CN102041257B - 抑制鸡肌肉生成抑制素基因表达的siRNA及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抑制鸡肌肉生成抑制素基因表达的siRNA及其应用。本发明提供了作用于肌肉生成抑制素基因的小干扰RNA，为如下a)或b)或c)：a)由序列表的序列1和序列表的序列2组成的双链RNA；b)由序列表的序列3和序列表的序列4组成的双链RNA；c)由序列表的序列5和序列表的序列6组成的双链RNA。本发明获得了有效抑制鸡MSTN基因表达的小干扰RNA，在分子生物学上通过实时荧光定量PCR证明它有效的降低了MSTN的表达；在胚胎学上通过显微注射试验成功获得了骨骼肌明显增大的雏鸡。以上结果说明，本发明的小干扰RNA可用于鸡的育种，从而提高肉鸡尤其是优质鸡的产肉量。
Description
技术领域
本发明涉及一种抑制鸡肌肉生成抑制素基因表达的siRNA及其应用。
背景技术
2006年我国禽肉产量1506.6万吨，仅次于美国，位居世界第二，比1985年增长了6.5倍，而同期世界禽肉产量只增长了1.4倍。据FAO统计，我国肉鸡屠宰量从1990年的21.29亿只增加到2006年的76.95亿只，净增加55.66亿只。鸡肉产量从1990年的266.32万吨增加到2006年的1070.1万吨，净增加803.78万吨。目前我国禽肉产量占肉类总量的18.7％，人均占有量1.5千克，同比世界禽肉产量比例30.3％还有很大的上升空间。
白羽肉鸡是快大型商品化选育的鸡种，具有生长快，产肉多的特点，但肉质较差。地方优质鸡品种肉质鲜嫩，风味佳，但是生长缓慢，产肉较少。二战以后，快大型白羽肉鸡的育种进展很快，与1957年相比，快大肉鸡达到上市体重的时间缩短了69天，目前只需32天即可上市。优质鸡在我国有丰富的种质资源，粗略统计约有100多个地方鸡种，如三黄鸡，麻鸡，狼山鸡，油鸡等。这些鸡肉质鲜嫩，色香味美，其中乌鸡还具有很高的药用价值。优质鸡种长期作为我国肉鸡生产的特色产业，具有广阔的市场空间，深受消费者欢迎。虽然价格相较于快大型白羽肉鸡要贵一倍甚至更多，但是其需求量仍在不断增长。国外知名的肉鸡育种公司也一直在觊觎这个庞大市场。但是优质鸡的育种进展缓慢，达到1.5Kg时日龄不少于50天。目前优质鸡育种工作遵循世代传递清晰的传统育种方法，父系、母系均采用一年一个世代的育种方案，凭经验选取质量性状，建立育种群进行世代杂交来选育。这样不仅世代间隔长，选择强度低，并且产肉量和肉质性状与其它质量性状杂交乱配，导致育种效率低下，遗传进展缓慢。因此目前亟需加快我国优质鸡育种技术体系创新。国家对此也相当重视，自从1980年国家科委设立优质黄羽肉鸡选育计划以来，其后每个五年计划都有涉及优质鸡育种攻关计划，以期提高优质肉鸡的产肉量和肉品质。
1998年Fire等将双链RNA(dsRNA)注入线虫体内，相关基因的表达被特异性的抑制，产生了与基因敲除一样的缺陷型。他们把这种基因转录后却被抑制表达的现象叫做RNAi(RNA interference)。其机制是生物细胞内的长双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)被Dicer酶结合并切成长度为21-23bp的小干扰RNA分子(small interfering RNA，siRNA)。siRNA识别并结合靶基因转录后的mRNA上的同源序列，引导RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)将mRNA降解，导致转录后的基因沉默(posttranscriptional gene silencing，PTGS)。近年来的研究发现，RNAi现象广泛存在于动植物体内。除了siRNA以外，具有茎环结构的短发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)在细胞内经过加工后也可以变成siRNA，并诱导RNA干扰，而且作用时间更为持久。这样使得针对一些具有潜在利用价值的基因构建shRNA表达载体，并导入生物体内，特异性的对靶基因表达进行干扰，从而使动植物相关基因的表达被长期沉默成为可能。也预示着动植物在医学医药，生物科技和畜牧业生产中潜在的巨大实用价值。
肌肉生成抑制素基因(Myostatin，MSTN)是1997年McPherron等从小鼠骨骼肌cDNA文库中筛选出的一种负性调控骨骼肌生长的基因。
发明内容
本发明的目的是提供一种抑制鸡肌肉生成抑制素基因表达的siRNA及其应用。
本发明提供的作用于肌肉生成抑制素基因的小干扰RNA，为如下a)或b)或c)：
a)由序列表的序列1和序列表的序列2所示核苷酸序列组成的双链RNA；
b)由序列表的序列3和序列表的序列4所示核苷酸序列组成的双链RNA；
