CN105349577A - 一种提高植物叶片淀粉含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种提高植物叶片淀粉含量的方法。本发明提供的提高植物叶片淀粉含量的方法包括将抑制微管蛋白基因TUB8表达的物质导入受体植物中，得到淀粉含量提高的转基因植物或在含有微管解聚剂的培养基中培养植物，实现植物叶片中淀粉含量的提高。通过实验证明：本发明提供的下调微管蛋白基因表达或施用微管解聚剂的方法简单、方便、可重复性好，能够很有效增加植物叶片淀粉的含量，有利于推动农业生产中高淀粉含量的材料的获得以及该些材料在生物能源制造等其他重要产业上的应用，为通过干扰微管实现植物绿色组织淀粉含量的提升提供了重要的理论支持。

Description

一种提高植物叶片淀粉含量的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种提高植物叶片淀粉含量的方法。

背景技术

绿色植物通过光合作用固定二氧化碳，生成碳水化合物，这其中的大部分都以淀粉的形式储存下来。根据其生物合成的时空差异，淀粉可以分为两类：储藏淀粉(reservestarch)和瞬时淀粉(transitorystarch)。储藏淀粉指的是合成和降解均发生在储藏器官(例如种子、根、块茎等)的淀粉存在形式，它是人类饮食中的重要组成部分，其所提供的平均热量占据人均每天所需能量的50％。瞬时淀粉又叫叶片淀粉(leafstarch)，指的是存在于植物叶片当中的、白天在叶肉细胞中合成、夜晚被降解的淀粉存在形式。叶片淀粉降解代谢所产生的麦芽糖(maltose)和葡萄糖(glucose)在被运出叶绿体后能够为植物夜间的生命活动提供能量来源(Strebetal.,2012)。作为人类或其他动物主要的食物来源，淀粉具有非常重要的食品用途。除此之外，淀粉还具有广泛的工业用途，可以应用于造纸、化妆品制造、制药等行业，还能够作为原材料参与到环保制品如生物降解塑料、环保涂料及生物燃料乙醇的生产过程中。

农业生产过程中，通常收获的作物组织大都是储藏淀粉积累的器官，这其中包括：小麦、大麦、玉米、水稻、高粱等谷类作物的种子；红薯、萝卜、甜菜等的作物的根；马铃薯、山药等作物的块茎等。收获后的作物的其余地上部分(如叶、茎等)中仍有大量的生物量(如淀粉、纤维素等碳水化合物)存在。但在实际农业生产中，这些植物组织除部分被用于牲畜饲料外，大都被焚烧或废弃在田中，致使组织中的生物量得不到有效的利用。随着科技的进步，越来越多的淀粉工业用途被人们所认识到(如上所述)。尤其是再生能源乙醇的有效、成功制备将大大缓解全球石油资源短缺、大气污染严重的现状，具有诱人的发展前景。未来对作物储藏器官以外的其余地上部分在工业用途上的合理使用，将有效地实现生物量的综合、循环利用。

目前对植物叶片淀粉降解的研究表明，这是一个主要发生在叶绿体中、需要诸多酶类共同参与的生物过程。根据参与的步骤不同，可以将这些酶类分为两大组：一组主要负责淀粉颗粒(starchgranule)的可逆磷酸化，另外一组负责淀粉链的水解。第一组酶类中包括能够磷酸化淀粉粒的两种葡聚糖水合二激酶(glucan,waterdikinase)GWD(glucan,waterdikinase)、PWD(phosphoglucan,waterdikinase)(Ritteetal.,2006)和负责去磷酸化的磷酸酶SEX4(forStarchExcess4)或LSF1(forLikeSexFour1)(Kottingetal.,2009；Comparot-Mossetal.,2010)。第二组酶类主要包括β-淀粉酶(β-amylase)BAM1、BAM3和脱支酶(debranchingenzyme)SA3、LDA(Fultonetal.,2008；Kaplanetal.,2005；Delatteetal.,2006；Wattebledetal.,2005)。β-淀粉酶能够催化α-1,4-糖苷键(α-1,4-glycosidicbond)的水解，从葡聚糖链的非还原端(nonreducingend)释放麦芽糖；脱支酶作用于支链淀粉(amylopectin)α-1,6-糖苷键(α-1,6-glycosidicbond)的水解从而去除糖链分支(Zeemanetal.,2010)。任何上述淀粉降解相关酶类的功能失常，都可能导致叶片淀粉的降解受阻，并最终在叶片中呈现淀粉过量积累的表型(starch-excessphenotype)，这就是经典的质体内淀粉降解途径，这一结论在拟南芥的上述酶类相关突变体中得到了有力的证明(Critchleyetal.,2001；Chiaetal.,2004；Niittylaetal.,2006；Comparot-Mossetal.,2010；Zeemanetal.,1998；Niittylaetal.,2004；Fultonetal.,2008)。除了经典的质体内淀粉降解途径外，植物体内还存在另外一条依赖于细胞自噬的淀粉降解途径，该途径中，自噬小泡能够将某些未知条件下进入胞质的小的淀粉粒类似物(SSGLs)运送到液泡中进行降解，自噬相关关键基因ATG6等的沉默会导致植物叶片出现不同程度的淀粉积累表型(Wangetal.,2013)。综上所述，通过干扰叶片淀粉的降解过程可以提高植物绿色组织中的淀粉积累量。这些高淀粉含量的植物绿色组织的获得将为实现淀粉各种工业用途提供大量的原材料来源。

