JP3106188B1 - 植物ウイルスの感染に関与する宿主遺伝子及びポリペプチド - Google Patents

Abstract

【要約】 【課題】 ウイルスによる植物の病害を防止するため
の、遺伝子工学的な手法による新たな技術を開発する。 【解決手段】 本発明により、新規遺伝子Ｈｃｐ１及び
当該遺伝子がコードするポリププチドであるＨＣＰ１が
与えられた。Ｈｃｐ１はオオムギ由来の遺伝子であり、
ブロムモザイクウイルスの外被蛋白質との結合活性を有
し、ウイルスの増殖に不可欠な蛋白質をコードするた
め、当該遺伝子の改変により、ウイルス耐性を付与した
形質転換植物の作成が可能である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、植物ウイルスの感
染に関与するオオムギ由来の宿主遺伝子であるＨｃｐ１
遺伝子、及び当該遺伝子がコードするＨＣＰ１ポリペプ
チドに関する。

【０００２】

【従来の技術】各種のウイルスによる植物の病害は、現
在の農業における大きな問題である。ウイルスによる被
害を防止する方法として、ウイルスを仲介する昆虫の駆
除が主として用いられているが、直接的な方法ではな
い。そのため、遺伝子工学的な手法を用いて、ウイルス
による植物の病害をより効率的に防止する技術につい
て、種々の研究がなされてきた。例えば、ウイルスゲノ
ムの一部を植物で発現させ、植物にウイルス耐性を付与
する方法が、実用化しつつある。しかし、この方法の場
合、ウイルスの遺伝子を利用しているため、生体内での
遺伝子組み換えにより、抵抗性を打ち破る新規ウイルス
の出現が危惧される事が問題となっていた。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】ところで、ウイルスが
宿主植物に感染するためには、ウイルス因子だけでなく
宿主側の因子の存在が必要不可欠ではないか、という可
能性が指摘されてきた。本発明者らはそのような知見に
注目し、宿主遺伝子の改変によりウイルスに耐性を付与
する可能性を検討した。これまでの抗ウイルス戦略は、
ウイルス側の遺伝子によるが、本発明の方法は宿主遺伝
子の操作によるため、上に述べた問題を根本的に解決す
るものである。植物へのウイルスの感染に関与する宿主
因子の存在を示唆する実験データが報告されてはいる
が、実際にそれらが単離同定された例はほとんどないの
が現状である。わずかに、シロイヌナズナ由来のウイル
ス増殖因子が報告されているのみであり（特願平１０−
３０１８１０）、シロイヌナズナ以外の植物体において
も、ウイルスの増殖に関与する宿主因子の同定される事
が求められていた。

【０００４】

【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは、
ブロムモザイクウイルス外被タンパク質（Ｂｒｏｍｅｍ
ｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ：
ＢＣＰ）と相互作用する植物因子に注目した。ブロムモ
ザイクウイルス（ＢＭＶ）は比較的研究の進んだプラス
鎖ＲＮＡウイルスであり、オオムギ、コムギ、トウモロ
コシ等の単子葉植物が主な宿主である。外被タンパク質
（ＣＰ）は数々のプラス鎖ＲＮＡウイルスゲノムにコー
ドされている因子の一つであり、様々な機能を持つこと
が知られている。例えば、（１）ＲＮＡゲノムを分解か
ら保護する役割、（２）病徴の発現をコントロールする
役割、（３）ウイルスの細胞間移行を促す役割、そして
（４）師管を介したウイルスの全身移行を促す役割を担
っていることが知られている。また、ＣＰはウイルス感
染した植物において最も大量に存在するタンパク質の一
つである。植物がそのような外来タンパク質の大量蓄積
を許容することは他に例が無く、この点も特筆すべきＣ
Ｐの性質の一つである。

