CN116555203A - 具有三酮类除草剂抗性的hir突变体及其在植物育种中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有三酮类除草剂抗性的HIR突变体及其在植物育种中的应用，涉及植物蛋白质领域。本发明公开的HIR突变体由来源于植物的野生型HIR发生突变得到。该HIR突变体能降解三酮类除草剂，从而使表达该突变体的植物具有三酮类除草剂抗性。该HIR突变体及其编码核酸等不仅可用于转基因作物培育，也可应用于培育具有三酮类除草剂抗性的非转基因植物，具有广阔的应用前景。

Description

具有三酮类除草剂抗性的HIR突变体及其在植物育种中的 应用

本分案申请是基于申请号为2021103453770，申请日为2021年03月31日，发明名称为“具有三酮类除草剂抗性的HIR突变体及其在植物育种中的应用”的中国发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及植物蛋白质领域，具体而言，涉及一种具有三酮类除草剂抗性的HIR突变体及其在植物育种中的应用。

背景技术

农田杂草是影响农作物产量的重要因素之一，而人工除草所需要消耗的人力资源和成本很高，而且不便于农业集约化生产，严重制约了农作物种植向高产、优质和低成本方向的发展进程。因此，除草剂就应运而生，其使用为解决农田草害、促进栽培方式的革新及增产起了很大的作用。

世界上除草剂研发注重高效、低毒、广谱和低用量的品种。三酮类(Triketones)除草剂是由先正达公司新近开发的一类白化型(属于环己稀酮类)除草剂，用于多种(如大豆、棉花、油菜、水果和甜菜等)阔叶作物田防除单子叶杂草，敏感杂草通过幼根吸收传导，竞争抑制对羟基苯丙酮酸双加氧酶(4-Hydroxyphenylpyruvate dioxygenase，HPPD)，抑制尿黑酸的合成，使质体醌和生育酚的生物合成受阻，导致植物出现白化、生长迟缓等症状最终杀死植物。三酮类除草剂杀草谱较广，可防除多种一年生禾本科和阔叶杂草，药效为3～5d，对环境友好。其中的硝磺草酮和环磺酮是一种主要的玉米田除草剂，可有效防除玉米田1年生阔叶杂草，也能防除玉米田部分禾本科杂草，如稗草、狗尾草、马唐等。硝磺草酮在国内的玉米田得到了很好的推广。但三酮类除草剂在其他作物使用非常有限。因它对杂草和农作物均有伤害作用。即使在玉米中，各品种对三酮类除草剂的抗性也有差别，在施药时也得谨慎。虽然三酮类除草剂已经大面积商业推广使用，但由于这些除草剂通常也能杀死农作物本身，因此对一般不具有除草剂抗性的农作物而言，除草剂的使用在时间和空间上受到了极大限制，如需在农作物播种前一段时间使用除草剂。

为此，人们研究开发具有除草剂抗性的农作物，这样可以在种植期间使用除草剂，杀死杂草，但不影响植物本身的生长，由此拓宽了除草剂的使用范围。为了扩大三酮类除草剂的除草谱以及用于其他敏感作物，通过基因工程技术手段构建具有HPPD抑制剂抗性的转基因植物是有效的方法。目前已有两种HPPD抑制剂抗性的转基因大豆正在美国农业部的审批过程中，前者在大豆中大量表达来源于Pseudomonas fluorescens的HPPD突变体，重组HPPD的过表达导致玉米对出苗前除草剂的耐受性增加4倍，大豆的耐受性增加10倍。使其耐受异恶唑草酮(Isoxaflutole)；后者则是利用来源于燕麦(Avena sativa)的HPPD突变体对抑制剂较低的底物亲和力，从而耐受硝磺草酮和异恶唑草酮。但是由于反转基因浪潮，转基因作物在全世界的接受程度仍然较低，即使在转基因作物种植面积最大的美洲，转基因也主要局限于玉米、大豆、棉花等几个作物。为此，人们也同时致力于用非转基因的方法突变作物来获得具有抗除草剂的农作物，其中常用的方法就有甲基磺酸乙酯(EMS)诱变。由于EMS诱变的不确定性，想通过这种方法获得有除草剂抗性的作物只能依赖科研人员艰苦实践，尤其是依赖长期筛选，并且凭借一定运气才能获得。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有三酮类除草剂抗性的HIR突变体及其在植物育种中的应用。本发明提供的HIR突变体能降解三酮类除草剂，从而使植物有三酮类除草剂抗性。

本发明是这样实现的：

一方面，本发明提供一种具有三酮类除草剂抗性的HIR突变体，所述HIR突变体由来源于植物的野生型HIR发生突变得到，其中，突变的方式为如下(1)-(9)中的任意一种或几种的组合：

