CN110295193B - 番茄miR6027基因在控制植物果实颜色中的应用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了番茄miR6027基因在控制植物果实颜色中的应用方法，涉及植物基因的应用，旨在得到一种能够控制miR6027基因的表达，调控果实的颜色的方法。所述番茄miR6027基因在控制植物果实颜色中的应用方法为:利用miR6027前体序列来构建pCambia1300‑SMMT6027沉默表达载体，然后通过农杆菌介导法转化番茄，通过番茄miR6027基因调控果实颜色。本发明通过构建STTM‑6027沉默表达载体来探究Sl‑miR6027在果实成熟中的功能，既可为基因工程来改善果实颜色提供潜在的基因资源，又可为通过STTM技术开展果实发育相关miRNA的功能研究奠定技术基础。

Description

番茄miR6027基因在控制植物果实颜色中的应用方法
技术领域
本发明涉及植物基因的应用方法，具体涉及番茄miR6027基因在控制植物果实颜色中的应用方法。
背景技术
目前，与果实发育及成熟相关的大量差异表达miRNAs被发现(Zuo et al.2012；Gao C et al.2015)。如：番茄miR161、miR173、miR393、miR397、miR398和miR414只有在绿熟期果实中表达量增加；miR159表达量在破色期果实中下降，到红熟期增加；miR156和miR394在成熟期表达量下降，miR396在破色期表达量明显增加；miR828和miR1917表达在红熟期下降(Zuo et al.2012)。miRNAs不仅在果实成熟各个时期表现出差异表达模式，而且其中一些miRNAs的表达受到乙烯调控，如：番茄miR394、miR414、miR1917的表达受乙烯负调控，而miR156、miR159、miR396、miR482、miR6027则为乙烯诱导表达(Zuo et al.2012；Gao C etal.2015)。香蕉miR156、miR162、miR171、miR393和miR172等受到乙烯诱导表达(Bi etal.2015)。一个基因在特定的组织、器官中特异性的特异性表达预示着该基因在特定的组织、器官中发挥着重要作用。Sl-miR6027在番茄果实绿熟期高表达，同时，Sl-miR602的表达受到乙烯的调节，该结果预示其参与调控番茄果实成熟过程，但其作用机制有待于深入研究。
果实颜色是重要的品质特征之一，番茄果实的颜色可分为红色，粉红色，橙色，黄色，绿色和紫色，各种颜色反映了果实中类胡萝卜素、叶绿素和类黄酮等的相对水平(Kilambi et al.2013；Gao L et al.2016)。其中，类胡萝卜素合成而产生的红色是果实成熟的一个关键指标。已经证明几种具有颜色缺陷的番茄突变体可用于通过类胡萝卜素合成来理解果实颜色形成的分子基础(Gao L et al.2016)。除了类胡萝卜素生物合成途径中的结构基因外，一些参与类黄酮合成和叶绿素降解的基因突变体，如：DDB1，DET1，ZEP及hp-1，hp-2，hp-3等(Galpaz et al.2008)，由于番茄红素、类固醇或者叶绿素水平升高，而使果实中具有高水平的色素。光是调节番茄果实发育和成熟过程的一种重要因素(Cruz etal.2018；Zhang et al.2019)。已有研究结果表明，通过对hp1和hp2等位基因的遗传分析揭示了核蛋白DDB1和DET1为光信号转导的负调节因子(Lieberman et al.2004；Liu etal.2004)。沉默S1-DDB1/HP1或S1-DET1/HP2极大地促进了果实组织中质体生物合成和类胡萝卜素的积累(Davuluri et al.2004；Wang S et al.2008)。此外，研究表明，光信号和植物激素乙烯已被确定为番茄果实成熟过程中类胡萝卜素生物合成的重要调节剂，如：在光照或黑暗条件下，hp2成熟果实中类胡萝卜素的过度积累导致乙烯产量变化、编码成熟相关的调节因子基因表达的增加以及乙烯敏感性增强(马勇et al.2017；Cruz et al.2018)。在本研究中，Sl-miR6027及其潜在靶基因Solyc09g098130的表达水平受到光调节，表明Sl-miR6027及其靶基因可能介导光信号传导来实现对果实成熟过程的调节。
反向遗传学主要通过超表达或者沉默表达方法实现对基因功能的研究。利用超表达载体转化植物，从而提高miRNA在体内的表达量的方法是一种已被广泛应用于植物miRNA功能研究的成熟方法(Todesco et al.2010)。但对miRNA功能沉默的方法一直不能取得令人满意的效果。STTM的发现揭示了一种miRNA沉默调控机制，该方法使表型更加明显，对miRNA的抑制程度更深。目前，尽管已有STTM应用于番茄miRNA功能的沉默(Jiang etal.2018；Kravchik et al.2019)，但是，利用STTM抑制果实发育相关miRNA的研究鲜有报道。
发明内容
本发明的目的是提供番茄miR6027基因在控制植物果实颜色中的应用方法，该方法能够控制miR6027的表达，调控果实的颜色。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
