BR112017002328B1 - Método para melhorar a absorção de nutrientes, a tolerância ao estresse abiótico e/ou o crescimento em plantas - Google Patents

Método para melhorar a absorção de nutrientes, a tolerância ao estresse abiótico e/ou o crescimento em plantas Download PDF

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Abstract

método para a modulação de processos fisiológicos e/ou patológicos em plantas e composição. a presente invenção refere-se a um método para modular processos de plantas, o referido método sendo caracterizado pelo fato de que uma planta é alimentada com uma composição bioestimulante, não prejudicial ao ambiente, derivada de plantas e/ou algas, compreendendo moléculas de rna pequenas exógenas. em particular, o método da invenção pode ser utilizado para modular processos de plantas fisiológicos ou patológicos, tais como crescimento de plantas, produtividade de plantas, qualidade de frutos, qualidade de produto, rendimento de plantas, resposta de plantas ao estresse abiótico e resistência de plantas a doenças ou a infecções.

Description

Campo técnico
[001] A presente invenção refere-se a um método para modulação de processos de plantas, o referido método sendo caracterizado pelo fato de que uma planta é alimentada com uma composição bioestimulante, não prejudicial ao ambiente, compreendendo moléculas de RNA pequenas exógenas derivadas de planta e/ou algas. Em particular, o método da invenção pode ser utilizado para modular os processos de plantas fisiológicos ou patológicos, tal crescimento de plantas, produtividade da planta, qualidade dos frutos, qualidade de produto, rendimento de planta, a resposta da planta ao estresse abiótico e a resistência das plantas às doenças ou infecções.
Estado da técnica
[002] Promover o crescimento das plantas e a produtividade é importante na agricultura. Hoje em dia, estes processos são principalmente controlados utilizando fertilizantes, substâncias de crescimento de plantas, tais como hormônios, modificações físicas do solo, etc.
[003] No entanto, o uso desses produtos agroquímicos resultou em muitas consequências ambientais de longo prazo, tais como o esgotamento de recursos, danos ambientais e efeitos na saúde.
[004] A fim de limitar o uso de insumos químicos ambientalmente perigosos, para aumentar o rendimento das culturas, e promover o crescimento de plantas e absorção de nutrientes, muitos esforços têm sido postos em direção ao desenvolvimento e à aplicação dos métodos ecologicamente corretos, com base em produtos naturais. Atualmente, em particular, bioestimulantes estão atraindo o interesse das comunidades de negócios e pesquisa em agricultura.
[005] Bioestimulantes são materiais, à exceção dos fertilizantes, que promovem o crescimento das plantas quando são aplicados em pequenas quantidades (Khan, et al 2009, JPlantGrowthRegul, 28: 386-399). De acordo com uma definição mais recente, bioestimulantes vegetais são substâncias e materiais, com a exceção de nutrientes e pesticidas, que, quando aplicados a plantas, sementes ou substratos de cultura em formulações específicas, têm a capacidade de modificar processos fisiológicos das plantas de uma forma que fornece benefícios potenciais para o crescimento, desenvolvimento e/ou resposta ao estresse (Du Jardin P 2012, The Science of bioestimulantes de plantas).
[006] O documento WO2009129596 divulga um processo para extração de compostos orgânicos bioativos a partir de extratos alcalinos de Ascophyllum nodosum. Os extratos de solventes orgânicos de A. nodosum, nomeadamente metanol, clorofórmio e acetato de etila, foram encontrados para aliviar o estresse induzido por sal nas plantas.
[007] O documento WO03000621 refere-se a hidrogéis frágeis, absorventes de água e semelhantes ao solo e utilizados para germinar, cultivar ou cultivar plantas compreendendo o fornecimento a uma planta.
[008] O documento WO2014113423 divulga um método para gerar plantas resistentes a fungos e / ou nemátodos, aplicando elementos silenciadores, em particular dsRNA, de PM R5 em superfícies de plantas, como raízes ou folhas.
[009] O documento US2014215656 divulga um método para gerar plantas resistentes a fungos com base na aplicação tópica de fragmentos de DNA ou RNA, como polinucleotídeos.
[010] O documento WO2013016201 divulga um método para diminuir a resistência da planta aos micróbios, o objetivo final é melhorar a nodulação da planta. Isso pode ser alcançado usando vários miRNAs.
[011] O documento US2011296556 divulga um método para tornar plantas suscetíveis a herbicidas aplicando topicamente oligômeros polinucleotídicos em plantas.
[012] O documento EP2468902 divulga uma nova planta de milho transgênica compreendendo o genótipo transgênico de MIR162 e métodos para produzir uma planta de milho cruzando uma planta de milho compreendendo o genótipo MIR162 consigo mesma ou com outra variedade de milho.
[013] O documento CN102899352 divulga o uso de oligonucleotídeo antissenso, visando, por exemplo, miR169 para regular o estresse das plantas, como o estresse de nutrientes nas plantas.
[014] Neste contexto, é um objetivo principal da presente invenção proporcionar um método não prejudicial ao ambiente para a modulação de processos de plantas fisiológicos ou patológicos, em particular, para melhorar o crescimento das plantas, a produtividade da planta, a qualidade dos frutos, a qualidade dos produtos, rendimento de planta, resposta da planta ao estresse abiótico e resistência das plantas a doenças ou infecções.
Descrição da invenção
[015] Em um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição bioestimulante derivada de plantas não prejudicial ao ambiente, de preferência um extrato de planta e/ou um exsudato de plantas, que compreende pequenas moléculas de RNA exógenas e a sua utilização para a modulação, em geral, em processos fisiológicos ou patológicos da planta, em que as moléculas de RNA pequenas exógenas são naturalmente derivadas de plantas ou de partes de plantas, tais como raízes, folhas, caule ou qualquer outra parte da planta.
[016] Alternativamente, a composição é derivada de algas e, por conseguinte, compreende moléculas de RNA pequenas exógenas naturalmente derivadas de algas.