(1)：将所述野生型HIR与参考序列比对，将所述野生型HIR对应于所述参考序列第5位的位点的氨基酸突变为P；

(2)：将所述野生型HIR与所述参考序列比对，将所述野生型HIR对应于所述参考序列第75位的位点的氨基酸突变为L；

(3)：将所述野生型HIR与参考序列比对，将所述野生型HIR对应于所述参考序列第80位的位点的氨基酸突变为R；

(4)：将所述野生型HIR与所述参考序列比对，将所述野生型HIR对应于所述参考序列第89位的位点的氨基酸突变为G；

(5)：将所述野生型HIR与参考序列比对，将所述野生型HIR对应于所述参考序列第111位的位点的氨基酸突变为S；

(6)：将所述野生型HIR与所述参考序列比对，将所述野生型HIR对应于所述参考序列第145位的位点的氨基酸突变为G；

(7)：将所述野生型HIR与参考序列比对，将所述野生型HIR对应于所述参考序列第218位的位点的氨基酸突变为N；

(8)：将所述野生型HIR与所述参考序列比对，将所述野生型HIR对应于所述参考序列第283位的位点的氨基酸突变为R；

(9)：将所述野生型HIR与所述参考序列比对，将所述野生型HIR对应于所述参考序列第322位的位点的氨基酸突变为G；

其中，所述参考序列的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

铁/抗坏血酸依赖性氧化还原酶(Fe(II)/2-oxoglutarate(2OG)-dependentoxygenases，HIR)存在于大部分的植物中。本发明通过对野生型HIR突变，得到的如上所述的HIR突变体能降解三酮类除草剂，从而使表达该突变体的植物具有三酮类除草剂抗性。该HIR突变体及其编码核酸等不仅可用于转基因作物培育，也可应用于培育具有三酮类除草剂抗性的非转基因植物，具有广阔的应用前景。

SEQ ID NO.1所示的参考序列为水稻日本晴的野生型HIR，任何植物来源的野生型HIR经过上述突变方式(1)-(9)中的任意一种或几种突变的组合得到的HIR突变体均具有三酮类除草剂抗性。

上述的植物包括但不限于水稻、小麦、玉米、大麦、燕麦、高粱、荞麦、黍稷、绿豆、蚕豆、豌豆、扁豆、甘薯、马铃薯、棉花、大豆、油菜、芝麻、花生、向日葵、萝卜、胡萝卜、芜菁、甜菜、白菜、芥菜、甘蓝、花椰菜、芥蓝、黄瓜、西葫芦、南瓜、冬瓜、苦瓜、丝瓜、菜瓜、西瓜、甜瓜、番茄、茄子、辣椒、菜豆、豇豆、毛豆、韭菜、大葱、洋葱、韭葱、菠菜、芹菜、苋菜、莴苣、茼蒿、黄花菜、葡萄、草莓、甜菜、甘蔗、烟草、苜蓿、牧草、草坪草、茶和木薯等。

需要说明的是，本发明所涉及的蛋白序列比对所使用的比对方式为Clustal在线比对，其网站地址为：http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/。采用其他的序列比对工具(例如DNAMAN，相关参数设置按默认设置)所得到结果与Clustal在线比对得到的结果基本一致。

不同植物来源的野生型HIR的序列相似性和一致性的比较结果如下表所示：

本发明中，氨基酸序列指构成蛋白质或多肽的氨基酸残基的种类以及排列方式，通常用本领域常规使用的三字母方式表示氨基酸残基，也可使用本领域常规使用的单字母方式表示氨基酸残基，本领域技术人员应当能够将三字母构成氨基酸序列与单字母构成的氨基酸序列进行转换。应当明确的是，无论本发明中采用哪种方式表示，本领域技术人员均能够理解以及转换。例如：丙氨酸，单字母为A，三字母为Ala；精氨酸，单字母为R，三字母为Arg；天冬氨酸，单字母为D，三字母为Asp；半胱氨酸，单字母为C，三字母为Cys；谷氨酰胺，单字母为Q，三字母为Gln；谷氨酸，单字母为E，三字母为Glu；组氨酸，单字母为H，三字母为His；异亮氨酸，单字母为I，三字母为Ile；甘氨酸，单字母为G，三字母为Gly；天冬酰胺，单字母为N，三字母为Asn；亮氨酸，单字母为L，三字母为Leu；赖氨酸，单字母为K，三字母为Lys；甲硫氨酸，单字母为M，三字母为Met；苯丙氨酸，单字母为F，三字母为Phe；脯氨酸，单字母为P，三字母为Pro；丝氨酸，单字母为S，三字母为Ser；苏氨酸，单字母为T，三字母为Thr；色氨酸，单字母为W，三字母为Trp；酪氨酸，单字母为Y，三字母为Tyr；缬氨酸，单字母为V，三字母为Val。