番茄miR6027基因在控制植物果实颜色中的应用方法，利用miR6027前体序列来构建pCambia1300-SMMT6027沉默表达载体，然后通过农杆菌介导法转化番茄，通过番茄miR6027基因调控果实颜色；所述miR6027前体序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地，所述农杆菌介导法中采用的基因工程菌为农杆菌EHA105。
进一步地，构建番茄miR6027基因的沉默表达载体使用的引物组为：
F-STTM6027:GGAGAGGACAGGGTACCCGCCGAAGGATTCctaACGAGAAACAGTTGTTGTTGTTATGG；
R-STTM6027:CTCTAGAGGATCCCCTGTTTCTCGTctaGAATCCTTCGGCATTCTTCTTCTTTAGACCA。引物F-STTM6027、R-STTM6027的序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。
进一步地，所述农杆菌介导法转化番茄的步骤为：将含有所述pCambia-STTM6027质粒的阳性菌接入液体LB培养基中，培养12～16h，然后进行质粒提取，转化到农杆菌EHA105感受态细胞中。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1.本发明通过构建Sl-miR6027的高效沉默载体，可利用农杆菌介导转化番茄，从而实现对番茄果实颜色的控制，实现了对番茄果实颜色的改变。
2.本发明通过构建STTM-6027沉默表达载体来探究Sl-miR6027在果实成熟中的功能，既可为基因工程来改善果实颜色提供潜在的基因资源，又可为通过STTM技术开展果实发育相关miRNA的功能研究奠定技术基础。
附图说明
下面结合附图中的具体实施例对本发明的技术方案做进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
图1为Sl-miR6027在番茄果实中的表达模式图；
图2为Sl-miR6027启动子顺式作用元件分析图；
图3为Sl-miR6027的靶基因预测；
图4为靶基因Solyc09g098130的光调节表达模式图；
图5为构建STTM-6027载体时的PCR扩增、酶切；
图6为pCambia1300-STTM6027沉默载体的结构图；
图7为农杆菌PCR阳性克隆的鉴定结果图；
图8为转基因番茄的PCR筛选；
图9为转基因番茄果实表型图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所选用的材料、试剂等，如无特别说明，均可以从商业途径中获得。
实施例1
所用材料：大肠杆菌DH5α、农杆菌EHA105、植物表达载体pCamiba-35S来源于玉林师范学院分子生物实验室，克隆载体PEASY-Blunt Clong Kit购于TRANSGENE公司。寡核苷酸由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，DNA聚合酶、限制性内切酶(KpnI,BamH I)和T4连接酶购于Thermo Fisher Scientific公司，质粒提取试剂盒和凝胶回收试剂盒购于Omega公司。
1.pCambia1300-SMMT6027沉默表达载体
根据Sl-miR6027成熟序列TGTTTCTCGTGAATCCTTCGGC，设计构建STTM沉默载体的寡核苷酸序列，序列如下：
F-STTM6027:GGAGAGGACAGGGTACCCGCCGAAGGATTCCTAACGAGAAACAGTTGTTGTTGTTATGG，
R-STTM6027:CTCTAGAGGATCCCCTGTTTCTCGTCTAGAATCCTTCGGCATTCTTCTTCTTTAGACCA，
Linker-STTM:GTTGTTGTTGTTATGGTCTAATTTAAATATGGTCTAAAGAAGAAGGAAT。
然后以Linker-STTM为接头，利用PCR将F-STTM6027和R-STTM6027片段连接后回收。将其与克隆载体pEASY-Blunt连接，构建中间载体pEASY-STTM6027。而后将pEASY-STTM6027与表达载体pCambia1300用KpnI和BamHI进行双酶切，回收后用T4连接酶将目的基因与表达载体连接，经菌落PCR、酶切及测序验证正确，命名为pCambia-STTM6027。
2.农杆菌介导番茄转化以及检测
把含有pCambia-STTM6027质粒的阳性菌接入含有50μg/mL利福平和100mg/L的卡那霉素的液体LB培养基中，37℃，250rpm条件下过夜摇床培养12～16h，然后进行质粒提取，用热激法转化农杆菌EHA105感受态细胞中。根据本研究组方法(Ren et al.2011)，利用农杆菌介导进行番茄转化。将农杆菌在含相应抗生素的LB培养基暗培养24h，收集农杆菌并用KCMS液体培养基(MS+0.9mg/L VB1+0.1mg/L KT+0.2mg/L 2,4-D+0.2mmol/L乙酰丁香酮+2％蔗糖)重悬至OD600＝0.05～0.1，将其作为侵染液与预培养24h的番茄外植体(子叶和茎段)共培养30min后重新置于KCMS培养基中，暗培养2d。然后将外植体转移到2Z培养基(MS+Nitsch+2mg/L玉米素核苷+100mg/L卡那霉素+400mg/L Augmentin+200mg/L Timentin)中诱导分化。2周左右后切割分化苗将其移栽到生根培养基(1/2MS+Nitsch+100mg/L卡那霉素+400mg/L Augmentin+200mg/L Timentin)中，2～3周移栽至温室。为了检测目标片段是否整合进植物基因组DNA，我们提取转基因植物和野生植物基因组DNA，利用35S前引物和STTM6027后引物进行PCR检测。
