되고, 여기서 상기 전사가능한 DNA 서열은 항시성 프로모터 또는 조직-특이적 또는 조직-바람직한 프로모터, 예컨대 관속 프로모터 또는 잎 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 그리고 여기서 하나 이상의 활성 GAs, 예컨대 GA1, GA3, GA4, 및/또는 GA7의 상기 수준은 야생형 또는 대조군 식물에 비교된 경우 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100% 만큼 변형된 또는 이식유전자성 식물의 하나 이상의 식물 조직(들), 예컨대 하나 이상의 줄기, 마디간, 관속 및/또는 잎 조직(들) 또는 하나 이상의 줄기 및/또는 마디간 조직(들)에서 감소 또는 저하된다.
많은 구현예에 따르면, 억제용 내인성 GA20 옥시다제_4 유전자를 표적화하는 비-코딩 RNA 분자를 인코딩하는 전사가능한 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 작제물로 형질전환되는, 및/또는 본 명세서에서 제공된 바와 같은, 표적화된 게놈 편집 기술을 통해 편집된 내인성 GA20 옥시다제_4 유전자를 갖는 변형된 또는 이식유전자성 식물이 제공되고, 여기서 상기 전사가능한 DNA 서열은 항시성 프로모터 또는 조직-특이적 또는 조직-바람직한 프로모터, 예컨대 관속 프로모터 또는 잎 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 그리고 여기서 내인성 GA20 옥시다제_4 유전자(들)의 상기 발현 수준은 야생형 또는 대조군 식물에 비교된 경우 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100% 만큼 변형된 또는 이식유전자성 식물의 하나 이상의 식물 조직(들), 예컨대 하나 이상의 관속 및/또는 잎 조직(들)에서 제거, 감소 또는 저하된다. 많은 구현예에 따르면, 억제용 내인성 GA20 옥시다제_4 유전자(들)을 표적화하는 비-코딩 RNA 분자를 인코딩하는 전사가능한 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 작제물로 형질전환되는, 및/또는 그것의 발현 수준 및/또는 활성을 감소 또는 제거하기 위해 표적화된 게놈 편집 기술을 통해 편집된 내인성 GA20 옥시다제_4 유전자를 갖는 변형된 또는 이식유전자성 식물이 제공되고, 여기서 상기 전사가능한 DNA 서열은 항시성 프로모터 또는 조직-특이적 또는 조직-바람직한 프로모터, 예컨대 관속 프로모터 또는 잎 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 여기서 하나 이상의 활성 GAs, 예컨대 GA1, GA3, GA4, 및/또는 GA7의 상기 수준은 야생형 또는 대조군 식물에 비교된 경우 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100% 만큼 변형된 또는 이식유전자성 식물의 하나 이상의 식물 조직(들), 예컨대 하나 이상의 줄기, 마디간, 관속 및/또는 잎 조직(들) 또는 하나 이상의 줄기 및/또는 마디간 조직(들)에서 감소 또는 저하된다.
많은 구현예에 따르면, 억제용 내인성 GA20 옥시다제_3, GA20 옥시다제_4, 및/또는 GA20 옥시다제_5 유전자(들)을 표적화하는 비-코딩 RNA 분자를 인코딩하는 전사가능한 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 작제물로 형질전환되는, 억제용 내인성 GA3 옥시다제_1 및/또는 GA3 옥시다제_2 유전자(들)을 표적화하는 비-코딩 RNA 분자를 인코딩하는 전사가능한 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 작제물로 형질전환되는, 및/또는 본 명세서에서 제공된 바와 같은, 그것의 발현 수준 및/또는 활성을 감소 또는 제거하기 위해, 표적화된 게놈 편집 기술을 통해 편집된 내인성 GA20 옥시다제_3, GA20 옥시다제_4, 또는 GA20 옥시다제_5 유전자를 갖는 변형된 또는 이식유전자성 식물이 제공되고, 여기서 상기 전사가능한 DNA 서열은 항시성 프로모터 또는 조직-특이적 또는 조직-바람직한 프로모터, 예컨대 관속 프로모터 또는 잎 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 여기서 상기 변형된 또는 이식유전자성 식물은 하기 특성 중 하나 이상을 갖는다: 반왜성 또는 감소된 식물 높이 또는 신장, 감소된 줄기 마디간 길이, 증가된 도복 저항성, 및/또는 증가된 줄기 또는 자루 직경. 그와 같은 변형된 또는 이식유전자성 식물은 임의의 상당한 생식 오프-유형을 갖지 않을 수 있다. 변형된 또는 이식유전자성 식물은 하기 추가의 특성 중 하나 이상을 가질 수 있다: 감소된 녹색 스냅, 더 깊은 뿌리, 증가된 잎 면적, 더 이른 캐노피 폐쇄, 더 높은 기공 유통성, 더 낮은 이삭 높이, 증가된 잎 수분 함량, 향상된 가뭄 내성, 증가된 질소 사용 효율, 증가된 물 사용 효율, 정상 및/또는 질소 또는 물 제한 스트레스 상태 하에서 잎내 감소된 안토시아닌 함량 및 안토시아닌 면적, 증가된 이삭 중량, 증가된 알맹이 수, 증가된 알맹이 중량, 증가된 수확량, 및/또는 증가된 수확 지수. 많은 이들 구현예에 따르면, 내인성 GA20 옥시다제_3, GA20 옥시다제_4, 및/또는 GA20 옥시다제_5 유전자(들), 또는 내인성 GA3 옥시다제_1 및/또는 GA3 옥시다제_2 유전자(들)의 발현 수준 및/또는 활성은 야생형 또는 대조군 식물에 비교된 경우 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100% 만큼 변형된 또는 이식유전자성 식물의 하나 이상의 식물 조직(들), 예컨대 하나 이상의 관속 및/또는 잎 조직(들)에서 제거, 감소 또는 저하될 수 있고/있거나, 하나 이상의 활성 GAs, 예컨대 GA1, GA3, GA4, 및/또는 GA7의 상기 수준은 야생형 또는 대조군 식물에 비교된 경우 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100% 만큼 변형된 또는 이식유전자성 식물의 하나 이상의 식물 조직(들), 예컨대 하나 이상의 줄기, 마디간, 관속 및/또는 잎 조직(들), 또는 하나 이상의 줄기 및/또는 마디간 조직(들)에서 감소 또는 저하된다.
상기 단락에서 기재된 많은 구현예에 따르면, 재조합 DNA 분자, 벡터 또는 작제물의 전사가능한 DNA 서열에 의해 인코딩된 비-코딩 RNA 분자는 성숙한 miRNA 또는 siRNA를 형성하기 위해 식물 세포에서 후속적으로 가공 또는 절단될 수 있는 전구체 miRNA 또는 siRNA일 수 있다.
본 개시내용의 재조합 DNA 분자, 작제물 또는 벡터는 억제용 내인성 GA 옥시다제 유전자를 표적화하는 비-코딩 RNA 분자를 인코딩하는 전사가능한 DNA 서열을 포함할 수 있고, 여기서 상기 전사가능한 DNA 서열은 식물-발현성 프로모터, 예컨대 구성적 또는 관속 및/또는 잎 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 본 개시내용의 목적을 위하여, 억제용 내인성 GA 옥시다제 유전자를 표적화하는 전사가능한 DNA 서열에 의해 인코딩된 비-코딩 RNA 분자는 억제용 내인성 GA 옥시다제 유전자를 표적화하는 성숙한 비-코딩 RNA 분자, 및/또는 억제용 내인성 GA 옥시다제 유전자를 표적화하는, 성숙한 비-코딩 RNA 분자 속에 식물 세포에서 가공될 수 있는 전구체 RNA 분자, 예컨대 miRNA 또는 siRNA를 포함할 수 있다. 그것의 관련된 프로모터에 더하여, 내인성 GA 옥시다제 유전자의 억제용 비-코딩 RNA 분자를 인코딩하는 전사가능한 DNA 서열은 또한, 식물 세포에서 전사가능한 DNA 서열의 발현을 조절 또는 허용하는, 강화에 적합한, 필요한 또는 바람직한, 하나 이상의 추가의 조절 인자(들), 예컨대 증진제(들), 리더, 전사 개시 부위 (TSS), 링커, 5' 및 3' 미번역된 영역(들) (UTRs), 인트론(들), 폴리아데닐화 신호, 종결 영역 또는 서열, 등에 작동가능하게 연결될 수 있다. 그와 같은 추가의 조절 인자(들)은 이식유전자 또는 전사가능한 DNA 서열의 발현을 증진 또는 최적화하기 위해 선택적일 수 있고/있거나 사용될 수 있다. 본 명세서에서 제공된 바와 같은, "증진제"는 증진제가 전형적으로 전사 개시 부위, TATA 박스, 또는 등가 서열이 부족하고 따라서 전사를 구동시키기에 단독으로 불충분한 "프로모터"와 식별될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "리더"는 이식유전자의 전사가능한 DNA 서열 또는 단백질 코딩 서열 개시 부위의 5' 말단과 전사 개시 부위 (TSS) 사이 유전자 (또는 이식유전자)의 5'-UTR의 DNA 서열로서 일반적으로 정의될 수 있다.
추가 구현예에 따르면, 이식유전자성 식물을 생산하기 위해 식물-발현성 프로모터에 작동가능하게 연결된 이식유전자 또는 전사가능한 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자 또는 작제물로 식물 세포, 조직 또는 외식편의 형질전환 방법이 제공된다. 전사가능한 DNA 서열은 억제용 GA 옥시다제 유전자(들)을 표적화하는 비-코딩 RNA 분자, 또는 억제용 하나 이상의 GA 옥시다제 유전자(들)을 표적화하는, 성숙한 RNA 분자, 예컨대 miRNA 또는 siRNA 속에 가공되는 RNA 전구체를 인코딩할 수 있다. 재조합 DNA 분자 또는 작제물로 식물 세포에서 염색체 또는 색소체의 수많은 형질전환 방법은 당해 기술에 공지되어 있고, 이는 이식유전자성 식물 세포 및 식물을 생산하기 위해 본 발명의 방법 구현예에 따라 사용될 수 있다. 당업계에서 공지된 식물 세포의 형질전환용 임의의 적합한 방법 또는 기술은 본 방법에 따라 사용될 수 있다. 식물의 효과적인 형질전환 방법은 박테리아성으로 매개된 형질전환, 예컨대 아그로박테리움-매개된 또는 라이조비움-매개된 형질전환, 및 미세투사물 또는 입자 폭격-매개된 형질전환을 포함한다. 이식유전자성 식물을 재생 또는 발생시키기 위해 박테리아성으로 매개된 형질전환 또는 미세투사물 또는 입자 폭격을 통해 형질전환 벡터로 외식편의 형질전환 그리고 그 다음 후속적으로 그들 외식편의 배양 등을 위한 다양한 방법은 당해 기술에 공지되어 있다. 다른 식물 형질전환 방법, 예컨대 미세주입, 전기천공, 진공 침윤, 압력, 초음파처리, 탄화규소 섬유 진탕, PEG-매개된 형질전환, 등은 또한 당업계에서 공지된다.
식물 세포 및 외식편의 형질전환 방법은 당해 분야의 숙련가에 의해 잘 알려진다. 재조합 DNA로 코팅된 입자로 미세투사물 폭격에 의한 식물 세포의 형질전환 방법은, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,550,318; 5,538,880 6,160,208; 6,399,861; 및 6,153,812에서 제공되고, 아그로박테리움-매개된 형질전환은, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,159,135; 5,824,877; 5,591,616; 6,384,301; 5,750,871; 5,463,174; 및 5,188,958에서 기재되고, 이들 모두는 본 명세서에 참고로 편입된다. 식물의 추가의 형질전환 방법은, 예를 들어, Compendium of Transgenic Crop Plants (2009) Blackwell Publishing에서 밝혀질 수 있다. 당업계에서 공지된 또는 나중에 개발된 식물의 임의의 적합한 형질전환 방법은 본 명세서에서 제공된 임의의 핵산 분자, 작제물 또는 벡터로 식물 세포 또는 외식편을 형질전환시키는데 사용될 수 있다.
형질전환 방법에 의해 생산된 이식유전자성 식물은 사용된 외식편 및 방법에 따라 형질전환 사건에 대하여 키메라성 또는 비-키메라성일 수 있다. 본 명세서에서 제공된 바와 같은 식물의-발현성 프로모터, 예컨대 구성적, 조직-특이적, 조직-바람직한, 관속 및/또는 잎 프로모터의 제어 하에서 하나 이상의 식물 세포 또는 조직에서 억제용 내인성 GA 옥시다제 유전자를 표적화하는 비-코딩 RNA 분자의 발현 방법이 추가로 제공된다. 그와 같은 방법은 더 짧은, 반왜성 신장, 감소된 마디간 길이, 증가된 자루/줄기 직경, 및/또는 향상된 도복 저항성을 갖는 이식유전자성 곡물 또는 옥수수 식물을 창출하는데 사용될 수 있다. 그와 같은 이식유전자성 곡물 또는 옥수수 식물은 추가로, 야생형 또는 대조군 식물에 비하여, 수확량에 유익할 수 있는 다른 특성, 예컨대 감소된 녹색 스냅, 더 깊은 뿌리, 증가된 잎 면적, 더 이른 캐노피 폐쇄, 향상된 가뭄 내성, 증가된 질소 사용 효율, 증가된 물 사용 효율, 더 높은 기공 유통성, 더 낮은 이삭 높이, 증가된 잎 수분 함량, 정상 또는 질소 또는 물 제한 스트레스 상태 하에서 잎내 감소된 안토시아닌 함량 및/또는 면적, 증가된 이삭 중량, 증가된 종자 또는 알맹이 수, 증가된 종자 또는 알맹이 중량, 증가된 수확량, 및/또는 증가된 수확 지수를 가질 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "수확 지수"는 수확된 면적에 대해 식물의 지상 바이오매스의 총 질량에 의해 나눗셈된 수확된 곡물의 질량을 지칭한다.
억제용 내인성 GA 옥시다제 유전자를 표적화하는 GA 옥시다제 이식유전자 또는 비-코딩 RNA 분자를 발현시키는 이식유전자성 식물은 야생형 또는 대조군 식물보다 더 이른 캐노피 폐쇄 (예를 들어, 대략 1 일 더 이른, 또는 12-48 시간, 12-36 시간, 18-36 시간, 또는 약 24 시간 더 이른 캐노피 폐쇄)를 가질 수 있다. 억제용 내인성 GA 옥시다제 유전자를 표적화하는 GA 옥시다제 이식유전자 또는 비-코딩 RNA 분자를 발현시키는 이식유전자성 식물이 야생형 또는 대조군 식물보다 더 낮은 이삭 높이를 가질 수 있어도, 이삭의 높이는 일반적으로 지상 위 적어도 18 인치일 수 있다. 억제용 내인성 GA 옥시다제 유전자를 표적화하는 비-코딩 RNA 분자를 발현시키는 이식유전자성 식물은 야생형 또는 대조군 식물보다 하나 이상의 후기 영양 단계 (예를 들어, V8-V12) 동안 더 큰 바이오매스 및/또는 잎 면적을 가질 수 있다. 억제용 내인성 GA 옥시다제 유전자를 표적화하는 GA 옥시다제 이식유전자 또는 비-코딩 RNA 분자를 발현시키는 이식유전자성 식물은, 증가된 뿌리 전선 속도에 기인될 수 있는, 야생형 또는 대조군 식물보다 야외에서 성장된 후기 영양 단계 동안 더 깊은 뿌리를 가질 수 있다. 이들 이식유전자성 식물은, 식물의 영양 내지 생식 전이에 의해 (예를 들어, 대조군 식물용 식재 후 약 70 일에 반대로 식재 후 약 50 일에 V16/R1에 의해) 발생할 수 있는, 야생형 또는 대조군 식물보다 더 빨리 (예를 들어, 10-25 일 더 빨리, 15-25 일 더 빨리, 또는 약 20 일 더 빨리) 지하 깊이 90 cm에 도달할 수 있다.
형질전환용 수령체 세포(들) 또는 외식편 또는 세포 표적는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 종자 세포, 과일 세포, 잎 세포, 자엽 세포, 배축 세포, 분열조직 세포, 배아 세포, 배유 세포, 뿌리 세포, 새싹 세포, 줄기 세포, 포드 세포, 꽃 세포, 꽃차례 세포, 자루 세포, 소화경 세포, 스타일 세포, 암술머리 세포, 소켓 세포, 화판 세포, 꽃받침 세포, 꽃가루 세포, 꽃밥 세포, 수술 세포, 씨방 세포, 밑씨 세포, 과피 세포, 체관부 세포, 싹 세포, 가골 세포, 엽록체, 기공 세포, 모상체 세포, 뿌리 모발 세포, 저장 뿌리 세포, 또는 관속 조직 세포, 종자, 배아, 분열조직, 자엽, 배축, 배유, 뿌리, 새싹, 줄기, 마디, 가골, 세포 현탁액, 원형질, 꽃, 잎, 꽃가루, 꽃밥, 난소, 밑씨, 과피, 싹, 및/또는 관속 조직, 또는 전술한 것 중 임의의 것의 임의의 형질전환가능 부분. 식물 형질전환을 위하여, 본 개시내용의 재조합 DNA 형질전환 벡터 또는 분자를 수용하는데 사용될 수 있는 임의의 표적 세포(들), 조직(들), 외식편(들), 등은 집합적으로 형질전환용 "외식편"으로 지칭될 수 있다. 바람직하게는, 형질전환가능 또는 형질전환된 외식편 세포 또는 조직은 추가로 식물 속에 발생 또는 재생될 수 있다. 수정 식물이 성장 또는 재생될 수 있는 것으로부터 임의의 세포 또는 외식편은 본 개시내용의 실시를 위하여 유용한 수령체 세포 또는 외식편으로서 (즉, 형질전환용 표적 외식편으로서) 고려된다. 가골은, 비제한적으로, 배아 또는 배아의 일부, 비-배아 종자 조직, 묘목 정단 분열조직, 소포자, 및 기타 동종의 것을 포함하는, 다양한 조직 공급원으로부터 개시 또는 창출될 수 있다. 가골로서 번식할 수 있는 임의의 세포는 형질전환용 수령체 세포로서 작용할 수 있다. 이식유전자성 식물의 형질전환 방법 및 제조 물질 (예를 들어, 이식유전자성 식물 속으로의 형질전환 및 후속적인 재생의 다양한 배지 및 수령체 표적 세포 또는 외식편 및 방법)은 당해 기술에 공지되어 있다.
표적 식물 재료 또는 외식편의 형질전환은 영양소 배지, 예를 들어 세포가 시험관내 성장시키는 영양소의 혼합물에서 조직 배양 또는 세포 배양으로 실시될 수 있다. 형질전환된 외식편, 세포 또는 조직은, 당해 분야에서 공지된 바와 같이, 추가의 배양 단계, 예컨대 가골 유도, 선택, 재생, 등을 거치게 될 수 있다. 형질전환은 또한가골 조직의 창출 또는 사용 없이 수행될 수 있다. 재조합 DNA 서열 삽입 또는 사건을 포함하는 형질전환된 세포, 조직 또는 외식편은 당해 분야에서 공지된 방법에 따라 배양물, 플러그, 또는 토양에서 이식유전자성 식물 속에 성장, 발생 또는 재생될 수 있다. 이식유전자성 식물은 추가로 자체 또는 다른 식물에 교배되어 형질전환 종자 및 자손을 생산할 수 있다. 이식유전자성 식물은 또한 삽입이 부족한 제2 식물로 재조합 DNA 서열 또는 형질전환 사건을 포함하는 제1 식물의 교배에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 재조합 DNA 작제물 또는 서열은 형질전환에 잘 받아들이는 제1 식물 계통에 도입될 수 있고, 이는 그 다음 제2 식물 계통과 교배되어 재조합 DNA 작제물 또는 서열을 제2 식물 계통에 유전자침투할 수 있다. 이들 교배의 자손은 추가로 더 바람직한 계통으로 여러 번, 예컨대 6 내지 8 생성 또는 역 교배를 통해 역 교배되어, 최초 친계로서 실질적으로 동일한 유전자형을 가진, 그러나 재조합 DNA 작제물 또는 서열의 도입을 위한 자손 식물을 생산할 수 있다.
본 명세서에서 제공된 이식유전자성 또는 편집된 식물, 식물 일부, 세포, 또는 외식편은 엘리트 변종 또는 엘리트 계열일 수 있다. 엘리트 변종 또는 엘리트 계열은 우월한 작물학적 성능을 위하여 교배 및 선택에서 비롯된 변종을 지칭한다. 본 명세서에서 제공된 이식유전자성 또는 편집된 식물, 세포, 또는 외식편은 하이브리드 식물, 세포, 또는 외식편일 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "하이브리드"는 상이한 변종, 계열, 동계번식체, 또는 종으로부터 2개의 식물을 교배시킴으로써 창출되어, 이로써 자손은 각각의 모체로부터 유전 물질을 포함한다. 숙련가는 고차 하이브리드가 또한 생성될 수 있다는 것을 인식한다. 예를 들어, 제1 하이브리드는 변종 A를 변종 B와 교배시킴으로써 제조되어 A x B 하이브리드를 창출할 수 있고, 제2 하이브리드는 변종 C를 변종 D와 교배시킴으로써 제조되어 C x D 하이브리드를 창출할 수 있다. 제1 및 제2 하이브리드는 추가로 모두 4개의 모체 변종으로부터 유전적 정보를 포함하는 고차 하이브리드 (A x B) x (C x D)를 창출하기 위해 교배될 수 있다.
본 개시내용의 구현예에 따르면, 억제용 2 이상 GA 옥시다제 유전자를 표적화하는 GA 옥시다제 억제 요소, 또는 2 이상의 GA 옥시다제 억제 요소(들) 및/또는 유전자 편집(들)의 조합을 포함하는 변형된 식물이 제공된다. 재조합 DNA 작제물 또는 벡터는 적어도 제1 GA 옥시다제 유전자 및 제2 GA 옥시다제 유전자를 포함하는 2 이상 GA 옥시다제 유전자의 mRNA 인식 또는 표적 서열에 상보적인 비-코딩 RNA 분자를 인코딩하기 위해 설계된 또는 선택된 전사가능한 DNA 서열을 포함하는 단일 카셋트 또는 억제 요소를 포함할 수 있다 - 즉, 표적화된 GA 옥시다제 유전자의 mRNAs는 단일 억제 요소 및 인코딩된 비-코딩 RNA 분자가 억제용 표적화된 GA 옥시다제 유전자의 각각을 표적화할 수 있도록 동일한 또는 거의 동일한 (또는 유사한) 서열을 공유한다. 예를 들어, 억제용 GA20 옥시다제_3 및 GA20 옥시다제_5 유전자 둘 모두를 표적화하는 단일 비-코딩 RNA 분자를 인코딩하는 전사가능한 DNA 서열을 포함하는 발현 카세트 및 억제 작제물이 본 명세서에서 제공된다.
다른 구현예에 따르면, 재조합 DNA 작제물 또는 벡터는 단일 발현 카세트에서 나란히 또는 2 이상 발현 카세트에서 별도로 작제물 또는 벡터에서 함께 적층될 수 있는 2 이상 억제 요소 또는 서열을 포함할 수 있다. 재조합 DNA 작제물 또는 벡터는, 적어도 제1 표적화 서열 및 제2 표적화 서열을 포함하는, 나란히 배열된 2 이상 표적화 서열을 포함하는 비-코딩 RNA 분자를 인코딩하는 전사가능한 DNA 서열을 포함하는 단일 발현 카세트 또는 억제 요소를 포함할 수 있고, 여기서 상기 제1 표적화 서열은 제1 GA 옥시다제 유전자의 mRNA 인식 또는 표적 부위에 상보적이고, 상기 제2 표적화 서열은 제2 GA 옥시다제 유전자의 mRNA 인식 또는 표적 부위에 상보적이고, 그리고 여기서 상기 전사가능한 DNA 서열은 식물-발현성 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 식물-발현성 프로모터는, 본 명세서에서 제공된 바와 같이, 항시성 프로모터, 또는 조직-특이적 또는 조직-바람직한 프로모터일 수 있다. 비-코딩 RNA 분자는 적어도 제1 성숙한 miRNA 및 제2 miRNA를 포함하는 2 이상 성숙한 miRNAs에 가공되는 pre-miRNA로서 발현될 수 있고, 여기서 상기 제1 miRNA는 제1 GA 옥시다제 유전자의 mRNA 인식 또는 표적 부위에 상보적인 표적화 서열을 포함하고, 상기 제2 miRNA는 제2 GA 옥시다제 유전자의 mRNA 인식 또는 표적 부위에 상보적인 표적화 서열을 포함한다.
다른 구현예에 따르면, 재조합 DNA 작제물 또는 벡터는 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트를 포함하는 2 이상 발현 카세트를 포함할 수 있고, 여기서 상기 제1 발현 카세트는 제1 식물-발현성 프로모터에 작동가능하게 연결된 제1 전사가능한 DNA 서열을 포함하고, 상기 제2 발현 카세트는 제2 식물-발현성 프로모터에 작동가능하게 연결된 제2 전사가능한 DNA 서열을 포함하고, 여기서 상기 제1 전사가능한 DNA 서열은 제1 GA 옥시다제 유전자의 mRNA 인식 또는 표적 부위에 상보적인 표적화 서열을 포함하는 제1 비-코딩 RNA 분자를 인코딩하고, 상기 제2 전사가능한 DNA 서열은 제2 GA 옥시다제 유전자의 mRNA 인식 또는 표적 부위에 상보적인 표적화 서열을 포함하는 제2 비-코딩 RNA 분자를 인코딩한다. 제1 및 제2 식물-발현성 프로모터는 각각, 본 명세서에서 제공된 바와 같이, 항시성 프로모터, 또는 조직-특이적 또는 조직-바람직한 프로모터일 수 있고, 제1 및 제2 식물-발현성 프로모터는 동일 또는 상이한 프로모터일 수 있다.
다른 구현예에 따르면, GA 옥시다제 유전자(들) 및/또는 GA 옥시다제 유전자 편집(들)을 표적화하는 2 이상 억제 요소 또는 작제물은 억제 요소(들) 및/또는 유전자 편집(들)의 원하는 조합을 갖는 변형된 식물을 생산하기 위해 하나 이상의 세대에서 2 이상 식물을 함께 교배시킴으로써 변형된 식물에서 조합될 수 있다. 이들 구현예에 따르면, GA 옥시다제 유전자(들)을 표적화하는 억제 요소 또는 작제물 (또는 GA 옥시다제 유전자 편집)을 포함하는 제1 변형된 식물은 GA 옥시다제 유전자(들)을 표적화하는 억제 요소 또는 작제물 (또는 GA 옥시다제 유전자 편집)을 포함하는 제2 변형된 식물로 교배될 수 있어서, 이로써 제1 억제 요소 또는 작제물 및 제2 억제 요소 또는 작제물, 억제 요소 또는 작제물 및 GA 옥시다제 유전자 편집, 또는 제1 GA 옥시다제 유전자 편집 및 제2 GA 옥시다제 유전자 편집을 포함하는 변형된 자손 식물이 제조될 수 있다. 대안적으로, GA 옥시다제 유전자(들)을 표적화하는 2 이상 억제 요소 또는 작제물 및/또는 GA 옥시다제 유전자 편집(들)을 포함하는 변형된 식물은 (i) (억제용 GA 옥시다제 유전자를 각각 표적화하는) 제1 억제 요소 또는 작제물 및 제2 억제 요소 또는 작제물을 공-형질감염시킴, (ii) 변형된 식물을 제2 억제 요소 또는 작제물로 형질전환시킴, 여기서 상기 변형된 식물은 이미 제1 억제 요소 또는 작제물을 포함함, (iii) 변형된 식물을 억제 요소 또는 작제물로 형질전환시킴, 여기서 상기 변형된 식물은 이미 편집된 GA 옥시다제 유전자를 포함함, (iv) 변형된 식물을 GA 옥시다제 유전자(들)에서 하나 이상의 편집 실시용 작제물(들)로 형질전환시킴, 여기서 상기 변형된 식물은 이미 억제 요소 또는 작제물을 포함함, 또는 (v) GA 옥시다제 유전자(들)에서 2 이상 편집 실시용 작제물(들)로 형질전환시킴으로써 제조될 수 있다.
본 개시내용의 구현예에 따르면, 제1 재조합 DNA 작제물 및 제2 재조합 DNA 작제물을 포함하는 억제용 GA 옥시다제 유전자(들)을 표적화하는 2 이상 작제물을 포함하는 변형된 식물이 제공되고, 여기서 상기 제1 재조합 DNA 작제물은 제1 GA 옥시다제 유전자의 mRNA 인식 또는 표적 서열에 상보적인 제1 비-코딩 RNA 분자를 인코딩하는 제1 전사가능한 DNA 서열을 포함하고, 상기 제2 재조합 DNA 작제물은 제2 GA 옥시다제 유전자의 mRNA 인식 또는 표적 서열에 상보적인 제2 비-코딩 RNA 분자를 인코딩하는 제2 전사가능한 DNA 서열을 포함한다. 제1 및 제2 재조합 DNA 작제물은 단일 벡터에서 적층될 수 있고 식물에 단일 사건으로서 형질전환될 수 있거나, 또는 별개의 사건으로서 형질전환될 수 있는 별개의 벡터 또는 작제물에서 존재할 수 있다. 이들 구현예에 따르면, 제1 GA 옥시다제 유전자는 GA20 옥시다제_3, GA20 옥시다제_5, GA20 옥시다제_4, GA3 옥시다제_1, 또는 GA3 옥시다제_2 유전자일 수 있고, 제1 비-코딩 RNA 분자는 그와 같은 GA 옥시다제 유전자로부터 발현된 mRNA의 인식 또는 표적 서열에 상보적이고, 제2 GA 옥시다제 유전자는 GA20 옥시다제_3, GA20 옥시다제_5, GA20 옥시다제_4, GA3 옥시다제_1, 또는 GA3 옥시다제_2 유전자일 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 제1 및 제2 GA 옥시다제 유전자는 동일 또는 상이한 GA 옥시다제 유전자(들)일 수 있다. 대안적으로, 제2 GA 옥시다제 유전자는 또 다른 GA 옥시다제 유전자, 예컨대 GA20 옥시다제_1, GA20 옥시다제_2, GA20 옥시다제_6, GA20 옥시다제_7, GA20 옥시다제_8, 또는 GA20 옥시다제_9 유전자일 수 있고, 제2 비-코딩 RNA 분자는 그와 같은 GA 옥시다제 유전자로부터 발현된 mRNA의 인식 또는 표적 서열에 상보적이다.
본 개시내용의 구현예에 따르면, 제1 GA 옥시다제 유전자의 mRNA 인식 또는 표적 서열에 상보적인 제1 표적화 서열 및 제2 GA 옥시다제 유전자의 mRNA 인식 또는 표적 서열에 상보적인 제2 표적화 서열을 적어도 포함하는 나란히 배열된 2 이상 표적화 서열을 포함하는 비-코딩 RNA 분자를 인코딩하는 전사가능한 DNA 서열을 포함하는 억제용 GA 옥시다제 유전자를 표적화하는 재조합 DNA 작제물을 포함하는 변형된 식물이 제공된다. 비-코딩 RNA 분자는 적어도 제1 성숙한 miRNA 및 제2 miRNA를 포함하는 2 이상 성숙한 miRNAs로 가공되는 pre-miRNA로서 발현될 수 있고, 여기서 상기 제1 miRNA는 제1 GA 옥시다제 유전자의 mRNA 인식 또는 표적 부위에 상보적인 제1 표적화 서열을 포함하고, 상기 제2 miRNA는 제2 GA 옥시다제 유전자의 mRNA 인식 또는 표적 부위에 상보적인 제2 표적화 서열을 포함한다. 이들 구현예에 따르면, 제1 GA 옥시다제 유전자는 GA20 옥시다제_3, GA20 옥시다제_5, GA20 옥시다제_4, GA3 옥시다제_1, 또는 GA3 옥시다제_2 유전자일 수 있고, 제1 비-코딩 RNA 분자는 그와 같은 GA 옥시다제 유전자로부터 발현된 mRNA의 인식 또는 표적 서열에 상보적이고, 제2 GA 옥시다제 유전자는 GA20 옥시다제_3, GA20 옥시다제_5, GA20 옥시다제_4, GA3 옥시다제_1, 또는 GA3 옥시다제_2 유전자일 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 제1 및 제2 GA 옥시다제 유전자는 동일 또는 상이한 GA 옥시다제 유전자(들)일 수 있다. 대안적으로, 제2 GA 옥시다제 유전자는 또 다른 GA 옥시다제 유전자, 예컨대 GA20 옥시다제_1, GA20 옥시다제_2, GA20 옥시다제_6, GA20 옥시다제_7, GA20 옥시다제_8, 또는 GA20 옥시다제_9 유전자일 수 있고, 제2 비-코딩 RNA 분자는 그와 같은 GA 옥시다제 유전자로부터 발현된 mRNA의 인식 또는 표적 서열에 상보적이다.
상기 적층 시나리오에서, 그리고 표적화 서열이 단일 전사가능한 DNA 서열 (또는 발현 카세트)에서 또는 별개의 전사가능한 DNA 서열 (또는 발현 카세트)에서 나란히 적층되는지와 무관하게, 제2 GA 옥시다제 유전자는 GA20 옥시다제_3, GA20 옥시다제_5, GA20 옥시다제_4, GA3 옥시다제_1, 또는 GA3 옥시다제_2 유전자 이외의 GA 옥시다제 유전자, 예컨대 GA20 옥시다제_1, GA20 옥시다제_2, GA20 옥시다제_6, GA20 옥시다제_7, GA20 옥시다제_8, 또는 GA20 옥시다제_9 유전자일 수 있다. 이들 구현예에 따르면, 비-코딩 RNA 분자의 제2 표적화 서열은 서열번호: 1, 2, 4, 5, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 및/또는 26 중 임의의 하나 이상의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적일 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 비-코딩 RNA 분자의 제2 표적화 서열은 서열번호: 1, 2, 4, 5, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 및/또는 26 중 임의의 하나 이상의 적어도 19 연속적인 뉴클레오타이드, 그러나 27 이하 연속적인 뉴클레오타이드에 상보적, 예컨대 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 27 연속적인 뉴클레오타이드에 상보적일 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 비-코딩 RNA 분자의 제2 표적화 서열은 서열번호: 3, 6, 18, 21, 24, 및/또는 27 중 임의의 하나 이상에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 식물에서 내인성 GA 옥시다제 단백질을 인코딩하는 mRNA 분자의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적일 수 있다. 추가 구현예에 따르면, 비-코딩 RNA 분자의 제2 표적화 서열은 서열번호: 3, 6, 18, 21, 24, 및/또는 27 중 임의의 하나 이상에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 유사한 내인성 GA 옥시다제 단백질을 인코딩하는 mRNA 분자의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인 서열을 포함할 수 있다.
본 개시내용의 재조합 DNA 분자 또는 작제물은 표적 식물 세포, 조직 또는 외식편의 형질전환에서 사용을 위하여 DNA 형질전환 벡터를 포함할 수 있거나 상기 내에 포함될 수 있다. 그와 같은 형질전환 벡터는 일반적으로는 억제용 내인성 GA 옥시다제 유전자를 표적화하는 비-코딩 RNA 분자 또는 GA 옥시다제 유전자를 인코딩하는 적어도 하나의 이식유전자, 발현 카세트 및/또는 전사가능한 DNA 서열에 더하여 효과적인 형질전환에 필요한 또는 유익한 서열 또는 요소를 포함할 수 있다. 아그로박테리움-매개된, 리조비아-매개된 또는 다른 박테리아-매개된 형질전환을 위하여, 형질전환 벡터는, 적어도 전사가능한 DNA 서열 또는 이식유전자를 측접하는, 2개의 경계 서열, 좌측 경계 (LB) 및 우측 경계 (RB)를 갖는 조작된 전달 DNA (또는 T-DNA) 분절 또는 영역을 포함할 수 있어서, 이로써 T-DNA의 식물 게놈에의 삽입은 전사가능한 DNA 서열, 이식유전자 또는 발현 카세트에 대하여 형질전환 이벤트를 창출할 것이다. 따라서, 억제용 내인성 GA 옥시다제 유전자를 표적화하는 비-코딩 RNA 분자를 인코딩하는 전사가능한 DNA 서열, 이식유전자 또는 발현 카세트는, 아마 추가의 이식유전자(들) 또는 발현 카세트(들), 예컨대 작물학적 관심의 특성 또는 표현형을 식물에 부여할 수 있는 작물학적 관심의 식물 선택가능한 마커 이식유전자 및/또는 다른 유전자(들)과 함께, T-DNA의 좌측 및 우측 경계 사이 위치할 수 있다. 대안적인 구현예에 따르면, 억제용 내인성 GA 옥시다제 유전자를 표적화하는 비-코딩 RNA 분자를 인코딩하는 전사가능한 DNA 서열, 이식유전자 또는 발현 카세트 그리고 식물 선택가능한 마커 이식유전자 (또는 작물학적 관심의 다른 유전자)는, 예컨대 공-형질전환을 위하여, 동일 또는 상이한 재조합 DNA 분자(들)상의 별개의 T-DNA 분절에서 존재할 수 있다. 형질전환 벡터 또는 작제물은 추가로, T-DNA 영역(들)의 외부 벡터에서 위치할 수 있는, 원핵 유지 요소를 포함할 수 있다.
본 개시내용의 형질전환 벡터 또는 작제물에서 식물 선택가능한 마커 이식유전자는 선택 제제, 예컨대 항생제 또는 제초제의 존재로 인해 형질전환된 세포 또는 조직의 선택에서 일조하는데 사용될 수 있고, 여기서 상기 식물 선택가능한 마커 이식유전자는 선택 제제에 내성 또는 저항을 제공한다. 따라서, 선택 제제는, 예컨대 R0 식물에서 형질전환된 세포 또는 조직의 분율을 증가시키기 위해, 식물 선택가능한 마커 유전자를 발현시키는 형질전환된 세포의 생존, 발생, 성장, 증식, 등을 편향 또는 선호할 수 있다. 통상적으로 사용된 식물 선택가능한 마커 유전자는, 예를 들어, 항생제에 내성 또는 저항을 부여하는 것, 예컨대 카나마이신 및 파로모마이신 (nptII), 하이그로마이신 B (aph IV), 스트렙토마이신 또는 스펙티노마이신 (aadA) 및 겐타마이신 (aac3 및 aacC4), 또는 제초제에 내성 또는 저항을 부여하는 것 예컨대 글루포시네이트 (bar 또는 pat), 디캄바 (DMO) 및 글라이포세이트 (aroA 또는 EPSPS)를 포함한다. 형질전환체, 예컨대 루시퍼라아제 또는 녹색 형광 단백질 (GFP), 또는 다양한 발색 기질이 공지되어 있는 uidA 유전자 (GUS) 또는 베타 글루쿠로니다제를 발현시키는 유전자에 시각적으로 스크리닝하는 능력을 제공하는, 식물 선택가능한 마커 유전자는 또한 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 명세서에서 제공된 벡터 또는 폴리뉴클레오타이드는 nptII, aph IV, aadA, aac3, aacC4, bar, pat, DMO, EPSPS, aroA, GFP, 및 GUS로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 선택가능한 마커 유전자를 포함한다. 식물 형질전환은 또한 형질전환된 외식편, 조직, 식물 및/또는 식물 부분 배양, 발생 또는 재생의 하나 이상의 단계 또는 단계들 동안 선택의 부재 하에서 수행될 수 있다.
본 구현예에 따르면, 재조합 DNA 분자 또는 작제물로 식물 세포, 조직 또는 외식편의 형질전환 방법은 추가로 부위 지향적 또는 표적화된 통합을 포함할 수 있다. 이들 방법에 따르면, 재조합 DNA 공여체 템플레이트 분자 (즉, 삽입 서열)의 한 부분은 식물 게놈 이내 원하는 부위 또는 유전자좌에서 삽입 또는 통합될 수 있다. 공여체 템플레이트의 삽입 서열은 이식유전자 또는 작제물, 예컨대 억제용 내인성 GA 옥시다제 유전자를 표적화하는 비-코딩 RNA 분자를 인코딩하는 이식유전자 또는 전사가능한 DNA 서열을 포함할 수 있다. 공여체 템플레이트는 또한 상동성 재조합 및/또는 상동성-유도 복구를 통해 표적화된 삽입 사건을 촉진시키기 위해 삽입 서열을 측접하는 1 또는 2 상동성 아암을 가질 수 있다. 각각의 상동성 아암은 외떡잎식물 또는 곡물 식물의 게놈 이내 표적 DNA 서열의 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 500, 적어도 1000, 적어도 2500, 또는 적어도 5000 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 또는 상보적일 수 있다. 따라서, 본 개시내용의 재조합 DNA 분자는, 식물의 게놈에, 이식유전자 또는 작제물, 예컨대 억제용 내인성 GA 옥시다제 유전자를 표적화하는 비-코딩 RNA 분자를 인코딩하는 이식유전자 또는 전사가능한 DNA 서열의 부위 지향적 또는 표적화된 통합용 공여체 템플레이트를 포함할 수 있다.
식물의 게놈 이내 임의의 부위 또는 유전자좌는 잠재적으로 본 명세서에서 제공된 이식유전자, 작제물 또는 전사가능한 DNA 서열의 부위 지향적 통합을 위하여 선택될 수 있다. 부위 지향적 통합을 위하여, 이중-가닥 절단 (DSB) 또는 닉은 선택된 유전자 좌위에서 부위-특이적 뉴클레아제, 예컨대, 예를 들어, 아연-핑거 뉴클레아제, 조작된 또는 고유 메가뉴클레아제, TALE-엔도뉴클레아제, 또는 RNA-유도된 엔도뉴클레아제 (예를 들어, Cas9 또는 Cpf1)로 최초 실시될 수 있다. 부위 지향적 통합을 위한 당해 분야에 공지된 임의의 방법은 사용될 수 있다. 삽입 서열을 가진 공여체 템플레이트 분자의 존재 하에서, DSB 또는 닉은, DSB 또는 닉의 부위에서 표적화된 삽입 사건을 창출하기 위해 식물 게놈 속에 삽입 서열의 부위 지향적 통합을 초래하는, 비-상동성 말단 연결 (NHEJ)에 의해 또는, 공여체 템플레이트의 상동성 아암(들)과 식물 게놈 사이 상동성 재조합에 의해 복구될 수 있다. 따라서, 이식유전자, 작제물 또는 서열의 부위-특이적 삽입 또는 통합은 달성될 수 있다.
DSB 또는 닉의 도입은 또한 식물의 게놈에서 표적화된 돌연변이를 도입하는데 사용될 수 있다. 이 접근법에 따르면, 돌연변이, 예컨대 결실, 삽입, 역전 및/또는 치환은 GA 옥시다제 유전자의 녹아웃 또는 녹다운을 생산하기 위해 DSB 또는 닉의 불완전 복구를 통해 표적 부위에서 도입될 수 있다. 그와 같은 돌연변이는 심지어 공여체 템플레이트 분자의 사용 없이 표적화된 유전자좌의 불완전 복구에 의해 생성될 수 있다. GA 옥시다제 유전자의 "녹아웃"은 GA 옥시다제 단백질의 비-발현 또는 비-기능성 단백질의 발현을 초래하는 GA 옥시다제 유전자의 내인성 유전자좌에서 또는 근처에서 DSB 또는 닉을 유도함으로써 달성될 수 있고, 반면에 GA 옥시다제 유전자의 "녹다운"은 인코딩된 GA 옥시다제 단백질의 기능을 제거할 방식으로 GA 옥시다제 유전자의 코딩 서열에 영향을 주지 않는 부위에서 불완전하게 복구되는 GA 옥시다제 유전자의 내인성 유전자좌에서 또는 근처에서 DSB 또는 닉을 유도함으로써 유사한 방식으로 달성될 수 있다. 예를 들어, 내인성 유전자좌 이내 DSB 또는 닉의 부위는 그것의 발현 수준에 영향을 주기 위해 또는 발현 수준을 감소시키기 위해 GA 옥시다제 유전자의 업스트림 또는 5' 영역 (예를 들어, 프로모터 및/또는 증진제 서열)에서일 수 있다. 유사하게, GA 옥시다제 유전자의 그와 같은 표적화된 녹아웃 또는 녹다운 돌연변이는 DSB 또는 닉의 복구를 통해 표적 부위에서 또는 근처에서 특정 또는 원하는 돌연변이를 유도하기 위해 공여체 템플레이트 분자로 생성될 수 있다. 공여체 템플레이트 분자는, DSB 또는 닉의 부위에서 또는 근처에서 표적화된 유전자 서열에 비하여, 하나 이상의 돌연변이, 예컨대 하나 이상의 결실, 삽입, 역전 및/또는 치환을 포함하는 그리고 삽입 서열이 있거나 없는 상동성 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, GA 옥시다제 유전자의 표적화된 녹아웃 돌연변이는 유전자의 적어도 일부분을 결실 또는 역전시킴으로써 또는 프레임 이동 또는 미성숙한 정지 코돈을 유전자의 코딩 서열에 도입시킴으로써 달성될 수 있다. GA 옥시다제 유전자의 한 부분의 결실은 또한 2개의 표적 부위에서 DSBs 또는 닉을 생성함으로써 그리고 표적 부위에 의해 측접된 개입 표적 영역의 결실을 야기시킴으로써 도입될 수 있다.
