WO2021128850A1 - 一种利用除草剂进行两系杂交稻制种的方法以及用于该方法的标记引物 - Google Patents

一种利用除草剂进行两系杂交稻制种的方法以及用于该方法的标记引物 Download PDF

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赵炳然
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Definitions

  • Figure 8 is a comparison of HIS1 gene haplotypes in Example 2.
  • the various raw materials, reagents, instruments and equipment used in the present invention can be purchased from the market or can be prepared by existing methods.
  • the dCAPS marker primers and detection methods of this embodiment can quickly, efficiently, accurately and conveniently identify whether there is a T1510G mutation in the HIS1 gene of a rice line, and then determine whether the rice HIS1 gene has ⁇ -triketone herbicide resistance Lay a good foundation.
  • a method for two-line hybrid rice seed production using herbicides which adopts the "two-line method" of photo-temperature-sensitive male sterile lines for hybrid rice seed production, including the following steps:
  • Reverse primer CCJ-3R 5'-TCAGGGAGTCGATGTACCTC-3' (as shown in SEQ. ID NO. 2).

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Abstract

提供一种利用除草剂进行两系杂交稻制种的方法，包括如下步骤：利用对除草剂敏感的两系不育系母本和对该除草剂具有抗性的两系恢复系父本配成两系杂交稻组合，进行杂交制种，得到的杂交后代植株用所述除草剂对其进行均匀喷洒，以除去因温度不稳定导致母本自交接种的后代，即获得真杂种后代。还提供用于该方法的引物，该方法在两系杂交稻制种过程中可很好地解决"打摆子"现象，大大提高制种纯度，快速、准确、高效的获得真杂交种后代，筛选的效率可达到100％，操作简单，大大解放了劳动力，在杂交水稻种子纯度提升以及种质资源创新上都具有重要意义。

Description

一种利用除草剂进行两系杂交稻制种的方法以及用于该方法的标记引物 技术领域
本发明属于水稻栽培技术领域，尤其涉及一种利用除草剂进行两系杂交稻制种的方法以及用于该方法的标记引物。
背景技术
杂交水稻为我国及世界粮食安全提供了重要保障，目前生产上主要利用的是三系杂交稻和两系杂交稻。三系杂交稻主要利用细胞核质互作型不育系，该类型不育系育性比较稳定，制种相对安全，但需要对应的保持系繁殖，并且受恢保关系限制，恢复系选育比较困难；两系法杂交稻主要利用光温敏型核不育系，在短日低温条件下，不育系可以自己繁殖，一般正常的材料都可以恢复其育性，因此配组相对自由，但两系不育系育性受气温影响较大，制种遇异常低温会导致不育系自交结实，从而影响两系杂交稻种子纯度。目前在解决两系杂交稻种子纯度问题上有一些尝试，比如通过转基因手段，将抗草甘膦基因转入两系杂交稻的恢复系中，创制出恢复系和杂交种抗草甘膦而不育系不抗草甘膦的制种体系，当两系杂交稻种子里面存在不育系自交结实的情况下，通过在秧苗期喷施草甘膦，选择性杀死不抗的不育系自交种子而达到杂交种子提纯的目的；通过物理和化学的诱变方法，将原本对除草剂苯达松抗的不育系改造成敏感型，从而通过在秧苗期喷施苯达松达到提纯的目的；以及通过物理和化学诱变方法，将恢复系中的咪唑啉酮类除草剂的靶酶乙酰乳酸合酶(Acetolactate Synthase，ALS)进行突变，创制抗咪唑啉酮类除草剂的两系恢复系，从而通过在秧苗期喷咪唑啉酮达到提纯的目的。然而，转基因水稻目前在国内尚未开放种植，而诱变只能针对特定亲本，其转育受到诸多限制，实际应用推广比较慢。
β-三酮类除草剂以植物对-羟苯基丙酮酸双氧化酶(HPPD)为靶标，通过抑制HPPD，阻断质体醌和生育酚的正常合成途径，造成类胡萝卜素的生物合成减少、光合作用链电子传递受阻，以及质体的光氧化等，导致植物中叶绿素分子被破坏，促使叶片出现白化症状，甚至死亡。β-三酮类除草剂具有高效、低毒、不易产生抗性、环境相容性好以及使用安全等特点，目前已开发的品种主要有硝磺草酮、双环磺草酮(BBC)、呋喃磺草酮等。最近，在水稻中克隆了β-三酮类除草剂抗性基因HIS1，该基因编码一种Fe(II)/2-氧戊二酸依赖性加氧酶，这种加氧酶通过催化β-三酮类除草剂发生羟基化反应来让它们失去毒性。
针对两系法杂交稻制种安全需要以及不同籼稻品种对β-三酮类除草剂具有不同的抗感 特性，选用HIS1基因无功能单倍型不育系和有功能单倍型恢复系，从而达到利用β-三酮类除草剂实现两系法杂交稻种子提纯的目的，这对本技术领域具有十分重要的意义。
发明内容
基于上述发现，本发明所要解决的技术问题是，提供一种利用除草剂进行两系杂交稻制种的方法以及用于该方法的标记引物，从而实现两系法杂交稻种子提纯的目的。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：
一种利用除草剂进行两系杂交稻制种的方法，包括如下步骤：
(1)利用对除草剂敏感的两系不育系母本和对该除草剂具有抗性的两系恢复系父本配成两系杂交稻组合，进行杂交制种；
(2)将所述步骤(1)后获得的杂交种子种植，得到的杂交后代植株用所述除草剂对其进行均匀喷洒，以除去母本自交接种的后代，即获得真杂种后代。
光温敏雄性不育系的“两系法”制种容易存在大面积制种失败的现象，温度不稳定性改变是导致这种现象的主要原因之一。而本发明通过利用对除草剂敏感的两系不育系母本和对该除草剂具有抗性的两系恢复系父本配成两系杂交稻组合，进行杂交制种，即便在制种过程中遇到低温天气，导致母本自交结实，在F1代种子幼苗期喷施除草剂，将母本自交结实的种子除去，只留下可抗除草剂的真杂种，缓解两系不育系制种过程中容易出现的“打摆子”现象，提高制种纯度和质量。
本发明针对两系法杂交稻制种安全需要以及除草剂对籼稻品种不同的抗感特性，提出利用对除草剂敏感的两系不育系和对除草剂具有抗性的两系恢复系配组，通过常规方法制种，获得杂交种子。由于制种过程中可能会遇到低温天气，导致两系不育系自交结实，从而使杂交种子中混杂了母本自身种子，从而影响杂交稻制种的质量。故而在生产上，在杂交种子幼苗期喷施除草剂，不育系自交结实种子由于不具有除草剂抗性，会白化死亡，而真正的杂交种子不会受到影响，从而有效提高了杂交制种的纯度。
上述的方法，优选的，所述步骤(1)中，对除草剂敏感的两系不育系母本为水稻HIS1基因第四外显子上存在28bp缺失变异和/或水稻HIS1基因上存在T1510G突变的两系不育系母本。
优选的，所述步骤(1)中，对除草剂具有抗性的两系恢复系父本为水稻HIS1基因第四外显子上不存在28bp缺失变异且水稻HIS1基因上不存在T1510G突变的两系恢复系父本。
