CN102580117A - miRNA-122抑制剂在制备治疗先天性心脏病的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了miRNA-122抑制剂在制备治疗先天性心脏病的药物中的应用。所述miRNA-122抑制剂序列如下：5′-CAAACACCAUUGUCACACUCCA-3′。申请人研究发现，miRNA-122表达上调导致心肌细胞凋亡，而心肌细胞凋亡增加是室间隔缺损的机制之一，所以本发明提示miRNA-122是治疗室间隔缺损药物的新靶点，通过下调miRNA-122的表达减少心肌细胞凋亡，这是一条药物治疗的新途径。本发明的有益效果主要体现在：本发明发现了VSD治疗的一个新基因靶点，提供了miRNA-122抑制剂在制备治疗先天性心脏病尤其是室间隔缺损的药物中的新用途，为新药筛选提供了基础。
Description
(一)技术领域
本发明涉及miRNA-122抑制剂在制备治疗先天性心脏病的药物中的应用。
(二)背景技术
非编码小分子RNA(miRNAs)是小分子量和内源性的RNA，调节基因的表达。miRNA可与靶mRNA分子的3’非编码区(3′-UTR)互补序列结合，通过抑制mRNA的翻译或直接使mRNA降解，在转录后水平达到基因沉默效果。研究发现miRNA不仅在发育调控、细胞增殖与凋亡、造血过程等方面发挥作用，并且对心脏的发生发育同样有重要影响，miRNA在心脏存在高表达。
先天性心脏病(CHD)影响世界上1％的新生儿并且具有高发病率和死亡率特别是在1岁之内的婴幼儿。先天性心脏病是一类常见的先天缺陷，约占人类所有先天缺陷的25％。室间隔缺损(VSD)作为最常见的先天性心脏病，其发病机制和致病因素仍未阐明。Pax-8基因属于哺乳类Pax蛋白家族的转录因子，这一基因家族编码的蛋白质都含有成对的结构域，一个保守的八肽和同源配对形式。这是一种核蛋白，参与甲状腺滤泡细胞的发育和甲状腺特异性基因的表达。Pax-8基因敲除小鼠有多种形式的心脏缺陷，特别是类似室间隔缺损和左心室扩大呈球形，其左心室壁和室间隔的细胞凋亡增加，此外，Pax-8基因在体外下调后细胞凋亡增加。因此，研究miRNA是否参与Pax-8基因敲除小鼠心脏结构发育的异常，可为VSD治疗药物筛选提供基础。
(三)发明内容
本发明目的是提供miRNA-122抑制剂在制备治疗先天性心脏病的药物中的应用。
本发明采用的技术方案是：
miRNA-122抑制剂在制备治疗先天性心脏病的药物中的应用。
所述miRNA-122抑制剂用于制备治疗室间隔缺损的药物。
所述药物通过抑制或降低miRNA-122表达来达到降低心肌细胞凋亡的作用。
所述miRNA-122抑制剂的RNA序列如下：5′-CAAACACCAUUGUCACACUCCA-3′。
近年的研究发现，脊椎动物中存在很多miRNA，其在个体发育过程中，尤其是在细胞发育过程中起着重要的作用，同样的miRNA在心肌损伤和凋亡的过程中也发挥了重要作用。Pax是机体内重要基因家族，其蛋白是一种重要的转录调节因子，在胚胎组织和器官的分化发育过程中起着重要的作用。Pax-8是哺乳类Pax家族的一员，Pax-8基因的表达具有组织的特异性，其基因敲除小鼠具有甲状腺发育不良和甲状腺功能低下。发明人之前研究发现Pax-8敲除小鼠模型其心脏出现室间隔缺损，电镜均显示左室壁和室间隔部位存在大量凋亡心肌细胞，细胞内线粒体数量明显增多，体积明显减小，因此Pax-8敲除小鼠可作为VSD药物筛选的模型用于新药的筛选研究。
本申请人通过研究miRNA-122表达对Pax-8基因敲除小鼠心肌细胞凋亡的影响发现，miRNA-122可能是VSD治疗的一个新基因靶点，有选择的调节miRNA-122表达，可以影响整个基因网络，从而影响复杂的疾病表型。因此，miRNA-122抑制剂有望作为VSD治疗的新药物，广泛应用于先天性心脏病的防治。
本发明的有益效果主要体现在：本发明发现了VSD治疗的一个新基因靶点，提供了miRNA-122抑制剂在制备治疗先天性心脏病尤其是室间隔缺损的药物中的新用途，为新药筛选提供了基础。
(四)附图说明
图1为pax-8基因敲除小鼠鉴别；A和B为Pax-8 KO-/-条带；C为Pax-8 KO+/-条带；D为野生型小鼠条带；
图2为HE染色观察Pax-8基因敲除纯合子与杂合子小鼠心脏形态；A：箭头所指为Pax-8-/-小鼠的心脏室间隔缺损处(×400)；B：Pax-8+/-小鼠的心脏基本上正常(×400)；