[017] No contexto da presente invenção, "moléculas de RNA pequenas naturalmente derivadas de plantas/algas" significa que as moléculas são produzidas naturalmente pelas as referidas plantas/algas, ou que as moléculas utilizadas são idênticas às produzidas na natureza pelas referidas plantas/algas.
[018] Em algumas modalidades da invenção, a composição bioestimulante compreende moléculas de RNA pequenas exógenas, derivadas naturalmente de plantas ou partes de plantas e moléculas de RNA pequenas exógenas, derivadas naturalmente de algas.
[019] Portanto, é um objetivo da presente invenção um método para a modulação de processos de plantas fisiológicos e/ou patológicos que compreendem, pelo menos, uma etapa de alimentação de uma planta, também um crescimento da planta ou uma semente, com uma composição bioestimulante compreendendo pelo menos uma molécula de RNA pequena exógena naturalmente derivada de plantas ou partes de plantas e/ou, pelo menos, uma molécula de RNA pequena exógena naturalmente derivada de algas. Em particular, a composição da invenção pode ser utilizada para melhorar o crescimento das plantas, a produtividade da planta, a qualidade dos frutos, a qualidade dos produtos, rendimento de planta, a resposta da planta ao estresse abiótico e a resistência das plantas às doenças ou infecções.
[020] Uma composição bioestimulante de planta preferida compreende RNAs de cadeia simples e/ou de cadeia dupla aplicados exogenamente, tais como, microRNAs naturalmente derivados de plantas ou de partes de plantas.
[021] Uma outra composição bioestimulante de planta preferida compreende RNAs de cadeia simples e/ou de cadeia dupla aplicados exogenamente, tais como, microRNAs naturalmente derivados de algas.
[022] De preferência, as algas são macroalgas ou microalgas, mais preferencialmente são algas.
[023] Na verdade, a Requerente verificou inesperadamente que: 1) Moléculas de RNA pequenas, tais como miRNAs, são extremamente estáveis em extratos de plantas/exsudatos vegetais; 2) Moléculas de RNA pequenas, tais como miRNAs, são extremamente estáveis em extratos de algas/lisados de algas; 3) Ao alimentar as plantas a serem tratadas com as composições da presente invenção, os RNAs exógenos pequenos derivados de plantas (derivados de plantas externos e não produzidos pela própria planta tratada) são capazes de alcançar as células das plantas tratadas, e a modular diversos processos biológicos de interesse agrícola por meio da segmentação de gene mediada por um mecanismo de interferência de RNA ambiental; e 4) Pequenas moléculas de RNA extraídas de algas incluem as sequências que são altamente conservadas em plantas. Portanto, é muito plausível que moléculas de RNA pequenas derivadas de algas, de preferência miRNAs, quando utilizadas para alimentar uma planta a ser tratada, são capazes de modular processos biológicos de interesse agrícola através da segmentação de gene mediada por um mecanismo de interferência de RNA ambiental.
[024] Por conseguinte, através do enriquecimento das composições com pequenos RNAs derivados da planta específica exógena e/ou derivados de algas, é possível direcionar (e, portanto, modular) várias funções de genes específicos em plantas, tais como o crescimento e a produtividade de plantas, a fase de transição do juvenil para a planta, e a resposta das plantas ao estresse abiótico. Além disso, desta maneira, é possível aproveitar este uso, por exemplo, para aumentar o rendimento de plantas e de frutos e/ou qualidade das flores, para melhorar a absorção de nutrientes, ou a resistência das plantas à doença específica causada, por exemplo, por fungos, bactérias, vírus, ou infestação por insetos ou por nematoides.
[025] Vantajosamente, o método da presente invenção é não prejudicial ao ambiente e, portanto, mais seguro em comparação com os produtos agroquímicos, tais como reguladores do crescimento das plantas ou pesticidas, usados atualmente para a mesma finalidade. Breve descrição dos desenhos - A Figura 1 mostra a distribuição do comprimento da sequência de RNA pequeno de Ascophyllum nodosum. - A Figura 2 mostra as famílias de miRNA identificadas por comparação do mRNA identificado em Ascophyllum nodosum e os miRNAs conhecidos. - A Figura 3 mostra exemplos de miRNAs identificados no Ascophyllum nodosum e seu papel em plantas superiores. - A Figura 4 mostra a classificação de Ontologia de Gene (GO) dos alvos putativos dos miRNA identificados em Ascophyllum nodosum. - A Figura 5 mostra a análise de RT-PCR associada à detecção por PCR quantitativa de miR399d, pré-miR399d, e as sequências de mRNA de rRNA 40S e GAPDH realizadas no meio de crescimento externo de plantas de Arabidopsis cultivadas usando um meio hidropônico. - A Figura 6 mostra a estabilidade (à temperatura ambiente e a 4°C) a seguir à extração de miR399d de miRNAs em tampão de citrato a partir dos brotos (A) e das raízes (B) de Arabidopsis que superexpressam miR399d. - Figura 7 mostra o sistema de cultivo utilizado para verificar o efeito de miRNAs extraídos de plantas OE-miR399d (plantas com superexpressão de miR399d) quando exogenamente alimentado para as plantas de tipo selvagem. O cultivo 7A de plantas de tipo selvagem, o cultivo 7B de plantas OE-miR399d, e co-cultivo 7C de plantas do tipo selvagem e OE- miR399d. - A Figura 8 mostra a expressão de PHO2 em plantas de tipo selvagem (Col-O Cntr), em plantas OE-miR399d (35S::miR399d Cntr), em plantas de tipo selvagem co-cultivadas com plantas OE-miR399d (Col-O Co-Colt.) e em plantas OE-miR399d co-cultivadas com plantas de tipo selvagem (35S::miR399d Co-Colt.). - A Figura 9 mostra a expressão de PHO2 em plantas de tipo selvagem (Cntr), em plantas OE-miR399d (miR399), em plantas de tipo selvagem co-cultivadas com as plantas de OE- miR399d (CNTR-cc), e em plantas OE-miR399d co-cultivados com plantas de tipo selvagem (miR399-CC) quando as plantas foram cultivadas com uma concentração de Pi de 3mM (gráfico à direita) e 1,5mm (gráfico da esquerda). - A Figura 10 mostra a expressão de PHO2 em plantas de tipo selvagem tratadas com o meio em que o tipo selvagem (cinza claro) e OE-miR399d foram cultivadas (cinza escuro). - Figura 11 mostra o nível de expressão de miR156 (A), SPL9 (B) e miR172 (C) em plântulas de Arabidopsis. Em particular, as plantas do tipo selvagem cultivadas durante 48 h em um meio onde as plantas do tipo selvagem foram cultivadas durante cinco dias (coluna A); plantas 35S::miR156 cultivadas durante 48 horas em um meio onde as plantas 35S::miR156 foram cultivadas por cinco dias (coluna B); plantas do tipo selvagem cultivadas durante 48 h em um meio onde as plantas 35S::miR156 foram cultivadas durante cinco dias (coluna C); e plantas 35S::miR156 cultivadas durante 48 h em um meio onde as plantas do tipo selvagem foram cultivadas durante cinco dias (coluna D).