본 명세서에서 제공된 부위-특이적 뉴클레아제는 아연-핑거 뉴클레아제 (ZFN), 메가뉴클레아제, RNA-유도된 엔도뉴클레아제, TALE-엔도뉴클레아제 (TALEN), 재조합효소, 전위효소, 또는 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 참고, 예를 들어, Khandagale, K. 등, "Genome editing for targeted improvement in plants", Plant Biotechnol Rep 10: 327-343 (2016); 및 Gaj, T. 등, "ZFN, TALEN and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering", Trends Biotechnol. 31(7): 397-405 (2013), 이의 내용 및 개시내용은 본 명세서에 참고로 편입됨. 재조합효소는 DNA 인식 모티프에 부착된 세린 재조합효소, DNA 인식 모티프에 부착된 티로신 재조합효소 또는 당업계에서 공지된 다른 재조합효소 효소일 수 있다. 재조합효소 또는 전위효소는 DNA 결합 도메인에 부착된 DNA 전위효소 또는 재조합효소일 수 있다. DNA 인식 모티프에 부착된 티로신 재조합효소는 Cre 재조합효소, Flp 재조합효소, 및 Tnp1 재조합효소로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 본 명세서에서 제공된 Cre 재조합효소 또는 Gin 재조합효소는 아연-핑거 DNA 결합 도메인에 결박된다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 제공된 DNA 인식 모티프에 부착된 세린 재조합효소는 PhiC31 인테그라제, R4 인테그라제, 및 TP-901 인테그라제로 구성된 군으로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 제공된 DNA 결합 도메인에 부착된 DNA 전위효소는 TALE-piggyBac 및 TALE-돌연변이유발유전자로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 개시내용의 구현예에 따르면, RNA-유도된 엔도뉴클레아제는 하기로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다: Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (Csn1 및 Csx12로도 공지됨), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, Cpf1, CasX, CasY, 및 이의 동족체 또는 변형된 버전, 아르고노트 (아르고노트 단백질의 비-제한적인 예는 하기를 포함한다: 테르무스 써모필루스 아르고노트 (TtAgo), 파이로코쿠스 푸리오서스 아르고노트 (PfAgo), 나트로노박테리움 그레고리이 아르고노트 (NgAgo) 및 이의 동족체 또는 변형된 버전. 일부 구현예에 따르면, RNA-유도된 엔도뉴클레아제는 Cas9 또는 Cpf1 효소일 수 있다.
일 양태에서, 본 명세서에서 제공된 부위-특이적 뉴클레아제는 아연-핑거 뉴클레아제, 메가뉴클레아제, RNA-유도된 뉴클레아제, TALE-뉴클레아제, 재조합효소, 전위효소, 또는 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 또 다른 양태에서, 본 명세서에서 제공된 부위-특이적 뉴클레아제는 Cas9 또는 Cpf1로 구성된 군으로부터 선택된다. 또 다른 양태에서, 본 명세서에서 제공된 부위-특이적 뉴클레아제는 하기로 구성된 군으로부터 선택된다: Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9, Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, Cpf1, CasX, CasY, 이의 동족체, 또는 이의 변형된 버전. 또 다른 양태에서, 본 명세서에서 제공된 RNA-유도된 뉴클레아제는 Cas9 또는 Cpf1로 구성된 군으로부터 선택된다. 또 다른 양태에서, 본 명세서에서 제공된 RNA 유도된 뉴클레아제는 하기로 구성된 군으로부터 선택된다: Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9, Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, Cpf1, CasX, CasY, 이의 동족체, 또는 이의 변형된 버전. 또 다른 양태에서, 본 명세서에서 제공된 방법 및/또는 조성물은 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 또는 적어도 10 부위-특이적 뉴클레아제를 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 명세서에서 제공된 방법 및/또는 조성물은 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 또는 적어도 10 부위-특이적 뉴클레아제를 인코딩하는 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 또는 적어도 10 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
RNA-유도된 엔도뉴클레아제에 대하여, 가이드 RNA (gRNA) 분자는 추가로 표적 부위에서 또는 근처에서 DSB 또는 닉을 야기시키기 위해 염기짝짓기 또는 하이브리드화를 통해 식물의 게놈에서 표적 부위에 엔도뉴클레아제를 유도하도록 제공된다. gRNA는 식물-발현성 프로모터에 작동가능하게 연결된 가이드 RNA를 인코딩하는 전사가능한 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자, 작제물 또는 벡터로서 또는, gRNA 분자로서 (아마 뉴클레아제, 또는 뉴클레아제-인코딩 DNA 분자, 작제물 또는 벡터와 함께) 식물 세포 또는 조직에 형질전환 또는 도입될 수 있다. 당업계에서 이해되는 바와 같이, "가이드 RNA"는, 예를 들어, CRISPR RNA (crRNA), 단일-사슬 가이드 RNA (sgRNA), 또는 게놈에서 특정 표적 부위에 엔도뉴클레아제를 안내 또는 유도할 수 있는 임의의 다른 RNA 분자를 포함할 수 있다. "단일-사슬 가이드 RNA" (또는 "sgRNA")는, 단일 RNA 전사체 또는 분자로서 발현될 수 있는, 링커 서열에 의해 tracrRNA에 공유결합된 crRNA를 포함하는 RNA 분자이다. 가이드 RNA는 식물 게놈 이내 표적 부위에, 예컨대 GA 옥시다제 유전자에서 또는 근처에서 동일한 또는 상보적인 가이드 또는 표적화 서열을 포함한다. 프로토스페이서-인접 모티프 (PAM)은 가이드 RNA의 표적화 서열에 상보적인 게놈 표적 부위 서열의 5' 말단에 바로 인접한 및 업스트림 - 즉, 당해 분야에서 공지된 바와 같이 (가이드 RNA의 표적화 서열에 비하여) 게놈 표적 부위의 센스 (+) 가닥에 즉시 다운스트림 (3') 게놈에서 존재할 수 있다. 참고, 예를 들어, Wu, X. 등, "Target specificity of the CRISPR-Cas9 system", Quant Biol. 2(2): 59-70 (2014), 이의 내용 및 개시내용은 본 명세서에 참고로 편입됨. (가이드 RNA의 표적화 서열에 비하여) 표적 부위에 인접한 센스 (+) 가닥에서 게놈 PAM 서열은 5'-NGG-3'를 포함할 수 있다. 그러나, 가이드 RNA의 상응하는 서열 (즉, 가이드 RNA의 표적화 서열에 즉시 다운스트림 (3'))는 일반적으로 게놈 PAM 서열에 상보적이지 않을 수 있다. 가이드 RNA는 전형적으로 단백질을 인코딩하지 않는 비-코딩 RNA 분자일 수 있다. 가이드 RNA의 가이드 서열은 적어도 10 뉴클레오타이드, 예컨대 12-40 뉴클레오타이드, 12-30 뉴클레오타이드, 12-20 뉴클레오타이드, 12-35 뉴클레오타이드, 12-30 뉴클레오타이드, 15-30 뉴클레오타이드, 17-30 뉴클레오타이드, 또는 17-25 뉴클레오타이드, 또는 약 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 그 초과 뉴클레오타이드일 수 있다. 가이드 서열은 게놈 표적 부위에서 DNA 서열의 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 또는 그 초과 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일할 수 있거나 또는 상보적일 수 있다.
RNA-유도된 엔도뉴클레아제로 GA20 옥시다제_3 유전자에서 또는 근처에서 게놈 편집을 위하여, 서열번호: 34 또는 거기에 상보적인 서열의 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 또는 그 초과 연속적인 뉴클레오타이드 (예를 들어, 서열번호: 34 또는 거기에 상보적인 서열의 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 그 초과 연속적인 뉴클레오타이드)에 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 또는 상보적인 가이드 서열을 포함하는 가이드 RNA가 사용될 수 있다. RNA-유도된 엔도뉴클레아제로 GA20 옥시다제_5 유전자에서 또는 근처에서 게놈 편집을 위하여, 서열번호: 35 또는 거기에 상보적인 서열의 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 또는 그 초과 연속적인 뉴클레오타이드 (예를 들어, 서열번호: 35 또는 거기에 상보적인 서열의 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 그 초과 연속적인 뉴클레오타이드)에 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 또는 상보적인 가이드 서열을 포함하는 가이드 RNA는 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 폴리뉴클레오타이드 또는 단백질 서열과 관련하여 용어 "연속적인"은 서열에서 결실 또는 갭 없음을 의미한다.
게놈 편집을 통한 녹다운 (및 가능하게는 녹아웃) 돌연변이를 위하여, RNA-유도된 엔도뉴클레아제는 GA20 옥시다제_3 또는 GA20 옥시다제_5 유전자의 업스트림 또는 다운스트림 서열, 예컨대 프로모터 및/또는 증진제 서열, 또는 인트론, 5'UTR, 및/또는 3'UTR 서열에 표적화되어 유전자의 하나 이상의 프로모터 및/또는 조절 서열을 돌연변이시킬 수 있고 그것의 발현 수준에 영향을 줄 수 있거나 감소시킬 수 있다. 옥수수에서 GA20 옥시다제_3 유전자의 녹다운 (및 가능하게는 녹아웃)을 위하여, 서열번호: 34의 뉴클레오타이드 서열 범위 1-3096, 서열번호: 34의 뉴클레오타이드 서열 범위 3666-3775, 서열번호: 34의 뉴클레오타이드 서열 범위 4098-5314, 서열번호: 34의 뉴클레오타이드 서열 범위 5585-5800, 또는서열번호: 34의 뉴클레오타이드 서열 범위 5801-8800, 또는 거기에 상보적인 서열 이내 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 또는 그 초과 연속적인 뉴클레오타이드 (예를 들어, 서열번호: 34의 뉴클레오타이드 서열 범위 1-3096, 3666-3775, 4098-5314, 5585-5800, 5801-8800, 또는 5585-8800, 또는 거기에 상보적인 서열 이내 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 그 초과 연속적인 뉴클레오타이드)에 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 또는 상보적인 가이드 서열을 포함하는 가이드 RNA가 사용될 수 있다.
옥수수에서 GA20 옥시다제_5 유전자의 녹다운 (및 가능하게는 녹아웃)을 위하여, 서열번호: 35의 뉴클레오타이드 서열 범위 1-3000, 서열번호: 35의 뉴클레오타이드 서열 범위 1-3000, 서열번호: 35의 뉴클레오타이드 서열 범위 3792-3906, 서열번호: 35의뉴클레오타이드 서열 범위 4476-5197, 또는 서열번호: 35의 뉴클레오타이드 서열 범위 5860-8859, 또는 거기에 상보적인 서열 이내 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 또는 그 초과 연속적인 뉴클레오타이드 (예를 들어, 서열번호: 35의 뉴클레오타이드 서열 범위 1-3000, 3792-3906, 4476-5197, 또는 5860-8859, 또는 거기에 상보적인 서열 이내 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 그 초과 연속적인 뉴클레오타이드)에 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 또는 상보적인 가이드 서열을 포함하는 가이드 RNA가 사용될 수 있다.
게놈 편집을 통한 녹아웃 (및 가능하게는 녹다운) 돌연변이를 위하여, RNA-유도된 엔도뉴클레아제는 GA20 옥시다제_3 또는 GA20 옥시다제_5 유전자의 코딩 및/또는 인트론 서열에 표적화되어 유전자로부터 기능적 GA 옥시다제 단백질의 발현 및/또는 활성을 잠재적으로 제거할 수 있다. 그러나, GA 옥시다제 유전자 발현의 녹아웃은 또한 일부 경우에 유전자의 업스트림 및/또는 5'UTR 서열(들), 또는 유전자의 유전자 좌위에서 또는 근처에서 다른 서열 표적화에 의해 달성될 수 있다. 따라서, GA 옥시다제 유전자 발현의 녹아웃은, GA20 옥시다제_3 또는 GA20 옥시다제_5 유전자의 녹다운을 위하여 상기에 기재된 바와 같이, 표적화된 GA20 옥시다제_3 또는 GA20 옥시다제_5 유전자의 부위 또는 유전자좌에서 또는 근처에서 유전자 서열, GA20 옥시다제_3 또는 GA20 옥시다제_5 유전자의 업스트림 또는 다운스트림 서열, 예컨대 프로모터 및/또는 증진제 서열, 또는 인트론, 5'UTR, 및/또는 3'UTR 서열 표적화에 의해 달성될 수 있다.
옥수수에서 GA20 옥시다제_3 유전자의 녹아웃 (및 가능하게는 녹다운)을 위하여, 서열번호: 34의 뉴클레오타이드 서열 범위 3097-5584, 서열번호: 34의 뉴클레오타이드 서열 범위 3097-3665, 서열번호: 34의 뉴클레오타이드 서열 범위 3776-4097, 또는 서열번호: 34의 뉴클레오타이드 서열 범위 5315-5584, 또는 거기에 상보적인 서열 이내 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 또는 그 초과 연속적인 뉴클레오타이드 (예를 들어, 서열번호: 34의 뉴클레오타이드 서열 범위 3097-5584, 3097-3665, 3097-3775, 3665-4097, 3776-4097, 3776-5314, 4098-5584, 또는 5315-5584, 또는 거기에 상보적인 서열 이내 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 그 초과 연속적인 뉴클레오타이드)에 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 또는 상보적인 가이드 서열을 포함하는 가이드 RNA가 사용될 수 있다.
옥수수에서 GA20 옥시다제_5 유전자의 녹아웃 (및 가능하게는 녹다운)을 위하여, 서열번호: 35의 뉴클레오타이드 서열 범위 3001-5473, 서열번호: 35의 뉴클레오타이드 서열 범위 3001-3791, 서열번호: 35의 뉴클레오타이드 서열 범위 3907-4475, 또는 서열번호: 35의 뉴클레오타이드 서열 범위 5198-5473, 또는 거기에 상보적인 서열 이내 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 또는 그 초과 연속적인 뉴클레오타이드 (예를 들어, 서열번호: 35의 뉴클레오타이드 서열 범위 3001-5473, 3001-3791, 3001-3906, 3792-4475, 3907-4475, 3907-5197, 4476-5473, 또는 5198-5473, 또는 거기에 상보적인 서열 이내 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 그 초과 연속적인 뉴클레오타이드)에 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 또는 상보적인 가이드 서열을 포함하는 가이드 RNA가 사용될 수 있다.
일부 구현예에 따르면, 서열번호: 138-167 중 임의의 하나 이상의 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 또는 적어도 21 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 또는 상보적인 가이드 서열을 포함하는 내인성 GA20 옥시다제_3 및/또는 GA20 옥시다제_5 유전자 표적화용 가이드 RNA가 제공된다.
RNA-유도된 엔도뉴클레아제로 GA20 옥시다제_4 유전자에서 또는 근처에서 게놈 편집을 위하여, 서열번호: 38의 또는 거기에 상보적인 서열의 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 또는 그 초과 연속적인 뉴클레오타이드 (예를 들어, 서열번호: 38 또는 거기에 상보적인 서열의 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 그 초과 연속적인 뉴클레오타이드)에 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 또는 상보적인 가이드 서열을 포함하는 가이드 RNA가 사용될 수 있다.
게놈 편집을 통한 녹아웃 (및 가능하게는 녹다운) 돌연변이를 위하여, RNA-유도된 엔도뉴클레아제는 GA20 옥시다제_4 유전자의 코딩 및/또는 인트론 서열에 표적화되어 유전자로부터 기능적 GA20 옥시다제_4 단백질의 발현 및/또는 활성을 잠재적으로 제거할 수 있다. 옥수수에서 GA20 옥시다제_4 유전자를 위하여, 서열번호: 38의 뉴클레오타이드 서열 범위 1544-2852, 서열번호: 38의 뉴클레오타이드 서열 범위 1544-1995, 서열번호: 38의 뉴클레오타이드 서열 범위 2084-2411, 또는 서열번호: 38의 뉴클레오타이드 서열 범위 2517-2852, 또는 거기에 상보적인 서열 이내 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 또는 그 초과 연속적인 뉴클레오타이드 (예를 들어, 서열번호: 38의 뉴클레오타이드 서열 범위 1544-2852, 1544-1995, 1544-2083, 1996-2411, 2084-2411, 2084-2516, 2412-2852, 또는 2517-2852, 또는 거기에 상보적인 서열 이내 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 그 초과 연속적인 뉴클레오타이드)에 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 또는 상보적인 가이드 서열을 포함하는 가이드 RNA가 사용될 수 있다.
게놈 편집을 통한 녹다운 (및 가능하게는 녹아웃) 돌연변이를 위하여, RNA-유도된 엔도뉴클레아제는 GA20 옥시다제_4 유전자의 업스트림 또는 다운스트림 서열, 예컨대 프로모터 및/또는 증진제 서열, 또는 인트론, 5'UTR, 및/또는 3'UTR 서열에 표적화되어 유전자의 하나 이상의 프로모터 및/또는 조절 서열을 돌연변이시킬 수 있고 그것의 발현 수준에 영향을 줄 수 있거나 상기를 감소시킬 수 있다. 옥수수에서 GA20 옥시다제_3 유전자의 녹다운을 위하여, 서열번호: 38의 뉴클레오타이드 서열 범위 1-1416, 서열번호: 38의 뉴클레오타이드 서열 범위 1417-1543, 서열번호: 38의 뉴클레오타이드 서열 범위 1996-2083, 서열번호: 38의 뉴클레오타이드 서열 범위 2412-2516, 서열번호: 38의 뉴클레오타이드 서열 범위 2853-3066, 또는 서열번호: 38의 뉴클레오타이드 서열 범위 3067-4465, 또는 거기에 상보적인 서열 이내 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 또는 그 초과 연속적인 뉴클레오타이드 (예를 들어, 서열번호: 38, 또는 거기에 상보적인 서열의 뉴클레오타이드 서열 범위 1-1416, 1417-1543, 1-1543, 1996-2083, 2412-2516, 2853-3066, 3067-4465 또는 2853-4465 이내 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 그 초과 연속적인 뉴클레오타이드)에 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 또는 상보적인 가이드 서열을 포함하는 가이드 RNA가 사용될 수 있다.
가이드 서열에 더하여, 가이드 RNA는 추가로, RNA-유도된 엔도뉴클레아제와 결합 또는 상호작용할 수 있는, 하나 이상의 다른 구조적 또는 스캐폴드 서열(들)을 포함할 수 있다. 그와 같은 스캐폴드 또는 구조적 서열은 추가로 다른 RNA 분자 (예를 들어, tracrRNA)와 상호작용할 수 있다. RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 사용하여 식물의 게놈 이내 표적 부위에서 게놈 편집 및 부위 지향적 통합을 위하여 표적화 작제물 및 가이드 RNAs의 설계 방법 및 기술은 당해 기술에 공지되어 있다.
일부 구현예에 따르면, 부위-특이적 뉴클레아제, 예컨대 아연-핑거 뉴클레아제 (ZFN), 메가뉴클레아제, RNA-유도된 엔도뉴클레아제, TALE-엔도뉴클레아제 (TALEN), 재조합효소, 또는 전위효소를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 DNA 작제물 및 벡터가 제공되고, 여기서 상기 코딩 서열은 식물 발현성 프로모터에 작동가능하게 연결된다. RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 위하여, 가이드 RNA를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 DNA 작제물 및 벡터가 추가로 제공되고, 여기서 상기 가이드 RNA는 식물의 게놈 이내, 예컨대 표적화된 GA 옥시다제 유전자에서 또는 근처에서 표적 부위에 퍼센트 동일성 또는 상보성을 갖는 충분한 길이의 가이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 부위-특이적 뉴클레아제 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 재조합 DNA 작제물 및 벡터의 폴리뉴클레오타이드 서열은 식물 발현성 프로모터, 예컨대 유도성 프로모터, 항시성 프로모터, 조직-특이적 프로모터, 등에 작동가능하게 연결될 수 있다.
일부 구현예에 따르면, 재조합 DNA 작제물 또는 벡터는 부위-특이적 뉴클레아제를 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오타이드 서열 그리고 식물 형질전환 기술을 통해 함께 식물 세포에 도입될 수 있는 가이드 RNA를 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 제1 재조합 DNA 작제물 또는 벡터 그리고 식물 형질전환 기술을 통해 함께 또는 순차적으로 식물 세포에 도입될 수 있는 제2 DNA 작제물 또는 벡터를 포함하는 2개의 재조합 DNA 작제물 또는 벡터는 제공될 수 있고, 여기서 상기 제1 재조합 DNA 작제물 또는 벡터는 부위-특이적 뉴클레아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하고 상기 제2 재조합 DNA 작제물 또는 벡터는 가이드 RNA를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 부위-특이적 뉴클레아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 DNA 작제물 또는 벡터는 가이드 RNA를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 DNA 작제물 또는 벡터를 이미 포함하는 (또는 상기로 형질전환되는) 식물 세포에 식물 형질전환 기술을 통해 도입될 수 있다. 대안적으로, 가이드 RNA를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 DNA 작제물 또는 벡터는 부위-특이적 뉴클레아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 DNA 작제물 또는 벡터를 이미 포함하는 (또는 상기로 형질전환되는) 식물 세포에 식물 형질전환 기술을 통해 도입될 수 있다. 추가 구현예에 따르면, 부위-특이적 뉴클레아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 DNA 작제물 또는 벡터를 포함하는 (또는 상기로 형질전환되는) 제1 식물은 가이드 RNA를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 DNA 작제물 또는 벡터를 포함하는 (또는 상기로 형질전환되는) 제2 식물과 교배될 수 있다. 그와 같은 재조합 DNA 작제물 또는 벡터는 식물 세포에 일시적으로 형질전환될 수 있거나 식물 세포의 게놈으로 안정적으로 형질전환 또는 상기에 통합될 수 있다.
일 양태에서, 부위-특이적 뉴클레아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 선택적으로 1 이상, 2 이상, 3 이상, 또는 4 이상 gRNAs를 포함하는 벡터는 식물 세포에 당해 분야에서 공지된 형질전환 방법 (예를 들어, 제한 없이, 입자 폭격, PEG-매개된 원형질 형질감염 또는 아그로박테리움-매개된 형질전환)에 의해 제공된다. 일 양태에서, Cas9 뉴클레아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 선택적으로 1 이상, 2 이상, 3 이상, 또는 4 이상 gRNAs를 포함하는 벡터는 식물 세포에 당해 분야에서 공지된 형질전환 방법 (예를 들어, 제한 없이, 입자 폭격, PEG-매개된 원형질 형질감염 또는 아그로박테리움-매개된 형질전환)에 의해 제공된다. 또 다른 양태에서, Cpf1을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및, 선택적으로 1 이상, 2 이상, 3 이상, 또는 4 이상 crRNAs를 포함하는 벡터는 세포에 당해 분야에서 공지된 형질전환 방법 (예를 들어, 제한 없이, 바이러스성 형질감염, 입자 폭격, PEG-매개된 원형질 형질감염 또는 아그로박테리움-매개된 형질전환)에 의해 제공된다.
몇 개의 부위-특이적 뉴클레아제, 예컨대 재조합효소, 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFNs), 메가뉴클레아제, 및 TALENs는 RNA-유도되지 않고 대신에 그것의 단백질 구조에 의존하여 DSB 또는 닉 야기를 위하여 그것의 표적 부위를 결정하거나, 또는 이들은 DNA-결합 단백질 도메인 또는 모티프에 융합, 결박 또는 부착된다. 부위-특이적 뉴클레아제 (또는 융합된/부착된/결박된 DNA 결합 도메인)의 단백질 구조는 부위-특이적 뉴클레아제를 표적 부위에 표적화할 수 있다. 많은 이들 구현예에 따르면, 비-RNA-유도된 부위-특이적 뉴클레아제, 예컨대 재조합효소, 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFNs), 메가뉴클레아제, 및 TALENs는 공지된 방법에 따라 설계, 조작 및 작제되어 옥수수 또는 곡물 식물의 내인성 GA 옥시다제 유전자, 예컨대 옥수수에서 GA20 옥시다제_3 유전자 또는 GA20 옥시다제_5 유전자의 유전자 좌위에서 또는 근처에서 표적 부위에 결합하고 상기를 표적화하여, DSB 또는 닉의 회복을 통해 GA 옥시다제 유전자의 발현 녹아웃 또는 녹다운시키기 위해 그와 같은 유전자 좌위에서 DSB 또는 닉을 창출할 수 있다. 예를 들어, 조작된 부위-특이적 뉴클레아제, 예컨대 재조합효소, 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 메가뉴클레아제, 또는 TALEN은 (i) GA20 옥시다제_3 유전자용 유전자 좌위에서 DSB 또는 닉을 창출하기 위해, 서열번호: 34 이내 서열, 또는 그것의 상보적 서열에 상응하는 식물의 게놈 이내 표적 부위, (ii) GA20 옥시다제_5 유전자용 유전자 좌위에서 DSB 또는 닉을 창출하기 위해, 서열번호: 35 이내 서열, 또는 그것의 상보적 서열에 상응하는 식물의 게놈 이내 표적 부위, 또는 (iii) GA20 옥시다제_4 유전자용 유전자 좌위에서 DSB 또는 닉을 창출하기 위해, 서열번호: 38 이내 서열, 또는 그것의 상보적 서열에 상응하는 식물의 게놈 이내 표적 부위를 표적화 및 상기에 결합하도록 설계될 수 있고, 이는 그 다음, 공여체 분자 또는 템플레이트에 의해 유도될 수 있는, 세포 회복 기전을 통해, DSB 또는 닉의 부위에서 서열의 돌연변이 또는 삽입의 창출로 이어질 수 있다.
일 양태에서, 본 명세서에서 기재된 표적화된 게놈 편집 기술은 재조합효소의 사용을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, DNA 인식 도메인 또는 모티프에 부착된 티로신 재조합효소, 등은 Cre 재조합효소, Flp 재조합효소, 및 Tnp1 재조합효소로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 일 양태에서, 본 명세서에서 제공된 Cre 재조합효소 또는 Gin 재조합효소는 아연-핑거 DNA 결합 도메인에 결박될 수 있다. Flp-FRT 부위 지향적 재조합 시스템은 베이커의 효모 사카로마이세스 세레비지애로부터 2μ 플라스미드에서 나올 수 있다. 이 시스템에서, Flp 재조합효소 (플립파제)는 플립파제 인식 표적 (FRT) 부위 사이 서열을 재조합시킬 수 있다. FRT 부위는 34 뉴클레오타이드를 포함한다. Flp는 FRT 부위의 "아암"에 결합할 수 있고 (하나의 아암은 역방향이다) 개입 핵산 서열의 한쪽 끝에서 FRT 부위를 절단시킨다. 절단 후, Flp는 2개의 FRT 부위 사이 핵산 서열을 재조합시킬 수 있다. Cre-lox는 Flp-FRT 재조합 시스템에 유사한 박테리오파아지 P1로부터 유래된 부위 지향적 재조합 시스템이다. Cre-lox는 핵산 서열을 역전, 핵산 서열을 결실, 또는 핵산 서열을 전위시키는데 사용될 수 있다. 이 시스템에서, Cre 재조합효소는 한 쌍의 lox 핵산 서열을 재조합시킬 수 있다. Lox 부위는 34 뉴클레오타이드를 포함하고, 최초 및 최종 13 뉴클레오타이드 (아암)은 회문성이다. 재조합 동안, Cre 재조합효소 단백질은 상이한 핵산에서 2개의 lox 부위에 결합하고 lox 부위에서 절단한다. 절단된 핵산은 함께 스플라이싱되고 (상호 전위되고) 재조합은 완료된다. 또 다른 양태에서, 본 명세서에서 제공된 lox 부위는 loxP, lox 2272, loxN, lox 511, lox 5171, lox71, lox66, M2, M3, M7, 또는 M11 부위이다.
ZFNs는, 제한 엔도뉴클레아제 (예를 들어, FokI)로부터 유래될 수 있는, 절단 도메인 (또는 절단 반-도메인)에 융합된 조작된 아연 핑거 DNA-결합 도메인으로 구성된 합성 단백질이다. DNA 결합 도메인은 표준적 (C2H2) 또는 비-표준적 (예를 들어, C3H 또는 C4)일 수 있다. DNA-결합 도메인은 표적 부위에 의존하여 하나 이상의 아연 핑거 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 그 초과 아연 핑거)를 포함할 수 있다. DNA-결합 도메인에서 다중 아연 핑거는 링커 서열(들)에 의해 분리될 수 있다. ZFNs는 아연 핑거 DNA-결합 도메인의 변형에 의해 이중-가닥 DNA의 거의 임의의 스트레치를 절단하도록 설계될 수 있다. ZFNs는 표적 부위 DNA 서열을 결합시키기 위해 조작된 아연 핑거 어레이를 포함하는 DNA-결합 도메인에 융합된 비-특이적 DNA 절단 도메인으로 구성된 (예를 들어, FokI 뉴클레아제로부터 유래된) 단량체로부터 이량체를 형성한다. ZFN의 DNA-결합 도메인은 전형적으로 3-4 (또는 그 초과) 아연-핑거로 구성될 수 있다. 표적 부위에 부위-특이적 결합에 기여하는, 아연 핑거 α-나선의 개시에 비하여 위치 -1, +2, +3, 및 +6에서 아미노산은 특정 표적 서열을 맞추기 위해 변화 및 맞춤화될 수 있다. 다른 아미노산은 상이한 서열 특이성으로 ZFNs을 생성하기 위해 공통 백본을 형성할 수 있다. 특정 표적 서열에 결합 및 표적화용 ZFNs 설계를 위한 방법 및 규칙은 당해 기술에 공지되어 있다. 참고, 예를 들어, 미국 특허 출원 번호 2005/0064474, 2009/0117617, 및 2012/0142062, 이의 내용 및 개시내용은 본 명세서에 참고로 편입된다. FokI 뉴클레아제 도메인은 DNA를 절단하기 위해 이량체화를 요구할 수 있고 따라서 그것의 C-말단 영역을 가진 2개의 ZFNs는 (5-7 bp에 의해 분리된) 절단 부위의 반대편 DNA 가닥을 결합시키는데 필요하다. ZFN 단량체는 2-ZF-결합 부위가 회문성이면 표적 부위를 컷팅할 수 있다. ZFN은, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 광범위하고 또 다른 ZFN으로부터 지원 없이 이중가닥 DNA를 절단시킬 수 있는 단량체성 ZFN을 포함한다. 용어 ZFN은 또한 동일한 부위에서 DNA를 절단시키기 위해 함께 작업하도록 조작되는 한 쌍의 ZFNs의 하나 또는 둘 모두 구성원을 지칭하는데 사용될 수 있다.
임의의 과학적 이론에 의해 제한됨 없이, 아연 핑거 도메인의 DNA-결합 특이성이 다양한 방법 중 하나를 사용하여 재-조작될 수 있기 때문에, 맞춤형 ZFNs는 (예를 들어, 식물 게놈에서 GA 옥시다제 유전자에서 또는 근처에서) 거의 임의의 표적 서열을 표적화하기 위해 이론적으로 작제될 수 있다. 아연 핑거 도메인의 공공연하게 이용가능한 조작 방법은 문맥-의존적 어셈블리 (CoDA), 올리고머화된 풀 공학기술 (OPEN), 및 모듈러 어셈블리를 포함한다. 일 양태에서, 본 명세서에서 제공된 방법 및/또는 조성물은 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 또는 5 이상 ZFNs를 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 명세서에서 제공된 ZFN은 표적화된 DSB 또는 닉을 생성할 수 있다. 일 양태에서, 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 또는 5 이상 ZFNs를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터는 세포에 당해 분야에서 공지된 형질전환 방법 (예를 들어, 제한 없이, 바이러스성 형질감염, 입자 폭격, PEG-매개된 원형질 형질감염, 또는 아그로박테리움-매개된 형질전환)에 의해 제공된다. ZFNs는 ZFN 단백질로서, ZFN 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드로서, 및/또는 단백질 및 단백질-인코딩 폴리뉴클레오타이드의 조합으로서 도입될 수 있다.
미생물에서 통상적으로 확인되는, 메가뉴클레아제, 예컨대 귀소 엔도뉴클레아제의 LAGLIDADG 계열은 표적 DNA의 부위-특이적 소화를 초래하는 긴 인식 서열 (> 14 bp) 및 높은 활성을 가진 특유의 효소이다. 자연 발생 메가뉴클레아제의 조작된 버전은 전형적으로 연장된 DNA 인식 서열 (예를 들어, 14 내지 40 bp)를 갖는다. 일부 구현예에 따르면, 메가뉴클레아제는 I-CreI, I-CeuI, I-MsoI, I-SceI, I-AniI, 및 I-DmoI로 구성된 군으로부터 선택된 스캐폴드 또는 염기 효소를 포함할 수 있다. 메가뉴클레아제의 조작은 메가뉴클레아제의 DNA 인식 및 절단 기능이 단일 도메인에서 뒤엉키기 때문에 ZFNs 및 TALENs보다 더욱 도전적일 수 있다. 돌연변이유발 및 고-처리량 스크리닝의 특화된 방법은 특유의 서열을 인식하는 그리고 향상된 뉴클레아제 활성을 갖는 신규한 메가뉴클레아제 변이체를 창출하는데 사용되어 왔다. 따라서, 메가뉴클레아제는 식물에서, 예컨대 GA 옥시다제 유전자의 유전자 좌위에서 또는 근처에서 게놈 표적 서열에 결합하도록 선택 또는 조작될 수 있다. 일 양태에서, 본 명세서에서 제공된 방법 및/또는 조성물은 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 또는 5 이상 메가뉴클레아제를 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 명세서에서 제공된 메가뉴클레아제는 표적화된 DSB를 생성시킬 수 있다. 일 양태에서, 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 또는 5 이상 메가뉴클레아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터는 세포에 당해 분야에서 공지된 형질전환 방법 (예를 들어, 제한 없이, 바이러스성 형질감염, 입자 폭격, PEG-매개된 원형질 형질감염 또는 아그로박테리움-매개된 형질전환)에 의해 제공된다.
TALENs는 전사 활성제-유사 효과기 (TALE) DNA 결합 도메인을 뉴클레아제 도메인 (예를 들어, FokI)에 융합시킴으로써 생성된 인공 제한 효소이다. TALEN 쌍의 각각의 구성원이 표적 부위를 측접하는 DNA 부위에 결합하는 경우, FokI 단량체는 표적 부위에서 이중-가닥 DNA를 절단시키고 이량체화시킨다. 야생형 FokI 절단 도메인 이외, 돌연변이를 가진 FokI 절단 도메인의 변이체는 절단 특이성 및 절단 활성을 향상시키도록 설계되어 왔다. FokI 도메인은, 적절한 배향 및 간격으로 상기 표적 게놈내 부위에 대하여 특유의 DNA 결합 도메인을 가진 2개의 작제물을 요구하는, 이량체로서 기능한다. TALEN DNA 결합 도메인과 FokI 절단 도메인 사이 아미노산 잔기의 수 그리고 2개의 개별 TALEN 결합 부위 사이 염기의 수 둘 모두는 활성의 높은 수준 달성용 파라미터이다.
TALENs는 전사 활성제-유사 효과기 (TALE) DNA 결합 도메인을 뉴클레아제 도메인에 융합시킴으로써 생성된 인공 제한 효소이다. 일부 양태에서, 뉴클레아제는 PvuII, MutH, TevI, FokI, AlwI, MlyI, SbfI, SdaI, StsI, CleDORF, Clo051, 및 Pept071로 구성된 군으로부터 선택된다. TALEN 쌍의 각각의 구성원이 표적 부위를 측접하는 DNA 부위에 결합하는 경우, FokI 단량체는 표적 부위에서 이중-가닥 DNA를 절단시키고 이량체화시킨다. 용어 TALEN은, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 광범위하고 또 다른 TALEN으로부터 지원 없이 이중가닥 DNA를 절단시킬 수 있는 단량체성 TALEN을 포함한다. 용어 TALEN은 또한 동일한 부위에서 DNA를 절단시키기 위해 함께 작업하는 한 쌍의 TALENs의 하나 또는 둘 모두 구성원을 지칭한다.
전사 활성제-유사 효과기 (TALEs)는, 예컨대 식물에서 GA 옥시다제 유전자의 유전자 좌위에서 또는 근처에서 실제로 임의의 DNA 서열을 결합시키도록 조작될 수 있다. TALE는 33-34 아미노산의 13-28 반복 단량체로 구성된 중심 DNA-결합 도메인을 갖는다. 각각의 단량체의 아미노산은, 위치 12 및 13에서 초가변성 아미노산 잔기를 제외하고, 고도로 보존된다. 2개의 가변성 아미노산은 반복-가변성 2잔기 (RVDs)로 불린다. RVDs의 아미노산 쌍 NI, NG, HD, 및 NN은 아데닌, 티민, 시토신, 및 구아닌/아데닌, 각각을 우선적으로 인식하고, RVDs의 조절은 연속적인 DNA 염기를 인식할 수 있다. 아미노산 서열과 DNA 인식 사이 이 단순 관계는 적절한 RVDs를 함유하는 반복 분절의 조합을 선택함으로써 특정 DNA 결합 도메인의 조작을 허용하여 왔다.
야생형 FokI 절단 도메인 이외, 돌연변이를 가진 FokI 절단 도메인의 변이체는 절단 특이성 및 절단 활성을 향상시키도록 설계되어 왔다. FokI 도메인은, 적절한 배향 및 간격으로 상기 표적 게놈내 부위에 대하여 특유의 DNA 결합 도메인을 가진 2개의 작제물을 요구하는, 이량체로서 기능한다. TALEN DNA 결합 도메인과 FokI 절단 도메인 사이 아미노산 잔기의 수 그리고 2개의 개별 TALEN 결합 부위 사이 염기의 수 둘 모두는 활성의 높은 수준 달성용 파라미터이다. PvuII, MutH, 및 TevI 절단 도메인은 TALEs와 사용을 위하여 FokI 및 FokI 변이체에 대한 유용한 대안이다. PvuII는 TALE에 커플링된 경우 고도로 특정 절단 도메인으로서 기능한다 (참고 Yank 등. 2013. PLoS One. 8: e82539). MutH는 DNA에서 가닥-특이적 닉을 도입할 수 있다 (참고 Gabsalilow 등. 2013. Nucleic Acids Research. 41: e83). TevI은 표적화된 부위에서 DNA내 이중-가닥 절단을 도입한다 (참고 Beurdeley 등, 2013. Nature Communications. 4: 1762).
아미노산 서열과 TALE 결합 도메인의 DNA 인식 사이 관계는 바람직한 단백질을 허용한다. 소프트웨어 프로그램 예컨대 DNA 작업은 TALE 작제물을 설계하는데 사용될 수 있다. TALE 작제물의 다른 설계 방법은 당해 분야의 숙련가에 공지된다. 참고 Doyle 등, Nucleic Acids Research (2012) 40: W117-122.; Cermak 등, Nucleic Acids Research (2011). 39:e82; 및 tale-nt.cac.cornell.edu/about. 일 양태에서, 본 명세서에서 제공된 방법 및/또는 조성물은 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 또는 5 이상 TALENs를 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 명세서에서 제공된 TALEN은 표적화된 DSB를 생성할 수 있다. 일 양태에서, 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 또는 5 이상 TALENs를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터는 세포에 당해 분야에서 공지된 형질전환 방법 (예를 들어, 제한 없이, 바이러스성 형질감염, 입자 폭격, PEG-매개된 원형질 형질감염 또는 아그로박테리움-매개된 형질전환)에 의해 제공된다. 참고, 예를 들어, 미국 특허 출원 번호 2011/0145940, 2011/0301073, 및 2013/0117869, 이의 내용 및 개시내용은 본 명세서에 참고로 편입됨.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "표적화된 게놈 편집 기술"은 부위-특이적 뉴클레아제, 예컨대 메가뉴클레아제, 아연-핑거 뉴클레아제 (ZFN), RNA-유도된 엔도뉴클레아제 (예를 들어, CRISPR/Cas9 시스템), TALE-엔도뉴클레아제 (TALEN), 재조합효소, 또는 전위효소를 사용하여 식물의 게놈에서 특정 위치의 정확한 및/또는 표적화된 편집을 허용하는 임의의 방법, 프로토콜, 또는 기술을 지칭한다 (즉, 편집은 크게 또는 완전히 비-랜덤이다). 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "편집" 또는 "게놈 편집"은 내인성 식물 게놈 핵산 서열의 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 75, 적어도 100, 적어도 250, 적어도 500, 적어도 1000, 적어도 2500, 적어도 5000, 적어도 10,000, 또는 적어도 25,000 뉴클레오타이드의 표적화된 돌연변이, 결실, 역전 또는 치환 생성을 지칭한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "편집" 또는 "게놈 편집"은 또한 식물의 내인성 게놈에 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 75, 적어도 100, 적어도 250, 적어도 500, 적어도 750, 적어도 1000, 적어도 1500, 적어도 2000, 적어도 2500, 적어도 3000, 적어도 4000, 적어도 5000, 적어도 10,000, 또는 적어도 25,000 뉴클레오타이드의 표적화된 삽입 또는 부위 지향적 통합을 포괄한다. 단수로 "편집" 또는 "게놈 편집"은 하나의 그와 같은 표적화된 돌연변이, 결실, 역전, 치환 또는 삽입을 지칭하고, 반면에 "편집들" 또는 "게놈 편집들"은 2 이상 표적화된 돌연변이(들), 결실(들), 역전(들), 치환(들) 및/또는 삽입(들)을 지칭하고, 각각의 "편집"은 표적화된 게놈 편집 기술을 통해 도입된다.
옥수수에서 GA20 옥시다제_3, GA20 옥시다제_4, 및/또는 GA20 옥시다제_5 유전자의 억제가 다른 유익한 특성에 더하여 더 짧은 식물 높이 및 마디간 길이를 갖는 식물을 생산한다는 점을 감안하면, 이들 유전자의 하나 이상의 발현이 옥수수 식물에 유사한 유익한 특성을 제공하기 위해 하나 이상의 이들 유전자(들)을 편집하는 게놈을 통해 감소 또는 제거될 수 있다는 것이 제안된다. 이들 GA20 옥시다제 유전자를 표적화하는 억제 작제물의 구성적 발현이 이삭에서 오프-유형 없이 유익한 짧은 높이 특성을 갖는 옥수수 식물을 생산한다는 점을 추가로, 그리고 생식 이삭 조직에서 직접적으로 발현이 또한 생식 오프-유형을 생기게 하지 않는다는 점을 감안하면, 이들 유전자좌의 하나 또는 둘 모두가 옥수수 식물에서 유사한 효과를 생산하기 위해 그것의 발현을 녹다운 또는 녹아웃시키도록 편집될 수 있다는 것이 제안된다. 표적화된 유전자 편집 접근법은, 예컨대 표적화된 결실, 삽입, 돌연변이, 또는 다른 서열 변화를 통해, 이들 유전자(들)의 발현을 녹다운 또는 녹아웃시키기 위해 GA20 옥시다제_3, GA20 옥시다제_4, 및/또는 GA20 옥시다제_5 유전자 중 하나 이상의 프로모터 및/또는 조절 영역(들)의 서열을 변형시키는데 사용될 수 있다. 사실상, GA20 옥시다제_3, GA20 옥시다제_4, 및/또는 GA20 옥시다제_5 유전자 중 하나 이상의 프로모터 및/또는 조절 영역(들) 또는 서열(들), 또는 5'-UTR, 3'UTR, 및/또는 인트론 서열(들)은 크게 결실 또는 돌연변이될 수 있다. 대안적으로, GA20 옥시다제_3, GA20 옥시다제_4, 및/또는 GA20 옥시다제_5 유전자 중 하나 이상의 코딩 (엑손), 5-UTR, 3'UTR, 및/또는 인트론 서열(들)의 전부 또는 일부는 이들 유전자(들)의 발현 또는 활성을 녹다운 또는 녹아웃시키기 위해 편집, 결실, 돌연변이, 또는 달리 변형될 수 있다. GA20 옥시다제_3, GA20 옥시다제_4, 및/또는 GA20 옥시다제_5 유전자좌에 대한 그와 같은 표적화된 변형은, 부위-특이적 뉴클레아제, 예컨대, 예를 들어, 아연-핑거 뉴클레아제, 조작된 또는 고유 메가뉴클레아제, TALE-엔도뉴클레아제, 또는 RNA-유도된 엔도뉴클레아제 (예를 들어, Cas9 또는 Cpf1)에 의해 도입된 이중 가닥 절단 (DSB) 또는 닉의 회복을 통해서와 같이, 당업계에서 공지된 임의의 적합한 게놈 편집 기술을 사용하여 달성될 수 있다. DSB 또는 닉의 그와 같은 회복은 DSB 또는 닉이 도입된 표적화된 부위에서 자발적인 또는 확률적 결실, 첨가, 돌연변이, 등을 도입할 수 있거나, 또는 부위의 회복은 표적화된 부위에서 바람직한 또는 특정 결실, 첨가, 돌연변이, 등을 유도 또는 야기시키기 위해 공여체 템플레이트 분자의 사용을 포함시킬 수 있다.
본 명세서에서 제공된 바와 같이, 억제용 내인성 GA 옥시다제 유전자를 표적화하는 비-코딩 RNA 분자를 인코딩하는 전사가능한 DNA 서열을 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 형질전환 벡터 또는 재조합 DNA 분자로 형질전환된 식물은 다양한 외떡잎식물 또는 곡물 식물, 예컨대 옥수수/옥수수 그리고 (옥수수에 유사하게) 별개의 웅성 및 자성 꽃을 갖는 다른 외떡잎식물 또는 곡물 식물을 포함할 수 있고 따라서 GA 경로에 돌연변이를 가진 자성 생식 기관, 구조 또는 조직에서 오프-유형에 민감할 수 있다.