【０００５】宿主側の植物材料としては、重要な作物で
あるオオムギを用いて解析を行った。即ち、ＢＣＰとの
相互作用を指標として、オオムギの相補的ＤＮＡ（ｃＤ
ＮＡ）ライブラリーのスクリーニングを、酵母のツーハ
イブリッドシステムを用いて行なった。その結果、ＢＣ
Ｐとの結合能を有する蛋白質をコードするオオムギｃＤ
ＮＡクローンを取得することに成功し、得られたクロー
ンより全長のｃＤＮＡ（Ｈｃｐ１）を得た。そのように
して単離されたＨｃｐ１の塩基配列（１３６０塩基
対）、及び当該遺伝子の翻訳産物であるＨＣＰ１のアミ
ノ酸配列（３５２アミノ酸）を決定した。

【０００６】また、インビトロにおける結合アッセイを
行ったところ、ＨＣＰ１とＢＣＰとの直接的な結合が確
認された。更に、ＢＣＰのＣ末端付近にアミノ酸変異を
導入する事により、ＨＣＰ１との結合能を失ったＢＣＰ
変異体を作成した。ＢＣＰとＨＣＰ１が相互作用する能
力と、ウイルス感染性の相関性を検討したところ、両者
の相関性が確認され、オオムギのブロムモザイクウイル
ス感染にＨＣＰ１が関与している事が示された。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明のＨｃｐ１遺伝子のｃＤＮ
Ａは配列表の配列番号２に記載した塩基配列により特定
される。またＨｃｐ１遺伝子がコードするポリペプチド
であるＨＣＰ１は、配列表の配列番号１に記載したアミ
ノ酸配列により特定される。上述したように、Ｈｃｐ１
はオオムギ由来の遺伝子であり、ＨＣＰ１ポリペプチド
はブロムモザイクウイルス外被蛋白質との結合活性を有
する。そのため、本発明の遺伝子の発現を制御したり、
改変する事により、植物にウイルス抵抗性を付与するこ
とが可能であり、そのような目的に本発明の遺伝子を利
用する事ができる。例えば、Ｈｃｐ１遺伝子のアンチセ
ンスＲＮＡを利用したり、導入したＨｃｐ１によるコサ
プレッションを利用することにより、オオムギ本来のＨ
ｃｐ１遺伝子の発現を制御する方法がある。又はＢＣＰ
との結合能を欠いた蛋白質をコードするＨｃｐ１遺伝子
を導入する事により発現するドミナントネガティブ効果
を利用する事で、植物にウイルス抵抗性を付与すること
が可能である。

【０００８】多くのアミノ酸については、それをコード
するＤＮＡの塩基配列は複数存在する。本発明で明らか
にされたＨＣＰ１のアミノ酸配列をコードする遺伝子の
場合にも、そのＤＮＡの塩基配列として、天然の遺伝子
の塩基配列以外にも、多数の塩基配列が存在する可能性
がある。しかし、本発明の遺伝子は、天然のＤＮＡ塩基
配列のみに限定されるものではなく、本発明により明ら
かにされたＨＣＰ１のアミノ酸配列をコードする、他の
ＤＮＡ塩基配列を含むものである。

【０００９】また、遺伝子組み換え技術によれば、基本
となるＤＮＡの特定の部位に、当該ＤＮＡがコードする
蛋白質の基本的な特性を変化させることなく、あるいは
その特性を改善する様に、人為的に変異を起こすことが
できる。本発明により提供される天然の塩基配列を有す
る遺伝子、あるいは天然のものとは異なる塩基配列を有
する遺伝子に関しても、同様に人為的に挿入、欠失、置
換を行うことにより天然の遺伝子と同等のあるいは改善
された特性を有するものとすることが可能であり、本発
明はそのような変異遺伝子を含むものである。