可选地，在本发明的一些实施方案中，所述野生型HIR的氨基酸序列选自SEQ IDNO.1-2中的任意一种。

SEQ ID NO.1为水稻(Oryza sativa)日本晴的野生型HIR，其既是参考序列，也是野生型HIR，按上述突变方式突变后的突变体具有三酮类除草剂抗性。

SEQ ID NO.2为玉米的野生型HIR，其按上述突变方式突变后的突变体具有三酮类除草剂抗性。

本发明中，将参考序列上的第5位、第75位、第80位、第89位、第111位、第145位、第218位、第283位和第322位称为参考位点，将野生型HIR或HIR突变体上对应于上述参考位点的位点称为突变位点。不同植物来源(以水稻和玉米为例)的野生型HIR对应于上述参考位点的突变位点在其野生型HIR序列上的位置如下表所示：

例如，以玉米野生型HIR为例，玉米野生型HIR的第5位对应于参考序列的第5位，第76位对应于参考序列的第75位，第81位对应于参考序列的第80位，第90位对应于参考序列的第89位，第112位对应于参考序列的第111位，第146位对应于参考序列的第145位，第220位对应于参考序列的第218位，第285位对应于参考序列的第283位，第324位对应于参考序列的第322位。

例如，以玉米野生型HIR为例，对其突变的方式进行说明：

对于上述的突变方式(1)来说，将玉米野生型HIR与参考序列比对，将玉米野生型HIR对应于参考序列第5位的位点(即玉米野生型HIR的第5位)氨基酸突变为P；

对于上述的突变方式(2)来说，将玉米野生型HIR与参考序列比对，将玉米野生型HIR对应于参考序列第75位的位点(即玉米野生型HIR的第76位)的氨基酸突变为L。

可选地，在本发明的一些实施方案中，所述三酮类除草剂选自硝磺草酮、环磺酮、双环磺草酮、呋喃磺草酮、磺草酮、氟吡草酮和双唑草酮中任意一种。

需要说明的是，三酮类除草剂抗性是指对包括硝磺草酮、环磺酮、双环磺草酮、呋喃磺草酮、磺草酮、氟吡草酮和双唑草酮等在内的三酮类除草剂具有耐受性。

需要说明的是，在蛋白质序列已知的情况下，本领域技术人员有能力通过改变已知蛋白质的编码基因序列并将其导入表达载体，就可以制备出取代、添加或缺失了氨基酸残基的蛋白质，这些方法记载于《分子克隆实验指南》(北京：科学出版社，2002版)等文献中。

另一方面，本发明提供一种分离的核酸分子，其编码如上任一项所述的具有三酮类除草剂抗性的HIR突变体。

本发明中，核酸可以是DNA，也可以是RNA，优选是DNA。在知晓所编码蛋白序列或核酸序列的前提下，通过常规的密码子对应关系和宿主表达频率，运用PCR方法、DNA重组法或人工合成的方法，本领域技术人员有能力获得并优化编码本发明HIR突变体蛋白质的核酸。一旦获得该核酸，就可以将其克隆入载体，再转化或转染入相应的细胞，然后通过常规的宿主细胞进行增殖，从中分离得到大量的核酸。

另一方面，本发明提供一种重组载体，其含有如上所述的核酸分子。

本发明中，载体是指本领域中常用的细菌质粒、粘粒、噬菌粒、酵母质粒、植物细胞病毒、动物细胞病毒及其它各种病毒载体。根据所应用的目的不同，载体可以分为克隆载体、表达载体和转化载体，指的是所使用的目的分别针对克隆并验证基因、表达相应基因和将相应基因转化。本发明中可用的载体包括但不限于：在细菌中表达用的载体(原核表达载体)、在酵母中表达用的载体(如毕赤酵母载体)、在昆虫细胞中表达的杆状病毒载体、在哺乳动物细胞中表达用的载体(逆转录病毒载体、腺病毒载体等)、在植物中表达用的植物病毒载体以及在哺乳动物乳腺中表达用的各种载体。

容易理解，本领域技术人员根据需要，可以选择合适的载体，作为运载上述核酸分子的工具，其均属于本发明的保护范围。

另一方面，本发明提供一种重组菌或重组细胞，其含有如上所述的核酸分子或如上所述的重组载体。

重组菌可以是球菌、杆菌例如大肠杆菌或者是螺旋菌；也可以是自氧菌或者是异氧菌等。细胞可以原核细胞，也可以是真核细胞。真核细胞可以是动物细胞，也可以是植物细胞。另外优选的细胞是植物细胞，优选的是水稻细胞，更优选的是日本晴细胞。所述植物细胞中包含的上述的核酸分子可以通过转基因技术导入植物细胞，包括导入到植物细胞的核、叶绿体和/或质体中，也可以是通过本领域常规的突变技术(例如化学诱变如甲基磺酸乙酯(EMS)诱变或辐射诱变等)使得上述的核酸分子存在于植物细胞中。