图3为电子显微镜观察Pax-8基因敲除纯合子与杂合子小鼠心脏；A：Pax-8KO-/-小鼠左心室壁细胞凋亡(6200×)；B：Pax-8KO-/-小鼠左心室壁细胞线粒体数量增加，但形态变小(17500×)；C：Pax-8 KO+/-小鼠左心室壁细胞线粒体未见明显异常(17500×)；D：Pax-8 KO-/-小鼠左心室壁细胞线粒体全景图(3700×)；
图4为FCM检测24h后不同剂量FAM-NC miRNA/LipofectamineTM2000转染H9C2细胞的效率；A：空白对照组0.1％；B：2.5μL/2.5μL组81.0％；C：5μL/5μL组96.6％；D：7.5μL/7.5μL组98.7％；
图5为实时定量PCR检测miR-122表达水平；A：空白对照；B：阴性对照组；C：miR-122组；
图6流式细胞仪检测细胞的凋亡率(转染24h后)；A：空白对照组；B：阴性对照组；C：miR-122组；
图7为流式细胞仪检测细胞的凋亡率(转染48h后)；A：空白对照组；B：阴性对照组；C：miR-122组；
图8为实时定量PCR检测Pax-8表达水平；A：空白对照组；B：为阴性对照组；C：Pax-8siRNA组；D：Pax-8siRNA+miR-122抑制剂组；
图9为实时定量PCR检测miR-122表达水平；A：空白对照组；B：阴性对照组；C：Pax-8siRNA组；D：Pax-8siRNA+miR-122抑制剂组；
图10为流式细胞仪检测细胞的凋亡率(转染Pax-8siRNA后48h)；A：空白对照组；B：阴性对照组；C：Pax-8siRNA组；D：Pax-8siRNA+miR-122抑制剂组。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
材料和方法
材料与试剂：
大鼠H9C2胚胎心肌细胞株购自中国科学院上海细胞库。达尔伯克改良伊格尔培养基(high glucose)(DMEM)、胎牛血清(FBS)、0.05％胰酶/乙二胺四乙酸(EDTA)、Hanks balanced salt solution均购自美国Gibco公司。
Trizol、lipofectaInineTM 2000转染试剂、焦碳酸二乙酯(DEPC)水(RNase-free and DNase-free)均购自美国Invitrogen公司。
miScript Reverse Transcription Kit购自荷兰Qiagen公司。
PCR试剂盒(SYBR Green Realtime PCR Master Mix)购自日本TaKaRa公司。BCA蛋白浓度测定试剂盒购自美国Pierce公司。
半胱天冬酶(caspase)-3分光光度法检测试剂盒购自南京凯基公司。
AnnexinV/PI apoptosis kit购自联科公司。
细胞计数试剂盒名(CCK-8)购自日本同仁化学研究所。
其他试剂均为进口或国产分析纯。
Backman Du800计算机分光光度分析仪(美国)。
酶标仪ECX800购自美国Bio-TEX公司。
流式细胞仪(flow cytometry，FCM)购自美国BD公司。
1.1鉴别和确定Pax-8敲除小鼠。
纯合子(Pax-8-/-)和杂合子(Pax-8 KO+/-)小鼠的获得以前已经报道过，它们的基因型通过PCR鉴别，鉴别引物如下：Pax-8：forward primer5′-GGATGTGGAATGTGTGCGAGG-3’，5′-GCTAAGAGAAGGTGGATGAGAG-3’，reverse primer 5′-GATGCTGCCAGTCTCGTAG3’；
反应条件：94℃5min；94℃15s、60℃15s、72℃30s，25个循环；72℃再延伸5min。
1.2 MicroRNA芯片杂交分析
首先收集试验组和对照组的小鼠的心脏，然后用总RNA试剂盒(Invitrogen)提取和纯化总RNA。经紫外吸收测定和变性琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA质量，miRNA分离，纯化和用Cy3标记，然后与miRNA芯片杂交，芯片结果由Agilent公司的扫描仪扫描，通过特定软件分析荧光信号的强度和比值(扫描分辨率5μm，PMT100％和5％)，两组之间的平均数值＞2为表达上调，＜0.5为表达下调。
1.3实时定量PCR分析