본 조성물 및 방법은 추가로 감소된 식물 높이 및/또는 도복에 대한 증가된 저항으로 유익할 다른 곡물 식물에 적용될 수 있다. 그와 같은 식물은 더 짧을 수 있고/있거나 도복에 대한 저항성일 수 있는 곡물 식물을 생산하기 위해 본 명세서에서 제공된 방법 및 접근법에 따라 식물에서 하나 이상의 내인성 GA20 및/또는 GA3 옥시다제 유전자를 억제시키도록 재조합 DNA 분자 또는 작제물로 형질전환될 수 있다. 사실상, 억제용 내인성 GA 옥시다제 유전자를 표적화하는 비-코딩 RNA 분자를 인코딩하는 전사가능한 DNA 서열을 이소성으로 발현시키는 곡물 식물은 다양한 유익한 특성, 예컨대 더 단간 또는 식물 높이, 더 짧은 마디간 길이, 증가된 자루/줄기 직경, 향상된 도복 저항성을, 본 명세서에서 제공된 바와 같이 다른 향상된 수확량-관련된 및/또는 가뭄 용인 특성에 더하여, 이식유전자 또는 전사가능한 DNA 서열을 갖지 않는 야생형 또는 대조군 식물에 비하여 가질 수 있다. 아래에 추가로 기재된 바와 같이, GA 경로에서 돌연변이를 통해 증가된 수확량 및 레지스트 도복을 갖기 위해 이미 변형된 곡물 농작물, 예컨대 밀, 쌀, 기장, 보리 및 수수는 대신에 본 명세서에서 제공된 바와 같이 재조합 DNA 분자 또는 작제물로 형질전환될 수 있다. 열성일 수 있는 이들 수확물에서 많은 GA 경로 돌연변이와 달리, 그들 수확물에서 내인성 생합성 GA 옥시다제 유전자를 표적화하는 억제 요소를 발현시키는 이식유전자성 작제물은 심지어 단일 카피로서 식물에서 반접합성 또는 존재인 경우 우세할 수 있다. 따라서, 억제 작제물을 발현시키는 재조합 DNA 분자 또는 작제물로 형질전환될 수 있는 식물은 잠재적으로 다양한 외떡잎식물 또는 곡물 수확물을 포함할 수 있다. 반왜성을 야기시키는 우세한 이식유전자성 유전자좌를 갖는다면, 도복 저항성 표현형은 교배 및 특성 통합에서 이점으로 인해 동일한 표현형에 대하여 열성 변이 대립유전자보다 유리할 수 있고 바람직할 수 있다.
본 개시내용의 구현예에 따르면, 재조합 DNA 억제 작제물로 억제된 경우 단간, 반왜성 표현형 및 다른 유익한 특성을 생산하기 위해 본 명세서에서 밝혀진 옥수수에서 GA20 옥시다제_3, GA20 옥시다제_4, GA20 옥시다제_5, GA3 옥시다제_1, 및/또는 GA3 옥시다제_2 유전자에 가장 큰 서열 동일성/유사성을 갖는 다른 곡물 식물에서 GA 옥시다제 유전자가 또한 유사한 반왜성 및/또는 도복 저항성 표현형을 갖는 이식유전자성 곡물 식물을 생산하기 위해 억제용 표적일 수 있다는 것이 추가로 제안된다. 표 3은 억제된 경우 단간, 반왜성 표현형을 생산하는 옥수수에서 GA 옥시다제 유전자 중 하나와 고도의 서열 동일성을 갖는 다른 곡물 식물 (수수 - 소르굼 비콜로르; 쌀 - 오리자 사티바; 조 - 세타리아 이탈리카; 밀 - 트리티쿰 아에스티범; 및 보리 - 호르데움 불가레)로부터 GA 옥시다제 유전자의 목록을 제공한다.
본 개시내용의 또 다른 양태에 따르면, 곡물 식물에서 내인성 GA 옥시다제 (또는 GA 옥시다제-유사) 유전자의 억제용 재조합 DNA 분자, 벡터 또는 작제물, 비-코딩 RNA 분자를 인코딩하는 전사가능한 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자, 벡터 또는 작제물이 제공되고, 여기서 상기 비-코딩 RNA 분자는 (i) 서열번호: 84, 85, 87, 88, 89, 91, 92, 93, 95, 96, 98, 99, 100, 102, 103, 105, 106, 107, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 119, 120, 122, 123, 124, 126, 127, 128, 130, 131, 132, 134, 135, 및/또는 137 중 임의의 하나 이상의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적, 및/또는 (ii) 서열번호: 86, 90, 94, 97, 101, 104, 108, 112, 116, 118, 121, 125, 129, 133, 및/또는 136 중 임의의 하나 이상에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 곡물 식물에서 단백질을 인코딩하는 mRNA 분자의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인 서열을 포함한다. 마찬가지로, 비-코딩 RNA 분자는 옥수수에서 식물 높이에 영향을 준다고 밝혀진 GA 옥시다제 유전자(들)에 퍼센트 동일성을 갖는 곡물 식물에서 내인성 GA 옥시다제 (또는 GA 옥시다제-유사) 유전자를 표적화할 수 있다. 따라서, 서열번호: 9, 12, 15, 30, 및/또는 33 중 임의의 하나 이상에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 곡물 식물에서 내인성 단백질을 인코딩하는 mRNA 분자의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인 서열을 포함하는 비-코딩 RNA 분자가 추가로 제공된다. 상기에서 언급된 바와 같이, 비-코딩 RNA 분자는 GA 옥시다제 (또는 GA 옥시다제-유사) 유전자의 엑손, 인트론 및/또는 UTR 서열을 표적화할 수 있다.
배열의 상이한 적층화 또는 공동 표적화를 포함하는 본 명세서에서 기재된 임의의 적합한 방식으로 작제될 수 있는, 임의의 본 명세서에서 기재된 방법에 따른, 작제물 또는, 임의의 전술한 작제물, 벡터를 곡물 식물, 식물 일부, 또는 식물 세포에 도입 또는 형질전환시키는 방법, 뿐만 아니라 그렇게 함으로써 제조된 및/또는 임의의 그와 같은 재조합 DNA 분자, 벡터 또는 작제물을 포함하는 변형된 곡물 식물, 식물 일부, 식물 조직, 및 식물 세포가 추가로 제공된다. 상기 작제물로부터 발현된 비-코딩 RNA 분자가 내인성 GA 옥시다제 유전자를 표적화하도록 설계될 것이기 때문에, 그와 같은 재조합 DNA 분자, 벡터 또는 작제물로 형질전환된 곡물 식물은 바람직하게는 표적 서열용 기원의 종, 또는 밀접하게 관련된 종, 균주, 생식질, 계통, 등에 상응할 수 있다. 예를 들어, 서열번호: 84에 상보적인 억제 작제물은 밀접하게 관련된 또는 유사한 GA 옥시다제 (또는 GA 옥시다제-유사) 유전자 서열을 갖는 것으로 기대될 수수 식물, 예컨대 소르굼 비콜로르 식물, 또는 아마 관련된 수수 종, 균주, 등에 사용될 수 있다.
곡물 식물로부터 각각의 상기 확인된 유전자용 유전자 서열은, 임의의 공지된 기술에 따라 게놈 편집용 그들 유전자를 표적화하는데 사용될 수 있는, 표 3에서 추가로 제공된다. 임의의 부위-특이적 뉴클레아제 및 방법은, 유전자 근처에서 또는 이내, 돌연변이, 등을 창출하기 위해 템플레이트-매개된 재조합을 통해 또는 불완전하게 복구될 수 있는, 유전자용 유전자 좌위에서 또는 근처에서 DSB 또는 닉을 생성하기 위해 본 명세서에서 기재된 바와 같이 사용될 수 있다. 적합한 뉴클레아제는 아연-핑거 뉴클레아제 (ZFN), 메가뉴클레아제, RNA-유도된 엔도뉴클레아제, TALE-엔도뉴클레아제 (TALEN), 재조합효소, 전위효소, 또는 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 위하여, 뉴클레아제를 표적 부위에 유도하는데 사용될 수 있는 가이드 RNA를 포함하는 재조합 DNA 작제물 또는 벡터가 제공된다. 따라서, 곡물 작물에서 GA 옥시다제 (또는 GA-옥시다제-유사) 유전자 편집용 가이드 RNA는 서열번호: 84, 85, 87, 88, 89, 91, 92, 93, 95, 96, 98, 99, 100, 102, 103, 105, 106, 107, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 119, 120, 122, 123, 124, 126, 127, 128, 130, 131, 132, 134, 135, 및/또는 137 중 임의의 하나 이상의 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 또는 그 초과 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 또는 상보적인 가이드 서열을 포함할 수 있다. RNA-유도되지 않은 부위-특이적 뉴클레아제, 예컨대 아연-핑거 뉴클레아제 (ZFN), 메가뉴클레아제, TALE-엔도뉴클레아제 (TALEN), 재조합효소, 및/또는 전위효소를 위하여, 편집용 게놈 표적 특이성은 그것의 단백질 구조, 특히 그것의 DNA 결합 도메인에 의해 결정된다. 그와 같은 부위-특이적 뉴클레아제는 곡물 식물의 게놈 이내 임의의 상기 GA 옥시다제 (또는 GA 옥시다제-유사) 유전자에서 또는 근처에서 원하는 표적 부위를 결합 및 컷팅하도록 선택, 설계 또는 조작될 수 있다. 억제 작제물의 형질전환과 유사한, 특정 가이드 RNA로 형질전환된 곡물 식물, 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 재조합 DNA 분자, 벡터 또는 작제물은 바람직하게는 표적화된 유전자 서열이 실재하는 종, 또는 밀접하게 관련된 종, 균주, 생식질, 계통, 등일 수 있어서, 이로써 가이드 RNA는 원하는 표적 절단 부위에 결합 및 인식할 수 있다.
상기 기재된 곡물 식물, 식물 일부, 또는 식물 세포 임의의 가이드 RNA에의 도입 또는 형질전환 방법, 또는 임의의 본 명세서에서 기재된 방법에 따라, 아마 RNA-유도된 뉴클레아제에 더하여, 그와 같은 가이드 RNA를 인코딩하는 임의의 작제물, 벡터, 또는 작제물, 뿐만 아니라 그렇게 함으로써 제조된 및/또는 임의의 그와 같은 재조합 DNA 분자, 벡터 또는 작제물 및/또는 편집된 GA 옥시다제 (또는 GA 옥시다제-유사) 유전자를 포함하는 변형된 곡물 식물, 식물 일부, 식물 조직, 및 식물 세포가 추가로 제공된다. 편집된 GA 옥시다제 (또는 GA 옥시다제-유사) 유전자를 갖는 변형된 곡물 식물, 및/또는 GA 옥시다제 (또는 GA 옥시다제-유사) 유전자를 표적화하는 억제 요소는 본 명세서에서 제공된 하나 이상의 유익한 특성, 예컨대 더 짧은 식물 높이, 더 짧은 마디간 길이, 증가된 자루/줄기 직경, 향상된 도복 저항성, 및/또는 가뭄 내성을, 임의의 그와 같은 편집 또는 억제 요소를 갖지 않는 야생형 또는 대조군 식물에 비하여 가질 수 있다. 게놈 편집에 더하여, GA 옥시다제 (또는 GA 옥시다제-유사) 유전자에서 돌연변이는 본 명세서에서 기재된 바와 같이 다른 돌연변이유발 기술을 통해 도입될 수 있다
본 개시내용의 또 다른 양태에 따르면, 이의 적어도 하나의 식물 세포의 게놈에 형질전환 사건 또는 삽입을 포함하는 이식유전자성 식물(들), 식물 세포(들), 종자(들), 및 식물 일부(들)이 제공되고, 여기서 상기 형질전환 사건 또는 삽입은 억제용 내인성 GA 옥시다제 유전자를 표적화하는 비-코딩 RNA 분자를 인코딩하는 전사가능한 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 서열, 작제물 또는 발현 카세트를 포함하고, 여기서 상기 전사가능한 DNA 서열은 식물-발현성 프로모터에, 예컨대 구성적, 관속 및/또는 잎 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 그와 같은 이식유전자성 식물은, 이식유전자성 R0 식물을 생산하기 위해, 상기에 제공된 바와 같이 임의의 적합한 형질전환 방법에 의해 생산될 수 있고, 이는 그 다음 다른 식물에 셀페드 또는 교배되어 R1 종자 및 후속적인 자손 생성 그리고 추가의 교배 등을 통해 종자를 생성할 수 있다. 본 개시내용의 구현예는 추가로, 억제용 내인성 GA 옥시다제 유전자를 표적화하는 비-코딩 RNA 분자를 인코딩하는 전사가능한 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 또는 폴리뉴클레오타이드 서열의 형질전환 사건 또는 게놈 삽입을 갖는 하나 이상의 이식유전자성 세포를 포함하는 식물 세포, 조직, 외식편, 식물 일부, 등을 포함한다.
본 개시내용의 이식유전자성 식물, 식물 세포, 종자, 및 식물 일부는 이의 적어도 하나의 식물 세포의 게놈에 GA 옥시다제 유전자의 억제용 전사가능한 DNA 서열의 이식유전자성 사건 또는 삽입, 또는 표적화된 게놈 편집 사건에 대하여 동종접합성 또는 반접합성일 수 있고, 본 구현예의 식물, 식물 세포, 종자, 및 식물 일부는 그와 같은 이식유전자성 사건(들), 삽입(들) 및/또는 편집(들)의 카피의 임의의 수를 함유할 수 있다. 이식유전자 또는 전사가능한 DNA 서열의 발현의 투약량 또는 양은, 이식유전자성 식물, 등에서 표현형 변화의 정도 또는 한도에 영향을 줄 수 있는, 카피의 수 및/또는 그것의 접합성에 의해 변경될 수 있다. 상기에 도입된 바와 같이, 본 명세서에서 제공된 이식유전자성 식물은, 이들 식물에서 GA 경로의 돌연변이 및 사전 교배 노력으로 인해 증가된 수확량 및/또는 도복 저항성을 이미 갖는, 다양한 외떡잎식물 또는 곡물 식물, 및 심지어 농작물, 예컨대 밀, 쌀 및 수수를 포함할 수 있다. 생합성 GA 옥시다제 유전자를 표적화하는 억제 요소를 발현시키기 위해 이식유전자 또는 전사가능한 DNA 서열 사용의 이점은 조직-특이적 또는 조직-바람직한 방식으로 발현을 제한시키는 능력, 뿐만 아니라 농작물에서 유익한 단-신장, 반왜성 특성 또는 표현형을 야기시키기 위해 전사가능한 DNA 서열의 단일 또는 반접합성 카피의 잠재적인 우세 (예를 들어, 우세한 부정적 효과)를 포함한다. 따라서, 본 개시내용의 재조합 DNA 분자 또는 작제물은 이식유전자성 사건, 삽입 또는 작제물의 단일 카피만을 사용하여 오프-유형 없이 다양한 외떡잎식물 또는 곡물 식물에서 유익한 특성을 창출하는데 사용될 수 있다. 열성인 그리고 변이 대립유전자에 대하여 동종접합성이도록 식물을 필요로 하는 GA 경로에서 이전에 기재된 돌연변이 또는 대립유전자와 달리, 본 개시내용의 GA-변형시키는 이식유전자 및 억제 작제물로 형질전환된 식물은 이들이 이식유전자 또는 억제 작제물의 단일 또는 반접합성 카피를 요구할 뿐이기 때문에 하이브리드 곡물 식물의 생산을 촉진시킴으로써 특성, 수확량 및 작물 교배 노력을 향상시킬 수 있다.
일부 구현예에 따르면, 내인성 GA 옥시다제 유전자, 또는 게놈 편집된 GA 옥시다제 유전자의 억제용 GA 옥시다제 이식유전자 또는 전사가능한 DNA 서열을 포함하는 이식유전자성 또는 변형된 곡물 또는 옥수수 식물은 하나 이상의 유익한 특성, 예컨대 더 단간 또는 반왜성 식물 높이, 감소된 마디간 길이, 증가된 자루/줄기 직경, 향상된 도복 저항성, 감소된 녹색 스냅, 더 깊은 뿌리, 증가된 잎 면적, 더 이른 캐노피 폐쇄, 물 제한 조건 하에서 증가된 잎 수분 함량 및/또는 더 높은 기공 유통성, 정상 또는 질소 또는 물 제한 스트레스 상태 하에서 잎내 감소된 안토시아닌 함량 및/또는 면적, 더 큰 자성 생식 기관 또는 이삭을 포함하는 향상된 수확량-관련된 특성, 이삭 중량, 수확 지수, 수확량, 종자 또는 알맹이 수, 및/또는 종자 또는 알맹이 중량에서 증가를, 야생형 또는 대조군 식물에 비하여, 갖는 것으로서 추가로 특징으로 할 수 있다. 그와 같은 이식유전자성 곡물 또는 옥수수 식물은 증가된 스트레스 내성, 예컨대 증가된 가뭄 내성, 질소 이용, 및/또는 고밀도 식재에 대한 내성을 추가로 가질 수 있다.
본 개시내용의 목적을 위하여, "식물"은 재생 또는 발생의 임의의 단계에서 외식편, 식물 일부, 묘목, 작은 식물 또는 전체의 식물을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "이식유전자성 식물"은 재조합 DNA 분자, 작제물 또는 서열의 통합 또는 삽입에 의해 게놈이 변경된 식물을 지칭한다. 이식유전자성 식물은 본래 형질전환된 식물 세포(들)로부터 발생된 또는 재생된 R0 식물 뿐만 아니라 R0 이식유전자성 식물로부터 후기 생성 또는 교배에서 자손 이식유전자성 식물을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "식물 일부"는 식물의 임의의 장기 또는 온전한 조직, 예컨대 분열 조직, 새싹 장기/구조 (예를 들어, 잎, 줄기 또는 마디), 뿌리, 꽃 또는 균무리 장기/구조 (예를 들어, 포엽, 꽃받침, 화판, 수술, 심피, 꽃밥 및 밑씨), 종자 (예를 들어, 배아, 배유, 및 종자 코트), 열매 (예를 들어, 성숙한 난소), 번식체, 또는 다른 식물 조직 (예를 들어, 관속 조직, 진피 조직, 지상 조직, 및 기타 동종의 것), 또는 이것의 임의의 부분을 지칭할 수 있다. 본 개시내용의 식물 일부는 생존가능, 비생존가능, 재생가능, 및/또는 비-재생가능할 수 있다. "번식체"는 전체 식물 속에 성장할 수 있는 임의의 식물 일부를 포함할 수 있다.
본 구현예에 따르면, 내인성 GA 옥시다제 유전자의 억제용 전사가능한 DNA 서열을 포함하는 작제물 또는 분자로, 또는 게놈 편집에 사용된 작제물로 형질전환된 식물 세포는 형질전환의 방법에 기반하여 당업계에서 이해되는 바와 같이 형질전환에 능숙한 임의의 식물 세포, 예컨대 분열 조직 세포, 배아 세포, 가골 세포, 등을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "이식유전자성 식물 세포"는 안정적으로-통합된 재조합 DNA 분자, 작제물 또는 서열로 형질전환되는 임의의 식물 세포를 단순히 지칭한다. 이식유전자성 식물 세포는, 식물의 종자 또는 배아의 세포(들), 또는 배양된 식물 세포, 가골 세포, 등을 포함하여, 본래-전환된 식물 세포, 재생된 또는 발생된 R0 식물의 이식유전자성 식물 세포, 또 다른 이식유전자성 식물 세포로부터 배양된 이식유전자성 식물 세포, 또는 형질전환된 R0 식물의 임의의 자손 식물 또는 새끼로부터 이식유전자성 식물 세포를 포함할 수 있다.
본 개시내용의 구현예는 추가로, 예컨대 형질전환, 게놈 편집, 교배, 등에 의해, 이식유전자성 또는 변형된 식물의 제조 또는 생산 방법을 포함하고, 여기서 상기 방법은, 이식유전자성 사건을 선호하는 선택가능한 압력 하에서 수행될 수 있는, 식물 세포에 내인성 GA 옥시다제 유전자의 억제용 GA 옥시다제 이식유전자 또는 전사가능한 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자, 작제물 또는 서열의 도입, 또는 내인성 GA 옥시다제 유전자의 유전자 좌위의 편집, 및 그 다음 형질전환된 또는 편집된 식물 세포로부터 이식유전자성 또는 변형된 식물의 재생 또는 발생을 포함한다. 그와 같은 방법은 내인성 GA 옥시다제 유전자의 억제용 전사가능한 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자, 작제물 또는 서열로 식물 세포의 형질전환, 그리고 하나 이상의 발생의 단계에서 하나 이상의 변경된 표현형 또는 특성, 예컨대 하기 특성 중 하나 이상을 갖는 식물 선택을 포함할 수 있다: 야생형 또는 대조군 식물에 비교된 경우, 더 짧은 또는 반왜성 신장 또는 식물 높이, 하나 이상의 마디간(들)에서 더 짧은 마디간 길이, 증가된 자루/줄기 직경, 향상된 도복 저항성, 감소된 녹색 스냅, 더 깊은 뿌리, 증가된 잎 면적, 더 이른 캐노피 폐쇄, 물 제한 조건 하에서 증가된 잎 수분 함량 및/또는 더 높은 기공 유통성, 정상 또는 질소 또는 물 제한 스트레스 상태 하에서 잎내 감소된 안토시아닌 함량 및/또는 면적, 더 큰 자성 생식 기관 또는 이삭을 포함하는 향상된 수확량-관련된 특성, 이삭 중량, 수확 지수, 수확량, 종자 또는 알맹이 수, 및/또는 종자 또는 알맹이 중량에서 증가, 증가된 스트레스 내성, 예컨대 증가된 가뭄 내성, 증가된 질소 이용, 및/또는 고밀도 식재에 대한 증가된 내성.
본 개시내용의 또 다른 양태에 따르면, 야외에서 정상/표준 또는 고밀도로 본 명세서에서 제공된 변형된 또는 이식유전자성 식물(들)의 식재 방법이 제공된다. 일부 구현예에 따르면, 에이커당 (또는 땅 면적당) 농작물의 수확량은 야외에서 더 높은 밀도로 본 개시내용의 변형된 또는 이식유전자성 식물(들)의 식재에 의해 증가될 수 있다. 본 명세서에서 기재된 바와 같이, 억제용 내인성 GA 옥시다제 유전자를 표적화하는, 또는 게놈-편집된 GA 옥시다제 유전자를 갖는 비-코딩 RNA 분자를 인코딩하는 전사가능한 DNA 서열을 발현시키는 변형된 또는 이식유전자성 식물은 감소된 식물 높이, 더 짧은 마디간(들), 증가된 자루/줄기 직경, 및/또는 증가된 도복 저항성을 가질 수 있다. 줄기 직경에서 증가가 도복을 저항할 수 있고 더 짧은 식물 높이가 고밀도 식재 조건 하에서 더 낮은 잎에 증가된 광 침투를 허용할 수 있기 때문에 변형된 또는 이식유전자성 식물이 고밀도 식재 조건을 용인할 수 있다는 것이 제안된다. 따라서, 본 명세서에서 제공된 변형된 또는 이식유전자성 식물은 야외에서 에이커당 (또는 땅 면적당) 수확량을 증가시키기 위해 더 높은 밀도로 식재될 수 있다. 줄뿌림 작물을 위하여, 더 높은 밀도는 줄 길이당 종자/식물의 더 큰 수 식재에 의해 및/또는 줄 사이 간격 감소에 의해 달성될 수 있다.
일부 구현예에 따르면, 변형된 또는 이식유전자성 농작물은 표준 작물학적 실시에 따라 그 농작물에 대하여 정상 식재 밀도보다 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 50%, 75%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 225%, 또는 250% 더 높은 야외에서의 밀도 (땅/야외 면적당 식물)로 식재될 수 있다. 변형된 또는 이식유전자성 농작물은 적어도 38,000 식물/에이커, 적어도 40,000 식물/에이커, 적어도 42,000 식물/에이커, 적어도 44,000 식물/에이커, 적어도 45,000 식물/에이커, 적어도 46,000 식물/에이커, 적어도 48,000 식물/에이커, 50,000 식물/에이커, 적어도 52,000 식물/에이커, 적어도 54,000/에이커, 또는 적어도 56,000 식물/에이커의 야외에서의 밀도로 식재될 수 있다. 예로서, 옥수수 식물은, 표준 밀도 범위, 예컨대 약 18,000 식물/에이커 내지 약 38,000 식물/에이커와는 대조적으로, 더 높은 밀도에서, 예컨대 약 38,000 식물/에이커 내지 약 60,000 식물/에이커, 또는 약 40,000 식물/에이커 내지 약 58,000 식물/에이커, 또는 약 42,000 식물/에이커 내지 약 58,000 식물/에이커, 또는 약 40,000 식물/에이커 내지 약 45,000 식물/에이커, 또는 약 45,000 식물/에이커 내지 약 50,000 식물/에이커, 또는 약 50,000 식물/에이커 내지 약 58,000 식물/에이커, 또는 약 52,000 식물/에이커 내지 약 56,000 식물/에이커, 또는 약 38,000 식물/에이커, 약 42,000 식물/에이커, 약 46,000 식물/에이커, 또는 약 48,000 식물/에이커, 약 50,000 식물/에이커, 또는 약 52,000 식물/에이커, 또는 약 54,000 식물/에이커 범위에서 식재될 수 있다.
본 개시내용의 구현예에 따르면, (i) 2000 mm 미만, 1950 mm 미만, 1900 mm 미만, 1850 mm 미만, 1800 mm 미만, 1750 mm 미만, 1700 mm 미만, 1650 mm 미만, 1600 mm 미만, 1550 mm 미만, 1500 mm 미만, 1450 mm 미만, 1400 mm 미만, 1350 mm 미만, 1300 mm 미만, 1250 mm 미만, 1200 mm 미만, 1150 mm 미만, 1100 mm 미만, 1050 mm 미만, 또는 1000 mm 미만의 식물 높이, 및/또는 (ii) 적어도 18 mm, 적어도 18.5 mm, 적어도 19 mm, 적어도 19.5 mm, 적어도 20 mm, 적어도 20.5 mm, 적어도 21 mm, 적어도 21.5 mm, 또는 적어도 22 mm의 평균 줄기 또는 자루 직경을 포함하는 변형된 옥수수 식물(들)이 제공된다. 상이한 방식으로 언급되면, 2000 mm 미만, 1950 mm 미만, 1900 mm 미만, 1850 mm 미만, 1800 mm 미만, 1750 mm 미만, 1700 mm 미만, 1650 mm 미만, 1600 mm 미만, 1550 mm 미만, 1500 mm 미만, 1450 mm 미만, 1400 mm 미만, 1350 mm 미만, 1300 mm 미만, 1250 mm 미만, 1200 mm 미만, 1150 mm 미만, 1100 mm 미만, 1050 mm 미만, 또는 1000 mm 미만의 식물 높이, 및/또는 18 mm 초과, 18.5 mm 초과, 19 mm 초과, 19.5 mm 초과, 20 mm 초과, 20.5 mm 초과, 21 mm 초과, 21.5 mm 초과, 또는 22 mm 초과인 평균 줄기 또는 자루 직경을 포함하는 변형된 옥수수 식물(들)이 제공된다. 밀리미터 (mm)로 표현되는 임의의 그와 같은 식물 높이 특성 또는 범위는 공지된 형질전환에 기반하여 측정의 상이한 단위로 전환될 수 있다 (예를 들어, 1 인치는 2.54 cm 또는 25.4 밀리미터와 같고, 밀리미터 (mm), 센티미터 (cm) 및 미터 (m)는 하나 이상의 10의 제곱수만큼만 상이하다). 따라서, 본 명세서에서 제공된 임의의 측정은 공지된 및 확립된 전환에 따라 측정의 임의의 다른 비교할만한 단위의 관점에서 추가로 기재된다. 그러나, 변형된 옥수수 식물의 정확한 식물 높이 및/또는 줄기 직경은 환경 및 유전적 배경에 의존할 수 있다. 따라서, 변형된 옥수수 식물의 식물 높이 및/또는 줄기 직경에서 변화는 대신에 대조군 식물에 비하여 최소 차이 또는 퍼센트 변화의 관점에서 기재될 수 있다. 변형된 옥수수 식물은 추가로 웅성 생식 조직 또는 구조 또는 다른 오프-유형이 실질적으로 없는 적어도 하나의 이삭을 포함할 수 있다.
본 개시내용의 구현예에 따르면, 1000 mm 내지 1800mm, 1000 mm 내지 1700 mm, 1050 mm 내지 1700 mm, 1100 mm 내지 1700 mm, 1150 mm 내지 1700 mm, 1200 mm 내지 1700 mm, 1250 mm 내지 1700 mm, 1300 mm 내지 1700 mm, 1350 mm 내지 1700 mm, 1400 mm 내지 1700 mm, 1450 mm 내지 1700 mm, 1000 mm 내지 1500 mm, 1050 mm 내지 1500 mm, 1100 mm 내지 1500 mm, 1150 mm 내지 1500 mm, 1200 mm 내지 1500 mm, 1250 mm 내지 1500 mm, 1300 mm 내지 1500 mm, 1350 mm 내지 1500 mm, 1400 mm 내지 1500 mm, 1450 mm 내지 1500 mm, 1000 mm 내지 1600 mm, 1100 mm 내지 1600 mm, 1200 mm 내지 1600 mm, 1300 mm 내지 1600 mm, 1350 mm 내지 1600 mm, 1400 mm 내지 1600 mm, 1450 mm 내지 1600 mm, 1000 mm 내지 2000 mm, 1200 mm 내지 2000 mm, 1200 mm 내지 1800 mm, 1300 mm 내지 1700 mm, 1400 mm 내지 1700 mm, 1400 mm 내지 1600 mm, 1400 mm 내지 1700 mm, 1400 mm 내지 1800 mm, 1400 mm 내지 1900 mm, 1400 mm 내지 2000 mm, 또는 1200 mm 내지 2500 mm의 발생의 후기 영양 및/또는 생식 단계 동안 (예를 들어, R3 단계에서) 식물 높이, 및/또는 17.5 mm 내지 22 mm, 18 mm 내지 22 mm, 18.5 내지 22 mm, 19 mm 내지 22 mm, 19.5 mm 내지 22 mm, 20 mm 내지 22 mm, 20.5 mm 내지 22 mm, 21 mm 내지 22 mm, 21.5 mm 내지 22 mm, 17.5 mm 내지 21 mm, 17.5 mm 내지 20 mm, 17.5 mm 내지 19 mm, 17.5 mm 내지 18 mm, 18 mm 내지 21 mm, 18 mm 내지 20 mm, 또는 18 mm 내지 19 mm의 평균 줄기 직경을 포함하는 변형된 옥수수 식물이 제공된다. 변형된 옥수수 식물은 변형된 옥수수 식물의 하나 이상의 이삭에서 오프-유형, 예컨대 웅성 생식 조직 또는 구조가 실질적으로 없을 수 있다.
본 개시내용의 구현예에 따르면, (i) 야생형 또는 대조군 식물의 높이보다 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 또는 적어도 75% 더 적은 식물 높이, 및/또는 (ii) 야생형 또는 대조군 식물의 줄기 직경보다 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 100% 더 큰 줄기 또는 자루 직경을 갖는 변형된 옥수수 식물이 제공된다. 본 개시내용의 구현예에 따르면, 변형된 옥수수 식물은 야생형 또는 대조군 식물의 높이보다 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 또는 60% 이하 더 짧은 감소된 식물 높이, 및/또는 야생형 또는 대조군 식물의 줄기 또는 자루 직경보다 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 미만 (또는 이하) 더 큰 줄기 또는 자루 직경을 가질 수 있다. 예를 들어, 변형된 식물은 (i) 야생형 또는 대조군 식물보다 적어도 10%, 적어도 15%, 또는 적어도 20% 미만 또는 더 짧은 (즉, 10%, 15%, 또는 20% 초과 또는 상당 더 짧은), 그러나 50% 이하 또는 초과 더 짧은 식물 높이, 및/또는 (ii) 야생형 또는 대조군 식물보다 적어도 5%, 적어도 10%, 또는 적어도 15% 더 큰, 그러나 30%, 35%, 또는 40% 이하 더 큰 줄기 또는 자루 직경을 가질 수 있다. 명백하게 하기 위해, 어구 "적어도 20% 더 짧은" 및 "20% 초과 또는 상당 더 짧은"은, 예를 들어, 10% 더 짧은을 배제할 것이다. 마찬가지로 명백하게 하기 위해, 어구 "50% 이하 더 짧은", "불과 50% 더 짧은" 및 "많아야 50% 더 짧은"은 60% 더 짧은을 배제할 것이고; 어구 "적어도 5% 더 큰"은 2% 더 큰을 배제할 것이고; 어구 "불과 30% 더 큰" 및 "많아야 30% 더 큰"은 40% 더 큰을 배제할 것이다.
본 개시내용의 구현예에 따르면, 야생형 또는 대조군 식물의 높이보다 5% 내지 75%, 5% 내지 50%, 10% 내지 70%, 10% 내지 65%, 10% 내지 60%, 10% 내지 55%, 10% 내지 50%, 10% 내지 45%, 10% 내지 40%, 10% 내지 35%, 10% 내지 30%, 10% 내지 25%, 10% 내지 20%, 10% 내지 15%, 10% 내지 10%, 10% 내지 75%, 25% 내지 75%, 10% 내지 50%, 20% 내지 50%, 25% 내지 50%, 30% 내지 75%, 30% 내지 50%, 25% 내지 50%, 15% 내지 50%, 20% 내지 50%, 25% 내지 45%, 또는 30% 내지 45% 더 적은 높이, 및/또는 야생형 또는 대조군 식물의 줄기 또는 자루 직경보다 5% 내지 100%, 5% 내지 95%, 5% 내지 90%, 5% 내지 85%, 5% 내지 80%, 5% 내지 75%, 5% 내지 70%, 5% 내지 65%, 5% 내지 60%, 5% 내지 55%, 5% 내지 50%, 5% 내지 45%, 5% 내지 40%, 5% 내지 35%, 5% 내지 30%, 5% 내지 25%, 5% 내지 20%, 5% 내지 15%, 5% 내지 10%, 10% 내지 100%, 10% 내지 75%, 10% 내지 50%, 10% 내지 40%, 10% 내지 30%, 10% 내지 20%, 25% 내지 75%, 25% 내지 50%, 50% 내지 75%, 8% 내지 20%, 또는 8% 내지 15% 더 큰 줄기 또는 자루 직경을 포함하는 변형된 옥수수 식물이 제공된다.
본 개시내용의 구현예에 따르면, 야생형 또는 대조군 식물의 동일 또는 평균 마디간 길이보다 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 또는 적어도 75% 더 적은 평균 마디간 길이 (또는 이삭의 위치에 비하여 마이너스-2 마디간 길이 및/또는 마이너스-4 마디간 길이)를 포함하는 변형된 옥수수 식물이 제공된다. 옥수수 식물의 "마이너스-2 마디간"은 식물의 이삭 아래 제2 마디간을 지칭하고, 옥수수 식물의 "마이너스-4 마디간"은 식물의 이삭 아래 제4 마디간을 지칭한다 많은 구현예에 따르면, 야생형 또는 대조군 식물의 동일 또는 평균 마디간 길이보다 5% 내지 75%, 5% 내지 50%, 10% 내지 70%, 10% 내지 65%, 10% 내지 60%, 10% 내지 55%, 10% 내지 50%, 10% 내지 45%, 10% 내지 40%, 10% 내지 35%, 10% 내지 30%, 10% 내지 25%, 10% 내지 20%, 10% 내지 15%, 10% 내지 10%, 10% 내지 75%, 25% 내지 75%, 10% 내지 50%, 20% 내지 50%, 25% 내지 50%, 30% 내지 75%, 30% 내지 50%, 25% 내지 50%, 15% 내지 50%, 20% 내지 50%, 25% 내지 45%, 또는 30% 내지 45% 더 적은 평균 마디간 길이 (또는 이삭의 위치에 비하여 마이너스-2 마디간 길이 및/또는 마이너스-4 마디간 길이)를 갖는 변형된 옥수수 식물이 제공된다.
본 개시내용의 구현예에 따르면, 야생형 또는 대조군 식물의 이삭 중량보다 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 100% 더 큰 이삭 중량을 (개별적으로 또는 평균적으로) 포함하는 변형된 옥수수 식물이 제공된다. 본 명세서에서 제공된 변형된 옥수수 식물은 야생형 또는 대조군 식물의 이삭 중량보다 5% 내지 100%, 5% 내지 95%, 5% 내지 90%, 5% 내지 85%, 5% 내지 80%, 5% 내지 75%, 5% 내지 70%, 5% 내지 65%, 5% 내지 60%, 5% 내지 55%, 5% 내지 50%, 5% 내지 45%, 5% 내지 40%, 5% 내지 35%, 5% 내지 30%, 5% 내지 25%, 5% 내지 20%, 5% 내지 15%, 5% 내지 10%, 10% 내지 100%, 10% 내지 75%, 10% 내지 50%, 25% 내지 75%, 25% 내지 50%, 또는 50% 내지 75% 더 큰 이삭 중량을 포함한다.
본 개시내용의 구현예에 따르면, 적어도 0.57, 적어도 0.58, 적어도 0.59, 적어도 0.60, 적어도 0.61, 적어도 0.62, 적어도 0.63, 적어도 0.64, 또는 적어도 0.65 (또는 초과)의 수확 지수를 갖는 변형된 옥수수 또는 곡물 식물이 제공된다. 변형된 옥수수 식물은 0.57 내지 0.65, 0.57 내지 0.64, 0.57 내지 0.63, 0.57 내지 0.62, 0.57 내지 0.61, 0.57 내지 0.60, 0.57 내지 0.59, 0.57 내지 0.58, 0.58 내지 0.65, 0.59 내지 0.65, 또는 0.60 내지 0.65의 수확 지수를 포함할 수 있다. 변형된 옥수수 식물은 야생형 또는 대조군 식물의 수확 지수보다 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 6%, 적어도 7%, 적어도 8%, 적어도 9%, 적어도 10%, 적어도 11%, 적어도 12%, 적어도 13%, 적어도 14%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 또는 적어도 50% 더 큰 수확 지수를 가질 수 있다. 변형된 옥수수 식물은 야생형 또는 대조군 식물의 수확 지수보다 1% 내지 45%, 1% 내지 40%, 1% 내지 35%, 1% 내지 30%, 1% 내지 25%, 1% 내지 20%, 1% 내지 15%, 1% 내지 14%, 1% 내지 13%, 1% 내지 12%, 1% 내지 11%, 1% 내지 10%, 1% 내지 9%, 1% 내지 8%, 1% 내지 7%, 1% 내지 6%, 1% 내지 5%, 1% 내지 4%, 1% 내지 3%, 1% 내지 2%, 5% 내지 15%, 5% 내지 20%, 5% 내지 30%, 또는 5% 내지 40% 더 큰 수확 지수를 가질 수 있다.
본 개시내용의 구현예에 따르면, 야생형 또는 대조군 식물에 비하여, 적어도 1 부셸/에이커, 적어도 2 부셸/에이커, 적어도 3 부셸/에이커, 적어도 4 부셸/에이커, 적어도 5 부셸/에이커, 적어도 6 부셸/에이커, 적어도 7 부셸/에이커, 적어도 8 부셸/에이커, 적어도 9 부셸/에이커, 또는 적어도 10 부셸/에이커의 수확가능한 수확량에서 증가를 갖는 변형된 옥수수 또는 곡물 식물이 제공된다. 변형된 옥수수 식물은 1 내지 10, 1 내지 8, 2 내지 8, 2 내지 6, 2 내지 5, 2.5 내지 4.5, 또는 3 내지 4 부셸/에이커의 수확가능한 수확량에서 증가를 가질 수 있다. 변형된 옥수수 식물은 야생형 또는 대조군 식물의 수확가능한 수확량보다 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 6%, 적어도 7%, 적어도 8%, 적어도 9%, 적어도 10%, 적어도 11%, 적어도 12%, 적어도 13%, 적어도 14%, 적어도 15%, 적어도 20%, 또는 적어도 25% 더 큰 수확가능한 수확량에서 증가를 가질 수 있다. 변형된 옥수수 식물은 야생형 또는 대조군 식물의 수확가능한 수확량보다 1% 내지 25%, 1% 내지 20%, 1% 내지 15%, 1% 내지 14%, 1% 내지 13%, 1% 내지 12%, 1% 내지 11%, 1% 내지 10%, 1% 내지 9%, 1% 내지 8%, 1% 내지 7%, 1% 내지 6%, 1% 내지 5%, 1% 내지 4%, 1% 내지 3%, 1% 내지 2%, 5% 내지 15%, 5% 내지 20%, 5% 내지 25%, 2% 내지 10%, 2% 내지 9%, 2% 내지 8%, 2% 내지 7%, 2% 내지 6%, 2% 내지 5%, 또는 2% 내지 4% 더 큰 수확가능한 수확량을 가질 수 있다.
본 개시내용의 구현예에 따르면, 야생형 또는 대조군 식물보다 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 더 적은 또는 더 낮은 도복 빈도를 갖는 변형된 곡물 또는 옥수수 식물이 제공된다. 변형된 곡물 또는 옥수수 식물은 야생형 또는 대조군 식물보다 5% 내지 100%, 5% 내지 95%, 5% 내지 90%, 5% 내지 85%, 5% 내지 80%, 5% 내지 75%, 5% 내지 70%, 5% 내지 65%, 5% 내지 60%, 5% 내지 55%, 5% 내지 50%, 5% 내지 45%, 5% 내지 40%, 5% 내지 35%, 5% 내지 30%, 5% 내지 25%, 5% 내지 20%, 5% 내지 15%, 5% 내지 10%, 10% 내지 100%, 10% 내지 75%, 10% 내지 50%, 10% 내지 40%, 10% 내지 30%, 10% 내지 20%, 25% 내지 75%, 25% 내지 50%, 또는 50% 내지 75% 더 적은 또는 더 낮은 도복 빈도를 가질 수 있다. 증가된 도복 저항성 및 감소된 도복 빈도를 갖는 곡물 또는 옥수수 식물의 모집단이 추가로 제공된다. 야생형 또는 대조군 식물의 모집단보다 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 더 적은 또는 더 낮은 도복 빈도를 갖는 변형된 곡물 또는 옥수수 식물의 모집단이 제공된다. 변형된 옥수수 식물의 모집단은, 식물의 지정된 수 또는 동일 밀도의 작물 면적에 대해 평균으로서 표현될 수 있는, 야생형 또는 대조군 식물의 모집단보다 5% 내지 100%, 5% 내지 95%, 5% 내지 90%, 5% 내지 85%, 5% 내지 80%, 5% 내지 75%, 5% 내지 70%, 5% 내지 65%, 5% 내지 60%, 5% 내지 55%, 5% 내지 50%, 5% 내지 45%, 5% 내지 40%, 5% 내지 35%, 5% 내지 30%, 5% 내지 25%, 5% 내지 20%, 5% 내지 15%, 5% 내지 10%, 10% 내지 100%, 10% 내지 75%, 10% 내지 50%, 10% 내지 40%, 10% 내지 30%, 10% 내지 20%, 25% 내지 75%, 25% 내지 50%, 또는 50% 내지 75% 더 적은 또는 더 낮은 도복 빈도를 포함할 수 있다.
본 개시내용의 구현예에 따르면, 야생형 또는 대조군 식물에 비하여, 상당히 감소된 또는 감축된 식물 높이 (예를 들어, 2000 mm 이하) 및 상당히 증가된 줄기 직경 (예를 들어, 18 mm 이상)을 갖는 변형된 옥수수 식물이 제공된다. 이들 구현예에 따르면, 식물 높이에서 감소 또는 감축 그리고 줄기 직경에서 증가는 본 명세서에서 인용된 임의의 높이, 직경 또는 백분율 범위 이내일 수 있다. 야생형 또는 대조군 식물에 비하여 감소된 식물 높이 및 증가된 줄기 직경을 갖는 그와 같은 변형된 옥수수 식물은 억제용 적어도 하나의 GA20 옥시다제 유전자 및/또는 적어도 하나의 GA3 옥시다제 유전자를 표적화하는 비-코딩 RNA 분자를 인코딩하는 전사가능한 DNA 서열로 형질전환될 수 있다. 야생형 또는 대조군 식물에 비하여 상당히 감소된 식물 높이 및/또는 상당히 증가된 줄기 직경을 갖는 변형된 옥수수 식물은 추가로 웅성 생식 조직 또는 구조 및/또는 다른 오프-유형이 실질적으로 없는 적어도 하나의 이삭을 가질 수 있다. 야생형 또는 대조군 식물에 비하여 상당히 감소된 식물 높이 및/또는 증가된 줄기 직경을 갖는 변형된 옥수수 식물은, 야생형 또는 대조군 식물의 동일한 조직(들)에 비하여, 식물의 하나 이상의 조직(들), 예컨대 식물의 하나 이상의 관속 및/또는 잎 조직(들)에서 하나 이상의 GA20 옥시다제 및/또는 GA3 옥시다제 유전자(들)의 감소된 활성을 가질 수 있다. 많은 구현예에 따르면, 변형된 옥수수 식물은, 구성적, 조직-특이적 또는 조직-바람직한 프로모터일 수 있는, 프로모터에 작동가능하게 연결된 비-코딩 RNA 분자를 인코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드 또는 전사가능한 DNA 서열을 포함할 수 있고, 여기서 상기 비-코딩 RNA 분자는 본 명세서에서 제공된 바와 같이 억제용 적어도 하나의 GA20 옥시다제 및/또는 GA3 옥시다제 유전자(들)을 표적화한다. 비-코딩 RNA 분자는 miRNA, siRNA, 또는 miRNA 또는 siRNA 전구체 분자일 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 야생형 또는 대조군 식물에 비하여 상당히 감소된 식물 높이 및/또는 증가된 줄기 직경을 갖는 변형된 옥수수 식물은 추가로 야생형 또는 대조군 식물에 비하여 증가된 수확 지수 및/또는 증가된 도복 저항성을 가질 수 있다.