容易理解，本领域技术人员根据需要，可以选择合适的细菌或细胞，作为上述核酸分子或重组载体的宿主，其均属于本发明的保护范围。

另一方面，本发明提供如上任一项所述的HIR突变体、如上所述的核酸分子、如上所述的重组载体、或者如上所述的重组菌或重组细胞在获得具有三酮类除草剂抗性的植物品种中的应用。

本发明中获得具有三酮类除草剂抗性的植物品种的方式包括制备、培育、生产或以其他方式产生得到，例如包括通过转基因育种方式获得，如将上述的核酸分子转化入植物后使之表达上述的HIR突变体；也包括通过非转基因育种方式获得，如通过杂交、回交、自交或无性繁殖并分选出包含上述核酸分子并表达上述HIR突变体的植物品种。

可选地，在本发明的一些实施方案中，所述应用包括：修饰目的植物的内源HIR基因，使其编码所述HIR突变体。

可选地，在本发明的一些实施方案中，所述应用包括：对植物细胞、组织、个体或群体进行诱变、筛选，使其编码所述HIR突变体。

本发明所述的植物品种包括但不限于单个植株、植株群或其繁殖材料、植物事件、植物后代、植物种子或其他植物的可繁殖部分。其中，植物后代本身就是植物，包括通过转基因技术产生的植株后代、与其他植物品种杂交产生的植物后代、以及回交或自交产生的植物后代。

本发明所述的植物品种可以是双子叶植物，也可以是单子叶植物，包括但不限于水稻、小麦、玉米、大麦、燕麦、高粱、荞麦、黍稷、绿豆、蚕豆、豌豆、扁豆、甘薯、马铃薯、棉花、大豆、油菜、芝麻、花生、向日葵、萝卜、胡萝卜、芜菁、甜菜、白菜、芥菜、甘蓝、花椰菜、芥蓝、黄瓜、西葫芦、南瓜、冬瓜、苦瓜、丝瓜、菜瓜、西瓜、甜瓜、番茄、茄子、辣椒、菜豆、豇豆、毛豆、韭菜、大葱、洋葱、韭葱、菠菜、芹菜、苋菜、莴苣、茼蒿、黄花菜、葡萄、草莓、甜菜、甘蔗、烟草、苜蓿、牧草、草坪草、茶和木薯等。

可选地，在本发明的一些实施方案中，所述三酮类除草剂选自硝磺草酮、环磺酮、双环磺草酮、呋喃磺草酮、磺草酮、氟吡草酮和双唑草酮中任意一种。

本发明中，植物指的单个植株、植株群或其繁殖材料，包括植物、植物品种、植株、植物事件、植物后代、植物种子或其他植物的可繁殖部分。其中，植物后代本身就是植物，包括通过转基因技术产生的植株后代、与其他植物品种杂交产生的植物后代、以及回交或自交产生的植物后代。

可选地，在本发明的一些实施方案中，所述应用包括如下步骤：

(1)使目标植物上述的核酸分子；和/或，(2)使目标植物表达上述的HIR突变体。

使目标植物包含上述的核酸分子，或者使目标植物表达上述的HIR突变体，继而得到具有三酮类除草剂抗性的植物品种。

本领域技术人员可以使用本领域熟知的基因编辑技术、育种技术、转基因技术等实现使目标植物包含上述的核酸分子和使目标植物表达上述的HIR突变体，这些方法包括但不限于如下方法：

(a)：将编码上述HIR突变体的核酸分子导入所述目标植物的细胞内，培养所述细胞使其分化、发育形成具有三酮类除草剂抗性的植株，以获得具有草铵膦抗性的植物品种；

(b)：通过基因编辑技术编辑所述目标植物的内源HIR基因，使其编码上述HIR突变体，以获得具有三酮类除草剂抗性的植物品种；

(c)：采用诱变技术，对所述目标植物的细胞或组织，或者所述目标植物个体或群体进行诱变，筛选出体内编码上述HIR突变体的细胞、组织或个体，以获得具有三酮类除草剂抗性的植物品种；

(d)：以上述(a)、(b)或(c)得到的具有三酮类除草剂抗性的植物品种为亲本，通过有性或无性杂交获得体内编码上述HIR突变体的植株，以获得三酮类除草剂抗性的植物品种。

另一方面，本发明提供一种具有三酮类除草剂抗性的植物的繁育方法，其包括：将由如上所述的应用得到的植物品种进行有性繁殖或无性繁殖。

其中，有性繁殖的方式包括杂交、回交和自交等。

基于本领域熟知的育种技术，本领域技术人员通过上述应用得到了具有三酮类除草剂抗性的植物品种后，可以很容易地通过有性繁殖或无性繁殖繁育出更多的具有三酮类除草剂抗性的植物品种，因此，此类繁育方法也属于本发明的保护范围。