水稻HIS1基因(LOC_Os02g17940)是近期克隆的对β-三酮类除草剂具有广谱抗性的水稻内源性基因。经过系统分析，我们发现水稻HIS1基因第四外显子存在的28bp片段缺失变异会影响HIS1基因抗除草剂功能。水稻HIS1基因的β-三酮类除草剂抗性表型为显性，β- 三酮类除草剂敏感表型为隐性。HIS1基因28bp片段缺失变异的显隐性类型为隐性，含有隐性纯合子HIS1基因的水稻对β-三酮类除草剂抗性丧失，且只存在于部分籼稻品种中。后来的研究还发现，除了28bp缺失导致的变异之外，HIS1基因上可能还存在其他变异，也可以导致其功能的丧失，从而也会表现出对β-三酮类除草剂敏感。经过我们的进一步研究发现，籼稻HIS1基因上起始密码子ATG下游第1510位碱基位置存在一个T到G的变异，即T1510G突变，该T1510G突变导致水稻对β-三酮类除草剂表现敏感。且该T1510G突变和28bp缺失变异中，只要存在其中任意一种或两种变异，都能够导致水稻对β-三酮类除草剂表现敏感。
因此，利用HIS1基因在第四外显子的28bp片段缺失变异或T1510G突变会导致β-三酮类除草剂抗性丧失这一特点设计引物，用于鉴定水稻品种中HIS1基因是否存在上述28bp片段缺失变异和T1510G突变，可以判断该水稻HIS1基因是否存在β-三酮类除草剂抗性，进而筛选得到对除草剂敏感的两系不育系母本和对该除草剂具有抗性的两系恢复系父本。进一步的，在两系杂交稻制种过程中利用除草剂进行针对性筛选除杂，能够明显提高水稻杂交制种的纯度，以及缓解两系不育系制种过程中“打摆子”的问题，对培育创新种质资源以及解放劳动力具有意义。
更优选的，检测所述水稻HIS1基因第四外显子上是否存在28bp缺失变异的操作具体包括如下步骤：以待检测水稻的DNA样本为模板，用特异的分子标记引物进行PCR扩增，取得到的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察所述扩增产物的DNA片段的长度；若扩增产物的DNA片段为单一的一条182bp条带，则表明该水稻HIS1基因第四外显子上存在28bp缺失变异；若扩增产物的DNA片段为一条单一的210bp条带，或包含两条长度分别为182bp和210bp的条带，则表明该水稻HIS1基因第四外显子上不存在28bp缺失变异；
所述特异的分子标记引物包括以下序列的正向引物CCJ-1F和反向引物CCJ-1R：
正向引物CCJ-1F：5’-GTACAACTTGACGATGTATCAAG-3’(如SEQ.ID NO.3所示)；
反向引物CCJ-1R：5’-GTTGAATCTTGCAAATGCAGGAGC-3’(如SEQ.ID NO.4所示)。
更优选的，用所述特异的分子标记物进行PCR扩增的具体操作包括如下步骤：将所述特异的分子标记物稀释为10mM，配置PCR反应体系：20μL PCR反应体系包含50ng/μL基因组DNA2μL，5μM/mL前后引物各1μL，1.1×PCR Mix 16μL；PCR反应条件如下：95℃预变性4min；95℃20s，58℃20s，72℃20s，共35个循环；72℃延伸5min。
更优选的，检测所述水稻HIS1基因是否存在T1510G突变的操作具体包括如下步骤：以待检测水稻的DNA样本为模板，用特异性的dCAPS标记引物对包含HIS1基因上起始密码子ATG下游第1510位核苷酸的位点在内的DNA片段进行PCR扩增，取得到的扩增产物用限制性内切酶Dde1进行酶切处理，然后通过琼脂糖凝胶电泳法或DNA测序法判断所述扩增 产物的核苷酸序列是否被切割；若被切割，则表示该水稻HIS1基因存在T1510G突变；若未被切割，则表示该水稻HIS1基因不存在T1510G突变。
更优选的，所述DNA样本是通过CTAB法提取所述待检测水稻的叶片DNA后得到。
更优选的，所述DNA片段为HIS1基因上起始密码子ATG下游第1510位核苷酸至该第1510位核苷酸下游的第50-192位核苷酸；
所述特异性的dCAPS标记引物包括以下序列的正向引物CCJ-3F和反向引物CCJ-3R：
正向引物CCJ-3F：5’-CATCTTCAGGAGCCCGGTGCACAGGCTGA-3’(如SEQ.ID NO.1所示)；
反向引物CCJ-3R：5’-TCAGGGAGTCGATGTACCTC-3’(如SEQ.ID NO.2所示)。
更优选的，通过琼脂糖凝胶电泳法判断所述扩增产物的核苷酸序列是否被切割成两段的具体操作包括如下步骤：将通过限制性内切酶Dde1酶切处理后的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，读取其DNA片段长度，若扩增产物的DNA片段出现一条长度为192bp的条带，则判断所述扩增产物的核苷酸序列被切割；若扩增产物的DNA片段未出现长度为192bp的条带，则判断所述扩增产物的核苷酸序列未被切割。可以快速、高效、准确、方便地鉴定水稻品系HIS1基因中是否存在T1510G突变。
更优选的，通过DNA测序法判断所述扩增产物的核苷酸序列是否被切割成两段的具体操作包括如下步骤：将通过限制性内切酶Dde1酶切处理后的扩增产物进行DNA测序，若得到如SEQ.ID NO.13和/或SEQ.ID NO.14所示的核苷酸序列，则判断所述扩增产物的核苷酸序列被切割；若得到如SEQ.ID NO.11所示的核苷酸序列，则判断所述扩增产物的核苷酸序列未被切割。可以高效、精确地鉴定水稻品系HIS1基因上起始密码子ATG下游第1510位碱基的突变类型。
上述的方法，优选的，所述步骤(1)中，对除草剂敏感的两系不育系母本和对该除草剂具有抗性的两系恢复系父本还可以通过以下方法筛选得到：利用所述除草剂对两系不育系母本和两系恢复系父本进行喷施鉴定，筛选出对该除草剂敏感的母本和对该除草剂具有抗性的父本。更优选的，所述除草剂为双环磺草酮除草剂，所述双环磺草酮除草剂的施用方法为：将所述双环磺草酮除草剂的浓度稀释为0.4μM-4μM后对目标植株进行喷洒。
上述的方法，优选的，所述步骤(2)中，所述母本自交接种的后代为因温度不稳定导致的母本自交接种后代。
优选的，所述步骤(1)和步骤(2)中，所述除草剂为β-三酮类除草剂。
更优选的，所述β-三酮类除草剂为双环磺草酮除草剂或硝磺草酮除草剂，施用时将所述双环磺草酮除草剂的浓度稀释为0.05g/L-0.6g/L后对目标植株进行喷洒，或将所述硝磺草酮除 草剂的浓度稀释为0.01g/L-0.1g/L后对目标植株进行喷洒，所述除草剂的施用时期为水稻幼苗3叶期。
优选的，所述步骤(1)中，所述对除草剂敏感的两系不育系母本包括安农S-1、标810S、KT27S、华1037S、湘陵628S、准S、龙S、奥龙1S、雁农S、锦4128S、360S、华煜4127S、Z9S、H175S、885S、C815S、SE21S、明香10S和明S中的任意一种或几种。
优选的，所述步骤(1)中，所述对除草剂具有抗性的两系恢复系父本包括玉香油占、R402、P143、粤禾丝苗、中早22、R534、华占和中嘉早32中的任意一种或几种。
优选的，所述步骤(1)中，两系杂交稻组合包括：由准S母本与玉香油占父本组成的准两优香油占组合、由准S母本与R402父本组成的准两优402组合、由明S母本与P143父本组成的明两优143组合、由龙S母本与粤禾丝苗父本组成的龙两优粤禾丝苗组合、由锦4128S母本与中早22父本组成的锦两优22组合、由锦4128S母本与R534父本组成的锦两优534组合、由锦4128S母本与华占父本组成的锦两优华占组合、由华煜4127S母本与中早22父本组成的煜两优22组合或由湘陵628S母本与中早22父本组成的陵两优22组合。以上两系杂交稻组合同时满足母本感、父本抗的要求，且这些组合经过审定能够直接在生产上应用，有较大实际价值。
部分籼稻品种中，HIS1基因第四外显子存在28bp片段缺失变异(28bp缺失)或在起始密码子ATG下游第1510位碱基位置存在一个T到G的变异(T1510G突变)，导致水稻对β-三酮类除草剂抗性丧失，利用这一特性，可以在杂交制种过程中，对后代植株喷洒β-三酮类除草剂，除去因温度不稳定(低温)导致母本自交接种的不抗除草剂的后代植株，剩下抗除草剂的真杂交种，可大大解放劳动力；同时，可有效缓解两系不育系制种过程中“打摆子”状况，提高制种纯度和质量。