【００１０】また、本発明の遺伝子を植物に導入して形
質転換を行う方法、及び形質転換した植物も本発明の範
囲内である。本発明の遺伝子を導入する対象として適し
ている植物の例として、オオムギのみならず、コムギ、
トウモロコシ等の植物が挙げられる。本発明の遺伝子を
導入する方法の例としては、本技術分野で通常用いられ
ている種々の方法を用いる事が可能である。即ち、アグ
ロバクテリウム法、プロトプラスト法、ＰＥＧ法、エレ
クトロポレーション法、パーティクルガン法、マイクロ
インジェクション法等が挙げられる。以下の実施例によ
り、本発明を更に詳細に説明するが、本発明は上述した
例又は以下の実施例に限定されるものではなく、本発明
の技術分野における通常の変更をする事ができる。

【００１１】

【実施例】ツーハイブリッドシステムにおいて用いられ
た、種々の遺伝子を導入したプラスミドを表１に示す。
更に、インビトロ転写系及び結合実験のためのグルタチ
オンＳ−トランスフェラーゼ融合蛋白質作成に用いたプ
ラスミドを表２に示す。尚、置換したヌクレオチドを太
文字で示す。

【００１２】

【表１】

【００１３】

【表２】

【００１４】（全ＲＮＡの採取）オオムギを光時間１６
時間、温度２５℃の条件下で生育させ、７日目の苗の葉
組織より全ＲＮＡを採取した。そしてポリ（Ａ）⁺ ＲＮ
Ａを、バイオマグオリゴ（ｄＴ）₂₀（パーセプティブバ
イオシステム）を用いて単離した。スーパースクリプト
チョイスシステム（ＢＲＬ）を用いて、ｃＤＮＡを合成
し、プラスミドｐＡＣＴ２（クローンテック）のＥｃｏ
ＲＩ部位へ挿入した。これを大腸菌ＤＨ５α株に導入
し、約２．４×１０⁶ 個のコロニーを得た。

【００１５】（ツーハイブリッドシステムによるスクリ
ーニング）オオムギｃＤＮＡライブラリーのスクリーニ
ングは、酵母ツーハイブリッドシステムのキットであ
る、マッチメーカーツーハイブリッドシステム２（クロ
ーンテック）を用いて行った。酵母ツーハイブリッドシ
ステムでは、酵母の転写活性化因子であるＧＡＬ４に
は、ＤＮＡ結合領域（ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍ
ａｉｎ：ＤＮＡ−ＢＤ）と、転写活性化領域（ｔｒａｎ
ｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｄｏｍ
ａｉｎ：ＡＤ）のような複数の領域が存在し、転写活性
化の開始には両者の相互作用が必要であることを利用し
た方法である。まず標的蛋白質であるＢＣＰのペプチド
断片をコードするＤＮＡ断片を、ＧＡＬ４のＤＮＡ−Ｂ
Ｄベクター（ｐＡＳ２−１）中に組み込み、「ベイトプ
ラスミド」を作成する。一方、オオムギのｃＤＮＡライ
ブラリーをＧＡＬ４のＡＤベクター（ｐＡＣＴ２）中に
組み込み、「プレイプラスミド」を作成する。両プラス
ミドを酵母Ｙ１９０株に導入して形質転換を行い、得ら
れたコロニーにつき、ヒスチジン栄養要求性及びβーガ
ラクトシダーゼ活性により形質転換体のスクリーニング
を行う。βーガラクトシダーゼ活性を示すコロニーにお
いてはＧＡＬ４による転写活性化が起こっており、ｐＡ
Ｓ２−１に組み込まれた標的蛋白質と、ｐＡＣＴ２に組
み込まれたｃＤＮＡがコードする蛋白質の間に、何らか
の物理的相互作用がある事を示している。