야생형 또는 대조군 식물에 비하여 상당히 감소된 식물 높이 및/또는 상당히 증가된 줄기 직경을 갖는 변형된 옥수수 또는 곡물 식물은 유전자 편집 기술 또는 다른 돌연변이유발 기술을 통해 도입된 GA 옥시다제 유전자에서 돌연변이 (예를 들어, 삽입, 결실, 치환, 등)을 포함할 수 있고, 여기서 상기 GA 옥시다제 유전자의 발현은 변형된 식물의 하나 이상의 조직에서 감소 또는 제거된다. 야생형 또는 대조군 식물에 비하여 감소된 식물 높이 및/또는 증가된 줄기 직경을 갖는 그와 같은 변형된 옥수수 식물은 추가로 야생형 또는 대조군 식물에 비하여 증가된 수확 지수 및/또는 증가된 도복 저항성을 가질 수 있다. 그와 같은 변형된 옥수수 식물은 실질적으로 변형된 식물의 적어도 하나의 이삭에서 오프-유형, 예컨대 웅성 생식 조직 또는 구조 및/또는 다른 오프-유형이 없을 수 있다. (게놈 편집을 제외한) 식물 돌연변이유발 기술은 화학적 돌연변이유발 (즉, 화학적 뮤타젠, 예컨대 아자이드, 하이드록실아민, 아질산, 아크리딘, 뉴클레오타이드 염기 유사체, 또는 알킬화제 - 예를 들어, EMS (에틸메탄 설포네이트), MNU (N-메틸-N-니트로소우레아), 등으로 처리), 물리적 돌연변이유발 (예를 들어, 감마선, X-선, UV, 이온 빔, 다른 형태의 방사선, 등), 및 삽입 돌연변이유발 (예를 들어, 트랜스포존 또는 T-DNA 삽입)을 포함할 수 있다. 식물 또는 다양한 식물 일부, 식물 조직 또는 식물 세포는 돌연변이유발을 거치게 될 수 있다. 처리된 식물은 종자를 수집하기 위해 또는 자손 식물을 생산하기 위해 재생산될 수 있고, 처리된 식물 일부, 식물 조직 또는 식물 세포는 식물 또는 다른 식물 조직으로 발생 또는 재생될 수 있다. 화학적 또는 물리적 돌연변이유발 기술로 생성된 돌연변이는 표적화된 유전자, 예컨대 GA3 또는 GA20 옥시다제 유전자의 발현 또는 기능의 상실을 초래하는 프레임 이동, 미스센스 또는 논센스 돌연변이를 포함할 수 있다.
유전자의 하나의 돌연변이유발 방법은 (게놈에서 유도된 국부 병변 표적화를 위하여) "TILLING"으로 불리고, 여기에서 돌연변이는 식물 세포 또는 조직에서, 바람직하게는 식물의 종자, 생식 조직 또는 생식계열에서, 예를 들어, 뮤타젠, 예컨대 EMS 처리를 사용하여 창출된다. 수득한 식물은 성장되고 자기-수정되며, 자손은 DNA 샘플을 제조하는데 사용된다. GA 옥시다제 유전자의 핵산 서열의 PCR 증폭 및 서열분석은 돌연변이된　식물이 GA 옥시다제 유전자에서 돌연변이를 갖는지 여부를 확인하는데 사용될 수 있다. GA 옥시다제 유전자에서 돌연변이를 갖는 식물은 그 다음 변경된 특성, 예컨대 감소된 식물 높이에 대하여 시험될 수 있다. 대안적으로, 돌연변이유발된 식물은 변경된 특성, 예컨대 감소된 식물 높이에 대하여 시험될 수 있고, 그 다음 GA 옥시다제 유전자의 핵산 서열의 PCR 증폭 및 서열분석은 변경된 특성을 갖는 식물이 또한 GA 옥시다제 유전자에서 돌연변이를 갖는지 여부를 결정하는데 사용될 수 있다. 참고, 예를 들어, Colbert 등, 2001,　Plant　Physiol 126:480-484; 및 McCallum 등, 2000, Nature Biotechnology 18:455-457. TILLING은,　옥수수 또는 곡물 식물의 GA 옥시다제 유전자에서 표적화된 돌연변이를 위하여 도입 및 선택하는데 사용될 수 있는, 유전자에 의해 인코딩된 단백질의 활성 또는 유전자 발현을 변경시키는 돌연변이를 확인하는데 사용될 수 있다.
돌연변이유발 또는 게놈 편집 처리를 거치게 된 옥수수 또는 곡물 식물은 관측가능한 표현형 (예를 들어, 본 명세서에서 기재된 임의의 표현형, 예컨대 더 짧은 식물 높이, 증가된 줄기/자루 직경, 등)에 기반하여, 또는 선택가능한 마커 (예를 들어, 제초제, 등), 선별가능한 마커, 또는 분자 기술 (예를 들어, 더 낮은 GA 수준, 더 낮은 GA 옥시다제 전사체 또는 단백질 수준, 이식유전자 또는 전사가능한 서열의 존재, 등)과 선택 제제를 사용하여 선별 및 선택될 수 있다. 그와 같은 선별 및/또는 선택 기술은 바람직한 식물 표현형을 유발시키는 GA 옥시다제 유전자에서 돌연변이를 갖는 식물을 확인 및 선택하는데 사용될 수 있다.
본 개시내용의 구현예에 따르면, 변형된 옥수수 또는 곡물 식물의 모집단은 제공되고, 여기서 상기 변형된 옥수수 또는 곡물 식물의 모집단은, 야생형 또는 대조군 식물의 모집단보다, 상당히 더 적은 평균 식물 높이, 및/또는 상당히 더 많은 평균 줄기 또는 자루 직경을 갖는다. 변형된 옥수수 또는 곡물 식물의 모집단은 단일 변형된 옥수수 또는 곡물 식물와 혈통을 공유할 수 있고/있거나 공통으로 단일 이식유전자성 GA 옥시다제 억제 작제물 삽입, 사건 또는 편집을 가질 수 있다. 변형된 옥수수 식물의 모집단 이내 변형된 옥수수 식물은 일반적으로는 웅성 생식 조직 또는 구조 및/또는 다른 오프-유형이 실질적으로 없는 적어도 하나의 이삭을 포함할 수 있다. 변형된 옥수수 또는 곡물 식물의 모집단은 야생형 또는 대조군 식물의 모집단보다 식물 또는 야외 면적의 수당 또는 평균적으로 증가된 도복 저항성을 가질 수 있다. 변형된 옥수수 또는 곡물 식물의 모집단은 대조군 옥수수 또는 곡물 식물의 모집단보다 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70% 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100% 더 적은 (또는 더 낮은) 도복 빈도를 가질 수 있다. 변형된 옥수수 식물의 모집단은 적어도 0.57 이상의 수확 지수를 가질 수 있다.
본 발명의 구현예에 따르면, 야생형 또는 대조군 식물의 동일한 조직(들)에 비교된 경우, 적어도 줄기 및 마디간 조직(들), 예컨대 줄기, 마디간, 잎 및/또는 관속 조직(들)에서 (활성 형태로) 감소된 지베렐린 함량을 갖는 변형된 옥수수 또는 곡물 식물이 제공된다. 많은 구현예에 따르면, 야생형 또는 대조군 식물에 비하여 상당히 감소된 식물 높이 및/또는 상당히 증가된 줄기 직경을 갖는 변형된 옥수수 또는 곡물 식물이 제공되고, 여기서 상기 변형된 옥수수 또는 곡물 식물은 추가로, 야생형 또는 대조군 식물의 동일한 조직(들)에 비하여, 하나 이상의 줄기, 마디간, 잎 및/또는 관속 조직(들)에서 활성 지베렐린 또는 활성 GAs (예를 들어, GA1, GA3, GA4, 및/또는 GA7 중 하나 이상)의 상당히 감소된 또는 감축된 수준(들)을 갖는다. 예를 들어, 변형된 옥수수 또는 곡물 식물의 줄기, 마디간, 잎 및/또는 관속 조직(들)에서 하나 이상의 활성 GAs의 수준은 야생형 또는 대조군 옥수수 식물의 동일한 조직(들)에서보다 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 100% 더 적거나 더 낮을 수 있다.
일부 구현예에 따르면, 변형된 옥수수 또는 곡물 식물은 야생형 또는 대조군 옥수수 식물의 동일한 조직(들)에서보다 5% 내지 50%, 10% 내지 100%, 20% 내지 100%, 30% 내지 100%, 40% 내지 100%, 50% 내지 100%, 60% 내지 100%, 70% 내지 100%, 80% 내지 100%, 80% 내지 90%, 10% 내지 90%, 10% 내지 80%, 10% 내지 70%, 10% 내지 60%, 10% 내지 50%, 10% 내지 40%, 10% 내지 30%, 10% 내지 20%, 50% 내지 100%, 20% 내지 90%, 20% 내지 80%, 20% 내지 70%, 20% 내지 60%, 20% 내지 50%, 20% 내지 40%, 20% 내지 40%, 20% 내지 30%, 30% 내지 90%, 30% 내지 80%, 30% 내지 70%, 30% 내지 60%, 30% 내지 50%, 30% 내지 40%, 40% 내지 90% 40% 내지 80%, 40% 내지 70%, 40% 내지 60%, 40% 내지 50%, 50% 내지 90%, 50% 내지 80%, 50% 내지 70%, 50% 내지 60%, 60% 내지 90%, 60% 내지 80%, 60% 내지 70%, 70% 내지 90%, 또는 70% 내지 80% 더 적은 또는 (또는 더 낮은) 하나 이상의 줄기, 마디간, 잎 및/또는 관속 조직(들)에서 활성 지베렐린 (GA) 수준(들) (예를 들어, GA1, GA3, GA4, 및/또는 GA7 중 하나 이상)을 포함할 수 있다. 하나 이상의 줄기, 마디간, 잎 및/또는 관속 조직(들)에서 감소된 활성 지베렐린 (GA) 수준(들)을 갖는 변형된 옥수수 또는 곡물 식물은 추가로 변형된 옥수수 식물의 적어도 하나의 이삭에서 오프-유형, 예컨대 웅성 생식 조직 또는 구조 및/또는 다른 오프-유형이 실질적으로 없을 수 있다.
본 개시내용의 구현예에 따르면, 야생형 또는 대조군 식물의 동일한 조직(들)에 비교된 경우, 변형된 식물의, 하나 이상의 조직(들), 예컨대 하나 이상의 줄기, 마디간, 잎 및/또는 관속 조직(들)에서 하나 이상의 GA3 옥시다제 및/또는 GA20 옥시다제 유전자 전사체(들) 및/또는 단백질(들)의 상당히 감소된 또는 제거된 발현 수준을 갖는 변형된 옥수수 또는 곡물 식물이 제공된다. 많은 구현예에 따르면, 야생형 또는 대조군 식물에 비하여 상당히 감소된 식물 높이 및/또는 상당히 증가된 줄기 직경을 포함하는 변형된 옥수수 또는 곡물 식물이 제공되고, 여기서 상기 변형된 옥수수 또는 곡물 식물은, 야생형 또는 대조군 옥수수 식물의 동일한 조직(들)에 비교된 경우, 변형된 식물의, 하나 이상의 조직, 예컨대 하나 이상의 줄기, 마디간, 잎 및/또는 관속 조직(들)에서 하나 이상의 GA20 옥시다제 및/또는 GA3 옥시다제 유전자 전사체(들) 및/또는 단백질(들)의 상당히 감소된 또는 제거된 발현 수준을 갖는다. 예를 들어, 변형된 옥수수 또는 곡물 식물은, 야생형 또는 대조군 식물의 동일한 조직(들)에 비교된 경우, 변형된 식물의, 하나 이상의 줄기, 마디간, 잎 및/또는 관속 조직(들)에서 GA3 옥시다제_1 및/또는 GA3 옥시다제_2 유전자 전사체(들) 및/또는 단백질(들)의 상당히 감소된 또는 제거된 발현 수준 및/또는, GA20 옥시다제_3 및/또는 GA20 옥시다제_5 유전자 전사체(들) 및/또는 단백질(들)의 상당히 감소된 또는 제거된 발현 수준을 갖는다. 예를 들어, 변형된 옥수수 식물의 하나 이상의 줄기, 마디간, 잎 및/또는 관속 조직(들)에서, 하나 이상의 GA3 옥시다제 및/또는 GA20 옥시다제 유전자 전사체(들) 및/또는 단백질(들), 또는 하나 이상의 GA 옥시다제 (또는 GA 옥시다제-유사) 유전자 전사체(들) 및/또는 단백질(들)의 수준은 야생형 또는 대조군 옥수수 또는 곡물 식물의 동일한 조직(들)에서 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 100% 더 적거나 더 낮을 수 있다.
일부 구현예에 따르면, 변형된 옥수수 또는 곡물 식물은 야생형 또는 대조군 옥수수 또는 곡물 식물의 동일한 조직(들)에서보다 5% 내지 50%, 10% 내지 100%, 20% 내지 100%, 30% 내지 100%, 40% 내지 100%, 50% 내지 100%, 60% 내지 100%, 70% 내지 100%, 80% 내지 100%, 80% 내지 90%, 10% 내지 90%, 10% 내지 80%, 10% 내지 70%, 10% 내지 60%, 10% 내지 50%, 10% 내지 40%, 10% 내지 30%, 10% 내지 20%, 50% 내지 100%, 20% 내지 90%, 20% 내지 80%, 20% 내지 70%, 20% 내지 60%, 20% 내지 50%, 20% 내지 40%, 20% 내지 40%, 20% 내지 30%, 30% 내지 90%, 30% 내지 80%, 30% 내지 70%, 30% 내지 60%, 30% 내지 50%, 30% 내지 40%, 40% 내지 90% 40% 내지 80%, 40% 내지 70%, 40% 내지 60%, 40% 내지 50%, 50% 내지 90%, 50% 내지 80%, 50% 내지 70%, 50% 내지 60%, 60% 내지 90%, 60% 내지 80%, 60% 내지 70%, 70% 내지 90%, 또는 70% 내지 80% 더 적은 또는 더 낮은 하나 이상의 줄기, 마디간, 잎 및/또는 관속 조직(들)에서, 하나 이상의 GA3 옥시다제 및/또는 GA20 옥시다제 유전자 전사체(들) 및/또는 단백질(들), 또는 하나 이상의 GA 옥시다제 (또는 GA 옥시다제-유사) 유전자 전사체(들) 및/또는 단백질(들)의 수준(들)을 포함할 수 있다. 하나 이상의 조직(들)에서 적어도 하나의 GA20 옥시다제 및/또는 GA3 옥시다제 유전자(들)의 감소된 또는 제거된 발현 수준을 갖는 변형된 옥수수 또는 곡물 식물은 또한 변형된 옥수수 식물의 적어도 하나의 이삭에서 오프-유형, 예컨대 웅성 생식 조직 또는 구조 및/또는 다른 오프-유형이 실질적으로 없을 수 있다.
일부 구현예에 따르면, 농작물에서, 예컨대 농작물의 하나 이상의 줄기, 마디간, 관속 및/또는 잎 조직에서 적어도 하나의 GA20 옥시다제 유전자 및/또는 적어도 하나의 GA3 옥시다제 유전자의 발현 감소 또는 제거를 포함하는 방법이 제공되고, 여기서 상기 적어도 하나의 GA20 옥시다제 유전자 및/또는 적어도 하나의 GA3 옥시다제 유전자(들)의 발현은 식물의 적어도 하나의 생식 조직에서 상당히 변경 또는 변화되지 않고/않거나, 여기서 상기 하나 이상의 활성 GAs의 수준(들)은, 야생형 또는 대조군 식물에 비교된 경우, 식물의 적어도 하나의 생식 조직에서 상당히 변경 또는 변화되지 않는다. 많은 구현예에 따르면, 적어도 하나의 GA20 옥시다제 또는 GA3 옥시다제 유전자의 발현 수준(들)은 GA20 옥시다제 또는 GA3 옥시다제 유전자용 억제 요소를 인코딩하는 전사가능한 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 작제물, 예컨대 성숙한 miRNA로 가공되는 적어도 하나의 성숙한 miRNA 또는 miRNA 전구체를 가진 변형된 식물의 적어도 하나의 조직에서 감소 또는 제거되고, 여기서 상기 miRNA는 적어도 하나의 GA20 옥시다제 또는 GA3 옥시다제 유전자의 발현 수준을 감소 또는 억제시킬 수 있고, 여기서 상기 전사가능한 DNA 서열은 구성적, 조직-특이적 또는 조직-바람직한 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
하나 이상의 표현형 또는 특성에, 또는 세포 또는 식물에서 분자 마커 또는 폴리뉴클레오타이드 또는 단백질 서열의 존재 또는 부재에 기반될 수 있는, 표적화된 편집 또는 이식유전자를 포함하는 세포 또는 식물의 선택 그리고, 표적화된 편집 또는 이식유전자의 존재를 위하여 세포 또는 식물, 등의 확인 및/또는, 상기를 위한 선별 방법 및 기술이 제공된다. 핵산은 당업계에서 공지된 기술을 사용하여 단리 및 검출될 수 있다. 예를 들어, 핵산은, 비제한적으로, 재조합 핵산 기술, 및/또는 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 사용하여 단리 및 검출될 수 있다. 일반적인 PCR 기술은, 예를 들어 하기에서 기재된다: PCR Primer: A Laboratory Manual, Dieffenbach & Dveksler, Eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995. 재조합 핵산 기술은, 예를 들어, 핵산을 단리시키는데 사용될 수 있는, 제한 효소 소화 및 결찰을 포함한다. 단리된 핵산은 또한 단일 핵산 분자로서 또는 일련의 올리고뉴클레오타이드로서 어느 한쪽으로 화학적으로 합성될 수 있다. 폴리펩타이드는 공지된 방법 예컨대 DEAE 이온 교환, 겔 여과, 및 수산화인회석 크로마토그래피에 의해 천연 공급원 (예를 들어, 생물학적 샘플)로부터 정제될 수 있다. 폴리펩타이드는 또한, 예를 들어, 핵산을 발현 벡터에서 발현시킴으로써 정제될 수 있다. 또한, 정제된 폴리펩타이드는 화학적 합성에 의해 수득될 수 있다. 폴리펩타이드의 순도의 한도는 임의의 적절한 방법, 예를 들어, 칼럼 크로마토그래피, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 또는 HPLC 분석을 사용하여 측정될 수 있다. 당해 분야에 공지된 임의의 방법은, 시각적 관찰, 선택, 분자 기술, 등의 임의의 적합한 형태에 기반될 수 있는, 그것의 게놈에서 이식유전자 또는 게놈 편집을 갖는 세포, 식물, 등을 선별, 및/또는 확인하는데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 식물 세포에서 재조합 핵산 및/또는 폴리펩타이드의 검출 방법이 제공된다. 예를 들어, 핵산은 당해 분야에서 공지된 바와 같이 프라이머와 PCR을 사용하여 앰플리콘의 생산을 통해 또는 하이브리드화 프로브를 사용하여 검출될 수 있다. 핵산 사이 하이브리드화는 하기에서 논의된다: Sambrook 등. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). 폴리펩타이드는 항체를 사용하여 검출될 수 있다. 항체를 사용하는 폴리펩타이드의 검출 기술은 효소 연결된 면역흡착 검정 (ELISAs), 웨스턴 블랏, 면역침강, 면역형광, 및 기타 동종의 것을 포함한다. 본 명세서에서 제공된 항체는 다클론성 항체 또는 단클론성 항체일 수 있다. 본 명세서에 제공된 폴리펩타이드에 대하여 특정 결합 친화도를 갖는 항체는 당해 분야에서 공지된 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 항체 또는 하이브리드화 프로브는, 당해 분야에서 공지된 방법을 사용하여, 고형 지지체, 예컨대 튜브, 플레이트 또는 웰에 부착될 수 있다.
(예를 들어, 증폭 생성물의, 하이브리드화 복합체의, 폴리펩타이드의) 검출은 하이브리드화 프로브 또는 항체와 부착 또는 관련될 수 있는 검출가능한 표지를 사용하여 달성될 수 있다. 용어 "표지"는 직접적인 표지 뿐만 아니라 간접적인 표지의 사용을 포괄하도록 의도된다. 검출가능한 표지는 효소, 보철 그룹, 형광 물질, 발광성 물질, 생물발광 물질, 및 방사선활성 물질을 포함한다.
변형된, 편집된 또는 이식유전자성 식물 또는 식물 세포의 선별 및 선택은 분자 생물학의 당해 분야의 숙련가에 공지된 임의의 방법론을 통해 될 수 있다. 선별 및 선택 방법론의 예는, 비제한적으로, 서던 분석, 폴리뉴클레오타이드의 검출용 PCR 증폭, 노던 블랏, RNase 보호, 프라이머-연장, RNA 전사체 검출용 RT-PCR 증폭, 생거 서열분석, 차세대 서열분석 기술 (예를 들어, Illumina®, PacBio®, Ion TorrentTM, 등) 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드의 효소 또는 리보자임 활성 검출용 효소적 검정, 및 단백질 겔 전기영동, 웨스턴 블랏, 면역침강, 및 폴리펩타이드를 검출하기 위한 효소-결합 면역검정을 포함한다. 다른 기술 예컨대 원위치 하이브리드화, 효소 염색, 및 면역염색은 또한 폴리펩타이드 및/또는 폴리뉴클레오타이드의 존재 또는 발현을 검출하는데 사용될 수 있다. 모든 언급된 기술의 수행 방법은 당해 기술에 공지되어 있다.
구현예
하기 단락은 예시적인 구현예의 서브셋을 열거한다.
구현예 1. 비-코딩 RNA 분자를 인코딩하는 전사가능한 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 작제물로서, 상기 비-코딩 RNA 분자가 곡물 식물 또는 식물 세포에서 내인성 GA20 옥시다제 단백질을 인코딩하는 mRNA 분자의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인 서열을 포함하고, 상기 내인성 GA20 옥시다제 단백질이 서열번호: 9에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고, 상기 전사가능한 DNA 서열이 식물-발현성 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 재조합 DNA 작제물.
구현예 2. 구현예 1에 있어서, 상기 비-코딩 RNA 분자가 서열번호: 7 또는 서열번호: 8의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인 서열을 포함하는, 재조합 DNA 작제물.
구현예 3. 구현예 1에 있어서, 상기 비-코딩 RNA 분자가 외떡잎식물 또는 곡물 식물 또는 식물 세포에서 내인성 GA20 옥시다제 단백질을 인코딩하는 mRNA 분자의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인 서열을 포함하고, 상기 내인성 GA20 옥시다제 단백질이 서열번호: 15에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한, 재조합 DNA 작제물.
구현예 4. 구현예 3에 있어서, 상기 비-코딩 RNA 분자가 서열번호: 13 또는 서열번호: 14의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인 서열을 포함하는, 재조합 DNA 작제물.
구현예 5. 구현예 1에 있어서, 상기 식물-발현성 프로모터가 관속 프로모터인, 재조합 DNA 작제물.
구현예 6. 구현예 5에 있어서, 상기 관속 프로모터가 하기 중 하나를 포함하는, 재조합 DNA 작제물: 수크로스 합성효소 프로모터, 수크로스 수송체 프로모터, Sh1 프로모터, 코멜리나 옐로우 반상 바이러스 (CoYMV) 프로모터, 밀 왜소 제미니바이러스 (WDV) 큰 유전자간 영역 (LIR) 프로모터, 옥수수 줄무늬 제미니바이러스 (MSV) 코트 단백질 (CP) 프로모터, 쌀 옐로우 스트라이프 1 (YS1)-유사 프로모터, 또는 쌀 옐로우 스트라이프 2 (OsYSL2) 프로모터.
구현예 7. 구현예 5에 있어서, 상기 관속 프로모터가 서열번호: 67, 서열번호: 68, 서열번호: 69, 서열번호: 70, 또는 서열번호: 71 중 하나 이상에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100% 동일한 DNA 서열, 또는 이의 기능적 부분을 포함하는, 재조합 DNA 작제물.
구현예 8. 구현예 1에 있어서, 상기 식물-발현성 프로모터가 RTBV 프로모터인, 재조합 DNA 작제물.
구현예 9. 구현예 8에 있어서, 상기 식물-발현성 프로모터가 서열번호: 65 또는 서열번호: 66 중 하나 이상에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100% 동일한 DNA 서열, 또는 이의 기능적 부분을 포함하는, 재조합 DNA 작제물.
구현예 10. 구현예 1에 있어서, 상기 식물-발현성 프로모터가 잎 프로모터인, 재조합 DNA 작제물.
구현예 11. 구현예 10에 있어서, 상기 잎 프로모터가 하기 중 하나를 포함하는, 재조합 DNA 작제물: RuBisCO 프로모터, PPDK 프로모터, FDA 프로모터, Nadh-Gogat 프로모터, 클로로필 a/b 결합 단백질 유전자 프로모터, 포스포에놀피루베이트 카복실라제 (PEPC) 프로모터, 또는 Myb 유전자 프로모터.
구현예 12. 구현예 10에 있어서, 상기 잎 프로모터가 서열번호: 72, 서열번호: 73 또는 서열번호: 74 중 하나 이상에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100% 동일한 DNA 서열, 또는 이의 기능적 부분을 포함하는, 재조합 DNA 작제물.
구현예 13. 구현예 1에 있어서, 상기 식물-발현성 프로모터가 항시성 프로모터인, 재조합 DNA 작제물.
구현예 14. 구현예 13에 있어서, 상기 항시성 프로모터가 하기로 구성된 군으로부터 선택되는, 재조합 DNA 작제물: 액틴 프로모터, CaMV 35S 또는 19S 프로모터, 식물 유비퀴틴 프로모터, 식물 Gos2 프로모터, FMV 프로모터, CMV 프로모터, MMV 프로모터, PCLSV 프로모터, Emu 프로모터, 튜불린 프로모터, 노팔라인 합성효소 프로모터, 옥토핀 합성효소 프로모터, 만노핀 합성효소 프로모터, 또는 옥수수 알코올 탈수소효소, 또는 이의 기능적 부분.
구현예 15. 구현예 13에 있어서, 상기 항시성 프로모터가 서열번호: 75, 서열번호: 76, 서열번호: 77, 서열번호: 78, 서열번호: 79, 서열번호: 80, 서열번호: 81, 서열번호: 82 또는 서열번호: 83 중 하나 이상에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100% 동일한 DNA 서열, 또는 이의 기능적 부분을 포함하는, 재조합 DNA 작제물.
구현예 16. 구현예 1에 있어서, 상기 전사가능한 DNA 서열에 의해 인코딩된 비-코딩 RNA 분자가 성숙한 miRNA 또는 siRNA를 형성하기 위해 식물 세포에서 가공 또는 절단되는 전구체 miRNA 또는 siRNA인, 재조합 DNA 작제물.
구현예 17. 구현예 1의 재조합 DNA 작제물을 포함하는, 형질전환 벡터.
구현예 18. 구현예 1의 재조합 DNA 작제물을 포함하는, 이식유전자성 곡물 식물, 식물 일부 또는 식물 세포.
구현예 19. 구현예 18에 있어서, 상기 이식유전자성 식물이 대조군 식물에 비하여 하기 특성 중 하나 이상을 갖는, 이식유전자성 곡물 식물: 더 짧은 식물 높이, 증가된 자루/줄기 직경, 향상된 도복 저항성, 더 깊은 뿌리, 증가된 잎 면적, 더 이른 캐노피 폐쇄, 더 높은 기공 유통성, 더 낮은 이삭 높이, 증가된 잎 수분 함량, 향상된 가뭄 내성, 향상된 질소 사용 효율, 정상 또는 질소-제한 또는 수-제한 스트레스 상태 하에서 감소된 안토시아닌 함량 및 면적, 증가된 이삭 중량, 증가된 수확 지수, 증가된 수확량, 증가된 종자 수, 증가된 종자 중량, 및/또는 증가된 다작성.
구현예 20. 구현예 18에 있어서, 상기 이식유전자성 식물이 더 짧은 식물 높이 및/또는 향상된 도복 저항성을 갖는, 이식유전자성 곡물 식물.
구현예 21. 구현예 18에 있어서, 상기 이식유전자성 식물의 높이가 야생형 대조군 식물보다 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 또는 적어도 40% 더 짧은, 이식유전자성 곡물 식물.
구현예 22. 구현예 18에 있어서, 하나 이상의 줄기 마디간에서 상기 이식유전자성 식물의 자루 또는 줄기 직경이 야생형 대조군 식물의 동일한 하나 이상의 마디간에서 상기 자루 또는 줄기 직경보다 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 또는 적어도 40% 더 큰, 이식유전자성 곡물 식물.
구현예 23. 구현예 18 중 어느 하나에 있어서, 상기 이식유전자성 곡물 식물이 옥수수 식물이고, 상기 이삭 아래 제1, 제2, 제3, 및/또는 제4 마디간 중 하나 이상에서 이식유전자성 옥수수 식물의 자루 또는 줄기 직경이 야생형 대조군 식물의 동일한 마디간보다 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 또는 적어도 40% 더 큰, 이식유전자성 곡물 식물.
구현예 24. 구현예 18에 있어서, 상기 이식유전자성 식물의 줄기 또는 자루의 적어도 하나의 마디간 조직에서 하나 이상의 활성 GAs의 수준이 야생형 대조군 식물의 동일한 마디간 조직보다 더 낮은, 이식유전자성 곡물 식물.
구현예 25. 구현예 18에 있어서, 상기 이식유전자성 식물의 줄기 또는 자루의 적어도 하나의 마디간 조직에서 하나 이상의 활성 GAs의 수준이 야생형 대조군 식물의 동일한 마디간 조직보다 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 또는 적어도 40% 더 낮은, 이식유전자성 곡물 식물.
구현예 26. 구현예 1의 재조합 DNA 작제물을 포함하는, 이식유전자성 옥수수 식물, 식물 일부 또는 식물 세포.
구현예 27. 하기 단계를 포함하는, 이식유전자성 곡물 식물의 생산 방법: (a) 외식편의 적어도 하나의 세포를 구현예 1의 상기 재조합 DNA 작제물로 형질전환시키는 단계, 및 (b) 상기 형질전환된 외식편으로부터 이식유전자성 곡물 식물을 재생 또는 발생시키는 단계.
구현예 28. 구현예 25에 있어서, 상기 곡물 식물이 아그로박테리움 매개된 형질전환 또는 입자 폭격을 통해 형질전환되는, 방법.
구현예 29. 비-코딩 RNA 분자를 인코딩하는 전사가능한 DNA 서열을 포함하는, 재조합 DNA 작제물로서, 상기 비-코딩 RNA 분자가 외떡잎식물 또는 곡물 식물 또는 식물 세포에서 내인성 GA20 옥시다제 단백질을 인코딩하는 mRNA 분자의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적이고, 상기 내인성 GA20 옥시다제 단백질이 서열번호: 15에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고, 상기 전사가능한 DNA 서열이 식물-발현성 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 재조합 DNA 작제물.
구현예 30. 구현예 29에 있어서, 상기 비-코딩 RNA 분자가 서열번호: 13 또는 서열번호: 14의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인 서열을 포함하는, 재조합 DNA 작제물.
구현예 31. 구현예 29에 있어서, 상기 식물-발현성 프로모터가 관속 프로모터인, 재조합 DNA 작제물.
구현예 32. 구현예 31에 있어서, 상기 관속 프로모터가 하기 중 하나를 포함하는, 재조합 DNA 작제물: 수크로스 합성효소 프로모터, 수크로스 수송체 프로모터, Sh1 프로모터, 코멜리나 옐로우 반상 바이러스 (CoYMV) 프로모터, 밀 왜소 제미니바이러스 (WDV) 큰 유전자간 영역 (LIR) 프로모터, 옥수수 줄무늬 제미니바이러스 (MSV) 코트 단백질 (CP) 프로모터, 쌀 옐로우 스트라이프 1 (YS1)-유사 프로모터, 또는 쌀 옐로우 스트라이프 2 (OsYSL2) 프로모터.
구현예 33. 구현예 31에 있어서, 상기 관속 프로모터가 서열번호: 67, 서열번호: 68, 서열번호: 69, 서열번호: 70, 또는 서열번호: 71 중 하나 이상에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100% 동일한 DNA 서열, 또는 이의 기능적 부분을 포함하는, 재조합 DNA 작제물.
구현예 34. 구현예 29에 있어서, 상기 식물-발현성 프로모터가 RTBV 프로모터인, 재조합 DNA 작제물.
구현예 35. 구현예 34에 있어서, 상기 식물-발현성 프로모터가 서열번호: 65 또는 서열번호: 66 중 하나 이상에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100% 동일한 DNA 서열, 또는 이의 기능적 부분을 포함하는, 재조합 DNA 작제물.
구현예 36. 구현예 29에 있어서, 상기 식물-발현성 프로모터가 잎 프로모터인, 재조합 DNA 작제물.
구현예 37. 구현예 36에 있어서, 상기 잎 프로모터가 하기 중 하나를 포함하는, 재조합 DNA 작제물: RuBisCO 프로모터, PPDK 프로모터, FDA 프로모터, Nadh-Gogat 프로모터, 클로로필 a/b 결합 단백질 유전자 프로모터, 포스포에놀피루베이트 카복실라제 (PEPC) 프로모터, 또는 Myb 유전자 프로모터.
구현예 38. 구현예 36에 있어서, 상기 잎 프로모터가 서열번호: 72, 서열번호: 73 또는 서열번호: 74 중 하나 이상에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100% 동일한 DNA 서열, 또는 이의 기능적 부분을 포함하는, 재조합 DNA 작제물.
구현예 39. 구현예 29에 있어서, 상기 식물-발현성 프로모터가 항시성 프로모터인, 재조합 DNA 작제물.
구현예 40. 구현예 39에 있어서, 상기 항시성 프로모터가 하기로 구성된 군으로부터 선택되는, 재조합 DNA 작제물: 액틴 프로모터, CaMV 35S 또는 19S 프로모터, 식물 유비퀴틴 프로모터, 식물 Gos2 프로모터, FMV 프로모터, CMV 프로모터, MMV 프로모터, PCLSV 프로모터, Emu 프로모터, 튜불린 프로모터, 노팔라인 합성효소 프로모터, 옥토핀 합성효소 프로모터, 만노핀 합성효소 프로모터, 또는 옥수수 알코올 탈수소효소, 또는 이의 기능적 부분.
구현예 41. 구현예 39에 있어서, 상기 항시성 프로모터가 서열번호: 75, 서열번호: 76, 서열번호: 77, 서열번호: 78, 서열번호: 79, 서열번호: 80, 서열번호: 81, 서열번호: 82 또는 서열번호: 83 중 하나 이상에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100% 동일한 DNA 서열, 또는 이의 기능적 부분을 포함하는, 재조합 DNA 작제물.
구현예 42. 구현예 29에 있어서, 상기 전사가능한 DNA 서열에 의해 인코딩된 비-코딩 RNA 분자가 성숙한 miRNA 또는 siRNA를 형성하기 위해 식물 세포에서 가공 또는 절단되는 전구체 miRNA 또는 siRNA인, 재조합 DNA 작제물.
구현예 43. 구현예 29의 재조합 DNA 작제물을 포함하는, 형질전환 벡터.
구현예 44. 구현예 29의 재조합 DNA 작제물을 포함하는, 이식유전자성 곡물 식물, 식물 일부 또는 식물 세포.
구현예 45. 구현예 44에 있어서, 상기 이식유전자성 식물이 대조군 식물에 비하여 하기 특성 중 하나 이상을 갖는, 이식유전자성 곡물 식물: 더 짧은 식물 높이, 증가된 자루/줄기 직경, 향상된 도복 저항성, 더 깊은 뿌리, 증가된 잎 면적, 더 이른 캐노피 폐쇄, 더 높은 기공 유통성, 더 낮은 이삭 높이, 증가된 잎 수분 함량, 향상된 가뭄 내성, 향상된 질소 사용 효율, 정상 또는 질소-제한 또는 수-제한 스트레스 상태 하에서 감소된 안토시아닌 함량 및 면적, 증가된 이삭 중량, 증가된 수확 지수, 증가된 수확량, 증가된 종자 수, 증가된 종자 중량, 및/또는 증가된 다작성.
구현예 46. 구현예 44에 있어서, 상기 이식유전자성 식물이 더 짧은 식물 높이 및/또는 향상된 도복 저항성을 갖는, 이식유전자성 곡물 식물.
구현예 47. 구현예 44에 있어서, 상기 이식유전자성 식물의 높이가 야생형 대조군 식물보다 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 또는 적어도 40% 더 짧은, 이식유전자성 곡물 식물.
구현예 48. 구현예 44에 있어서, 하나 이상의 줄기 마디간에서 상기 이식유전자성 식물의 자루 또는 줄기 직경이 야생형 대조군 식물의 동일한 하나 이상의 마디간에서 상기 자루 또는 줄기 직경보다 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 또는 적어도 40% 더 큰, 이식유전자성 곡물 식물.
구현예 49. 구현예 44 중 어느 하나에 있어서, 상기 이식유전자성 곡물 식물이 옥수수 식물이고, 상기 이삭 아래 제1, 제2, 제3, 및/또는 제4 마디간 중 하나 이상에서 이식유전자성 옥수수 식물의 자루 또는 줄기 직경이 야생형 대조군 식물의 동일한 마디간보다 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 또는 적어도 40% 더 큰, 이식유전자성 곡물 식물.
구현예 50. 구현예 44에 있어서, 상기 이식유전자성 식물의 줄기 또는 자루의 적어도 하나의 마디간 조직에서 하나 이상의 활성 GAs의 수준이 야생형 대조군 식물의 동일한 마디간 조직보다 더 낮은, 이식유전자성 곡물 식물.
구현예 51. 구현예 44에 있어서, 상기 이식유전자성 식물의 줄기 또는 자루의 적어도 하나의 마디간 조직에서 하나 이상의 활성 GAs의 수준이 야생형 대조군 식물의 동일한 마디간 조직보다 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 또는 적어도 40% 더 낮은, 이식유전자성 곡물 식물.
구현예 52. 구현예 29의 재조합 DNA 작제물을 포함하는, 이식유전자성 옥수수 식물, 식물 일부 또는 식물 세포.
구현예 53. 하기 단계를 포함하는, 이식유전자성 곡물 식물의 생산 방법: (a) 외식편의 적어도 하나의 세포를 구현예 29의 상기 재조합 DNA 작제물로 형질전환시키는 단계, 및 (b) 상기 형질전환된 외식편으로부터 상기 이식유전자성 곡물 식물을 재생 또는 발생시키는 단계.
구현예 54. 구현예 29에 있어서, 상기 곡물 식물이 아그로박테리움 매개된 형질전환 또는 입자 폭격을 통해 형질전환되는, 방법.
구현예 55. 비-코딩 RNA 분자를 인코딩하는 전사가능한 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 작제물로서, 상기 비-코딩 RNA 분자가 외떡잎식물 또는 곡물 식물 또는 식물 세포에서 내인성 GA3 옥시다제 단백질을 인코딩하는 mRNA 분자의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인 서열을 포함하고, 상기 내인성 GA3 옥시다제 단백질이 서열번호: 30 또는 33에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고, 상기 전사가능한 DNA 서열이 식물-발현성 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 재조합 DNA 작제물.
구현예 56. 구현예 55에 있어서, 상기 비-코딩 RNA 분자가 서열번호: 28, 29, 31 또는 32의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인 서열을 포함하는, 재조합 DNA 작제물.
구현예 57. 구현예 55에 있어서, 상기 식물-발현성 프로모터가 관속 프로모터인, 재조합 DNA 작제물.
구현예 58. 구현예 57에 있어서, 상기 관속 프로모터가 하기 중 하나를 포함하는, 재조합 DNA 작제물: 수크로스 합성효소 프로모터, 수크로스 수송체 프로모터, Sh1 프로모터, 코멜리나 옐로우 반상 바이러스 (CoYMV) 프로모터, 밀 왜소 제미니바이러스 (WDV) 큰 유전자간 영역 (LIR) 프로모터, 옥수수 줄무늬 제미니바이러스 (MSV) 코트 단백질 (CP) 프로모터, 쌀 옐로우 스트라이프 1 (YS1)-유사 프로모터, 또는 쌀 옐로우 스트라이프 2 (OsYSL2) 프로모터.
구현예 59. 구현예 57에 있어서, 상기 관속 프로모터가 서열번호: 67, 서열번호: 68, 서열번호: 69, 서열번호: 70, 또는 서열번호: 71 중 하나 이상에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100% 동일한 DNA 서열, 또는 이의 기능적 부분을 포함하는, 재조합 DNA 작제물.
구현예 60. 구현예 55에 있어서, 상기 식물-발현성 프로모터가 RTBV 프로모터인, 재조합 DNA 작제물.
구현예 61. 구현예 60에 있어서, 상기 식물-발현성 프로모터가 서열번호: 65 또는 서열번호: 66 중 하나 이상에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100% 동일한 DNA 서열, 또는 이의 기능적 부분을 포함하는, 재조합 DNA 작제물.
구현예 62. 구현예 55에 있어서, 상기 식물-발현성 프로모터가 잎 프로모터인, 재조합 DNA 작제물.
구현예 63. 구현예 62에 있어서, 상기 잎 프로모터가 하기 중 하나를 포함하는, 재조합 DNA 작제물: RuBisCO 프로모터, PPDK 프로모터, FDA 프로모터, Nadh-Gogat 프로모터, 클로로필 a/b 결합 단백질 유전자 프로모터, 포스포에놀피루베이트 카복실라제 (PEPC) 프로모터, 또는 Myb 유전자 프로모터.
구현예 64. 구현예 62에 있어서, 상기 잎 프로모터가 서열번호: 72, 서열번호: 73 또는 서열번호: 74 중 하나 이상에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100% 동일한 DNA 서열, 또는 이의 기능적 부분을 포함하는, 재조합 DNA 작제물.
구현예 65. 구현예 55에 있어서, 상기 식물-발현성 프로모터가 항시성 프로모터인, 재조합 DNA 작제물.
구현예 66. 구현예 65에 있어서, 상기 항시성 프로모터가 하기로 구성된 군으로부터 선택되는, 재조합 DNA 작제물: 액틴 프로모터, CaMV 35S 또는 19S 프로모터, 식물 유비퀴틴 프로모터, 식물 Gos2 프로모터, FMV 프로모터, CMV 프로모터, MMV 프로모터, PCLSV 프로모터, Emu 프로모터, 튜불린 프로모터, 노팔라인 합성효소 프로모터, 옥토핀 합성효소 프로모터, 만노핀 합성효소 프로모터, 또는 옥수수 알코올 탈수소효소, 또는 이의 기능적 부분.
구현예 67. 구현예 65에 있어서, 상기 항시성 프로모터가 서열번호: 75, 서열번호: 76, 서열번호: 77, 서열번호: 78, 서열번호: 79, 서열번호: 80, 서열번호: 81, 서열번호: 82 또는 서열번호: 83 중 하나 이상에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100% 동일한 DNA 서열, 또는 이의 기능적 부분을 포함하는, 재조합 DNA 작제물.
구현예 68. 구현예 55에 있어서, 상기 전사가능한 DNA 서열에 의해 인코딩된 비-코딩 RNA 분자가 성숙한 miRNA 또는 siRNA를 형성하기 위해 식물 세포에서 가공 또는 절단되는 전구체 miRNA 또는 siRNA인, 재조합 DNA 작제물.
구현예 69. 구현예 55의 재조합 DNA 작제물을 포함하는, 형질전환 벡터.
구현예 70. 구현예 55의 재조합 DNA 작제물을 포함하는, 이식유전자성 곡물 식물, 식물 일부 또는 식물 세포.
구현예 71. 구현예 70에 있어서, 상기 이식유전자성 식물이 대조군 식물에 비하여 하기 특성 중 하나 이상을 갖는, 이식유전자성 곡물 식물: 더 짧은 식물 높이, 증가된 자루/줄기 직경, 향상된 도복 저항성, 더 깊은 뿌리, 증가된 잎 면적, 더 이른 캐노피 폐쇄, 더 높은 기공 유통성, 더 낮은 이삭 높이, 증가된 잎 수분 함량, 향상된 가뭄 내성, 향상된 질소 사용 효율, 정상 또는 질소-제한 또는 수-제한 스트레스 상태 하에서 감소된 안토시아닌 함량 및 면적, 증가된 이삭 중량, 증가된 수확 지수, 증가된 수확량, 증가된 종자 수, 증가된 종자 중량, 및/또는 증가된 다작성.
구현예 72. 구현예 70에 있어서, 상기 이식유전자성 식물이 더 짧은 식물 높이 및/또는 향상된 도복 저항성을 갖는, 이식유전자성 곡물 식물.
구현예 73. 구현예 70에 있어서, 상기 이식유전자성 식물의 높이가 야생형 대조군 식물보다 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 또는 적어도 40% 더 짧은, 이식유전자성 곡물 식물.
구현예 74. 구현예 70에 있어서, 하나 이상의 줄기 마디간에서 상기 이식유전자성 식물의 자루 또는 줄기 직경이 야생형 대조군 식물의 동일한 하나 이상의 마디간에서 자루 또는 줄기 직경보다 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 또는 적어도 40% 더 큰, 이식유전자성 곡물 식물.
구현예 75. 구현예 70 중 어느 하나에 있어서, 상기 이식유전자성 곡물 식물이 옥수수 식물이고, 상기 이삭 아래 제1, 제2, 제3, 및/또는 제4 마디간 중 하나 이상에서 이식유전자성 옥수수 식물의 자루 또는 줄기 직경이 야생형 대조군 식물의 동일한 마디간보다 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 또는 적어도 40% 더 큰, 이식유전자성 곡물 식물.
구현예 76. 구현예 70에 있어서, 상기 이식유전자성 식물의 줄기 또는 자루의 적어도 하나의 마디간 조직에서 하나 이상의 활성 GAs의 수준이 야생형 대조군 식물의 동일한 마디간 조직보다 더 낮은, 이식유전자성 곡물 식물.
구현예 77. 구현예 70에 있어서, 상기 이식유전자성 식물의 줄기 또는 자루의 적어도 하나의 마디간 조직에서 하나 이상의 활성 GAs의 수준이 야생형 대조군 식물의 동일한 마디간 조직보다 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 또는 적어도 40% 더 낮은, 이식유전자성 곡물 식물.