基于一个总的发明构思，本发明还提供一种可用于上述方法中筛选对除草剂敏感的两系不育系母本和对该除草剂具有抗性的两系恢复系父本的特异的分子标记引物，所述特异的分子标记引物包括以下序列的正向引物CCJ-1F和反向引物CCJ-1R：
正向引物CCJ-1F：5’-GTACAACTTGACGATGTATCAAG-3’(如SEQ.ID NO.3所示)；
反向引物CCJ-1R：5’-GTTGAATCTTGCAAATGCAGGAGC-3’(如SEQ.ID NO.4所示)。
基于一个总的发明构思，本发明还提供另一种可用于上述方法中筛选对除草剂敏感的两系不育系母本和对该除草剂具有抗性的两系恢复系父本的dCAPS标记引物，所述dCAPS标记引物包括以下序列的正向引物CCJ-3F和反向引物CCJ-3R：
正向引物CCJ-3F：5’-CATCTTCAGGAGCCCGGTGCACAGGCTGA-3’(如SEQ.ID NO.1所示)；
反向引物CCJ-3R：5’-TCAGGGAGTCGATGTACCTC-3’(如SEQ.ID NO.2所示)。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1、本发明利用除草剂进行两系杂交稻制种的方法，在两系杂交稻制种过程中可很好地解决“打摆子”现象，大大提高制种纯度，快速、准确、高效的获得真杂交种后代，筛选的效率可达到100％，操作简单，大大解放了劳动力，在杂交水稻种子纯度提升以及种质资源创新上都具有重要意义。
2、本发明的特异的分子标记引物和dCAPS标记引物，快速、高效、准确、方便地检测水稻品系HIS1基因是否存在28bp缺失或T1510G突变，进而判断该水稻HIS1基因是否存在β-三酮类除草剂抗性，最终实现对除草剂敏感的两系不育系母本和对该除草剂具有抗性的两系恢复系父本的筛选，为β-三酮类除草剂在部分籼稻田的使用提供一定的理论依据，为后续采用β-三酮类进行杂交水稻制种、杂交种提纯打下良好的基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是实施例1中检测的24份水稻材料的HIS1基因电泳图；
图2是实施例1中日本晴HIS1基因结构组成图；
图3是实施例1中双环磺草酮除草剂对不同水稻抗性鉴定图；
图4是实施例2中籼稻材料IR64对β-三酮类除草剂敏感鉴定结果；
图5是实施例2中籼稻材料日本晴对β-三酮类除草剂敏感鉴定结果；
图6是实施例2中籼稻材料对β-三酮类除草剂敏感表现分级情况(分为6级，从左至右分别是：0级和1级表示高抗，2级和3级表示中抗和中感，4级和5级表示高感)；
图7是实施例2中493份籼稻材料的除草剂喷施结果(从左至右分别是：0级和1级表示高抗，2级和3级表示中抗和中感，4级和5级表示高感)；
图8是实施例2中HIS1基因单倍型对比情况；
图9是实施例2中HIS1各单倍型氨基酸差异及关键结构域预测图；
图10是实施例2中HIS1蛋白的三维结构图；
图11是实施例2中HIS1的单倍型H2和H3的表达水平检测结果；
图12是实施例2中dCAPS检测标记对H2、H3、H5扩增出的序列电泳图；
图13是实施例2中H2、H3、H5扩增产物经过酶切后的序列电泳图；
图14是实施例2中利用dCAPS检测标记对农香42和先恢207及其构建的F2群体的检测结果；
图15是实施例3中8份两系不育系都进行了0.4g/L浓度BBC喷施实验结果；
图16是实施例3中Y58S、SE21S和明S的BBC浓度梯度实验结果；
图17是实施例3中明S、P143及其杂交种明两优143的BBC浓度梯度实验结果；
图18是实施例4中IR64的硝磺草酮浓度梯度实验结果；
图19是实施例4中日本晴的硝磺草酮浓度梯度实验结果；
图20是实施例4中Y58S的硝磺草酮浓度梯度实验结果；
图21是实施例4中SE21S的硝磺草酮浓度梯度实验结果；
图22是实施例4中明S、P143及其杂交种明两优143的硝磺草酮浓度梯度实验结果；
图23是实施例5中利用双环磺草酮除草剂对水稻材料筛选的作用效果图；
图24是实施例5中两系杂交稻母本、父本及其杂交种喷施BBC除草剂后的效果图(由左至右依次为明S，P143，明两优143)。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例1：
用于筛选对除草剂敏感的两系不育系母本和对除草剂具有抗性的两系恢复系父本的特异的分子标记引物，所述特异的分子标记引物包括以下序列的正向引物CCJ-1F和反向引物CCJ-1R：
正向引物CCJ-1F：5-’GTACAACTTGACGATGTATCAAG-’3(如SEQ.ID NO.3所示)；
反向引物CCJ-1R：5-’GTTGAATCTTGCAAATGCAGGAGC-’3(如SEQ.ID NO.4所示)。
采用所述特异的分子标记引物鉴定水稻品系HIS1基因第四外显子处是否存在28bp缺失的方法，包括如下步骤：
S1、采用CTAB法，对水稻新鲜幼嫩叶片提取DNA样本：取适量新鲜水稻叶片装入2mL离心管中并加入钢珠，于液氮中速冻，放入高通量组织研磨器(宁波新芝Scientz-48)破碎组织，立即加入65℃预热的2×CTAB溶液650μL，置于65℃水浴锅中恒温45min，每10min上 下均匀颠倒一次，45min结束并待DNA样品冷却到室温后置于通风橱中加入650μL氯仿﹕异丙醇(24﹕1)的溶液，上下颠倒混匀，12000rmp离心10min，将500μl上清液转移到1.5mL的离心管中，加入500μl异丙醇溶液混匀并于-20℃沉淀2h，12000rmp离心10min，弃上清，加入1mL70％乙醇溶液洗除杂质，12000rmp离心5min后倒出上清，加入200μl ddH 2O于4℃冰箱中过夜溶解，得到提取的水稻样品DNA模板。
S2、将合成的引物CCJ-1F、CCJ-1R稀释为10mM；配置PCR反应体系：20μL PCR反应体系包含基因组DNA 2μL(50ng/μL)，前后引物各1μL(5μM/mL)，1.1×PCR Mix(擎科生物技术有限公司)16μL。PCR反应条件如下：95℃预变性4min；95℃20s，58℃20s，72℃20s，共35个循环；72℃延伸5min。
S3、将得到的扩增产物在3％琼脂糖凝胶上进行电泳分离，读取扩增出的产物片段大小；若扩增出的产物片段为单一的一条182bp条带，表示该水稻HIS1基因为隐性纯合子，则鉴定该水稻中存在28bp缺失变异；若扩增出的产物片段为一条单一的210bp条带，表示该水稻HIS1基因为显性纯合子，则鉴定该水稻中不存在28bp缺失变异；若扩增出的产物片段包含一条182bp条带和一条210bp条带，表示该水稻HIS1基因为杂合子，则鉴定该水稻中不存在28bp缺失变异。
本实施例收集了24份水稻材料进行上述特异的分子标记引物的检测试验，24份水稻材料的HIS1基因电泳图见图1。其中，M为DL2000 DNA Marker，1为IR64，2为对照材料日本晴，3-24依次为：炳1B、地谷、粤泰A、9311、珍籼97B、丰源B、绵恢725、II-32A、天丰A、丰华占、远恢2、粤泰B、IR36、桂99、丰源A、蜀恢498、密阳46、湘晚籼1号、D62B、G46B、CDR22、五丰A。
由图1可知，IR64、地谷、绵恢725、IR36、蜀恢498、湘晚籼1号、CDR22扩增出的产物片段为一条182bp条带，表示该水稻HIS1基因为隐性纯合子，存在28bp片段缺失变异，该水稻HIS1基因不存在BBC类除草剂抗性。其余水稻材料扩增出的产物片段为一条210bp条带，表示该水稻HIS1基因为显性纯合子，未存在28bp片段缺失变异。
实验室利用粳稻日本晴作为对照(日本晴HIS1基因结构如图2所示)，明恢82、德恢381、成都矮8号等应用比较广泛的重要籼稻育种材料作为实验组，将双环磺草酮除草剂(BBC)的有效成分浓度用水稀释为0.75μM后对长到3叶期的水稻苗进行均匀喷洒，15天后观察表型，结果如图3所示。