微管是植物细胞骨架的重要组成部分，由微管蛋白α-tubulinsandβ-tubulins形成的蛋白二聚体进一步聚合而成的具有极性的管状结构。它参与到植物体内的多项重要生命过程中，如细胞分裂、极性生长、细胞壁的形成、胁迫信号的感应及内膜系统的组织和运输等。

病毒诱导的基因沉默(virusinducedgenesilencing，VIGS)是基于植物对RNA病毒防御机制发展的RNA干扰技术，通过携带目标基因片段的病毒侵染植物，诱导植物内源基因的沉默、引起表型变化，进而研究目标基因的功能。相比传统的通过转基因实现RNA干扰的手段，VIGS技术能够省去植物转化的繁琐、费时步骤，在植物当代即可实现基因的有效沉默和功能分析。其中，TRV介导的VIGS系统已在烟草、番茄等模式研究生物中得到广泛的应用。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种抑制植物微管聚合的物质的新用途。

本发明提供了抑制植物微管聚合的物质在如下(1)-(4)中至少一种中的应用：

(1)提高植物叶片中的淀粉含量；

(2)抑制植物叶片淀粉的细胞自噬降解途径；

(3)抑制植物叶片淀粉的质体内降解途径；

(4)培育高淀粉含量的植物。

上述应用中，所述抑制植物叶片淀粉的细胞自噬降解途径体现在植物叶片中自噬结构的减少。

上述应用中，所述抑制植物微管聚合的物质为如下1)或2)：

1)抑制微管蛋白基因TUB8表达的物质；

2)微管解聚剂。

上述应用中，所述抑制微管蛋白基因TUB8表达的物质为如下A)或B)：

A)序列表中序列1所示的DNA分子；

B)含有所述A)的表达载体；

所述B)具体为将所述A)插入表达载体得到的重组载体。

上述应用中，所述表达载体为pTRV2载体；所述重组载体是将序列表中序列1所示的DNA分子插入pTRV2载体的酶切位点中得到的。

上述应用中，所述微管解聚剂为甲基胺草膦和/或氨璜乐灵。

本发明的另一个目的是提供一种具有如下1)-5)中至少一种功能的产品：

1)提高植物叶片中的淀粉含量；

2)抑制植物微管的聚合；

3)抑制植物叶片淀粉的细胞自噬降解途径；

4)抑制植物叶片淀粉的质体内降解途径；

5)培育高淀粉含量的植物。

本发明提供的具有上述1)-5)中至少一种功能的产品的活性成分为抑制植物微管聚合的物质。

上述产品中，所述抑制植物叶片淀粉的细胞自噬降解途径体现在植物叶片中自噬结构的减少。

上述产品中，所述抑制植物微管聚合的物质为如下1)或2)：

1)抑制微管蛋白基因TUB8表达的物质；

2)微管解聚剂。

上述产品中，所述抑制微管蛋白基因TUB8表达的物质为如下A)或B)：

A)序列表中序列1所示的DNA分子；

B)含有所述A)的表达载体；

所述B)具体为将所述A)插入表达载体得到的重组载体。

上述产品中，所述表达载体为pTRV2载体；所述重组载体是将序列表中序列1所示的DNA分子插入pTRV2载体的酶切位点中得到的。

上述产品中，所述微管解聚剂为甲基胺草膦和/或氨璜乐灵。

本发明的最后一个目的是提供一种培育高淀粉含量的植物的方法。

本发明提供的培育高淀粉含量的植物的方法为如下1)或2)：

1)包括如下步骤：将抑制微管蛋白基因TUB8表达的物质导入植物中，得到高淀粉含量的植物；

2)包括如下步骤：在含有微管解聚剂的培养基中培养植物，得到高淀粉含量的植物。

上述方法中，所述抑制微管蛋白基因TUB8表达的物质为如下A)或B)：

A)序列表中序列1所示的DNA分子；

B)含有所述A)的表达载体；

所述B)具体为将所述A)插入表达载体得到的重组载体。

上述方法中，所述表达载体为pTRV2载体；所述重组载体是将序列表中序列1所示的DNA分子插入pTRV2载体的酶切位点中得到的。

上述方法中，所述微管解聚剂为甲基胺草膦和/或氨璜乐灵；

所述微管解聚剂在所述培养基中的浓度为10-50μM。

上述方法中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述植物为烟草，更具体为本生烟草。