【００１６】上述の表１に示されたプラスミドで形質転
換した酵母Ｙ１９０株を、３０ｍＭの３ーアミノトリア
ゾールを含み、トリプトファン、ロイシン及びヒスチジ
ンを含まないプレート上で培養した。１０日以内に生じ
た大きなコロニーにつき、βーガラクトシダーゼ活性を
アッセイ（マッチメーカー ツーハイブリッドシステム
２の添付マニュアルによる）し、ポシティブコロニーを
スクリーニングした。ポシティブコロニーより全核酸を
調製し、大腸菌ＤＨ５ａ株への形質転換を利用して、オ
オムギｃＤＮＡを含むプレイプラスミドを単離した。得
られた４個のｃＤＮＡクローンを、５’及び３’末端の
塩基配列により、３つの異なったグループに分類した
（図１）。得られたｃＤＮＡグループの１つが、部分Ｈ
ｃｐ１（ｄＨｃｐ１）を含むプレイプラスミド（ｐＡＣ
ＴｄＨｃｐ１）である。以下、Ｈｃｐ１につき特性解析
を行った。

【００１７】ｐＡＣＴｄＨｃｐ１をＹ１９０細胞に再び
導入し、相互作用の特異性を検討した（表３）。その結
果、ＢＣＰ（１３８−１８９）とｄＨＣＰ１を共発現し
ている酵母細胞（サンプル２）は、レポーター遺伝子を
活性化した。ところが、ｄＨＣＰ１のみを発現している
酵母細胞（サンプル２）は、レポーター遺伝子を活性化
しなかった。一方、任意の蛋白質をコードしているｃＤ
ＮＡを有するプレイプラスミド（サンプル４：ｐＡＣＴ
Ｃｃｐは任意の蛋白質をコードし、ここではキュウリモ
ザイクウイルスの外被蛋白質をコードする）の場合、ま
たは蛋白質をコードするｃＤＮＡを有していないプレイ
プラスミド（サンプル３）の場合には、ＢＣＰ（１３８
−１８９）を発現している酵母細胞のレポーター遺伝子
の活性化が認められなかった。また、ｄＨＣＰ１と全長
ＢＣＰ（２−１８９）とを共に発現（サンプル５）する
酵母細胞でも、レポーター遺伝子の活性化はやはり認め
られなかった。これらの結果は、ＢＣＰ（１３８−１８
９）とｄＨＣＰの両者が、レポーター遺伝子の活性化に
は必要であるという事を示している。即ち、酵母ツーハ
イブリッドシステムにおいて、これら２つの蛋白質間の
物理的な相互作用が認められた。

【００１８】

【表３】

【００１９】（Ｈｃｐ１遺伝子の塩基配列、Ｈｃｐ１が
コードするアミノ酸配列の決定）更に、ｐＡＣＴｄＨｃ
ｐ１のｃＤＮＡ断片をプローブとして用いたコロニーハ
イブリダイゼーションにより、オオムギｃＤＮＡライブ
ラリーより全長Ｈｃｐ１クローンをスクリーニングし、
配列を決定した。得られた全長Ｈｃｐ１遺伝子は１３６
０塩基より構成され、また、当該遺伝子がコードするポ
リペプチドは３５２個のアミノ酸より構成されていた。
Ｈｃｐ１遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号２に、Ｈ
ＣＰ１ポリペプチドの推定アミノ酸配列を配列表の配列
番号１に、それぞれ示す。両配列を併記した図を、図２
に示す。尚、図２において、矢印はｄＨｃｐ１遺伝子の
５’末端の塩基を示す。ＨＣＰ１ポリペプチドの推定ア
ミノ酸配列は、植物の鉄ーアスコルビン酸依存的酸化還
元酵素と、明確な類似性を有している。

【００２０】ＢＣＰとＨＣＰ１との直接的な相互作用を
示すために、ＨＣＰ１とグルタチオンＳ−トランスフェ
ラーゼ（ＧＳＴ）との融合蛋白質を利用した、インビト
ロ結合実験を行った。インビトロ結合実験の詳細を下記
に示す。この実験により、上述したＢＣＰ−ＨＣＰ１蛋
白質の相互作用が、ツーハイブリッドシステムのアーテ
ィファクトにすぎない、という可能性を除外する事がで
きる。