结果表明HIS1基因存在28bp片段缺失变异的三种籼稻育种材料在用双环磺草酮除草剂稀释液处理15天后，稻苗枯黄干萎，最终死亡。而对照材料日本晴稻苗青葱较为健康。这说明BBC除草剂在应用过程中的确会对HIS1基因存在28bp片段缺失变异的部分籼稻产生致命 性的药理作用，同时对HIS1基因完整的粳稻影响微小。在生产实践过程中，完全可以利用这一特性来缓解两系不育系“打摆子”状况以及解放在混播混收过中的劳动力。
实施例2：
用于筛选对除草剂敏感的两系不育系母本和对除草剂具有抗性的两系恢复系父本的dCAPS标记引物，所述dCAPS标记引物包括以下序列的正向引物CCJ-3F和反向引物CCJ-3R：
正向引物CCJ-3F：5’-CATCTTCAGGAGCCCGGTGCACAGGCTGA-3’(如SEQ.ID NO.1所示)；
反向引物CCJ-3R：5’-TCAGGGAGTCGATGTACCTC-3’(如SEQ.ID NO.2所示)。
该dCAPS标记引物的设计，其正向引物的识别位点位于HIS1基因上起始密码子ATG下游第1510位核苷酸，其反向引物的识别位点位于该第1510位核苷酸下游的第50-192位核苷酸之间。
采用所述dCAPS标记引物检测水稻HIS1基因是否存在T1510G突变的方法，具体包括如下步骤：
S1、采用CTAB法，对水稻新鲜幼嫩叶片提取DNA样本：取适量新鲜水稻叶片装入2mL离心管中并加入钢珠，于液氮中速冻，放入高通量组织研磨器(宁波新芝Scientz-48)破碎组织，立即加入65℃预热的2×CTAB溶液650μL，置于65℃水浴锅中恒温45min，每10min上下均匀颠倒一次，45min结束并待DNA样品冷却到室温后置于通风橱中加入650μL氯仿﹕异丙醇(24﹕1)的溶液，上下颠倒混匀，12000rmp离心10min，将500μl上清液转移到1.5mL的离心管中，加入500μl异丙醇溶液混匀并于-20℃沉淀2h，12000rmp离心10min，弃上清，加入1mL70％乙醇溶液洗除杂质，12000rmp离心5min后倒出上清，加入200μl ddH 2O于4℃冰箱中过夜溶解，得到提取的水稻样品DNA模板。
S2、以步骤S1的DNA样本为模板，用dCAPS标记引物进行PCR扩增：将合成的引物CCJ-3F和CCJ-3R稀释为10mM；配置PCR反应体系：20μL PCR反应体系包含基因组DNA 2μL(50ng/μL)，前后引物各1μL(5μM/mL)，1.1×PCR Mix(擎科生物技术有限公司)16μL。PCR反应条件如下：95℃预变性4min；95℃20s，58℃20s，72℃20s，共35个循环；72℃延伸5min。
S3、取步骤S2后得到的扩增产物用限制性内切酶Dde1进行酶切，然后进行琼脂糖凝胶电泳，读取其DNA片段长度，若扩增产物的DNA片段出现一条长度为192bp的条带，则判断扩增产物的核苷酸序列被切割；通过DNA测序法发现，被限制性内切酶Dde1切割后得到两段长度分别为29bp和192bp的核苷酸序列，其中长度为29bp的核苷酸序列如SEQ.ID NO.13 所示，长度为192bp的核苷酸序列如SEQ.ID NO.14所示，表示该水稻HIS1基因存在T1510G突变；若扩增产物的DNA片段未出现长度为192bp的条带，只得到一条长度为221bp的核苷酸序列如SEQ.ID NO.11所示，则判断扩增产物的核苷酸序列未被切割，表示该水稻HIS1基因不存在T1510G突变。
为了验证28bp缺失和T1510G变异是导致HIS1基因抗β-三酮类除草剂功能丧失的关键，以及本发明的引物和检测方法的准确性，我们进行了如下实验：
1、针对HIS1基因是否存在28bp缺失设计的分子标记以及对中国籼稻材料的检测
针对已报道的导致β-三酮类除草剂广谱抗性基因HIS1功能丧失的28bp缺失突变，设计了分子标记CCJ-1F/CCJ-1R，并采用该分子标记对中国主要的籼稻材料631份(包含221份常规稻，213份三系恢复系，59份两系恢复系，87份三系不育系和51份两系不育系)进行了检测，检测结果见表1，其中的24份水稻材料的HIS1基因电泳图如图1所示。结果发现该28bp缺失在中国籼稻材料中广泛存在(表1)，我们还在两系不育系中发现5份缺失，在恢复系中存在大量非突变材料，因此，基于HIS1基因功能有无是有可能实现两系杂交稻种子提纯的。
正向引物CCJ-1F：5’-GTACAACTTGACGATGTATCAAG-3’(如SEQ.ID NO.3所示)；
反向引物CCJ-1R：5’-GTTGAATCTTGCAAATGCAGGAGC-3’(如SEQ.ID NO.4所示)。
2、籼稻材料28bp缺失与对β-三酮类除草剂敏感表型之间的关系验证
为了验证HIS1基因缺失28bp和对β-三酮类除草剂敏感的材料是否完全一致，我们对493份籼稻材料进行了β-三酮类除草剂喷施实验(包括了221份常规稻，213份三系恢复系和59份两系恢复系，不育系种子有限未能做喷施鉴定)，实验结果见表1。
首先利用已知对β-三酮类除草剂敏感的籼稻品种IR64(其中的HIS1基因存在28bp缺失)和对β-三酮类除草剂表现抗性的粳稻品种日本晴(HIS1基因正常)进行β-三酮类除草剂浓度梯度实验，筛选合适的β-三酮类除草剂浓度进行鉴定。结果如图4和图5所示，结果发现当喷施β-三酮类除草剂双环磺草酮(BBC)浓度在0.15g/L时，两者就表现出显著差异，当在BBC浓度达到1.2g/L时，日本晴也开始表现少许敏感性状。最后采用0.4g/L的BBC浓度来进行籼稻材料喷施鉴定。
由于不同材料对BBC表型存在细微差异，我们将水稻材料对BBC的表型共分为六级(图6)，其中0级和1级表示高度抗，2级和3级表示中度抗和中度敏感，4级和5级表示高度敏感。对493份籼稻材料喷施结果可以看出(图7)，绝大多数材料对BBC都表现为高抗或者高感，说明水稻中对BBC抗性是由主效基因控制的质量性状，这与HIS1基因是β-三酮类除草剂主效抗性基因相吻合。通过对28bp缺失与对BBC敏感材料的对照分析，我们发现这 两者在三种不同类型水稻材料中都存在关联(见表1)，但对BBC敏感的材料明显多于28bp缺失的材料，说明在这些籼稻材料中，除了28bp缺失外，可能HIS1基因还存在其他变异，导致其功能的丧失，从而表现出对BBC敏感。
表1：籼稻材料HIS1基因功能突变及对β-三酮类除草剂敏感表型数量
Figure PCTCN2020105922-appb-000001
3、籼稻材料中HIS1基因单倍型测定
为了明确HIS1基因是否还有其他变异，我们通过引物CCJF-F/CCJF-R，利用高保真PCR将HIS1基因起始密码子到终止密码子的基因组序列进行扩增后测序，得到了493份已测定BBC表型的籼稻材料中HIS1基因序列。通过比对发现，与日本晴基因组相比，493份籼稻中，HIS1基因的编码区上只存在5个变异位点，分别是第9位，第61位，第829-856位，第1055位和第1510位碱基。这些变异位点将HIS1基因分为了5个单倍型，如图8所示，其中单倍型2(H2)和日本晴相同，单倍型5(H5)和IR64相同。与H2相比，H1在第9和第1055位置存在两个单碱基变异；H3只在1510位置存在一个T到G的变异(T1510G突变)；H4在第61位和1055位存在两个碱基变异；H5主要存在有一个28bp的缺失。将HIS1基因各单倍型与材料对BBC敏感表型关联后，我们发现只有H3和H5表现敏感，其中H5是由于28bp缺失导致，而H3极有可能是由于T1510G变异导致，因为与抗BBC的H2相比，H3只存在这一个变异。
正向引物CCJF-F：5’-AAGCAAGAACAAAGTTAAGCAAG-3’(如SEQ.ID NO.5所示)；
反向引物CCJF-R：5’-AAGGAAATACTTGCTACTGAAAGC-3’(如SEQ.ID NO.6所示)。
4、确定T1510G突变导致HIS1基因抗β-三酮类除草剂功能丧失