本发明利用VIGS技术将烟草中的微管蛋白基因TUB8沉默，通过激光共聚焦显微观察微管蛋白基因TUB8沉默后的烟草微管网络的变化和夜间细胞自噬的情况，并通过碘染色法和淀粉定量分析试剂盒定性、定量研究微管对叶片淀粉代谢的影响。试验结果表明：TUB8沉默后的叶片细胞中的微管网络呈现异常分布，夜间参与淀粉降解的细胞自噬降解途径受到一定程度的抑制，TUB8沉默的叶片呈现严重的淀粉积累表型；本发明还通过长黑暗处理实验和淀粉合成受阻的背景下对TUB8沉默导致的淀粉积累表型进行了研究，证实了淀粉的降解途径受阻是造成TUB8沉默叶片淀粉严重积累的原因；进一步地通过对TUB8沉默叶片及细胞自噬关键基因ATG6沉默叶片中的淀粉积累量的比较显示，TUB8沉默叶片的淀粉积累表型不仅单单是由淀粉的细胞自噬降解途径被抑制所导致的，经典的质体降解途径的阻滞也是造成其淀粉过量积累的原因之一。另外，本发明还采用的两种微管解聚剂甲基胺草膦(Amiprophos-methyl，简称APM)和氨璜乐灵(Oryzalin)处理烟草小苗或植株，研究了微管对叶片淀粉代谢的影响。通过实验证明：两种药剂均能通过结合微管蛋白Tubulin，特异地抑制植物微管的聚合，而且无论是在10μMAPM、10μMOryzalin上萌发的小苗或是移植在含有APM、Oryzalin(处理浓度为10μM、50μM)的培养基上培养处理的烟草植株均呈现出严重的淀粉积累表型。进一步证明了完好微管网络对于叶片淀粉正常降解的重要性。

本发明首次发现植物微管在叶片淀粉正常降解代谢中的重要作用，为通过干扰微管实现植物绿色组织淀粉含量的提高提供了重要的理论支持。此外，本发明还提供了下调微管蛋白基因表达或施用微管解聚剂的方法，该方法简单方便、可重复性好，能够很有效提高植物叶片淀粉的含量，有利于推动农业生产中高淀粉含量的材料的获得以及该些材料在生物能源制造等其他重要产业上的应用。

附图说明

图1为TUB8基因的沉默导致微管网络的异常。图1A为RT-PCR检测VIGS-TUB8植株中的TUB8基因的成功被下调；图1B为微管网络荧光标记蛋白GFP-MBD显示VIGS-TUB8植株中的微管网络呈现异常。

图2为TUB8基因的沉默能够大幅度地增加烟草叶片淀粉的积累量。图2A为碘染色法定性检测TUB8沉默叶片和ATG6沉默叶片中的淀粉积累情况；图2B为加长暗处理实验检测TUB8沉默对叶片淀粉代谢的影响；图2C为碘染色法定性检测淀粉合成受阻的背景下TUB8沉默对叶片淀粉代谢的影响；图2D为淀粉定量分析试剂盒定量检测淀粉合成受阻的背景下TUB8沉默对叶片淀粉代谢的影响。

图3为微管解聚剂的施用能够大幅度地增加烟草小苗或叶片淀粉的积累量。图3A为平板萌发法施用微管解聚剂后的烟草小苗发育表型；图3B为平板萌发法施用微管解聚剂能够增加小苗体内的淀粉积累量(检测方法为碘染色法)；图3C为平板萌发法施用微管解聚剂能够增加小苗体内的淀粉积累量(检测方法为淀粉定量分析试剂盒)；图3D为植物移植法施用微管解聚剂能够增加烟草叶片内的淀粉积累量(检测方法为淀粉定量分析试剂盒)；图3E为植物移植法施用微管解聚剂能够增加烟草叶片内的淀粉积累量后的烟草发育表型；图3F为植物移植法施用微管解聚剂能够增加烟草叶片内的淀粉积累量(检测方法为碘染色法)。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的pTRV1载体和pTRV2载体均来自耶鲁大学DineshKumar实验室，均在文献“LiuY,SchiffM,MaratheR,etal.2002.TobaccoRar1,EDS1andNPR1/NIM1likegenesarerequiredforN-mediatedresistancetotobaccomosaicvirus.PlantJ[J],30:415-429.”中公开过，公众可从清华大学获得。

下述实施例中的PJG045载体、转化有表达细胞自噬结构荧光标记蛋白CFP-ATG8f的载体的农杆菌和沉默细胞自噬关键基因ATG6的烟草植株均在文献“WangY,YuB,ZhaoJ,etal.2013.Autophagycontributestoleafstarchdegradation.PlantCell[J],25:1383-1399.”中公开过，公众可从清华大学获得。

下述实施例中的MS培养基的配方如下表1所示：

表1、MS培养基的配方

实施例1、沉默TUB8的烟草植株的获得及其叶片淀粉含量的检测

一、沉默TUB8的烟草植株的获得

1、构建载体pTRV2-TUB8

(1)以本生烟草(Nicotianabenthamiana)的cDNA为模板，采用F1和R1引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即为沉默TUB8基因的核苷酸序列，其核苷酸序列如序列表中序列1所示，引物序列如下：

F1：5’-CGGTCTAGAAAGAACATGATGTGTGCTGCTGACC-3’；

R1：5’-CGGGGATCCCTACTCATGATATGCTTCTTCTTCG-3’。

(2)用限制性内切酶XbaI和BamHI对上述步骤1的PCR扩增产物进行双酶切，回收得到大小为450bp的DNA片段；用限制性内切酶XbaI和BamHI对pTRV2载体进行双酶切，回收得到大小9641bp的骨架载体；将上述大小为450bp的DNA片段和大小为9641bp的骨架载体连接，得到pTRV2-TUB8载体。并对其进行测序验证。