Descrição detalhada da invenção
[026] Para melhor compreensão do objetivo, a construção, as características e as funções da invenção, uma descrição detalhada com referência às modalidades é dada a seguir. No conceito geral, a presente invenção, portanto, descreve um método para a modulação de processos de plantas fisiológicos e/ou patológicos, compreendendo uma etapa de alimentação de uma planta com uma composição bioestimulante não prejudicial ao ambiente, compreendendo pelo menos uma molécula de RNA pequena exógena naturalmente derivada de (produzida naturalmente por), pelo menos, uma planta ou uma parte de planta, tais como raízes, folhas, caule ou qualquer outra parte de planta. Alternativamente, a planta é alimentada com uma composição bioestimulante compreendendo pelo menos uma molécula de RNA pequena exógena naturalmente derivada de (produzida naturalmente por) algas.
[027] De acordo com uma modalidade preferida da invenção, a composição bioestimulante compreende pelo menos uma molécula de RNA pequena exógena naturalmente derivada de, pelo menos, uma planta ou parte de planta ou exsudato de planta e, pelo menos, uma molécula de RNA pequena exógena naturalmente derivada de algas. Em uma modalidade preferida da invenção, as algas são macroalgas e/ou microalgas, mais preferivelmente elas são algas marinhas.
[028] Em uma modalidade preferida da invenção, as plantas e/ou algas são coletadas a partir de fontes naturais ou elas são cultivadas artificialmente.
[029] De acordo com uma modalidade preferida da invenção, pelo menos uma molécula de RNA pequena exógena é derivada de, pelo menos, um extrato ou, pelo menos, um exsudato ou qualquer outra amostra de, pelo menos, uma planta ou uma parte de uma planta, tais como raízes, folhas, tronco ou qualquer outra parte de plantas.
[030] De acordo com uma outra modalidade preferida da invenção, a pelo menos uma molécula de RNA pequena exógena é derivada de, pelo menos, um extrato ou lisado de algas e/ou microalgas, preferencialmente de algas marinhas, mais preferencialmente, de algas marinhas castanhas.
[031] De acordo com uma modalidade preferida da invenção, as algas marinhas são selecionadas a partir do grupo que consiste em: Ascophyllum nodosum, Ecklonia maxima, Laminaha saccharina, Fucus serratus, F. vesiculosus, Macrocystis spp, e Sargassum spp.
[032] Para a finalidade da presente invenção, a alga marinha castanha preferida é a Ascophyllum nodosum.
[033] De acordo com uma modalidade preferida da invenção, as microalgas pertencerem ao gênero selecionado a partir do grupo que consiste em: a Spirulina, Scenedesmus, Nannochloropsis, Haematococcus, Chlorella e Dunaliella.
[034] Tal como aqui utilizada, a frase "a modulação de processos de plantas fisiológicos e/ou patológicos"refere-se a um processo de modificar a expressão de um ou mais genes responsáveis ou envolvidos no processo de planta de interesse, por regulação negativa e/ou regulação positiva da expressão dos genes através de um mecanismo que envolve a interferência das moléculas de RNA pequenas exógenas (contidas na composição reivindicada e administradas para a planta, alimentando-a) e o gene(s) de interesse (interferência de RNA ambiental, ver abaixo).
[035] A composição da invenção pode ser utilizada também para alimentar uma planta em crescimento ou uma semente.
[036] Como usado aqui, os processos de plantas fisiológicos e/ou patológicos de interesse se referem, por exemplo, para a absorção de nutrientes, tolerância ao estresse abiótico, o crescimento e os processos de desenvolvimento, como floração e produção de frutos, a produtividade da planta em termos de quantidade e qualidade, resistência de plantas à doença específica provocada, por exemplo, por fungos, bactérias, vírus, ou a infestação por insetos ou nematódeos.
[037] Tal como aqui utilizado, o termo "bioestimulante/bioestímulo"refere-se a materiais de promoção de crescimento de plantas, com exceção de fertilizantes, geralmente usados em pequenas quantidades. Em outras palavras, bioestimulantes vegetais são substâncias/materiais, com a exceção de nutrientes e pesticidas, que, quando aplicados a plantas, sementes ou substrato de crescimento em formulações específicas, têm a capacidade de modificar os processos fisiológicos das plantas de uma maneira que proporciona benefícios potenciais para crescimento, desenvolvimento e/ou resposta ao estresse. Assim, a aplicação de bioestimulantes tem um impacto positivo sobre a nutrição da planta e crescimento da planta, enquanto que, ao mesmo tempo, proporcionando efeitos anti-estresse. Tendo em vista a definição acima descrita, a composição usada no método da invenção pode ser considerada como uma "composição bioestimulante". Na verdade, quando alimentada às plantas, por exemplo, é capaz de modificar os processos de plantas de uma forma que proporciona vários benefícios às plantas; por exemplo, melhora o crescimento das plantas, o desenvolvimento da planta e/ou a resposta da planta ao estresse.