使用miScription Reverse Transcription Kit(QIAGEN)进行miRNAs的逆转录，具体操作根据公司的说明书进行。使用ABI7300进行PCR反应，每个miRNA的相对上样量通过U6RNA进行标准化，使用公式2-ΔCT，ΔCT＝(CTmiRNA-CTU6RNA)(CT是提示荧光信号强度达到阈值，在PCR扩增过程中所需的周期。)。miRNA实时定量PCR特定引物(见表1，由上海Invitrogen合成)和试剂盒中包括的通用引物一起参与PCR反应，实验重复3次。
表1：miRNA特异性引物
1.4 Pax-8基因敲除小鼠的心脏形态学观察
取胚胎期15.5天的小鼠心脏(分别来自Pax-8纯合子和Pax-8杂合子小鼠)做四腔心切片，切片用HE法染色来观察心脏大体形态。心脏样本用10％甲醛常温下固定72h，石蜡包埋，4μm切片。切片规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗，染色，封片观察。刚出生的小鼠心脏(分别来自Pax-8纯合子和Pax-8杂合子小鼠和C57野生型小鼠)被用于做超薄切片电镜下观察。小鼠心脏离体后分别快速取左心室壁和室间隔部位约1mm×1mm×1mm大小的组织块，固定于新鲜的2.5％戊二醛液中1周，制作电镜样本，1％锇酸后固定1h，环氧树脂包埋，做超薄切片，透射电镜观察，每份标本观察10个以上的视野，选典型视野拍照。
1.5细胞培养
大鼠H9C2心肌细胞株在含有10％FBS的DMEM(高糖)培养基中于37℃、5％CO2的孵箱中培养，平均每3天传代培养。
1.6 miR-122片段的合成
由上海吉玛公司设计并合成。miR-122片段序列为：正义链5′-UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG-3′；反义链5′-AACACCAUUGUCACACUCCAUU-3′，与大鼠基因组各基因均无显著同源性。不同剂量的FAM-NC miRNA/LipofectamineTM2000(Invitrogen)分别转染H9C2细胞(空白对照组，2.5μl/2.5μl组，5μl/5μl组，7.5μl/7.5μl组)，24小时后通过流式细胞仪检测转染效率。
1.7 miR-122片段转染H9C2心肌细胞
转染前24h，制备单细胞悬液，以1×105/孔接种至6孔板。当细胞生长达60％～70％融合，分3组：(1)miR-122组：细胞转染miR-122片段作为实验组；(2)阴性对照组：细胞转染随机合成的miRNA片段作为阴性对照组；(3)空白对照组：给予不含miRNA片段的常规培养液。在37℃，5％CO2的孵箱中培养24h后进行下一步实验。
1.8荧光实时定量PCR检测miR-122表达水平
Trizol一步法提取细胞总RNA，异丙醇法浓缩RNA，分光光度计测定总RNA的纯度，甲醛变性凝胶电泳质检总RNA的质量。取60ng总RNA，应用miRNA Isolation Kit分离小于100nt的小分子RNA，应用miScIiptReverse Transcription Kit逆转录合成cDNA，再应用ABI 7500 FAST型荧光定量PCR仪进行定量PCR检测。
PCR条件：95℃、5s，60℃、34s，共40个循环。
采用U6 RNA作为内标，进行归一化。采用美国Biosyste脚公司的Sequence Detection system(SDS)2.2.2软件进行数据分析。样品目的基因的相对表达率(relative expression，RQ)采用ΔΔCT方法计算，RQ＝2-ΔΔCT。(CT表示PCR扩增过程中荧光信号强度达到阈值所需要的循环数)，ΔCT sample＝CT sample-CT U6sample，ΔCT control＝CTcontrol-CT U6 control，ΔΔCT＝ΔCT sample-ΔCT control)。实验重复3次。
1.9 CCK-8法检测细胞抑制率
转染前1天将处于对数生长期的细胞传代至96孔板，每孔100μl 7000个细胞，并设加等浓度细胞和培养基的空白对照组，只加培养基的本底对照组，每组设6个复孔，转染48h后，弃旧培养基，避光在各孔中加入100μlCCK-8混合液(含10μl CCK-8和90μl无血清培养基)，置37℃培养箱中继续避光温育1h后酶标仪测A450值。细胞抑制率表示为(空白对照组A450-实验组A450)/(空白对照组A450-本底对照A450)，实验组A450和空白对照组A450为实验组和阴性对照组或空白对照组在λ＝450nm的吸光度，本底对照组A450为10％FBS+DMEM培养基的本底在λ＝450nm的吸光度。实验重复3次。
1.10荧光光度法检测Caspase-3活性