测序结果表明：pTRV2-TUB8载体为将序列表中序列1所示的DNA分子插入pTRV2载体的XbaI和BamHI酶切位点间，且保持pTRV2载体的其他序列不变得到的载体。

2、通过VIGS技术下调本生烟草微管蛋白基因TUB8的表达

(1)将pTRV1载体和上述步骤1获得的pTRV2-TUB8载体分别转化到农杆菌GV3101中；三天后分别挑取阳性克隆接种到LB液体培养基中(含50μg/mLKan，30μg/mLRif，25μg/mLGen)，28℃，200rpm振荡培养过夜；次日收集菌体，分别得到pTRV1/GV3101重组菌和pTRV2-TUB8/GV3101重组菌，并用侵染悬浮液(10mMMgCl₂，10mMMES和200μM乙酰丁香酮)重悬至OD600＝0.5。

将pTRV1载体和pTRV2载体分别转化到农杆菌GV3101中；三天后分别挑取阳性克隆接种到LB液体培养基中(含50μg/mLKan，30μg/mLRif，25μg/mLGen)，28℃，200rpm振荡培养过夜；次日收集菌体，得到pTRV1/GV3101重组菌和pTRV2/GV3101重组菌，并用侵染悬浮液(10mMMgCl₂，10mMMES和200μM乙酰丁香酮)重悬至OD600＝0.5。

(2)将上述步骤(1)获得的pTRV1/GV3101重组菌和pTRV2-TUB8/GV3101重组菌按照1：1的体积比混合，得到待侵染的菌液1，室温下放置4小时。

将上述步骤(1)获得的pTRV1/GV3101重组菌和pTRV2/GV3101重组菌按照1：1的体积比混合，得到待侵染的菌液2，室温下放置4小时。

(3)选取6叶龄大的、生长良好的本生烟草，用上述步骤(2)获得的待侵染的菌液1对其进行注射。将注射过的烟草置于光照/黑暗周期为16h/8h的温室中进行培养。两周后，TRV介导的基因沉默表型会逐渐显现出来，得到沉默TUB8的烟草植株(VIGS-TUB8)。

选取6叶龄大的、生长良好的本生烟草，用上述步骤(2)获得的待侵染的菌液2对其进行注射。将注射过的烟草置于光照/黑暗周期为16h/8h的温室中进行培养。两周后，得到对照植株(VIGS-Vector)。

(4)注射两周后，通过RT-PCR检测沉默TUB8的烟草植株(VIGS-TUB8)和对照植株(VIGS-Vector)体内TUB8基因的mRNA水平。具体检测方法如下:

A、Trizol法分别提取对照植株(VIGS-Vector)和沉默TUB8的烟草植株(VIGS-TUB8)的叶片总RNA；

B、分别取2μL上述步骤A提取的RNA进行反转录，得到cDNA；

C、以步骤B获得的cDNA为模板，采用F2和R2引物进行RT-PCR，得到扩增产物，即为目标基因TUB8的mRNA，同时以Actin为内参基因，内参基因的引物为F3和R3。引物序列如下：

F2：5’-ACAAGGGTTTCAGGTGTGCCATTC-3’；

R2：5’-AGGCTCTACAACAGTGTCCGAGAC-3’；

F3：5’-CCCAGAGAGGAAATACAGTG-3’；

R3：5’-CAATAGACGGACCAGATTCG-3’。

RT-PCR扩增程序为：95℃预变性10分钟；循环条件为95℃15秒，60℃30秒；共40循环。

使用BIO-RADCFXManager软件分析检测样本的TUB8基因的mRNA水平。

RT-PCR检测结果如图1A所示：和对照植株(VIGS-Vector)相比，沉默TUB8的烟草植株(VIGS-TUB8)的叶片的TUB8的表达量被成功下调。

(5)对沉默TUB8的烟草植株(VIGS-TUB8)进行表型观察。结果发现：与对照植株(VIGS-Vector)相比，沉默TUB8的烟草植株(VIGS-TUB8)的顶端生长受阻、叶子皱缩卷曲、花结构发育异常；注射四周左右时，沉默TUB8的烟草植株叶片开始有黄化的迹象；注射七周左右时，沉默TUB8的烟草植株(VIGS-TUB8)的叶片明显黄化，而对照植株(VIGS-Vector)未见明显黄化叶片。说明TUB8可能是植株发育的关键蛋白。

二、沉默TUB8的烟草植株叶片的微管网络的分布

1、表达GFP-MBD的沉默TUB8的烟草植株的获得

(1)构建微管网络荧光标记蛋白GFP-MBD的表达载体

A、以pGWB6载体(GenBank:AB289769.1)为模板，采用F4和R4引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即为绿色荧光蛋白GFP，其核苷酸序列如序列表中序列2所示。引物序列如下：

F4：5’-CGGGGTACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGT-3’；

R4：5’-CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGTGA-3’。

B、以人类白血病细胞系THP1的cDNA为模板，采用F5和R5引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即为微管结合蛋白MAP4的微管结合域MBD，其核苷酸序列如序列表中序列3所示。F5引物的5’端加入GFP3’末端18bp的反向互补序列。引物序列如下：