【００２１】（ＢＣＰの調製）Ｈｉｅｂｅｒｔら（Ｈｉ
ｅｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９６８）：Ｖｉｒｏｌｏ
ｇｙ，３４：４９２−５０８）の方法により、ブロムモ
ザイクウイルス外被タンパク質（ＢＣＰ）を調製した。
ウイルス粒子を、１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭジチオスレイ
トールを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．
４）中で、４℃で１４時間透析した。その懸濁液を、４
℃で６０１，０００ｇで４時間遠心分離し、非破砕ウイ
ルス粒子とウイルスＲＮＡを除去した。さらに、濃縮器
（セントリコン−１０：アミコン）を用いて蛋白質の濃
縮を行い、最終濃度を０．３μｇ／μｌとした。ＢＣＰ
の濃度は、励起定数により分光学的に決定した。 励起定数：０．１％（ｗ／ｖ）溶液につきＡ２６０ｎｍ
＝０．７６

【００２２】（ＧＳＴ蛋白質の発現）ＧＳＴとＨＣＰ１
との融合蛋白質を得るために、プレイプラスミドｐＡＣ
ＴｄＨｃｐ１よりｃＤＮＡ部分を回収し、ｐＧＥＸ−２
ＴＫプラスミド（アマシャムファルマシアバイオテク）
のＥｃｏＲ１部位へ導入した。ＧＳＴまたはＧＳＴ／Ｈ
ＣＰ１融合蛋白質はＢＬ２１大腸菌細胞（アマシャムフ
ァルマシアバイオテク）にて発現させた。５０μｇ／ｍ
ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地（ＬＢ−Ａｍｐ）２．
５ｍｌにて、目的のプラスミドを持ったＢＬ２１大腸菌
細胞を、３７℃で１６時間培養した。この培養液を１２
５ｍｌのＬＢ−Ａｍｐに添加し、１７０ｒｐｍで震盪し
ながら、ＯＤ６００が１．０になるまで、２５℃でイン
キュベートした。ＩＰＴＧが１ｍＭになるように添加し
て４時間後に、ＧＳＴ蛋白質及びＧＳＴ／ＨＣＰ１融合
蛋白質の発現が誘導された。細胞を回収し、１×ＰＢＳ
（１０ｍＭ Ｎａ₂ ＨＰＯ₄ 、１．８ｍＭ ＫＨ₂ ＰＯ
₄ 、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ）の中
に懸濁し、超音波処理により破砕した。遠心分離を行う
ことにより細胞ライゼートを得、トライトンＸ−１００
（最終濃度：１％（ｖ／ｖ））を添加した。

【００２３】（ＧＳＴ蛋白質の精製）ライゼートをグル
タチオンセファロース４Ｂ（アマシャムファルマシアバ
イオテク）と混合し、室温で１時間、穏やかに攪拌し
た。カラム担体を、バッファーＡで３回洗浄し（１％ト
ライトンＸ−１００及び５ｍＭジチオスレイトールを含
む１×ＰＢＳ）、その後ＧＳＴ蛋白質及びＧＳＴ／ＨＣ
Ｐ１融合蛋白質を、バッファーＢ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＮａＯＨ、ｐＨ９．０、１０ｍＭ還元型グルタチオ
ン、１％トライトンＸ−１００、５ｍＭジチオスレイト
ール）にて溶出させた。溶出蛋白質をバッファーＡに対
して透析し、グルタチオンを除去した。蛋白質の単離精
製度は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にて分離した蛋白質サ
ンプルを、クマシーブルーで染色した後、マーカー蛋白
質の量と比較して評価した。

