CN105802977A - 一种番茄ATG8f基因的克隆及其应用 - Google Patents

一种番茄ATG8f基因的克隆及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105802977A
CN105802977A CN201610261653.4A CN201610261653A CN105802977A CN 105802977 A CN105802977 A CN 105802977A CN 201610261653 A CN201610261653 A CN 201610261653A CN 105802977 A CN105802977 A CN 105802977A
Authority
CN
China
Prior art keywords
atg8f
gene
lycopersici esculenti
fructus lycopersici
seqidno
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610261653.4A
Other languages
English (en)
Inventor
周杰
王玉
喻景权
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang University ZJU
Original Assignee
Zhejiang University ZJU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang University ZJU filed Critical Zhejiang University ZJU
Priority to CN201610261653.4A priority Critical patent/CN105802977A/zh
Publication of CN105802977A publication Critical patent/CN105802977A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8273—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for drought, cold, salt resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种番茄ATG8f基因的克隆及其应用。该基因在番茄自噬体形成过程中发挥重要作用。本发明克隆了番茄ATG8f基因，构建含番茄ATG8f基因过表达载体的根癌农杆菌工程菌A；将所述根癌农杆菌工程菌A介导转化目标植物外植体，制备得到ATG8f基因转基因植株，该植株营养生长旺盛；将所述根癌农杆菌工程菌A侵染本氏烟，可以观察点状的自噬体。说明番茄ATG8f基因在培育优良的番茄品种及自噬体检测中具有重要的应用价值。

Description

一种番茄ATG8f基因的克隆及其应用
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及番茄ATG8f基因的克隆及其应用。
背景技术
近年来，我国设施园艺产业得到迅速发展，生产面积仍以每年10％左右的速度在增长，但是由于设施结构简单、设施装备落后，设施蔬菜生产中常遭遇冬春低温弱光等逆境以及连作障碍，引起番茄、黄瓜等设施蔬菜光合效率明显下降，花粉活力降低，落花落果严重，进而影响其产量和品质，成为制约设施蔬菜产业发展的瓶颈问题。
番茄(SolanumlycopersicumL.)属喜温性果菜作物，也是我国设施园艺生产的主要栽培作物，对温度反应敏感。温度作为一个重要的环境因子对其生长发育起着至关重要的作用，设施生产中秋冬茬和早春茬，低温环境已成为制约我国设施番茄高产优质的主要障碍因子之一。逆境下，植株生长缓慢甚至停滞，株高、茎粗、叶面积等形态发生变化。此外，低温还对植物花芽分化、开花、授粉、坐果及果实发育等有明显的影响。因此发掘番茄抵御高温、低温、干旱、盐害等逆境关键基因，对培育抗逆品种具有重要的理论指导意义。
自噬(Autophagy)是真核生物细胞中进化保守的对大分子物质和细胞器降解再利用的重要过程。变性或聚集的蛋白被ATGs所识别形成双层膜的泡状结构称为自噬小体，与液泡融合将包含物溶解；自噬在植物生长发育、维持细胞平衡、免疫和逆境响应中具有重要的功能。当一些自噬基因如ATG5、ATG6、ATG7、ATG10等缺失时，自噬体不能正常形成，植物普遍表现出花粉数量减少，花粉活力下降的现象，而且对营养亏缺极为敏感，提前黄化衰老；Hanamata等(2014)通过电镜观测也发现水稻花药减数分裂后期的绒毡层细胞中观察到自噬体结构，尤其是在花粉发育的单核期最为明显。在自噬体的形成和质膜延伸过程中，ATG8s起着重要作用。因此，深入发掘自噬过程中的关键基因，不仅对阐明植物自噬在逆境响应中重要作用具有理论意义而且对培育抗逆品种奠定了深厚的基础。