[038] Tal como aqui utilizado, "moléculas de RNA pequenas" significa moléculas de RNA curtas de cadeia simples/de cadeia dupla, tais como microRNAs (miRNAs) ou pequenos RNA interferentes (siRNAs), que são capazes de regular a expressão do gene através da interferência com os RNAs mensageiros (mRNAs) ou por outros mecanismos de silenciamento gênico pós-transcricional. Os RNAs pequenos exógenos, de preferência os RNA exógenos de cadeia dupla, mais preferencialmente, os miRNAs exógenos ou siRNAs podem ser moléculas naturais ou artificiais. Por conseguinte, a molécula de RNA pequena é de preferência obtida a partir de uma fonte natural, de preferência uma planta, mais preferivelmente uma planta natural ou uma planta transgênica (planta geneticamente modificada).
[039] Alternativamente, a fonte a partir da qual é obtida a molécula de RNA pequena é algas ou microalgas naturais e/ou transgênicas, preferencialmente algas, mais preferencialmente, algas marinhas castanhas. De preferência, as algas marinhas são selecionadas a partir do grupo que consiste em: Ascophyllum nodosum, Ecklonia maxima, Laminaha saccharina, Fucus serratus, F. vesiculosus, Macrocystis spp, e Sargassum spp.
[040] De preferência, as microalgas pertencerem ao gênero selecionado a partir do grupo que consiste em: Spirulina, Scenedesmus, Nannochloropsis, Haematococcus, Chlorella e Dunaliella.
[041] De acordo com uma modalidade preferida, as moléculas de RNA pequenas utilizadas na presente invenção podem ser sintetizadas artificialmente. Neste contexto molécula artificial significa uma molécula sintetizada no laboratório, por outras palavras, uma molécula artificial é uma molécula sintética. Portanto, Em uma modalidade preferida da invenção, a composição administrada às plantas no método desta invenção compreende RNAs artificiais pequenos exógenos, RNA exógenos de cadeia dupla preferencialmente artificiais, e mais preferivelmente miRNAs exógenos artificiais. Em qualquer caso, a sequência destas pequenas moléculas de RNA, de um modo preferido, miRNAs, são idênticas ou muito semelhantes à sequência do RNA pequeno naturalmente presente em plantas e/ou algas.
[042] De acordo com uma modalidade preferida, a molécula de RNA pequena é selecionada a partir de: miR156, miR399d, miR166, miR398, miR168, miR396, miR159, miR6027, miR6024, miR162, miR157, miR9471, miR390, miR169, miR1919, miR397, miR414, miR4376, miR482, miR5168, miR5300, miR827, miR9470, miR9476, mais preferencialmente é miR156 e/ou miR399d. De acordo com uma outra modalidade preferida, as referidas moléculas de RNA pequenas compreendem uma sequência selecionada a partir de: SEQ ID NO: 1 a 44.
[043] Tal como aqui utilizado, "interferência de RNA (RNAi)" refere-se a um mecanismo de regulação genético endógeno de pós-transcrição genericamente mediado por moléculas de RNA de não-codificação (siRNAs/miRNAs). Em particular, este mecanismo pode ser utilizado para o silenciamento do gene alvo por introdução de ferramentas à base de ácido nucleico que são especialmente concebidos para acionar o mecanismo de RNAi. Na sequência da descoberta de RNAi, várias aplicações potenciais têm sido propostas. Na área de planta/colheita, por exemplo, o uso de RNAi como uma ferramenta para a modulação da fisiologia das plantas é hoje em dia uma técnica comumente usada. Em particular, este método é uma abordagem transgênica, através da qual uma planta superexpressa um miRNA ou outra sequência de RNA pequeno, a fim de silenciar a expressão de gene(s) alvo. No entanto, a presente invenção baseia-se no conceito de transferência horizontal de material genético, ou especificamente outros miRNAs pequenos RNAs capazes de desencadear RNAi. Este processo também é chamado de "interferência de RNA ambiental", o que significa que, para além de controlar a expressão do gene por mecanismos múltiplos dentro de uma célula de produzindo os mesmos ou sistemicamente produzindo os mesmos na planta, moléculas de RNA podem ser exportadas, através de um mecanismo desconhecido, no exterior da planta, bem em outras plantas em que elas modulam processos fisiológicos e/ou patológicos, por interferir com a expressão do gene.
[044] Assim, de acordo com a presente invenção, é possível alimentar uma planta (ou uma plântula ou uma semente ou mesmo um tecido de planta primordial) com uma composição compreendendo pelo menos uma molécula de RNA pequena exógena, preferencialmente pelo menos um de RNAs de cadeia dupla tais como moléculas de miRNA, em que esta molécula exógena é, naturalmente, derivada de plantas ou partes de plantas e/ou de algas e/ou a partir de microalgas, e em que esta molécula exógena é capaz de modular a expressão de um ou mais genes de plantas envolvidos em um processo de planta, através de um mecanismo de interferência de RNA ambiental. Isto significa que as pequenas moléculas de RNA utilizadas no método da invenção são moléculas presentes naturalmente em plantas/algas e que derivam de um extrato de plantas/partes da planta/algas ou de um exsudato de plantas/partes de plantas, e que são usadas para modular processos fisiológicos e/ou patológicos de outras plantas que não produzem elas.
[045] Mais preferivelmente, pelo menos, uma molécula de RNA exógena pequena está envolvida na modulação do processo da planta específica de interesse. Em outras palavras, a composição da invenção contém, de preferência, pelo menos, uma molécula de RNA pequena exógena (derivada de plantas e/ou partes de plantas e/ou de algas e/ou de microalgas) capazes de modular (suprimindo ou superexpressando) a expressão do gene de interesse por meio de um mecanismo de interferência de RNA do ambiente e, portanto, para modular (aumentando ou reduzindo) o processo de planta de interesse.
