ES2626560T3 - Método para modular procesos vegetales - Google Patents

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ES2626560T3 ES15767295.7T ES15767295T ES2626560T3 ES 2626560 T3 ES2626560 T3 ES 2626560T3 ES 15767295 T ES15767295 T ES 15767295T ES 2626560 T3 ES2626560 T3 ES 2626560T3
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Abstract

Método para mejorar la absorción de nutrientes, la tolerancia al estrés abiótico y el crecimiento en plantas que comprende: (a) extraer miARN156 y/o miARN399d de una planta; o (b) recoger exudado de raíz que comprende miARN156 y/o miARN399d; y suministrar a una planta en desarrollo o a una semilla el extracto o el exudado.

Description

imagen1
imagen2
imagen3
imagen4
imagen5
Algunas de ellas están implicadas en la regulación de procesos en relación al desarrollo de la planta y la respuesta al estrés (Figura 3). Las secuencias de miARN que comprenden 20 a 22 nucleótidos y repetidas al menos 100 veces (5.059 secuencias)
5 se sometieron a Blast frente la base de datos GenBank de NCBI de Arabidopsis para encontrar dianas posibles. Los resultados informaron del posible emparejamiento de secuencia de miARN de Ascophyllum con 2.303 genes de Arabidopsis anotados. Este grupo posiblemente comprende también miARN novedoso no representado en familia de miARN previamente conocida. Los genes de Arabidopsis emparejados se agruparon en 50 clases implicadas en Procesos Biológicos (52 %), Funciones Moleculares (44 %) y Componentes Celulares (4 %) (clasificación GO –
10 Figura 4).
Las dianas relacionadas con el Proceso Biológico GO:0007166 (p=6,08 x 10-5) comprenden genes relacionados con la activación del mecanismo de defensa, respuesta a frío, respuesta a etileno, ABA y estímulos de azúcar, hormonas y metabolismos de carbohidrato, crecimiento y desarrollo (Fig. 4). Este grupo de genes de Arabidopsis es
15 probablemente una diana interesante para la acción de los miARN producidos por Ascophyllum nodosum.
El miARN de Ascophyllum nodosum está muy conservado en plantas
Para identificar el miARN conservado en Ascophyllum nodosum, los inventores compararon los conjuntos de datos
20 con los miARN vegetales y animales conocidos usando la base de datos miRBase (versión 21, publicada en junio de 2014, http://www.mirbase.org).
No permitiendo errores de emparejamiento entre secuencias de 20 a 22 nucleótidos, se identificaron un total de 62 miARN maduros putativos correspondientes a familias de miARN vegetales conocidas (Tabla II), compuestas así por
25 ortólogos de miARN putativos de diferentes especies vegetales.
La Tabla II muestra secuencias identificadas en Ascophyllum nodosum que comparten 100 % de homología con la secuencia de miARN conocidos para plantas superiores.
30 Tabla II
Nombre
Secuencias SEQ. ID. Códigos ID usados para identificar la familia
miR-166
AGAATGTCGTCTGGTTCGAGA GGGATGTTGTCTGGCTCGACA TCGGACCAGGCTTCAATCCCT TCGGACCAGGCTTCATTC TCGGACCAGGCTTCATTCC SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:5 miR166, miR166a. miR166a-3p, miR166b. miR166c, miR166c-3p, miR166c-5p, miR166d. miR166d-3p, miR166d-5p. miR166e, miR166e-3p. miR166f, miR166f3p. miR166g, miR166g-3p. miR166h, miR166h-3p. miR166i, miR166i-3p.
miR-166
TCGGACCAGGCTTCATTCCCC TCGGACCAGGCTTCATTCCCT TCGGACCAGGCTTCATTCCTC TCTCGGACCAGGCTTCATTCC TTGGACCAGGCTTCATTCCCC SEQ ID NO:6 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:8 SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:10 miR166i-5p, miR166j, miR166j-3p, miR166k, miR166k-3p, miR166l, miR166l-3p, miR166m, miR166n, miR166n-3p, miR166o, miR166p. miR166q, mir166r. mir166s. mir166t, miR166u
miR-398
GGGTTGATTTGAGAACATATG TATGTTCTCAGGTCGCCCCTG SEQ ID NO:11 SEQ ID NO:12 miR398: miR398a miR398a-3p
miR-168
CCCGCCTTGCATCAACTGAAT CCTGCCTTGCATCAACTGAAT SEQ ID NO:13 SEQ ID NO:14 miR-168: miR168a, miR168a-3p, miR168a5p. miR168b, miR168b-3p, miR168b-5p, miR168c, miR168c-5p, miR168d, miR168e
Nombre
Secuencias SEQ. ID. Códigos ID usados para identificar la familia
TCCCGCCTTGCACCAAGTGAAT TCGCTTGGTGCAGATCGGGAC
SEQ ID NO:15 SEQ ID NO:16
TCGCTTGGTGCAGGTCGGGAC
SEQ ID NO:17