发明内容
本发明提供一种番茄ATG8f基因的克隆及其应用，挖掘一种与自噬相关的关键基因。
一种番茄ATG8f基因，其核酸序列选自如下中的一种：
(1)如SEQIDNO：1所示的碱基序列；
(2)任一其碱基序列与SEQIDNO：1所示序列有90％以上同源性且编码如SEQIDNO：2所示氨基酸序列的DNA分子。
本发明还提供一种用于克隆所述番茄ATG8f基因的引物，所述引物的碱基序列如下：
SlATG8f-F：5′-GGACGAGCTGTACAAGATGGCTAAGAGCTCATT
CAAG-3′(SEQIDNO：3)；
SlATG8f-R：5′-CGCggatccCTACAGTTCGCTCAGGACC-3′(SEQIDNO：4)。
引物设计按照overlapPCR的原理设计，通过PCR的方法将GFP和ATG8f连接在一起，用于表达GFP-ATG8f融合蛋白。
本发明还提供一种如所述番茄ATG8f基因的克隆方法，包括如下步骤：
(1)从番茄幼嫩叶片中提取总RNA；
(2)将步骤(1)中获得的番茄总RNA反转录成cDNA；
(3)以步骤(2)获得的cDNA为模板，权利要求2所述引物序列为扩增引物，进行PCR扩增得ATG8f基因。
本发明还提供一种如所述番茄ATG8f基因的应用，所述应用为：构建含番茄GFP-ATG8f过表达载体的根癌农杆菌工程菌A；将所述根癌农杆菌工程菌A介导转化目标植物外植体，制备得到ATG8f基因转基因植株。
本发明还提供一种利用所述番茄ATG8f基因提高植物自噬体活性的方法，包括如下步骤，
(1)构建含番茄GFP-ATG8f过表达载体的根癌农杆菌工程菌A；
(2)将所述根癌农杆菌工程菌A介导转化目标植物外植体，制备得到ATG8f基因转基因植株；
(3)将所述根癌农杆菌工程菌A侵染本氏烟，观察自噬体的数目。
本发明使用GFP(绿色荧光蛋白基因)偶联ATG8f用于检测自噬的活性，发现一个可用于检测番茄自噬的marker基因。
优选地，所述目标植物为双子叶植物。
进一步优选地，所述目标植物为番茄或烟草。
所述根癌农杆菌工程菌A的制备方法如下：
(a)从番茄幼嫩叶片中提取总RNA；
(b)将步骤(a)中获得的番茄总RNA反转录成cDNA；
(c)以步骤(b)获得的cDNA为模板，SlATG8f-F(SEQIDNO：3)和SlATG8f-R(SEQIDNO：4)为引物(BamHI限制性酶切位点)对ATG8f基因进行扩增，获得PCR产物1；以pAC010质粒为模板，GFP-F(SEQIDNO：5)和GFP-R(SEQIDNO：6)为引物(AscI限制性酶切位点)对GFP基因进行扩增，获得PCR产物2；再以PCR产物1和PCR产物2为模板，GFP-F(SEQIDNO：5)和SlATG8f-R(SEQIDNO：4)为引物进行扩增，连接到pFGC1008载体获得OE载体；
(d)将步骤(c)获得的OE载体转入根癌农杆菌EHA105中，获得含ATG8f基因植物过表达载体的根癌农杆菌工程菌A。
所用引物序列如下：
SlATG8f-F：5′-GGACGAGCTGTACAAGATGGCTAAGAGCTCATT
CAAG-3′(SEQIDNO：3)，
SlATG8f-R：5′-CGCggatccCTACAGTTCGCTCAGGACC-3′(SEQIDNO：4)，
GFP-F：5′-TTggcgcgccATGGTGAGCAAGGGCGAG-3′(SEQIDNO：5)，
GFP-R：5′-GAATGAGCTCTTAGCCATCTTGTACAGCTCGTCC-3′(SEQIDNO：6)。
从番茄幼嫩叶片中提取总RNA采用PlanttotalRNAextractionkit(TIANGEN)，其步骤为：
(1)取0.1g叶片在液氮中磨碎，加1mL裂解液，涡旋混匀；
(2)将均浆样品在15-30℃放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离；
(3)4℃，12,000rpm离心5min，弃上清，转入一个新的无RNase的离心管中。
(4)加入200μL氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15s，室温放置3min；
(5)4℃，12,000rpm离心10min，样品会分为三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，水相的体积约为所用裂解液RZ试剂的50％。把水相转移到新管中，进行下一步操作；