【００２４】（結合実験による相互作用の検出）１μｇ
のＧＳＴ蛋白質またはＧＳＴ／ＨＣＰ１融合蛋白質を、
１００μｌのバッファーＣ（０．０５％（ｗ／ｖ）ウシ
血清アルブミンを含むバッファーＡ）に溶解した１μｇ
のＢＣＰと共に混合し、４℃で１時間穏やかに攪拌して
インキュベートした。その懸濁液を、１０μｌのグルタ
チオンセファロース４Ｂ（５０％スラリー）と混合し、
４℃で１時間、穏やかに攪拌した。カラム担体を２５０
μｌのバッファーＣで５回洗浄した後、２５μｌのバッ
ファーＢの中で室温で２０分間攪拌しながらインキュベ
ートした。その混合液を、４℃において６，０００ｇで
１０秒間遠心分離し、上清を回収した。溶出蛋白質を１
５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、ＰＶＤＦ膜（ミ
リポア）に転写し、抗ＢＣＰ抗体又は抗ＧＳＴ抗体によ
り検出した（図３）。図３において、レーン１及びレー
ン４はバッファーとインキュベーションしたコントロー
ルサンプルの結果、レーン２及びレーン５はＧＳＴのみ
を用いたサンプルにおける結果、レーン３及びレーン６
はＧＳＴ／ＨＣＰ融合蛋白質を用いたサンプルにおける
結果を示している。尚、レーン１からレーン３（Ａ）は
抗ＢＣＰ抗体で、レーン４からレーン６（Ｂ）は抗ＧＳ
Ｔ抗体でイムノブロッティングを行った。図３におい
て、ＧＳＴ／ＨＣＰ１とＢＣＰとの結合が認められた
（レーン３）。尚、ＧＳＴ単独ではＢＣＰとの結合は観
察されなかった（レーン２）。これらの結果は、ＨＣＰ
１とＢＣＰとが直接的に結合している事を示している。

【００２５】（ＢＣＰ結合領域のマッピング）ＢＣＰの
アミノ酸配列の中で、ＨＣＰ１との相互作用に関与して
いる部位を決定するために、Ｎ末端またはＣ末端を欠失
させたＢＣＰをコードするＤＮＡ断片を、ｐＡＳ２−１
プラスミド中に導入した。これら欠失したＢＣＰ遺伝子
を有するベイトプラスミドと、ｐＡＣＴｄＨｃｐ１プレ
イプラスミドにより、酵母Ｙ１９０株を形質転換し、両
者の相互作用をツーハイブリッドシステムを用いてアッ
セイした（図４）。Ｃ末端より４アミノ酸残基を除いた
ＢＣＰ（１３８−１８５）では、ＨＣＰ１との結合活性
の低下は見られなかった。一方、Ｃ末端より１２アミノ
酸残基を除いたＢＣＰ（１３８−１７７）では、ＨＣＰ
１との結合活性が低下した。また、ＢＣＰ（１２−１８
９）及びＢＣＰ（７７−１８９）は、ＢＣＰ（１３８−
１８９）より長いＮ末端を含んでいるにもかかわらず、
ＨＣＰ１に対して結合活性を有していなかった。これら
の結果は、ＢＣＰにおいて、アミノ酸配列の１３８番目
から１８５番目にまたがる部分が、ＨＣＰ１との結合に
関与している事を示している。

【００２６】（ＨＣＰ１−ＢＣＰ結合と感染性の相関
性）ＨＣＰ１とＢＣＰとの結合と、ウイルス感染性との
相関性を評価した。Ｃ末端部位にそれぞれ１アミノ酸置
換を生じた、ＢＣＰ変異体を作成し、ＨＣＰ１との結合
能、ウイルスの感染性、及び粒子化作用について評価し
た（表４）。表４において、アスタリスクマークは、ア
ミノ酸置換が生じている箇所を示している。ＨＣＰ１と
の結合アッセイは、酵母ツーハイブリッドシステムによ
り行った。ウイルス感染性のアッセイは、ティッシュー
プリントアッセイ（Ｍｉｓｅ ｅｔａｌ．（１９９
３）：Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：２８１５−２８２３）に
より行った。即ち、転写産物を６日目のオオムギの苗に
接種し、ウイルスＲＮＡ量の蓄積量により、ウイルスの
感染性を評価した。粒子化作用は、転写産物をオオムギ
のプロトプラストに接種した後に粒子画分を調製し、ウ
イルスＲＮＡを粒子より抽出し、ノーザンブロット解析
を行う事により評価した。