F5：5’-ATGGACGAGCTGTACAAGATGCCGTCCACAGTAAAAGAAGTGGG-3’；

R5：5’-CGGGGGCCCTCAACCTCCTGCAGGTAGGTGGCC-3’。

C、将步骤(1)和(2)得到的PCR扩增产物混合，得到混合物，将其作为模板，采用F4/R5引物进行融合PCR扩增，得到融合PCR产物，即为GFP和MBD的融合产物GFP-MBD，其核苷酸序列如序列表中序列4所示。

D、将上述序列4所示的融合PCR产物插入PJG045载体的KpnI和ApaI酶切位点间，获得表达载体GFP-MBD。并对其进行了测序。

测序结果表明：表达载体GFP-MBD为将序列4所示的DNA分子插入PJG045载体的KpnI和ApaI酶切位点间，且保持PJG045载体的其他序列不变得到的载体。

(2)表达GFP-MBD的沉默TUB8的烟草植株

将步骤(1)获得的表达载体GFP-MBD转化到农杆菌GV3101中，得到重组菌，将重组菌分别注射到上述步骤一获得的沉默TUB8的烟草植株(VIGS-TUB8)和对照植株(VIGS-Vector)的叶片中进行瞬时表达。注射48小时后，分别得到表达GFP-MBD的沉默TUB8的烟草植株和表达GFP-MBD的对照植株。

2、微管网络的分布

取表达GFP-MBD的沉默TUB8的烟草植株和表达GFP-MBD的对照植株的叶片，置于激光共聚焦扫描显微镜ZeissLSM710下进行观察。GFP-MBD的激发光为488nm。

结果如图1B所示：表达GFP-MBD的对照植株的叶片中的微管网络完整、密集，微管走向呈现随机性；而表达GFP-MBD的沉默TUB8的烟草植株中的微管网络稀疏，分布异常，主要表现在有些微管发生弯曲、断裂，有些微管则呈现平行分布。说明TUB8基因的沉默会抑制微管聚合，导致微管网络的异常。

三、观察沉默TUB8的烟草植株叶片的细胞自噬活性

文献“Wangetal.,2013”中的研究结果表明：烟草叶片中瞬时表达荧光标记蛋白CFP-ATG8f能够用于细胞自噬活性的监测；夜间烟草叶片中的细胞自噬活性呈现动态变化，主要表现在黑暗降临后的前半时间段上升，半夜时升至最高，在夜间的后半时间段下降，在黎明时降回至基础水平；这一动态变化的夜间细胞自噬活动能够参与叶片淀粉夜间的降解，自噬活性的抑制会使得一部分淀粉在夜间代谢结束时仍然积累在叶片中，呈现高于正常叶片的淀粉含量。

本发明将转化有表达细胞自噬结构荧光标记蛋白CFP-ATG8f的载体的农杆菌分别注射到步骤一获得的沉默TUB8的烟草植株(VIGS-TUB8)和对照植株(VIGS-Vector)的叶片中进行瞬时表达。注射60小时后，得到表达CFP-ATG8f的沉默TUB8的烟草植株和表达CFP-ATG8f的对照植株。

取表达CFP-ATG8f的沉默TUB8的烟草植株和表达CFP-ATG8f的对照植株的叶片，置于激光共聚焦扫描显微镜ZeissLSM710下进行观察。采用405nm激发CFP-ATG8f的荧光，而用543nm激发叶绿体的自发荧光。

结果表明：表达CFP-ATG8f的沉默TUB8和表达CFP-ATG8f的对照植株的叶片的细胞自噬活性黑暗开始时(0h)和黑暗结束时(8h)并无显著差异；然而在半夜时段(黑暗4h)存在显著差异，表达CFP-ATG8f的沉默TUB8的烟草植株的叶片内的细胞自噬结构数目明显减少，仅为表达CFP-ATG8f的对照植株叶片中细胞自噬结构数目的34％。说明微管网络的异常会影响夜间细胞自噬活性上调时细胞自噬结构的形成。

四、定性、定量检测沉默TUB8的烟草植株叶片的淀粉含量

本发明采用碘染色法和淀粉定量分析试剂盒定性、定量检测沉默TUB8的烟草植株叶片的淀粉含量，并分析造成高淀粉表型的原因。

1、碘染色法显示沉默TUB8的烟草植株叶片呈现淀粉积累表型

碘染色法的操作步骤如下：将沉默TUB8的烟草植株(VIGS-TUB8)、对照植株(VIGS-Vector)和沉默细胞自噬关键基因ATG6的烟草植株(VIGS-ATG6)置于光照/黑暗周期为16h/8h的温室中培养；在夜晚结束(即暗周期结束)时，取沉默TUB8的烟草植株(VIGS-TUB8)、对照植株(VIGS-Vector)和沉默细胞自噬关键基因ATG6的烟草植株(VIGS-ATG6)的叶片样品，置于95％酒精中加热脱色至白净，双蒸水冲洗两遍；将脱色后的样品浸泡在5％的卢戈氏溶液(Lugol'ssolution：5％I₂(w/v)；10％KI(w/v))染色10分钟。回收卢戈氏溶液，更换清水浸泡叶片，退色直至得到较干净的背景，拍照记录染色结果。