miR-396
GTTCAATAAAGCTGTGGGAAG TTCCACAGCTTTCTTGAACTT SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:19 miR396: miR396c. miR396c-3p, miR396c5p, miR396d, miR396d-3p, miR396d-5p, miR396e, miR396e-3p, miR396e-5p, miR396f, miR396f-5p, miR396h. miR396i-5p, miR396k-5p
miR-159
TTTGGATTGAAGGGAGCTCTA SEQ ID NO:20 miR159: miR159, miR159a miR159a.1, miR159a-3p, miR159b, miR159b-3p.1, miR159c, miR159d. miR159f, miR159f-3p. miR159j-3p, mir159k3p
miR-6027
ATGGGTAGCACAAGGATTAATG TGAATCCTTCGGCTATCCATAA SEQ ID NO:21 SEQ ID NO:22 miR6027: miR6027, miR6027-3p, miR60275p
miR-6024
TTTAGCAAGAGTTGTTTTACC TTTTAGCAAGAGTTGTTTTACC SEQ ID NO:23 SEQ ID NO:24 miR6024: miR6024
miR-162
TCGATAAACCTCTGCATCCAG SEQ ID NO:25 miR162: miR162, miR162-3p, miR162a, miR162a-3p. miR162b-3p, miR162c
miR-156
GCTTACTCTCTATCTGTCACC TTGACAGAAGATAGAGAGCAC SEQ ID NO:26 SEQ ID NO:27 miR156: miR156a, miR156aa, miR156b, miR156c-3p, miR156e-3p, miR156f, miR156g, miR156g-3p, miR156h, miR156i, miR156j, miR156p, miR156q, miR156r, miR156s, miR156x, miR156y, miR156z
miR-157
TTGACAGAAGATAGAGAGCAC SEQ ID NO:28 miR157: mlr157d, miR157d-5p
miR-9471
TTGGCTGAGTGAGCATCACGG TTGGCTGAGTGAGCATCACT TTGGCTGAGTGAGCATCACTG SEQ ID NO:29 SEQ ID NO:30 SEQ ID NO:31 miR9471: miR9471a-3p, miR9471b-3p
miR-390
AAGCTCAGGAGGGATAGCACC AAGCTCAGGAGGGATAGCGCC SEQ ID NO:32 SEQ ID NO:33 miR390: miR390, miR390-5p, miR390a, miR390a-5p, miR390b-5p, miR390c. miR390d, miR390d-5p, miR390e, miR390f, miR390g
miR-169
TAGCCAAGGATGACTTGCCT SEQ ID NO:34 miR169: miR169, miR169a miR169b, miR169c, miR169d, miR169e, miR169f, miR169g, miR169h, miR169i, miR169j, miR169k, miR169l, miR169m, miR169m, miR169o, miR169p, miR169g, miR169r, miR169s, miR169t, miR169u
miR-1919
TGTCGCAGATGACTTTCGCCC SEQ ID NO:35 miR1919, miR1919-5p, miR1919c-5p
Nombre
Secuencias SEQ. ID. Códigos ID usados para identificar la familia
miR-397
ATTGAGTGCAGCGTTGATGAC SEQ ID NO:36 miR397: miR397, miR397-5p, miR397a, miR397b-5p
miR-414
TCATCCTCATCATCATCGTCC SEQ ID NO:37 miR414: miR414
miR-4376
TACGCAGGAGAGATGATGCTG SEQ ID NO:38 miR4376: miR4376, miR4376-5p
miR-482
TCTTGCCTACACCGCCCATGCC SEQ ID NO:39 miR482. miR482b-3p, miR482d
miR-5168
TCGGACCAGGCTTCAATCCCT SEQ ID NO:40 miR5168: miR5168-3p (blast con también la familia miR166)
miR-5300
TCCCCAGTCCAGGCATTCCAAC SEQ ID NO:41 miR5300: miR5300
miR-827
TTAGATGACCATCAGCAAACA SEQ ID NO:42 miR827: miR827. miR8273p
miR-9470
TTTGGCTCATGGATTTTAGC SEQ ID NO:43 miR9470: miR6471b-3p
miR-9476
AAAAAGATGCAGGACTAGACC SEQ ID NO:44 miR9476: miR9476-3p
Los resultados muestran que los extractos de Ascophyllum contienen pequeños ARN cuyas secuencias son idénticas a los expresados en plantas superiores como miARN. Es muy plausible que estos miARN sean capaces de modular procesos fisiológicos y/o patológicos en plantas por medio de un mecanismo de interferencia ambiental
5 puesto que están muy conservados en las plantas.
Ejemplo II
Liberación vegetal de miARN
10 Para verificar si una planta es capaz de liberar miARN, se usó un sistema hidropónico. En particular, se cultivaron plantas de Arabidopsis en una cámara de crecimiento a 23 ºC con un fotoperiodo de 12/12. La intensidad de luz era de 100 micromol de fotones m-2 s-2 (como se describe por Gibeaut y col. 1997, Plant Physiol., 115:317-319) y se detectó miARN399d en el medio de cultivo externo.
15 El análisis se ha llevado a cabo usando una metodología de RT-PCR, acoplada con la detección por PCR cuantitativa de miR399d, pre-miR399d, las secuencias de ARN ARNr 40 S y GAPDH.
El procedimiento de RT de tallo-bucle seguido de análisis por PCR de sybr-green se usó para amplificar la secuencia
20 de miR399. Los resultados mostrados en la Figura 5 muestran claramente que pre-miR399 así como las secuencias de miR399 maduras se detectan en el medio de cultivo externo, mientras que las otras secuencias de ARN de cadena sencilla no se detectaron.
Los resultados fuertemente sugieren que el miARN puede ser liberado de raíces de Arabidopsis y soportan la visión 25 de la absorción posterior de los miARN por plantas cercanas. La detección de los miARN en el medio hidropónico externo no estéril sugirió que los miARN son estables incluso fuera de la planta.