首先，我们对HIS1基因5个单倍型的氨基酸序列进行了比对，如图9所示，发现H3只在286位氨基酸位置存在一个氨基酸变异(V286G)，该位置位于HIS1蛋白关键的结构域2OG-Fell_Oxy内，说明该位点可能会对HIS1蛋白功能起重要作用。接下来，我们通过同源建模，对HIS1蛋白三维结构进行了解析，发现V286G存在于HIS1蛋白与铁离子相互作用的口袋结构中(图10)，该位置的氨基酸对HIS1蛋白发挥功能是非常重要的，因此V286G变 异可能影响了HIS1蛋白抗BBC功能。为了排除H3是由于HIS1基因表达水平不同造成了对BBC的敏感，我们随机在H2和H3中各选择了5份材料，利用引物CCJ-2F/CCJ-2R进行HIS1基因的表达水平检测，同时以日本晴和IR64作为对照，水稻基因Actin为内参，其引物为Actin-F/Actin-R。检测结果如图11所示，HIS1基因在H3的材料中正常表达，与H2相比没有明显的区别，因此，可以排除是由于HIS1基因表达水平不同导致H3抗BBC功能丧失。
正向引物CCJ-2F：5’-GGTAATGTGCAATGGCATCTTC-3’(如SEQ.ID NO.7所示)；
反向引物CCJ-2R：5’-CAGATCCTCAGGGAGTCGATGTAC-3’(如SEQ.ID NO.8所示)；
正向引物Actin-F：5’-CCTCGTCTCGACCTTGCTGGG-3’(如SEQ.ID NO.9所示)；
反向引物Actin-R：5’-GAGAACAAGCAGGAGGACGGC-3’(如SEQ.ID NO.10所示)。
为了进一步验证H3的抗β-三酮类除草剂功能丧失是由于HIS1基因T1510G突变导致的，我们构建了一个以水稻品种农香42(含有H2，对BBC抗)和先恢207(含有H3，对BBC敏感)为双亲构建的F2群体。对该群体喷施0.4g/L的BBC，结果显示总共968个单株F2群中，对BBC表现抗的有737株，对BBC敏感的有231株，其抗感比例符合3:1(X2＝0.607<X(0.05)2＝3.84)，说明在H2和H3构建的F2群体中，只存在一个显性主效的抗BBC基因。
进一步的，我们针对H3与其他单倍型特异的这个T1510G突变，设计了一个dCAPS标记引物，其前后引物分别为CCJ-3F和CCJ-3R，利用该对引物，在日本晴(H2)和IR64(H5)等其他单倍型中扩增出一段221bp的序列1(如SEQ.ID NO.11所示)；在含有H3的水稻材料如先恢207中扩增出一段221bp的序列2(如SEQ.ID NO.12)。扩增出的序列经过电泳后观察，如图12所示。由于T1510G突变，导致在H3扩增出的序列2中含有且只有一个限制性内切酶Dde1特异识别位点(CTNAG)，因此能够用Dde1对PCR产物进行酶切，得到两段长度分别为29bp和192bp的序列3(如SEQ.ID NO.13所示)和序列4(如SEQ.ID NO.14所示)，进行电泳(如图13所示)可以观察到221bp序列被酶切，出现了一条192bp的条带，而在其他单倍型材料中，Dde1不能进行酶切。按照琼脂糖凝胶电泳的特点，如果存在T1510G突变，那么酶切得到的29bp的条带是观察不到的，只能观察到192bp的条带，且通常情况下221bp的序列被酶切后电泳结果一般会出现一个221bp和一个192bp的条带，因此只要观察到一条长度为192bp的条带，就可以判断扩增产物的核苷酸序列被Dde1切割；如果不存在T1510G突变，那么就绝对不会出现192bp条带。
利用本实施例的dCAPS标记引物和检测方法，我们对农香42和先恢207构建的F2群体进行了检测，结果如图14所示，发现T1510G突变与各单株对BBC敏感表型完全共分离。
综上所述，我们确定T1510G变异是导致HIS1基因抗β-三酮类除草剂功能丧失的关键。且本实施例的dCAPS标记引物和检测方法，可以快速、高效、准确、方便地鉴定水稻品系 HIS1基因中是否存在T1510G突变，进而为判断该水稻HIS1基因是否存在β-三酮类除草剂抗性打下良好的基础。
5、检测水稻HIS1基因是否存在β-三酮类除草剂抗性
采用实施例1的特异的分子标记引物(CCJ-1F/CCJ-1R)和实施例2的dCAPS标记引物(CCJ-3F/CCJ-3R)检测水稻HIS1基因是否存在β-三酮类除草剂抗性的方法，包括如下步骤：
SS1、采用CTAB法，对水稻新鲜幼嫩叶片提取DNA样本：取适量新鲜水稻叶片装入2mL离心管中并加入钢珠，于液氮中速冻，放入高通量组织研磨器(宁波新芝Scientz-48)破碎组织，立即加入65℃预热的2×CTAB溶液650μL，置于65℃水浴锅中恒温45min，每10min上下均匀颠倒一次，45min结束并待DNA样品冷却到室温后置于通风橱中加入650μL氯仿﹕异丙醇(24﹕1)的溶液，上下颠倒混匀，12000rmp离心10min，将500μl上清液转移到1.5mL的离心管中，加入500μl异丙醇溶液混匀并于-20℃沉淀2h，12000rmp离心10min，弃上清，加入1mL70％乙醇溶液洗除杂质，12000rmp离心5min后倒出上清，加入200μl ddH 2O于4℃冰箱中过夜溶解，得到提取的水稻样品DNA模板。
SS2、以所述步骤SS1的DNA样本为模板，用所述的dCAPS标记引物进行PCR扩增：将合成的引物CCJ-3F和CCJ-3R稀释为10mM；配置PCR反应体系：20μL PCR反应体系包含基因组DNA 2μL(50ng/μL)，前后引物各1μL(5μM/mL)，1.1×PCR Mix(擎科生物技术有限公司)16μL。PCR反应条件如下：95℃预变性4min；95℃20s，58℃20s，72℃20s，共35个循环；72℃延伸5min。取得到的扩增产物用限制性内切酶Dde1进行酶切，然后进行琼脂糖凝胶电泳，读取其DNA片段长度，若扩增产物的DNA片段出现一条长度为192bp的条带，则判断所述扩增产物的核苷酸序列被切割；通过DNA测序法发现，被限制性内切酶Dde1切割后得到两段长度分别为29bp和192bp的核苷酸序列，其中长度为29bp的核苷酸序列如SEQ.ID NO.13所示，长度为192bp的核苷酸序列如SEQ.ID NO.14所示，表示该水稻HIS1基因存在T1510G突变，进而可以确定该水稻HIS1基因不存在β-三酮类除草剂抗性；
SS3、以步骤SS1的DNA样本为模板，用检测水稻HIS1基因第四外显子上是否存在28bp缺失的分子标记CCJ-1F/CCJ-1R进行PCR扩增：将合成的引物CCJ-1F、CCJ-1R稀释为10mM；配置PCR反应体系：20μL PCR反应体系包含基因组DNA2μL(50ng/μL)，前后引物各1μL(5μM/mL)，1.1×PCR Mix(擎科生物技术有限公司)16μL。PCR反应条件如下：95℃预变性4min；95℃20s，58℃20s，72℃20s，共35个循环；72℃延伸5min。取得到的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察所述扩增产物的DNA片段的长度；若扩增产物的DNA片段为单一的一条182bp条带，则表明该水稻HIS1基因存在长度为28bp的缺失变异，进而可以确定该水稻HIS1基因不存在β-三酮类除草剂抗性。若扩增产物的DNA片段为一条单一的210bp 条带，或包含两条长度分别为182bp和210bp的条带，则表明该水稻HIS1基因不存在长度为28bp的缺失变异，在此情况下，若根据步骤SS2得到的扩增产物的DNA片段也未出现长度为192bp的条带，只得到一条长度为221bp的核苷酸序列(如SEQ.ID NO.11所示)，说明该待检测水稻的HIS1基因也不存在T1510G突变，进一步就可以确定该水稻HIS1基因存在β-三酮类除草剂抗性；
采用上述方法对493份籼稻材料HIS1基因功能进行检测鉴定，具体实验结果见表1。由表1可知，存在28bp缺失和T1510G突变的水稻材料数量总和与对BBC敏感表型数量总和相同，说明存在28bp缺失或T1510G突变都能够导致水稻对BBC表现敏感；既不存在28bp缺失也不存在T1510G突变的水稻材料数量总和与对BBC具有抗性表型数量总和相同，说明HIS1基因对β-三酮类除草剂抗性功能基本上完全由28bp缺失和T1510G突变两种变异类型控制。只要检测到水稻材料中存在28bp缺失或者存在T1510G突变，即可鉴定该水稻材料HIS1基因不存在β-三酮类除草剂抗性；反之，如果检测到水稻材料中既不存在28bp缺失也不存在T1510G突变，即可鉴定该水稻材料HIS1基因存在β-三酮类除草剂抗性。