c)由序列表的序列5和序列表的序列6所示核苷酸序列组成的双链RNA。
本发明还保护以上任一所述小干扰RNA在抑制细胞的肌肉生成抑制素基因表达中的应用。
所述肌肉生成抑制素基因可为GenBank Accession Number：NM_001001461自5’末端第1至1128位核苷酸。
所述细胞具体可为鸡胚成肌细胞。
本发明还保护以上任一所述小干扰RNA在抑制鸡的肌肉生成抑制素基因表达中的应用。
所述肌肉生成抑制素基因可为GenBank Accession Number：NM_001001461自5’末端第1至1128位核苷酸。
以上任一所述方法均可应用于鸡的育种。
本发明获得了有效抑制鸡MSTN基因表达的小干扰RNA，在分子生物学上通过实时荧光定量PCR证明它有效的降低了MSTN的表达；在胚胎学上通过显微注射试验成功获得了骨骼肌明显增大的雏鸡。以上结果说明，本发明的小干扰RNA可用于鸡的育种，从而提高肉鸡尤其是优质鸡的产肉量。
附图说明
图1为实施例2中siRNA转染鸡胚成肌细胞(CEM)后MSTN基因荧光定量实验结果。
图2为实施例3中注射siRNA-9的实验组雏鸡(a)与对照组雏鸡(b)及相应的解剖照。
图3为实施例3中实时荧光定量PCR检测鸡胚胎期肌肉MSTN基因的表达量的结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的“％”，如无特殊说明，均为质量百分含量。
实施例1、siRNA的设计和合成
根据NCBI公布的肌肉生成抑制素基因(MSTN)设计三对siRNA如下：
第一对(siRNA-9)：5’-GCUAGCAGUCUAUGUUUAUTT-3’(序列1)；
3’-TTCGAUCGUCAGAUACAAAUA-5’(序列2)；
第二对(siRNA-338)：5’-CCACAACCGAGACGAUUAUTT-3’(序列3)；
3’-TTGGUGUUGGCUCUGCUAAUA-5’(序列4)；
第三对(siRNA-926)：5’-GCUCCGGAGAAUGUGAAUUTT-3’(序列5)；
3’-TTCGAGGCCUCUUACACUUAA-5’(序列6)；
对照siRNA(siRNA-NC)：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’；
3’-TTAAGAGGCUUGCACAGUGCA-5’。
化学合成以上4对siRNA，化学合成的siRNA为减压离心干燥品，制品干燥于管底，成干粉状。
分别将3对siRNA进行实施例2和实施例3的实验。实验前，分别将siRNA离心后加入适量DEPC水震荡器混匀制成浓度为20μM溶液。
实施例2、siRNA转染后鸡胚成肌细胞中MSTN基因的表达量
分别用实施例1制备的三对siRNA对鸡胚成肌细胞进行转染实验，具体步骤如下：
1、取发育到9天的白来航种蛋(购自中国农业大学动物科技学院试验鸡场)用灭菌弯头镊撕破鸡蛋内壳膜、尿囊膜和羊膜，夹出鸡胚，放于已加入DPBS的无菌培养皿中漂洗去血污、杂质。
2、将胚胎移至解剖镜下，用眼科镊去除鸡胚胸部皮肤，露出胸肌，从胸腔肋骨处剪取肌肉。放进装有DPBS溶液的培养皿中。以同样方式分离另一半胸肌肉组织。
3、用眼科剪将肌肉组织剪碎成1立方毫米的肉块，加入适量DPBS，用去尖头的移液器吹打几次，静置后去上清。
4、向肌肉糜中加入含15％FBS的DMEM培养基，漩涡振荡器上振荡30s，静置后吸取上清细胞悬液，重复该步骤3-5次。
5、将收集到的细胞悬液吹打数次，使细胞分散均匀，经四层纱布过滤后收集细胞滤液。
6、将细胞滤液接种于大的细胞培养瓶中，37℃ CO2培养箱中培养半小时。使其中混杂的成纤维细胞贴壁。
7、轻轻拿出细胞培养瓶，吸出上层细胞培养液，适度稀释后，经台盼蓝染色，计数其中的活细胞数(鸡胚成肌细胞)。按照3×105细胞/mL的浓度接种到已经0.01％多聚赖氨酸包被的细胞培养板中。
8、六孔板中原代培养鸡胚成肌细胞，当细胞融合度达到50％时，进行转染。
9、转染前用DPBS洗去原培养基，换为OPTI-MEM培养基(无血清)；转染液(A液：siRNA 100pmol+250μL OPTI-MEM培养基，室温5分钟；B液：脂质体2000 3μL+250μL OPTI-MEM培养基，室温放置5分钟；将A、B液混合，室温放置20分钟)逐滴加入每个培养孔中；同时设对照孔(NC)，用等体积的无菌水代替siRNA；继续培养，6小时后换正常完全培养基。
10、36小时后收集细胞，提取RNA，实时荧光定量进行MSTN基因表达干扰效果检测。
结果见图1(反应设立β-actin为内对照基因，目的基因与β-actin基因的起始拷贝数之比，作为该基因的相对表达量)。结果显示：转染了3对siRNA的成肌细胞的MSTN基因表达量显著低于对照组；siRNA-9，siRNA-338的抑制效果达到了70％。在分子水平上证明了本发明的siRNA干扰序列可以有效抑制MSTN基因的表达，间接证明了其促进肌肉的生长的作用，具有活体应用价值。