1.实验内容
1.1Sl-miR6027在果实不同发育时期的动态表达模式
研究通过挖掘带注释的TOMATO FUNCTIONAL GENOMICS DATABASE(http://ted.bti.cornell.edu/)番茄miRNA表达数据库，对Sl-miR6027在番茄果实发育过程中的表达进行分析，结果如图1所示。结果表明，Sl-miR6027的表达量在番茄果实未成熟绿期(Immature)到绿熟期(Mature green)表达量增强，从绿熟期到破色期(Breaker)下降，到红熟期(Red ripe)表达量最低。通常情况下，一个基因在特定的组织、器官中特异性的表达模式预示着该基因在特定的组织、器官中发挥着重要作用。因此，上述结果预示Sl-miR6027在番茄果实成熟中发挥着重要作用，其具体功能及机制有待深入探究。
1.2Sl-miR6027启动子中存在果实成熟过程相关的顺式作用元件
将Sl-miR6027前体序列在NCBI中blastn，分离出Sl-miR6027基因组序列，选择转录起始位点上游1900bp序列，在生物信息学网站http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/中分析Sl-miR6027启动子中存在的顺式作用元件，如图2。分析结果显示，Sl-miR6027启动子中含有20个光应答元件(Light responsive element)、2个脱落酸应答元件(ABRE:abscisic acid responsiveness)、1个茉莉酸甲酯应答元件(CGTCA-motif:meJA-responsive)、1个水杨酸应答元件(TCA:salicylic acid responsiveness)、1个低温应答原件(LTR:low-temperature responsive)、1个干旱应答元件(MBS:MYBbinding site involved in drought-inducibility)和2个防御和胁迫应答元件(Tc-richrepeat:defense and stress responsiveness)等。茉莉酸甲酯和水杨酸都是果实成熟过程中重要的植物激素，作为应激激素广泛参与调控植物生长发育过程，与果实的成熟衰老有着密切的联系(Bleecker and Kende,2000)(莫琴et al.)。上述结果表明，Sl-miR6027可能参与调节番茄果实发育过程中非生物胁迫相关过程。
1.3Solyc09g098130被预测为Sl-miR6027潜在的靶基因
miRNA通常通过对靶基因mRNA的降解或抑制靶基因翻译过程来实现对植物生长和发育过程的调控。如图3A所示，利用靶基因预测网站http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/，共得到10个Sl-miR6027潜在的靶基因。通过挖掘番茄基因表达数据库(http://ted.bti.cornell.edu/)，对10个潜在靶基因在番茄果实发育阶段的表达情况进行分析，结果如图3B所示。图3C为Solyc09g098130表达与Sl-miR6027表达的关系，从表达水平分析结果可以看出，在番茄果实不同的发育阶段，只有Solyc09g098130(一种CC-NBS-LRR抗病基因)表达与Sl-miR6027表达呈负相关。miRNA调节植物生长发育过程，主要通过调节其靶基因的表达来实现，因此，miRNA与其靶基因的表达通常呈现此消彼长的反比关系。上述结果表明，Sl-miR6027可能通过调节Solyc09g098130的表达，从而参与调控番茄成熟发育过程。
1.4靶基因Solyc09g098130的表达受光照调节
由于Sl-miR6027启动子中存在众多的光应答元件，因此有理由推测其靶基因的表达水平也受到光照的调节。利用番茄RNA-seq数据库http://tomexpress.toulouse.inra.fr/，分析了在光、遮阴两种生长条件下Sl-miR6027的潜在靶基因Solyc09g098130表达，结果如图4所述。表明，在萌发50d后(50dpg)的茎、花中，Solyc09g098130在光照条件下表达量低于遮光条件下的表达量；而在未成熟绿期和成熟绿期果实中，Solyc09g098130在光照条件下表达量却明显高于遮光条件下的表达量。上述结果表明，Solyc09g098130的表达受到光照的调节，进一步预示Sl-miR6027及其靶基因Solyc09g098130通过调节光信号传递过程来实现对番茄果实成熟过程的调控。
1.5构建了pCambia1300-STTM6027植物沉默表达载体
根据Sl-miR6027成熟序列信息设计引物F-STTM6027和R-STTM6027，以Linker-STTM为模板利用PCR技术扩增回收得到长度为129bp的STTM6027序列，鉴定结果如图5A所示。其中，M为DL2000 DNA Marker，1～4为STTM6027。随后构建得到克隆载体pEASY-STTM6027，将其与载体pCambia1300用KpnI和BamHI进行双酶切，定结果如图5B所示。其中，1～4为pEASY-STTM6027，5为酶切的pCambia1300。分别回收片段STTM6027和片段pCambia1300，用T4连接酶连接后转入DH5α大肠杆菌感受态细胞中，利用35S前引物和STTM6027后引物序列进行菌落PCR验证、酶切验证及测序，结果如5C和5D所示。其中，C中1～4为菌落PCR，P为阳性对照，N为阴性对照；D中1～2为已酶切的重组质粒，3为未酶切的重组质粒。pCambia1300-STTM6027沉默表达载体，如图6所示。