[046] Em alternativa, a composição compreende um extrato, um exsudato, todas as amostras derivadas de plantas ou partes de plantas, tais como raízes ou folhas, em que o referido extrato, exsudato ou amostra compreende pequenas moléculas de RNA exógenas (de origem vegetal), RNAs de preferência de dupla cadeia, tais como miRNAs.
[047] De acordo com uma modalidade preferida, o miRNA é selecionado a partir de: miR156, miR399d, miR166, miR398, miR168, miR396, miR159, miR6027, miR6024, miR162, miR157, miR9471, miR390, miR169, miR1919, miR397, miR414, miR4376, miR482, miR5168, miR5300, miR827, miR9470, miR9476 ou combinação dos mesmos, mais preferivelmente, é miR156 e/ou miR399d.
[048] De acordo com uma outra modalidade preferida, o miRNA compreende uma sequência selecionada a partir de: SEQ ID NO: 1 a 44.
[049] De acordo com uma modalidade preferida da invenção, os pequenos RNAs, de preferência os RNA de cadeia dupla, tais como moléculas de miRNA, derivados de uma planta selecionada a partir do grupo que consiste em: Beterraba sacarina (Beta vulgaris), cana de açúcar (Saccharum officinarum), milho (Zea mays) e Alfafa (Medicago sativa).
[050] No entanto, qualquer planta, dicotiledônea ou monocotiledônea ou uma parte ou suas misturas podem ser usadas para o escopo da presente invenção.
[051] A planta, a partir da qual os RNAs pequenos exógenos da composição usada no método da invenção são derivados, pode ser um tipo selvagem ou uma planta geneticamente modificada, tal como uma planta geneticamente modificada de modo a expressar os RNAs pequenos de interesse, de um modo preferido os RNAs de cadeia dupla de interesse, mais preferencialmente os miRNAs de interesse.
[052] De acordo com uma outra modalidade da invenção, a composição compreende um extrato ou um lisado ou qualquer amostra derivada de algas e/ou microalgas, preferencialmente a partir de algas, com maior preferência a partir de algas marinhas castanhas, preferencialmente uma alga selecionada a partir do grupo que consiste em: Ascophyllum nodosum, Ecklonia maxima, Laminaria saccharina, Fucus serratus, F. vesiculosus, Macrocystis spp., e Sargassum spp., em que o referido extrato, lisado ou amostra compreende pequenas moléculas de RNA exógenas (derivadas de algas), de preferência RNAs de cadeia dupla como miRNAs. De preferência, as microalgas pertencem ao gênero selecionado a partir do grupo que consiste em: a Spirulina, Scenedesmus, Nannochloropsis, Haematococcus, Chlorella e Dunaliella.
[053] Outra modalidade preferida da composição da presente invenção compreende os componentes, tais como substâncias capazes de modificar a tensão superficial, agentes tensoativos, adjuvantes, adesivos ou agentes umectantes e substâncias capazes de facilitar o transporte da composição dentro da planta para os locais alvos.
[054] De acordo com uma outra modalidade, a composição da invenção compreende ainda micronutrientes e/ou macronutrientes.
[055] Exemplos de micronutrientes úteis são: KCl, H3BO3, MnSO4, CuSO4, ZnSO4, ou Fe- EDTA.
[056] Exemplos de macronutrientes úteis são: KNO3, Ca(NO3)2, MgSO4, KH2PO4.
[057] De preferência, os micronutrientes estão presentes em uma concentração que varia de 0,1 a 20% p/p, de preferência de 1 a 10% p/p, mais de preferência de 2 a 6% p/p.
[058] De preferência, os micronutrientes estão presentes em uma concentração que varia 0,01-100 mg/kg para a aplicação única (quando aplicado).
[059] De preferência, os macronutrientes estão presentes em uma concentração que varia de 0,5 a 50% p/p, de preferência de 10 a 30% p/p, mais de preferência de 12 a 25% p/p.
[060] De preferência, os macronutrientes estão presentes em uma concentração que varia entre 1-50 g/kg para a aplicação única (quando aplicado).
[061] Em outra modalidade preferida da invenção, a composição bioestimulante pode ser administrada na forma de pó, pó de preferência solúvel em água, grânulos, gel, comprimidos, emulsão, concentrado emulsionável, ou como uma solução líquida (um meio) ou uma suspensão líquida. Mais preferivelmente, a composição pode ser diluída ou não diluída antes de ser administrada.
[062] Em outra modalidade da invenção, a composição pode ser aplicada às plantas de qualquer forma. De preferência, as plantas podem ser alimentadas com a composição revelada através da raiz como um produto aplicado no solo ou folhas como um tratamento foliar.
[063] A composição é preferencialmente formulada como um pulverizador, quando ele é administrado através das folhas.
[064] Modalidades preferidas da invenção não excluem a aplicação do método aqui descrito em combinação com composições compreendendo produtos químicos, tais como fertilizantes, outros bioestimulantes, hormônios, reguladores do crescimento das plantas (PGR), rizobactérias promotoras do crescimento (PGPR), pesticidas ou quaisquer outras substâncias conhecidas para serem utilizadas em plantas para a mesma finalidade. Estas combinações são particularmente úteis a fim de reduzir as taxas ou doses de aplicação por temporada dos referidos fertilizantes, bioestimulantes, hormônios, PGRs, PGPR, pesticidas ou qualquer composto que possui sinergia ou inibe a atividade destes compostos, reduzindo assim os efeitos adversos sobre o ambiente.
[065] A utilização das composições da presente invenção (o método da invenção) é uma alternativa não prejudicial ao ambiente para os produtos químicos atuais disponíveis no mercado para efeitos de modulação de processos de plantas, tais como a melhoria da produtividade da planta ou o crescimento das plantas. Na verdade, a utilização da composição aqui descrita pode reduzir o impacto ambiental do tratamento de plantas com produtos químicos tóxicos, tais como herbicidas e pesticidas. Portanto, o uso das composições da presente invenção é ambientalmente e biologicamente seguro.