碘染色法的检测结果如图2A所示：夜晚结束时，对照植株(VIGS-Vector)在经历了一夜的物质代谢后，叶片内的淀粉所剩无几，经过染色后显示为白色或黄色；而同样条件下，沉默TUB8的烟草植株(VIGS-TUB8)叶片染色后呈现深蓝色或蓝黑色，表明叶片内有大量淀粉存在，且沉默TUB8的烟草叶片的染色程度远远高于沉默细胞自噬关键基因ATG6的烟草植株叶片。说明沉默TUB8的烟草叶片呈现严重的淀粉积累表型，且该种表型不单单是由于淀粉的细胞自噬降解途径所导致的。

2、碘染色法和淀粉定量分析试剂盒检测显示沉默TUB8的烟草植株叶片的高淀粉积累表型是由于叶片淀粉的降解途径受阻造成

造成叶片淀粉积累的原因可能有两种：淀粉合成加快或是淀粉降解变慢。为确认沉默TUB8的烟草植株叶片内高水平的淀粉积累是否是由于淀粉降解变慢造成，发明人设计了两种实验方法来研究TUB8沉默对叶片淀粉代谢的影响。

(1)长黑暗处理实验

长黑暗处理实验的具体操作步骤如下：将上述步骤一获得的沉默TUB8的烟草植株(VIGS-TUB8)和对照植株(VIGS-Vector)置于暗室中进行120h的黑暗处理，并分别在黑暗处理0h、12h、24h、36h、48h、72h、96h、120h时在叶片上打孔取样，每个时间点取三个重复，取样后立即脱色并于4℃冰箱中保存。待所有时间点的样品取完后，一起进行碘染色并拍照。

结果如图2B所示：对照植株(VIGS-Vector)叶片在光照结束时(0h)积累的淀粉在黑暗12h后会被完全降解；而沉默TUB8的烟草植株(VIGS-TUB8)叶片在黑暗处理的120h内，淀粉积累量几乎无可见的明显变化。该实验说明沉默TUB8的烟草植株叶片内的淀粉降解过程受到了阻滞。

(2)淀粉合成受阻的背景下研究TUB8沉默导致的淀粉积累表型

腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucosepyrophosphorylase，简称AGPase)作用于淀粉合成的第一个关键、限速步骤，其小亚基编码基因的APS1/ADG1的突变会导致叶片淀粉的合成量急剧下降(Linetal.,1988)。本发明通过分别构建单独沉默APS1的VIGS载体(pTRV2-APS1)和共同沉默APS1和TUB8的VIGS载体(pTRV2-APS1+TUB8)，采用VIGS技术侵染烟草，分别获得单独沉默APS1的烟草植株(VIGS-APS1)和共同沉默APS1和TUB8的烟草植株(VIGS-APS1+TUB8)，并结合步骤一获得的沉默TUB8的烟草植株(VIGS-TUB8)，以步骤一获得的对照植株(VIGS-Vector)作为对照，分别在白天光照结束点和夜晚结束点对各植株叶片内的淀粉含量进行监测。具体步骤如下：

A、载体的构建

pTRV2-APS1载体是将序列5所示的DNA分子插入pTRV2载体的XbaI和BamHI酶切位点间，且保持pTRV2载体的其他序列不变得到的载体。

pTRV2-APS1+TUB8载体是将序列6所示的DNA分子插入pTRV2载体的XbaI和BamHI酶切位点间，且保持pTRV2载体的其他序列不变得到的载体。

B、VIGS技术获得单独沉默APS1的烟草植株(VIGS-APS1)、单独沉默TUB8的烟草植株(VIGS-TUB8)、共同沉默APS1和TUB8的烟草植株(VIGS-APS1+TUB8)和对照植株(VIGS-Vector)

将上述步骤A的pTRV2-APS1载体和pTRV2-APS1+TUB8载体分别转化到农杆菌GV3101中，分别获得pTRV2-APS1/GV3101重组菌和pTRV2-APS1+TUB8/GV3101重组菌；

将pTRV1/GV3101重组菌与pTRV2-APS1/GV3101重组菌按照1：1的体积比混合后注射烟草。将注射过的烟草置于光照/黑暗周期为16h/8h的温室中进行培养。2周后，获得沉默APS1的烟草植株(VIGS-APS1)。

将pTRV1/GV3101重组菌与pTRV2-APS1+TUB8/GV3101重组菌按照1：1的体积比混合后注射烟草。将注射过的烟草置于光照/黑暗周期为16h/8h的温室中进行培养。2周后，获得共同沉默APS1和TUB8的烟草植株(VIGS-APS1+TUB8)。