(6)缓慢加入0.5倍体积的无水乙醇，混合均匀(此时肯能会出现沉淀)。将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3，4℃，12,000rpm离心30s，弃掉收集管中的废液；
(7)向吸附柱CR3中加入500μL去蛋白液RD，4℃，12,000rpm离心30s，弃废液；
(8)向吸附柱CR3中加入600μL漂洗液RW，室温静止2min，4℃，12,000rpm离心30s，弃废液；
(9)重复操作步骤(8)；
(10)将吸附柱放入2mL收集管中，4℃，12,000rpm离心2min，去除残余废液；
(11)将吸附柱CR3转入一个新的离心管中，加入50μLRNase-FreeddH2O，室温放置2min，4℃，12,000rpm离心2min；
(12)用紫外分光光度计测定OD260/OD280检验RNA样品含量与纯度，并用琼脂糖凝胶电泳对RNA的质量进行检验。
将番茄总RNA反转录成cDNA采用ToyoboReverTraAceqPCRRTKit。
本发明中自噬体数目采用LSM780共聚焦显微镜(Zeiss,德国)观察。
本发明的有益效果如下：
植物自噬在应对高温、盐害和灰霉等逆境胁迫中具有重要的功能，深入发掘自噬关键基因对阐释自噬的机理和培育抗性品种具有一定的指导意义。本发明从番茄中克隆得到可用于检测番茄自噬活性的maker基因，可以简单、快速检测自噬活性，对自噬在植物中的应用提供理论基础。
附图说明
图1为番茄ATG8f基因过表达植株PCR验证结果。M，DNAmaker；1—11，不同株系；12，无模板的阴性对照。图2为根癌农杆菌工程菌A侵染烟草后48h共聚焦结果图。
图3为根癌农杆菌工程菌B侵染烟草后48h共聚焦结果图。
具体实施方式
下述实施例中所用实验方法如无特殊说明，均为常规方法，包括PCR、纯化、酶切、连接、转化、测序等几个步骤。
下述实施例中所用实验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
实施例1
番茄ATG8f基因克隆
1.番茄总RNA提取
采用PlanttotalRNAextractionkit(TIANGEN)提取番茄幼嫩叶片的总RNA，其步骤为：
(1)取0.1g叶片在液氮中磨碎，加1mL裂解液，后用均浆仪处理；
(2)将均浆样品在15-30℃放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离；
(3)4℃，12,000rpm离心5min，去上清，转入一个新的无RNase的离心管中。
(4)加入200μL氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15s，室温放置3min；
(5)4℃，12,000rpm离心10min，样品会分为三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，水相的体积约为所用裂解液RZ试剂的50％。把水相转移到新管中，进行下一步操作；
(6)缓慢加入0.5倍体积的无水乙醇，混合均匀(此时肯能会出现沉淀)。将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3，4℃12,000rpm离心30s，弃掉收集管中的废液；
(7)向吸附柱CR3中加入500μL去蛋白液RD，4℃，12,000rpm离心30s，弃废液；
(8)向吸附柱CR3中加入600μL漂洗液RW，室温静止2min，4℃，12,000rpm离心30s，弃废液；
(9)重复操作步骤(8)；
(10)将吸附柱放入2mL收集管中，4℃，12,000rpm离心2min，去除残余废液；
(11)将吸附柱CR3转入一个新的离心管中，加入50μLRNase-FreeddH2O，室温放置2min，4℃，12,000rpm离心2min；
(12)用紫外分光光度计测定OD260/OD280检验RNA样品含量与纯度，浓度为835ng/μL，OD260/OD280＝2.12。
2.基因克隆
采用ReverTraAceqPCRRTKit(Toyobo)，将1μg番茄总RNA反转录成cDNA。根据ATG8f基因的编码序列，设计扩增出完整框的引物(表1中的SlATG8f-F和SlATG8f-R)，并在SlATG8f-R引物加上限制性酶切位点(BamHI)，然后对ATG8f基因进行扩增，获得PCR产物1。
PCR反应体系如下：
PCR反应条件设置：
表1ATG8f扩增引物序列表
实施例2
GFP基因克隆
根据GFP序列设计特异性引物(表2中的GFP-F和GFP-R)，并在GFP-F引物加上限制性酶切位点(AscI)，然后对GFP基因进行扩增，获得PCR2。