[066] A seguir a presente invenção é exemplificada, a fim de melhor ilustrar e não a limitar a invenção.
Exemplo I - Extração e caracterização de miRNAs de Ascophyllum nodosum
[067] RNA pequeno de Ascophyllum nodosum foi extraído por 100 mg de amostras de algas (previamente armazenadas a -80°C) com kit de isolamento de microRNA mirPremier (Sigma- Aldrich).
[068] As amostras de RNA pequenas purificadas foram analisadas por eletroforese em gel de agarose a 4% e a qualidade foi verificada por um BioAnalyzer.
[069] Uma vez que a maioria dos miRNAs maduros têm um grupo 3'-hidroxila como um resultado da clivagem enzimática por Dicer ou outras enzimas de processamento de RNA, utilizou-se o kit de preparação de Amostra de RNA Pequeno TruSeq (lllumina) para preparar uma biblioteca de miRNA. Esta tecnologia utiliza um adaptador 3' especificamente modificado para segmentar microRNAs e outros pequenos RNAs que possuem um grupo hidroxila 3'. Em seguida, os imiRNA isolados foram sequenciados utilizando a plataforma HiSeq 2000 (Serviço de Tecnologia IGA, Udine).
[070] As sequências obtidas foram então limpas removendo as sequências de adaptador/aceitador. Um total de 27.152.631 leituras foi obtido que produziu 2.117.202 miRNA únicos. A ocorrência do comprimento do número total das sequências de leitura foi contada, considerando apenas o intervalo de 9 a 48 nucleotídeos, que mostra que a maioria do RNA pequeno da biblioteca de Ascophyllum foi de 21 em tamanho (Figura 1), que é consistente com o tamanho de miRNA típico produzido por Dicer.
[071] As sequências de miRNA putativas identificadas foram comparadas com miRNA conhecido utilizando a base de dados de imiRBase.
[072] Com esta análise, foram identificadas 316 famílias conhecidas de miRNA, assim, compostas por ortólogos de miRNA de outras espécies de plantas. Entre eles, 17 famílias de miRNA tem um número relativamente maior de contagens de sequência (10 <n <106), indicando que provavelmente elas são altamente expressas (Figura 2).
[073] Algumas delas estão envolvidas na regulação de processos relativos ao desenvolvimento da planta e resposta ao estresse (Figura 3).
[074] As sequências de miRNA abrangendo 20-22 nucleotídeos e repetidas pelo menos 100 vezes (5.059 sequências) foram inseridas no banco de dados de GenBank Arabidopsis NCBI para encontrar possíveis alvos. Os resultados relataram a correspondência de sequência de miRNA de Ascophyllum possível para 2.303 genes de Arabidopsis anotados. Este grupo compreende, possivelmente, também novos miRNA não representados na família de miRNA anteriormente conhecida. Os genes de Arabidopsis combinados foram agrupados em 50 classes envolvidas em Processos Biológicos (52%), Funções Moleculares (44%) e Componentes Celulares (4%) (classificação GO - Figura 4).
[075] Os alvos relacionados com o Processo Biológico GO:0007166 (p = 6.08E-05) compreenderam genes relacionados à ativação de mecanismo de defesa, resposta ao frio, a resposta ao etileno, ABA e estímulos de açúcar, hormônios e metabolismo, crescimento e desenvolvimento de carboidratos (Fig 4). Este grupo de genes de Arabidopsis é provavelmente um alvo interessante para a ação dos miRNAs produzidos por Ascophyllum nodosum.
- miRNAs de Ascophylum nodosumsão altamente conservados nas plantas
[076] Para identificar os miRNA conservados em Ascophyllum nodosum, comparamos o conjunto de dados com os miRNAs de plantas e animais conhecidos que utilizam o banco de dados miRBase (versão 21, lançado em 2014 06, http://www.mirbase.org).
[077] Permitindo que não exista desemparelhamentos entre as sequências de 20-22 nucleotídeos, um total de 62 miRNAs maduros putativos foram identificados que corresponde a famílias de miRNA de plantas conhecidas (Tabela II), assim, compostas por ortólogos de miRNA putativos de diferentes espécies de plantas.
[078] A Tabela II mostra as sequências identificadas em Ascophylum nodosum compartilhando 100% de homologia com a sequência de miRNAs conhecidos para plantas superiores.
[079] Os resultados mostram que os extratos de Ascophyllum contêm pequenos RNAs cujas sequências são idênticas às expressas em plantas superiores como miRNAs. É muito plausível que estes miRNAs sejam capazes de modular processos fisiológicos e/ou patológicos em plantas por meio de um mecanismo de interferência ambiental, uma vez que são altamente conservados em plantas.
Exemplo II Liberação da planta de miRNAs
[080] A fim de verificar se uma planta é capaz de liberar miRNAs, foi utilizado um sistema hidropônico. Em particular, plantas de Arabidopsis foram cultivadas numa câmara de crescimento a 23°C com um fotoperíodo de 12/12. A intensidade da luz foi de 100 fótons micromolares, m-2 s -2 (tal como descrito por Gibeaut et al. 1997, Plant Physiol., 115: 317-319) e miRNA399d foi detectado no meio de crescimento externo.
[081] A análise foi realizada utilizando uma metodologia de RT-PCR, juntamente com a detecção quantitativa de PCR de miR399d, pré-miR399d, as sequências de RNA de rRNA 40S e GAPDH.
[082] Um procedimento de stem-loop RT, seguido por análise de PCR syber-green foi utilizado para amplificar a sequência miR399. Os resultados mostrados na Figura 5 mostram claramente que pré-miR399, bem como as sequências de miR399 maduras foi detectado no meio de crescimento externo, enquanto no outro, as sequências de RNA de cadeia simples não eram detectáveis.
[083] Estes resultados sugerem fortemente que miRNA pode ser liberado a partir de raízes de Arabidopsis e que suportam a visão de captação subsequente dos miRNAs por plantas vizinhas. A detecção de miRNAs no meio hidropônico externo não estéril sugeriu que miRNAs são estáveis mesmo fora da planta. -
A estabilidade de miRNAs após extração.