구현예 78. 구현예 55의 재조합 DNA 작제물을 포함하는, 이식유전자성 옥수수 식물, 식물 일부 또는 식물 세포.
구현예 79. 하기 단계를 포함하는, 이식유전자성 곡물 식물의 생산 방법: (a) 외식편의 적어도 하나의 세포를 구현예 55의 상기 재조합 DNA 작제물로 형질전환시키는 단계, 및 (b) 상기 형질전환된 외식편으로부터 상기 이식유전자성 곡물 식물을 재생 또는 발생시키는 단계.
구현예 80. 구현예 79에 있어서, 상기 곡물 식물이 아그로박테리움 매개된 형질전환 또는 입자 폭격을 통해 형질전환되는, 방법.
구현예 81. 비-코딩 RNA 분자를 인코딩하는 전사가능한 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 작제물로서, 상기 비-코딩 RNA 분자가 외떡잎식물 또는 곡물 식물 또는 식물 세포에서 내인성 GA20 옥시다제 단백질을 인코딩하는 mRNA 분자의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인 서열을 포함하고, 상기 내인성 GA20 옥시다제 단백질이 서열번호: 12에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고, 상기 전사가능한 DNA 서열이 식물-발현성 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 재조합 DNA 작제물.
구현예 82. 구현예 81에 있어서, 상기 비-코딩 RNA 분자가 서열번호: 10 또는 11의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인 서열을 포함하는, 재조합 DNA 작제물.
구현예 83. 구현예 81에 있어서, 상기 식물-발현성 프로모터가 관속 프로모터인, 재조합 DNA 작제물.
구현예 84. 구현예 83에 있어서, 상기 관속 프로모터가 하기 중 하나를 포함하는, 재조합 DNA 작제물: 수크로스 합성효소 프로모터, 수크로스 수송체 프로모터, Sh1 프로모터, 코멜리나 옐로우 반상 바이러스 (CoYMV) 프로모터, 밀 왜소 제미니바이러스 (WDV) 큰 유전자간 영역 (LIR) 프로모터, 옥수수 줄무늬 제미니바이러스 (MSV) 코트 단백질 (CP) 프로모터, 쌀 옐로우 스트라이프 1 (YS1)-유사 프로모터, 또는 쌀 옐로우 스트라이프 2 (OsYSL2) 프로모터.
구현예 85. 구현예 83에 있어서, 상기 관속 프로모터가 서열번호: 67, 서열번호: 68, 서열번호: 69, 서열번호: 70, 또는 서열번호: 71 중 하나 이상에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100% 동일한 DNA 서열, 또는 이의 기능적 부분을 포함하는, 재조합 DNA 작제물.
구현예 86. 구현예 81에 있어서, 상기 식물-발현성 프로모터가 RTBV 프로모터인, 재조합 DNA 작제물.
구현예 87. 구현예 86에 있어서, 상기 식물-발현성 프로모터가 서열번호: 65 또는 서열번호: 66 중 하나 이상에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100% 동일한 DNA 서열, 또는 이의 기능적 부분을 포함하는, 재조합 DNA 작제물.
구현예 88. 구현예 81에 있어서, 상기 식물-발현성 프로모터가 잎 프로모터인, 재조합 DNA 작제물.
구현예 89. 구현예 88에 있어서, 상기 잎 프로모터가 하기 중 하나를 포함하는, 재조합 DNA 작제물: RuBisCO 프로모터, PPDK 프로모터, FDA 프로모터, Nadh-Gogat 프로모터, 클로로필 a/b 결합 단백질 유전자 프로모터, 포스포에놀피루베이트 카복실라제 (PEPC) 프로모터, 또는 Myb 유전자 프로모터.
구현예 90. 구현예 88에 있어서, 상기 잎 프로모터가 서열번호: 72, 서열번호: 73 또는 서열번호: 74 중 하나 이상에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100% 동일한 DNA 서열, 또는 이의 기능적 부분을 포함하는, 재조합 DNA 작제물.
구현예 91. 구현예 81에 있어서, 상기 식물-발현성 프로모터가 항시성 프로모터인, 재조합 DNA 작제물.
구현예 92. 구현예 91에 있어서, 상기 항시성 프로모터가 하기로 구성된 군으로부터 선택되는, 재조합 DNA 작제물: 액틴 프로모터, CaMV 35S 또는 19S 프로모터, 식물 유비퀴틴 프로모터, 식물 Gos2 프로모터, FMV 프로모터, CMV 프로모터, MMV 프로모터, PCLSV 프로모터, Emu 프로모터, 튜불린 프로모터, 노팔라인 합성효소 프로모터, 옥토핀 합성효소 프로모터, 만노핀 합성효소 프로모터, 또는 옥수수 알코올 탈수소효소, 또는 이의 기능적 부분.
구현예 93. 구현예 91에 있어서, 상기 항시성 프로모터가 서열번호: 75, 서열번호: 76, 서열번호: 77, 서열번호: 78, 서열번호: 79, 서열번호: 80, 서열번호: 81, 서열번호: 82 또는 서열번호: 83 중 하나 이상에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100% 동일한 DNA 서열, 또는 이의 기능적 부분을 포함하는, 재조합 DNA 작제물.
구현예 94. 구현예 81에 있어서, 상기 전사가능한 DNA 서열에 의해 인코딩된 비-코딩 RNA 분자가 성숙한 miRNA 또는 siRNA를 형성하기 위해 식물 세포에서 가공 또는 절단되는 전구체 miRNA 또는 siRNA인, 재조합 DNA 작제물.
구현예 95. 구현예 81의 재조합 DNA 작제물을 포함하는, 형질전환 벡터.
구현예 96. 구현예 81의 재조합 DNA 작제물을 포함하는, 이식유전자성 곡물 식물, 식물 일부 또는 식물 세포.
구현예 97. 구현예 96에 있어서, 상기 이식유전자성 식물이 대조군 식물에 비하여 하기 특성 중 하나 이상을 갖는, 이식유전자성 곡물 식물: 더 짧은 식물 높이, 증가된 자루/줄기 직경, 향상된 도복 저항성, 더 깊은 뿌리, 증가된 잎 면적, 더 이른 캐노피 폐쇄, 더 높은 기공 유통성, 더 낮은 이삭 높이, 증가된 잎 수분 함량, 향상된 가뭄 내성, 향상된 질소 사용 효율, 정상 또는 질소-제한 또는 수-제한 스트레스 상태 하에서 감소된 안토시아닌 함량 및 면적, 증가된 이삭 중량, 증가된 수확 지수, 증가된 수확량, 증가된 종자 수, 증가된 종자 중량, 및/또는 증가된 다작성.
구현예 98. 구현예 96에 있어서, 상기 이식유전자성 식물이 더 짧은 식물 높이 및/또는 향상된 도복 저항성을 갖는, 이식유전자성 곡물 식물.
구현예 99. 구현예 96에 있어서, 상기 이식유전자성 식물의 높이가 야생형 대조군 식물보다 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 또는 적어도 40% 더 짧은, 이식유전자성 곡물 식물.
구현예 100. 구현예 96에 있어서, 하나 이상의 줄기 마디간에서 상기 이식유전자성 식물의 자루 또는 줄기 직경이 야생형 대조군 식물의 동일한 하나 이상의 마디간에서 자루 또는 줄기 직경보다 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 또는 적어도 40% 더 큰, 이식유전자성 곡물 식물.
구현예 101. 구현예 96 중 어느 하나에 있어서, 상기 이식유전자성 곡물 식물이 옥수수 식물이고, 상기 이삭 아래 제1, 제2, 제3, 및/또는 제4 마디간 중 하나 이상에서 이식유전자성 옥수수 식물의 자루 또는 줄기 직경이 야생형 대조군 식물의 동일한 마디간보다 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 또는 적어도 40% 더 큰, 이식유전자성 곡물 식물.
구현예 102. 구현예 96에 있어서, 상기 이식유전자성 식물의 줄기 또는 자루의 적어도 하나의 마디간 조직에서 하나 이상의 활성 GAs의 수준이 야생형 대조군 식물의 동일한 마디간 조직보다 더 낮은, 이식유전자성 곡물 식물.
구현예 103. 구현예 96에 있어서, 상기 이식유전자성 식물의 줄기 또는 자루의 적어도 하나의 마디간 조직에서 하나 이상의 활성 GAs의 수준이 야생형 대조군 식물의 동일한 마디간 조직보다 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 또는 적어도 40% 더 낮은, 이식유전자성 곡물 식물.
구현예 104. 구현예 81의 재조합 DNA 작제물을 포함하는, 이식유전자성 옥수수 식물, 식물 일부 또는 식물 세포.
구현예 105. 하기 단계를 포함하는, 이식유전자성 곡물 식물의 생산 방법: (a) 외식편의 적어도 하나의 세포를 구현예 81의 상기 재조합 DNA 작제물로 형질전환시키는 단계, 및 (b) 상기 형질전환된 외식편으로부터 상기 이식유전자성 곡물 식물을 재생 또는 발생시키는 단계.
구현예 106. 구현예 105에 있어서, 상기 곡물 식물이 아그로박테리움 매개된 형질전환 또는 입자 폭격을 통해 형질전환되는, 방법.
구현예 107. 구현예 1, 29, 55 또는 81에 있어서, 상기 비-코딩 RNA 분자가 외떡잎식물 또는 곡물 식물 또는 식물 세포에서 내인성 GA 옥시다제 단백질을 인코딩하는 mRNA 분자의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인 서열을 포함하고, 상기 내인성 GA 옥시다제 단백질이 서열번호: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30 및 33 중 하나 이상에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한, 재조합 DNA 작제물.
구현예 108. 구현예 107에 있어서, 상기 비-코딩 RNA 분자가 서열번호: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 및 32 중 하나 이상의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인 서열을 포함하는, 재조합 DNA 작제물.
구현예 109. 비-코딩 RNA 분자를 인코딩하는 전사가능한 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 작제물로서, 상기 비-코딩 RNA 분자가 외떡잎식물 또는 곡물 식물 또는 식물 세포에서 내인성 단백질을 인코딩하는 mRNA 분자의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인 서열을 포함하고, 상기 내인성 단백질이 서열번호: 86, 90, 94, 97, 101, 104, 108, 112, 116, 118, 121, 125, 129, 133, 또는 136에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일하고, 상기 전사가능한 DNA 서열이 식물-발현성 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 재조합 DNA 작제물.
구현예 110. 구현예 109에 있어서, 상기 비-코딩 RNA 분자가 서열번호: 84, 85, 87, 88, 89, 91, 92, 93, 95, 96, 98, 99, 100, 102, 103, 105, 106, 107, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 119, 120, 122, 123, 124, 126, 127, 128, 130, 131, 132, 134, 135, 또는 137의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인 서열을 포함하는, 재조합 DNA 작제물.
구현예 111. 구현예 109에 있어서, 상기 식물-발현성 프로모터가 관속 프로모터인, 재조합 DNA 작제물.
구현예 112. 구현예 109에 있어서, 상기 식물-발현성 프로모터가 RTBV 프로모터인, 재조합 DNA 작제물.
구현예 113. 구현예 109에 있어서, 상기 식물-발현성 프로모터가 잎 프로모터인, 재조합 DNA 작제물.
구현예 114. 구현예 109에 있어서, 상기 식물-발현성 프로모터가 항시성 프로모터인, 재조합 DNA 작제물.
구현예 115. 구현예 81의 재조합 DNA 작제물을 포함하는, 형질전환 벡터.
구현예 116. 구현예 109의 재조합 DNA 작제물을 포함하는, 이식유전자성 곡물 식물, 식물 일부 또는 식물 세포.
구현예 117. 구현예 116에 있어서, 상기 이식유전자성 식물이 더 짧은 식물 높이 및/또는 향상된 도복 저항성을 갖는, 이식유전자성 곡물 식물.
구현예 118. 구현예 116에 있어서, 상기 이식유전자성 식물의 줄기 또는 자루의 적어도 하나의 마디간 조직에서 하나 이상의 활성 GAs의 수준이 야생형 대조군 식물의 동일한 마디간 조직보다 더 낮은, 이식유전자성 곡물 식물.
구현예 119. 하기 단계를 포함하는, 이식유전자성 곡물 식물의 생산 방법: (a) 외식편의 적어도 하나의 세포를 구현예 116의 상기 재조합 DNA 작제물로 형질전환시키는 단계, 및 (b) 상기 형질전환된 외식편으로부터 상기 이식유전자성 곡물 식물을 재생 또는 발생시키는 단계.
구현예 120. 구현예 119에 있어서, 상기 곡물 식물이 아그로박테리움 매개된 형질전환 또는 입자 폭격을 통해 형질전환되는, 방법.
구현예 121. 하기 단계를 포함하는, 옥수수 또는 곡물 식물의 줄기 또는 자루에서 적어도 하나의 활성 GA 분자의 수준의 저하 방법: 이식유전자성 곡물 또는 옥수수 식물의 하나 이상의 조직에서 재조합 DNA 작제물로 하나 이상의 GA3 옥시다제 또는 GA20 옥시다제 유전자를 억제시키는 단계.
구현예 122. 구현예 121에 있어서, 상기 재조합 DNA 작제물이 억제용 하나 이상의 GA3 또는 GA20 옥시다제 유전자를 표적화하는 비-코딩 RNA 분자를 인코딩하고, 상기 전사가능한 DNA 서열이 식물-발현성 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 방법.
구현예 123. 구현예 122에 있어서, 상기 식물-발현성 프로모터가 관속 프로모터인, 방법.
구현예 124. 구현예 122에 있어서, 상기 식물-발현성 프로모터가 RTBV 프로모터인, 방법.
구현예 125. 구현예 122에 있어서, 상기 식물-발현성 프로모터가 항시성 프로모터인, 방법.
구현예 126. 구현예 122에 있어서, 상기 식물-발현성 프로모터가 잎 프로모터인, 방법.
구현예 127. 구현예 121에 있어서, 상기 이식유전자성 옥수수 또는 곡물 식물이 옥수수 식물인, 방법.
구현예 128. 재조합 DNA 작제물을 포함하는 이식유전자성 옥수수 또는 곡물 식물로서, 상기 재조합 DNA 작제물이 억제용 적어도 하나의 내인성 GA20 또는 GA3 옥시다제 유전자를 표적화하는 비-코딩 RNA 분자를 인코딩하는 전사가능한 DNA 서열을 포함하고, 상기 전사가능한 DNA 서열이 식물-발현성 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 상기 이식유전자성 외떡잎식물 또는 곡물 식물이 야생형 대조군 식물에 비하여 더 짧은 식물 높이를 갖는, 이식유전자성 옥수수 또는 곡물 식물.
구현예 129. 구현예 128에 있어서, 상기 이식유전자성 식물이 대조군 식물에 비하여 하기 추가의 특성 중 하나 이상을 갖는, 이식유전자성 옥수수 또는 곡물 식물: 증가된 자루/줄기 직경, 향상된 도복 저항성, 더 깊은 뿌리, 증가된 잎 면적, 더 이른 캐노피 폐쇄, 더 높은 기공 유통성, 더 낮은 이삭 높이, 증가된 잎 수분 함량, 향상된 가뭄 내성, 향상된 질소 사용 효율, 정상 또는 질소 또는 물 제한 스트레스 상태 하에서 감소된 안토시아닌 함량 및 면적, 증가된 이삭 중량, 증가된 수확 지수, 증가된 수확량, 증가된 종자 수, 증가된 종자 중량, 및 증가된 다작성.
구현예 130. 구현예 128에 있어서, 상기 이식유전자성 식물의 높이가 대조군 식물보다 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 또는 적어도 40% 더 짧은, 이식유전자성 옥수수 또는 곡물 식물.
구현예 131. 구현예 128에 있어서, 하나 이상의 줄기 마디간에서 상기 이식유전자성 식물의 자루 또는 줄기 직경이 대조군 식물보다 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 또는 적어도 40% 더 큰, 이식유전자성 옥수수 또는 곡물 식물.
구현예 132. 구현예 128 중 어느 하나에 있어서, 상기 이식유전자성 식물의 줄기 또는 자루의 적어도 하나의 마디간 조직에서 하나 이상의 활성 GAs의 수준이 대조군 식물의 동일한 마디간 조직보다 더 낮은, 이식유전자성 옥수수 또는 곡물 식물.
구현예 133. 구현예 128 중 어느 하나에 있어서, 상기 이식유전자성 식물의 줄기 또는 자루의 적어도 하나의 마디간 조직에서 하나 이상의 활성 GAs의 수준이 대조군 식물의 동일한 마디간 조직보다 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 또는 적어도 40% 더 낮은, 이식유전자성 옥수수 또는 곡물 식물.
구현예 134. 구현예 128 중 어느 하나에 있어서, 상기 이식유전자성 식물이 적어도 하나의 자성 장기 또는 이삭에서 임의의 상당한 오프-유형을 갖지 않는, 이식유전자성 옥수수 또는 곡물 식물.
구현예 135. 구현예 128 중 어느 하나에 있어서, 상기 이식유전자성 곡물 식물이 옥수수 식물이고, 상기 비-코딩 RNA 분자가 억제용 내인성 GA20 옥시다제_3 및/또는 GA20 옥시다제_5 유전자(들)을 표적화하는, 이식유전자성 옥수수 또는 곡물 식물.
구현예 136. 구현예 128에 있어서, 상기 식물-발현성 프로모터가 관속 프로모터인, 이식유전자성 옥수수 또는 곡물 식물.
구현예 137. 구현예 128에 있어서, 상기 식물-발현성 프로모터가 RTBV 프로모터인, 이식유전자성 옥수수 또는 곡물 식물.
구현예 138. 구현예 128에 있어서, 상기 식물-발현성 프로모터가 항시성 프로모터인, 이식유전자성 옥수수 또는 곡물 식물.
구현예 139. 구현예 128에 있어서, 상기 식물-발현성 프로모터가 잎 프로모터인, 이식유전자성 옥수수 또는 곡물 식물.
구현예 140. 구현예 128에 있어서, 상기 이식유전자성 식물이 대조군 식물에 비하여 하기 추가의 특성 중 하나 이상을 갖는, 이식유전자성 옥수수 또는 곡물 식물: 증가된 자루/줄기 직경, 향상된 도복 저항성, 더 깊은 뿌리, 증가된 잎 면적, 더 이른 캐노피 폐쇄, 더 높은 기공 유통성, 더 낮은 이삭 높이, 증가된 잎 수분 함량, 향상된 가뭄 내성, 향상된 질소 사용 효율, 정상 또는 질소 또는 물 제한 스트레스 상태 하에서 감소된 안토시아닌 함량 및 면적, 증가된 이삭 중량, 증가된 수확 지수, 증가된 수확량, 증가된 종자 수, 증가된 종자 중량, 및 증가된 다작성.
구현예 141. 돌연변이유발 기술에 의해 도입된 내인성 GA 옥시다제 유전자에서 또는 근처에서 돌연변이를 포함하는 곡물 식물로서, 상기 내인성 GA 옥시다제 유전자의 발현 수준이 곡물 식물에서 감소 또는 제거되고, 상기 곡물 식물이 야생형 대조군 식물에 비하여 더 짧은 식물 높이를 갖는, 곡물 식물.
구현예 142. 구현예 141에 있어서, 돌연변이를 포함하는 상기 곡물 식물이 대조군 식물에 비하여 하기 추가의 특성 중 하나 이상을 갖는, 곡물 식물: 증가된 자루/줄기 직경, 향상된 도복 저항성, 더 깊은 뿌리, 증가된 잎 면적, 더 이른 캐노피 폐쇄, 더 높은 기공 유통성, 더 낮은 이삭 높이, 증가된 잎 수분 함량, 향상된 가뭄 내성, 향상된 질소 사용 효율, 정상 또는 질소 또는 물 제한 스트레스 상태 하에서 감소된 안토시아닌 함량 및 면적, 증가된 이삭 중량, 증가된 수확 지수, 증가된 수확량, 증가된 종자 수, 증가된 종자 중량, 및 증가된 다작성.
구현예 143. 구현예 141에 있어서, 상기 곡물 식물의 높이가 대조군 식물보다 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 또는 적어도 40% 더 짧은, 곡물 식물.
구현예 144. 구현예 141에 있어서, 하나 이상의 줄기 마디간에서 상기 곡물 식물의 자루 또는 줄기 직경이 대조군 식물보다 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 또는 적어도 40% 더 큰, 곡물 식물.
구현예 145. 구현예 141에 있어서, 상기 곡물 식물의 줄기 또는 자루의 적어도 하나의 마디간 조직에서 하나 이상의 활성 GAs의 수준이 대조군 식물의 동일한 마디간 조직보다 더 낮은, 곡물 식물.
구현예 146. 구현예 141에 있어서, 상기 곡물 식물의 줄기 또는 자루의 적어도 하나의 마디간 조직에서 하나 이상의 활성 GAs의 수준이 대조군 식물의 동일한 마디간 조직보다 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 또는 적어도 40% 더 낮은, 곡물 식물.
구현예 147. 구현예 141에 있어서, 상기 곡물 식물이 적어도 하나의 자성 장기 또는 이삭에서 임의의 상당한 오프-유형을 갖지 않는, 곡물 식물.
구현예 148. 구현예 141에 있어서, 상기 곡물 식물이 옥수수 식물인, 곡물 식물.
구현예 149. 내인성 GA 옥시다제 유전자의 유전자좌에서 또는 근처에서 표적화된 게놈 편집 기술을 통해 도입된 게놈 편집을 포함하는 옥수수 또는 곡물 식물로서, 상기 내인성 GA 옥시다제 유전자의 발현 수준이 대조군 식물에 비하여 감소 또는 제거되고, 상기 편집된 곡물 식물이 대조군 식물에 비하여 더 짧은 식물 높이를 갖는, 옥수수 또는 곡물 식물.
구현예 150. 구현예 149에 있어서, 상기 편집된 식물이 대조군 식물에 비하여 하기 추가의 특성 중 하나 이상을 갖는, 편집된 옥수수 또는 곡물 식물: 증가된 자루/줄기 직경, 향상된 도복 저항성, 더 깊은 뿌리, 증가된 잎 면적, 더 이른 캐노피 폐쇄, 더 높은 기공 유통성, 더 낮은 이삭 높이, 증가된 잎 수분 함량, 향상된 가뭄 내성, 향상된 질소 사용 효율, 정상 또는 질소 또는 물 제한 스트레스 상태 하에서 감소된 안토시아닌 함량 및 면적, 증가된 이삭 중량, 증가된 수확 지수, 증가된 수확량, 증가된 종자 수, 증가된 종자 중량, 및 증가된 다작성.
구현예 151. 구현예 149에 있어서, 상기 편집된 식물의 높이가 대조군 식물보다 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 또는 적어도 40% 더 짧은, 편집된 옥수수 또는 곡물 식물.
구현예 152. 구현예 149에 있어서, 하나 이상의 줄기 마디간에서 상기 편집된 식물의 자루 또는 줄기 직경이 대조군 식물보다 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 또는 적어도 40% 더 큰, 편집된 옥수수 또는 곡물 식물.
구현예 153. 구현예 149에 있어서, 상기 편집된 식물의 줄기 또는 자루의 적어도 하나의 마디간 조직에서 하나 이상의 활성 GAs의 수준이 대조군 식물의 동일한 마디간 조직보다 더 낮은, 편집된 옥수수 또는 곡물 식물.
구현예 154. 구현예 149에 있어서, 상기 편집된 식물의 줄기 또는 자루의 적어도 하나의 마디간 조직에서 하나 이상의 활성 GAs의 수준이 대조군 식물의 동일한 마디간 조직보다 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 또는 적어도 40% 더 낮은, 편집된 옥수수 또는 곡물 식물.
구현예 155. 구현예 149에 있어서, 상기 편집된 식물이 적어도 하나의 자성 장기 또는 이삭에서 임의의 상당한 오프-유형을 갖지 않는, 편집된 옥수수 또는 곡물 식물.
구현예 156. 구현예 149에 있어서, 상기 게놈 편집이 메가뉴클레아제, 아연-핑거 뉴클레아제 (ZFN), RNA-유도된 엔도뉴클레아제, TALE-엔도뉴클레아제 (TALEN), 재조합효소, 또는 전위효소를 사용하여 도입되는, 편집된 옥수수 또는 곡물 식물.
구현예 157. 구현예 149에 있어서, 상기 게놈 편집이 대조군 식물에서 내인성 GA 옥시다제 유전자의 서열에 비하여 하나 이상의 뉴클레오타이드의 치환, 결실, 삽입, 또는 역전을 포함하는, 편집된 옥수수 또는 곡물 식물.
구현예 158. 가이드 RNA를 포함하는 조성물로서, 상기 가이드 RNA가 곡물 식물의 내인성 GA 옥시다제 유전자의 유전자 좌위에서 또는 근처에서 표적 DNA 서열의 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 또는 적어도 25 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 또는 상보적인 가이드 서열을 포함하는, 조성물.
구현예 159. 구현예 158에 있어서, 상기 가이드 RNA 분자가 서열번호: 34, 35 또는 38, 또는 거기에 상보적인 서열의 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 또는 적어도 25 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 상보적인 가이드 서열을 포함하는, 조성물.
구현예 160. 구현예 158에 있어서, 상기 가이드 RNA 분자가 서열번호: 87, 91, 95, 98, 105, 109, 113, 117, 122, 126, 130 또는 137, 또는 거기에 상보적인 서열의 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 또는 적어도 25 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 상보적인 가이드 서열을 포함하는, 조성물.
구현예 161. 구현예 158에 있어서, RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 추가로 포함하는, 조성물.
구현예 162. 구현예 161에 있어서, 가이드 RNA 분자의 존재 하에서 상기 RNA-유도된 엔도뉴클레아제가 곡물 식물의 게놈에서 상기 표적 DNA 서열에서 또는 근처에서 이중 가닥 절단 또는 닉을 야기시키는, 조성물.
구현예 163. 구현예 161에 있어서, 상기 RNA-유도된 엔도뉴클레아제가 하기로 구성된 군으로부터 선택되는, 조성물: Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9, Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn1, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx12, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, Cpf1, CasX, CasY, 아르고노트, 및 RNA-유도된 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 임의의 동족체 또는 이의 변형된 버전.
구현예 164. 구현예 158에 있어서, 적어도 하나의 상동성 서열 또는 상동성 아암을 포함하는 재조합 DNA 공여체 템플레이트를 추가로 포함하는 조성물로서, 상기 적어도 하나의 상동성 서열 또는 상동성 아암이 표적 DNA 서열의 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 500, 적어도 1000, 적어도 2500, 또는 적어도 5000 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 상보적이고, 상기 표적 DNA 서열이 옥수수 또는 곡물 식물의 내인성 GA 옥시다제 유전자의 유전자 좌위에서 또는 근처에서 유전자 서열인, 조성물.
구현예 165. 비-코딩 가이드 RNA 분자를 인코딩하는 전사가능한 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 작제물로서, 상기 가이드 RNA 분자가 옥수수 또는 곡물 식물의 내인성 GA 옥시다제 유전자의 유전자 좌위에서 또는 근처에서 표적 DNA 서열의 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 또는 적어도 25 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 상보적인 가이드 서열을 포함하는, 재조합 DNA 작제물.
구현예 166. 구현예 165에 있어서, 상기 가이드 RNA가 서열번호: 34, 35 또는 38, 또는 거기에 상보적인 서열의 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 또는 적어도 25 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 상보적인 가이드 서열을 포함하는, 재조합 DNA 작제물.
구현예 167. 구현예 165에 있어서, 상기 가이드 RNA 분자가 서열번호: 87, 91, 95, 98, 105, 109, 113, 117, 122, 126, 130 또는 137, 또는 거기에 상보적인 서열의 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 또는 적어도 25 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 상보적인 가이드 서열을 포함하는, 재조합 DNA 작제물.
구현예 168. 구현예 165에 있어서, 상기 전사가능한 DNA 서열이 식물-발현성 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 재조합 DNA 작제물.
구현예 169. 구현예 165에 있어서, 상기 가이드 RNA 분자가 CRISPR RNA (crRNA) 또는 단일-사슬 가이드 RNA (sgRNA)인, 재조합 DNA 작제물.
구현예 170. 구현예 165에 있어서, 상기 가이드 RNA가 내인성 GA 옥시다제 유전자의 유전자 좌위에서 또는 근처에서 표적 DNA 서열에 바로 인접한 곡물 식물의 게놈에서 존재하는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM) 서열에 상보적인 서열을 포함하는, 재조합 DNA 작제물.
구현예 171. 구현예 165 중 어느 하나에 있어서, 상기 PAM 서열이 표준적 5'-NGG-3' 서열을 포함하는, 재조합 DNA 작제물.
구현예 172. 구현예 165에 있어서, 상기 내인성 GA 옥시다제 유전자가 서열번호: 9, 12 또는 15에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 단백질을 인코딩하는, 재조합 DNA 작제물.
구현예 173. 구현예 165의 재조합 DNA 작제물을 포함하는, DNA 분자.
구현예 174. 구현예 165의 재조합 DNA 작제물을 포함하는, 형질전환 벡터.
구현예 175. 구현예 165의 재조합 DNA 작제물을 포함하는, 박테리아 세포.
구현예 176. 구현예 165의 재조합 DNA 작제물을 포함하는, 옥수수 또는 곡물 식물, 식물 일부 또는 식물 세포.
구현예 177. 구현예 165의 재조합 DNA 작제물을 포함하는, 조성물.
구현예 178. 구현예 177에 있어서, RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 추가로 포함하는, 조성물.
구현예 179. 구현예 177에 있어서, 상기 RNA-유도된 엔도뉴클레아제가 하기로 구성된 군으로부터 선택되는, 조성물: Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9, Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, Cpf1, 아르고노트, 및 RNA-유도된 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 동족체 또는 이의 변형된 버전.
구현예 180. 구현예 177에 있어서, RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 제2 전사가능한 DNA 서열을 포함하는 제2 재조합 DNA 작제물을 추가로 포함하는, 조성물.
구현예 181. 구현예 177에 있어서, 재조합 DNA 작제물 및 제2 재조합 DNA 작제물을 포함하는 DNA 분자 또는 벡터를 포함하는, 조성물.
구현예 182. 구현예 177에 있어서, 제1 DNA 분자 또는 벡터 및 제2 DNA 분자 또는 벡터를 포함하는 조성물로서, 상기 제1 DNA 분자 또는 벡터가 가이드 RNA 분자를 인코딩하는 재조합 DNA 작제물을 포함하고, 상기 제2 DNA 분자 또는 벡터가 RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 제2 재조합 DNA 작제물을 포함하는, 조성물.
구현예 183. 구현예 177에 있어서, 적어도 하나의 상동성 서열 또는 상동성 아암을 포함하는 재조합 DNA 공여체 템플레이트를 추가로 포함하는 조성물로서, 상기 적어도 하나의 상동성 서열 또는 상동성 아암이 표적 DNA 서열의 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 500, 적어도 1000, 적어도 2500, 또는 적어도 5000 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 상보적이고, 상기 표적 DNA 서열이 옥수수 또는 곡물 식물의 내인성 GA 옥시다제 유전자의 유전자 좌위에서 또는 근처에서 유전자 서열인, 조성물.
구현예 184. 적어도 하나의 상동성 서열을 포함하는 재조합 DNA 공여체 템플레이트로서, 상기 적어도 하나의 상동성 서열이 표적 DNA 서열의 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 500, 적어도 1000, 적어도 2500, 또는 적어도 5000 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 상보적이고, 상기 표적 DNA 서열이 옥수수 또는 곡물 식물의 내인성 GA 옥시다제 유전자의 유전자 좌위에서 또는 근처에서 유전자 서열인, 재조합 DNA 공여체 템플레이트.
구현예 185. 구현예 184에 있어서, 상기 적어도 하나의 상동성 서열이 내인성 GA 옥시다제 유전자의 유전자 좌위에서 또는 근처에서 표적 DNA 서열의 상보적 가닥에 비하여 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, 재조합 DNA 공여체 템플레이트.
구현예 186. 구현예 185에 있어서, 상기 적어도 하나의 돌연변이가 표적 DNA 서열의 상보적 가닥에 비하여 하나 이상의 뉴클레오타이드의 치환, 결실, 삽입, 또는 역전을 포함하는, 재조합 DNA 공여체 템플레이트.
구현예 187. 구현예 184에 있어서, 상기 적어도 하나의 상동성 서열이 서열번호: 34, 35 또는 38, 또는 거기에 상보적인 서열의 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 500, 적어도 1000, 적어도 2500, 또는 적어도 5000 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 또는 상보적인, 재조합 DNA 공여체 템플레이트.
구현예 188. 구현예 184에 있어서, 상기 적어도 하나의 상동성 서열이 서열번호: 87, 91, 95, 98, 105, 109, 113, 117, 122, 126, 130 또는 137, 또는 거기에 상보적인 서열의 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 500, 적어도 1000, 적어도 2500, 또는 적어도 5000 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 또는 상보적인, 재조합 DNA 공여체 템플레이트.
구현예 189. 제1 상동성 아암 및 제2 상동성 아암을 포함하는 2개의 상동성 아암을 포함하는 재조합 DNA 공여체 템플레이트로서, 상기 제1 상동성 아암이 제1 측접하는 DNA 서열의 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 500, 적어도 1000, 적어도 2500, 또는 적어도 5000 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 상보적인 서열을 포함하고, 상기 제2 상동성 아암이 제2 측접하는 DNA 서열의 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 500, 적어도 1000, 적어도 2500, 또는 적어도 5000 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 상보적인 서열을 포함하고, 상기 제1 측접하는 DNA 서열 및 상기 제2 측접하는 DNA 서열이 옥수수 또는 곡물 식물의 내인성 GA 옥시다제 유전자의 유전자 좌위에서 또는 근처에서 유전자 서열인, 재조합 DNA 공여체 템플레이트.
구현예 190. 구현예 189에 있어서, 제1 상동성 아암과 제2 상동성 아암 사이 위치한 삽입 서열을 추가로 포함하는, 재조합 DNA 공여체 템플레이트.
구현예 191. 구현예 189에 있어서, 상기 삽입 서열이 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 200, 적어도 300, 적어도 400, 적어도 500, 적어도 750, 적어도 1000, 적어도 2500, 또는 적어도 5000 뉴클레오타이드를 포함하는, 재조합 DNA 공여체 템플레이트.
구현예 192. 구현예 189에 있어서, 각각의 상동성 아암이 서열번호: 34, 35 또는 38, 또는 거기에 상보적인 서열의 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 500, 적어도 1000, 적어도 2500, 또는 적어도 5000 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 또는 상보적인, 재조합 DNA 공여체 템플레이트.
구현예 193. 구현예 189에 있어서, 각각의 상동성 아암이 서열번호: 87, 91, 95, 98, 105, 109, 113, 117, 122, 126, 130 또는 137, 또는 거기에 상보적인 서열의 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 500, 적어도 1000, 적어도 2500, 또는 적어도 5000 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 또는 상보적인, 재조합 DNA 공여체 템플레이트.
구현예 194. 구현예 189에 있어서, 제1 측접하는 DNA 서열과 제2 측접하는 DNA 서열 사이 외떡잎식물 또는 곡물 식물의 게놈에서 존재하는 하나 이상의 뉴클레오타이드가 제1 상동성 아암과 제2 상동성 아암 사이 재조합 DNA 공여체 템플레이트 분자에서 부재인, 재조합 DNA 공여체 템플레이트.
구현예 195. 구현예 194에 있어서, 제1 및 제2 측접하는 DNA 서열 사이 외떡잎식물 또는 곡물 식물의 게놈에서 존재하는 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 200, 적어도 300, 적어도 400, 적어도 500, 적어도 750, 적어도 1000, 적어도 2500, 또는 적어도 5000 뉴클레오타이드가 제1 및 제2 상동성 아암 사이 재조합 DNA 공여체 템플레이트 분자에서 부재인, 재조합 DNA 공여체 템플레이트.
구현예 196. 구현예 189의 재조합 DNA 공여체 템플레이트를 포함하는, DNA 분자 또는 벡터.
구현예 197. 구현예 189의 재조합 DNA 공여체 템플레이트를 포함하는, 박테리아 또는 숙주세포.
구현예 198. 구현예 189의 재조합 DNA 작제물을 포함하는, 옥수수 또는 곡물 식물, 식물 일부 또는 식물 세포.
구현예 199. 옥수수 또는 곡물 식물의 내인성 GA 옥시다제 유전자의 유전자 좌위에서 또는 근처에서 표적 부위에 결합하는 그리고 상기 표적 부위에 이중-가닥 절단 또는 닉을 야기시키는, 조작된 부위-특이적 뉴클레아제.
구현예 200. 구현예 199에 있어서, 상기 부위-특이적 뉴클레아제가 메가뉴클레아제 또는 귀소 엔도뉴클레아제인, 조작된 부위-특이적 뉴클레아제.
구현예 201. 구현예 200에 있어서, 상기 조작된 메가뉴클레아제 또는 귀소 엔도뉴클레아제가 I-CreI, I-CeuI, I-MsoI, I-SceI, I-AniI, 및 I-DmoI로 구성된 군으로부터 선택된 스캐폴드 또는 염기 효소를 포함하는, 조작된 부위-특이적 뉴클레아제.
구현예 202. 구현예 199에 있어서, 상기 부위-특이적 뉴클레아제가 DNA 결합 도메인 및 절단 도메인을 포함하는 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN)인, 조작된 부위-특이적 뉴클레아제.
구현예 203. 구현예 202에 있어서, 상기 절단 도메인이 FokI 뉴클레아제 도메인인, 조작된 아연 핑거 뉴클레아제.
구현예 204. 구현예 199에 있어서, 상기 부위-특이적 뉴클레아제가 DNA 결합 도메인 및 절단 도메인을 포함하는 전사 활성제-유사 효과기 뉴클레아제 (TALEN)인, 조작된 부위-특이적 뉴클레아제.
구현예 205. 구현예 204에 있어서, 상기 절단 도메인이 하기로 구성된 군으로부터 선택되는, 조작된 TALEN: PvuII 뉴클레아제 도메인, MutH 뉴클레아제 도메인, TevI 뉴클레아제 도메인, FokI 뉴클레아제 도메인, AlwI 뉴클레아제 도메인, MlyI 뉴클레아제 도메인, SbfI 뉴클레아제 도메인, SdaI 뉴클레아제 도메인, StsI 뉴클레아제 도메인, CleDORF 뉴클레아제 도메인, Clo051 뉴클레아제 도메인, 및 Pept071 뉴클레아제 도메인.
구현예 206. 구현예 199에 있어서, 부위-특이적 뉴클레아제에 의해 결합된 상기 표적 부위가 서열번호: 34, 35 또는 38, 또는 거기에 상보적인 서열의 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 500, 적어도 1000, 적어도 2500, 또는 적어도 5000 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 또는 상보적인, 조작된 부위-특이적 뉴클레아제.
구현예 207. 구현예 199에 있어서, 부위-특이적 뉴클레아제에 의해 결합된 상기 표적 부위가 서열번호: 87, 91, 95, 98, 105, 109, 113, 117, 122, 126, 130 또는 137, 또는 거기에 상보적인 서열의 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 500, 적어도 1000, 적어도 2500, 또는 적어도 5000 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 또는 상보적인, 조작된 부위-특이적 뉴클레아제.
구현예 208. 부위-특이적 뉴클레아제를 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 재조합 DNA 작제물로서, 상기 부위-특이적 뉴클레아제가 외떡잎식물 또는 곡물 식물의 내인성 GA 옥시다제 유전자의 유전자 좌위에서 또는 근처에서 표적 부위에 결합하고 표적 부위에 이중-가닥 절단 또는 닉을 야기시키는, 재조합 DNA 작제물.
구현예 209. 구현예 208에 있어서, 상기 이식유전자가 식물-발현성 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 재조합 DNA 작제물.
구현예 210. 구현예 208에 있어서, 상기 부위-특이적 뉴클레아제가 메가뉴클레아제 또는 귀소 엔도뉴클레아제, 아연 핑거 뉴클레아제, 또는 전사 활성제-유사 효과기 뉴클레아제 (TALEN)인, 재조합 DNA 작제물.
구현예 211. 구현예 208의 재조합 DNA 작제물을 포함하는, DNA 분자 또는 벡터.
구현예 212. 구현예 208의 재조합 DNA 작제물을 포함하는, 박테리아 또는 숙주세포.
구현예 213. 구현예 208의 재조합 DNA 작제물을 포함하는, 옥수수 또는 곡물 식물, 식물 일부 또는 식물 세포.
구현예 214. 적어도 하나의 상동성 아암 및 삽입 서열을 포함하는 재조합 DNA 공여체 템플레이트로서, 상기 적어도 하나의 상동성 아암이 옥수수 또는 곡물 식물의 게놈 DNA 서열의 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 500, 적어도 1000, 적어도 2500, 또는 적어도 5000 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 상보적이고, 상기 삽입 서열이 비-코딩 RNA 분자를 인코딩하는 전사가능한 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 작제물을 포함하고, 상기 비-코딩 RNA 분자가 외떡잎식물 또는 곡물 식물 또는 식물 세포에서 하나 이상의 내인성 GA20 또는 GA3 옥시다제 유전자 억제를 위하여 표적화하고, 그리고 상기 전사가능한 DNA 서열이 식물-발현성 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 재조합 DNA 공여체 템플레이트.
구현예 215. 구현예 214에 있어서, 상기 적어도 하나의 상동성 아암이 제1 상동성 아암 및 제2 상동성 아암을 포함하는 2개의 상동성 아암을 포함하고, 상기 제1 상동성 아암이 제1 측접하는 DNA 서열의 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 500, 적어도 1000, 적어도 2500, 또는 적어도 5000 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 상보적인 서열을 포함하고, 상기 제2 상동성 아암이 제2 측접하는 DNA 서열의 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 500, 적어도 1000, 적어도 2500, 또는 적어도 5000 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 상보적인 서열을 포함하고, 상기 제1 측접하는 DNA 서열 및 상기 제2 측접하는 DNA 서열이 외떡잎식물 또는 곡물 식물의 동일한 유전자 좌위에서 또는 근처에서 유전자 서열이고, 그리고 상기 삽입 서열이 제1 상동성 아암과 제2 상동성 아암 사이 위치하고 비-코딩 RNA 분자를 인코딩하는 전사가능한 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 작제물을 포함하는, 재조합 DNA 공여체 템플레이트.
구현예 216. 구현예 215에 있어서, 상기 전사가능한 DNA 서열이 식물-발현성 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 재조합 DNA 공여체 템플레이트.
구현예 217. 구현예 215에 있어서, 상기 비-코딩 RNA 분자가 서열번호: 9, 12, 15, 30 또는 33에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 GA 옥시다제 단백질을 인코딩하는 mRNA 분자의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인 서열을 포함하는, 재조합 DNA 공여체 템플레이트.
구현예 218. 구현예 215에 있어서, 상기 비-코딩 RNA 분자가 서열번호: 86, 90, 94, 97, 101, 104, 108, 112, 116, 118, 121, 125, 129, 133, 또는 136에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 GA 옥시다제 단백질을 인코딩하는 mRNA 분자의 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 또는 적어도 27 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 상보적인 서열을 포함하는, 재조합 DNA 공여체 템플레이트.
구현예 219. 구현예 214의 재조합 DNA 공여체 템플레이트를 포함하는, 조성물.
구현예 220. 구현예 214의 재조합 DNA 공여체 템플레이트를 포함하는, 박테리아 또는 숙주세포.
구현예 221. 구현예 214의 재조합 DNA 공여체 템플레이트의 삽입 서열을 포함하는, 이식유전자성 옥수수 또는 곡물 식물, 식물 일부 또는 식물 세포.
구현예 222. 구현예 214에 있어서, 상기 이식유전자성 식물이 대조군 식물에 비하여 하기 특성 중 하나 이상을 갖는, 이식유전자성 옥수수 또는 곡물 식물: 더 짧은 식물 높이, 증가된 자루/줄기 직경, 향상된 도복 저항성, 더 깊은 뿌리, 증가된 잎 면적, 더 이른 캐노피 폐쇄, 더 높은 기공 유통성, 더 낮은 이삭 높이, 증가된 잎 수분 함량, 향상된 가뭄 내성, 향상된 질소 사용 효율, 정상 또는 질소 또는 물 제한 스트레스 상태 하에서 감소된 안토시아닌 함량 및 면적, 증가된 이삭 중량, 증가된 수확 지수, 증가된 수확량, 증가된 종자 수, 증가된 종자 중량, 및/또는 증가된 다작성.
구현예 223. 구현예 222에 있어서, 상기 이식유전자성 식물이 더 짧은 식물 높이 및/또는 향상된 도복 저항성을 갖는, 이식유전자성 옥수수 또는 곡물 식물.
구현예 224. 구현예 222에 있어서, 상기 이식유전자성 식물의 높이가 대조군 식물보다 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 또는 적어도 40% 더 짧은, 이식유전자성 옥수수 또는 곡물 식물.
구현예 225. 구현예 222에 있어서, 상기 이식유전자성 식물의 줄기 또는 자루의 적어도 하나의 마디간 조직에서 하나 이상의 활성 GAs의 수준이 대조군 식물의 동일한 마디간 조직보다 더 낮은, 이식유전자성 옥수수 또는 곡물 식물.
구현예 226. 하기 단계를 포함하는, 이식유전자성 옥수수 또는 곡물 식물의 생산 방법으로서: (a) 외식편의 적어도 하나의 세포를 구현예 215의 상기 재조합 DNA 공여체 템플레이트로 형질전환시키는 단계, 및 (b) 상기 형질전환된 외식편으로부터 상기 이식유전자성 옥수수 또는 곡물 식물을 재생 또는 발생시키는 단계, 상기 이식유전자성 옥수수 또는 곡물 식물이 재조합 DNA 공여체 템플레이트의 삽입 서열을 포함하는, 방법.