PCR反应体系如下：
PCR反应条件设置：
表2GFP基因扩增引物序列表
实施例3
GFP-ATG8f载体构建
1.PCR扩增
以GFP-F和SlATG8f-R为引物，PCR产物1和2为模板进行扩增，纯化、酶切，连接到pFGC1008载体中。
PCR反应体系如下：
PCR反应条件设置：
2.切胶回收
PCR反应结束后，回收目的条带，根据DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒(TIANGEN)进行纯化，具体步骤如下：
(1)柱平衡步骤：向吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中)加入500μL的平衡液BL，12,000rpm(～13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2重新放回收集管中；
(2)将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下(尽量切除多余部分)放入干净的离心管中，称取重量；
(3)向胶块中加入等倍体积溶液PN(如果凝胶重为0.1g，其体积可视为100μl，则加入100μlPN溶液)，50℃水浴放置，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块，可继续放置几分钟或再补加一些溶胶液，直至胶块完全溶解；
(4)将第(3)步所得溶液加入一个吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中)，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中；
(5)向吸附柱CA2中加入600μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。
(6)重复操作步骤(5)；
(7)将吸附柱CA2放回收集管中，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，尽量除尽漂洗液。将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验；
(8)将吸附柱CA2放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30-50μL洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min收集DNA溶液。
3.切胶回收产物和质粒酶切
切胶回收产物酶切反应体系如下：
质粒酶切反应体系如下：
37℃孵育2h，酶切结束后质粒根据DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒(TIANGEN)进行纯化，具体步骤同上。切胶回收产物根据普通PCR产物纯化试剂盒(TIANGEN)进行纯化，具体步骤如下：
(1)柱平衡步骤：向吸附柱CB2中(吸附柱放入收集管中)加入500μL的平衡液BL，12,000rpm(～13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2重新放回收集管中；
(2)估计PCR反应液或酶切反应液的体积，向其中加入5倍体积的结合液PB，充分混匀；
(3)将第(2)步所得溶液加入一个吸附柱CB2中(吸附柱放入收集管中)，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中；
(4)向吸附柱CB2中加入600μL漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中；
(5)重复操作步骤(4)；
(6)将吸附柱CB2放回收集管中，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱CB2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验；
(7)将吸附柱CB2放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30-50μL洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min收集DNA溶液。
4.连接
采用全式金生物公司的T4连接酶连接，具体步骤如下：
16℃连接过夜
5.转化大肠杆菌
(1)从-80℃冰箱中取出感受态细胞悬液，放置于冰上使其解冻，每50μL分装一管；
(2)每管加入连接产物5μL，轻轻摇匀，冰上放置30min；