[084] Pensa-se genericamente que os RNA são altamente instáveis devido à ação das RNAases. A fim de verificar a estabilidade de moléculas de RNAs pequenas fora do compartimento celular, a estabilidade de RNAs foi avaliada em um extrato de planta em bruto.
[085] O RNA total foi extraído dos brotos e raízes de plantas de Arabidopsis com superexpressão de miR399d. As folhas foram rapidamente congeladas em líquido seguido de extração por trituração com almofariz e pilão, utilizando tampão de citrato 100 mM (pH 6).
[086] O extrato foi mantido, sem realizar uma etapa de centrifugação, a temperatura ambiente (RT) e a 4°C durante vários dias.
[087] Inesperadamente, miR399d foi detectado nos extratos de derivados de raiz ou broto mesmo após 4 dias de incubação. Não foram observadas diferenças de estabilidade de miR399d significativas entre RT ou condições a 4°C (Figura 6).
[088] Estes resultados demonstram a estabilidade da miRNAs em um extrato e, por conseguinte, confirmam a possibilidade de formular um produto à base de RNA de cadeia dupla a ser alimentado de forma exógena para plantas, a fim de modular a expressão de gene de planta sem quaisquer preocupações relacionadas com a estabilidade de RNA.
Exemplo III - A co-cultura de plantas de Arabidopsis que superexpressam miR399d resulta no silenciamento do gene alvo (PHO2) em plantas de tipo selvagem nas proximidades.
[089] A fim de entender se miRNAs exógenos podem afetar a expressão do gene alvo em uma planta que não é a que está produzindo o mesmo, nós definimos um experimento em que as plantas de Arabidopsis de tipo selvagem (Figura 7A) e plantas que superexpressam o gene miR399d (OE-miR399d-Figura 7B) foram cultivadas separadamente usando um sistema hidropônico.
[090] A composição da solução hidropônica é relatada na Tabela I. Tabela I
[091] Um grupo de plantas foi co-cultivado na mesma bandeja. Assim, os miRNAs vazando eventualmente a partir das plantas OE-miR399d podem alcançar o sistema radicular das plantas de tipo selvagem (Figura 7C). Portanto, se os miRNAs produzidos pela OE-miR399d forem absorvidos pelas plantas de tipo selvagem, deve-se esperar que a expressão do gene PHO2, que é o alvo de miR399, a ser afetada também nas plantas de tipo selvagem que foram co-cultivadas com as plantas de OE-miR399d.
[092] Os resultados mostraram que a expressão de PHO2 foi reduzida nas plantas de tipo selvagem que foram co-cultivadas com as plantas de OE-miR399d, indicando assim que miRNAs vazam para fora das raízes de plantas de OE-miR399d e são tomadas por plantas tipo selvagem (Figura 8).
[093] Uma vez que a expressão de PHO2 é fortemente influenciada pelo nível de fosfato do meio, a experiência foi repetida adicionando extra fosfato para o meio.
[094] Os resultados confirmaram que o miRNA exógeno reprimiu PHO2 nas plantas de tipo selvagem, mesmo na presença de extra fosfato no meio (Figura 9).
[095] Numa experiência em separado, as plantas do tipo selvagem foram tratadas com um meio em que ou plantas de tipo selvagem ou plantas de OE-miR399d foram cultivadas desde a fase de germinação. Este meio deve conter miRNAs vazados respectivamente a partir das raízes de tipo selvagem ou as raízes de OE-miR399d.
[096] Os resultados na Figura 10 mostram a expressão de PHO2 em raízes de quatro plantas individuais para cada um dos dois tratamentos. Em três dos quatro casos, o meio a partir de plantas de OE-miR399d foi capaz de reprimir PHO2 (Figura 10).
[097] No geral, estes resultados confirmam que miRNAs exógenos são capazes de modular a expressão de um gene alvo na planta tratada com uma solução contendo miRNA.
[098] Estes resultados também indicam que qualquer extrato, solução, produto derivado de uma planta e que contém miRNAs exógenos pode afetar os processos de crescimento de plantas, incluindo os que estão associados com características de importância agronômica.
[099] Uma solução de miRNAs pode ser preparada a partir de exsudatos de raiz, a partir de um extrato de planta ou qualquer outro processo possível que pode fornecer um produto contendo imiRNA.
[0100] Estes produtos contendo RNA pequeno/imiRNA podem ser usados para tratar plantas ou órgãos da planta pela alimentação de raiz, pulverização foliar ou qualquer outro método possível que é usado na agricultura para administrar fertilizantes, PGRs, pesticidas ou qualquer outro produto usado em plantas e culturas.
Exemplo IV
[0101] A seguinte experiência demonstra que uma solução contendo miRNAs resultantes de exsudação a partir de raízes de plantas que superexpressam um miRNA específico influencia a expressão de genes alvo em uma planta exposta à solução enriquecida em miRNA.
[0102] O sistema miRNA utilizado é miR156/SPL9, onde miR156 é capaz de reprimir o mRNA do gene SPL9, um ativador de miR172. Esta cascata reguladora afeta o desenvolvimento da planta, ou seja, a transição da fase juvenil para a fase de adulto, assim como a tolerância ao estresse abiótico.
[0103] As plantas de tipo selvagem e plantas que superexpressam miR156 foram cultivadas em meio de Murashige-Skoog sob condições estéreis.
[0104] Em particular, as plantas foram cultivadas no meio durante 5 dias. Em seguida, o meio foi trocado e as plantas do tipo selvagem foram transferidas para o meio onde as plantas 35S::miR156 onde previamente cresceram e vice-versa.
[0105] Neste ponto, as plantas tratadas foram cultivadas no novo meio durante dois dias adicionais.
[0106] Um conjunto de plantas foi deixado no meio original como controle.