구현예 227. 구현예 226에 있어서, 상기 외떡잎식물 또는 곡물 식물이 아그로박테리움 매개된 형질전환 또는 입자 폭격을 통해 형질전환되는, 방법.
구현예 228. 하기 단계를 포함하는, 내인성 GA 옥시다제 유전자에서 또는 근처에서 게놈 편집을 갖는 옥수수 또는 곡물 식물의 생산 방법: (a) 부위-특이적 뉴클레아제를 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 재조합 DNA 분자 또는 부위-특이적 뉴클레아제를 옥수수 또는 곡물 식물의 외식편의 적어도 하나의 세포에 도입하는 단계, 여기서 상기 부위-특이적 뉴클레아제는 내인성 GA 옥시다제 유전자의 유전자 좌위에서 또는 근처에서 표적 부위에 결합하고 상기 표적 부위에 이중-가닥 절단 또는 닉을 야기시킴, 및 (b) 편집된 옥수수 또는 곡물 식물의 내인성 GA 옥시다제 유전자에서 또는 근처에서 게놈 편집을 포함하는 적어도 하나의 외식편 세포로부터 편집된 옥수수 또는 곡물 식물을 재생 또는 발생시키는 단계.
구현예 229. 구현예 228에 있어서, 상기 도입 단계 (a)가 추가로 적어도 하나의 상동성 서열 또는 상동성 아암을 포함하는 DNA 공여체 템플레이트의 도입을 포함하고, 상기 적어도 하나의 상동성 서열 또는 상동성 아암이 표적 DNA 서열의 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 500, 적어도 1000, 적어도 2500, 또는 적어도 5000 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 상보적이고, 상기 표적 DNA 서열이 옥수수 또는 곡물 식물의 내인성 GA 옥시다제 유전자의 유전자 좌위에서 또는 근처에서 유전자 서열인, 방법.
구현예 230. 구현예 228에 있어서, 하기 단계를 추가로 포함하는, 방법: (c) 편집된 옥수수 또는 곡물 식물을 선택하는 단계.
구현예 231. 구현예 230에 있어서, 상기 선택 단계 (c)가 분자 검정을 사용하여 내인성 GA 옥시다제 유전자 좌위가 편집되었는지를 결정하는 것을 포함하는, 방법.
구현예 232. 구현예 230에 있어서, 상기 선택 단계 (c)가 식물 표현형 관찰에 의해 내인성 GA 옥시다제 유전자가 편집되었는지를 결정하는 것을 포함하는, 방법.
구현예 233. 구현예 231에 있어서, 상기 식물 표현형이 대조군 식물에 비하여 식물 높이에서 감소인, 방법.
구현예 234. 구현예 228에 있어서, 상기 도입 단계 (a)가 내인성 GA 옥시다제 유전자의 유전자 좌위에서 또는 근처에서 적어도 하나의 돌연변이를 창출하고, 상기 돌연변이가 대조군 식물의 게놈 DNA 서열에 비하여 하나 이상의 뉴클레오타이드의 치환, 결실, 삽입, 또는 역전을 포함하는, 방법.
구현예 235. 2000 mm 미만, 1950 mm 미만, 1900 mm 미만, 1850 mm 미만, 1800 mm 미만, 1750 mm 미만, 1700 mm 미만, 1650 mm 미만, 1600 mm 미만, 1550 mm 미만, 1500 mm 미만, 1450 mm 미만, 1400 mm 미만, 1350 mm 미만, 1300 mm 미만, 1250 mm 미만, 1200 mm 미만, 1150 mm 미만, 1100 mm 미만, 1050 mm 미만, 또는 1000 mm 미만의 식물 높이, 그리고 어느 하나의 (i) 18 mm 초과, 18.5 mm 초과, 19 mm 초과, 19.5 mm 초과, 20 mm 초과, 20.5 mm 초과, 21 mm 초과, 21.5 mm 초과, 또는 22 mm 초과의 평균 줄기 또는 자루 직경, (ii) 야생형 대조군 식물에 비하여 향상된 도복 저항성, 또는 (iii) 야생형 대조군 식물에 비하여 향상된 가뭄 내성을 갖는, 변형된 옥수수 식물.
구현예 236. 구현예 235에 있어서, 상기 옥수수 식물이 야생형 대조군 식물에 비하여 하기 특성 중 하나 이상을 갖는, 변형된 옥수수 식물: 증가된 자루/줄기 직경, 향상된 도복 저항성, 더 깊은 뿌리, 증가된 잎 면적, 더 이른 캐노피 폐쇄, 더 높은 기공 유통성, 더 낮은 이삭 높이, 증가된 잎 수분 함량, 향상된 가뭄 내성, 향상된 질소 사용 효율, 정상 또는 질소 또는 물 제한 스트레스 상태 하에서 감소된 안토시아닌 함량 및 면적, 증가된 이삭 중량, 증가된 수확 지수, 증가된 수확량, 증가된 종자 수, 증가된 종자 중량, 및/또는 증가된 다작성.
구현예 237. 구현예 235에 있어서, 상기 옥수수 식물의 줄기 또는 자루의 적어도 하나의 마디간 조직에서 하나 이상의 활성 GAs의 수준이 야생형 대조군 식물의 동일한 마디간 조직보다 더 낮은, 변형된 옥수수 식물.
구현예 238. 야생형 대조군 식물에 비하여 감소된 식물 높이, 및 (i) 야생형 대조군 식물에 비하여 증가된 줄기 또는 자루 직경, (ii) 야생형 대조군 식물에 비하여 향상된 도복 저항성, 또는 (iii) 야생형 대조군 식물에 비하여 향상된 가뭄 내성을 갖는, 변형된 곡물 식물.
구현예 239. 구현예 238에 있어서, 상기 곡물 식물의 줄기 또는 자루에서 하나 이상의 활성 GAs의 수준이 야생형 대조군 식물보다 더 낮은, 변형된 곡물 식물.
실시예
실시예 1. GA20 옥시다제 억제 요소에 대한 형질전환 사건에 걸쳐 근친교배 옥수수 계통에서 감소된 식물 높이.
근친교배 옥수수 식물 계통은 식물의 관속 조직에서 발현을 야기시킨다고 공지되는 쌀 퉁그로 바실리폼 바이러스 (RTBV) 프로모터 (서열번호: 65)의 제어 하에서 miRNA의 표적화 서열 (서열번호: 40)을 인코딩하는 서열 (서열번호: 39)와 전사가능한 DNA 서열을 포함하는 발현 작제물을 갖는 형질전환 벡터로 아그로박테리움 매개된 형질전환을 통해 형질전환되었다. 작제물에 의해 인코딩된 miRNA는 억제용 옥수수 식물에서 GA20 옥시다제_3 및 GA20 옥시다제_5 유전자를 표적화하는 RNA 서열을 포함한다. 몇 개의 형질전환 사건은 이 작제물로 생성되었고, 이들 형질전환체는 이들이 비-이식유전자성 야생형 대조군 식물에 비하여 감소된 식물 높이를 가졌는지를 결정하기 위해 온실에서 시험되었다. 도 1에서 볼 수 있듯이, 식물 높이에서 상당한 감소는 야생형 (WT) 대조군 식물에 비하여 몇 개의 형질전환 사건 (참고 사건 1-8)을 거쳐 억제 작제물을 발현시키는 이식유전자성 식물에서 일관되게 관측되었다. 각각의 형질전환 사건에 대한 식물 높이는 각각의 사건에 대하여 대략 10 식물 중에서 평균으로서 계산되었고 대조군 식물에 대하여 평균 높이로서 비교되었다. 표준 오차는, 도 1에서 오차 막대로서 표시되는, 각각의 사건 및 대조군 식물에 대하여 계산되었다. 게다가, 각각의 이들 형질전환체에서 이삭 발생은 정상처럼 보였다.
이 실험의 결과로부터 알 수 있듯이, 억제용 GA20 옥시다제_3 및 GA20 옥시다제_5 유전자를 표적화하는 miRNA를 발현시키는 식물에서 평균 식물 높이는 다중 사건을 거쳐 대조군 식물에 비하여 최대 35%의 일관되게 감소된 식물 높이를 가졌다. 이 데이터는 이 억제 작제물로 보여진 효과가 식물 게놈 이내 임의의 하나의 유전자좌에서 작제물의 삽입에 기인되지 않는다는 결론을 뒷받침한다.
이 데이터는 추가로 RTBV 관속 프로모터를 사용하는 이 GA20 옥시다제 억제 작제물의 발현이 이들 식물 높이 표현형 야기에 효과적인 것을 추가로 나타낸다. 또한, 상이한 항시성 프로모터의 제어 하에서 동일한 GA20 옥시다제 억제 작제물을 구성적으로 발현시키는 R0 옥수수 식물에서 초기 데이터는 또한 단간 식물을 생산한다 (참고 아래 실시예 15). 따라서, 관속 및 구성적 발현을 포함하는 상이한 발현 패턴이 이삭에서 분명한 오프-유형 없이 유사한 식물 높이 표현형을 제공한다는 점을 감안하면 표적화된 GA20 옥시다제 억제 작제물의 발현은 식물 높이의 감소 그리고 본 명세서에서 기재된 다른 유익한 항-도복 및 수확량-관련된 특성의 제공에서 효과적일 수 있다.
실시예 2. GA20 옥시다제 억제 요소를 발현시키는 하이브리드 옥수수 식물에서 감소된 식물 높이.
실시예 1에서 기재된 GA20 옥시다제 억제 작제물을 갖는 하이브리드 옥수수 식물은 또한 야외 조건 하에서 성장된 경우 야생형 대조군 식물에 비하여 감소된 식물 높이를 보여주었다. 10 소시험구에서 GA20 옥시다제 억제 요소를 발현시키는 이식유전자성 하이브리드 옥수수 식물의 평균 식물 높이는 계산되었고 32 소시험구에서 (비-이식유전자성) 야생형 대조군 하이브리드 옥수수 식물의 평균 식물 높이에 비교되었다. 플롯당 식물의 실제 숫자가 이삭을 갖는 식물로 발아 및 발생하는 식물의 숫자에 의존하여 다양할 수 있어도, 이식유전자성 및 비-이식유전자성 대조군에 대한 각각의 소시험구는 대략 6 식물을 포함하였다. 도 2A에서 볼 수 있듯이, 평균 식물 높이에서 상당한 감소는, 야생형 하이브리드 옥수수 식물 (대조군)에 비하여, 억제 작제물 (SUP-GA20ox 하이브리드)를 발현시키는 이식유전자성 하이브리드 식물에서 관측되었다. 표준 오차는, 도 2A에서 오차 막대로서 표시되는, 이식유전자성 하이브리드 및 대조군 식물에 대하여 계산되었다. GA20 옥시다제 억제 요소를 발현시키는 이식유전자성 하이브리드 식물 (우측) 옆에 하이브리드 대조군 식물 (좌측)의 이미지는 도 2B에서 추가로 보여진다.
이 실험에서, GA20 옥시다제_3 및 GA20 옥시다제_5 유전자를 표적화하는 miRNA를 발현시키는 야외 성장된 하이브리드 옥수수 식물의 평균 식물 높이는 야생형 하이브리드 대조군 식물에 비하여 약 40% 만큼 감소되었다. 이 데이터는 식물 높이 표현형이 자식 계통에 더하여 하이브리드 옥수수 식물에서 존재한다는 것을 보여준다. 그러나, 이 실험에서 전체적인 바이오매스는 대조군에 비교하여 반왜성 옥수수 식물에서 중성처럼 보였다.
실시예 3. GA20 옥시다제 억제 요소를 발현시키는 하이브리드 옥수수 식물에서 증가된 줄기 직경.
실시예 1에서 기재된 GA20 옥시다제 억제 작제물을 갖는 하이브리드 옥수수 식물은 또한 야외 조건 하에서 성장된 경우 야생형 대조군 식물에 비하여 증가된 줄기 직경을 보여주었다. 줄기 직경은 1차 이삭 아래 제2 마디간에서 측정되었다. 8 소시험구에서 GA20 옥시다제 억제 요소를 발현시키는 이식유전자성 하이브리드 옥수수 식물의 평균 줄기 직경은 계산되었고 8 소시험구에서 (비-이식유전자성) 야생형 대조군 하이브리드 옥수수 식물의 평균 줄기 직경에 비교되었다. 각각의 소시험구는 대략 6 식물을 포함하였다. 도 3A에서 볼 수 있듯이, 평균 줄기 직경에서 유의미한 증가는, 야생형 하이브리드 옥수수 식물 (대조군)에 비하여, 억제 작제물 (SUP-GA20ox 하이브리드)를 발현시키는 이식유전자성 하이브리드 식물에서 관측되었다. 표준 오차는, 도 3A에서 오차 막대로서 표시되는, 이식유전자성 하이브리드 및 대조군 식물에 대하여 계산되었다. 하이브리드 대조군 식물 (대조군; 좌측)으로부터 자루의 단면의 이미지는 도 3B에서 추가로 보여지는 GA20 옥시다제 억제 요소를 발현시키는 이식유전자성 하이브리드 식물 (SUP_GA20ox; 우측)으로부터 자루의 단면 옆에서 보여진다.
이 실험에서, GA20 옥시다제_3 및 GA20 옥시다제_5 유전자를 표적화하는 miRNA를 발현시키는 야외 성장된 하이브리드 옥수수 식물의 평균 줄기 직경은 야생형 하이브리드 대조군 식물에 비하여 약 13% 증가되었다. 이 데이터는 GA20 옥시다제 miRNA를 발현시키는 하이브리드 옥수수 식물이 감소된 식물 높이 표현형에 더하여 더 두꺼운 줄기를 가질 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 4. GA20 옥시다제 억제 요소를 발현시키는 하이브리드 옥수수 식물이 생 이삭 중량에서 증가를 가졌다.
실시예 1에서 기재된 GA20 옥시다제 억제 작제물을 갖는 하이브리드 옥수수 식물은 또한 야외 조건 하에서 성장된 경우 야생형 대조군 식물에 비하여 생 이삭 중량에서 증가를 보여주었다. 24 소시험구에서 GA20 옥시다제 억제 요소를 발현시키는 이식유전자성 하이브리드 옥수수 식물의 플롯당 평균 생 이삭 중량은 계산되었고 8 소시험구에서 (비-이식유전자성) 하이브리드 옥수수 대조군 식물의 평균 생 이삭 중량에 비교되었다. 재차, 각각의 소시험구는 약 6 식물을 포함하였다. 도 4에서 볼 수 있듯이, 플롯당 평균 생 이삭 중량에서 증가는, 야생형 하이브리드 옥수수 식물 (대조군)에 비하여, 억제 작제물을 발현시키는 이식유전자성 하이브리드 식물 (SUP-GA20ox 하이브리드)에서 관측되었고, 이삭 및 알맹이 발생은 정상처럼 보였다. 이 실험에 대한 표준 편차는, 도 4에서 오차 막대로서 표시되는, 이식유전자성 하이브리드 및 대조군 식물에 대하여 계산되었다. 도 5에서 나타낸 바와 같이, 유사한 결과는 풍해를 또한 경험하였던 또 다른 야외 시험 부지에서 수득되었다.
이 실험에서, GA20 옥시다제_3 및 GA20 옥시다제_5 유전자를 표적화하는 miRNA를 발현시키는 야외 성장된 하이브리드 옥수수 식물의 평균 생 이삭 중량은 야생형 하이브리드 대조군 식물에 비하여 증가되었고, 이들 이식유전자성 식물이 향상된 수확량-관련된 특성을 추가로 가질 수 있다는 것을 나타냈다. 그러나, 이들 결과는 대조군에 대규모 통계적인 비교 없이 관찰적 데이터에 기반되고, 수확량 성능은 넓은 토지 조건 하에서 시험될 수 있다.
실시예 5. GA20 옥시다제 억제 요소를 발현시키는 하이브리드 옥수수 식물은 도복에 대한 증가된 저항을 표시하였다.
야외 시험 위치에서, 사전-개화 하이브리드 옥수수 식물에 대한 풍상은, 야생형 하이브리드 대조군 식물에 비하여, 실시예 1에서 기재된 GA20 옥시다제 억제 작제물을 발현시키는 식물로 증가된 도복 저항성을 실증하였다. 야생형 (비-이식유전자성) 하이브리드 대조군 식물이 이 강풍 사건에 반응하여 시각적으로 도복되었던 한편, 인접하는 야외 위치에서 GA20 옥시다제 억제 요소를 발현시키는 이식유전자성 하이브리드 옥수수 식물은 도복 손상에 저항하였다. GA20 옥시다제 억제 작제물을 발현시키는 하이브리드 옥수수 식물에 의한 도복 저항성의 효과를 평가하기 위해, 도복 손상을 경험하는 2 야외 시험 위치에 걸쳐 이식유전자성 GA20 옥시다제-억제 하이브리드 옥수수 식물의 플롯당 평균 생 이삭 중량은 야생형 하이브리드 대조군 식물의 평균 생 이삭 중량에 비교되었다. 이들 2 시험으로부터 수집된 데이터는 하이브리드 대조군 식물이, GA20 옥시다제 억제 작제물을 발현시키는 하이브리드 식물에 비하여, 각각 2 시험에서, 약 57% 및 81%만큼 감소되었던 평균 생 이삭 중량을 가졌다는 것을 나타냈다.
이식유전자성 GA20 옥시다제-억제 하이브리드 옥수수 식물이 비-이식유전자성 대조군 식물보다 증가된 도복 저항성을 가졌다는 시각적 관찰은, 이식유전자성 GA20 옥시다제-억제 식물로 이들 시험에서 평균 생 이삭 중량에서 증가와 함께, 증가된 도복 저항성이 평균 생 이삭 중량에서 증가로 해석할 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서, GA20 옥시다제-억제 식물에서 증가된 도복 저항성은 악천후 사건 동안 도복의 효과를 저항함으로써 이들 이식유전자성 옥수수 식물의 수확량 잠재력/안정성을 추가로 증가시킬 수 있다.
실시예 6. GA20 옥시다제 억제 요소를 발현시키는 하이브리드 옥수수 식물은 수확 지수에서 증가를 가졌다.
실시예 1에서 기재된 GA20 옥시다제 억제 작제물을 갖는 하이브리드 옥수수 식물은 추가로 야외 조건 하에서 성장된 경우 야생형 대조군 식물에 비하여 수확 지수에서 증가를 보여주었다. GA20 옥시다제 억제 요소를 발현시키는 이식유전자성 하이브리드 옥수수 식물의 수확 지수는 8 소시험구에서 성장된 식물로부터 결정되었고 비-이식유전자성 하이브리드 옥수수 대조군 식물에 비교되었다. 각각의 소시험구는 대략 6 식물을 포함하였다. 도 6에서 볼 수 있듯이, 수확 지수에서 유의미한 증가는, 야생형 하이브리드 옥수수 식물 (대조군)에 비하여, 억제 작제물을 발현시키는 이식유전자성 하이브리드 식물 (SUP-GA20ox 하이브리드)에서 관측되었다. 표준 오차는, 도 6에서 오차 막대로서 표시되는, 이식유전자성 하이브리드 및 대조군 식물에 대하여 계산되었다.
이 실험에서, GA20 옥시다제_3 및 GA20 옥시다제_5 유전자를 표적화하는 miRNA를 발현시키는 야외 성장된 하이브리드 옥수수 식물의 수확 지수는 야생형 하이브리드 대조군 식물에 비하여 약 11% 증가되었다. 수확 지수에서 이 증가는 추가로 야생형 대조군 식물에 비교된 경우 마초 중량에서 감소와 관련되었지만, 총 건성 바이오매스 중량에서 차이는 이식유전자성 식물에서 관측되지 않았다.
실시예 7. GA20 옥시다제 억제 요소를 발현시키는 하이브리드 옥수수 식물은 평균 곡물 수확량 추정치에서 증가를 가졌다.
(실시예 1에서 확인된) GA20 옥시다제 억제 요소를 발현시키는 하이브리드 옥수수 식물에 대한 평균 곡물 수확량 추정치는 (플롯당 대략 6 식물로) 야외에서 16 소시험구로부터 계산되었다. GA20 옥시다제를 억제하는 이들 이식유전자성 하이브리드 옥수수 식물에 대한 계산된 평균 곡물 수확량 추정치는 옥수수 하이브리드 대조군 식물보다 약 15% 만큼 증가되었다 (도 7). 곡물 수확량 추정치는 이삭 특성 메트릭스에 기반하여 기대된 수확량의 일반적인 추정치를 제공하는 측정기준이다. 곡물 수확량 추정치는 작은 플롯에서 손으로 수확된 이삭으로부터 유래되고, 단위는 (bu/ac 대신에) kg/ha이다. 곡물 수확량 추정치 (kg/ha)는 식 (단위 면적당 알맹이 수 (알맹이/m2) x 단일 알맹이 중량 (mg) x 15.5 % / 100)에 의해 계산된다.
실시예 8. GA20 옥시다제 억제 요소를 발현시키는 하이브리드 옥수수 식물은 평균 다작성 스코어에서 증가를 가졌다.
(실시예 1에서 확인된) GA20 옥시다제 억제 요소를 발현시키는 하이브리드 옥수수 식물은 또한 소시험구 실험에서 비-이식유전자성 하이브리드 대조군 식물에 비교된 경우 증가된 다작성 및 2차 이삭을 갖는 것으로 보여졌다. 다작성 스코어는 (플롯당 대략 6 식물로) 야외에서 이식유전자성 하이브리드 옥수수 식물의 10 소시험구로부터 결정되었다. 도 8에서 나타낸 바와 같이, GA 20 옥시다제를 발현시키는 이식유전자성 하이브리드 옥수수 식물의 평균 다작성 스코어는 3이었고, 반면에 대조군 식물의 평균 다작성 스코어는 1이었다. 다작성 스코어를 결정하기 위해, 식물은 발생의 R1 단계에서 2차 이삭의 발생에 대하여 분석되었다. 식물은 하기 척도로 등급화되었다: 1 = 거의 없는 2차 이삭 형성; 2 = 실크가 2차 이삭에서 두드러짐; 3 = 이삭 잎 외피로부터 부각된 발생되는 2차 이삭; 및 4 = 1차 이삭에 유사한 양호한 2차 이삭 발생. 적어도 일부 2차 이삭을 추가로 나타낸 시즌 말기 수확은 정상적으로 발생된 알맹이로 생산적이었다.
실시예 9. GA20 옥시다제 억제 작제물로 형질전환된 하이브리드 옥수수 식물이 있는 야외에서 넓은-토지 수확량 및 특성 시험.
실시예 1에서 기재된 GA20 옥시다제 억제 작제물은 자성 상업적 옥수수 자식 계통으로 형질전환되었고, 수많은 형질전환 사건은 창출되었다. 형질전환된 식물은 성장 및 자기-교배되어 충분한 종자를 크게 만들었고, 그 다음 다양한 웅성 상업적 옥수수 자식 계통으로 교배되어 하이브리드 옥수수 식물을 생산하였다. 웅성-자성 하이브리드를 생산하는데 사용된 각각의 구별되는 웅성 자식 계통은 테스터로 불린다. 상이한 테스터를 가진 하이브리드 옥수수 식물은 그 다음 표준 작물학적 실시 (SAP)에 따라 야외의 넓은 토지에서 성장되었다. SAP용 식재 밀도는 30" 줄 간격을 가진 34,000 식물/에이커이었다.
야외 시험을 위하여, GA20 옥시다제 억제 작제물을 발현시키는 4개의 상이한 형질전환 사건은 2 상이한 상업적 테스터 계열에 교배되었다. 하이브리드 옥수수 식물은 그 다음 6 미국 중서부 주에 걸쳐 16 지리학적 위치에서 시험되었다. 이들 위치에 걸쳐 이식유전자성 하이브리드 옥수수 식물의 수확량은 계산되었고 비-이식유전자성 하이브리드 옥수수 대조군 식물의 수확량에 비교되었다. 표 4는 비-이식유전자성 대조군에 비교된 경우 각각의 사건에 대한 이식유전자성 하이브리드 옥수수 식물 사이 부셸/에이커로 수확량 차이를 제공한다. 음수는 수확량 감소를 나타낸다. 0.2 미만의 통계적인 p-값으로 수확량 차이는 볼드체 및 이탤릭체 폰트로 표 4에서 표시된다. 이 표기법은, 달리 지적되지 않는 한, 이들 실시예에서 잔여 표에 대하여 통계적 유의도를 나타내는데 또한 사용된다. SAP 제목 하에서 표 4에서 나타낸 바와 같이, 수확량에서 유의미한 증가는, 야생형 하이브리드 옥수수 식물 (대조군)에 비하여, SAP 조건 하에서 억제 작제물을 발현시키는 이식유전자성 하이브리드 옥수수 식물 (이식유전자성 식물)에서 관측되었다. 수확량에서 유의미한 증가는 4 이식유전자성 사건, 및 2 테스터 계열에 걸쳐 관측되었다.
비교할만한 넓은-토지 수확량 시험은 42,000 식물/에이커 및 30" 줄 간격으로 고밀도 (HD) 식재 조건 하에서 수행되었고, 표준 작물학적 실시 (SAP) 밀도에 비교되었다. HD 조건 하에서 수확량에서 차이는 HD 제목 하에서 표 4에서 제공된다. 혼합된 결과는 사건 및 테스터에 걸쳐 다양한 수확량으로 이들 고밀도 조건 하에서 수득되었다. 그러나, 수확량에서 증가는 2개의 테스터 중 하나로 2 사건에 대하여 관측되었고, 상이한 고밀도 조건 하에서 생식질의 더 큰 수에 걸쳐 고수율에 대한 가능성은 남아있다.
특성 시험은 야외에서 수많은 발달성 및 생식 특성을 측정하기 위해 또한 수행되었다. 이들 시험은 상기에 기재된 바와 같이 정상 밀도 (SAP) 그리고 20" 줄 간격으로 54,000 식물/에이커의 초고밀도 (UHD) 식재 조건 하에서 수행되었다. 시험은 하이브리드 옥수수 식물에서 7 형질전환 사건 및 3 테스터로 수행되었고, 각각의 테스터에 대한 데이터는 7 사건에 대해 풀링되었다.
표 5는 하이브리드 옥수수 식물에서 특성 시험 결과를 요약한다. 측정은, 이식유전자성 식물과 대조군 사이, 어느 한쪽 퍼센트 차이, 또는 일 또는 잎의 수 차이이다. 적절한 경우, 측정이 실시되었던 발생 단계, 예컨대 R3, 등은 칼럼 "특성 명칭" 밑에서 괄호로 표시된다. 꽃가루 방출은 발아부터 식물 방출 꽃가루의 50%까지 일수의 관점에서 측정된다. 출사 출현은 발아부터 식물 출사의 50%까지 일수 관점에서 측정된다. 꽃가루-실크 간격은 식물 방출 꽃가루의 50%부터 출사까지 일수의 측정치이다. 자루 강도는, 자루 브레이커 기기를 사용하여, 자루 분절이 측면으로 절단하는 힘의 양의 측정치이다. 잎 면적 지수 (LAI)는, 활엽 캐노피 공간 이내 단위 지표면 면적당 한쪽 생엽 면적으로서 정의된, 식물의 캐노피의 한도를 특성규명하는 무차원 양이다.
표 5에서 나타낸 바와 같이, 식물 높이, 이삭 높이, 및 마디간 길이에서 상당한 감소는 대조군에 비하여 이식유전자성 식물에서 관측되었다. 이식유전자성 식물은 6 피트 미만 식물 높이, 및 18 인치 초과 이삭 높이를 일관되게 나타내어, 기계장치에 변형 없이 컴바인에 의한 수확을 허용하였다. 이 실험에서, 증가된 자루 직경은 특히 더 높은 밀도 식재 조건 하에서 관측되었다.
표 6은 하이브리드 옥수수에 대하여 이삭 특성 시험 결과를 요약한다. 시험은 하이브리드 옥수수 식물에서 7 형질전환 사건 및 3 테스터로 수행되었고, 각각의 테스터용 데이터는 7 사건에 대해 풀링되었다. 측정은 이식유전자성 식물과 대조군 사이 퍼센트 델타 차이이다. 적절한 경우, 측정이 실시되었던 발생 단계, 예컨대 R3, 등은 칼럼 "특성 명칭" 밑에서 괄호로 표시된다. 이삭 면적은, 알맹이 및 공동을 포함하는, 이삭의 이미지형성에 의해 실시된 2차원 시계로부터 면적의 관점에서 이삭의 플롯 평균 크기의 측정치이다. 이삭 직경은 그것의 가장 넓은 부문에 대해 이삭의 최대 "넓은" 축으로서 측정된 이삭 직경의 플롯 평균의 측정치이다. 이삭 길이는 직선으로 이삭의 정점부터 이삭 마디의 기저부까지 측정된 이삭의 길이의 플롯 평균의 측정치이다. 이삭 정점 공동_pct는, 알맹이 및 공동을 포함하는, 이삭의 이미지형성에 의해 실시된 2-차원 시계로부터, 이삭의 최상부 30% 면적에서 공동의 면적 백분율의 플롯 평균의 측정치이다. 2-차원 시계로부터, 이삭에서 공동의 면적 백분율의 플롯 평균으로 이삭 공동 측정치는, 알맹이 및 공동을 포함하는, 이삭의 이미지형성에 의해 측정된다. 곡물 수확량 추정치는 실시예 7에서 정의된다. 단위 면적당 알맹이는 야외의 단위 면적당 알맹이의 수의 플롯 평균으로서 측정된다. 이삭은 세트 줄 길이, 전형적으로 1 미터로부터 수집되었고, 벗겨졌고 조합되어 알맹이를 계수하였고, 계수는 그 다음 야외의 단위 면적당 총 알맹이로 전환되었다. 단일 알맹이 중량은 알맹이당 중량의 플롯 평균을 측정한다. (15.5% 수분으로 조정된 샘플 알맹이 중량) / (샘플 알맹이 수)의 비로서 계산된다. 이삭당 알맹이는 이삭당 알맹이의 수의 플롯 평균의 측정치이다. (총 알맹이 중량 / (단일 알맹이 중량 * 총 이삭 계수)로서 계산되고, 여기에서 총 알맹이 중량 및 총 이삭 계수는 0.19 내지 10 제곱 미터 사이 면적에 대해 이삭 샘플로부터 측정된다.
표 6에서 나타낸 바와 같이, 대조군에 비교된 경우 이식유전자성 식물에 대한 이들 실험에서 관측된 이삭 면적 및 이삭 길이에서 유의미한 증가가 있었다. 이삭 직경에서 현저한 감소가 또한 있었다. 이 실험에서, 곡물 수확량 추정치는 이식유전자성 식물과 대조군 사이 대부분 중성이었다.
추가의 데이터는, 대조군에 비교된 경우, 식물 높이, 이삭 높이, 및 마디간 길이에서 감소, 그리고 줄기 직경 및 수확 지수에서 증가를 보여주는 하나의 테스터에 교배된 8 사건에 걸쳐 표준 밀도로 야외에서 수집되었다 (데이터 도시되지 않음). 식물 높이는 지면에서 최상위 설상화된 잎까지 R3 단계에서 측정되었다. 이삭 높이는 지면부터 이삭 마디까지 R3 단계에서 측정되었다. 자루 직경은, 달리 나타내지 않는 한, 이삭 아래 자루 마디간 2 마디의 중간에서 측정되었다. 이들 데이터는, 다작성 (또는 2차 이삭의 수)에서 증가가 이들 연구에서 유의미하거나 확연하지 않았어도, 사건에 걸쳐 식물 높이의 높은 침투 및 자루 특성을 실증하였다.
별개의 실험에서, 식물 높이 성장은 V11 내지 R1 단계 및 초과하여 측정되었다. 도 9는 이 기간에 대해 이식유전자성 식물과 대조군 사이 식물 높이에서 차이를 보여준다. 참고로 5-피트 및 6-피트 높이용 점선이 도에서 작도된다.
실시예 10. 이식유전자성 식물은 제어된 환경 조건에서 질소 및 물 스트레스 상태 하에서 증진된 특성을 나타냈다.
본 실시예는, 지시된 바와 같이 자동화 온실 (AGH) 또는 야외에서, 대조군에 대해 실시예 1에서 기재된 GA20 옥시다제 억제 작제물을 갖는 이식유전자성 옥수수 식물의 증진된 물 및 질소 스트레스 반응을 설명한다. AGH에서 식물의 자동화 표현형 검정용 장치 및 방법은, 예를 들어, 미국 특허 공보 번호 2011/0135161에서 개시되고, 이는 본 명세서에 참고로 전체적으로 편입된다.
AGH 셋팅에서, 옥수수 식물은 비-스트레스, 약한 및 중간 정도 질소 결손, 그리고 약한 및 중간 정도 물 결손 스트레스 상태를 포함하는 5개의 상이한 상태 하에서 시험되었다. 옥수수 식물은 표 7에서 보여진 스트레스-특이적 조건 하에서 성장되었다.
물 결손은 비-스트레스 받은 식물의 VWC보다 더 낮은 비 용적 수분 함량 (VWC)로서 정의된다. 예를 들어, 비-스트레스 받은 식물은 50% VWC에서 유지될 수 있고, 수-결손 검정용 VWC는 35% 내지 40% VWC로 정의될 수 있다. 데이터는 1일 기준으로 개별 식물에 적용된 물 및 영양소의 양 그리고 포트 중량의 직접적인 측정 뿐만 아니라 가시광 및 하이퍼스펙트럼 이미지형성을 사용하여 수집되었다. 질소 결손은 비-스트레스 받은 식물의 질소 농도보다 더 낮은 질소의 특정 mM 농도로서 (부분적으로) 정의된다. 예를 들어, 비-스트레스 받은 식물은 8 mM 질소로 유지될 수 있고, 반면에 질소-결손 검정에 적용된 질소 농도는 4 내지 6 mM 농도로 유지될 수 있다.
최대 10 파라미터는 각각의 스크린에 대하여 측정되었다. 가시광 컬러 이미지형성 기반 측정은 하기이다: 식물 높이, 바이오매스, 및 캐노피 면적. 식물 높이 (PlntH)는 포트의 최상부부터 측면 이미지부터 유래된 식물의 가장높은 지점까지 거리 (mm)를 지칭한다. 바이오매스 (Bmass)는 다중 시야각으로부터 획득된 이미지로부터 수득된 식물의 추정된 새싹 생 중량 (g)로서 정의된다. 캐노피 면적 (Cnop)는 하향식 이미지에서 나타낸 바와 같이 잎 면적 (mm2)로서 정의된다. 안토시아닌 스코어 및 면적, 클로로필 스코어 및 농도, 그리고 수분 함량 스코어는 하이퍼스펙트럼 이미지형성으로 측정되었다. 안토시아닌 스코어 (AntS)는 하향식 하이퍼스펙트럼 이미지로부터 수득된 잎 캐노피에서 안토시아닌의 추정치이다. 안토시아닌 면적 (AntA)는 측면도 하이퍼스펙트럼 이미지로부터 수득된 줄기에서 안토시아닌의 추정치이다. 클로로필 스코어 (ClrpS) 및 클로로필 농도 (ClrpC) 둘 모두는 하향식 하이퍼스펙트럼 이미지로부터 수득된 잎 캐노피에서 클로로필의 측정치이고, 여기에서 클로로필 스코어는 상대 단위로 측정하고, 클로로필 농도는 백만분율 (ppm) 단위로 측정된다. 잎 수분 함량 (FlrWtrCt)는 하향식 하이퍼스펙트럼 이미지로부터 수득된 잎 캐노피에서 물의 측정치이다. 물 사용 효율 (WUE)는 첨가된 물의 리터당 식물 바이오매스의 그램으로부터 유래된다. 적용된 물 (WtrAp)는 실험의 과정 동안 포트 (홀이 없는 포트)에 첨가된 물의 직접적인 측정치이다. 이들 생리적 시험은 시험된 이식유전자성 식물이 대조군에 비교되도록 셋팅되었다. 2개의 형질전환 사건의 이식유전자성 식물은 대조군과 비교하여 측정되었다. 모든 데이터는 대조군에 관하여 이식유전자성 식물의 퍼센트 델타 차이이다. 통계적인 p-값 <0.1을 가진 데이터 포인트는 굵은 이탤릭체 폰트로 보여졌다. 다른 데이터 포인트는 p-값 >0.1을 갖는다.
대조군 식물에 비하여 실시예 1에서 기재된 GA20 옥시다제 억제 작제물의 2 사건 중 하나를 갖는 이식유전자성 식물에서, 표 8은 영양 단계에서 식재로부터 21 일에 측정된 경우 AGH 특성 시험 결과를 요약하고, 반면에 표 9는 생식 단계에서 식재로부터 55 일에 측정된 경우 AGH 특성 시험 결과를 요약한다.
표 8에서 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교하여, 이식유전자성 식물은 스트레스 저항에 관련된 일부 증진된 특성 그리고 스트레스 상태 하에서 유지된 다른 양성 특성을 나타냈다. 식물 높이는 모든 처리에 걸쳐 상당히 감소하였고 스트레스 상태에 의해 영향받지 않았다. 바이오매스 및 캐노피 면적은 무-스트레스 상태에서 중성이었지만 더욱 중증 스트레스 상태에서 증가되었다. 잎 수분 함량은 무-스트레스 및 스트레스 상태에서 상당히 증가하였고, 이식유전자성 식물이 잎 조직에서 더 많은 물을 유지하였다는 것을 나타냈다. 안토시아닌 면적은 무-스트레스 및 스트레스 상태에서 상당히 감소하였고, 이식유전자성 식물에서 질소 결핍이 없었다는 것을 나타냈다.
표 9에서 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교하여, 이식유전자성 식물은 적용된 물, WUE, 바이오매스 및 마초 중량의 특성 면적에서 상당한 감소를 나타내어, 이식유전자성 식물이, 더 적은 물을 요구하는 더 낮은 바이오매스의 식물로, 향상된 물 사용 효율을 가졌다는 것을 나타냈다. 수확 지수는 비-스트레스 및 스트레스 상태 하에서 상당히 증가하였다.
실시예 11. 이식유전자성 식물은 야외에서 양쪽 표준 및 고 밀도로 생식 단계에서 증가된 가뭄 내성, 기공 유통성, 및 뿌리 전선 속도를 나타냈다.
직접적인 관찰은 대조군 식물에 비교된 야외에서 가뭄 조건 하에서 실시예 1로부터 GA20 옥시다제 억제 작제물을 갖는 이식유전자성 옥수수 식물에서 감소된 잎 말림으로 실시되었다. 옥수수 잎 말림은 잎 물 잠재력이 대략 -1.1 MPa의 역치 아래로 떨어지는 경우 발생한다. 기공 유통성은 또한 물 스트레스 하에서 감소한다. 안정한 산소 동위원소 비 (δ18O)는, 기공 유통성에 역으로 비례하는, 기공 유통성의 지수로서 사용되었다. 대조군에 대해 이식유전자성 식물에서, δ18O의 상당한 감소, 및 따라서 기공 유통성에서 유의미한 증가는 R5 단계에서 수집된 이삭 잎 샘플로부터 관측되었다 (참고 도 10). 데이터는 2 형질전환 사건에 걸쳐 이식유전자성 식물로부터 취득되었고 테스터당 2 레프를 가진 10 테스터에 걸쳐 평균되었다. 대조군 식물의 잎에서 증가된 δ18O는 기공 유통성이 대조군에 대하여 더 낮았다는 것을 나타낸다. 야외에서 관측된 감소된 잎 말림과 공조하여, 16 야외 위치 중 15곳에서 야외 시험으로부터 이식유전자성 식물의 잎에서 기공 유통성의 유의미한 증가는 이식유전자성 식물에 대하여 후기 영양 성장 동안 향상된 잎 물 상태를 나타낸다.
뿌리에 의한 효과적인 수분 흡수는 식물 성장에서 중요한 인자이다. 뿌리화 깊이의 발달성 과정을 측정하기 위해, Sentek® SOLO 토양 수분 수용력 프로브는 하나의 야외 위치에서 식물 사이 줄 이내 V4 단계에서 설치되었다. 토양 수분은 지면 수준으로부터 10, 20, 30, 50, 70, 90, 120, 및 150 cm의 깊이에서 수용력 센서로 매시간 기준으로 측정되었다. 뿌리화 전선의 깊이는 센서에 의해 기록된 토양 수분 고갈에서 매일 패턴의 존재에 의해 추론되었다. 뿌리 활성은 V4 단계에서 설치의 시간에 10, 20, 및 30 cm 깊이에서 이미 존재하였다. 우리는 50, 70, 및 90 cm 깊이에서 토양 수분 고갈의 제1 발생을 검출하였다. 120 및 150 cam 깊이에서 토양은 성장 시즌 내내 포화되었다. 뿌리 성장이 이들 깊이에 도달할 수 있는 반면에, 우리는 포화된 구역에서 토양 수분 고갈을 검출하는 무능으로 인해 이 실험에 대하여 이들 깊이에서 뿌리 활성을 검출할 수 없었다. 도 11은 Y 축에서 다양한 깊이에 도달하기 위해 식물의 정면 뿌리에 대한 시간 (식재 후 일)을 보여준다. 원을 가진 선은 30-인치 줄 간격 및 34,000 식물/에이커 식재 밀도에서 식물에 대한 것이고, 정사각형을 가진 선은 20-인치 줄 간격, 및 55,000 식물/에이커 식재 밀도에서 식물에 대한 것이다. 성장 단계는 X 축에서 보여진다.
도 11에서 나타낸 바와 같이, 뿌리 성장은 이 실험에서 이식유전자성과 대조군 식물 사이 최대 V12 유사하였고, 뿌리는 식재 후 약 30 및 36 일에서 50 및 70 cm 깊이에, 각각 도달하였다. 그러나, 이식유전자성 식물 뿌리는 R1에서 또는 그 이전 (즉, 식재 후 약 50 일째), 또는 대조군 식물보다 약 20 일 더 일찍 90 cm 깊이에 도달하였다. 이식유전자성 식물은 V11/V12 단계 후 증가된 뿌리화 전선 속도를 나타냈고, 이는 식물 발생의 임계 기간 대략 개화 동안 증가된 가뭄 회피로 이어질 수 있다. 뿌리화 전선 속도에서 이 증가는 임계 기간 대략 R1 단계 동안 토양 수의 더 깊은 비축을 이식유전자성 식물이 이용할 수 있도록, 가능하게는 개화 및 수분에서 가뭄 효과를 회피, 감소 또는 최소화되도록 할 수 있다. 가뭄 조건 하에서 향상된 수분은 유사하게 알맹이 세트 및 수확량 잠재력을 향상시킬 수 있다.
상기 야외 실험을 수분 센서로 보완하기 위해, 실시예 1로부터 GA20 옥시다제 억제 작제물을 가진 이식유전자성 옥수수 식물 (n = 10)에 대한 뿌리 전선 속도는 뿌리 박스 실험에서 측정되었고 야생형 대조군 식물 (n = 9)에 비교되었다. 플렉시글라스 뿌리 박스 (5 피트 높이 및 단면으로 6 × 8 인치; 1/2 인치 벽 두께)는 #10 야외 토양/질석/펄라이트 (1:1:1 비)의 믹스로 채워졌고 각각의 식물용 뿌리 가시화에 대하여 사용되었다. 각각의 박스에서 최대 뿌리화 깊이는 식재 후 규칙적 간격에서 (대략 2일마다) 측정되었다. 이 실험에서, 이식유전자성 식물의 중앙 뿌리 전선 깊이는 일관되게 식재 후 약 21 일에서 (즉, 약 V4 단계)에서 시작하는 그리고 측정이 중단된 경우 식재 후 적어도 34 일까지 계속하는 WT 대조군 식물보다 더 컸거나 더 깊었다 (데이터 도시되지 않음). 제어된 환경 뿌리 박스에서 이 관찰은, 뿌리 깊이에서 차이가 V11/V12 단계 후까지 야외 실험에서 검출되지 않았어도, 야외에서 수분 센서로 관측된 증가된 뿌리 깊이와 일치하고 더 깊은 뿌리가 더 이른 발달성 단계에서 발생할 수 있다는 것을 보여준다.
아래 실시예 14에서 기재된 제어된 환경 실험에서 측정된 뿌리 특성이 일반적으로 뿌리 깊이에서 유의차 (또는 단지 최소 차이)를 보여주지 않았어도, 실시예 14에서 질석 실험은 뿌리 깊이에서 차이가 이 실시예 11에서 (즉, 대략 V4 단계를 시작하는) 뿌리 박스 실험에서 관측되기 전 V3 단계에서 수행되었고, 실시예 14에서 수기경재배 장치 실험이 V5 단계에서 수행되었어도, 수기경재배 시스템은 정상 (또는 더욱 천연) 뿌리 성장 및 발생에 영향을 줄 (질석 실험과 달리) 임의의 식물-토양 상호작용을 갖지 않는다.
실시예 12. 이식유전자성 식물은 정상 및 가뭄 조건에서 더 높은 기공 유통성을 갖고 가뭄 스트레스 하에서 더 높은 광합성 수용력을 유지한다.