本发明的dCAPS标记引物可以快速、高效、准确、方便地鉴定水稻品系HIS1基因中是否存在T1510G突变，结合水稻HIS1基因是否存在28bp缺失进而判断该水稻HIS1基因是否存在β-三酮类除草剂抗性，为β-三酮类除草剂在部分籼稻田的使用提供一定的理论依据，为后续采用β-三酮类除草剂进行杂交水稻制种打下良好的基础。
实施例3：
一种利用除草剂进行两系杂交稻制种的方法，采用光温敏雄性不育系的“两系法”进行杂交水稻制种，包括如下步骤：
(1)检测水稻父本、母本的HIS1基因是否存在β-三酮类除草剂抗性：采用本发明的dCAPS标记引物CCJ-3F/CCJ-3R和分子标记引物CCJ-1F/CCJ-1R，对实施例2中51份两系杂交稻不育系进行了检测，检测结果见表1；
具体的检测方法包括如下步骤：
SS1、采用CTAB法，对水稻新鲜幼嫩叶片提取DNA样本：取适量新鲜水稻叶片装入2mL离心管中并加入钢珠，于液氮中速冻，放入高通量组织研磨器(宁波新芝Scientz-48)破碎组织，立即加入65℃预热的2×CTAB溶液650μL，置于65℃水浴锅中恒温45min，每10min上下均匀颠倒一次，45min结束并待DNA样品冷却到室温后置于通风橱中加入650μL氯仿﹕异丙醇(24﹕1)的溶液，上下颠倒混匀，12000rmp离心10min，将500μl上清液转移到1.5mL的离心管中，加入500μl异丙醇溶液混匀并于-20℃沉淀2h，12000rmp离心10min，弃上清， 加入1mL70％乙醇溶液洗除杂质，12000rmp离心5min后倒出上清，加入200μl ddH 2O于4℃冰箱中过夜溶解，得到提取的水稻样品DNA模板。
SS2、以所述步骤SS1的DNA样本为模板，用所述的dCAPS标记引物进行PCR扩增：将合成的引物CCJ-3F和CCJ-3R稀释为10mM；配置PCR反应体系：20μL PCR反应体系包含基因组DNA 2μL(50ng/μL)，前后引物各1μL(5μM/mL)，1.1×PCR Mix(擎科生物技术有限公司)16μL。PCR反应条件如下：95℃预变性4min；95℃20s，58℃20s，72℃20s，共35个循环；72℃延伸5min。取得到的扩增产物用限制性内切酶Dde1进行酶切，然后进行琼脂糖凝胶电泳，读取其DNA片段长度，若扩增产物的DNA片段出现一条长度为192bp的条带，则判断所述扩增产物的核苷酸序列被切割；通过DNA测序法发现，被限制性内切酶Dde1切割后得到两段长度分别为29bp和192bp的核苷酸序列，其中长度为29bp的核苷酸序列如SEQ.ID NO.13所示，长度为192bp的核苷酸序列如SEQ.ID NO.14所示，表示该水稻HIS1基因存在T1510G突变，进而可以确定该水稻HIS1基因不存在β-三酮类除草剂抗性；
dCAPS标记引物包括以下序列的正向引物CCJ-3F和反向引物CCJ-3R：
正向引物CCJ-3F：5’-CATCTTCAGGAGCCCGGTGCACAGGCTGA-3’(如SEQ.ID NO.1所示)；
反向引物CCJ-3R：5’-TCAGGGAGTCGATGTACCTC-3’(如SEQ.ID NO.2所示)。
SS3、以步骤SS1的DNA样本为模板，用检测水稻HIS1基因第四外显子上是否存在28bp缺失的分子标记CCJ-1F/CCJ-1R进行PCR扩增：将合成的引物CCJ-1F、CCJ-1R稀释为10mM；配置PCR反应体系：20μL PCR反应体系包含基因组DNA2μL(50ng/μL)，前后引物各1μL(5μM/mL)，1.1×PCR Mix(擎科生物技术有限公司)16μL。PCR反应条件如下：95℃预变性4min；95℃20s，58℃20s，72℃20s，共35个循环；72℃延伸5min。取得到的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察所述扩增产物的DNA片段的长度；若扩增产物的DNA片段为单一的一条182bp条带，则表明该水稻HIS1基因存在长度为28bp的缺失变异，进而可以确定该水稻HIS1基因不存在β-三酮类除草剂抗性。若扩增产物的DNA片段为一条单一的210bp条带，或包含两条长度分别为182bp和210bp的条带，则表明该水稻HIS1基因不存在长度为28bp的缺失变异，在此情况下，若根据步骤SS2得到的扩增产物的DNA片段也未出现长度为192bp的条带，只得到一条长度为221bp的核苷酸序列(如SEQ.ID NO.11所示)，说明该待检测水稻的HIS1基因也不存在T1510G突变，进一步就可以确定该水稻HIS1基因存在β-三酮类除草剂抗性；
正向引物CCJ-1F：5’-GTACAACTTGACGATGTATCAAG-3’(如SEQ.ID NO.3所示)；
反向引物CCJ-1R：5’-GTTGAATCTTGCAAATGCAGGAGC-3’(如SEQ.ID NO.4所示)。
检测结果发现了3份不育系存在T1510G突变，5份不育系存在28bp缺失变异，我们总共在两系不育系中鉴定出8份水稻材料存在HIS1基因功能缺失突变，他们分别是湘陵628S、C815S、华1037S、明S、准S、华68S、SE21S和明香10S；
为了进一步验证该结果，我们将这8份两系不育系都进行了0.4g/L浓度双环磺草酮除草剂(BBC)喷施实验，结果如图15所示，结果发现这些不育系都表现出对BBC敏感；进一步的，我们对三种代表类型两系不育系Y58S(HIS1正常)、SE21S(H3)和明S(H5)进行了BBC浓度梯度实验，结果如图16所示，发现SE21S和明S在BBC为0.05g/L时就表现出明显的药害，而Y58S在浓度为1.2g/L时才开始表现出药害。
(2)选择母本HIS1基因不存在β-三酮类除草剂抗性的水稻品种明S、父本HIS1基因存在β-三酮类除草剂抗性的水稻品种P143进行杂交，其中父本、母本HIS1基因的β-三酮类除草剂抗性/敏感表型均为纯合子，正常收获F1代种子进行种植得到杂交种明两优143(对β-三酮类除草剂表现抗性)；用不同浓度梯度的BBC除草剂对杂交种明两优143进行均匀喷洒，结果如图17所示，当BBC浓度在0.05g/L-0.6g/L范围内时，杂交种明两优143表现抗性，而母本明S表现敏感；最后，我们利用0.4g/L浓度BBC对杂交种明两优143种子进行除杂提纯实验，结果发现混杂的不育系明S能够100％杀死，而对杂交种明两优143没有产生明显药害(见表2)，以此除去因温度不稳定导致母本自交接种的后代，即获得真杂种后代。
表2：0.4g/L浓度BBC在明两优143中除杂提纯结果
类型 总数量 致死数量 正常生长数量 致死率
明两优143 2000 0 2000 0
明S 20 20 0 100％
实施例4：
一种利用除草剂进行两系杂交稻制种的方法，采用光温敏雄性不育系的“两系法”进行杂交水稻制种，包括如下步骤：
(1)检测水稻父本、母本的HIS1基因是否存在β-三酮类除草剂抗性：采用本发明的dCAPS标记引物CCJ-3F/CCJ-3R和分子标记引物CCJ-1F/CCJ-1R，对实施例2中51份两系杂交稻不育系进行了检测，检测结果见表1；
具体的检测方法包括如下步骤：
SS1、采用CTAB法，对水稻新鲜幼嫩叶片提取DNA样本：取适量新鲜水稻叶片装入2mL离心管中并加入钢珠，于液氮中速冻，放入高通量组织研磨器(宁波新芝Scientz-48)破碎组织，立即加入65℃预热的2×CTAB溶液650μL，置于65℃水浴锅中恒温45min，每10min上 下均匀颠倒一次，45min结束并待DNA样品冷却到室温后置于通风橱中加入650μL氯仿﹕异丙醇(24﹕1)的溶液，上下颠倒混匀，12000rmp离心10min，将500μl上清液转移到1.5mL的离心管中，加入500μl异丙醇溶液混匀并于-20℃沉淀2h，12000rmp离心10min，弃上清，加入1mL70％乙醇溶液洗除杂质，12000rmp离心5min后倒出上清，加入200μl ddH 2O于4℃冰箱中过夜溶解，得到提取的水稻样品DNA模板。