另一方面，本发明提供一种具有三酮类除草剂抗性的植物的鉴定方法，其包括：测定待测植物是否表达如上任一项所述的HIR突变体；和/或测定待测植物是否含有如上所述的核酸分子。

本领域技术人员通过本领域常规的方法如蛋白质测序、核酸测序、PCR检测、探针杂交检测等可以实现上述鉴定方法。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为喷洒硝磺草酮后不同天数水稻苗的生长情况。

图2为喷洒双唑草酮后水稻苗的生长情况。

图3为喷洒环璜酮后水稻苗的生长情况。

图4为野生型水稻OsHIR(OsWT)和OsB、OsC、OsD、OsE、OsI以及OsJ的氨基酸序列比对结果。

图5为不同播种密度的水稻突变体种子的生长情况。

图6为Kasalath种子播种后10天的生长情况。

图7为Kasalath种子播种后20天的生长情况。

图8为野生型水稻OsHIR(OsWT)和野生型玉米ZmHIR(ZmWT)的氨基酸序列比对结果。

图9为pPAH载体图谱。

图10为水稻HIR突变体的颜色反应结果。

图11为玉米ZmHIR突变体的颜色反应结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

F1水稻品种抗三酮类除草剂诱变筛选和突变基因分离

1.水稻愈伤组织的诱导

将种业公司水稻(Oryza sativa)品种F1种子进行消毒：取成熟种子，人工脱壳，挑选饱满无菌斑的种子，放入50ml无菌离心管中，加入70％酒精消毒30秒。倒去酒精，用无菌水清洗一次；加入适量的2.6％次氯酸钠溶液，浸泡消毒15分钟。倒去次氯酸钠溶液，用无菌水浸泡清洗6-7次，每次3分钟。

诱导与继代培养：种子放在无菌滤纸上吸干，置于诱导培养基中，每皿12颗；操作完毕用封口膜封好培养皿，在30℃暗中培养21-28天，将愈伤组织转接到新鲜培养基上，继续培养7天左右，取1-2mm大小的球型愈伤组织作为培养材料。

诱导培养基：NB+水解酪蛋白0.3g/L+L-proline 2.8g/L+蔗糖30g/L+2,4-D 4mg/L+琼脂8g/L，pH5.8。高压灭菌。

2.悬浮培养和EMS处理

配制用于悬浮培养的液体培养基：S0(不加琼脂)+头孢(100mg/L)+50-100mg/L硝磺草酮+0.05％-0.5％甲硫酸乙酯(EMS)(只加第一次液体培养基)。

取继代7-21天的愈伤组织5g和50ml液体培养基加入150ml的三角瓶，在摇床上培养4星期(120rpm，28℃，黑暗)。每个星期换一次培养基(EMS只加第一次的液体培养基)。3-5星期后转至分化培养基。

S0培养基：NB+L-脯氨酸2.8g/L+蔗糖30g/L+2,4-D 2mg/L，pH5.8，高压灭菌。

3.抗性愈伤组织的诱导分化

将悬浮培养的愈伤组织在无菌滤纸上吸干，同时用紫外灯照射5分钟，转接到分化培养基上(含0.1-5.0mg/L硝磺草酮)，30℃，光照，培养21天左右。继代培养1次。挑选新生的幼小绿芽移至新的分化培养基，30℃，光照，继续培养21天左右。

分化培养基：MS+蔗糖30g/L+琼脂8g/L，pH5.8，高压灭菌，加山梨醇30g/L+KT 2mg/L+NAA 0.02mg/L+硝磺草酮0.1-5.0mg/L。

4.生根

待新生幼苗长至2cm左右时，移至生根培养基中，30℃光照，培养3～4周，待诱导出根并且幼苗长至7-10cm时，从培养基中取出，洗净根部沾染的培养基，移至土中。

生根培养基：1/2MS+肌醇0.1g/L+蔗糖20g/L，pH5.8，高压灭菌，加NAA 0.2mg/L+硝磺草酮0.1-5mg/L。

5.田间喷洒

将移栽后的水稻苗均匀地排放在同一实验区域(避免叶片重叠)。计算实验组和对照组的占地区域面积，根据区域面积，按硝磺草酮1倍计量为每公顷105克(每平方米10.5毫克)有效成分喷洒硝磺草酮。硝磺草酮6倍剂量为630克/公顷。实际喷洒是按照每平米40ml喷洒，含药量为6倍硝磺草酮。喷洒后4天、10天、21天分别拍照。取部分有代表性的植株拍照，结果见图1。