정상 및 가뭄 조건 하에서 잎내 기공 유통성 및 광합성 수준은 온실에서 또한 측정되었다. 이 실험을 위하여, 실시예 1로부터 GA20 옥시다제 억제 작제물을 가진 이식유전자성 식물 및 야생형 대조군 식물은 풍부 급수된 (1500 ml 물 / 일) 또는 제한된 물 / 만성 가뭄 (1000 ml 물 / 일) 처리를 거치게 되었다. 야생형 대조군 식물의 이십 (20) 레프 그리고 GA20 옥시다제 억제 작제물용 십 (10) 레프 / 이벤트 (총 2 사건)은 풍부 급수된 처리를 거치게 되었고, 야생형 대조군 식물의 백사십 (140) 레프 그리고 GA20 옥시다제 억제 작제물용 칠십 (70) 레프 / 이벤트 (총 2 사건)은 제한된 물 / 만성 가뭄 처리를 거치게 되었다. 적절한 높이의 경계 식물 (WT 식물용 하이브리드 및 이식유전자성 식물용 동계번식체)는 온실에서 실험 식물의 주변 근처에 배치되어 음영화의 효과를 정상화하였다. 매일 기공 유통성 및 광합성 측정은 아침 및 오후에 LI-COR® 디바이스로 V12 단계에서 제조자의 지침에 따라 실시되었다. 도 12A에서 나타낸 바와 같이, 기공 유통성은 매일 시점 둘 모두에서 풍부-급수된 및 가뭄 조건 둘 모두 하에서 이식유전자성 식물에 대하여 일관되게 더 높다는 것으로 밝혀졌다. 이식유전자성 식물은 또한 가뭄 조건 하에서 더 적은 잎 말림을 갖는다고 관측되었다. 도 12B에서 추가로 보여진 바와 같이, 더 높은 광합성 비율은 또한, 특히 가뭄 조건 하에서 오후에 광합성의 비율에서 하락을 보여주었던 대조군 식물과 달리, 오후에 증가된 태양광에 상당히 반응하지 않았던 가뭄 조건에 반응하여 관측되었다.
(상기 별개의 야외 관찰과 조합으로) 이들 결과는 GA20 옥시다제 억제 작제물을 가진 이식유전자성 식물이 잎에서 더 높은 가스 교환 및 광합성을 가졌고 뿐만 아니라, 물 제한 / 만성 가뭄 조건에 반응하여 잎에서 더 높은 가스 교환 및 광합성을 유지하였다는 것을 실증한다. 이식유전자성 식물이 대조군 식물보다 더 낮은 잎 온도를 가졌다는 것이 추가로 관측되었다 (데이터 도시되지 않음). 따라서, GA20 옥시다제 억제 작제물을 발현시키는 이식유전자성 식물이 대조군에 비교된 경우 물 제한 조건 하에서 더 큰 가뭄 내성 그리고 광합성을 유지하는 능력을 가질 수 있다는 것이 예상된다. 이론에 의한 구속됨 없이, (특히 후기 영양 및 초기 생식 단계 동안) GA20 옥시다제 억제 작제물을 가진 이식유전자성 식물에 대하여 관측된 더 깊은 뿌리가 이들 이식유전자성 식물의 가뭄 내성에 기여할 수 있다는 것이 추가로 제안된다.
실시예 13. 이식유전자성 식물은 온실 조건에서 대조군의 것에 비교할만한 생식 특성을 나타냈다.
실시예 1에서 기재된 GA20 옥시다제 억제 작제물을 갖는 이식유전자성 옥수수 식물 그리고 대조군 식물은 생식 R1 단계까지 온실에서 포트내 성장되었고, 생식 특성은 V8 및 R1 단계에서 측정되었다. 데이터는 2 형질전환 사건의 이식유전자성 식물에 대하여 취득되었다 (표 10). 데이터는 어느 한쪽으로 일수에서 차이의 관점에서, 또는 퍼센트 차이로서, 야생형 대조군에 비교된 경우 이식유전자성 식물에 대하여 제공되고, 유의미한 변화는 볼드체이다. 특성 명칭은 상기 실시예 9 및 10에서 정의된다. 개화, 미성숙한 이삭, 성숙한 이삭 및 술의 특성 및 특성 부류의 특정 관찰은 표에서 요약된다. 전반적으로, 이식유전자성 식물에서 생식 발생은 단지 몇몇 약간 또는 소수의 변화가 있는 대조군 식물과 거의 동등하였다.
실시예 14. 온실 조건에서 이식유전자성 및 대조군 식물의 뿌리 특성.
실시예 1에서 기재된 GA20 옥시다제 억제 작제물을 갖는 이식유전자성 식물 그리고 대조군 식물은 V3 단계까지 질석 배지내 온실에서 또는 V5 단계까지 수기경재배 장치에서 성장되었다. 식물은 추출되었고 뿌리는 뿌리 특성의 직접 또는 광학 영상 측정을 위하여 세정되었다. 4 형질전환 사건의 이식유전자성 식물은 대조군에 비교하여 시험되었다. 측정 결과는 질석 배지 성장으로부터 식물에 대하여, 또는 수기경재배 성장 장치, 각각에서 표 11 및 12에 요약된다. 뿌리 분지점 수는 식물 뿌리의 이미지형성을 통해 식물의 뿌리 분지 끝 지점의 수를 측정한다. 뿌리 시스템 이미지는 뿌리 길이 측정을 위하여 요약되었다. 최대 40 이미지는 뿌리 수직축 근처 다양한 각에서 찍어졌고 측정은 이미지에 대해 평균되었다. 뿌리 총 길이는, 식물의 뿌리 시스템의 이미지형성을 통해, 뿌리가 한 줄로 모두 늘어세워진 것처럼, 식물의 뿌리의 누적 길이를 측정한다. 뿌리 시스템 이미지는 뿌리 길이 측정에 대하여 요약되었다. 최대 40 이미지는 뿌리 수직축 근처 다양한 각에서 찍어졌고 측정은 이미지에 대해 평균이었다. 표 11 및 12에서 데이터는 볼드체로 나타난 유의미한 변화가 있는 대조군에 비교하여 이식유전자성 식물의 퍼센트 델타 차이이다.
표 11 및 12에서 나타낸 바와 같이, 이식유전자성 식물은 V3 및 V5 단계에서 식물 높이에서의 상당한 감소를 나타냈지만, 전체적인 뿌리 구조에서 단지 소수의 변형은 이식유전자성 및 대조군 식물 사이 이들 실험에서 관측되었다.
실시예 15. 대안적 프로모터를 가진 이식유전자성 식물의 표현형 관찰.
실시예 1 내지 14에서, 이식유전자성 식물은 RTBV 프로모터에 작동가능하게 연결된 GA20 옥시다제 억제 요소를 함유하였다. 옥수수 식물은 또한 다양한 다른 프로모터에 작동가능하게 연결된 동일한 억제 요소로 형질전환되어, GA20 옥시다제 억제 요소의 발현의 상이한 패턴이 얼마나 식물 높이 및 다른 표현형에 영향을 줄 수 있는지를 시험하였다.
다양한 프로모터에 작동가능하게 연결된 작제물로 형질전환된 외식편으로부터 재생된 이식유전자성 식물 (R0 식물)은 온실에서 R5 성장 단계에서 관측되었고, 이삭은 건조를 위하여 역으로 박리된 후 관측되었다. 시험된 다양한 프로모터는 표 13에서 확인된다. 관찰은 GA20 옥시다제 억제 작제물 없이 동일한 교배 계통의 대조군 식물에 비교하여 상이한 프로모터를 함유하는 각각의 작제물용 다중 형질전환 사건의 식물에 대하여 실시되었다. 이들 관찰의 결과는 각각의 작제물용 형질전환 사건에 걸쳐 표 13에서 요약된다.
표 13에서 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교하여, GA20 옥시다제 억제 작제물을 가진 R0 이식유전자성 식물은 시험된 모든 프로모터용 관찰에 의해 임의의 상당한 오프-유형을 나타내지 않았다. 생식 이삭 조직에서 직접적으로 발현조차 임의의 관측가능한 오프-유형을 야기시키지 않았다. 식물 높이는 (이전의 실시예에서) RTBV 프로모터 작제물에 대하여, 뿐만 아니라 다양한 항시성 프로모터, 상이한 발현 수준에서 잎 프로모터, 일부 관속 프로모터, 및 높은 발현 수준을 가진 뿌리 프로모터에 작동가능하게 연결된 동일한 GA20 옥시다제 억제 작제물을 갖는 이식유전자성 식물에 대하여 분명히 감소되었다. GA20 옥시다제 억제 작제물에 연결된 구성적 발현 (C1)을 가진 조작된 프로모터는 시험되었고 또한 단간 표현형을 야기시킨다고 밝혀졌다. 유사하게, GA20 옥시다제 억제 작제물에 연결된 관속 발현 (V1)을 가진 적어도 하나의 조작된 프로모터는, 2개의 다른 조작된 관속 프로모터 (V2, V3), 및 3개의 조작된 줄기 프로모터 (S1, S2, S3)을 가진 식물이 감소된 식물 높이를 갖지 않았어도, 관속 쌀 Cyp2 프로모터에 더하여, 단간 표현형을 야기시킨다고 밝혀졌다. 그러나, RTBV 프로모터의 제어 하에서 GA20 옥시다제 억제 작제물에 대한 전사 종결자 서열 변화는 단간 표현형을 변경시키지 않았다 (표 11에서 도시되지 않음). 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "중간-짧은"은 (RTBV 프로모터로 관측된 식물 높이에서 감소에 비하여) 식물 높이에서 중간 정도 감소를 지칭하고, "일부 짧은"의 관찰은 식물 높이에서 감소의 합계에서의 일부 변형이 있었다는 것을 의미한다.
이들 결과는, 이들 항시성 프로모터로 관측된 식물 높이 표현형에서 일부 가변성이 있었어도, 항시성 프로모터로 GA20 옥시다제 억제 요소의 발현이 단간 표현형을 일관되게 생산하였다는 것을 보여준다. 마찬가지로, 관속부터 구성적까지 발현의 패턴을 형질전환시키기 위한 증진제 요소와 RTBV 프로모터의 조합은 여전히 (RTBV 프로모터의 충분량을 나타내는) 단간 표현형을 생산하였다. RTBV 프로모터를 포함하는 관속 프로모터의 몇몇은 단간 표현형을 생산하였지만, 몇몇의 다른 조작된 관속 프로모터는 단간 표현형을 생산하지 못했고, 이는 이들 프로모터의 더 낮은 발현 수준에 기인될 수 있다. 줄기 프로모터의 어느 것도 단간 표현형을 생산하지 못했고, 줄기에서 GA20 억제 작제물의 발현이 이 표현형을 생산하는데 충분하지 않았다는 것을 나타냈다. 놀랍게도, 잎에서 GA20 억제 작제물의 발현은, 결과가 어느 정도 가변성이었어도, 발현의 상이한 수준으로 단간 표현형을 일관되게 생산하였다. 이 데이터는 잎 조직에서 활성 GAㄴdml 생산이, 그와 같은 수직 성장이 식물의 줄기 또는 자루에서 발생하여도, 식물 성장 및 궁극적으로 식물 높이에 기여한다는 것을 나타낸다. 다양한 뿌리 프로모터로 GA20 옥시다제 억제 작제물의 발현은, 하나의 뿌리 프로모터가, 상기-토양 식물 조직에서 추가의 발현에 기인될 수 있는, 중간 정도 표현형을 생산하였어도, 일반적으로 단간 표현형을 생산하지 못했다.
R0 식물은 그 다음 자기-교배되었고 수득한 종자는 묘목장에서 성장되어 동종접합성 근친교배 자손 식물 (R1 식물)을 생성하였다. 프로모터 작제물의 일부로 (적어도 4 형질전환 사건 / 작제물; ) R1 자손 이식유전자성 식물의 관찰은, GA20 옥시다제 억제 작제물 없이 동일한 교배 계통의 대조군 식물에 비교하여, R1 발달성 단계에서 실시되었다. R0 식물과 유사하게, 각각의 RTBV, CAMV e35S, 및 율무 폴리유비퀴틴 프로모터로 GA20 옥시다제 억제 작제물을 발현시키는 R1 자손 식물은 관측된 임의의 상당한 오프-유형 없이 단간, 반왜성 표현형을 갖는 것으로 또한 밝혀졌다.
실시예 16. 상이한 GA 옥시다제 유전자를 표적화하는 작제물을 가진 이식유전자성 옥수수 식물의 표현형 관찰.
상기 실시예는 억제용 GA20 옥시다제_3 및 GA20 옥시다제_5 유전자를 표적화하는, 그리고 식물-발현성 관속, 구성적 및/또는 잎 프로모터에 작동가능하게 연결된 miRNA-발현 작제물이 단간, 반왜성 옥수수 식물을 생성하는데 사용될 수 있다는 것을 실증한다. 억제용, 상이한 GA20 또는 GA3 옥시다제 유전자, 또는 GA20 옥시다제_3 및/또는 GA20 옥시다제_5 유전자의 상이한 부분이 얼마나 식물 높이에 영향을 줄 수 있는지를 시험하기 위해, 몇 개의 작제물은 생성되었고 옥수수 식물로 형질전환되었다. 작제물은 또한 상기 예에서처럼, 그러나 상이한 miRNA 백본 서열 (옥수수 miRNAs로부터 2개, 대두 miRNA로부터 1개, 그리고 면 miRNA로부터 1개 - 상기 예에서 작제물은 쌀 miRNA 백본 서열을 사용하였다)로 동일한 표적화 서열로 제조되었다. 표 14는, (야생형 대조군 식물에 비교하여) 온실에서 이들 작제물을 포함하는 이식유전자성 R0 식물의 관찰과 함께, 이들 추가의 억제 작제물의 목록을 제공한다. (i) GA20 옥시다제_1 / GA20 옥시다제_2, (ii) GA20 옥시다제_3 / GA20 옥시다제_9, (iii) GA20 옥시다제_7 / GA20 옥시다제_8, 및 (iv) (상이한 miRNA 백본을 가진) GA20 옥시다제_3 / GA20 옥시다제_5를 표적화하는 작제물은, 각각 양쪽 유전자 표적에 상보적인 단일 표적화 서열을 가진 miRNA를 인코딩하였고, 반면에 (i) 개별 GA20 옥시다제_3 및 GA20 옥시다제_5 표적화 서열, (ii) 개별 GA20 옥시다제_4 및 GA20 옥시다제_6 표적화 서열, 및 (iii) 개별 GA20 옥시다제_4 및 GA20 옥시다제_7/8 표적화 서열의 스택은, 각각 2개의 성숙한 miRNAs로 절단 및 분리된 나란히 배열된 2개의 표적화 서열을 가진 단일 pre-miRNA로서 발현되었다. 표 14는 miRNA 표적화 서열 그리고 miRNA 표적화 서열에 상보적인 cDNA 서열을 제공한다. GA20 옥시다제_1 / GA20 옥시다제_2 작제물을 위하여, 별표 (*)는 miRNA의 표적화 서열과 mRNA 표적 또는 인식 부위 사이 정렬 길이가 GA20 옥시다제_2에 대해서보다 GA20 옥시다제_1에 대해서 더 짧았다 (17 대 20 뉴클레오타이드)는 것을 나타낸다. 유사하게 GA20 옥시다제_3 / GA20 옥시다제_9 작제물에 대하여, 별표 (*)는 miRNA의 표적화 서열과 mRNA 표적 또는 인식 부위 사이 정렬 길이가 GA20 옥시다제_3에 대해서보다 GA20 옥시다제_9에 대해서 더 짧았다 (17 대 20 뉴클레오타이드)는 것을 나타낸다. 표 14에서 열거된 작제물의 각각에 대하여, 상당한 오프-유형은, 표에서 제공된 관찰 외에는, 관측되지 않았다.
표 14에서 요약된 관찰은 몇 개의 다른 GA20 옥시다제 유전자의 표적화가 단간, 반왜성 표현형을 생산하지 못했다는 것을 실증한다. (i) 관련된 GA20 옥시다제_1 및 GA20 옥시다제_2 유전자, (ii) 관련된 GA20 옥시다제_3 및 GA20 옥시다제_9 유전자, (iii) 관련된 GA20 옥시다제_7 및 GA20 옥시다제_8 유전자, 또는 (iv) GA20 옥시다제_9 유전자 단독을 표적화하는 작제물의 어느 것도 R0 식물에서 관측가능한 단간, 반왜성 표현형을 생산하지 못했다. 그에 반해서, 이식유전자성 R0 및 R1 식물에서 GA20 옥시다제_3 및 GA20 옥시다제_5 유전자를 공동으로 표적화하는 단일 miRNA를 인코딩하는 그들 작제물은, 상이한 전사 종결 서열 또는 상이한 miRNA 백본이 사용됨 (총 5 miRNA 백본 서열 시험됨)에도 불구하고, 단간, 반왜성 표현형을 생산하였다. 또한, GA20 옥시다제_3 및 GA20 옥시다제_5 유전자의 상이한 서열 표적화는 여전히 반왜성 식물을 생산하였다. 흥미롭게도, GA20 옥시다제_3 및 GA20 옥시다제_5 유전자 중 어느 하나를 표적화하도록 설계된 억제 작제물은 개별적으로, GA20 옥시다제_3 유전자를 개별적으로 표적화하는 작제물이 식물 높이에서 약간의 감소를 생산하였을지라도, GA20 옥시다제_3 및 GA20 옥시다제_5 유전자를 공동으로 표적화하는 작제물과 달리, 단간, 반왜성 표현형을 생산하지 못했다. 그러나, GA20 옥시다제_3 및 GA20 옥시다제_5 유전자를 개별적으로 표적화하는 억제 작제물의 탠덤 벡터 스택을 갖는 이식유전자성 식물은 GA20 옥시다제_3 및 GA20 옥시다제_5 유전자를 공동으로 표적화하는 단일 miRNA를 인코딩하는 작제물에 유사한 단간, 반왜성 표현형을 생산하지 못했다. 이들 데이터는 단간, 반왜성 표현형이 GA20 옥시다제_3 및 GA20 옥시다제_5 유전자의 둘 모두를 표적화하는 작제물로 관측되지만, 전체 반왜성 표현형이 억제를 위하여 개별적으로 GA20 옥시다제_3 및 GA20 옥시다제_5 유전자의 표적화로 관측되지 않음 (표적화 GA20 옥시다제_3으로 높이에서 단지 약간의 감소, 및 표적화 GA20 옥시다제_5로 관측된 식물 높이 표현형 없음)을 실증한다. 또한, 식물 높이 표현형은 기재된 바와 같이 GA20 옥시다제_1, GA20 옥시다제_2, GA20 옥시다제_6, GA20 옥시다제_7, GA20 옥시다제_8, 및/또는 GA20 옥시다제_9 유전자(들) 표적화로 관측되지 않았다.
GA20 옥시다제_3 및 GA20 옥시다제_5 유전자 외에는, 식물 높이에서 중간 정도 감소는 (i) GA20 옥시다제_4 및 GA20 옥시다제_6 유전자, 또는 (ii) GA20 옥시다제_4, GA20 옥시다제_7 및 GA20 옥시다제_8 유전자를 공동으로 표적화하는데 상보적으로 나란히 2개의 표적화 서열을 포함하는 억제 작제물을 가진 R0 이식유전자성 식물에서 관측되었다 - 2개의 표적화 서열 중 하나는 GA20 옥시다제_7 및 GA20 옥시다제_8 유전자 둘 모두를 표적화한다. GA20 옥시다제_7 및 GA20 옥시다제_8 유전자를 표적화하는 별개의 작제물이 식물 높이 표현형을 생산하지 못했고, GA20 옥시다제_4 및 GA20 옥시다제_6 유전자를 표적화하는 억제 작제물이 GA20 옥시다제_4, GA20 옥시다제_7 및 GA20 옥시다제_8 유전자를 표적화하는 억제 작제물에 유사하였던 식물 높이 표현형을 생산하였다는 점을 감안하면, GA20 옥시다제_4 유전자의 표적화가 이들 이식유전자성 식물에서 관측된 식물 높이 표현형을 (완전히 아니면) 크게 책임진다고 여겨진다. 게다가, GA3 옥시다제_1 또는 GA3 옥시다제_2 유전자를 표적화하는 작제물을 가진 이식유전자성 옥수수 식물은, 항시성 프로모터에 의존하여 이 표현형에서 일부 가변성이 있었어도, 식물 높이에서 감소를 또한 표시하였다. 따라서, 또한 GA20 옥시다제_3 및 GA20 옥시다제_5 유전자, GA20 옥시다제_4, GA3 옥시다제_1, 및 GA3 옥시다제_2 유전자는 또한 억제용으로 표적화되어 단간, 반왜성 식물을 생산할 수 있다.
실시예 17. 편집된 GA20 옥시다제_3 또는 GA20 옥시다제_5 유전자를 갖는 옥수수 식물의 표현형 관찰.
상기 억제 작제물에 더하여, 몇 개의 게놈-편집된 돌연변이는 옥수수 식물내 내인성 GA20 옥시다제_3 및 GA20 옥시다제_5 유전자에서 창출되어 각각의 이들 유전자의 녹아웃의 표현형 효과에 대하여 시험하였다. 표적화 작제물을 인코딩하는 일련의 10 단일-사슬 가이드 RNA (sgRNAs)는 각각의 유전자에 대하여 유전자 서열에 따라 상이한 위치를 표적화하는 각각의 GA20 옥시다제_3 및 GA20 옥시다제_5 유전자에 대하여 창출되었다. 각각의 유전자에 대하여 유전자 서열에 따라 유사한 또는 상이한 위치에서, GA20 옥시다제_3 및 GA20 옥시다제_5 유전자의 둘 모두를 각각 표작화하는 추가 일련의 10 sgRNAs는 창출되었다. 표적화된 게놈 편집은 sgRNA를 Cas9 단백질의 발현과 함께 옥수수 외식편에 전달함으로써 실시되어 DSB 또는 닉이 gRNA용 게놈 표적 부위에서 또는 근처에서 발생시키게 되었고, 이는 그 다음 불완전하게 복구되어 표적 부위에서 또는 근처에서 돌연변이를 도입할 수 있다. 돌연변이의 존재는 식물의 RFLP 분석 및/또는 서열분석에 의해 후속적으로 확인되었다. 아래 표 15는, RNA-유도된 엔도뉴클레아제로 GA20 옥시다제_3 및 GA20 옥시다제_5 유전자(들)의 하나 또는 둘 모두의 게놈 편집에 사용될 수 있는, 시험된 가이드 RNA (gRNA) 작제물의 목록을 제공한다. 이들 가이드 RNA 작제물은 GA20 옥시다제_3 및 GA20 옥시다제_5 유전자의 코딩 서열을 표적화하기 위해 일반적으로 설계되지만, 공동 표적화 작제물의 일부는 대신에 2 유전자 중 하나의 UTR 서열을 표적화할 수 있다. 이들 gRNAs는, 돌연변이 (예를 들어, 삽입, 결실, 치환, 등)을 생산하기 위해 불완전하게 복구될 수 있는, 각각의 gRNA의 게놈 표적 부위에서 또는 근처에서 게놈에 이중가닥 절단 (DSB) 또는 닉을 생산하기 위해 적합한 엔도뉴클레아제로 사용될 수 있다. 편집된 GA20 옥시다제_3 유전자에 대하여 동종접합성 또는 편집된 GA20 옥시다제_5 유전자에 대하여 동종접합성이었던 이식유전자성 식물은 몇몇의 작제물로부터 생성되었다 (참고 볼드체). 사건은 편집용 양쪽 유전자를 표적화하는 작제물로부터 또한 생성되었다. GA20 옥시다제_3 및 GA20 옥시다제_5 유전자를 공동으로 표적화하는 작제물을 위하여, 코딩 서열 (CDS) 좌표는 괄호로 표시된 2 유전자 중 하나와 관련하여 제공된다. 표 15는 어떤 작제물이 유전자 편집 사건을 생산하였는지, 그들 사건이 R0 식물에서 동종접합성 또는 이종접합성인지 여부, 및 괄호내 ± 숫자가 돌연변이를가진 유사한 서열 변화를 나타내는지를 추가로 보여준다 (예를 들어, +1은 1 뉴클레오타이드, 등의 삽입을 의미하고, 더 큰 또는 더욱 복잡한 인델은 "del." 또는 insert."로서 표지된다). GA20 옥시다제_3 및 GA20 옥시다제_5의 적층된 표적화를 위하여, 돌연변이된 유전자의 동일성은 괄호로 또한 제공된다. 억제 작제물용 결과와 일치하는, 편집된 GA20 옥시다제_3 또는 GA20 옥시다제_5 유전자에 대하여 동종접합성인 이식유전자성 식물은 단간, 반왜성 표현형을 갖지 않았고 대조군 식물에 비하여 정상 식물 높이를 가졌고 (참고 표 15에서 작제물 GA20 옥시다제_3-D 및 GA20 옥시다제_3-G, 그리고 작제물 GA20 옥시다제_5-B 및 GA20 옥시다제_5-G), 이들 유전자 중 단 하나의 녹아웃이 반왜성 표현형을 생산하는데 충분하지 않다는 것을 나타냈다.
실시예 18. GA20 옥시다제_3 및 GA20 옥시다제_5 유전자를 표적화하는 억제 작제물은 식물에서 활성 GA 수준 및 GA20 옥시다제 전사체를 감소시킨다.
GA20 옥시다제 전사체 수준이 GA20 옥시다제_3 및 GA20 옥시다제_5 유전자를 표적화하는 억제 작제물을 가진 이식유전자성 식물에서 얼마나 영향을 주었는지를 결정하기 위해, 온실에서 성장된 이식유전자성 식물의 다양한 부분으로부터 전체의 조직은 상이한 영양 단계 (V3, V8, 및 V14)에서 획득되었고, 각각의 GA20 옥시다제 유전자에 대하여 mRNA 전사체 수준은 TaqMan® 검정을 사용하여 분석되었다. 이들 실험을 위하여, 총 RNA는 Zymo ResearchTM로부터 Direct-Zol RNA 추출 키트를 사용하여 추출되었고 게놈 DNA 오염을 감소시키기 위해 TurboTM DNAse로 처리되었다. RNA는 그 다음 이중-가닥 cDNA를 생성하기 위해 역전사되었다. 역전사 정량적 PCR은 Bio-Rad® CFX96 실시간 시스템에서 FAM 표지된 TaqMan® 프로브 및 유전자 특정 프라이머로 수행되었다. 품질관리 메트릭스는 잔존 게놈 DNA 오염을 설명하기 위해 역전사를 경험하지 않았던 qPCR 효율 및 총 RNA를 결정하도록 조직 특정 표준을 사용하여 계산되었다. 관심 유전자 대 정규화군 유전자에 대하여 사이클 역치 값 사이 차이는 각각의 조직에서 각각의 유전자 전사체의 상대량을 결정하였다. 이 상대량은 어느 한쪽 1개 (18S) 또는 2개 (18S 및 ELF1A) 정규화군 유전자의 기하 평균을 사용하여 계산되었다.
이 실험에서, GA20 옥시다제_3 전사체의 수준은, V3 뿌리 및 V8 잎에서 GA20 옥시다제_3 전사체의 수준이 변함없는 것처럼 보였어도, V3에서 잎 및 줄기 조직, V8에서 마디간 조직, 그리고 V14에서 잎 및 마디간 조직을 포함하는, 이들 단계에서 대부분의 영양 조직에서 감소되었다 (데이터 도시되지 않음). 게다가, 이 실험에 대한 GA20 옥시다제_5 전사체의 수준은, GA20 옥시다제_5 전사체의 발현 수준이 이들 조직에서 상대적으로 낮았어도, 시험된 영양 조직에서 일반적으로 변함없었다 (데이터 도시되지 않음). GA20 옥시다제_3도 GA20 옥시다제_5도 이식유전자성 식물의 뿌리 조직 샘플에서 상당히 감소되지 않았다. 각각의 다른 GA20 옥시다제 유전자 (즉, 1, 2, 4 및 6-9 하위유형)은 이식유전자성 식물의 일부 조직에서 일반적으로 변함없었거나 증가되었다.
유사한 실험은 동일한 억제 작제물을 발현시키는 이식유전자성 식물로부터 생식 조직으로 수행되었다. 온실에서 성장된 이식유전자성 식물의 다양한 부분으로부터 전체의 조직은 상이한 생식 단계 (R1 및 R3)에서 취득되었고, 각각의 GA20 옥시다제 유전자에 대한 mRNA 전사체 수준은 TaqMan® 검정을 사용하여 분석되었다. 이 실험에서, GA20 옥시다제_3 및 GA20 옥시다제_5 전사체의 수준은, 대조군에 비하여, R1 잎, 이삭, 술 및 마디간 및 R3 잎 및 마디간에서 대부분 변함없었다 (데이터 도시되지 않음). 다른 GA20 옥시다제 유전자에 대한 결과는 대부분 혼합된 또는 중성이었다 (데이터 도시되지 않음).
이들 데이터는 영양 단계 동안 이식유전자성 옥수수 식물에서 GA20 옥시다제_3 전사체의 수준이 일반적으로 이 실험에서 감소되었다는 것을 보여주지만, 후기 생식 단계 동안 대조군 식물 조직에 비하여 대부분 변함없는 것처럼 보인다. GA20 옥시다제_5 유전자 전사체의 수준에서 명백한 감소가 이들 이식유전자성 식물 조직에서 일반적으로 관측되지 않았어도, 이 유전자의 발현 수준은 상대적으로 낮았다. 따라서, 그것의 발현 수준에서 변화는 이 방법으로 검출하기 어려웠을 수 있다. 또한, 억제 작제물은 발현 수준에서 일관된 감소가 임의의 다른 GA20 옥시다제 유전자에 대한 이 실험에서 관측되지 않았기 때문에 표적화된 GA20 옥시다제 유전자에 특이적인 것처럼 보인다.
별개의 실험에서, GA20 옥시다제 발현 수준은, 야생형 대조군에 비교하여, (RTBV 프로모터의 제어 하에서 억제용 GA20 옥시다제_3 및 GA20 옥시다제_5 유전자를 표적화하는) 이전 실시예로부터 억제 작제물을 발현시키는 이식유전자성 식물의 줄기 조직에서 결정되었다. 조직 샘플은 V3-V6 줄기/줄기로부터 취득되었고 그들 줄기의 일부는 별개의 관속 및 비-관속 조직으로 추가 해부되어 이들 조직 중에서 차별적인 발현 수준을 결정하였다. 전사체 발현 수준은 이식유전자성 및 야생형 식물 조직 사이 정량적 비교용 RNA 서열분석 (RNA-Seq) 접근법을 사용하여 결정되었다. 도 13A에서 나타난 데이터는 2 생식질 중 하나를 갖는 야생형 대조군 식물 그리고 2 사건 중 하나를 갖는 이식유전자성 식물로부터 생성되고, 도 13A에서 각각의 막대는 2 이식유전자성 사건 또는 생식질 중 하나를, 각각 나타낸다. 이들 실험을 위하여, 개별 관속 다발은 샘플의 잔여 줄기/자루 조직으로부터 분리되었고 별개의 분석을 거치게 되었다. 도 13A에서 나타낸 바와 같이, 억제 작제물에 의해 발현된 miRNA는 벌크 줄기/자루 샘플로부터 벌크 식물 줄기 조직 ("벌크", 즉, 관속 및 비-관속 조직의 분리 없이)에서, 뿐만 아니라 분리된 관속 ("Vasc") 및 비-관속 ("Non-Vasc") 조직에서 검출되었다. 그러나, miRNA의 발현 수준은 RTBV 프로모터의 관속 발현 패턴을 나타내는 비-관속 조직에서보다 관속 조직에서 훨씬 높았다.
벌크 줄기/자루 샘플 그리고 분리된 관속 및 비-관속 샘플은, 단 하나의 야생형 샘플이 각각의 조직 유형에 대하여 보여져도, (다른 GA20 옥시다제 유전자와 함께) 이식유전자성 대 야생형 대조군 식물에서 GA20 옥시다제_3 및 GA20 옥시다제_5 유전자 전사체의 수준을 측정 및 비교하기 위해 유사한 RNA-Seq 실험에서 또한 분석되었다. 이들 실험을 위하여, 대조군 또는 이식유전자성 식물 (2 사건)으로부터 자루 조직은 상기에 기재된 바와 같이 별개의 관속 다발 및 비-관속 조직으로 절단되었다. 총 sRNA 및 mRNA는 각각의 샘플에 대하여 서열분석되었고, 데이터는 원리 성분 분석을 사용하여 분석 및 비교되었다.
도 13B에서 나타낸 바와 같이, GA20 옥시다제_3 유전자의 전사체 수준은 야생형 대조군 (WT)에 비하여 이식유전자성 식물 (TG)의 벌크 줄기 조직 (벌크) 및 분리된 줄기 관속 조직 (Vasc)에서 상당히 감소되었지만, 분리된 비-관속 (비-Vasc) 조직에서 변함없는 것처럼 보였다. 그러나, 이식유전자성 식물로부터 관속 (Vasc) 조직 샘플에서 GA20 옥시다제_5 전사체에 대하여 하향 추세 선이 있었어도, GA20 옥시다제_5 유전자의 전사체 수준은 벌크 줄기 조직 (벌크)에서 상당히 감소되었지만, 이식유전자성 식물의 분리된 관속 (Vasc) 및 비-관속 (비-Vasc) 조직에서 상대적으로 변함없었다. GA20 옥시다제_5 유전자의 발현 수준은 특히 비-관속 조직에서 낮았다. 모든 다른 GA20 옥시다제 유전자는, 커플 GA20 옥시다제 유전자가 그것의 발현 수준에서 약간의 상향 추세를 보여주었어도, 분석된 이식유전자성 식물 조직내 그것의 전사체 수준에서 상당한 감소를 보여주지 못했다. 이 데이터는 GA20 옥시다제_3 및 GA20 옥시다제_5 유전자의 발현 수준이 대조군에 비하여 억제 작제물을 갖는 이식유전자성 식물의 하나 이상의 조직에서 다양한 정도로 감소되는 것을 추가로 실증한다. 사실상, miRNA의 더 높은 발현 및 관속 조직에서 내인성 GA20 옥시다제_3 유전자의 더 큰 억제는 RTBV 프로모터의 발현의 관속 패턴, 그리고 아마 야생형 식물의 관속 대 비-관속 조직에서 GA20 옥시다제_3 유전자 발현의 더 높은 수준과 일치한다. 유사한 패턴은, 관속 및 비-관속 조직 사이 GA20 옥시다제_3 유전자만큼 확연하지 않아도, GA20 옥시다제_5 유전자에 대하여 또한 관측된다.
이식유전자성 식물에서 GA20 옥시다제 억제로 관측된 단간, 반왜성 표현형은 활성 GAs를 생산하는 식물 조직에서 및/또는 줄기 또는 마디간 조직에서 존재하는 활성 GAs의 수준에서 감소에 의해 유사하게 매개된다. 호르몬의 다른 불활성 형태에 비하여 활성 GAs (특히 G1, G3 및 G4)의 수준을 결정하기 위해, GA 수준은 발생의 상이한 단계에서 이식유전자성 및 야생형 대조군 식물로부터 취득된 상이한 조직 샘플에서 측정되었다. 이들 실험을 위하여, 각각의 조직용 신선한 냉동된 샘플은 분쇄되었고 내부 표준을 따라 96 웰 유리관에 분배되었다. 샘플은 4 ℃에서 4 시간 동안 2회 메탄올:물:아세트산 (80:19:1 v/v/v) 용매를 사용하여 추출되었다. 용매는 추출물로부터 거의 건조까지 질소가 있는 다중-채널 SPE를 사용하여 증발되었다. 샘플은 SPE 카트리지를 사용하여 추가 정제되었다. 정제 후, 샘플은 Shimadzu® Nexera® UPLC 및 SCIEX® 삼중 콰드 5500 질량 분석 계기 장비로 표준 LC-MS/MS 방법을 사용하여 운영되었다. 크로마토그래프는 분석되었고 내부 표준을 사용하여 정량화되었다.
2 세트의 실험은 영양 단계 식물의 다양한 조직으로부터 취득된 샘플로 수행되었다. 온실에서 하나의 실험을 위하여 표 16에서 나타낸 바와 같이, 활성 GAs (GA1, GA3, 및 GA4)의 감소된 수준은 상이한 영양 단계에서 이식유전자성 식물의 다양한 조직에서 관측되었다. 표 16에서 데이터는 주어진 조직에 대하여 각각의 GA 호르몬의 양에서 유의미한 변화를 갖는 이식유전자성 식물의 숫자로서 표시된다 ("U" = 상승 또는 증가됨; "D" = 하락 또는 감소됨; "N" = 중성 또는 변화 없음; 및 "T" = 식물의 총 수). 조직 샘플에서 적어도 한 부분적 감소를 보여주었던 GAs는 볼드체로 나타난다. 활성 GA1은 V8 단계에 잎 및 마디간 조직에서 그리고 V14 단계에 마디간 조직에서 감소되었고, 활성 GA4는 V3 줄기 및 V8 및 V14 마디간에서 감소되었다. 그러나, 활성 GA3은 이 실험에서 관측가능하게 감소되지 않았다. GAs의 다른 불활성 형태는 표 16에서 나타낸 바와 같이 이식유전자성 식물의 다양한 조직에서 변경되었다. 일반적으로, 지베렐린산 경로에서 GA20 옥시다제 유전자의 다운스트림인 GAs (예를 들어, GA9, GA20, 및 GA34)는 감소되는 경향이 있었고, 반면에 GA20 옥시다제 유전자의 업스트림인 GAs는 더 높은 경향이 있었고 (예를 들어, GA12 및 GA53), 이는 전구체 GAs 업스트림이 축적하게 만드는 GA 옥시다제 유전자의 더 낮은 활성에 기인될 수 있다. 이 데이터는 이식유전자성 식물의 줄기 및 잎에서 활성 GA 호르몬의 더 낮은 수준 그리고 이들 조직에서 GA20 옥시다제 활성의 억제와 일치한다.
별개의 실험에서, GA 호르몬의 유사한 측정은 발생의 영양 단계 동안 다양한 식물 조직으로부터 취득되었다. 온실 및 야외에서 식물로부터 취득된 조직을 사용하는 실험에 대한 표 17에서 나타낸 바와 같이, 하나 이상의 활성 GAs (GA1, GA3, 및 GA4)의 감소된 수준은 V3 및 V8 단계에서 이식유전자성 식물의 잎 및 마디간에서 관측되었다. 이 실험에 대한 V8 단계에서 잎 샘플은, 온실에서 식물로부터 취득된 다른 샘플과 달리, 야외에서 식물로부터 취득되었다. 표 17에서 데이터는 표 16에 대하여 기재된 바와 유사한 방식으로 표시된다. GAs의 다른 불활성 형태는 표 17에서 나타낸 바와 같이 이식유전자성 식물의 다양한 조직에서 변경되었다. 상기 관찰에 유사한, 지베렐린산 경로에서 GA20 옥시다제 유전자의 다운스트림인 GAs (예를 들어, GA9, GA20, 및 GA34)는 감소되는 경향이 있었고, 반면에 GA20 옥시다제 유전자의 업스트림인 GAs는 더 높은 경향이 있었다 (예를 들어, GA12 및 GA53). 이 데이터는 이식유전자성 식물의 줄기 및 잎에서 활성 GA 호르몬의 더 낮은 수준 그리고 이들 조직에서 GA20 옥시다제 활성의 억제와 재차 일치한다.
이식유전자성 옥수수 식물에서 GA20 옥시다제_3 및 GA20 옥시다제_5 유전자의 억제는 줄기, 마디간, 관속 조직 및 잎을 포함하는 다양한 조직에서 표적화된 GA 옥시다제 전사체의 수준을 감소시키고, 이들 GA20 옥시다제 유전자의 억제는, 영양 단계 동안 식물 성장 그리고 궁극적으로 후기 영양 및 생식 단계에 의한 식물 높이에 영향을 주기 위한 작용 부위인, 줄기 및 마디간을 포함하는 이식유전자성 식물의 조직에서 활성 GAs의 감소된 수준과 추가로 관련된다. GA20 옥시다제 전사체 수준이 생식 단계 조직에서 대부분 변함없거나 혼합되는 관찰에 유사한, 활성 GAs를 포함하는 GA 호르몬의 수준은 생식 단계 조직에서 또한 대부분 변함없거나 혼합된다 (데이터 도시되지 않음).
본 개시내용을 상세히 기재한다면, 변형, 변이, 및 등가 구현예가 본 명세서에서 그리고 첨부된 청구항들에서 기재된 바와 같이 본 개시내용의 사상 및 범위에서 이탈 없이 가능하다는 것이 분명할 것이다. 게다가, 본 개시내용에서 모든 예가 비-제한적인 예로서 제공되는 것이 인정되어야 한다.