SS2、以所述步骤SS1的DNA样本为模板，用所述的dCAPS标记引物进行PCR扩增：将合成的引物CCJ-3F和CCJ-3R稀释为10mM；配置PCR反应体系：20μL PCR反应体系包含基因组DNA 2μL(50ng/μL)，前后引物各1μL(5μM/mL)，1.1×PCR Mix(擎科生物技术有限公司)16μL。PCR反应条件如下：95℃预变性4min；95℃20s，58℃20s，72℃20s，共35个循环；72℃延伸5min。取得到的扩增产物用限制性内切酶Dde1进行酶切，然后进行琼脂糖凝胶电泳，读取其DNA片段长度，若扩增产物的DNA片段出现一条长度为192bp的条带，则判断所述扩增产物的核苷酸序列被切割；通过DNA测序法发现，被限制性内切酶Dde1切割后得到两段长度分别为29bp和192bp的核苷酸序列，其中长度为29bp的核苷酸序列如SEQ.ID NO.13所示，长度为192bp的核苷酸序列如SEQ.ID NO.14所示，表示该水稻HIS1基因存在T1510G突变，进而可以确定该水稻HIS1基因不存在β-三酮类除草剂抗性；
dCAPS标记引物包括以下序列的正向引物CCJ-3F和反向引物CCJ-3R：
正向引物CCJ-3F：5’-CATCTTCAGGAGCCCGGTGCACAGGCTGA-3’(如SEQ.ID NO.1所示)；
反向引物CCJ-3R：5’-TCAGGGAGTCGATGTACCTC-3’(如SEQ.ID NO.2所示)。
SS3、以步骤SS1的DNA样本为模板，用检测水稻HIS1基因第四外显子上是否存在28bp缺失的分子标记CCJ-1F/CCJ-1R进行PCR扩增：将合成的引物CCJ-1F、CCJ-1R稀释为10mM；配置PCR反应体系：20μL PCR反应体系包含基因组DNA 2μL(50ng/μL)，前后引物各1μL(5μM/mL)，1.1×PCR Mix(擎科生物技术有限公司)16μL。PCR反应条件如下：95℃预变性4min；95℃20s，58℃20s，72℃20s，共35个循环；72℃延伸5min。取得到的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察所述扩增产物的DNA片段的长度；若扩增产物的DNA片段为单一的一条182bp条带，则表明该水稻HIS1基因存在长度为28bp的缺失变异，进而可以确定该水稻HIS1基因不存在β-三酮类除草剂抗性。若扩增产物的DNA片段为一条单一的210bp条带，或包含两条长度分别为182bp和210bp的条带，则表明该水稻HIS1基因不存在长度为28bp的缺失变异，在此情况下，若根据步骤SS2得到的扩增产物的DNA片段也未出现长度为192bp的条带，只得到一条长度为221bp的核苷酸序列(如SEQ.ID NO.11所示)，说明该待检测水稻的HIS1基因也不存在T1510G突变，进一步就可以确定该水稻HIS1基因存在β- 三酮类除草剂抗性；
正向引物CCJ-1F：5’-GTACAACTTGACGATGTATCAAG-3’(如SEQ.ID NO.3所示)；
反向引物CCJ-1R：5’-GTTGAATCTTGCAAATGCAGGAGC-3’(如SEQ.ID NO.4所示)。
检测结果发现了3份不育系存在T1510G突变，5份不育系存在28bp缺失变异，我们总共在两系不育系中鉴定出8份水稻材料存在HIS1基因功能缺失突变，他们分别是湘陵628S、C815S、华1037S、明S、准S、华68S、SE21S和明香10S；
为了验证硝磺草酮在两系杂交稻种子提纯中的作用，我们对日本晴(HIS1正常)、Y58S(HIS1正常)、SE21S(H3)和IR64(H5)进行了硝磺草酮浓度梯度实验，结果如图18、图19、图20、图21所示，结果发现当浓度为0.01g/L时，IR64和SE21S就表现出明显的药害，而日本晴和Y58S在浓度达到0.45g/L时才表现出明显的药害，证明硝磺草酮和BBC对水稻具有相似的表型；
(2)选择母本HIS1基因不存在β-三酮类除草剂抗性的水稻品种明S、父本HIS1基因存在β-三酮类除草剂抗性的水稻品种P143进行杂交，其中父本、母本HIS1基因的β-三酮类除草剂抗性/敏感表型均为纯合子，正常收获F1代种子进行种植得到杂交种明两优143(对β-三酮类除草剂表现抗性)；用不同浓度梯度的硝磺草酮除草剂对杂交种明两优143进行均匀喷洒，结果如图22所示，当硝磺草酮浓度在0.01g/L-0.1g/L范围内时，硝磺草酮除草剂对杂交种明两优143安全(表现抗性)，而母本明S表现出严重伤害(表现敏感)；最后，我们利用0.03g/L浓度硝磺草酮除草剂对杂交种明两优143种子进行除杂提纯实验，结果发现硝磺草酮除草剂能够100％杀死不育系明S自交结实种子，而对杂交种明两优143生长无影响(见表3)，以此除去因温度不稳定导致母本自交接种的后代，即获得真杂种后代。由于HIS1基因是β-三酮类除草剂广谱抗性基因，因此，利用β-三酮类除草剂(包括BBC、硝磺草酮和呋喃磺草酮等)都可以实现对两系杂交稻种子除杂提纯。
表3：0.03g/L浓度硝磺草酮在明两优143中除杂提纯结果
类型 总数量 致死数量 正常生长数量 致死率
明两优143 3000 0 3000 0
明S 30 30 0 100％
总体来说，本发明针对两系法杂交稻制种安全需要以及不同籼稻品种对β-三酮类除草剂具有不同的抗感特性，对我国主要籼稻中的HIS1基因单倍型进行了系统分析，明确了各单倍型是否具有抗除草剂功能，鉴定出一个新的HIS1无功能单倍型，并设计了相应的检测分子标记。通过选用HIS1基因无功能单倍型不育系和有功能单倍型恢复系，从而达到利用β-三酮类除草剂实现两系法杂交稻种子提纯的目的。
实施例5：
一种利用除草剂进行两系杂交稻制种的方法，包括如下步骤：
(1)从我国各水稻种植区域，搜集了600份水稻材料，其中包括两系不育系90份，包含两系恢复系的正常水稻材料510份，在以上600份水稻材料苗期3叶期喷施双环磺草酮除草剂(BBC，有效成分浓度稀释为0.75μM)，双环磺草酮除草剂(BBC)对水稻材料筛选的作用效果如图23所示，双环磺草酮除草剂(BBC)不具抗性的水稻材料叶片枯黄，甚至死亡，而对双环磺草酮除草剂(BBC)具有抗性的水稻材料生长健康；在90份两系不育系中筛选到16份材料对BBC敏感，包括安农S-1，标810S，KT27S，华1037S，湘陵628S，准S，龙S，奥龙1S，雁农S，锦4128S，360S，华煜4127S，Z9S，H175S，885S，明S；在510份包含两系恢复系的正常水稻材料中，筛选到344份材料对BBC表现抗性；在这两种类型材料中，已经配组出两系杂交稻品种组合方案的有9种，如表4所示，母本不抗BBC，父本抗BBC，其中父本、母本的HIS1基因均为纯合子；
(2)将步骤(1)筛选出的两系杂交稻品种组合进行杂交，得到的杂交种子种植，得到的杂交后代在苗期3叶期用双环磺草酮除草剂(BBC)对其进行均匀喷洒，以除去因温度不稳定导致母本自交接种的后代，即获得真杂种后代。
表4：符合筛选条件的两系杂交稻组合
Figure PCTCN2020105922-appb-000002
本发明对上述两系杂交稻品种组合的真杂种后代及其母本、父本进行喷施双环磺草酮除草剂实验(有效成分浓度稀释为0.75μM)，图24中从左至右依次是两系杂交稻父本P143及其杂交种明两优143、母本明S经喷施双环磺草酮除草剂后的效果对比图。由图24可知，母本明S对双环磺草酮除草剂不具抗性，叶片枯黄，而父本P143及其杂交种明两优143对双环 磺草酮除草剂具有抗性，植株生长健康。其他8种两系杂交稻品种组合方案的效果与图24一致，均表现为母本对BBC类除草剂不具抗性，叶片枯黄，而父本及其真杂交种对BBC类除草剂具有抗性，植株生长健康。结果证明母本死亡，杂交种及父本存活，筛选的效率可达到100％，效果比较明显，因此能够达到提高杂交稻种子纯度的目的。

Claims (18)

  1. 一种利用除草剂进行两系杂交稻制种的方法，其特征在于，包括如下步骤：