【００２７】それら変異体の間で、Ｐ１７８Ａ及びＤ１
８２Ａにおいて、結合のレベルの低下が観察され、これ
らの変異体はオオムギにおいて感染性を有さなかった
（表４）。逆に、野生株と同程度のＨＣＰ１結合活性を
有する変異体は、通常のウイルス感染性を保持した。Ｆ
１８４Ａにおいても感染性の消失が認められ、この現象
はＨＣＰ１との結合活性と合致していないが、これは粒
子化作用の消失に原因があると考えられる。尚、ウイル
ス外被蛋白質の粒子化作用により、ウイルスゲノムはＲ
ＮＡ分解酵素の作用から保護され、ウイルスの毒性が促
進される。これらの結果は、変異ＢＣＰとＨＣＰ１との
結合活性と、変異ＢＣＰ遺伝子をコードするＢＭＶ変異
体のオオムギへの感染性とが、顕著な相関性を有する事
を示している。

【００２８】

【表４】

【００２９】

【発明の効果】本発明により、植物ウイルスの感染に関
与するオオムギ由来の宿主遺伝子である、Ｈｃｐ１遺伝
子及び当該遺伝子がコードする蛋白質ＨＣＰ１が与えら
れた。

【００３０】

【配列表】 ＜１１０＞出願人氏名：京都大学長 ＜１２０＞発明の名称：植物ウイルスの感染に関与する宿主遺伝子及びポリペプ チド ＜１６０＞配列の数：２ ＜２１０＞配列番号：１ ＜２１１＞配列の長さ：３５２ ＜２１２＞配列の型：アミノ酸 ＜２１３＞起源：Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ Ｌ．（オオムギ） ｌｅａ ｆ ＜４００＞配列 MAASDEMPMV QDLVSAGVQE PPSRYLVHEQ DRHGDLLAAH EMPEPIPLID LSRLMDADEA 60 DKLRAALQTW GFFLATNHGI EDSLMEAMMS ASREFFRQPS EEKQKCSNLV DGNGKHYQVE 120 GYGSDKVESE DQVLNWNDRL HLRVEPEDER NFAKWPSHPE SFRDVLNEYA SKTKKIRDLV 180 LRSIAKLLEI DEDYFVNQIS NKASGFARLY YYPPCPRPDL VLGLTPHSDG NLLTILFVDD 240 DVGGLQVQRD GKWYNVPAKP HTLVINLADC LEIMNNGIFR SPVHRVVTNT EKERLSLAVF 300 YAVDEETVLE PAPGLLDEKR PPRYRKMMAK DFVVGLFEHF LQGKRFIDTL KM 352 ＜２１０＞配列番号：２ ＜２１１＞配列の長さ：１３６０ ＜２１２＞配列の型：核酸 ＜２１３＞起源：Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ Ｌ．（オオムギ） ｌｅａ ｆ ＜４００＞配列 GAAGTGAACA GTAGTAATAA CAGAATGGCT GCGTCCGATG AGATGCCGAT GGTGCAAGAC 60 CTTGTGTCGG CCGGAGTTCA GGAGCCGCCG AGCCGGTACT TAGTGCACGA GCAAGACCGT 120 CACGGCGACC TGCTGGCCGC CCACGAAATG CCGGAGCCCA TCCCTCTCAT TGACCTTAGC 180 CGGCTCATGG ACGCCGACGA GGCCGACAAG CTCCGGGCGG CTCTACAGAC CTGGGGCTTC 240 TTCCTGGCCA CCAACCATGG GATCGAGGAC TCTCTCATGG AAGCAATGAT GAGCGCGTCG 300 AGGGAGTTCT TCCGTCAACC GTCTGAGGAG AAGCAGAAAT GCAGCAACCT GGTGGACGGC 360 AACGGCAAGC ACTACCAGGT GGAAGGGTAT GGAAGTGACA AGGTGGAGTC CGAGGATCAG 420 GTCCTCAATT GGAACGACCG GTTGCATCTG AGAGTTGAGC CCGAAGATGA GAGGAATTTC 480 GCTAAGTGGC CCAGTCACCC AGAATCTTTC AGGGATGTGC TGAATGAGTA CGCATCAAAA 540 ACCAAGAAAA TAAGAGACCT TGTCTTGCGA TCGATAGCCA AGCTCCTGGA GATTGACGAG 600 GATTACTTCG TCAACCAGAT ATCAAACAAG GCTTCCGGGT TTGCTAGATT GTACTACTAC 660 CCTCCGTGTC CGAGACCTGA CCTAGTTTTG GGCCTCACGC CTCACTCTGA TGGCAACCTC 720 CTTACCATCC TTTTTGTCGA CGACGATGTT GGTGGCTTGC AAGTTCAGAG AGATGGGAAA 780 TGGTACAATG TTCCAGCCAA GCCTCACACG CTGGTGATCA ACTTAGCAGA CTGCCTGGAG 840 ATAATGAACA ATGGAATCTT TAGGAGCCCG GTTCACAGAG TGGTGACGAA CACTGAGAAG 900 GAGAGGCTTT CGCTGGCCGT GTTCTATGCC GTGGATGAAG AAACGGTGCT GGAGCCAGCG 960 CCCGGTTTGC TGGATGAGAA GCGACCACCA AGATATAGGA AAATGATGGC CAAGGATTTC 1020 GTAGTCGGAC TCTTTGAACA TTTCCTTCAA GGGAAGAGAT TCATCGACAC CCTGAAGATG 1080 TAAGTTATAG TACGTGTTAA CATTGATTAC CTATGTAGAA TAAAGAGATG GTCCTATCGT 1140 CTCTGAGTGG GGGTTTTATC TATCATTATC ATAAGCAACT TAGGTTGTGT TTATATTCAG 1200 TTGTTTCCAA AGGATGCAAA ACTTCGCTCC ATCTCAGTGA TTAAGAAGAA CGGTGTGCTA 1260 GTTAATTATA AAGTGGAAAG ACGGATCAAA GTAAATACTC CCTCCATCCG AAAATACTTG 1320 TATAAGAATG GATGTATGTA AATGTATTTT AGTTCTATAG 1360