从图1可以看出，喷洒硝磺草酮4天后，对照组(WT)出现了叶片白化，实验组(Mutant)没有受影响。喷洒硝磺草酮10天后，WT组、Nipponbare组和Kasalath组明显开始枯萎，Mutant组依然没受影响，长势良好。喷洒硝磺草酮21天后，WT、Nipponbare和Kasalath已经枯死，Mutant依然没受影响，长势良好。表明Mutant能抗至少6倍田间剂量的硝磺草酮。

将喷洒硝磺草酮后存活的Mutant和新的WT再次用双唑草酮和环磺酮除草剂喷洒。根据区域面积，按双唑草酮1倍计量为每公顷60克(每平方米6毫克)有效成分，环磺酮1倍计量为每公顷92克(每平方米9.2毫克)有效成分喷洒除草剂。双唑草酮6倍计量为360克/公顷，环磺酮6倍计量为552克/公顷。实际喷洒是按照每平米40ml喷洒，含药量为6倍除草剂。喷洒后取部分存活植株拍照，结果见图2和图3。

从图2可以看出，喷洒双唑草酮21天后，两株WT明显也枯死，而两株Mutant虽然出现了叶尖黄化，但整体长势还是良好，受除草剂影响不大。表明这两株Mutant能抗至少6倍田间剂量的双唑草酮。

从图3可以看出，喷洒环璜酮21天后，WT明显也枯死，而Mutant虽然出现了叶尖黄化，但整体长势还是良好，受除草剂影响不大。表明这株Mutant能抗至少6倍田间剂量的环璜酮。

保留并繁殖这些长势良好的绿色秧苗(Mutant)，其为可以抗三酮类除草剂的F1突变植株。

实施例2

验证实施例1中的水稻HIR突变体降解硝磺草酮

1.繁殖实施例1中的可以抗三酮类除草剂的突变植株并收获种子，然后对种子进行消毒：取成熟种子(突变植株的混合种子)，人工脱壳，挑选饱满无菌斑的种子，放入50ml无菌离心管中，加入70％酒精消毒30秒。倒去酒精，用无菌水清洗一次；加入适量的2.6％次氯酸钠溶液，浸泡消毒15分钟。倒去次氯酸钠溶液，用无菌水浸泡清洗6-7次，每次3分钟。

2.准备固体培养基，其含有硝磺草酮1mg/L，灭菌后分装至培养瓶中，每个培养瓶中有100mL固体培养基。

3.分别取不同的种子密度培养于含硝磺草酮的培养基上，即分别取0、10、30、100和300颗已消毒好的突变植株种子，分别置于一个含有步骤2培养基的培养瓶中，并在瓶身上标记为M0、M10、M30、M100、M300，每个实验组做5次重复。

4.培养9天后，观察不同实验组秧苗的颜色并拍照。其结果见图4。

5.然后移除所有培养基上的秧苗和谷粒，再在每一个培养瓶中放置10颗脱壳的对硝磺草酮敏感的水稻Kasalath种子。

6.分别于第10天和20天观察秧苗的颜色并拍照。其结果见图5和图6。

从图4中可以看出在含有1mg/L硝磺草酮的培养基上长出的秧苗，不管是哪个种子密度，长起来的秧苗均是白化苗，表明这些秧苗都受到了硝磺草酮的影响。

从图5中可以看出，在第10天时，M0和M10培养瓶中的Kasalath秧苗均为白化苗，表明秧苗的生长受到培养基中的硝磺草酮影响，换言之，培养基中的硝磺草酮没有被上一轮播种的水稻突变体降解或降解的不多。而在M30、M100和M300培养瓶中，明显有绿色Kasalath秧苗生长，这表明这些培养基中的硝磺草酮浓度低或没有，不会对秧苗造成伤害，也就是说这些培养基中的硝磺草酮已被上一轮种植的众多的水稻突变体秧苗降解到对敏感品种的抑制水平之下。从图6中可以看出，在第20天时，秧苗的情况和第10天时区别不大，已长出的绿色秧苗依然存活。这些结果都说明实施例1的突变植株对硝磺草酮是有降解作用的，并且它们的降解作用是有群体效应，群体数越多，降解效果越好。

取上述实施例1中突变植株的叶片，分别提取它们的基因组DNA，根据已有的研究，设计和三酮类除草剂有关的基因引物，并以提取的突变植株基因组DNA为模板进行扩增，连接pMD19-T载体后，送至成都擎科伟业生物科技有限公司进行测序。将测序结果与NCBI上相应的水稻基因序列相比较，发现：

与野生型日本晴的OsHIR基因(SEQ ID NO.3)和及其编码的野生型OsHIR蛋白(SEQID NO.1)相比较，F1突变植株1至F1突变植株6的OsHIR基因和OsHIR蛋白各自具有的突变如下表1所示：

表1F1突变植株的OsHIR基因和OsHIR蛋白具有的突变

野生型水稻OsHIR和水稻HIR突变体OsB、OsC、OsD、OsE、OsI以及OsJ的氨基酸序列比对结果如图7所示，图中：箭头所指示的位置为突变位点，OsWT代表野生型水稻OsHIR。