    (1)利用对除草剂敏感的两系不育系母本和对该除草剂具有抗性的两系恢复系父本配成两系杂交稻组合，进行杂交制种；
    (2)将所述步骤(1)后获得的杂交种子种植，得到的杂交后代植株用所述除草剂对其进行均匀喷洒，以除去母本自交接种的后代，即获得真杂种后代。
  2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，对除草剂敏感的两系不育系母本为水稻HIS1基因第四外显子上存在28bp缺失变异和/或水稻HIS1基因上存在T1510G突变的两系不育系母本。
  3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，对除草剂具有抗性的两系恢复系父本为水稻HIS1基因第四外显子上不存在28bp缺失变异且水稻HIS1基因上不存在T1510G突变的两系恢复系父本。
  4. 根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，检测所述水稻HIS1基因第四外显子上是否存在28bp缺失变异的操作具体包括如下步骤：以待检测水稻的DNA样本为模板，用特异的分子标记引物进行PCR扩增，取得到的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察所述扩增产物的DNA片段的长度；若扩增产物的DNA片段为单一的一条182bp条带，则表明该水稻HIS1基因第四外显子上存在28bp缺失变异；若扩增产物的DNA片段为一条单一的210bp条带，或包含两条长度分别为182bp和210bp的条带，则表明该水稻HIS1基因第四外显子上不存在28bp缺失变异。
  5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述特异的分子标记引物包括以下序列的正向引物CCJ-1F和反向引物CCJ-1R：
    正向引物CCJ-1F：5’-GTACAACTTGACGATGTATCAAG-3’；
    反向引物CCJ-1R：5’-GTTGAATCTTGCAAATGCAGGAGC-3’。
  6. 根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，检测所述水稻HIS1基因是否存在T1510G突变的操作具体包括如下步骤：以待检测水稻的DNA样本为模板，用特异性的dCAPS标记引物对包含HIS1基因上起始密码子ATG下游第1510位核苷酸的位点在内的DNA片段进行PCR扩增，取得到的扩增产物用限制性内切酶Dde1进行酶切处理，然后通过琼脂糖凝胶电泳法或DNA测序法判断所述扩增产物的核苷酸序列是否被切割；若被切割，则表示该水稻HIS1基因存在T1510G突变；若未被切割，则表示该水稻HIS1基因不存在T1510G突变。
  7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述DNA片段为HIS1基因上起始密码子ATG下游第1510位核苷酸至该第1510位核苷酸下游的第50-192位核苷酸。
  8. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述特异性的dCAPS标记引物包括以下序列的正向引物CCJ-3F和反向引物CCJ-3R：
    正向引物CCJ-3F：5’-CATCTTCAGGAGCCCGGTGCACAGGCTGA-3’；
    反向引物CCJ-3R：5’-TCAGGGAGTCGATGTACCTC-3’。
  9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，通过琼脂糖凝胶电泳法判断所述扩增产物的核苷酸序列是否被切割成两段的具体操作包括如下步骤：将通过限制性内切酶Dde1酶切处理后的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，读取其DNA片段长度，若扩增产物的DNA片段出现一条长度为192bp的条带，则判断所述扩增产物的核苷酸序列被切割；若扩增产物的DNA片段未出现长度为192bp的条带，则判断所述扩增产物的核苷酸序列未被切割。
  10. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，通过DNA测序法判断所述扩增产物的核苷酸序列是否被切割成两段的具体操作包括如下步骤：将通过限制性内切酶Dde1酶切处理后的扩增产物进行DNA测序，若得到如SEQ.ID NO.13和/或SEQ.ID NO.14所示的核苷酸序列，则判断所述扩增产物的核苷酸序列被切割；若得到如SEQ.ID NO.11所示的核苷酸序列，则判断所述扩增产物的核苷酸序列未被切割。
  11. 根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述母本自交接种的后代为因温度不稳定导致的母本自交接种后代。
  12. 根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)和步骤(2)中，所述除草剂为β-三酮类除草剂。
  13. 根据权利要求12的方法，其特征在于，所述β-三酮类除草剂为双环磺草酮除草剂或硝磺草酮除草剂，施用时所述双环磺草酮除草剂的浓度稀释为0.05g/L-0.6g/L，施用时所述硝磺草酮除草剂的浓度稀释为0.01g/L-0.1g/L。
  14. 根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述对除草剂敏感的两系不育系母本包括安农S-1、标810S、KT27S、华1037S、湘陵628S、准S、龙S、奥龙1S、雁农S、锦4128S、360S、华煜4127S、Z9S、H175S、885S、C815S、SE21S、明香10S和明S中的任意一种或几种。
  15. 根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述对除草剂具有抗性的两系恢复系父本包括玉香油占、R402、P143、粤禾丝苗、中早22、R534、华占和中嘉早32中的任意一种或几种。
  16. 根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，两系杂交稻组合包括：由准S母本与玉香油占父本组成的准两优香油占组合、由准S母本与R402父本组成的准两优402组合、由明S母本与P143父本组成的明两优143组合、由龙S母本与 粤禾丝苗父本组成的龙两优粤禾丝苗组合、由锦4128S母本与中早22父本组成的锦两优22组合、由锦4128S母本与R534父本组成的锦两优534组合、由锦4128S母本与华占父本组成的锦两优华占组合、由华煜4127S母本与中早22父本组成的煜两优22组合或由湘陵628S母本与中早22父本组成的陵两优22组合。
  17. 一种可用于权利要求1-16中任一项所述方法中筛选对除草剂敏感的两系不育系母本和对该除草剂具有抗性的两系恢复系父本的特异的分子标记引物，其特征在于，所述特异的分子标记引物包括以下序列的正向引物CCJ-1F和反向引物CCJ-1R：
    正向引物CCJ-1F：5’-GTACAACTTGACGATGTATCAAG-3’；
    反向引物CCJ-1R：5’-GTTGAATCTTGCAAATGCAGGAGC-3’。
  18. 一种可用于权利要求1-16中任一项所述方法中筛选对除草剂敏感的两系不育系母本和对该除草剂具有抗性的两系恢复系父本的dCAPS标记引物，其特征在于，所述dCAPS标记引物包括以下序列的正向引物CCJ-3F和反向引物CCJ-3R：
    正向引物CCJ-3F：5’-CATCTTCAGGAGCCCGGTGCACAGGCTGA-3’；
    反向引物CCJ-3R：5’-TCAGGGAGTCGATGTACCTC-3’。
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