La estabilidad de los miARN después de la extracción
30 Generalmente se cree que los ARN son muy inestables debido a la acción de las ARNasas. Para verificar la estabilidad de las moléculas de ARN pequeñas fuera del compartimento celular, se ha evaluado la estabilidad de los miARN en un extracto bruto de planta.
Se ha extraído el ARN total de los brotes y las raíces de plantas de Arabidopsis que sobreexpresan miR399d. Las 35 hojas se congelaron rápidamente en líquido después de la extracción machacando con mortero y la mano de mortero usando tampón citrato 100 mM (pH 6).
El extracto se ha mantenido, sin realizar una etapa de centrifugación, a temperatura ambiente (RT) y a 4 ºC durante diversos días. 40
Inesperadamente, se ha detectado miR399d en los extractos derivados de o bien raíz o brote incluso después de 4 días de incubación. Se han observado diferencias de estabilidad de miR399d no significantes entre las condiciones RT o 4 ºC (Figura 6).
5 Estos resultados demuestran la estabilidad de los miARN en un extracto y, por lo tanto, confirman la posibilidad de formular un producto basado en ARN de doble cadena para ser suministrado de manera exógena a las plantas para modular la expresión génica vegetal sin ningún interés en relación con la estabilidad de ARN. Ejemplo III
10 El cultivo conjunto de plantas de Arabidopsis que sobreexpresan miR399d da como resultado el silenciamiento del gen diana (PHO2) en plantas de tipo natural cercanas.
Para entender si los miARN exógenos pueden afectar la expresión del gen diana en una planta que no es la que lo produce, los inventores establecen un experimento en el que plantas de Arabidopsis de tipo natural (Figura 7A) y 15 plantas que sobreexpresan el gen miR399d (OE-miR399d-Figura 7B) se cultivaron por separado usando un sistema hidropónico.
La composición de la solución hidropónica se informa en la Tabla I
20 Tabla I
Macronutrientes
KNO3
1,25 mM
Ca(NO3)2
1,50 mM
MgSO4
0,75 mM
KH2PO4
0,50 mM
Micronutrientes
KCl
50 µM
H3BO3
50 µM
MnSO4
10 µM
CuSO4
1,5 µM
ZnSO4
2 µM
Fe-EDTA
72 µM
Se cultivaron conjuntamente un grupo de plantas en la misma bandeja. Por tanto, los miARN que finalmente se derraman de las plantas OE-miR399d pueden alcanzar el sistema radicular de las plantas de tipo natural (Figura
25 7C). Por lo tanto, si los miARN producidos por la OE-miR399d se absorben por las plantas de tipo natural, uno debería esperar que la expresión del gen PHO2, que es la diana de miR399, también esté afectada en las plantas de tipo natural que se cultivaron conjuntamente con las plantas OE-miR399d.
Los resultados mostraron que la expresión de PHO2 se ha reducido en las plantas de tipo natural que se cultivaron 30 conjuntamente con las plantas OE-miR399d, indicando así que los miARN salen de las raíces de las plantas OEmiR399d y son absorbidos por las plantas de tipo natural (Figura 8).
Puesto que la expresión de PHO2 está fuertemente afectada por el nivel de fosfato en el medio, el experimento se repitió añadiendo fosfato extra al medio.
35 Los resultados confirmaron que el miARN exógeno reprimía PHO2 en las plantas de tipo natural incluso en presencia de fosfato extra en el medio (Figura 9).
En un experimento separado, las plantas de tipo natural se trataron con un medio en el que o bien plantas de tipo 40 natural o plantas OE-miR399d se cultivaron desde la fase de germinación. Este medio debería contener miARN salidos respectivamente de las raíces de tipo natural o de las raíces de OE-miR399d.
Los resultados en la Figura 10 muestran la expresión de PHO2 en raíces de cuatro plantas individuales para cada uno de los dos tratamientos. En tres de cada cuatro casos, el medio de las plantas OE-miR399d era capaz de 45 reprimir PHO2 (Figura 10).
imagen6

Claims (1)

  1. imagen1
ES15767295.7T 2014-08-06 2015-08-06 Método para modular procesos vegetales Active ES2626560T3 (es)

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US201462033757P 2014-08-06
ITMI20141447 2014-08-06
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