实施例3

本实施例提供来源于玉米的HIR突变体，该HIR突变体通过如下突变方式得到：

将野生型玉米(Zea mays)郑58的由SEQ ID NO.4所示的ZmHIR基因编码的野生型ZmHIR蛋白(SEQ ID NO.2)与参考序列SEQ ID NO.1进行比对，结果如图8所示，在野生型ZmHIR蛋白对应于参考序列的参考位点(第111位、第75位、第218位、第322位、第5位、第80位和第89位中的一个或多个位点，如图8中箭头所指)的突变位点进行突变，突变后得到的突变体及其具有的突变见下表4：

表4由玉米野生型ZmHIR蛋白突变后得到的突变体

本发明实施例提供的玉米ZmHIR突变体编码基因和玉米ZmHIR突变体均可通过化学合成的方法获得。

实施例4

水稻OsHIR突变体颜色反应

检测实施例1提供水稻OsHIR突变体的OsB、OsC、OsD、OsE、OsI和OsJ的硝磺草酮抗性，方法如下：

根据上述实施例1提供的水稻核苷酸序列，设计PCR引物，在基因两端引入酶切位点(Pac1和Sbf1)，酶切后，在连接酶的作用下连接至经相同酶切处理后的表达载体(例如pPAH载体，载体上带有PaHPPD(Pseudomonas aeruginosa)基因，其结构如图9所示)上，然后转化DH5α大肠杆菌。

经验证后，挑取阳性克隆，接种至含不同浓度硝磺草酮的LTM液体培养基上生长，观察培养基的颜色变化情况，此为颜色反应系统。此检测系统中，在有酪氨酸(tyrosine，Tyr)的存在下，pPAH载体上的PaHPPD能分解酪氨酸形成尿黑酸(HGA)，HGA进一步被氧化变成褐色，在有硝磺草酮存在下，PaHPPD活性被抑制，培养基不能表现出褐色颜色变化，当HIR突变体降解硝磺草酮后，PaHPPD活性恢复，培养基出现褐色颜色变化，所以能通过观察培养基的颜色反应来确定HIR降解硝磺草酮的能力。

以野生型水稻OsHIR作为对照CK1，同时用一个没有降解硝磺草酮能力的基因OsGS(Glutaminesynthetase，GS)替换pPAH载体上的OsHIR，构建另一个对照CK2，在颜色反应系统中观察实验组和对照组的颜色变化。结果如图10所示。

其中，LTM(LB+1‰Tyr+kan+mesotrione)培养基的配制方法如下：LTM0(1L):

1‰Tyr：取1gTyr溶解与750ml ddH₂O中，再加入适量NaOH溶液促进溶解，放置于磁力搅拌器上加热溶解。待完全溶解,调节PH＝7.0，过滤灭菌后，尽快与高温灭菌的溶液混合(高浓度Tyr极易析出)形成LTM0。

LTM25：LTM0+25μM硝磺草酮；

LTM50：LTM0+50μM硝磺草酮；

LTM100：LTM0+100μM硝磺草酮。

根据图10的结果可看出：在LTM0中，6个水稻突变体和对照CK1、CK2都有明显的褐色，表明它们能在LTM0中正常生长，且PaHPPD表现出正常酶活性。在LTM25中，CK1和CK2没有褐色反应，表明CK1中的OsHIR和CK2中的OsGS没有降解硝磺草酮，载体中的PaHPPD受到了硝磺草酮的影响，不能正常表达，而OsB、OsC、OsD、OsE、OsI、OsJ出现了褐色反应，表明这些培养基中的硝磺草酮已被水稻OsHIR突变体降解到对PaHPPD的抑制水平之下，PaHPPD能够表达，产生颜色反应。说明水稻OsHIR突变体OsB、OsC、OsD、OsE、OsI、OsJ中的突变赋予了这些突变体降解硝磺草酮的能力且能力明显优于野生型OsHIR。表明这些OsB、OsC、OsD、OsE、OsI、OsJ至少能在25μM的硝磺草酮浓度下起一定的降解作用。

由此说明，突变S5P，F75L，H80R，S89G，L111S，E145G，D218N，H283R和/或R322G突变能够赋予或增强水稻OsHIR突变体硝磺草酮抗性。

实施例5

玉米ZmHIR突变体颜色反应

参考实施例4的检测方法，验证实施例3提供的玉米ZmHIR突变体ZmC、ZmE、ZmI和ZmJ的硝磺草酮抗性。结果如图11所示。其中，以野生型玉米ZmHIR作为对照CK3。