<110> Monsanto Technology LLC Allen, Edwards M. Boddu, Jayanand Dietrich, Charles R. Goldshmidt, Alexander Howell, Miya Kosola, Kevin R. Neelam, Anil Slewinski, Thomas L. Venkatesh, Tyamagondlu V. 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21 <210> 65 <211> 726 <212> DNA <213> Rice tungro bacilliform virus <400> 65 tcctacaaaa gggagtagta atatttaatg agcttgaagg aggatatcaa ctctctccaa 60 ggtttattgg agacctttat gctcatggtt ttattaaaca aataaacttc acaaccaagg 120 ttcctgaagg gctaccgcca atcatagcgg aaaaacttca agactataag ttccctggat 180 caaataccgt cttaatagaa cgagagattc ctcgctggaa cttcaatgaa atgaaaagag 240 aaacacagat gaggaccaac ttatatatct tcaagaatta tcgctgtttc tatggctatt 300 caccattaag gccatacgaa cctataactc ctgaagaatt tgggtttgat tactacagtt 360 gggaaaatat ggttgatgaa gacgaaggag aagttgtata catctccaag tatactaaga 420 ttatcaaagt cactaaagag catgcatggg cttggccaga acatgatgga gacacaatgt 480 cctgcaccac atcaatagaa gatgaatgga tccatcgtat ggacaatgct taaagaagct 540 ttatcaaaag caactttaag tacgaatcaa taaagaagga ccagaagata taaagcggga 600 acatcttcac atgctaccac atggctagca tctttacttt agcatctcta ttattgtaag 660 agtgtataat gaccagtgtg cccctggact ccagtatata aggagcacca gagtagtgta 720 atagat 726 <210> 66 <211> 165 <212> DNA <213> Rice tungro bacilliform virus <400> 66 acgaatcaat aaagaaggac cagaagatat aaagctggaa catcttcaca tgctaccaca 60 tggctagcat ctttacttta gcatctctat tattgtaaga gtgtataatg accagtgtgc 120 ccctggactc cagtatataa ggagcaccag agtagtgtaa tagat 165 <210> 67 <211> 2000 <212> DNA <213> Zea mays <400> 67 ctgcaatata tacaccaaaa gtattataaa ctgtcatata tatgaccaaa acctttttat 60 tttagaaaag tatattaatc atggtatatt aatcaaagtt gttgttgggg ctgcaaaaat 120 catacccttc ttccacaagc tgttccttga actgcaggta ctcaggaact ctcagctcct 180 caacagcgag ctcactgacg ttgaccctca catactccca gacaccaggc ctagggcgga 240 tggcaagtgc aacccatggg gggatgacaa tcgcctcctg taagataata gagctagaat 300 gattaaagaa ggtgcacact acaaaaggaa cagtgctgtc cagcgagatc tgaatctgat 360 gcaaacctga gctgccctca ggacatcctc aaaagcacca tccttgagct tctcgcgctc 420 agcctcaggg atcgcattgt tgtactcggc aatgatctgg tggggctgca gcataccctt 480 tccaaggttt ttcagcctgc gcaaaacgat gtgccaaata acatcagact atgccagatc 540 tataaactca tcaaacatat acaatttcaa gaaatagttt agacgtatga tcagcagtca 600 gtagcgtggg aacatatgca acatagcgaa gaggcacaac agcaaattca 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1500 taagtctcga cacacccttg acgctgcgcc acgaaactat attgcaggca agaaaccaac 1560 agaacctaac tctggaaggg gggaaagaaa cggcagacag gagcaagacc caaaaaaaaa 1620 cgactcagat cctggtacta tagtcctagt acctagacca gaaagaagaa acaaccaata 1680 caacaagagg catacaagaa ctgaatcgat gaactgaaac gcttcagagg accgaggaat 1740 ggcggagaag ggaggcgcct atttatacag atctgacgag agaaccgaac aaaaacacat 1800 cgatgggaac catggagaag aaaagggctg gccgcatggc accaatggcc tcggcctcca 1860 aaaagccgtt gaatccaaag caggcgagga cgaagcgtga cgcggcaggg tacttctcta 1920 gaaaagcacg gcatcagcaa ggtggggggg ctggggttcc ttattgcagg caatcacgag 1980 gtgattagca caaacggaag 2000 <210> 68 <211> 2000 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 68 ctgaaatata catcagagat attacaatga catatatatc gataaaagaa aaataataaa 60 attaagtttt aaattttaag aatatatgtt tttagtatcc caattatgca gatttcatac 120 ccttcttcca caagctgttc cttgaactgc aagtactcgg ggactgtcag caactcaaca 180 gcgagctcgc tcacattgac cctcacatac tcccagacac cgggcctcgg gcggatggca 240 agggcaaccc atggggagat aacaatcccc tcctgcatga taaaaaacaa 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catgtgttat gatttatctc acatcttata 1320 gttaatagga gtaagtaaca agctactttt ttcatattat agttcgtttg attttttttt 1380 tttaaagttt ttttagtttt atccaaattt attgaaaaac ttagcaacgt ttataatacc 1440 aaattagtct catttagttt aatattgtat atattttgat aatatattta tgttatatta 1500 aaaatattac tatatttttc tataaacatt attaaaagcc atttataata taaaatggaa 1560 ggagtaatta atatggatct cccccgacat gagaatattt tccgatggtg tgacgacgcc 1620 atgtaagctt cggtgggcct ggacggccag aggtgccaac agccacgtcc aacaacccct 1680 gggtcccccc ctaacactcc aaacagtagt gagtagtgtc tcgtcgcgtt ttagtatttg 1740 atgacaaaca aagtgtgagt tgagttagcc accaccaact tgcacacgag cacatacatt 1800 tgtgtccatt ctcgccagtc acttccatct ctagtcctaa ctcctatcta gcgatgtaag 1860 cggataattt catcatccgt atataaacct gtttgttata gttaatttcc tatataatac 1920 tataacagta tacattttaa aagaaaacaa aattaggata aacaggccct gctcctatcc 1980 atccatggca cttggaagga ccagactcgg tcatgccatg ccaagccaag atatgggtta 2040 tggaagagta gagaagagga gagatgagag ataagcatgc gttctcctcc tcgttggatg 2100 tgtattttgg agggatttgt gtagtagtag cagcggcgcc gcggggacgg atgcggatgg 2160 tggcgctttc ggtggcgttt tcccgggggg gttttggttt ggcgcttggg ggggatggca 2220 tggcgcggcg tgcggctgca cgccacacac acgcgcgcgc acgcacgtac gtcgtcgtcg 2280 ccgcgggcgg acggtagctt agggtggtgt gttccgcgcg cgggcgcgga ttgttccatg 2340 ccgatcgatt tggcgccacc ctcgccgcgg ctcttgtcgc gtcgtgcgcc tctctcgcgc 2400 ggtttgtcct tgtcgcgttg ctcagccggc gacgggggca cggacattgg cgatgtagcc 2460 ctgcacgtgt cggcctctcc gttgatgaat gatgatgtat gtatgtattt ttttttgtct 2520 gaaggaattt gtggggaatt gttgtgtgtg caggcgctgt cgaacgggag gtataagagc 2580 tgcctgcaca gggcggtggt gaaccagcgg cgggagcggc ggtcgctggc gttcttcctg 2640 tgcccgcggg aggacagggt ggtgcggccg ccgccgagcg ccgccacgcc gcagcactac 2700 ccggacttca cctgggccga cctcatgcgc ttcacgcagc gccactaccg cgccgacacc 2760 cgcacgctcg acgccttcac gcgctggctc gcgccgccgg ccgccgacgc cgccgcgacg 2820 gcgcaggtcg aggcggccag ctgatcgccg aacggaacga aacggaacga acagaagccg 2880 atttttggcg gggcccacgc ccacgtgagg ccccacgtgg acagtgggcc cgggcggagg 2940 tggcacccac gtggaccgcg ggccccgcgc 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gtttctagtg gtctcgaaaa 2040 gtagggtttc attcattcta tctatctatc cgtccgtcca aaagggctgc gatgcgagca 2100 cttgagtcgg agccaatcag agcgcgagaa aagatagggg gggtagcaag ccatgtcgga 2160 ggggcgtttg cttccggcag gtttggattc ttgtggtagg cgggcggctc tgtacagtag 2220 cggcggtgac ggtgaggtgg cggcgctttc ggtggcgggc caacccaggt gcatgcacgc 2280 gcgctcgtcg ttttcccgcc tgaatctgcc gctgcgccca tggcaagggg gtgggtgctg 2340 ccgccgggcg atggagtaga tcacggtcgc cgtcgggctc ggccagttga tcacggttcg 2400 ttcgtgcggt actaggttcc cccacggcac tgtgactgca tcgttccggc cctcgccatt 2460 ggcgatcggg caatctcctg ttcatccgtc gctgttgatt cctcggccac gatagaccat 2520 gcgcgtgccg gtcgtcgccc cgtcgcgctc gcttcacgtg ctcgtcgcgt ggctcccgtc 2580 ccacacgagg ccgccgcttt ctgacccagt ggagcgcgtg atttacagtt tatatatgtc 2640 gctgcatttt tctttttgtg tgctgctcat tttgcttgga cggagaccgg gaacgattag 2700 ccacggatct aacgcgttgt tgcttgtttt caatgcatgc atgcaggcgc tgtcgaacgg 2760 gcggtacaag agctgcctgc accgcgcggt ggtgaaccgg cggcaggagc ggcggtcgct 2820 ggccttcttc ctgtgcccgc gcgaggaccg cgtggtgcgg 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accggctgca cggcttcttc aaggaccaga cgacgttcat ccggctgaac 600 cactaccctc catgcccgag cccggacctg gcgctgggag tggggcggca caaggacgcg 660 ggggcgctga ccatcctgta ccaggacgaa gtgggcgggc tggacgtccg gcggcgctcc 720 tccgacggcg gcggcggcga gtgggtgcgg gtgaggcccg tgccggagtc gttcgtcatc 780 aacgtcggcg acctcgtcca ggtgtggagc aacgacaggt acgagagcgc ggagcaccgg 840 gtgtcggtga actcggcgag ggagaggttc tccatgccct acttcttcaa cccggcgagc 900 tacaccatgg tggagccggt ggaggagctg gtgagcgacg acgacccgcc caggtacgac 960 gcctacagct ggggcgagtt cttcagcacc aggaagaaca gcaacttcaa gaagctcagc 1020 gtggagaaca ttcagatcgc gcatttcaag aagaccctcg tcctcgccta g 1071 <210> 104 <211> 356 <212> PRT <213> Sorghum bicolor <400> 104 Met Gly Gly Leu Thr Met Glu Gln Ala Phe Val Gln Ala Pro Glu His 1 5 10 15 Arg Pro Lys Pro Thr Val Thr Glu Ala Thr Gly Ile Leu Val Ile Asp 20 25 30 Leu Ser Pro Leu Thr Ala Ser Asp Thr Asp Ala Ala Ala Val Asp Ala 35 40 45 Leu Ala Ala Glu Val Gly Ala Ala Ser Arg Asp Trp Gly Phe Phe Val 50 55 60 Val Val Gly His Gly Val Pro Ala 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1490 <210> 107 <211> 1059 <212> DNA <213> Setaria italica <400> 107 atgggcggct tctccatgga tcagtccttc gtgcaggccc ccgagcaccg ccccaagccc 60 accgtcaccg aggccacggg catcccgctc atcgacctct cgccactcac cggcggtggc 120 ggcggcgacg cggccgccgt ggacgcgctg gccgccgagg tgggcgcggc gagccgggac 180 tggggcttct tcgtggtggt ggggcacggt gtgccggcgg agaccgtggc gcgcgccacg 240 gaggcgcagc gcgcgttctt cgccctgccg gcggagcgga aagccgccgt gcggaggagc 300 gaggcggagc cgctcgggta ctacgagtcg gagcacacca agaacgtcag ggactggaag 360 gaggtgtacg acctcgtccc gggcgggctt cagccgccga tagccgtggc cgacggcgag 420 gtcgtgttcg aaaacaagtg gcccgaagac ctgccgggat tcagagaggc gttggaggag 480 tacatgcaag cgatggaaga gctggcattc aagatactgg agctgatcgc ccggagcctg 540 aacctgaggc ctgacagact gcacggcttc ttcaaggacc agaccacctt catccggctc 600 aaccactacc ctccctgccc gagccccgac ctcgccctcg gcgtcggccg gcacaaggac 660 gccggagcac tgaccatcct ctaccaggac gacgtcggcg ggctcgacgt ccggcgccgt 720 tccgacggcg attgggtccg cgtcaagcct gtccccgact ccttcatcat caacgtcggc 780 gacctcatcc aggtttggag 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aacccggcgg gccacaccat ggtggagcca ctggaggagg tcgtgagcga cgagagcccg 1680 gccaggtaca acccctacaa ctggggcgaa ttcttcagca ccaggaagaa cagcaacttc 1740 aagaagctgg acgtggagaa cgtccagatc acgcatttca ggaagaatta acgcgccggc 1800 tagatcatgt tcagtaaatt ttcagatgat gatgcgtgga caaccatata gcctttgcgt 1860 cataagttaa taatgtctgt gacagtatat catgtaaaca atcgtatgat gtggcttctc 1920 tatctgccgg tgatggtaat gtgacattgt agaagagggt ttgtgagata cttccttcac 1980 ttaactttta cgaatgaata tagacaacca caacatcctt gtcgtga 2027 <210> 114 <211> 1747 <212> DNA <213> Triticum aestivum <400> 114 tcactcaagg ccacaacaca ctcgccagtc catcgccacc atacgtgaca acttgagtta 60 cttgatctgt tgctcatcga tctcgacatc gccatgggcg gcctctccat ggaccaggcc 120 ttcgtgcagg cccccgagca tcgcaccaag gcgaacctcg ccgacgcggc cggcatcccg 180 gtcatcgacc tctcccctct cgccgccggc gacaaggccg gcctggacgc cctcgcggcc 240 gaggtgggca gggcgagccg tgactggggg ttcttcgtgg tggtgcgcca cggcgtgccg 300 gcggagacgg tggcgcgggc gctggaggcg cagagggcct tcttcgcgct gcccgcggac 360 cggaaggcgg ccgtgcggag ggacgaggcg 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gggtgccgga gacgcacgcc 300 tggccggggc tgcacgacca ccccgtcgtg gacggcggcg cgccggggcc agacgccgtc 360 cccgtggtgg acctcgcggg ggcggcggac gagccgagag ccgcggtggt ggcccaagtg 420 gcgcgcgccg ccgagcaatg gggcgcgttc ctgctcacgg ggcacggcgt ccccgcggag 480 ctgctggcgc gcgtcgagga ccggatcgcc accatgttcg cgctgccagc ggacgacaag 540 atgcgcgccg tgcgcgggcc tggcgacgcc tgcggctacg gctccccgcc catctcctcc 600 ttcttctcca agtgcatgtg gtcggaggga tacaccttct cgccggccaa cctccgcgcc 660 gacctccgca agctctggcc taaggccggc gacgactaca ccagcttctg tgatgtgatg 720 gaggagttcc acaagcacat gcgtgccctc gcggacaagc tgctggagct gttcctcatg 780 gcgctggggc tcaccgacga gcaggtcggc ggcgtggagg cggagcggag gatcgccgag 840 acgatgaccg ccaccatgca cctcaactgg taccctcggt gcccggaccc gcgccgcgcg 900 ctggggctga tcgcgcacac cgactcgggc ttcttcacct tcgtgctgca gagcctcgtc 960 ccggggctgc agctcttccg ccacgccccg gaccggtggg tggcggtgcc ggcggtaccg 1020 ggcgccttcg tcgtcaacgt gggcgacctc ttccacatcc tcaccaacgg ccggttccac 1080 agcgtgtacc accgcgccgt cgtgaaccgg gacctcgaca ggatatctct cggctacttc 1140 ctcggcccgc cgccgcacgc caaggtggcg ccgctaaggg aggccgtgcc gcccggccgc 1200 acccccgcgt accgcgccgt cacgtggccc gagtacatgg gcgtccgcaa gaaggccttc 1260 accaccggcg catccgcgct caagatggtc gccctcgccg ccgccgccgc cgccgccgac 1320 ctcgacgatg acgccggtgc tggcgccgcc gccgaacctg tcgtccatca gcagctactc 1380 gtctcgtcgt agccgatcga tcgccggatc ggtcgagact gatgatgatg atgcatatat 1440 actcgtcgat ggagtagaca gactaatcaa gcaaccctga aactatgaat gcatgcgtgc 1500 gcttcgtgct tgcttgcgca tgcagctagc aggcttcatt ccgttccgca gctgctctgc 1560 tccaacctgc tctgctggat tgatgtatat ggtagaagaa ttaagagatc gatggatgac 1620 ggaggaagaa gaagacgaag acgacgatga ggaaaaggac acgctgtacg tagctggttc 1680 ttctagtcta gtttacagca ggccgggcgg ccggctgctg cttccaatcg agtttgtcgt 1740 tactgacgat tgttagtgga tcgattaact aatctggaat tctggattat taatataatg 1800 catgtggttt ggcatctggc gtaaagcagg taatggtacc tagccagtag ccagtagcca 1860 ggctggtcaa tgataggtct ataccctgat cctgtactgt tgtttctttc ggtctttctg 1920 agagagaaaa aaaacgaata tatggcgtac tcaattcatc aaa 1963 <210> 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tctagttgcg caggccgctc ccagtcgagt ttgtcgttac 1560 tgacgattat tactctgatg aaaactaatc tgaattaatg catgtagttt ggcaatttgg 1620 tactaaaggt aggcacctag ccaggctggt caatgatagg tctataacct gatcctgttc 1680 tctgttgttt tcctttgtct gagaaaaaat ggaaataatt gatccggccg gacgggtgta 1740 ctgataggtg atgctgaatt gctgatgcaa gaggttgcga gctgcagtga gcagca 1796 <210> 124 <211> 1149 <212> DNA <213> Setaria italica <400> 124 atgccgacgc cgtcgcacct caagaacccg ctctacttcg acttccgcgc cgcgcggcgg 60 gtgccggagt cccacgcctg gccggggctc gacgaccacc ccgtggtgga cggcggcggc 120 gcgccggggt ccccggacgc cgtgccggtg gtggacctgc gcgagccggg cgccgcggcg 180 gtggcccgcg tggcgcgcgc cgccgagcag tggggcgcgt tcctgctcac cggccacggc 240 gtccccgcgg agctcctggc gcgcgtcgag gaccgcgtcg cgtgcatgtt cgcgctgccg 300 gccgccgaca agatgcgcgc cgtgcgcggg ccgggggacg cctgcggcta cggctcgccg 360 cccatctcct ccttcttctc caagtgcatg tggtccgagg gctacacctt ctcgccggcc 420 tccctccgcc gcgacctccg caagctctgg cccaaggccg gcgacgacta cgacagcttc 480 tgtgacgtga tggaggagtt ccacaaggag atgcgcgccc 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Thr Asp Asp Ala Ala Asp Val Leu Pro Asp Val Leu Ser 355 360 365 Ser <210> 134 <211> 1653 <212> DNA <213> Triticum aestivum <220> <221> misc_feature <222> (1594)..(1600) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1641) <223> n is a, c, g, or t <400> 134 cacgagatcc atccgtctcc accattgctc gctagctcga gctcctagct agtactgcaa 60 agtcagccgg ggagttgatt tggtccttct tggcttgacc gatcgtacgt gccgccagga 120 tgccgacgcc ggcgcacctg agcaaggacc cgcgctactt cgacttccgg gcggcgcggc 180 gggtgccgga gacgcacgcg tggcccgggc tgcacgacca ccccgtggtg gacggcagcg 240 gcgcgggcgg agggccggac gcggtgccgg tggtggacat gcgcgacccg tgcgcggcgg 300 aggcggtggc gctggcggcg caggactggg gcgccttcct cctggagggc cacggcgtcc 360 cgttggagct gctggcgcgc gtggaggccg cgatcgcggg catgttcgcg ctgccggcgt 420 cggagaagat gcgcgccgtg cggcggcccg gcgactcgtg cggctacggg tcgccgccca 480 tctcctcctt cttctccaag tgcatgtggt ccgagggcta caccttctcc ccggccaacc 540 tccgctccga cctccgcaag ctctggccca aggccggcca cgactaccgc cacttctgcg 600 ccgtgatgga ggagttccac agggagatgc gcgcgctggc cgacaagctg ctggagctgt 660 tcctggtggc cctcgggctc accggcgagc aggtcgccgc cgtcgagtcc gagcagaaga 720 tcgccgagac catgaccgcc acaatgcacc tcaactggta ccccaagtgc ccggacccga 780 agcgggcgct gggcctgatc gcgcacacgg actcgggctt cttcaccttc gtgctgcaga 840 gccttgtgcc cgggctgcag ctgttccggc acggccccga ccggtgggtg acggtgcccg 900 ccgtgccggg ggccatggtc gtcaacgtcg gcgacctctt ccagatcctc accaacggcc 960 gcttccacag cgtctaccac cgcgccgtcg tcaaccgcga cagcgaccgg atatcgctcg 1020 gctacttcct cggcccgccc gcccacgtca aggtggcgcc gctcagggag gccctggccg 1080 gcacgcccgc cgcctaccgc gccgtcacgt ggcccgagta catgggcgtg cgcaagaagg 1140 ccttcaccac cggcgcctcc gcgctcaaga tggtcgccat ctccactgac aacgacgccg 1200 ccaaccacac ggacgacctg atctcgtcgt agatcggcgc cggccatcac cggccggcca 1260 agggatcgat ctacacacac aattagtgaa caaaaaaatg ccagagatgg tgcatggtgg 1320 gctggtagct tagctgaggt agctaggagg aagagcgcgc gtgcggctgt cgttcgtgcg 1380 gctgttcccg caaaaaaaaa aaaggtttcc tccatatatg tctccatgca gaactgcaga 1440 tgctggtggt ggatgcgtcc atgcagcagg gaacgaacta 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cacaatgcac ctcaactggt accccaagtg cccggacccg 660 aagcgggcgc tgggcctgat cgcgcacacg gactcgggct tcttcacctt cgtgctgcag 720 agccttgtgc ccgggctgca gctgttccgg cacggccccg accggtgggt gacggtgccc 780 gccgtgccgg gggccatggt cgtcaacgtc ggcgacctct tccagatcct caccaacggc 840 cgcttccaca gcgtctacca ccgcgccgtc gtcaaccgcg acagcgaccg gatatcgctc 900 ggctacttcc tcggcccgcc cgcccacgtc aaggtggcgc cgctcaggga ggccctggcc 960 ggcacgcccg ccgcctaccg cgccgtcacg tggcccgagt acatgggcgt gcgcaagaag 1020 gccttcacca ccggcgcctc cgcgctcaag atggtcgcca tctccactga caacgacgcc 1080 gccaaccaca cggacgacct gatctcgtcg tag 1113 <210> 136 <211> 370 <212> PRT <213> Triticum aestivum <400> 136 Met Pro Thr Pro Ala His Leu Ser Lys Asp Pro Arg Tyr Phe Asp Phe 1 5 10 15 Arg Ala Ala Arg Arg Val Pro Glu Thr His Ala Trp Pro Gly Leu His 20 25 30 Asp His Pro Val Val Asp Gly Ser Gly Ala Gly Gly Gly Pro Asp Ala 35 40 45 Val Pro Val Val Asp Met Arg Asp Pro Cys Ala Ala Glu Ala Val Ala 50 55 60 Leu Ala Ala Gln Asp Trp Gly Ala Phe Leu Leu Glu Gly His Gly Val 65 70 75 80 Pro Leu Glu Leu Leu Ala Arg Val Glu Ala Ala Ile Ala Gly Met Phe 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Ser Glu Lys Met Arg Ala Val Arg Arg Pro Gly Asp 100 105 110 Ser Cys Gly Tyr Gly Ser Pro Pro Ile Ser Ser Phe Phe Ser Lys Cys 115 120 125 Met Trp Ser Glu Gly Tyr Thr Phe Ser Pro Ala Asn Leu Arg Ser Asp 130 135 140 Leu Arg Lys Leu Trp Pro Lys Ala Gly His Asp Tyr Arg His Phe Cys 145 150 155 160 Ala Val Met Glu Glu Phe His Arg Glu Met Arg Ala Leu Ala Asp Lys 165 170 175 Leu Leu Glu Leu Phe Leu Val Ala Leu Gly Leu Thr Gly Glu Gln Val 180 185 190 Ala Ala Val Glu Ser Glu Gln Lys Ile Ala Glu Thr Met Thr Ala Thr 195 200 205 Met His Leu Asn Trp Tyr Pro Lys Cys Pro Asp Pro Lys Arg Ala Leu 210 215 220 Gly Leu Ile Ala His Thr Asp Ser Gly Phe Phe Thr Phe Val Leu Gln 225 230 235 240 Ser Leu Val Pro Gly Leu Gln Leu Phe Arg His Gly Pro Asp Arg Trp 245 250 255 Val Thr Val Pro Ala Val Pro Gly Ala Met Val Val Asn Val Gly Asp 260 265 270 Leu Phe Gln Ile Leu Thr Asn Gly Arg Phe His Ser Val Tyr His Arg 275 280 285 Ala Val Val Asn Arg Asp Ser Asp Arg Ile Ser Leu Gly Tyr Phe Leu 290 295 300 Gly Pro Pro Ala His Val Lys Val Ala Pro Leu Arg Glu Ala Leu Ala 305 310 315 320 Gly Thr Pro Ala Ala Tyr Arg Ala Val Thr Trp Pro Glu Tyr Met Gly 325 330 335 Val Arg Lys Lys Ala Phe Thr Thr Gly Ala Ser Ala Leu Lys Met Val 340 345 350 Ala Ile Ser Thr Asp Asn Asp Ala Ala Asn His Thr Asp Asp Leu Ile 355 360 365 Ser Ser 370 <210> 137 <211> 1884 <212> DNA <213> Triticum aestivum <400> 137 tatatataca gctccttgta cttctctcgt tcttacactc actcctcaat ccatccgtct 60 ccaccattgc tcgctagctc gagctcctag ctagtactgc aaagtcagcc ggggagttga 120 tttggtcctt cttggcttga ccgatcgtac gtgccgccag gatgccgacg ccggcgcacc 180 tgagcaagga cccgcgctac ttcgacttcc gggcggcgcg gcgggtgccg gagacgcacg 240 cgtggcccgg gctgcacgac caccccgtgg tggacggcag cggcgcgggc ggagggccgg 300 acgcggtgcc ggtggtggac atgcgcgacc cgtgcgcggc ggaggcggtg gcgctggcgg 360 cgcaggactg gggcgccttc ctcctggagg gccacggcgt cccgttggag ctgctggcgc 420 gcgtggaggc cgcgatcgcg ggcatgttcg cgctgccggc gtcggagaag atgcgcgccg 480 tgcggcggcc cggcgactcg tgcggctacg ggtcgccgcc catctcctcc ttcttctcca 540 agtgcatgtg gtccgagggc tacaccttct ccccggccaa cctccgctcc gacctccgca 600 agctctggcc caaggccggc cacgactacc gccacttctg gtacgtacgc cggccgccga 660 tgcgcatata cacgtcatag tacggcacct acctaactgg ctctggccaa ccgtccgtac 720 acacgtgaag gggcgacgtg tccgactccg accatgcatg catgcacgcg cgcgaaactt 780 gttactcctg ttctgctatg gcagcagcta gccgcgtgtg tccgttcgta ggagtagtta 840 cttacacagt tacacttacg ccgtccgtcg tgttcctcga cgtgcagcgc cgtgatggag 900 gagttccaca gggagatgcg cgcgctggcc gacaagctgc tggagctgtt cctggtggcc 960 ctcgggctca ccggcgagca ggtcgccgcc gtcgagtccg agcagaagat cgccgagacc 1020 atgaccgcca caatgcacct caactggtac gttccactac tactccagta gtacaagtac 1080 aatatataga atacaaatgg cagcagccac gacgacacgt actccaccat gcagcaaagc 1140 atatattgtc ggtgcggcgg ttgacacgga gttgtgtcgt gtcgttgatt cacaggtacc 1200 ccaagtgccc ggacccgaag cgggcgctgg gcctgatcgc gcacacggac tcgggcttct 1260 tcaccttcgt gctgcagagc cttgtgcccg ggctgcagct gttccggcac ggccccgacc 1320 ggtgggtgac ggtgcccgcc gtgccggggg ccatggtcgt caacgtcggc gacctcttcc 1380 agatcctcac caacggccgc ttccacagcg tctaccaccg cgccgtcgtc aaccgcgaca 1440 gcgaccggat atcgctcggc tacttcctcg gcccgcccgc ccacgtcaag gtggcgccgc 1500 tcagggaggc cctggccggc acgcccgccg cctaccgcgc cgtcacgtgg cccgagtaca 1560 tgggcgtgcg caagaaggcc ttcaccaccg gcgcctccgc gctcaagatg gtcgccatct 1620 ccactgacaa cgacgccgcc aaccacacgg acgacctgat ctcgtcgtag atcggcgccg 1680 gccatcaccg gccggccaag ggatcgatct acacacacaa ttagtgaaca aaaaaatgcc 1740 agagatggtg catggtgggc tggtagctta gctgaggtag ctaggaggaa gagcgcgcgt 1800 gcggctgtcg ttcgtgcggc tgttcccgca aaaaaaaaaa ggtttcctcc atatakgtcc 1860 ccakscaaaa tsgmaawgct gggg 1884 <210> 138 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> suppression oligo <400> 138 acggguucuu ccaggugugc 20 <210> 139 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> suppression oligo <400> 139 cacggguucu uccaggugug 20 <210> 140 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> suppression oligo <400> 140 cauugaccuc cccgcuggca 20 <210> 141 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> suppression oligo <400> 141 ccagcgggga ggucaaugcu 20 <210> 142 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> suppression oligo <400> 142 cccagcauug accuccccgc 20 <210> 143 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> suppression oligo <400> 143 cgcgcucgug uacccggaca 20 <210> 144 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> suppression oligo <400> 144 cucccggcgc aggucgaaca 20 <210> 145 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> suppression oligo <400> 145 guguacccgg acacggugcc 20 <210> 146 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> suppression oligo <400> 146 ugcagggaag cuguccgggc 20 <210> 147 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> suppression oligo <400> 147 uucuuccagg ugugcgggca 20 <210> 148 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> suppression oligo <400> 148 agauccccgc gccauuccug 20 <210> 149 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> suppression oligo <400> 149 augcagggaa gcuguccggg 20 <210> 150 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> suppression oligo <400> 150 auuccugugg ccgcaggaag 20 <210> 151 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> suppression oligo <400> 151 cagcggggag gucaaugcug 20 <210> 152 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> suppression oligo <400> 152 caggaauggc gcggggaucu 20 <210> 153 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> suppression oligo <400> 153 gacuacuucg ucggcacccu 20 <210> 154 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> suppression oligo <400> 154 gccaggauuu cgagccaaug 20 <210> 155 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> suppression oligo <400> 155 ggaacauuug gagggaggcg 20 <210> 156 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> suppression oligo <400> 156 gggaggucaa ugcuggggcu 20 <210> 157 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> suppression oligo <400> 157 uuggcucgaa auccuggccg 20 <210> 158 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> suppression oligo <400> 158 acggguucuu ccaggugugc 20 <210> 159 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> suppression oligo <400> 159 cacggguucu uccaggugug 20 <210> 160 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> suppression oligo <400> 160 cauugaccuc cccgcuggca 20 <210> 161 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> suppression oligo <400> 161 ccagcgggga ggucaaugcu 20 <210> 162 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> suppression oligo <400> 162 cccagcauug accuccccgc 20 <210> 163 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> suppression oligo <400> 163 cgcgcucgug uacccggaca 20 <210> 164 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> suppression oligo <400> 164 cucccggcgc aggucgaaca 20 <210> 165 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> suppression oligo <400> 165 guguacccgg acacggugcc 20 <210> 166 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> suppression oligo <400> 166 ugcagggaag cuguccgggc 20 <210> 167 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> suppression oligo <400> 167 uucuuccagg ugugcgggca 20

Claims (86)

  1. 비-코딩 RNA 분자를 인코딩하는 전사가능한 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 작제물로서,
    상기 비-코딩 RNA 분자가 내인성 지베렐린(GA) 옥시다제 단백질을 옥수수 식물에서 인코딩하는 mRNA 분자의 적어도 19 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 90% 상보적인 표적화 서열을 포함하고, 상기 내인성 GA 옥시다제 단백질은 서열번호: 12, 30 및 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 것이며,
    상기 전사가능한 DNA 서열이 식물-발현성 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 및
    상기 비-코딩 RNA 분자가 이식유전자성 옥수수 식물에서 발현된 경우, 비-코딩 RNA 분자가 재조합 DNA 작제물을 포함하는 이식유전자성 옥수수 식물의 적어도 하나의 조직에서 mRNA 분자의 발현 수준을 대조군 식물에 비하여 감소시키는 것인, 재조합 DNA 작제물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 비-코딩 RNA 분자가 서열번호: 10, 11, 28, 29, 31 및 32로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열의 적어도 19 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 90% 상보적인 서열을 포함하는 것인, 재조합 DNA 작제물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 비-코딩 RNA 분자가 mRNA 분자의 적어도 21 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 90% 상보적인 서열을 포함하는 것인, 재조합 DNA 작제물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 비-코딩 RNA 분자가 서열번호: 10, 11, 28, 29, 31 및 32로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열의 적어도 21 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 90% 상보적인 서열을 포함하는 것인, 재조합 DNA 작제물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 비-코딩 RNA 분자가 mRNA 분자의 적어도 19 연속적인 뉴클레오타이드에 100% 상보적인 서열을 포함하는 것인, 재조합 DNA 작제물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 비-코딩 RNA 분자가 서열번호: 10, 11, 28, 29, 31 및 32로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열의 적어도 19 연속적인 뉴클레오타이드에 적어도 100% 상보적인 서열을 포함하는 것인, 재조합 DNA 작제물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 비-코딩 RNA 분자가 mRNA 분자의 적어도 21 연속적인 뉴클레오타이드에 100% 상보적인 서열을 포함하는 것인, 재조합 DNA 작제물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 비-코딩 RNA 분자가 서열번호: 10, 11, 28, 29, 31 및 32로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열의 적어도 21 연속적인 뉴클레오타이드에 100% 상보적인 서열을 포함하는 것인, 재조합 DNA 작제물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 내인성 GA 옥시다제 단백질은 서열번호: 12, 30 및 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 95% 동일한 것인, 재조합 DNA 작제물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 내인성 GA 옥시다제 단백질은 서열번호: 12, 30 및 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 100% 동일한 것인, 재조합 DNA 작제물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 식물-발현성 프로모터가 관속 프로모터인, 재조합 DNA 작제물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 관속 프로모터가 하기 중 하나를 포함하는 것인, 재조합 DNA 작제물: 수크로스 합성효소 프로모터, 수크로스 수송체 프로모터, Sh1 프로모터, 코멜리나 옐로우 반상 바이러스 (CoYMV) 프로모터, 밀 왜소 제미니바이러스 (WDV) 큰 유전자간 영역 (LIR) 프로모터, 옥수수 줄무늬 제미니바이러스 (MSV) 코트 단백질 (CP) 프로모터, 쌀 옐로우 스트라이프 1 (YS1)-유사 프로모터, 또는 쌀 옐로우 스트라이프 2 (OsYSL2) 프로모터.
  13. 제11항에 있어서, 상기 관속 프로모터가 서열번호: 67, 서열번호: 68, 서열번호: 69, 서열번호: 70 및 서열번호: 71로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함하는 것인, 재조합 DNA 작제물.
  14. 제1항에 있어서, 상기 식물-발현성 프로모터가 잎 프로모터인, 재조합 DNA 작제물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 잎 프로모터가 하기 중 하나를 포함하는, 재조합 DNA 작제물: RuBisCO 프로모터, PPDK 프로모터, FDA 프로모터, Nadh-Gogat 프로모터, 클로로필 a/b 결합 단백질 유전자 프로모터, 포스포에놀피루베이트 카복실라제 (PEPC) 프로모터, 또는 Myb 유전자 프로모터.
  16. 제14항에 있어서, 상기 잎 프로모터가 서열번호: 72, 서열번호: 73 및 서열번호: 74로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함하는 것인, 재조합 DNA 작제물.
  17. 제1항에 있어서, 상기 식물-발현성 프로모터가 항시성 프로모터인, 재조합 DNA 작제물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 항시성 프로모터가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 재조합 DNA 작제물: 액틴 프로모터, CaMV 35S 또는 19S 프로모터, 식물 유비퀴틴 프로모터, 식물 Gos2 프로모터, FMV 프로모터, CMV 프로모터, MMV 프로모터, PCLSV 프로모터, Emu 프로모터, 튜불린 프로모터, 노팔라인 합성효소 프로모터, 옥토핀 합성효소 프로모터, 만노핀 합성효소 프로모터, 또는 옥수수 알코올 탈수소효소.
  19. 제17항에 있어서, 상기 항시성 프로모터가 서열번호: 75, 서열번호: 76, 서열번호: 77, 서열번호: 78, 서열번호: 79, 서열번호: 80, 서열번호: 81, 서열번호: 82, 및 서열번호: 83로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함하는 것인, 재조합 DNA 작제물.
  20. 제1항에 있어서, 상기 전사가능한 DNA 서열에 의해 인코딩된 상기 비-코딩 RNA 분자가 성숙한 miRNA 또는 siRNA를 형성하기 위해 식물 세포에서 가공 또는 절단되는 전구체 miRNA 또는 siRNA인 것인, 재조합 DNA 작제물.
  21. 제1항에 있어서, 상기 식물-발현성 프로모터가 쌀 퉁그로 바실리폼 바이러스 (RTBV) 프로모터인 것인, 재조합 DNA 작제물.
  22. 제21항에 있어서, 상기 RTBV 프로모터가 서열번호: 65 및 서열번호: 66으로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함하는 것인, 재조합 DNA 작제물.
  23. 제1항에 있어서, 상기 비-코딩 RNA 분자가 이식유전자성 옥수수 식물에서 발현될 경우, 비-코딩 RNA 분자가 이식유전자성 옥수수 식물에서 내인성 GA 옥시다제 단백질의 발현을 대조군 식물에 비교하여 하향-조절하는 것인, 재조합 DNA 작제물.
  24. 제1항 내지 제8항 또는 제11항 내지 제23항 중 어느 한 항의 재조합 DNA 작제물을 포함하는, 이식유전자성 옥수수 식물.
  25. 제24항에 있어서, 상기 이식유전자성 옥수수 식물이 대조군 식물에 비하여 하기 특성 중 하나 이상을 갖는, 이식유전자성 옥수수 식물: 더 짧은 식물 높이, 증가된 자루/줄기 직경, 향상된 도복 저항성, 감소된 녹색 스냅, 더 깊은 뿌리, 증가된 잎 면적, 더 이른 캐노피 폐쇄, 더 높은 기공 유통성, 더 낮은 이삭 높이, 증가된 잎 수분 함량, 향상된 가뭄 내성, 향상된 질소 사용 효율, 정상 또는 질소-제한 또는 수-제한 스트레스 상태 하에서 잎내 감소된 안토시아닌 함량 및 면적, 증가된 이삭 중량, 증가된 수확 지수, 증가된 수확량, 증가된 종자 수, 증가된 종자 중량, 또는 증가된 다작성.
  26. 제24항에 있어서, 하나 이상의 줄기 마디간에서 상기 이식유전자성 옥수수 식물의 자루 또는 줄기 직경이 야생형 대조군 식물의 동일한 하나 이상의 마디간에서 자루 또는 줄기 직경보다 적어도 5% 더 큰, 이식유전자성 옥수수 식물.
  27. 제24항에 있어서, 이삭 아래 제1, 제2, 제3, 또는 제4 마디간 중 하나 이상에서 상기 이식유전자성 옥수수 식물의 자루 또는 줄기 직경이 야생형 대조군 식물의 동일한 마디간보다 적어도 5% 더 큰, 이식유전자성 옥수수 식물.
  28. 제24항에 있어서, 상기 이식유전자성 옥수수 식물의 줄기 또는 자루의 적어도 하나의 마디간 조직에서 하나 이상의 활성 GA의 수준이 야생형 대조군 식물의 동일한 마디간 조직보다 더 낮은, 이식유전자성 옥수수 식물.
  29. 제24항에 있어서, 상기 이식유전자성 옥수수 식물의 줄기 또는 자루의 적어도 하나의 마디간 조직에서 하나 이상의 활성 GA의 수준이 야생형 대조군 식물의 동일한 마디간 조직보다 적어도 5% 더 낮은, 이식유전자성 옥수수 식물.
  30. 제24항에 있어서, 상기 이식유전자성 옥수수 식물이 적어도 하나의 자성 기관 또는 이삭에서 오프-유형을 갖지 않는 것인, 이식유전자성 옥수수 식물.
  31. 제24항에 있어서, 상기 이식유전자성 옥수수 식물이 대조군 식물에 비하여 더 짧은 식물 높이를 갖는, 이식유전자성 옥수수 식물.
  32. 제24항에 있어서, 상기 이식유전자성 옥수수 식물의 높이가 야생형 대조군 식물보다 적어도 10% 더 짧은, 이식유전자성 옥수수 식물.
  33. 제24항에 있어서, 상기 이식유전자성 옥수수 식물의 높이가 대조군 식물보다 적어도 20% 더 짧은, 이식유전자성 옥수수 식물.
  34. 제24항에 있어서, 상기 이식유전자성 옥수수 식물의 높이가 대조군 식물보다 적어도 30% 더 짧은, 이식유전자성 옥수수 식물.
  35. 제24항에 있어서, 상기 이식유전자성 옥수수 식물의 높이가 대조군 식물보다 적어도 40% 더 짧은, 이식유전자성 옥수수 식물.
  36. 제24항에 있어서, 상기 이식유전자성 옥수수 식물이 대조군 식물에 비하여 더 깊은 뿌리를 갖는, 이식유전자성 옥수수 식물.
  37. 제24항에 있어서, 하나 이상의 줄기 마디간에서 상기 이식유전자성 옥수수 식물의 자루 또는 줄기 직경이 대조군 식물의 동일한 하나 이상의 마디간에서 자루 또는 줄기 직경보다 더 큰, 이식유전자성 옥수수 식물.
  38. 제24항에 있어서, 상기 재조합 DNA 작제물이 상기 이식유전자성 옥수수 식물의 게놈에 안정적으로 통합된, 이식유전자성 옥수수 식물.
  39. 제24항에 있어서, 상기 내인성 GA 옥시다제 단백질은 서열번호: 12, 30 및 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 95% 동일한 것인, 이식유전자성 옥수수 식물.
  40. 제24항에 있어서, 상기 내인성 GA 옥시다제 단백질은 서열번호: 12, 30 및 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 100% 동일한 것인, 이식유전자성 옥수수 식물.
  41. 제1항 내지 제8항 또는 제11항 내지 제23항 중 어느 한 항의 재조합 DNA 작제물을 포함하는, 이식유전자성 옥수수 식물 일부.
  42. 제41항에 있어서, 상기 내인성 GA 옥시다제 단백질은 서열번호: 12, 30 및 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 95% 동일한 것인, 이식유전자성 옥수수 식물 일부.
  43. 제41항에 있어서, 상기 내인성 GA 옥시다제 단백질은 서열번호: 12, 30 및 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 100% 동일한 것인, 이식유전자성 옥수수 식물 일부.
  44. 제41항에 있어서, 상기 재조합 DNA 작제물이 상기 이식유전자성 옥수수 식물의 게놈에 안정적으로 통합된, 이식유전자성 옥수수 식물 일부.
  45. 제1항 내지 제8항 또는 제11항 내지 제23항 중 어느 한 항의 재조합 DNA 작제물을 포함하는, 이식유전자성 옥수수 식물 세포.
  46. 제45항에 있어서, 상기 내인성 GA 옥시다제 단백질은 서열번호: 12, 30 및 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 95% 동일한 것인, 이식유전자성 옥수수 식물 세포.
  47. 제45항에 있어서, 상기 내인성 GA 옥시다제 단백질은 서열번호: 12, 30 및 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 100% 동일한 것인, 이식유전자성 옥수수 식물 세포.
  48. 제45항에 있어서, 상기 재조합 DNA 작제물이 상기 이식유전자성 옥수수 식물의 게놈에 안정적으로 통합된, 이식유전자성 옥수수 식물 세포.
  49. 하기 단계를 포함하는, 이식유전자성 옥수수 식물의 생산 방법:
    (a) 외식편의 적어도 하나의 세포를 제1항 내지 제8항 또는 제11항 내지 제23항 중 어느 한 항의 재조합 DNA 작제물로 형질전환시키는 단계, 및
    (b) 단계 (a)에서 형질전환된 외식편의 적어도 하나의 세포로부터 이식유전자성 옥수수 식물을 재생 또는 발생시키는 단계.
  50. 제49항에 있어서, 상기 외식편의 적어도 하나의 세포가 아그로박테리움 매개된 형질전환 또는 리조비움-매개된 형질전환을 통해 형질전환되는 것인, 방법.
  51. 제49항에 있어서, 상기 외식편의 적어도 하나의 세포가 미세투사물-매개된 형질전환 또는 입자 폭격-매개된 형질전환을 통해 형질전환되는 것인, 방법.
  52. 제49항에 있어서, 상기 내인성 GA 옥시다제 단백질은 서열번호: 12, 30 및 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 95% 동일한 것인, 방법.
  53. 제49항에 있어서, 상기 내인성 GA 옥시다제 단백질은 서열번호: 12, 30 및 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 100% 동일한 것인, 방법.
  54. 제49항에 있어서, 상기 재조합 DNA 작제물이 상기 이식유전자성 옥수수 식물의 게놈에 안정적으로 통합되는 것인, 방법.
  55. 제49항에 있어서, 상기 외식편의 적어도 하나의 세포가 외식편의 적어도 하나의 세포의 게놈으로의 재조합 DNA 작제물의 부위-지향적 통합을 통해 형질전환되는 것인, 방법.
  56. 제55항에 있어서, 상기 재조합 DNA 작제물의 부위-지향적 통합이 부위-특이적 뉴클레아제의 사용을 포함하는 것인, 방법.
  57. 제56항에 있어서, 상기 부위-특이적 뉴클레아제가 아연-핑거 뉴클레아제, 조작된 메가뉴클레아제, 고유 메가뉴클레아제, TALE-엔도뉴클레아제 및 RNA-유도된 엔도뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  58. 제56항에 있어서, 상기 재조합 DNA 작제물의 부위-지향적 통합이 RNA-유도된 엔도뉴클레아제 및 적어도 하나의 가이드 RNA의 사용을 포함하는 것인, 방법.
  59. 제57항에 있어서, 상기 RNA-유도된 엔도뉴클레아제가 Cas9 및 Cpf1로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  60. 제58항에 있어서, 상기 RNA-유도된 엔도뉴클레아제가 Cas9 및 Cpf1로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  61. 제57항에 있어서, 상기 RNA-유도된 엔도뉴클레아제가 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9, Cas10, Csyl, Csy2, Csy3, Csel, Cse2, Cscl, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmrl, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csbl, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, Cpf1, CasX 및 CasY로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  62. 제58항에 있어서, 상기 RNA-유도된 엔도뉴클레아제가 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9, Cas10, Csyl, Csy2, Csy3, Csel, Cse2, Cscl, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmrl, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csbl, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, Cpf1, CasX 및 CasY로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  63. 옥수수 외식편의 적어도 하나의 세포를 제1항 내지 제8항 또는 제11항 내지 제23항 중 어느 한 항의 재조합 DNA 작제물로 형질전환시키는 단계를 포함하는, 이식유전자성 옥수수 외식편의 생산 방법.
  64. 제63항에 있어서, 상기 내인성 GA 옥시다제 단백질은 서열번호: 12, 30 및 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 95% 동일한 것인, 방법.
  65. 제63항에 있어서, 상기 내인성 GA 옥시다제 단백질은 서열번호: 12, 30 및 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 100% 동일한 것인, 방법.
  66. 제63항에 있어서, 상기 재조합 DNA 작제물이 상기 이식유전자성 옥수수 식물의 게놈에 안정적으로 통합되는 것인, 방법.
  67. 제63항에 있어서, 상기 옥수수 외식편의 적어도 하나의 세포가 미세투사물-매개된 형질전환 또는 입자 폭격-매개된 형질전환을 통해 형질전환되는 것인, 방법.
  68. 제63항에 있어서, 상기 옥수수 외식편의 적어도 하나의 세포가 아그로박테리움 매개된 형질전환 또는 리조비움-매개된 형질전환을 통해 형질전환되는 것인, 방법.
  69. 제63항에 있어서, 상기 옥수수 외식편의 적어도 하나의 세포가 옥수수 외식편의 적어도 하나의 세포의 게놈으로의 재조합 DNA 작제물의 부위-지향적 통합을 통해 형질전환되는 것인, 방법.
  70. 제69항에 있어서, 상기 재조합 DNA 작제물의 부위-지향적 통합이 부위-특이적 뉴클레아제의 사용을 포함하는 것인, 방법.
  71. 제70항에 있어서, 상기 부위-특이적 뉴클레아제가 아연-핑거 뉴클레아제, 조작된 메가뉴클레아제, 고유 메가뉴클레아제, TALE-엔도뉴클레아제 및 RNA-유도된 엔도뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  72. 제70항에 있어서, 상기 재조합 DNA 작제물의 부위-지향적 통합이 RNA-유도된 엔도뉴클레아제 및 적어도 하나의 가이드 RNA의 사용을 포함하는 것인, 방법.
  73. 제71항에 있어서, 상기 RNA-유도된 엔도뉴클레아제가 Cas9 및 Cpf1로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  74. 제72항에 있어서, 상기 RNA-유도된 엔도뉴클레아제가 Cas9 및 Cpf1로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  75. 제71항에 있어서, 상기 RNA-유도된 엔도뉴클레아제가 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9, Cas10, Csyl, Csy2, Csy3, Csel, Cse2, Cscl, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmrl, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csbl, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, Cpf1, CasX 및 CasY로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  76. 제72항에 있어서, 상기 RNA-유도된 엔도뉴클레아제가 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9, Cas10, Csyl, Csy2, Csy3, Csel, Cse2, Cscl, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmrl, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csbl, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, Cpf1, CasX 및 CasY로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  77. 제1항 내지 제8항 또는 제11항 내지 제23항 중 어느 한 항의 재조합 DNA 작제물을 포함하는, 형질전환 벡터.
  78. 제1항 내지 제8항 또는 제11항 내지 제23항 중 어느 한 항의 재조합 DNA 작제물을 포함하는, DNA 분자.
  79. 제24항의 이식유전자성 옥수수 식물로부터 제조된, 변형된 식물 생산물.
  80. 제42항의 이식유전자성 옥수수 식물 일부로부터 제조된, 변형된 식물 생산물.
  81. 제80항에 있어서, 이식유전자성 옥수수 식물 일부가 종자인, 변형된 식물 생산물.
  82. 제1항 내지 제8항 또는 제11항 내지 제23항 중 어느 한 항의 재조합 DNA 작제물을 포함하는, 변형된 식물 생산물.
  83. 제1항 내지 제8항 또는 제11항 내지 제23항 중 어느 한 항의 재조합 DNA 작제물을 포함하는, 조성물.
  84. 제1항 내지 제8항 또는 제11항 내지 제23항 중 어느 한 항의 재조합 DNA 작제물을 포함하는, 변형된 옥수수 원형질.
  85. 제1항 내지 제8항 또는 제11항 내지 제23항 중 어느 한 항의 재조합 DNA 작제물을 포함하는, 변형된 종자.
  86. 제41항에 있어서, 식물 일부가 종자인, 이식유전자성 옥수수 식물 일부.
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