【図面の簡単な説明】

【図１】 酵母ツーハイブリッドシステムにより、ブロ
ムモザイクウイルス外被蛋白質結合因子のスクリーニン
グを行った過程を示した図である。

【図２】 Ｈｃｐ１遺伝子の塩基配列と、Ｈｃｐ１がコ
ードするポリペプチドの推定アミノ酸配列を示した図で
ある。

【図３】 ＨＣＰ１とＢＣＰとの結合を、インビトロ結
合アッセイで検出したイムノブロッティングを示す写真
である。

【図４】 ＨＣＰ１との結合部位のマッピングを行った
結果を示す図である。

フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 14/415 C12N 15/29 ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の（ａ）または（ｂ）に示すアミノ
   酸配列からなることを特徴とする、ポリペプチド。 （ａ）配列表の配列番号１に示す、アミノ酸番号１−３
   ５２で示されるアミノ酸配列からなることを特徴とす
   る、ポリペプチド。 （ｂ）（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加され、ブ
   ロムモザイクウイルス外被蛋白質との結合活性を有す
   る、ポリペプチド。
2. 【請求項２】 請求項１記載のポリペプチドをコードす
   る、遺伝子。
3. 【請求項３】 以下の（ｃ）または（ｄ）に示す塩基配
   列からなることを特徴とする、遺伝子。 （ｃ）配列表の配列番号２に示す、塩基番号１−１３６
   ０で示される塩基配列からなることを特徴とする、遺伝
   子。 （ｄ）（ｃ）の一部が欠損、置換若しくは付加され、ブ
   ロムモザイクウイルス外被蛋白質との結合活性を有する
   ポリペプチドをコードする、遺伝子。