(3)42℃水浴中热击45s，然后置于冰上冷却2—5min；
(4)向离心管中加入800μL不含抗生素的LB液体培养基，混匀后37℃振荡培养1h，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因；
(5)3000rpm离心2min，倒置离心管去掉部分上清，留下100-200μL，用移液枪吸打混匀，涂布于含有CM抗性的LB平板上，37℃倒置培养过夜。
6.测序
挑取单克隆于1mL含有CM抗性的LB液体培养基中，37℃振荡培养6h，送上海桑尼生物公司测序，测序结果正确的质粒命名为ATG8fOE。
7.根癌农杆菌工程菌构建
将ATG8fOE载体转入根癌农杆菌EHA105中，获得含番茄ATG8f基因过表达载体的根癌农杆菌工程菌A，同时将构建ATG8fOE的空载体pAC010转入根癌农杆菌EHA105中，获得含GFP基因过表达载体的根癌农杆菌工程菌B。
实施例4
番茄ATG8f过表达植株构建
1获取无菌苗
番茄种子在28℃200r/min摇6-8h，然后用75％酒精消毒30s，之后用10％NaClO中消毒15min(用摇床28℃200r/min)，灭菌水冲洗5次并转移到灭菌锥形瓶中，接种于1/2MS培养基。25℃黑暗条件下培养至发芽，转入光照培养室，幼苗生长条件为25℃、16h光照/8h黑暗，光照强度1800lx。
2准备外植体、培养农杆菌
种子发芽后6d，将无菌苗的子叶用刀切下，子叶带有一小段叶柄，置入看护培养基KCMS中预培养1d。在含有抗生素的LB平板上挑取农杆菌单菌落，接种于20mL含有抗生素的LB中，28℃、200r/min过夜培养至OD600≈1.0。
3转化再生
3.1侵染
培养好的根癌农杆菌工程菌A菌液转到50mL离心管，4℃4000r/min离心10min；倒出培养基，加入悬浮培养基MS0.2，摇匀。将3～4皿的子叶外植体转移到倒有MS0.2的灭菌培养皿中，倒入悬浮好的菌液至OD600≈0.2～0.3暗下接种感染2-3min，并轻轻晃动培养皿。将外植体转移到灭菌滤纸上，吸干残留的菌液，回接到KCMS上，22℃共培养2d(避光)。反面朝上
3.2选择培养、再生
共培养后，将外植体小心的转入MRS1(2Z+)上，2～3周后转入MRS2(0.2Z+)中培养，选择培养的过程中要及时清理污染的材料，直至长出再生芽。
4.再生芽生根、移栽
待再生芽长至1cm左右时，将芽切下，放入生根培养基中生根。2周后对生根良好、长至5cm左右的转化苗进行炼苗，移栽至一次性塑料杯中，成活后移栽至花盆中，得番茄ATG8f基因过表达植株，植株生长旺盛。转基因植株35S验证结果如图1。
实施例5
番茄ATG8f用于自噬体观测
本实施例中用的培养基和抗生素配制方法如下：
LB培养基的配制：5g酵母提取物，10g蛋白胨，10g氯化钠，用蒸馏水定容至1L，调节pH值为7.0，121℃高压灭菌20min备用。LB固体培养基每升加琼脂粉15g，其它分成份同液体培养基。
利福平：25mg/mLDMSO溶解，过滤除菌，-20℃分装保存。
氯霉素：34mg/mL，乙醇溶解，过滤除菌，-20℃分装保存。
侵染液配制：10mM氯化镁、10mMMES，pH＝5.7，用时加150μM/L乙酰丁香酮。
处理方法如下：
(1)将含有目的基因的农杆菌EHA105(根癌农杆菌工程菌A和B)划平板，36-48h出现单菌落；
(2)挑取单菌落于含有5mLLB培养基的10mL管中摇菌，在28℃条件下200rpm摇菌24h；
(3)按1:100的比例将步骤(2)的工程菌A和B液加入含有氯霉素、利福平两种抗生素的50mLLB培养基中扩大培至OD600＝0.8-1.0(约12h)；
(4)4℃，4000g，离心10min，弃上清；
(5)预冷灭菌水20mL洗涤，4000g，4℃，10min离心，弃上清；
(6)重复步骤(5)一次；
(7)预冷侵染液溶解沉淀至OD600＝0.6-0.8；
(8)室温放置3h，工程菌A和工程菌B分别侵染五至六叶时期的本氏烟；
(9)侵染后36—48h取样检测自噬体。
图2为工程菌A侵染后48h共聚焦显微镜拍摄结果，图3为工程菌B侵染后48h共聚焦显微镜拍摄结果。
结果表明，工程菌A侵染后能观察到绿色的自噬体点状结构(白色箭头所示)，而工程菌B侵染后观察不到，表明番茄ATG8f基因可用于自噬体活性的检测。
以上所述仅为本发明专利的具体实施案例，但本发明专利的技术特征并不局限于此，任何相关领域的技术人员在本发明的领域内，所作的变化或修饰皆涵盖在本发明的专利范围之中。

Claims (8)

1.一种番茄ATG8f基因，其特征在于，其核酸序列选自如下中的一种：
(1)如SEQIDNO：1所示的碱基序列；
(2)任一其碱基序列与SEQIDNO：1所示序列有90％以上同源性且编码如SEQIDNO：2所示氨基酸序列的DNA分子。