C、淀粉含量的检测

将单独沉默APS1的烟草植株(VIGS-APS1)、单独沉默TUB8的烟草植株(VIGS-TUB8)、共同沉默APS1和TUB8的烟草植株(VIGS-APS1+TUB8)和对照植株(VIGS-Vector)置于光照/黑暗周期为16h/8h的温室中进行培养，在白天结束时(即16h光照后)和夜晚结束时(即8h黑暗后)，分别对叶片淀粉含量进行碘染色法(方法参照上述步骤1)和淀粉定量分析试剂盒的定性、定量检测。淀粉定量测定的操作步骤如下：取待测烟草叶片样品，置95％酒精中加热脱色至白净，双蒸水冲洗两遍，得到酒精脱色后的烟草叶片；将酒精脱色后的烟草叶片晾干，置液氮中冷冻、研磨至均一的粉末，称量样品的干重(dryweight)，记录，然后按照淀粉检测试剂盒(Sigma-Aldrich，货号STA20)的操作步骤进行检测。

结果如图2C和图2D所示：在白天结束时，定性检测结果表明，沉默APS1的烟草植株(VIGS-APS1)叶片内几乎无可见淀粉，定量检测结果表明，其淀粉含量仅为野生型烟草植株叶片含量的35.8％，说明APS1的沉默的确能够减少叶片淀粉的合成；在各个时间点，共同沉默APS1和TUB8的烟草植株(VIGS-APS1+TUB8)的淀粉量均稍低于沉默TUB8的烟草植株的叶片淀粉含量；而在夜晚结束时，相对于对照植株(VIGS-Vector)，共同沉默APS1和TUB8的烟草植株(VIGS-APS1+TUB8)的叶片内仍有大量的淀粉留存。该实验进一步证实了沉默TUB8的烟草植株叶片内的淀粉积累表型不是淀粉合成加快造成，而是叶片淀粉的降解受阻过程阻滞所导致的。

已有的研究成果表明，叶片淀粉的降解通过两种途径进行：一种是经典的质体内降解途径，这也是最主要的降解的降解途径；另一条是细胞自噬的降解途径。结合TUB8沉默叶片及细胞自噬关键基因ATG6沉默叶片中的淀粉积累量的比较显示(图2A)，TUB8沉默叶片中的淀粉积累量要远远高于ATG6沉默叶片中的淀粉积累量。这表明叶片淀粉的细胞自噬降解途径受阻不是造成TUB8沉默叶片呈现严重淀粉积累表型的唯一原因；叶片淀粉经典的质体内降解途径的受阻也是造成TUB8沉默叶片淀粉积累的原因。

综上所述，微管网络的正常存在对于淀粉通过两条代谢途径(细胞自噬降解途径和经典的质体内降解途径)进行降解代谢是必需的，可以通过抑制微管网络的聚合来提高植物叶片淀粉的含量，获得高淀粉含量植物。

实施例2、微管解聚剂在提高植物叶片淀粉含量中的应用

本发明通过在烟草中施用微管解聚剂：甲基胺草膦(Amiprophos-methyl，简称APM，购自Sigma-Aldrich)和氨璜乐灵(Oryzalin，购自Sigma-Aldrich)，实现植物叶片中淀粉含量的增加。微管解聚剂的施用方法如下：

一、平板萌发法施用微管解聚剂

1、平板萌发法施用微管解聚剂

平板萌发法施用微管解聚剂的操作步骤如下：将烟草种子(Nicotianabenthamiana)进行表面消毒(用10％次氯酸钠溶液浸泡15分钟，之后用灭菌双蒸水洗涤5次，每次2分钟)；表面消毒后的种子分别点铺到含有10μMAPM的MS培养基平板、含有10μMOryzalin的MS培养基平板和不含有任何药剂的MS培养基平板上，置于光周期是16小时光照/8小时黑暗的培养室中光照培养，分别得到10μMAPM处理的小苗、10μMOryzalin处理的小苗和野生型小苗(Control)；收取2-3周大的10μMAPM处理的小苗、10μMOryzalin处理的小苗和野生型小苗用于淀粉含量分析。

2、实验结果

(1)表型的观察

对10μMAPM处理的小苗、10μMOryzalin处理的小苗和野生型小苗(Control)的表型进行观察。

结果如图3A所示：和野生型小苗(Control)相比，10μMAPM处理的小苗和10μMOryzalin处理的小苗的生长发育均明显受阻。具体表现在：MS平板上生长三周左右的野生型小苗(Control)具有4-7片叶、15-20mm左右的株高，根系发育正常；而在含有10μMAPM的MS平板和含有10μMOryzalin的MS平板上生长的10μMAPM处理的小苗和10μMOryzalin处理的小苗仅能长出两片子叶，之后胚轴和子叶的生长就几乎停滞，且无明显根结构。说明微管解聚剂的处理会抑制烟草的生长发育。

(2)淀粉含量的检测

对10μMAPM处理的小苗、10μMOryzalin处理的小苗和野生型烟草小苗(Control)体内的淀粉含量进行定性和定量检测。

淀粉含量的定性检测结果如图3B所示，淀粉含量的定量检测结果如图3C所示。定性和定量检测结果均表明在含有10μMAPM的MS平板和含有10μMOryzalin的MS平板上生长的10μMAPM处理的小苗、10μMOryzalin处理的小苗的淀粉含量均显著高于野生型小苗(Control)体内的淀粉含量。