转染前1天将各组细胞以1×105/孔接种至6孔板，转染后48h，收集各组细胞，裂解细胞提取蛋白质。BCA法测蛋白浓度，各组均取200μg蛋白质，与Caspase-3底物反应，于37℃避光孵育4h，酶标仪测定405nm的A值作为实验值。Caspase-3活性表示为A(实验)-A(本底)：A(实验)表示干扰组，阴性对照组或空白对照组在λ＝405nm的吸光度；A(本底)表示2×Reaction buffer 50μl和Lysis buffer 50μl的本底在λ＝405nm的吸光度。实验重复3次。
1.11流式细胞仪AnnexinV/PI双染法检测细胞凋亡率
各组处于对数生长期的细胞以1×105/孔接种至6孔板，转染后收集各组培养48h的细胞，PBS洗涤1次，离心去上清，200μl binding buffer重悬细胞，加入AnnexinV-FITC5μl，PI10μl避光孵育15min，随即进行流式细胞仪检测，AnnexinV+/P-为早期凋亡细胞，双阳性为坏死细胞，双阴性为正常细胞。用MULTCYCLE软件分析处理结果。实验重复3次。
1.12合成Pax-8的siRNA和miR-122的抑制剂
上述实验可以得出转染miR-122片段后，H9C2的细胞增殖活性会降低，Caspase-3活性增强，并且细胞的凋亡也会增加。为了进一步研究miR-122在先天性心脏疾病特别是室间隔缺损的发病机制中所起的作用，将miR-122的抑制剂转染H9C2细胞，24h后再转染Pax-8的siRNA去诱导细胞凋亡，然后观察miR-122抑制剂是否可以保护H9C2细胞凋亡。
Pax-8的siRNA序列如下：正义链5′-GGAAGUGAGUAUUCUGGCATT-3′，反义链5′-UGCCAGAAUACUCACUUCCTG-3′，miR-122抑制剂序列为：5′-CAAACACCAUUGUCACACUCCA-3′(Sigma-Aldrich，St.Louis，USA)。与大鼠的基因组没有同源性。
1.13转染Pax-8的siRNA和miR-122的抑制剂
转染前24h制备单细胞悬液，以1×105/孔接种至6孔板。当细胞生长达60％～70％融合，根据LipofectamineTM2000的说明书进行转染，分4组：(1)实验组：细胞转染miR-122的抑制剂24h后再转染Pax-8的siRNA作为实验组；(2)凋亡诱导组：细胞转染Pax-8的siRNA作为凋亡诱导组；(3)NC miRNA组：细胞转染随机合成的miRNA片段作为阴性对照组；(4)空白对照组：给予不含miRNA片段的常规培养液。在37℃，5％CO2的孵箱中培养24h后进行下一步实验。
1.14.实时定量PCR检测各组RNA水平
Trizol一步法提取细胞总RNA，异丙醇法浓缩RNA，分光光度计测定总RNA的纯度，甲醛变性凝胶电泳质检总RNA的质量。取60ng总RNA，应用miRNA Isolation Kit分离小于100nt的小分子RNA，应用miScIiptReverse Transcription Kit逆转录合成cDNA，再应用ABI 7500 FAST型荧光定量PCR仪进行定量PCR检测。
PCR条件：95℃、5s，60℃、34s，共40个循环。
采用U6 RNA作为内标，进行归一化。采用美国Biosyste脚公司的Sequence Detection system(SDS)2.2.2软件进行数分析。样品目的基因的相对表达率(relative expression，RQ)采用ΔΔCT方法计算，RQ＝2-ΔΔCT。(CT表示PCR扩增过程中荧光信号强度达到阈值所需要的循环数)，ΔCT sample＝CT sample-CTU6sample，ΔCT control＝CT control-CT U6control，ΔΔCT＝ΔCT sample-ΔCT control)。实验重复3次。
1.15 CCK-8法检测细胞抑制率
转染前1天将处于对数生长期的细胞传代至96孔板，每孔100μl 7000个细胞，并设加等浓度细胞和培养基的空白对照组，只加培养基的本底对照组，每组设6个复孔，转染48h后，弃旧培养基，避光在各孔中加入100μlCCK-8混合液(含10μl CCK-8和90μl无血清培养基)，置37℃培养箱中继续避光温育1h后酶标仪测A450值。细胞抑制率表示为(空白对照组A450-实验组A450)/(空白对照组A450-本底对照A450)，实验组A450和空白对照组A450为实验组和阴性对照组或空白对照组在λ＝450nm的吸光度，本底对照组A450为10％FBS+DMEM培养基的本底在λ＝450nm的吸光度。实验重复3次。