根据图11的结果可看出：在LTM0中，4个玉米突变体和对照CK2、CK3都有明显的褐色，表明它们能在LTM0中正常生长，且PaHPPD表现出正常酶活性。在LTM25中，CK2没有褐色反应，表明CK2中的OsGS没有降解硝磺草酮，载体中的PaHPPD受到了硝磺草酮的影响，不能正常表达，而ZmC、ZmE、ZmI、ZmJ和CK3出现了褐色反应，表明这些培养基中的硝磺草酮已被野生型玉米ZmHIR和其突变体降解到对PaHPPD的抑制水平之下，PaHPPD能够表达，产生颜色反应。但ZmC、ZmE、ZmI、ZmJ的颜色明显深于CK3，特别是在LTM50中，ZmC、ZmE、ZmI、ZmJ的颜色依然深于CK3，说明玉米ZmHIR突变体ZmC、ZmE、ZmI、ZmJ中的突变赋予了这些突变体降解硝磺草酮的能力且能力明显优于野生型玉米ZmHIR。表明这些ZmC、ZmE、ZmI、ZmJ至少能在25uM的硝磺草酮浓度下起一定的降解作用。

由此说明，突变S5P，F75L，H80R，D89G，L111S，D218N和/或R322G突变能够赋予或增强玉米ZmHIR突变体的硝磺草酮抗性。

综合上述结果，可以看出，将来源于植物的野生型HIR通过突变后得到的突变体都能降解三酮类除草剂，具有三酮类除草剂抗性，表达这类突变体的植株也具有三酮类除草剂抗性，前述突变的方式可以是如下(1)-(9)中的任意一种或几种的组合：

(1)：将野生型HIR与参考序列比对，将野生型HIR对应于参考序列第5位的位点的氨基酸突变为P；

(2)：将野生型HIR与参考序列比对，将野生型HIR对应于参考序列第75位的位点的氨基酸突变为L；

(3)：将野生型HIR与参考序列比对，将野生型HIR对应于参考序列第80位的位点的氨基酸突变为R；

(4)：将野生型HIR与参考序列比对，将野生型HIR对应于参考序列第89位的位点的氨基酸突变为G；

(5)：将野生型HIR与参考序列比对，将野生型HIR对应于参考序列第111位的位点的氨基酸突变为S；

(6)：将野生型HIR与参考序列比对，将野生型HIR对应于参考序列第145位的位点的氨基酸突变为G；

(7)：将野生型HIR与参考序列比对，将野生型HIR对应于参考序列第218位的位点的氨基酸突变为N；

(8)：将野生型HIR与参考序列比对，将野生型HIR对应于参考序列第283位的位点的氨基酸突变为R；

(9)：将野生型HIR与参考序列比对，将野生型HIR对应于参考序列第322位的位点的氨基酸突变为G。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种具有三酮类除草剂抗性的HIR突变体，其特征在于，所述HIR突变体由来源于植物的野生型HIR发生突变得到，所述HIR突变体为水稻突变体OsC，或水稻突变体OsE，或玉米突变体ZmC，或玉米突变体ZmE；

其中，水稻突变体OsC的突变方式为：与水稻参考序列相比，第111位的位点的氨基酸R突变为G；

水稻突变体OsE的突变方式为：与水稻参考序列相比，第75位的位点的氨基酸F突变为L；

玉米突变体ZmC的突变方式为：与玉米参考序列相比，第112位的位点的氨基酸L突变为S；

玉米突变体ZmE的突变方式为：与玉米参考序列相比，第76位的位点的氨基酸F突变为L；

其中，所述水稻参考序列的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述玉米参考序列的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种分离的核酸分子，其特征在于，其编码权利要求1所述的具有三酮类除草剂抗性的HIR突变体。

3.一种重组载体，其特征在于，其含有权利要求2所述的核酸分子。

4.一种重组菌，其特征在于，其含有权利要求2所述的核酸分子或权利要求3所述的重组载体。

5.权利要求1所述的HIR突变体、权利要求2所述的核酸分子、权利要求3所述的重组载体、或者权利要求4所述的重组菌在获得具有三酮类除草剂抗性的植物品种中的应用；

所述植物为水稻或玉米。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用包括：修饰目的植物的内源HIR基因，使其编码所述HIR突变体。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述三酮类除草剂选自硝磺草酮、环磺酮、双环磺草酮、呋喃磺草酮、磺草酮、氟吡草酮和双唑草酮中任意一种。

8.一种具有三酮类除草剂抗性的植物的繁育方法，其特征在于，其包括：将由权利要求5或6所述的应用得到的植物品种进行有性繁殖或无性繁殖；

所述植物为水稻或玉米。

9.一种具有三酮类除草剂抗性的植物的鉴定方法，其特征在于，其包括：测定待测植物是否表达权利要求1所述的HIR突变体；和/或测定待测植物是否含有权利要求2所述的核酸分子；

所述植物为水稻或玉米。