二、植物移植法施用微管解聚剂

1、植物移植法施用微管解聚剂

植物移植法施用微管解聚剂的操作步骤如下：将烟草种子进行表面消毒(用10％次氯酸钠溶液浸泡15分钟，之后用灭菌双蒸水洗涤5次，每次2分钟)；表面消毒后的种子播至含MS培养基的组培瓶中进行培养，光周期是16小时光照/8小时黑暗；生长2-3周后，得到烟草苗，将烟草苗分别移至含10μMAPM、50μMAPM、10μMOryzalin、50μMOryzalin及不含任何药剂的组培瓶中进行处理。药剂施用4周后，分别得到10μMAPM处理的小苗、50μMAPM处理的小苗、10μMOryzalin处理的小苗、50μMOryzalin处理的小苗及野生型小苗(Control)进行淀粉含量分析。

2、淀粉含量的检测

(1)表型的观察

对10μMAPM处理的小苗、50μMAPM处理的小苗、10μMOryzalin处理的小苗、50μMOryzalin处理的小苗及野生型小苗(Control)的表型进行观察。

结果如图3E所示：从图中可以看出，10μMAPM处理的小苗、50μMAPM处理的小苗、10μMOryzalin处理的小苗、50μMOryzalin处理的小苗的生长明显滞后于野生型小苗。其中，APM对烟草生长的抑制作用较Oryzalin明显，10μMAPM处理的小苗、50μMAPM处理的小苗都变现出顶端生长停滞、叶片黄化的表型。Oryzalin处理的小苗的生长受抑制程度与浓度有关，50μMOryzalin处理的小苗生长的抑制作用明显强于10μMOryzalin，且叶片黄化表型仅出现在高浓度处理组中。

(2)淀粉含量的检测

对10μMAPM处理的小苗、50μMAPM处理的小苗、10μMOryzalin处理的小苗、50μMOryzalin处理的小苗及野生型小苗(Control)的淀粉含量进行定性和定量检测。

淀粉含量的定性检测结果如图3F所示，从图中可以看出：APM和Oryzalin的各个浓度处理组均能使受处理的烟草植株叶片出现淀粉积累，而且施加药剂浓度越高的烟草叶片中的淀粉积累量越高。

淀粉含量的定量检测结果如图3D所示，从图中可以看出：和野生型小苗(Control)相比，10μMAPM处理的小苗和10μMOryzalin处理的小苗的淀粉含量明显增加，10μMAPM或10μMOryzalin的处理就能明显的提升烟草叶片中的淀粉含量。

综上所述，可以通过用微管解聚剂来抑制微管网络的聚合，从而来提高植物叶片淀粉的含量，获得高淀粉含量植物。

Claims (10)

1.抑制植物微管聚合的物质在如下(1)-(4)中至少一种中的应用：

(1)提高植物叶片中的淀粉含量；

(2)抑制植物叶片淀粉的细胞自噬降解途径；

(3)抑制植物叶片淀粉的质体内降解途径；

(4)培育高淀粉含量的植物。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：

所述抑制植物叶片淀粉的细胞自噬降解途径体现在植物叶片中自噬结构的减少。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述抑制植物微管聚合的物质为如下1)或2)：

1)抑制微管蛋白基因TUB8表达的物质；

2)微管解聚剂。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述抑制微管蛋白基因TUB8表达的物质为如下A)或B)：

A)序列表中序列1所示的DNA分子；

B)含有所述A)的表达载体；

所述B)具体为将所述A)插入表达载体得到的重组载体；

所述微管解聚剂为甲基胺草膦和/或氨璜乐灵。

5.一种具有如下1)-5)中至少一种功能的产品，其活性成分为抑制植物微管聚合的物质；

1)提高植物叶片中的淀粉含量；

2)抑制植物微管的聚合；

3)抑制植物叶片淀粉的细胞自噬降解途径；

4)抑制植物叶片淀粉的质体内降解途径；

5)培育高淀粉含量的植物。

6.根据权利要求5所述的产品，其特征在于：所述抑制植物叶片淀粉的细胞自噬降解途径体现在植物叶片中自噬结构的减少。

7.根据权利要求5所述的产品，其特征在于：所述抑制植物微管聚合的物质为如下1)或2)：

1)抑制微管蛋白基因TUB8表达的物质；

2)微管解聚剂。

8.根据权利要求7所述的产品，其特征在于，所述抑制微管蛋白基因TUB8表达的物质为如下A)或B)：

A)序列表中序列1所示的DNA分子；

B)含有所述A)的表达载体；

所述B)具体为将所示A)插入表达载体得到的重组载体；

所述微管解聚剂为甲基胺草膦和/或氨璜乐灵。

9.一种培育高淀粉含量的植物的方法，如下1)或2)：

1)包括如下步骤：将抑制微管蛋白基因TUB8表达的物质导入植物中，得到高淀粉含量的植物；

2)包括如下步骤：在含有微管解聚剂的培养基中培养植物，得到高淀粉含量的植物。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述抑制微管蛋白基因TUB8表达的物质为如下A)或B)：

A)序列表中序列1所示的DNA分子；

B)含有所述A)的表达载体；

所述B)具体为将所示A)插入表达载体得到的重组载体；

所述微管解聚剂为甲基胺草膦和/或氨璜乐灵；

所述微管解聚剂在所述培养基中的浓度为10-50μM。