1.6农杆菌介导转化番茄并获得阳性植株
把筛选鉴定出的1μL重组质粒用热激法导入到农杆菌EHA105感受态细胞中，在含50μg/mL利福平和100mg/L的卡那霉素抗性平板上进行筛选，随后进行菌落PCR验证筛选阳性克隆，结果如图7所示，其中，M为DL2000 DNA Marker，P为阳性对照，N为阴性对照，2～4为菌落PCR。然后通过农杆菌侵染法获得转基因植株，利用35S前引物和STTM6027后引物进行PCR检测，共获得7株PCR阳性且具有卡那霉素抗性的转基因植株，如图8所示。其中，M为DL2000 DNA Marker，P为阳性对照，N为阴性对照，1～8为PCR扩增。转基因番茄植株的获得，将为下一步Sl-miR6027的基因功能的鉴定和分子机制的阐明奠定了坚实的基础。
1.7沉默Sl-miR6027表达影响了成熟期番茄果实的颜色
对获得的T0代转基因番茄进行初步的表型分析，发现在常温生长条件下，pCambia1300-STTM6027转基因番茄与野生型番茄在植株高度、果实成熟过程等方面存在差异。野生型番茄果实在红熟期通常为鲜红色，而pCambia1300-STTM6027转基因番茄的果实在红熟期颜色变暗至暗红色，如图9所示。表明Sl-miR6027在番茄成熟过程中参与调解果实颜色的变化，其具体的调控机制有待于进一步的探究。
2.材料与方法
2.1实验材料
大肠杆菌DH5α、农杆菌EHA105、植物表达载体pCamiba-35S来源于玉林师范学院分子生物实验室，克隆载体PEASY-Blunt Clong Kit购于TRANSGENE公司。寡核苷酸由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，DNA聚合酶、限制性内切酶(KpnI,BamH I)和T4连接酶购于Thermo Fisher Scientific公司，质粒提取试剂盒和凝胶回收试剂盒购于Omega公司。
2.2 miRNA表达分析
根据TOMATO FUNCTIONAL GENOMICS DATABASE http://ted.bti.cornell.edu/番茄基因组数据库中miRNA表达数据，选择未成熟绿期(Immature)、绿熟期(Mature green)、绿熟期、破色期(Breaker)、红熟期(Red ripe)果实中Sl-miR6027的表达量，对Sl-miR6027在番茄果实不同发育期的表达量进行分析，用Excel作图。
2.3启动子分析
根据基因组序列及Sl-miR6027前体序列，选择Sl-miR6027基因转录起始位点上游1900bp DNA序列，提交启动子在线预测软件http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/预测Sl-miR6027启动子中存在的顺式作用元件。
2.4靶基因预测
利用靶基因在线预测软件http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/预测Sl-miR6027的靶基因。
2.5靶基因的光调控表达模式
利用番茄RNA-Seq表达数据库http://tomexpress.toulouse.inra.fr/数据，挖掘靶基因Solyc09g098130在光照及遮光条件下茎、花、果实中的表达数据，利用Excel处理数据并做出柱状图。
以上实施例为本发明的部分实施方式，并不限制于本发明。对本领域技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下做出的若干改进和变型，也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 玉林师范学院
<120> 番茄miR6027基因在控制植物果实颜色中的应用方法
<140> 2019106923183
<141> 2019-07-30
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 番茄(Lycopersicon esculentum)
<400> 1
tgtttctcgt gaatccttcg gc 22
<210> 2
<211> 59
<212> DNA
<213> 番茄(Lycopersicon esculentum)
<400> 2
ggagaggaca gggtacccgc cgaaggattc ctaacgagaa acagttgttg ttgttatgg 59
<210> 3
<211> 59
<212> DNA
<213> 番茄(Lycopersicon esculentum)
<400> 3
ctctagagga tcccctgttt ctcgtctaga atccttcggc attcttcttc tttagacca 59
<210> 4
<211> 49
<212> DNA
<213> 番茄(Lycopersicon esculentum)
<400> 4
gttgttgttg ttatggtcta atttaaatat ggtctaaaga agaaggaat 49