[0107] A seguinte Tabela III resume o conjunto experimental. Tabela III
[0108] O meio foi analisado para verificar a presença de miR156 (Fig. 11A). Os resultados indicaram que o meio onde as plantas 35S::miR156 foram cultivadas é enriquecido em miR156 (amostra B) quando comparado com o meio onde as plantas do tipo selvagem foram cultivadas durante cinco dias (amostra A).
[0109] A amostra de meio C, que é o meio onde as plantas 35S::miR156 foram cultivadas durante 5 dias, mas, em seguida, substituídas com plantas de tipo selvagem, mostrou uma redução do teor de miR156 (cfr. C com B). Este resultado significa que, na ausência de plantas 35S::miR156, o conteúdo de miR156 diminui, ou, em alternativa, isto significa que o miR156 foi tomado pelas plantas de tipo selvagem cultivadas em C.
[0110] Por outro lado, o teor de miR156 da amostra D aumentou em comparação com a amostra A.
[0111] D é o meio onde as plantas do tipo selvagem foram cultivadas durante 5 dias, e onde as plantas 35S::miR156 foram transferidas por mais 48 h.
[0112] O aumento do teor de miR156 nesta condição experimental é atribuível à libertação de miR156 no meio (cfr. Meio A, que é um meio em que as plantas do tipo selvagem foram cultivadas com meio D onde as plantas do tipo selvagem foram cultivadas durante 5 dias, mas então plantas 35S::miR156 foram cultivadas durante 2 dias a mais).
[0113] O nível de expressão do gene alvo miR156 SPL9 foi medido (Fig. 11B).
[0114] Como esperado, a expressão do gene SLP9 foi reprimida quando o nível de expressão de miR156 foi elevado, tais como em plantas 35S::miR156, e este foi o caso (Cfr. B com A).
[0115] Surpreendentemente, o extrato de tipo selvagem a partir de plantas que foram transferidas a partir de mais dois dias no meio condicionado por plantas 35S::miR156 (amostra C) exibiu um nível de expressão de SPL9 que era comparável ao das plantas 35S::miR156 (Amostra B) e não de plantas de tipo selvagem (amostra A).
[0116] Consequentemente, as moléculas miR156 presentes no meio condicionado foram absorvidas pelas plantas de tipo selvagem em C, o que resultou em repressão do gene SPL9.
[0117] Como já foi dito, o gene SPL9 controla a expressão de miR172. Portanto, nesta condição experimental a expressão de pré-miR172 deve espelhar a de SPL9. Os resultados obtidos confirmaram essa expectativa (Fig.11C)
[0118] Em particular, os resultados demonstram que miRNAs contidos em um meio que foi pré-condicionado pelo crescimento de plântulas de Arabidopsis que superexpressam um miRNA específico são capazes de modular o sistema de regulação do gene correspondente. No exemplo dado, o meio foi enriquecido em miR156 por crescimento de plântulas de 35S::miR156 como mostrado na Figura 1, o nível de miR156 é 10 vezes maior em "B" (onde plântulas de 35S:miR156 foram cultivadas) do que em "A" (onde plântulas do tipo selvagem foram cultivadas). Colocar plântulas de tipo selvagem durante 48 h num meio enriquecido em miR156 resultou na repressão do gene SPL9 e do gene pré-miR172 (Amostra "C"), indicando que as moléculas de miRNA presentes no meio foram capazes de induzir o silenciamento do gene.

Claims (12)

1. Método para melhorar a absorção de nutrientes, a tolerância ao estresse abiótico e/ou o crescimento em plantas, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: - extrair miRNA156 e/ou miR399d de uma planta doadora; ou - coletar o exsudato compreendendo miRNA156 e/ou miR399d de uma planta doadora; e - alimentar uma planta receptora com uma composição compreendendo o extrato e/ou o exsudato de uma planta doadora; e - atuar nas plantas receptoras através do mecanismo de interferência do RNA ambiental, em que o miRNA156 consiste em qualquer uma das SEQ ID NOs: 45 a 54, e o miRNA399d consiste em qualquer uma das SEQ ID NOs: 55 ou 56.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida pelo menos uma molécula de RNA pequena exógena é produzida naturalmente pelas raízes das plantas doadoras, folhas, caule ou qualquer outra parte da planta.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a planta doadora é uma planta dicotiledônea ou uma monocotiledônea.
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a planta doadora está selecionada a partir do grupo que consiste em: açúcar de beterraba (Beta vulgaris), cana-de-açúcar (Saccharum officinarum), milho (Zea mays) e alfalfa (Medicago sativa).
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a composição compreende ainda micronutrientes e/ou macronutrientes.
6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que os micronutrientes estão presentes em uma concentração que varia de 0,1 a 20% p/p, de preferência de 1 a 10% p/p, mais de preferência de 2 a 6% p/p.
7. Método, de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que os macronutrientes são selecionados a partir de: KCl, H3BO3, MnSO4, CuSO4, ZnSO4 e Fe- EDTA.
8. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que os macronutrientes estão presentes em uma concentração que varia de 0,5 a 50% p/p, de preferência, de 10 a 30% p/p, mais de preferência de 12 a 25% p/p.
9. Método, de acordo com a reivindicação 5 ou 8, caracterizado pelo fato de que os micronutrientes são selecionados de entre: KNO3, Ca(NO3)2, MgSO4 e KH2PO4.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a composição é formulada na forma de pó, pó solúvel em água, grânulo, gel, comprimido ou emulsão, concentrado emulsionável ou como solução líquida ou como suspensão líquida.
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a composição compreende adicionalmente substâncias capazes de modificar a tensão superficial, tensoativos, adjuvantes, adesivos, compostos umectantes e substâncias capazes de facilitar o transporte da composição dentro da planta para o local alvo.
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a alimentação da planta é alimentação por raiz e/ou pulverização foliar.
BR112017002328-8A 2014-08-06 2015-08-06 Método para melhorar a absorção de nutrientes, a tolerância ao estresse abiótico e/ou o crescimento em plantas BR112017002328B1 (pt)

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