2.一种用于克隆如权利要求1所述番茄ATG8f基因的引物，其特征在于，所述引物的碱基序列如下：
SlATG8f-F：5′-GGACGAGCTGTACAAGATGGCTAAGAGCTCATTCAAG-3′；
SlATG8f-R：5′-CGCggatccCTACAGTTCGCTCAGGACC-3′。
3.一种如权利要求1所述番茄ATG8f基因的克隆方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)从番茄幼嫩叶片中提取总RNA；
(2)将步骤(1)中获得的番茄总RNA反转录成cDNA；
(3)以步骤(2)获得的cDNA为模板、权利要求2所述引物序列为扩增引物，进行PCR扩增得ATG8f基因。
4.一种如权利要求1所述番茄ATG8f基因的应用，其特征在于，所述应用为：构建含番茄GFP-ATG8f过表达载体的根癌农杆菌工程菌A；将所述根癌农杆菌工程菌A介导转化目标植物外植体，制备得到ATG8f基因转基因植株。
5.一种利用如权利要求1所述番茄ATG8f基因提高植物自噬体活性的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)构建含番茄GFP-ATG8f过表达载体的根癌农杆菌工程菌A；
(2)将所述根癌农杆菌工程菌A介导转化目标植物外植体，制备得到ATG8f基因转基因植株；
(3)将所述根癌农杆菌工程菌A侵染本氏烟，观察自噬体的数目。
6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述目标植物为双子叶植物。
7.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述目标植物为番茄或烟草。
8.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述根癌农杆菌工程菌A的制备方法如下：
(a)从番茄幼嫩叶片中提取总RNA；
(b)将步骤(a)中获得的番茄总RNA反转录成cDNA；
(c)以步骤(b)获得的cDNA为模板、SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示序列为引物，对ATG8f基因进行扩增获得PCR产物1；以pAC010质粒为模板、SEQIDNO：5和SEQIDNO：6所示序列为引物，对GFP基因进行扩增获得PCR产物2；再以PCR产物1和PCR产物2为模板、SEQIDNO：SEQIDNO：4所示序列为引物进行扩增，扩增产物连接到pFGC1008载体获得GFP-ATG8f过表达载体；
(d)将所得GFP-ATG8f过表达载体转入根癌农杆菌即得。
CN201610261653.4A 2016-04-22 2016-04-22 一种番茄ATG8f基因的克隆及其应用 Pending CN105802977A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610261653.4A CN105802977A (zh) 2016-04-22 2016-04-22 一种番茄ATG8f基因的克隆及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610261653.4A CN105802977A (zh) 2016-04-22 2016-04-22 一种番茄ATG8f基因的克隆及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105802977A true CN105802977A (zh) 2016-07-27

Family

ID=56458489

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610261653.4A Pending CN105802977A (zh) 2016-04-22 2016-04-22 一种番茄ATG8f基因的克隆及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105802977A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109734784A (zh) * 2019-01-29 2019-05-10 浙江大学 SlDALR1基因在增强番茄细菌性叶斑病抗性中的应用