Claims (3)

1.番茄miR6027基因在控制植物果实颜色中的应用方法，其特征在于，利用miR6027成熟序列来构建pCambia1300-STTM6027沉默表达载体，然后通过农杆菌介导法转化番茄，通过番茄miR6027基因调控果实颜色；其中，根据miR6027成熟序列为TGTTTCTCGTGAATCCTTCGGC，设计构建STTM6027沉默载体的寡核苷酸序列，序列如下：
F-STTM6027:GGAGAGGACAGGGTACCCGCCGAAGGATTCCTAACGAGAAACAGTTGTTGTTGTTATGG，
R-STTM6027:CTCTAGAGGATCCCCTGTTTCTCGTCTAGAATCCTTCGGCATTCTTCTTCTTTAGACCA，
Linker-STTM:GTTGTTGTTGTTATGGTCTAATTTAAATATGGTCTAAAGAAGAAGGAAT。
2.根据权利要求1所述的番茄miR6027基因在控制番茄果实颜色中的应用方法，其特征在于，所述农杆菌介导法中采用的基因工程菌为农杆菌EHA105。
3.根据权利要求2所述的番茄miR6027基因在控制番茄果实颜色中的应用方法，其特征在于，所述农杆菌介导法转化番茄的步骤为：将含有所述pCambia1300-STTM6027沉默表达载体的阳性菌接入液体LB培养基中，培养12～16h，然后进行质粒提取，转化到农杆菌EHA105感受态细胞中。
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Assignee: Guangxi Longcheng Agricultural Investment Development Co.,Ltd.

Assignor: Yulin Normal University

Contract record no.: X2022450000369

Denomination of invention: Application of tomato miR6027 gene in controlling plant fruit color

Granted publication date: 20211210

License type: Common License

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