1.16荧光光度法检测Caspase-3活性
转染前1天将各组细胞以1×105/孔接种至6孔板，转染后48h，收集各组细胞，裂解细胞提取蛋白质。BCA法测蛋白浓度，各组均取200μg蛋白质，与Caspase-3底物反应，于37℃避光孵育4h，酶标仪测定405nm的A值作为实验值。Caspase-3活性表示为A(实验)-A(本底)：A(实验)表示干扰组，阴性对照组或空白对照组在λ＝405nm的吸光度；A(本底)表示2×Reaction buffer 50μl和Lysis buffer 50μl的本底在λ＝405nm的吸光度。实验重复3次。
1.17流式细胞仪AnnexinV/PI双染法检测细胞凋亡率
各组处于对数生长期的细胞以1×105/孔接种至6孔板，转染后收集各组培养48h的细胞，PBS洗涤1次，离心去上清，200μl binding buffer重悬细胞，加入AnnexinV-FITC 5μl，PI 10μl避光孵育15min，随即进行流式细胞仪检测，AnnexinV+/P-为早期凋亡细胞，双阳性为坏死细胞，双阴性为正常细胞。用MULTCYCLE软件分析处理结果。实验重复3次。
1.18统计学分析
采用SPSS 17.0软件完成统计分析。计量资料以均数±标准差表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，独立的两组间比较用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1 Pax-8基因敲除小鼠模型PCR鉴定结果
Pax-8KO-/-表现为约370bp的单1条带，Pax-8KO+/+表现为约390bp的单1条带，Pax-8KO+/-表现为390bp和370bp双条带，见图1。
2.2 miRNA在Pax-8基因敲除小鼠中的差异表达
使用miRNA芯片筛选Pax-8-/-(实验组)和Pax-8+/-(对照组)对已知的443个miRNA进行了进一步的研究，超过两倍的miRNA表达水平差异被认为是有意义的。研究发现，有2个miRNA的表达显著减少(miR-148a*，miR-218-2*)，而有8个miRNA(miR-122，miR-125b-3p，miR-142-3p，miR-142-5p，miR-144，miR-451，miR-486，miR-7a)在试验组上调(见表2)。这10个表达差异的miRNA用实时定量PCR验证。结果表明，其中8个表达上调(miR-451，8.98倍；miR-142-3p，7.77倍；miR-144，2.80倍；miR-7a*1.99倍；miR-122，1.92倍；miR-142-5p，1.85倍；miR-148a*，1.59倍；miR-486，1.21倍)，miR-125-3p表达下调0.56，而MiR-218-2*未能通过PCR检测，因为表达水平太低(见表3)。
表2.Pax-8KO-/-和Pax-8KO+/-两小鼠模型之间的miRNAs的差异性表达
表3：实时定量PCR分析miRNAs表达的具体差异
2.3心肌组织病理学改变
光镜下Pax-8KO-/-心脏四腔心切片HE染色后形态与Pax-8KO+/-比较，Pax-8KO-/-心脏呈球形，左心室壁肥厚，室间隔增厚，左室乳头肌肥大，Pax-8KO+/-小鼠心脏形态基本正常(图2)。透射电镜下Pax-8KO-/-小鼠心肌左心室壁以及室间隔组织的肌丝肌节排列尚整齐，肌浆网扩张，可见大量的凋亡心肌细胞，凋亡程度较重，细胞染色质浓集和边移，形成凋亡小体，细胞固缩而细胞膜完整，胞浆空泡，线粒体数量明显增多，体积明显减小。Pax-8KO+/-小鼠心肌左心室和室间隔组织肌丝肌节排列尚整齐，肌浆网未见明显扩张，可见中等量的凋亡心肌细胞，线粒体大小数量未见明显异常(图3)。
2.4转染效率的测定和实时定量PCR检测miR-122的表达
为了进一步研究miR-122在先天性心脏病特别是室间隔缺损的发病机制中所起的作用，实验将适量的miR-122转染进了H9C2细胞。流式细胞仪检测转染24h后不同剂量的FAM-NC miRNA/Lipofectamine 2000TM转染6孔板中H9C2细胞的效率，空白对照组为0.1％，2.5/2.5μl组为81.0％，5/5μl组为96.6％，7.5/7.5μ组为98.7％。综合考虑转染率和过高浓度miRNA/转染试剂的脱靶效应/细胞毒性等因素，选择miRNA 5μl/LipofectamineTM2000作为转染条件(图4)。经单因素方差分析，荧光实时定量PCR结果显示，三组间两两比较，miR-122组的miR-122的表达(108.90±1.90)明显高于阴性对照组(0.41±0.02)和空白对照组(1.00±0.00)(p均＜0.01)，而阴性对照组与空白对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)(图5)。