CN117384914A (zh) * 2023-07-11 2024-01-12 云南大学 MhEML4基因克隆及其在种子败育中的应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105349577A (zh) * 2015-08-27 2016-02-24 清华大学 一种提高植物叶片淀粉含量的方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105349577A (zh) * 2015-08-27 2016-02-24 清华大学 一种提高植物叶片淀粉含量的方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SOON-HEE KIM ET AL.: "Genes for Plant Autophagy: Functions and Interactions", 《MOL. CELLS》 *
TIMOTHY P. DEVARENNE: "The plant cell death suppressor Adi3 interacts with the autophagic protein Atg8h", 《BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS》 *
YAN WANG ET AL.: "Autophagy Contributes to Leaf Starch Degradation", 《THE PLANT CELL》 *
朱琪等: "自噬的分子标志物", 《药学学报》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109734784A (zh) * 2019-01-29 2019-05-10 浙江大学 SlDALR1基因在增强番茄细菌性叶斑病抗性中的应用
CN117384914A (zh) * 2023-07-11 2024-01-12 云南大学 MhEML4基因克隆及其在种子败育中的应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101747419B (zh) 耐盐相关蛋白及其编码基因与应用
CN109777810B (zh) Pub41基因作为负调控因子在提高番茄灰霉病和青枯病抗性中的应用
Tiwari et al. Biotechnological approaches to improve sugarcane crop with special reference to disease resistance
CN105543269B (zh) 利用球孢白僵菌BbP4-ATPase基因提高植物对黄萎病抗性的方法
CN106636025B (zh) 一种水稻epsps突变体及其编码基因和应用
CN106480163B (zh) 一种联合苹果愈伤组织细胞培养和遗传转化鉴定苹果抗病基因的方法
CN105585619B (zh) 与水稻籽粒粒长和粒重相关蛋白及其编码基因gl3-3与应用
CN103194456B (zh) 岷江百合抗真菌基因Lr14-3-3及其应用
CN102978218B (zh) 苹果抗逆相关基因MdSIMYB2的克隆及其应用
CN102719449A (zh) 苹果抗逆相关基因MdSIMYB1的克隆及其应用
CN107641627A (zh) 一种调控番茄i型腺毛形成的h基因、h蛋白及其应用
CN105802977A (zh) 一种番茄ATG8f基因的克隆及其应用
CN103981194A (zh) 一种烟草镉转运基因NtHMA2及其克隆方法与应用
CN108486149A (zh) 一种黄瓜CsWRKY50基因在增强黄瓜霜霉病抗性中的应用
CN102453083B (zh) 与植物耐逆性相关蛋白ZmPMP3及其编码基因与应用
CN102010864B (zh) 玉米花粉组织特异性启动子及其表达载体
CN103266130A (zh) 大豆水通道蛋白基因GmPIP1;2的应用
CN106636180A (zh) 一种用于得到对盐胁迫高敏感的植物的质粒载体及方法
CN102286494B (zh) 条斑紫菜tps基因及其在提高水稻耐盐性中的应用
CN101864430B (zh) 小麦渐渗系抗非生物胁迫基因Tamyb31及其应用
CN101704882B (zh) 一种植物黄矮病抗性相关蛋白及其编码基因和应用
CN105254730B (zh) 一种提高植物耐盐耐旱性的蛋白及其编码基因与应用
CN104988175B (zh) 番茄HsfA1a基因在提高植物自噬体活性及抗旱性中的应用
CN103952431B (zh) 一种农杆菌介导的葡萄座腔菌基因转化方法
CN107176983B (zh) 蛋白质PpLEA3-3在调控植物抗逆性中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20160727