实施例3、siRNA转染后活体鸡胚中MSTN基因的表达量
分别用实施例1制备的三对siRNA和对照siRNA(siRNA-NC)对活体鸡胚进行转染实验，实验情况见表1。
表1活体鸡胚转染实验情况
| 注射组 | 注射种蛋数 | 3日龄鸡胚采集数 | 出雏鸡数 |
| siRNA-9 | 47 | 7 | 2 |
| siRNA-338 | 42 | 9 | 4 |
| siRNA-926 | 44 | 8 | 2 |
| siRNA-NC | 23 | 7 | 0 |
| NC | 79 | 8 | 6 |
3日龄鸡胚即为注射后孵化3天的鸡胚。
活体鸡胚转染实验的具体步骤如下：
1、将12μL Opti-MEM与3μL siRNA混合制成A液；12μL Opti-MEM与3μL脂质体2000混合制成B液。
2、A液与B液室温下分别孵育5min后，再将两者混合室温下孵育20min，即为转染液。
3、新鲜白来航种蛋(购自中国农业大学动物科技学院试验鸡场)赤道面开窗后，体视镜下找到胚盘中心区，于明区下针，每个胚盘注射1μL左右转染液，用石蜡膜封口后入孵，孵化温度为37.8℃，湿度为75％，翻蛋角度45度，2小时翻蛋一次，21天后出雏。
设置对照组(NC)，用等体积的无菌水代替siRNA，其它步骤同上。
将不同试验组雏鸡引颈处死，拍照记录表观，发现siRNA转染组和对照组雏鸡活体表观并无差异，但是剥皮后发现siRNA转染组比对照组肌肉组织增大明显，有明显差异。其中第1组(siRNA-9转染组)和对照组的照片见图2。
取3日龄鸡胚的新鲜肌肉组织提取RNA，利用实时荧光定量PCR检测MSTN基因的表达量。
MSTN基因荧光定量的PCR引物：
F：5’-CAGTGGATTTCGAAGCTTTTGG-3’；
R：5’-CAGGTGAGTGTGCGGGTATTT-3’；
内参β-actin基因引物：
F：5’-GAGAAATTGTGCGTGACATCA-3’；
R：5’-CCTGAACCTCTCATTGCCA-3’。
实时荧光定量PCR检测结果见图3。结果表明，三个siRNA转染组MSTN基因表达量相对于对照组均显著下降，证明本发明的siRNA能有效的干扰并抑制了MSTN基因的表达，促进鸡胚胎期肌肉的增生发育，在活体上具有明显的肌肉生长增量效应。
序列表
<110>中国农业大学
<120>抑制鸡肌肉生成抑制素基因表达的siRNA及其应用
<130>CGGNARY92581
<160>6
<210>1
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
gcuagcaguc uauguuuaut t 21
<210>2
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
ttcgaucguc agauacaaau a 21
<210>3
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>3
ccacaaccga gacgauuaut t 21
<210>4
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>4
ttgguguugg cucugcuaau a 21
<210>5
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>5
gcuccggaga augugaauut t 21
<210>6
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>6
ttcgaggccu cuuacacuua a 21
Claims (4)
1.作用于肌肉生成抑制素基因的小干扰RNA，为由序列表的序列5和序列表的序列6所示核苷酸序列组成的双链RNA。
2.权利要求1所述小干扰RNA在抑制细胞的肌肉生成抑制素基因表达中的应用，其中，所述肌肉生成抑制素基因为GenBank Accession Number:NM_001001461自5’末端第1至1128位核苷酸，所述细胞为鸡胚成肌细胞。
3.权利要求1所述小干扰RNA在抑制鸡的肌肉生成抑制素基因表达中的应用，其中，所述肌肉生成抑制素基因为GenBank Accession Number:NM_001001461自5’末端第1至1128位核苷酸。
4.权利要求2或3所述应用在鸡的育种中的应用。
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