2.5 H9C2细胞转染miR-122后CCK-8和caspase-3活性的检测
miR-122在室间隔缺损的发病机制中所起的作用被认为是其对细胞的凋亡和增值的影响。三组间两两比较，miR-122组细胞抑制率((35.64％±3.82％)较阴性对照组16.77％±5.06％)高(P＜0.01)。而caspase-3活性检测结果为：三组间两两比较，miR-122组(0.361±0.051)明显高于阴性对照组(0.112±0.014)和空白对照组(0.099±0.012)(P均＜0.01)，而阴性对照组与空白对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。
2.6 H9C2细胞转染miR-122后细胞凋亡增加
转染24h后，miR-122组细胞凋亡率(13.00％±0.76％)明显高于阴性对照组(5.13％±1.25％)和空白对照组(4.500±1.179)(P均＜0.01)。而阴性对照组与空白对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)(图6)。
转染48h后，miR-122组细胞凋亡率(20.033％±0.416％)明显高于阴性对照组(6.233％±0.306％)和空白对照组(5.467％±0.764％)(P均＜0.01)，而阴性对照组与空白对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)(图7)。这一现象具有时间依赖性，转染miR-122后48小时的细胞凋亡率(20.033％±0.416％)比较高。
2.7 H9C2细胞转染miR-122抑制剂后细胞凋亡减少
上述实验可以看到，H9C2细胞转染miR-122片段后，细胞增值减少、凋亡增加，Caspase-3活性增强，为了进一步研究miR-122在先天性心脏病特别是室间隔缺损的发病机制中所起的作用，将miR-122的抑制剂转染H9C2细胞，24h后再转染Pax-8的siRNA去诱导细胞凋亡，然后观察到的miR-122抑制剂是否可以保护H9C2细胞凋亡。实时定量PCR的检测H9C2细胞内Pax-8的表达水平，细胞转染Pax-8的siRNA的凋亡诱导组(0.055±0.005)与细胞转染miR-122和Pax-8的siRNA的实验组(0.060±0.003)明显低于阴性对照miRNA的组(0.968±0.071)和空白对照组(1.000±0.000)(P＜0.01)，而前后组组间比较无统计学差异(P＞0.05)(图8)。
实时定量PCR检测H9C2细胞内miR-122的表达水平，细胞转染miR-122抑制剂和Pax-8 siRNA的实验组(0.069±0.003)明显低于细胞转染Pax-8的siRNA的凋亡诱导组(0.964±0.081)，阴性对照miRNA的组(1.006±0.071)和空白对照组(1.000±0.000)(P＜0.01)，而后三组无显著统计学差异(P＞0.05)(图9)。
2.8 H9C2细胞转染miR-122抑制剂后降低了细胞的抑制率和caspase-3活性
如前所见，转染了miR-122片段后会增加H9C2细胞的抑制率和caspase-3活性。而将转染Pax-8 siRNA的凋亡诱导组的抑制率(31.49％±3.16％)明显高于阴性对照组(4.08％±4.46％)(P＜0.01)，但却低于转染miR-122抑制剂和Pax-8的siRNA的实验组(17.69％±2.33％)(P＜0.01)。转染Pax-8 siRNA的凋亡诱导组的Caspase-3活性(0.569±0.023)明显高于阴性对照组(0.261±0.023)和空白对照组(0.236±0.025)(P＜0.01)，并且也高于转染miR-122抑制剂和Pax-8 siRNA的实验组(0.426±0.033)(P＜0.01)，而阴性对照组和空白对照组之间无显著统计学差异(P＞0.05)。
2.9 H9C2细胞转染Pax-8 siRNA后，细胞凋亡增加，而将miR-122的抑制剂转染24h后再转染Pax-8 siRNA去诱导细胞凋亡，可以减少细胞凋亡
转染48小时后，使用流式细胞仪检测H9C2细胞凋亡情况，转染Pax-8siRNA的凋亡诱导组的凋亡率(25.57％±1.88％)明显高于阴性对照组(6.70％±1.23％)和空白对照组(4.33％±1.00％)(P＜0.01)，并且也高于转染miR-122抑制剂和Pax-8 siRNA的实验组(16.10±0.70)％(P＜0.01)，而阴性对照组和空白对照组之间无显著统计学差异(P＞0.05)(图10)。
由上述结果可见，miR-122表达在Pax-8 KO-/-小鼠上调了1.92倍，Pax-8-/-小鼠患有室间隔缺损，并且左室壁和室间隔部位细胞凋亡增加。miR-122片段或抑制剂转染H9C2心肌细胞，检测到细胞凋亡率、细胞增殖和Caspase-3活性水平跟对照组相比有差异性改变。
3.讨论
在本实验研究中，miRNA-122片段被转染到H9C2细胞中，增加细胞内该miRNA的表达水平，可以发现该组细胞与对照组相比细胞凋亡和细胞抑制率都增加，故可以推断miRNA可能导致心肌细胞的凋亡，那么miRNA-122抑制剂对心肌细胞凋亡的影响如何。发明人将Pax-8 siRNA转染进H9C2心肌细胞，建立凋亡模型，可以观察到转染Pax-8 siRNA后细胞内Pax-8表达下调，并导致细胞凋亡率和抑制率增加。发明人将miR-122的抑制剂转染H9C2细胞，24h后再转染Pax-8的siRNA去诱导细胞凋亡，可以观察到与单独转染Pax-8 siRNA的凋亡诱导组相比较，细胞凋亡率和抑制率都明显减少，所以推断，miRNA-122可能是VSD治疗的一个新基因靶点。
总之，为了解miRNA在先天性心脏疾病尤其是室间隔缺损的发病机制中所起的作用，用芯片分析了Pax-8基因敲除纯合子和杂合子小鼠中miRNA表达的差异，发现纯合子的miR-122明显上调。将miR-122的片段和抑制剂分别转染H9C2心肌细胞，研究其对心肌细胞的影响，转染miR-122片段后细胞增殖率下降，Caspase-3活性增加以及细胞凋亡增加。而转染Pax-8 siRNA的心肌细胞，其细胞内Pax-8表达水平下调，引起相应Caspase-3活性、细胞凋亡增加，细胞增殖减少。然而，当H9C2细胞转染Pax-8 siRNA前24h转染miR-122抑制剂，发现相对于单纯转染Pax-8 siRNA的心肌细胞，其细胞凋亡减少，增殖增加。
4、结论：
miR-122在Pax-8-/-小鼠心肌细胞内表达上调，可能参与了心肌细胞凋亡和先天性心脏病的发病过程，因此miR-122抑制剂作为治疗先天性心脏病的药物，具有较好开发前景。
SEQUENCE LISTING
<110> 杨, 德业
黄, 晓燕
黄, 芳
<120> miRNA-122抑制剂在制备治疗先天性心脏病的药物中的应用
<130>
<160> 5
<170> PatentIn version 3.4
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> Unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 1
caaacaccau ugucacacuc ca 22
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<212> DNA
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<212> DNA
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<400> 5
ugccagaaua cucacuucct g 21
Claims (4)
1.miRNA-122抑制剂在制备治疗先天性心脏病的药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述miRNA-122抑制剂用于制备治疗室间隔缺损的药物。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述药物通过抑制或降低miRNA-122表达来达到降低心肌细胞凋亡的作用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述miRNA-122抑制剂序列如下：5′-CAAACACCAUUGUCACACUCCA-3′。
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